TW202108176A - 抗her3抗體-藥物結合物之製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供抗腫瘤效果及安全性面優異之具有優異治療效果的抗腫瘤藥之抗體-藥物結合物之製造方法。 本發明之解決手段係提供一種抗體-藥物結合物之製造方法，其特徵為將抗HER3抗體於還原條件下處理後，與下列之化合物反應： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。

Description

抗HER3抗體-藥物結合物之製造方法
本發明係關於使抗HER3抗體與抗腫瘤性藥物經由連接物(linker)結構部分而結合之有用於作為抗腫瘤藥的抗體-藥物結合物。
對於結合於在癌細胞表面表現且可內在化至細胞中的抗原之抗體(與該抗原結合的該抗體亦可內在化至細胞中)，使具有細胞毒性的藥物結合而成的抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)，可期待藉由可選擇性地將藥物送達至癌細胞，而使藥物蓄積於癌細胞內，並使癌細胞死亡(參照非專利文獻1~3)。作為ADC，例如，使抗CD33抗體與卡奇黴素(calicheamicin)結合的Mylotarg(註冊商標；吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin))被認可作為急性骨髓性白血病之治療藥。又，使抗CD30抗體與奧利司他汀E(auristatin E)結合的Adcetris(註冊商標；布妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin))最近已被認可作為何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)與未分化大細胞淋巴瘤之治療藥(參照非專利文獻4)。迄今被認可的ADC所含有的藥物係以DNA或微管蛋白(tubulin)作為標的。
就抗腫瘤性之低分子化合物而言，已知有抑制拓樸異構酶I(topoisomerase I)而表現抗腫瘤作用的化合物之喜樹鹼(camptothecin)衍生物。其中下式
Figure 02_image001
所示的抗腫瘤性化合物(依喜替康(exatecan)，化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并(indolizino)[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)係水溶性的喜樹鹼衍生物(專利文獻1、2)。此化合物係與現在臨床上使用的愛萊諾迪肯(irinotecan)相異，抗腫瘤效果的表現不需要由酵素所致的活性化。又，觀察到愛萊諾迪肯之藥效本體的SN-38，較同樣於臨床上使用的拓樸替康(topotecan)有更強的拓樸異構酶I抑制活性，於活體外對各種癌細胞具有更強的殺細胞活性。尤其藉由P-糖蛋白之表現，對於對SN-38等顯示耐性的癌細胞亦呈現效果。又，小鼠之人類腫瘤皮下移植模式中亦顯示有強的抗腫瘤效果，雖然已進行臨床試驗，但迄今尚未上市(參照非專利文獻5~10)。對於依喜替康作為ADC是否有效地作用並不清楚。
DE-310係於生物分解性之羧甲基葡聚糖多元醇聚合物上使依喜替康經由GGFG胜肽間隔物而結合的複合體(專利文獻3)。藉由將依喜替康作高分子前藥化，而保持高血中滯留性，進一步利用腫瘤新生血管之通透性的亢進及腫瘤組織滯留性，被動地提高對腫瘤部位的指向性。DE-310係藉由利用酵素的胜肽間隔物之切斷，而使活性本體的依喜替康、及甘胺酸與胺基結合的依喜替康持續地游離，其結果改善藥物動態。於非臨床試驗中的各種腫瘤之評價模式，儘管DE-310其中所含的依喜替康之總量較依喜替康單劑投予時更為減少，但較單劑投予時顯示更高的有效性。與DE-310有關之臨床試驗被實施而有效例亦經確認，已有確認活性本體相較於正常組織更集積於腫瘤的報告，另一方面，亦有DE-310及活性本體對腫瘤之集積與對正常組織之集積無顯著差異，而於人類未見到被動標的(passive targeting)之報告(參照非專利文獻11~14)。結果，DE-310亦未達成上市，對於依喜替康是否有效地發揮作為此種指向標的之藥物的作用並不清楚。
作為DE-310之關連化合物，雖亦已知有將-NH-(CH2 )4 -C(=O)-所示的結構部分插入-GGFG-間隔物與依喜替康之間，將-GGFG-NH-(CH2 )4 -C(=O)-作為間隔物結構的複合體(專利文獻4)，但對於相同複合體之抗腫瘤效果則完全未知。
人類上皮增殖因子受體3(HER3，亦已知為ErbB3)係受體蛋白質酪胺酸激酶，與HER1(EGFR、亦已知為上皮增殖因子受體)、HER2及HER4(參照非專利文獻15~17)一同屬於受體蛋白質酪胺酸激酶之EGFR次家族。與典型的上皮增殖因子受體同樣地，跨膜型受體HER3係包含細胞外配位子結合功能域(ECD)、ECD內之二聚體化功能域、跨膜型功能域、及羧基末端磷酸化功能域。除此等之功能域之外，HER1、HER2、HER4雖保持細胞內蛋白質酪胺酸激酶功能域(TKD)，但HER3係此功能域缺失，而不具自體磷酸化能力。 為配位子的赫瑞古林(heregulin，HRG)，藉由與HER3之細胞外功能域結合，促進與其他之人類上皮增殖因子受體(HER)家族成員之二聚體化及細胞內功能域之磷酸轉移，而將經由受體的訊息路徑加以活性化。與HER家族成員之二聚體形成，使HER3之訊息潛能增大，不僅為了訊息之多樣化，亦成為用以放大訊息的手段。例如，HER2/HER3異二聚體(heterodimer)係誘導HER家族中最重要的增殖訊息之一者。HER3係於乳癌、胃腸癌及胰臓癌等一些種類之癌症中過度表現。有趣的是，已呈現HER2/HER3之表現與自非浸潤性階段向浸潤性階段之進行之間有相關(參照非專利文獻18~20)。據此，正冀望抑制經由HER3之訊息的物質。抗HER3抗體及其免疫結合物已各自報告於專利文獻5~10等。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1　日本特開平5-59061號公報 專利文獻2　日本特開平8-337584號公報 專利文獻3　國際公開第1997/46260號 專利文獻4　國際公開第2000/25825號 專利文獻5　美國專利第5968511號公報 專利文獻6　美國專利第5480968號公報 專利文獻7　國際公開第2003/013602號 專利文獻8　國際公開第2007/077028號 專利文獻9　國際公開第2008/100624號 專利文獻10　國際公開第2012/019024號 [非專利文獻]
非專利文獻1　Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13. 非專利文獻2　Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537. 非專利文獻3　Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452. 非專利文獻4　Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637. 非專利文獻5　Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632. 非專利文獻6　Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-786. 非專利文獻7　Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769. 非專利文獻8　Joto, N. et al.. Int J Cancer (1997) 72, 680-686. 非專利文獻9　Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220. 非專利文獻10　De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273. 非專利文獻11　Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al., (2003) 145-153. 非專利文獻12　Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175. 非專利文獻13　Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711. 非專利文獻14　Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347. 非專利文獻15　Plowman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87, 4905-4909. 非專利文獻16　Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 9193-9197. 非專利文獻17　Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 2900-2904. 非專利文獻18　Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821. 非專利文獻19　deFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498. 非專利文獻20　Naidu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390.
[發明所欲解決的課題]
於藉由抗體的腫瘤治療，亦有觀察到即使抗體辨識抗原而與腫瘤細胞結合，但抗腫瘤效果亦不充分的情形，有需要更高效果的抗腫瘤抗體的情形。又，於抗腫瘤性之低分子化合物，即使抗腫瘤效果優異，具有副作用或毒性面等之安全性上之問題者多，進一步提高安全性而獲得更優異的治療效果係成為課題。即，本發明之課題係獲得並提供抗腫瘤效果與安全性面優異之具有優異治療效果的抗腫瘤藥。 [用以解決課題之手段]
因為抗HER3抗體係可將腫瘤細胞作為標的之抗體，即因為其係具備可辨識腫瘤細胞的特性、可與腫瘤細胞結合的特性、可內在化至腫瘤細胞中的特性、或對腫瘤細胞的殺細胞活性等的抗體，故本發明者們認為達成下列效果為可能的：藉由將抗腫瘤性化合物之依喜替康，變換為經由連接物構造部分而與該抗體結合的抗體-藥物結合物，可使抗腫瘤性化合物更確實地移動至腫瘤細胞而使該化合物之抗腫瘤效果特異性地於腫瘤細胞中發揮；據此，抗腫瘤效果確實發揮的同時，可期待抗HER3抗體之殺細胞效果的增強；再者，可將抗腫瘤性化合物之投予量較該化合物之單體投予時更為減少；即由於藉由此等可使抗腫瘤性化合物對正常細胞的影響緩和，而可達成較高的安全性。 因此，本發明者們創造出特定構造之連接物，成功獲得經由此連接物而使抗HER3抗體與依喜替康結合的抗體-藥物結合物，發現該結合物發揮優異的抗腫瘤效果而完成本發明。
即，本發明係關於： [1]一種抗體-藥物結合物，其特徵為使下式：
Figure 02_image001
所示的抗腫瘤性化合物與抗HER3抗體，經由下式： -L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-或-L1 -L2 -LP - 所示的結構之連接物，藉由於抗HER3抗體之鉸鏈(hinge)部存在的雙硫鍵部分形成的硫醚鍵而結合。
其中，抗HER3抗體係於L1 之末端結合，抗腫瘤性化合物係將1位之胺基之氮原子作為結合部位，而與-(CH2 )n2 -C(=O)-部分之羰基或LP 之C末端結合。 式中， n1 表示0至6之整數， n2 表示0至5之整數， L1 表示-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)-， 其中，n3 表示2至8之整數， L2 表示-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-或單鍵， 其中，n4 表示1至6之整數， LP 表示以2至7個胺基酸所構成的胜肽殘基， La 表示-O-或單鍵， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-係下式所示的結構：
Figure 02_image004
，  於其3位與抗HER3抗體結合，於1位之氮原子上與含其的連接物結構內之亞甲基結合。
再者，本發明係關於以下各者。 [2]如[1]記載之抗體-藥物結合物，其中LP 之胜肽殘基係包含選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸的胺基酸的胜肽殘基。 [3]如[1]或[2]記載之抗體-藥物結合物，其中LP 係選自以下之群組的胜肽殘基： -GGF-、  -DGGF-、  -(D-)D-GGF-、  -EGGF-、  -GGFG-、  -SGGF-、  -KGGF-、  -DGGFG-、  -GGFGG-、  -DDGGFG-、  -KDGGFG-、及  -GGFGGGF-；  其中，『(D-)D』表示D-天冬胺酸。 [4]如[1]或[2]記載之抗體-藥物結合物，其中LP 係以4或5個胺基酸所構成的胜肽殘基。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中LP 係-GGFG-或-DGGFG-。 [6]如[1]至[4]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中LP 係-GGFG-。
[7]如[1]至[6]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中n3 為2至5之整數，L2 為單鍵。 [8]如[1]至[7]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中連接物為-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-。 [9]如[8]記載之抗體-藥物結合物，其中n3 為2至5之整數，L2 為-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-，n4 為2或4。 [10]如[8]或[9]記載之抗體-藥物結合物，其中-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-係具有4至7原子之鏈長的部分結構。 [11]如[8]或[9]記載之抗體-藥物結合物，其中-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-係具有5或6原子之鏈長的部分結構。 [12]如[10]或[11]記載之抗體-藥物結合物，其中-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-係 -NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、或 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-。 [13]如[12]記載之抗體-藥物結合物，其中-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-係 -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、或 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-。 [14]如[1]至[5]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中連接物係-L1 -L2 -LP -。 [15]如[14]記載之抗體-藥物結合物，其中LP 係-DGGFG-。 [16]如[15]記載之抗體-藥物結合物，其中n3 為2至5之整數，L2 為單鍵。
[17]如[1]記載之抗體-藥物結合物，其中使藥物與-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-或-L1 -L2 -LP -結合的藥物-連接物結構部分係選自下列之群組的1種之藥物-連接物結構： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
其中，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-係下式所示的結構：
Figure 02_image004
，  於其3位與抗HER3抗體結合，於1位之氮原子上與含其的連接物結構內之亞甲基結合。 -(NH-DX)表示下式：
Figure 02_image007
所示之1位之胺基的氮原子成為結合部位的基。 -GGFG-表示-Gly-Gly-Phe-Gly-之四胜肽殘基、-DGGFG-表示-Asp-Gly-Gly-Phe-Gly-之五胜肽殘基。
[18]如[1]記載之抗體-藥物結合物，其中使藥物與-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-結合的藥物-連接物結構部分係為選自下列群組的1種之藥物-連接物結構： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
其中，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-、-(NH-DX)、-GGFG-、及-DGGFG-係如上述。
[19]一種抗體-藥物結合物，其特徵為使下式：
Figure 02_image001
所示的抗腫瘤性化合物與抗HER3抗體，經由下式： -L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)- 所示的結構之連接物，藉由於抗HER3抗體之鉸鏈部存在的雙硫鍵部分所形成的硫醚鍵而結合。 其中，抗HER3抗體係於L1 之末端結合，抗腫瘤性化合物係與-(CH2 )n2 -C(=O)-部分之羰基結合。 式中，n1 表示0至6之整數， n2 表示0至5之整數， L1 表示-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)-， 其中，n3 表示2至8之整數， L2 表示-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-或單鍵， 其中，n4 表示1至6之整數， LP 表示-GGFG-之四胜肽殘基， La 表示-O-或單鍵， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-係下式：
Figure 02_image004
所示的結構，於其3位與抗HER3抗體結合，於1位之氮原子上與含其的連接物結構內之亞甲基結合。
[20]如[19]記載之抗體-藥物結合物，其中n1 為3，n2 為0，n3 為2，L2 為-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-，n4 為2，La 為單鍵，或 n1 為1，n2 為1，n3 為5，L2 為單鍵，La 為-O-，或 n1 為2，n2 為1，n3 為5，L2 為單鍵，La 為-O-。 [21]如[19]或[20]記載之抗體-藥物結合物，其中n3 為2或5，L2 為單鍵。 [22]如[19]或[20]記載之抗體-藥物結合物，其中n3 為2或5，L2 為-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-，n4 為2或4。 [23]如[19]至[22]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-為 -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、或 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-。
[24]如[19]至[23]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中使藥物結合於-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-的藥物-連接物結構部分係選自下列群組的1種之藥物-連接物結構： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)；
其中，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-係下式所示的結構：
Figure 02_image004
，  於其3位與抗HER3抗體結合，於1位之氮原子上與含其的連接物結構內之亞甲基結合。  -(NH-DX)表示下式：
Figure 02_image007
所示的1位之胺基之氮原子成為結合部位的基。  -GGFG-表示-Gly-Gly-Phe-Gly-之四胜肽殘基。
[25]如[19]~[23]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中使藥物結合於-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-的藥物-連接物結構部分係選自下列群組的1種之藥物-連接物結構： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。 其中，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-、-(NH-DX)、及-GGFG-係如上述。
[26]如[1]至[25]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1至10個之範圍。 [27]如[1]至[25]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2至8個之範圍。 [28]如[1]至[25]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為3至8個之範圍。
[29]一種醫藥，其含有如[1]至[28]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。  [30]一種抗腫瘤藥及/或抗癌藥，其含有如[1]至[28]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。  [31]如[30]記載之抗腫瘤藥及/或抗癌藥，其係用以應用於肺癌、腎癌、尿道上皮癌(urothelial carcinoma)、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸基質腫瘤(gastrointestinal stromal tumor)、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、鱗狀上皮癌(squamous carcinoma)、腹膜癌、多形性神經膠質胚細胞瘤、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰癌(squamous carcinoma)、甲狀腺癌、肝癌腫瘤、肛門癌腫瘤、或陰莖癌。  [32]一種醫藥組成物，其含有作為活性成分之如[1]至[28]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物，以及藥學上可容許的製劑成分。  [33]如[32]記載之醫藥組成物，其係用以應用於肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸基質腫瘤、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、鱗狀上皮癌、腹膜癌、多形性神經膠質胚細胞瘤、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌腫瘤、肛門癌腫瘤、或陰莖癌。  [34]一種腫瘤及/或癌之治療方法，其特徵為投予如[1]至[28]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。  [35]如[29]記載之醫藥、[30]或[31]記載之抗腫瘤藥及/或抗癌藥、[32]或[33]記載之醫藥組成物、或[34]記載之治療方法，其係與其他藥劑組合而被投予。  [36]如[32]或[33]記載之醫藥組成物，其亦含有其他之藥劑作為活性成分。
[35]一種抗體-藥物結合物之製造方法，其特徵為使下式所示的化合物：  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)或(順丁烯二醯亞胺-N-基)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -LP -(NH-DX)  與抗HER3抗體或其反應性衍生物反應，藉由於該抗體之鉸鏈部存在的雙硫鍵部分形成硫醚鍵的方法而使藥物-連接物部分與該抗體結合。
式中，n3 表示整數之2至8， L2 表示-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-或單鍵， 其中，n4 表示1至6之整數， LP 表示以選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸的2至7個胺基酸所構成的胜肽殘基， n1 表示0至6之整數， n2 表示0至5之整數， La 表示-O-或單鍵， (順丁烯二醯亞胺-N-基)-係下式：
Figure 02_image013
所示的氮原子為結合部位的基。 -(NH-DX)係下式
Figure 02_image007
所示的1位之胺基之氮原子成為結合部位的基。
[36]如[35]記載之製造方法，其中使藥物-連接物部分與抗HER3抗體結合的方法係將該抗體還原處理而變換為反應性衍生物的方法。
[37]如[35]或[36]記載之製造方法，其所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1至10個之範圍。 [38]如[35]或[36]記載之製造方法，其所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2至8個之範圍。 [39]如[35]或[36]記載之製造方法，其所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為3至8個之範圍。 [40]一種抗體-藥物結合物，其係藉由如[35]至[39]中任一項之製造方法而獲得。
[41]一種於該抗體之鉸鏈部之雙硫鍵部分形成硫醚鍵而獲得的抗體-藥物結合物，其特徵為其係使抗HER3抗體於還原條件下處理後，與選自以下之化合物群組的化合物反應： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 O-CH2 CH2 O-CH2 CH2 O-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、或  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
其中，(順丁烯二醯亞胺-N-基)-係下式：
Figure 02_image013
所示的氮原子為結合部位的基。 -(NH-DX)係下式
Figure 02_image007
所示的1位之胺基之氮原子成為結合部位的基。 -GGFG-表示-Gly-Gly-Phe-Gly-之四胜肽殘基、-DGGFG-表示-Asp-Gly-Gly-Phe-Gly-之五胜肽殘基。
[42]一種於該抗體之鉸鏈部之雙硫鍵部分形成硫醚鍵而獲得的抗體-藥物結合物，其特徵為係使抗HER3抗體於還原條件下處理後，與選自以下之化合物群組的化合物反應： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、或 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。 其中，(順丁烯二醯亞胺-N-基)-、-(NH-DX)、及-GGFG-係如上述。
[43]如[41]或[42]記載之抗體-藥物結合物，其所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1至10個之範圍。 [44]如[41]或[42]記載之抗體-藥物結合物，其所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2至8個之範圍。 [45]如[41]或[42]記載之抗體-藥物結合物，其所選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為3至8個之範圍。 [46]一種醫藥，其含有如[40]至[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。 [47]一種抗腫瘤藥及/或抗癌藥，其含有如[40]至[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。 [48]如[47]記載之抗腫瘤藥及/或抗癌藥，其係用以應用於肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸基質腫瘤、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、鱗狀上皮癌、腹膜癌、多形性神經膠質胚細胞瘤、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌腫瘤、肛門癌腫瘤、或陰莖癌。 [49]一種醫藥組成物，其含有作為活性成分之如[40]至[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物，以及藥學上可容許的製劑成分。 [50]如[49]記載之醫藥組成物，其係用以應用於肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸基質腫瘤、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、鱗狀上皮癌、腹膜癌、多形性神經膠質胚細胞瘤、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌腫瘤、肛門癌腫瘤、或陰莖癌。 [51]一種腫瘤及/或癌之治療方法，其特徵為投予如[40]至[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。 [52]如[46]記載之醫藥、[47]或[48]記載之抗腫瘤藥及/或抗癌藥、[49]或[50]記載之醫藥組成物、或[51]記載之治療方法，其係與其他藥劑組合而被投予。 [53]如[49]或[50]記載之醫藥組成物，其亦含有其他之藥劑作為活性成分。 [發明效果]
藉由經由特定結構之連接物而結合抗腫瘤性化合物依喜替康的抗HER3抗體-藥物結合物，可達成優異的抗腫瘤效果及安全性。
[用以實施發明之形態]
以下，一邊參照圖式一邊說明用以實施本發明之較佳形態。又，以下說明的實施形態係呈示本發明之代表性的實施形態之一例，並非藉由此等而狹隘解釋本發明之範圍。
本發明係提供HER3結合蛋白質-藥物結合物。本發明之HER3結合蛋白質較佳係具有抗體樣結合活性的支架蛋白(scaffolding protein)或抗體，即，抗HER3抗體。
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物係使抗腫瘤性化合物經由連接物結構部分而結合於抗HER3抗體的抗腫瘤性藥物，詳細說明如下。 於本發明之文脈內，本說明書所使用的「支架蛋白」的用語係意指具有高度容許胺基酸的插入、取代或刪除之露出表面的多胜肽或蛋白質。依據本發明，可使用的支架蛋白之例，有自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)獲得的蛋白質A (protein A)、自歐洲粉蝶(Pieris brassicae)獲得的膽素(bilin)結合蛋白質或其他之脂質運載蛋白(lipocalin)、錨蛋白(ankyrin)重複蛋白質及人類纖網蛋白(fibronectin)(概述於Binz and Pluckthun，Curr Opin Biotechnol. 16，459-69中)。支架蛋白之操作係可視為於安定折疊的蛋白質結構的框架上或結構的框架中移植、或組入親和性機能。親和性機能係意指依據本發明之蛋白質結合親和性。支架係有可能自賦予結合特異性的胺基酸序列結構性地分離。一般而言，被認為適合此種人工的親和性試藥之開發的蛋白質，可依據推論，或依據最一般性地藉由對HER3(經純化的蛋白質或展示於細胞表面上的蛋白質之任一者)的淘選(panning)等之對於活體外展示的人工支架庫之結合劑的組合蛋白質工程技術(此等之技術係於本領域周知(Skerra，J. Mol. Recog. ，2000；Binz and Pluckthun，2005))而取得。再者，具有抗體樣結合活性的支架蛋白可來自含有支架功能域的受體多胜肽，為了對含有受體多胜肽的支架功能域上賦予供體多胜肽之結合特異性，可將供體多胜肽之結合功能域移植至受體多胜肽。前述被插入的結合功能域可為例如，抗體之互補性決定區(CDR)，尤其是抗HER3抗體之互補性決定區。插入係可藉由例如，利用本技術領域者周知之重組法之各式各樣的形態的多胜肽合成、編碼的胺基酸之核酸合成等之本項技術領域者周知之各式各樣方法而達成。 [抗體]
再者，於本說明書所使用的所謂「抗體」或「抗HER3抗體」的用語係意指單株抗體、多株抗體、重組抗體、人化抗體(Jones et al. ，Nature 321(1986)，522-525；Riechmann et al. ，Nature 332(1988)，323-329；and Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2(1992)，593-596)、嵌合抗體(Morrison et al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81(1984)，6851-6855)、人類抗體與完全人類抗體、(Tomizuka，K. et al. ，Nature Genetics(1997)16，p. 133-143，；Kuroiwa，Y. et. al. ，Nucl. Acids Res. (1998)26，p. 3447-3448；Yoshida，H. et. al. ，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol. 10，p. 69-73(Kitagawa，Y. ，Matsuda，T. and Iijima，S. eds. )，Kluwer Academic Publishers，1999. ；Tomizuka，K. et. al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97，p. 722-727、國際公開第2007/077028號等)、由至少2種抗體所形成的多重特異性抗體(例如，雙重特異性抗體)或此等之抗體片段。所謂「抗體片段」的用語係包含上述抗體之各式各樣的一部分，較佳為包含彼等之抗原結合區或可變區。於抗體片段之例，包含Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2 片段、Fv片段、雙價抗體(diabodies)(Hollinger et al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90(1993)，6444-6448)、單鏈抗體分子(Pluckthun in：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113，Rosenburg and Moore，EDS，Springer Verlag，N. Y. (1994)，269-315)及只要展現對HER3之所需的結合能力的其他片段皆包含在內。
再者，於本說明書所使用的所謂「抗體」或「抗HER3抗體」的用語可包含：含有抗體之經加工的次功能域的抗體樣分子或天然存在的抗體變種。此等之抗體樣分子可為獲自駱駝科之動物(camelid)等之天然取得來源(Muyldermans et al. ，Reviews in Molecular Biotechnology 74，277-302)、或通過自人類、駱駝科之動物或其他物種獲得的資料庫之活體外展示而獲得(Holt et al. ，Trends Biotechnol. ，21，484-90)之僅VH或僅VL的功能域等之單一功能域抗體。
於本發明，「Fv片段」係含有完全抗原辨識及結合部位的最低的抗體片段。此等之區域係包含緊密地非共價結合的1個重鏈可變功能域與1個輕鏈可變功能域之二聚體。各可變功能域之3個CDR用以規定VH -VL 二聚體之表面上之抗原結合部位而相互作用者位於此立體配置中。總括而言，6個CDR對抗體賦予抗原結合特異性。然而，即使為單一之可變功能域(或僅含對抗原為特異性的3個CDR的Fv之一半)，一般而言，雖較完全結合部位為低的親和性，但具有辨識及結合抗原的能力。 「Fab片段」亦含有輕鏈之恆定功能域及重鏈之第一恆定功能域(CH1)。「Fab片段」係於在重鏈CH1功能域之羧基末端附加來自抗體鉸鏈區之1個或以上之半胱胺酸等之數個殘基的點，與「Fab’片段」不同。「F(ab’)2 片段」係作為原來於其之間具有鉸鏈半胱胺酸的「Fab’片段」之對而被製作。木瓜酵素或胃蛋白酶消化等之調製此類的抗體片段的方法係本項技術領域者周知。
於本發明之其他較佳實施形態，本發明之抗HER3抗體係針對HER3之細胞外功能域(ECD)而誘導的抗HER3抗體。
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物所使用的抗HER3抗體係可來自任一物種，但較佳可例示人類、大鼠、小鼠、及兔。來自人類以外之物種的情形，使用周知之技術而嵌合化或人化較佳。本發明之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，但單株抗體較佳。 抗HER3抗體係可以腫瘤細胞為標的的抗體，即具備可辨識腫瘤細胞的特性、可與腫瘤細胞結合的特性、被攝入腫瘤細胞內而內在化的特性、而且具備對腫瘤細胞的殺細胞活性等，使具有抗腫瘤活性的化合物經由連接物結合而可作成抗體-藥物結合物。 抗體之對腫瘤細胞的結合性係可使用流動式細胞測量術(flow cytometry)而確認。至腫瘤細胞內之抗體之攝入，可使用下列檢驗而確認:(1)使用與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)而將被攝入細胞內的抗體藉由螢光顯微鏡加以可視化的檢驗(Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761)、(2)使用與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)而測量被攝入細胞內的螢光量的檢驗(Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004)、或(3)使用與治療抗體結合的免疫毒素，一旦被攝入細胞內則毒素被釋放而細胞增殖被抑制的Mab-ZAP檢驗(Bio Techniques 28：162-165，January 2000)。就免疫毒素而言，亦可使用白喉毒素之觸媒區與蛋白質G(Protein G)之重組複合蛋白質。 抗體之抗腫瘤活性，於活體外可藉由測定細胞之增殖的抑制活性而確認。例如，可培養過度表現抗體之標的蛋白質的癌細胞株，於培養系統中以各種濃度添加抗體，測定對病灶形成、菌落形成及類球狀體(spheroid)增殖的抑制活性。於活體內，例如，藉由對移植高度表現標的蛋白質的腫瘤細胞株的裸鼠投予抗體，測定癌(腫瘤)細胞之變化，而可確認抗腫瘤活性。 抗體-藥物結合物由於使發揮抗腫瘤效果的化合物結合，故抗體本身具有抗腫瘤效果雖較佳，但非必須。由使抗腫瘤性化合物之細胞毒殺性於腫瘤細胞特異性・選擇性地發揮之目的而言，具有抗體內在化而移動至腫瘤細胞內的性質是重要且較佳的。
抗HER3抗體可藉由使用此領域通常實施的方法，將成為抗原的多胜肽對動物免疫，採取、純化活體內產生的抗體而獲得。抗原之來源並未限於人類，亦可將來自小鼠、大鼠等之人類以外之動物的抗原對動物免疫。於此情形，藉由試驗與取得的異種抗原結合的抗體與人類抗原之交叉反應性，可選出可應用於人類疾病的抗體。 又，依據周知之方法(例如，Kohler and Milstein, Nature(1975)256, p.495-497、Kennet, R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y.(1980)) ，藉由使產生對抗抗原的抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，亦可建立融合瘤，獲得單株抗體。 又，抗原可藉由利用基因操作使編碼抗原蛋白質的基因於宿主細胞中產生而獲得。具體而言，只要製作可表現抗原基因的載體(vector)，將其導入宿主細胞而使該基因表現，純化表現的抗原即可。使用將利用上述之基因操作的抗原表現細胞或表現抗原的細胞株對動物進行免疫的方法，藉此亦可取得抗體 抗HER3抗體係可藉由周知之手段取得。
本發明可使用的抗HER3抗體並未特別限制，但例如期望為具有以下特性者。 (1)一種抗HER3抗體，其特徵為具有以下之特性； (a)與HER3特異性結合。 (b)具有藉由與HER3結合，而內在化至HER3表現細胞的活性。 (2)如上述(1)記載之抗體，其結合於HER3之細胞外功能域。 (3)如上述(1)或(2)記載之抗體，其係單株抗體。 (4)如上述(1)至(3)中任一項記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)如上述(1)乃至(4)中任一項記載之抗體，其係小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、人化單株抗體或者人類或完全人類(單株)抗體。 (6)如上述(1)至(5)中任一項記載之抗體，其係包含含序列識別號1記載之胺基酸序列的重鏈及含序列識別號2記載之胺基酸序列的輕鏈而成的人化單株抗體。 (7)如上述(1)至(6)中任一項記載之抗體，其重鏈羧基末端之離胺酸殘基缺失。 (8)如上述(7)記載之抗體，其包含序列識別號70記載之胺基酸序列所示的重鏈可變領域及序列識別號72記載之胺基酸序列所示的輕鏈可變領域而成。 (9)一種抗體，其係藉由下列抗體之製造方法而獲得的抗體，該方法包含培養宿主細胞的步驟，該宿主細胞係藉由含有編碼如上述(1)至(8)中任一項記載之抗體的多核苷酸的表現載體而轉形；及自該步驟獲得的培養物採集目的抗體的步驟。
以下，說明於本發明所使用的抗HER3抗體。 於本說明書，「癌」與「腫瘤」係以相同意義使用。 於本說明書，所謂「基因」之用語不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA、及其cRNA。 於本說明書，所謂「多核苷酸」之用語係以與核酸相同的意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。 於本說明書，「多胜肽」與「蛋白質」並未區別地使用。 於本說明書，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。 於本說明書，所謂「HER3」之用語係以與HER3蛋白相同的意義使用。 本說明書中的「CDR」係意指互補性決定區(CDR：Complementarity determining region)。已知於抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處之CDR。CDR亦稱為超可變區(hypervariable domain)，位於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，為一次結構之變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈之一次結構上，各自分離於3處。於本說明書中，針對抗體之CDR，將重鏈之CDR自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之CDR自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體結構上相互近接，而決定對結合的抗原的特異性。 於本發明，「於嚴格條件下雜交」係指於市售之雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中，於68℃雜交；或指於下述條件下雜交：藉由使用將DNA固定的濾紙，於0.7-1.0M之NaCl存在下、於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃洗淨，而可鑑定的條件或與其同等的條件。 1.HER3
HER3為人類上皮增殖因子受體3，亦被稱為HER3、ErbB3，為受體蛋白質酪胺酸激酶，與HER1、HER2及HER4一起屬於受體蛋白質酪胺酸激酶之上皮增殖因子受體次家族。HER3為跨膜型受體，包含細胞外配位子結合功能域(ECD)、ECD內之二聚體化功能域、跨膜型功能域、細胞內蛋白質酪胺酸激酶功能域(TKD)及羧基末端磷酸化功能域。HER3於乳癌、胃腸癌及胰臓癌等之一些種類的癌中過度表現。可見HER2-HER3之表現與自非浸潤性階段至浸潤性階段的進行之間有相關。 本發明所使用的HER3蛋白質係可由人類、非人類哺乳動物(大鼠、小鼠等)之HER3表現細胞直接純化而使用，或者可調製該細胞之細胞膜劃分(fraction)而使用，又可藉由將HER3於活體外合成而獲得、或者可藉由利用基因操作使其於宿主細胞中產生而獲得。基因操作具體而言，藉由將HER3 cDNA組入可表現的載體後，於含轉錄及轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成，或藉由利用使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形來使HER3表現，而可獲得該蛋白質。又，亦可將利用前述之基因操作之HER3表現細胞、或表現HER3的細胞株作為HER3蛋白使用。 HER3之RNA序列、cDNA序列及胺基酸序列已於公眾的資料庫被公開，例如，可藉由AAA35979(包含含胺基末端19個胺基酸殘基的訊息序列的先驅體)、M34309(NCBI)等之登錄號而參照。 又，HER3亦包含下述蛋白質：包含於上述HER3之胺基酸序列取代、刪除、添加及/或插入1或數個之胺基酸的胺基酸序列，且具有與該蛋白質同等之生物活性的蛋白質。 2.抗HER3抗體之製造
本發明之抗HER3的抗體係可藉由依據此領域通常實施的方法，將HER3或選自HER3之胺基酸序列的任意多胜肽對動物免疫，採取、純化活體內產生的抗體而獲得。成為抗原的HER3之生物種類並未限定於人類，亦可將來自小鼠、大鼠等之人類以外的動物的HER3對動物作免疫。於此情形，藉由試驗與所取得的異種HER3結合的抗體及人類HER3之交叉反應性，可選出可應用於人類疾病的抗體。 又，依據周知之方法(例如，Kohler and Milstein，Nature(1975)256，p.495-497、Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibodies，p.365-367，Plenum Press，N.Y.(1980))，藉由使產生抗HER3的抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，亦可建立融合瘤，獲得單株抗體。 又，成為抗原的HER3可藉由利用基因操作使HER3基因於宿主細胞中表現而獲得。 具體而言，只要製作可表現HER3基因的載體，將其導入宿主細胞而使該基因表現，純化表現的HER3即可。 又，亦可將利用上述之基因操作之HER3表現細胞、或表現HER3的細胞株作為HER3蛋白來使用。以下，具體說明抗HER3的抗體之取得方法。 (1)抗原之調製
就用以製作抗HER3抗體之抗原而言，可列舉HER3或包含其至少6個連續的部分胺基酸序列的多胜肽、或於彼等附加有任意之胺基酸序列或載體(carrier)的衍生物。 HER3係可自人類之腫瘤組織或腫瘤細胞直接純化而使用，又，可藉由將HER3於活體外合成而獲得、或可藉由利用基因操作使其於宿主細胞中產生而獲得。 基因操作具體而言，藉由將HER3之cDNA組入可表現的載體後，於含轉錄及轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成，或藉由將其他原核生物或真核生物之宿主細胞轉形來使HER3表現，而可獲得抗原。 又，藉由使連結膜蛋白質的HER3之細胞外區域與抗體之恆定區的融合蛋白質於適當宿主・載體(vector)系統中表現，亦可獲得呈分泌蛋白質之抗原。 HER3之cDNA，例如可藉由將表現HER3之cDNA的cDNA庫作為模板，使用將HER3 cDNA特異性增幅的引子，而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」；參照Saiki，R. K.，et al.，Science(1988)239，p.487-489)，即藉由所謂的PCR法而取得。 就多胜肽之活體外(in vitro)合成而言，例如，可列舉Roche Diagnostics公司製之快速轉譯系統(Rapid Translation System)(RTS)，但未限定於此。 就原核細胞之宿主而言，例如，可列舉大腸桿菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。為了使目的基因於此等之宿主細胞內轉形，係以含有來自可適合作為宿主物種之複製單元(replicon)，即複製起點，及調節序列的質體載體使宿主細胞轉形。又，就載體而言，具有可對轉形細胞賦予表型(表現型)之選擇性的序列者為較佳。 真核細胞之宿主細胞包含脊椎動物、昆蟲、酵母等之細胞，就脊椎動物細胞而言，例如，常使用猴之細胞的COS細胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650；ATCC：美國菌種保存中心(American Type Culture Collection))、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub，G. and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，p.4126-4220)等，但未限定於此等。 如上述而獲得的轉形體，可依據此領域通常實施的方法加以培養，藉由該培養而於細胞內或細胞外產生目的之多胜肽。 就該培養所使用的培養基而言，可因應採用的宿主細胞而適宜選擇慣用的各種者，若為大腸桿菌，例如，因應必要可於LB培養基中添加安比西林(ampicillin)等之抗生素或IPMG而使用。 藉由上述培養，轉形體之細胞內或細胞外所產生的重組蛋白質可藉由利用該蛋白質之物理性質或化學性質等的各種周知的分離操作法而分離・純化。 就該方法而言，具體而言，例如可例示利用通常之蛋白質沉澱劑的處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和性層析等之各種液體層析、透析法、此等之組合等。 又，藉由於所表現的重組蛋白質連接包含6個殘基的組胺酸標籤(histidine tag)，可以鎳親和性管柱有效率地純化。或者，藉由於所表現的重組蛋白質連接IgG之Fc區域，可以蛋白質A(Protein A)管柱有效率地純化。 藉由組合上述方法，可容易地大量製造以高產率、高純度為目的之多胜肽。 亦可將上述所述轉形體本身作為抗原而使用。又，亦可將表現HER3的細胞株作為抗原來使用。 (2)抗HER3單株抗體之製造
就與HER3特異性結合的抗體之例而言，可列舉與HER3特異性結合的單株抗體，但其取得方法係如以下記載。 於單株抗體之製造，一般而言如下述的作業步驟係必要的。 即， (a)作為抗原使用的生物高分子之純化、或抗原表現細胞之調製， (b)藉由將抗原注射於動物而免疫後，採取血液，檢定其抗體力價而決定脾臓摘出之時期後，調製抗體產生細胞的步驟， (c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)之調製， (d)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合， (e)產生作為目的之抗體的融合瘤群之選出， (f)對單一細胞選殖株的分割(選殖)， (g)依據情形，用以大量製造單株抗體的融合瘤之培養、或移植融合瘤的動物之飼育， (h)如此製造的單株抗體之生理活性、及其結合特異性之檢討、或作為標識試藥之特性之檢定等。 以下，將單株抗體之製作法依上述步驟詳述，但該抗體之製作法並未限制於此，例如，亦可使用脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。 (a)抗原之純化
就抗原而言，可使用如前述方法所調製的HER3或其一部分。 又，亦可將下列作為抗原來使用：藉由HER3表現重組體細胞所調製的膜劃分，或HER3表現重組體細胞本身，再者，使用本技術領域者所周知之方法而化學合成的本發明之蛋白質之部分胜肽。 再者，亦可將HER3表現細胞株作為抗原來使用。 (b)抗體產生細胞之調製
將步驟(a)所獲得的抗原與弗氏完全或不完全佐劑、或鉀礬(potash alum)之類的輔助劑混合，作為免疫原對實驗動物免疫。除此之外，亦有將抗原表現細胞作為免疫原對實驗動物免疫的方法。實驗動物可無障礙地使用周知融合瘤製作法所使用的動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。惟，由與摘出的抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞之取得容易性等之觀點，將小鼠或大鼠作為被免疫動物較佳。 又，實際上使用的小鼠及大鼠之品系並未別限制，於小鼠之情形，例如，可使用各品系A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，又於大鼠的情形，例如，可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。 此等之小鼠及大鼠可例如獲自日本CLEA股份有限公司、日本Charles River股份有限公司等之實驗動物飼育販售業者。 就被免疫動物而言，若考慮後述之與骨髓瘤細胞之融合適合性，則小鼠係BALB/c品系為特佳，大鼠係Wistar及Low品系為特佳。 又，考慮抗原之於人類與小鼠之同源性，使用去除自體抗體之使生物機制降低的小鼠，即使用自體免疫疾病小鼠為較佳。 又，此等小鼠或大鼠之免疫時的週齡，較佳為5~12週齡，更佳為6~8週齡。 藉由HER3或其重組體而免疫動物時，例如，可使用Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)；Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Springfield，Illinois(1964)等所詳細記載的周知方法。 此等之免疫法中，若具體呈示本發明之較佳方法，例如，如以下所示。 即，首先，將作為抗原的膜蛋白質劃分、或表現抗原的細胞投予至動物之皮內或腹腔內。惟，為了提高免疫效率，兩者之併用為較佳，若前半進行皮內投予、後半或僅最終次進行腹腔內投予，則可特別地提高免疫效率。 抗原之投予時程係依被免疫動物之種類、個體差等而異，但一般而言，抗原投予次數3~6次、投予間隔2~6週較佳，投予次數3~4次、投予間隔2~4週更佳。 又，抗原之投予量係依動物之種類、個體差異等而異，但一般而言，作成0.05~5mg，較佳為作成0.1~0.5mg左右。 追加免疫係在如以上之抗原投予1~6週後，較佳為1~4週後，更佳為1~3週後進行。免疫原為細胞的情形，使用1×106 至1×107 個細胞。 又，進行追加免疫之際之抗原投予量，依動物種類、大小等而異，但一般而言，例如為小鼠的情形，作成0.05~5mg，較佳為0.1~0.5mg，更佳為0.1~0.2mg左右。免疫原為細胞的情形，使用1×106 至1×107 個細胞。 上述追加免疫後1~10日後，較佳為2~5日後，更佳為2~3日後，自被免疫動物無菌地取出含抗體產生細胞的脾臓細胞或淋巴球。此時，測量抗體力價，若將抗體力價變的充分高的動物作為抗體產生細胞之供給源使用，可提高以後操作之效率。 就本文使用的抗體力價之測定法而言，例如，可列舉RIA法或ELISA法，但未限定於此等方法。本發明中的抗體力價之測定，例如，若依據ELISA法，可藉由如以下記載的順序進行。 首先，使純化或部分純化的抗原吸附於ELISA用96孔盤等之固相表面，進一步將抗原未吸附的固相表面以與抗原無關係的蛋白質覆蓋，例如，藉由牛血清白蛋白(以下稱為「BSA」)覆蓋，將該表面洗淨後，與作為第一抗體之連續稀釋的試料(例如，小鼠血清)接觸，使上述抗原與試料中之抗體結合。 再者作為第二抗體，添加經酵素標識的抗小鼠抗體之抗體而與小鼠抗體結合，洗淨後添加該酵素之基質，藉由測量由基於基質分解的顯色所造成之吸光度變化等，而算出抗體力價。 自被免疫動物的脾臓細胞或淋巴球之抗體產生細胞的分離，可依據周知方法(例如，Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495；Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p.511；Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550；Walsh, Nature, (1977)266, p.495)而進行。例如，脾臓細胞之情形，可採用將脾臓細切而將細胞以不鏽鋼篩網過濾後，使其游離於伊格爾最低必須培養基(Eagle minimal essential medium)(MEM)而將抗體產生細胞加以分離的一般方法。 (c)骨髓瘤細胞(以下，稱為「骨髓瘤」)之調製
用於細胞融合的骨髓瘤細胞並未特別限定，可由周知之細胞株適當選擇來使用。惟，考慮自融合細胞選擇融合瘤之際之便利性，較佳使用其選擇手續已確立的HGPRT(次黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酵素，Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株。 即，來自小鼠之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等；來自大鼠之210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等；來自人類之U266AR(SKO-007)、GM1500・GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。此等之HGPRT缺損株例如可獲自ATCC等。 此等之細胞株係以適當培養基，例如以8-氮鳥嘌呤培養基(於RPMI-1640培養基中添加麩醯胺酸、2-巰基乙醇、健它黴素(gentamycin)、及胎牛血清(以下稱為「FBS」)的培養基中添加8-氮鳥嘌呤的培養基)、伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、或杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下稱為DMEM)繼代培養，但細胞融合之3至4日前以正常培養基(例如，含10% FCS的ASF104培養基(味之素股份有限公司製))繼代培養，於融合當日確保2×107 以上之細胞數目。 (d)細胞融合
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合可依據周知之方法(Weir，D.M.，Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)；Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Springfield，Illinois(1964)等)，於使細胞生存率未極度降低的程度的條件下適當實施。 就此類方法而言，例如，可使用於聚乙二醇等之高濃度聚合物溶液中將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合的化學方法、利用電刺激的物理方法等。其中，若呈示上述化學方法之具體例係如以下。 即，使用聚乙二醇作為高濃度聚合物溶液的情形，於分子量1500~6000，較佳為2000~4000之聚乙二醇溶液中，於30~40℃，較佳為於35~38℃之溫度下，將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合1~10分鐘，較佳為5~8分鐘。 (e)融合瘤群之選擇
藉由上述細胞融合獲得的融合瘤之選擇方法並未特別限制，但通常使用HAT(次黃嘌呤・胺基喋呤・胸苷)選擇法(Kohler et al.，Nature(1975)256，p.495；Milstein et al.，Nature(1977)266，p.550)。 此方法對使用於胺基喋呤中無法生存的HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞而獲得融合瘤的情形為有效的。即，藉由將未融合細胞及融合瘤以HAT培養基培養，可僅使具有對胺基喋呤之耐性的融合瘤選擇性殘存，且使其增殖。 (f)對單一細胞選殖株之分割(選殖)
就融合瘤之選殖法而言，例如，可使用甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、極限稀釋法等之周知方法(例如，參照Barbara，B.M.and Stanley，M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))。此等之方法中，尤其是甲基纖維素法等之三維培養法為較佳。例如，將藉由細胞融合所形成的融合瘤群懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司製#03804)等之甲基纖維素培養基而培養，藉由回收形成的融合瘤菌落，可取得單株融合瘤。培養所回收的各融合瘤群落，將於獲得的融合瘤培養上清液中安定而被認可抗體力價者，選擇作為HER3單株抗體產生融合瘤株。 (g)利用融合瘤的培養之單株抗體之調製
如此選擇的融合瘤，藉由將其培養，可有效率地獲得單株抗體，但期望於培養之前，篩選產生目的單株抗體的融合瘤。 此篩選係可採用本身已知之方法。 本發明中的抗體力價的測定可藉由例如，上述(b)之項目中說明的ELISA法而進行。 藉由以上之方法所獲得的融合瘤可於液態氮中或-80℃以下之冷凍庫中以凍結狀態保存。 完成選殖的融合瘤係將培養基由HT培養基換成正常培養基而被培養。 大量培養係以使用大型培養瓶的旋轉培養、或旋轉器(spinner)培養來進行。自此大量培養中的上清液，藉由使用膠體過濾等之本技術領域者所周知之方法而純化，可獲得與本發明之蛋白質特異性結合的單株抗體。 又，藉由於同品系之小鼠(例如，上述之BALB/c)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內注射融合瘤，使該融合瘤增殖，可獲得含大量本發明之單株抗體的腹水。 投予腹腔內的情形，於事前(3~7日前)，投予2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethylpentadecane；姥鮫烷(pristane))等之礦物油時，可獲得較多量之腹水。 例如，於與融合瘤同品系的小鼠腹腔內預先注射免疫抑制劑，使T細胞不活化後，於20日後，使106 ~107 個之融合瘤・選殖株細胞於不含血清的培養基中游離(0.5ml)而投予至腹腔內，通常於腹部為膨滿、腹水累積時，自小鼠採取腹水。藉由此方法，與培養液相比，可獲得約100倍以上之濃度之單株抗體。 藉由上述方法所獲得的單株抗體，可以例如，Weir，D.M.：Handbook of Experimental Immunology，Vol.I，II，III，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1978) 記載的方法而加以純化。 如此獲得的單株抗體係對HER3具有高抗原特異性。 (h)單株抗體之檢定
如此獲得的單株抗體之同型(isotype)及亞型(subtype)之決定係可如以下方式進行。 首先，可列舉歐氏(Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法作為鑑定法。 歐氏法係為簡便，但單株抗體濃度低的情形，需要濃縮操作。 另一方面，使用ELISA法或RIA法的情形，藉由使培養上清液直接與抗原吸附固相反應，進一步使用對應各種免疫球蛋白同型、亞型的抗體作為二次抗體，而可鑑定單株抗體之同型、亞型。 又，就更簡便的方法而言，亦可利用市售之鑑定用之套組(例如，Mouse typer kit：Bio-Rad公司製)等。 再者，蛋白質之定量係可藉由自斐林-洛瑞法(Folin Lowry method)及280nm中的吸光度(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)算出的方法而進行。 再者，再次實施(2)之(a)至(h)的步驟而另外獨立取得單株抗體的情形，亦可能取得具有與抗HER3抗體同等之細胞傷害活性的抗體。就此類抗體之一例而言，可列舉於與抗HER3抗體相同之抗原決定位結合的抗體。新製作的單株抗體若與抗HER3抗體之結合的部分胜肽或部分立體結構結合，則可判定該單株抗體於與抗HER3抗體相同之抗原決定位結合。又，藉由確認對於「抗HER3抗體之對於HER3的結合」，該單株抗體為競合(即，該單株抗體妨礙抗HER3抗體與HER3之結合)，即使未決定具體的抗原決定位之序列或結構，亦可判定該單株抗體結合於與抗HER3抗體相同之抗原決定位。確認抗原決定位相同的情形，強烈地期待該單株抗體具有與抗HER3抗體同等之抗原結合能力或生物活性。 (3)其他之抗體
本發明之抗體，除了上述抗HER3的單株抗體之外，亦包含以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等之抗體可使用已知方法來製造。 就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區與恆定區彼此為異種的抗體，例如，將來自小鼠或大鼠的抗體之可變區與來自人類的恆定區接合的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855，(1984))。 就人化抗體而言，可列舉僅將互補性決定區(CDR；complementarity determining region)組入來自人類的抗體的抗體(參照Nature(1986)321，p.522-525)、藉由CDR移植法而除了CDR之序列外將一部分之框架區胺基酸殘基亦移植於人類抗體的抗體(國際公開第90/07861號)。 又，本說明書中的「數個」係意指1至10個、1至9個、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、或者1或2個。
於本發明，本發明之結合蛋白質之胺基酸序列應理解並未限定於20個一般的胺基酸(請參照Immunology-A Synthesis 2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991)(藉由參照而併入本說明書))。例如，胺基酸可包含20個一般的胺基酸之立體異構物(例如，D胺基酸)、經α,α-二取代的胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他之非慣用胺基酸等之非天然胺基酸。亦可為對本發明之結合蛋白質的適切成分的非慣用胺基酸之例包含4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸以及其他類似之胺基酸及亞胺酸(例如，4-羥基脯胺酸)。
又，就本說明書中的胺基酸之取代而言，保存性胺基酸取代為較佳。保存性胺基酸取代係指與胺基酸側鏈有關連的胺基酸基團內產生的取代。較佳的胺基酸基團係如以下：酸性基團＝天冬胺酸、麩胺酸；鹼性基團＝離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性基團＝丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族＝甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他適合的胺基酸基團係如下：脂肪族羥基團＝絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺基的基團＝天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族基團＝丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族基團＝苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該胺基酸取代係於不使具有原本胺基酸序列的物質之特性降低的範圍內進行者為較佳。於本發明之抗體之重鏈及輕鏈，N末端之胺基酸為麩胺酸的情形，其有環化(成為焦麩醯胺酸)的情況。於本發明，在胺基酸序列上，此種焦麩醯胺酸亦未與通常之麩醯胺酸區別。又，於本發明之抗體之重鏈及輕鏈，半胱胺酸有半胱胺醯基(cysteinyl)化的情況。於本發明，在胺基酸序列上，此種經半胱胺醯基(cysteinyl)化者亦未與通常之半胱胺酸區別。
就本發明之抗體而言，進一步可列舉與HER3結合的人類抗體。抗HER3人類抗體係意指僅具有來自人類染色體之抗體之基因序列的人類抗體。抗HER3人類抗體可藉由使用具有含人類抗體之重鏈及輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka，K.et al.，Nature Genetics(1997)16，p.133-143；Kuroiwa，Y.et.al.，Nucl.Acids Res.(1998)26，p.3447-3448；Yoshida，H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10，p.69-73(Kitagawa，Y.，Matsuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2000)97，p.722-727等)而取得。
此類人類抗體產生小鼠，具體而言，作為將內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座破壞、取而代之以通過酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等而導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座的重組動物，可藉由基因剔除動物及基因轉殖動物之製作及使此等動物彼此交配而作出。 又，利用基因重組技術，藉由各自編碼此類人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA，較佳為藉由含該cDNA的載體，而將真核細胞轉形、培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此亦可自培養上清液中獲得此抗體。 其中，作為宿主，例如可使用真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等之哺乳動物細胞。 關於人類抗體製作，詳細記載於國際公開第2007/077028號。國際公開第2007/077028號之內容構成本發明之揭示之一部分。
又，亦已知取得自人類抗體庫選出的來自噬菌體顯示的人類抗體的方法(參照Wormstone，I.M.et.al，Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7)，p.2301-2308；Carmen，S.et.al.，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002)，1(2)，p.189-203；Siriwardena，D.et.al.，Ophthalmology(2002)109(3)，p.427-431等)。 例如，可使用使人類抗體之可變區作為單鏈抗體(scFv)而於噬菌體表面表現，而選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105-1116)。 藉由解析以與抗原結合而選擇的噬菌體之基因，可決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區的DNA序列。 若與抗原結合的scFv之DNA序列變得清楚，則可藉由製作具有該序列的表現載體，導入於適當宿主而使其表現，來取得人類抗體(國際公開第92/01047號、國際公開第92/20791號、國際公開第93/06213號、國際公開第93/11236號、國際公開第93/19172號、國際公開第95/01438號、國際公開第95/15388號；Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433-455；Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105-1116)。
本發明之一面係關於與HER3結合的蛋白質。於本發明具有之態樣，本發明之經單離的HER3結合蛋白質包含重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列，該重鏈胺基酸序列包含(a)序列識別號2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226或230所示的胺基酸序列所含的CDHR1；(b)序列識別號2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226或230所示的胺基酸序列所含的CDRH2；及(c)序列識別號2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226或230所示的胺基酸序列所含的CDRH3；以及該輕鏈胺基酸序列包含(d)序列識別號4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228或232所示的胺基酸序列所含的CDRL1；(e)序列識別號4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228或232所示的胺基酸序列所含的CDRL2；及(f)序列識別號4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228或232所示的胺基酸序列所含的CDRL3。
本發明之經單離的HER3結合蛋白質較佳包含重鏈胺基酸序列以及輕鏈胺基酸序列，其中重鏈胺基酸序列含有：(a)含有選自包含序列識別號236、251、252及256的群組的一個所示的胺基酸序列的CDRH1；(b)含有選自包含序列識別號258、278、280及282的群組的一個所示的胺基酸序列的CDRH2；及(c)含有選自包含序列識別號283、285、309、313及315的群組的一個所示的胺基酸序列的CDRH3；輕鏈胺基酸序列含有:(d)含有選自包含序列識別號320、334、337及340的群組的一個所示的胺基酸序列的CDRL1；(e)含有選自包含序列識別號343、356、351及344的群組的一個所示的胺基酸序列的CDRL2；及(f)含有選自包含序列識別號360、381、385及387的群組的一個所示的胺基酸序列的CDRL3。
於本發明之另一形態，本發明之經單離的HER3結合蛋白質係包含選自包含序列識別號2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226及230的群組的重鏈可變區胺基酸序列、及/或選自包含序列識別號4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228及232的群組的輕鏈可變區胺基酸序列。
於本發明之又另一形態，本發明之經單離的HER3結合蛋白質係較佳包含序列識別號2及4、6及8、10及12、14及16、18及20、22及24、26及28、30及32、36及38、42及44、46及48、50及52、54及56、60及58、62及64、66及68、70及72、74及76、78及82、80及82、84及86、88及90、92及94、96及98、100及102、104及106、108及110、112及114、116及118、122及124、126及128、130及132、134及136、138及140、142及144、146及148、150及152、154及156、158及160、162及164、166及168、170及172、174及176、178及180、182及184、186及188、190及192、194及196、198及200、202及204、206及208、210及212、214及216、218及220、222及224、226及228、或230及232所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列、或者包含序列識別號34、40、60、62或120所示的重鏈可變區胺基酸序列及序列識別號58或64所示的輕鏈可變區胺基酸序列。 本發明之經單離的HER3結合蛋白質係更佳為包含序列識別號42、54、70、92或96所示的重鏈可變區胺基酸序列、及序列識別號44、56、72、94或98所示的輕鏈可變區胺基酸序列。
將含序列識別號2及4所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-39」；將包含序列識別號6及8所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-40」；將包含序列識別號10及12所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-38」；將包含序列識別號14及16所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-41」；將包含序列識別號18及20所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-42」；將包含序列識別號22及24所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-43」；將包含序列識別號26及28所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-44」；將將包含序列識別號30及32所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-45」；將包含序列識別號36及38所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-47」；將包含序列識別號42及44所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-49」；將包含序列識別號46及48所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-50」；將包含序列識別號50及52所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-51」；將包含序列識別號54及56所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-53」；將序列識別號60及58所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-55」；將包含序列識別號62及64所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-57」；將包含序列識別號66及68所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-58」；將包含序列識別號70及72所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-59」；將包含序列識別號74及76所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-52」；將包含序列識別號78及82所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-61」；將包含序列識別號80及82所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-61.1」；將包含序列識別號84及86所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-62」；將包含序列識別號88及90所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-2」；將包含序列識別號92及94所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-7」；將包含序列識別號96及98所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-9」；將包含序列識別號100及102所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-10」；將包含序列識別號104及106所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-12」；將包含序列識別號108及110所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-13」；將包含序列識別號112及114所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-14」；將包含序列識別號116及118所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-15」；將包含序列識別號122及124所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-20」；將包含序列識別號126及128所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-21」；將包含序列識別號130及132所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-22」；將包含序列識別號134及136所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-23」；將包含序列識別號138及140所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-24」；將包含序列識別號142及144所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-25」；將包含序列識別號146及148所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-26」；將包含序列識別號150及152所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-27」；將包含序列識別號154及156所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-28」；將包含序列識別號158及160所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-31」；將包含序列識別號162及164所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-32」；將包含序列識別號166及168所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-35」；將包含序列識別號170及172所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-36」；將包含序列識別號174及176所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-37」；將包含序列識別號178及180所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-34」；將包含序列識別號182及184所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-1」；將包含序列識別號186及188所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-3」；將包含序列識別號190及192所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-4」；將包含序列識別號194及196所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-5」；將包含序列識別號198及200所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-6」；將包含序列識別號202及204所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-8」；將包含序列識別號206及208所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-11」；將包含序列識別號210及212所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-16」；將包含序列識別號214及216所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-17」；將包含序列識別號218及220所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-18」；將包含序列識別號222及224所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-33」；將包含序列識別號226及228所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-29」；將包含序列識別號230及232所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-30」；將包含序列識別號34所示的重鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-46」；將包含序列識別號40所示的重鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-48」；將包含序列識別號60及58所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-55.1」；將包含序列識別號120所示的重鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-19」；將包含序列識別號62及64所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體稱為「U1-57.1」。關於此等之抗體，詳細記載於實施例。 本發明之經單離的HER3結合蛋白質更佳地係含有序列識別號42及44所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列、序列識別號54及56所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列、序列識別號70及72所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列、序列識別號92及94所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列、或序列識別號96及98所示的重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列，又更佳為該HER3結合蛋白質為抗HER3抗體的U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9。
以下序列表中之「Antibody」為抗體，「Heavy chain」為重鏈，「Light Chain」為輕鏈，「Protein」為蛋白質。
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新製作的單株抗體若與U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9抗體之結合的部分胜肽或部分立體結構結合，則可判定該抗體結合於與U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9抗體相同之抗原決定位。又，藉由確認對於「U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9抗體之對於HER3的結合」，該抗體為競合(即，該抗體妨礙U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9抗體與HER3之結合)，即使未決定具體的抗原決定位之序列或結構，亦可判定該抗體結合於與U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9抗體相同之抗原決定位。確認抗原決定位相同的情形，強烈地期待該抗體具有與U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9抗體同等之生物活性。
依據本發明，本發明之HER3結合蛋白質係與HER3之細胞外部分中之至少1個抗原決定位相互作用。抗原決定位較佳位於胺基末端功能域的功能域L1(胺基酸19至184)、富含半胱胺酸的2個功能域的功能域S1(胺基酸185至327)及S2(胺基酸500至632)、與富含半胱胺酸的2個功能域鄰接的功能域L2(328至499)或HER3功能域之組合之中。抗原決定位亦可位於由L1及S1之一部分所構成的抗原決定位等(惟，並未限定於此)之功能域之組合中。再者，本發明之結合蛋白質之特徵進一步為其對HER3的結合使藉由HER3而媒介的訊息傳導降低。依據本發明，藉由HER3媒介的訊息傳導的降低係例如，可藉由自細胞表面使HER3分子至少部分地消失的HER3的下游控制，或藉由實質上不活性的形態(即，與未安定化的形態相比，呈現更低訊息傳導的形態)之細胞表面上之HER3的安定化所引起。或者，亦可藉由HER3所媒介的訊息傳導的降低係藉由影響對HER3之配位子或HER家族之其他成員的結合、對HER-2之GRB2的結合或對SHC之GRB2的結合(例如，減少或抑制)，藉由抑制受體酪胺酸磷酸化、AKT磷酸化、PYK2酪胺酸磷酸化或ERK2磷酸化，或藉由使腫瘤之浸潤性減少而引起。或者，藉由HER3而媒介的訊息傳導的降低亦可藉由影響與其他之HER家族之成員的含HER3的二聚體形成(例如，減少或抑制)而引起。尤其其1例可為減少或抑制HER3-EGFR蛋白質複合體之形成。
再者，於本發明，序列識別號1至232之任一者所示的胺基酸序列中的些微變動被假定由本發明所包含，然而胺基酸序列中之變動係維持序列識別號1至232之任一者所示的序列之至少75%，較佳為至少80%、90%、95%、96%、97%、98%及最佳為99%。變動可發生於框架區內(即，CDR外)、CDR內、或框架區及CDR內。序列識別號1至232所示的胺基酸序列中之較佳變動，即1至數個胺基酸之缺失、插入及/或取代，係發生於機能的功能域之邊境附近。結構的及機能的功能域係可藉由將核苷酸及/或胺基酸序列資料，與公開序列資料庫或獨自之序列資料庫加以比較而鑑定。為了鑑定周知之結構及/或機能之其他結合蛋白質中產生的序列基序(motif)或被預測的蛋白質立體結構功能域，可使用電腦化的比較法。用以鑑定摺疊為周知三維結構的蛋白質序列的方法為周知的。例如，請參照Bowie et al.，Science 253，164(1991)；Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991 ))；及Thornton et al.，Nature 354：105(1991)(此等全部藉由參照而併入本說明書中)。因此，若為本項技術領域者，可依據本發明辨識為了定義結構及機能的功能域而可使用的序列基序及結構的立體結構。由將具有此種胺基酸序列中之變動的重鏈及輕鏈組合而獲得的抗體之中，可選擇與原本抗體(母抗體(parent antibody))同等或較母抗體更優異的抗體。本發明之HER3結合蛋白質、抗HER3抗體等係即使如前述於胺基酸序列中發生變動，亦保持HER3結合活性。 於本發明，「同源性」係與「同一性」同意義。二種類之胺基酸序列間之同源性係可藉由使用Blast algorithm第2.2.2版(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaeffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，and David J.Lipman(1997)，「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」，Nucleic Acids Res.25：3389-3402) 之系統內定參數(default parameter)而決定。Blast algorithm亦可藉由例如於網際網路存取www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。
藉由以上之方法所獲得的嵌合抗體、人化抗體、或人類抗體係可藉由周知方法等評價對抗原的結合性，並選出適合的抗體。 本發明之抗HER3抗體亦包含MEHD-7945A(或多利戈珠單抗(doligotuzumab))、RG-7116、MM-111、MM-121(或西利班珠單抗(seribantumab))、MM-141、LJM-716、huHER3-8、三-特異性抗-EGFR/ErbB3 zybody、GSK-2849330、REGN-1400、KTN-3379、AV-203、單特異性替代抗體(monospecific surrobody)(ErbB3)、倫雷珠單抗(lumretuzumab)、MP-EV-20、ZW-9、DimerceptTM 、抗-Erb3替代抗體(surrobody)(SL-175或SL-176)、SYM-013、彼等之變異體、活性片段、修飾體等。
就比較抗體性質之際之其他指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱析儀(DSC)係可快速又正確地測量成為蛋白質之相對的結構安定性良好指標的熱變性中點(Tm)的裝置。藉由使用DSC測量Tm値，比較其値，可比較熱安定性之差異。已知抗體之保存安定性呈現與抗體之熱安定性有某程度之相關(Lori Burton，et.al.，Pharmaceutical Development and Technology(2007)12，p.265-273) ，可將熱安定性作為指標而選擇適合的抗體。就用以選擇抗體的其他指標而言，可列舉於適當宿主細胞中的產量高、及水溶液中之凝集性低。例如，產量最高的抗體不一定呈現最高的熱安定性，因此基於以上所述指標而綜合地判斷，有必要選出最適合對人類投予之抗體。
本發明之抗體亦包含抗體之修飾體。該修飾體係意指對本發明之抗體施予化學或生物學的修飾者。化學的修飾體係包含對胺基酸骨架之化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學修飾體等。生物學的修飾體包含施予轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結之糖鏈附加、N末端或C末端之加工、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞表現，而於N末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了可進行本發明之抗體或抗原之檢測或單離而被標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含於該修飾物之意義。此類本發明之抗體之修飾物係有用於抗體的安定性及血中滯留性之改善、抗原性之減輕、抗體或抗原之檢出或單離等。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(糖苷化(glycosylation)、脫岩藻糖(fucose)化等)，可增強抗體依賴性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知有國際公開第1999/54342號、國際公開第2000/61739號、國際公開第2002/31140號等，但未限定於此等。本發明之抗體亦包含該糖鏈修飾被調節的抗體。 一旦單離抗體基因後，導入適當宿主而製作抗體的情形，可使用適當的宿主與表現載體之組合。就抗體基因之具體例而言，可列舉將編碼本說明書記載的抗體之重鏈序列的基因、及編碼輕鏈序列的基因加以組合者。將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可被插入相同表現載體，又亦可被插入各別表現載體。 將真核細胞作為宿主使用的情形，可使用動物細胞、植物細胞、或真核微生物。尤其就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴細胞的COS細胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658) 或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61) 之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)。 使用原核細胞的情形，例如，可列舉大腸桿菌、枯草桿菌。 藉由轉形而於此等之細胞中導入作為目的之抗體基因，並藉由將經轉形的細胞於活體外培養，可獲得抗體。於該培養，依抗體之序列而有產量不同的情形，自具有同等結合活性的抗體之中，以產量作為指標而可選出容易作為醫藥生產者。據此，本發明之抗體亦包含藉由下列抗體之製造方法所獲得的抗體，該製造方法之特徵為包含：培養上述經轉形的宿主細胞的步驟、及自該步驟所獲得的培養物採收目的之抗體或該抗體的機能性片段的步驟。
又，已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A，705：129-134(1995))，又，已知相同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基缺失，且新位於羧基末端的脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))。然而，此等重鏈序列之缺失及修飾對於抗體之抗原結合能力及效應子機能(補體之活性化或抗體依賴性細胞毒殺作用等)並無影響。據此，本發明之抗體亦包含受該修飾的抗體及該抗體之機能性片段，亦包含於重鏈羧基末端有1或2個之胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能力及效應子機能，本發明之抗體之重鏈之羧基末端的缺失體並未限於上述種類。構成本發明之抗體的2股重鏈可為選自包含完全長度及上述之缺失體之群組的重鏈之任一種，亦可組合任二種。各缺失體之量比係受產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但就本發明之抗體之主成分而言，可列舉於2股重鏈之雙方，羧基末端之一個胺基酸殘基缺失的情形。本發明之全長抗體(於本發明，亦有僅記載為「抗體」)之範圍亦包含彼等之缺失體、含1種或2種以上之彼等之缺失體的混合物等。又，本發明之「抗體」亦包含：N末端為麩醯胺酸時，含其環化而成為焦麩醯胺酸的重鏈或輕鏈者；及/或含半胱胺酸之一部分作半胱胺醯基(cysteinyl)化的重鏈或輕鏈者。
就本發明之抗HER3抗體之同型而言，例如，可列舉IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型，較佳為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1及IgM2型等，但未限定於彼等，更佳為IgG或IgM型，最佳為IgG1、IgG2或IgG4。
就抗體之生物活性而言，一般可列舉抗原結合活性、藉由與抗原結合而內在化至表現該抗原的細胞的活性、中和抗原之活性的活性、增強抗原之活性的活性、抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性、補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性及抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)，但本發明之抗體所具有的機能係對HER3的結合活性，較佳為藉由與HER3結合而內在化至HER3表現細胞的活性。再者，本發明之抗體除了細胞內在化活性之外，亦可兼具ADCC活性、CDC活性及/或ADCP活性。
於某一觀點，例如，關於製作抗HER3的抗體作為治療候補物，本發明之抗HER3抗體可期望有將補體固定，可參與補體依賴性細胞毒殺(CDC)的情形。小鼠IgM、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人類IgM、人類IgG1、人類IgG3及人類IgA等(惟，並未限定於此等)，存有許多可能參與補體之固定及補體依賴性細胞毒殺(CDC)的抗體之同型。製作的抗體並無必要從一開始即具有此種同型，而是製作的抗體可具有各式各樣的同型，以及被理解為使用本領域周知的慣用分子生物學的技術，於適當表現載體中加入經分子選殖的恆定區基因或對cDNA加入經分子選殖的V區基因或cDNA，其次，藉由使用本領域周知的技術而於宿主細胞中使抗體表現，可將抗體做同型交換。經同型交換的抗體以與天然存在的變種相比具有優異的CDC的方式被分子性地加工(Idusogie et al.，J Immunol.，166，2571-2575)，使用本領域周知之技術，亦可具有於宿主細胞中重組表現的Fc區。此種技術，尤其是包含直接的重組技術(例如，參照美國專利第4,816,397號)、細胞-細胞融合技術(例如，美國專利第5,916,771號及美國專利第6,207,418號)之使用。於細胞-細胞融合技術，調製保有具有任何所欲之同型的重鏈的骨髓瘤或其他細胞株(CHO等)，進一步調製保有輕鏈的其他骨髓瘤或其他細胞株(CHO等)。之後，可將此種細胞融合，將表現完全狀態的抗體的細胞株加以單離。作為一例，為了具有(規定抗體之特異性及抗體之親和性的多少之)相同可變區，同時製作人類IgM、人類IgG1或人類IgG3同型，可容易地使具有對HER3抗原之所欲結合的人類抗HER3 IgG4抗體進行同型交換。之後，此種分子係有可將補體固定、參與CDC的可能。
再者，本發明之抗HER3抗體係可對單核球及自然殺手(NK)細胞等之效應細胞上之Fc受體結合，亦可期待有參與抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)的情形。小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人類IgG1及人類IgG3等(惟，並未限定於此等)，存有許多上述為可能的抗體之同型。製作的抗體並無必要從一開始即具有此種同型，而是製作的抗體可具有各式各樣的同型，以及被理解為使用本領域周知的慣用分子生物學的技術，於適當表現載體中加入經分子選殖的恆定區基因或對cDNA加入經分子選殖的V區基因或cDNA後，藉由使用本領域周知的技術而於宿主細胞中使抗體表現，可實施抗體之同型交換。經同型交換的抗體以與天然存在的變種相比具有優異的ADCC的方式而被分子性地加工(Shields et al.J Biol Chem.，276，6591-6604)，使用本領域周知之技術，亦可具有於宿主細胞中重組表現的Fc區。此種技術，尤其是包含直接的重組技術(例如，參照美國專利第4,816,397號)、細胞-細胞融合技術(例如，美國專利第5,916,771號及美國專利第6,207,418號)之使用。於細胞-細胞融合技術，調製保有具有任何所欲之同型的重鏈的骨髓瘤或其他細胞株(CHO等)，及調製保有輕鏈的其他骨髓瘤或其他細胞株(CHO等)。之後，可將此種細胞融合，將表現完全狀態的抗體的細胞株加以單離。作為一例，為了具有(規定抗體之特異性及抗體之親和性的多少之)相同可變區，同時製作人類IgG1或人類IgG3同型，可容易地使具有對HER3抗原之所欲結合的人類抗HER3 IgG4抗體進行同型交換。其次，此種分子有可與效應細胞上之FcγR結合、參與ADCC的可能。
獲得的抗體可純化至均一。抗體之分離、純化只要使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法即可。例如，只要適宜選擇管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等加以組合，即可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual，Daniel R.Marshak et al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但未限定於此等。 就層析而言，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、膠體過濾層析、逆相層析、吸附層析等。 此等之層析可使用HPLC或FPLC等之液相層析來進行。 就用於親和性層析所使用的管柱而言，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。例如，就使用蛋白質A管柱的管柱而言，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia公司)等。 又亦可使用將抗原固定化的載體(carrier)，利用對抗原之結合性而純化抗體。 [抗腫瘤性化合物]
茲描述於本發明之抗HER3抗體-藥物結合物所結合的抗腫瘤性化合物。就本發明所使用的抗腫瘤性化合物而言，只要為具有抗腫瘤效果的化合物，且具有可與連接物結構結合的取代基、部分結構者即可，並未特別限制。抗腫瘤性化合物係連接物之一部份或全部於腫瘤細胞內被切斷，抗腫瘤性化合物部分游離，而表現抗腫瘤效果。若連接物與藥物結合部分被切斷，則抗腫瘤性化合物以未修飾的結構游離，而發揮其本來之抗腫瘤效果。 就本發明所使用的抗腫瘤性化合物而言，較佳可使用為喜樹鹼衍生物的依喜替康((1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮；下式：)
Figure 02_image001
。
此依喜替康雖具有優異的抗腫瘤活性，但尚未作為抗腫瘤藥被市售。該化合物可以周知方法容易地取得，且可適合使用1位之胺基作為對連接物結構之結合部位。又，依喜替康亦有連接物之一部份為結合的狀態下於腫瘤細胞內游離的情形，但其係即使為如此的結構，亦發揮優異抗腫瘤效果的優異化合物。 已知依喜替康因具有喜樹鹼結構，於酸性水性介質中(例如，pH3左右)平衡偏向有內酯環形成的結構(閉環體)，另一方面，於鹼性水性介質中(例如，pH10左右)平衡偏向內酯環為開環的結構(開環體)。即使為導入對應如此的閉環結構及開環結構的依喜替康殘基的藥物結合物，亦被期待同等之抗腫瘤效果，不用說，任一者之狀態亦被包含於本發明之範圍。
就其他之抗腫瘤性化合物而言，例如，可列舉阿黴素(Doxorubicin)、柔紅黴素(Daunorubicin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、博來黴素(Bleomycin)、環胞苷(Cyclocytidine)、長春新鹼(Vincristine)、長春鹼(Vinblastine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、白金系抗腫瘤劑(順鉑(Cisplatin)或其衍生物)、塔克素(Taxol)或其衍生物、其他之喜樹鹼或其衍生物(日本特開平6-87746號公報記載的抗腫瘤劑)等。
於抗體-藥物結合物，對抗體1分子之藥物之結合數係影響其有效性、安全性的重要因子。抗體-藥物結合物之製造係以藥物之結合數成為一定數目的方式，規定反應的原料・試藥之使用量等之反應條件而實施，但與低分子化合物之化學反應不同，通常係作為結合相異數目的藥物之混合物而獲得。對抗體1分子之藥物結合數係標記平均値，即，被特定為平均藥物結合數。本發明原則上，除非另有指定，即，除了表示於具有相異藥物結合數的抗體-藥物結合物混合物中所含之具有特定藥物結合數的抗體-藥物結合物的情形，藥物之結合數係意指平均値。 依喜替康對抗體分子之結合數係可控制，就每1抗體之藥物平均結合數而言，可使1至10個左右的依喜替康結合，但較佳為2至8個，更佳為3至8個。又，若為本技術領域者，由本案實施例之記載，可設計使必要數目的藥物結合於抗體的反應，可取得控制依喜替康之結合數的抗體-藥物結合物。 本發明之抗體-藥物結合物係即使藥物對抗體1分子的結合數變多的情形，亦難以產生凝集、不溶性、片段化(fragmentation)等。 [連接物結構]
針對於本發明之抗HER3抗體-藥物結合物中使抗腫瘤性化合物與抗HER3抗體結合的連接物結構加以描述。該連接物係具有下式之結構： -L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-或-L1 -L2 -LP -， 抗體係於L1 之末端(與L2 結合者的相反側之末端)結合，抗腫瘤性化合物係於-La -(CH2 )n2 -C(=O)-部分之羰基或LP 之C末端結合。 n1 表示0至6之整數，但較佳為1至5之整數，更佳為為1至3。
1.L1 L1 係 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)- 之結構所示者。 其中，n3 為2至8之整數，『-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-』係具有下式所示的結構：
Figure 02_image004
。
此部分結構中的3位係對抗HER3抗體之結合部位。於此3位之與該抗體之結合，其特徵係形成硫醚而結合。此結構部分之1位氮原子係與含其結構的連接物內存在的亞甲基之碳原子結合。即，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -為下式所示的結構(其中，「抗體-S-」係來自抗體)。
Figure 02_image087
式中，n3 為2至8之整數，但較佳為2至5。
就L1 之具體例而言，可列舉 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-等。
2.L2 L2 係 -NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)- 所示的結構，但L2 亦可不存在，於此情形，L2 成為單鍵。尤其於本發明之藥物-連接物結構，有LP 與藥物直接鍵結的情形，但於此情形，此L2 係單鍵為特佳。n4 為1至6之整數，較佳為2至4。L2 為於末端之胺基與L1 結合，於相反側末端之羰基與LP 結合。
就L2 之具體例而言，可列舉 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-等。
3.LP LP 為以2至7個胺基酸所構成的胜肽殘基。即，由2至7個之胺基酸經胜肽鍵結的寡肽之殘基所構成。LP 係於N末端與L2 結合，於C末端與連接物之-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-部分之胺基結合。
構成LP 的胺基酸並未特別限定，但例如，L-或D-胺基酸，較佳為L-胺基酸。又，α-胺基酸之外，可為β-丙胺酸、ε-胺基己酸、γ-胺基丁酸等之結構的胺基酸，又例如亦可為經N-甲基化的胺基酸等之非天然型之胺基酸。 LP 之胺基酸序列並未特別限定，但就構成的胺基酸而言，可列舉苯丙胺酸(Phe；F)、酪胺酸(Tyr；Y)、白胺酸(Leu；L)、甘胺酸(Gly；G)、丙胺酸(Ala；A)、纈胺酸(Val；V)、離胺酸(Lys；K)、瓜胺酸(Cit)、絲胺酸(Ser；S)、麩胺酸(Glu；E)、天冬胺酸(Asp；D)等。此等中，較佳可列舉苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸。依據胺基酸之種類，可控制藥物游離的樣式。胺基酸之數目可為2至7個。
就LP 之具體例而言，可列舉 -GGF-、 -DGGF-、 -(D-)D-GGF-、 -EGGF-、 -GGFG-、 -SGGF-、 -KGGF-、 -DGGFG-、 -GGFGG-、 -DDGGFG-、 -KDGGFG-、 -GGFGGGF-。 上述之『(D-)D』意指D-天冬胺酸。就本發明之抗體-藥物結合物之特佳LP 而言，可列舉-GGFG-及-DGGFG-胜肽殘基。再者，於本發明之藥物-連接物結構，有LP 與藥物直接鍵結的情形，但於此情形，就較佳LP 而言，可列舉-DGGFG-之五胜肽殘基。
4.La -(CH2 )n2 -C(=O)- La -(CH2 )n2 -C(=O)-中的La 為-O-之結構、或單鍵。n2 為0至5之整數，但較佳為0至3，更佳為0或1。 就La -(CH2 )n2 -C(=O)-而言，可列舉以下之結構。 -O-CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。 此等中為 -O-CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 -C(=O)- 的情形，或La 為單鍵且n2 為0的情形較佳。
就連接物之-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所示的結構之具體例而言，可列舉 -NH-CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-等。
此等中更佳為 -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、  -NH-CH2 CH2 -O-C(=O)-。
連接物之-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-，就鏈長而言，為4至7原子之鏈長者為較佳，但更佳為具有5或6原子之鏈長者。
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物被認為係移動至腫瘤細胞內後，連接物部分被切斷，NH2 -(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)所示的結構之藥物衍生物游離而表現抗腫瘤作用。就自本發明之抗體-藥物結合物游離而表現抗腫瘤效果的抗腫瘤性衍生物而言，可列舉先前舉例的連接物之-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所示的結構之末端具有成為胺基的結構部分的抗腫瘤性衍生物，但特佳為下列各者。 NH2 -CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 NH2 -CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 NH2 -CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 NH2 -CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。 又，NH2 -CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)的情形，已確認因相同分子內的縮醛胺(aminal)結構不安定，進一步自己分解，而 HO-CH2 -C(=O)-(NH-DX) 被游離。此等之化合物亦可適合使用作為本發明之抗體-藥物結合物之製造中間體。 又，於本發明之藥物-連接物結構，有LP 與藥物直接鍵結的情形。於此情形，LP 之C末端為甘胺酸時，經游離的抗腫瘤性藥物為依喜替康本身或依喜替康之胺基有甘胺酸鍵結的化合物。
於將藥物作成依喜替康的本發明之抗體-藥物結合物，使下述之結構之藥物-連接物結構部分 -L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)、或 -L1 -L2 -LP -(NH-DX) 與抗體結合者為較佳。此等之藥物-連接物結構部分，就每1抗體之平均結合數，若使與1至10個結合即可，但較佳為2至8，更佳為3至8。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。 此等中更佳為下列各者。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。 再者，較佳為下列各者。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。 特佳為下列各者。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
於本案之抗體-藥物結合物，將抗HER3抗體與藥物結合的連接物結構藉由結合目前為止所述的連接物各部分所示的較佳結構者，可構築較佳連接物。就此種連接物結構而言，可較佳使用以下之結構。又，結構之左端為與抗體的結合部位，右端為與藥物的結合部位。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-。 此等中更佳為下列各者。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-。 再者，較佳可列舉下列各者。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-。 特佳可列舉下列各者。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。 [製造方法]
其次，說明本發明之抗體-藥物結合物或其製造中間體之代表性的製造方法。又，於以下，將化合物以各反應式中所示的編號表示。即，稱為『式(1)之化合物』、『化合物(1)』等。又關於此以外之編號之化合物亦同樣地記載。 1.製造方法1
式(1)所示之抗體與藥物-連接物結構經由硫醚而結合的抗體-藥物結合物可藉由例如下述之方法來製造。
Figure 02_image089
[式中，AB表示具有氫硫基(sulfhydryl)的抗體，L1 ’為於L1 所示的連接物結構，末端變換為順丁烯二醯亞胺基(下式)的結構：
Figure 02_image013
(其中，氮原子為結合部位)。具體而言，表示於-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n2 -C(=O)-所示的L1 之結構，該-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-部分成為順丁烯二醯亞胺基的結構之連接物。又，-(NH-DX)係下式所示的結構：
Figure 02_image007
，
表示依喜替康之1位之胺基之1個氫原子被去除而生成的基]。
又，於上述之反應式，式(1)之化合物可被解釋為由藥物至連接物末端之結構部分1個對1個之抗體結合的結構。然而，此係用以說明之方便的記載，實際上大多為該結構部分對抗體分子1個為結合複數個的情形。此狀況於以下之製造方法之說明亦為相同。
即，藉由使利用後述方法取得的化合物(2)與具有氫硫基的抗體(3a)反應，可製造抗體-藥物結合物(1)。 具有氫硫基的抗體(3a)係可以本技術領域者周知之方法獲得(Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press(1996))。例如，可列舉使陶特氏試藥(Traut’s reagent)對抗體之胺基作用；使N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯基硫烷酸酯類與抗體之胺基作用後，使羥基胺作用；使N-琥珀醯亞胺基 3-(吡啶基二硫基)丙酸酯作用後，使還原劑作用；使二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)等之還原劑對抗體作用而將抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原、生成氫硫基等之方法，但未限定於此等。 具體而言，將TCEP作為還原劑，相對於抗體內鉸鏈部雙硫鍵每1個使用0.3至3莫耳當量，於含螯合劑的緩衝液中，藉由使其與抗體反應，可獲得抗體內鉸鏈部雙硫鍵被部分或完全地還原的抗體。就螯合劑而言，例如可列舉乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙三胺5乙酸(DTPA)等。將此等以1mM至20mM之濃度使用即可。就緩衝液而言，可使用磷酸鈉或硼酸鈉、乙酸鈉溶液等。具體而言，抗體藉由於4℃至37℃使其與TCEP反應1至4小時，可獲得具有部分或完全地還原的具有氫硫基的抗體(3a)。 其中藉由實施使氫硫基附加於藥物-連接物部分的反應，可藉由硫醚鍵使藥物-連接物部分結合。 具有氫硫基的抗體(3a)每1個，使用2至20莫耳當量之化合物(2)，可製造抗體每1個結合2個至8個藥物的抗體-藥物結合物(1)。具體而言，於含有氫硫基的抗體(3a)的緩衝液中，添加使化合物(2)溶解的溶液而使其反應即可。其中，就緩衝液而言，只要使用乙酸鈉溶液、磷酸鈉或硼酸鈉等即可。反應時之pH為5至9，更佳為使其於pH7附近反應即可。就使化合物(2)溶解的溶媒而言，可使用二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)等之有機溶劑。 只要將溶解有化合物(2)的有機溶媒溶液，添加1至20%v/v至含有含氫硫基之抗體(3a)的緩衝液而使其反應即可。反應溫度係0至37℃，更適合地為10至25℃，反應時間係0.5至20小時。反應可藉由利用含有硫醇的試藥使未反應之化合物(2)之反應性失活而結束。含有硫醇的試藥係例如，半胱胺酸或N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體而言，相對於使用的化合物(2)，添加1至2莫耳當量之NAC，並藉由於室溫保溫(incubate)10至30分鐘而可結束反應。 製造的抗體-藥物結合物(1)係藉由以下之共通操作而進行濃縮、緩衝液交換、純化、抗體濃度及抗體每一分子的藥物平均結合數之測定，可進行抗體-藥物結合物(1)之鑑定。 共通操作A：抗體或抗體-藥物結合物水溶液之濃縮
於Amicon Ultra(50,000 MWCO，Millipore Corporation)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)的離心操作(以2000G至3800G離心5至20分鐘)，而將抗體或抗體-藥物結合物溶液濃縮。 共通操作B：抗體之濃度測定
使用UV測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。其中，280nm吸光係數係可自抗體之胺基酸序列，藉由已知之計算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)而推定，各抗體使用相異的280nm吸光係數(1.3mLmg-1 cm-1 至1.8mLmg-1 cm-1 )。U1-59的情形，依據其胺基酸序列，使用1.768mLmg-1 cm-1 之280nm吸光係數作為推定値。 共通操作C：抗體之緩衝液交換
將使用Sephadex G-25載體(carrier)的NAP-25管柱(Cat. No.17-0852-02，GE Healthcare Japan Corporation)，依據製造商規定之方法，以含氯化鈉(137mM)及乙二胺四乙酸(EDTA，5mM)的磷酸緩衝液(10mM，pH6.0；本說明書中稱為PBS6.0/EDTA)使其平衡化。對每一根此NAP-25管柱，放置抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL溶出的劃分(3.5mL)。將此劃分藉由共通操作A而濃縮，使用共通操作B而進行抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA而調整抗體濃度為10mg/mL。 共通操作D：抗體-藥物結合物之純化
以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM，pH5.5；於本說明書稱為ABS)使NAP-25管柱平衡化。藉由於此NAP-25管柱，置入抗體-藥物結合物反應水溶液(2.5mL)，以製造商規定之量的緩衝液使其溶出，而分取抗體劃份。藉由重複將此分取劃份再次置入NAP-25管柱、以緩衝液使其溶出的膠體過濾純化操作共計2至3次，而獲得去除未結合之藥物連接物或低分子化合物(參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、二甲基亞碸)的抗體-藥物結合物。 共通操作E：抗體-藥物結合物中的抗體濃度及抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(1)
抗體-藥物結合物中的結合藥物濃度係可藉由測定抗體-藥物結合物水溶液之280nm及370nm之二波長中的UV吸光度後，進行下述之計算而算出。 因某波長中的全吸光度係相等於系統內存在的全部吸收化學物種之吸光度之和[吸光度之加成性]，故於抗體與藥物之結合前後，假設抗體及藥物之莫耳吸光係數未變化時，則抗體-藥物結合物中的抗體濃度及藥物濃度係如下述之關係式所示。 A280 ＝AD ， 280 ＋AA ， 280 ＝εD ， 280 CD ＋εA ， 280 CA 式(1) A370 ＝AD ， 370 ＋AA ， 370 ＝εD ， 370 CD ＋εA ， 370 CA 式(2) 其中，A280 表示280nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度；A370 表示370nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度；AA ， 280 表示280nm中的抗體之吸光度；AA ， 370 表示370nm中的抗體之吸光度；AD ， 280 表示280nm中的結合物先驅體之吸光度；AD ， 370 表示370nm中的結合物先驅體之吸光度；εA ， 280 表示280nm中的抗體之莫耳吸光係數；εA ， 370 表示370nm中的抗體之莫耳吸光係數；εD ， 280 表示280nm中的結合物先驅體之莫耳吸光係數；εD ， 370 表示370nm中的結合物先驅體之莫耳吸光係數；CＡ 表示抗體-藥物結合物中的抗體濃度；CＤ 表示抗體-藥物結合物中的藥物濃度。 其中，εA ， 280 、εA ， 370 、εD ， 280 、εD ， 370 係使用事前準備的値(計算推定値或由化合物之UV測定而獲得的實測値)。例如，εA ， 280 係可自抗體之胺基酸序列，藉由已知之計算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)而推定。εA ， 370 係通常為零。U1-59的情形，依據其胺基酸序列，εA ， 280 係使用259400作為推定値。εD ， 280 及εD ， 370 係可藉由測定將使用的結合物前驅物溶解成某莫耳濃度的溶液之吸光度，依據朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)(吸光度＝莫耳濃度×莫耳吸光係數×槽光徑長)而獲得。藉由測定抗體-藥物結合物水溶液之A280 及A370 ，將此等之値代入式(I)及(II)而解出連立方程式，可求得CA 及CD 。再者，藉由以CA 除CD ，可求得每1抗體之藥物平均結合數。 於本發明，將以上說明的每1抗體之藥物平均結合數的求出方法稱為「UV法」。 共通操作F：抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(2)
抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數係除了前述之共通操作E之外，亦可藉由使用以下之方法的高速液體層析(HPLC)分析而求得。 [F-1.HPLC分析用樣品之調製(抗體-藥物結合物之還原)] 將抗體-藥物結合物溶液(約1mg/mL、60μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)混合。將混合物於37℃保溫30分鐘，將藉此切斷抗體-藥物結合物之L鏈及H鏈間的雙硫鍵的樣品用於HPLC分析。 [F-2.HPLC分析] 將HPLC分析以下述之測定條件進行。 HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies) 檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm) 管柱：PLRP-S(2.1×50mm、8μm、1000Å；Agilent Technologies、P/N PL1912-1802) 管柱溫度：80℃ 移動相A：0.04%三氟乙酸(TFA)水溶液 移動相B：含0.04%TFA的乙腈溶液 梯度程式：29%-36%(0分鐘-12.5分鐘)、36%-42%(12.5-15分鐘)、42%-29%(15分鐘-15.1分鐘)、29%-29%(15.1分鐘-25分鐘) 樣品注入量：15μL [F-3.資料解析] 〔F-3-1〕相對於未結合藥物之抗體之L鏈(L0 )及H鏈(H0 )，藥物結合的L鏈(結合一個藥物的L鏈：L1 )及H鏈(結合一個藥物的H鏈：H1 、結合二個藥物的H鏈：H2 、結合三個藥物的H鏈：H3 )係與結合的藥物數成比例地增加疏水性而滯留時間變大，故以L0 、L1 、H0 、H1 、H2 、H3 之順序被溶出。可藉由L0 及H0 之滯留時間比較，將檢出波峰分配於L0 、L1 、H0 、H1 、H2 、H3 之任一者。 〔F-3-2〕因於藥物連接物有UV吸收，因應藥物連接物之結合數，使用L鏈、H鏈及藥物連接物之莫耳吸光係數而依據下式進行波峰面積値之補正。
Figure 02_image093
Figure 02_image095
其中，各抗體中的L鏈及H鏈之莫耳吸光係數(280nm)係可藉由已知之計算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)，使用自各抗體之L鏈及H鏈之胺基酸序列所推定的値。U1-59之情形，依據其胺基酸序列，就L鏈之莫耳吸光係數而言，使用34690作為推定值，就H鏈之莫耳吸光係數而言，使用95000作為推定值。又，藥物連接物之莫耳吸光係數(280nm)係使用將各藥物連接物以巰基乙醇或N-乙醯基半胱胺酸反應，將順丁烯二醯亞胺基變換為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實測之莫耳吸光係數(280nm)。 〔F-3-3〕依據下式計算相對於波峰面積補正値合計之各鏈波峰面積比(%)。
Figure 02_image097
〔F-3-4〕將抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數，依據下式計算。 藥物平均結合數＝(L0 波峰面積比×0＋L0 波峰面積比×1＋H0 波峰面積比×0＋H1 波峰面積比×1＋H2 波峰面積比×2＋H3 波峰面積比×3)/100×2
以下描述於製造方法1所使用的製造中間體化合物。製造方法1中的式(2)所示的化合物係下式所示的化合物：
(順丁烯二醯亞胺-N-基)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)或 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -LP -(NH-DX)。 式中， n3 表示整數之2至8， L2 表示-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-或單鍵， 其中，n4 表示1至6之整數， LP 表示以選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸的2至7個胺基酸所構成的胜肽殘基， n1 表示0至6之整數， n2 表示0至5之整數， La 表示-O-或單鍵， (順丁烯二醯亞胺-N-基)-係下式：
Figure 02_image013
所示的順丁烯二醯亞胺基(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)，氮原子成為結合部位的基， -(NH-DX)係下式：
Figure 02_image007
所示的1位之胺基之氮原子成為結合部位的基。
就LP 之胜肽殘基而言，為包含選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸的胺基酸的胺基酸殘基者作為製造中間體較佳。此種胜肽殘基LP 中，為以4或5個之胺基酸所構成的胜肽殘基者作為製造中間體較佳。更具體而言，LP 為-GGFG-之四胜肽殘基或-DGGFG-之五胜肽者作為製造中間體較佳，但更佳為-GGFG-。
又，就-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -而言，為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -者作為製造中間體較佳，為-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 者更佳。 就n3 而言，為整數之2至8者作為製造中間體較佳。 L2 為單鍵、或-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-，且n4 為整數之2至4者作為製造中間體較佳。
再者，n3 為整數之2至5，L2 為單鍵，-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -者作為製造中間體較佳。而且，此等中更佳為-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -的化合物。再者，n3 為整數之2或5者較佳。
又，n3 為整數之2至5，L2 為-NH-(CH2 -CH2 -O)n4 -CH2 -CH2 -C(=O)-，且n4 為整數之2至4，-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -者作為製造中間體較佳。更佳係n4 為整數之2或4之化合物。再者，-NH-(CH2 )n1 -La -為-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -者較佳。
就此種對本發明化合物之製造有用的中間體而言，可例示以下各者作為較佳者： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、或  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
藉由使選自上述之製造中間體化合物之群組的藥物-連接物化合物，與抗Her3抗體或其反應性衍生物反應，可於抗Her3抗體之鉸鏈部存在的雙硫鍵部分使硫醚鍵形成而製造本發明之抗Her3抗體-藥物結合物。此情形，較佳使用抗Her3抗體之反應性衍生物，尤其將抗Her3抗體還原處理而獲得的反應性衍生物為較佳。
以下者為作為製造中間體更佳的化合物。 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)、  (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。
又，上述之中間體化合物群組之中係下式： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、或 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-DGGFG-(NH-DX)。 所示的中間體為更佳的化合物。 特佳為下式所示的化合物： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、或 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。 2.製造方法2
於先前之製造方法所使用的中間體的式(2)所示的化合物或彼等之藥理上可容許的鹽可藉由例如下述之方法來製造。
Figure 02_image101
[式中，L1 ’為L1 之末端變換為順丁烯二醯亞胺基的結構，P1 、P2 及P3 表示保護基。]
藉由將羧酸(5)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與NH2 -DX[表示依喜替康；化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮](4)或其藥理上可容許的鹽反應，可製造化合物(6)。 此反應只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可。活性酯係有各種者，但例如，將p-硝基酚等之酚類、N-羥基苯并三唑或N-羥基琥珀醯亞胺等與羧酸(5)，使用N,N’-二環己基碳二亞胺(dicyclohexyl carbodiimide)或1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺・鹽酸鹽等之縮合劑而使其反應即可製造。又，活性酯亦可藉由下列反應製造：羧酸(5)與五氟苯基三氟乙酸酯等之反應；羧酸(5)與1-苯并三唑基氧基三吡咯啶鏻六氟亞磷酸酯(1-benzotriazolyloxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphite)之反應；羧酸(5)與氰基膦酸二乙酯之反應(鹽溶法)；羧酸(5)與三苯基膦及2,2'-二吡啶基二硫醚之反應(向山法(Mukaiyama's method))；羧酸(5)與氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 109127496-A0304-12-0000-4
-2-基)-4-甲基
Figure 109127496-A0304-12-0020-6
啉鎓(DMTMM)等之三
Figure 109127496-A0304-12-0000-4
衍生物之反應等。又，亦可利用藉由將羧酸(5)於鹼存在下，以亞硫醯氯、草醯氯等之酸鹵化物處理而製造之酸鹵化物法等來進行反應。 藉由將如上述獲得的羧酸(5)之活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物，與化合物(4)於適當鹼存在下，使其於惰性溶媒中於-78℃~150℃之反應溫度下反應，可製造化合物(6)。又，「惰性溶媒」係意指於採用該溶媒的反應中不阻礙實施目的之反應的溶媒。
上述之各步驟所使用的具體的鹼而言，例如，可列舉碳酸鈉、碳酸鉀、乙醇鈉、丁醇鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫化鈉、氫化鉀等之鹼金屬或鹼土類金屬之碳酸鹽、烷氧化物、氫氧化物或氫化物；n-丁基鋰等之烷基鋰、二異丙基醯胺鋰(lithium diisopropylamide)等之二烷基胺基鋰所代表的有機金屬鹼；鋰雙(三甲基矽烷基)醯胺等之雙矽烷基胺之有機金屬鹼；或吡啶、2,6-二甲基吡啶、柯林鹼(collidine)、4-二甲基胺基吡啶、三乙基胺、N-甲基
Figure 109127496-A0304-12-0020-6
啉、二異丙基乙基胺、二吖雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)等之有機鹼等。
就本反應所使用的惰性溶媒而言，可列舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等之鹵化烴系溶媒；四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二
Figure 109127496-A0304-12-0059-1
烷等之醚系溶媒；苯、甲苯等之芳香族烴系溶媒；N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶-2-酮等之醯胺系溶媒；除了此等之外，依情形亦可使用二甲基亞碸、環丁碸等之亞碸系溶媒；丙酮、甲基乙基酮等之酮系溶媒；甲醇、乙醇等之醇系之溶媒等。再者，亦可將此等混合而使用。
就化合物(6)之末端胺基之保護基P1 而言，可使用三級丁氧基羰基或9-茀基甲氧基羰基、苯甲氧基羰基等之胜肽合成通常使用的胺基之保護基。就其他之胺基之保護基而言，可列舉乙醯基等之烷醯基；甲氧基羰基、乙氧基羰基等之烷氧基羰基；對甲氧基苯甲氧基羰基、對(或鄰)硝基苯甲氧基羰基等之芳基甲氧基羰基；苯甲基、三苯基甲基等之芳基甲基；苯甲醯基等之芳醯基；2,4-二硝基苯磺醯基、鄰硝基苯磺醯基等之芳基磺醯基。保護基P1 只要因應保護胺基的化合物之性質等來選擇即可。 可藉由使獲得的化合物(6)之末端胺基之保護基P1 脫保護，而製造化合物(7)。此脫保護係只要選擇因應保護基的試藥或條件即可。 藉由將N末端以P2 保護的胜肽羧酸(8)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與獲得的化合物(7)反應，可製造化合物(9)。形成胜肽羧酸(8)與化合物(7)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼、及惰性溶媒，只要由化合物(6)之合成所述者加以適宜選擇來使用即可。保護基P2 係只要由化合物(6)之保護基所述者加以適宜選擇來使用即可，只要因應保護胺基的化合物之性質等來選擇即可。又，如胜肽合成通常使用的方式，重複將構成胜肽羧酸(8)的胺基酸或胜肽依序反應並脫保護，而使其伸長，亦可製造化合物(9)。 可藉由使獲得的化合物(9)之胺基之保護基P2 脫保護而製造化合物(10)。此保護基係選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 藉由將羧酸(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，使其與獲得的化合物(10)反應，可製造化合物(2)。形成羧酸(11)與化合物(10)之胜肽鍵的反應條件或試藥、及鹼、惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
化合物(9)亦可例如以下述之方法製造。 可藉由將N末端以P2 保護的胜肽羧酸(8)誘導為活性酯、混合酸酐等，於鹼存在下，使其與羧基經P3 保護的胺化合物(12)反應而製造化合物(13)。形成胜肽羧酸(8)與化合物(12)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼、及惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 就化合物(13)之胺基之保護基P2 而言，係只要為通常使用的保護基則未特別限制。具體而言，就羥基之保護基而言，可列舉甲氧基甲基等之烷氧基甲基；苯甲基、4-甲氧基苯甲基、三苯基甲基等之芳基甲基；乙醯基等之烷醯基；苯甲醯基等之芳醯基；三級丁基二苯基矽烷基等之矽烷基等。羧基可作成與甲基、乙基、三級丁基等之烷基、烯丙基、或苯甲基等之芳基甲基之酯等而加以保護。胺基可列舉三級丁氧基羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基等之烷氧基羰基；烯丙氧基羰基、或9-茀基甲氧基羰基、苯甲氧基羰基、對甲氧基苯甲氧基羰基、對(或鄰)硝基苯甲氧基羰基等之芳基甲氧基羰基；此外，乙醯基等之烷醯基；苯甲基、三苯基甲基等之芳基甲基；苯甲醯基等之芳醯基；或2,4-二硝基苯磺醯基、鄰硝基苯磺醯基等之芳基磺醯基等。 就羧基之保護基P3 而言，只要使用有機合成化學中於胜肽合成通常使用作為羧基之保護基的保護基即可，具體而言為甲基、乙基、三級丁基等之烷酯、烯丙酯、苯甲酯等，只要由上述之保護基加以適宜選擇來使用即可。 於此情形，胺基之保護基與羧基之保護基可以相異方法或條件除去者為較佳。例如可列舉P2 為三級丁氧基羰基，P3 為苯甲基的組合等作為代表性者。彼等之保護基係因應保護胺基與羧基的化合物之性質等而由上述選擇即可，彼等之保護基之切斷之際亦選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由使獲得的化合物(13)之羧基之保護基P3 脫保護而製造化合物(14)。此脫保護只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將獲得的化合物(14)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(4)反應而製造化合物(9)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
化合物(2)亦可例如以下述之方法製造。 可藉由使化合物(13)之胺基之保護基P2 脫保護而製造化合物(15)。此脫保護只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與獲得的化合物(15)反應，而製造化合物(16)。形成胜肽羧酸(11)與化合物(15)之醯胺鍵的反應條件或試藥、鹼、及惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(16)之羧基之保護基脫保護而製造化合物(17)。此脫保護可與化合物(14)之製造中的羧基之脫保護同樣地進行。 可藉由將化合物(17)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(4)反應而製造化合物(2)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼、及惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 3.製造方法3
中間體之式(2)所示的化合物亦可藉由下述之方法來製造。
Figure 02_image103
[式中，L1 ’為L1 之末端變換為順丁烯二醯亞胺基的結構，P4 表示保護基]。
藉由將化合物(11)誘導為活性酯、混合酸酐等，於鹼存在下，使其與C末端以P4 保護的胜肽羧酸(18)反應，可製造化合物(19)。形成胜肽羧酸(18)與化合物(11)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼、及惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。化合物(18)之羧基之保護基P4 只要由先前所述保護基適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(19)之羧基之保護基脫保護來製造化合物(20)。此脫保護係可與化合物(14)之製造中的羧基之脫保護同樣地進行。 藉由將獲得的化合物(20)誘導為活性酯、或混合酸酐等，使其與化合物(7)反應，可製造化合物(2)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼、及惰性溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 4.製造方法4
以下，詳述製造方法2記載之製造中間體(10)中，成為n1 =1、La =O的化合物(10b)之製造方法。式(10b)所示的化合物、其鹽或彼等之溶媒合物可例如以下述之方法製造。
Figure 02_image105
[式中，LP 表示與前述相同者，L表示醯基、乙醯基等之烷醯基或苯甲醯基等之芳醯基、或氫原子等，X及Y表示由1至3個之胺基酸所構成的寡肽，P5 及P7 表示胺基之保護基，P6 表示羧基之保護基]。
式(21)所示的化合物可藉由日本特開2002-60351號公報記載的手法或文獻(J. Org. Chem., 51卷，3196頁，1986年)記載之方法、或應用其方法而因應必要進行保護基之去除或官能基變換而加以製造。此外，藉由將末端胺基經保護的胺基酸或胺基經保護的寡肽之酸醯胺與醛或酮進行處理，可加以獲得。 藉由使化合物(21)，於惰性溶媒中、酸或鹼存在下，於冷卻下至室溫之溫度條件，與具有羥基的化合物(22)反應，可製造化合物(23)。 其中就可使用的酸而言，例如，可列舉氫氟酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸等之無機酸；乙酸、檸檬酸、對甲苯磺酸、甲烷磺酸等之有機酸；四氟硼酸鹽、氯化鋅、氯化錫、氯化鋁、氯化鐵等之路易士酸等。此等中以磺酸類為較佳，特佳為對甲苯磺酸。再者，就使用的鹼而言，只要自已述之鹼之中適宜選擇來使用即可，尤其較佳為三級丁醇鉀等之鹼金屬烷氧化物；氫氧化鈉、氫氧化鉀等之鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物；氫化鈉、氫化鉀等之鹼金屬氫化物；二異丙基醯胺鋰(lithium diisopropylamide)等之二烷基胺基鋰所代表的有機金屬鹼；雙(三甲基矽烷基)醯胺鋰等之雙矽烷基胺之有機金屬鹼等。 就反應所使用的溶媒而言，可使用四氫呋喃、1,4-二
Figure 109127496-A0304-12-0059-1
烷等之醚系溶媒；苯、甲苯等之芳香族烴系溶媒等。上述之溶媒可為與水之混合物。 又，就P5 所例示的胺基之保護基而言，通常，只要為用於胺基之保護的基即可，並未特別限制，作為代表性者，可列舉製造方法2所記載的胺基之保護基，但於本反應中，作為P5 所例示的胺基之保護基有被切斷的情形。於此情形，因應必要只要與適當的胺基之保護試藥反應而再度導入保護基即可。 化合物(24)可藉由去除化合物(23)之保護基P6 而製造。其中，就P6 所示的羧基之保護基而言，製造方法2已記載了代表性者，可自此適宜選擇。於化合物(23)，冀望胺基之保護基P5 與羧基之保護基P6 為可以相異方法或條件去除的保護基。例如，可列舉P5 為9-茀基甲氧基羰基，P6 為苯甲基的組合等作為代表性者。彼等之保護基係只要因應保護胺基及羧基的化合物之性質等來選擇即可，彼等之保護基之去除之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 藉由將羧酸(24)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(4)或其藥理上可容許的鹽反應而製造化合物(25)，可藉由去除獲得的化合物(25)之保護基P5 而製造化合物(26)。化合物(4)與羧酸(24)之反應及去除保護基P6 的反應係只要使用與製造方法2所述試藥或反應條件相同者即可。 藉由使化合物(26)與末端胺基被保護的胺基酸或胺基被保護的寡肽(27)反應而製造化合物(9b)，去除獲得的化合物(9b)之保護基P7 ，藉此可製造化合物(10b)。就P7 所示的胺基之保護基而言，通常，只要為用於胺基之保護的基即可並未特別限制，作為代表性者可列舉製造方法2記載的胺基之保護基，其去除之際亦只要選擇因應保護基的試藥或條件即可。化合物(26)與化合物(27)之反應，只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可。以上述方法所製造的化合物(10b)係可依據上述之製造方法而導向本發明化合物(1)。 5.製造方法5
中間體之式所示的化合物(2)亦可藉由下述之方法來製造。
Figure 02_image107
[式中，L1 ’為L1 之末端變換為順丁烯二醯亞胺基的結構，LP 表示包含-Lp1 -Lp2 -的結構，P3 、P8 、P9 、P10 、P11 、及P12 表示保護基。]
LP 因係使Lp1 及Lp2 結合而形成，由於LP 之N末端之親水性胺基酸係來自Lp1 ，Lp1 只要採用N末端為親水性胺基酸者即可。又，親水性胺基酸可為複數個。又，若於Lp2 採用有親水性胺基酸者，因應其位置，可製造於LP 之N末端或N末端與其以外之位置含有複數個之親水性胺基酸的LP 。
藉由將N末端為經P2 保護的胜肽或胺基酸(28)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與獲得的化合物(7)反應，可製造化合物(29)。形成胜肽或胺基酸(28)與化合物(7)之醯胺鍵的反應條件或試藥、鹼、及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。胺基之保護基P8 係由化合物(6)之保護基所述者適宜選擇而使用即可，因應其化合物之性質等而選擇即可。又，如胜肽合成通常使用的方式，重複將構成胜肽或胺基酸(28)的胺基酸或胜肽依序反應並脫保護，使其伸長，亦可製造化合物(29)。 可藉由使獲得的化合物(29)之胺基之保護基P8 脫保護而製造化合物(23)。脫保護只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 藉由使N末端經P8 保護、側鏈之羧基羥基或胺基經P9 保護的胺基酸或胜肽(31)誘導為活性酯、混合酸酐等，與獲得的化合物(30)反應，可製造化合物(32)。形成胺基酸或胜肽(31)與化合物(30)的胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。就保護基P8 及P9 而言，只要由化合物(6)之胺基、羧基或羥基之保護基所述者適宜選擇來使用即可。惟，於此情形，胺基之保護基P9 與側鏈之官能基之保護基P10 可以相異方法或條件去除係有必要的。例如可列舉下述之組合等作為代表性者：P9 為9-茀基甲氧基羰基；P10 若為羧基之保護基則為三級丁基等、若為羥基之保護基則為甲氧基甲基等、若為胺基之保護基則為三級丁氧基羰基等。側鏈之官能基之保護基P10 係藉由付加酸性條件而可脫保護的保護基為較佳，但並未限定於此，只要因應保護的化合物之胺基、羧基或羥基之性質等自上述者選擇即可。又，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。又，如胜肽合成通常使用的方式，化合物(32)亦可重複將構成的胺基酸或胜肽依序反應、脫保護，使其伸長而製造。 可藉由使獲得的化合物(32)之末端胺基之保護基P9 脫保護而製造化合物(33)。此脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，使其與獲得的化合物(33)反應，可製造化合物(34)。其中羧酸衍生物(11)係L1 ’之連接物末端具有順丁烯二醯亞胺基的結構之化合物。 形成羧酸衍生物(11)與化合物(33)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(34)之胜肽部分之胺基酸側鏈的羧基或羥基、胺基之保護基P10 脫保護而製造化合物(2)。只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。
化合物(29)例如亦可以下述方法製造。 藉由使N末端經P8 保護的胜肽或胺基酸(28)誘導為活性酯、混合酸酐等，於鹼存在下，與末端之羧基經P3 保護的胺化合物(12)反應，可製造化合物(35)。形成胜肽或胺基酸(28)與化合物(12)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼、及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。化合物(35)之胺基之保護基P8 係由化合物(6)之保護基所述者適宜選擇來使用即可。就羧基之保護基P3 而言，只要使用有機合成化學中於胜肽合成作為羧基之保護基所通常使用的保護基即可，具體而言只要自甲基、乙基、三級丁基等之烷酯、烯丙酯、苯甲酯等、化合物(6)之保護基所述者適宜選擇而使用即可。於此情形，胺基之保護基P8 與羧基之保護基P3 可以相異方法或條件除去係有必要的。例如可列舉P8 為三級丁氧基羰基，P3 為苯甲基的組合等作為代表性者。彼等之保護基只要因應保護胺基與羧基的化合物之性質等自上述者選擇即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由使獲得的化合物(35)之羧基之保護基P3 脫保護而製造化合物(36)。脫保護只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 藉由將獲得的化合物(36)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(4)反應，可製造化合物(29)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
化合物(32)例如亦可以下述方法製造。 可藉由使化合物(35)之胺基之保護基P8 脫保護而製造化合物(37)。脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將胺基酸或胜肽(31)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與獲得的化合物(37)反應而製造化合物(38)。形成胺基酸或胜肽(31)與化合物(37)之醯胺鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。其中，胺基酸或胜肽(31)之保護基P9 、P10 與化合物(37)之保護基P3 可各自以相異方法或條件去除係有必要的。例如可列舉P9 為9-茀基甲氧基羰基，P10 為三級丁氧基羰基、三級丁基、或甲氧基甲基，P3 為苯甲基等的組合等作為代表性者。又，如上述，側鏈之官能基之保護基P10 為藉由付加酸性條件而可脫保護的保護基為較佳，但並未限定於此，因應保護的化合物之胺基、羧基或羥基之性質等自上述者選擇即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由使獲得的化合物(38)之羧基之保護基P3 脫保護而製造化合物(39)。脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 藉由將化合物(39)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(4)反應，可製造化合物(32)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
化合物(34)例如亦可以下述方法製造。 可藉由使化合物(38)之胺基之保護基P9 脫保護而製造化合物(40)。脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與獲得的化合物(40)反應而製造化合物(41)。形成羧酸衍生物(11)與化合物(40)之醯胺鍵的反應條件或試藥、及鹼、溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(41)之羧基之保護基P3 脫保護而製造化合物(42)。脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將化合物(42)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(4)反應而製造化合物(34)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
化合物(34)例如亦可以下述方法製造。 可藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與羧基經P11 保護、側鏈之羧基、羥基或胺基經P10 保護的胺基酸或胜肽(43)反應而製造化合物(44)。形成羧酸衍生物(11)與化合物(43)之醯胺鍵的反應條件或試藥、及鹼、溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。其中就化合物(44)之保護基P10 及P11 而言，只要自化合物(6)之羧基、羥基、或胺基之保護基所述者適宜選擇而使用即可。惟，於此情形，羧基之保護基P11 與側鏈之官能基之保護基P10 可以相異方法或條件去除係有必要的。例如可列舉下述之組合等作為代表性者：P11 為苯甲基；P10 若為羧基之保護基則為三級丁基等、若為羥基之保護基則為甲氧基甲基等、若為胺基之保護基則為三級丁氧基羰基等。側鏈之官能基之保護基P10 係藉由付加酸性條件而可脫保護的保護基為較佳，但並未限定於此，因應保護的化合物之胺基、羧基或羥基之性質等自上述者選擇即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由使獲得的化合物(44)之羧基之保護基P11 脫保護而製造化合物(45)。此脫保護只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將化合物(45)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(30)反應而製造化合物(34)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 又，可藉由將化合物(45)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與羧基經P12 保護的胺基酸或胜肽(46)反應而製造化合物(47)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。其中就化合物(47)之保護基P10 及P12 而言，自化合物(6)之羧基、羥基或胺基之保護基所述者適宜選擇來使用即可。惟，於此情形，羧基之保護基P12 與側鏈之官能基之保護基P10 可以相異方法或條件去除係有必要的。例如可列舉下述之組合等作為代表性者：P12 為苯甲基；P10 若為羧基之保護基則為三級丁基等、若為羥基之保護基則為甲氧基甲基等、若為胺基之保護基則為三級丁氧基羰基等。側鏈之官能基之保護基P10 係藉由付加酸性條件而可脫保護的保護基為較佳，但並未限定於此，因應保護的化合物之胺基、羧基或羥基之性質等自上述者選擇即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。又，化合物(47)亦可重複將構成的胺基酸或胜肽依序反應、脫保護，使其伸長而製造。 可藉由使獲得的化合物(47)之羧基之保護基P12 脫保護而製造化合物(48)。只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將化合物(48)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與化合物(7)反應而製造化合物(34)。此反應係只要適用胜肽合成通常使用的反應試藥或條件即可，反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 化合物(47)例如亦可以下述方法製造。 可藉由將胺基酸或胜肽(46)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與N末端經P9 保護、側鏈之羧基、羥基或胺基經P10 保護的胺基酸或胜肽(31)反應而製造胜肽(49)。形成胺基酸或胜肽(46)與胺基酸或胜肽(31)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。其中就胺基酸或胜肽(46)之羧基之保護基P12 、及胺基酸或胜肽(31)之保護基P9 及P10 而言，如上述，但可彼此以相異的方法或條件去除係有必要的。例如可列舉下述的組合等作為代表性者：P9 為9-茀基甲氧基羰基；P10 若為羧基之保護基則為三級丁基等、若為羥基之保護基則為甲氧基甲基等、若為胺基之保護基則為三級丁氧基羰基等；P12 為苯甲基。側鏈之官能基之保護基P10 係藉由付加酸性條件而可脫保護的保護基為較佳，但並未限定於此，因應保護的化合物之胺基、羧基或羥基之性質等自上述者選擇即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由使獲得的胜肽(49)之N末端之保護基P9 脫保護而製造胜肽(50)。只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與獲得的胜肽(50)反應而製造化合物(47)。形成羧酸衍生物(11)與胜肽(50)之醯胺鍵的反應條件或試藥、及鹼、溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 6.製造方法6
製造中間體(2)之中，連接物為-L1 -L2 -LP -所示的結構，該LP 為其N末端為親水性胺基酸的胜肽殘基，存在於該N末端的親水性胺基酸為甘胺酸以外之親水性胺基酸的胜肽殘基者亦可藉由下述之方法製造。
Figure 02_image109
[式中，L1 ’係L1 之末端變換為順丁烯二醯亞胺基的結構，LP 表示包含-Lp1 -Lp2 -的結構，P8 、P9 、P10 、及P12 表示保護基。]
LP 因係使Lp1 及Lp2 結合而形成，由於LP 之N末端之親水性胺基酸來自Lp1 的緣故，Lp1 只要採用N末端為親水性胺基酸者即可。又，親水性胺基酸可為複數個。又，若於Lp2 採用有親水性胺基酸者，則因應其位置，可製造於LP 之N末端或N末端與其以外之位置含有複數個親水性胺基酸的LP 。 可藉由將製造方法5記載之N末端經P8 保護的胜肽或胺基酸(28)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與化合物(4)及其鹽反應，而製造化合物(51)。形成胜肽或胺基酸(28)與化合物(4)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。保護基P8 係由化合物(6)之保護基所述者適宜選擇而使用即可，只要因應保護胺基的化合物之性質等來選擇即可。又，如胜肽合成通常使用的方式，重複將構成胜肽或胺基酸(28)的胺基酸或胜肽依序反應及脫保護，而使其伸長，亦可製造化合物(51)。 可藉由使獲得的化合物(51)之胺基之保護基P8 脫保護而製造化合物(52)。此脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將製造方法4記載之N末端經P9 保護、側鏈之羧基、羥基、或胺基經P10 保護的胺基酸或胜肽(31)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與獲得的化合物(52)反應，而製造化合物(53)。形成胺基酸或胜肽(31)與化合物(52)之胜肽鍵的反應條件或試藥、及鹼、溶媒，係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。就保護基P9 及P10 而言，係如製造方法5記載。又，如胜肽合成通常使用的方式，化合物(53)亦可重複將構成的胺基酸或胜肽依序反應、脫保護，使其伸長而製造。 可藉由使獲得的化合物(53)之胺基之保護基P9 脫保護而製造化合物(54)。此脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，使其與獲得的化合物(54)反應而製造化合物(55)。形成羧酸衍生物(11)與化合物(54)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒，係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(55)之羧基或羥基、胺基之保護基P10 脫保護而製造化合物(2)。此脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。
化合物(53)例如亦可以下述方法製造。 可藉由使製造方法5記載之胜肽(49)之羧基之保護基P12 脫保護而製造胜肽(56)。此脫保護係只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將獲得的胜肽(56)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，使其與化合物(4)或其鹽反應而製造化合物(53)。形成化合物(56)與化合物(4)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
化合物(55)例如亦可以下述方法製造。 藉由將製造方法5記載之化合物(48)誘導為活性酯、混合酸酐等，於鹼存在下，使其與化合物(4)反應，或藉由將製造方法5記載之胺基酸或胜肽(45)誘導為活性酯、混合酸酐等，於鹼存在下，使其與上述之化合物(52)反應，可製造化合物(55)。形成各自胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒，係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 7.製造方法7
式(2)所示的製造中間體中，連接物為-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所示的結構，該LP 為其N末端為親水性胺基酸的胜肽殘基，存在於N末端的該親水性胺基酸為甘胺酸以外之親水性胺基酸的情形，例如亦可藉由下述之方法製造。
Figure 02_image111
[式中，L1 ’為L1 之末端變換為順丁烯二醯亞胺基的結構，LP 表示包含-Lp1 -Lp2 -的結構，P9 、P13 表示保護基。]
於式(2)所示的製造中間體，連接物有-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所示的結構、及-L1 -L2 -LP -所示的結構之二個態樣。 連接物為-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所示的結構之化合物(2)可如以下方式製造。 化合物(57)可與製造方法5記載之化合物(32)同樣地合成，但與化合物(32)不同，其胺基之保護基P9 與側鏈之官能基之保護基P13 可以相異方法或條件去除並非必要。側鏈之官能基為羧基或羥基，亦可使其胺基之保護基P9 與側鏈之羧基或羥基之保護基P13 同時脫保護。例如可列舉P9 為三級丁氧基羰基，P13 為三級丁基或三苯甲基、或者P3 為苯甲氧基羰基、P13 為苯甲基等之組合等作為代表性者。彼等之保護基係因應保護的化合物之胺基、羧基、或羥基之性質等而由化合物(6)之保護基所述者適宜選擇而使用即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。化合物(57)係只要使用滿足上述性質的經保護的胺基酸或胜肽，則可與製造方法5同樣地合成。 可藉由使化合物(57)之保護基P9 、P13 依序或同時脫保護而製造化合物(51)。只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 化合物(58)係LP 之親水性側鏈之官能基並未被特別保護，但於鹼存在下，藉由使其與誘導為活性酯、混合酸酐等的化合物(11)反應，可製造化合物(2)。形成各自之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 連接物為-L1 -L2 -LP -所示的結構之化合物(2)係可如以下方式製造。 化合物(59)亦可與製造方法6記載之化合物(53)同樣地合成，但與化合物(53)相異，其胺基之保護基P3 與側鏈之官能基之保護基P8 可以相異方法或條件去除並非必要。側鏈之官能基為羧基或羥基，亦可使其胺基之保護基P9 與側鏈之羧基或羥基之保護基P13 同時脫保護。例如可列舉P9 為三級丁氧基羰基，P13 為三級丁基或三苯甲基、或者P3 為苯甲氧基羰基、P13 為苯甲基等之組合等作為代表性者。彼等之保護基係因應保護的化合物之胺基、羧基、或羥基之性質等而由化合物(6)之保護基所述者適宜選擇而使用即可，彼等之保護基之切斷之際亦只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。化合物(59)係只要使用滿足上述性質的經保護的胺基酸或胜肽，可與製造方法6同樣地合成。 可藉由使化合物(59)之保護基P9 、P13 依序或同時脫保護而製造化合物(53)。只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 化合物(60)係LP 之親水性側鏈之官能基並未特別被保護，但於鹼存在下，藉由使其與誘導為活性酯、混合酸酐等的化合物(11)反應，可製造化合物(2)。形成各自之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 8.製造方法8
製造方法5所示的化合物(43)之中，連接物-LP -為具有包含-Lp1 -Gly-Gly-Phe-Gly-的結構的情形亦可藉由下述之方法製造。
Figure 02_image113
[式中，P9 、P10 表示保護基。]
可藉由將製造方法5記載之胺基酸或胜肽(31)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，於鹼存在下，使其與甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]甘胺醯胺(國際公開第1997/46260號記載的醫藥化合物之游離體)(61)或其鹽反應而製造化合物(62)。形成胺基酸或胜肽(31)與化合物(61)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。就N末端之保護基P3 、側鏈之官能基之保護基P10 而言，如於上述製造方法5。又，亦可無側鏈之官能基之保護基P10 ，使用僅保護N末端的胺基酸或胜肽(31)進行反應，可獲得化合物(62)。 9.製造方法9
式(2)所示的化合物中，連接物係-L1 -L2 -LP -所示的結構，該LP 係其C末端為包含2或3個以上之甘胺酸的寡肽且與藥物結合，且該胜肽殘基之N末端為親水性胺基酸的情形、為甘胺酸的胜肽殘基的情形，例如亦可以下述之方法製造。
Figure 02_image115
[式中，L1 ’為L1 之末端變換為順丁烯二醯亞胺基的結構，LP 表示包含Lp1 -Lp2 的結構，P12 及P14 表示保護基。]
LP 因係使Lp1 及Lp2 結合而形成，用以構成此等所含的LP 之C末端的甘胺酸之數目係只要考慮LP 具有的C末端之甘胺酸之數目、進一步考慮於反應時使用此等的反復次數來設計即可。 胜肽(63)，其C末端為包含2或3個以上之甘胺酸的寡肽，且該胜肽殘基之N末端成為親水性胺基酸的情形係為甘胺酸的胜肽殘基，該N末端係經P14 保護。胜肽(63)係如胜肽合成通常使用的方式，可重複將其構成的胺基酸或胜肽依序縮合反應及脫保護而合成。 藉由將胜肽(63)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與化合物(4)或其鹽反應，可製造化合物(64)。形成胜肽(63)與化合物(4)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。保護基P14 係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 又，化合物(64)亦可藉由將N末端以P14 保護的胺基酸或胜肽(65)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與製造方法6記載之化合物(52)反應而製造。形成胺基酸或胜肽(65)與化合物(52)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。保護基P14 係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(64)之胺基之保護基P14 脫保護而製造化合物(66)。只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由使羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，與獲得的化合物(66)反應，而製造化合物(2)。形成羧酸衍生物(11)與化合物(66)之醯胺鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 化合物(2)亦可以下述之方法製造。 化合物(67)係Lp1 之N末端之甘胺酸與L2 結合，可與製造方法5記載之化合物(45)同樣地合成。可藉由將製造方法5記載的胺基酸或胜肽(46)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，使其與化合物(67)反應，而製造化合物(68)。其中，胺基酸或胜肽(46)為甘胺酸或其C末端包含2或3個以上之甘胺酸的寡肽，其C末端經P12 保護。形成胺基酸或胜肽(46)與化合物(67)之醯胺鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 化合物(68)亦可藉由使化合物(11)誘導為活性酯、混合酸酐等，與C末端經P12 保護的胜肽(69)反應而製造。其中，胜肽(69)係其C末端包含2或3個以上之甘胺酸的寡肽，且於N末端成為親水性胺基酸的場合係成為甘胺酸的胜肽殘基。胜肽(69)係如胜肽合成通常使用的方式，可重複將其構成的胺基酸或胜肽依序縮合反應與重複脫保護而合成。形成胜肽(69)與化合物(11)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。保護基P12 係於酸條件可脫保護的保護基為較佳，但並未限定於此，只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 可藉由使獲得的化合物(68)之羧基之保護基P12 脫保護而製造化合物(70)。此脫保護只要選擇因應其保護基的試藥或條件即可。 可藉由將化合物(70)誘導為活性酯、混合酸酐等，使其與化合物(4)或其鹽反應，而製造化合物(2)。形成化合物(70)與化合物(4)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。 此外化合物(2)亦可以下述之方法製造。 可藉由將製造方法6記載之化合物(52)誘導為活性酯、混合酸酐等，於鹼存在下，使其與化合物(67)反應，而製造化合物(2)。形成化合物(67)與化合物(52)之胜肽鍵的反應條件或試藥、鹼及溶媒係只要由化合物(6)之合成所述者適宜選擇來使用即可。
又，製造方法1至製造方法9之中間體之化合物皆可成為鹽及/或水合物。
本發明之抗體-藥物結合物藉由放置於大氣中、或進行再結晶等之純化操作，而吸收水分，或有吸附水附著等而成為水合物的情形，此類含水的化合物或鹽亦包含於本發明。 又，本發明中亦包含以各種放射性或非放射性同位素標誌的化合物。構成本發明之抗體-藥物結合物的原子之1個以上可以非天然比率含有原子同位素。就原子同位素而言，例如，可列舉氘(2 H)、氚(3 H)、碘-125(125 I)或碳-14(14 C)等。又，本發明化合物係例如，可以氚(3 H)、碘-125(125 I)、碳-14(14 C)、銅-64(64 Cu)、鋯-89(89 Zr)、碘-124(124 I)、氟-18(18 F)、銦-111(111 I)、碳-11(11 C)或碘-131(131 I)之類的放射性同位素作放射性標識。經放射性標識的化合物係有用於作為治療或預防劑、研究試藥，例如，檢驗試藥、及診斷劑，例如，活體影像診斷劑。本發明之抗體-藥物結合物之全部之同位素變異種不論是否有放射性，皆包含於本發明之範圍。 [醫藥]
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物因對癌細胞顯示細胞毒殺活性，故可作為醫藥使用，尤其可作為抗癌的治療劑及/或預防劑使用。 即，本發明之抗HER3抗體-藥物結合物係可選擇作為癌治療之主要治療法的化學療法用之藥劑而使用，就其結果而言，可使癌細胞之成長遲緩、抑制增殖、進而破壞癌細胞。藉由此等，於癌患者，可達成由癌所致的症狀的解放、生活品質(QOL)之改善，保持癌患者之生命而達成治療效果。即使為未達到癌細胞之破壞的情形，可藉由癌細胞之增殖之抑制或控制，而於癌患者達成高QOL的同時，亦達成更長期之生存。 除了於此類藥物療法中的藥物單獨使用之外，亦可於輔助療法中作為與其他療法組合的藥劑來使用，可與外科手術、或放射線療法、荷爾蒙療法等組合。再者，亦可作為新輔助療法(neoadjuvant therapy)中的藥物療法之藥劑使用。 如以上的治療用途之外，亦可期待抑制微細轉移癌細胞之增殖，進而破壞的效果。尤其於原發性之癌細胞中HER3的表現被確認時，藉由投予本發明之抗HER3抗體-藥物結合物，可期待癌轉移之抑制或預防效果。例如，可期待抑制、破壞在轉移過程位於體液中的癌細胞的效果、或對於剛在任一組織著床的微細癌細胞的抑制、破壞等之效果。據此，尤其可期待於外科的癌去除後之癌轉移的抑制、預防效果。 本發明之抗HER3抗體-藥物結合物，對患者除了作為全身療法而投予之外，於癌組織局部投予亦可期待治療效果。 抗體-藥物結合物(1)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(2)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用及抗黑色素瘤作用，於於活體內顯示較U1-59更強的抗乳癌作用及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(3)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗卵巢癌、抗大腸癌作用及抗黑色素瘤作用，於活體內顯示較U1-59更強的抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用、抗胃癌作用、及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(4)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用。 抗體-藥物結合物(5)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(6)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗黑色素瘤作用，於活體內顯示較U1-59更強的抗乳癌作用。 抗體-藥物結合物(7)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(8)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗黑色素瘤作用，於活體內顯示較U1-59更強的抗乳癌作用。 抗體-藥物結合物(9)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗卵巢癌、抗大腸癌作用及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(10)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用及抗黑色素瘤作用，於活體內顯示較U1-59更強的抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用、抗胃癌作用、及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(11)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用。 抗體-藥物結合物(12)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗卵巢癌、抗大腸癌作用及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(13)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用及抗黑色素瘤作用，於活體內顯示較U1-59更強的抗乳癌(包含三陰性乳癌)作用、抗肺癌作用、抗大腸癌作用、抗胃癌作用、抗胰臓癌作用、及抗黑色素瘤作用。 抗體-藥物結合物(14)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於活體外顯示抗乳癌作用。 抗體-藥物結合物(16a)具有優異的抗腫瘤活性、安全性及物性，於單獨或與曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉非替尼(gefitinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)或帕妥珠單抗(pertuzumab)併用下，於活體內顯示抗乳癌(包含管腔(luminal)乳癌及三陰性乳癌)作用、抗黑色素瘤作用、抗卵巢癌作用、抗膀胱癌作用、抗肺癌作用、抗頭頸部癌作用及抗胃癌作用。
就本發明之抗HER3抗體-藥物結合物所應用的癌之種類而言，例如，可列舉肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、轉移性乳癌、管狀乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃腸基質腫瘤、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、鱗狀上皮癌、腹膜癌、多形性神經膠質胚細胞瘤、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌腫瘤、肛門癌腫瘤、或陰莖癌等。尤其乳癌中之三陰性乳癌(不表現HER2、雌激素受體、助孕酮受體)於現行治療僅有化學療法，可謂預後不良。於三陰性乳癌關於HER3表現係幾乎未被報告，然而，HER3表現若於三陰性乳癌患者中被觀察到，則本發明之抗HER3抗體-藥物結合物可使用作為治療劑及/或予防劑。惟，於成為治療對象的癌細胞，只要為表現抗體-藥物結合物中之抗體可辨識的蛋白質的癌細胞即可，並未限定於此等。 本發明之抗HER3抗體-藥物結合物係於成為治療對象的癌細胞，以表現抗體-藥物結合物中之抗體可辨識的HER3蛋白的癌細胞成為治療對象。於本說明書，「表現HER3蛋白的癌」係包含於其細胞表面具有HER3蛋白的細胞的癌、或將HER3蛋白分泌於血液中的癌。HER3蛋白係於各式各樣的人類腫瘤中過度表現，可使用評價腫瘤(原發、轉移)檢體中的HER3蛋白之過度表現的免疫組織化學染色法(IHC)、或評價HER3基因增幅的螢光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization) (FISH)、或評價血液檢體中的HER3蛋白之過度表現的酵素結合免疫吸附法(ELISA)等之本領域通常實施的方法而加以評價。 又，本發明之抗HER3抗體-藥物結合物並未因藉由其抗HER3抗體辨識於癌細胞表面表現的HER3蛋白，進一步內在化而表現抗腫瘤效果，而限定本發明之抗HER3抗體-藥物結合物之治療對象於「表現HER3蛋白的癌」，例如白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤、骨髓瘤、或肉瘤亦可成為治療對象。
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物係可適合對哺乳動物投予，但更佳為人類。
就含本發明之抗HER3抗體-藥物結合物的醫藥組成物中使用的物質而言，於投予量或投予濃度，可自此領域所通常使用的其他製劑添加物加以適宜選擇而應用。
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物係可作為含有1種以上之藥學上適合性之成分的藥學組成物而投予。例如，上述藥學組成物，就代表而言，含有1種以上之藥學載劑(例如，滅菌液體)。其中，液體包含例如，水及油(石油、動物來源、植物來源、或合成來源之油)。油可為例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。於將上述藥學組成物經靜脈內投予的情形，水更為代表性的載劑。食鹽水溶液、以及右旋糖水溶液及甘油水溶液亦可作為液體載劑，尤其可用於注射用溶液。適當的藥學賦形劑可自此領域周知者適宜選擇。又上述組成物，只要需要，亦可含有微量之濕潤劑或乳化劑、或pH緩衝化劑。適當之藥學載劑之例係記載於E.W.Martin之「Remington’s Pharmaceutical Sciences」。其處方係對應投予之態樣。
各種輸送系統為周知的，可用於投予本發明之抗HER3抗體-藥物結合物。就導入方法而言，可列舉皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、及皮下之路徑，但並未限定於此等。投予可為例如經由注入或團式注射(bolus injection)者。於特定之較佳實施形態，上述配位體藥物結合體之投予係經由注入。非經口的投予係較佳投予路徑。
於代表的實施形態，上述藥學組成物係作為適合對人類靜脈內投予的藥學組成物，依據常用順序而被調配。代表性地，靜脈內投予用之組成物係滅菌之等張性之水性緩衝液中的溶液。必要的情形，上述醫藥亦可含有助溶劑及用以緩和注射部位之疼痛的局部麻醉劑(例如，利卡多因(lignocaine))。一般而言，上述成分係以下列任一者而供給，例如，作為密封於顯示活性劑的量的安瓿或小袋(sachet)等而經封口的容器中之乾燥冷凍乾燥粉末或無水之濃縮物，各別、或於單位劑型中一起混合而供給。藉由注入上述醫藥而被投予的形態的情形，其可例如以含有滅菌之製藥等級的水或食鹽水的注入瓶而投藥。上述醫藥係藉由注射而被投予的情形，注射用滅菌水或食鹽水之安瓿例如可以將上述成分於投予前混合的方式而提供。
本發明之醫藥組成物作為有效成分可僅含有本發明之抗HER3抗體-藥物結合物，亦可含有抗HER3抗體-藥物結合物及至少一個其他之藥劑(例如癌治療劑)。本發明之抗HER3抗體-藥物結合物亦可與其他癌治療劑一起投予，據此，可使抗癌效果增強。以如此之目的而使用的其他抗癌劑，例如，可於投予後投予含本發明之抗HER3抗體-藥物結合物作為有效成分的醫藥組成物、或於投予含抗HER3抗體-藥物結合物作為有效成分的醫藥組成物後投予、或與抗體-藥物結合物同時、各別(個別)、或連續被投予個體，亦可變換各自之投予間隔來投予。本發明之抗HER3抗體-藥物結合物於本發明，於將抗體-藥物結合物與其他藥劑作為單一製劑而同時投予的情形，及作為個別製劑而同時、連續、或變換投予間隔而投予的情形之任一者皆包含於「含抗體-藥物結合物及其他藥劑的醫藥組成物」之意義中。就此種癌治療劑而言，可列舉5-FU、曲妥珠單抗、曲妥珠單抗依坦辛(trastuzumab emtansine)(T-DM1)、西妥昔單抗、吉非替尼、帕尼單抗、帕妥珠單抗、Abraxane、埃羅替尼(erlotinib)、卡鉑定(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、截瘤達錠(capecitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan)(CPT-11)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、索拉非尼(sorafenib)、長春鹼(vinblastine)、溫諾平(vinorelbine)、維羅非尼(vemurafenib)或國際公開第2003/038043號小冊記載之藥劑，又可列舉LH-RH類似物(亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)等)、雌二醇氮芥磷酸酯(estramustine phosphate)、雌激素(estrogen)拮抗藥(他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香酶(aromatase)抑制劑(阿那曲唑(anastrozole)、利妥唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)等，但只要具有抗腫瘤活性的藥劑即可，並未限定。此等之癌治療劑，基於其標的，可分類為西妥昔單抗、吉非替尼、帕尼單抗等之抗FGER劑；曲妥珠單抗、T-DM1、帕妥珠單抗等之抗HER2劑；派崔單抗(patritumab)、MM-121、MM-111等之抗HER3劑；英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)等之抗VEGF劑等。再者，可分類為西妥昔單抗、帕尼單抗等之抗EGFR抗體、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等之抗HER2抗體、派崔單抗、MM-121、MM-111等之抗HER3抗體、英夫利昔單抗、阿達木單抗等之抗VEGF抗體等。本發明之抗HER3抗體-藥物結合物若為下述則產生優異效果:i)於胃癌、乳癌、三陰性乳癌等之治療，與抗HER2劑或抗HER2抗體組合而投予、或ii)於肺癌、頭頸部癌、胃癌、乳癌、三陰性乳癌等之治療，與抗EGFR劑或抗EGFR抗體組合而投予。又，其他藥劑為1或2種以上，其他藥劑可為抗癌劑，亦可為用以減輕併用劑所引起的副作用的藥劑。
於本發明，「含抗HER3抗體-藥物結合物及其他藥劑的醫藥組成物」係與「將抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑組合而被投予的醫藥組成物」同義。於本發明，抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑「組合而被投予」係指於某一定期間，使抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑被攝入被投予對象之體內。可投予使抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑含於單一製劑中的製劑，又可各自被個別製劑化而各別被投予。各別被製劑化的情形，其投予之時期並未被特別限定，可同時被投予，亦可於間隔一段時間之不同的時間、或不同日被投予。抗HER3抗體-藥物結合物與其他之藥劑於各別相異的時間或日被投予的情形，其投予之順序並未特別限定。通常，因各自之製劑係依據各自之投予方法被投予，故彼等之投予有成為相同次數的情形，亦有成為相異次數的情形。又，各自被各別製劑化的情形，各製劑之投予方法(投予路徑)可為相同，亦可以相異的投予方法(投予路徑)被投予。又，抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑並無同時存在於體內的必要，於某一定期間(例如一個月，較佳為1週，更佳為數日，又更佳為1日)之間被攝入體內即可，任一者之投予時另一種有效成分可已自體內消失。 就「將抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑組合而被投予的醫藥組成物」之投予形態而言，例如，可列舉1)含抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑的單一製劑之投予、2)將使抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑各別被製劑化而獲得的2種製劑以同一投予路徑之同時投予、3)將使抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑各別被製劑化而獲得的2種製劑以同一投予路徑之間隔時間差的投予、4)將使抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑被各別製劑化而獲得的2種製劑以相異投予路徑之同時投予、5)將使抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑各別製劑化而獲得的2種製劑以相異投予路徑之間隔時間差的投予等。「將抗HER3抗體-藥物結合物與其他藥劑組合而被投予的醫藥組成物」之投予量、投予間隔、投予形態、製劑等係依據含有本發明之抗HER3抗體-藥物結合物的醫藥組成物之彼等，但並未限定於彼等。 該醫藥組成物係將其作成2種相異製劑的情形，可為含有彼等的套組。 於本發明，抗HER3抗體-藥物結合物及其他藥劑之「組合」係意指使抗HER3抗體-藥物結合物及其他劑「組合而被投予」。
此類醫藥組成物，作為具有所選擇的組成及必要純度的製劑，只要製劑化為冷凍乾燥製劑或液狀製劑即可。製劑化為冷凍乾燥製劑之際，可為含有此領域所使用的適當製劑添加物的製劑。又於液劑亦同樣地可製劑化為含有此領域所使用的各種製劑添加物的液狀製劑。
醫藥組成物之組成及濃度亦依投予方法而變化，但本發明之醫藥組成物所含的抗HER3抗體-藥物結合物，於抗體-藥物結合物之對抗原的親和性、即對抗原的解離常數(Kd値)之點，係親和性越高(Kd値低)，越能以即使為少量之投予量來發揮藥效。據此，於抗體-藥物結合物之投予量之決定時，亦可基於抗體-藥物結合物與抗原之親和性的狀況而設定投予量。將本發明之抗體-藥物結合物對人類投予之際，例如，只要將約0.001~100mg/kg以1次或以1~180日1次之間隔作複數次投予即可。[ 實施例 ]
藉由以下所示實施例而具體說明本發明，但本發明並未限定於此等。又，此等於任何的意義皆非作限定解釋。又，於本說明書，未特別記載之試藥、溶媒及起始材料係可自市售之供給源容易地取得。參考例 1 U1-59 之製作
U1-59係基於國際公開2007/077028號記載之方法而製作。實施例 1 抗體 - 藥物結合物 (1)
Figure 02_image117
步驟1：(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)胺甲酸三級丁酯 將4-(三級丁氧基羰基胺基)丁酸(0.237g、1.13mmoL)溶解於二氯甲烷(10mL)，添加N-羥基琥珀醯亞胺(0.130g、1.13mmoL)、及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.216g、1.13mmoL)而攪拌1小時。將此反應溶液滴加於添加了依喜替康之甲磺酸鹽(0.500g、0.94mmoL)、及三乙基胺(0.157mL、1.13mmoL)的N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)中，於室溫攪拌一日。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]純化，獲得標題化合物(0.595g、定量的)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.31(9H，s)，1.58(1H，t，J＝7.2Hz)，1.66(2H，t，J＝7.2Hz)，1.89-1.82(2H，m)，2.12-2.21(3H，m)，2.39(3H，s)，2.92(2H，t，J＝6.5Hz)，3.17(2H，s)，5.16(1H，d，J＝19.2Hz)，5.24(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.59-5.55(1H，m)，6.53(1H，s)，6.78(1H，t，J＝6.3Hz)，7.30(1H，s)，7.79(1H，d，J＝11.0Hz)，8.40(1H，d，J＝8.6Hz). MS(APCI)m/z：621(M＋H)＋ .
步驟2：4-胺基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]丁醯胺三氟乙酸鹽 將上述步驟1所獲得的化合物(0.388g、0.61mmoL)溶解於二氯甲烷(9mL)。添加三氟乙酸(9mL)而攪拌4小時。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得標題化合物(0.343g、定量的)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.79-1.92(4H，m)，2.10-2.17(2H，m)，2.27(2H，t，J＝7.0Hz)，2.40(3H，s)，2.80-2.86(2H，m)，3.15-3.20(2H，m)，5.15(1H，d，J＝18.8Hz)，5.26(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.54-5.61(1H，m)，6.55(1H，s)，7.32(1H，s)，7.72(3H，brs)，7.82(1H，d，J＝11.0Hz)，8.54(1H，d，J＝8.6Hz). MS(APCI)m/z：521(M＋H)＋ .
步驟3：N-(三級丁氧基羰基)甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺醯胺 將N-(三級丁氧基羰基)甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基甘胺酸(0.081g、0.19mmoL)溶解於二氯甲烷(3mL)，添加N-羥基琥珀醯亞胺(0.021g、0.19moLL)、及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.036g、0.19mmoL)而攪拌3.5小時。將此反應溶液滴加至添加上述步驟2所獲得的化合物(0.080g、0.15mmoL)的N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.5mL)，於室溫攪拌4小時。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]純化，獲得標題化合物(0.106g、73%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.36(9H，s)，1.71(2H，m)，1.86(2H，t，J＝7.8Hz)，2.15-2.19(4H，m)，2.40(3H，s)，2.77(1H，dd，J＝12.7，8.8Hz)，3.02(1H，dd，J＝14.1，4.7Hz)，3.08-3.11(2H，m)，3.16-3.19(2H，m)，3.54(2H，d，J＝5.9Hz)，3.57-3.77(4H，m)，4.46-4.48(1H，m)，5.16(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.55-5.60(1H，m)，6.53(1H，s)，7.00(1H，t，J＝6.3Hz)，7.17-7.26(5H，m)，7.31(1H，s)，7.71(1H，t，J＝5.7Hz)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，7.92(1H，t，J＝5.7Hz)，8.15(1H，d，J＝8.2Hz)，8.27(1H，t，J＝5.5Hz)，8.46(1H，d，J＝8.2Hz). MS(APCI)m/z：939(M＋H)＋ .
步驟4：甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺醯胺三氟乙酸鹽 將上述步驟3所獲得的化合物(1.97g、2.10mmoL)溶解於二氯甲烷(7mL)。添加三氟乙酸(7mL)而攪拌1小時。減壓餾除溶媒，添加甲苯而共沸，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得標題化合物(1.97g、99%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.71-1.73(2H，m)，1.82-1.90(2H，m)，2.12-2.20(4H，m)，2.40(3H，s)，2.75(1H，dd，J＝13.7，9.4Hz)，3.03-3.09(3H，m)，3.18-3.19(2H，m)，3.58-3.60(2H，m)，3.64(1H，d，J＝5.9Hz)，3.69(1H，d，J＝5.9Hz)，3.72(1H，d，J＝5.5Hz)，3.87(1H，dd，J＝16.8，5.9Hz)，4.50-4.56(1H，m)，5.16(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.55-5.60(1H，m)，7.17-7.27(5H，m)，7.32(1H，s)，7.78-7.81(2H，m)，7.95-7.97(3H，m)，8.33-8.35(2H，m)，8.48-8.51(2H，m). MS(APCI)m/z：839(M＋H)＋ .
步驟5：N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺醯胺 於上述步驟4所獲得的化合物(337mg，0.353mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(1.2mL)溶液中，添加三乙基胺(44.3mL，0.318mmoL)、6-順丁烯二醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺基酯(119.7mg，0.388mmoL)，於室溫攪拌1小時。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝5：1(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(278.0mg，76%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.87(3H，t，J＝7.3Hz)，1.12-1.22(2H，m)，1.40-1.51(4H，m)，1.66-1.76(2H，m)，1.80-1.91(2H，m)，2.05-2.21(6H，m)，2.39(3H，s)，2.79(1H，dd，J＝14.0，9.8Hz)，2.98-3.21(5H，m)，3.55-3.77(8H，m)，4.41-4.48(1H，m)，5.15(1H，d，J＝18.9Hz)，5.24(1H，d，J＝18.9Hz)，5.40(1H，d，J＝17.1Hz)，5.44(1H，d，J＝17.1Hz)，5.54-5.60(1H，m)，6.53(1H，s)，6.99(2H，s)，7.20-7.27(5H，m)，7.30(1H，s)，7.70(1H，t，J＝5.5Hz)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，8.03(1H，t，J＝5.8Hz)，8.08(1H，t，J＝5.5Hz)，8.14(1H，d，J＝7.9Hz)，8.25(1H，t，J＝6.1Hz)，8.46(1H，d，J＝8.5Hz). MS(APCI)m/z：1032(M＋H)＋ .
步驟6：抗體-藥物結合物(1) 抗體之還原：將參考例1製作的U1-59，使用製造方法1記載的共通操作B及C，將介質取代為PBS6.0/EDTA，調製為10mg/mL之抗體濃度。將本溶液(1.00mL)置入2.0mL聚丙烯製管，於其中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.0307mL；相對於抗體一分子為4.6當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。確認本溶液之pH為7.4±0.1內後，藉由於37℃保溫1小時，使抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原。 抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於22℃水浴保溫10分鐘後，添加二甲基亞碸(Sigma-Aldrich Co.LLC；0.0586mL)與含上述步驟5所獲得的化合物10mM的二甲基亞碸溶液(0.0615mL；相對於抗體一分子為9.2當量)，並於22℃水浴保溫40分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0123mL)，再於室溫使用試管混勻器(Tube Rotator)(MTR-103，AS ONE股份有限公司)而攪拌20分鐘，而使藥物連接物之反應停止。 純化：將上述溶液，進行使用製造方法1記載的共通操作D(使用ABS作為緩衝液)的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物的溶液6mL。 特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝7280 εD ， 370 ＝23400)，獲得下述之特性値。 抗體濃度：1.29mg/mL，抗體產量：7.74mg(77%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.9。實施例 2 抗體 - 藥物結合物 (2)
Figure 02_image119
步驟1：抗體-藥物結合物(2) 使用參考例1製作的U1-59及實施例1步驟5所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：12.0mg/mL，抗體產量：226.8mg(91%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.9。實施例 3 抗體 - 藥物結合物 (3)
Figure 02_image121
步驟1：抗體-藥物結合物(3) 使用參考例1製作的U1-59及實施例1步驟5所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：16.9mg/mL，抗體產量：219.7mg(88%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.9。實施例 4 抗體 - 藥物結合物 (4)
Figure 02_image123
步驟1：抗體-藥物結合物(4) 抗體之還原：將參考例1製作的U1-59，使用製造方法1記載的共通操作B及共通操作C，將介質置換為PBS6.0/EDTA，調製為10mg/mL之抗體濃度。將本溶液(1.00mL)置入1.5mL聚丙烯製管，於其中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.0187mL；相對於抗體一分子為2.8當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0170mL)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃保溫1小時，使抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原。 抗體與藥物連接物之結合：對上述溶液，於室溫添加含上述步驟5所獲得的化合物10mM的二甲基亞碸溶液(0.0314mL；相對於抗體一分子為4.7當量)，於15℃保溫1小時，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0123mL；相對於抗體一分子為18.4當量)，再於室溫保溫20分鐘，使藥物連接物之反應停止。 純化：將上述溶液，進行使用製造方法1記載的共通操作D(使用ABS作為緩衝液)的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物的溶液6mL後，使用共通操作A而將溶液濃縮 特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5000、εD ， 370 ＝19000)，獲得下述之特性値。 抗體濃度：1.02mg/mL，抗體產量：6.1mg(61%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.9；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5000)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.2。實施例 5 抗體 - 藥物結合物 (5)
Figure 02_image125
步驟1：(5S，14S)-5-苯甲基-1-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-14-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}-1,4,7,10,13-五側氧基-3,6,9,12-四氮十六-16-酸三級丁酯 冰冷下，於甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]甘胺醯胺(國際公開第1997/46260號記載的醫藥化合物之游離體；0.250g，0.332mmoL)、N-羥基琥珀醯亞胺(57.2mg，0.497mmoL)、及N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-天冬胺酸4-三級丁酯(0.205g，0.497mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(10.0mL)溶液中，添加N,N’-二環己基碳二亞胺(0.123g，0.497mmoL)，並於室溫攪拌2日。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(0.278g，73%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.86(3H，t，J＝7.1Hz)，1.35(9H，s)，1.79-1.90(2H，m)，2.03-2.25(2H，m)，2.40(3H，s)，2.40-2.51(2H，m)，2.64-2.82(2H，m)，2.98(1H，dd，J＝13.7，4.6Hz)，3.16(2H，brs)，3.55(1H，dd，J＝16.7，5.7Hz)，3.63-3.80(4H，m)，4.16-4.34(3H，m)，4.36-4.50(2H，m)，5.23(2H，s)，5.37(1H，d，J＝16.5Hz)，5.43(1H，d，J＝16.5Hz)，5.51-5.62(1H，m)，6.52(1H，s)，7.10-7.25(5H，m)，7.26-7.33(3H，m)，7.39(2H，t，J＝7.3Hz)，7.65-7.72(3H，m)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，7.86(2H，d，J＝7.3Hz)，7.98(1H，t，J＝5.5Hz)，8.07(1H，d，J＝7.8Hz)，8.15(1H，t，J＝5.5Hz)，8.31(1H，t，J＝5.5Hz)，8.41(1H，d，J＝8.7Hz). MS(ESI)m/z：1147(M＋H)＋ .
步驟2：(5S,14S)-14-胺基-5-苯甲基-1-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-1,4,7,10,13-五側氧基-3,6,9,12-四氮十六-16-酸三級丁酯 於上述步驟1所獲得的化合物(0.279g，0.242mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(2.00mL)溶液中，添加哌啶(0.240mL，2.42mmoL)，於室溫攪拌1小時。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝2：1(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(0.265g，定量的)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.88(3H，t，J＝7.2Hz)，1.39(9H，s)，1.81-1.94(1H，m)，2.07-2.28(2H，m)，2.37(1H，dd，J＝15.8，8.0Hz)，2.43(3H，s)，2.60(1H，dd，J＝15.8，4.9Hz)，2.75-2.82(1H，m)，3.00(1H，dd，J＝13.9，4.5Hz)，3.16-3.25(2H，m)，3.50-3.61(2H，m)，3.65-3.81(5H，m)，4.40-4.51(1H，m)，5.27(2H，dd，J＝24.1，19.0Hz)，5.43(2H，dd，J＝21.3，16.2Hz)，5.56-5.65(1H，m)，6.55(1H，s)，7.15-7.28(5H，m)，7.33(1H，s)，7.83(1H，d，J＝11.0Hz)，8.04(1H，t，J＝5.7Hz)，8.09(1H，d，J＝8.2Hz)，8.26-8.39(2H，m)，8.44(1H，d，J＝8.2Hz).
步驟3：(5S,14S)-5-苯甲基-14-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-1-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-1,4,7,10,13-五側氧基-3,6,9,12-四氮十六-16-酸三級丁酯 於上述步驟2所獲得的化合物(0.100g，0.108mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(2.00mL)溶液中，添加6-順丁烯二醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺基酯(40.0mg，0.130mmoL)，並於室溫攪拌2日。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(80.0mg，66%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.88(3H，t，J＝7.2Hz)，1.13-1.23(2H，m)，1.37(9H，s)，1.42-1.54(4H，m)，1.80-1.96(2H，m)，2.08-2.25(4H，m)，2.35-3.76(15H，m)，2.43(3H，s)，4.39-4.49(1H，m)，4.55-4.67(1H，m)，5.21-5.34(2H，m)，5.43(2H，dd，J＝21.1，16.4Hz)，5.56-5.64(1H，m)，6.55(1H，s)，7.01(2H，d，J＝0.8Hz)，7.16-7.26(5H，m)，7.33(1H，s)，7.83(1H，d，J＝11.3Hz)，8.04-8.18(3H，m)，8.30-8.37(1H，m)，8.43(1H，d，J＝8.6Hz). MS(ESI)m/z：1118(M＋H)＋ .
步驟4：N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-α-天冬胺醯基甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]甘胺醯胺 冰冷下，於上述步驟3所獲得的化合物(70.0mg，62.6μmoL)中添加三氟乙酸(4.00mL)，於室溫攪拌1小時。減壓餾除溶媒，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(55.0mg，83%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.88(3H，t，J＝7.4Hz)，1.14-1.24(2H，m)，1.41-1.53(4H，m)，1.79-1.95(2H，m)，2.08-2.28(4H，m)，2.37-2.60(2H，m)，2.42(3H，s)，2.63-2.82(2H，m)，2.99(1H，dd，J＝14.1，5.1Hz)，3.12-3.25(2H，m)，3.29-3.44(1H，m)，3.52-3.80(6H，m)，4.38-4.48(1H，m)，4.56(1H，dd，J＝13.7，7.4Hz)，5.27(2H，dd，J＝24.3，18.8Hz)，5.43(2H，dd，J＝21.5，16.4Hz)，5.57-5.62(1H，m)，6.55(1H，s)，7.01(2H，s)，7.15-7.26(5H，m)，7.33(1H，s)，7.82(1H，d，J＝11.0Hz)，7.98(1H，brs)，8.08(1H，d，J＝6.7Hz)，8.15(1H，d，J＝7.8Hz)，8.34(1H，brs)，8.44(1H，d，J＝8.6Hz)，12.26(1H，brs). MS(ESI)m/z：1062(M＋H)＋ .
步驟5：抗體-藥物結合物(5) 使用參考例1製作的U1-59及上述步驟4所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：1.36mg/mL，抗體產量：8.16mg(82%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝7620、εD ， 370 ＝23700)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.0。實施例 6 抗體 - 藥物結合物 (6)
Figure 02_image127
步驟1：抗體-藥物結合物(6) 使用以參考例1製作的U1-59及實施例5步驟4所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：11.5mg/mL，抗體產量：224.2mg(90%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝7620、εD ， 370 ＝23700)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.6。實施例 7 抗體 - 藥物結合物 (7)
Figure 02_image129
步驟1：(3S,12S)-12-苯甲基-21-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}-4,7,10,13,16,21-六側氧基-5,8,11,14,17-五氮二十一-1-酸三級丁酯 將(2S)-4-三級丁氧基-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸(0.625g、1.52mmoL)溶解於二氯甲烷(10.0mL)，添加N-羥基琥珀醯亞胺(0.175g、1.52moL)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.291g、1.52mmoL)而攪拌1小時。將此反應溶液滴加於添加有實施例1步驟4所獲得的化合物(1.00g、1.01mmoL)的N,N-二甲基甲醯胺溶液(10.0mL)中，並於室溫攪拌20小時。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(0.873g、70%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.88(3H，t，J＝7.4Hz)，1.37(9H，s)，1.68-1.78(2H，m)，1.81-1.93(2H，m)，2.10-2.23(4H，m)，2.41(3H，s)，2.68-2.85(3H，m)，2.99-3.22(5H，m)，3.58-3.81(6H，m)，4.19-4.36(3H，m)，4.38-4.52(2H，m)，5.17(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝19.2Hz)，5.43(2H，s)，5.54-5.62(1H，m)，6.55(1H，s)，7.15-7.34(8H，m)，7.41(2H，t，J＝7.2Hz)，7.66-7.75(4H，m)，7.81(1H，d，J＝11.0Hz)，7.88(2H，d，J＝7.4Hz)，8.01-8.06(1H，m)，8.14(1H，d，J＝8.2Hz)，8.17-8.22(1H，m)，8.25-8.30(1H，m)，8.47(1H，d，J＝8.6Hz). MS(APCI)m/z：1232(M＋H)＋ .
步驟2：(3S,12S)-12-苯甲基-3-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-21-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4,7,10,13,16,21-六側氧基-5,8,11,14,17-五氮二十一-1-酸三級丁酯 將上述步驟1所獲得的化合物(0.800g、0.649mmoL)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(3.00mL)，添加哌啶(0.643mL、6.49mmoL)並攪拌1小時。將溶媒減壓乾燥，並將獲得的殘留物溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)。添加6-順丁烯二醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺基酯(0.300g、0.974mmoL)，攪拌20小時。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(0.224g、29%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.87(3H，t，J＝7.6Hz)，1.15-1.22(2H，m)，1.35(9H，s)，1.44-1.47(4H，m)，1.71-1.73(2H，m)，1.80-1.91(2H，m)，2.08(2H，t，J＝7.6Hz)，2.13-2.20(4H，m)，2.40(3H，s)，2.67(1H，dt，J＝11.1，4.8Hz)，2.78(1H，dd，J＝13.6，9.4Hz)，2.99-3.17(6H，m)，3.31-3.36(2H，m)，3.57-3.76(6H，m)，4.45-4.47(1H，m)，4.57-4.60(1H，m)，5.16(1H，d，J＝18.7Hz)，5.25(1H，d，J＝18.7Hz)，5.42(2H，s)，5.55-5.60(1H，m)，6.53(1H，s)，6.99(2H，s)，7.15-7.27(5H，m)，7.31(1H，s)，7.70(1H，t，J＝5.4Hz)，7.80(1H，d，J＝10.9Hz)，7.99(1H，t，J＝5.7Hz)，8.09-8.12(3H，m)，8.25(1H，t，J＝6.0Hz)，8.45(1H，d，J＝9.1Hz). MS(APCI)m/z：1203(M＋H)＋ .
步驟3：N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-α-天冬胺醯基甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺醯胺 使上述步驟2所獲得的化合物(0.224g、0.186mmoL)與實施例1步驟2同樣地反應，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(21.2mg、10%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.13-1.21(2H，m)，1.42-1.45(6H，m)，1.70-1.72(2H，m)，1.85-1.88(2H，m)，2.06-2.20(6H，m)，2.39(3H，s)，2.63-2.67(1H，m)，2.78-2.81(1H，m)，3.04-3.12(6H，m)，3.63-3.70(6H，m)，4.46-4.52(2H，m)，5.16(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.55-5.58(1H，m)，6.53(1H，s)，6.99(2H，s)，7.18-7.23(6H，m)，7.30(1H，s)，7.71(1H，t，J＝5.5Hz)，7.79(1H，d，J＝10.9Hz)，7.99-8.02(1H，m)，8.10-8.11(3H，m)，8.27-8.30(1H，m)，8.47-8.50(1H，m). MS(APCI)m/z：1147(M＋H)＋ .
步驟4：抗體-藥物結合物(7) 使用以參考例1製作的U1-59及上述步驟3所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：1.39mg/mL，抗體產量：8.34mg(83%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝7670、εD ， 370 ＝24800)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.7。實施例 8 抗體 - 藥物結合物 (8)
Figure 02_image131
步驟1：抗體-藥物結合物(8) 使用以參考例1製作的U1-59及實施例7步驟3所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：11.2mg/mL，抗體產量：228.5mg(91%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝7670、εD ， 370 ＝24800)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.7。
實施例 9 抗體 - 藥物結合物 (9)
Figure 02_image133
步驟1：N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺醯胺 將實施例1之步驟4所獲得的化合物(100mg，0.119mmoL)，使用3-(2-(2-(3-順丁烯二醯亞胺丙醯胺)乙氧基)乙氧基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(50.7mg，0.119mmoL)替代6-順丁烯二醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺基酯，而使其與實施例1之步驟5同樣地反應，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(66.5mg，48%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.85(3H，t，J＝7.4Hz)，1.65-1.74(2H，m)，1.77-1.90(2H，m)，2.07-2.19(4H，m)，2.30(2H，t，J＝7.2Hz)，2.33-2.36(2H，m)，2.38(3H，s)，2.76(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，2.96-3.18(9H，m)，3.42-3.44(4H，m)，3.53-3.76(10H，m)，4.43(1H，td，J＝8.6，4.7Hz)，5.14(1H，d，J＝18.8Hz)，5.23(1H，d，J＝18.8Hz)，5.38(1H，d，J＝17.2Hz)，5.42(1H，d，J＝17.2Hz)，5.52-5.58(1H，m)，6.52(1H，s)，6.98(2H，s)，7.12-7.17(1H，m)，7.18-7.25(4H，m)，7.29(1H，s)，7.69(1H，t，J＝5.5Hz)，7.78(1H，d，J＝11.3Hz)，7.98-8.03(2H，m)，8.11(1H，d，J＝7.8Hz)，8.16(1H，t，J＝5.7Hz)，8.23(1H，t，J＝5.9Hz)，8.44(1H，d，J＝9.0Hz). MS(APCI)m/z：1149(M＋H)＋ .
步驟2：抗體-藥物結合物(9) 使用以參考例1製作的U1-59及上述步驟1所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：2.08mg/mL，抗體產量：18.7mg(94%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝4964、εD ， 370 ＝18982)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.6。實施例 10 抗體 - 藥物結合物 (10)
Figure 02_image135
步驟1：抗體-藥物結合物(10) 使用以參考例1製作的U1-59及實施例9步驟1所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：19.7mg/mL，抗體產量：236.4mg(95%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝4964、εD ， 370 ＝18982)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.2；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝4964)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.4。
實施例 11 抗體 - 藥物結合物 (11)
Figure 02_image137
步驟1：抗體-藥物結合物(11) 使用以參考例1製作的U1-59及實施例9步驟1所獲得的化合物，藉由與實施例4步驟1同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：0.88mg/mL，抗體產量：5.28mg(53%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝4964、εD ， 370 ＝18982)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.0；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝4964)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.3。實施例 12 抗體 - 藥物結合物 (12)
Figure 02_image139
步驟1：({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯 於包含N-9-茀基甲氧基羰基甘胺醯基甘胺酸(4.33g，12.2mmol)、四氫呋喃(120mL)、及甲苯(40.0mL)的混合物中，添加吡啶(1.16mL，14.7mmol)及四乙酸鉛(6.84g，14.7mmol)，並加熱回流5小時。將反應液冷卻至室溫後，藉由矽藻土過濾去除不溶物，減壓下濃縮濾液之溶媒。將獲得的殘留物溶解於乙酸乙酯，以水及飽和食鹽水洗淨後，將有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶媒後，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯＝9：1(v/v)~乙酸乙酯]純化，獲得呈無色固體之標題化合物(3.00g，67%)。1 H-NMR(400MHz，CDCl3 )δ：2.07(3H，s)，3.90(2H，d，J＝5.1Hz)，4.23(1H，t，J＝7.0Hz)，4.46(2H，d，J＝6.6Hz)，5.26(2H，d，J＝7.0Hz)，5.32(1H，brs)，6.96(1H，brs)，7.32(2H，t，J＝7.3Hz)，7.41(2H，t，J＝7.3Hz)，7.59(2H，d，J＝7.3Hz)，7.77(2H，d，J＝7.3Hz).
步驟2：[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苯甲酯 於上述步驟1所獲得的化合物(3.68g，10.0mmoL)及乙醇酸苯甲酯(4.99g，30.0mmoL)之四氫呋喃(40.0mL)溶液中，於0℃添加三級丁醇鉀(2.24g，20.0mmoL)，並於室溫攪拌15分鐘。於0℃，於反應溶液中添加乙酸乙酯、水，以乙酸乙酯、氯仿萃取，將獲得的有機層以硫酸鈉乾燥，並過濾。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物溶解於二
Figure 109127496-A0304-12-0059-1
烷(40.0mL)、水(10.0mL)，添加碳酸氫鈉(1.01g，12.0mmoL)、氯甲酸9-茀基甲酯(2.59g，10.0mmoL)，於室溫攪拌2小時。於反應溶液中添加水，以乙酸乙酯萃取，將獲得的有機層以硫酸鈉乾燥，並過濾。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)~0：100]純化，獲得無色油狀之標題化合物(1.88g、40%)。1 H-NMR(400MHz，CDCl3 )δ：3.84(2H，d，J＝5.5Hz)，4.24(3H，t，J＝6.5Hz)，4.49(2H，d，J＝6.7Hz)，4.88(2H，d，J＝6.7Hz)，5.15-5.27(1H，m)，5.19(2H，s)，6.74(1H，brs)，7.31-7.39(7H，m)，7.43(2H，t，J＝7.4Hz)，7.61(2H，d，J＝7.4Hz)，7.79(2H，d，J＝7.4Hz).
步驟3：[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸 將上述步驟2所獲得的化合物(1.88g、3.96mmoL)溶解於乙醇(40.0mL)、乙酸乙酯(20.0mL)。添加鈀碳觸媒(376mg)，在氫氣環境下，於室溫攪拌2小時。藉由矽藻土過濾去除不溶物，減壓餾除濾液之溶媒，獲得呈無色固體之標題化合物(1.52g、定量的)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：3.62(2H，d，J＝6.3Hz)，3.97(2H，s)，4.18-4.32(3H，m)，4.60(2H，d，J＝6.7Hz)，7.29-7.46(4H，m)，7.58(1H，t，J＝5.9Hz)，7.72(2H，d，J＝7.4Hz)，7.90(2H，d，J＝7.4Hz)，8.71(1H，t，J＝6.5Hz).
步驟4：9H-茀-9-基甲基(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]胺基}-2-側氧基乙基)胺甲酸酯 冰冷下，於依喜替康之甲磺酸鹽(0.283g，0.533mmoL)、N-羥基琥珀醯亞胺(61.4mg，0.533mmoL)、及上述步驟3所獲得的化合物(0.205g，0.533mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(10.0mL)溶液中，添加N,N-二異丙基乙基胺(92.9μL，0.533mmoL)及N,N’-二環己基碳二亞胺(0.143g，0.693mmoL)，並於室溫攪拌3日。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得呈淡茶色固體之標題化合物(0.352g，82%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.81(3H，t，J＝7.4Hz)，1.73-1.87(2H，m)，2.06-2.20(2H，m)，2.34(3H，s)，3.01-3.23(2H，m)，3.58(2H，d，J＝6.7Hz)，3.98(2H，s)，4.13-4.25(3H，m)，4.60(2H，d，J＝6.7Hz)，5.09-5.22(2H，m)，5.32-5.42(2H，m)，5.50-5.59(1H，m)，6.49(1H，s)，7.24-7.30(3H，m)，7.36(2H，t，J＝7.4Hz)，7.53(1H，t，J＝6.3Hz)，7.66(2H，d，J＝7.4Hz)，7.75(1H，d，J＝11.0Hz)，7.84(2H，d，J＝7.4Hz)，8.47(1H，d，J＝8.6Hz)，8.77(1H，t，J＝6.7Hz). MS(ESI)m/z：802(M＋H)＋ .
步驟5：N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺 於上述步驟4所獲得的化合物(0.881g，1.10mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(11.0mL)溶液中，添加哌啶(1.1mL)，並於室溫攪拌2小時。減壓餾除溶媒，獲得含標題化合物的混合物。本混合物未進一步純化而用於下一反應。
步驟6：N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺 冰冷下，於上述步驟5所獲得的混合物(0.439mmoL)、N-羥基琥珀醯亞胺(0.101g，0.878mmoL)、及N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺酸(日本特開2002-60351號公報記載的化合物；0.440g，0.878mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(50.0mL)溶液中，添加N,N’-二環己基碳二亞胺(0.181g，0.878mmoL)，並於室溫攪拌4日。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]純化，獲得呈淡橙色固體之標題化合物(0.269g，58%)。 MS(ESI)m/z：1063(M＋H)＋ .
步驟7：甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺 於上述步驟6所獲得的化合物(0.269g，0.253mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(4.00mL)溶液中，添加哌啶(0.251mL，2.53mmoL)，於室溫攪拌2小時。減壓餾除溶媒，獲得含標題化合物的混合物。本混合物未進一步純化而用於下一反應。
步驟8：N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 109127496-A0101-12-0029-1
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺 於上述步驟7所獲得的化合物(0.253mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(10.0mL)溶液中，添加6-順丁烯二醯亞胺己酸N-琥珀醯亞胺基酯(0.156g，0.506mmoL)，並於室溫攪拌3日。減壓餾除溶媒，將獲得的殘留物以矽膠管柱層析[氯仿~氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]純化，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(0.100g，38%)。1 H-NMR(400MHz，DMSO-d6 )δ：0.83(3H，t，J＝7.2Hz)，1.09-1.21(2H，m)，1.33-1.47(4H，m)，1.75-1.90(2H，m)，2.00-2.23(4H，m)，2.36(3H，s)，2.69-2.81(1H，m)，2.94-3.03(1H，m)，3.06-3.22(2H，m)，3.23-3.74(6H，m)，3.98(2H，s)，4.39-4.50(1H，m)，4.60(2H，d，J＝6.7Hz)，5.17(2H，s)，5.39(2H，s)，5.53-5.61(1H，m)，6.50(1H，s)，6.96(2H，s)，7.11-7.24(5H，m)，7.28(1H，s)，7.75(1H，d，J＝11.0Hz)，7.97(1H，t，J＝5.7Hz)，8.03(1H，t，J＝5.9Hz)，8.09(1H，d，J＝7.8Hz)，8.27(1H，t，J＝6.5Hz)，8.48(1H，d，J＝9.0Hz)，8.60(1H，t，J＝6.5Hz). MS(ESI)m/z：1034(M＋H)＋ .
步驟9：抗體-藥物結合物(12) 使用以參考例1製作的U1-59及上述步驟8所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：2.11mg/mL，抗體產量：19.0mg(95%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：4.9。實施例 13 抗體 - 藥物結合物 (13)
Figure 02_image141
步驟1：抗體-藥物結合物(13) 使用以參考例1製作的U1-59及實施例12步驟8所獲得的化合物，藉由與實施例1步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：22.2mg/mL，抗體產量：244.2mg(98%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.2；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.0。實施例 14 抗體 - 藥物結合物 (14)
Figure 02_image143
步驟1：抗體-藥物結合物(14) 抗體之還原：將參考例1製作的U1-59，使用製造方法1記載的共通操作B及共通操作C，將介質置換為PBS6.0/EDTA，調製為10mg/mL之抗體濃度。將本溶液(1.00mL)置入2.0mL聚丙烯製管，於其中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.0160mL；相對於抗體一分子為2.4當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0150mL)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃保溫1小時，使抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原。 抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於15℃水浴保溫10分鐘後，添加二甲基亞碸(Sigma-Aldrich Co.LLC；0.0209mL)及含實施例12步驟8所獲得的化合物10mM的二甲基亞碸溶液(0.0315mL；相對於抗體一分子為5.0當量)，於15℃水浴保溫60分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0050mL)，再於室溫使用試管混勻器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)攪拌20分鐘，使藥物連接物之反應停止。 藉由與實施例1步驟6同樣之純化操作及特性評價，獲得下述之特性値。 抗體濃度：1.46mg/mL，抗體產量：8.76mg(88%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.5；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.9。實施例 15 抗體 - 藥物結合物 (15)
Figure 02_image145
步驟1：抗體-藥物結合物(15) 抗體之還原：將參考例1製作的U1-59，使用製造方法1記載的共通操作B及共通操作C，將介質置換為PBS6.0/EDTA，調製為10mg/mL之抗體濃度。將本溶液(100mL)置入聚碳酸酯製之250mL三角燒瓶容器，於磁攪拌器攪拌下，於室溫添加1M磷酸氫二鉀水溶液(1.70mL)後，添加10mM TCEP水溶液(4.010mL；相對於抗體一分子為6.0當量)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，停止攪拌，藉由於37℃保溫1小時，將抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原。 抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液冷卻至15℃後，於攪拌下，緩緩滴加含實施例12步驟8所獲得的化合物10mM的DMSO溶液(6.684mL；相對於抗體一分子為10.0當量)。於15℃，最初之30分鐘攪拌，其次之1小時使攪拌停止而保溫，使藥物連接物與抗體結合。其次，於攪拌下，添加100mM NAC水溶液(0.862mL；相對於抗體一分子為12.9當量)，再於室溫下保溫20分鐘，使未反應之藥物連接物之反應性停止。 純化：於攪拌下，於上述溶液中緩緩添加20%乙酸水(約0.6mL)及ABS(100mL)，將本溶液之pH作成5.5±0.1。將此溶液進行精密過濾(Millipore Co. Millex-HV過濾器，0.45μm、PVDF膜)而去除白濁物。對此溶液，使用由超過濾膜(Merck股份有限公司、Pellicon XL Cassette、Biomax 50KDa)、管幫浦(美國Cole-Parmer公司Masterflex Pump model 77521-40、幫浦壓頭model 7518-00)及管(美國Cole-Parmer公司Masterflex tube L/S16)所構成的超過濾裝置，進行超過濾純化。即，藉由於反應液中一邊滴加作為純化緩衝液之ABS(共計1600mL)，一邊進行超過濾純化，而去除未結合之藥物連接物及其他低分子量試藥，並將緩衝液置換為ABS，進一步進行至濃縮。對獲得的純化溶液，進行精密過濾(0.22μm(Millipore Co. Millex-GV過濾器，PVDF膜)，獲得含有標題抗體-藥物結合物的溶液37.5mL。 抗體濃度：26.5mg/mL，抗體產量：993.0mg(90%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.3；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.3。實施例 16a 抗體 - 藥物結合物 (16a)
Figure 02_image147
步驟1：抗體-藥物結合物(16a) 抗體之還原：將參考例1製作的U1-59，使用製造方法1記載的共通操作B及共通操作C，將介質置換為PBS6.0/EDTA，調製為10mg/mL之抗體濃度。將本溶液(15mL)置入聚對苯二甲酸乙二酯製之50mL容器中，於磁攪拌器攪拌下，於室溫添加1M磷酸氫二鉀水溶液(0.255mL)後，添加10mM TCEP水溶液(0.601mL；相對於抗體一分子為6.0當量)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃保溫2小時，將抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原。 抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液冷卻至15℃後，於攪拌下，緩緩滴加含實施例12步驟8所獲得的化合物10mM的DMSO溶液(1.002mL；相對於抗體一分子為10.0當量)。於15℃，攪拌30分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，於攪拌下，添加100mM NAC水溶液(0.129mL；相對於抗體一分子為12.9當量)，再於室溫下保溫20分鐘，使未反應之藥物連接物之反應性停止。藉由與實施例1步驟6同樣之純化操作及特性評價，獲得下述之特性値。 抗體濃度：2.36mg/mL，抗體產量：140mg (59.5mL) (94%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.4；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.7。實施例 16b 抗體 - 藥物結合物 (16b)
Figure 02_image149
抗體之還原：將參考例1製作的U1-59，使用製造方法1記載的共通操作B及共通操作C，將介質置換為PBS6.0/EDTA，調製為10mg/mL之抗體濃度。將本溶液(900mL)置入聚碳酸酯製之2000mL三角燒瓶容器，於磁攪拌器攪拌下，於室溫添加1M磷酸氫二鉀水溶液(15.3mL)後，添加10mM TCEP水溶液(36.1mL；相對於抗體一分子為6.0當量)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，藉由停止攪拌並於37℃保溫2小時，將抗體內鉸鏈部之雙硫鍵還原。 抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液冷卻至15℃後，於攪拌下，緩緩滴加含實施例12步驟8所獲得的化合物10mM的DMSO溶液(60.16mL；相對於抗體一分子為10.0當量)。於15℃攪拌30分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，於攪拌下，添加100mM NAC水溶液(7.76mL；相對於抗體一分子為12.9當量)，再於室溫下保溫20分鐘，使未反應之藥物連接物之反應性停止。 純化：於攪拌下，於上述溶液緩緩添加20%乙酸水(約5mL)及ABS(1000mL)，將本溶液之pH作成5.5±0.1。將此溶液進行精密過濾(Millipore Co. Stericup、0.45μm、PVDF膜)而去除白濁物。對此溶液，使用由超過濾膜(Merck股份有限公司、Pellicon 2 mini casette、Ultracel 30KDa、0.1m2 )、管幫浦(美國Cole-Parmer社Masterflex Pump model 7528-20、幫浦壓頭model 77800-62)及管(美國Cole-Parmer公司Masterflex tube L/S24及25)所構成的超過濾裝置，進行超過濾純化。即，藉由於反應液中一邊滴加作為純化緩衝液之ABS(共計16L) ，一邊進行超過濾純化，而去除未結合之藥物連接物及其他低分子量試藥，並將緩衝液置換為ABS，進一步進行至濃縮。獲得含有標題抗體-藥物結合物的溶液約500mL。 抗體濃度：19.66mg/mL，抗體產量：9830mg(109%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.5。實施例 16c 抗體 - 藥物結合物 (16c)
Figure 02_image151
使用以參考例1製作的U1-59及實施例12步驟8所獲得的化合物，藉由與實施例16b同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。 抗體濃度：16.21mg/mL，抗體產量：9726mg(600mL、108%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.5。實施例 16d 抗體 - 藥物結合物 (16d)
Figure 02_image153
將實施例16a、16b及16c製作的抗體-藥物結合物(16a)、(16b)及(16c)混合(共計約18g)，再者，進行與實施例16b同樣之超過濾純化(使用11L之ABS)。對獲得的純化溶液，進行精密過濾(Millipore Co. Stericup、0.45μm及0.22μm、PVDF膜)，獲得含有標題抗體-藥物結合物的溶液745mL。再藉由添加ABS 110mL，獲得含有標題抗體-藥物結合物的溶液855mL。 抗體濃度：20.0mg/mL，抗體產量：17.1g(94%)，以共通操作E(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178、εD ， 370 ＝20217)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.5；以共通操作F(作為藥物連接物之莫耳吸光係數，使用εD ， 280 ＝5178)所測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.8。試驗例 1 與 U1-59 比較的抗體 - 藥物結合物之對 HER3 的結合親和性
方法： 將來自ATCC之人類乳癌細胞株HCC1569 (CRL-2330)以RPMI1640培養基(購自Invitrogen，含10%牛血清白蛋白(Invitrogen製)及2mM之L-麩醯胺酸(Invitrogen製))培養。將細胞以ACCUTASE(註冊商標)SOLUTION (Millipore，SCR005)或EDTA(5mM、磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline) (PBS，137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，1.47mM磷酸二氫鉀，10.5mM磷酸氫二鈉))自培養盤剝離，藉由台酚藍(Trypan Blue)處理而測定活細胞數。將懸浮於螢光活化細胞分選(Fluorescence-activated cell sorting) (FACS)緩衝液(含3% FBS及0.004%疊氮化鈉的PBS)的相同數目細胞接種於96孔U底盤，藉由離心分離使細胞沉澱，懸浮於100μL之冰冷抗體或抗體-藥物結合物稀釋液、或FACS緩衝液。 抗體或抗體-藥物結合物係以FACS緩衝液，以1/3進行連續稀釋(serial dilution)，調整為30μg/mL~5ng/mL (200nM~0.03nM)。將未添加一次抗體的以FACS緩衝液處理的細胞作為對照組。 作為抗體或抗體-藥物結合物，評價U1-59、抗體-藥物結合物(3)、抗體-藥物結合物(10)、抗體-藥物結合物(13)。 各細胞以一次抗體稀釋液於冰上使反應45分鐘後，以FACS緩衝液洗淨。再添加100μL之FACS緩衝液、或二次抗體(藻紅素(PE)-偶合的抗人類抗體，Dianova #709-116-149)以1/100稀釋的反應液。於黑暗、冰上處理45分鐘後，以FACS緩衝液洗淨，以FACS緩衝液或添加有7-胺基放線菌素D(7AAD，Sigma，#A9400，1.1μg/mL)的FACS緩衝液排除死細胞。 活細胞中的螢光訊號使用Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences/Accuri(註冊商標)Cytometers Inc，序號1424)及CFlow軟體(CFlow sampler 版本1.0.264.13)評價。 為了補正來自PE及7-AAD的訊號，評價U1-59(30μg/mL)及以PE標識二次抗體或7-AAD染色的細胞之螢光訊號。 為了定量細胞中的U1-59特異性螢光訊號，使用減去僅以二次抗體或7-AAD處理的細胞之FL-2訊號的値。平衡的結合親和性(KD)及最大結合強度(Bmax)係以GraphPad Prism軟體(Windows用5.04版(註冊商標)(單位點特異性結合(one-site-specific binding)))計算。
將結果示於第3圖及表1。第3圖及表1呈現以U1-59或抗體-藥物結合物之連續稀釋液處理的HCC1569之平均螢光強度。平衡結合親和性KD及最大結合強度Bmax係藉由GraphPad Prism軟體計算。
表1
   U1-59 抗體 - 藥物複合體 (3) 抗體 - 藥物複合體 (10) 抗體 - 藥物複合體 (13)
Bmax 31830 28981 28841 28415
Kd (nM) 1.672 1.653 1.554 2.757
抗體-藥物結合物(3)或抗體-藥物結合物(10)對HCC-1569的平均結合親和性KD係顯示與非結合物的抗HER3抗體U1-59相同程度的KD。再者，抗體-藥物結合物(13)之平均結合親和性KD係顯示與非結合物的抗HER3抗體U1-59相同程度的KD(2.7nM及1.6nM)。由相異的抗體-藥物結合物之KD値，暗示抗體-藥物結合・處理無顯著地損及U1-59之結合親和性。試驗例 2 由抗 HER3 抗體 - 藥物結合物所致的 HER3 訊息之抑制
方法： 將來自Cell Line Service的人類肺癌細胞株A549 (CRS-300114)以胰蛋白酶處理而剝離，於6孔盤將50,000個之活細胞接種於3mL之DMEM/F12 (Invitrogen，#21331-020)＋10% FBS (Invitrogen，#10270-106)。將細胞培養3日後，交換成2mL之新鮮培養基。 將抗體及抗體-藥物結合物以成為最終濃度10μg/mL的方式，直接添加於6孔之各2mL培養基(添加1μg/μL之抗體或抗體-藥物結合物之母液20μL)。 使用U1-59、抗體-藥物結合物(3)、抗體-藥物結合物(10)、抗體-藥物結合物(13)作為抗體或抗體-藥物結合物，將未處理組作為對照組。 培養細胞2日，以PBS洗淨1次，以100μL之冰冷緩衝液(於50mM 4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 109127496-A0304-12-0000-4
乙烷磺酸(HEPES)pH7.5，150mM氯化鈉，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，12.5%甘油，1% Triton X-100，10mM四元焦磷酸鈉(sodium pyrophosphate tetrabasic)添加蛋白酶抑制劑(Roche，#11697 498 001)，10mM氟化鈉，1mM釩酸鈉，1mM苯基-甲烷-磺醯基-氟化物(PMSF)，10μg/mL抑肽酶(aprotinin)(Sigma，A1153))，於4℃進行處理30分鐘，進行溶解化(lysis)。將溶解產物於13000rpm、4℃洗淨20分鐘，將上清液用於利用布拉德福試驗(Bradford assay)(Sigma，#B6916，BSA標準係來自Thermo Scientific，#23209)之蛋白質濃度測定。將蛋白質量120μg作為一樣品，添加4倍濃度之LDS緩衝液(Invitrogen、含最終濃度166.67mM之DTT)，最終以水作成40μL。將樣品於70度煮沸10分鐘，添加於NuPage Mini Bis-Tris膠體(4%-12%，1.5mm厚、10溝槽/膠體、Invitrogen)之孔。添加7.5μL之Novex(註冊商標)sharp ladder(Invitrogen，P/N 57318)作為蛋白質標準。樣品係以175伏特，將含NuPage抗氧化劑(Invitrogen，NP0005，Lot 1356629的1×MOPS電泳緩衝液(Running buffer)(Invitrogen)添加於內腔，進行電泳70分鐘。藉由膠體電泳而分離的蛋白質係使用含10%甲醇與NuPage抗氧化劑(Invitrogen，NP0005，Lot 1356629，1：1000稀釋)的NuPage轉印緩衝液(Invitrogen)，而轉印(transfer)於0.45μm孔徑之硝基纖維素膜(GE Healthcare Life Sciences)。蛋白質係於30V定壓下轉印80分鐘。 切斷轉印膜，分成100kDa以上及30-100kDa之劃份，以含0.1% Tween-20的PBS洗淨2次，以奧德賽封阻液(Odyssey Blocking solution)(LI-COR，#927-40000)於室溫使其震盪一小時，進行封阻。封阻後，轉印膜係於4℃進行一晩一次抗體稀釋的溶液(將奧德賽封阻液及PBS等量混合)之處理。 作為一次抗體，使用抗HER3抗體(Santa Cruz，SC-81455，1：500稀釋)、抗磷酸化HER抗體(Cell Signaling Technology，#4791 1：1000)，而且作為電泳對照組，使用抗肌動蛋白抗體(Neomarkers，#MS1295，稀釋1：3333)。 轉印膜係以含0.1%Tween-20的PBS洗淨3次(各5分鐘)，藉由含二次抗體的稀釋液(將奧德賽封阻液與PBS等量混合)而於暗室、於室溫使其反應1小時。 作為二次抗體，使用山羊抗小鼠IRDye 680RD (Li-COR，#926-68070，稀釋1：25000)或山羊抗兔IR Dye 800CW(Li-COR，#926-32211，1：10000稀釋)。轉印膜係藉由含0.1% Tween-20的PBS洗淨3次、各6分鐘，藉由Li-COR/奧德賽紅外光顯像器(Odyssey infrared imager)檢測訊號。
將結果示於第4圖。將A549細胞與U1-59或相異的抗體-藥物結合物一起培養2日。藉由西方氏轉漬(Western blotting)評價HER3或磷酸化HER3。作為電泳對照組，檢測泛-肌動蛋白(pan-Actin)。
將A549與U1-59或抗體-藥物結合物10μg/mL一起培養2日的結果，與未處理細胞相比，HER3之磷酸化降低。此HER3磷酸化的降低係U1-59及抗體-藥物結合物為相同程度，暗示來自U1-59之HER3訊息抑制機能並未因複數之藥物結合物操作而受損。 將A549以U1-59及抗體-藥物結合物處理2日的情形，與未處理細胞相比，亦觀察到HER3的表現降低。表現降低的程度係U1-59及抗體-藥物結合物為相同程度，此係暗示介由U1-59存在之內在化(參照內在化之試驗例)及U1-59誘導性HER向下調節(down regulation)(參照訊息抑制之試驗例)並未因複數之藥物結合物操作而受損。試驗例 3 因 U1-59 及抗體 - 藥物結合物所致的細胞表面 HER3 的表現降低
方法： 因U1-59及抗體-藥物結合物所致的HER3之內在化係藉由流式細胞測量術評價。將70,000個之活細胞HCC1569 (來自ATCC)，懸浮於0.5mL之RPMI1640 (Invitrogen，#31870-025) (含10%FBS(Invitrogen，#10270-106或PAN Biotech，# 1505-P131304)及2mM麩醯胺酸(Invitrogen，#25030-024))，接種於24孔盤之各孔。細胞係培養4日，於內在化試驗開始前，交換成0.5mL之新鮮培養基。將5μg之抗體或抗體-藥物結合物，添加0.5mL於24孔盤之各孔，將最終濃度作成10μg/mL。將細胞於37℃，於抗體或抗體-藥物結合物之存在下，培養1小時。使用U1-59、抗體-藥物結合物(3)、抗體-藥物結合物(10)、或抗體-藥物結合物(13)作為抗體或抗體-藥物結合物。作為陽性對照組或陰性對照組之細胞，一部分操作為未處理。 為了流式細胞測量術解析，將細胞以PBS洗淨1次，以ACCUTASE(註冊商標)SOLUTION(Millipore，SCR005)或溶解於PBS的5mM EDTA(100μL/well)將細胞剝離。懸浮於200μL之冰冷FACS緩衝液(含3% FBS及0.004%疊氮化鈉的PBS)後，添加於96孔U底盤之各孔，並置於冰上。將細胞以FACS緩衝液洗淨1次，於各樣品中添加稀釋於100μL之FACS緩衝液的U1-59(10μg/mL)或僅添加FACS緩衝液。將細胞一邊於冰上振盪，一邊處理45分鐘處理後，以FACS緩衝液洗淨，於各孔添加100μL之將PE標識二次抗體抗人類抗體(Dianova，709-116-149)以1：100溶解於FACS緩衝液者，或僅添加FACS緩衝液。將細胞一邊於冰上振盪一邊進行暗室處理45分鐘。將細胞以FACS緩衝液洗淨，以FACS緩衝液或含將死細胞染色的7AAD(Sigma，A9400,1.1μg至1.25μg/mL)的FACS緩衝液處理。藉由Accuri C6流式細胞儀測定活細胞之螢光訊號，為了補正PE及7-AAD之訊號，使用U1-59(10μg/mL)及PE標識二次抗體或僅以7-AAD染色的細胞。 為了定量HER3特異性訊號，自一次抗體與二次抗體、進一步以7-AAD染色的FL-2値減去二次抗體或僅以7-AAD染色的値。 將未進行U1-59或抗體-藥物結合物處理的(未使其內在化的)細胞之FL-2訊號作為最大値，計算於37℃處理的由U1-59或抗體-藥物結合物所致的細胞表面HER3之降低(內在化)。 陽性對照組(無37℃之處理)及陰性對照組(未添加一次抗體)係作為自2~3個孔算出的平均値而將各處理組之孔之內在化定量化。
將結果示於第5圖。圖中呈現由U1-59或抗體-藥物結合物處理(37℃，1小時)所致的HCC1569細胞表面之HER表現降低的平均値。細胞中的HER3表現的最大値係作為未添加U1-59或抗體-藥物結合物的組。背景之値為僅二次抗體或僅7-AAD處理的組。將U1-59或各抗體-藥物結合物處理1小時者作為處理組。由U1-59及抗體-藥物結合物所致的FL-2之値幾乎相同。
藉由將HCC-1569以U1-59或各抗體-藥物結合物處理而產生的螢光降低係顯示HER3表現之降低。由於與由U1-59所致的HER3之表現降低約50%比較，由各抗體-藥物結合物所致的HER3表現降低亦呈現同等或其以上之値，故暗示使HER3內在化的抗體之機能並未因對抗體之藥物結合物操作而受損。試驗例 4 由 HER3 抗體 - 藥物結合物所致的於人類癌細胞株之活體外增殖・生存訊息之抑制
方法： 由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制活性係於10% FBS存在下測定。細胞之增殖及成長係藉由測定未處理及抗體-藥物結合物處理組之三磷酸腺苷(ATP)活性而評價。接著性之癌細胞株(來自ATCC之人類乳癌細胞株HCC1569(CRL-2330)、來自ATCC之人類乳癌細胞株MDA-MB-453(CLB-22)及來自ProQinase之人類大腸癌細胞株HT-29(CPQ-57))係以2D培養系統培養，浮游性之(非接著性)癌細胞株(來自ATCC之人類黑色素瘤細胞株A375(CRL-1619)及來自Cell Line Service之人類肺癌細胞株A549(CRS-300114))係以3D培養系統培養。接著細胞之處理 癌細胞株係以低密度(HT-29為500個細胞/孔，MDA-MB-453係800個細胞/孔，HCC-1569係1000個細胞/孔)懸浮於100μL之各培養基，接種於96微孔光學底部盤(96 MicroWell Optical Bottom Plate)(Thermo Scientific/Nunc，#165306、白壁透明底)。關於HCC-1569及MDA-MB-453，以含10% FBS(Invitrogen，10270-106)及2mM麩醯胺酸(Invitrogen，25030-024)的RPMI1640培養基(Invitrogen，31870-025)培養，關於HT-29，以含10% FBS(Invitrogen，10270-106)及2mM麩醯胺酸(Invitrogen，25030-024)的Mc Coy’s 5A培養基(Invitrogen，26600-023)培養。各盤之邊緣之孔，以100μL培養基填滿。 培養細胞3日，於抗體-藥物結合物處理前交換成95μL之新鮮培養基。 使用抗體-藥物結合物(3)、抗體-藥物結合物(10)、以及使用抗體-藥物結合物(13)，為了測定通常之細胞增殖，放置無處理組作為對照組。 將濃縮20倍濃度的抗體-藥物結合物5μL，添加於置入96孔盤之各孔的95μL之培養基(10% FBS)而作成最終濃度。於對照組之孔中僅添加5μL之培養基。每1樣品以三重複實施。 為了算出使細胞之增殖・生存降低50%的抗體-藥物結合物之濃度，抗體-藥物結合物之濃度係以4倍稀釋作成(10μg/mL至0.15ng/mL、或40μg/mL~0.15ng/mL)，處理細胞，與無處理組比較ATP活性。添加抗體-藥物結合物後，關於HT-29，以5日之培養進行評價，關於HCC-1569及MDA-MB-453，以7日之培養進行評價。為了評價抗體-藥物結合物之活性，利用CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞生存力試驗(Luminescent Cell Viability Assay)。此係以ATP活性作為基準測定有代謝活性的活細胞，而最終評估活細胞數的方法，使用作為套組之CellTiter-Glo(註冊商標) 發光細胞(Promega，G7573)。 將100μL之CellTiter-Glo(註冊商標)試劑添加於96孔盤之各孔，以Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter(program luminescence，測定時間0.5s)測定前，於暗室室溫保存25分鐘至65分鐘。將未接種細胞且僅含培養液的孔，作為空白組。為了測定ATP活性的降低，算出各條件各3孔之平均發光値(Microsoft Excel 2010)。為了去除非細胞依賴的訊號，自抗體-藥物結合物處理的細胞之平均發光値減去空白組平均發光値 (Microsoft Excel 2010)。發光降低率(%)係藉由與無處理組之細胞比較而算出(Microsoft Excel 2010)，其値被解釋為細胞增殖・生存抑制率(%)。浮游細胞之處理 因A375與A549較其他細胞株之增殖速度快，以非接著的3D培養系統實施增殖測定。 癌細胞株係以低密度(A375為500個細胞/孔、A549係1500個細胞/孔)懸浮於75μL之各培養基，接種於96圓底孔非接著3D培養盤(Prime Surface 96U；Sumitomo Bakelite Co，Ltd.；order no. MS-9096U)。關於A375，以含10% FBS(Invitrogen，10270-106)及2mM麩醯胺酸(Invitrogen，25030-024)的DMEM培養基(Invitrogen，41965-039)培養，關於A549，以含10% FBS(Invitrogen，10270-106)及2mM麩醯胺酸(Invitrogen，25030-024)的DMEM/F12培養基(Invitrogen，21331-020)培養。各盤之邊緣之孔以150μL培養基注滿。培養細胞3日，於抗體-藥物結合物添加前添加67.5或75μL之新鮮培養基，最終用量作成142.5μL或150μL。使用抗體-藥物結合物(3)、抗體-藥物結合物(10)、或抗體-藥物結合物(13)，為了測定通常之細胞增殖，放置無處理組作為對照組。 將濃縮20倍濃度的抗體-藥物結合物7.5或8μL，添加於置入96孔盤之各孔的142.5或150μL之培養基(10% FBS)而作成最終濃度，最終用量作成150μL或158μL。於對照組僅添加培養基7.5或8μL。每1樣品以三重複實施。 為了算出使細胞之增殖・生存降低50%的抗體-藥物結合物之濃度，抗體-藥物結合物之濃度係以4倍稀釋作成(10μg/mL至0.15ng/mL、或40μg/mL~0.15ng/mL)，處理細胞，與無處理組比較ATP活性。添加抗體-藥物結合物後，以7日之培養來評價。為了評價抗體-藥物結合物之活性，利用CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞生存力試驗(Luminescent Cell Viability Assay)。此係以ATP活性作為基準測定有代謝活性的活細胞，而最終評估活細胞數的方法，使用作為套組之CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞(Promega，G7573)。 測定前，自各孔去除50μL之培養基，將100μL之CellTiter-Glo(註冊商標)試劑添加於96孔盤之各孔，以Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter(程式：發光(luminescence)，測定時間0.5秒)測定前於暗室室溫保存30分鐘至55分鐘。測定前採取各孔之180μL，移至可測定的96 微孔光學底部白色盤。將未接種細胞而僅含培養液的孔作為空白組測定。關於抑制50%細胞之增殖・生存的抗體-藥物結合物之濃度算出方法，記載於接著細胞之評價法。
將人類乳癌株HCC1569及MDA-MB453之結果各自示於第6圖及第7圖。又，將人類黑色素瘤株A375之結果示於第8圖，將人類大腸癌株HT29之結果示於第9圖，將人類肺癌株A549之結果示於第10圖。A：呈示於10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存。縱軸呈示成為各樣品之ATP活性的發光値，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。B：呈示將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率。
於10% FBS存在下，於各式各樣人類癌細胞株中添加三種類之抗體-藥物結合物，評價於2D或3D之活體外增殖。自利用CellTiter-Glo(註冊商標)的ATP活性之測定，算出無處理及由抗體-藥物結合物所致的細胞之增殖・成長抑制率。自ATP活性之評價，抗體-藥物結合物係強烈抑制2種類之乳癌細胞株(HCC-1569、MDA-MB-453)及一種類之人類黑色素瘤株A375之細胞增殖・生存。 藉由添加抗體-藥物結合物而培養7日(於10%FBS存在下)，於HCC1569為55至75% ATP活性降低、MDA-MB-453為60-83% ATP活性降低、A375為60至70%ATP活性降低。與人類乳癌株及人類黑色素瘤株比較，於人類大腸癌株HT-29與人類肺癌株A549，由抗體-藥物結合物所致的細胞增殖・生存之抑制活性不強。於HCC-1569及MDA-MB-453，抗體-藥物結合物(10)顯示強的抑制活性，與抗體-藥物結合物(3)之抑制活性於活體外亦無大差別。關於此，於雙方之人類乳癌株，抗體-藥物結合物(13)顯示低活性，對於抗體-藥物結合物(3)或抗體-藥物結合物(10)以1nM以下達成可抑制的細胞增殖・生存之50%抑制，抗體-藥物結合物(13)必須為15nM之濃度。相對於人類乳癌株，於人類黑色素瘤株，抗體-藥物結合物(13)之活性係與抗體-藥物結合物(3)或抗體-藥物結合物(10)相同。 全部之抗體-藥物結合物係支持61至68%左右之最大抑制率，於ATP活性50%抑制，抗體-藥物結合物係以1至4nM之濃度達成。 除上述之外，由抗體-藥物結合物(13)所致的對人類卵巢癌細胞株OVCAR-8之細胞增殖・生存抑制活性亦於活體外確認(資料未呈現)。試驗例 5 於人類癌細胞株之活體外細胞增殖・生存之由抗體 - 藥物結合物之藥物承載數 ( 高、中 ) 所致的抑制率之比較
方法： 評價具有相異藥物承載數的抗體-藥物結合物之活體外細胞增殖・生存之抑制活性。高藥物承載係表示5至7個之藥劑與抗體結合的狀態，中藥物承載係表示約3個之藥劑與抗體結合的狀態。與1抗體結合的藥劑之平均個數係藉由UV法(記載於本發明之其他部分)測定。
與1個抗體結合的藥劑之平均個數： 高藥物承載〈HDL：High drug loading〉 抗體-藥物結合物(3)：4.9個 抗體-藥物結合物(10)：6.2個 抗體-藥物結合物(13)：6.2個 中藥物承載〈MDL：Middle drug loading〉 抗體-藥物結合物(4)：2.9個 抗體-藥物結合物(11)：3.0個 抗體-藥物結合物(14)：2.5個
由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制活性係於10% FBS存在下測定。細胞增殖及成長係藉由測定未處理及抗體-藥物結合物處理組之三磷酸腺苷(ATP)活性而評價。癌細胞株係以低密度(來自ATCC之人類乳癌細胞株MDA-MB-453(CLB-22))為750個細胞/孔)懸浮於100μL之各培養基，並接種於96微孔光學底部白色盤(Thermo Scientific/Nunc，#165306)。以含10% FBS(Invitrogen，10270-106)及2mM麩醯胺酸(Invitrogen，25030-024)的RPMI1640培養基(Invitrogen，31870-025)培養。各盤之邊緣之孔以100μL培養基注滿。 培養細胞3日，於抗體-藥物結合物添加前交換成95μL之新鮮培養基。使用抗體-藥物結合物(3)、抗體-藥物結合物(10)、抗體-藥物結合物(13)、抗體-藥物結合物(4)、抗體-藥物結合物(11)、或抗體-藥物結合物(14)，為了測定通常之細胞增殖，放置無處理組作為對照組。 將濃縮20倍濃度的抗體-藥物結合物5μL添加於置入96孔盤之各孔的95μL之培養基(10% FBS)而作成最終濃度。對照組之孔中僅添加5μl培養基。每1樣品以三重複實施。為了算出使細胞之增殖・生存降低50%的抗體-藥物結合物之濃度，抗體-藥物結合物之濃度係以4倍稀釋作成(10μg/mL至0.15ng/mL)，並處理細胞，與無處理組比較ATP活性。添加抗體-藥物結合物後，以7日之培養來評價。為了評價抗體-藥物結合物之活性，利用CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞生存力試驗。此係以ATP活性作為基準測定有代謝活性的活細胞，而最終評估活細胞數的方法，使用作為套組之CellTiter-Glo(註冊商標)發光細胞(Promega，G7573)。將100μL之CellTiter-Glo(註冊商標)試劑添加於96孔盤之各孔，以Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter(程式：發光(luminescence)，測定時間0.5s)測定前，於暗室室溫保存25分鐘至55分鐘。將未接種細胞且僅含培養液的孔，作為空白組。為了測定ATP活性的降低，算出各條件各3孔之平均發光値(Microsoft Excel 2010)。為了去除非細胞依賴的訊號，自抗體-藥物結合物處理的細胞之平均發光値減去空白組平均發光値(Microsoft Excel 2010)。發光降低率(%)係藉由與無處理組之細胞比較而算出(Microsoft Excel 2010)，其値被解釋為細胞增殖・生存抑制率(%)。
結果示於第11~13圖。第11圖呈示抗體-藥物結合物(3)與抗體-藥物結合物(4)之比較的結果，第12圖呈示抗體-藥物結合物(10)與抗體-藥物結合物(11)之比較的結果，第13圖呈示抗體-藥物結合物(13)與抗體-藥物結合物(14)之比較的結果。於各圖，左圖呈示實施3次的試驗之1次中的於10% FBS存在下的來自抗體-藥物結合物之細胞增殖・生存抑制率。縱軸呈示顯示各樣品之ATP活性的發光，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。右圖係將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率以高藥物承載(HDL)與中藥物承載(MDL)加以比較。
高藥物承載及中藥物承載之抗體-藥物結合物係藉由對MDA-MB-453之處理及7日之培養，而抑制細胞增殖・生存。雖已以高藥物承載的結果表示，但中藥物承載之抗體-藥物結合物(11)顯示與抗體-藥物結合物(4)相同程度的高活性。於藥物承載數之比較，高藥物承載數之抗體-藥物結合物係較中藥物承載者顯示較高的ATP降低。以10μg/mL之濃度，高藥物承載數之抗體-藥物結合物(3)顯示68%之抑制率，抗體-藥物結合物(10)顯示76%之抑制率，抗體-藥物結合物(13)顯示56%之抑制率，但於相同濃度，中藥物承載數之抗體-藥物結合物(4)僅顯示44%之抑制，抗體-藥物結合物(11)僅顯示47%之抑制，抗體-藥物結合物(14)僅顯示27%之抑制率。由癌細胞之增殖・生存之50%抑制濃度，高藥物承載數之抗體-藥物結合物較中藥物承載數之抗體-藥物結合物更為優異。高藥物承載數之抗體-藥物結合物(3)或抗體-藥物結合物(10)為了使ATP活性値降低50%，15ng/mL(1nM)之抗體-藥物結合物為必要的，抗體-藥物結合物(13)係至少於試驗的最高濃度使其降低50%，但中藥物承載數之抗體-藥物結合物於評價濃度範圍內1000ng/mL(67nM)以下，未觀察到相當於此的ATP活性降低。由活體外之高藥物承載數與中藥物承載數之比較，暗示即使於活體內，抗體-藥物結合物之對癌細胞增殖的抑制活性亦高藥物承載數較為優異。試驗例 6 抗體 - 藥物結合物 (3) 、 (10) 、 (13) 於人類乳癌抗腫瘤活體內試驗顯示抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為15至20g之5週齡之雌性BALB/C裸鼠。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。將來自ATCC之人類乳癌細胞株HCC1569(CRL-2330)5×106 個，懸浮於將50μL之將PBS與Matrigel(PBS：PAA #H21-002， Matrigel：BD #354230)以1對1混合的調整液中，於BALB/C裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。 體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(maual caliper，OMC Fontana)於1週測定2次，並計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示(於以下之試驗例亦相同)。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第19日，腫瘤徑成為約150mm3 後，使用腫瘤徑將70隻動物實施隨機分成7組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(3)、(10)、(13)及作為對照組之PBS以下述之用量作尾靜脈內投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(3)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(10)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(13)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。
全部之資料係以±SEM之平均値呈現，腫瘤徑及體重係以平均值±SEM評價。全部之資料解析係使用Microsoft Excel 2009(於以下之試驗例亦相同)。
將結果示於第14圖。因超過可容許的最大腫瘤徑，故PBS投予組係於移植後第53日進行安樂死。於全部之抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類乳癌細胞株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少於處置組中並未觀察到。試驗例 7 抗體 - 藥物結合物 (3) 、 (10) 、 (13) 於人類黑色素瘤抗腫瘤試驗顯示抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為22至26g之5至6週齡之雌性NMRI裸鼠。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類黑色素瘤細胞株HT-144(HTB-63)5×106 個，懸浮於將50μL之將PBS與Matrigel(PBS：PAA #H21-002，Matrigel：BD #354230)以1對1混合的調整液中，於NMRI裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。 體重、腫瘤徑之測定、及腫瘤體積之測定、算出係藉由試驗例6記載之方法進行。 於第22日，腫瘤徑成為約150mm3 時，使用腫瘤徑將80隻動物實施隨機分成8組的分組。同日，將U1-59或抗體-藥物結合物(3)、(10)、(13)及作為對照組之PBS以下述之用量作尾靜脈內投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：U1-59，以25mg/kg，每週2次皮下注射。 投予組：抗體-藥物結合物(3)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(10)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(13)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。
將結果示於第15圖。因超過可容許的最大腫瘤徑，故PBS及U1-59投予組係各自於移植後第48日、第52日進行安樂死。於全部之抗體-藥物結合物之投予，與對照組及U1-59投予組比較，觀察到人類黑色素瘤細胞株之腫瘤増殖抑制。試驗例 8 抗體 - 藥物結合物 (3) 、 (10) 、 (13) 於人類乳癌株抗腫瘤試驗顯示抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為17至25.5g之16週齡之雌性SCID裸鼠。小鼠係於換氣籠中室溫及濕度被保持一定。 來自ATCC之人類乳癌細胞株MDA-MB-453(CLB-22)之固態腫瘤，第1次繼代(批次(Batch) 1089)係將MDA-MB-453移植於3隻小鼠(對1隻於2處所，右體側部及左體側部)，13至17週後回收腫瘤片，並冷凍保存。第2次繼代係將第1次繼代之腫瘤片(2×2×2mm)再皮下移植(10隻，對1隻為2處所，右體側部及左體側部)而使其增殖，使其形成7週之腫瘤。將於此形成的腫瘤作成腫瘤片(2×2×2mm，第2次繼代)，移植於SCID裸鼠之右體側部。 體重係藉由體重計量測。將腫瘤之長徑(length)及直徑(diameter)以電子式數位測徑器(Pro-Max 150mm hand-held calipers、Fred V. Fowler Co., Inc)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝π/6×長徑(mm)×[直徑(mm)]2 於第40日，腫瘤徑成為約143mm3 時，將72隻之動物實施隨機分成8組的分組。同日，將U1-59或抗體-藥物結合物(3)、(10)、(13)及作為對照組之PBS以下述之用量作尾靜脈內投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：U1-59，以25mg/kg，每週2次皮下注射。 投予組：抗體-藥物結合物(3)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(10)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(13)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。
將結果示於第16圖。於全部之抗體-藥物結合物之投予，與對照組及U1-59投予組比較，觀察到人類乳癌細胞株之腫瘤増殖抑制。又，小鼠之體重減少於處置組未觀察到。又，於使用人類乳癌細胞株HCC1954或JIMT1-PR10(曲妥珠單抗耐性、帕妥珠單抗耐性、T-DM1耐性)的抗腫瘤試驗，抗體-藥物結合物(16a)呈現活體內抗腫瘤效果。試驗例 9 抗體 - 藥物結合物 (3) 、 (10) 、 (13) 於人類大腸癌株抗腫瘤試驗顯示抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為15至20g之5至6週齡之雌性NMRI裸鼠。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ProQinase之人類大腸癌細胞株HT-29(CPQ-57)4×106 個，懸浮於將PBS與Matrigel (PBS：PAA #H21-002，Matrigel：BD #354230)以1對1混合的調整液中，於NMRI裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。 體重、腫瘤徑之測定、及腫瘤體積之測定、算出係藉由試驗例6記載之方法進行。 於第8日，腫瘤徑成為約150mm3 時，使用腫瘤徑將70隻動物實施隨機分成7組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(3)、(10)、(13)及作為對照組之PBS以下述之用量，作尾靜脈內投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(3)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(10)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(13)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。
將結果示於第17圖。因超過可容許的最大腫瘤徑、或潰瘍形成，故使PBS投予組(10隻中6隻)、抗體-藥物結合物(3)之3mg/kg(10隻中3隻)、10mg/kg(10隻中4隻)、抗體-藥物結合物(10)之3mg/kg(10隻中2隻)、10mg/kg(10隻中2隻)、抗體-藥物結合物(13)之3mg/kg(10隻中2隻)，於移植後第50日進行安樂死。於全部之抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類大腸癌細胞株之腫瘤増殖抑制。又抗體-藥物結合物(13)係顯示較抗體-藥物結合物(3)或抗體-藥物結合物(10)更強的抗腫瘤活性。又小鼠之體重減少於處置組中並未觀察到。試驗例 10 抗體 - 藥物結合物 (3) 、 (10) 、 (13) 於人類肺癌株抗腫瘤試驗顯示抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為24至28g的5至6週齡之雌性CD1裸鼠。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自Cell Line Service之人類肺癌細胞株A549(CRS-300114)5×106 個，懸浮於200μL之將PBS與Matrigel(PBS：PAA #H21-002，Matrigel：BD #354230)以1對1混合的調整液，於CD1裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。 體重、腫瘤徑之測定、及腫瘤體積之測定、算出係藉由試驗例6記載之方法進行。 於第38日腫瘤徑成為約200 mm3 時，使用腫瘤徑將70隻動物實施隨機分成7組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(3)、(10)、(13)及作為對照組之PBS以下述之用量作尾靜脈內投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(3)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(10)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(13)，以3或10mg/kg，每週1次靜脈注射。
將結果示於第18圖。於全部之抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類肺癌細胞株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少於處置組中並未觀察到。試驗例 11 抗體 - 藥物結合物 (13) 於人類三陰性乳癌 (Triple-Negative Breast Cancer) 株抗腫瘤試驗，顯示活體內抗腫瘤效果
三陰性乳癌係指不表現荷爾蒙受體(雌激素受體及助孕酮受體)，又不表現HER2的乳癌。因未表現此等之受體，由於無法利用荷爾蒙治療(他莫昔芬等)或抗HER2治療(曲妥珠單抗、曲妥珠單抗依坦辛、帕妥珠單抗)，故為生存率低的乳癌，現在亦於臨床試驗嘗試許多治療劑。於人類三陰性乳癌株的MDA-MB-468，因確認HER3之表現(資料未呈示)，而評價抗體-藥物結合物之抗腫瘤活性。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類三陰性乳癌細胞株MDA-MB-468(CRL-2322)5×106 個，懸浮於200μL之將PBS與Matrigel(PBS：PAA #10010-023，Matrigel：BD #354234)以1對1混合的調整液，於裸鼠之右體側部，使用29G針，作皮下移植而移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第20日，腫瘤徑成為約170 mm3 時，使用腫瘤徑將18隻動物實施隨機分成3組的分組。同日，將U1-59或抗體-藥物結合物(13)及作為對照組之PBS，以下述之用量作尾靜脈內投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：U1-59，以10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(13)，以10mg/kg，每週1次靜脈注射。
將結果示於第19圖。於抗體-藥物結合物之投予，與對照組及U1-59投予組比較，觀察到人類三陰性乳癌株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 12 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類管腔乳癌株抗腫瘤試驗顯示活體內抗腫瘤效果
人類管腔乳癌係指表現荷爾蒙受體(雌激素受體)，不表現HER2的乳癌。因此等之受體不表現，由於無法利用抗HER2治療(曲妥珠單抗、曲妥珠單抗依坦辛、帕妥珠單抗)，故為生存率低的乳癌，現在亦於臨床試驗嘗試許多治療劑。於人類管腔乳癌株的MCF-7，因已確認HER3之表現(資料未顯示)，而評價抗體-藥物結合物之抗腫瘤活性。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌Athymic裸鼠Nude-Foxn1nu (Proqinase)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將人類管腔乳癌細胞株MCF-7(CRQ-#327)5×106 個，懸浮於200μL之將PBS與Matrigel(PBS：PAA #10010-023，Matrigel：BD #354234)以1對1混合的調整液中，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第11日，腫瘤徑成為約250 mm3 時，使用腫瘤徑將20隻動物實施隨機分成2組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)及作為對照組之PBS以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg，單次靜脈注射。
將結果示於第20圖。於抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類管腔乳癌株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 13 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類黑色素瘤株抗腫瘤試驗顯示活體內抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類黑色素瘤細胞株WM-266-4 (CRL-1676)3×106 個混合・懸浮於Matrigel (BD #354234)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第19日，腫瘤徑成為約220 mm3 時，使用腫瘤徑將8隻動物實施隨機分成2組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、及作為對照組之PBS以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg，單次靜脈注射。
將結果示於第21圖。於抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類黑色素瘤株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。又即使於其他之人類黑色素瘤株C32之抗腫瘤試驗，抗體-藥物結合物(16a)亦呈現活體內抗腫瘤效果。試驗例 14 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類卵巢癌株抗腫瘤試驗顯示活體內抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類卵巢癌細胞株OVCAR-8(HTB-161)5×106 個混合・懸浮於Matrigel(BD #354234)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第21日，腫瘤徑成為約140 mm3 時，使用腫瘤徑將8隻動物實施隨機分成2組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、及作為對照組之PBS以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg，單次靜脈注射。
將結果示於第22圖。於抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類卵巢癌株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 15 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類膀胱癌株抗腫瘤試驗顯示活體內抗腫瘤效果
使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類膀胱癌細胞株SW-780(CRL-2169)8×106 個，混合・懸浮於Matrigel(BD #354234)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第7日，腫瘤徑成為約190 mm3 時，使用腫瘤徑將10隻動物實施隨機分成2組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、及作為對照組之PBS以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg，單次靜脈注射。
將結果示於第23圖。於抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，觀察到人類膀胱癌株之腫瘤増殖抑制。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 16 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類乳癌株抗腫瘤試驗顯示 HER3 依存的活體內抗腫瘤效果
人類乳癌株的MDA-MB-453係表現HER3，如於試驗例8所記載，對抗體-藥物結合物(13)有感受性。然而，因無法證明此藥效係經由HER3所致，故藉由將U1-59事前投予而遮蔽HER3，來評價藥效是否降低。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類乳癌細胞株MDA-MB-453(CLB-22)1×107 個，混合・懸浮於Matrigel(BD #354234)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第11日，腫瘤徑成為約130 mm3 時，使用腫瘤徑將16隻動物實施隨機分成4組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、U1-59及作為對照組之PBS以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次靜脈注射。 投予組：U1-59，以30mg/kg，單次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)、3mg/kg、單次靜脈注射。 投予組：於投予U1-59(單次靜脈注射)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以3mg/kg單次靜脈注射。
將結果示於第24圖。於抗體-藥物結合物之投予，與對照組比較，雖觀察到人類乳癌株之腫瘤増殖抑制，但此腫瘤抑制效果藉由U1-59之事前投予而減弱。由以上證明，由抗體-藥物結合物所致的腫瘤抑制效果係經由HER3的藥效。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 17 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類乳癌株抗腫瘤試驗，呈現與曲妥珠單抗之活體內抗腫瘤併用效果
於人類HER2陽性乳癌之治療藥，曲妥珠單抗已被承認。然而，已知有曲妥珠單抗耐性，已報告於耐性機構之一與PIK3CA之變異〈H1047R， H420R〉有關。於本試驗，評價對於為曲妥珠單抗耐性的乳癌株，曲妥珠單抗與抗體-藥物結合物之併用是否有效果。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類乳癌細胞株MDA-MB-453(CLB-22， PIK3CA H1047R變異)1×107 個，混合・懸浮於Matrigel(PBS：PAA #10010-023，Matrigel：BD #354234)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第11日，腫瘤徑成為約130 mm3 時，使用腫瘤徑將16隻動物實施隨機分成4組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、曲妥珠單抗、兩劑之併用、及作為對照組之PBS，以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次靜脈注射。 投予組：曲妥珠單抗(Roche)，以1mg/kg，單次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)、3mg/kg、單次靜脈注射。 投予組：於投予曲妥珠單抗(Roche)(單次靜脈注射)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以3mg/kg單次靜脈注射。
將結果示於第25圖。於曲妥珠單抗與抗體-藥物結合物投予，與各單劑比較，觀察到於人類乳癌株(PIK3CA H1047R)之抗腫瘤併用效果。由以上顯示，抗體-藥物結合物之藥效係藉由與曲妥珠單抗之併用而增強。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。又即使於其他之人類乳癌株(PIK3CA H1047R)之HCC1954之抗腫瘤試驗，抗體-藥物結合物(16a)亦顯示與曲妥珠單抗之活體內抗腫瘤併用效果。試驗例 18 抗體 - 藥物結合物 (15) 於人類乳癌株抗腫瘤試驗，呈現與曲妥珠單抗之活體內抗腫瘤併用效果
於人類HER2陽性乳癌之治療藥，曲妥珠單抗已被承認。然而，已知有曲妥珠單抗耐性，已報告於耐性機構之一與PIK3CA之變異〈H1047R， H420R〉有關。於本試驗，評價對於為曲妥珠單抗耐性的乳癌株，曲妥珠單抗與抗體-藥物結合物之併用是否有效果。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類乳癌細胞株JIMT-1(ACC-589 PIK3CA H420R變異)5×106 個，懸浮於PBS(PAA #10010-023)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第10日，腫瘤徑成為約200 mm3 時，使用腫瘤徑將24隻動物實施隨機分成4組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(15)、曲妥珠單抗、兩劑之併用、及作為對照組之PBS，以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：曲妥珠單抗(Roche)，以10mg/kg，每週1次靜脈注射。 投予組：抗體-藥物結合物(15)、10mg/kg、每週1次靜脈注射。 投予組：於投予曲妥珠單抗(Roche)(每週1次靜脈注射)30分鐘後，抗體-藥物結合物(15)、以10mg/kg每週1次靜脈注射。
將結果示於第26圖。於曲妥珠單抗與抗體-藥物結合物投予，與各單劑比較，觀察到於人類乳癌株(PIK3CA H420R)之抗腫瘤併用效果。由以上顯示，抗體-藥物結合物之藥效係藉由與曲妥珠單抗之併用而增強。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 19 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類肺癌株抗腫瘤試驗，呈現與吉非替尼之活體內抗腫瘤併用效果
於人類肺癌之治療藥，吉非替尼已被承認。於本試驗，評價吉非替尼與抗體-藥物結合物之併用是否有效果。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類肺癌細胞株PC-9(RCB0446)3×106 個，懸浮於PBS(PAA #10010-023)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，而進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第14日，腫瘤徑成為約270 mm3 時，使用腫瘤徑將16隻動物實施隨機分成4組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、吉非替尼、兩劑之併用、及作為對照組之PBS，以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，每週1次靜脈注射。 投予組：吉非替尼(Astra Zeneca)、以6mg/kg，每日1次經口投予。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)、10mg/kg、每週1次靜脈注射。 投予組：於投予吉非替尼(Astra Zeneca)(每日1次經口投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg每週1次靜脈注射。
將結果示於第27圖。於吉非替尼與抗體-藥物結合物投予，與各單劑比較，觀察到於人類肺癌株之抗腫瘤併用效果。由以上顯示，抗體-藥物結合物之藥效係藉由與吉非替尼之併用而增強。又小鼠之體重減少係於任一處置組皆未被觀察到。試驗例 20 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類三陰性乳癌株抗腫瘤試驗，顯示與西妥昔單抗及帕尼單抗之活體內抗腫瘤併用效果
對人類三陰性乳癌，已實施為抗EGFR抗體的西妥昔單抗或帕尼單抗之臨床試驗。於本試驗，評價西妥昔單抗或帕尼單抗與抗體-藥物結合物之併用是否有效果。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類三陰性乳癌細胞株MDA-MB-468(CRL-2322)5×106 個，懸浮於200μL之將PBS與Matrigel(PBS：PAA #10010-023，Matrigel：BD #354234)以1對1混合的調整液中，使用29G針，皮下移植於裸鼠之右體側部。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第21日腫瘤徑成為約160 mm3 時，使用腫瘤徑將30隻動物實施隨機分成6組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、西妥昔單抗、帕尼單抗、兩劑之併用、及作為對照組之PBS，以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次投予。 投予組：西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)，以10mg/kg，單次投予。 投予組：帕尼單抗(AMGEN)，以10mg/kg，單次投予。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)，10mg/kg、單次投予。 投予組：於投予西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)(單次投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg單次投予。 投予組：於投予帕尼單抗(AMGEN)(單次投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg單次投予。
將結果示於第28圖。於西妥昔單抗(A)或帕尼單抗(B)與抗體-藥物結合物投予，與各單劑比較，觀察到於人類三陰性乳癌株之抗腫瘤併用效果。以上顯示，抗體-藥物結合物之藥效係藉由與西妥昔單抗或帕尼單抗之併用而增強。又小鼠之體重減少係於任一處置組皆未觀察到。又即使使用其他之人類三陰性乳癌株MDA-MB-231，抗體-藥物結合物(16a)藉由與西妥昔單抗或帕尼單抗之併用而亦顯示抗腫瘤併用效果。試驗例 21 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於人類頭頸部癌株抗腫瘤試驗，呈現與西妥昔單抗及帕尼單抗之活體內抗腫瘤併用效果
對人類頭頸部癌，為抗EGFR抗體的西妥昔單抗已被承認，又已實施帕尼單抗之臨床試驗。於本試驗，評價西妥昔單抗或帕尼單抗與抗體-藥物結合物之併用是否有效果。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自ATCC之人類頭頸部癌細胞株Fadu(HTB-43)4×106 個，懸浮於200μL之PBS(PAA #10010-023)，於裸鼠之右體側部，使用29G針，進行皮下移植。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第6日腫瘤徑成為約330 mm3 時，使用腫瘤徑將30隻動物實施隨機分成6組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、西妥昔單抗、帕尼單抗、兩劑之併用、及作為對照組之PBS，以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次投予。 投予組：西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)，以5mg/kg，單次投予。 投予組：帕尼單抗(AMGEN)，以5mg/kg，單次投予。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)、10mg/kg、單次投予。 投予組：於投予西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)(單次投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg單次投予。 投予組：於投予帕尼單抗(AMGEN)(單次投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)以10mg/kg單次投予。
將結果示於第29圖。於西妥昔單抗(A)或帕尼單抗(B)與抗體-藥物結合物投予，與各單劑比較，觀察到於人類頭頸部癌株之抗腫瘤併用效果。由以上顯示，抗體-藥物結合物之藥效係藉由與西妥昔單抗或帕尼單抗之併用而增強。又小鼠之體重減少係於任一處置組中皆未被觀察到。試驗例 22 抗體 - 藥物結合物 (16a) 於胃癌患者腫瘤之移植抗腫瘤試驗，呈現與西妥昔單抗及帕妥珠單抗之活體內抗腫瘤併用效果。
對人類胃癌，已實施為抗EGFR抗體的西妥昔單抗、及抗HER2抗體之帕妥珠單抗之臨床試驗。於本試驗，評價西妥昔單抗與帕妥珠單抗與抗體-藥物結合物之併用是否有效果。又並非使用通常之人類癌株的評價系統，而藉由將來自患者之腫瘤移植於小鼠而進行抗腫瘤試驗，以於包含患者之間質的接近臨床的狀態來實施評價。 使用馴化後之體重為15至20g，5-6週齡之雌CAnN．Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj[Foxn1nu/Foxn1nu]裸鼠(日本Charles River公司)。小鼠於換氣籠(IVC，各籠最大4隻)，室溫及濕度被保持一定。隨機化後，每隔1日測量小鼠體重，記錄每日動物之行動。 將來自獨立行政法人・醫藥基盤研究所(National Institute of Biomedical Innovation)之來自胃癌患者的腫瘤NIBIO-G016皮下移植於裸鼠之右體側部。體重藉由體重計(Mettler Toledo PB602-L)量測。 腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX、Mitsutoyo Corp)測定，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )＝1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2 於第56日腫瘤徑成為約220 mm3 時，使用腫瘤徑將30隻動物實施隨機分成6組的分組。同日，將抗體-藥物結合物(16a)、西妥昔單抗、帕妥珠單抗、兩劑之併用、及作為對照組之PBS，以下述之用量投予。
投予組：將PBS，以與抗體-藥物結合物相同容量，單次投予。 投予組：西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)，以10mg/kg，單次投予。 投予組：帕妥珠單抗(Roche)，以10mg/kg，單次投予。 投予組：抗體-藥物結合物(16a)、10mg/kg、單次投予。 投予組：於投予西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)(單次投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg單次投予。 投予組：於投予帕妥珠單抗(Roche)(單次投予)30分鐘後，抗體-藥物結合物(16a)，以10mg/kg單次投予。
將結果示於第30圖。於西妥昔單抗(A)或帕妥珠單抗(B)與抗體-藥物結合物投予，與各單劑比較，觀察到於來自胃癌患者的腫瘤模式之抗腫瘤併用效果。由以上，於來自癌患者之腫瘤模式中顯示抗體-藥物結合物之藥效藉由與西妥昔單抗或帕尼單抗之併用而增強者。又小鼠之體重減少係於任一個處置組皆未被觀察到。又，即使於使用人類胰臓癌細胞株BxPC3的抗腫瘤試驗，抗體-藥物結合物(13)與PBS投予之對象組或U1-59投予組比較，亦顯示強的抗腫瘤效果。又，即使於使用獲得曲妥珠單抗及帕妥珠單抗之併用之耐性或對曲妥珠單抗依坦辛之耐性的HER2陽性乳癌細胞株JIMT1的活體內抗腫瘤模式，其抗體-藥物結合物亦呈現強的抗腫瘤效果。試驗例 23 抗體 - 藥物結合物之於非人類動物之安全性
本發明之抗HER3抗體-藥物結合物及含其之醫藥組成物係作為疾病之治療或預防劑之安全性優異。例如，將抗體-藥物結合物(5)、(10)或(13)以最大30mg/kg、以每週1次之間隔，投予為交叉種的大鼠共計2次，觀察至最終投予後7日的結果，於任一者之抗體-藥物結合物皆未觀察到嚴重的毒性。又，將抗體-藥物結合物(5)、(10)或(13)以最大30mg/kg，單次投予為交叉種的猴而觀察7日的結果，於任一者之抗體-藥物結合物皆未觀察到顯著毒性。 又，對猴投予複數次〈3週間隔〉而觀察的結果，於任一者之抗體-藥物結合物亦未觀察到顯著毒性。如此，本發明之抗體-藥物結合物係具備作為疾病之治療或預防用之醫藥組成物之優異安全性。 [序列表之非關鍵詞文字(Sequence Listing Free Text)]
序列識別號1：編碼抗HER3人類抗體U1-39重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號2：抗HER3人類抗體U1-39重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號3：編碼抗HER3人類抗體U1-39輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號4：抗HER3人類抗體U1-39輕鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號5：編碼抗HER3人類抗體U1-40重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號6：抗HER3人類抗體U1-40重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號7：編碼抗HER3人類抗體U1-40輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號8：抗HER3人類抗體U1-40輕鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號9：編碼抗HER3人類抗體U1-38重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號10：抗HER3人類抗體U1-38重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號11：編碼抗HER3人類抗體U1-38輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號12：抗HER3人類抗體U1-38輕鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號13：編碼抗HER3人類抗體U1-41重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號14：抗HER3人類抗體U1-41重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號15：編碼抗HER3人類抗體U1-41輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號16：抗HER3人類抗體U1-41輕鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號17：編碼抗HER3人類抗體U1-42重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號18：抗HER3人類抗體U1-42重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號19：編碼抗HER3人類抗體U1-42輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號20：抗HER3人類抗體U1-42輕鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號21：編碼抗HER3人類抗體U1-43重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號22：抗HER3人類抗體U1-43重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號23：編碼抗HER3人類抗體U1-43輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號24：抗HER3人類抗體U1-43輕鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號25：編碼抗HER3人類抗體U1-44重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 序列識別號26：抗HER3人類抗體U1-44重鏈可變區之胺基酸序列 序列識別號27：編碼抗HER3人類抗體U1-44輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列 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序列識別號565：抗HER3人類抗體U1-59輕鏈CDRL1胺基酸序列 序列識別號566：抗HER3人類抗體U1-59輕鏈CDRL2胺基酸序列 序列識別號567：抗HER3人類抗體U1-59輕鏈CDRL3胺基酸序列 序列識別號568：抗HER3人類抗體U1-61.1重鏈CDRH1胺基酸序列 序列識別號569：抗HER3人類抗體U1-61.1重鏈CDRH2胺基酸序列 序列識別號570：抗HER3人類抗體U1-61.1重鏈CDRH3胺基酸序列 序列識別號571：抗HER3人類抗體U1-61.1輕鏈CDRL1胺基酸序列 序列識別號572：抗HER3人類抗體U1-61.1輕鏈CDRL2胺基酸序列 序列識別號573：抗HER3人類抗體U1-61.1輕鏈CDRL3胺基酸序列 序列識別號574：抗HER3人類抗體U1-61重鏈CDRH1胺基酸序列 序列識別號575：抗HER3人類抗體U1-61重鏈CDRH2胺基酸序列 序列識別號576：抗HER3人類抗體U1-61重鏈CDRH3胺基酸序列 序列識別號577：抗HER3人類抗體U1-62重鏈CDRH1胺基酸序列 序列識別號578：抗HER3人類抗體U1-62重鏈CDRH2胺基酸序列 序列識別號579：抗HER3人類抗體U1-62重鏈CDRH3胺基酸序列 序列識別號580：抗HER3人類抗體U1-62輕鏈CDRL1胺基酸序列 序列識別號581：抗HER3人類抗體U1-62輕鏈CDRL2胺基酸序列 序列識別號582：抗HER3人類抗體U1-62輕鏈CDRL3胺基酸序列 序列識別號583：抗HER3人類抗體U1-59重鏈之全長胺基酸序列 序列識別號584：抗HER3人類抗體U1-59輕鏈之全長胺基酸序列
無。
第1圖呈示抗HER3人類抗體U1-59重鏈之全長胺基酸序列(序列識別號583)。 第2圖呈示抗HER3人類抗體U1-59輕鏈之全長胺基酸序列(序列識別號584)。 第3圖呈示以U1-59或抗體-藥物結合物之連續稀釋液處理的HCC1569之平均螢光強度。藉由GraphPad Prism軟體，算出KD與Bmax値。 第4圖將A549細胞與U1-59或各種抗體-藥物結合物一起培養2日。藉由西方氏轉漬法(Western blotting)評價HER3或磷酸化HER3。檢測泛-肌動蛋白(pan-Actin)作為電泳對照組。 第5圖呈示由U1-59或抗體-藥物結合物處理(37℃，1小時)所致之HCC1569細胞表面的HER3表現降低之平均値。 第6圖呈示於人類乳癌株(HCC 1569)之由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制試驗之結果。 A：呈示於10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存。數據係呈現三重複之平均±標準誤差。縱軸呈示成為各樣品之ATP活性的發光値，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。 B：呈示將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率。 第7圖呈示於人類乳癌株(MDA-MB 453)之由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制試驗的結果。 A：呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存。縱軸呈示成為各樣品之ATP活性的發光値，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。 B：呈示將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率。 第8圖呈示於人類黑色素瘤株(A375)之由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制試驗之結果。 A：呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存。縱軸呈示成為各樣品之ATP活性的發光値，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。 B：呈示將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率。 第9圖呈示於人類大腸癌株(HT 29)之由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制試驗之結果。 A：呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存。縱軸呈示成為各樣品之ATP活性的發光値，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。 B：呈示將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率。 第10圖呈示於人類肺癌株(A 549)之由HER3抗體-藥物結合物所致的增殖・生存訊息之抑制試驗之結果。 A：呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存。縱軸呈示成為各樣品之ATP活性的發光値，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。 B：呈示將無處理組作為100%的情形之由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率。 第11圖呈示抗體-藥物結合物(3)與抗體-藥物結合物(4)之細胞增殖・生存抑制率之比較結果。左圖係呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存抑制率。縱軸呈示顯示各樣品之ATP活性的發光，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。右圖係將無處理組作為100%的情形，將由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率以高藥物承載(HDL)與中藥物承載(MDL)加以比較。 第12圖呈示抗體-藥物結合物(10)與抗體-藥物結合物(11)之細胞增殖・生存抑制率之比較結果。左圖係呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物之細胞增殖・生存抑制率。縱軸呈示顯示各樣品之ATP活性的發光，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。右圖係將無處理組作為100%的情形，將由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率以高藥物承載(HDL)與中藥物承載(MDL)加以比較。 第13圖呈示抗體-藥物結合物(13)與抗體-藥物結合物(14)之細胞增殖・生存抑制率之比較結果。左圖係呈示10% FBS存在下之來自抗體-藥物結合物的細胞增殖・生存抑制率。縱軸呈示顯示各樣品之ATP活性的發光，橫軸呈示各抗體-藥物結合物之濃度。數據係呈示三重複之平均±標準誤差。右圖係將無處理組作為100%的情形，將由抗體-藥物結合物處理所致的發光降低率以高藥物承載(HDL)與中藥物承載(MDL)加以比較。 第14圖呈示使用抗體-藥物結合物(3)、(10)、或(13)的人類乳癌(HCC1569)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，使用Microsoft Excel 2009來解析。 第15圖呈示使用抗體-藥物結合物(3)、(10)、或(13)的人類黑色素瘤(HT-144)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，使用Microsoft Excel 2009而解析。 第16圖呈示使用抗體-藥物結合物(3)、(10)、或(13)的人類乳癌(MDA-MB-453)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，使用Microsoft Excel 2009而解析。 第17圖呈示使用抗體-藥物結合物(3)、(10)、或(13)的人類大腸癌株(HT-29)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，使用Microsoft Excel 2009而解析。 第18圖呈示使用抗體-藥物結合物(3)、(10)、或(13)的人類肺癌株(A549)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，使用Microsoft Excel 2009而解析。 第19圖呈示使用抗體-藥物結合物(13)的人類三陰性(triple-negative)乳癌株(MDA-MB-468)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，使用Microsoft Excel 2009而解析。 第20圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類管腔乳癌株(MCF-7)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第21圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類黑色素瘤株(WM-266-4)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第22圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類卵巢癌株(OVCAR-8)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第23圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類膀胱癌株(SＷ-780)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第24圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類乳癌株(MDA-MB-453)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第25圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類乳癌株(MDA-MB-453)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第26圖呈示使用抗體-藥物結合物(15)的人類人類乳癌株(JIMT-1)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第27圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類肺癌株(PC9)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第28圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類三陰性乳癌株(MDA-MB-468)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第29圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)的人類頭頸部癌株(Fadu)抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。 第30圖呈示使用抗體-藥物結合物(16a)之使用來自人類胃癌患者的腫瘤片(NIBIO-G016)的抗腫瘤試驗之結果。縱軸表示平均腫瘤體積，橫軸表示細胞移植後之日數。全部的値係以平均±標準誤差表示。初期腫瘤體積及初期小鼠重量係使用記述的數據(平均及標準誤差)，並使用Microsoft Excel 2009解析。
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無。

Claims (8)

  1. 一種通過硫醚鍵而結合下列之藥物-連接物(drug-linker)結構之抗體-藥物結合物之製造方法， 藥物-連接物結構： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)， 其特徵為將抗HER3抗體於還原條件下處理後，與下列之化合物反應： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)， (式中，(順丁烯二醯亞胺-N-基)-為下式所示的氮原子為結合部位的基：
    Figure 03_image155
    ， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-為下式所示的結構：
    Figure 03_image157
    ， 於其3位與抗體結合，於1位之氮原子上與含其的連接物結構內之亞甲基結合， -(NH-DX)表示下式之1位之胺基之氮原子成為結合部位的基：
    Figure 03_image159
    ， -GGFG-表示-Gly-Gly-Phe-Gly-之四胜肽殘基)。
  2. 如請求項1之製造方法，其中藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2至8個之範圍。
  3. 如請求項1之製造方法，其中藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為3至8個之範圍。
  4. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中抗HER3抗體各自於重鏈及輕鏈含有U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9之CDRH1至H3及CDRL1至L3。
  5. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中抗HER3抗體各自於重鏈及輕鏈含有U1-49、U1-53、U1-59、U1-7或U1-9之重鏈可變區及輕鏈可變區。
  6. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中抗HER3抗體各自於重鏈及輕鏈含有序列識別號42及44、54及56、70及72、92及94、或96及98所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中抗HER3抗體各自於重鏈及輕鏈含有序列識別號583及584所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項7之製造方法，其中抗HER3抗體之重鏈羧基末端之離胺酸殘基缺失。
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