JP2014090709A

JP2014090709A - 組換えタンパク質の製造方法

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Publication number: JP2014090709A
Application number: JP2012244435A
Authority: JP
Inventors: Naoki Yamanaka; 直紀山中; Satoshi Hanzawa; 敏半澤; Yosuke Terao; 陽介寺尾
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2014-05-19

Abstract

【課題】タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を用いた前記タンパク質の製造方法において、培養した前記形質転換体内から抽出した前記タンパク質を含む抽出液より、夾雑タンパク質を効率的に除去することで、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供する。
【解決手段】前記抽出液をｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理することで、夾雑タンパク質を効率的に除去する、前記タンパク質の製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、組換えタンパク質を発現可能な形質転換体から、前記タンパク質を効率的に製造可能な方法に関する。特に本発明は、培養した前記形質転換体内から抽出した前記タンパク質を含む抽出液より、前記タンパク質以外の夾雑タンパク質を効率的に除去して製造する方法に関する。

タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体を用いた前記タンパク質の製造において、前記形質転換体内に前記タンパク質を発現している場合、前記形質転換体を培養後、当該培養した形質転換体内から超音波破砕、フレンチプレス処理、リゾチームなどの酵素を含む試薬や界面活性剤を含む試薬の添加、などにより前記タンパク質を抽出する必要がある。しかしながら、得られた抽出液には、前記タンパク質の他に、前記形質転換体に由来する夾雑タンパク質を多く含んでおり、そのまま分取用カラムにアプライすると、前記夾雑タンパク質のカラム充填材への吸着により、形質転換体内に発現した前記タンパク質を効率よく回収することができない。このため通常は、分取用カラムにアプライする前に、前記夾雑タンパク質を除去する精製操作を行なう。

従来から行なわれている、抽出液から夾雑タンパク質を除去する方法として、硫酸アンモニウムを用いた塩析による方法や、アセトンやエタノールなどの有機溶媒を用いた方法があげられる。しかしながら硫酸アンモニウムを用いた塩析による方法は、塩析で生じた沈殿物が容器に付着するなどの物理的ロスや、凝集した不純物による沈殿物再溶解の阻害により、目的タンパク質の回収率が低下する問題があった。また有機溶媒を用いた方法は、タンパク質を不可逆的に変性させる可能性があった。

本発明の目的は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を用いた前記タンパク質の製造方法において、培養した前記形質転換体内から抽出した前記タンパク質を含む抽出液より、夾雑タンパク質を効率的に除去することで、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供することにある。

本願発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、組換えタンパク質を発現可能な大腸菌（形質転換体）内から抽出した前記組換えタンパク質を含む抽出液を、一定の条件で酸処理することで、前記大腸菌由来の夾雑タンパク質を効率的に除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は以下の発明を包含する。

（１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、前記培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する工程と、前記タンパク質を含む抽出液をｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理して前記タンパク質を精製する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。

（２）ｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下での酸処理を、前記タンパク質を含む抽出液に酢酸を添加することで処理する、（１）に記載の製造方法。

（３）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（１）または（２）に記載の製造方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の製造方法は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、前記培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する工程を行なった後、前記タンパク質を含む抽出液をｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理して前記タンパク質を精製する工程を行なうことで、抽出液に含まれる夾雑タンパク質を効率的に除去し、抽出液中に含まれる前記タンパク質の純度を向上させることを特徴としている。

本発明の製造方法の特徴である酸処理は、超音波破砕、フレンチプレス処理、リゾチームなどの酵素を含む試薬や界面活性剤を含む試薬などの添加、などにより形質転換体内から抽出して得られた抽出液に、有機酸または無機酸を添加することで、抽出液に含まれる前記形質転換体由来の夾雑タンパク質を変性させて沈殿させた後、前記沈殿を遠心分離で除去して行なえばよい。酸処理に用いる有機酸または無機酸に特に限定はなく、酢酸、リン酸、硝酸が例示できる。その中でも、夾雑タンパク質を変性させ沈殿させる効果が特に高い酢酸が、酸処理に用いる酸として好ましい。

有機酸または無機酸の添加量については、ｐＨ５．０より中性側では夾雑タンパク質を十分に沈殿させることができないことから、ｐＨ２．５からｐＨ５．０（好ましくはｐＨ３．０からｐＨ４．０、さらに好ましくはｐＨ３．０からｐＨ３．５）の範囲となるよう、添加すればよい。なお有機酸または無機酸を抽出液に添加する際は、滴下した酸の抽出液中への拡散を促すために撹拌しながら添加するとよい。酸処理する際の温度は、４℃から２５℃の範囲で行なえばよく、４℃から１０℃の範囲で行なうと好ましい。酸処理の時間は、有機酸または無機酸添加後、１分から４８時間（好ましくは５分から２４時間、さらに好ましくは１５分から２時間）行なえばよい。

前記酸処理により、夾雑タンパク質の除去および形質転換体内に発現したタンパク質の精製を行なった後、当該処理液をそのまま使用することもできるが、液体クロマトグラフィーなど当業者にとって公知の手法を用いて、前記タンパク質をさらに高度に精製すると好ましい。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、前記タンパク質を高純度に調製することができる。

本発明の製造方法で得られたタンパク質の分析方法は、抽出液、酸処理液等から安定的にかつ効率的に定量できる方法であれば特に限定はなく、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）やウェスタンブロット法があげられる。

本発明の方法で製造するタンパク質は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の菌体内に発現するタンパク質であれば特に限定されない。ここでは前記タンパク質の一例である、ヒトＦｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。

本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。

本発明の製造方法は、組換えタンパク質を発現可能な大腸菌（形質転換体）内から抽出した前記組換えタンパク質を含む抽出液を、ｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理する工程を行なうことを特徴としており、前記工程を行なうことで、抽出液に含まれる前記大腸菌由来の夾雑タンパク質を効率的に除去し、抽出液に含まれる前記組換えタンパク質の純度を向上させることができる。したがって、前記抽出液に対し液体クロマトグラフィーによるさらなる精製を行なう場合、前記工程を行なわなかった場合と比較し、カラム精製時の吸着ロスなどが低減する。結果として、本発明の製造方法により、前記組換えタンパク質を高純度かつ効率的に製造することができる。

酢酸、リン酸、硝酸を用いて抽出液を酸処理した場合と、酸処理しない場合とで、抽出液中に含まれるヒトＦｃ結合性タンパク質の純度を比較した図。酢酸を用いて抽出液をｐＨ３．０、ｐＨ３．３、ｐＨ３．５で酸処理した場合と、酸処理しない場合とで、抽出液中に含まれるヒトＦｃ結合性タンパク質の純度を比較した図。

以下、ヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を用いた場合を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

実施例１
（１）特開２０１２−０３４５９１号公報に記載の方法により、ヒトＦｃ結合性タンパク質を生産する形質転換体を培養し、当該形質転換体菌体を得た。
（２）得られた菌体を０．２％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．３ｇ／Ｌリゾチーム（リゾチーム太陽、太陽化学社製）、２５０ｕｎｉｔ／ＬＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＭＥＲＣＫ社製）および６ｍＭＭｇＳＯ_４を含む、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、撹拌することでタンパク質を抽出した。
（３）（２）の抽出液に、酢酸、１０％（ｖ／ｖ）リン酸、または１０％（ｖ／ｖ）硝酸を、ｐＨが３．０となるまで、それぞれ撹拌しながら３０分から１時間かけて滴下することで酸処理を行なった。
（４）（３）の酸処理で析出した沈殿を遠心分離で除去後、得られた上清中のヒトＦｃ結合性タンパク質の量を以下に示すＥＬＩＳＡ法で、得られた上清中のヒトＦｃ結合性タンパク質を含む全タンパク質の量をＢｒａｄｆｏｒｄ法で、それぞれ測定した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定し（４℃で１８時間）、固定化終了後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）によりブロッキングした。
（４−２）前記洗浄緩衝液にて洗浄後、酸処理液を１．０ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ａｎｔｉ−ｈＦｃγＲ１／ＣＤ６４抗体試薬（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加した（３０℃で１時間）。
（４−４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＧｏａｔａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ−ｈ＋ＩＨＲＰ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（４−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。

結果、酢酸、リン酸または硝酸による酸処理を行なった場合の、抽出液（遠心分離で得られた上清）中のヒトＦｃ結合性タンパク質濃度はそれぞれ、１５５ｍｇ／Ｌ、１３４ｍｇ／Ｌ、１１１ｍｇ／Ｌとなり、抽出液中の全タンパク質濃度は、それぞれ、５４０ｍｇ／Ｌ、１９７０ｍｇ／Ｌ、および７８０ｍｇ／ｍＬとなった。すなわち、抽出液中の全タンパク質に占めるヒトＦｃ結合性タンパク質の割合（純度）はそれぞれ、０．２８７、０．０６８、０．１４２となった。

比較例１
実施例１（１）に記載の方法で得られた菌体を、実施例１（２）に記載の方法でタンパク質を抽出し、当該抽出液を遠心分離後、得られた上清について、実施例１（４）に記載の方法でヒトＦｃ結合性タンパク質の量および全タンパク質の量を測定した。結果、抽出液（遠心分離で得られた上清）中のヒトＦｃ結合性タンパク質濃度は２３３ｍｇ／Ｌ、抽出液中の全タンパク質濃度は１７６１０ｍｇ／Ｌとそれぞれなり、抽出液中の全タンパク質に占めるヒトＦｃ結合性タンパク質の割合（純度）は０．０１３となった。

実施例１および比較例１の結果をまとめたものを図１に示す。比較例１の方法（図１の「未処理ｐＨ７」）と比較し、本発明の方法（図１の「ＡｃＯＨｐＨ３（酢酸処理）」、「１０％Ｈ_３ＰＯ_４ｐＨ３（リン酸処理）」および「１０％ＨＮＯ_３ｐＨ３（硝酸処理）」）は純度が５．２倍から２２．１倍向上していることがわかる。特に酢酸を用いて酸処理した場合は、比較例１と比較し純度が２２．１倍向上していることから、酸処理に用いる酸として好ましいことがわかる。

実施例２
（１）実施例１（１）に記載の方法で得られた菌体を、２％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％（ｗ／ｖ）臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、０．２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、６５０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＰＭＳＦ、２５０ｕｎｉｔ／ＬＢｅｎｚｏｎａｓｅおよび２ｍＭＭｇＳＯ_４を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、撹拌することでタンパク質を抽出した。
（２）（１）の抽出液に、酢酸を、ｐＨが３．０、３．３または３．５となるまで、それぞれ撹拌しながら３０分から１時間かけて滴下することで酸処理を行なった。
（３）（２）の酸処理で析出した沈殿を遠心分離で除去後、実施例１（４）に記載の方法で得られた上清中のヒトＦｃ結合性タンパク質の量および全タンパク質の量を測定した。

結果、ｐＨ３．０、ｐＨ３．３またはｐＨ３．５で酢酸による酸処理を行なった場合の、抽出液（遠心分離で得られた上清）中のヒトＦｃ結合性タンパク質濃度はそれぞれ、１２８ｍｇ／Ｌ、１２８ｍｇ／Ｌ、１５７ｍｇ／Ｌとなり、抽出液中の全タンパク質濃度は、それぞれ、６２５０ｍｇ／Ｌ、５２３０ｍｇ／Ｌ、および６３１０ｍｇ／ｍＬとなった。すなわち、抽出液中の全タンパク質に占めるヒトＦｃ結合性タンパク質の割合（純度）はそれぞれ、０．０２０、０．０２４、０．０２５となった。

比較例２
実施例１（１）に記載の方法で得られた菌体を、実施例２（１）に記載の方法でタンパク質を抽出し、当該抽出液を遠心分離後、得られた上清について、実施例１（４）に記載の方法でヒトＦｃ結合性タンパク質の量および全タンパク質の量を測定した。結果、抽出液（遠心分離で得られた上清）中のヒトＦｃ結合性タンパク質濃度は２７２ｍｇ／Ｌ、抽出液中の全タンパク質濃度は１８２７０ｍｇ／Ｌとそれぞれなり、抽出液中の全タンパク質に占めるヒトＦｃ結合性タンパク質の割合（純度）は０．０１５となった。

実施例２および比較例２の結果をまとめたものを図２に示す。比較例２の方法（図２の「未処理ｐＨ７．０」）と比較し、本発明の方法は純度が１．３倍から１．７倍向上していることがわかる。

実施例３
（１）実施例１（１）に記載の方法で得られた菌体を、２％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％（ｗ／ｖ）臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、１ｍＭＥＤＴＡ、６５０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＰＭＳＦ、２５０ｕｎｉｔ／ＬＢｅｎｚｏｎａｓｅ、および２ｍＭＭｇＳＯ_４を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、撹拌することでタンパク質を抽出した。
（２）（１）の抽出液に、ｐＨが３．０となるまで、酢酸を撹拌しながら３０分から１時間かけて滴下することで酸処理を行なった。
（３）（２）の酸処理で析出した沈殿を遠心分離で除去後、実施例１（４）に記載の方法で得られた上清中のヒトＦｃ結合性タンパク質の量および全タンパク質の量を測定した。

結果、抽出液（遠心分離で得られた上清）中のヒトＦｃ結合性タンパク質濃度は２５３ｍｇ／Ｌ、抽出液中の全タンパク質濃度は４８００ｍｇ／Ｌとそれぞれなり、抽出液中の全タンパク質に占めるヒトＦｃ結合性タンパク質の割合（純度）は０．０５３となった。

比較例３
実施例１（１）に記載の方法で得られた菌体を、実施例３（１）に記載の方法でタンパク質を抽出し、当該抽出液を遠心分離後、得られた上清について、実施例１（４）に記載の方法でヒトＦｃ結合性タンパク質の量および全タンパク質の量を測定した。結果、抽出液（遠心分離で得られた上清）中のヒトＦｃ結合性タンパク質濃度は３３７ｍｇ／Ｌ、抽出液中の全タンパク質濃度は２８６００ｍｇ／Ｌとそれぞれなり、抽出液中の全タンパク質に占めるヒトＦｃ結合性タンパク質の割合（純度）は０．０１２となった。

実施例３および比較例３の結果をまとめると、比較例３の方法と比較し、本発明の方法は純度が４．４倍向上していることがわかる。

以上をまとめると、本発明の方法で実施する酸処理により、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体の培養液から得られた菌体より、当該タンパク質を効率的に精製する（純度を高める）ことができるため、その後の高純度な精製を容易に実施することができ、結果として高純度な前記タンパク質を効率的に製造することができる。

Claims

タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、前記培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する工程と、前記タンパク質を含む抽出液をｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理して前記タンパク質を精製する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。
ｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下での酸処理を、前記タンパク質を含む抽出液に酢酸を添加することで処理する、請求項１に記載の製造方法。
タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、請求項１または２に記載の製造方法。