JP2012034591A - Fc結合性タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を、前記大腸菌の増殖速度に合わせて炭素源を供給し、前記炭素源の供給量の0.4倍以上の窒素源を供給して培養し、製造する。
【選択図】図1
Description
第一の発明は、
Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を、前記大腸菌の増殖速度に合わせて炭素源を供給し、前記炭素源の供給量に比例した量の窒素源を供給して培養することで、前記タンパク質を製造する方法であって、
前記窒素源の供給量が前記炭素源の供給量の0.4倍以上である、前記製造方法である。
Fc結合性タンパク質が、
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも16番目のグルタミンから289番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも16番目のグルタミンから289番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
第一から第三のいずれかの発明に記載の製造方法である。
炭素源をグルコース、窒素源を酵母エキスとした場合、式(1)において、F1はグルコース溶液の流速(g/分)、F2は酵母エキス溶液の流速(g/分)、Y1はグルコースからの菌体収率(g(菌体)/g(グルコース))、Y2は酵母エキスからの菌体収率(g(菌体)/g(酵母エキス))、S1は流加用グルコース溶液の濃度(g/L)、S2は流加用酵母エキス溶液の濃度(g/L)を示す。式(1)で与えられる比例関係を基にポンプ回転数を決定する。Y1およびY2は微生物の種類や生育状態に応じて設定される定数であり、前記定数は予備実験で求めた値にもとづき、適切な値に設定することができる。ただし実施例で示すように、炭素源供給量に対する窒素源供給量(式(1)における(Y1/Y2)×(S1/S2)値)が少ないと、大腸菌の増殖および発現するFc結合性タンパク質の生産量が低下するため、窒素源供給量を炭素源供給量の0.4倍以上、好ましくは0.7倍以上となるようにY1およびY2を設定すればよい。
(a)Fc結合性タンパク質に対する抗体
(b)Fc結合性タンパク質
(c)酵素標識抗Fc結合性タンパク質抗体
の順番で重ねたサンドイッチ法を好ましく用いることができる。
ここで酵素標識抗Fc結合性タンパク質抗体として、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で標識された抗Fc結合性タンパク質抗体を好ましく用いることができる。また、ELISAの検出法についても特に限定されないが、標識に用いた酵素の特異的発色試薬、蛍光試薬または化学発光試薬が市販されており、それらを標識に用いた酵素に応じて任意に使用することができる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合は発色基質をペルオキシダーゼと過酸化水素で酸化反応させて比色定量する方法があり、例えばTMB 2−Component Microwell Peroxidase Substrate Kit(フナコシ社製)などの市販の試薬で発色させた後、市販の測定装置(例えばマイクロタイタープレートリーダMPRA4i、東ソー社製)で比色定量することができる。
炭素源(グルコース)はDOスタット法により炭素源濃度が0から0.1g/Lに維持するよう供給量を制御し、窒素源(酵母エキス)は炭素源(グルコース)の供給速度の0.74倍となるよう供給量を制御して、ヒトFcγRIを発現する大腸菌を培養した。
(1)公知の方法(例えば特許文献2の方法)により、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち、16番目のグルタミンから289番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトFcγRIをコードするポリヌクレオチドをプラスミドpET26b(+)に挿入した発現ベクターで形質転換した、大腸菌BL21(DE3)株を、4mLの2×YT培地(バクトトリプトン:16g/L、酵母エキス:10g/L、NaCl:5g/L)を入れた14mL容試験管に植菌し、30℃で16時間、毎分160回の振とう速度で前培養を行なった。
(2)表1に示す組成の培地よりグルコースと金属塩を除いた培地約1.4Lを3Lの発酵槽に入れ、121℃で20分間滅菌後、表1に示す濃度のグルコースおよび金属塩、ならび(1)の前培養液90mLを添加して、本培養を行なった。なお、通気した空気速度は1.8L/分、培養温度は30℃、pHは6.9から7.1とした。また、培養中におけるpHの変動は、14%アンモニア水または50%リン酸の添加により前記範囲に制御した。
炭素源(グルコース)はDOスタット法により炭素源濃度が0から0.1g/Lに維持するよう供給量を制御し、窒素源(酵母エキス)は本培養開始時に50g/L投入して、ヒトFcγRIを発現する大腸菌を培養した。
炭素源(グルコース)はDOスタット法により炭素源濃度が0から0.1g/Lに維持するよう供給量を制御し、窒素源(酵母エキス)は炭素源(グルコース)の供給速度の0.35倍となるよう供給量を制御して、ヒトFcγRIを発現する大腸菌を培養した。
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち、16番目のグルタミンから289番目のバリンまでのアミノ酸を含むヒトFcγRIをコードするポリヌクレオチドをプラスミドpET26b(+)に挿入した発現ベクターで形質転換する宿主を、大腸菌W3110株にした他は、実施例1と同様な方法でヒトFcγRIを発現する大腸菌を培養した。
Claims (4)
- Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を、前記大腸菌の増殖速度に合わせて炭素源を供給し、前記炭素源の供給量に比例した量の窒素源を供給して培養することで、前記タンパク質を製造する方法であって、
前記窒素源の供給量が前記炭素源の供給量の0.4倍以上である、前記製造方法。 - 炭素源がグルコースであり、窒素源が酵母エキスである、請求項1に記載の製造方法。
- 培養液中のグルコース濃度を5g/L以下に維持するよう、グルコースを供給する、請求項2に記載の製造方法。
- Fc結合性タンパク質が、
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも16番目のグルタミンから289番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも16番目のグルタミンから289番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項1から3のいずれかに記載の製造方法。
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