CZ165298A3

CZ165298A3 - Způsob výroby rekombinantních proteinů v E.coli pomocí fermentace a velkou hustotou buněk

Info

Publication number: CZ165298A3
Application number: CZ981652A
Authority: CZ
Inventors: Wolfgang Strittmatter; Siegfried Matzku; Dieter Riesenberg; Uwe Horn; Uwe Knüpfer
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 1998-08-12
Also published as: PL327188A1; SK283169B6; KR19990072037A; JP2000501936A; CZ291415B6; AU716612B2; NO982672L; CA2240097C; ATE213271T1; US6410270B1; BR9611937A; ZA9610384B; ES2171752T3; UA61066C2; NO319090B1; DK0866876T3; SI0866876T1; EP0866876A1; AU1032597A; RU2201455C2

Description

Způsob výroby rekombinantních proteinů v E.coli pomocí fermentace s velkou hustotou buněk

Oblast techniky

Vynález se týká fermentačního způsobu fed-batch se specielními hostujícími vektorovými systémy E.coli k účinnému vytváření rekombinantních proteinů, obzvláště rekombinantních proti 1átkových molekul, obzvláště fragmentů protilátek, jako například miniproti 1átek.

Za podmínek podle vynálezu mohou buňky E.coli růst s maximální specifickou rychlostí růstu až do velmi vysokých hustot buněk. Po spuštění rekombinantního vytváření produktu působí pouze vytvářený produkt omezeně na růst; k omezení růstu substráty nebo metabolickými vedlejšími produkty nedochází. Tímto způsobem a ve spojení s novými k tomu specielně přizpůsobenými expresními vektory, vykazujícími vysokou stálost, lze dosáhnout vysokých výtěžků se zřetelem na prostor a čas rekombi nantn ích proteinů, které vykazují zejména v případě fragmentů protilátek vysokou biologickou aktivitu.

Dosavadní stav techniky

Podstatným předpokladem pro účinné vytváření rekombinantních proteinů je kultivace buněk E.coli k vysoké hustotě buněk. K tomu jsou stavem techniky dány následující kultivce: Po neomezeném růstu ( u « Uaax) v batch-fázi se obvykle přidává v navazující fed-batch-fázi zdroj uhlíku (glukóza nebo glycerin) omezeně tak, že se zabrání vytváření růst inhibujících vedlejších produktů, jako například acetátu s tím důsledkem, že v růstu se pak může pokračovat až k dosažení vysokých hustot buněk omezených pouze substrátem (u < Umax) (například B.

• · · · · · ···· ·» ·· ♦ ··*.··♦ »···. ··· 9 · ♦ · · « ··· • · · · · 9 9 9 999 99

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 · · 9 9 9 9 99 9

Riesenberg a kol., J. Biotechnol. sv. 20, sir. 17 až 28, 1991; Strandberg a kol.,FEMS Microbiol. Rev., sv. 14, sír. 53 až 56, 1994; Korz a kol., J. Biotechnol. 39, sír. 59 až 65, 1995; EP-B-0 511 226). Růst s redukovanou rychlostí růstu má jako důsledek přirozeně dlouhé doby fermentace a tím také menší prostoro-časové výtěžky. V důsledku okamžitého spotřebování se blíží při těchto fementacích koncentrace zdroje uhlíku v kul i tivačním roztoku téměř nule. Po vyřazení rekombinantního vytváření produktu se na poměrech omezených substrátem nic nemění .

Jsou též známé kultivace fed-batch s E.coli, při kterých se zdroj uhlíku přidává přerušovaně ve větších časových intervalech a pak ve větších množstvích, přičemž se většinou jako indikátoru vyčerpání substrátu používá nárůstu hodnoty p02 k iniciaci následného zdroje uhlíku (například Eppstein a kol., Biotechnol 7, str. 1178 áž 1181, 1989). Tento způsob znamená hromadnou změnu od dlouhodobých podmínek přebytku substrátu k podmínkám s omezeným substrátem a implikuje tak metabolické porušení rovnováhy.

Dále bude pojednáno o kultivacích fed-batch, při kterých mohou buňky růst ve fed-batch-fázi s maximální spec i f i ckou rychlostí růstu

Umax)· Kultivace fed-batch, při kterých po stanoveních off-line se kultuře přivádějí větší množství ve větších časových intervalech k zabránění zdroje uhlíku omezování substrátu, jsou experimentálně náročné a mají ten nedostatek, že se během celé fermentace koncentrace zdroje uhlíku trvale mění (například B. Pack a kol., Biotechnol. sv. 11, str. 1271 až 1277, 1993, Hahn a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, str. 100 až 107, 1994).

Jsou též popsány kultivace fed-batch, při kterých se koncentrace zdroje uhlíku měří a reguluje on-line, takže jsou vyloučena omezování, i když - obzvláště v oboru vysokých hustot

- 3 • · ·· · * » · · · · « · ·

9 9 9 »9# 9 « 9· • 9· · 9 ··· 9 9·9 *9 9 · · · «Μ 9·99· ·9·99 · 9 99

9999 ·♦ ·« ··· 4««· buněk - jsou spojena s dále popsanými nedostatky. Nedávno byl popsán autoklávovatělný biosenzor glukózy k nasazení v mikrobi lních fermentacích v kotlových fermentátorech s míchadlem (M.R. Phelps kol., Biotechnol . Bioeng. 46, str. 514 až 524, 1995) . Bylo ho použito pro kultury E.coli. Tesnto sensor in šitu podává s časovým prodlením přibližně 2 minuty aktuální hodnotu kutivačního roztoku. Signál, poskytovaný glukosovým sensorem, je kromě jiného závislý také na ρθ2. V oboru vysokých hustot buněk X > 80 g není sensor vyzkoušen. Podle zkušeností mohou nárůsty E.coli na sondách in šitu při velmi vysokých hustotách buněk vést k dalším chybným hodnotám. Kromě toho není možno sensor během probíhající fermentace přesně znovu o cejchovat. Jiné způsoby nejsou založeny na měření sensorem in šitu, nýbrž jsou založeny na například stanovení zdrojů uhlíku pomocí on line průtokových injekčních analyzátorů (Flft) nebo on-line HPLC v kultutivačním roztoku prostém buněk, který je z fermentátoru poloprůběžně odebírán a podrobován mikroodstředění (Kleman a kol., Appl. Environ. Microbiol. 57, str. 910 až 917 a 918 až 923, 1991 a Turner kol., Biotechnol. Bioeng. 44, str. 819 až 829, 1994). Předpovídací a zpětnovazební kontrolní algoritmy zmenšují kolísání koncentrace glukózy při růstu až do X = 65 g/1 (Kleman a kol., Appl. Environ. Microbiol. 57, str. 910 až 917, 1991) . V oboru velmi vysokých hustot buněk (od přibližně 80 g/1 do 150 g/1) se stává oddělování buněk stále obtížnějším a časově náročnějším, takže narůstá i časové zpoždění k určování aktuelní hodnoty glukózy ve fermentátoru v závislosti na biomase a udržování hladiny glukózy na konstantní hodnotě je ztíženo, případně znemožněno. Při konstantním a krátkém časovém zpoždění se naopak koncentrace glukózy měří aparaturou, která se obejde bez této separace buněk (Pfaff a kol., Proceedings of the 6th Inetrnational Conference on Computer Appl. in Biotechnol., Garnisch-Partenkirchen, FRG 1995, str. 6 až 11). Podle Pfaffa a kol. se v těsné blízkosti místa odběru vzorku po zředění kultury inhibitorem růstu nasadí Flft s enzymaticky-amperometrickým sensorem glukózy.

4

4 4 4 • ·· ·

4 « • 4 4 «

•444 *4 ·«

Při aerobní kultivaci vytvářejí buňky E.coli, které nejsou nuceny dávkovačím režime® k růstu limitovanému substrátem, obvykle v zesílené míře metabolický vedlejší produkt acetát (Riesenberg, Curr.Opinion Biotechnol. sv. 2, str. 380 až 384,

1991), který se akumuluje v živném roztoku a ve větších množstvích působí jako inhibitor růstu (Pan a kol., Biotechnol. Lett. sv. 2, str. 89 až 94, 1987). Proto jsou dosud tyto kultivace fed-batch k vysokým hustotám buněk možné pouze se zvláštními kmeny E.coli, jejichž akumulace acetátu byla snížena cílenými genetickými změnami při tolerování ostatních, s tím spojených, nedostatků. K potomkům E.coli K12 patří fosfotransacetylázově negativní mutanty (Bauer a kol., Appl. Environ. Microbiol. sv. 42, str. 100 až 107, 1994), které jsou však v prostředí minerálních solí glukózy silně v růstu omezovány. Phelps a kol. (Biotechnol. Bioeng. 46, str. 514 až 524, 1995).) používají jako hostitele kmene E.coli T0PP5 pro kultivaci nelimitovanou substrátem až do biohmoty X=85 g/1. Tento kmen E.coli, který zřejmě acetát silně neakumuluje, není však žádným kmenem E.coli K-12. E.coli T0PP5 vytváří hemolysin a je tak patogenním kmenem, který z bezpečnostních důvodů nepřipadá v úvahu jako hostitel pro vytváření rekombinantních produktů DNA v průmyslovém odvětví. Transformací buněk E.coli plasmidem, který obsahuje gen ke kódování acetolactátsyntházy (ALS) by bylo možno docílit snížení akumulace acetátu (San a kol., Ann-N-Y-Acad-Sci, sv. 721, str. 257 až 267, 1994). Tento způsob je však spojen s tím nedostatkem, že při použití plasmidu kódujícího ALS v kombinaci s druhým plasmidem nesoucím produkční gen, dochází obvykle za podmínek vysoké hustoty buněk k nestabilitám. Nestabi1 itami plasmidu, které se vyskytují v zesílené míře při kultivaci na vysoké hustoty buněk, je účinnost vytváření rekombinantních produktů hromadně snižována.

Protilátky nebo fragmenty protilátek, jako na příklad Fab*, F(ab )2 miniproti látky nebo jednořetězcové Fv získávají rostoucí měrou význam v lékařství a biotechnice. Pod pojmem • 9 ··

- 5 miniproti 1átka se v následujícím textu podle vynálezu rozumí bivalentní nebo bispecifický jednořetězcový Fv-fragment spojený přes Hinge-oblast. Přitom může být důležité, jako například v terapii rakoviny, poskytnout k dispozici velká množství protilátek (přibližné lg/na dávku). V E.coli je nyní možno obzvlášť snadno a dobře vyrobit monovalentní fragmenty protilátek nebo jejich fusní proteiny, popřípadě jejich multimerní nebo mul tispécifické varianty. Tyto fragmenty, případně varianty, vykazují malou vel ikost spojenou s vysokou specifickou vazební schopností. (Například Pliickthun A., Immunol.Rev. 130, str. 151 až 188, 1992; Pack a kol.. J.Mol.Biol. 246, str. 28 až 34, 1995). Proteiny, a zejména protilátky, musejí být však vhodně vinuty, aby byly biologicky a funkčně účinné. Tento problém je třeba respektovat při posuzování výtěžku vytvořených prot1átkových fragmentů pro buňku v souvislosti s hustotou buněk. Dále hraje důležitou úlohu primární sekvence protilátky při stanovení výtěžku in vitro a vinutí in vivo (Knappik A. a Pliickthun A., Protein Engin. 6, str. 81 až 89, 1995). Tak se například expresují Fab-fragmenty jako nerozpustné cytoplastické nebo periplasmatické agregáty a zpětně se vinou in vitro. Tak je referováno o výtěžcích přibližně 0,14 g/l při nízké hustotě buněk (Condra a kol., J. Biol. Chem. 165, str. 2292 až 2295, 1990) a až přibližně 1-2 g/l nerozpustných protilátek při střední hustotě buněk (Shubui a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol.38, str.770 až 775, 1993). Lze také získat bivalentní miniproti 1átky (Pack a kol. Biotechnol. 11, str. 1271 až 1277, 1993) v biologicky funkční formě ve výtěžcích přibližně 0,2 g/l v E.coli. Při těchto výtěžcích je v průměru 5 až 45 X řádně zpětně vinuto.

Ve známých systémech E.coli se napojuje tvoření cizích proteinů zpravidla vhodným způsobem po dosažení přiměřených hustot buněk odpovídajících expresnímu systému regulovatelným promotorovým systémem. Zde lze jmenovat například (i) promotor araBAD v přítomnosti AraC represoru (indukovatelným arabinózou)

• 9	9 9	9 9	9 9 99
	9	9	• to	9
•	99	9 9
9	9	9	9 9 9	9
*	9	•	• ♦	9
9999	99	• «	...

•to ·· * ··φ •· · · • ·« ·9 • «» •· ·· (například Better a kol., Proč. Nati. Acad. Sci . (USA) 90, str. 457 až 461, 1993), (ii) phoA promotor (indukovatelný odtahem fosfátu) (například Carter a kol., Biotechnol. 10, str. 163 až 167, 1992) a (i i i) promotorový systém lac (indukovatelný IPTG) (Pack a kol. 1993). Systém lac, který zpravidla ovlivňuje dobrou expresi, má však ten nedostatek, že u něj lze pozorovat jednak nežádoucí základní expresi před indukcí promotoru, jednak nestabilitu plasmidinu po indukci IPTG.

Ve zvláštním provedení vynálezu je popsán specielní vektor (pHKK), který obsahuje jako cizí gen sekvence, které kódují fragmenty myší případně humanizované protilátky MAb 425. MAb 425 (ATCC HB 9629) je myší monoklonální protilátka, která byla izolována ze známé lidské rakovinové linie Ά432 (ATCC CRL 1555) a váže na epitop lidského epidermického receptoru růstového faktoru (EGFR) glykoprotein o přibližně 170 kD za inhibice vazby přirozeného 1igandu EGF. Ukázalo se, že MAb 425 má cytotoxické působení na nádorové buňky, případně brání v jejich růstu (Rodeck a kol. Cancer Res. 47: 3692, 1987). Z patentového spisu WO 92/15683 jsou známy humanizované i chiměrní formy Mb 425, včetně sekvencí DNA a aminokyselin jejich lehkých a těžkých řetězců.

Cílem vynálezu je poskytnout způsob výroby cizích proteinů, obzvláště fragmentů protilátek v rekombinantních buňkách E.coli za podmínek vysoké hustoty buněk (HCDC = High Cell Density Cul ture) s vysokými časoprostorovými výtěžky a bez podstatného zhoršení růstu působením substrátů nebo metabolitů a be2 pozorovatelných ztrát plasmidu, případně nestabilit plasmidu při zaručení vysokého procenta účinné biologické aktivity (vazební schopnosti, korektního vinutí) exprimovaného proteinu,.

Podstata vynálezu

Způsob výroby cizího proteinu v buňkách E.coli, které ·» ♦ » • · »

« ··»· ·· · « · · » • » · ·«·* * · • ··» • « * • » byly transformovány cizím genem a indukovatelným plasmidem nesoucím promotor, pomocí fermentace buněk o vysoké hustotě přes stupně batoh a fed-batch bez obvyklého omezování růstu substráty nebo metabolickými vedlejšími produkty a izolováním a vyčištěním expresovaného proteinu z kultivačního prostředí, přičemž koncentrace substrátu ve fed-batch-fázi je regulována a/nebo řízena poloautomatickým systémem analýz a přísad, spočívá podle vynálezu v tom, že ve fed-batch-fáži (i) je koncentrace zdroje uhlíku v mediu udržována konstantní 0,1 g/1 až 25 g/1 při zachování neomezeného růstu buněk ( u = ifaaxh iii) produkce cizího proteinu v uvedené fed-batch-fázi se zahájí při hustotě buněk 20 až 80 g/1 indukcí promotoru a (iii) po proběhlé indukované synteze produktu se kontinuálně přivádí zužitkovate1ný dusík a fosfát i soli stopových prvků, přičemž (iv) v průběhu celé fed-batch-fáze se hodnota p02 nastaví odpovídajícím přívodem kyslíku do fermentační suspense na 5 až 25 %.

Způsob podle vynálezu je vícestupňový batch-postup, který spočívá podle vynálezu především v tom, že buňky mohou během celé batch-fáze maximálně růst (y = Umax). Popsaným způsobem je tak nakonec možno dosáhnout hustot buněk 100 až 150 g/1 (suché biomasy). Růstu není také podstatně bráněno akumulací acetátu, jelikož ta není za zvolených podmínek s překvapením obzvlášť výrazná, obzvláště při použití kmenů E.coli, které kromě toho mají sklon ke zmenšenému vytváření acetátu v průběhu fermentace. Toho se dosahuje při řadě jiných dodatečných opatření především tím, že koncentrace zdroje uhlíku v mediu je udržována v definovaném oboru konstantní, při zachování neomezeného růstu buněk. Odpovídajícím uspořádáním příslušného expresního vektoru může být téměř vyloučena nežádoucí bazálníexprese proteinu před napojením syntézy proteinu řiditelným promotorovým systémem, stejně jako částečně velká ztráta plasmidu, která, jak shora uvedeno, je normálně pozorována v expresních systémech se silnými, promotory, jako je například

··	··		• 9 ♦ 9
• ·	•	•	•	•	9
•	··		•	•	9 99
•	•	•	• ·	•	9 9
•	•	•	• ·	•
····	··			999

·♦ ·* »« « · •· ·· ··· ·« • ·« ·· ··

1ac-promotorový systém.

Dají se docílit v průměru výtěžky proteinů 3 až 5 g/1 po přibližně 25 až 35 hodinách celkové kultivace. V případě obzvlášť kritických proti 1átkových fragmentů, zejména miniproti1átek vlivem jejich kritérií vinutí, je asi 80 % syntetizovaného materiálu biologicky aktivní a správně vinutá.

Hodnoty pro potřebnou koncentraci zdroje uhlíku jsou podle vynálezu v průběhu fed-batch-fáze v rozmezí 0,1 g/ až 25 g/1. Výhodný rozsah je 0,5 až 15 g/1, obzvláště O, 1 g až 5 g/1, případně 1,0 až 3 g/1. Obzvlášť výhodnou je koncentrace 1,5 g/1. Jako zdroj uhlíku slouží s výhodou glukóza a glycerin nebo jejich směs. Podle vynálezu probíhá přísada zdroje uhlíku automatickým nebo poloautomatickým systémem přísad a analýz kontinuálním způsobem (on-line). S výhodou se používá systému průběžných injektovaných analýz (FIA) on-line.

Doplňování zhodnotí telného dusíku, s výhodou amoniového dusíku, a fosfátu, například diamoniumhydrogenfosfátu nebo amoniumdihydrogenfosfátu, i stopových prvků, například v mediu rozpustných solí bóru, manganu, mědi, molybdenu a kobaltu, železa nebo zinku probíhá ve fed-batch-fázi zařazené za batchfázi, s výhodou se zapojením syntesy proteinů regulovatelným promotorem při hustotě buněk 50 až 80 g/1 (suché biohmoty), s výhodou při přibližně 70 g/1 při celkové rychlosti růstu 100 až 150, s výhodou 140 g/1.

Spuštění syntesy proteinů aktivací regulovatelného systému promotorů nastává podle vynálezu při hustotě buněk 10 až 80 g/1, s výhodou 20 až 60 g/1; obzvláště výhodně 40 až 50 g/1.

Parciální tlak kyslíku obnáší během fed-batch-fáze 5 až 25 %, s výhodou 15 až 25 obzvlášť výhodně 20 %.

··		• 9	9999	9 9	99
♦ ♦	*	•	9 ♦	9	9 ·	9		•
•	99		• ·	999	• 9		9 9
•	9	9	♦ · ·	9 9	999	9		•
•	9	9	• ·	9	9	9		9
• •♦e	9 ♦		··	999	99		··

Hodnota pH se během celé batoh-fáze se podle vynálezu nastavuje na 6,5 až 7,0, s výhodou 6,7 až 6,9, obzvlášť na 6,8.

Vynález se dále týká odpovídajícího způsobu, při kterém se použije expresní vektor s expresní kasetou obsahující cizí gen, vymezený dvěma term inátorovými sekvencemi. Tyto terminátorové sekvence, zejména umístěné upstream zabraňují s úspěchem nežádoucí expresi proteinu před napojením promotorového systému. Obzvlášť výhodným je terminátor thp (Nohno a kol., J. Bacteriol. 170, str. 4097 až 4102, 1988), použít lze i jiných známých terminátorových sekvencí.

Vynález se dále týká způsobu, při kterém použitý expresní vektor obsahuje přídavně sebevražedný systém. Sebevražedný systém produkuje protein, který je bez výskytu plasmidu v buňce pro buňku toxický. Vhodné sebevražedné systémy jsou známy z literatury. Jedním pro vynález obzvlášť výhodným sebevražedným systémem je systém hop-sok (například Gerdes K., Biotechnol . 6, str. 1402 až 1405, 1988). Pro způsob účinného vytváření rekombinantních proteinů je totiž důležité, aby se systém hostujícího vektoru vyznačoval v oboru vysokých hustot buněk vysokou stabilitou plasmidu, malou rekombinantní bazální expresí a vysokou tvorbou produktu. Sebevražedné systémy v kombinaci s rekombinantními expresními kasetami, vymezenými terminátory, jsou přitom vektorově specifické.

Vynález se dále týká odpovídajícího způsobu, při kterém je nasazen cizí gen, kódující fragment protilátky, obzvláště mini prot i 1átku.

Dále se vynález týká způsobu, při kterém je použito expresních vektorů s přídavnými, dále popsanými význaky.

V zásadě je možno použít většiny známých kmenů E.coli, vhodných pro rekombinační techniku a pro výrobu v technickém ·· »4 4444 ·444 • · 4 · 4 4 44*44 • ·· 4 4 444 4 ·44 • · ··· 4 44 444 ·4

4 4 4 4 · 4 ·4 ••44 44 44 «44 4««4 měřítku. S výhodou nacházejí takové kmeny přednostní použití, které při růstu do vysokých hustot buněk akumulují poměrně málo acetátu. Obzvlášť výhodnými jsou kmeny, které vykazují obohacování acetátem pod 5 g/1 . S překvapením může být zvolenými podmínkami podle vynálezu akumulace acetátu udržována na obzvlášť nízké úrovni. Z tohoto hlediska se obzvlášť hodí obecně známý a obchodně dostupný kmen E.coli RV308 (ATCC 31608) i jeho varianty se stejným působením.

Vynález se týká zejména způsobu, při kterém se používá kmene E.coli s akumulací acetátu nižší než 5 g/1 v kultivačním mediu během fermentace.

Kromě toho se vynález týká expresního vektoru E.coli, vhodného k expresi cizích proteinů za podmínek fermentace s vysokou hustotou buněk, který vykazuje následující význaky:

(i) terminátorovou sekvenci upstream a downstream“, (ii) systém lac promotor/operátor, (iii) sekvenci T7gl0 Shine Dalgamo, (iv) signální sekvenci pelB- nebo ompA, (v) sekvenci cizího genu, a ve vhodném provedení přídavně sebevražedný systém, obzvláště systém hok-sok.

Podle vynálezu může být promotorový systém nahražen také jinými vhodnými, například shora jmenovanými systémy. Vynález také zahrnuje jiné stejně působící signální a řídicí sekvence.

Jako specielní provedení se vynález dále týká expresního vektoru pHKK (obr. 2) definovaného svou konstrukcí, který obsahuje sekvence pro miniprotilátku, odvozenou z MAb 425, i specielní rekombinantni hostitel E.coli RV308 [pHKK].

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomočí přiložených obrázků:

····

- 11 Na obr*. 1 je pokusný bioreaktor k výrobě proteinů za podmínek vysoké hustoty buněk. Systém je vybaven měřicím, ukazatelovým, kontrolním a dávkovačím zařízením. Význam vztahových značek je následuj ící:

procesní počítač PC 386-MFCS spravování procesu, zviditelnění dat, ukládání dat

DCU řízení procesu ustanovení

teplota	počet otáček
tlak	hmotnost
pH	protipěnicí činidlo
pO₂

	glukosa
6	odpadní plyn
7	plyn
8	fermentor Biostat ED 10
9	dávkování
10	protipěnicí činidlo
11	nh₃
12	glukosa
13	analýza odpadního plynu	(Hartmann &	Braun)
	o₂ co₂
14	stanice směšování plynu	(B. Braun)
	vzduch 0₂
15	FIA
	g1ukosa
16	FIA
	amon i um
17	LT 386
	filtr dat řízení FIA
Na	obr. 2 je optimalizovaný	expresní vektor pHKK i díly jeho
konstrukce. Vektor sestává v podsttě z	dílů známých vektorů

pASK40, ρΑΚΙΟΟ a pKG1022.

Na obr. 3(a-d) je znázorněna kultivace rekomhinantní E.coli na příkladu E.voli RV308[pHKK]: časový průběh biomasy, glukózy, amoniového dusíku, fosfátu, acetátu,rychlosti míchání, pOz, Oz a CO2 v odpadním plynu, stabilita plasmidu (vyjádřená % betalactamase positivních kolonií) tvoření proteinu (zde scFv425dhlx). Batch-fáze a fed-batch-fáze jsou rozděleny do 5 subfází. Šipka IPTG udává start produkce proteinu.

Na obr. 3a je na ose x doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají tento význam

	acetát [g/1]
amon i um g1ukóza biomasa	- N [g/1] [g/1] [g/1]
Na obr. 3b j e	na ose x

kult ivační doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají fosfát [g/1] ® 1ac. pos i t i vn í ko1 on i e [%] tento význam biomasa [g/1]

Na obr. 3c je na ose x doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají tento význam

- - - koncentrace oxidu uhličitého v odpadním plynu [%] koncentrace kyslíku v odpadním plynu [%] koncentrace pOz [%]

Na obr. 3d je na ose x kultivační doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají tento význam

aktivní scFv42sdhlx [mg/gX] celkový scFv42sdhlx [g/1] aktivní scFv425dhlx [g/1] biomasa [g/1]

- 13 Způsob podle vynálezu používá transformovaných hostících buněk E.coli. Zvolené plasmidové konstrukce se řídí podle druhu exprimovaného proteinu. Obzvlášť vhodné význaky takových plasmidových konstrukcí jsou popsány dále. Techniky a způsoby potřebné k plasmidové konstrukci a transformaci hostících buněk jsou všeobecně známé a v literatuře podrobně popsané (například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor, 1989). Kromě toho jsou popsány v příkladech u zvláštních provedení vynálezu. Výchozí plasmidy nebo díly plasmidů jsou buď obchodně dostupné, nebo je lze snadno zkonstruovat podle standardních metod na základě známého konstrukčního schématu.

Předběžně zařazená batcb-fáze typické fermentace podle vynálezu transformovaných buněk E.coli je rozdělena do dvou subfází. Po naočkování odpovídající předkulturou je subfáze I vyznačena lag-fází, ve které se buňky adaptují a rychlost růstu q návazně stoupne na Uaax. Během subfáze II rostou buňky exponenciálně při u = u_ttax. Po poklesu p02 ze 100% nasycení na 5 až 15%, se nastaví hodnota p02 řízením rychlosti míchadla p02 na hodnoty p02 s výhodou 15 až 25 %, obzvláště 20 % (obr. 3c). Toto nastavení (zavedením vzduchu obohaceného čistým kyslíkem) se má provést přibližně 6 až 12 hodin před začátkem fermentace hlavní kultury. Koncentrace glukózy, která je zpočátku s výhodou 20 až 35 g/1, klesne až ke konci subfáze II, který představuje také konec batch-fáze předřazené před fed-batch-fázi. Přitom nemají být podkročeny v žádném případě hodnoty 0,1 g/1. Tomu se od této chvíle čelí příslušným přikrmováním glukózou (subfáze III, obr. 3a, start fed-batch-fáze). Podle vynálezu se hodnota glukózy udržuje konstantní 0,1 až 25 g/1, s výhodou však 1 až 3 g/1 . K tomu může sloužit například přikrmovací medium FS1 (tab.I). Jelikož tento rozsah koncentrace glukózy je dostatečně daleko nad hodnotou “Ks pro glukózu (Bergter Růst mikroorganismů, str.41, nakladatelství Gustav Fischer, Jena 1983), mohou buňky nadále růst při ifaax.

·< ·· «··« *· 4» • · 4 4 4 · · 44 ·· 4 · 4 · · 4 44* • 444 4 «· 444 44 ··♦· ·444 ·♦ 44 444 4444

- 14 Kontrolu a řízení koncentrace glukózy obstarává podle vynálezu automatický nebo poloautomatický systém.

Obzvlášť výhodnými jsou systémy průtočného injekčního analyzátoru v provozu on-line. Cistě ruční nebo do značné míry ručně ovládné systémy se neosvědčily. Konec fed-batch-fáže začíná přibližně mezi 15. až 22. hodinou, závisí nakonec na různých individuelních faktorech, jako je teplota, složení a koncentrace media, velikost reaktoru, avšak obzvláště na druhu použitého kmene E.coli. S výhodou se zapojuje 4 až 8 hodin po začátku fed-batch-fáze syntéza cizího proteinu. Přesný okamžik se řídí však podle dosažené hustoty buněk kultury v daném okamžiku. Hustoty buněk 10 až 80 b/1, s výhodou 20 až 60 g/1 jsou obzvlášť výhodné, pokud má být dosaženo konečné hustoty buněk 100 až 150 g/1. Pro strat syntézy proteinu je všeobecně vhodné, jestliže v okamžiku indukce je přibližně 10 až 60 % hustoty buněk, které má být maximálně dosaženo.

Syntéza proteinů je ovlivněna zapojením regulovatelného promotorového systému. K tomuto zapojení dochází podle použitého systému zpravidla přísadou substance nebo změnou fyzikální veličiny. V případě výhodného lac-systému (promotor, operátor, induktor) přísadou IPTG (isopropylthiogalactopyranosid). Další růst buněk je nyní omezen pouze hromadícím se produktem. Proto je podle vynálezu důležité, že před indukcí nemůže dojít k žádné patrné bazální expresi, která by měla na celkový růst a tím i na celkový výtěžek nepříznivý vliv. Toho se podle vynálezu dosáhne tím, že expresní kazeta v plasmidu je vymezena účinnými terminátorovými sekvencemi.

Od okamžiku přikrmování glukózou se fermentační medium ochuzuje o dusík a fosfát (obr. 3a,b). Aby se zabránilo omezením tohoto druhu, přivádí se dusík a fosfát s výhodou rovněž odpovídajícím kontinuálním způsobem. Dusík se přivádí účelně ve formě amonných solí, jelikož se tím současně může ovlivňo• φ • φ ··

Φ • Φ· Φ • · · · Φ φ • Φ· Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ vat hodnota pH (6,5 až 7,0, s výhodou 6,8). Hodí se například roztok FS2 (tah. I). Subfáze IV se vyznačuje podle vynálezu přiváděním stopových prvků (například bóru, manganu, železa, kobaltu, molybdenu, cínu) ve formě jejich rozpustných solí. Přisazuje se zpravidla kontinuálně konstantní rychlostí. Subfáze V se vyznačuje zmírněným růstem, způsobeným především hromaděním produktu. Kromě toho lze pozorovat nepatrný nárůst koncentrace acetátu. Přesto je akumulace nebo koncentrace acetátu v mediu překvapivě nízká. Přičítá se to specielním podmínkám postupu. Kmeny E.coli s maximálním obohacením acetátu < 5 g/1 během fermentace tento efekt ještě výrazně zesilují.

Výtěžky proteinu kolísají podle druhu proteinu v průměru mezi 2 až 6 g/1. Z nich, opět podle druhu proteinu, je 50 až 95 % biologicky aktivních. V případě fragmentů protilátek se získá více než 80 % zpětně vinutého proteinu. Tyto hodnoty překračují zřetelně porovnatelné způsoby popsané ve stavu techniky.

Popsaným způsobem se dají účinně vyrábět s výhodou při zapojení k tomu zkonstruovaných a přizpůsobených expresních plasmidů fragmenty protilátek, obzvláště miniproti 1átky. Avšak i výroba mnoha jiných proteinů, fuzních proteinů nebo enzymů je způsobem podle vynálezu s výhodou možná. Příklady takových vhodných proteinů jsou hybridstreptokináza, g1ukosedehydrogenáza nebo také proteiny mající vliv na krvácivost, jako například hirudin, thrombin, hementin nebo theromin.

V následující tabulce I se uvádí složení medií; FS1, FS2 a FS3 představují přikrmovací media, kterých se používá v různých subfázích fed-batch-fáze. Ve sloupci A se charakterizuje koncentrace předkultivačního media a ve sloupci B koncentrace hlavního kultivačního media.

Tabulka I:

•	··	...	··♦·		··
• c	·' ·	• ·	•	• ·	•	•
•	··	• ·	···	• ·	··
•	• · · · ·	• ·	·»·	• ·
•	• ·	• ·	•	•	•	•
····	··	··	»··	··	··

Sloučenina A

B FS1 FS2 FS3 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1

1	Na,HP0₄ x2HjO	8,6 xlO³
2	KoHPOa	3,xl0³	16,6 xlO³
3	(NHaLHPOa		4 xlO³		227xl0³
4	(NHálHjPOa				169,5 xlO³
5	NHaCl	1 xlO³
6	NaCl	5 xlO²
7	Kys. citrónová		2,1 xlO³
8	Fe(III)-citrat-hvdrat	60,0	75,0			5 xlO³
9	HjBO₃	³I°	3,8			250
10	MnCb χ 4H₂O	15,0	18,8			125
11	EDTA χ 2H₂O	8/	10,5			700
12	CuCh x 2 HjO	¥	1,9			125
13	Na₂MO₄ x 2 H₂O	2,5	3,1			213
14	CoCl₂ x 6 H₂0	2,5	3,1			213
15	Zn(CH₃COO)₂x 2H₂O	8,0	10			668
16	Glukóza	lOxlO³	25 xlO³	670x10³
17	MgSOa X 7 H₂0	600	1,5 xlO³	19J3xlO³
18	Ampiciilin	100	100

- 17 99 99'' ' ’99 ''' 9 9 9 9ti 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99 • · · · · · · · · ··· ······ «· ··· · · · · · 9 ···· ···· ·· ·· ··· ·«β·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

K vyrobení rekombinantní hostící buňky E.coli se použije prototropního kmene E.coli K12 RV308 (lac74-gaIISII:0P308strA), (Maurer a kol., J. Mol. Biol . 139, str. 147 až 161, 1980; ATCC 31608). Transformace vektorem vhodným k expresi i další potřebné manipulace s DNA se provedou podle standardních metod, pokud není uvedeno jinak. Plasmidu prosté buňky E.coli RV308 se nasadí jako kontrola do odpovídající fermentace s vysokou hustotou buněk. Vektor pHKK se zkonstruuje takto (obr.2): malý fragment MIuI z pAKlOO (Krebber a Pliickthun, 1955) , který obsahuje silný transkribční terminátor tHP (Nohno a kol.) v oblasti upstream“ se vloží do plasmidu pASK40 (Skerra a kol. Biotechnol. 9, str. 273 až 278, 1991). Vložení hok-sok DNA se uskuteční dvěma dalšími klonovacími kroky: gen aphA z pKG1022 (Gerdes K., Biotechnol. 6, str. 1402 až 1405, 1988) se odstraní dvojnásobným pohlcením XhoO a EcoRI, zaplní se polymerázou DNA (Klenovův fragment) a religuje se. Ve druhém kroku se modifikovaný fragment BamHI z pKG1022 klonuje do jediného místa řezu prvního klonovacího produktu. Miniproti 1átka pochází z fragmentu s jediným řetězcem, ve kterém byly variabilní domény ve směru Hh-Vl spojeny flexibilním linkerem Ígly4ser)3, následovaným na prolin bohatou hinge-oblastí a změněnou doménou “helix-turn-helix (dhlx) (Pack a kol. Biotechnol. 11, str. 1271 až 1277, 1993). Sekvence DNA, primer, zesílení a klonování lehkého a těžkého řetězce myšího/humanizovaného MAb 425 je podrobně popsáno v patentovém spise WO 92/15683. K sekreci fragmentu scFv425hdlx do periplasmy byl N-terminál domény Vh nafúzován na signální sekvenci pelB. Vazební místo T7gl0ribosomů (Shine-Dalgarno) se klonuje metodikou PCR do míst řezu Xbal a Sfil pEGl (Strittmatter a kol,1995). Hotová expresní kazeta scFv425dhlx se klonuje mezi místy řezu Xhal a HindlII. Výsledkem je expresní vektor pHKK podle obr. 2.

Příklad 2

Složení medií předběžných kultur v Erlenmayerově baňce, hlavní kultury v tankovém reaktoru s míchadlem (Biostat ED10,B. Braun, Biotech Internát ional, Melsungen, FRG) i přikrmovacích medií FS1 , FS2 a FS3 je uvedeno v tabulce I. Hlavní kultivační medium (8 1 ) se oproti Riesenbergovu mediu (Riesenberg a kol. 1991) modifikuje. Aby se zabránilo srážení, přidávají se přísady v pořadí uvedeném v tabulce I. Glukóza a síran horečnatý se přidají jako zvláštní autoklávovaný roztok. Reako tor se provozuje při teplotě 26 C, tlaku 0,15 MPa, hodnotě pH 6,8 a s průměrnou rychlostí zavzdušnění 10 1/min. K nastavení hodnoty pH se použije 25% vodného roztoku amoniaku. Během fermentace se přidává amoniak a Ucolub N115^R (Fragol Industrieschmierstoffe GmBH, Miihleim/Ruhr FRG) pomocí sensorové kontroly k regulaci hodnoty pH, případně jako protipěnivý prostředek. FS1 se připraví takto: odděleně se rozpustí 750 g glukózy a 22,2 g heptahydrátu síranu hořečnatého ve 600 ml vody, popřípadě v 50 ml vody. Po provedeném autoklávování se roztoky navzájem smísí. FS2 se připraví po rozpuštění 227 g diamoniummonohydrogenfosfátu a 169,5 g amoniumdihydrogenfosfátu ve vodě za přidání 60 ml 25% amoniaku, k nastavení hodnoty pH 6,8 před autoklávováním. FS3 se připraví ze zásobních roztoků v následujícím pořadí: 50 ml roztoku citráthydrátu železitého (6 g/1) , 0,5 ml kyseliny bori té (30 g/1), 0,5 ml tetrahydrátu chloridu manganatého (1O g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu ethylendiamintetraoctové kyseliny (84 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu chloridu měďnatého (15 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu molybdenanu sodného (25 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu chloridu kobaltnatého (25 g/1) a 10 ml roztoku dihydrátu octanu zinečnatého (4 g/1).

Příklad 3

K přeočkovánl 20 ml tekutého LB-media slouží několik

9 9 9* ··'···· · · · · • · ♦ 9 ··· 9 9 9 9 • · · · 9 9 9 9 · · 9 ·

kolonií Petri ho misek, promytých na LB-agar při teplotě 26 C. Po 5-hodinovém protřepávání (200 otáček za minutu, 26 C) se převede 1 ml 100 ml media předběžné kultury do 500 ml baňky a dále se inkubuje. 10 ml této předkultury se použije k přeočkování 100 ml nového media předběžné kultury. Tím se získá 9 předkultur, kterých se použije k přeočkování celkem 8 1 hlavního kulturního media ve fermentoru s počátečním ODeso přibližně 0,2.

Příklad 4

Sestava bioreaktoru o obsahu 10 litrů s příslušenstvím a s kontrolním zařízením je znázorněna na obr. 1. Kultivace v měřítku fermentace s vysokou hustotou buněk probíhá pomocí digitální měřicí a kontrolní jednotky (DCU), multifermentačního kontrolního systému (MFCS) a průtokoměru plynu. Údaje oxidu uhličitého a kyslíku se průběžně měří. Po přeočkování slouží sběrač biovzorků MX-3 (New Brunsvick Scientific, Watford, UK) k odběru aseptických vzorků k umožnění analysy dat off-line ( Webb a kol., Biotechnol. 8, str. 926 až 928, 1990). Kontrolní jednotky udržují rychlost proudění plynu 10 1/min, hodnotu pH 6,8, teplotu 26 C a tlak 0,15 MPa. Dvě kontrolní smyčky zaručují aerobní růstové podmínky při hodnotě p0₂ 20%. Všechny důležité fyzikální veličiny se během celé fermentace sledují a zaznamenávají. Během fed-batch-fáze se udržuje koncentrace glukózy v kultuře na 1,5 g/1. K tomu slouží modifikovaný přístroj průtokové injektované analysy (FIAstar 5020 analyzátor s fotometrem a detekční kontrolní jednotka Tecator AAB, Švédsko) . Detaily tohoto systému a jeho funkce jsou popsány v literatuře (například Pfaff a kol. 1995 v Numack A. Schiigerl L (vydavatelé): Computer Applications in Biotechnology, Elsevier Science Ltd. Oxford, str. 6 až 11). Hustota buněk se vypočítává z měření optické hustoty při 550 nm. Stabilita plasmidu se určuje způsobem, který popsal Packa a kol. (Biotechnol. sv. 11, str. 1271 až 1277, 1993).

Příklad 5

Kvantitativní stanovení syntetizovaných miniproti 1átek se provádí způsobem, který popsal Pack a kol. (Biotechnol. sv. 11, str. 1271 až 1277, 1993). Množství funkceschopných miniprot i látek se sleduje způsobem ELISA, celkové množství na miniprotilátce SDS-PAGE ve 12% polyakrylamidovém gelu podle Laemmliho (1970). Pro ELISY se povrství mikrotitrové destičky lidským receptorem EGFR (například podle WO 92/15683). Vázané miniproti látky se detekují králičím sérem scFv425 peroxidázou konjugovaným kozím protikráličím IgG (Jackson Immunoresearch lne, Sp. st. a.). Výtěžek aktivních miniproti 1átek se vypočte z ředicích řad vyčištěných miniproti 1átek. Při jedné kontrole se ukázalo, že anti-scFv425 králičí sérum nevykazuje žádnou zjistitelnou křížovou reakci s jinými složkami plasmidu prostého surového extraktu

E.coli

RV308. Dále neměla přísada tohoto surového extraktu k ředicí řadě stejné protilátky ve vyčištěné formě žádný účinek na signály ELISA.

Ke stanovení celkováho množství miniproti 1átek byly fotometricky detekovány gely vybarvené brilantní modří

Coomassie a koncentrace miniprotilátek se vypočetla z ředicí řady vyčištěné miniproti látky, která byla oddělena na stejném gelu. Jako kontrola sloužila analogická vsázka, při které bylo použito E.coli hostících buněk, které neprodukovaly žádné miniproti 1átky.

Průmyslová využitelnost

Vysokovýtěžkový způsob výroby rekombinantních proteinů a fragmentů protilátek, obzvláště miniproti 1átek a mnoho jiných prote i nů, fuzn í ch prote i nů nebo enzymů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby cizího proteinu v buňkách E.coli, které byly transformovány cizím genem a indukovatelným plasmidem nesoucím promotor, pomocí fermentace buněk o vysoké hustotě přes stupně batch a fed-batch bez obvyklého omezování růstu substráty nebo metabolickými vedlejšími produkty a izolováním a vyčištěním expresovaného proteinu z kultivačního prostředí, přičemž koncentrace substrátu ve fed-batch-fázi je regulována a/nebo řízena poloautomatickým systémem analýz a přísad, vyznačující se tím, že ve fed-batch-fázi (i) je koncentrace zdroje uhlíku v mediu udržována konstantní v rozsahu 0,1 g/1 až 25 g/1 při zachování neomezeného růstu buněk (π = Unaxb (ii) produkce cizího proteinu v uvedené fed-batch-fázi se zahájí při hustotě buněk 20 až 80 g/1 indukcí promotoru a (iii) po proběhlé indukované synteze produktu se kontinuálně přivádí zužitkovatelný dusík a fosfát i soli stopových prvků, přičemž íiv) v průběhu celé fed-batch-fáze se hodnota pO2 nastaví odpovídajícím přívodem kyslíku do fermentační suspense na 5 až 25 %.
2.

tím,

Způsob podle nároku 1, v y z že koncentrace zdroje uhlíku se načující se během fed-batch-fáze udržuj e konstantní na 1 až 3 g/1.
3.

Způsob podle nároku 2, v tím, že se dus í k, fosfát a stopové prvky přidáváj í při hustotě buněk 50 až 80 g/1 ·

4. tím, Způsob podle nároku 1 že hustota buněk ve až 3, stupn i v y z n a č u jící 60 g/1 . s e ( i i) je 20 až 5. Způsob podle nároku 1 až 4, v y z n a č u jící s e tím, že ve fed-batch-fázi může být dosaženo hustoty buněk

150 g/1.

až

100

- 22 • · ·'· · · ···· • · · · · · · • ·· · · ·« · • · · · · · « · • · · « · · • · · · ·· ·· ···
6. Způsob podle nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že se používá expresního vektoru s expresní kazetou obsahující cizí gen vymezený dvěma terminátořovými sekvencemi.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že použitý expresní vektor obsahuje přídavně sebevražedný systém, s výhodou sebevražedný systém bok-sok.
8. Způsob podle nároku 6 nebo 7,vyznačuj ící se t í m, že se používá cizího gelu kódujícího proti látkový fragment, obzvláště miniproti1átku.
9. Způsob podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že se používá expresního vektoru podle nároku 12 až 16.
10. Způsob podle nároku 1 až 9, vyznačující se tím, že používá kmene E.coli, který akumuluje během fermentační fáze méně než 5g/l acetátu v kultivačním médiu.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se t í m, že se používá kmene E.coli RV308 ( ATCC 316081.
12. Expresní vektor E.coli vhodný k expresi cizích proteinů za podmínek fermentace s vysokou hustotou buněk , vyznačující se tím, že obsahuje tyto význaky:

(i) terminátorovou sekvenci upstream” a downstream”, (ii) systém lac promotor/operátor, (iii) sekvenci T7gl0-Shine Dalgarno, (iv) signální sekvenci pelB nebo ompA, (v) sekvenci cizího genu.
13. Expresní vektor podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že obsahuje přídavně sebevražedný systém, zejména sebevražedný systém hok-sok.
14. Expresní vektor podle nároku 13, vyznačuj ící se tím, že terminátorová sekvence upstream je tHP a terminátorová sekvednce dovnstrean je tLPp
15. Expresní vektor podle nároku 12 až 14, vyznačující se tím, že cizí gen obsahuje sekvenci kódující Vh a řetězec Vl miniproti 1átky.
16. Expresní vektor s označením pHKK podle konstrukčního schéma na obr. 2.
17. Transformovaný expresní hostitel E.coli RV308 [pHKK], zísaktelný transformací RV308 (ATCC 31608) expresním vektorem podle nároku 14.