CZ291415B6

CZ291415B6 - Způsob výroby rekombinantních proteinů v E.coli pomocí fermentace s velkou hustotou buněk

Info

Publication number: CZ291415B6
Application number: CZ19981652A
Authority: CZ
Inventors: Marian Kujau; Rolf Wenderoth; Andreas Plückthun; Wolfgang Strittmatter; Siegfried Matzku; Dieter Riesenberg; Uwe Horn; Uwe Knüpfer
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 2003-03-12
Also published as: PL327188A1; SK283169B6; KR19990072037A; JP2000501936A; AU716612B2; NO982672L; CA2240097C; ATE213271T1; US6410270B1; BR9611937A; ZA9610384B; ES2171752T3; UA61066C2; NO319090B1; DK0866876T3; SI0866876T1; EP0866876A1; AU1032597A; RU2201455C2; HUP0000317A3

Abstract

Zp sob v²roby ciz ho proteinu v bu k ch E.coli, kter byly transformov ny plazmidem nesouc m ciz gen a indukovateln² promotor, pomoc fermentace bun k o vysok hustot p°es stupn batch a fed-batch bez obvykl ho omezov n r stu substr ty nebo metabolick²mi vedlejÜ mi produkty a izolov n m a vy iÜt n m exprimovan ho proteinu z kultiva n ho prost°ed , p°i em koncentrace substr tu ve fed-batch-f zi je regulov na a/nebo ° zena poloautomatick²m syst mem anal²z a p° sad, p°i kter m ve fed-batch-f zi je koncentrace zdroje uhl ku v m diu udr ov na konstantn 0,1 g/l a 25 g/l p°i zachov n neomezen ho r stu bun k (.mi. = .mi..sub.max.n.), produkce ciz ho proteinu v uveden fed-batch-f zi se zah j p°i hustot bun k 20 a 80 g/l indukc promotoru a po prob hl indukovan synt ze produktu se kontinu ln p°iv d zu itkovateln² dus k a fosf t i soli stopov²ch prvk , p°i em v pr b hu cel fed-batch-f ze se hodnota pO.sub.2.n. nastav odpov daj c m p° vodem kysl ku do fermenta n suspenze na 5 a 25 %. E.coli expresn vektor vhodn² k expresi ciz ch protein za podm nek fermentace s vysokou hustotou bun k a transformovan² expresn hostitel E.coli, RV 308 (pHKK) z skan² transformac RV 308 (ATCC 31 608) specifick²m vektorem pHKK..sub. .n.\

Description

Způsob výroby rekombinantních proteinů v E. coli pomocí fermentace s velkou hustotou buněk

Oblast techniky

Vynález se týká fermentačního způsobu fed-batch se speciálními hostujícími vektorovými systémy E. coli k účinnému vytváření rekombinantních proteinů, obzvláště rekombinantních protilátkových molekul, obzvláště fragmentů protilátek, jako například miniprotilátek.

Za podmínek podle vynálezu mohou buňky E. coli růst s maximální specifickou rychlostí růstu až do velmi vysokých hustot buněk. Po spuštění rekombinantního vytváření produktu působí pouze vytvářený produkt omezeně na růst; k omezení růstu substrátu nebo metabolickými vedlejšími produkty nedochází. Tímto způsobem a ve spojení s novými k tomu speciálně přizpůsobenými expresními vektory, vykazujícími vysokou stálost, lze dosáhnout vysokých výtěžků se zřetelem na prostor a čas rekombinantních proteinů, které vykazují zejména v případě fragmentů protilátek vysokou biologickou aktivitu.

Dosavadní stav techniky

Podstatným předpokladem pro účinné vytváření rekombinantních proteinů je kultivace buněk E. coli k vysoké hustotě buněk. K tomu jsou stavem techniky dány následující kultivace: Po neomezeném růstu ( μ = μ™^) v batch-fázi se obvykle přidává v navazující fed-batch-fázi zdroj uhlíku (glukóza nebo glycerin) omezeně tak, že se zabrání vytváření růstu inhibujících vedlejších produktů, jako například acetátu s tím důsledkem, že v růstu se pak může pokračovat až k dosažení vysokých hustoto buněk omezených pouze substrátem (μ < μ,ηαχ) (např. B. Riesenber a kol., J. Biotechnol. sv. 20, str. 17 až 28, 1991; Strandberg a kol., FEMS Microbiol. Rév. sv. 14, str. 53 až 56, 1994; Korz a kol., J. Biotechnol. 39, str. 59 až 65, 1995; EP-B-0 511 226). Růst s redukovanou rychlostí růstu má jako důsledek přirozeně dlouhé doby fermentace a tím také menší prostoro-časové výtěžky. V důsledku okamžitého spotřebování se blíží· při těchto fermentacích koncentrace zdroje uhlíku v kultivačním roztoku téměř nule. Po vyřazení rekombinantního vytváření produktu se na poměrech omezených substrátem nic nemění.

Jsou též známé kultivace fed-batch s E. coli, při kterých se zdroj uhláku přidává přerušovaně ve větších časových intervalech a pak ve větších množstvích, přičemž se většinou jako indikátoru vyčerpání substrátu používá nárůst hodnoty p0₂ k iniciaci následného zdroje uhlíku (například Eppstein a kol., Biotechnol 7, str. 1178 až 1181, 1989). Tento způsob znamená hromadnou změnu od dlouhodobých podmínek přebytku substrátu k podmínkách s omezeným substrátem a implikuje tak metabolické porušení rovnováhy.

Dále bude pojednáno o kultivacích fed-batch, při kterých mohou buňky růst ve fed-batch-fázi s maximální specifickou rychlostí růstu (μ = μ,ηαχ)· Kultivace fed-batch, při kterých po stanoveních off-lione se kultuře přivádějí větší množství zdroje uhlíku ve větších časových intervalech k zabránění omezování substrátu, jsou experimentálně náročné a mají ten nedostatek, že se během celé fermentace koncentrace zdroje uhlíku trvale mění (například B. Pack a kol., Biotechnol. sv. 11, str. 1271 až 1277, 1993, Hand a kol., Appl. Microbiol. Bitechnol. 42, str. 100 až 107,1994).

Jsou též popsány kultivace fed-batch, při kterých se koncentrace zdroje uhlíku měří a reguluje on line, takže jsou vyloučena omezování, i když - obzvláště v oboru vysokých hustot buněk - jsou spojena s dále popsanými nedostatky. Nedávno bylo popsán autoklávovatelný biosenzor glukózy k nasazení v mikrobilních fermentacích v kotlových fermentátorech s míchadlem (M.R. Phelps kol., Biotechnol. Bioeng. 46, str. 514 až 524, 1995). Bylo ho použito pro kultury E. coli. Tento senzor in šitu podává s časovým prodlením přibližně 2 minuty aktuální hodnotu kultivačního

- 1 CZ 291415 B6 roztoku. Signál, poskytovaný glukózovým senzorem, je kromě jiného závislý také na pO₂.

V oboru vysokých hustoto buněk X > 80 g není senzor vyzkoušen. Podle zkušeností mohou nárůsty E. coli na sodách in šitu při velmi vysokých hustotách buněk vést k dalším chybným hodnotám. Kromě toho není možno senzor během probíhající fermentace přesně znovu ocejchovat. Jiné způsoby nejsou založeny na měření senzorem in šitu, nýbrž jsou založeny na například stanovení zdrojů uhlíku pomocí on line průtokových injekčních analyzátorů (FIA) nebo on-line HPLC v kultivačním roztoku prostém buněk, který je z fermentátoru poloprůběžně odebírán a podrobován mikroodstředěním (Kleman a kol., Appl. Environ. Microbiol. 57, str. 910 až 917 a 918 až 923, 1991 a Turner kol., Biotechnol. Bioeng. 44, str. 819 až 829, 1994). Předpovídací a zpětnovazební kontrolní algoritmy zmenšují kolísání koncentrace glukózy při růstu až do X = 65 g/1 (Kleman a kol., Appl. Environ. Microbiol. 57, str. 910 až 917, 1991).

V oboru velmi vysokých hustot buněk (od přibližně 80 g/1 do 150 g/1) se stává oddělování buněk stále obtížnější a časově náročnějším, takže narůstá i časové zpoždění k určování aktuální hodnoty glukózy na konstantní hodnotě je ztíženo, případně znemožněno. Při konstantním a krátkém časovém zpoždění se naopak koncentrace glukózy měří aparaturou, která se obejde bez této separace buněk (Pfaff a kol., Proceedings of the 6^th Intemational Conference on Computer Appl. in Biotechnol., gamisch-Partenkirchen, FRG 1995, str. 6 až 11). Podle Pfaffa a kol., se v těsné blízkosti místa odběru vzorku po zředění kultury inhibitorem růstu nasadí FIA s enzymaticky-amperometrickým senzorem glukózy.

Při aerobní kultivaci vytvářejí buňky E. coli, které nejsou nuceny dávkovacím režimem k růstu limitovanému substrátem, obvykle v zesílené míře metabolický vedlejší produkt acetát (Riesenbeřg, Curr. Opinion Biotechnol. sv. 2, str. 380 až 384, 1991), který se akumuluje v živném roztoku a ve větších množstvích působí jako inhibitor růstu (Pan a kol., Biotechnol. Lett. sv. 2, str. 89 až 94, 1987). Proto jsou dosud tyto kultivace fed-batch k vysokým hustotám buněk vážné pouze se zvláštními kmeny E. coli, jejichž akumulace acetátu byla snížena cílenými genetickými změnami při tolerování ostatních, s tím spojených, nedostatků. K potomkům E. coli K12 patří fosfotransacetylázově negativní mutanty (Bauer a kol., Appl. Environ. Microbiol. sv. 42, str. 100 až 107, 1994), které jsou však v prostředí minerálních solí glukózy silně v růstu omezování. Phelps a kol. (Biotechnol. Bioeng. 46, str. 514 až 524, 1995).) používají jako hostitele kmene E. coli TOPP5 pro kultivaci nelimitovanou substrátem až do biohmoty X=85 g/1. Tento kmen E. coli, který zřejmě acetát silně neakumuluje, není však žádný kmen E. coli K-12. E. coli TOPP5 vytváří hemolysin aje tak patogenním kmenem, kteiý z bezpečnostních důvodů nepřipadá v úvahu jako hostitel pro vytváření rekombinantních produktů DNA v průmyslovém odvětví. Transformací buněk E. coli plazmidem, který obsahuje gen ke kódování acetolactátsyntázy (ALS) by bylo možno docílit snížení akumulace acetátu (San a kol., Ann-N-Y-Acad-Sci, sv. 721, str. 257 až 267, 1994). Tento způsob je však spojen s tím nedostatkem, že při použití plazmidu kódujícího ALS v kombinaci za podmínek vysoké hustoty buněk k nestabilitám. Nestabilita plazmidu, které se vyskytují v zesílené míře při kultivaci na vysoké hustoty buněk, je účinnost vytváření rekombinantních produktů hromadně snižována.

Protilátky nebo fragmenty protilátek, jako na příklad Fab', F(ab')2 miniprotilátky nebo jednořetězcové Fv' získávají rostoucí měrou význam v lékařství a biotechnice. Pod pojmem miniprotilátka se v následujícím textu podle vynálezu rozumí bivalentní nebo bispecifický jednořetězcový Fv-fragment spojený přes Hinge-oblast. Přitom může být důležité, jako například v terapii rakoviny, poskytnout k dispozici velká množství protilátek (přibližně 1 g/na dávku).

V E. coli je nyní možno obzvlášť snadno a době vyrobit monovalentní fragmenty protilátek nebo jejich fúzní proteiny, popřípadě jejich multimemí nebo multispecifické varianty. Tyto fragmenty, případně varianty, vykazují malou velikost spojenou s vysokou specifickou vazební schopností. (Například Plůckthun A., Immunol. Rev. 130, str. 151 až 188, 1992; Pack a kol.. J. Mol. Biol. 246, str. 28 až 34, 1985). Proteiny, a zejména protilátky, musejí být však vhodně vinuty, aby byly biologicky a funkčně účinné. Tento problém je třeba respektovat při posuzování výtěžku vytvořených protilátkových fragmentů pro buňku v souvislosti s hustotou buněk. Dále hraje důležitou úlohu primární sekvence protilátky při stanovení výtěžku in vitro a vinutí in vivo

-2CZ 291415 B6 (Knappik A. a Pluckthun A., Protein Engin. 6, str. 81 až 89, 1995). Takto se například expresují Fab-fragmenty jako nerozpustné cytoplastické nebo periplazmatické agregáty a zpětně se vinou in vitro. Tak je referováno o výtěžcích přibližně 0,14 g/1 při nízké hustotě buněk (Condra a kol., J. Biol. Chem. 165, str. 2292 až 2295, 1990) a až přibližně 1-2 g/1 nerozpustných protilátek při střední hustotě buněk (Shubui a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, str. 770 až 775, 1993). Lze také získat bivalentní miniprotilátky (Pack a kol. Biotechnol. 11, str. 1271 až 1277, 1993) v biologicky funkční formě ve výtěžcích přibližně 0,2 gd v E. coli. Při těchto výtěžcích je v průměru 5 až 45 % řádně zpětně vinuto.

Ve známých systémech E. coli se napojuje tvoření cizích proteinů zpravidla vhodným způsobem po dosažení přiměřených hustot buněk odpovídajících expresnímu systému regulovatelným promotorovým systémem. Zde lze jmenovat například (i) promotor araBAD v přítomnosti AraC represoru (indukovatelným arabinózou) (například Better a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 90, str. 457 až 461,1993), (ii) phoA promotor (indukovaný odtahem fosfátu) (například Carter a kol., Biotechnol. 10, str. 163 až 167, 1992) a (iii) promotorový systém lac (indukovatelný IPTG) (Pack a kol. 1993). Systém lac, který zpravidla ovlivňuje dobrou expresi, má však ten nedostatek, že u něj lze pozorovat jednak nežádoucí základní expresi před indukcí promotoru, jednak nestabilitu plazmidinu po indukci IPTG.

Ve zvláštním provedení vynálezu je popsán speciální vektor (pHKK), který' obsahuje jako cizí gen sekvence, které kódují fragmenty myší případně humanizované protilátky MAb 425. MAb 425 (ATCC HB 9629) je myší monoklonální protilátka, která byla izolována ze známé lidské rakovinové linie A432 (ATCC CRL 1555) a váže na epitop lidského epidemického receptoru růstového faktoru (EGFR) glykoprotein o přibližně 170 kD za inhibice vazby přirozeného ligandu EGF. Ukázalo se, že MAb 425 má cytotoxické působení na nádorové buňky, případně brání v jejich růstu (Rodeck a kol. Cancer Res. 47: 3692, 1987). Z patentového spisu WO 92/15 683 jsou známy humanizované i chimémí formy Mb 425, včetně sekvencí DNA a aminokyselin jejich lehkých a těžkých řetězců.

Cílem vynálezu je poskytnout způsob výroby cizích proteinů, obzvláště fragmentů protilátek v rekombinantních buňkách E. coli za podmínek vysoké hustoty buněk (HCDC = High Cell Density Culture) s vysokými časoprostorovými výtěžky a bez podstatného zhoršení růstu působením substrátu nebo metabolitů a bez pozorovatelných ztrát plazmidu, případně nestabilit plazmidu při zaručení vysokého procenta účinné biologické aktivity (vazební schopnosti, korektního vinutí) exprimovaného proteinu.

Podstata vynálezu

Způsob výroby cizího proteinu v buňkách E. coli, které byly transformovány plazmidem nesoucím cizí gen a indukovatelný promotor, pomocí fermentace buněk o vysoké hustotě před stupně batch a fed-batch bez obvyklého omezování růstu substráty nebo metabolickými vedlejšími produkty a izolováním a vyčištěním exprimovaného proteinu z kultivačního prostředí, přičemž koncentrace substrátu ve fed-batch-fází je regulována a/nebo řízena poloautomatickým systémem analýz a přísad, spočívá podle vynálezu v tom, že ve fed-batch-fázi (i) je koncentrace zdroje uhlíku v médiu udržována konstantní 0,1 g/1 až 25 g/1 při zachování neomezeného růstu buněk (μ = μ™*), (ii) produkce cizího proteinu v uvedené fed-batch-fázi se zahájí při hustotě buněk 20 až 80 g/1 indukcí promotoru a (iii) po proběhlé indukované syntéze produktu se kontinuálně přivádí zužitkovatelný dusík a fosfát i soli stopových prvků, přičemž (iv) v průběhu celé fed-batch-fáze se hodnota p0₂ nastaví odpovídajícím přívodem kyslíku do fermentační suspenze na 5 až 25 %.

Způsob podle vynálezu je vícestupňový batch-postup, který spočívá podle vynálezu především v tom, že buňky mohou během celé batch-fáze maximálně růst (μ = μ^χ)· Popsaným způsobem je tak nakonec možno dosáhnout hustot buněk 100 až 150 g/1 (suché biomasy). Růstu není také

-3CZ 291415 B6 podstatně bráněno akumulací acetátu. jelikož ta není za zvolených podmínek s překvapením obzvlášť výrazná, obzvláště při použití kmenů E. coli, které kromě toho mají sklon ke zmenšenému vytváření acetátu v průběhu fermentace. Toho se dosahuje při řadě jiných dodatečných opatření především tím, že koncentrace zdroje uhlíku a médium je udržována v definovaném oboru konstantní, při zachování neomezeného růstu buněk. Odpovídajícím uspořádáním příslušného expresního vektoru může být téměř vyloučena nežádoucí bazální exprese proteinu před napojením syntézy proteiny řiditelným promotorovým systémem, stejně jako částečně velká ztráta plazmidu, která, jak shora uvedeno, je normálně pozorována v expresních systémem se silnými promotory, jako je například lac-promotorový systém.

Dají se docílit v průběhu výtěžku proteinů 3 až 5 g/1 po přibližně 25 až 35 hodinách celkové kultivace. V případě obzvlášť kritických protilátkových fragmentů, zejména miniprotilátek vlivem jejich kritérií vinutí, je asi 80 % syntetizovaného materiálu biologicky aktivní a správně vinutý.

Hodnoty pro potřebnou koncentraci zdroje uhlíku jsou podle vynálezu v průběhu fed-batch-fáze v rozmezí 0,1 g/ až 25 g/1. Výhodný rozsah je 0,5 až 15 g/1, obzvláště 0,1 g až 5 g/1. Jako zdroj uhlíku slouží s výhodou glukóza a glycerin nebo jejich směs. Podle vynálezu probíhá přísada zdroje uhlíku automatickým nebo poloautomatickým systémem přísad a analýz kontinuálním způsobem (on-line). S výhodou se používá systému průběžných injektovaných analýz (FIA) on-line.

Doplňování zhodnotitelného dusíku, s výhodou amoniového dusíku, a fosfátu, například diamoniumhydrogenfosfátu nebo amoniumdihydrogenfosfátu, i stopových prvků, například v médiu rozpustných solí bóru, manganu, mědi, molybdenu a kobaltu, železe nebo zinku probíhá ve fedbatch-fází zařazené za batch-fázi, s výhodou se zapojením syntézy proteinů regulovatelným promotorem při hustotě buněk 50 až 80 g/1 (suché biohmoty), s výhodou při přibližné 70 g 1 při celkové rychlosti růstu 100 až 150, s výhodou 140 g/1.

Spuštění syntézy proteinů aktivací regulovatelného systému promotorů nastává podle vynálezu při hustotě buněk 10 až 80 g/1, s výhodou 20 až 60 g/1; obzvláště výhodně 40 až 50 g/1.

Parciální tlak kyslíku obnáší během fed-batch-fáze 5 až 25 %, s výhodou 15 až 25 %, obzvlášť výhodně 20 %.

Hodnota pH se během celé batch-fáze podle vynálezu nastavuje na 6,5 až 7,0, s výhodou 6,7 až 6,9, obzvlášť na 6,8.

Vynález se dále týká odpovídajícího způsobu, při kterém se použije expresní vektor s expresní kazetou obsahující cizí gen, vymezený dvěma terminátorovými sekvencemi. Tyto terminátorové sekvence, zejména umístěné „upstream“ zabraňují s úspěchem nežádoucí expresi proteinu před napojením promotorového systému. Obzvlášť výhodným je terminátor t_hp (Nohno a kol., J. Bacterio. 170, str. 4097 až 4102, 1988), použit lze i jiných známých terminátorových sekvencí.

Vynález se dále týká způsobu, při kterém použitý expresní vektor obsahuje přídavně sebevražedný systém. Sebevražedný systém produkuje protein, který je bez výskytu plazmidu v buňce pro buňku toxický. Vhodné sebevražedné systémy jsou známy z literatury. Jedním pro vynález obzvlášť výhodným sebevražedným systémem je systém hop-sok (například gerdes K., Biotechnol. 6, str. 1402 až 1405,1988). Pro způsob účinného vytváření rekombinantních proteinů je totiž důležité, aby se systém hostujícího vektoru vyznačoval v oboru vysokých hustot buněk vysokou stabilitou plazmidu, malou rekombinantní bazální expresí a vysokou tvorbou produktu. Sebevražedné systémy v kombinaci s rekombinantními expresními kazetami, vymezenými terminátory, jsou přitom vektorově specifické.

-4CZ 291415 B6

Vynález se dále týká odpovídajícího způsobu, při kterém je nasazen cizí gen, kódující fragment protilátky, obzvláště miniprotilátku.

Dále se vynález týká způsobu, při kterém je použito expresních vektorů s přídavnými, dále popsanými význaky.

V zásadě je možno použít většiny známých kmenů E. coli, vhodných pro rekombinační techniku a pro výrobu v technickém měřítku. S výhodou nacházejí takové kmeny přednostní použití, které při růstu do vysokých hustot buněk akumulují poměrně málo acetátu. Obzvlášť výhodnými jsou kmeny, které vykazují obohacování acetátem pod 5 g/1. S překvapením může být zvolenými podmínkami podle vynálezu akumulace acetátu udržována na obzvlášť nízké úrovni. Z tohoto hlediska se obzvlášť hodí obecně známý a obchodně dostupný kmen E. coli RV308 (ATCC 31608) i jeho varianty se stejným působením.

Vynález se týká zejména způsobu, při kterém se používá kmene E. coli s akumulací acetátu nižší než 5 g/1 v kultivačním médiu během fermentace.

Kromě toho se vynález týká expresního vektoru E. coli, vhodného k expresi cizích proteinů za podmínek fermentace s vysokou hustoto buněk, který vykazuje následující význaky:

(i) terminátorovou sekvenci „upstream“ a „downstream“, (ii) systém lac promotor/operátor, (iii) sekvenci T7gl0 Shine Dalgamo, (iv) signální sekvenci pelB- nebo ompA, (v) sekvenci cizího genu, a ve výhodném provedení případně sebevražedný systém, obzvláště systém hok-sok.

Podle vynálezu může být promotorový systém nahražen také jinými vhodnými, například shora jmenovanými systémy. Vynález také zahrnuje jiné stejně působící signální a řídicí sekvence.

Jako speciální provedení se vynález dále týká expresního vektoru pHKK (obr. 2) definovaného svou konstrukcí, který obsahuje sekvence pro miniprotilátku, odvozenou z MAb 425, i speciální rekombinantní hostitel E. coli RV308 [pHKK].

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků:

Na obr. 1 je pokusný bioreaktor k výrobě proteinů za podmínek vysoké hustoty buněk. Systém je vybaven měřicím, ukazovatelovým, kontrolním a dávkovacím zařízením. Význam vztahových značek je následující:

procesní počítač PC 386-MFCS, spravování procesu, zviditelnění dat, ukládání dat,

DCU, řízení procesu,

-5CZ 291415 B6 ustanovení teplota počet otáček tlak hmotnost pH protipěnicí činidlo pC>2___ glukóza odpadní plyn, plyn, fermentor Biostat ED 10, dávkování, protipěnicí činidlo,

NH₃ glukóza analýza odpadního plynu (Hartman & Braun),

O₂ CO₂ stanice směšování plynu (B. Braun), vzduch O₂

FIA glukóza

FIA amonium

LT386, filtr dat, řízení FIA.

Na obr. 2 je optimalizovaný expresní vektor pHKK i díly jeho konstrukce. Vektor sestává v postatě z dílů známých vektorů pASK40, pAK.100 a pKG 1022.

Na obr. 3(a-d) je znázorněna kultivace rekombinantní E. coli na příkladu E. voli RV308[pHKKJ: časový průběh biomasy, glukózy, amoniového dusíku, fosfátu, acetátu, rychlosti míchání, pO₂, O₂ a CO₂ v odpadním plynu, stabilita plazmidu (vyjádřená % betalactamase pozitivních kolonií) tvoření proteinu (zde scFv₄₂₅dhIx). Batch-fáze a fed-batch-fáze jsou rozděleny do 5 sulfází. Šipka 1PTG udává start produkce proteinu.

Na obr. 3a je na ose x doba v hodinách křivky s jednotlivými symboly mají tento význam.

acetát [g/1] ~~amonium-N [g/1]

glukóza [g/1] biomasa [g/1]

Na obr. 3b je na ose x kultivační doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají tento význam

fosfát [g/1] lac. pozitivní kolonie [%] biomasa [g/1] io

Na obr. 3c je na ose x doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají tento význam koncentrace oxidu uhličitého v odpadním plynu [%] koncentrace kyslíku v odpadním plynu [%] koncentrace pO₂ [%]

Na obr. 3d je na ose x kultivační doba v hodinách, křivky s jednotlivými symboly mají tento význam aktivní scFv₄₂₅dhIx [mg/gX] celkový scFv₄₂₅dhlx [g/1] aktivní scFv_425ddhlx [g/1] · biomasa [g/1]

Způsob podle vynálezu používá transformovaných hostících buněk E. coli. Zvolené plazmidové konstrukce se řídí podle druhu exprimovaného proteinu. Obzvlášť vhodné význaky takových plazmidových konstrukcí jsou popsány dále. Techniky a způsoby potřebné k plazmidové konstrukci a transformaci hostících buněk jsou všeobecně známé a v literatuře podobně popsané 30 (například Sambrook a kol., Molecular Clonig: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989).

Kromě toho jsou popsány v příkladech u zvláštních provedení vynálezu. Výchozí plazmidy nebo díly plazmidů jsou buď obchodně dostupné, neboje lze snadno zkonstruovat podle standardních metod na základě známého konstrukčního schématu.

Předběžně zařazená batch-fáze typická fermentace podle vynálezu transformovaných buněk E. coli je rozdělena do dvou subfází. Po naočkování odpovídající předkulturou je subfáze I vyznačena lag-fází, ve které se buňky adaptují a rychlost růstu μ návazně stoupne na μ™*. Po poklesu pO₂ ze 100% nasycení na 5 až 15%, se nastaví hodnota pO₂ s výhodou 15 až 25 %, obzvláště 20 % (obr. 3c). Toto nastavení (zavedením vzduchu obohaceného čistým kyslíkem) se má provést přibližně 6 až 12 hodin před začátkem fermentace hlavní kultury. Koncentrace glukózy, která je zpočátku s výhodou 20 až 35 g/1, klesne až ke konci sulfáze III, který představuje také konec batch-fáze předřazené před fed-batch-fází. Přitom nemají být pokročeny v žádném případě hodnoty 0,1 g/1. Tomu se od této chvíle celí příslušným přikrmováním glukózou (sulfáze III, obr. 3a, start fed-batch-fáze). Podle vynálezu se hodnota glukózy udržuje konstantní 0,1 až 25 g/1, s výhodou však 1 až 3 g/1. Ktomu může sloužit například přikrmovací médium FS1 (tab. I). Jelikož tento rozsah koncentrace glukózy je dostatečně daleko nad hodnotou „Ks“ pro glukózu (Bergter „Růst mikroorganismů“, str. 41, nakladatelství Gustav Fischer, Jena 1983), mohou buňky nadále růst při μ,η^. Kontrolu a řízení koncentrace glukózy obstarává podle vynálezu automatický nebo poloautomatický systém.

Obzvlášť výhodnými jsou systémy průtočného injekčního analyzátoru v provozu on-line. Čistě ruční nebo do značné míry ručně ovládané systémy se neosvědčily. Konec fed-batch-fáze začíná přibližně mezi 15. až 22. hodinou, závisí konec na různých individuálních faktorech, jako je teplota, složení a koncentrace média, velikost reaktoru, avšak obzvláště na druhu použitého kmene E. coli. S výhodou se zapojuje 4 až 8 hodin po začátku fed-batch-fáze syntéza cizího proteinu. Přesný okamžik se řídí však podle dosažené hustoty buněk kultury v daném okamžiku. Hustot} buněk 10 až 80 b/1, s výhodou 20 až 60 g/1 jsou obzvlášť výhodné, pokud má být dosaženo konečné hustoty buněk 100 až 150 g/1. Pro start syntézy proteinu je všeobecně vhodné, jestliže v okamžiku indukce je přibližně 10 až 60 % hustoty buněk, které má být maximálně dosaženo.

Syntéza proteinů je ovlivněna zapojením regulovatelného promotorového systému. K tomuto zapojení dochází podle použitého systému zpravidla přísadou substance nebo změnou fyzikální veličiny. V případě výhodného lac-systému (promotor, operátor, induktor) přísadou IPTG (izopropylthiogalactopyranosid). Další růst buněk je nyní omezen pouze hromadícím se produktem. Proto je podle vynálezu důležité, že před indukcí nemůže dojít k žádné patrné bazální expresi, která by měla na celkový růst a tím i na celkový výtěžek nepříznivý vliv. Toho se podle vynálezu dosáhne tím, že expresní kazeta v plazmidu je vymezena účinnými terminátorovými sekvencemi.

Od okamžiku přikrmování glukózou se fermentační médium ochuzuje o dusík a fosfát (obr. 3a,b). Aby se zabránilo omezení tohoto druhu, přivádí se dusík a fosfát s výhodou rovněž odpovídajícím kontinuálním způsobem. Dusík se přivádí účelně ve formě amonných solí, jelikož se tím současné může ovlivňovat hodnota pH (6,5 až 7,0, s výhodou 6,8). Hodí se například roztok FS2 (tab. I). Subfáze IV se vyznačuje podle vynálezu přiváděním stopových prvků (například bóru, manganu, železa, kobaltu, molybdenu, cínu) ve formě jejich rozpustných solí. Přisazuje se zpravidla kontinuálně konstantní rychlostí. Subfáze V se vyznáčuje zmírněným růstem, způsobeným především hromaděním produktu. Kromě toho lze pozorovat nepatrný nárůst koncentrace acetátu. Přesto je akumulace nebo koncentrace acetátu v médiu překvapivě nízká. Přičítá se to speciálním podmínkám postupu. Kmeny E. coli s maximálním obohacením acetátu < 5 g/1 během fermentace tento efekt ještě výrazně zesilují.

Výtěžky proteinu kolísají podle druhu proteinu v průběhu mezi 2 až 6 g/1. Z nich, opět podle druhu proteinu, je 50 až 95 % biologicky aktivních. V případě fragmentů protilátek se získá více než 80% zpětně vinutého proteinu. Tyto hodnoty překračují zřetelně porovnatelné způsoby popsané ve stavu techniky.

Popsaným způsobem se dají účinně vyrábět s výhodou při zapojení ktomu zkonstruovaných a přizpůsobených expresních plazmidů fragmenty protilátek, obzvláště miniprotilátky. Avšak i výroba mnoha jiných proteinů, fůzních proteinů nebo enzymů je způsobem podle vynálezu s výhodou možná. Příklady takových vhodných proteinů jsou hybridstreptokináza, glukosedahydrogenáza nebo také proteiny mající vliv na krvácivost, jako například hirudin, trombin, hementin nebo teromin.

V následující tabulce I se uvádí složení médií; FS1, FS2 a FS3 představují přikrmovací média, kterých se používá v různých sulfázích fed-batch-fáze. Ve sloupci A se charakterizuje koncentrace předkultivačního média a ve sloupci B koncentrace hlavního kultivačního média.

-8CZ 291415 B6

Tabulka I

Sloučenina

FS1

FS2

FS3 m

mi mi

1	Na₂HPO₄ x 2H₂O	8,6 x 10³
2	k₂hpo₄	3xlO³	16,6 x 10³
3	(NH₄)₂HPO₄		4x 10³		227 x 10³
4	(NH₄)H₂PO₄				169,5x10³
5	nh₄ci	lxlO³
6	NaCl	5x10²
7	kys. citrónová		2, lxl 0³
8	F e(III)-citrat-hydrat	60,0	75,0			5x10³
9	h₃bo₃	3,0	3,8			250
10	MnCl₂x4H₂O	15,0	18,8			125
11	EDTAx2H₂O	8,4	10,5			700
12	CuC1₂x2 H₂O	1,5	1,9			125
13	Na₂MO₄x2 H₂O	2,5	3,1			213
14	CoC1₂ x 6 H₂O	2,5	3,1			213
15	Zn(CH₃COO)₂x2H₂O	8,0	10			668
16	Glukóza	10x1O³	25x10³	670x10³
17	MgSO₄ x 7 H₂O	600	1,5x1ο³	19,8x10³
18	Ampicillin	100	100

Příklady provedení vynálezu .

Příklad 1

K vyrobení rekombinantní hostící buňky E. coli se použije prototropního kmene E. coli K.12 RV308 (lac74-gaIISII::OP308strA), (Maurer a kol., J. Mol. Biol. 139, str. 147 až 161, 1980; ATCC 31608). Transformace vektorem vhodným k expresi i další potřebné manipulace s DNA se provedou podle standardních metod, pokud není uvedeno jinak. Plazmidu prostá buňky E. coli 15 RV308 se nasadí jako kontrola do odpovídající fermentace s vysokou hustotou buněk. Vektor pHKK se zkonstruuje takto (obr. 2): malý fragment MIuI zpAKlOO (Krebber a Pliickthun, 1955), který obsahuje silný transkripční terminátor íhp (Nohno a kol.) v oblasti „upstream“ se vloží do plazmidu pASK.40 (Skerra a kol. Biotechnol. 9, str. 273 až 278, 1991). Vložení hok-sok DNA se uskuteční dvěma dalšími klonovacími kroky: gen aphA zpKG1022 (Gardes K., 20 Bitechnol. 6, str. 1402 až 1405, 1988) se odstraní dvojnásobný pohlcením XhoO a EcoRI, zaplní se polvmerázou DNA (Klenowův fragment) a religuje se. Ve druhém kroku se modifikovaný fragment BamHl zpKG1022 klonuje do jediného místa řezu prvního klonovacího produktu. Miniprotilátka pochází z fragmentu s jediným řetězcem, ve kterém byly variabilní domény ve směru Hh-Vl spojeny flexibilním linkerem (gly_4ser)3, následovaným na prolin bohatou 25 hinge-oblastí a změněnou doménou „helix-tum-helix“ (dhlx) (Pack a kol. Biotechnol. 11, str. 1271 až 1277, 1993). Sekvence DNA, primer, zesílení a klonování lehkého a těžkého řetězce myšího/humanizovaného MAb 425 je podrobně popsáno v patentovém spisu WO 92/15 683.

K sekreci fragmentu scFv425hdlx do periplazmy byl N-terminál domény V_H nafúzován na signální sekvenci pelB. Vazební místo T7gl0-ribosomů (Sine-Dalgerno) se klonuje metodikou 30 PCR do míst řezu Xbal a Sfil pEGl (Strittmatter a kol., 1995). Hotová expresní kazeta scFv425dhlx se klonuje mezi místy řezu Xhal a HindlII. Výsledkem je expresní vektor pHKK podle obr. 2.

-9CZ 291415 B6

Příklad 2

Složení médií předběžných kultur v Erlenmayerově baňce, hlavní kultury v tankovém reaktoru s míchadlem (Biostat ED10, B. Braun, Biotech Intemational, Melsungen, FRG) i přikrmovacích médií FS1, FS2 a FS3 je uvedeno v tabulce I. Hlavní kultivační médiu (81) se oproti Riesenbergovu médiu (Riesenberg a kol. 1991) modifikuje. Aby se zabránilo srážení, přidávají se přísady v pořadí uvedeném v tabulce I. glukóza a síran hořečnatý se přidají jako zvláštní autoklávovaný roztok. Reaktor se provozuje při teplotě 26 °C, tlak 0,15 MPa, hodnotě pH 6,8 a s průměrnou rychlostí zavzdušnění 10 1/min. K nastavení hodnoty pH se použije 25% vodného roztoku amoniaku. Během fermentace se přidává amoniak a Ucolub NI 15^R (Fragol Industrieschmierstoffe gmBH, Muhleim/Ruhr FRG) pomocí senzorové kontroly k regulaci hodnoty pH, případně jako protipěnivý prostředek. FS1 se připraví takto: odděleně jako protipěnivý prostředek. FS1 se připraví takto: odděleně se rozpustí 750 g glukózy a 22,2 g heptahydrátu síranu hořečnatého v 600 ml vody, popřípadě v 50 ml vody. Po provedení autoklávování se roztoky navzájem smísí. FS2 se připraví po rozpuštění 227 g diamoniummonohydrogenfosfátu a 169,5 g amoniumdihydrogenfosfátu ve vodě za přidání 60 ml 25% amoniaku, k nastavení hodnoty pH 6,8 před autoklávováním. FS3 se připraví ze zásobních roztoků v následujícím pořadí: 50 ml roztoku citráthydrátu železitého (6 g/1) 0,5 ml kyseliny borité (30 g/1), 0,5 ml tetrahydrátu chloridu manganatého (10 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu ethylendiamintetraoctové kyseliny (84 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu chloridu měďnatého (15 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu molybdenanu sodného (25 g/1), 0,5 ml roztoku dihydrátu chloridu kobaltnatého (25 g/1) a 10 ml roztoku dihydrátu octanu zinečnatého (4 g/1).

Příklad 3

K přeočkování 20 ml tekutého LB-média slouží několik kolonií Petriho misek, promytých na LB-agar při teplotě 26 °C. Po 5-hodinovém protřepávání (200 otáček za minutu, 26 °C) se převede 1 ml 100 ml média předběžné kultury do 500ml baňky a dále se inkubuje. 10 ml této předkultury se použije k přeočkování 100 ml nového média předběžné kultury. Tím se získá 9 předkultur, kterých se použije k přeočkování celkem 8 ml hlavního kulturního média ve fermentoru s počáteční OD₅₅o přibližně 0,2.

Příklad 4

Sestava bioreaktoru o obsahu 10 litrů s příslušenstvím a s kontrolním zařízením je znázorněna na obr. 1. Kultivace v měřítku fermentace s vysokou hustotou buněk probíhá pomocí digitální měřicí a kontrolní jednotky (DCU), multifermentačního kontrolního systému (MFSC) a průtokoměru plynu. Údaje oxidu uhličitého a kyslíku se průběžně měří. Po přeočkování slouží sběrač biovzorků MX-3 (New Brunswick Scientifíc, Watford, UK) k odběru aseptických vzorků k uložení analýzy dat off-line (Webb a kol., Biotechnol. 8, str. 926 až 928, 1990). Kontrolní jednotky udržují rychlost proudění plynu 10 1/min, hodnotu pH 6,8, teplotu 26 °C a tlak 0,15 MPa. Dvě kontrolní smyčky zaručují aerobní růstové podmínky při hodnotě pO₂ 20%. Všechny důležité fyzikální veličiny sběhem celé fermentace sledují a zaznamenávají. Během fed-batch-fáze se udržuje koncentrace glukózy v kultuře na 1,5 g/1. K tomu slouží modifikovaný přístroj průtokové injektované analýzy (FIAstar 5020 analyzátor s fotometrem a detekční kontrolní jednotka Tecator AAB, Švédsko). Detaily tohoto systému a jeho funkce jsou popsány v literatuře (například Pfaff a kol. 1995 a Numack A. Schiigerl L (vydavatelé): Computer Applications in Biotechnology, Elsevier Science Ltd. Oxford, str. 6 až 11). Hustota buněk se vypočítává z měření optické hustoty při 550 nm. Stabilita plazmidu se určuje způsobem, který popsal Packa a kol. (Biotechnol. sv. 11, str. 1271 až 1277, 1993).

-10CZ 291415 B6

Příklad 5

Kvalitativní stanovení syntetizovaných miniprotilátek se provádí způsobem, který popsal Pack a kol. (Biotechnol. sv. 11, str. 1271 až 1277, 1993). Množství funkceschopných miniprotilátek se sleduje způsobem ELISA, celkové množství na miniprotilátce SDS-PAGE ve 12% polyakrylamidovém gelu podle Laemmliho (1970). Pro ELISY se povrství mikrotitrové destičky lidským receptorem EGFR (například podle WO 92/15 683). Vázané miniprotilátky se detekují králičím sérem scFv425 peroxidázou konjugovaným kozím protikráličím IgG (Jackson Immunoresearch lne. Sp. st. a.). Výtěžek aktivních miniprotilátek se vypočte z ředicích řad vyčištěných miniprotilátek. Při jedné kontrole se ukázalo, že anti-scFv425 králičí sérum nevykazuje žádnou zjistitelnou křížovou reakci sjinými složkami plazmidu prostého surového extraktu E. coli RV3O8. Dále neměla přísada tohoto surového extraktu k ředicí řadě stejné protilátky ve vyčištěné formě žádný účinek na signály ELISA. Ke stanovení celkového množství miniprotilátek byly fotometricky detekovány gely vybarvené brilantní modří Coomassie a koncentrace miniprotilátek se vypočetla z ředicí řady vyčištěné miniprotilátky, která byla oddělena na stejném gelu. Jako kontrola sloužila analogická vsázka, při které bylo použito E. coli hostících buněk, které neprodukovaly žádné miniprotilátky.

Průmyslová využitelnost

Vysokovýtěžkový způsob výroby rekombinantních proteinů a fragmentů protilátek, obzvláště miniprotilátek a mnoho jiných proteinů, luzních proteinů nebo enzymů.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob výroby cizího proteinu v buňkách E. coli, které byly transformovány plazmidem nesoucím cizí gen a indukovatelný promotor, pomocí fermentace buněk o vysoké hustotě přes stupeň batch a fed-batch bez obvyklého omezování růstu substrátu nebo metabolickými vedlejšími produkty a izolováním a vyčištěním exprimovaného proteinu z kultivačního prostředí, přičemž koncentrace substrátu ve fed-batch-fázi je regulována a/nebo řízena poloautomatickým systémem analýz a přísad, vyznačující se tím, že ve fed-batch-fázi (i) je koncentrace zdroje uhlíku v médiu udržovaná konstantní v rozsahu 0,1 g/1 až 25 g/1 při zachování neomezeného růstu buněk, tj. μ = μ^), (ii) produkce cizího proteinu v uvedené fed-batch-fázi se zahájí při hustotě buněk 20 až 80 g/1 indukcí promotoru a (iii) po proběhlé indukované syntéze produktu se kontinuálně přivádí zužitkovatelný dusík a fosfát i soli stopových prvků, přičemž (iv) v průběhu celé fed-batch-fáze se hodnota pO₂ nastaví odpovídajícím přívodem kyslíku do fermentační suspenze na 5 až 25 %.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace zdroje uhlíku se během fed-batch-fáze udržuje konstantní na 1 až 3 g/1.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se dusík, fosfát a stopové prvky přidávají při hustotě buněk 50 až 80 g/1.

4. Způsob podle nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že hustota buněk ve stupni (ii) je 20 až 60 g/1.

5. Způsob podle nároků 1 až4, vyznaču j ící se tí m , že ve fed-batch-fázi může být dosaženo hustoty buněk 100 až 150 g/1.

-11 CZ 291415 B6

6. Způsob podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se používá expresního vektoru s expresní kazetou obsahující cizí gen vymezený dvěma terminátorovými sekvencemi.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že použitý expresní vektor obsahuje přídavně sebevražedný systém, s výhodou sebevražedný systém hok-sok.

8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že se používá cizího genu kódujícího protilátkový fragment, obzvláště miniprotilátku.

9. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se používá expresního vektoru podle nároků 12 až 16.

10. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se používá kmene E. coli, který akumuluje během fermentační fáze méně než 5 g/l acetátu v kultivačním médiu.

11. Způsob podle nároku 10, vy zn ač u j í c í se t í m , že se používá kmene E. coli RV308 ATCC 31608.

12. E. coli expresní vektor vhodný k expresi cizích proteinů za podmínek fermentace s vysokou hustotou buněk, vyznačující se tím, že obsahuje (i) terminátorovou sekvenci „upstream“ a „downstream“, (ii) systém lac promotor/operátor, (iii) sekvenci T7gl0-Shine Dalgamo, (iv) signální sekvenci pelB nebo ompA, (v) sekvenci cizího genu.

13. Expresní vektor podle nároku 12, vyznačující se tím, že obsahuje přídavně sebevražedný systém, zejména sebevražedný systém hok-sok.

14. Expresní vektor podle nároku 13, vyznačující se tím, že terminátorová sekvence „upstream“ je tnp a terminátorová sekvence „downstrean“ je t_Lp_P

15. Expresní vektor podle nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že cizí gen obsahuje sekvenci kódující V_H a řetězec V_L miniprotilátky.

16. Expresní vektor s označením pHKK podle konstrukčního schématu na obr. 2.

17. Transformovaný expresní hostitel E. coli RV308 [pHKK] získaný transformací RV308 ATCC 31608 expresním vektorem podle nároku 16.