TWI361689B - Substituted 2-alkyl quinazolinone derivatives as parp inhibitors - Google Patents

Description

1361689 .九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 —本發明係關於PARP抑制劑以及提供化合物與含被揭 路的化合物之組成物，此外，本發明提供使用所揭露的 5 PARP抑制劑作為醫藥品的方法。 【先前技術】 核的酵素，聚(ADP-核糖）聚合酶_1(pARIM)* pARP 、酵素家族的成貞之-，此成長巾的pARp酵素類包括，例 10 如：PARIM，PARP-2，pARP-3 與 Va泰PARP ;以及錨 蛋白酶類（TankyraseS，TANKS)，例如：ΤΑ·」，tank_2 與TANK-3 ; PARP也被歸之為聚（腺苷5，_二磷酸_核糖）聚 合酶或PARS (聚(ADP-核糖)合成酶）。 PARP-1是具有116 kDa的主要的核蛋白，組成自三 15 個區域：N-端DNA結合的區域，其含有兩個含鋅指形結 癱 合位點（zinc finSers) ’自動修飾區域與C-端催化性區域， • 它存在於幾乎所有的真核生物中，此酵素合成聚(ADP-核 糖），一種可包含超過200個ADP_核糖單位之分枝的聚合 物，聚(ADP-核糖）的蛋白質受器類直接地或間接地參與維 20 持DNA的完整性，它們包括組織蛋白類，拓樸異構酶類， DNA以及RNA聚合酶類，DNA連接酶類，與Ca2+_& Mg2+· 依賴的核酸内切酶類；PARP蛋白質被高度表現於許多的 組織中’最著稱的是在免疫系統、心臟、腦及種系 (germ-line)細胞，在正常的生理狀況下，pARp是處於最 i1361689 低的活性狀況，然而，當DNA受損會立即引起高達500 倍的PARP活化反應。

10 15

錨蛋白酶（Tankyrases，TANKs)被發現是作為人類端 粒的複合物(human telomeric complex)的組成分，它們也被 提出在泡囊非法交易（vesicle trafficking)過程中扮演某種 角色且可能在蛋白質參與各種的其他的細胞内的過程中 提供作為一種臨時舞臺；在染色體的維持與安定性方面極 其重要的端粒’係受到一種特殊化的反轉轉錄酶--端粒酶 (Telomeres)來維持’ TANK類為具有一些同時為帶信號的 與細胞骨架蛋白質兩種特徵之(ADP-核糖）轉移酶，它們含 有PARP區域’用於催化受質蛋白質類之聚-ADP-核糖化 反應，與某些傳訊息的分子共有之SAM(sterile alpha motif)，以及ANK區域，其含有24個相同於細胞骨架蛋 白錨蛋白之錨蛋白（ankyrin)重覆單元，此ANK區域與端 粒的蛋白質-端粒重覆結合的因子-1 (Telomere Repeat binding Factor-1, TRF-1)交互作用，這些蛋白質因此被命 名為TRF1-交互作用的，錨蛋白_相關的ADP-核糖聚合酶 (TANKs)。 TANK的更特殊的官能之一是TRF-1之ADP-核糖化 作用；人類端粒功能需要兩個端粒_專性的DNA結合的蛋 白質’ TRF-1與TRF-2, TRF-2保護染色體末端，而TRF-1 用於調節端粒的長度’ ADP-核糖化反應抑制TRF-1結合 至端粒的DNA之能力，此種TRF-1的聚-ADP-核糖化作 用自端粒釋放TRF-1，打開端粒的複合物並允許接近至端 20 粒酶’因此’ TANK的作用如同端粒長度的正調節物，允 許措由端粒酶加長端粒。 在許多因PARP(尤其是PARP-1)提供的功能中，其主 要角色為：藉由ADP-核糖化作用使DNA修復變成容易， 並因此係共同協力於許多的DNA修復蛋白質，在pARp 活化後，NAD+值明顯降低，強力的parp活化作用，使 得遭逢嚴重DNA損害之細胞中的NAD+值大幅滑落，聚 (ADP-核糖）的短半-生期導致快速的流動率，一旦聚(ad 核糖)被形成’它很快地受到結構地活性聚(ADP-核糖）聽 水解酶(PARG)，一起與磷酸二酯酶以及(ADp·核糖）蛋白 質裂解酶之作用而被降解；PARP與PARG形成一循環用 於轉換大量的NAD+成ADP-核糖，在少於丨小時内，pARp 之過度-刺激可引起NAD+與ATP之滑落至少於正常值之 20%，這樣的情節在局部缺血期間，氧氣的剝奪已劇烈地 危及細胞能量輸出時尤其不利，接著在再流通時產生游離 基被認為是引起組織傷害的主要原因，部分的Ατρ降落， 在局部缺血與再流通期間，在許多器官中為典型的反應| 可由於聚(ADP-核糖）的轉移被連結至NAD+消耗，於是， PARP或PARG之抑制相被翻能用於保存細胞能量 值’於是可使組織在㈣局部缺▲傷害後得以增加存活 能力。 聚(ADP-核糖）合成也參與發炎反應必要之許多基因 之誘導表現，PARP__壓制可誘發的—氧化氣 酶(iNOS)產生於巨嗟細胞，ρ·類型選擇素(selectin)與分子 間的祐附;7子-1 (ICAM-1)產生於内皮細胞，這樣的活性構 成PARP抑制劑類呈現之強力的抗·發炎效果，pARp抑制 作用能簡—时條料隸與浸職錢 減少壞死。 PARP被㈣的DNA斷片活化，且一旦被活化，其催 化钻附達⑽ADP_核糖單位至各種的核蛋白f，包括板 織蛋白倾PARP本身，在較大的細胞壓力，pARp被強 力活化下，由於儲存的能量被消耗殆盡而可能迅速地導致 細胞的傷害或死亡’由於每四分子的Ατρ供應每—να〇+ 分子之再生’ NAD+因大量的PARp活化作用而被消耗之 時’為了再合成NAD+，ATP也會被折損。 已有報告說，PARP活化作用在nmda—與N〇_誘導的 神經毒性中扮演了關鍵的角色，這也經證明於皮層的培養 物與海馬區切>{，其中毒性的預防係直接㈣於pARp# 制作用潛力；PARP抑制劑類在治療神經退化性疾病與頭 部創傷的潛在角色因此被認知，雖然其真正的作用 未被說明。 類似地，已證明，單純地注射pARp抑制劑類已可減 少兔子心臟或骨骼肌因局部缺血與再灌流所造成之栓塞 大小，這些研究中，單獨地注射3_胺基_苯甲醯胺（1〇毫 /公斤），不管是在阻塞前一分鐘或再灌流前一分鐘施行， 均有類似地縮減心臟梗塞(32_42%)的結果，而使用1 5· 一 經基異料(1毫克/公斤），其為另種pARp抑制劑時’，^； 縮減栓塞大小達相當的程度（38_48%)，由這些結果可人理 1361689

ίο 15

2〇 制賴可事先搶救缺續㈣或骨路肌組織 的冉7翟々丨L暢害。 PARP活化作用也可被使用於測量導因於曝露在任何 下述誘發劑所起之神經毒性凌#後之傷害：穀胺酸(經由 NMDA受體刺激作用）’具反應性的氧中間物，澱粉樣的 β蛋白質N-甲基-4-苯基_ι，2,3,6_四氫0比咬(MpTp)或其活 性代謝物Ν.甲基_4_苯基Μ(Μρρ+)，其參與病理的狀 況，例如：中風，阿耳滋海默氏症與巴金森氏症，其他研 究也持續發覺到PARP活化作用在試管中腦的粒細胞與在 ΜΡΤΡ中之神經毒性的角色，過度的神經曝露於榖胺酸， 其作為主導的中樞神經系統神經遞質且作用於Ν_曱基D_ 門冬胺酸(NMDA)受體類與其他的亞型受體類，最常出現 為中風或其他神經退化過程之結果；在缺血性腦傷害期 間，例如中風或心臟病，被奪走氧氣的神經元釋放出相當 大量的榖胺酸，過量的榖胺酸回頭造成N-甲基-]>門冬胺 酸(NMDA)，AMPA，紅藻胺酸(Kainate)與MGR受體類之 過度刺激(刺激毒性，excitotoxicity)，打開離子通道並允許 不受管制的離子流動（例如，Ca2+與Na+進入細胞而κ+流 出細胞），導致過度刺激神經元；被過度刺激的神經元分 泌更多的穀胺酸，產生回饋圈或骨牌效應，最後經由產生 蛋白酶、解脂酶與游離基等造成細胞傷害或死亡；榖胺酸 受體類的過度的活化作用已被認為牽涉在許多的神經疾 病與病況中，包括：癲癇，中風，阿耳滋海默氏# ’巴金 森氏病，肌萎縮性側索硬化(ALS)，亨丁頓氏症，人格分 裂症’ ‘fe性疼痛，缺氧後之局部缺血與神經損耗，低血糖 症:絕血症，創傷，與神經受傷，穀胺酸曝露與刺激已被 暗不為強迫症之原g) ’特別是藥物依賴性；證據包括，在 很多種的動物巾H以及經處理榖減或NMDA之 在腦皮質培養物中，榖胺酸受體拮抗劑類（即，可阻斷榖 ，酸結合至其受體或活化其受體之化合物類）阻斷了血管 衝擊後之傷害，企圖藉由阻斷NMDA、AMPA、紅藥胺酸 與MGR受體類而預防刺激毒性的方式已被證明相當困 難’乃由於各個受體具有多個榖胺酸可結合的位置，因此 尋找有效的拮抗劑類或萬能的拮抗劑類以防止榖胺酸結 合至所有受體及允許測試此種理論之混合物相當困難，再 者’許多有效於阻斷這些受體的組成物，對動物也具有毒 性’因此，目前仍不知可有效處理不正常的榖胺酸之組成 物，被穀胺酸刺激之NMDA受體，例如，活化酵素神經 元的一氧化氮合成酶(nNOS)，導致形成一氧化氮(NO)，其 也媒介神經毒性，NMD A神經毒性也受到以一氧化氮合成 酶(NOS)抑制劑類處理或透過試管中nNOS的標靶的基因 瓦解而被預防。 PARP抑制劑類的其他用途為用於治療周圍神經傷 害，與導致病理疼痛之綜合症狀，所知之神經病變性疼 痛，例如因一般坐骨神經的慢性狹窄傷害（CCI)引起者與 其中脊髓背侧的角之經突觸的改變所引起者，特徵為出現 胞質與核質的過度色素沈著（所謂的”暗色”神經元）。 證據也顯示，PARP抑制劑類有用於供治療炎性腸

性的PARP活性的抑制劑，pARp 本甲醯胺，其為一種專 活性的抑制減少及發炎 反應並恢復遠端結腸的形態與能量。 …進-步的證據顯示，PARP抑制劑類有用於供治療關 節炎’此外，PARP抑制劑類似乎有用於供治療糖尿病， P ARP抑制_已證财用於供治療㈣素休克或敗血性 休克’ PARP抑制麵也被用於延長壽命及細胞的增殖能 力，包括疾病的治療，譬如皮膚老化，阿耳滋海默^症二 動脈硬化，骨關節炎骨質疏鬆症，肌肉營養不良症，骨骼 肌的退化性疾病，包括複製衰老，與年紀相關的肌肉退 化，免疫衰退，AIDS，與其他的免疫衰退疾病；並用於 修改變衰老細胞之基因表現。 也已知，PARP抑制劑類，例如3_胺基笨曱醯胺，影 響全面的DNA修復反應於，例如過氧化氫或離子照射。 PARP在修復DNA股破損處的主要角色已被充分建 立，尤其是直接受離子化照射所引起時，或間接地在受到 曱基化劑、拓樸異構酶I (t〇p〇isonierases I)抑制劑類與其 他的化學治療劑（例如順氯氨鉑與保米黴素）作用引起之 DNA損傷的酵素性修復後；許多使用„剔除基因 (knockout)’’小鼠’轉移_顯性的（trans_d〇minant)抑制作用模 式(DNA-結合區域的過度表現），反義及小分子量抑制劑類 的研究已證明，在誘導DNA損害後，PARP在修復及細 1361689 胞存活上之角色，PARP酵素活性的抑制作用必會導致腫 瘤細胞對DNA損害的處理之提昇的敏感性。 PARP抑制劑類已被報導為可有效放射性致敏化（缺 氧性）腫瘤細胞，並有效的預防腫瘤細胞在經放射性療法 後，從DNA的致命的與未達致死的傷害中，藉其阻止DNA 股斷裂再結合與影響許多的DNA損壞訊號路徑的能力而 復元。

10 PARP抑制劑類已被使用於治療癌症，此外，u.S.專 利N〇.5，177,075討論許多的異喧琳類被用於提升離子化 照射或化學療法劑對腫瘤細胞之致死效果，Weltin et al.， ”Effect of 6(5-Phenanthridinone) ’ 一種聚(ADP-核糖）聚合 酶的抑制劑，on Cultured Tumor Cells”，Oncol. Res.，6:9, 15

399-403 (1994)，討論PARP活性的抑制作用，腫瘤細胞 之減少的增殖作用，與當以烷基化藥物一起用於治療時之 明顯的增效作用。 本技藝的狀況的回顧’已被公開於：Li and Zhang in IDrugs 2001, 4(7); 804-812; Ame et al in Bioassays 2004, 26: 882-883 以及 Nguewa et al” in Progress in Biophysic &

Molecular Biology 2005, 88: 143-172。 對於有效的與有潛力的PARP抑制劑類仍有挎續的需 求’特別是產生最低副作用之PARP-1抑制劑類，本發明 提供化合物、組成物、方法、抑制的PARP活性供治療癌 症及/或預防因壞死或自我凋亡造成細胞的傷害或死亡而 產生之細胞的、組織及/或器官的傷害，本發明的化合物 -12- 20 1361689 與組成物尤其有用於提升化學療法與放射性療法之有效 性，其中主要的治療效果為目標細胞中造成之DNA傷害。 【背景文獻】 GB 1062357，公開於1967年3月22日，揭露具有抗 高血壓效果之啥吐酮衍生物。

10 DE 2258561，公開於1973年6月20日，揭露具有抗 高血壓作用之經取代的吡啶酮衍生物。 EP 13612，公開於1983年11月11日，揭露經取代的 六氫°比σ定院基喧°坐琳衍生物類，所揭露的化合物係血清素 -拮抗劑類，特別是本發明之No. 63化合物。 EP 669919,公開於1994年6月9日，揭露二曱基苯 並呋喃與二曱基苯並吡喃類作為5-HT3拮抗劑類。 15

US 5374637，公開於1994年12月20曰，揭露苯曱 醯胺衍生物類，此類化合物具有胃能動性之刺激性質。 EP 885190，公開於1998年12月23日，揭露1，4-二 取代的六氩°比咬衍生物，具有胃動能的性質。 EP 1036073，公開於1999年6月17日，揭露經取代 的喧。坐琳二酮衍生物類，其具有累積放鬆的性質。 EP 1355888,公開於2002年6月20日，揭露喹唑啉 _衍生物類作為P ARP抑制劑類。 【發明說明】 本發明相關於式⑴的化合物 -13- 20 1361689 N—Ck 炫二基.-

R1 Ο) 其^氧化物型式、藥學可接受的酸加成鹽類以及立體化學 異構物，其中 點線代表選擇的鍵； X々N- ’ >CHKR2-其中R2為胺基羰基；或 田乂為>〇11 - ’則r與-L-Z—起可形成雙價的下式基 10 15 -C(0)-NH-CH2-NR10- (a.1} 其中R1Q為笨基； 為-N_C(0)·或-N=CR4-，其中R4為經基； ^為氫，_基，Cl_6烷氧基或ci6烷基； R為氫，或烷氧基； Z 為選自下列的基

R5

(b-3) (Μ) R6

R5 (b-6)

(b-7) R5

(b-8) R5 •14- 20 1361689

(b-9)

R5

(b-11) 其中各R，R6 ’ R7與r8獨立地為選自氫，齒基 Ci-6烷基或Cl_6烷氡基；或 敗暴， R7與R8—起可形成具下式之雙價基： J-^ΎΎ Ο 10 -CH2-CR92.〇 -(CH2)3-〇. -〇-(CH2)2-0--CH=CH-CH=CH 其中各R9為獨立地選 i (c-l), (c-2), (c-3)或 (c-4) 氫或Ck烷基；且 15 20 L為選自下列之雙價基：一 NH_， mc(〇)-〇-Cl.6烧二基或 （0)^ L可以是直接鍵，當Xg>CR2_或當z u ，料··當X為〉CH-，—¥_為赠，第〜:點 4不疋一個鍵，Z為式(b·2)的基且L為-C(O)-,則-Cw烷二 基-為異於_CH2-CH2-之基。 式⑴的化合物也可呈現為其互變異構物型式，這類型 式雖未明確將其出示於上述化學式中，但被涵蓋於本發明 的範圍中。 上述定義中用到的許多名詞將在後面予以說明，這些 名詞有時候被單獨使用，有時候為複合名詞。 — 15- 1361689 5

10 在前面及後面的定義中，鹵基係指說，氯，漠與蛾； Cu烷基代表具有1至6個碳原子之直鏈或支鏈的飽和的 烴基，例如，曱基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，1-曱基乙基，2-曱基丙基，2-曱基-丁基，2-曱基戊基，等等； 烷二基係指具有1至6個碳原子之雙價的直鏈或支鏈 的飽和的烴基，例如，亞曱基，1，2-乙二基，1，3-丙二基， 1,4-丁二基，1，5-戊二基，1，6-己二基以及其分枝的異構 物，例如，2-曱基戊二基，3-甲基戊二基，2,2-二甲基丁 二基，2,3-二曱基丁二基，等等。 15

’’藥學可接受的鹽類'’一詞係指藥學可接受的酸或鹼加 成鹽類，上述的藥學可接受的酸或鹼加成鹽類係指式（I) 的化合物可形成之包括具治療活性的無毒性之酸與無毒 性的驗加成鹽型式，具有驗性性質之式（I)的化合物可被轉 變成為其藥學可接受的酸加成鹽型式，係以酸處理所述呈 鹼性型式之化合物，適當的酸類包括，例如，無機酸類， 例如氫鹵酸，例如，氫氯酸或氫溴酸；硫酸；硝酸；磷酸， 等等酸類；或有機酸類，例如，乙酸，丙酸，羥基乙酸， 乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸（即，丁二酸），順 丁烯二酸，反丁烯二酸，蘋果酸，酒石酸，擰檬酸，曱磺 酸，乙磺酸，苯磺酸，對-甲苯磺酸，環磺酸，水揚酸， 對-胺基水楊酸，巴泳酸(pamoic)，等等。 具有酸性性質之式（I)的化合物可被轉變成其藥學可 接受的鹼加成鹽，係以適當的有機或無機鹼處理所述的酸 性型態的化合物而得，適當的鹼鹽型式包括，例如，銨鹽 -16- 20 1361689 類，驗與鹼土金屬鹽類，例如鋰、鈉、鉀、鎮、釣鹽等， 有機鹼類之鹽類，例如，苯札辛（benzathine)，N—曱基七· 葡萄糖胺，海巴明（hydrabamine)鹽類，以及與胺基酸（例 如精胺酸、離胺酸等）形成之鹽類。 5 酸或鹼加成鹽也包含式（I)化合物能形成之水合物與 溶劑的加成物型式’這類型式的實例為水合物、醇化物等。

10 本文中’式(I)化合物之立體化學地異構物型式係指所 有式（I)的化合物可能擁有的’由相同原子，以相同序列組 成，但具有不能交換的不同三度空間結構之化合物，除非 另有說明或指示，化合物的化學代號涵蓋所述化合物可能 擁有的所有的立體異構型式，所述的混合物可含有所述化 合物的基本分子結構之所有的非鏡像物及/或鏡像物，式⑴ 化合物之所有的立體異構物，包括純態或彼此的混合物， 岣在本發明的範圍之内。 15

式(I)的化合物之iV-氧化物型式係指式⑴的化合物， 其中一或多個氮原子被氧化成所謂的ΛΓ_氧化物，特別是那 些氧化物’其中一或多個的六氣吨咬或六氮0比〇井的氣為 Μ氧化的。 “式(I)的化合物”一詞，也包括其#•氧化物型，藥學可 接受的酸或鹼加成鹽類與所有的立體異構物型式。 GB 1062357揭露具有抗高血藶效果之啥唾_衍生 物，DE 2258561揭露具有抗高血壓效果之經取代的咕咬 _衍生物，ΕΡ 13612揭露作為血清素-拮抗劑類之經取代 的六氫吡啶基烷基喹唑啉衍生物；ΕΡ 669919揭露二甲基 、17- 20 1361689 苯並呋喃與二甲基苯並吡喃，作為5-ΗΤ3拮抗劑類；US 5374637揭露具有胃腸的能動性刺激的性質之苯並醯胺衍 生物；EP 885190揭露具胃動能性質之1,4-二取代的六氫 吡啶衍生物；EP 1036073揭露具有積累的鬆弛作用性質之 經取代的喹唑啉二酮衍生物；EP 1355888揭露作為PARP 抑制劑類之喹唑啉衍生物類。 意外地’發現本發明的化合物顯現PARP抑制的活

性。 0 第一組令人感興趣的化合物包括那些式（I)的化合 物，其中適用一或多個下述限制： a) X為〉N-或〉CR2-，其中R2為胺基羰基； b) 當乂為>〇尺2- ’則R2與-L-Z可一起形成式（Μ)之雙價 基； 15 c) 一Ν=-Υ—為-N-C(O)-或_n=CR4-，其中 R4為羥美且 第二個點線為一個鍵； 土 _ d) R1為鹵基，Cu烷氧基或匚“烷基； e) R3為烷氧基； f) Z為選自下列之基：（b-1)，（b_3)，（b-4)，（b-5)，（b 20 (b-7) > (b-8) » (b-9) > (b-H) , (b-H) ; -6) ’ g) 各R5，R6’R7與R8為獨立地選自氫，胺基 或<^.6烷氧基； I·6、元基 h) L為選自下列的雙價基：_α〇)_ΝΗ_，___ 基-或-(:(0)-0-(^.6烷二基_。 U6燒二 •18· 1361689 第二組令人感興趣的化合物包括那些式（I)的化合 物，其中.適用一或多個下述限制： a) X&>CH-4>CR2-，其中R2為胺基羰基； 5 b) 當乂為>012-，則R2與-L-Z可一起形成式（a-1)之雙價 基； c) R1為氫； d) R3為氫；

10 e) Z為式(b-1)，（b-2)或(b-11)之基； f) 各R5，R6，R7與R8為獨立地選自氫或鹵基； g) L為選自-C(O)-，-C(0)-NH-，或-CXCO-Ck烷二基-之 雙價基；且 h) L可為直接鍵，係當又為>012-或當Z為式(b-11)之基 時。 15

第三組令人感興趣的化合物包括那些式（I)的化合 物，其中適用一或多個下述限制： a) 又為>(：11-或〉CR2-，其中R2為胺基羰基； b) R1為氫； c) R3為氳； d) Z為式(b-1)或(b-2)之基； e) 各R5，R6，R7與R8為獨立地選自氫或鹵基； f) L為選自-C(0)-或-C(0)-NH-之雙價基；且 g) L可為直接鍵，係當乂為>0112-時。 -19- 20 一組較佳的化合物包括那些式（I)的化合物，其中，X 為>〇^或>0112-，其中R2為胺基幾基；當乂為>0尺2·，貝，J R2可與-L-Z —起形成式(a-1)之雙價基；R1為氫；R3為氫； Z 為式(b-1)，（b-2)或(b-ΙΙ)之基；各個 R5，R6，R7 與 R8 為獨立地選自氬或鹵基；L為選自下列的雙價基：-〇(0)_， -C(0)-NH-，或-CW-Cu烷二基-;且L可為直接鍵，係 當X為>0112-或當Z為式(b-U)之基時。 較佳的一組化合物包括那些式⑴的化合物，其中，X 為〉CH-4>CR2-，其中r2為胺基幾基；R1為氫；R3為氫； Z為式(b-Ι)或（b-2)之基；各R5 ’ R6 ’ R7與R8為獨立地選 自氫或鹵基；L為選自下列之雙價基：-C(0)-或-C(0)-NH-且L·可為直接鍵，係當X為>Cr2_時。 最佳的化合物為 N〇.4、No.5、No.ll、No.12 與 No.14 之化合物。

化合物5 化合物4

化合物12 化合物11

1361689 式⑴的化合物可根據揭露於EP13612中的一般方法 製備，起始化合物及一些中間物為已知的化合物且為可購 得的或可根據通常為本技藝中已知之傳統反應方法製得 者。 5

10 一些製備方法將於後面作更詳細的描述，其他供取得 最後的式⑴化合物的方法被描述於實例中。 式（I)化合物，其中一N=-Y—為-N-C(O)-且第2個點 線為鍵結者，在這兒被歸之為式(I-a)的化合物，可藉由將 後者進行文獻已知的環化反應被衍生自適當的式（II)之經 取代的2-胺基羰基笨曱醯胺

或者，式(I)的化合物，其中-Cw烷二基-為-CH2-CH2- 且—N-'-'-Y—為-N-C(O)-且第2個點線為鍵結者，被歸之 20 為式（I-b)的化合物，可利用文獻中所知的環化方法，以適 當的式（IV)之經取代的2-胺基羰基苯曱醯胺將式(III)的中 間物進行環化而得。 -21 - 1361689

式(I)的化合物，其中—為-N-C(O)-且第二個 點線不是鍵結者，被歸之為式（I-c)之化合物，可藉由與適 當的經取代的式(VI)的中間物環化式（V)之適當的經取代 之2-胺基笨曱醯胺而得，所述的環化反應可方便地在適當 的溶劑（例如，醇類，例如甲醇，乙醇，丙醇等)存在下， 將反應劑一起攪拌而進行，稱微加溫並添加催化性劑量的 適當的強酸，例如鹽酸等，可提高反應速率。

式（I)的化合物也可經由文獻已知的反應或官能基轉 形反應被彼此轉換，部分這類的轉形反應己在前面被描述 過；其他實例為：水解羧酸酯類成相關的羧酸或醇；水解 醯胺類成相關的羧酸或胺；水解腈類成相關的醯胺類；利 用文獻所知的重氮化反應及接著的以氫置換重氮基，可將 在味嗤或笨基上的胺基被取代成氫；醇類可被轉變成其醋 類與賴；-級賴可_變成二級或三㈣類；雙鍵可 •22. 1361689 被氫化成相_單鍵；位於祕上㈣基，在適當的絲 化劑存在下藉由-氧化碳插人反應，可被轉變成一種醋 基。 本發明也相關於使用被定義如上的式⑴化合物作為 醫藥品之用途。 本發明的化合物具有PARP抑制的性質，從下面的實 驗部分可以看出。

ίο PARP —詞在本文中的意義係指一種具有聚_ADp_ 核糖化作用活性之蛋白質，就此種定義，PARp涵蓋由parp 基因、其變種所編瑪得的所有蛋白質，以及其薄片蛋白 質’此外’本文中的"PARP” 一詞包含parp同功的 (analogues)，同源的（homologues)與其他動物之同功物。

”PARPn—詞，包括，但不限於PARIM，就此含義， 可包括 PARP-2，PARP-3，Vault-PARP (PARP-4)，PARP-7 (TiPARP) ’ PARP-8，PARP-9(Bal)，PARP-10，PARP-11， PARP-12，PARP-13，PARP-14，PARP-15，PARP-16， TANK-卜 TANK-2，與 TANK-3。 能同時抑制PARP-1與錨蛋白酶2之化合物具有有利 的性質，在癌症細胞中，它們具有增加的生長抑制的活性。 本發明也盤算使用化合物用於製備供治療被描述於 此的動物中發生之疾病及病況之醫藥的用途，其中所述化 合物為式(I)的化合物 -23- 20 1361689 Ο) 其氧化物型式，藥學可接受的加成鹽類以及立體化學的 異構物型，其中， 點線代表選擇的鍵結； X為琳，>CH-或>CR2_，其中R2為胺基羰基；或 10 當X為>CR2-，則R2與-L-Z可形成下述之雙價基 -C(〇)-NH-CH2-NR10- (a_1} 其中Rio為苯基； 广7:一為.C(〇)·或-N=CR4- ’其中R4為羥基； 3為氣，鹵基，Cl-6烷氧基或C!-6烷基； 15 •Cl—炫二基

R 為氫’或C1-6烷氧基； z 為選自下列的基： 20

(b-4)

(b-8) R5 -24- 1361689

(b-9) R5

N-O (b-10) R5

(b-H) R5

10 其中各R5，R6，R7與R8獨立地為選自氫，鹵基，胺基’ 〇1_6烧基或匚1-6炫*氧基，或 R7與R8—起可形成下列之雙價基： -CH2-CR 2·〇"* (c-1), -(CH2)3_〇- (c-2), -o-(ch2)2-o- (c-3)或 -CH=CH-CH=CH- (c-4) 其中各R9獨立地為選自氫或Cm烷基；且 15

L為選自下列的雙價基：-C(〇)_ ’ -C(0)-NH-，-QCO-Ck 烷二基-或-QCO-O-Ck烷二基或 L可為直接鍵，係當X為〉CR2-或當Z為式(b-ΙΙ)之基時。 本發明的化合物以其PARP結合的性質來看，可被使 用作為參考化合物或示縱化合物，在其中分子的原子之一 可被取代成，例如，放射性同位素。 為製備本發明的藥學組成物，將作為活性組成分之有 效量的特定化合物，呈鹼或酸加成鹽型式者，與藥學可接 受的載劑密切混合，其中的載劑視供投與的製 =多種型式，這些藥學组成物有必要呈單位的劑 適於，較佳地經由口服、首 腸、皮下、或非經胃腸注射的 •25- 20 ¢361689

10 15

方式投與，例如，製備呈口服劑型的組成物時，可應用任 何習用的製藥學的介質，例如，製備像是懸浮劑、濃漿液、 触劍與/谷液劑時，可使用水、甘醇類、油類，醇類，等等； 或使用像疋凝粉、糖、高嶺土、潤滑劑、轴結劑、崩散劑 等固體載劑以製備呈粉劑、丸粒、膠囊與錠劑之組成物； 由於易於投與起見，錠劑與膠囊劑為最有利的劑量單位型 式，其中顯然要使用固體藥學載劑。非經胃腸投藥的組成 物I載劑通常包括無菌水，至少佔一大部分，也可加入其 他的組成分’例如，助溶劑；可注射的溶液類，其載劑可 包栝，例如，食鹽溶液，葡萄糖溶液或食鹽溶液與葡萄糖 混合之溶液；可注射的懸浮液可應用適當的液體載劑、懸 浮劑等製備；在適於供皮下施用的組成物中，載劑可選擇 地包含助穿透劑及/或適當的可濕劑，選擇地併用微量比 例之任何適當的天然物，其不會造成皮膚明顯傷害者；這 類添加物可協助容易地施用至皮膚及/或有助於配製所要 的組成物’這些組成物可用各種方式被投與，例如，作成 經皮膚的貼片、作成供點上的組成物、作成油膏；尤其有 利的是’將上述藥學組成物配製成劑量型式供易於投與型 式與均勻的劑量型式，在說明書及專利中所稱之劑量單位 犁成孫指適於作為單獨的呈物理分離的單位，各單位中含 有預定$的活性組成分，其為經計算與所要的藥學載劑在 一起此產生所要治療效果的量者，這類劑型單位型式的實 ，為鍵劑（包括藥心與包衣的銳劑）、膠囊劑、丸劑、粉劑 藥包、薄酥片、可注射的溶液劑或懸浮劑、茶匙、湯匙等 -26- 1361689 等，以及其分隔的多重型式。 5

10 本發明的化合物可治療或預防因壞死或自我凋亡所 引起的細胞受損或死亡而造成之組織傷害；可改善神經的 或心血管組織的傷害，包括病灶缺血、心肌梗塞、及再灌 流的傷害；可治療受PPAR活性引起的或惡化的多種疾病 與病況；可延長或增加細胞的壽命或增殖能力；可改變衰 老細胞的基因表現；可放射性致敏化（radiosensitize)及/或 化學致敏化（chemosensitize)細胞，通常，PARP活性的抑 制’可減少細胞能量的損失，以神經細胞之情況下，預防 其發生神經元的不可逆的去極化作用，於是可用於神經保 護作用。 15

基於前述的理由’本發明也相關於投與足以抑制 PARP活性之具治療有效量的上述被定義的化合物，用於 治療或預防產生自壞死或自我凋亡的細胞受損或死亡而 致之組織傷害，非藉由NMDA毒性媒介之用於影響神經 活性，藉由NMDA毒性媒介之用於影響神經活性，用於 治療產生自局部缺血及再灌流傷害之神經組織傷害，神經 性疾病以及神經退化性疾病；用於預防或治療血管衝擊； 用於治療或預防心血管疾病；用於治療其他病況及/或疾 病’例如與年紀相關的肌肉退化，aids及其他免疫衰老 疾病，炎症，風濕痛，關節炎，動脈硬化，惡病質，癌症， 包含複製的哀老之骨路肌的退化性疾病，糖尿病，頭部創 傷，炎性腸疾（例如結腸炎與局部性迴腸炎），肌肉萎縮， 骨關節炎，骨質疏鬆症，慢性及/或急性疼痛（例如神經病 •27- 20 1361689 變性疼痛），腎衰竭，視網膜的 如内毒素性休克），以及皮膚老j P缺血，敗血性休克（例 殖能力；用於改變衰老細胞的其’延長細胞的壽命與增 或放射性致敏化(缺氧性)腫瘤^錢；化學致敏化及/ 物的疾病與病況係包括對所述’本發明也關於治療動 的上述已鑑別之化合物類。 物投與具治療有效量

明確地，本發明係關於—#、A

ίο 神經的疾病的方法，其係包括c—或抑制動物的 θ /Λ μP脒8|丨夕仆人私* 厅迷動物投與具治療有效 神經的疾病係選自包括下列 疾病·因物Li疾病狀^丨起的周圍神經病變，創傷 性腦傷害’賴的物理傷害，因中 = 的疾病以及與神經退化相關的神=傷害，難脫失 15

本發明也企圖使用式(I)的化合物供抑制pARp活性， 供治療、預防或抑制因壞死或自我壯之細胞傷害所引起 的組織傷害，供治療、預防或抑制動物之神經疾病。 ，，預防神經退化作用”包括有能力去預防新近被診斷為 帶有神經退化〖生疾病或有危險發展成為新的神經退化性 疾病者，以及供預防己遭遇神經退化或具有神經退化的病 徵患者的病情惡化。 π治療”一詞係涵蓋在動物，特別是人類中的疾病及/ 或病況之治療，且包括.（i)對於尚未被診斷出具有疾病， 但有傾向發生疾病及/或狀況之對象給予預防疾病及/或病 況；（ii)抑制疾病及/或病况，即，制止其發展；（iii)解 -28· 20 1361689 除疾病及/或病況，即，使疾病及/或病況復元。

10 ”放射致敏劑（radiosenhtizer)”係指一種分子，宜為低 分子量分子，經投與治療有效量給動物後，能増加細胞對 於離子化照射之敏感性及/或促進可藉離子化照射治療的 疾病之治療者，可藉離子化照射治療的疾病包括資生瘤疾 病，良性的與惡性的腫瘤’以及癌細胞，未被列示於此之 其他疾病的離子化放射性治療也為本發明企圖涵蓋之部 分。 ”化學致敏劑（chemosensitizer)"係指一種分子，宜為低 分子量分子’經投與治療有效量給動物後，能增加細胞對 於化學療法之敏感性及/或促進可藉化學療法治療的疾病 之治療者，可藉化學療法治療的疾病包括贅生瘤疾病，良 性的與惡性的腫瘤，以及癌細胞，未被列示於此之其他疾 病的化學療法治療也為本發明企圖涵蓋之部分。 15

本發明的化合物、組成物及方法，特別有用於供治療 或預防因壞死或自我凋亡之細胞死亡或傷害所引起的組 織傷害。 本發明的化合物可以是"抗〜癌劑類，，，此名詞也包含” 抗-腫瘤細胞生長劑與”抗-贅生瘤劑”，例如’本發明的方 法有用於供治療癌症與癌症中的化學致敏的及/或放射性 致敏的腫瘤細胞，例如ACTH-產生的腫瘤，急性淋巴性血 癌’急性非淋巴性血癌，腎上腺皮質癌’膀胱癌，腦癌， 乳癌，頸部的癌症’慢性淋巴癌，慢性髓母細胞血癌，大 腸直腸癌’皮下T-細胞淋巴癌，子宮内膜癌，食道癌， •29· 20 1361689

10

Ewing's肉瘤膽囊癌，髮細胞血癌，頭&頸癌，Hodgkin's 淋巴瘤，Kaposi's肉瘤’腎癌，肝癌，肺癌（小型及/或非 小型細胞），惡性的腹腔擴散液，惡性的胸腔擴散液，黑 色素瘤’中皮層瘤，多重骨髓瘤，神經母細胞瘤，非-Hodgkin's淋巴瘤，骨癌，印巢癌’卵（精細胞)癌，前列腺 癌’胰臟癌，陰莖癌，視網膜胚細胞瘤，皮膚癌，軟組織 肉瘤，鱗狀細胞癌，胃癌’睪丸癌曱狀腺癌，滋養葉的贅 生瘤，子宮癌’陰道癌’會陰癌以及Wilm’s腫瘤。 因此，本發明的化合物可被用作為”放射性致敏劑” 及/或"化學致敏劑”。 15

放射性致敏劑是為人所知之一種化合物，其被用於增 加癌性細胞被曝露於離子照射下毒性效果之敏感性，放射 性致敏劑作用模式的許多機制，已在文獻中被提及，包括： 缺氧性細胞放射性致敏劑類（例如，2-硝基咪唑化合物類， 與苯並三畊二氧化物化合物類），在缺氧下模仿氧或行為 像是生物還原劑；非-缺氧性細胞放射性致敏劑類（例如， 鹵化的嘧啶類）可作為D N A鹼基之類似物且優先被結合至 癌細胞之DNA並因此促進放射-誘發的DNA分子的斷裂 及/或防止正常DNA修復機制；與各種已被假設於放射性 致敏劑用於治療疾病之其他潛在的作用機制。 目前的許多癌症治療程序，應用放射性致敏劑與χ_ 射線的照射’ X-射線活化的放射性致敏劑之實例包括，但 不限於 ： metronidazole ， misonidazole ， desmethylmisonidazole ’ pimonidazole ’ etanidazole ’ -30- 20 1361689 mmorazole，mitomycin C，RSU 1069，SR 4233，E09 , RB 6145 ’菸鹼醯胺’ 5-溴去氧尿苷（BUdR)，5-碘去氧尿苷 (IUdR) ’溴去氧胞苷，氟去氧尿苷(FudR)，羥基尿素，順 氣氨麵’與具治療效果的類似物以及相同的衍生物。

10 癌症的光照療法(Photodynamic therapy, PDT)應用可 視光作為放射性致敏劑之放射活化劑，光動能的放射性致 敏劑的實例包括’但不限於：血π比σ各紫質（hematoporphyrin) 衍生物類’ Photofrin，苯並。比洛紫質（benzoporphyrin)衍生 物類’錫（etioporphyrin)，pheoborbide-a，細菌葉綠素-a (bacteriochlorphyll-a) ’ 萘敵氰類（naphthalocyanine?)，酞 氰類(phthalocyanines)，醜氰鋅(zinc phthalocyanine)，與具 治療效果的類似物以及相同的衍生物。 15

放射性致敏劑可與具治療效果量的一或多種其他化 合物一起使用，包括，但不限於：能促進放射性致敏劑進 入標乾細胞之化合物；能控制治療劑、營養物、及/或氧 氣的流動至標靶細胞之化合物類；不管有無另外的照射下 能作用腫瘤之治療劑；或其他供處理之癌症或其他疾病具 治療效果的化合物；可被與放射性致敏劑聯合使用的其他 的治療劑之實例包括’但不限於：5-氟嘧啶二酮’福林酸 (leucovorin)，5'-胺基-5'去氧胸苦，氧氣，高壓氧 (carbogen)，紅細胞轉輸(red cell transfusions)，高氟烴類 (perfluorocarbons，例如 ’ Fluosol 10 DA) ’ 2,3-DPG， BW12C，鈣通道阻斷劑類，pentoxyfylline，抗血管生成化 合物類，hydralazine，與LBSO ;可被與放射性致敏劑聯 -31 - 20 1361689 5 合使用的化學治療劑之實例包括，但不限於：adriamyCin， camptothecin，carboplatin，順氯氨鉑（cisplatin)， daunorubicin，docetaxel ’ doxorubicin，干擾素（aipha，beta， gamma)，白細胞介素2，伊林諾貼肯(irin〇tecan)，太平洋 紫杉醇(paclitaxel) ’托波貼肯（topotecan)，與治療有效的 類似物與其衍生物。

10 化學致敏劑類可被與具有治療劑有效量的一或多種 其他的化合物類聯合使用，包括，但不限於： 能促進化學致敏劑進入標靶細胞之化合物；能控制治 療劑、營養物、及/或氧氣的流動至標靶細胞之化合物類； 作用腫瘤之治療劑或其他供處理癌症或其他疾病具治療 效果的化合物；可被與化學致敏劑聯合使用的其他的治療 劑之實例包括’但不限於：曱基化劑，拓樸異構酶I抑制 15

劑類與其他的化學致敏劑類，例如，順氯氨翻與保米黴素 (bleomycin)。 式(I)的化合物可被用於供偵測或鏗定PARP，特別是 PARP-1受體，在此目的下，式(1)的化合物可被標記，所 述標記物可選自包括：放射性同位素，旋轉標記（spin label)，抗原標記(antigen label)，酵素標記(enzyme labd) 螢光基（fluorescent group)或化學冷光基（chemiluminiscent group) ° 從事本行的行家由後面呈現的試驗可容易地決定出 有效量’通常’被建議的有效量將為自〇 〇〇1毫克/公斤至 100毫克/公斤體重，且特別是自〇.〇〇5毫克/公斤至10毫 -32· 20 克/公斤體重’可以將適當量的一天用劑量分成二、三、 四或多次分量，在適當的時間間隔下施用，所述的分量可 被配製成單位劑1型式，例如，每單位劑量型式含有〇 至500宅克，且特別是含有〇1毫克至200毫克的活性組 成分者。 眚驗部分 之後，"DCM”係代表二氯曱烷，”DMF，，係代表" 二曱基甲醯胺，|’MeOH”係代表甲醇，”]VIIK”代表甲基 異丁基酿I ’ ’’MEK"代表曱基乙基酮，”TEA”代表三乙基胺 且"THF”代表四氫咬喃。 A.中間化合物之芻借 實例A1

±.閒..物].灸製.備. 將2-[(4-氯-1-酮基丁基)胺基]-笨甲醯胺（〇 莫耳）， 4_苯基六氫吡啶羧醯胺(〇.〇3莫耳）與TEA (0.1莫耳）混 合於乙腈（150毫升）後’攪拌迴流過夜，濃縮除去溶劑 後’加水至殘留物中，油質層經三氯曱烷萃取，乾燥，過 濾’再蒸發除去溶劑，殘留物以置於玻璃過濾器上之矽膠 純化（溶離液：三氣曱烧/MeOH 95/5)，收集含產物之劃分， 蒸發除去溶劑，收得5克(40.8%)的中間物1。 -33·

-34· 1361689

將2-[(l-酮基-2-丙烯基)胺基]-苯曱醯胺(0.02莫耳）， 1-(4-就苯基）-2-(4-六氫n比啶基)_乙酮（〇 〇2莫耳）與碳酸氫 鈉(4克）混合於2-丙醇（15〇毫升)後，攪拌及迴流過夜，趁 熱將反應昆合物過濾，蒸發除去溶劑，殘留物經管柱層析 法在矽膠上層析兩遍（流洗液：三氣曱烷/Me〇H95/5)，收 集含產物的劃分’蒸發除去溶劑，殘留物置於2-丙醇予以 再結晶，虼集沈澱，可得2克（25%)的化合物3，熔點 159.10C。 實例B2 &1.盒激.1..&崖.憊. 將中間物1(0.012莫耳）混合於氫化鈉（6〇毫升）與乙醇 (100亳升)後’授拌迴流加熱U小時，蒸發除去溶劑，加 水至殘留物中，油質層經三氣曱烧萃取，乾燥，過據，蒸 發除去溶劑，自MIK/2-丙醇進行再結晶，收集所要1物^ 乾燥’製付2克(41,7〇/〇)的化合物4，溶點138 9〇C。 實例B3 &盒.物„1..左1備 將2-胺基笨甲醯胺(0·027莫耳)與中間物6⑺㈣莫 -35· 20 1361689 耳）混合於乙醇（100毫升）後，加熱並以鹽酸c.p.(3毫升) 將混合物酸化，反應混合物經攪拌迴流過夜，蒸發除去溶 劑後，濃縮，加入NH4OH溶液，濾下所得沈澱，溶解入 三氯曱烷，乾燥，過濾，蒸發除去溶劑，殘留物自MeOH 5 中再結晶，收集所得沈澱，可得3克(28%)的化合物5， 熔點 216.1°C。

•36· 1361689 表F-1列出的化合物係根據上述實例之一製備者。

10 15

0 ^55^JL^NH 〇 Co.No. Ι,ΕΡ 13612 Co. No. 3; Ex. [Bl]; mp. 159.1°C ο^νη2 0 O^NHz οφτ^^χ) 0 Co. No. 4; Ex. [B2]; mp, 138.9°C Co. No. 5; Ex. [B3]; mp. 216.1°C 0 Oh 0 o Co. No. 9; Ex. [Bl]; mp. 188.2°C Co. No. 10; Ex. [B2]; mp. 234.3°C 〇L^nh2 0 0 Co. No. 11; Ex. [B2] Co. No· 12; Ex. [B2]; mp. > 300°C H H 9 Cv^H 0X/ Ο H Co. No. 2; Ex. [B2]; mp. 243°C Co. No.6; Ex. [B3]; mp. 251°C 〇cJr^N〜化 0 Co. No. 7; Ex. [B3]; mp. 239.8°C Co. No. 8; Ex. [B3]; mp. 194.4°C H ςν 〇 Co. No. 13; Ex. [B3]; mp. 232.9°C Co. No. 14; Ex. [B2] -37- 9 藥學的實例 以試營中閃蟀桿訊测定法（Scintillation Proximity Assay. SPA)測定PARP-1物制的活性 本發明的化合物以SPA技術(ProPrietary t0 Amersham Pharmacia Biotech)，在試管中分析被測試。 原則上，此分析係仰賴已充分被建立之SPA技術，其 係供偵測生物素化的標靶蛋白質類（即組織蛋白質）之聚 (ADP-核糖基），此核糖化作用係使用切斷的（nicked) DNA 活化的PARP-1酵素與[3H]-菸鹼醯胺腺苷二核苷酸 ([3H]-NAD+)作為ADP-核糖基供應者。 作為PARP-1酵素活性的誘導物，製備切斷的DNA， 為此，將25毫克的DNA (供應者：Sigma)溶解於25毫升 的 DNAse 缓衝液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4 ; 0.5 毫克/毫升 之牛血清白蛋白（BSA) ; 5 mM MgCl2.6H20 與 1 mM KC1) 後’加入50微升的DNAse溶液（1毫克/毫升，溶解於0.15 Μ的NaCl)，在37°C下培育90分鐘後，經添加1.45克的 NaCl中止反應’接著在58°C下再培育15分鐘，在冰浴 上將反應混合物冷卻後，在4°C下以1.5升的0.2M KC1 分別透析1.5與2小時，並以1.5升的o.oiM KC1分別透 析1.5與2小時兩次’將混合物作成分量，並儲存於_2〇〇c; 使用Amersham的生物素化反應套組將組織蛋白（1毫克/ 毫升，類型II-A，供應商：Sigma)予以生物素化並分量地 儲存於-20°C下，製備溶解於pBS之1〇〇毫克/毫升SpA K乙烯基曱本）（PVT)珠粒（供應商：Amersham)的儲備 -38- 1361689 液；利用添加120微升的[3Η]_ΝΑ〇+(〇] mCi/毫升 商.NEN)至6毫升的培育緩衝液(5〇mMTds/Hc 0.2 mM DTT ; 4 mM MgCl2)以製備[3Η]·ΝΑΙ)+之儲備溶 t 10 15

液，製備溶解於培育緩衝液(得自儲存於_2〇它，在水中之 100 mM儲備溶液)之4 mM NAD+ (供應商：尺沉“)溶液； PARP-1酵素係使用文獻已知的技術產生，即，從人類肝 cDNA開始進行無性繁殖與表現蛋白質；有關使用的 PARP-1酵素的蛋白質序列之相關資訊包括文獻參考資料 可得自Swiss-Prot資料庫，主要登錄號為p〇9874,將生物 素化的組織蛋白與PVT-SPA珠粒混合並在室溫下預培育 30分鐘；PARP-1酵素（濃度視批次而定）與切斷的DNa混 合後，在4°C下預培育30分鐘，將等份量的此種組織蛋白 /PVT-SPA珠粒溶液與pARP_丨酵素/DNA溶液混合並將乃 微升的此混合物與1微升的化合物置於DMS0，對96槽 微滴定板中的每槽加入25微升的[3H]-NAD+，培育混合物 中含有各物的最後浪濃度為：2微克/毫升的生物素化的組 織蛋白，2毫克/毫升的PVT-SPA珠粒，2微克/毫升的切 斷的DNA與介於5-10微克/毫升的PARP-1酵素，在室溫 下將混合物培養15分鐘後，添加在培養緩衝液中之1QQ 微升的4mMNAD+(最後濃度為2mM)並將板子混合。 讓珠粒沈降至少15分鐘，板子被移置至 TopCountNXT™ (Packard)供閃爍計數，所得數值以每分鐘 閃爍數（cpm)表示，就每次實驗，平行測試對照組（含 PARP-1酵素與DMSO，不含化合物）、空白培育組(僅含 -39- 20 MSO ’不含PARp i酵素或化合物）以及樣品組（含 /RIM酵素與溶解於DMS〇中之化合物），所有試驗的化 :物均疋被溶解於DMSO且進一步被稀釋於DMS〇 ,初 次f試時，化合物在1G·5的濃度下被測試，當化合物在 ⑺員示活性時’製出其中化合物濃度為介於1〇_5與1〇 8 ，的濃度之劑量·反應曲線’各個試驗均從對照組與樣品 、且減去空白值’對照樣品代表最大的PARP-1酵素活性， ，各樣品’ Cpm @量相對於對照組的啊被表示成百分 1適备地，可使用線性内插法，從介於50〇/〇值上下的竇 驗點’由電腦推算出IC5〇值（用於減少pARpj酵素活 組的观之藥物的濃度)’此處的試驗化合物 破表示成PIC5Q(IC5()值的請數值），至於參考化合物， :基士8-萘亞Si胺也被包含於確認SPA分析，試ς化人_ 物在最邳試驗濃度為1〇·5 Μ下顯現抑制的活性（見表2)σ 中過瀘分析PARP-丨抑 本發明的化合物以試管中的過渡分析被 PARPd活性(在切斷的DNA存在下被啟動）之卜^取得 其組織蛋白聚(ADP-核糖基）化作用活性，使用’藉由 作為ADP-核糖供應者，具放射性的核糖基化的纟 類以三氯乙酸(TCA)沈澱於96-槽濾板，而二入的織蛋白 閃爍計數器測量。 ' L P]使用 將組織蛋白（儲備液：5毫克/毫升，在 NAD+(儲備液：lOOmM，在 H2〇 中）' 與[32pi 2 +中）、 ’、J'NAt)+ 〇» • 40- 1361689 置入培育緩衝液内（50 mM Tris/HCl，PH 8; 0.2 mM DIT ; 4 5

10 mM MgCl2)，另準備PARIM酵素(5 _1〇微克/毫升)與切 斷的DNA之混合物，切斷的DNA係如描述的方式在試管 中製備於SPA供測試PARP_i抑制的活性，將乃微升的 PARP-1酵素/DNA混合物，一起與i微升溶解於DMS〇 中的化合物與25微升的組織蛋白_NAD+/[32p]_NAD+混合 物加至96-槽過濾板(0.45微米，供應豪MiUip〇re)之每一 槽中，在培育混合物中的最後濃度為2微克/毫升的組織 蛋白，0.1 mM 的 NAD+，200 μΜ(0.5 μ〇的[32P]-NAD+與 2 15

微克/毫升的切斷的DNA;板子在室溫下被培育15分鐘， 中止反應係藉由添加1〇微升冰冷的1〇〇%TCA，接著添加 10微升冰冷的BSA溶液（1%之水溶液），在4〇c下放置1〇 分鐘以沈澱蛋白質劃分，板子以抽真空過濾，板子中各槽 在室溫下相繼以1毫升，1〇%冰冷的TCA'i毫升，5%冰 冷的TCA與1毫升，5%冰冷的TCA洗滌，最後在各槽 加入1〇〇微升的閃爍溶液(Microscint 40，Packard)，將板 子移置至TopCountNXTTM (供應商：packard)供閃爍計 數，所得值以每分鐘閃爍數表示（cpm),就每個實驗，平 行測試對照組(含PARP-1酵素與DMS〇，不含化合物）、 空白培育組（僅含DMSO ’不含pARp—丨酵素或化合物）以 及樣品組(含PARP-1酵素與溶解於DMSO中之化合物）， 所有忒驗的化合物均是被溶解於DMS〇且進一步被稀釋 於DMSO ,初次測試時，化合物在1〇·5的濃度下被測試， 當化合物在1〇-5Μ顯示活性時，製出其中化合物濃度為介

•4U 20 於10與10㈤的/辰度之劑量-反應曲線，各個試驗均從 對照組與樣品組減去空白值，對照樣品代表最大的 PARP-1酵素活性’ _各樣品，—$量相對於對照組的 cpm被表示成百分比，適當地可使用線性内插法，從介 於50%值上下的實驗點，由電腦推算出心值（用於減少 PARP-1酵素活性達對照組的5〇%之藥物的濃度），此處的 試驗化合物的效果破表示成pIC5〇(IC5〇值的負對數值），至 於參考化合物’ 4-胺基蓁亞醯胺也被包含於確認過濾 分析，試驗的化合物在最初試驗濃度為1〇-5M下顯現抑制 的活性（見表-2)。 以試·管中閃爍槿(SPA、測定TANK-2抑制的活性 本發明的化合物以SPA技術使用Ni閃光板(Flash plate，96或384槽）’進行試管中分析被測試。 原則上’此分析係仰賴SPA技術，使用[3H]-於鹼醯 胺腺苷二核皆酸([3H]-NAD+)作為ADP-核糖基供應者，供 偵測TANK-2蛋白質之自動-聚(ADP-核糖基)化作用。 [3H]-NAD+/NAD儲備溶液之製備：將64 6微升的 [3H]-NAD+ (0.1 毫 Ci/毫升，供應商：perkinElmer)與 46.7 微升NAD-儲備液（10.7 mM，被儲存於-20oC，供應商： Roche)加至1888.7微升的分析緩衝液中（6〇 mM Tris/HCl， pH 7·4 ; 0·9 mM DTT ; 6 mM MgCl2) ; TANK-2 酵素的產 生，如揭露於EP1238063中方法，將60微升的分析緩衝 液，一起與1微升溶解於DMSO中的化合物，20微升的 •42- [3H]-NAD+/NAD及20微升的TANK-2酵素（最後濃度為6 微克/毫升)加至96-槽經Ni塗覆的閃爍板(Perkin Elmer)上 之每一槽令’在室溫下培育120分鐘後，添加60微升的 中止溶液(42_6毫克NAD，於6毫升水中），覆蓋上封口板， 置於TopCountNXT™ (Packard)中進行閃爍計數，其數值 以每分鐘閃爍次數(cpm)表示，就每次實驗，平行測試對 照組（含TANK-2酵素與DMSO，不含化合物）、空白培育 組(僅含DMSO，不含TANK-2酵素或化合物）以及樣品組 (含TANK-2酵素與溶解於DMS〇中之化合物），所有試驗 的化合物均是被溶解於DMS〇且進一步被稀釋於 DMSO，初次測試時，化合物在1〇4的濃度下被測試，當 化，物在丨0、顯㈣性時，製出其中化合物濃度為介於 10 〃 10間的/辰度之劑量_反應曲線各個試驗均從對昭 ，樣品_去空白值’對照樣品代表最大的ΤΑΝΚ“ =5比對2品’cpm的量相對於對照組的cpm被表示 3二可使用線性内插法，從介於篇值上 二由電腦推算出1C5°值(用於減少·-2酵 組的5〇%之藥物的濃度)，此處的試驗化合 =m示成pic5〇(ic5°值的負對數值），至於參考化 5物，3-胺基本曱醯胺與4_ ^ 確認SPA分析，太他在产〇“奈亞醯胺也被包含於 的八供φ Γ 在槽板巾騎，在敗槽板 = 同繼濃度與容積，如果槽板結 槽板之結果^。果被併入至表_2,否則係示出得自似- •43- 1361689 表-2

化合物號碼 試管過濾分析 PAKP-1 pIC50 試管SPA分析 PARP-1 pIC50 試管SPA分析 TANK-2 pIC50 1 <5 2 5.303 6.414 <5 3 5.371 6.252 5.605 4 7.115 7.699 <5 5 6.523 7.64 <5 6 5.669 6.75 5.129 7 5.381 6.233 >5 8 5.804 6.627 <5 9 5.243 6.214 <5 10 5 6.376 5.674 11 5.942 6.725 <5 12 6.172 6.931 <5 13 5.332 6.497 6.028 14 6.263 7.232 <5 這些化合物可進一步在細胞内的化學-及/或放射性致 5 敏化分析中被評估，此分析係測定在癌細胞株中内生的 PARP-1活性之抑制作用以及最後在活體内之放射性致敏 性試驗。 -44-

Claims (1)

136*1689

十、申請專利範圍1 專利申請案第94121746號 ROC Patent Application No. 94121746 修正之申請專利範圍中文本-附件（二) Amended Claims in English-Encl. (ΙΠ (民國100年6月10日送呈） (Submitted on June 10, 2011) 1. 一種具式（I)的化合物

R1 〇) 其沁氧化物型式、藥學可接受的酸加成鹽類或立體化學 異構物型式，其中 點線代表選擇的鍵；

X為〉CH-或〉CR2-其中R2為胺基羰基； _Ν=^γ—為-NH-C(O)-或-N=CR4-，其中R4為羥基； 10 R1為氫，齒基，Cw烷氧基或Cu烷基； R3為氮’或Ci-6烧氧基， Z為選自下列的基

-45- 1361689 其中各R5，R6，R7與R8獨立地為選自氫，鹵基，胺基， 炫基或C!-6烧氧基；且 L 為選自下列之雙價基：-C(0)-NH-或-CCCO-Cw烷二 基-;或 L 可以是直接鍵，當乂為>^12-或當Z為式（b-ΙΙ)之基 時。

10 2. 根據申請專利範圍第1項的化合物，其中 R1為氫；R3為氫；Z為式(b-1)，（b-2)或(b-ΙΙ)之基；各個 R5，R6，R7與R8為獨立地選自氫或鹵基。 3. 根據申請專利範圍第1項的化合物，其中 R1為氫；R3為氫；Z為式(b-Ι)或(b-2)之基；各個R5，R6 ’ R7與R8為獨立地選自氫或鹵基；L為-C(0)-NH-;或L可 為直接鍵結，係當乂為>〇12-時。 4. 根據申請專利範圍第1項的化合物，其中化合物係選自 化合物]^〇.4、1^〇.5、>^〇,11與]^〇.12 15

化合物11

〇 化合物12 •46- 6. =申細嶋丨至4物—嫩合物，其作為 一種藥學組成物，其係包 性成分之具治療效果量的^予由可接文的載劑與作為活 中的化合物。 的根據申請專利範圍第…項 =製專利_6項㈣學組成物的方 須二入二子0 *的裁劑與根據申請專利範圍第1至4 項的化合物被密切地混合。 :種根據申請專利範圍第…項中任—項的使用化合 途用於製備-種供治療PARp媒介的疾病之醫藥品的用 9 :::用根據申請專利範圍第8項之化合物的用途，其 1〇㈣^㈣療―種PARpM介的疾狀醫藥品。 學範圍第8與第9項的用途，其中治療包含化 U.t申請專利範圍第8與第9項的用途，其中治療包含放 射性致敏性作用。 種式(I)的化合物與化學療劑的組合物。 種根據申請專利範圍第8項之化合物的用途，其用於 1備供治療癌症之醫藥品。 -47-