TWI344371B - Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides - Google Patents

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1344371 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關可抑制血管收縮素轉化酶因而可用爲具 有降血壓效應的健康食品、藥物等的成分之肽類。 【先前技術】 患有高血壓——種生活型態相關疾病的典型例子-的 φ患者數目正逐漸增加著。已知者，高血壓會誘發出多種倂 發症例如腦出血、蜘蛛膜出血、腦梗塞、心肌梗塞、痠痛 病、腎硬化、等等。因此，對於高血壓的起始機制已有多 種硏究進行過。 有關血壓調節系統，與血壓增高相關的血管緊張肽原 酶-血管收縮素系統及與血壓降低相關的激肽釋放酶-激 肽系統扮有重要角色。於血管緊張肽原酶-血管收縮素系 統中，從肝分泌出的血管收縮素原會被腎中產生的血管緊 •張肽原酶轉化成血管收縮素I。血管收縮素I會被血管收縮 素轉化酶（ACE )進一步轉化成血管收縮素II。血管收縮 素系統Π會誘導血管平滑肌的收縮因而增高血壓》另一方 面，降血壓系統中的激肽釋放酶對激肽原作用因而變成血 管舒緩激肽（bradykinin)。亦即，已知者，ACE透過上 述二種效應而參與在血壓增高之中，亦即產生作爲一血管 加壓神經肽（vasopressor peptide)的血管收縮素II及抑 制活化作爲降血壓肽的血管舒緩激肽。如此一來，可以經 由壓制ACE的酵素活性而減低血壓的增高。經開發成爲 1344371 ACE抑制劑的脯胺酸衍生物例如刻甫定（captopril )和恩 納比爾（enalapril)業經廣泛地用於高血壓的治療之中。 於最近數年內，業經報導者，用酵素消化食物所得之 肽類具有ACE抑制活性。例如，已有報導過一致數目的此 等消化產物，例如，明膠的膠原酶消化產物（日本專利公 開揭示內容SHO 52-148631)、酪蛋白的胰蛋白酶消化產 物（日本專利公開揭示內容S Η 0 5 8 - 1 0 9 4 2 5，日本專利公 φ開揭示內容SHO 59-44323，曰本專利公開揭示內容 SHO 60-23086，日本專利公開揭示內容SH0 60-23087，日 本專利公開揭示內容SH0 61-36226，及日本專利公開揭示 內容SH0 61 -36227 ) ，r—玉米醇溶蛋白的嗜熱菌蛋白酶 消化產物（日本專利公開揭示內容SH0 2-321 27 )，沙丁 魚肉的胃蛋白酶消化產物（日本專利公開揭示內容 HEI 3-11097)，乾鰹魚的嗜熱菌蛋白酶消化產物（日本 專利公開揭示內容HEI 4- 1 44690 )，芝麻蛋白質的嗜熱菌 φ蛋白酶消化產物（日本專利公開揭示內容Η EI 8 - 2 3 1 5 8 8 ) ，/t -酪蛋白的胃蛋白酶消化產物（日本專利公開揭示內 容 8-26908 8 )等。 此等ACE抑制性肽類，都是食物來源者，具有明顯的 優點，亦即，彼等具有很少安全性問題（如副作用、毒性 等）且如一般食物一樣可食用。不過，經報導上述肽產物 主要包括有5或更多個胺基酸的肽類（日本專利公開揭示 內容SH0 52-148631，日本專利公開揭示內容58-109425, 日本專利公開揭示內容SH0 59-44323，日本專利公開揭示 ί S1 -6- 1344371 ·· 內容60-23086，日本專利公開揭示內容SHO 61-36226，日 本專利公開揭示內容SHO 61 _3 622 7，曰本專利公開揭示內 容HEI 3 - 1 1 097，日本專利第3135812和日本專利公開揭示 內容HEI 8-2690 8 8 )。經指出者由更長的胺基酸鏈所構成 的肽類不能達到以試管內強ACE抑制活性爲基底的預期水 平之降血壓效應，可能是因爲彼等易於被體內的消化性酵 素所消化因而喪失A C E抑制活性之故，或者即使彼等保持 φ不被消化，彼等也會因爲彼等的龐大分子結構而不容易被 吸收。 【發明內容】 綜上所述，本發明的一項目的爲提供ACE抑制性三肽 類，彼等在經口攝入時不容易被消化性酵素所消化因而具 有較低在活體內失去彼等的ACE抑制活性之傾向。 於本發明中，也意欲提供可食用的（食物/飮料）組 φ成物，血管收縮素轉化酶抑制劑及降血壓劑，彼等都包括 一或多個上述三肽類。 發明詳細說明 本案發明人假設食物的嗜熱菌蛋白酶消化產物含有能 夠解決上述問題的肽類而尋找由不超過3個胺基酸所構成 的ACE抑制性肽類。其結果，他們成功地在芝麻的嗜熱菌 消化產物中發現出3個三肽類，該三肽類都具有ACE抑制 活性且在動物實驗中顯示出降血壓效應。本發明即根據此 [S] -7- 1344371 ·· 等發現而完成。 因而，本發明提供三肽類，分別具有胺基酸序列 Leu-Ser-Ala、Val-Ile-Tyr 和 Leu-Val-Tyr且顯示出血管收 縮素轉化酶抑制活性。 本發明進一步提供含有一或多個上述三肽類的可食用 組成物，血管收縮素轉化酶抑制劑及降血壓劑。 本發明三肽類可經由化學合成而產生。不過’於本發 φ明一具體實例中，三肽係加到食物，飲料或口服藥物內以 利用彼等的ACE抑制活性，此時，較佳者係經由用嗜熱菌 蛋白酶消化源自芝麻或類似者之內的植物蛋白質來產生富 含至少一種上述3種三肽的可食用組成物。 有關植物性蛋白質來源，可以使用富含蛋白質的植物 組織（較佳者爲種子），例如，縠類如米、小麥、大麥、 燕麥和玉米、或豆類如菜豆、蠶豆、大豆和綠豆、及芝麻 ΰ • 在用嗜熱菌蛋白酶消化以得到本發明肽類時，處理程 序係依起始物所具性質而變異。較佳者，作爲前處理者， 係將材料先去脂肪，例如用溶劑如醇、丙酮、己烷等擠揑 或萃取脂肪以移除汁液。爲了改進用嗜熱菌蛋白酶對起始 物的消化效率，也爲較佳者係將起始物細磨後，在攪拌下 懸浮於水中。於難溶性蛋白質的情況中，也可以採用另一 種前處理例如添加氫氧化鈉或加熱藉以均勻地溶解或懸浮 該蛋白質。然後於其中加入恰當量的嗜熱菌蛋白酶，較佳 者爲從5 00至5 0000 PU每克蛋白質，並在pH 5至9，溫度10 1344371 至80t，穩態或攪拌之下進行蛋白質消化反應。（w PU 〃意指a蛋白酶單位"，且1 PU係經定義的使用牛奶酪蛋 白作爲受質在pH 7.2和35°C下促成相當於1微克酪胺酸每 分鐘的非蛋白質Folin顏色的增加之酵素量）。要檢查反 應是否已有足夠的進展（亦即，反應是否是以得到所提出 的三肽），可以採用包括將液體反應混合物施加到使用 ODS管柱的高性能液體層析術及經由測量在210奈米（nm φ )的吸光度以測定溶析樣式"之方法。反應係經由添加， 例如，鹽酸予以停止。或者，可經由加熱將嗜熱菌蛋白酶 抑制活化。也可以同時添加鹽酸和加熱來停止反應。然後 將液體反應混合物離心、過濾，等並移除沈澱物。將如此 所得濾液用氫氧化鈉或鹽酸中和後予以濾縮。另外，若有 需要時，可用活性碳處理以移除異味（例如，苦味、澀味 、難聞味、等）。如此所得芝麻肽含有Leu-Ser-Ala、

Val-I丨e-Tyr和Leu-Val-Tyr含量各爲從0.001重量％至〇.1重 籲量％。 以上面所述方式得到之嗜熱菌蛋白酶消化產物可於在 有或沒有採用離子交換樹脂，高孔調型聚合物樹脂等進一 步處理以移除高分子量蛋白質，藉以提供富含本發明三肽 的部份純化產物之後作爲本發明三肽組成物之形式使用。 此等消化產物和部份純化產物於後文中有時候槪稱爲·^富 含三肽組成物〃。於需要時，此等組成物可用活性碳進一 步處理以去除異味（例如，苦味、澀味、難聞味、等）之 後再使用。 -9 - 1344371 ' 要得到本發明肽類的純化製備物時，係對上述濃縮物 施以膠濾管柱層析術，使用離子交換樹脂或高孔調型聚合 物樹脂之層析術，親和層析術等，並將具有A C E抑制活性 的溶析肽部份合倂。接著’可將合併的活性液份以純化肽 常用的方法予以純化，例如，使用逆相管柱如〇 D S管柱或 C 3 0管柱進行高性能液體層析術，藉此提供呈實質純態的 單一肽形式。本發明三肽不僅可用上述方法得自芝麻（如 •，胡麻（Sesamum indicum L.) ’而且也可以得自榖類例 如稻（例如，水稻（Oryza Sativa L.)、小麥（如小麥（ Triticum aestivum L.) , T. durum Desf.,圖錐小麥（T. turgidum L.,)、埃及小麥（T. pyramidale ( Delile ) perciv. non Delite ex Schult) ' T. abyssinicum Vavilov > 和 T. carthlicum Nevski )、大麥（如，大麥（Hordeum vulgare L.) ' 燕麥（如，燕麥（Avena sativa L.)或玉米 (如’玉蜀黍（Zeamyas)、或豆類（如菜豆（phaseolus Φ vulgaris L.)、蠶豆（Vicia faba L.)、大豆（如，大豆 (Glycine max ( L‘）Merrill )或綠豆（如綠豆（Vigna radiata ( L. ) R. Wilcz )。該三肽或富含三肽組成物所具 A C E抑制活性可用，例如，後文實施例中所要述及的試管 內試驗法及/或活體內試驗法予以測量。 於本發明每一肽係以化學合成法製備之時，該合成可 用合成肽中習用的固相法和液相法中任一者來進行。經由 合成所得本發明肽可用常用的純化程序予以純化，例如逆 相高性能液體層析術，使用離子交換樹脂或高孔調型聚合 -10- 1344371 _· 物樹脂的層析術，親和性層析術等。 如此所得三肽類和富含該三肽類的組成物具有強大的 抑制ACE之活性且於經口攝入時展現出強ACE抑制效應。 所以，彼等可用爲高強力A C E抑制劑。再者，彼等可以透 過胃腸道容易地被吸收且在墊下相當地穩定。由於此等特 性，彼等可用於多種形式的食品，飲料和醫學製劑之中。 據此，本發明提出一種可食用的組成物，其包括一或 鲁多種上述三肽且其預期具有血管收縮素轉化酶抑制作用： 一種血管收縮素轉化酶抑制劑及一種含有一或多種上述三 肽的降血壓劑。 於一或多種本發明三肽用於食品，飲料，藥物等之中 的情況中，可以使用從芝麻蛋白質部份的嗜熱菌蛋白酶消 化產物充分地純化出之三肽，或可以使用化學合成產物。 或者，由於本發明三肽具有高安定性及強ACE抑制活性， 可以使用上述經部份純化的產物或嗜熱菌蛋白酶消化產物 鲁或其經部份純化的產物本身作爲富含三肽的組成物；於此 情況中，同樣地也得到充分的ACE抑制活性，因而，此爲 本發明的較佳具體實例。 本發明可食用的組成物係經由添加單一攝取劑量爲從 0.001毫克至100毫克，較佳者從0.01毫克至20毫克且更佳 者從0.1毫克至10毫克之量添加一或多種上述三肽而製成 。本發明三肽係呈可以容易處置且高度溶於水中之固體或 粉末形式。此外，該等三肽可透過胃腸道獲得良好的吸收 。所以，該等三肽可以沒有特別限制地於任何階段以任何 -11 - 1344371 "方法添加到食物中。也就是說，該等三肽可用粉末，溶液 ’懸浮液等形式，在食物製造程序的起始階段，中間階段 或最後階段使用食品工業領域中常用的方法添加。含有本 發明三肽的可食用組成物之暫時，間斷，連續或每日攝取 可以抑制血管收縮素轉化酶且得到，例如，降血壓效應。 該等食品和飲料可呈’例如，固體、半固體或液體之形式 。固體食物的例子包括一般的食品與健康食品，呈餅乾、 鲁片、九等形式例如錠、膠囊、顆粒、粉末等。半固體食品 的例子包括呈糊、果凍、凝膠等形式者。液體食品的例子 包括一般飲品與健康飲料，呈果汁、冷飮、茶飲料、滋補 飮料等形式。此等食品或飲料可用營養補充飮料或佐料形 式供給以使我們可連續地攝取本發明三肽，藉而壓制血壓 增高的風險。 本發明醫藥組成物含有在量上類似於上述可食用組成 物的量之本發明三肽。本發明醫藥組成物可臨時給高血壓 鲁患者服用以壓制體內的血管收縮素轉化酶，藉此得到降血 壓效應。或者，本發明醫藥組成物可安全地連續給用，因 爲該活性成分係源自天然物質。有關本發明醫藥組成物可 治療及/或預防的疾病之例子，可提及者爲高血壓。較佳 者，該醫藥組成物係呈口服製劑形式例如錠劑、膠囊、粉 、粒或糖漿。非經腸給用所用製劑的例子包括經靜脈內、 動脈內、皮下、肌肉內或鼻內給用的無菌溶液。此等溶液 可呈乾固體形式，而於使用前才溶解。注射製劑可經由將 一有效量的三肽溶解在生理食鹽水中且在無菌條件下處理 is] -12- 1344371 而製成’如製造注射製劑所常用者。 【實施方式】 實施例 至此’本發明要參照下列諸實施例予以更詳細地說明 φ測量ACE抑制活性的方法 於本發明中，ACE抑制活性（IC5G )係根據下述方法 予以測量。

緩衝液·· 〇· 1 M HEPES，0.3 NaCl，0.01 % Triton-X (pH 8.3) 酵素：得自兔子肺的ACE(Sigma)。 溶解在上述緩衝液及經調整劑1 mU/50微升 濃度。 _ 受質：Bz-Gly-His-Leu-H2〇 ( Peptide Institute Inc. )° 將8.95毫克的受質溶解在1毫升二甲亞碼中 且用水進一步稀釋5倍（最後濃度：4 mM ) 〇

吸收5微升含有本發明肽的樣品到96 -洞微滴板內。 於添加25微升緩衝液和10微升酵素之後，充分地攪拌混合 物且在37°C下溫澱5分鐘。添加10微升受質之後，將混合 物置於37°C下反應30分鐘。然後添加40微升的0.1 N NaOH -13- 1344371 " 以停止反應。於添加20微升 1%鄰-酞醛/甲醇溶液且 靜置於室溫下1 0分鐘之後，加入1 〇〇微升〇. 1 N HC1並將所 得混合物在37°C下溫浸30分鐘。然後經由將在組胺酸殘基 所含胺基與鄰-酞醛之間反應形成的螢光性物質予以激發 (於3 5 5奈米）且測量在460奈米波長的螢光而測定ACE水 解所形成的His - Leu之量。根據下面的方程式測定本發明 肽的百分抑制率且計算出A C E抑制活性（IC 5 〇 ) φ 百分抑制率={ 1-(A-a)/(B-b) } xl 00 A :加入樣品時的螢光測量値。 a :加入樣品且以緩衝液取代酵素加入時的螢光測量 値。 B :加入蒸餾水取代樣品時的螢光測量値 b :加入蒸餾水取代樣品及加入緩衝液取代酵素時的 螢光測量値 •實施例1 :肽的製造和純化 將2升的水加到1 0 〇克去脂芝麻中並經由添加n a Ο Η將 所得混合物的ρ Η値調整到1 2 · 0至1 2.5。於5 5 °C下攪拌1小 時之後，過減混合物而得蛋白質萃取物。於蛋白質萃取物 中加入HC1以調整pH値到4_0。於離心之後，得到芝麻蛋 白質（乾基重量：19.8克）。 於10克所得芝麻蛋白質中，加入300毫升的水並用 NaOH將混合物的pH値調整到7.5。然後於其中加入10毫 克的嗜熱菌蛋白酶（Nacalai Tesque，7000 PU /毫克）且 I S3 -14- 1344371 ·· 將混合物置於6 5 °C下溫和攪拌反應6小時。於反應完全之 後，於反應混合物中加入HC1以調整到pH 4.0並加熱到90 °C 1 〇分鐘以抑活化該嗜熱菌蛋白酶。於加熱之後，離心 移除如此形成的沈澱物並將上澄液濾過濾紙（Toy 〇，No .2 )。將濾液冷凍乾燥而得5.9克肽粉末。 將80毫克此肽粉末溶解在2毫升10%乙醇溶液中並施 以膠濾管柱層析術。所用條件如下。 φ 管柱：Bio-Gel P-2 ( 15 毫米 IDx820 毫米 L， B i 〇- Rad )。 溶析劑：1 〇 %乙醇。 流速：0.1 5毫升/分鐘。 偵檢：UV 210奈米。 以1 5分鐘間隔使用液份收集器分液收集得自管柱的溶 析液。根據上述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結 果，在液份32至38中觀察到在上述條件下的主要ACE抑制 φ活性。將此等液份合倂及冷凍乾燥。重複此程序三次’因 而得到總共3 7.5毫克的肽。 接著，將以Bio-Gel P-2膠濾管柱層析術得到37.5毫克 ACE抑制活性肽溶解在2毫升的純化水中且使用〇DS管柱 施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條件如下。 管柱：Develosil ODS-10 (20 毫米 IDx250 毫米L， Nomura Chemical ) 〇 移動相··緩衝液 A : 5% CH3CN，0.1% TFA。 緩衝液B: 40%CH3CN，0.1%TFA。 [S] -15- 1344371 • 梯度：〇至20分鐘：0%緩衝液B。 20至80分鐘：0至100%緩衝液B。 流速：1 0毫升/分鐘。 偵檢：UV 210奈米。 於上述條件之下，使用液份收集器以1分鐘間隔逐液 份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一96 -洞微 滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微 φ升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上 述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份39、 52和54顯示出強ACE抑制活性。將該3液份分別冷凍乾燥 因而從每一液份得到小量的肽。 液份39中的ACE抑制性肽之純化 將液份39的冷凍乾燥肽溶解在200微升的純水中且使 用C 30管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條 φ件如下。 管柱：Develosil C30-UG-5 ( 10 毫米 IDx250 毫米 L ，Nomura Chemical) 。 移動相：緩衝液：5% CH3CN ’ 0.1 % TFA。 流速：4毫升/分鐘。 偵檢：UV 210奈米。 於上述條件之下，使用液份收集器以1 5分鐘間隔逐液 份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一 96 -洞微 [S1 •16- 1344371 滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微 升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上 述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份44和 45顯示出強ACE抑制活性。將該2液份分別冷凍乾燥因而 從每一液份得到小量的肽。接著，對此等部份施以胺基酸 分析與T〇F MS/MS分析。其結果，發現液份44和45的肽爲 Leu-Ser-Ala 〇 液份52中的ACE抑制性肽之純化 將液份52的冷凍乾燥肽溶解在200微升的純水中且使 用C 30管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條 件如下。

管柱：Develosil C30-UG-5 ( 10 毫米 IDx250 毫米 L )。 移動相··緩衝液：14% CH3CN，0. 1 % TFA。 流速：4毫升/分鐘。 偵檢：UV 210奈米。 於上述條件之.下，使用液份收集器以1 5分鐘間隔逐液 份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一96 -洞微 滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微 升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上 述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份89和 90與液份96和97顯示出強ACE抑制活性。將該4液份分別 i S] -17- 344371 冷凍乾燥因而從每一液份得到小量的肽。接著，對此等部 份施以胺基酸分析與TOF MS/MS分析。其結果，發現液份 89和90的肽爲Ile-Val-Tyr且液份96和97的肽爲Val-Ile-Tyr 液份54中的ACE抑制性肽之純化 將液份54的冷凍乾燥狀溶解在200微升的純水中且使 用C 30管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條 件如下。 管柱：Develosil C30-UG-5 ( 10 毫米 iDx250 毫米 L ，Nomura Chemical )。 移動相：緩衝液：17%CH3CN，0.1%TFA。 流速：4毫升/分鐘。 偵檢：UV 210奈米。 於上述條件之下，使用液份收集器以1 5分鐘間隔逐液 份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一 96 -洞微 滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微 升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上 述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份69至 73顯示出強ACE抑制活性。將該5液份分別冷凍乾燥因而 從每一液份得到小量的肽。接著，對其中的液份69、70、 72和73施以胺基酸分析與TOF MS/MS分析。其結果，發現 每一此等液份的肽皆爲Leu-Val-Tyr。 [S1 -18- 1344371 實施例2 :以化學合成製造肽 使用自動肽合成器（Model ABI 430，爲Appiied Biosystems所製），經由從C —端起始及根據程式以BOC 法依序延展肽鏈而合成一經有意保護的肽樹脂。 於肽在樹脂上的構造完成之後，將經保護的肽樹脂乾 燥。將如此得到的經保護肽去保護基且經由用無水氟化氫 處理（HF/對一甲酚8 : 2 Wv，60分鐘）而從樹脂承載體 取下肽。用90 %乙酸萃取如此所得粗製肽後冷凍乾燥而得 粉末狀固體。將如此得到的粗製肽用〇DS管柱以高性能液 體層析術進一步純化因而得到合意的肽。 管柱：YMC-Pack 0DS-2 ( 30 毫米 IDx250 毫米 L， YMC )。 移動相：緩衝液 A: 5%CH3CN，0.1%TFA。 緩衝液 B : 40% CH3CN，0.1 % TFA。 梯度：〇至10分鐘：〇%緩衝液B。 10至90分鐘：0至100%緩衝液B。 流速：20毫升/分鐘。 偵檢·· υν 220奈米。 經如此純化的肽所具純度再用〇 D S管柱以高性能液體 層析術予以檢驗。 管柱：Zorbax 300SB-C18 ( 46 毫米 iDxl50 毫米 L，

Agilent Technologies) ° 移動相：緩衝液 A: 1%CH3CN，〇.i%tfa。 -19- 344371 - 緩衝液 B : 60% CH3CN，0. 1 % TFA。 梯度：0至25分鐘：0至100%緩衝液B。 流速·· 1毫升/分鐘。 偵檢：UV 220奈米。

Leu-Ser-Ala之合成 使用Boc-Ala ( Brz )樹脂（0.5毫莫耳）作爲起始胺 φ基酸樹脂承載體，使用2 mM分量的胺基酸衍生物B〇C-Aia 和Boc-Leu延展肽鏈。然後以上面實施例2所述純化方法得 到經純化的Leu-Ser-Ala。該經純化的產物所具純度在用 上面實施例2中所述方法測量得知爲99.0%。

Val-Ile-Tyr之合成 使用Boc-Tyr ( Brz )樹脂（0.5毫莫耳）作爲起始胺 基酸樹脂承載體，使用2 mM分量的胺基酸衍生物Boc-Ile φ和Boc-Val延展肽鏈。然後以上面實施例2所述純化方法得 到經純化的Val-Ile-Tyr。該經純化的產物所具純度在用上 面實施例2中所述方法測量得知爲98.8 %。

Leu-Val-Tyr之合成 使用Boc-Tyr ( Brz )樹脂（0.5毫莫耳）作爲起始胺 基酸樹脂承載體，使用2 mM分量的胺基酸衍生物 Boc-Va丨和Boc-Leu延展肽鏈。然後以上面實施例2所述純 化方法得到經純化的Leu-Val-Tyr »該經純化的產物所具 -20- 1344371 純度在用上面實施例2中所述方法測量得知爲99.2%。 實施例3 :肽的ACE抑制活性之測量 實施例2所得3肽的ACE抑制活性係根據上面所述方法 測量且定出IC5〇値。表1顯示出結果。作爲對照者，也測 量實施例1所得芝麻肽粉末的ACE抑制活性且測定出其1C50 値。

表1 肽 抑制活性（IC50) 微克/毫升 UL Μ Leu-Ser-Ala 2.4 8.4 Val-Ile-Tyr 1.6 4.2 Leu-Val-Tyr 0.84 2.1 肽粉末 - 50.3 實施例4:肽對自然高血壓大鼠的降血壓效應 將17至22週大的SHR大鼠禁食整夜。然後將實施例2 中得3肽分別以1毫克/公斤的劑量經口給用。對-對照組 ，以相同量的水經口給用作爲比較。測量給用之前’及直 到24小時之後的收縮期血壓之變化（BP-98A，SOFTRON )。圖1顯示出結果。 實施例5 使用實施例2的合成產物，從下列諸成分製造穀物茶 飲料。 i S1 -21 - 344371 組成： 烤過的大麥 50克 熱水 2000毫升 實施例2的肽 Leu-Ser-Ala 19毫克 Val-He-Tyr 18毫克 Leu-Val-Tyr 18毫克 製造方法： 將熱水加到烤過的大麥且加熱到90 °C 5分鐘。於冷 卻到4 0 °C之後，過濾該混合物。然後將水加到萃取物中以 調整體積到2000毫升。接著，加入上述肽並攪拌溶解而得 穀的茶飲料。 貫施例6 :從蛋白酶處理過的植物種子離析及定量Leu-Val -Tyr 分別稱取2 5克的稻粒和燕麥粒，然後硏磨成粉。於每 一粉中加入50毫升已烷且濾過濾紙（Whatman，N〇.1 )以 移除溶劑。重複相同的已烷處理，共4次。從濾紙上的剩 餘物移除己烷而分別得到18.8克去脂肪米粉末和15.9克去 脂肪燕麥粉。 分別稱取10克的去脂肪粉末，懸浮在200毫升0.01N NaOΗ中且在55 °C下攪拌1小時。於冷卻到室溫之後，將懸 浮液德過一濾紙（W h a t m a η，N 〇. 1 )。經由添加〇 . 1 N H C1 -22- 1344371 將濾液調整到pH 4.0。離心收集如此形成的沈澱物’冷凍 乾燥而分別得到〇 · 3 8克和〇 . 5 7克的米和燕麥粗蛋白粉末。 別稱取0.2克所得粉末，懸浮在10毫升0.1 mM CaCl2 中。將懸浮液整到pH 7.5，於其中加入0.2毫克嗜熱菌蛋 白酶（ 7.000 PU/毫克，Nacalai Tesque)以在 65°C 下溫和 混合實施酵素反應6小時。於反應期之後，以IN HC1調整 pH到4.0且在90°C加熱混合物10分鐘以抑活化嗜熱菌蛋 白酶。以3,0 0 0 rp m離心3 0分鐘以移除該經加熱所形成的 沈澱物。將上澄液冷凍乾燥而得28.6毫克來自稻米和87.8 毫克來自燕麥的肽粉末。 按下述進行上面所得稻米和燕麥肽粉中所含本發明諸 肽之一的Leu-Val-Tyr之離析與定量。 i )在PD-10管柱上預處理 分別稱取20毫克的稻米和燕麥肽粉，溶解在0.1 N乙 酸中到5毫克/毫升，濾經一微濾器（Millex-HV，孔徑 0.45 微米，濾器直徑 13 微米，Millipore Corporation)以 移除不溶性成分。取2.5毫升份的濾液導到用0.1 N乙酸平 衡過的PD-10管柱（脫鹽管柱，Amersham Biosciences) 中。用另一份3.5毫升體積0.1 N乙酸洗該管柱。然後收集 用另一 3.0毫升體積的0.1 N乙酸所溶析出之液份，蒸乾， 溶解在0.5毫升水中，再冷凍乾燥。

ϋ )使用 TSK-GEL G2000 SWXL進行膠濾 HPLC -23- 1344371 將在PD-10管柱上預處理所製樣品溶解在250微升45% CH3CN，0.1% TFA中，以2,000 rpm離心5分鐘。將濾液 經一微濾器（Millex-HV，孔徑0.45微米，濾器直徑13微 米’ Millipore Corporation)以移除不溶性成分。 將一5 0微升份的濾液給到一用4 5 % CH3CN - 0.1 % TF A平衡過的 TSK-GEL G2000 SWXL 管柱（7.8x300 毫米’ Tosoh Corporarion)，且用 45% CH3CN，0.1% TFA 實 施HPLC (流速0.7毫升/分，偵檢波長280奈米）。收集在 滯留時間30秒鐘之前與30秒之後之間內一分鐘的溶析物， 蒸乾，溶解在0.5毫升水中且冷凍乾燥》Leu-Val-Tyr的滯 留時間係經由另外對合成Leu-Val-Tyr施以相同條件下的 HPLC而預先測定的。 iii)在 Develosil C30-UG-5上的逆相 HPLC(Leu-Val-Tyr 之定量分析） 對得自膠濾的活性肽液份中所含Leu-Val-Tyr以逆相 HPLC 在 Develosil C30-UG-5管柱（3x150毫米，Nomura Chemical Co., Ltd.)上定量分析。將 TSK-GEL G2000 SWXL上膠濾HPLC所得部份溶在250微升5% CH3CN，0.1 % TFA中，以2,000 rpm離心5分鐘並將上澄液濾經微濾器 (Millex-HV，孔徑0.45微米，濾器直徑13微米， Millipore Corporation)以移除不溶性成分。將一50微升 份的濾液給到用5 % CH3CN -0.1% TFA平衡過的 D e v e 1 〇 s i I C 3 0 - U G - 5管柱上以在下列條件下實施層析術： -24- 1344371 溶析溶劑：

0-5 分： 5%CH3CN，0.1% TFA

5-10分：5-14% CH3CN，0_ 1 % TFA 10-35 分： 1 4% CH3CN，0· 1 % TFA 流速：0.4毫升/分鐘 偵檢波長：2 8 0奈米 收集稻米和燕麥肽分別在Develosil C30-UG-5管柱層 析術中對應於真Leu-Val-Tyr肽的滞留時間處之溶析峰。 對該液份實以TOF MS分析及TOF MS/MS分析而確定該液 份爲 Leu-Val-Tyr。 經由將不同量的真品Leu-Val-Tyr給到相同的 Develosil C3 0-UG-5管柱上於上述相同條件下溶析且將峰 面積對所給量進行標繪而製備一校準曲線。 校準曲線 Y = 249197X-2510.6 ( R2 = 0.9991 ) Y:峰面積，X: Leu-Val-Tyr的量（微克） 將得自Develosil C30-UG-5層析術的稻米和燕麥之 Leu-Val-Tyr液份的峰面積代入校準曲線中。其結果測定 出1毫克得自稻米肽和燕麥肽中的Leu-Val-Tyr之量分別爲 0.71微和和1.05微克。 【圖式簡單說明】 圖1爲一圖解，顯示出使用自然低血壓大鼠探討本發 明肽類的降血壓效應所得結果。 [S1 -25-

Claims (1)

1344371 • 公告本 ' 第097129374號專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國100年4月1日修正 十、申請專利範圍 1.—種三肽，其具有胺基酸序列Leu-Val-Tyr。 2 ·根據申請專利範圍第1項之三肽，其係經由將源自 一或多種選自稻米、小麥、大麥、燕麥、玉米 '菜豆、蠶 豆、大豆、綠豆和芝麻之中的材料之蛋白質用嗜熱菌蛋白 φ 酶消化而得者。 3 ·—種可食用組成物，其含有具有胺基酸序列Leu_ Val-Tyr之二肽。 4 · 一種血管收縮素轉化酶抑制劑，其含有作爲活性 成分的具有胺基酸序列Leu-Val-Tyr之三肽。 5. —種降血壓劑，其含有作爲活性成分的具有胺基 酸序列Leu-Val-Tyr之三肽。 6. 根據申請專利範圍第3項之可食用組成物，其包括 籲在一單一攝取劑量中從0.001毫克至100毫克的該三肽。 7. 根據申請專利範圍第4項之血管收縮素轉化酶抑制 劑’其包括在一單一口服攝取劑量中從0.001毫克至1〇〇毫 克的該三肽。 8 ·根據申請專利範圍第5項之降血壓劑，其包括在一 單一口服攝取劑量中從0.001毫克至100毫克的該三肽。