KR20240005876A - 재조합 단백질의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 단백질의 재조합 생산의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 스트루바이트(struvite)의 형성이 생산기 동안 첨가되는 마그네슘의 양을 특정 범위 내에서 유지함으로써 감소되는, 재조합 단백질의 생산을 위한 박테리아 숙주 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 단백질의 재조합 생산의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 스트루바이트(struvite)의 형성이 감소되는, 재조합 단백질의 생산을 위한 박테리아 숙주 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
의학 분야에서, 항체 또는 항체-유래 분자와 같은 생물학적 개체의 사용은 지속적으로 존재감과 중요성을 얻고 있다. 이에 따라, 제어된 제조 공정에 대한 필요성이 야기되었다. 의학적 용도를 위한 단백질의 상업화는 이들이 다량으로 생산되는 것을 필요로 하며, 요망되는 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포의 배양 및 이의 가공을 개선하기 위해 많은 노력을 기울였다. 이는 생성물 역가의 증가를 야기했지만, 이에 따라 세포 배양 수준에서 더 많은 양의 바이오매스/파편 및 오염물이 또한 관찰된다. 이러한 오염물의 제거는 힘들 수 있으므로, 요망되지 않는 오염물의 형성이 최소화되도록 공정을 최적화하는 것이 바람직할 것이다.
스트루바이트는 화학식 NH4MgPO4·6H2O를 갖는 인산염 물질이다. 스트루바이트는 고농도의 마그네슘, 암모늄 및 인산염의 존재 하에서 형성될 수 있다. 스트루바이트 형성은 종종 폐수 처리 공장에서 발생한다(예를 들어, 문헌[Kim et al., 2007] 참조). 스트루바이트 형성은 또한 박테리아 발효 동안 발생할 수 있다(Beavon 1962). 스트루바이트 형성은 요망되지 않는 침전물 및/또는 막 오염의 형성을 초래할 수 있으며, 이는 특히 재조합 단백질의 산업적 규모 제조에서 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 정제에 문제가 된다.
폐기물의 제거 또는 예를 들어 폐수로부터의 영양소의 회수를 위한 스트루바이트 침전의 사용이 광범위하게 조사되었지만, 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포의 배양 동안 스트루바이트 형성에 대하여 우수한 세포 성장 및 단백질 생산을 계속 유지하면서 스트루바이트의 형성을 방지하거나 최소화하는 방법은 거의 보고된 바 없다.
이는 본 발명에 의해 해결된다.
발명의 개요
첫 번째 양상에서, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는, 방법에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생산 동안 스트루바이트 형성을 감소시키거나 스트루바이트 형성의 위험을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는, 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 단계의 개요이고, 배치 단계 동안, 세포는 배치된 탄소원 상에서 성장한다. 규정된 OD600에 도달하면 마그네슘 볼루스가 첨가된다. 배치된 탄소원이 고갈되면 공급이 시작되고(Exp. Feed) 세포가 계속 성장한다. 배치 및 Exp. Feed 단계는 본원에 기재된 바와 같은 단계 (c)에 상응한다. 이후, 이종성 단백질의 발현 유도[유도제 첨가 - 단계 (d)에 상응함] 후, 이종성 단백질이 생산되는 동안[단계 (e)에 상응함] 세포가 계속 배양된다.
도 2에서 도 2a는 스트루바이트가 생성된 발효 생물반응기로부터 취한 펠렛이고(스트루바이트는 화살표로 표시된 백색 반점으로 볼 수 있음), 반면에 도 2b는 스트루바이트가 존재하지 않는 발효로부터의 펠렛이다.
도 3은 볼루스에서 상이한 수준의 마그네슘으로 수행된 실험으로부터 발효 공정 동안 취한 상청액 샘플에서의 마그네슘 농도(단계 (b)의 액체 배지 kg 당 마그네슘의 그램)이다.
도 4는 실시예 4 동안 기재된 발효 공정 동안 취한 상청액 샘플에서 마그네슘 농도이다.
도 2에서 도 2a는 스트루바이트가 생성된 발효 생물반응기로부터 취한 펠렛이고(스트루바이트는 화살표로 표시된 백색 반점으로 볼 수 있음), 반면에 도 2b는 스트루바이트가 존재하지 않는 발효로부터의 펠렛이다.
도 3은 볼루스에서 상이한 수준의 마그네슘으로 수행된 실험으로부터 발효 공정 동안 취한 상청액 샘플에서의 마그네슘 농도(단계 (b)의 액체 배지 kg 당 마그네슘의 그램)이다.
도 4는 실시예 4 동안 기재된 발효 공정 동안 취한 상청액 샘플에서 마그네슘 농도이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 재조합 단백질의 생산을 위한 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 발효 동안 마그네슘의 농도가 임계 수준 미만으로 유지되도록 마그네슘이 발효 동안 세포 배양 배지에 단계적으로 첨가될 때, 우수한 세포 성장 및 재조합 단백질 생산이 유지되면서 스트루바이트 침전물의 형성 위험이 유의하게 감소된다는 것을 발견하였다. 초기 배지 중의 마그네슘 농도에 따라, 배양 공정의 생산기 동안 첨가되는 마그네슘의 총량은 우수한 배양 성능을 유지하면서 스트루바이트 침전물의 형성 위험을 감소시키기 위해 특정 범위 내로 유지되어야 한다. 도 1은 본 발명에 따른 실시양태의 비-제한적인 개략도를 제공한다.
따라서, 첫 번째 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는, 방법에 관한 것이다.
두 번째 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생산 동안 스트루바이트 형성을 감소시키거나 스트루바이트 형성의 위험을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는, 방법에 관한 것이다.
세 번째 실시양태에서, 본 발명은 첫 번째 및 두 번째 실시양태에 따른 재조합 단백질의 생산 방법으로서, 0.17 g 내지 0.28 g의 상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 3개, 또는 4개 이상의 단계에 첨가되는, 방법에 관한 것이다.
네 번째 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
제공된 총량의 마그네슘 중, 제1 양의 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지에 있고, 제2 양의 마그네슘은 단계 (c) 동안 보충물로서 첨가되고, 제3 양의 마그네슘은 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는, 방법에 관한 것이다.
다섯 번째 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생산 동안 스트루바이트 형성을 감소시키거나 스트루바이트 형성의 위험을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
제공된 총량의 마그네슘 중, 제1 양의 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지에 있고, 제2 양의 마그네슘은 단계 (c) 동안 보충물로서 첨가되고, 제3 양의 마그네슘은 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는, 방법에 관한 것이다.
여섯 번째 실시양태에서, 첫 번째 내지 다섯 번째 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법에 제공되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.18 g 내지 0.27 g, 또는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.19 g 내지 0.26 g이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 방법에 제공되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.17, 약 0.18, 약 0.19, 약 0.20, 약 0.21, 약 0.22, 약 0.23, 약 0.24, 약 0.25, 약 0.26 및 약 0.27 g(및 이들의 임의의 중간 값)이다.
일곱 번째 실시양태에서, 첫 번째 내지 여섯 번째 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (c)는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.04 내지 0.22 g의 제2 양의 마그네슘을 첨가하는 것을 포함한다. 추가의 비-제한적인 실시양태로서, 단계 (c)는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.06 내지 0.20 g의 제2 양의 마그네슘을 첨가하는 것을 포함한다. 추가적인 비-제한적인 실시양태로서, 단계 (c)는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.08 내지 0.18 g의 제2 양의 마그네슘을 첨가하는 것을 포함한다. 다른 비-제한적인 실시양태에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.10, 약 0.11, 약 0.12, 약 0.13, 약 0.14, 약 0.15, 약 0.16, 약 0.17 또는 0.18 g(및 이들의 임의의 중간 값)의 제2 양의 마그네슘을 첨가하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 방법의 임의의 실시양태에서, 단계 (c) 동안 제2 양으로 첨가되는 마그네슘은, 예를 들어, 볼루스(bolus) 양(즉, 한 번에 첨가되는 단회 용량)으로 첨가될 수 있고/거나 유가식 단계의 공급물로서 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 일 실시양태에서, 단계 (c)는 배치 단계(batch phase) 및 이어서 유가 단계(fed-batch phase)로 이루어지며, 여기서 마그네슘의 볼루스는 배치 단계 동안 첨가되고 추가의 마그네슘은 유가 단계 동안 첨가된다.
여덟 번째 실시양태에서, 첫 번째 내지 일곱 번째 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법에 제공되는 암모늄의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 적어도 2 g의 암모늄이지만, 바람직하게는 20 g 이하, 예를 들어, 4 내지 20 g, 5 내지 15 g 또는 6 내지 12 g의 암모늄이다.
아홉 번째 실시양태에서, 첫 번째 내지 여덟 번째 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법에 제공되는 인산염의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 적어도 1 g의 인산염이지만, 바람직하게는 20 g 이하, 예를 들어, 3 내지 15 g, 예를 들어, 5 내지 12 g 또는 5 내지 10 g의 인산염이다. 첫 번째 내지 여덟 번째 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (a)의 박테리아 숙주 세포는 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 전체적으로 본 발명의 맥락에서 사용되는 박테리아 숙주 세포는 단백질의 재조합 생산에 적합하고 특정 조건 하에 성장할 수 있는 임의의 적절한 박테리아 숙주 세포일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포 또는 바실러스(Bacillus) 세포이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 숙주 세포, 예를 들어, 균주 K12, HB101, B7, RV308, DH1, HMS174, W3110 또는 BL21 또는 프로테아제 결핍인 이. 콜라이 균주의 이. 콜라이 숙주 세포이다. 전형적으로, 유도성 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 박테리아 숙주 세포에 도입되었다. 숙주 세포에서 이러한 핵산 작제물을 발현시키기에 적합한 벡터 및 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염을 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 유도성 프로모터는 또한 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 비-제한적인 일부 예가 하기에 본원에 언급되어 있다.
첫 번째 내지 아홉 번째 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (c)에서, 상기 박테리아 숙주 세포는 액체 배지에서 배양된다. 다양한 유형의 박테리아 숙주 세포를 배양하기 위한 방법 및 배지는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 배지는 유기체에 따라 다양하지만, 전형적으로 탄소원, 질소원, 인원, 필수 금속 이온 및 가능하게는 미량 원소(최소 배지)와 같은 성분을 포함한다. 이들은 아미노산 및 비타민(부유 배지)과 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Elbing et al., 2019] 참조). 본 발명의 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (c)는 전형적으로 생물반응기에서 유가식 배양을 포함한다. 유가식 단계에는 배치 단계가 선행될 수 있다. 접종은 작업 세포 은행(working cell bank)으로부터 직접 또는 종자 배양을 통해, 예를 들어, 진탕 플라스크에서 일어날 수 있다. 본 발명의 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (c)의 주요 목적은 후속 단백질 생산기에 충분한 바이오매스를 수득하는 것이다. 일 실시양태에서, 단계 (c)는 배양물을 적어도 20, 예컨대, 적어도 25, 적어도 35, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 70, 또는 적어도 80의 OD600(600 nm의 파장에서의 광학 밀도)로, 바람직하게는 20 내지 80 및 더욱 바람직하게는 20 내지 55 또는 25 내지 50의 OD600으로 성장시키는 것을 포함한다.
박테리아 숙주 세포 배양물에 마그네슘을 첨가하면 일반적으로 성장이 촉진된다. 마그네슘은 막 인지질, 지질다당류, DNA 및 RNA와 같은 폴리포스페이트 화합물, 및 리보솜의 안정화에 관여하는 것을 포함하여 세포에서 많은 역할을 한다. 마그네슘은 또한 ATP를 생물학적 활성으로 만드는 데 필요하고 직접적인 또는 간접적인 메커니즘을 통해 특정 효소 반응의 촉매작용에 참여한다. 본 발명의 맥락에서, 최적의 성장 및 생존력을 위해 충분한 마그네슘이 첨가되어야 하지만, 마그네슘 수준은 스트루바이트 형성을 피하거나 최소화하기 위해 특정 임계 농도를 초과하지 않아야 한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 마그네슘은 발효 공정 동안 단계적으로 첨가될 필요가 있다. 마그네슘은 전형적으로 마그네슘 염의 형태로 첨가된다.
열 번째 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
i) OD600이 20 내지 55일 때, 마그네슘의 볼루스를 첨가하는 단계,
ii) 용존 산소(DO)가 50% 이상의 공기 포화도로 증가할 때까지 OD가 증가하도록 상기 박테리아 숙주 세포를 추가로 배양하는 단계,
iii) 추가의 마그네슘을 첨가하고, OD600이 단계 (c)(i)에서 언급된 OD600의 적어도 15, 20, 25, 35, 40 또는 50 유닛, 바람직하게는 15 내지 50 및 더욱 바람직하게는 20 내지 40 유닛 초과로 증가할 때까지 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는, 방법에 관한 것이다.
열한 번째 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생산 동안 스트루바이트 형성을 감소시키거나 스트루바이트 형성의 위험을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 OD600으로 배양하는 단계,
i) OD600이 20 내지 55일 때, 마그네슘의 볼루스를 첨가하는 단계,
ii) 용존 산소(DO)가 50% 이상의 공기 포화도로 증가할 때까지 OD가 증가하도록 상기 박테리아 숙주 세포를 추가로 배양하는 단계,
iii) 추가의 마그네슘을 첨가하고, OD600이 단계 (c)(i)에서 언급된 OD600의 적어도 15, 20, 25, 35, 40 또는 50 유닛, 바람직하게는 15 내지 50 및 더욱 바람직하게는 20 내지 40 유닛 초과로 증가할 때까지 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는, 방법에 관한 것이다.
DO의 증가는 탄소원의 고갈과 연관성이 있는 것으로 잘 알려져 있다.
비-제한적인 실시양태로서, 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.03 g 내지 0.12 g의 양으로 방법의 단계 (c)(i)에서 볼루스로서 첨가될 수 있고, 단계 (c)(iii)에서 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.01 g 내지 0.10 g의 마그네슘에 상응할 수 있다. 추가의 비-제한적인 실시양태로서, 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.04 g 내지 0.11 g의 양으로 단계 (c)(i)에서 볼루스로서 첨가될 수 있고, 단계 (c)(iii)에서 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.02 g 내지 0.09 g의 마그네슘에 상응할 수 있다. 추가의 비-제한적인 실시양태로서, 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.05 g 내지 0.10 g의 양으로 단계 (c)(i)에서 볼루스로서 첨가될 수 있고, 단계 (c)(iii)에서 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.02 g 내지 0.08 g의 마그네슘에 상응할 수 있다. 일부 비-제한적인 실시양태에서, 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지의 kg 당 약 0.03, 약 0.04, 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.10, 약 0.11 또는 약 0.12 g(및 이들의 임의의 중간 값)의 마그네슘으로 단계 (c)(i)에서 볼루스로서 첨가될 수 있고, 단계 (c)(iii)에서 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.01, 0.02, 0.03, 약 0.04, 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.10(및 이들의 임의의 중간 값)의 마그네슘에 상응할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 단계 (c)(iii)에서 보충물로서 첨가된 마그네슘은 주 공급물(즉, 탄소원을 포함하는 공급물)의 일부로서 첨가된다. 대안적으로, 마그네슘은 보충 공급물로서 첨가될 수 있고, 주 공급물과 동시에 또는 별도로 첨가될 수 있다. 상기 공급물은 간헐적 공급물 또는 연속적(중단되지 않는) 공급물일 수 있다.
일 실시양태에서, 단계 (d)는 DO가 배양물에서 50% 이상의 공기 포화도로 증가할 때 또는 단계 (c)(iii)에서 규정된 바와 같이 소정의 OD600에 도달할 때 개시된다. DO는 온라인 폴라로그래프 용존 산소 센서, 광학 용존 산소 센서 또는 임의의 다른 적절한 산소 감지 기법과 같은 임의의 표준 수단에 의해 측정될 수 있다.
방법의 단계 (d)에서, 재조합 단백질의 생산이 유도된다. 일 실시양태에서, 단계 (d) 전에 재조합 단백질의 생산이 없거나 상당한 생산이 없다.
재조합 단백질 생산의 유도는 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 일 실시양태에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 다수의 이러한 유도성 프로모터는 당 분야에 공지되어 있다. 유도성 프로모터를 사용하는 널리 공지되어 있는 박테리아 발현 시스템은 재조합 단백질을 인코딩하는 유전자가 IPTG(이소프로필 β-D1-티오갈락토피라노시드)에 의해 유도될 수 있는 lac-타입 프로모터의 제어 하에 놓이는 시스템이다. 다른 공지된 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어, araBAD 프로모터 시스템(예를 들어, 문헌[Guzman et al., 1995] 참조) 또는 T7/lac 시스템(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., 1987] 참조)을 포함한다. 이들 및 다른 시스템은, 예를 들어, 문헌[Rosano and Ceccarelli (2014)]에서 검토되었다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 IPTG-유도성 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 따라서 IPTG로 유도 시 재조합 단백질을 생산한다. 이러한 실시양태에서, 방법의 단계 (d)는 IPTG의 첨가를 포함한다. 대안적으로, 박테리아 숙주 세포는, 예를 들어, 아라비노스-유도성 프로모터(예를 들어, araBAD 프로모터), 트립토판-유도성 프로모터(예를 들어, trp 프로모터) 또는 인산염-유도성 프로모터(예를 들어, phoA 프로모터)의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 이에 따라 각각 아라비노스, 트립토판 또는 인산염으로 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 단계 c)는 아라비노스, 트립토판 또는 인산염의 첨가를 포함한다.
본 발명의 방법의 단계 (e)에서, 박테리아 숙주 세포는 재조합 단백질을 생산하기 위해 배양된다.
단계 (e)는 전형적으로 생물반응기에서 유가식 배양을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (e)의 지속시간은 약 10 내지 약 96시간, 예컨대, 약 12 내지 약 72시간, 예를 들어, 약 15 내지 약 55시간, 예컨대, 약 18 내지 약 50 시간이다.
본 발명의 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 비-제한적인 실시양태에서, 방법의 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.02 g 내지 0.08 g이다. 본 발명의 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 추가의 비-제한적인 실시양태에서, 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.02 g 내지 0.07 g이다. 추가적인 비-제한적인 실시양태에서, 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.03 내지 0.06이다. 일부 특정 비-제한적인 예에서, 본 발명의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.02, 약 0.03, 약 0.04, 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07 또는 약 0.08 g(및 이들의 임의의 중간 값)이다.
본 발명에 따르면, 스트루바이트 침전을 감소시키거나 방지하기 위해, 방법에 제공되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g이다. 액체 배지에서 마그네슘이 고갈되거나 매우 적은 경우, 방법[즉, 단계 (c) 및 (e)] 동안 첨가될 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g일 수 있다. 일반적으로 사용되는 대부분의 액체 배지는 마그네슘을 포함하므로, 단계 (c) 및 (e)에서 첨가되는 마그네슘의 총량은 액체 배지 중 마그네슘의 함량에 의존할 것이기 때문에 조정되어야 할 것이다. 액체 배지를 위한 레시피는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 당업자는 M9 최소 배지가 약 0.002 g/kg의 마그네슘을 포함하는 반면, Durany 배지는 약 0.01 g/kg의 마그네슘을 포함한다는 것을 알 것이다. 비-제한적인 실시양태로서, 마그네슘의 총량이 단계 (b)의 액체 배지의 kg 당 0.20 g을 목표로 하고, M9 최소 배지로부터 시작하여, 당업자는, 예를 들어, 0.1 g/kg의 볼루스, 0.05 g/kg을 제공하는 지수기 공급물 및 0.048 g/kg을 제공하는 생산기 공급물을 첨가함으로써 단계 (c) 및 (e) 동안 액체 배지 kg 당 총 0.198 g의 마그네슘을 첨가할 수 있다. 추가의 비-제한적인 실시양태에서, 마그네슘의 총량이 액체 배지의 0.18 g/kg을 목표로 하고, Durany 최소 배지로부터 시작하여, 당업자는, 예를 들어, 0.1 g/kg의 볼루스, 0.025 g/kg을 제공하는 지수기 공급물 및 0.045 g/kg을 제공하는 생산기 공급물을 첨가함으로써 단계 (c) 및 (e) 동안 액체 배지의 kg 당 총 0.17 g의 마그네슘을 첨가할 것이다.
추가 실시양태에서, 탄소원을 함유하는 공급물(본원에서 "주 공급물"로도 지칭됨)이 본 발명의 방법의 출발 단계 (c)(iii)에 첨가된다. 바람직하게는, 공급 속도를 낮추거나 공급물에서 탄소원의 농도를 감소시킴으로써, 시간 단위당 배양물에 첨가되는 탄소원의 양은 단계 (c)(iii)에서보다 단계 (e)에서 더 낮다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 마그네슘 염과 같은 마그네슘원의 존재 하에 박테리아 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
언급된 바와 같이, 마그네슘은 미생물 및 동물 세포의 성장 및 대사 기능에서 중요한 역할을 하고, 세포 배양 및 발효 배지에서 Mg2+ 이용가능성은 세포의 성장 및 대사에 극적으로 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서 제공되는 마그네슘 염은 마그네슘 염의 혼합물 또는 단일 마그네슘 염으로 이루어질 수 있다. 황산마그네슘, 염화마그네슘 또는 또한 붕화마그네슘을, 그 자체로 또는 임의의 이들의 수화물 형태로, 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 성장 또는 미생물 또는 동물 세포에 적합한 임의의 마그네슘 염이 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 제공된 마그네슘 염은 상당량의 인산마그네슘을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 마그네슘 염은 임의의 마그네슘 염 및 인산염을 포함하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 마그네슘 염은 황산마그네슘 또는 염화마그네슘을, 그 자체로 또는 이들의 임의의 수화물 형태로, 포함하거나 이로 이루어진다.
액체 배지는 최소 배지 또는 부유 배지, 예컨대(이로 제한되지는 않지만), M9, M63, Durany, LB, TNT 또는 이의 유도체 배지일 수 있다(예를 들어, 문헌[Elbing et al., 2019] 참조).
액체 배지는 전형적으로 마그네슘을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (b)의 액체 배지는 액체 배지 kg 당 0.001 g 내지 0.25 g의 마그네슘 총량, 예를 들어, 본 발명의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.01 g 내지 0.25 g, 0.02 내지 0.25 g, 0.02 내지 0.2 g, 0.02 내지 0.1, 예컨대, (약) 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08 또는 0.09 g의 마그네슘을 포함한다.
액체 배지는 전형적으로 또한 암모늄을 포함한다. 암모늄 염은 질소의 중요한 공급원이다. 황산암모늄, 인산암모늄, 염화암모늄 및 탄산암모늄을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 성장 또는 미생물 또는 동물 세포에 적합한 임의의 암모늄 염 또는 암모늄 염의 혼합물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 암모늄 염은 임의의 암모늄 염 및 인산염을 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 방법에 제공되는 암모늄의 총량은 본 발명의 방법의 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 적어도 약 2 g의 암모늄이지만, 바람직하게는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 20 g 이하, 예를 들어, 4 내지 20 g, 5 내지 15 g 또는 6 내지 12 g, 예컨대, (약) 6.0, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5 또는 12 g 의 암모늄이다.
단계 (b)의 액체 배지는 전형적으로 또한 인산염을 포함한다. 일 실시양태에서, 액체 배지는 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 총 적어도 1 g의 인산염에 상응하는 인산염이지만, 바람직하게는 kg 당 20 g/kg 이하, 예를 들어, 3 내지 15 g/kg 또는 5 내지 12 g/kg, 예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 g의 인산염을 포함한다.
본 발명의 방법은 전형적으로 하나 이상의 유기 탄소원의 첨가를 포함한다. 사용되는 탄소원은 단일 유형의 탄소원 또는 상이한 탄소원의 혼합물일 수 있다. 적합한 탄소원은, 예를 들어, 글루코스, 락토스, 아라비노스, 글리세롤, 소르비톨, 갈락토스, 자일로스 또는 만노스를 포함한다. 예로서, 단계 b)에서 배양 배지 중 탄소원의 75% 초과, 예를 들어, 적어도 90%는 글리세롤로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (e)에서 배양 배지 중 탄소원의 75% 초과, 예를 들어, 적어도 90%는 글리세롤로 이루어진다. 또 다른 예로서, 단계 (c)에서 배양 배지 중 탄소원의 75% 초과, 예를 들어, 적어도 90%는 글루코스로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (e)에서 배양 배지 중 탄소원의 75% 초과, 예를 들어, 적어도 90%는 글루코스로 이루어진다. 추가의 예로서, 단계 (c)에서 배양 배지 중 탄소원의 75% 초과, 예를 들어, 적어도 90%는 락토스로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (e)에서 배양 배지 중 탄소원의 75% 초과, 예를 들어, 적어도 90%는 락토스로 이루어진다.
스트루바이트의 형성은 pH에 의해 영향을 받는 것으로 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[ et al., 1989] 참조). 본 발명의 방법의 실시양태에서, 본 발명의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 방법의 단계 (c)에서 배양물의 pH는 6.5 초과, 예컨대, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2이고, 단계 (e)에서 배양물의 pH는 6.5 초과, 예컨대, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2이다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (c)의 pH는 6 내지 8, 예컨대, 6.5 내지 7.5, 예를 들어, 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.7 내지 7.3, 예를 들어, 6.8 내지 7.2이고, 단계 (e)의 pH는 6 내지 8, 예컨대, 6.5 내지 7.5, 예를 들어, 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.7 내지 7.3, 예를 들어, 6.8 내지 7.2이다. 온도는 전형적으로 전체 발효 공정 내내 가능한 한 일정하게 유지된다.
본 발명의 방법에서 생산된 재조합 단백질은 전형적으로 또 다른 유기체로부터 기원하는 이종성 단백질이다. 예를 들어, 재조합 단백질은 항체, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬 또는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 재조합 단백질은 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 당 분야에 공지된 바와 같은 재조합 기법에 의해 생성된 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 재조합 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. "항체"는 임의의 종의 항체, 특히 포유동물 종의 항체; 예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE, IgD를 포함하는 임의의 이소타입의 인간 항체 및 IgGA1, IgGA2를 포함한 이러한 기본 구조의 이량체, 또는 오량체, 예컨대, IgM 및 이의 변형된 변이체로서 생산된 항체; 예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰구스 원숭이로부터의 비-인간 영장류 항체; 예를 들어, 마우스 또는 래트로부터의 설치류 항체; 토끼, 염소 또는 말 항체; 낙타류 항체(예를 들어, 낙타 또는 라마, 예컨대, Nanobodies™로부터) 및 이의 유도체; 닭 항체와 같은 조류 종의 항체; 또는 상어 항체와 같은 어류 종의 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 적어도 하나의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제1 부분이 제1 종으로부터 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제2 부분이 제2 종으로부터 유래되는 항체이다. 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이(Old World Monkey), 예컨대, 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다. "인간화된" 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성, 및 활성을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역[또는 상보성 결정 영역(CDR)]으로부터의 잔기로 대체된 인간 항체(수용자 항체)이다. 대부분의 경우, CDR 외부에서; 즉, 프레임워크 영역(FR)에서 인간(수용자) 항체의 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 추가로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 특성을 추가로 정제하기 위해 이루어진다. 인간화는 인간에서 비-인간 항체의 면역원성을 감소시켜, 인간 질병의 치료에 대한 항체의 적용을 용이하게 한다. 인간화 항체 및 이를 생성하기 위한 여러 상이한 기법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화에 대한 대안으로서 생성될 수 있는 인간 항체를 지칭한다. 예를 들어, 면역화 시, 내인성 뮤린 항체의 생산 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 시험관내에서 인간 항체/항체 단편을 수득하기 위한 다른 방법은 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 기법과 같은 디스플레이 기법을 기초로 하며, 여기서 적어도 부분적으로 인공적으로 또는 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 생성된 재조합 DNA 라이브러리가 사용된다. 인간 항체를 생성하기 위한 파지 및 리보솜 디스플레이 기법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 인간 항체는 또한 관심 항원으로 생체외 면역화된 단리된 인간 B 세포로부터 생성된 후 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있고, 이는 이후 최적 인간 항체에 대해 스크리닝될 수 있다. 용어 "항체"는 글리코실화된 항체와 비글리코실화된 항체 둘 모두를 지칭한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전장 항체를 지칭할 뿐만 아니라 항체 단편을 지칭한다. 항체의 단편은 당 분야에 공지된 바와 같은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 도메인을 포함하고, 하나 이상의 항원(들)에 결합한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예는 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-Fv-Fv, scFv 및 Bis-scFv 단편을 포함한다. 상기 단편은 또한 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 단일 도메인 항체(dAb), 예컨대, sdAb, VL, VH, VHH 또는 낙타과 항체(예를 들어, Nanobody™와 같이 낙타 또는 라마로부터 유래됨) 및 VNAR 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 항원-결합 단편은 또한 1개 또는 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함할 수 있고, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적에 결합한다(예를 들어, 치료 표적에 결합하는 하나의 scFv 또는 dsscFv 및 예를 들어, 알부민에 결합함으로써 반감기를 증가시키는 하나의 scFv 또는 dsscFv). 이러한 항체 단편의 예시는 FabdsscFv(BYbe로도 지칭됨) 또는 Fab-(dsscFv)2(TrYbe로도 지칭됨, 예를 들어, WO2015/197772 참조)이다. 상기 정의된 바와 같은 항체 단편은 당 분야에 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 생산된 재조합 단백질은 Fab 또는 Fab' 단편이다.
본 발명의 임의의 실시양태에 따른 방법은 원칙적으로, 예를 들어, 요구되는 생산 규모에 따라 유가 방식으로 작동되거나 작동되지 않을 수 있는 진탕 플라스크 또는 생물반응기와 같은 임의의 적합한 용기에서 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 단계 (c), (d) 및 (e)는 생물반응기, 바람직하게는 산업 규모의 생물반응기에서 수행된다. 생물반응기는, 예를 들어, 교반-탱크 또는 공기-부양 반응기일 수 있다. 생물반응기는 유리 또는 금속, 예를 들어, 스테인리스강으로 제조된 재사용 가능한 반응기, 또는 플라스틱과 같은 합성 물질로 제조된 일회용 생물반응기일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 적어도 단계 (e)는 100 L 이상, 500 L 이상, 1,000 L 이상, 또는 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상 또는 20,000 L 이상, 1,000 내지 30,000 L, 5,000 내지 30,000 L, 10,000 내지 30,000 L, 1,000 내지 20,000 L, 5,000 내지 20,000 L, 10,000 내지 20,000 L 또는 10,000 내지 25,000 L의 부피를 갖는 생물반응기에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b), (c), (d) 또는 (e)에서, 배양물은 100 L 이상, 500 L 이상, 1,000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상 또는 20,000 L 이상, 1,000 내지 30,000 L, 5,000 내지 30,000 L, 10,000 내지 30,000 L, 1,000 내지 20,000 L, 5,000 내지 20,000 L, 10,000 내지 20,000 L 또는 10,000 내지 25,000 L의 부피를 갖는다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 모든 단계 (b), (c), (d) 및 (e)에서 배양물은 100 L 이상, 500 L 이상, 1,000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상 또는 20,000 L 이상, 1,000 내지 30,000 L, 5,000 내지 30,000 L, 10,000 내지 30,000 L, 1,000 내지 20,000 L, 5,000 내지 20,000 L, 10,000 내지 20,000 L 또는 10,000 내지 25,000 L의 부피를 갖는다.
본 발명의 방법은 단계 (e) 후에 하나 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 재조합 단백질을 회수하는 추가 단계를 포함할 수 있으며, 이는 먼저 상청액으로부터 또는 봉입체로부터 세포를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 일단 회수되면, 재조합 단백질은 단리되고 정제될 수 있다. 단리 및 정제 공정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들은 전형적으로 다양한 크로마토그래피 및 여과 단계의 조합으로 이루어진다. 본 발명의 방법은 재조합 단백질을 의학적 용도, 예를 들어, 치료적 또는 예방적 용도에 적합한 약학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 재조합 단백질은 약학적 조성물로 제형화되기 전에 변형, 예컨대, 또 다른 분자에 컨쥬게이션된다.
실시예
재료 및 방법
하기 실시예에서, 달리 언급되지 않는 한, 공정은 하기와 같이 수행된다:
세포의 배양: 항체 A(8.8 내지 9.3 범위의 pI를 갖는 Fab' 단편)를 발현하는 이. 콜라이 W3110 숙주 세포를 함유하는 동결된 세포 은행 바이알을 사용하여 6x 펩톤-효모 추출물(6xP-Y) 배지 + 테트라사이클린을 함유하는 진탕 플라스크(700 mL 총 부피)에서 접종을 하였다. 이 진탕 플라스크를 30℃ 및 200 내지 250 rpm에서 인큐베이션하였다. 필요한 OD 범위에서, 진탕 플라스크를 사용하여 탄소원과 함께 화학적으로 정의된 배지(문헌[Durany et al. 2004]로부터의 MD 배지로부터 유래되고, 약 0.05 g/kg의 Mg를 함유함) + 테트라사이클린을 함유하는 종자 발효기(20 L 총 부피)에서 접종을 하였다. 종자 발효기 내의 세포 배양물을 30℃에서 유지하고, 용존 산소 농도(DO)를 20% 초과의 공기 포화도로 유지하고, pH를 약 7.0으로 조절하였다. 필요한 OD 범위에서, 종자 배양물을 사용하여 종자 발효기에서 사용된 것과 동일한 화학적으로 정의된 배지를 함유하는 생산 발효기(175 L 액체 배지)에서 접종을 하였다. 생산 발효기를 종자 발효기와 동일한 조건에서 유지하고 탄소원이 고갈될 때까지 배치 단계에서 성장시켰다. 이 시간 동안 이 대사산물의 고갈을 피하기 위해 MgSO4를 볼루스 첨가하였다(모든 실시예 참조). 배치 단계의 종료 시(측정된 DO의 스파이크로 표시됨), 지수 탄소원 공급물(단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.06 g의 수준의 마그네슘 함유)을 스위치 온하고, 50 유닛 초과의 OD600을 달성하기 위해 특정량의 탄소원을 배양물에 공급하였다. 이 시점에서, 탄소원 공급물을 지수기 공급물에서 생산기 공급물로 전환하고(모든 실시예 참조), IPTG의 첨가에 의해 항체 A 발현을 유도하였다. 세포(발현된 항체 A 함유)를 유도 후 40시간이 지나서 수확하였다.
스트루바이트 분석: 각 샘플링 시점에, 삼중의 1 mL 브로쓰 배양물을 2 ml 에펜도르프 튜브에서 원심분리하고, 상청액을 버리고, 표준 방법에 따라 튜브를 거꾸로 하여 세포 펠렛을 건조시켰다. 펠렛을 110℃의 오븐에서 24시간 이상 동안 추가로 건조시킨 다음, 스트루바이트가 있는 펠렛(도 2a에 도시된 바와 같음)과 스트루바이트가 없는 펠렛(도 2b에 도시된 바와 같음)의 참조 이미지와 비교하여 스트루바이트의 존재를 정성적으로 평가하기 위해 육안으로 검사하였다.
마그네슘 분석: 샘플에서 마그네슘의 농도를 Quantichrom 마그네슘 검정 키트(BioAssay Systems, cat #DIMG-250) 및 FLUOstar OPTIMA 마이크로 플레이트 리더(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 결정하였다.
DO 측정: 온라인 폴라로그래프 용존 산소 센서를 사용하여 산소 용해(DO)를 측정하였다.
실시예 1: 공정 A
발효를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 발효 동안 샘플을 취하고, 마그네슘 수준뿐만 아니라 스트루바이트의 존재에 대해 분석하였다. 볼루스 및 생산기 공급물을 통해 첨가된 마그네슘의 양은 하기 표에 제시되어 있다:
이 실시예에서, 발효 과정 전체에 걸쳐(액체 배지, 볼루스, 지수기 공급물 및 선형 공급물을 통해) 세포에 제공된 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.3 g 초과였다.
스트루바이트를 수확 시점에 취한 샘플로부터 생성된 펠렛에서 분명히 볼 수 있었고(데이터는 제시되지 않음), 따라서 사용된 볼루스 및 공급물 농도가 적합하지 않다고 결론지을 수 있다. 생물반응기에서 스트루바이트 침전의 단점 때문에, 공정을 수정할 필요가 있었다. 공정을 위해 제공된 마그네슘의 몰량은 인산염 및 암모늄 각각 하나의 몰량보다 적어도 5배 낮았기 때문에, 스트루바이트 침전은 발효 과정에 제공된 마그네슘의 총량(즉, 액체 배지에 포함된 마그네슘의 양에 더하여, 볼루스로서, 지수기 공급물 첨가에서 및 생산기 공급물에서 첨가된 마그네슘)에 의해 가장 유의하게 영향을 받는다는 것이 본 발명자들의 가설이었다.
실시예 2: 생산기 공급물에서 Mg를 감소시키고 Mg 볼루스 양을 변화시킨 효과
본 발명자들은 액체 배지도 또한 지수기 공급물의 조성도 변경할 의도가 없었으므로, 이들은 볼루스로서 및 생산기 공급물에 첨가된 마그네슘의 효과를 연구하기로 결정하였다. 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 발효를 수행하였다. 발효 동안 샘플을 취하고, 마그네슘 수준뿐만 아니라 스트루바이트의 존재에 대해 분석하였다. 생산기 공급물에서 마그네슘의 양을 세 가지 조건 모두에 대해 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.04 g으로 설정하였다. 이는 실시예 1에 기재된 생산기 공급물에 사용된 양의 대략 절반이다. 볼루스에 첨가된 마그네슘의 수준은 하기 표에 제시된 바와 같이 다양하였다.
이 실시예에서, 발효 과정 전체에 걸쳐(액체 배지, 볼루스, 지수기 공급물 및 선형 공급물을 통해) 세포에 제공된 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.2 g 내지 0.25 g이었다.
도 3은 생산기 공급물 및 볼루스에 사용된 양에 대한 조정이 발효 브로쓰에서 생성된 마그네슘 수준에 예상된 영향을 미쳤음을 보여준다.
수확 시점에서 취한 샘플로부터 생성된 펠렛의 육안 검사는 평가된 조건 중 어느 것도 스트루바이트의 형성을 초래하지 않았음을 분명히 보여준다. 또한, 세포 성장은 영향을 받지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 3: 추가 볼루스 감소의 영향
재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 발효를 수행하였다. 발효 동안 샘플을 취하고, 마그네슘 수준뿐만 아니라 스트루바이트의 존재에 대해 분석하였다. 볼루스 및 공급물을 통해 첨가된 마그네슘의 농도는 하기 표에 제시되어 있다:
이 실시예에서 볼루스에 첨가된 마그네슘 양은 실시예 2에 보고된 연구의 중간점과 비교하여 83% 감소이다. 발효 공정 전체에 걸쳐 세포에 제공된 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.16 g 미만이었다. 수확 시점에 취한 샘플로부터 생성된 펠렛의 육안 검사는 이들 농도가 스트루바이트의 형성을 초래하지 않았음을 분명히 보여준다(데이터는 제시되지 않음). 도 4는 마그네슘 농도가 낮은 수준으로 떨어졌고 상당한 시간 동안 낮게 유지되었고, 이는 세포의 성장에 부정적인 영향을 주어 마그네슘 수준의 후기 증가를 초래하였음을 보여준다(성장의 감소는 세포가 공급물을 통해 첨가된 만큼의 마그네슘을 이용하지 않게 함).
전반적인 결론:
배양을 위해 제공되는 마그네슘의 총량을 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 약 0.17 내지 약 0.28 g으로 유지하고 마그네슘을 단계적으로 첨가함으로써, 우수한 배양 성능을 유지하면서 스트루바이트 침전을 감소시키거나 피할 수 있다는 것은 본 발명자들의 놀라운 발견이었다.
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Claims (16)
- 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는 것인 생산 방법. - 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생산 동안 스트루바이트 형성을 감소시키거나 스트루바이트 형성의 위험을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
a) 유도 시 재조합 단백질을 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 소정량의 액체 배지를 제공하는 단계,
c) 상기 액체 배지에서 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
d) 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계, 및
e) 상기 박테리아 숙주 세포를 액체 배지에서 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하고,
전체 방법에 대해, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.17 g 내지 0.28 g 총량의 마그네슘이 제공되고,
상기 총량의 마그네슘은 단계 (b)의 시작부터 단계 (e)의 종료까지 배양 동안 단계적으로 제공되는 것인 감소 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 제공된 총량의 마그네슘 중, 제1 양의 마그네슘은 단계 (b)의 액체 배지에 있고, 제2 양의 마그네슘은 단계 (c) 동안 보충물로서 첨가되고, 제3 양의 마그네슘은 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는 것인 방법.
- 제1항, 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 배양물을 적어도 35의 OD600으로 성장시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)는 배양물에서 용존 산소가 50% 이상의 공기 포화도로 증가할 때 개시되는 것인 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 동안 첨가되는 마그네슘 보충물은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.04 내지 0.22 g의 총량의 마그네슘의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는
i) 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
ii) OD600이 20 내지 55일 때, 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.03 g 내지 0.12 g의 마그네슘에 상응하는 마그네슘 보충물을 첨가하는 단계,
iii) 용존 산소가 50% 이상의 공기 포화도로 증가할 때까지 상기 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계,
iv) 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.01 g 내지 0.10 g의 총량의 마그네슘을 첨가하고, 배양물의 OD600이 단계 (ii)에서 언급된 OD600의 적어도 20 유닛 초과로 증가할 때까지 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 동안 보충물로서 첨가되는 마그네슘의 총량은 단계 (b)의 액체 배지 kg 당 0.02 내지 0.08인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘은 염의 형태로 첨가되고, 바람직하게는 마그네슘 염은 황산 마그네슘 또는 염화 마그네슘을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 배양물의 pH는 6 내지 8이고/거나 단계 (e)에서 배양물의 pH는 6 내지 8인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 지속시간은 10 내지 96 시간인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 방법은 재조합 단백질을 정제하는 단계 및 선택적으로 재조합 단백질을 제형화하는 추가 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 산업적 규모 방법인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)는 100 L 이상의 부피를 갖는 생물반응기에서 수행되는 것인 방법.
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