KR100444735B1 - 세포고밀도발효를통한e.콜라이의재조합단백질제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 재조합 단백질, 특히 재조합 항체 분자, 바람직하기는 소형 항체와 같은 항체 단편을 효과적으로 형성시킬 목적으로, E. 콜라이 숙주/벡터계를 사용하는 유가-배치 발효 방법에 관한 것이다.
주어진 조건하에, E. 콜라이 세포를 최대 비성장율로 매우 높은 세포 밀도까지 성장시킬 수 있다. 재조합 생성물 형성을 가동한 후, 형성된 생성물만이 성장을 제한한다; 기질 또는 대사 부산물 때문에 성장이 제한되지 않는다. 이와 같은 방법을 통하여, 재조합 단백질을 시간적, 공간적으로 높은 수율로 얻을 수 있다.

Description

세포 고밀도 발효를 통한 Ｅ. 콜라이의 재조합 단백질 제조 방법
E. 콜라이 세포를 높은 세포 밀도로 배양하는 것은 재조합 단백질 형성에 필수적이다. 이러한 목적을 위하여 본 분야의 문헌에서는 하기와 같이 배양한다.: E. 콜라이 세포를 배치기(batch phase)에 무제한 배양(μ= μmax)하고, 이어서 유가배치기(fed-batch phase)에, 통상적으로 성장-저해 부산물, 예를 들면 아세테이트가 형성되지 않도록 제한하면서 탄소원(글루코오스 또는 글리세롤)을 계량하여, 결과적으로 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 기질만을 제한(μ< μmax)하면서 E. 콜라이 세포를 계속 성장시킨다(예를 들면, Riesenberg et al., 1991, J. Biotechnol., vol. 20, 17-28; Strandberg et al., 1994, FEMS Microbiol. Rev., vol. 14, 53-56; Korz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65; EP-B-0 511 226). 자연적으로 감소된 성장률로 성장하면, 발효 기간이 오래 걸리며, 결과적으로, 시간 공간적으로 수율이 감소한다. 탄소원은 즉각적으로 소모되므로, 상기 발효시 배양액 중 탄소원 농도는 실질적으로 0 이다. 재조합 생성물 생성을 가동한 후 기질-제한 조건은 변화시키지 않는다.
E. 콜라이를 사용하는 유가 배치 배양법이 또한 공지되어 있다. 이 방법에 따르면, 배양시에 탄소원은 비교적 넓은 시간 간격으로 비교적 다량을 불연속 첨가하고, 일반적으로 pO2값 상승은 탄소원을 연이어 새로 넣기 위한 기질 소모의 표지이다.(예를 들면, Eppstein et al., 1989, Biotechnol. 7, 1178-1181). 상기 방법은 비교적 장기간의 기질 과량 조건에서 기질 제한 조건으로 빈번한 전환을 의미하며, 결과적으로 대사 불균형을 의미한다.
하기는, 세포가 유가 배치 기에서 최대 비성장율(μ= μmax)로 성장할 수 있는 유가 배치 배양에 관한 것이다. 오프-라인 발효에 따라, 기질을 제한하지 않을 목적으로 비교적 다량의 탄소원을 비교적 넓은 시간 간격으로 배양액에 첨가하는유가 배치 배양은 실험시 노력이 많이 들고, 탄소원 농도가 전체 발효동안 끊임없이 변화한다는 단점이 있다(예를 들면, Pack et al., 1993, Biotechnol., vol. 11, 1271-1277, Hahm et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 100-107).
탄소원 농도가 온-라인 측정되고 조절되어 제한되지 않는 유가 배치 배양액이 또한 공개되어 있으나, 이러한 배양액(특히, 세포 고밀도 지역에서)은 하기의 단점을 갖는다. 교반 탱크 발효조의 미생물 발효용 고압 멸균성(autoclavable) 글루코오스 바이오센서가 최근 개시되었다(M.R. Phelps et al., 1995, Biltechnol. Bioeng., vol. 46, 514-524). 이것은 E. 콜라이 배양을 위하여 사용된다. 이 원 위치(in situ)의 센서는, 약 2분의 시간 지연이 있기는 하지만 함께 배양액의 현재값을 제공한다. 글루코오스 센서에 의하여 제공되는 신호는 특히 pH 및 pO2에 의존적이다. 센서는 세포 밀도가 높은 영역(X > 80g/l)에서 실험하지 않았다. E. 콜라이가 사용되는 경우, 원 위치 탐침에서의 성장 때문에, 매우 높은 세포 밀도에서 잘못된 값이 나타날 수 있다는 것이 경험적으로 알려져 있다. 또한, 발효 진행동안 센서를 정확히 재보정할 수 없다. 다른 방법으로는, 원 위치(in-situ) 센서를 사용하여 측정하는 대신, 여과 또는 마이크로원심분리를 통하여 반-연속적으로 발효조로부터 제거되어 세포가 없는 배양액 중에서, 예를 들면 온-라인 흐름 주입 분석기(FIA) 또는 온-라인 HPLC를 사용하여 탄소원을 측정한다(Kleman et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 910-917 및 918-923; Turner et al., 1994, Biotechnol. Bioeng. 44, 819-829). 예측(prediction) 및 피이드백 조절 알고리즘을 통하여, X=65g/l 까지 성장하는 동안 글루코오스 농도 변동이 감소하였다(Kleman et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol., vol. 57, 910-917). 세포 농도가 매우 높은 영역(약 80g/l 내지 150g/l)에서는, 세포와 영양액을 분리하기가 어렵고 시간이 더욱 많이 소모되므로, 발효조 내의 현재 글루코오스 값을 결정하는 데 걸리는 시간 지연도 바이오매스에 의존하여 증가하게 되어 글루코오스 수준을 일정하게 유지하는 것이 더욱 어렵거나 불가능하다. 대조적으로, 이러한 세포 분리를 하지 않는 장치를 사용하여, 일정하고 짧은 시간 지연으로 글루코오스 농도를 측정한다(Pfaff et al., 1995, pp.6-11, in: Proceedings of the 6th International Conference on Computer Appl. in Biotechnol. Garmisch Partenkirchen, FRG). 문헌(Pfaff et al.,)의 방법에 따르면, 성장 저해제로 배양액을 희석한 후, 효소-전류법 글루코오스 센서를 갖는 FIA를 샘플링 부위 부근에서 사용한다.
호기성 배양시, 기질-제한법으로 성장시키기 위한 적량 규제가 없는 E. 콜라이 세포는, 통상적으로 대사 부산물인 아세테이트를 증가된 정도로 생성하며(Riesenberg 1991, Curr. Opinion Biotechnol., vol. 2, 380-384), 상기 아세테이트는 영양액 중에 축척되어 비교적 다량으로 존재하게 되면, 성장-저해 효과를 나타낸다(Pan et al. 1987, Biotechnol. Lett., vol. 2, 89-94). 이와 같은 이유로, 종래에는, 특정 유전자 변형을 통하여 아세테이트 축척이 감소되는 특별한 E. 콜라이 주를 사용해서만 유가 배치 배양액의 세포 밀도를 높일 수 있었으나, 이와 관련되는 다른 단점이 있었다. 그러나, E. 콜라이 K12의 자손에는,글루코오스/미네랄 염 배지에서 성장이 크게 감소하는 포스포트랜스아세틸라아제-음성 돌연변이체(Bauer et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol., vol. 56, 1296-1302; Hahm et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, 100-107)가 포함된다. Phelps 및 공동 연구자(상기 참조)는 숙주로서 E. 콜라이주 TOPP5를 사용하여 바이오매스 X=85g/l까지 비-기질-제한 배양 하였다. 그러나, 알려진 방식으로 아세테이트가 축척되지 않는 이러한 E. 콜라이주는 E. 콜라이 K12주가 아니다. E. 콜라이 TOPP5는 헤모라이신을 형성하므로, 안전성 때문에 산업 부문에서 재조합 DNA 산물 생성 숙주로 사용하기에 적당하지 않은 병원주이다. 아세토락테이트 신타아제(ALS)를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이 세포를 형질전환함으로써, 특히 중간 대사(intermediary metabolism)조절에 의하여 아세테이트 축척을 감소시킬 수 있다(San et al., 1994, in: Ann.N.Y. Acad.Sci., vol. 721, 257-267). 그러나, 이러한 방법은, ALS-암호화 플라스미드를 "생산(production)" 유전자를 운반하는 제 2 플라스미드와 조합하여 높은 세포 밀도 조건 하에서 사용하는 경우, 일반적으로 불안정하다는 단점이 있다. 재조합 생성물 생성 효율은 플라스미드의 불안정성으로 인하여 종종 감소하는데, 이는 배양액이 세포 고밀도가 되면 높아진다.
Fab', F(ab')2, 소형항체 또는 단일-사슬 Fv's와 같은 항체 및 항체 단편은 의학 및 생물공학분야에서 중요성이 증대되고 있다. 하기에서, 소형 항체는 본 발명에 따라, 가경첩 영역(pseudohinge region)에 의하여 연결되는 2가 또는 2 특이 단일-사슬 Fv 단편으로 이해되어야 한다. 이 때문에, 예를 들면 암 치료시 이용 가능한 항체(약, 1g/1회용량)를 다량 만드는 것이 중요하다. 이와 관련하여, 1가 항체 단편 또는 상기 단편의 융합 단백질, 또는 이의 다중 결합성 또는 다중 특이 변이체를 특히 E. 콜라이에서 용이하고 만족스럽게 제조할 수 있다. 상기 단편 또는 변이체는 고도의 특이 결합능과 관련되는 소형이다(E.g. Pluckthun A., 1992, Immunol. Rev. 130, 151-188; Pack et al., 1995, J.Mol. Biol. 246, 28-34). 그러나, 단백질 및 항체는 특히, 생물학적으로 그리고 기능적으로 활성이 되도록 바람직하게 접혀야 한다. 세포당 형성된 항체 단편 수율을 고려하는 경우, 세포 밀도와 관련하여 이러한 문제에 주의를 기울여야 한다. 또한, in vitro에서의 수율 및 in vivo에서의 접힘을 결정할 때 항체의 1차 서열이 중요하다(Knappik A. 및 Pluckthun A.,1995, Protein Engin. 8, 81-89). 따라서, 예를 들면 Fab 단편은 불용성 세포질 또는 세포형질 집합체로 발현되고 in vitro에서 다시 접힌다. 따라서, 불용성 항체 수율은 낮은 세포 밀도에서 약 0.14g/l(Condra et al., 1990, J.Biol. Chem. 265, 2292-2295) 및 중간의 세포 밀도에서 약 1-2g/l(Shibue et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 770-775)로 보고되었다. 또한, 생물학적 기능형 E. 콜라이에서는 2가 소형 항체(Pack et al., 1993, Biotechnol. 11, 1993, 1271-1277)를 약 0.2g/l의 수율로 얻을 수 있다. 평균적으로, 수율의 약 5-45%가 바람직하게 다시 접힌다.
공지된 E. 콜라이계에서, 대체로, 적절한 세포 밀도에 도달한 후, 발현 계에 상응하는 조절가능한 프로모터계에 의하여, 적당한 방법으로 외래 단백질 생성이 시작된다. 본 명세서에 언급할 수 있는 프로모터계의 예로는, (i) AraC억제제(repressor)의 존재하에 araBAD 프로모터(아라비노우즈에 의하여 유도 가능)(예를 들면, Better et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 90, 457-461), (ii) phoA 프로모터(포스페이트를 줄여 유도 가능)(예를 들면, Carter et al., 1992, Biotechnol. 10, 163-167) 및 (iii) lac 프로모터 계(IPTG에 의하여 유도 가능)(Pack et al., 1993, loc. cit.)를 들 수 있다. lac 계는 대체로 발현이 우수하나, 한편으로 프로모터 유도 전에 바람직하지 못한 기저 발현(basal expression)이 관찰되고, 다른 한편으로 IPTG로 유도 후 플라스미드 불안정성이 관찰된다는 단점이 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 외래 유전자로서, 쥐 또는 인간화된 항체 Mab 425 단편을 암호화하는 서열을 함유하는 특별한 벡터(pHKK)가 기재되어 있다. Mab 425(ATCC HB 9629)는 공지된 인간 A432 암세포선(ATCC CRL 1555)으로부터 분리된 쥐의 모노클로날 항체이며, 인간 상피 성장 인자 수용체(EGFR, 약 170kD의 당단백질) 에피토프에 결합하나, 자연 리간드 EGF의 결합을 저해한다. Mab 425는 종양 세포에 대하여 세포 파괴 효과를 갖거나, 이러한 세포의 성장을 방해할 수 있다(Rodeck et al., Cancer Res. 1987, 47: 3692). WO 92/15683에는, 경사슬 및 중사슬의 DNA 및 아미노산 서열을 포함하여, 인간화된 가상의 Mab 425(chimeric form)가 개시되어 있다.
본 발명의 목적은, 기질 또는 대사 산물이 실질적으로 성장을 저해하지 않고 플라스미드가 크게 손실되거나 불안정하지 않으며, 발현 단백질이 고도의 생물학적 활성(결합능 및 올바른 접힘)을 효과적으로 나타내도록 재조합 E. 콜라이 세포 내에서 고밀도 조건(HCDC=세포 고밀도 배양)하에서, 시간 공간적으로 높은 수율로, 외래 단백질, 특히 항체 단편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법은, 세포가 전체 배치동안 최대 성장률로 성장할 수 있다는 점에서 우선적으로 주목 가능한 다단계 배치 방법이다(μ= μmax). 따라서, 기재된 방법으로, 100 내지 150g/l(건조 바이오매스)의 궁극적인 세포 밀도를 얻을 수 있다. 또한, 아세테이트 축척에 의하여 성장이 크게 저해되지 않았는데, 놀랍게도 특히 선택된 조건하에서, 특히 발효시 감소된 양의 아세테이트를 생성하는 E. 콜라이주를 사용하는 경우에는 아세테이트 축척이 나타나지 않기 때문이다. 또한, 일련의 부가적인 다른 방법과 관련하여, 1차적으로 우선, 배치기에 이은 유가 배치 기에 세포의 무제한 성장을 유지하고 배지내 탄소원 농도를 정의된 범위로 유지함으로써 이를 달성할 수 있다. 적절한 발현 벡터를 적당한 방법으로 설계함으로써, 조절 가능한 프로모터 계를 사용하여 단백질 합성을 가동하기 전에 바람직하지 못한 단백질 기저 발현이나 플라스미드 손실도 실질적으로 없앨 수 있다. 이는, 때때로 실제 발생하고 있으며, 이미 상기한 바와 같이, lac 프로모터 계와 같은 강한 프로모터를 사용하는 발현계에서 일반적으로 관찰할 수 있다.
총 배양 시간 약 25 내지 35 시간 후, 단백질 수율 평균 3 내지 5g/l을 얻을 수 있다. 접힘으로 인하여 특히 중요한 항체 단편, 특히 소형 항체의 경우, 합성된 물질의 약 80%가 생물학적으로 활성이고 올바르게 접힌다.
결과적으로, 본 발명은, 외래 유전자 및 유도 가능한 프로모터를 운반하는플라스미드로 형질전환된 E. 콜라이 세포에서, 배치 및 유가 배치 단계에 의한 세포 고밀도 발효를 통하여, 기질 또는 신진대사 부산물에 의한 어떠한 성장 제한 및 배양 배지로부터 발현된 단백질의 분리 및 정제없이, 유가 배치기의 기질 농도를 연속적으로, 자동화 또는 반자동화 분석 및 첨가 시스템을 통하여 조절하여 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 유가 배치기에 i) 배지 내 탄소원 농도를 0.1g/l 내지 25g/l 범위로 일정하게 유지하면서 세포 무제한 성장(μ= μmax)을 유지하고 ii) 10 내지 80g/l의 세포 밀도에서 프로모터를 유도함으로써 상기 유가 배치기에서 외래 단백질 제조를 시작하고, iii) 생성물 합성 유도 후, 이용 가능한 질소 및 포스페이트 및 미량원소의 염을 연속적으로 공급하고, iv) 산소를 적당한 방법으로 발효 브로스에 통과시켜, pO2값을 유가 배치기의 전기간 동안 5 내지 25%로 조절한다.
본 발명에 따른, 유가 배치기동안 탄소원의 필요한 농도값은 0.1g내지 25g/l의 범위이다. 0.5 내지 15g/l의 범위가 바람직하고, 1.0 내지 5g/l 또는 1.0 내지 3g/l가 특히 바람직하다. 1.5g/l가 특히 바람직한 농도이다. 바람직한 탄소원으로는 글루코오스 또는 글리세롤 또는 상기 두 화합물의 혼합물을 들 수 있다. 본 발명에 따라, 탄소원을 연속적인 방법(온-라인)으로 자동화 또는 반-자동화 첨가 및 분석 시스템을 사용하여 첨가한다. 온-라인 흐름 주사 분석 시스템(FIA)을 사용하는 것이 바람직하다.
사용 가능한 질소, 바람직하기는 질소 암모늄, 포스페이트, 예를 들면 인산수소 이암모늄 또는 인산 이수소 암모늄과, 미량 원소, 예를 들면 배지안에서 용해성인 붕소, 망간, 구리, 몰리브덴, 코발트, 철 또는 아연의 염은, 세포밀도 약 50 내지 80g/l(건조 바이오매스), 바람직하기는 약 70g/l, 총 성장률 100 내지 150, 바람직하기는 약 140g/l에서, 배치기 이후, 바람직하기는 조절 가능한 프로모터를 사용하여 단백질 합성을 가동한 후의 유가 배치기에 공급한다.
본 발명에 따르면, 세포 밀도 10 내지 80g/l, 바람직하기는 20 내지 60g/l; 특히 바람직하게는 40 내지 50g/l에서, 조절 가능한 프로모터계를 활성화하여 단백질 합성을 가동한다.
유가 배치기 동안, 산소 부분압은 5 내지 25%, 바람직하기는 15 내지 25%, 특히 바람직하기는 20%이다.
본 발명에 따르면, 발효 배지의 pH는 배치 전 기간동안 6.5 내지 7.0, 바람직하기는 6.7 내지 6.9, 특히 6.8로 조절해야 한다.
또한, 본 발명은, 외래 유전자를 함유하고 두 종료 암호 서열이 측면에 위치하는 발현 카세트를 갖는 발현 벡터의 사용 방법에 관한 것이다. 특히 상류에 위치한 상기 종료 암호 서열은, 프로모터 계를 사용하여 발현을 가동하기 전에 원하지 않는 단백질이 발현되는 것을 성공적으로 억제한다. 종료 암호 thp(Nohno et al., 1988, J. Bacteriol. 170, 4097-4102)가 특히 적합하나, 다른 공지된 종료 암호 서열도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 사용되는 발현 벡터가 추가적으로 자멸계(suicide system)를 함유하는 방법에 관한 것이다. 자멸계는, 해당 플라스미드가 세포 내에 존재하지 않는 경우, 세포에 독성인 단백질을 생성한다. 적당한 자멸계는 문헌에 공지되어 있다. 특히 본 발명에 적당한 자멸계는 hok-sok계(예를 들면, Gerdes K., 1988, Biotechnol. 6, 1402-1405)이다. 따라서, 재조합 단백질, 특히 항체 분자의 효과적인 생산 방법에서는, 숙주/벡터계가 세포 고밀도 영역에서 플라스미드 안정성이 높고 재조합 기저 발현이 낮으며 생성물이 우수하게 형성되는 것이 중요하다. 이 때, 종료 암호가 측면에 위치하는 재조합 발현 카세트와 조합한 자멸계는 벡터-특이적이다.
또한, 본 발명은, 항체 단편, 특히 소형 항체를 암호화하는 외래 유전자의 사용 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 추가로 하기 특징을 갖는 발현 벡터의 이용 방법에 관한 것이다.
원칙적으로, 공지되어 있으며 재조합 기술 및 산업적 규모로 생산하기 적당한 대부분의 E. 콜라이 주를 사용할 수 있다. 바람직하기는, 세포 고밀도로 성장하는 동안 아세테이트를 비교적 거의 축적하지 않는 균주를 사용하는 것이 유리하다. 특히, 아세테이트 축척이 5g/l 미만인 균주가 적당하다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법의 조건을 선택하여, 아세테이트 축척을 낮출 수 있다. 이런 점에서 특히, 공지되어 있으며 상업적으로 이용 가능한 E. 콜라이 주 RV308(ATCC 31608) 및 동일한 작용을 하는 이의 변형체가 특히 적합하다.
따라서, 본 발명은 특히, 발효동안 배양 배지에서의 아세테이트 축척이 5g/l미만인 E. 콜라이주의 사용 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 세포 고밀도 발효 조건 하에서 외래 단백질을 발현시키기 적합하며 하기의 특징:
(i) 상류 종료 암호 서열 및 하류 종료 암호 서열
(ii) lac 프로모터/오퍼레이터 계
(iii) T7g10 Shine Delgarno 서열
(iv) pelB 또는 ompA 신호 서열
(v) 외래 유전자 서열
및 바람직한 실시 형태에서, 자멸계, 특히 hok-sok 자멸계를 갖는 E. 콜라이 발현 벡터에 관한 것이다:
또한, 본 발명에 따르면, 프로모터 계를 상기와 같은 다른 적당한 계로 바꿀 수 있다. 또한, 본 발명에 동일한 작용을 하는 다른 신호 서열 및 조절 서열이 포함될 수도 있다.
마지막으로, 본 발명은, Mab 425로부터 유래한 소형 항체 서열을 함유하며 구조를 통하여 정의되는 발현 벡터 pHKK(도 2), 및 특정 실시 형태로서 특별한 재조합 E. 콜라이 숙주 RV308[pHKK]에 관한 것이다.
본 발명은, 재조합 단백질, 특히 재조합 항체 분자, 특히 소형 항체(miniantibodies)와 같은 항체 단편을 효과적으로 형성시키기 위하여 특별한 E. 콜라이 숙주/벡터계를 사용하는 유가 배치(fed-batch) 발효 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조건 하에서, E. 콜라이 세포는 최대 비성장율(maximum specific growth rate)로 매우 높은 세포 밀도까지 성장할 수 있다. 재조합 생성물을 형성한 후, 성장을 제한하는 효과를 갖는 것은 형성된 생성물 뿐이다. 기질 또는 신진 대사 부산물은 성장을 제한하지 않는다. 이러한 목적으로 특별히 변형시킨 안정성이 우수한 신규 발현 벡터와 함께 이런 방식으로, 특히 항체 단편의 경우 생물학적 활성이 우수한 재조합 단백질을 시간-공간적으로 높은 수율로 얻을 수 있다.
도 1은 세포 고밀도 조건하에서의 단백질 제조용 생물 반응로 실험 장치이다. 시스템에는 측정 장치, 표시 장치, 조절 장치 및 계량 장치가 구비되어 있다.
도 2는 최적화된 발현 벡터 pHKK 및 이 구조체의 구성부이다. 벡터는 공지된 벡터 pASK40, pAK100 및 pKG1022로부터의 구성부로 이루어지는 것이 필수적이다.
도 3(a-d)는, 예를 들어 E. 콜라이 RV308[pHKK]를 사용하여 재조합 E. 콜라이를 HCD 배양한 것으로, 바이오매스, 글루코오스, 질소 암모늄, 포스페이트, 아세테이트, 교반기의 속도, pO2, 배출 가스의 O2및 CO2, 플라스미드 안정성(β-락타마아제-양성 콜로니의 %로 기재) 및 단백질 형성(이 경우, scFv425dhlx)을 시간 경과에 따라 나타낸다. 배치 및 유가 배치기는 다섯 개의 세부 기간(sub-phases)으로 나뉜다. IPTG 화살표는 단백질 생산을 나타낸다.
본 발명에 따른 방법은 형질 전환된 E. 콜라이 숙주 세포를 사용한다. 발현시키려는 단백질의 성질에 따라 플라스미드 구조체를 선택한다. 특히 바람직한 플라스미드 구조체는 하기 특징을 갖는다. 플라스미드 구성 및 숙주 세포 형질전환에 필요한 기술 및 방법은 모두 공지되어 있으며, 문헌(예를 들면, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)에 상세히 기재되어 있다. 추가로, 본 발명의 특정 실시 형태를 사용하여 예를 들어 설명한다. 원료(starting) 플라스미드 또는 플라스미드 일부는 상업적으로 입수하거나, 공지된 구성 계획을 기초한 표준 방법을 사용하여 용이하게 구성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 형질 전환된 E. 콜라이 세포의 전형적인 발효기인 선행 배치기는 두 기간으로 나뉜다. 접종하여 적당히 예비 배양한 후, 세포 적응에 이어 성장률 μ가 μmax까지 도달하는 기간 I은 지체기(lag phase)임을 특징으로 한다. 기간 II동안, 세포는 μ= μmax로 지수함수적으로 성장한다. pO2가 100% 포화로부터 5 내지 15% 이하로 감소한 후, pO2교반기의 속도를 조절함으로써 바람직하기는 15 내지 25%, 바람직하기는 약 20%로 pO2값을 조정한다(도 3c). 주 배양 발효를 시작한 약 6 내지 12시간 후에 이러한 조정(순수 산소가 풍부한 공기에 통과시킴)을 실시해야 한다. 초기에 20 내지 35g/l인 것이 바람직한 글루코오스 농도는, 유가-배치기 이전의 배치기 말기를 구성하는 기간 II의 말기에 감소한다. 이와 관련하여, 글루코오스 농도값은 어떤 환경에서도 0.1g/l 이하로 감소하지 않도록 한다. 이후에는, 글루코오스를 적당히 공급하여 글루코오스 농도가 0.1g/l 이하로 감소하는 것을 방지한다(기간 III, 도 3a, 유가-배치기의 시작). 본 발명에 따르면, 글루코오스 값은 0.1 내지 25g/l, 바람직하기는 1 내지 3g/l로 일정하게 유지한다. 예를 들면, 공급 배지 FS1(표 1)를 상기 목적을 위하여 사용할 수 있다. 상기 글루코오스 농도 범위는 글루코오스의 Ks값[Bergter, 1983, "Wachstum von Mikroorganismen(Growth of microorganisms)", p.41, Gustav Fischer Verlag, Jena]보다 훨씬 크기 때문에, 세포는 μmax로 계속 성장할 수 있다. 본 발명에 따르면, 자동화 또는 반자동화 시스템을 사용하여 글루코오스 농도를 모니터하여 조절한다. 온-라인 작동하는 흐름 주사 분석기 시스템이 특히 적당하다. 완전히 수동이거나 대체로 수동인 시스템은 부적절한 것으로 밝혀졌다. 유가-배치기는 약 15 내지 22시간 후에 개시되나, 궁극적으로는 온도, 배지 조성, 배지 농도, 반응기 크기 등에 달려 있으며, 특히 사용되는 E. 콜라이주의 성질에 따라 다르다. 유가-배치기 개시 약 4 내지 8시간 후에 외래 단백질 합성을 가동하는 것이 유리하다. 정확한 시간은 궁극적으로 그 시간의 배양액의 세포 농도에 달려 있으나, 이 시간 정도면 이미 도달하여 있다. 최종 세포 밀도가 100 내지 150g/l에 달하도록 하려면, 10 내지 80g/l, 바람직하게는 20 내지 60g/l의 세포 밀도가 특히 바람직하다. 따라서, 일반적으로, 도달하려는 최대 세포 밀도의 약 10 내지 60%가 존재하는 유도 시간에 단백질 합성을 개시하는 것이 바람직하다.
조절 가능한 프로모터계를 가동(switching on)함으로써 단백질을 합성한다. 대체로, 사용하는 계에 따라, 기질을 가하거나 물리량을 바꿈으로써 상기 가동을 수행한다. 바람직한 lac계의 경우(프로모터, 오퍼레이터 및 유도인자), IPTG(이소프로필 티오갈락토피라노사이드)를 첨가함으로써 가동을 수행한다. 이제, 축척 생성물에 의해서만 추가의 세포 성장이 제한된다. 이와 같은 이유로, 본 발명에 따르면, 전체 성장에 바람직하지 못한 영향을 미쳐, 수율에도 바람직하지 못한 영향을 미치는 어떠한 상당한 기저 발현도 유도전에 발생할 수 없다. 이를 위하여 본 발명에서는, 효과적인 종료 암호 서열이 플라스미드의 발현 카세트의 측면에 위치하도록 설계한다.
글루코오스 공급을 시작하는 시점으로부터 발효 배지에는 질소 및 포스페이트가 감소한다(도 3a, b). 어떤 성질이 제한되지 않도록, 질소 및 포스페이트를 적당한 방법을 통하여 연속적으로 공급하는 것이 바람직하다. 질소는 암모늄 염의 형태로 공급하면 pH(6.5 내지 7.0, 바람직하기는 6.8) 효과도 동시에 나타날 수 있으므로 편리하다. 예를 들면, FS2 용액이 적당하다(표 1). 본 발명에 따르면, 세부 기간 IV는 미량 원소(예를 들면, 붕소, 망간, 철, 코발트, 몰리브덴 및 아연)가 이의 용해성 염의 형태로 공급되는 것이 특징이다. 대체로, 일정한 속도로 연속적으로 첨가하는 것이 효과적이다. 세부 기간 V는 주로 생성물 축적으로 인하여 성장이 감소하는 것이 특징이다. 또한, 아세테이트 농도가 약간 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 그러나, 배지 내에서 아세테이트 축척 및 아세테이트 농도는 매우 낮다. 이것은 또한 특별한 방법상의 조건 때문이다. 발효동안 최대 아세테이트 < 5g/l인 E. 콜라이주는 상기 효과를 더욱 크게 강화한다.
단백질의 성질에 따라, 단백질 수율은 평균 2 내지 6g/l로 다양하다. 역시 단백질의 성질에 따라, 이 중 50 내지 95%가 생물학적으로 활성이다. 항체 단편의 경우, 얻어진 단백질의 80% 이상이 다시 접힌다. 이러한 값은 이전에 본 분야에서 개시된 방법에 따른 값을 훨씬 상회한다.
항체 단편, 특히 소형 항체를 효과적으로 형성하기 위하여, 이러한 목적으로 특별히 설계 및 변형된 발현 플라스미드를 포함하여 기재된 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 많은 다른 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 유리하게 제조할 수도 있다. 이러한 적당한 단백질은 혼성 스트렙토키나아제 및 글루코오스 디히드로게나아제, 또는 히루딘, 트롬빈, 헤멘틴(hementin) 또는 테로민(theromin)과 같은 혈액 응고에 영향을 미치는 다른 단백질을 예로 들수 있다.
배지 조성물(FS1, FS2 및 FS3은 유가 배치기의 여러 다른 기간에 사용되는 공급 배지를 구성)
화합물 예비 배양배지(mg/l) 주 배양배지(mg/l) FS1(mg/l) FS2(mg/l) FS3(mg/l)
1 Na2HPO4x2H2O 8.6x103
2 K2HPO4 3x103 16.6x103
3 (NH4)2HPO4 4x103 227x103
4 (NH4)H2PO4 169.5x103
5 NH4Cl 1x103
6 NaCl 5x102
7 시트르산 2.1x103
8 수산화 시트르산철(III) 60.0 75.0 5x103
9 H3BO3 3.0 3.8 250
10 MnCl2x4H2O 15.0 18.8 125
11 EDTAx2H2O 8.4 10.5 700
12 CuCl2x2H2O 1.5 1.9 125
13 Na2MoO4x2H2O 2.5 3.1 213
14 CoCl2x6H2O 2.5 3.1 213
15 Zn(CH3COO)2x2H2O 8.0 10 668
16 글루코오스 10x103 25x103 670x103
17 MgSO4x7H2O 600 1.5x103 19.8x103
18 암피실린 100 100
실시예 1
원시형(prototrophic) E. 콜라이 K12주 RV308(lac74-galISII: OP308strA)(Maurer et al., 1980, J.Mol. Biol. 139, 147-161; ATCC 31608)를 사용하여 재조합 E. 콜라이 숙주를 제조하였다. 달리 설명이 없는 경우, 표준 방법을 통하여, 발현에 적당한 벡터로 형질 전환하고, 모든 다른 필수적인 DNA 조작을 행하였다. 상응하는 고밀도 세포 발효의 대조물로서 플라스미드가 없는 E. 콜라이 RV308 세포를 사용하였다.
벡터 PHKK를 도 2와 같이 구성하였다.: lac p/o의 상류 영역에 강력한 전사 종료 암호 tHP(Nono et al., 상기 참조)를 함유하는 pAK100 유래의 작은 MluI 단편(Krebber 및 Pluckthun, 1995)을 플라스미드 pASK40(Skerra et al., 1991, Biotechnol. 9, 273-278)에 삽입하였다. hok-sok DNA를 추가의 두 클로닝 단계를 통하여 삽입하였다.: pKG1022(Gerdes, 1988, 상기 참조) 유래 aphA 유전자를 XhoI 및 EcoRI로 이중 소화하여 제거하고, DNA 폴리머라아제 I(Klenow 단편)로 채워 재결찰하였다. 제 2 단계로, pKG1022 유래의 변형된 BamHI 단편을 제 1 클로닝 생성물의 단일 BamHI 절단 부위에 클론하였다. 소형 항체는, VH-VL방향의 가변성 도메인을 가요성 연결기 (gly4ser)3, 이어서 프롤린-풍부 경첩 영역 및 변형된 헬릭스-회전-헬릭스 영역(helix-turn-helix domain, dhlx)이 연결된 단일-사슬 ab 단편에서 유래한다(Pack et al., 1993, Biotechnol. 11, 1271-1277). 쥐/인간화 Mab 425의 경사슬 및 중사슬의 DNA 서열, 프라이머, 증폭 및 클로닝은 WO 92/15683에 상세히 기재되어 있다. 세포질 주위로 scFv425dhlx 단편이 분비되도록 하기 위하여, VH도메인을 pelB 신호 서열 N-말단에 융합하였다. T7g10 리보솜 결합 부위(Shine Dalgarno)를 PCR 방법으로 pEG1의 XbaI 및 SfiI 절단 부위(Strittmatter et al., 1995)에 클론하였다. 최종적으로 완성된 scFv425dhlx 발현 카세트를 XhaI 및 HindIII 절단 부위 사이에 클론하여, 도 2의 발현 벡터 pHKKK를 얻었다.
실시예 2
삼각 플라스크에서의 예비 배양 배지 조성물, 교반기 메카니즘(Biostat ED10, B. Braun, Biotech International, Melsungen, FRG)을 장착한 탱크 반응기 중에서의 주배양액 조성물, 및 FS1, FS2 및 FS3의 공급 배지 조성물을 표 1에 기재하였다. 주배양 배지(8 l)는 Riensenberg 배지[Riensenberg et al. 1991(상기 참조)]와 비교하면 변형되었다. 침전을 막기 위하여, 구성물을 표 1의 순서로 첨가하였다. 글루코오스 및 마그네슘 설파이트는 고압 멸균된 용액(autoclaved solution)으로서 개별적으로 첨가하였다. 반응기를 26℃, 압력 0.15MPa, pH 6.8 및 평균 공기 혼입 속도 10 l/분으로 작동시켰다. 25% 암모니아 수용액을 사용하여 pH를 조절하였다. 발효 동안, 센서를 조정하여, 암모니아를 첨가하여 pH를 조절하고 Ucolub N115(Fragol Industrieschmierstoffe GmbH, Muhleim/Ruhr, FRG)를 첨가하여 거품을 제거하였다. FS1은 다음과 같이 제조하였다.: 750g의 글루코오스 및 22.2g의 MgSO4x7H2O를 개별적으로 600ml의 H2O 및 50ml의 H2O 에 각각 용해시켰다. 상기 용액을 고압 멸균후 서로 혼합하였다. FS2는 (NH4)2HPO4227g 및 (NH4)H2PO4169.5g을 물에 용해시키는 동시에 25% NH360ml를 첨가하여 고압 멸균 이전에 pH를 6.8로 조절함으로써 제조하였다. FS3은 하기 순서: 시트르산철(III) 수화물 50ml(6g/l), H3BO30.5ml(30g/l), MnCl2x4H2O 0.5ml(10 g/l), EDTAx2H2O 0.5ml(84 g/l), CuCl2x2H2O 0.5ml(15 g/l), Na2MoO4x2H2O 0.5ml(25 g/l), CoCl2x6H2O 0.5ml(25 g/l) 및 Zn(CH3COO)2x2H2O 10ml(4 g/l)로, 모용액으로부터 제조하였다.
실시예 3
26℃ LB 아가에서 성장시킨 몇 개의 콜로니를 페트리 접시로부터 수집하여 액상 LB 배지 20ml에 과량 접종(overinoculate)하였다. 5시간동안 흔들어 주고(200rpm, 26℃), 이어서 1ml를 500ml 플라스크의 100ml 예비 배양 배지에 옮긴 후, 추가로 배양하였다. 상기 예비 배양액 10ml를 사용하여, 새로운 예비 배양 배지 100ml에 과량 접종하였다. 이런 방법으로, 함께 사용되는 9개의 예비 배양액을 제조하여, 발효조 내의 주배양 배지 8 l에 초기 OD550≒0.2로 과량 접종하였다.
실시예 4
도 1과 같이 부속물, 조절 장치 및 10 l 생물 반응로를 설치한다. 디지털 측정 및 조절 단위(DCU), 다중발효조 조절 시스템(MFCS) 및 가스 흐름 조절 단위를 사용하여 세포 고밀도 발효 규모로 배양하였다. CO2및 산소 배출을 계속적으로 측정하였다. 과량 접종 후, 생물 시료 수집기 MX-3(New Brunswick Scientific, Watford, UK)를 사용하여 무균 시료를 수집하고 오프-라인 데이터 분석(Webb et al., 1990, Biotechnol. 8, 926-928)하였다. 조절 단위를 투입 가스 유량 10 l/분, pH 6.8, 온도 26℃, 및 압력 0.15MPa로 유지시켰다. 두가지 조절 루프를 통하여 호기성 성장 조건이 pO220%로 보장된다. 중요한 물리량은 모두, 발효 전 기간동안 표시되고 기록되었다.
유가-배치기 동안, 배양액 내의 글루코오스 농도는 1.5g/l로 유지된다. 이를 위하여, 변형된 흐름 주사 분석기(광도계 및 검출 조절 유닛을 장착한 FIAstar 5020 분석기, Tecator AB, Sweden)를 사용하였다. 이 시스템 및 이의 작동 모우드는 본 분야의 문헌(예를 들면, Pfaff et al., 1995, Munack A. 및 Schugerl K(eds): Computer Applications in Biotechnology, Elsevier Science Ltd. Oxford, 6-11)에 상세히 기재되어 있다.
550nm의 광학 밀도에서 세포 밀도를 계산하였다. 문헌의 방법(Pack et al., 1993, 상기 참조)을 통하여 플라스미드 안정성을 측정하였다.
실시예 5
문헌(Pack et al., 1993, 상기 참조)의 방법을 사용하여 합성된 소형 항체를정량적으로 측정하였다. ELISA를 사용하여 기능성 소형 항체량을 측정하고, 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE를 통하여 소형 항체의 전체량을 측정한 후, 문헌(Laemmli, 1970)에 따라 겔-스케닝을 하였다. ELISA에서, 적량(microtitre) 플레이트를 인간 EGFR 수용체(예를 들면, WO 92/15683의 수용체)로 도포하였다. 결합된 소형 항체를 항-scFv425 래빗 혈청 및 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 염소 항-래빗 IgG(Jackson Immunoresearch Inc., USA)를 사용하여 검출하였다. 정제 소형 항체로 제조한 일련의 희석액으로부터 활성 소형 항체 수율을 계산하였다. 대조물에서, 항-scFv425 래빗 혈청은, E. 콜라이 RV308의 플라스미드 없는 조추출물 중 다른 성분과 전혀 교차 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 조추출물을, 동일한 항체의 정제된 형태로부터 제조한 일련의 희석액에 첨가하면, ELISA 신호에 영향을 미치지 않는다. 소형 항체의 총량을 측정하기 위하여, 코마시 브릴리언트 블루로 염색된 겔을 광학적으로 측정하고, 동일한 겔에서 분별 증류한 정제된 소형 항체로부터 제조한 일련의 희석액으로부터 소형 항체의 농도를 측정하였다. 소형 항체를 생산하지 않는 E. 콜라이 숙주 세포를 사용하여 제조한 유사 혼합물을 대조물로 사용하였다.

Claims (17)

  1. 외래 유전자 및 유도 가능한 프로모터를 운반하는 플라스미드로 형질전환된 E. 콜라이 세포에서, 배치 및 유가 배치 단계를 통하여 세포 고밀도 발효법에 의해, 기질 또는 신진대사 부산물에 의한 어떠한 성장 제한 및 배양 배지로부터 발현된 단백질의 분리 및 정제없이, 자동화 또는 반자동화 분석 및 첨가 시스템을 사용하여 유가 배치기의 기질 농도를 연속적으로 조절하면서 외래 단백질을 제조하는 방법으로서, 유가 배치기에 i) 세포 무제한 성장(μ= μmax)을 유지하면서 배지 내 탄소원 농도를 0.1g/l 내지 25g/l 범위로 일정하게 유지하고, ii) 10 내지 80g/l의 세포 밀도에서 프로모터를 유도함으로써 상기 유가 배치기에서 외래 단백질의 제조를 개시하고, iii) 생성물 합성 유도 후, 이용 가능한 질소, 포스페이트 및 미량원소의 염을 연속적으로 공급하고, iv) 산소를 적당한 방법으로 발효 브로스에 통과시켜, pO2값을 유가 배치기의 전기간 동안 5 내지 25%로 조절하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 유가 배치기 동안 상기 탄소원 농도를 1 내지 3g/l 범위로 일정하게 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 질소, 포스페이트 및 미량 원소를 50내지 80g/l의 세포 밀도에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 (ii)에서의 세포 밀도가 20 내지 60g/l인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유가-배치기에서 100 내지 150g/l의 세포 밀도에 도달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 외래 유전자를 함유하고 측면에 두 종료 암호 서열이 위치하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 사용되는 상기 발현 벡터가 자멸계, 바람직하기는 hok-sok 자멸계를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 항체 단편, 특히 소형 항체를 암호화하는 외래 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 발효 기간동안 배양 배지에 아세테이트가 5g/l 이하로 축척되는 E. 콜라이주를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, E. 콜라이주 RV308(ATCC 31608)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 세포 고밀도 발효 조건 하에서 외래 단백질을 발현시키기 적합하며:
    (i) 상류 종료 암호 서열 및 하류 종료 암호 서열
    (ii) lac 프로모터/오퍼레이터 계
    (iii) T7g10 Shine Delgarno 서열
    (iv) pelB 또는 ompA 신호 서열 및
    (v) 외래 유전자 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 E. 콜라이 발현 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 자멸계, 특히 hok-sok 자멸계 서열을 더욱 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 상류 종료 암호 서열은 tHP이고, 상기 하류 종료 암호 서열은 tLPP인 것을 특징으로 하는 벡터.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 외래 유전자가 소형 항체의 VH사슬 및 VL사슬을 암호화하는 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  15. 도 2의 구조에 따라 설계된 pHKK인 발현 벡터.
  16. RV308(ATCC 31608)을 제 13 항에 따른 발현 벡터로 형질전환하여 얻을 수 있는 형질 전환된 E. 콜라이 발현 숙주 RV308[pHKK].
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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