TW201518323A - 合成ａｐｅｌｉｎ多肽之生物結合物 - Google Patents

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Shari L Caplan
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Carla Guimaraes
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Abstract

本發明提供一種包含式I'之合成多肽的生物結合物： □或其醯胺、酯或鹽，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12及X13係如本文所定義及半衰期延長部分，其中該肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。該多肽為APJ受體之促效劑。本發明亦關於一種用於製造本發明之生物結合物之方法，及其治療性用途，諸如治療或預防急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群(Brugada syndrome)、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、外傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。本發明另外提供藥理學活性劑之組合與醫藥組合物。

Description

合成APELIN多肽之生物結合物
本發明係關於包含半合成生物分子之組合物，該等半合成生物分子為APJ促效劑多肽及半衰期延長部分之生物結合物。詳言之，本發明之生物結合物展現與其對應裸多肽相比對經由肽酶作用之蛋白降解的較大抗性。本發明另外關於製造該組合物及使用該等組合物作為醫藥活性劑治療心血管疾病的方法。
西方世界之心臟衰竭發病率為約1/100之65歲後之成人。最常見病變為心肌收縮性之慢性短缺及因此隨時間推移心輸出量(亦即由任一心室排出之有效血液容量)之慢性短缺。慢性心臟衰竭患者可具有急性失代償發作，亦即心臟無法維持足夠血液循環，其中心肌收縮性進一步衰退。僅美國每年存在約500K「急性失代償心臟衰竭」(ADHF)住院患者。
針對ADHF之現有療法包括利尿劑、血管擴張劑及收縮影響劑，其直接增加心肌收縮性。現有靜脈內收縮影響劑(多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、米利酮(milrinone)、左西孟旦(levosimendan))用於急性設定，儘管其與諸如心律不整及長期死亡率增加之不利事件相關聯。此等傾向已阻止其應用於慢性心臟衰竭。地高辛為口服收縮影響劑，但受治療指數狹窄、致心律不整可能性增加及腎功能不全之禁忌限制。
增加心肌收縮性而無致心律不整或死亡傾向之心臟衰竭療法為ADHF迫切需要的，但亦可解決慢性心臟衰竭之未滿足的巨大醫藥需求。
Apelin為先前孤兒G蛋白偶合受體(GPCR)之內源性配位體APJ，亦稱為Apelin受體、類血管收縮素-1受體、類血管收縮素II-1受體及其類似物。Apelin/APJ路徑廣泛表現於心血管系統中且Apelin已在臨床前模型中展示重要的有利心血管效應。人類之急性Apelin投與造成周邊及冠狀動脈血管擴張且增加心輸出量(Circulation.2010；121：1818-1827)。因此，APJ促效作用作為心臟衰竭患者之重要治療目標出現。咸信Apelin受體APJ之活化增加心肌收縮性且提供心肌保護，而無當前療法之傾向。然而，天然Apelin顯示出極短活體內半衰期及作用持續時間。極短半衰期為由於經由肽酶作用之快速血清清除及蛋白水解降解而公認的遞送該等治療性內源肽的重要難題。
目前已用於克服此缺點之一種方法為向患者投與大劑量所關注之治療性肽，以使得即使一些治療性肽降解仍保留足夠治療上有效的。然而，此方法對於患者而言為不適的。由於大部分治療性肽不能經口投與，故治療性肽將必須不斷注入、藉由靜脈內注射頻繁注入或藉由不便的皮下注射途徑頻繁投與。對頻繁投與的需要亦導致許多可能的肽治療劑具有不可接受的高預計治療成本。大量降解肽之存在亦可產生不希望有的副作用。
投與不適及高成本為大部分具有引入關注之生物活性概況的治療性肽無法作為藥物候選物開發的兩個原因。
因此，延長肽之半衰期之一種方法為以一定方式修飾治療性肽使其降解減慢同時仍維持生物活性。該等以合成方式修飾之多肽已描述於未公開之美國專利申請案第13/747,621號(PAT054961-US-NP)中。另一方法包括藉由使肽結合於阻止其經由腎臟消除之分子而降低 清除速率。然而，該等生物結合物可仍對蛋白酶活性敏感。
因此，需要半衰期延長之經修飾治療性肽以便提供較長活體內作用持續時間，同時維持低毒性，仍保留經修飾肽之治療性優勢。
本發明係關於藉由修飾所關注之治療性肽或多肽(亦即APJ促效劑)克服體內肽降解之問題。
因此，本發明之目標為提供新穎生物結合物或其多聚體，包含a)適用作APJ促效劑之肽或多肽；及b)半衰期延長部分；其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
本發明之生物結合物具有優於野生型Apelin及其他已知Apelin類似物之以下改良中之至少一者：半衰期增加；在投與後及/或在溶解後降解免疫性較大；及構形限制增加，同時全部顯示出與野生型Apelin相同或較大的生物活性。本發明之肽及多肽因此特別適用於治療或預防心血管疾病，諸如心臟衰竭、與心臟衰竭相關之病症及病狀及對APJ受體活性之活化有反應之病症及病狀。
在一個實施例中，本發明之生物結合物特別適用於治療或預防與心臟衰竭相關之病症或病狀或對APJ受體活性之活化(或促效作用)有反應之病症。在另一實施例中，本發明之生物結合物適用於治療急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群(Brugada syndrome)、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、外傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
本發明係關於肽或多肽與半衰期延長部分之生物結合物，其醫藥組合物，及其製造及使用方法，如本文所描述。
形成生物結合物之肽或多肽之實例包括根據式I至IX中之任一者之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，以及本文包括(但不限於)實驗性實例特定列舉之任何肽或或多肽。
本發明因此提供一種生物結合物或其多聚體，其包含：a. 式(I')之肽或多肽：
其中：X1為多肽之N端且為不存在的或係選自pE、R、Isn、Q、A、K及5-胺基-戊酸；X2為R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK、F、E或Orn；X3為P、A、a、p、4-PhP、K、D、哌啶甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X4為R、A、r、N-Me-R、F、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X5為L、Cha、A、D-L、N-Me-L、K、D、4-PhF或F；X6及X12獨立地為選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6及X12之側鏈經由共價鍵連接在一起形成單硫鍵(-S-)、二硫鍵(-S-S-)或醯胺鍵(-NHC(O)-或-C(O)-NH-)；或者X6為K，X13不存在且X12為F或f，其中X12之C端與X6之胺基側鏈一起形成醯胺鍵；X7為H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X3位之半胱胺酸之側鏈或與X4位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X8為K、k、F、f、A、hF、N-Me-R、E或4-胺基-Isn；X9為G、N-Me-G、A、D、L、R或Aib； X10為P、A、p、4-PhP或哌啶甲酸，X11為M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K、3-PyA或Cha；及X13為C端且為不存在的或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap、H及E；其中：Nle為L-正白胺酸；D-hC為D-高半胱胺酸hC為L-高半胱胺酸；hF為L-高苯丙胺酸；hK為L-離胺酸；Nal為L-萘基丙胺酸；Orn為鳥胺酸；Aib為α-胺基異丁酸；Dab為(S)-二胺基丁酸；Dap為(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)為甲硫胺酸碸；Cha為(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn為4-胺基哌啶-4-甲酸；Isn為異哌啶甲醯基；pE為L-焦麩胺酸；3-PyA為3-(3-吡啶基)-L-丙胺酸；4-PhF為4-苯基-L-苯丙胺酸；其中N端及C端視情況連同1、2、3或4個甘胺酸胺基酸形成環；及或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽；及 b. 半衰期延長部分；其中該肽或多肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
如本文所進一步解釋，技術公認的三個字母或一個字母縮寫用以表示構成本發明之肽及多肽之胺基酸殘基。除了當前面有「D」時，胺基酸為L-胺基酸。當一個字母縮寫為大寫字母時，其係指L-胺基酸。當一個字母縮寫為小寫字母時，其係指D-胺基酸。
以上列舉之本文所述之式I或其相關式(例如式I、II至IX)之胺基酸殘基中之任一者可以保守方式經取代，提供仍保留功能活性及結構特性(例如半衰期延長、避免降解、構形限制)之本發明之生物結合物。許用保守胺基酸取代之原則及實例進一步解釋於本文中。
本發明之半衰期延長部分可與肽或多肽類似物共價融合、連接、連接或結合。半衰期延長部分可為例如聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)、膽固醇基團、碳水化合物或寡醣；脂肪酸或結合於救助受體之任何天然或合成蛋白質、多肽或肽。較佳地，半衰期延長部分視情況經由連接子與具有長血清半衰期之血漿蛋白(白蛋白及免疫球蛋白)共價連接。在其他實施例中，半衰期延長部分為白蛋白結合殘基。如本文所用，「白蛋白結合殘基」意指與人類血清白蛋白非共價結合之殘基。在一個實施例中，白蛋白結合殘基為親脂性殘基。在另一實施例中，白蛋白結合殘基在生理pH值下帶負電荷。白蛋白結合殘基通常包含可帶負電荷之羧酸。白蛋白結合殘基之實例包括脂肪酸。在其他實施例中，半衰期延長部分為IgG恆定結構域或其片段(例如Fc區)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽。較佳地，生物結合物之半衰期延長部分為人類血清白蛋白或Fc區。最佳地，生物結合物之半衰期延長部分為Fc區。
半衰期延長部分以一定方式連接以便增強及/或不干擾本發明之 生物結合物之成分部分，例如本文所述之式I'或其相關式(式I-IX)之肽或多肽之生物功能。在一些實施例中，本發明之多肽可視情況經由連接子與半衰期延長部分融合。半衰期延長部分可為蛋白質，諸如IgG恆定結構域或其片段(例如Fc區)、人類血清白蛋白(HSA)、脂肪酸或白蛋白結合多肽。本文所揭示之該等蛋白質亦可形成多聚體。
在一些實施例中，半衰期延長部分(例如HSA、Fc、脂肪酸等)與式I'或I-IX中之肽或多肽的N端共價連接或融合。在其他實施例中，半衰期延長部分(例如HSA、Fc、脂肪酸等)與本發明之式I'或I-IX之肽或多肽的C端共價連接或融合。
本發明之生物結合物經由APJ受體之活化而具有治療急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、外傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症之效用。
在一個較佳實施例中，本發明之生物結合物適用於治療急性失代償心臟衰竭(ADHF)。
在另一實施例中，本發明係關於一種用於治療對APJ受體活化有反應之病症或疾病的方法，在需要該治療之個體中，包含：向該個體投與有效量之本發明之生物結合物，以便治療該個體之對APJ受體之活化有反應之病症或疾病。
在另一實施例中，本發明係關於醫藥組合物，包含本發明之生物結合物及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在另一實施例中，本發明係關於組合，包括本發明之生物結合物及一或多種治療活性劑之醫藥組合。
在另一實施例中，本發明係關於一種用於活化有需要之個體之APJ受體的方法，包含：向該個體投與治療有效量之本發明之生物結合物。
本發明之此等及其他態樣將在以下【實施方式】中加以闡明。
定義
出於解釋本說明書之目的，除非另外規定，否則以下定義將適用且只要適當，單數形式使用之術語亦包括複數個且反之亦然。
如本文所用，「對APJ受體調節有反應之病症或疾病」、「對APJ調節有反應之病症及病狀」、「對APJ受體活性調節有反應之病症及病狀」、「對APJ受體活性之活化(或促效作用)有反應之病症」及類似術語包括急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、外傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
如本文所用，「APJ受體活性之活化」或「APJ受體之活化」係指APJ受體活性增加。APJ受體活性之活化亦稱為APJ受體「促效作用」，例如藉由投與本發明之肽及多肽。
如本中所用，術語「多肽」及「肽」可互換使用以指代兩個或兩個以上胺基酸連接在一起。除下表1中陳述之不常見或非天然胺基酸的縮寫之外，技術公認的三個字母或一個字母縮寫用以表示構成本發明之肽及多肽的胺基酸殘基。除了當前面有「D」時，胺基酸為L- 胺基酸。當一個字母縮寫為大寫字母時，其係指D-胺基酸。當一個字母縮寫為小寫字母時，其係指L-胺基酸。群或串或胺基酸縮寫用以表示肽。肽經指定N端在左側且自N端至C端書寫序列。
本發明之肽含有非天然胺基酸(亦即不存在於自然界中之化合物)及如此項技術中已知可替代使用之其他胺基酸類似物。
某些非天然胺基酸可藉由Deiters等人，J Am Chem Soc 125：11782-11783,2003；Wang及Schultz,Science 301：964-967,2003；Wang等人，Science 292：498-500,2001；Zhang等人，Science 303：371-373,2004或美國專利第7,083,970號中所述之技術引入。簡言之，一些此等表現系統涉及定點突變誘發以將無意義密碼子(諸如琥珀TAG)引入編碼本發明多肽之開放閱讀框架中。該等表現載體接著引入可利用特異性針對所引入之無意義密碼子且用所選非天然胺基酸填充之tRNA之宿主中。對使部分與本發明之多肽結合之目的有益的特定非天然胺基酸包括具有乙炔及疊氮基側鏈之彼等非天然胺基酸。
本發明之肽中之一或多個天然或非天然胺基酸可例如藉由添加以下化學個體加以修飾，諸如碳水化合物基、磷酸酯基、法呢基、異法呢基、脂肪酸基(CqHq+1C(O)2H，其中q為3至20)、用於結合、官能化或其他修飾之連接子等。該等修飾可以位點特異性或非位點特異性方式進行。在一個較佳實施例中，肽之修飾產生較穩定的肽(例如顯示出較大活體內半衰期之肽)。此等修飾可包括併入額外D-胺基酸等。修飾中無一者將實質上干擾肽之所需生物活性，但該等修飾可賦予肽所需特性，例如增強的生物活性。
該等修飾增強本發明蛋白質相對於野生型蛋白質之生物特性，以及在一些情況下，充當例如標記及蛋白質半衰期延長劑之連接點及用於使該等變異體固定於固體支撐物表面之目的。
在某些實施例中，該等修飾(例如位點特異性修飾)用以連接例如 PEG基之半衰期延長部分至本發明之多肽及/或肽，用於例如延長半衰期或以其他方式改良該等多肽及/或肽之生物特性的目的。該等技術進一步描述於本文中。
在其他實施例中，該等修飾(例如位點特異性修飾)用以連接延長本發明多肽之半衰期的其他聚合物及小分子及重組蛋白質序列。一個此類實施例包括脂肪酸或特異性白蛋白結合化合物連接於多肽及/或肽。在其他實施例中，修飾在特定胺基酸類型處進行且可連接在多肽上之一或多個位點。
在其他實施例中，該等修飾(例如位點特異性修飾)用作產生野生型及/或變異多聚體，例如二聚體(均二聚體或雜二聚體)或三聚體或四聚體之連接方式。此等多聚蛋白質分子可另外具有在胺基端或在羧基端與諸如Fc、人類血清白蛋白(HSA)等之其他蛋白質連接或融合的基團，諸如PEG、糖及/或PEG-膽固醇結合物。
在其他實施例中，該等位點特異性修飾用以產生蛋白質、多肽及/或肽，其中位點特異性併入吡咯離胺酸或吡咯離胺酸類似物或非天然存在之胺基酸(對乙醯基-Phe、對疊氮基-Phe)之位置使得該等蛋白質、多肽及/或肽可受控定向及連接於固體支撐物之表面上或具有連接之諸如PEG、糖及/或PEG-膽固醇結合物之基團。
在其他實施例中，該等位點特異性修飾用於位點特異性交聯蛋白質、多肽及/或肽，由此形成雜寡聚物，包括(但不限於)雜二聚體及雜三聚體。在其他實施例中，該等位點特異性修飾用於位點特異性交聯蛋白質、多肽及/或肽，由此形成蛋白質-蛋白質結合物、蛋白質-多肽結合物、蛋白質-肽結合物、多肽-多肽結合物、多肽-肽結合物或肽-肽結合物。在其他實施例中，位點特異性修飾可包括分支點以允許一種類型以上之分子連接在蛋白質、多肽或肽之單個位點。
在其他實施例中，本文中列舉之修飾可以非位點特異性方式進 行且產生本發明之蛋白質-蛋白質結合物、蛋白質-多肽結合物、蛋白質-肽結合物、多肽-多肽結合物、多肽-肽結合物或肽-肽結合物。
一般熟習此項技術者應理解，可在本文所述之任何多肽之序列中進行各種胺基酸取代，例如保守胺基酸取代，而不一定降低其活性。如本文所用，「常用作其取代物之胺基酸」包括保守取代(亦即用具有類似化學特徵之胺基酸取代)。出於保守取代之目的，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甘胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。極性(親水性)、中性胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩胺醯胺。帶正電荷之(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電荷之(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。胺基酸取代之實例包括用L-胺基酸取代其對應D-胺基酸、用半胱胺酸取代高半胱胺酸或其他具有含硫醇側鏈之非天然胺基酸、用離胺酸取代高離胺酸、二胺基丁酸、二胺基丙酸、鳥胺酸或其他具有含胺基側鏈之非天然胺基酸、或用丙胺酸取代正纈胺酸或其類似物。
如本文所用之術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸、非天然胺基酸、以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物，全部呈其D及L立體異構體形式(若其結構提供該等立體異構形式)。胺基酸在本文中藉由其名稱、其一般已知的三字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議之一字母符號來提及。
術語「天然存在」係指在自然界中發現且未由人類操控之物質。類似地，如本文所用，「非天然存在」、「非天然」及其類似物係指未在自然界中發現或已由人類進行結構修飾或合成之物質。當與胺基酸相連使用時，術語「天然存在」係指20種習知胺基酸(亦即丙胺酸(A或Ala)、半胱胺酸(C或Cys)、天冬胺酸(D或Asp)、麩胺酸(E或Glu)、苯丙胺酸(F或Phe)、甘胺酸(G或Gly)、組胺酸(H或His)、異白 胺酸(I或Ile)、離胺酸(K或Lys)、白胺酸(L或Leu)、甲硫胺酸(M或Met)、天冬醯胺(N或Asn)、脯胺酸(P或Pro)、麩胺醯胺(Q或Gln)、精胺酸(R或Arg)、絲胺酸(S或Ser)、蘇胺酸(T或Thr)、纈胺酸(V或Val)、色胺酸(W或Trp)及酪胺酸(Y或Tyr))。
如本文所用之術語「非天然胺基酸(non-natural amino acid及unnatural amino acid)」可互換意欲表示無法在任何生物體中使用來自任何生物體(無論相同或不同)之未修飾或經修飾之基因以生物合成方式產生之胺基酸結構。該等術語係指天然存在之(野生型)Apelin蛋白質序列或本發明之序列中不存在之胺基酸殘基。此等包括(但不限於)並非20種天然存在之胺基酸中之一者的經修飾胺基酸及/或胺基酸類似物、硒代半胱胺酸、吡咯離胺酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-離胺酸(Pcl，例如，如PCT專利公開案WO2010/48582中所述)。該等非天然胺基酸殘基可藉由取代天然存在之胺基酸及/或藉由插入非天然胺基酸而引入天然存在之(野生型)Apelin蛋白質序列或本發明之序列中。亦可併入非天然胺基酸殘基以使得所需功能賦予Apelin分子，例如連接官能性部分(例如PEG)之能力。當與胺基酸相連使用時，符號「U」應意指如本文所用之「非天然胺基酸」。
此外，應瞭解該等「非天然胺基酸」需要經修飾tRNA及經修飾tRNA合成酶(RS)以便併入蛋白質。此等「經選擇」垂直tRNA/RS對係藉由如Schultz等人所開發之選擇方法或藉由隨機或目標突變產生。舉例而言，吡咯啉-羧基-離胺酸為「非天然胺基酸」，因為其係藉由自一種生物體轉移至宿主細胞中之基因以生物合成方式產生及因為其藉由使用天然tRNA及tRNA合成酶基因併入蛋白質，而對胺基苯丙胺酸(參見Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code,Mehl RA,Anderson JC,Santoro SW,Wang L,Martin AB,King DS,Horn DM,Schultz PG.J Am Chem Soc.2003 Jan 29；125(4)：935-9)為「非天然胺 基酸」，因為雖然以生物合成方式產生，但其藉由「經選擇」垂直tRNA/tRNA合成酶對併入蛋白質。
經修飾之編碼胺基酸包括(但不限於)羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、O-磷絲胺酸、氮雜環丁烷羧酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-甲基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺酸、高脯胺酸、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘基丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、戊基甘胺酸、哌啶酸及硫代脯胺酸。術語「胺基酸」亦包括在某些生物體中代謝但未由遺傳密碼子編碼以便併入蛋白質之天然存在之胺基酸。該等胺基酸包括(但不限於)鳥胺酸、D-鳥胺酸及D-精胺酸。
如本文所用之術語「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同的基礎化學結構的化合物，僅舉例而言，鍵結於氫、羧基、胺基及R基團之α-碳。胺基酸類似物包括經可逆或不可逆地化學阻斷或C端羧基、N端胺基及/或側鏈官能基經化學修飾之天然及非天然胺基酸。該等類似物包括(但不限於)甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸、S-(羧甲基)-半胱胺酸亞碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸碸、天冬胺酸-(β-甲酯)、N-乙基甘胺酸、丙胺酸甲醯胺、高絲胺酸、正白胺酸及甲硫胺酸甲基鋶。
Nal係指1-萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸兩者，較佳為2-萘基丙胺酸。
4-苯基脯胺酸係指順式及反式4-苯基脯胺酸，較佳為反式4-苯基脯胺酸。
如本文所用，術語「醯胺」係指在C端之羧酸基的醯胺衍生物(例如-C(O)NH2、-C(O)NH-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-2烷基苯基、-C(O)NH-NHBn或-C(O)N(C1-6烷基)2)。
術語「醯胺」亦指在N端之胺基的衍生物(例如-NHC(O)C1-16烷基、-NHC(O)(CH2)nPh(n為1至6之整數)、-NHC(O)(CH2)2CO2H、4-Cl-Ph-(CH2)3C(O)NH-、C11H23C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-NH-、C13H27C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-NH-；C15H27C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)NH-、Ph-CH2CH2NHC(O)-NH-或CH3(OCH2CH2)mC(O)NH-(m為1至12之整數)。
如本文所用，術語「酯」係指在C端之羧酸基的酯衍生物(例如-COOR)形式，其中該酯之R係指C1-6烷基，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等；C3-8環烷基，諸如環戊基、環己基等；C6-10芳基，諸如苯基、α-萘基等；C6-10芳基-C1-6烷基，例如苯基-C1-2烷 基，諸如苯甲基、苯乙基、二苯甲基等，及α-萘基-C1-2烷基，諸如α-萘基甲基及其類似基團。亦可提及特戊醯氧甲基酯及其類似物，其常用作用於口服之酯。當本發明之多肽在除C端以外的位置具有額外羧基或羧酸酯基時，該等基團經醯胺化或酯化之彼等多肽亦屬於本發明之多肽的類目。在該等情況下，酯可例如為與以上提及之C端酯相同種類的酯。
術語烷基係指包含1至20個碳原子之完全飽和分支鏈或未分支(或直鏈)烴部分。烷基較佳包含1至7個碳原子且更佳包含1至4個碳原子。
術語芳基係指在環部分中具有6-10個碳原子之單環或雙環芳族烴基。芳基之代表性實例為苯基或萘基。
術語雜芳基包括單環或雙環雜芳基，其含有5-10個選自碳原子之環成員及1至5個雜原子，且各雜原子獨立地選自O、N或S，其中S及N可氧化成各種氧化態。對於雙環雜芳基系統，該系統為完全芳族(亦即所有環皆為芳族)。
術語環烷基係指3-12個碳原子、較佳3-8或3-7個碳原子之飽和或不飽和但非芳族單環、雙環或三環烴基。對於雙環及三環環烷基系統，所有環皆為非芳族。
術語雜環基係指飽和或不飽和非芳族(部分不飽和)環，其為4員、5員、6員或7員單環且含有至少一個選自O、S及N之雜原子，其中N及S亦可視情況氧化成各種氧化態。在一個實施例中，雜環基部分表示含有5-7個環原子且視情況含有另一選自O、S或N之雜原子的飽和單環。
術語「APJ」(亦稱為「Apelin受體」、「類血管收縮素-1受體」、「類血管收縮素II-1受體」及其類似物)表示具有380個殘基、7個跨膜結構域之Gi偶聯受體，其基因定位於人類染色體11之長臂上(NCBI參 考序列：NP_005152.1，且由NCBI參考序列：NM_005161編碼)。1993年使用簡併寡核苷酸引子自基因組人類DNA中第一次克隆出APJ(O'Dowd等人Gene,136：355-60,1993)且與血管收縮素II受體1型共享顯著之同源性。然而，儘管有此同源性，但血管收縮素II不結合APJ。儘管成為孤兒受體很多年，但已分離出內源配位體且名為Apelin(Tatemoto等人，Biochem Biophys Res Commun 251,471-6(1998))。
術語「Apelin」表示77個殘基之前蛋白(NCBI參考序列：NP_0059109.3，且由NCBI參考序列：NM_017413.3編碼)，其經加工成Apelin肽之生物活性形式，諸如Apelin-36、Apelin-17、Apelin-16、Apelin-13、Apelin-12。全長成熟肽(稱為「Apelin-36」)包含36個胺基酸，但最有效之同功異構物為Apelin之13聚體(Apelin-13)之焦麩胺酸鹽化形式，稱為「Pyr-1-Apelin-13或Pyr1-Apelin-13」。不同Apelin形式描述於例如美國專利6,492,324B1中。
術語「結合物」及「生物結合物」可互換使用，且意欲指由於APJ促效劑多肽或式I'或I-IX之多肽與半衰期延長部分經由視情況選用之連接子之共價連接而形成的實體。術語「結合物」或「生物結合物」亦意欲包括由於APJ促效劑多肽或式I'或I-IX之多肽與半衰期延長部分之間的融合而形成的實體。
術語半衰期延長部分可共價連接/連接或熔合於肽或多肽類似物。半衰期延長部分可為例如聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)、脂肪酸、膽固醇基團、碳水化合物或寡醣；或結合於救助受體之任何天然或合成蛋白質、多肽或肽。在其他實施例中，半衰期延長部分為白蛋白結合殘基。如本文所用，「白蛋白結合殘基」意指非共價結合於人類血清白蛋白之殘基。在一個實施例中，白蛋白結合殘基為親脂性殘基。在另一實施例中，白蛋白結合殘基在生理pH值下帶負電荷。白 蛋白結合殘基通常包含可帶負電荷之羧酸。白蛋白結合殘基之實例包括脂肪酸。在其他實施例中，半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接於具有長血清半衰期之血漿蛋白(白蛋白及免疫球蛋白)。舉例而言，半衰期延長部分為IgG恆定結構域或其片段(例如Fc區)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽或殘基(例如脂肪酸)。最佳地，生物結合物之半衰期延長部分為Fc區。
術語「增加之半衰期」或「增加血清半衰期」或「延長半衰期」意指經修飾之生物活性分子(例如Apelin 13)相對於其未經修飾形式(或該肽之裸形式)的循環半衰期中的正向變化。血清半衰期藉由如下方法量測：在投與生物活性分子之後的不同時間點時獲取血液樣品，且測定各樣品中該分子之濃度。量測血清濃度隨時間之變化允許計算經修飾分子(例如經結合分子)之血清半衰期。藉由比較經修飾分子(例如經結合分子)與未經修飾分子(例如Apelin 13)之血清半衰期，可確定血清半衰期或t1/2之相對增加。增加宜為至少約兩倍，但較小之增加可為適用的。
本發明之肽或多肽
本發明之各種實施例描述於本文中。應認識到，各實施例中規定之特徵可與其他規定特徵組合以提供其他實施例。
在實施例1A中，本發明因此提供一種生物結合物或其多聚體，其包含a. 式(I)之肽或多肽：
其中：X1為多肽之N端且為不存在的或係選自pE、R、Q、A、K、5-胺基-戊酸及Isn； X2為R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK或Orn；X3為P、A、a、p、4-PhP、哌啶甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X4為R、A、r、N-Me-R或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X5為L、Cha、A、D-L、N-Me-L或F；X6及X12獨立地為選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6及X12之側鏈經由共價鍵連接在一起；或者X6為K，X13不存在且X12為F或f，其中X12之C端與X6之胺基側鏈一起形成醯胺鍵；X7為H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X3位之半胱胺酸之側鏈或與X4位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X8為K、k、F、f、A、hF、N-Me-R或4-胺基-Isn；X9為G、N-Me-G、A或Aib；X10為P、A、p、4-PhP或哌啶甲酸，X11為M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K或Cha；及X13為C端且為不存在的或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap
其中：Nle為L-正白胺酸；D-hC為D-高半胱胺酸
hC為L-高半胱胺酸；hF為L-高苯丙胺酸； hK為L-離胺酸；Nal為L-萘基丙胺酸；Orn為鳥胺酸；Aib為α-胺基異丁酸；Dab為(S)-二胺基丁酸；Dap為(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)為甲硫胺酸碸；Cha為(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn為4-胺基哌啶-4-甲酸；Isn為異哌啶甲醯基；pE為L-焦麩胺酸；其中N端及C端視情況連同1、2、3或4個甘胺酸胺基酸形成環；及或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽；及b. 半衰期延長部分；其中該肽或多肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例2中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含：a. 根據實施例1、2或3之肽或多肽，其具有式II：
其中X1為不存在的、pE、R、Q或Isn；X5為L或Cha；X7為H、Aib、F、K； X8為K、F或4-胺基-Isn；X9為G或Aib；X11為Nle或Cha；X13為不存在的或為F、f、K；X6及X12獨立地為選自C、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6及X12之側鏈經由共價鍵連接在一起；及其中N端及C端視情況連同1、2、3或4個甘胺酸胺基酸形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽；a. 半衰期延長部分及其中該肽或多肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在先前實施例中之任一者之另一態樣中，更特定言之先前實施例中之任一者，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地為選自C、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6及X12之側鏈經由共價鍵連接在一起；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽；及半衰期延長部分；其中該肽或多肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例3中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據先前實施例中之任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地選自K、Orn、Dab、E及D且其中X6及X12之側鏈一起形成醯胺鍵；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽；及半衰期延長部分，其中該肽或多肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。在此實施例之另一態樣中，X6為K、Orn或Dab且X12為E或D且X6及X12之側鏈形成醯胺鍵。在此實施例之另一態樣中，X6為K且X12為E或D。
在實施例4中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包 含根據先前實施例中之任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地為C、c、D-hC或hC，其中X6及X12之側鏈一起形成二硫鍵；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽；及半衰期延長部分，其中該肽或多肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。在此實施例之另一態樣中，X6及X12為C。
在實施例4A中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據先前實施例中之任一者，更特定言之實施例1、2及4中之任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地為C、c、D-hC或hC，其中X6及X12之側鏈一起形成單硫(-S-)鍵；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽及半衰期延長部分，其中該肽或多肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。在此實施例之另一態樣中，X6及X12為C。
在實施例5中，本發明之某些生物結合物包含根據實施例1、2、4、4A及4B中之任一者之肽或多肽，該肽或多肽具有式III： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。在實施例5A中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含式III之肽或多肽，其中6位及12位之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)、單硫鍵(-S-)。在實施例5或5A之另一態樣中，本發明包括生物結合物或其多聚體，其包含式III之肽或多肽，其中6位及12位之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)。
在實施例6中，某些生物結合物或其多聚體包含根據實施例1-5中之任一者之肽或多肽，該肽或多肽具有式IV： 或該多肽之醯胺、酯或鹽，用於與半衰期延長部分結合。
在實施例7中，某些生物結合物或其多聚體包含實施例1、2及4至6中之任一者之多肽，該多肽具有式V： 或該多肽之醯胺、酯或鹽，用於與半衰期延長部分結合。在實施例7A中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含式V之肽或多肽，其中6位及12位之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)或單硫鍵(-S-)。在實施例7或7A之另一態樣中，本發明包括一種生物結合物，其包含式V之肽或多肽，其中6位及12位之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)，用於與半衰期延長部分結合。
在實施例8中，本發明係關於一種生物結合物，其包含式I或I'之雙環肽或多肽，其中X3為半胱胺酸且其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵，及半衰期延長部分，其中該肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。此實施例由一種生物結合物或其多聚體表示，其包含式VI之肽或多肽：
或該多肽之醯胺、酯或鹽，用於與半衰期延長部分結合。
在實施例9中，本發明係關於一種生物結合物，其包含式I或I'之雙環肽或多肽，其中X4為半胱胺酸且其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵，及半衰期延長部分，其中該肽及該半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。此實施例由一種生物結合物或其多聚體表示，其包含式VII之肽或多肽：
或該多肽之醯胺、酯或鹽，用於與半衰期延長部分結合。
在實施例10中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據實施例1至7中之任一者之式I至V中之任一者之肽或多肽；其中N端及C端視情況連同1、2、3或4個甘胺酸胺基酸形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。此實施例由具有式VIII之肽或多肽表示：
其中L為(G)r，G為甘胺酸且r為1、2、3或4；或該多肽之鹽。在此實施例中，半衰期延長部分視情況經由連接子連接於側鏈之官能基(例如K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈上的胺基)。
在實施例10A，亦即實施例10之另一態樣中，本發明係關於用於與半衰期延長部分結合之式VIII之肽或多肽，其中X1為Q，X13為F且r為2，或其酯、醯胺或鹽；在實施例11中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據實施例1或2之式I或I'之肽或多肽，其中X6為K，X13不存在且X12為F或f，其中X12之C端與X6之胺基側鏈一起形成醯胺鍵，及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。此實施例由式IX之肽或多肽表示： 或該多肽之酯、醯胺或鹽，用於與半衰期延長部分結合。在此 實施例之一個特定態樣中，式IX之肽較佳經由其N端，視情況經由連接子連接於半衰期延長部分。
上文或下文列舉之本文所述之式I'或其相關式及所有實施例(例如式I、II至IX)之胺基酸殘基中之任一者可以保守方式經取代，提供仍保留功能活性及結構特性(例如半衰期延長、避免降解、構形限制)之本發明之肽或多肽。許用保守胺基酸取代之原則及實例進一步解釋於本文中。
以下實施例可獨立地、共同地或以任何組合或子組合形式使用：在實施例12中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I'、I至VII及IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至9及11中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X1為pE。在本發明之一個態樣中，半衰期延長部分視情況經由連接子連接於肽之C端。在本發明之另一態樣中，半衰期延長部分視情況經由連接子連接於肽之側鏈官能基，諸如K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈之胺基酸官能基。用於使肽連接於半衰期延長部分之尤其受關注之一個側鏈胺基酸為8位之離胺酸(X8為K)。
在實施例12A中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I'、I至VII及IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至9及11中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X1為A或Q。在此實施例之另一態樣中，肽經由其A或Q N端融合或共價連接於半衰期延長部分。
在實施例13A中，本發明係關於生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至VII中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至9中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或 鹽，其中X13為F；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
在實施例13B中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至VII中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至9中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X13不存在；或該多肽之醯胺、酯或鹽。在實施例13C，亦即實施例13B之一個態樣中，C端為醯胺。在實施例13D，亦即實施例13C之另一態樣中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至VII中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者之多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中C端為式-C(O)R2之醯胺且R2為-NH2、-NH-Me、-NH-NHBn或-NH-(CH2)2-Ph。在實施例13D之一個較佳態樣中，本發明係關於一種生物結合物，其包含根據式I至VII中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中C端為式-C(O)R2之醯胺且R2為-NH-(CH2)2-Ph。
在實施例14中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至12中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X5為L，及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例15中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至V、VIII及IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至7及10-14中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X7為H，及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例16中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至III及VI至IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及 亞類中之任一者(亦即根據實施例1至15中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X8為K或F。在此實施例之另一態樣中，X8為K及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例17中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至III及VI至IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至16中之任一者)之肽及多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X9為G，及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例18中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含根據式I至IX中之任一者或上文所述之任何其他種類及亞類中之任一者(亦即根據實施例1至17中之任一者)之肽或多肽，或其醯胺、酯或鹽，其中X11為Nle，及半衰期延長部分，其中該肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
在實施例18A中，本發明係關於一種生物結合物或其多聚體，其包含實施例1、2或3之肽或多肽，其中胺基酸X1至X13中之三者不同於Pyr-1-Apelin-13中存在之對應胺基酸。在實施例18B中，本發明係關於一種生物結合物，其包含實施例1、2或3之肽或多肽，其中胺基酸X1至X13中之四者不同於Pyr-1-Apelin-13中存在之對應胺基酸。
在另一實施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12及X13胺基酸、連接子及半衰期延長部分為由下文實例部分中之X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12及X13胺基酸、連接子及半衰期延長部分所定義之彼等胺基酸、連接子及半衰期延長部分。
除非另外規定，否則術語「多肽」係指式(I')及其子式(式I、II至IX)之多肽；或其醯胺、酯或鹽。
除非另外規定，否則術語「多肽」、「肽」、「APJ肽促效劑」及其類似物係指式I'及其子式(式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX)之肽及多肽；或其醯胺、酯或鹽。本發明之肽及多肽之生物結合物顯示與本文所述之已知Apelin肽及多肽相比實質上等效或改良之活性及/或血漿穩定性，該等已知Apelin肽及多肽包括(但不限於)野生型Apelin、Apelin-13及pyr-1-Apelin-13。
本發明之生物結合物亦涵蓋含有與根據式I'、I至IX中之任一者之肽及多肽至少約95%一致的肽及多肽，或其醯胺、酯或鹽，以及本文包括(但不限於)實驗性實例中所特定列舉之任何肽或多肽的生物結合物。
如本文所用，片語「同源胺基酸序列」或其變異體係指藉由在胺基酸水準下至少規定百分比之同源性表徵的序列且可與「序列一致性」互換使用。同源胺基酸序列包括含有保守胺基酸取代之彼等胺基酸序列且該等多肽具有相同結合及/或活性。在一些實施例中，若胺基酸序列與比較序列具有至少60%或60%以上、至多99%之一致性，則其為同源的。在一些實施例中，若胺基酸序列與比較序列共有一或多個、至多60個胺基酸取代、添加或缺失，則其為同源的。在一些實施例中，同源胺基酸序列具有不超過5個或不超過3個保守胺基酸取代。
同源性亦可在多肽水準下。本發明之肽或多肽、或其部分與不同胺基酸序列之一致性程度或一致性百分比係以兩個序列比對精確匹配的數目除以「本發明序列」或「外來序列」中最短序列的長度來計算。結果以一致性百分比形式表示。
包含與特定實例中所述之胺基酸序列具有約80-99.9%、較佳90-99.9%之同源性之胺基酸序列且具有優於Apelin-13或pyr-1-Apelin-13之血漿穩定性的多肽屬於本發明之多肽的類目。在一個實施例中，血 漿穩定性改良至少2倍。在一個實施例中，本發明之多肽具有至少30分鐘之血漿穩定性。在另一實施例中，本發明之多肽具有至少60分鐘，較佳至少100分鐘且更佳至少150分鐘之血漿穩定性。
術語「實質上等效」意指受體結合活性、信號轉導活性及其類似物之性質為等效的。因此，可允許甚至在諸如多肽之受體結合活性強度及分子量之等級中存在差異。
如本文所述之多肽或其藉由取代、缺失、添加或插入一或多個胺基酸之實質性等效物可作為上述意義中含有胺基酸序列實質性等效物之多肽加以提及。如本文所述之多肽或其藉由經天然或非天然胺基酸取代1至5個、較佳1至3個且更佳1或2個胺基酸之實質性等效物可在以上意義中作為含有胺基酸序列實質性等效物之多肽加以提及。其他修飾及改變可包括用D-胺基酸置換L-胺基酸或其他變化形式，包括(但不限於)磷酸化、羧化、烷基化及其類似物，只要保持式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX之肽或多肽之APJ促效活性且與Apelin-13之焦麩胺酸鹽化形式相比血漿穩定性得以改良即可。舉例而言，在式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX之環狀肽及多肽之2位(X2)、3位(X3)、5、6、7及8位(X5、X6、X7及X8)、10位(X10)及13位(X13)的D-胺基酸在多肽之活性及穩定性方面具有良好耐受性。
在一個實施例中，半衰期延長部分視情況經由連接子部分共價連接或融合於式I'或式I至VII及IX中之任一者之肽的N端。
在另一實施例中，半衰期延長部分視情況經由連接子部分共價連接或融合於式I'或式I至IX中之任一者之肽的C端。
在另一實施例中，半衰期延長部分視情況經由連接子部分共價連接或融合於式I'或式I至IX中之任一者之肽的側鏈，例如半衰期延長部分視情況經由連接子部分連接於K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈的胺基。較佳地，半衰期延長部分視情況經由連接子部分 連接於式I'或式I-IX中之任一者之肽的N端。
半衰期延長部分
本發明之半衰期延長部分可共價融合、連接、連接或結合於肽或多肽類似物。半衰期延長部分可為例如聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)、脂肪酸、膽固醇基團、碳水化合物或寡醣；或結合於救助受體之任何天然或合成蛋白質、多肽或肽。較佳地，半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接於具有長血清半衰期之血漿蛋白(白蛋白及免疫球蛋白)。舉例而言，半衰期延長部分為IgG恆定結構域或其片段(例如Fc區)、人類血清白蛋白(HSA)、脂肪酸或白蛋白結合多肽。較佳地，生物結合物之半衰期延長部分為人類血清白蛋白、脂肪酸或Fc區。
半衰期延長部分包括白蛋白，其係指血漿中最豐富的蛋白質，其單體形式具有約65至67千道爾頓之分子量，視來源物種而定。術語「白蛋白」可與「血清白蛋白」互換使用且不意味著定義與本發明之經修飾肽一起形式結合物之白蛋白的來源。因此，如本文所用之術語「白蛋白」可係指自諸如血液或漿液之天然來源純化之白蛋白，或其可係指化學合成或重組產生之白蛋白。本發明之經修飾肽或多肽較佳視情況經由連接子繫栓於白蛋白表面上之半胱胺酸-34的游離硫醇基。
半衰期延長部分包括脂肪酸，其可定義為C6-70烷基、C6-70烯基或C6-70炔基鏈，其每一者經至少一個羧酸(例如1、2、3或4個CO2H)取代且視情況另外經羥基取代。脂肪酸之實例由式A1、A2及A3定義：
R2為CO2H、H；R3、R4及R5彼此獨立地為H、OH、CO2H、-CH=CH2或-C≡CH；Ak1為分支鏈C6-C30伸烷基；q、r及p彼此獨立地為6至30之整數；或其醯胺、酯或醫藥學上可接受之鹽。
脂肪酸之實例係選自：
其中Ak2、Ak3、Ak4、Ak5及Ak6獨立地為(C8-20)伸烷基，R6及R7獨立地為(C8-20)烷基。
更特定言之，脂肪酸係選自：
此等脂肪酸部分已描述於共同申請之申請案代理人案號PAT055274-US-PSP中。
半衰期延長部分包括「天然Fc」(其係指包含由完整抗體之分解而產生或藉由其他方式產生之非抗原結合片段之序列的分子或序列，不論呈單體或多聚體形式)，且可含有鉸鏈區。天然Fc之原始免疫球蛋白來源較佳為人類來源且可為免疫球蛋白中之任一者，但IgG1及IgG2為較佳的。天然Fc分子由可藉由共價(亦即二硫鍵)及非共價締合連接成二聚體或多聚體形式之單體多肽組成。天然Fc分子之單體次單位之間的分子間二硫鍵的數目在1至4之範圍內，視類別(例如IgG、IgA及IgE)或子類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1及IgGA2)而定。天然Fc之一個實例為由IgG之番木瓜蛋白酶分解產生之經二硫鍵結的二聚體(參見Ellison等人，1982,Nucleic Acids Res.10：4071-9)。如本文所用，術語「天然Fc」對於單體、二聚體及多聚體形式為通用的。
半衰期延長部分包括「Fc變異體」，其係指自天然Fc修飾但仍包含救助受體FcRn(新生Fc受體)之結合位點的分子或序列。國際公開案第WO 97/34631號及第WO 96/32478號描述例示性Fc變異體以及與 救助受體之相互作用，且其在此以引用之方式併入。因此，術語「Fc變異體」可包含由非人類天然Fc人類化之分子或序列。此外，天然Fc包含可移除區，因為該等可移除區提供本發明之生物結合物不需要的結構特徵或生物活性。因此，術語「Fc變異體」包含缺乏一或多個天然Fc位點或殘基或一或多個Fc位點或殘基經修飾之分子或序列，該等Fc位點或殘基影響或參與：(1)二硫鍵形成，(2)與所選宿主細胞之不相容性，(3)在所選宿主細胞中表現後之N端異質性，(4)糖基化，(5)與補體之相互作用，(6)結合於除救助受體以外之Fc受體，或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。Fc變異體於下文進一步詳述。
半衰期延長部分包括C端離胺酸已缺失或經丙胺酸置換之Fc變異體。
半衰期延長部分係指「Fc結構域」，其涵蓋如上文所定義之天然Fc及Fc變異體及序列。如同Fc變異體及天然Fc分子，術語「Fc結構域」包括單體或多聚體形式之分子，無論由完整抗體分解或藉由其他方式產生。在本發明之一些實施例中，Fc結構域可經由例如Fc結構域與肽序列之間的共價鍵結合於式I'或式I-IX中之任一者的多肽。該等Fc蛋白質可經由Fc結構域之締合而形成多聚體，且此等Fc蛋白質及其多聚體均為本發明之一個態樣。
半衰期延長部分包括「經修飾Fc片段」，其將意指包含經修飾序列之抗體之Fc片段。Fc片段為包含CH2、CH3及一部分鉸鏈區之抗體的一部分。經修飾Fc片段可衍生自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。FcLALA為具有LALA突變(L234A、L235A)之經修飾Fc片段，其以降低的效率觸發ADCC且較弱地結合及活化人類補體。Hessell等人2007 Nature 449：101-104。對Fc片段之額外修飾描述於例如美國專利第7,217,798號中。
如應用於Fc結構域或包含Fc結構域之分子之術語「多聚體」係 指具有共價締合之兩個或兩個以上多肽鏈的分子。舉例而言，IgG分子通常形成二聚體且因此包含二聚體IgG分子之生物結合物將融合於式I'之兩個多肽鏈。
連接子
任何連接子為視情況選用的。當存在時，其化學結構並不關鍵，因為其主要用作間隔子。
連接子為含有兩個反應性基團/官能基之化學部分，其中一個基團可與多肽反應且另一個可與半衰期延長部分反應。連接子之兩個反應性基團經由鍵聯基團連接，該鍵聯基團之結構並不關鍵，只要其不干擾連接子偶合於肽及半衰期延長部分。
連接子可由藉由肽鍵連接在一起之胺基酸組成。在本發明之一些實施例中，連接子由藉由肽鍵連接之1至20個胺基酸組成，其中該等胺基酸選自20種天然存在之胺基酸。在各種實施例中，1至20種胺基酸係選自胺基酸甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸及離胺酸。在一些實施例中，連接子由多數無空間位阻之胺基酸(諸如甘胺酸及丙胺酸)組成。在一些實施例中，連接子為聚甘胺酸、聚丙胺酸、甘胺酸及丙胺酸之組合(諸如聚(Gly-Ala))，或甘胺酸與絲胺酸之組合(諸如聚(Gly-Ser))。在一些實施例中，連接子包含多數選自組胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺及甘胺酸之胺基酸。在一些實施例中，連接子含有聚組胺酸部分。連接子之實例為包含基元AH、MHA或AHA之連接子。該等基元已於同在申請中之申請案及共同申請之申請案代理人案號PAT055418-US-PSP2、PAT056274-US-PSP及PAT056275-US-PSP中描述為有益於在肽或多肽之N端的選擇性結合。
連接子之其他實例包含基元GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGS、GS或GG。
在一些其他實施例中，連接子包含酶之識別基元。實例為可包括在C端之LPXTG/A基元，其中X為任何胺基酸，最常為E：麩胺酸。(L：白胺酸，P：脯胺酸，T：蘇胺酸，G：甘胺酸，A：丙胺酸)。(Carla P.Guimaraes等人：「Site specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions」,Nature protocols，第8卷，No 9,2013,1787-1799)
在其他實施例中，連接子包含1至20個選自非天然胺基酸之胺基酸。儘管3至15個胺基酸殘基之連接子對於與半衰期延長部分結合而言為較佳的，但本發明涵蓋具有任何長度或組成之連接子。較佳非天然胺基酸連接子為下式之O2Oc：或其重複單元。
本文所述之連接子為例示性的，且本發明涵蓋長得多且包括其他殘基之連接子。本發明亦涵蓋非肽連接子。
連接子之鍵聯部分可包含一或多個烷基、烷氧基、烯基、環烷基、芳基、雜芳基及雜環基或其組合。舉例而言，可使用烷基連接子，諸如-NH-(CH2)z-C(O)-或-S-(CH2)z-C(O)-或-O-(CH2)z-C(O)-，其中z為2至20。此等烷基連接子可另外經任何無空間位阻之基團取代，包括(但不限於)低碳烷基(例如C1-C6)、低碳醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。
連接子亦可具有聚合性質。連接子可包括生物穩定或可生物降解之聚合物鏈或單元。具有重複鍵聯之聚合物在生理條件下可具有變化的穩定性程度，視鍵不穩定性而定。聚合物可含有諸如聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)、聚酯(-C(O)-O-)、聚胺基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)、聚醯胺(-C(O)-NH-)之鍵。此等鍵由舉例方式提供，且不意欲限制本發明之 聚合物鏈或連接子中可採用之鍵的類型。適合之聚合物包括例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚胺基酸、二乙烯醚順丁烯二酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯醯胺、聚葡萄糖、聚葡萄糖衍生物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、纖維素及纖維素衍生物、澱粉及澱粉衍生物、聚伸烷二醇及其衍生物、聚伸烷二醇與其衍生物之共聚物、聚乙烯基乙醚及其類似物與其混合物。聚合物連接子為例如PEG。例示性非肽連接子為聚乙二醇連接子：
其中連接子之分子量為100至5000kD，例如100至500kD。
較佳地，鍵聯部分含有一或多個胺基酸部分，諸如(O2Oc)單元或甘胺酸或絲胺酸、C1-4伸烷基-C(O)-、C1-4伸烷基、-NH-C2-6伸烷基-NH-或-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-二胺基單元或其組合及連接2個反應性基團或官能基之鍵聯部分。
較佳地，反應性基團或官能基為順丁烯二醯亞胺、硫醇或吡啶-2-基二硫基。
肽或多肽及用於結合之肽-連接子構築體之製備：
本發明之Apelin肽及多肽及/或肽-連接子構築體可藉由任一合成化學方法或藉由重組方法或兩種方法之組合而產生。Apelin肽及/或肽-連接子構築體可以全長形式製備或可以非全長片段形式合成且接合。本發明之肽及多肽或肽-構築體可藉由用於肽合成之本身已知程序來產生。用於肽合成之方法可為固相合成及液相合成中之任一者。因此，所關注之肽及多肽可藉由如下方法產生：將能夠構成蛋白質之部分肽或胺基酸與其殘基部分縮合，且當產物具有保護基時，將保護基分離，接著可製造所需肽。用於縮合及脫除保護基之已知方法包括 以下文獻(1)-(5)中所描述之程序。
(1)M. Bodanszky及M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966,(2)Schroeder及Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965,(3)Nobuo Izumiya等人.Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975,(4)Haruaki Yajima及Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977，及(5)Haruaki Yajima(編)，Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten.
反應之後，可藉由習知純化技術(諸如溶劑萃取、管柱層析、液相層析及再結晶)之組合將肽純化及分離。若如上所述分離之肽為游離化合物，則可藉由已知方法將其轉化成適合之鹽。相反地，若經分離產物為鹽，則可藉由已知方法將其轉化成游離肽。
多肽之醯胺可藉由使用適合於醯胺化之用於肽合成之樹脂獲得。樹脂包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲基胺樹脂、胺基甲基樹脂、4-苄氧基苄基醇樹脂、4-甲基二苯甲基胺樹脂、PAM樹脂、4-羥甲基甲基苯基乙醯胺基甲基樹脂、聚丙烯醯胺樹脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-羥甲基)苯氧基樹脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-胺甲基)苯氧基樹脂、2-氯三苯甲基氯樹脂等。使用此類樹脂，藉由本身已知的各種縮合技術根據目標肽之序列在樹脂上將側鏈之α-胺基及官能基已經適合保護之胺基酸縮合。在系列反應結束時，將肽或經保護之肽自樹脂上移除，且將保護基移除，且若需要，形成二硫鍵以獲得目標多肽。
為了縮合上文提及之經保護胺基酸，可使用多種用於肽合成之 活化試劑，諸如HATU、HCTU或例如碳化二亞胺。碳化二亞胺包括DCC、N,N'-二異丙基碳化二亞胺及N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺。為了使用此類試劑進行活化，可使用外消旋抑制劑添加劑，例如HOBt或Oxyma Pure。經保護胺基酸可連同活化試劑及外消旋抑制劑一起直接添加至樹脂中，或經預活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，隨後添加至樹脂中。用於活化經保護胺基酸或使用樹脂之縮合的溶劑可恰當地選自已知適用於肽縮合反應之彼等溶劑當中。舉例而言，可提及N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮、氯仿、三氟乙醇、二甲亞碸、DMF、吡啶、二噁烷、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、乙酸乙酯或其適合之混合物。
反應溫度可選自迄今已知適用於肽鍵形成之範圍且通常選自約-20℃至50℃之範圍。經活化胺基酸衍生物一般以1.5至4倍過量之比例使用。若藉由利用茚三酮反應之測試發現縮合不充分，則可重複縮合反應以在不移除保護基之情況下達成充分縮合。若重複縮合仍無法得到充分程度之縮合，則可用乙酸酐或乙醯咪唑使未反應之胺基乙醯化。
用於起始物質胺基酸之胺基之保護基包括Z、Boc、第三戊氧基羰基、異冰片氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷氧基羰基、三氟乙醯基、苯二甲醯基、甲醯基、2-硝基苯基次磺醯基、二苯基硫膦基或Fmoc。可使用之羧基保護基包括(但不限於)上文所提及之C1-6烷基、C3-8環烷基及C6-10芳基-C1-2烷基以及2-金剛烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苄醯甲基、苄氧基羰基肼基、第三丁氧基羰基肼基及三苯甲基肼基。
絲胺酸及蘇胺酸之羥基可藉由酯化或醚化來保護。適合於該酯化之基團包括碳衍生基團，諸如低碳烷醯基(例如乙醯基等)、芳醯基(例如苄醯基等)、苄氧羰基及乙氧羰基。適合於該醚化之基團包括苄 基、四氫哌喃基及第三丁基。用於酪胺酸之酚羥基之保護基包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z及第三丁基。
用於組胺酸之咪唑之保護基包括Tos、4-甲氧基-2,3,6-三乙基苯磺醯基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt及Fmoc。
起始胺基酸之經活化羧基包括對應酸酐、疊氮化物及活性酯，例如與諸如五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲基醇、對硝基苯酚、HONB、N-羥基丁二醯亞胺、N-羥基鄰苯二甲醯亞胺、HOBt等醇的酯。起始胺基酸之經活化胺基包括對應磷醯胺。
用於消除保護基之方法包括在催化劑(諸如鈀黑或鈀/碳)存在下使用氫氣之催化還原，使用無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或該等酸之混合物之酸處理，使用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪之鹼處理，使用含鈉金屬之液氨之還原。藉由上文所提及之酸處理達成之消除反應一般在-20℃至40℃之溫度下進行，且有利地可在添加陽離子受體(諸如苯甲醚、酚、苯硫基甲烷、間甲酚、對甲酚、二甲硫、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇)之情況下進行。用於保護組胺酸之咪唑基之2,4-二硝基苯基可藉由使用硫酚之處理來消除，而用於保護色胺酸之吲哚基之甲醯基可藉由使用稀氫氧化鈉溶液或稀氨水之鹼處理以及上文所提及之在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇存在下之酸處理來消除。
不應參與可使用之起始物質、保護基之反應之用於保護官能基的方法、移除保護基之方法及活化將參與反應之官能基的方法均可自已知基團及方法中判斷性地選擇。
獲得多肽之醯胺形式之另一方法包含：首先使C端胺基酸之α-羧基醯胺化，隨後將肽鏈向N側延長直至所需鏈長，且隨後選擇性脫除C端肽之α-胺基及將形成目標多肽之其餘部分之胺基酸或肽之α-羧基之保護基，且使α-胺基及側鏈官能基已在諸如上文提及之混合溶劑中 經上文所提及之適合之保護基保護的兩個片段縮合。此縮合反應之參數可與上文所述相同。藉由上述方法將所有保護基自藉由縮合獲得之經保護肽移除，由此得到所需粗肽。此粗肽可藉由已知純化程序純化，且主要部分經凍乾以得到目標醯胺化多肽。為獲得該多肽之酯，使用所需醇使C端胺基酸之α-羧基縮合，得到胺基酸酯，且隨後進行用於產生醯胺之上述程序。
或者，重組表現方法特別適用。使用宿主細胞(經人工工程改造以包含編碼肽序列之核酸且將轉錄及轉譯該等核酸，且視情況分泌肽至細胞生長培養基中之細胞)之重組蛋白質表現常規用於此項技術中。對於重組生產方法，編碼肽之胺基酸序列之核酸通常藉由習知方法合成且整合至表現載體中。該等方法尤其較佳用於製造包含與額外肽序列或其他蛋白質或蛋白質片段或結構域融合之肽之多肽組合物。宿主細胞可視情況為選自以下之至少一者：大腸桿菌細胞、COS-1細胞、COS-7細胞、HEK293細胞、BHT21細胞、CHO細胞、BSC-1細胞、Hep G2細胞、653細胞、SP2/0細胞、293細胞、海拉(heLa)細胞、骨髓瘤細胞、淋巴瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞或其任何衍生之永生化或經轉形細胞。
經修飾之治療性肽或多肽及/或肽-連接子構築體包括可與半衰期延長部分上之可獲得之反應性官能基反應以形成共價鍵的反應性基團。反應性基團為能夠形成共價鍵之化學基團。反應性基團可一般為羧基、磷醯基、醯基、酯或混合酸酐、順丁烯二醯亞胺、醯亞胺酯、吡啶-2-基-二硫基，因此能夠與在白蛋白或Fc結構域之目標位點處之如胺基、羥基、羧基或硫醇基之官能基形成共價鍵。用於連接於白蛋白之尤其受關注之反應性基團包括含有順丁烯二醯亞胺基之基團及含有吡啶-2-基-二硫基之基團。官能基為白蛋白或Fc結構域上能夠與經修飾肽或多肽上之反應性基團反應以形成共價鍵之基團。官能基包括 與酯反應性實體鍵結之羥基、與順丁烯二醯亞胺、含有順丁烯二醯亞胺基之基團或吡啶-2-基二硫基、醯亞胺酯基及硫酯基反應之硫醇基；鍵結於羧酸、磷醯基、醯基之胺基。
流程1至3描述肽-連接子構築體之合成，其中肽為APJ促效劑肽或根據式I至IX中任一者之肽。
流程1描述連接於APJ促效劑肽或式I至IX之多肽之N端之含有順丁烯二醯亞胺之連接子的合成。
根據良好確立之醯胺偶合化學方法使肽之N端與一或多個O2Oc胺基酸單元(x為1至20，較佳1至10且更佳3至6)偶合以產生(1A)。使(1A)之末端胺基官能基與活化酸(1B)反應，其中R為直鏈或分支鏈伸烷基、芳基、雜芳基、環烷基或其組合，以便產生肽-含有順丁烯二醯亞胺之連接子構築體(1C)。活化酸(1B)市售可得或易於根據一般熟習此項技術者已知的技術自其對應羧酸獲得。R較佳為直鏈伸烷基，且更佳R為-CH2-CH2-。或者，對於側鏈中含有胺基官能基之肽(例如 含有離胺酸之肽)，在偶合反應之前需要諸如Alloc之正交保護基，接著再進行脫除保護基步驟以便獲得(1C)。
流程2A及2B描述連接於APJ促效劑多肽或式I至IX之多肽之N端之含有吡啶-2-基-二硫基之連接子的合成。
肽-連接子構築體(1A)如流程1中所描述製備，且進一步與式(2A)之經活化酸反應，其中R'為直鏈或分支鏈伸烷基，以產生肽-含有吡啶-2-基-二硫基之連接子構築體(2B)。經活化酸(2A)市售可得或易於 根據一般熟習此項技術者中之一些人已知的技術自其對應羧酸獲得。R'較佳為-CH2-CH2-。或者，肽-連接子構築體(2C)可使用HO2C-R'-SH或其經保護形式(例如三苯甲基或Acm基團，需要額外脫除保護基步驟)來製備，且進一步與(2D)反應以產生肽-含有吡啶-2-基-二硫基之連接子構築體(2B)。類似於流程1，在偶合反應之前可能需要正交官能基(諸如離胺酸之胺基)保護。
使用二胺單元(諸如-NH-CH2CH2-NH-或-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-)，以與流程1、2A及2B中所述之類似方式使類似官能基連接於肽之C端。此類肽-連接子轉導物之非限制性實例為：
或者，可根據流程3A、3B及3C使順丁烯二醯亞胺或吡啶-2-基-二硫基官能基連接於APJ促效劑多肽或式I至IX之多肽：
使用標準醯胺偶合條件使肽之C端處之羧酸基與一或多個O2Oc胺基酸單元偶合以產生(3A)。末端羧酸官能基與(3B)或(3C)之胺基反應，其中R及R'如上文所定義，以便產生經活化之肽-連接子構築體(3D)或(3E)。另外，當肽含有羧基官能基側鏈(例如Glu或Asp)時，需要正交保護基(例如O-烯丙基)及額外脫除保護基步驟。
肽-連接子構築體3F可使用半胱胺2-氯三苯甲基樹脂獲得，且隨後與3G或3H反應以分別產生肽-連接子構築體3I或3E。
肽-連接子構築體(3J)可獲自二胺樹脂且進一步與(1B)或(2A)反應以分別產生式4K或4L之肽-連接子構築體。當肽在其側鏈(例如離胺酸)含有胺基官能基時，一般熟習此項技術者應理解需要額外正交保護及脫除保護基步驟。
流程1至3C描述肽-連接子構築體，更特定言之用於與白蛋白一起製備生物結合物之肽-連接子構築體。順丁烯二醯亞胺反應性基團及吡啶-2-基-二硫基反應性基團與白蛋白之半胱胺酸34之-SH官能基反應。
流程3D及3E描述用於疊氮化物-炔烴胡伊斯根(Huisgen)環加成，更通常稱為點擊化學法之肽-連接子構築體之製備。
其中m為0或1，C1為視情況經氟取代之單、二或三環碳環或雜環系統，L1為C1-C20伸烷基連接子，其中該伸烷基鏈視情況經側氧基(=O)取代，且其中一或多個碳經O或NH置換。環炔部分(3Da)易於獲自商業來源。此外，用於蛋白質標記之點擊化學法中之環狀炔烴已描述於US 2009/0068738中，其以引用的方式併入本文中。特定實例已在下文描述(實例20)。可在肽之N端處或離胺酸殘基側鏈上引入點擊柄。
流程3E描述在Apelin肽之N端處視情況經由連接子L(諸如一或多個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸)引入疊氮基離胺酸殘基。疊氮化物官能基充當點擊化學法之柄。特定實例已描述於共同申請之申請案(代理人案號PAT055418-US-PSP2)中。
半衰期延長部分-連接子構築體之製備：
流程3F及3G描述脂肪酸-連接子構築體之製備。
其中FA為脂肪酸，L2為鍵聯部分(例如PEG)，NHS為N-羥基丁二醯亞胺。該等脂肪酸-連接子構築體用於使用點擊化學法結合。在脂肪酸含有諸如羥基或額外羧酸之官能基的情形中，可能需要保護該等官能基。
其中FA、NHS及L2係如上文流程3F中所定義。該等脂肪酸構築體用於與肽(較佳N端)上之胺基官能基結合。
流程3H描述Fc-連接子構築體之製備
Fc-HA為在Fc之N端含有序列AH-之構築體。該構築體係使用重 組方法來製備。AH-序列允許在低pH值下選擇性修飾N端。該選擇性修飾已揭示於共同申請之申請案(代理人案號PAT056275-US-PSP及PAT056274-US-PSP)中。因此在Fc構築體之N端引入點擊柄。
在另一實施例中，Fc構築體在C端經修飾以引入小轉肽酶識別基元(LPXTG/A)。
該Fc-識別基元係使用重組方法來製備。該構築體之實例為：Fc-[GGGG]n-LPETGGLEVLFQGP，其中GGLEVLFQGP在轉肽酶處理期間經剪除。
Fc APJ肽融合蛋白之製備
以生物學方式產生之多聚化分子，諸如包含稱為鉸鏈之含有半胱胺酸區之至少一部分的抗體Fc可由已呈多聚化(二聚體)形式分泌之重組表現蛋白質產物來製備。本發明亦包括經修飾Fc融合蛋白，其中該Fc區之胺基酸序列已相對於天然存在之抗體中發現之Fc區或恆定區之胺基酸序列變化。舉例而言，Fc-融合蛋白可藉由突變經工程改造(亦即經修飾)以便獲得FcRn結合親和力/或血清半衰期之所需特徵。經修飾Fc-融合蛋白之實例已揭示於美國專利第7,217,798號中，其以引用的方式併入。
本發明之Fc-融合蛋白亦可例如藉由連接連接子部分及肽或多肽部分而以合成方式加以改變。此外，具有來源於重組抗體之Fc結構域之「經修飾」Fc-融合蛋白可在包括原核及真核表現系統之任何表現系統中或使用噬菌體呈現方法來製得。
諸如Fc-[GGGGS]、Fc-[GGGGS]2、Fc-[GGGGS]3、Fc-GG及Fc-GS之Fc-連接子構築體描述於下文實驗部分中。[GGGGS]、[GGGGS]2、[GGGGS]3、GS及GG連接子連接於Fc結構域之C端或Fc結構域之N端，其中Fc為天然Fc或其變異體。Fc變異體之實例包括C端離胺酸已缺失或經丙胺酸置換之Fc。
結合物
在本發明之一個實施例中，根據式I至IX中之任一者之肽或多肽結合(化學/共價連接)於白蛋白之半胱胺酸34之硫醇官能基。
在本發明之另一實施例中，式I'或式I-IX中之任一者之肽或多肽融合於人類IgG之Fc區之一或多個結構域。抗體包含兩個功能上獨立的部分，亦即稱為「Fab」之結合抗原之可變結構域及稱為「Fc」參與諸如補體活化及藉由吞噬細胞攻擊之效應功能的恆定結構域。Fc具有長血清半衰期，而Fab為短期的(Capon等人，1989,Nature 337：525-31)。當與治療性肽或多肽接合在一起時，Fc結構域可提供較長半衰期(C.Huang,Curr.Opin.Biotechnol.,2009,20,692-699)。
在一個實施例中，Fc-肽係指Fc序列融合於肽之N端的生物結合物。或者，肽-Fc係指Fc序列融合於肽之C端之生物結合物。
本發明之較佳實施例為如本文所定義之包含式I'、I-IX中之任一者之肽或多肽的Fc-肽結合物。在此實施例之一個態樣中，Fc-肽為Fc序列融合於式I'-IX中之任一者之多肽或肽的生物結合物。
Fc區可為天然存在之Fc區或可經改變以改良某些品質，諸如治療品質、循環時間或減少聚集。
蛋白質治療劑藉由與抗體之「Fc」結構域融合之適用修飾詳細論述於PCT公開案第WO 00/024782號中。此文件論述與諸如聚乙二醇(PEG)、聚葡萄糖之「媒劑」或Fc區之鍵聯。
本發明之較佳實施例為包含根據前述實施例中之任一者之肽或多肽及半衰期延長部分之生物結合物，其中該半衰期延長部分為經由連接子融合於本發明之多肽之Fc結構域。在本發明之一個態樣中，連接子具有下式：-[GGGGS]n-，n為1、2或3或連接子為GG或GS，且式I及III至IX中之任一者之多肽含有天然存在之胺基酸。適合於與Fc結構域融合之本發明之多肽之實例為：Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-M-C*- F、Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-M-C*及Q-R-P-R-L-S-H-K-G-P-M-P-F。本發明之較佳實施例為如上文所定義之Fc-肽融合之生物結合物，包含經修飾Fc片段(例如FcLALA)及式I'、I-IX中之任一者之肽或多肽，如本文所定義。
在另一實施例中，本發明係關於根據前述實施例中之任一者之生物結合物，其中該半衰期延長部分為C端離胺酸已缺失或經丙胺酸置換之經修飾Fc結構域。此實施例之代表性實例為實例9、10、15及16。該等Fc變異體已與Apelin肽/多肽一起產生更穩定的融合蛋白。
已發現融合於Fc區之肽展現實質上比未融合對應物大的活體內半衰期。此外，與Fc區融合允許多肽二聚化/多聚化。
在本發明之另一實施例中為包含根據式I-IX之肽或多肽及半衰期延長部分之生物結合物，其中該半衰期延長部分為化學連接於多肽之Fc結構域。
製備結合物：
流程4及5說明用於使APJ促效劑肽或根據式I至IX中之任一者之肽與半衰期延長部分(諸如Fc結構域或白蛋白)結合之化學反應。
流程4說明式4A之肽-連接子與人類血清白蛋白之半胱胺酸34之結合
其中L表示肽與順丁烯二醯亞胺官能基之間的鍵聯部分。在一個特定實施例中，L為如流程1、3A、3B或3C中所揭示之鍵聯部分。
流程5說明式5A之肽-連接子構築體與白蛋白之半胱胺酸34之結合。
其中L表示肽與-S-S-吡啶官能基之間的鍵聯部分。在一個特定實施例中，L為如流程2、3A、3B或3C中所揭示之鍵聯部分。
如流程1-5中所述用於製造結合物及肽-連接子構築體之方法亦已描述及例示於共同申請之美國申請案(代理人案號：PAT055326-US-PSP3)中，其以引用的方式併入本文中。
其他結合方法已描述於同在申請中且共同申請之申請案(代理人案號PAT056274-US-PSP、PAT056275-US-PSP及PAT055418-US-PSP)中。該方法包括肽之選擇性N-醯化且概述於流程6中。
其中AH-為在肽之N端引入以有助於在N端之反應的連接子，H為組胺酸，A為丙胺酸，FA為如上文所述之脂肪酸，例如式A1至A3之脂肪酸，且L為鍵聯部分(例如PEG鍵聯部分)。當使用低pH值條件時，脂肪酸連接子構築體6a(如流程3G中所示製備)在N端選擇性引入於肽上。該方法已描述於共同申請之專利申請案(代理人案號PAT056275-US-PSP及PAT055418-US-PSP02)中。
流程7及8描述使用點擊化學法形成本發明之結合物。
流程9描述APJ肽與Fc構築體使用轉肽酶之結合
其中n為1、2或3，L為視情況選用之連接子(例如聚甘胺酸連接子)
尤其受關注的為以下本發明之實施例： 在實施例21中，本發明係關於根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體，其中該半衰期延長部分為IgG恆定結構域或其片段、脂肪酸或人類血清白蛋白。
在實施例22中，本發明係關於根據前述實施例中之任一者之生物結合物，其中該半衰期延長部分為具有LALA突變(L234A、L235A)之FcLALA經修飾Fc片段。
在實施例23中，本發明係關於根據實施例1、4-7、13-17、21及22中之任一者之生物結合物，其中該半衰期延長部分為經由連接子融合於根據式I及III至IX中之任一者之多肽的Fc結構域且其中該連接子具有下式：-[GGGGS]n-，n為1、2或3或該連接子為GS或GG，且根據式I及III至IX中之任一者之多肽含有天然存在之胺基酸。
在實施例23A中，本發明係關於根據實施例23之生物結合物，其中該半衰期延長部分為C端離胺酸已缺失或經丙胺酸置換之Fc變異體。
在實施例24中，本發明係關於根據實施例23之生物結合物，其中該多肽為式I之多肽，其中：X1為該多肽之N端且為不存在的或係選自R、Q、A及K；X2為R、A、K、H、F或E；X3為P、A、K或D；X4為R、A、F或E；X5為L、A、K、D或F；X6及X12為C且經由二硫(-S-S-)鍵連接在一起；X7為H、A、K、F、P、N或E
X8為K、F、A或E；X9為G、A、D、L或R； X10為P或A；X11為M、A、F、Y、L或K；及X13為C端且為不存在的或係選自F、I、A、K、H及E。
在實施例25中，本發明係關於根據實施例22、23或24之生物結合物，其中該多肽為：Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-M-C*-F。
在實施例26中，本發明係關於根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體，其中該半衰期延長部分為人類血清白蛋白。
在實施例27中，本發明係關於根據實施例25或26之生物結合物，其中該人類血清白蛋白經由下式之連接子化學連接於式I至VII及IX中之任一者之多肽的N端：
其中x為1至20，R為直鏈或分支鏈伸烷基、環烷基、芳基或雜芳基或其組合，R'為直鏈或分支鏈伸烷基、芳基或環烷基或其組合。
在實施例28中，本發明係關於根據實施例26或27之生物結合物，其中該人類血清白蛋白經由下式之連接子化學連接於式I至VII中之任一者之多肽的C端：
其中x為1至20，R為直鏈或分支鏈伸烷基、環烷基、芳基或雜芳基或其組合，R'為直鏈或分支鏈伸烷基、芳基或環烷基或其組合。
在其他實施例中，本發明之生物結合物具有下式：
其中肽為該肽之N端，A為丙胺酸，H為組胺酸，m為0或1，n為0、1、2或3，L及L2為連接子，C1為視情況經氟取代之單、二或三環碳環或雜環系統且L1為C1-C20伸烷基連接子，其中該伸烷基鏈視情況經側氧基(=O)取代，且其中一或多種碳經O或NH置換。在此實施例之一個特定態樣中，L及L2為PEG連接子。
醫藥組合物
本發明之生物結合物可以多種方式中之任一者投與，包括皮下、肌肉內、靜脈內、腹膜內、吸入、鼻內、經口等。本發明之尤其較佳實施例採用連續靜脈內投與本發明之生物結合物或其醯胺、酯或鹽。本發明之生物結合物可以大丸劑形式或以經一段時間之持續輸注形式投與。可使用可植入式泵。在本發明之某些實施例中，間歇或連續之生物結合物投與持續一天至數天(例如2-3天或更多天)，或持續更長時段，例如數週、數月或數年。在一些實施例中，提供間歇或連續之生物結合物投與持續至少約3天。在其他實施例中，提供間歇或連續之生物結合物投與持續至少約一週。在其他實施例中，提供間歇或連續之生物結合物投與持續至少約兩週。可能需要在投與期間或多次給藥之投與之間使平均血漿生物結合物濃度維持在一個特定臨限值以上。可例如基於個體之生理狀況、疾病嚴重性等確定所需濃度。該(等)所需值可藉由進行標準臨床試驗來鑑別。或者，肽及其結合物可經由FcRn機制經口遞送。(Nat Rev Immunol.7(9),715-25,2007；Nat Commun.3；3：610,2012,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304：G262-G270,2013)。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之生物結合物或其醯胺、酯或鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可針對諸如口服投藥、非經腸投藥及經直腸投藥等之特定投藥途徑加以調配。此外，本發明之醫藥組合物可以固體形式(包括(但 不限於)膠囊、錠劑、丸劑、顆粒劑、凍乾物、散劑或栓劑)或液體形式(包括(但不限於)溶液、懸浮液或乳液)製成。醫藥組合物可經受諸如無菌製造、滅菌之習知醫藥操作，及/或可含有習知惰性稀釋劑、成餅劑、張力劑、潤滑劑或緩衝劑，以及諸如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑及緩衝劑等之佐劑。
適於可注射使用之醫藥組合物通常包括無菌水溶液(其中水可溶)或分散液及用於無菌可注射溶液或分散液之即用型製備之無菌粉末。
對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物均應為無菌的且應具有流體性至存在易於注射能力之程度。較佳醫藥調配物在製造及儲存條件下為穩定的，且必須經保護以抵抗諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。一般而言，相關載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及其類似物)及其適合之混合物之溶劑或分散介質。舉例而言，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持就分散液而言所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。微生物活動之預防可藉由各種抗細菌及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將較佳包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇)、胺基酸、山梨醇、氯化鈉。藉由使組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)，可實現可注射組合物之延長吸收。
某些可注射組合物為等滲水溶液或懸浮液，且栓劑宜自脂肪乳液或懸浮液製備。該等組合物可經滅菌，及/或含有佐劑，諸如保藏劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進劑、用於調節滲透壓之鹽及/或緩衝劑。此外，其亦可含有其他治療上有價值之物質。該等組合物根據習知混合、粒化或包覆方法分別製備，且含有約0.1%-75%之 活性成分或含有約1%-50%之活性成分。
無菌可注射溶液可藉由如下方法來製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合併入適當溶劑中，視需要接著進行過濾滅菌。一般，分散液係藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒介中來製備。就用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末而言，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其由先前無菌過濾溶液產生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
經口組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載劑。出於經口治療性投與之目的，活性化合物可併有賦形劑且以錠劑、糖衣錠或膠囊(例如明膠膠囊)形式使用。經口組合物亦可使用流體載劑來製備以便用作漱口劑。可包括醫藥學上可相容之黏合劑及/或佐劑材料作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基乙酸鈉或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes；滑動劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。用於經口遞送之調配物宜併有改良胃腸道內之穩定性及/或增強吸收之藥劑。
對於藉由吸入之投與，本發明治療劑較佳自含有適合之推進劑(例如諸如二氧化碳之氣體)之加壓容器或分配器、或噴霧器以氣溶膠噴霧形式遞送。應注意，肺部提供較大表面積以便治療劑之全身遞送。
藥劑可囊封於例如聚合微米粒子(諸如美國公開案20040096403中所述之彼等粒子)中，或與此項技術中已知的多種其他藥物遞送媒劑中之任一者聯合。在本發明之其他實施例中，該等藥劑與如例如美國 公開案20040062718中所述之填充脂質聯合來遞送。應注意，後一系統已用於投與治療性多肽、胰島素，表明此系統用於投與肽劑之效用。
全身性投與亦可藉由經黏膜或經皮方式。
用於經皮施用之適合組合物包括有效量之本發明之生物結合物與適合載劑。適於經皮遞送之載劑包括可吸收的藥理學上可接受之溶劑，以輔助穿過主體皮膚。舉例而言，經皮裝置呈繃帶形式，其包含襯底部件、含有化合物及視情況存在之載劑的儲集層、視情況存在之在延長時段內以受控制及預定速率將化合物遞送至主體皮膚之速率控制障壁、及使裝置對於皮膚安全之構件。
適用於局部施用於例如皮膚及眼睛之組合物包括水溶液、懸浮液、軟膏、乳膏、凝膠或例如用於由噴霧劑或其類似物遞送之可噴霧調配物。該等局部遞送系統特別適合於經皮施用。因此，其特別適用於此項技術中熟知之局部調配物，包括化妝品。該等調配物可含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝劑及防腐劑。
如本文所用，局部施用亦可涉及吸入或鼻內施用。其宜以乾粉形式(單獨、作為混合物(例如與乳糖之乾式摻合物)或例如與磷脂之混合組分粒子)自乾粉吸入器遞送，或以噴霧劑噴霧形式，在使用或不使用適合之推進劑的情況下，自加壓容器、泵、噴射器、霧化器或噴霧器遞送。
本發明另外提供醫藥組合物及劑型，其包含一或多種降低作為活性成分之本發明化合物之分解比率的藥劑。在本文中稱為「穩定劑」之該等試劑包括(但不限於)諸如抗壞血酸之抗氧化劑、pH緩衝劑或鹽緩衝劑等。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保持本發明生物結合物之生物學有效性及特性之鹽，且其通常並非生物學上或另外 不合需要的。在許多情況下，本發明之生物結合物能夠憑藉胺基及/或羧基或與其類似之基團的存在而形成酸式鹽及/或鹼式鹽。
醫藥學上可接受之酸加成鹽可用無機酸及有機酸形成，例如乙酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽(chlortheophyllonate)、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、馬尿酸鹽(hippurate)、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基磺酸鹽、萘甲酸鹽(naphthoate)、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽及三氟乙酸鹽。
可衍生鹽之無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物。可衍生鹽之有機酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸及其類似物。醫藥學上可接受之鹼加成鹽可用無機鹼及有機鹼形成。
可衍生鹽之無機鹼包括例如銨鹽及週期表之第I行至第XII行之金屬。在某些實施例中，鹽衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅及銅；特別適合之鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽及鎂鹽。
可衍生鹽之有機鹼包括例如一級胺、二級胺及三級胺；包括天然產生之經取代之胺的經取代之胺；環胺；鹼離子交換樹脂及其類似物。某些有機胺包括異丙胺、苄星(benzathine)、膽茶鹼(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺、哌嗪及緩血酸胺。
本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由母體化合 物、鹼性或酸性部分來合成。一般，該等鹽可藉由使此等化合物之游離酸形式與化學計算量之適當鹼(諸如Na、Ca、Mg或K之氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或其類似物)反應，或藉由使此等化合物之游離鹼形式與化學計算量之適當酸反應來製備。該等反應通常於水中或有機溶劑中，或於兩者之混合物中進行。一般，在可實行時，需要使用如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈之非水性介質。其他適合之鹽之清單可見於例如「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第20版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；及「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use」Stahl及Wermuth(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)中。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括如熟習此項技術者已知的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料，及其類似物及其組合(參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329頁)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則考慮將其用於治療或醫藥組合物中。
本發明之方法：
肽之Apelin家族為G蛋白偶聯APJ受體之唯一已知的天然配位體家族。Apelin基因編碼含77個胺基酸之多肽，其經加工成Apelin肽之生物活性形式，諸如Apelin-36、Apelin-17、Apelin-16、Apelin-13、Apelin-12及Apelin-13之焦麩胺酸鹽修飾形式(Pyr1-Apelin-13)。此等Apelin肽中之任一者在結合於APJ受體時均經由Gi及Gq蛋白轉導信號。在心肌細胞中，Gi或Gq偶聯導致細胞內pH值、PLC活化及IP3產生方面之變化，該等變化使肌絲鈣敏感度增強且最終導致心肌收縮性 增加。Gi偶聯抑制活化Gs、腺苷酸環化酶及cAMP產生，且增加pAkt含量，引起心臟保護。在血管內皮細胞中，經由Gi、pAKT達成之APJ活化導致氧化氮(NO)產生增加，其使平滑肌鬆弛度增加，導致整體血管擴張。
患有慢性穩定性心臟衰竭之患者具有失代償之偶發性急性事件，其中心肌收縮性進一步降低且症狀惡化。此等惡化稱為急性失代償心臟衰竭(ADHF)。針對ADHF之現有療法包括利尿劑、血管擴張劑及收縮影響劑，其直接增加心肌收縮性。現有靜脈內收縮影響劑(多巴酚丁胺、多巴胺、米利酮、左西孟旦)因其不良事件(諸如心律不整及長期死亡率增加)而熟知。本發明之合成Apelin生物結合物類似物提供一種用於ADHF之療法，其增加心肌收縮性而無心律不整或死亡傾向，且解決慢性心臟衰竭中未滿足的巨大醫藥需求。
實際上，人類之急性Apelin治療(5分鐘)引起冠狀血管擴張及心輸出量改良。然而，天然Apelin展現出極短t½(數秒)及活體內作用持續時間(幾分鐘)。本發明之強效合成生物結合物APJ促效劑與天然Apelin相比具有較長半衰期。
心肌細胞中之APJ受體之活化a)經由Gi/Gq、PLC及Ca2+改良心肌收縮性，及b)經由Gi、pAkt活化提供心臟保護，但不增加cAMP(如在其他收縮影響劑之情況下所見)。此外，內皮細胞中之APJ促效作用導致動脈血管擴張，其進一步藉由解除左心室之工作而有益於心臟衰竭。綜合而言，本發明之生物結合物可改良整體心臟功能，減少心律不整發生，且提供生存益處。
最近，已有多個聚焦Apelin在糖尿病及胰島素抗性方面之潛在涉及的臨床前研究出版物。Apelin已顯示1)藉由改良肌肉、脂肪及心臟中之葡萄糖吸收降低血糖含量，2)保護胰腺β細胞免於ER應激及隨後凋亡，3)降低β細胞中之胰島素分泌，及4)調節脂肪組織中兒茶酚胺 誘導之脂肪分解。此等方法中已牽涉到pAKT路徑之活化。
包含根據式I至IX中之任一者之多肽或其醫藥學上可接受之鹽的呈游離形式或呈醫藥學上可接受之鹽形式之生物結合物展現有價值的藥理學特性，例如APJ受體促效特性，例如如隨後部分中提供之活體外及活體內測試所指示，且因此指示用於療法。
本發明之生物結合物或其醫藥學上可接受之鹽可適用於治療選自如下疾病之適應症：急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
因此，作為另一實施例，本發明提供如本文所述之生物結合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於治療與APJ受體活性相關之疾病。在另一實施例中，療法係選自對APJ受體之促效作用有反應之疾病。在另一實施例中，疾病係選自前文提及之清單，宜為急性失代償心臟衰竭。在此實施例之另一子集中，本發明提供如本文所述之生物結合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製造用於治療與APJ受體活性相關之疾病之藥劑。
因此，作為另一實施例，本發明提供生物結合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於療法。在另一實施例中，療法係選自可藉由APJ受體之活化(促效作用)治療之疾病。
在另一實施例中，本發明提供一種治療對APJ受體之促效作用有反應之疾病的方法，其包含投與治療上可接受之量之根據實施例1至31中之任一者之生物結合物或其多聚體。在另一實施例中，疾病係選自前文提及之清單，宜為急性失代償心臟衰竭。
在此實施例之另一子集中，本發明提供一種治療與APJ受體活性相關之疾病的方法，其包含投與治療上可接受之量之根據實施例1至31中之任一者之生物結合物或其多聚體。
治療上待採用之本發明之醫藥組合物或組合的有效量將視例如治療環境及目標而定。熟習此項技術者應瞭解，治療之適當劑量水準因此將部分視所遞送分子、使用生物結合物之適應症、投藥途徑及患者之尺寸(體重、體表或器官尺寸)及/或狀況(年齡及整體健康)而變化。因此，臨床醫師可滴定劑量並修改投藥途徑以獲得最佳治療效應。典型劑量可在約0.1μg/kg至高達約100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內變化，視上文所提及之因素而定。在其他實施例中，劑量可在0.1μg/kg至高達約100mg/kg；或1μg/kg至高達約100mg/kg範圍內變化。
給藥頻率將視所用調配物中之雙功能蛋白質的藥物代謝動力學參數而定。通常，臨床醫師投與組合物直至達到達成所需效應之劑量。因此，可以單次劑量或隨時間推移以兩次或兩次以上之劑量(其可含有或可不含相同量之所需分子)或經由植入裝置或導管以連續輸注形式投與組合物。適當劑量之進一步優化常規由一般熟習此項技術者來進行且在一般熟習此項技術者常規進行之任務的範圍內。可經由使用適當劑量-反應資料來確定適當劑量。
本發明之生物結合物之術語「治療有效量」係指會引發個體之生物學或醫學反應，例如改善症狀、緩解病狀、減緩或延遲疾病進展或預防疾病等之本發明之生物結合物之量。在一個非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指當投與個體時有效(1)至少部分緩解、抑制、預防及/或改善(i)藉由APJ受體之活化改善、或(ii)與APJ受體活性相關、或(iii)藉由APJ受體之異常活性表徵之病狀、病症或疾病或其症狀；或(2)活化APJ受體之本發明之生物結合物之量。
在另一非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指當投與細胞或組織或非細胞生物材料或培養基時，有效至少部分活化APJ受體之本發明之生物結合物之量。如一般熟習此項技術者應瞭解，有效之特定藥劑之絕對量可視諸如所需生物學終點、待遞送之藥劑、目標組織等因素而變化。一般熟習此項技術者理解，「治療有效量」可以單次劑量投與或可藉由投與多次劑量而達成。舉例而言，在治療心臟衰竭之藥劑的情況下，有效量可為足以產生患者之臨床改良(例如運動耐量/能力提高、血壓上升、液體瀦留減少及/或關於心臟功能(例如射血分數、運動能力(達至力竭之時間)之定量測試的結果改良等)之量。
如本文所用，術語「個體」係指動物。動物通常為哺乳動物。個體亦指例如靈長類(例如，人類)、母牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、大鼠、小鼠、魚、鳥及其類似物。在某些實施例中，個體為靈長類。在其他實施例中，個體為人類。
如本文所用，術語「抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)」係指減少或遏止既定病狀、症狀、或病症、或疾病，或顯著減少生物活動或過程之基線活性。
如本文所用，術語「治療(treat、treating或treatment)」任何疾病或病症在一個實施例中係指改善疾病或病症(亦即，減緩或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展)。在另一實施例中，「治療」係指緩解或改善至少一個生理參數，包括患者可能無法辯別之生理參數。在另一實施例中，「治療」係指身體上(例如，穩定可辯別之症狀)、生理上(例如穩定生理參數)或兩方面上調節疾病或病症。在另一實施例中，「治療」係指預防或延緩疾病或病症之起始或發展或進展。
如本文所用，術語「預防(prevent、preventing及prevention)」係指預防個體之病症之一或多個症狀的復發、發作或發展，該預防由投 與療法(例如治療劑)或投與療法之組合(例如治療劑之組合)產生。
如本文所用，若個體在生物學、醫學或生活質量上將受益於治療，則該個體「需要」該治療。
如本文所用，除非本文中另外指明或與上下文明顯矛盾，否則本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所用的術語「一(a/an)」、「該」及類似術語應解釋為涵蓋單數及複數兩者。
除非本文另外指明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合順序進行。使用本文提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲較佳闡明本發明，而不對以其他方式主張的本發明之範疇造成限制。
根據本發明之生物結合物之活性可藉由下文描述之以下活體外方法評估。
hAPJ鈣通量分析：
將Chem-5 APJ穩定細胞(Millipore # HTS068C)以每孔25μL生長培養基中含10,000個細胞接種於384孔格式中，隨後在37℃組織培養恆溫箱中生長24小時。在分析前一小時，添加25微升/孔FLIPR Calcium 4染料(Molecular Devices R8142)與2.5mM丙磺舒(probenecid)，且在37℃組織培養恆溫箱中培育細胞一小時。將生物結合物溶解於HBSS、HEPES及0.1%BSA緩衝液中，且一式三份地自50μM至5pM連續稀釋10倍。使用FLIPR Tetra將生物結合物添加至具有染料之細胞中(1：5，最終生物結合物濃度範圍介於10μM至1pM)。細胞內之FLIPR染料在結合於鈣後發射螢光，而來自細胞外部之螢光經遮蔽。在FLIPR Tetra上使用470-495激發波長及515-575發射波長量測螢光。在生物結合物添加前10秒時開始進行讀數，總共持續3分鐘。針對各生物結合物濃度計算最大-最小值且進行標繪，且使用GraphPad prism軟體針對由生物結合物達成之鈣通量刺激計算曲線反
曲點處之EC50值。
血漿穩定性分析：
材料：工作溶液：在Milli-Q水中製備1mg/mL測試物品
提取溶液：具有0.1%甲酸及400ng/mL格列本脲(Glyburide)之甲醇：乙腈：水(1：1：1)。
血漿：雄性史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat)血漿(具有肝素鈉)，購買自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。
全血：雄性史-道二氏大鼠全血(具有肝素鈉)，購買自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)
肺組織勻漿：雄性史-道二氏大鼠肺購買自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。添加5倍體積的1X PBS後，使用polytron勻漿機使肺勻漿化。在4℃下以9000rpm使勻漿離心10分鐘。再以3000rpm使上清液離心30分鐘，得到透明上清液。使用市售套組(Pierce,Thermo Scientific)測定蛋白質濃度。
樣品製備程序：(肽)
在以下生物基質中之一者中製備測試物品：肝素化大鼠血漿、肝素化大鼠全血或肺組織勻漿。藉由添加5μL 1mg/mL工作溶液至995μL大鼠血漿或全血中來以5000ng/mL製備血漿及全血樣品。肺組織勻漿樣品藉由如下方法製備：用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)將肺組織勻漿稀釋至1mg/ml蛋白質濃度，接著添加5μL工作溶液至995μL稀釋肺組織勻漿中。在水浴恆溫箱中於37℃下伴隨輕微震盪(65~75rpm)培育樣品。在時間0分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120及240分鐘時，將培育樣品之25μL等分試樣轉移至96孔板中，且緊接著使用150μL提取溶液沈澱蛋白質。在培育實驗完成後，在4℃下以4000rpm使樣品培養板離心10分鐘。隨後，使用吸液裝置(Tecan Temo)將上清液轉移至另一培養板，且向所有樣品中添加50μL水。使培養板渦旋，隨後進行LC-MS分析。
樣品製備程序(結合物)
藉由添加5μL 1mg/mL工作溶液至495μL大鼠血漿中來以50,000ng/mL製備測試物品。在水浴恆溫箱中於37℃下伴隨輕微震盪(65~75rpm)培育樣品。在時間0小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、6及24小時，將培育樣品之50μL等分試樣轉移至96孔板中，且向各樣品中添加100μL 40mM TCEP(參(2-羧乙基)膦)。在37℃下培育反應混合物1小時。在反應完成後，使用300μL乙腈進行蛋白質沈澱。在4℃下以4000rpm使樣品培養板離心10分鐘。隨後，使用吸液裝置(Tecan Temo)將125μL上清液轉移至另一培養板，且向所有樣品中添加50μL水。使培養板渦旋，隨後進行LC-MS分析。
穩定性樣品之LC-MS分析
HPLC：具有自動進樣器之Agilent 1290 HPLC
管柱：MAC-MOD ACE C18,3μm,30mm×2.1mm i.d.
移動相A：含0.1%甲酸之乙腈
移動相B：含0.1%甲酸之水
梯度程式：
質譜儀：Agilent Q-TOF 6530
資料獲取模式：在100-1000 m/z之質量範圍下全掃描
資料獲取及分析軟體：MassHunter
資料分析：穩定性分析：穩定性半衰期(t½)值藉由將各時間點處之峰面積轉化成相對於初始(t=0)峰面積之剩餘百分比來測定。
剩餘百分比=100×(樣品峰面積)÷(t=0峰面積)
針對樣品時間計算且標繪剩餘百分比的自然對數值(Microsoft Excel)。藉由線性回歸確定此直線之斜率k(Microsoft Excel)。
隨後藉由式t½=0.693÷k計算穩定性半衰期。
本發明之生物結合物可具有與Apelin-13或pyr-1-Apelin-13類似之APJ受體效能。在一個實施例中，本發明之生物結合物具有小於100nM之EC50。在另一實施例中，本發明之生物結合物具有小於50nM、較佳小於25nM且更佳小於15nM之EC50。在另一實施例中，本發明之生物結合物具有小於10nM之EC50。
本發明之生物結合物可具有優於Apelin-13或pyr-1-Apelin-13之血漿穩定性。在一個實施例中，血漿穩定性改良為至少2倍。在一個實施例中，本發明之生物結合物具有至少30分鐘之血漿穩定性。在另一實施例中，本發明之生物結合物具有至少10分鐘、至少40分鐘且更佳至少60分鐘之血漿穩定性。
本發明之生物結合物可與一或多種其他治療劑同時、或在其之前或之後投與。本發明之生物結合物可藉由相同或不同投藥途徑分別投與，或以與其他藥劑相同之醫藥組合物形式共同投與。
在一個實施例中，本發明提供一種產品，其包含實施例1至31中之任一者之生物結合物及至少一種作為用於療法中之同時、分別或依序使用之組合製劑的其他治療劑。在一個實施例中，療法為治療對APJ受體之活化有反應之疾病或病狀。
以組合製劑形式提供之產品包括含如下物質的組合物：實施例1至31中之任一者之生物結合物，及共同在同一醫藥組合物中之其他治療劑，或實施例1至31中之任一者之生物結合物，及呈獨立形式(例如呈套組形式)之其他治療劑。
在一個實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含實施例1至31中之任一者之生物結合物，及其他治療劑。如上所述，醫藥組合物視情況可包含醫藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，本發明提供一種套組，其包含兩種或兩種以上獨立醫藥組合物，其中至少一者含有實施例1至31中之任一者之生物結合物。在一個實施例中，該套組包含用於分別保留該等組合物之構件，諸如容器、分隔瓶或分隔箔片封包。該套組之實例為泡殼包裝，如通常用於錠劑、膠囊及其類似物之包裝。
本發明之套組可用於投與不同劑型(例如經口及非經腸)，用於以不同劑量區間投與各別組合物，或用於針對彼此滴定各別組合物。為輔助順應性，本發明之套組通常包含用於投藥之指導。
在本發明之組合療法中，本發明之生物結合物及其他治療劑可由相同或不同製造商製造及/或調配。此外，本發明之生物結合物及其他治療劑可一起進入組合療法：(i)在對醫師釋放組合產品之前(例如在包含本發明之生物結合物及其他治療劑之套組的情況下)；(ii)由醫師自身(或在醫師指導下)在投與之前即刻；(iii)在患者自身中，例如在連續投與本發明之生物結合物及其他治療劑期間。
因此，本發明提供實施例1至31中之任一者之生物結合物之用途，其係用於治療對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病狀，其中該藥劑經製備以用於與另一治療劑一起投與。本發明亦提供另一治療劑之用途，其係用於治療對Apelin受體之促效作用有反應之疾病或病狀，其中該藥劑與實施例1至31中之任一者之生物結合物一起投與。
本發明亦提供一種根據實施例1至31中之任一者之生物結合物，用於治療對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病狀的方法，其中該生物結合物經製備以用於與另一治療劑一起投與。本發明亦提供另一治療劑，用於治療對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病狀的方 法，其中該另一治療劑經製備以用於與根據實施例1至31中之任一者之生物結合物一起投與。
本發明亦提供根據實施例1至31中之任一者之生物結合物之用途，其係用於治療對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病狀，其中患者先前(例如24小時內)已經另一治療劑治療。本發明亦提供另一治療劑之用途，其係用於治療對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病狀，其中患者先前(例如24小時內)已用根據實施例1至31中之任一者之生物結合物治療。
在一個實施例中，該另一治療劑係選自收縮影響劑、β腎上腺素激導性受體阻斷劑、HMG-Co-A還原酶抑制劑、血管收縮素II受體拮抗劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、鈣離子通道阻斷劑(CCB)、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、利尿劑、ApoA-I模擬物、抗糖尿病劑、減肥劑、醛固酮受體阻斷劑、內皮素受體阻斷劑、醛固酮合成酶抑制劑(ASI)、CETP抑制劑、抗凝劑、鬆弛素、BNP(奈西立肽(nesiritide))及NEP抑制劑。
術語與第二藥劑或治療劑「組合」包括共投與本發明之生物結合物(例如根據實施例1至31中之任一者之生物結合物或本文另外描述之生物結合物)與第二藥劑或治療劑，首先投與本發明之化合物，接著投與第二藥劑或治療劑，及首先投與第二藥劑或治療劑，接著投與本發明之生物結合物。
術語「第二藥劑」包括此項技術中已知的治療、預防或減少本文所述之疾病或病症的症狀的任何藥劑，該疾病或病症為例如對APJ受體之活化有反應之病症或疾病，諸如急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括 妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
第二藥劑之實例包括收縮影響劑、β腎上腺素激導性受體阻斷劑、HMG-Co-A還原酶抑制劑、血管收縮素II受體拮抗劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、鈣離子通道阻斷劑(CCB)、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、利尿劑、ApoA-I模擬物、抗糖尿病劑、減肥劑、醛固酮受體阻斷劑、內皮素受體阻斷劑、醛固酮合成酶抑制劑(ASI)、CETP抑制劑、抗凝劑、鬆弛素、BNP(奈西立肽)及/或NEP抑制劑。
如本文所用之收縮影響劑包括例如多巴酚丁胺、異丙基腎上腺素、米利酮、胺力農(amirinone)、左西孟旦、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙基腎上腺素及地高辛。
如本文所用之β腎上腺素激導性受體阻斷劑包括例如醋丁洛爾(acebutolol)、阿替洛爾(atenolol)、倍他洛爾(betaxolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、美托洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、普萘洛爾(propranolol)、索他洛爾(sotalol)及噻嗎洛爾(timolol)。
如本文所用之抗凝劑包括達肝素(Dalteparin)、達那肝素(Danaparoid)、依諾肝素(Enoxaparin)、肝素、亭紮肝素(Tinzaparin)、華法林(Warfarin)。
術語「HMG-Co-A還原酶抑制劑」(亦稱為β-羥基-β-甲基戊二醯基輔酶A還原酶抑制劑)包括可用於降低血液中包括膽固醇在內的脂質含量的活性劑。實例包括阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、康百汀(compactin)、達伐他汀(dalvastatin)、二氫康百汀(dihydrocompactin)、氟多他汀(fluindostatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、美伐他 汀(mevastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)、利伐他汀(rivastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及維洛他汀(velostatin)或其醫藥學上可接受之鹽。
術語「ACE抑制劑」(亦稱為血管收縮素轉化酶抑制劑)包括中斷血管收縮素I酶促降解成血管收縮素II之分子。此類化合物可用於調節血壓及用於治療充血性心臟衰竭。實例包括阿拉普利(alacepril)、貝那普利(benazepril)、貝那普拉(benazeprilat)、卡托普利(captopril)、西羅普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普拉(enaprilat)、福辛普利(fosinopril)、咪達普利(imidapril)、賴諾普利(lisinopril)、莫西普利(moexipril)、莫福普利(moveltopril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)及群多普利(trandolapril)或其藥學上可接受之鹽。
術語「內皮素拮抗劑」包括波生坦(bosentan)(參見EP 526708 A)、替唑生坦(tezosentan)(參見WO 96/19459)或其醫藥學上可接受之鹽。
術語「腎素抑制劑」包括地特吉侖(ditekiren)(化學名稱：[1S-[1R*,2R*,4R*(1R*,2R*)]]-1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-L-脯胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[2-羥基-5-甲基-1-(2-甲基丙基)-4-[[[2-甲基-1-[[(2-吡啶基甲基)胺基]羰基]丁基]胺基]羰基]己基]-N-α-甲基-L-組胺醯胺)；特拉吉侖(terlakiren)(化學名稱：[R-(R*,S*)]-N-(4-嗎啉基羰基)-L-苯丙胺醯基-N-[1-(環己基甲基)-2-羥基-3-(1-甲基乙氧基)-3-側氧基丙基]-S-甲基-L-半胱胺酸醯胺)；阿力克倫(Aliskiren)(化學名稱：(2S,4S,5S,7S)-5-胺基-N-(2-胺甲醯基-2,2-二甲基乙基)-4-羥基-7-{[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基}-8-甲基-2-(丙-2-基)壬醯胺)及占吉侖(zankiren)(化學名稱：[1S-[1R*[R*(R*)],2S*,3R*]]-N-[1-(環己基 甲基)-2,3-二羥基-5-甲基己基]-α-[[2-[[(4-甲基-1-哌嗪基)磺醯基]甲基]-1-側氧基-3-苯丙基]-胺基]-4-噻唑丙醯胺)或其鹽酸鹽、或由Speedel開發之SPP630、SPP635及SPP800、或式(A)及(B)之RO 66-1132及RO 66-1168：及，或其醫藥學上可接受之鹽。
術語「阿力克倫」若未特別定義，應理解為游離鹼及其鹽，尤其為其醫藥學上可接受之鹽，最佳為其半反丁烯二酸鹽。
術語「鈣通道阻斷劑(CCB)」包括二氫吡啶(DHP)及非DHP(例如地爾硫卓(diltiazem)型及維拉帕米(verapamil)型CCB)。實例包括氨氯地平(amlodipine)、苄普地爾(Bepridil)、地爾硫卓、非洛地平(felodipine)、里奧斯汀(ryosidine)、伊拉地平(isradipine)、拉西地平(lacidipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼古地平(niguldipine)、尼魯地平(niludipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、維拉帕米及尼伐地平(nivaldipine)，且較佳為選自由以下組成之群的非DHP代表：氟桂利嗪(flunarizine)、普尼拉明(prenylamine)、地爾硫卓、芬地林(fendiline)、加洛帕米(gallopamil)、米貝地爾(mibefradil)、阿尼帕米(anipamil)、替阿帕米(tiapamil)及維拉帕米，或其醫藥學上可接受之鹽。CCB可用作抗高血壓、抗心絞痛或抗心律不整之藥物。
術語「利尿劑」包括噻嗪衍生物(例如氯噻嗪、氫氯噻嗪、甲氯噻嗪及氯噻酮)。
術語「ApoA-I模擬物」包括D4F肽(例如式D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F)
血管收縮素II受體拮抗劑或其醫藥學上可接受之鹽理解為結合於血管收縮素II受體之AT1受體亞型但未導致該受體活化之活性成分。由於AT1受體之抑制，此等拮抗劑可例如用作抗高血壓藥或用於治療充血性心臟衰竭。
AT1受體拮抗劑之類別包含具有不同結構特徵之化合物，基本上較佳為非肽化合物。舉例而言，可提及選自由以下組成之群之化合物：纈沙坦(valsartan)、洛沙坦(losartan)、坎地沙坦(candesartan)、依普羅沙坦(eprosartan)、依貝沙坦(irbesartan)、沙普立沙坦(saprisartan)、他索沙坦(tasosartan)、替米沙坦(telmisartan)、命名為E-1477之下式化合物 命名為SC-52458之下式化合物 及命名為ZD-8731之下式化合物 或在各種情況下，其醫藥學上可接受之鹽。
較佳AT1受體拮抗劑為坎地沙坦、依普羅沙坦、伊貝沙坦、洛沙坦、替米沙坦、纈沙坦。已銷售之彼等藥劑亦較佳，最佳為纈沙坦或其醫藥學上可接受之鹽。
術語「抗糖尿病劑」包括胰島素分泌增強劑，其促進自胰腺β-細胞分泌胰島素。實例包括雙胍衍生物(例如二甲雙胍(metformin))、磺醯脲(SU)(例如甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、乙醯苯磺醯環己脲(acetohexamide)、4-氯-N-[(1-吡咯啶基胺基)羰基]-苯磺醯胺(格列派得(glycopyramide))、格列本脲(glibenclamide)(格列瑞得(glyburide))、格列齊特(gliclazide)、1-丁基-3-間胺苯磺醯基脲、磺胺丁脲(carbutamide)、格列波脲(glibonuride)、格列吡嗪(glipizide)、格列喹酮(gliquidone)、格列派特(glisoxepid)、格列噻唑(glybuthiazole)、格列丁唑(glibuzole)、格列己脲(glyhexamide)、格列嘧啶(glymidine)、格列平脲(glypinamide)、苯磺丁脲(phenbutamide)及甲苯環脲(tolylcyclamide))或其醫藥學上可接受之鹽。其他實例包括苯丙胺酸衍生物(例如下式之那格列奈(nateglinide)[N-(反式-4-異丙基環己基羰基)-D-苯丙胺酸](參見EP 196222及EP 526171) 瑞格列奈(repaglinide)[(S)-2-乙氧基-4-{2-[[3-甲基-1-[2-(1-哌啶 基)苯基]丁基]胺基]-2-側氧基乙基}苯甲酸](參見EP 589874、EP 147850 A2(詳言之第61頁之實例11)及EP 207331 A1)；(2S)-2-苯甲基-3-(順-六氫-2-異吲哚啉基羰基)-丙酸鈣二水合物(例如米格列奈(mitiglinide)(參見EP 507534))；及格列美脲(格列美脲)(參見EP 31058)。
本發明之生物結合物可與之組合使用的第二藥劑的其他實例包括DPP-IV抑制劑、GLP-1及GLP-1促效劑。
DPP-IV負責使GLP-1不活化。更特定言之，DPP-IV產生GLP-1受體拮抗劑且由此縮短對GLP-1之生理反應。GLP-1為胰腺胰島素分泌之主要刺激劑，且對葡萄糖處置具有直接有益效應。
DPP-IV(二肽基肽酶IV)抑制劑可為肽或較佳為非肽。DPP-IV抑制劑在各種情況下一般地及特定地揭示於例如WO 98/19998、DE 196 16 486 A1、WO 00/34241及WO 95/15309中，在各種情況下詳言之在化合物申請專利範圍及實施例之最終產物中，最終產物、醫藥製劑及申請專利範圍之標的物以引用此等公開案之方式併入本申請案中。較佳為分別特定揭示於WO 98/19998之實例3及WO 00/34241之實例1中之彼等化合物。
GLP-1(類升糖素肽-1)為一種促胰島素蛋白質，其描述於例如W.E.Schmidt等人，Diabetologia,28,1985,704-707中及US 5,705,483中。
術語「GLP-1促效劑」包括GLP-1(7-36)NH2之變異體及類似物，其特別揭示於US 5,120,712、US 5,118666、US 5,512,549、WO 91/11457及C.Orskov等人，J.Biol.Chem.264(1989)12826中。其他實例包括GLP-1(7-37)，其中GLP-1(7-36)NH2分子之Arg36之羧基端醯胺官能基經在第37位之Gly移位之化合物及其變異體及類似物，包括GLN9-GLP-1(7-37)、D-GLN9-GLP-1(7-37)、乙醯基LYS9-GLP-1(7- 37)、LYS18-GLP-1(7-37)，及尤其GLP-1(7-37)OH、VAL8-GLP-1(7-37)、GLY8-GLP-1(7-37)、THR8-GLP-1(7-37)、MET8-GLP-1(7-37)及4-咪唑并丙醯基-GLP-1。亦特別較佳為由Greig等人在Diabetologia 1999,42,45-50中所述之GLP促效劑類似物腸促胰島素類似物-4。
同樣包括在定義「抗糖尿病劑」中之為胰島素敏感度增強劑，其恢復減弱之胰島素受體功能，以減小胰島素抗性且因此增強胰島素敏感度。實例包括降血糖噻唑啶二酮衍生物(例如格列酮(glitazone)、(S)-((3,4-二氫-2-(苯基-甲基)-2H-1-苯并吡喃-6-基)甲基-噻唑啶-2,4-二酮(恩格列酮(englitazone))、5-{[4-(3-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-1-側氧基丙基)-苯基]-甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(達格列酮(darglitazone))、5-{[4-(1-甲基-環己基)甲氧基)-苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(環格列酮(ciglitazone))、5-{[4-(2-(1-吲哚基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(DRF2189)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-乙氧基)]苯甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(BM-13.1246)、5-(2-萘磺醯基)-噻唑啶-2,4-二酮(AY-31637)、雙{4-[(2,4-二側氧基-5-噻唑啶基)甲基]苯基}甲烷(YM268)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-2-羥基乙氧基]苯甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(AD-5075)、5-[4-(1-苯基-1-環丙烷羰基胺基)-苯甲基]-噻唑啶-2,4-二酮(DN-108)、5-{[4-(2-(2,3-二氫吲哚-1-基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮、5-[3-(4-氯-苯基])-2-丙炔基]-5-苯磺醯基)噻唑啶-2,4-二酮、5-[3-(4-氯苯基])-2-丙炔基]-5-(4-氟苯基-磺醯基)噻唑啶-2,4-二酮、5-{[4-(2-(甲基-2-吡啶基-胺基)-乙氧基)苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(羅格列酮(rosiglitazone))、5-{[4-(2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基)苯基]-甲基}噻唑啶-2,4-二酮(吡格列酮(pioglitazone))、5-{[4-((3,4-二氫-6-羥基-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基)-苯基]-甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(曲格列酮(troglitazone))、5-[6-(2-氟-苯甲氧基)萘-2-基甲基]-噻唑啶-2,4-二酮(MCC555)、5-{[2-(2-萘基)-苯并噁唑-5- 基]-甲基}噻唑啶-2,4-二酮(T-174)及5-(2,4-二側氧基噻唑啶-5-基甲基)-2-甲氧基-N-(4-三氟甲基-苯甲基)苯甲醯胺(KRP297))。
其他抗糖尿病劑包括胰島素信號傳導路徑調節劑，如蛋白質酪胺酸磷酸酶(PTPase)之抑制劑、抗糖尿病非小分子模擬化合物及麩醯胺酸-果糖-6-磷酸鹽醯胺轉移酶(GFAT)之抑制劑；影響失調肝葡萄糖產生之化合物，如葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)之抑制劑、果糖-1,6-二磷酸酶(F-1,6-Bpase)之抑制劑、肝糖磷酸化酶(GP)之抑制劑、升糖素受體拮抗劑及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)之抑制劑；丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)抑制劑；胃排空抑制劑；胰島素；GSK-3之抑制劑；類視黃素X受體(RXR)促效劑；β-3 AR之促效劑；解偶聯蛋白質(UCP)之促效劑；非格列酮型PPARγ促效劑；雙重PPARα/PPARγ促效劑；抗糖尿病含釩化合物；腸促胰島素激素，如類升糖素肽-1(GLP-1)及GLP-1促效劑；β-細胞咪唑啉受體拮抗劑；米格列醇(miglitol)；α2-腎上腺素激導性拮抗劑；及其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施例中，本發明提供一種組合，詳言之一種醫藥組合，其包含治療有效量之根據實施例1至31中之任一者之生物結合物，及一或多種選自以下之治療活性劑：β-腎上腺素激導性受體阻斷劑，諸如醋丁洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾、比索洛爾、美托洛爾、納多洛爾、普萘洛爾、索他洛爾及噻嗎洛爾；血管收縮素II受體拮抗劑，諸如AT1阻斷劑；抗糖尿病劑，諸如DPPIV抑制劑(例如維格列汀)及GLP1肽促效劑。
術語「減肥劑」包括脂肪酶抑制劑(例如奧利司他(orlistat))及食慾抑制劑(例如西布曲明(sibutramine)及苯丁胺(phentermine))。
醛固酮合成酶抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽理解為具有抑制醛固酮產生之特性的活性成分。醛固酮合成酶(CYP11B2)為催化腎上腺皮質中醛固酮產生之最後步驟(亦即11-去氧皮質酮轉化成醛固酮)之 粒線體細胞色素P450酶。用所謂醛固酮合成酶抑制劑抑制醛固酮產生已知為治療血鉀過低、高血壓、充血性心臟衰竭、心房纖維性顫動或腎衰竭之成功變化形式。該醛固酮合成酶抑制活性易於由熟習此項技術者根據標準分析(例如US 2007/0049616)來測定。
醛固酮合成酶抑制劑之類別包含類固醇及非類固醇醛固酮合成酶抑制劑，後者為最佳。
較佳為市售之醛固酮合成酶抑制劑或已由衛生當局批准之彼等醛固酮合成酶抑制劑。
醛固酮合成酶抑制劑之類別包含具有不同結構特徵之化合物。非類固醇醛固酮合成酶抑制劑之實例為下式之法屈唑之鹽酸鹽的(+)-對映異構體(美國專利4617307及4889861)
或若可用，其醫藥學上可接受之鹽。
適用於該組合之醛固酮合成酶抑制劑為一般地及特定地揭示於例如US2007/0049616中，詳言之化合物申請專利範圍及實施例之最終產物中之化合物及類似物，最終產物、醫藥製劑及申請專利範圍之標的物以引用此公開案之方式併入本申請案中。適用於本發明之較佳醛固酮合成酶抑制劑包括(但不限於)4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-3-甲基苯甲腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸(4-甲氧基苯甲基)甲基醯胺；4'-氟-6-(6,7,8,9-四氫-5H-咪唑并[1,5-a]氮呯-5-基)聯苯-3-甲腈；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸丁酯；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苯甲腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸4-氟苯甲酯；5-(4-氰基-2-三氟甲氧基苯基)-6,7- 二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸甲酯；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸2-異丙氧基乙酯；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲基苯甲腈；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-3-氟苯甲腈；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苯甲腈；3-氟-4-(7-亞甲基-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)苯甲腈；順-3-氟-4-[7-(4-氟-苯甲基)-5,6,7,8-四氫-咪唑并[1,5-a]吡啶-5-基]苯甲腈；4'-氟-6-(9-甲基-6,7,8,9-四氫-5H-咪唑并[1,5-a]氮呯-5-基)聯苯-3-甲腈；4'-氟-6-(9-甲基-6,7,8,9-四氫-5H-咪唑并[1,5-a]氮呯-5-基)聯苯-3-甲腈或在各種情況下，其(R)或(S)對映異構體；或若可用，其醫藥學上可接受之鹽。
術語醛固酮合成酶抑制劑亦包括WO2008/076860、WO2008/076336、WO2008/076862、WO2008/027284、WO2004/046145、WO2004/014914、WO2001/076574中所揭示之化合物及類似物。
此外，醛固酮合成酶抑制劑亦包括美國專利申請案US2007/0225232、US2007/0208035、US2008/0318978、US2008/0076794、US2009/0012068、US20090048241及PCT申請案WO2006/005726、WO2006/128853、WO2006128851、WO2006/128852、WO2007065942、WO2007/116099、WO2007/116908、WO2008/119744及歐洲專利申請案EP 1886695中所揭示之化合物及類似物。適用於本發明之較佳醛固酮合成酶抑制劑包括(但不限於)如由Speedel開發之8-(4-氟苯基)-5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c1[1,4]噁嗪；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2-氟苯甲腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2,6-二氟苯甲腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2-甲氧基苯甲腈；3-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苯甲腈；4-(5,6-二氫-8H- 咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)酞腈；4-(8-(4-氰基苯基)-5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苯甲腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苯甲腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)萘-1-甲腈；8-[4-(1H-四唑-5-基)苯基]-5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪或在各種情況下，其(R)或(S)對映異構體；或若可用，其醫藥學上可接受之鹽。
適用於該組合之醛固酮合成酶抑制劑為一般地及特定地揭示於例如WO 2009/156462及WO 2010/130796中，詳言之化合物申請專利範圍及實施例之最終產物中之化合物及類似物，最終產物、醫藥製劑及申請專利範圍之標的物。適用於本發明組合之較佳醛固酮合成酶抑制劑包括3-(6-氟-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚-1-基甲基)-苯甲腈鹽酸鹽、1-(4-甲磺醯基-苯甲基)-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚、2-(5-苯甲氧基-吡啶-3-基)-6-氯-1-甲基-1H-吲哚、5-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-菸鹼酸乙酯、N-[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺醯胺、吡咯啶-1-磺酸5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基酯、N-甲基-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺醯胺、6-氯-1-甲基-2-{5-[(2-吡咯啶-1-基-乙胺基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-2-[5-(4-甲磺醯基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-3-基]-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-1-甲基-2-{5-[(1-甲基-哌啶-4-基胺基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、嗎啉-4-甲酸[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-醯胺、N-[5-(6-氯-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺醯胺，C,C,C-三氟-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺醯胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-4-三氟甲基-苯磺醯胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-1-苯基-甲磺醯胺、N-(5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)丁-1-磺醯胺、N-(1-(5-(4-氰基-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)乙基)乙磺醯胺、N-((5-(3-氯-4-氰 基苯基)吡啶-3-基)(環丙基)甲基)乙磺醯胺、N-(環丙基(5-(1H-吲哚-5-基)吡啶-3-基)甲基)乙磺醯胺、N-(環丙基(5-萘-1-基-吡啶-3-基)甲基)乙磺醯胺、乙磺酸[5-(6-氯-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-吡啶-3-基甲基]-醯胺及乙磺酸{[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-環丙基-甲基}-乙基-醯胺。
術語「內皮素受體阻斷劑」包括波生坦及安立生坦(ambrisentan)。
術語「CETP抑制劑」係指抑制膽固醇酯轉移蛋白(CETP)介導之自HDL轉運各種膽固醇酯及甘油三酯至LDL及VLDL之化合物。該CETP抑制活性易於由熟習此項技術者根據標準分析(例如美國專利第6,140,343號)來測定。實例包括美國專利第6,140,343號及美國專利第6,197,786號中所揭示之化合物(例如[2R,4S]4-[(3,5-雙-三氟甲基-苯甲基)-甲氧羰基-胺基]-2-乙基-6-三氟甲基-3,4-二氫-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(托塞曲匹(torcetrapib))；美國專利第6,723,752號中所揭示之化合物(例如(2R)-3-{[3-(4-氯-3-乙基-苯氧基)-苯基]-[[3-(1,1,2,2-四氟-乙氧基)-苯基]-甲基]-胺基}-1,1,1-三氟-2-丙醇)；美國專利申請案第10/807,838號中所揭示之化合物；美國專利第5,512,548號中所揭示之多肽衍生物；分別揭示於J.Antibiot.,49(8)：815-816(1996)及Bioorg.Med.Chem.Lett.；6：1951-1954(1996)中之玫瑰菌素衍生物及膽固醇酯之含磷酸鹽類似物。此外，CETP抑制劑亦包括揭示於WO2000/017165、WO2005/095409、WO2005/097806、WO 2007/128568、WO2008/009435、WO 2009/059943及WO2009/071509中之彼等化合物。
術語「NEP抑制劑」係指抑制中性內肽酶(NEP)EC 3.4.24.11之化合物。實例包括坎沙曲(Candoxatril)、坎沙曲拉(Candoxatrilat)、右卡多曲(Dexecadotril)、依卡曲爾(Ecadotril)、消旋卡多曲 (Racecadotril)、山帕曲拉(Sampatrilat)、法西多曲(Fasidotril)、奧馬曲拉(Omapatrilat)、傑莫曲拉(Gemopatrilat)、達魯曲(Daglutril)、SCH-42495、SCH-32615、UK-447841、AVE-0848、PL-37及(2R,4S)-5-聯苯-4-基-4-(3-羧基-丙醯胺基)-2-甲基-戊酸乙酯或其醫藥學上可接受之鹽。NEP抑制劑亦包括如美國專利第US 5,155,100號中所揭示之經膦醯基/聯芳基取代之二肽衍生物。NEP抑制劑亦包括如PCT申請案第WO 2003/104200號中所揭示之N-巰基醯基苯丙胺酸衍生物。NEP抑制劑亦包括如PCT申請案第WO 2008/133896號、第WO 2009/035543號或第WO 2009/134741號中所揭示之雙作用抗高血壓劑。其他實例包括美國申請案第12/788,794號、第12/788,766號及第12/947,029號中所揭示之化合物。NEP抑制劑亦包括WO 2010/136474、WO 2010/136493、WO 2011/061271及美國臨時申請案第61/414171號及第61/414163號中所揭示之化合物。
在一個實施例中，本發明提供一種活化個體之APJ受體的方法，其中該方法包含向該個體投與治療有效量之根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體。
在一個實施例中，本發明提供一種治療個體之對APJ受體之活化有反應之病症或疾病的方法，其中該方法包含向該個體投與治療有效量之根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體。
在一個實施例中，本發明提供一種治療個體之對APJ受體之活化(促效作用)有反應之病症或疾病的方法，其中該病症或該疾病係選自急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒 傷(包括曬傷)及子癇前症。
在一個實施例中，本發明提供一種根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體，以用作藥劑。
在一個實施例中，本發明提供根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體之用途，其係用於製造藥劑，以用於治療對APJ受體之活化有反應的病症或疾病。在另一實施例中，本發明提供根據前述實施例中之任一者之生物結合物或其多聚體之用途，其係用於製造藥劑，以用於治療對APJ受體之活化有反應的病症或疾病，其中該病症或疾病詳言之係選自急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
本發明之範例：用於與半衰期延長部分結合之肽及多肽合成
以下肽係藉由標準固相Fmoc化學方法合成。在PreludeTM肽合成器(Protein Technologies,Inc.,Tucson,USA)上組裝肽。由2-氯三苯甲 基氯-PS-樹脂(ABCR,Karlsruhe,Germany)合成在C端具有游離羧酸之肽。由受Fmoc保護之Rink-Amide-AM-PS-樹脂(Merck,Darmstadt,Germany)合成在C端具有未經取代之甲醯胺的肽。由負載有胺之BAL-AM-PS樹脂(EMC Microcollections,Tübingen,Germany)合成在C端具有經N-單取代之甲醯胺的肽。
肽係藉由製備型逆相HPLC來純化。使用以下管柱：
●Waters SunFire Prep C18 OBD管柱，5μm，30×100mm，部件編號186002572(一根管柱或串聯之兩根管柱)
●Waters SunFire Prep C18 OBD管柱，5μm，30×50mm，部件編號186002572
●Waters SunFire Prep C18 OBD管柱，5μm，30×150mm，部件編號186002797
●Waters Atlantis Prep OBD T3管柱，5μm，30×150mm，部件編號186003703
●Waters XBridge Prep C8 OBD管柱，5μm，30×150mm，部件編號186003083
●Machery-Nagel Nucleosil® 100-5 C18，5μm，250×40mm，部件編號715340.400
移動相由溶離劑A(含0.1% TFA之H2O)及溶離劑B(ACN)組成。梯度係基於分離問題之特定需求而設計。純產物係自ACN/H2O凍乾。
藉由使用λ=214nm處之UV偵測的HPLC及使用電噴霧電離的UPLC-MS對產物進行分析。
使用下文描述之通用程序合成例示於表4中之肽。未經取代之N或C端分別由小斜體H-或-OH指示。
分析方法 1a)HPLC-分析方法A
●管柱：具有ProntoSil 120-3-C18-H之Bischoff UHC-640(53×4.0mm)，3μm；部件編號：0604F185PS030
●溶離劑A：含0.07% TFA之水/溶離劑B：含0.1% TFA之ACN
●流量：1.5ml/min
●溫度：40℃
●梯度：
1b)UPLC-分析方法B
●管柱：XBridge BEH300 C18(100×4.6mm)，3μm；部件編號：186003612
●溶離劑A：含0.1% TFA之水/溶離劑B：含0.1% TFA之ACN
●流量：1.0ml/min
●溫度：40℃
●梯度：
2a)UPLC-MS-分析方法C
●Waters Acquity UPLC® BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；部件編號：186002350
●溶離劑A：含0.1% FA之水；溶離劑B：含0.1% FA之ACN
●流量：0.7ml/min
●溫度40℃
●梯度：
實例1至54之肽之分析資料彙總於表5中，且使用上文描述之分析方法產生。
3)分析方法D：
●XBridge C18管柱，3.5μm，3.0×30mm
●溶離劑：A：水(0.1%甲酸)；B：CAN
●流速：2mL/min
●梯度：0min 40% B；1.70min內40%至95% B；2.0min 95% B；2.1min 40% B
●質譜儀：掃描範圍150-1600之單級四極桿ESI
●HPLC：Agilent 1100系列
●溫度：40℃
通用合成程序 1)將第一胺基酸負載至2-氯三苯甲基氯樹脂上且移除Fmoc
用DCM充分洗滌2-氯三苯甲基氯樹脂(1當量，1.0-1.6mmol/g)。將所需胺基酸(就1.6mmol/g負載量而言，通常相對於樹脂0.5-2當量)溶解於DCM(每公克樹脂約10mL)及DIPEA(就1.6mmol/g負載量而言，相對於樹脂4當量)中。將溶液添加至樹脂中，且在室溫下震盪懸浮液19小時。將樹脂排出，且隨後依次用DCM/MeOH/DIPEA(17：2：1)、DCM、DMA、DCM充分洗滌。
為移除Fmoc及測定負載量，將樹脂反覆地與哌啶/DMA(1：4)或4-甲基哌啶/DMA(1：4)(12×每公克初始樹脂10mL)一起震盪，且用DMA(2×每公克初始樹脂10mL)洗滌。用MeOH將合併之溶液稀釋至每公克初始樹脂250mL之體積 V 。用MeOH將此溶液之2mL等分試樣( V a )進一步稀釋至250mL( V t )。以MeOH為參考在299.8nm下量測UV吸收，得到吸收 A 。依次用DMA、DCM、DMA、DCM充分洗滌樹脂，且將其在40℃下之高真空中乾燥，得到 m g樹脂。
根據下式計算樹脂之負載量：負載量[mol/g]=(A×V t ×V)/(d×ε×V a ×m)
(其中d：光析槽之寬度；ε=7800L mol-1 cm-1)
2)Prelude TM 合成器上之固相肽合成 2a)合成循環A
用DMA洗滌樹脂。藉由反覆用4-甲基哌啶/DMA(1：4)處理來移除 Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由如下步驟進行偶合，添加Fmoc-胺基酸(3當量；NMP中之0.2M溶液)、HCTU(3當量；NMP中之0.3M溶液)及DIPEA(3.3當量；NMP中之0.66M溶液)，接著在室溫下將懸浮液與氮氣混合，持續通常15分鐘至4小時，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶合步驟1至3次，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物及隨後在室溫下混合懸浮液來進行封端。用DMA洗滌樹脂。
2b)合成循環B
用DMA洗滌樹脂。藉由反覆用哌啶/DMA(1：4)處理來移除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由如下步驟進行偶合，添加Fmoc-胺基酸(3當量；NMP中之0.3M溶液)、HCTU(3當量；NMP中之0.3M溶液)及DIPEA(4.5當量；NMP中之0.9M溶液)，接著在室溫下將懸浮液與氮氣混合，持續通常15分鐘至4小時，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶合步驟1至3次，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物及隨後在室溫下混合懸浮液來進行封端。用DMA洗滌樹脂。
2c)合成循環C
用DMA洗滌樹脂。藉由反覆用哌啶/DMA(1：4)處理來移除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由如下步驟進行偶合，添加Fmoc-胺基酸(3當量；NMP中之0.3M溶液)、HCTU(3當量；NMP中之0.3M溶液)及DIPEA(6當量；NMP中之0.9M溶液)，接著在室溫下將懸浮液與氮氣混合，持續通常15分鐘至4小時，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶合步驟1至3次，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物及隨後在室溫下混合懸浮液來進行封端。用DMA洗滌樹脂。
2d)合成循環D
用DMA洗滌樹脂。藉由反覆用4-甲基哌啶/DMA(1：4)處理來移除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由如下步驟進行偶合，添加Fmoc-胺基酸及Oxyma Pure之混合物(各3當量；兩者於NMP中之0.2M溶液)及DIC(3當量；NMP中之0.3M溶液)，接著在室溫下將懸浮液與氮氣混合，持續通常15分鐘至4小時，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶合步驟1至3次，視特定需求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物及隨後在室溫下混合懸浮液來進行封端。用DMA洗滌樹脂。
3)在有或無伴隨移除保護基之情況下自樹脂裂解 3a)裂解方法A
在室溫下將樹脂(0.1mmol)與95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)(3mL)一起震盪2小時。過濾出裂解溶液，且添加新鮮溶液(3mL)。在室溫下震盪懸浮液1小時，隨後過濾出裂解溶液。添加新鮮溶液(3mL)，且在室溫下震盪懸浮液1小時。過濾出裂解溶液。將合併之裂解溶液緩慢倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)混合物(35mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(10mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。在高真空中乾燥固體。
3b)裂解方法B
用95%水性TFA/EDT(4：1)(0.75mL)處理樹脂(0.1mmol)且在室溫下震盪懸浮液1小時。添加95%水性TFA(2.18mL)及TIS(75μL)之混合物且恢復在室溫下震盪1小時。過濾出裂解溶液，接著添加95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)(3mL)至樹脂且在室溫下震盪懸浮液1小時。過濾出裂解溶液且收集並添加新鮮溶液(3mL)。在室溫下震盪懸浮液1小時，隨後過濾出裂解溶液。將合併之裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)(35mL)上。使由此形成之沈澱物沈降，離心，接著小心地 倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(10mL)洗滌沈澱物一次，將懸浮液離心且倒出上清液。高真空乾燥殘餘物。
3c)裂解方法C
將HFIP/DCM(30：70)(5mL)添加至樹脂(0.1mmol)且在室溫下攪拌懸浮液1.5小時。過濾出裂解溶液且收集並添加新鮮HFIP/DCM(30：70)(5mL)。在室溫下攪拌懸浮液30分鐘。過濾出裂解溶液且收集。用DCM(2×5mL)洗滌樹脂，亦加以收集。合併之裂解及洗滌溶液高真空濃縮至乾燥。殘餘物自tBuOH/H2O(1：1)凍乾。
4)環化方法 4a)環化方法A(二硫鍵形成)
將完全脫除保護基之線狀前驅體肽溶解於H2O/DMSO(9：1)或(4：1)中以通常得到1-15mg/mL之濃度。接著在室溫下攪拌反應混合物，視需求而定持續通常40小時，且隨後高真空濃縮至乾燥。
4b)環化方法B(二硫鍵形成)
將完全脫除保護基之線狀前驅體肽(1當量)溶解於H2O中以通常得到10mg/mL之濃度。向攪拌溶液中一次性添加50mM I2於AcOH(1.2當量)中之溶液且在室溫下攪拌反應物10分鐘。添加含0.5M抗壞血酸之H2O(1.5當量)以淬滅過量I2。溶液真空濃縮至幾乎乾燥。
4c)環化方法C(兩種二硫鍵之選擇性形成)
將部分受保護之線狀前驅體肽(1當量)(兩個半胱胺酸受Acm保護且兩個半胱胺酸未受保護)溶解於AcOH/H2O(4：1)中以通常得到1mg/mL之濃度。添加含50mM I2之AcOH(2當量)且在室溫下攪拌反應混合物1小時。經4小時再逐份添加含50mM I2之AcOH(10當量)。在21小時後，反應混合物真空濃縮至幾乎乾燥且過量添加含1M抗壞血酸之H2O以淬滅未反應之I2。
4d)環化方法D(側鏈之間形成內醯胺)
將完全脫除保護基之線狀前驅體肽(1當量)及HATU(1.5當量)溶解於NMP中(肽濃度：通常1mmol/L)。添加DIPEA(3當量)且在室溫下攪拌溶液90分鐘。反應混合物真空濃縮至乾燥。
4e)環化方法E(側鏈與C端之間形成內醯胺)
用2,6-二甲基吡啶(20當量)處理肽(1當量)、HATU(1.3當量)及HOAt(1.3當量)於DMF中之溶液(肽濃度：2.6mmol/L)，且在室溫下攪拌反應物2小時。反應混合物真空濃縮至乾燥。
下文中描述代表性實例之合成。
肽1 pE-R-P-R-L-K-H-F-G-P-Nle-D-苯乙胺(內醯胺K6-D12)之合成
●中間物1a之製備
(線狀肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對苯乙胺-BAL-PS樹脂(167mg，0.100mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物1b之製備
(自樹脂裂解，伴隨保護基移除，隨後純化)
將95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)(2mL)混合物添加至中間物1a(0.1mmol)中，且在室溫下震盪懸浮液2.5小時。過濾出裂解溶液，且添加新鮮裂解溶液(2mL)。在室溫下震盪懸浮液45分鐘，隨後過濾出裂解溶液。添加新鮮溶液(2mL)，且在室溫下震盪懸浮液45分鐘。過濾出裂解溶液，且用95%水性TFA(1mL)洗滌樹脂。將合併之裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)(35mL)混合物上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(20mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。高真空乾燥固體。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到不同品質之兩個批次的呈白色固體狀之中間物1b：批次A(35.9mg(98%純度)，0.018mmol)及批次B(52.9mg(80%純度)，0.021mmol)。
●肽1之製備
(環化及純化)
來自先前步驟之兩個批次分別按照相同方案處理：批次A：在室溫下攪拌肽(35.9mg(98%純度)，0.018mmol)及HATU(10.0mg，0.026mmol)於NMP(18mL)及DIPEA(9.2μL，0.053mmol)中之溶液2小時。
批次B：在室溫下攪拌肽(52.9mg(80%純度)，0.021mmol)及HATU(14.5mg，0.038mmol)於NMP(26mL)及DIPEA(13.0μL，0.076mmol)中之溶液2小時。
各批次真空濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC分離產物。合併兩種純化之純溶離份且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽1(52.0mg，0.025mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=4.16min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=511.2，計算值：[M+3]3+=511.3)分析純產物。
肽5 pE-R-P-R-L-K-F-K-G-P-Nle-F(內醯胺K6-C端)之合成
●中間物5a之製備
(使2-氯三苯甲基氯樹脂負載有Fmoc-F-OH，移除Fmoc及測定樹脂之負載量)
以類似於上述通用程序之方式使2-氯三苯甲基氯樹脂(10.0g， 16.0mmol)與Fmoc-F-OH(6.24g，32.0mmol)於DCM(100mL)及DIPEA(11.2mL，64.0mmol)中之溶液反應以得到中間物5a(12.8g，負載量=0.79mmol/g)。
●中間物5b之製備
(線狀肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間物5a(0.100mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物5c之製備
(移除ivDde及自樹脂裂解)
中間物5b(0.100mmol)用肼單水合物(0.081mL，1.67mmol)於DMA(4mL)中之溶液處理6次，持續10分鐘。隨後，樹脂用肼單水合物(0.081mL，1.67mmol)於THF(4mL)中之溶液處理三次，持續20分鐘。用DCM(3×)洗滌樹脂。將HFIP/DCM(30：70)(5mL)添加至樹脂(0.100mmol)且在室溫下攪拌懸浮液1.5小時。過濾出裂解溶液且添加新鮮HFIP/DCM(30：70)(5mL)。在室溫下攪拌懸浮液30分鐘。過濾出裂解溶液。用DCM(2×5mL)洗滌樹脂。合併之裂解及洗滌溶液真空濃縮至乾燥。殘餘物自tBuOH/H2O(1：1)凍乾以得到中間物5c(187mg，0.090mmol)。
●肽5之製備
(環化及保護基移除)
用2,6-二甲基吡啶(0.210mL，1.80mmol)處理中間物5c(187mg，0.090mmol)、HATU(44.6mg，0.117mmol)及HOAt(16.0mg，0.117mmol)於DMF(35mL)中之溶液，且在室溫下攪拌反應物2小時。反應混合物真空濃縮至乾燥。將殘餘中間物5d溶解於95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)(5mL)中且在室溫下攪拌溶液2.5小時。將裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)(30mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(10mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。重複洗滌步驟一次。高真空乾燥殘餘物。藉由製備型HPLC分離產物且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽5(41.4mg，0.023mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.70min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=484.5，計算值：[M+3]3+=484.6)分析純產物。
肽7 Q-R-P-R-L-C-F-K-G-P-Nle-C-F-G-G(內醯胺N端-C端)之合成
●中間物7a之製備
(使2-氯三苯甲基氯樹脂負載有Fmoc-Gly-OH，Fmoc移除及測定樹脂之負載量)
以類似於上述通用程序之方式使2-氯三苯甲基氯樹脂(2.00g，3.20mmol)與Fmoc-Gly-OH(0.476g，1.60mmol)於DCM(20mL)及DIPEA(2.24mL，12.8mmol)中之溶液反應，得到中間物7a(2.22g；負載量=0.68mmol/g)。
●中間物7b之製備
(線狀肽之組裝及Fmoc移除)
在PreludeTM肽合成器上對中間物7a(147mg，0.100mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
在肽組裝後，藉由反覆用哌啶/DMA(1：4)處理來移除Fmoc。用DMA洗滌樹脂得到中間物7b(0.100mmol)。
●中間物7c之製備
(自樹脂HFIP裂解)
將HFIP/DCM(30：70)(3mL)添加至中間物7b(0.100mmol)且在室溫下震盪懸浮液1.5小時。過濾出裂解溶液且添加新鮮HFIP/DCM(30：70)(3mL)。在室溫下震盪懸浮液30分鐘。過濾出裂解溶液。用DCM(2×3mL)洗滌樹脂。合併之裂解及洗滌溶液真空濃縮至乾燥。殘餘物自tBuOH/H2O(1：1)凍乾以得到中間物7c(203mg，0.067mmol)。
●中間物7d之製備
(主鏈環化)
用2,6-二甲基吡啶(0.157ml，1.35mmol)處理中間物7c(203mg，0.067mmol)、HATU(33.3mg，0.088mmol)及HOAt(11.9mg，0.088mmol)於DMF(40mL)中之溶液，且在室溫下攪拌反應物2小時。反應 混合物真空濃縮至乾燥以得到中間物7d(0.067mmol)。
●中間物7e之製備
(移除保護基，隨後純化)
將95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)(3mL)混合物添加至中間物7d(0.067mmol)中，且在室溫下震盪懸浮液2.5小時。將溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)混合物(30mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(10mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。重複洗滌步驟一次。高真空乾燥固體。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之中間物7e(33.6mg，0.017mmol)。
●肽7之製備
(環化及純化)
將中間物7e(33.6mg，0.017mmol)溶解於H2O/DMSO(9：1)(30mL)中。在室溫下攪拌反應混合物40小時，接著真空濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽7(21.0mg；0.010mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.85min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=553.6，計算值：[M+3]3+=553.6)分析純產物。
肽8 pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫鍵C6-C12)之合成
●中間物8a之製備
(使2-氯三苯甲基氯樹脂負載有Fmoc-F-OH，移除Fmoc及測定樹脂之負載量)
用DCM(3×)洗滌2-氯三苯甲基氯樹脂(40.0g，64.0mmol)。添加Fmoc-F-OH(24.8g，64.0mmol)於DCM(400mL)及DIPEA(44.7mL，256mmol)中之溶液且在室溫下震盪懸浮液22小時。用DCM/MeOH/DIPEA(17：2：1)(3×)、DCM(3×)、DMA(3×)、DCM(3×)充分洗滌樹脂。
樹脂接著用哌啶/DMA(1：4)混合物(400mL)處理四次，持續10分鐘，隨後用DMA(2×180ml)洗滌。收集哌啶/DMA溶液及DMA洗滌溶液用於測定樹脂之負載量。1mL合併之溶液用MeOH稀釋至500mL，且在299.8nm下之UV吸收經量測為A=0.368。此對應於46.2mmol之Fmoc量。
用DCM(3×)、DMA(3×)、DCM(3×)充分洗滌樹脂且真空乾燥以 得到中間物8a(50.7g；負載量=0.91mmol/g)。
●中間物8b之製備
(線狀肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間物8a(2.64g,2.40mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物8c之製備
(自樹脂裂解，伴隨保護基移除)
用DCM(4×)仔細洗滌中間物8b(2.40mmol)。添加95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)混合物(50mL)且在室溫下震盪懸浮液1小時。過濾出裂解溶液，且添加新鮮裂解溶液(35mL)。在室溫下震盪懸浮液1小時，隨後過濾出裂解溶液。添加新鮮溶液(35mL)，且在室溫下震盪懸浮液1小時。過濾出裂解溶液。將合併之裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)攪拌混合物(500mL)上，得到沈澱物。在室溫下攪拌懸浮液2小時且隨後使沈澱物沈降。用玻璃料吸出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(2×100mL)洗滌殘餘物，用玻璃料吸出上清液。高真空乾燥固體以得到呈灰白色固體狀之中間物8c(3.75g，1.88mmol)。
●肽8之製備
(環化及純化)
將中間物8c(3.75g，1.88mmol)溶解於H2O(375mL)中。向攪拌 溶液中一次性添加50mM I2於AcOH(45.1mL，2.26mmol)中之溶液且在室溫下攪拌溶液10分鐘。添加含0.5M抗壞血酸之H2O(5.64mL，2.82mmol)以淬滅過量I2。溶液濃縮至幾乎乾燥。反應分兩部分進行：0.188mmol規模及1.69mmol規模。合併粗物質用於純化。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽8(1.53g，0.767mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.43min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=512.4，計算值：[M+3]3+=512.6)分析純產物。
或者，將粗物質肽8溶解於水(500mL水/mmol多肽)中且藉助於離子交換樹脂(亦即Amberlite IRA-67(乙酸鹽形式)(200g/mmol多肽)轉化成乙酸鹽，藉由製備型HPLC(來自Daisogel之C8經修飾逆相矽膠，梯度：ACN/H2O：3% ACN及97%[混合物0.3%乙酸/水]直至12% ACN及88%[混合物0.3%乙酸/水])純化並凍乾，得到呈白色固體狀之肽8之乙酸鹽(60-100%產率)。
基於乙酸含量(離子層析)及水含量之分析評估鹽化學計量，且確定在1：3與1：4(多肽：乙酸鹽)之間變化。
肽9 pE-R-P-R-L-C-Aib-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫鍵C6-C12)之合成
●中間物9a之製備
(使2-氯三苯甲基氯樹脂負載有Fmoc-F-OH，移除Fmoc及測定樹脂之負載量)
以類似於上述通用程序之方式使2-氯三苯甲基氯樹脂(10.0g，16.0mmol)與Fmoc-F-OH(6.20g，16.0mmol)於DCM(100mL)及DIPEA(11.2mL，64.0mmol)中之溶液反應以得到中間物9a(11.6g，負載量=0.87mmol/g)。
●中間物9b之製備
(線狀肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間物9a(345mg，0.300mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物9c之製備
(自樹脂裂解，伴隨保護基移除，隨後純化)
將95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)混合物(9mL)添加至中間物9b(0.300mmol)中，且在室溫下震盪懸浮液2小時。過濾出裂解溶液，且添加新鮮裂解溶液(4mL)。在室溫下震盪懸浮液1小時，隨後過濾出裂解溶液。添加新鮮溶液(4mL)，且在室溫下震盪懸浮液1小時。過濾出裂解溶液。將合併之裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)混合物(100mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(40mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。高真空乾燥固體。
藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之中間物9c(188mg，0.103mmol)。
●肽9之製備
(環化及純化)
將中間物9c(188mg，0.103mmol)溶解於H2O/DMSO(9：1)(180mL)中。在室溫下攪拌反應混合物40小時，接著真空濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽9(97mg；0.053mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.77min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=495.2，計算值：[M+3]3+=495.3)分析純產物。
肽22 pE-R-P-C-L-C-C-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫鍵C4-C7及C6-C12)之合成
●中間物22a之製備
(使2-氯三苯甲基氯樹脂負載有Fmoc-F-OH，移除Fmoc及測定樹脂之負載量)
以類似於上述通用程序之方式使2-氯三苯甲基氯樹脂(10.0g，16.0mmol)與Fmoc-F-OH(6.20g，16.0mmol)於DCM(100mL)及DIPEA(11.2mL，64.0mmol)中之溶液反應以得到中間物22a(11.6g，負載量=0.87mmol/g)。
●中間物22b之製備
(線狀肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間物22a(115mg，0.100mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物22c之製備
(自樹脂裂解，伴隨部分保護基移除)
用DCM(4×)仔細洗滌中間物22b(0.100mmol)。添加95%水性TFA/EDT(4：1)混合物(0.750mL)且在室溫下震盪懸浮液1小時。添加TFA/H2O(95：5)(2.18mL)及TIS(75μL)之混合物至懸浮液且在室溫下繼續震盪1小時。過濾出裂解溶液且添加95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)混合物(3mL)至樹脂。在室溫下震盪懸浮液1小時，隨後過濾出裂解溶液。添加新鮮溶液(3mL)，且在室溫下震盪懸浮液1小時。過濾出裂解溶液。將合併之裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)(35mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(10mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。重複洗滌步驟一次。高真空乾燥殘餘物。藉由製備型HPLC純化粗產物且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之中間物22c(51.1mg，0.028mmol)。
●肽22之製備
(兩種二硫鍵之一鍋式形成)
將中間物22c(51.1mg，0.028mmol)溶解於AcOH(48mL)及H2O(12mL)中。添加I2於AcOH(1.12mL,56μmol)中之50mM溶液且在室溫下攪拌黃色溶液。經4小時再逐份添加含50mM I2之AcOH(5.61mL，0.281mmol)。在21小時後，反應混合物真空濃縮至2mL且添加含1M抗壞血酸之H2O(6mL)以淬滅過量I2。藉由製備型HPLC分離產物且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽22(19.3mg，0.012mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=4.16min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+2]2+=723.7，計算值：[M+2]2+=723.8)分析純產物。
肽52 pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-NH2(二硫鍵C6-C12)之合成
●中間物52a之製備
(線狀肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對受Fmoc保護之Rink-Amide-AM-PS-樹脂(217mg，0.100mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物52b之製備
(自樹脂裂解，伴隨保護基移除)
將95%水性TFA/EDT/TIS(95：2.5：2.5)混合物(3mL)添加至中間物52a(0.1mmol)中，且在室溫下震盪懸浮液1.5小時。過濾出裂解溶液，且添加新鮮裂解溶液(2mL)。在室溫下震盪懸浮液45分鐘，隨後過濾出裂解溶液。添加新鮮溶液(2mL)，且在室溫下震盪懸浮液45分鐘。將合併之裂解溶液倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)混合物(35mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。用冷的庚烷/乙醚(1：1)(10mL)洗滌殘餘物，將懸浮液離心且倒出上清液。高真空乾燥固體。粗產物中間物52b未經純化即用於下一步驟中。
●肽52之製備
(環化及純化)
將中間物52b(0.100mmol)溶解於H2O(20mL)中。向攪拌溶液中一次性添加50mM I2於AcOH(2.4mL，0.120mmol)中之溶液且在室溫下攪拌溶液30分鐘。添加含0.5M抗壞血酸之H2O(0.30mL，0.300mmol)以淬滅過量I2。溶液濃縮至幾乎乾燥。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色固體狀之肽52(50.5mg，0.025mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.22min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=512.3，計算值：[M+3]3+=512.3)分析純產物。
其他肽以類似方式合成：
●肽2至4以類似於肽1之方式合成。
●肽6以類似於肽5之方式合成。
●肽10至21以類似於肽9之方式合成。
●肽23以類似於肽22之方式合成。
●肽24至51以類似於肽8之方式合成。
●肽53以類似於肽52之方式合成。
肽54：在6位及12位[C6-C12]之2個半胱胺酸之間具有單硫鍵之pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH
在室溫下攪拌肽8(S)-2-((3S,6R,11R,14S,17S,25aS)-14-((1H-咪唑-5-基)甲基)-17-(4-胺基丁基)-3-丁基-11-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-側氧基吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯基)吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯胺基)-4-甲基戊醯胺基)-1,4,12,15,18,21-六側氧基二十二氫-1H-吡咯并[2,1-j][1,2,5,8,11,14,17,20]二硫雜六氮雜環二十三烷-6-甲醯胺基)-3-苯基丙酸TFA酸(30mg，0.015mmol)及N,N,N',N',N",N"-六甲基膦三胺(12.3mg，0.075mmol)於PBS pH 9.2緩衝液(1mL)中之混合物3天。藉由製備型HPLC(Sunfire C18，含0.1% TFA之水/MeCN)純化反應混合物兩次，且凍乾產物部分以得到呈白色粉末狀之肽54(4mg，13.4%)。[M+2H]2+(計算值)=752.88，[M+2H]2+(量測值)=752.40，[M+3H]3+(計算值)=502.26，[M+3H]3+(量測 值)=501.94。HPLC(分析方法B),tR=6.93min。
肽1至54可如上文所述及/或藉由諸如溶劑萃取、管柱層析、液相層析及再結晶之習知純化技術之組合加以純化及分離。若上述實例中分離肽為游離化合物，則可藉由已知方法將其轉化成適合之鹽。因此，肽1至54可轉化成其對應鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽或適用於注射之其他醫藥學鹽)，其中多肽：鹽比率範圍介於1：1至1：4。舉例而言，肽1至54可溶解於水中且使用離子交換樹脂轉化成鹽。相反地，若經分離肽為鹽，則可藉由已知方法將其轉化成游離肽或藉助於離子交換樹脂直接轉化成不同鹽。
肽-連接子構築體1及2合成如下：
肽-連接子產物係藉由使用在λ=214nm下UV偵測之分析型HPLC(管柱：XBridge BEH300 C18(100×4.6mm)，3μm；部件編號：186003612)來分析。移動相由溶離劑A(含0.1% TFA之H2O)、溶離劑B(含0.4% TFA之ACN)組成。產物之額外表徵係藉由配備有二極體陣列偵測器及使用電噴霧電離之UPLC-MS(管柱：Waters Acquity UPLC® BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；部件編號：186002350)來進行。移動相由溶離劑A：含0.05% FA+3.75mM乙酸銨之水；溶離劑B：含0.04% FA之ACN組成。
肽係藉由標準固相Fmoc化學方法合成。肽係在Liberty微波肽合成器(CEM Corporation,North Carlina,USA)上組裝。由2-氯三苯甲基氯-PS-樹脂(AnaSpec,Inc.,California,USA)合成在C端具有游離羧酸之肽。
肽係藉由製備型逆相HPLC來純化。使用以下管柱：Waters SunFire Prep C18 OBD管柱，5μm，30×50mm，部件編號186002570。
移動相由溶離劑A(含0.1% TFA之H2O)及溶離劑B(ACN)組成。梯度係基於分離問題之特定需求而設計。純產物係自ACN/H2O凍乾。
產物係藉由使用在λ=214nm下UV偵測之分析型HPLC(管柱：XBridge BEH300 C18(100×4.6mm)，3μm；部件編號：186003612)來分析。移動相由溶離劑A(含0.1% TFA之H2O)、溶離劑B(含0.1% TFA之ACN)組成。產物之額外表徵係藉由配備有二極體陣列偵測器及使用電噴霧電離之UPLC-MS(管柱：Waters Acquity UPLC® BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；部件編號：186002350)來進行。移動相由溶離劑A：含0.05% FA+3.75mM乙酸銨之水；溶離劑B：含0.04% FA之ACN組成。
使用下文所述之通用程序合成下文例示之肽-連接子構築體。未經取代之N或C端分別由小斜體H-或-OH指示。
肽-連接子構築體1及2之分析方法 1)UPLC-MS-分析方法D
●Waters Acquity UPLC® BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；部件編號：186002350
●溶離劑A：含0.05% FA+3.75mM乙酸銨之水；溶離劑B：含0.04% FA之ACN
●流量：1.0ml/min
●溫度：50℃
●梯度：在1.7min內2%至44%
2)UPLC-HRMS-分析方法E
●Waters Acquity UPLC® BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；部件編號：186002350
●溶離劑A：0.1% FA；溶離劑B：含0.1% FA之ACN
●流量：1.0ml/min
●溫度：50℃
●梯度：在4.4min內2%至98%
3)UPLC-MS-分析方法F
●Waters Acquity UPLC® BEH300 SEC保護管柱，4.6×30mm；部件編號：186005793
●溶離劑A：含0.1% FA之水；溶離劑B：含0.04% FA之ACN
●流量：1.0ml/min
●梯度：50% B持續6min
4)UPLC-MS-分析方法G
●Waters Acquity UPLC® ProSwift RP-3，1.7μm，4.6×50mm；部件編號：064298
●溶離劑A：含0.1% FA之水；溶離劑B：含0.08% FA之ACN
●流量：2.0ml/min(在2min內3%至80% B)-流量1.8mL/min
●溫度：40℃
●梯度：在3min內2%至98%
肽-連接子構築體1及2之通用程序 1)將第一胺基酸負載至2-氯三苯甲基氯樹脂上及移除Fmoc
用DCM充分洗滌2-氯三苯甲基氯樹脂(1當量，1.0-1.6mmol/g)。將所需胺基酸(就1.6mmol/g負載量而言，通常相對於樹脂0.5-2當量)溶解於DCM(每公克樹脂約10mL)及DIPEA(就1.6mmol/g負載量而言，相對於樹脂4當量)中。將溶液添加至樹脂中，且在室溫下震盪懸浮液19小時。將樹脂排出，且隨後依次用DCM/MeOH/DIPEA(17：2：1)、DCM、DMA、DCM充分洗滌。
為移除Fmoc及測定負載量，將樹脂反覆地與哌啶/DMA(1：4)或4-甲基哌啶/DMA(1：4)(12×每公克初始樹脂10mL)一起震盪，且用DMA(2×每公克初始樹脂10mL)洗滌。用MeOH將合併之溶液稀釋至 每公克初始樹脂250mL之體積V。用MeOH將此溶液之2mL等分試樣(Va)進一步稀釋至250mL(Vt)。以MeOH為參考在299.8nm下量測UV吸收，得到吸收A。依次用DMA、DCM、DMA、DCM充分洗滌樹脂，且將其在40℃下之高真空中乾燥，得到m g樹脂。
根據下式計算樹脂之負載量：負載量[mol/g]=(A×V t ×V)/(d×ε×V a ×m)
(其中d：光析槽之寬度；ε=7800L mol-1 cm-1)
2)LibertyTM合成器上之固相肽合成 合成循環
用DMF及DCM洗滌樹脂。藉由用20%哌啶或20% 4-Me-哌啶/DMF處理(通常每0.1mmol 7ml，兩次)來移除Fmoc。用DMF及洗滌樹脂。藉由如下步驟進行偶合，添加Fmoc-胺基酸(5當量；DMF中之0.2M溶液)、HCTU(5當量；DMF中之0.5M溶液)及DIPEA(10當量；NMP中之2M溶液)，接著在75℃或50℃下將懸浮液與氮氣混合，使用微波功率0至20瓦持續通常5至50分鐘，視特定需求而定。在用DMF洗滌後，可能重複一次偶合步驟，視特定需求而定。用DMF及DCM洗滌樹脂。
3)在有或無伴隨移除保護基之情況下自樹脂裂解
在室溫下將樹脂(0.1mmol)與95%水性TFA//TIS/DTT(95：2.5：2.5)(3mL)一起震盪3小時。過濾出裂解溶液。用95%水性TFA(1mL)沖洗樹脂一次。將合併之裂解及洗滌溶液緩慢倒至冷的庚烷/乙醚(1：1)混合物(10-15mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。將乙醚(10mL)添加至殘餘物中，將懸浮液渦旋3分鐘且離心，並倒出上清液。重複洗滌過程兩次。高真空乾燥固體。
4)二硫鍵形成
環化方法： 將完全脫除保護基之線狀前驅體肽(1當量)溶解於H2O中以得到通常約10-25mM之濃度。向攪拌溶液中一次性添加50mM I2於AcOH(1-2當量)中之溶液且在室溫下攪拌反應物直至實現完全轉化。添加含0.5M抗壞血酸之H2O以淬滅過量I2。
肽-連接子構築體1：MPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-f-OH，其中MPA為3-順丁烯二醯亞胺基丙酸
●中間物1a之製備
(使2-氯三苯甲基氯樹脂負載有Fmoc-f-OH，移除Fmoc及測定樹脂之負載量)
以類似於上述通用程序之方式使2-氯三苯甲基氯樹脂(5.0g，8.01mmol)與Fmoc-f-OH(3.10g，8.01mmol)於DCM(50mL)及DIPEA(5.59mL，32.0mmol)中之溶液反應，得到中間物1a(5.87g，負載量 =0.897mmol/g)。
●中間物1b之製備
(線狀肽之組裝)
在LibertyTM微波肽合成器上對中間物1a(0.250mmol)進行固相肽合成。偶合進行如下：
●中間物1c之製備
(自樹脂裂解，伴隨保護基移除，隨後純化)
將由含1.54g DTT及0.75mL硫代苯甲醚之6mL TFA/TIPS/水(95：2.5：2.5)製成之溶液添加至中間物1b(0.25mmol)且在室溫下震盪懸浮液5小時。過濾出裂解溶液，且用95%水性TFA(1mL)洗滌樹脂。將合併之裂解及洗滌溶液倒至冷的乙醚(40mL)上，得到沈澱物。將懸浮液離心，且倒出上清液。將乙醚(40mL)添加至殘餘物中，將懸浮液渦旋3分鐘且離心，並倒出上清液。重複洗滌過程3次。高真空乾燥固體。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以 得到呈白色粉末狀之中間物1c(178mg，71μmol)。
藉由UPLC-MS(分析方法D；tR=1.33min；量測值：[M+2H]2+=1078.1；計算值：[M+2H]2+=1078.3)分析純產物。
中間物1d之製備
(環化及純化)
將中間物1c(178mg,71μmol)溶解於H2O(2.0mL)中。向攪拌溶液中一次性添加50mM I2於AcOH(I2(50mM於HOAc中)(1.85mL，93μmol)中之溶液，且在室溫下攪拌溶液隔夜直至LC/MS顯示反應完全。添加含0.5M抗壞血酸之H2O以淬滅過量I2。藉由製備型HPLC純化粗物質且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色粉末狀之中間物1d(92mg，35μmol)。
藉由UPLC-MS(分析方法D；tR=1.44min；量測值：[M+2]2+=1077.4；計算值：[M+2]2+=1077.2)分析純產物。
肽-連接子構築體1之製備
在25℃下震盪中間物1d之製備物(30mg，12μmol)、3-(順丁烯二醯亞胺基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(3.06mg，12μmol)及碳酸氫鈉溶液(50μL，1M)於DMF(1mL)中之混合物2小時。用MeOH稀釋反應混合物且過濾。藉由製備型HPLC純化溶液且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色粉末狀之肽-連接子構築體1(12mg，4.54μmol)。
藉由UPLC-MS(分析方法D；tR=1.59min；量測值：[M+2]2+=1153.0；計算值：[M+2]2+=1152.8)分析純產物。
肽-連接子構築體2：PPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-f-OH，其中PPA為3-(2-吡啶基二硫基)丙酸
在25℃下震盪中間物1d之製備物(27mg，10.4μmol)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(5.7mg，18μmol)及碳酸氫鈉溶液(72μL，1M)於DMF(1mL)中之混合物2小時。用MeOH稀釋反應混 合物且過濾。藉由製備型HPLC純化溶液且自ACN/H2O凍乾以得到呈白色粉末狀之肽-連接子構築體2(10mg，3.71μmol)。
藉由UPLC-MS(分析方法D；tR=1.71min；量測值：[M+2]2+=1175.7；計算值：[M+2]2+=1175.9)分析純產物。
實例1：白蛋白-MPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-f-OH 步驟1：白蛋白去封端
●用TCEP去封端
向15mL管中之白蛋白(500mg，Aldrich，凍乾粉末，來自人類血清)於10mL PBS 1×緩衝液中之溶液中添加一次TCEP鹽酸鹽溶液(生物級純水中之1.074mg)。在室溫下震盪所得溶液1小時，隨後將其脫鹽且用兩個Amicon Ultra-4離心過濾器(30K MWCO)洗滌。使過濾器在4Kg下旋轉40分鐘，且棄去濾液。向各過濾器中添加3mL生物級純水以用於各洗滌(在14Kg下旋轉10分鐘)，且重複洗滌過程3次。將去封端HSA溶解於水(共約20mL)中。將溶液轉移至50mL Falcon管中且凍乾，得到結晶粉末(500mg)。
藉由UPLC-MS(分析方法F；量測值：66439.0；預期值：66437)分析純產物。
●測定去封端HSA中游離硫醇基團之數目
向2mL管中之此去封端HSA(2mg)於400μL PBS pH 7.4中之溶液中添加6-順丁烯二醯亞胺基己酸(13μg)水溶液。在室溫下震盪所得溶液2小時。UPLC-MS(分析方法G)顯示僅形成單加合物，量測值：66649.0；預期值：66648。
●用DTT去封端
向15mL管中之白蛋白(400mg，Aldrich，凍乾粉末，來自人類血清)於5mL PBS 1×緩衝液中之溶液中添加一次DTT(0.232μl，生物 級純水中2mg/mL)溶液。在室溫下震盪所得溶液2小時，隨後將其脫鹽且用二十個Amicon Ultra-0.5離心過濾器(10K MWCO)洗滌。使過濾器在14Kg下旋轉10分鐘，且棄去濾液。向各過濾器之頂部添加生物級純水以用於各洗滌(在14Kg下旋轉10分鐘)，且重複洗滌過程6次。將去封端HSA溶解於水(共約20mL)中。將溶液轉移至50mL Falcon管中且凍乾，得到結晶粉末(376mg)。
藉由UPLC-MS(分析方法G；量測值：66438.5；預期值：66437)分析純產物。
●測定去封端HSA中游離硫醇基團之數目
向2mL管中之此去封端HSA(3mg)於400μL PBS pH 7.4中之溶液中添加3-順丁烯二醯亞胺基丙酸(25μg)水溶液。在室溫下震盪所得溶液隔夜。UPLC-MS(分析方法G)顯示僅形成單加合物，量測值：66608.0；預期值：66606。
●用半胱胺酸去封端
向2mL管中之白蛋白(120mg，Aldrich，凍乾粉末，來自人類血清)於1mL 50mM PBS緩衝液pH 8.0中之溶液中添加一次半胱胺酸(10.94mg)。在室溫下震盪所得溶液1小時，隨後將其脫鹽且用兩個Amicon Ultra-0.5離心過濾器(10K MWCO)洗滌。使過濾器在14Kg下旋轉10分鐘，且棄去濾液。向各過濾器之頂部添加生物級純水以用於各洗滌(在14Kg下旋轉10分鐘)，且重複洗滌過程5次。將去封端HSA溶解於水(共4mL)中。將溶液轉移至15mL Falcon管中且凍乾，得到結晶粉末(108mg)。
藉由UPLC-MS(分析方法G；量測值：66439；預期值：66437)分析純產物。
●測定去封端HSA中游離硫醇基團之數目
向2mL管中之此去封端HSA(3mg)於500μL PBS pH 7.4中之溶液 中添加3-順丁烯二醯亞胺基丙酸(15μg)水溶液。在室溫下震盪所得溶液1小時。UPLC-MS(分析方法G)顯示僅形成單加合物，量測值：66608.0；預期值：66606。
步驟2：肽-連接子構築體/白蛋白結合
用肽-連接子構築體1(11.6mg於水中)之溶液處理去封端HSA(97mg)於PBS緩衝液中之溶液。在室溫下震盪所得溶液隔夜，接著脫鹽且用6個Amicon Ultra-0.5離心過濾器(10K MWCO)洗滌。使過濾器在13Kg下旋轉10分鐘且棄去濾液。向各過濾器之頂部添加生物級純水以用於各洗滌(在13Kg下旋轉10分鐘)，且重複洗滌過程6次。將結合物溶解於水(共4mL)中。將溶液轉移至15mL Falcon管中且凍乾，得到結晶粉末(90.5mg)。
藉由UPLC-MS(分析方法G；量測值：68742.5；預期值：68741)分析純產物。
實例2：白蛋白-TPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-f-OH，其中TPA為：3-巰基丙酸
將去封端HSA(65.8mg)於PBS緩衝液(1mL)中之溶液逐份(每30分鐘100μl)添加至肽-連接子構築體2(8mg)及碳酸氫鈉(8.92μL，1M)於PBS緩衝液(1mL)中之溶液。在添加後，在室溫下震盪所得溶液隔夜，接著脫鹽且用4個Amicon Ultra-0.5離心過濾器(10K MWCO)洗滌。使過濾器在13Kg下旋轉10分鐘且棄去濾液。向各過濾器之頂部添加生物級純水以用於各洗滌(在13Kg下旋轉10分鐘)，且重複洗滌過程5次。將結合物溶解於水(共4mL)中。將溶液轉移至15mL Falcon管中且凍乾，得到結晶粉末(65.6mg)。
藉由UPLC-MS(分析方法G；量測值：68677；預期值：68678)分析純產物。
實例3：白蛋白-MPA-NHCH2CH2CH2-OCH2CH2OCH2CH2O- CH2CH2CH2NH-C(O)CH2CH2C=O-A-R-P-R-L-S-H-K-G-P-Nle-P-F-OH
如實例1般合成實例3。藉由UPLC-MS(分析方法G，量測值68367；預期值：68366)分析純產物。
Fc-Apelin構築體選殖：
下文DNA片段係藉由標準PCR技術使用載體pPL1146作為模板及以下引子來產生：5'引子，其經設計以含有NheI位點，後為對應於載體pPL1146中含有之人類Fc之5'端的序列。3'引子經設計以含有EcoRI位點、用於適當構築體之Apelin序列、甘胺酸絲胺酸連接子及與pPL1146中含有之人類Fc之3'端互補的序列。在擴增後，四個片段各用NheI及EcoRI限制酶限制消化，分離且純化，並接合至以相同方式消化及純化之載體pPL1146。將接合物轉形至大腸桿菌細胞中且藉由DNA定序鑑別出含有正確質體之菌落。所示序列屬於有義股且以5-引子至3-引子方向延伸。
Fc-Apelin融合體(實例4至實例7) Fc-Apelin蛋白質表現及純化：
表現質體DNA係使用標準聚乙烯亞胺方法以每毫升約10 E6個細胞之密度下轉染至HEK293T細胞中。500ml培養物接著在37℃下於3L燒瓶中之FreeStyle培養基(Gibco)中生長3天。
Fc-Apelin蛋白質自具有蛋白質A瓊脂糖FF之澄清條件培養基純化。簡言之，將500ml條件培養基在4℃下分批結合於2ml蛋白質A瓊脂糖隔夜。將蛋白質A瓊脂糖轉移至拋棄式管柱且用PBS廣泛洗滌。Fc-Apelin蛋白質用0.1M甘胺酸pH 2.7溶離，用1M tris-HCl pH 9中和且相對於PBS加以透析。產量為每500ml條件培養基10至20mg，且內毒素含量較低(<1EU/mg)，如藉由Charles River ENDOSAFE PTS測試所量測。
Fc-Apelin蛋白質之品質控制：
原生Fc-Apelin蛋白質之LC/MS：峰為非均質的且比二聚體之預期值大約3kDa。此為具有共同N-連接糖基化位點之Fc所預期的N-連接糖基化的特徵。
經還原、N-去糖基化之Fc-Apelin蛋白質之LC/MS：得到尖銳峰。Fc-Apelin 3及4以及Fc-Cys之分子量正如預期的，而Fc-Apelin 1及2以及Cys-Fc之分子量與C端胺基酸裂解相符。在C端之半胱胺酸似乎保護蛋白質免於裂解。
在Superdex 200上之分析型尺寸排阻：Fc-Apelin蛋白質具有89%至100%之二聚體、0至10%之四聚體及0至1%之聚集物。
還原SDS/PAGE：所有蛋白質主要以預期尺寸之單體形式遷移。
核苷酸序列：Fc-Apelin融合體：實例4
Fc-Apelin融合體：實例5
Fc-Apelin融合體：實例6
Fc-Apelin融合體：實例7
引子序列：
實例4：Fc-Apelin融合體：
其中GGGGSGGGGS表示連接子且QRPRLSHKGPMPF為多肽。
實例5：Fc-Apelin融合體：
其中GGGGSGGGGSGGGGS表示連接子且ORPRLSHKGPMPF為多肽。
實例6：Fc-Apelin融合體：
其中GGGGSGGGGS表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*F為多肽。
實例7：Fc-Apelin融合體：
其中GGGGSGGGGSGGGGS表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*F為多肽。
Fc-Apelin構築體選殖：
下文所示Fc-Apelin DNA片段係藉由標準PCR技術，使用含有小鼠Ig κ信號序列後為CMV啟動子下游之人類Fc的載體pPL1146作為模板來產生。正向引子(5'-GCT TGC TAG CCA CCA TGG AAA CTG-3')經設計以含有NheI位點，後為對應於載體pPL1146中含有之信號序列之5'端的序列。反向引子(5'-GTT GAT TGA ATT CTT AGA AGC ACA TGG GGC CCT TGT GGC ACA GCC GGG GCC GCT GGC TTC CGC CAC CTC CGC TGC CTC CAC CGC CGC TGC CTC CGC CAC CTG CGC CTG GAC TCA GAG ACA GGG-3')經設計以含有EcoRI位點、Apelin序列、甘胺酸絲胺酸連接子及與pPL1146中含有之人類Fc之3'端互補的序列。在擴增後，片段用NheI及EcoRI限制消化，自瓊脂糖凝膠分離及純化，且接合至以相同方式消化及純化之載體pPL1146。將接合物轉形至大腸桿菌DH5α細胞中且藉由DNA定序鑑別出含有正確質體之菌落。所示Fc融合體、連接子及/或其他Fc-Apelin融合體之Apelin序列中之修飾係藉由標準定點突變誘發方案使用實例9作為模板來產生。在Apelin之C端含有Fc融合體之實例8係藉由基因合成(GeneArt)而使密碼子最佳化且如上所述將插入物選殖至載體pPL1146中。所示序列屬於有義股且以5'至3'方向延伸。
Fc-Apelin蛋白質表現及純化：
Fc-Apelin表現質體DNA係使用標準聚乙烯亞胺方法以每毫升1×106個細胞之密度轉染至HEK293T細胞中。500ml培養物接著在37℃下於3L燒瓶中之FreeStyle 293培養基(Life Technologies)中生長4天。
Fc-Apelin蛋白質自澄清條件培養基純化。簡言之，500ml條件培養基以4ml/min流經5ml HiTrap MabSelect SuRe管柱(GE Life Sciences)。管柱用20管柱體積之含有0.1% Triton X-114之PBS洗滌，且隨後Fc-Apelin蛋白質用0.1M甘胺酸pH 2.7溶離，用1M Tris-HCl pH 9中和且相對於PBS進行透析。蛋白質產量為每500ml條件培養基10至20mg，且內毒素含量<1EU/mg，如藉由Charles River ENDOSAFE PTS測試所量測。
Fc-Apelin蛋白質之品質控制：
原生Fc-Apelin蛋白質之LC/MS：峰為非均質的且比二聚體之預期值大約3kDa。此為具有共同N-連接糖基化位點之Fc所預期的N-連 接糖基化的特徵。
經還原、N-去糖基化之Fc-Apelin蛋白質之LC/MS：峰為尖銳的。實例8之分子量小於理論值488道爾頓，其中130道爾頓可能歸因於Fc之C端離胺酸殘基之損失。實例9至實例19之分子量小於預期值2或3道爾頓，可能分別歸因於半胱胺酸x2還原或Cys X2還原及額外修飾(亦即Asn去醯胺成Asp)。
在Superdex 200上之分析型尺寸排阻：Fc-Apclin蛋白質具有89%至100%之二聚體、0至10%之四聚體及0至1%之聚集物。
還原SDS/PAGE：所有蛋白質主要以預期尺寸之單體形式遷移。
核苷酸序列
實例9：Fc-Apelin融合體
其中GGGGSGGGGSGGGGS表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*F為多肽。
實例10：Fc-Apelin融合體
其中GGGGSGGGGSGGGGS表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*F為多肽。
實例11：Fc-Apelin融合體
其中GS表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*F為多肽。
實例12：Fc-Apelin融合體
其中GG表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*F為多肽。
實例13：Fc-Apelin融合體
其中GGGGS表示連接子且QRPRLC*HKGPMC*F為多肽。
實例14：Fc-Apelin融合體
其中GGGGS GGGGS GGGGS表示連接子且ORPRLC*HKGPMC*為多肽。
實例15：Fc-Apelin融合體
其中GGGGS GGGGS GGGGS表示連接子且QRPRLC*HKGPMC*為多肽。
實例16：Fc-Apelin融合體
其中GGGGS GGGGS GGGGS表示連接子且QRPRLC*HKGPMC*為多肽。
實例17：Fc-Apelin融合體
其中GS表示連接子且QRPRLC*HKGPMC*為多肽。
實例18：Fc-Apelin融合體
其中GG表示連接子且QRPRLC*HKGPMC*為多肽。
實例19：Fc-Apelin融合體
其中GGGGS表示連接子且QRPRLC*HKGPMC*為多肽。
實例20：經由BCN-PEG連接子結合於脂肪酸之Apelin環狀肽 步驟1：Apelin肽-BCN連接子(BCN為(N-碳酸(1R,8S,9s)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯)
在室溫下攪拌pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH(二硫鍵C6-C12)50mg，0.033mmol，如美國專利第8,673848號中所製備)、碳酸氫鈉(18mg，0.215mmol)及水(40μL)於DMF(0.5mL)中之混合物10分鐘，接著添加碳酸(1R,8S)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基丁二醯亞胺基酯(Berry &associates，18mg，0.065mmol)。在室溫下攪拌反應混合物90分鐘。藉由LCMS觀察+1及+2添加物之混合物，因此藉由質量觸發之HPLC(肽方法5 25-50% ACN 5min梯度：條件：Sunfire 30×50mm 5μm管柱ACN/含0.1% TFA之H2O 75ml/min 1.5ml注射量)純化混合物：rt 3.2min(+1),rt 4.65min,4.9min(+1及+2混合物)。LCMS證實所需+1產物產率為61%且+1、+2混合物產率為18%。LCMS：(鹼性溶離劑A：水+5mM氫氧化銨，溶離劑B：ACN，酸性管柱：Sunfire C18 3.5μm 3.0×30mm-40℃，鹼性管柱：XBridge C18 3.5μm 3.0×30mm-40℃)滯留時間：0.98min；MS[M+2]2+：觀測值：856.0，計算值：865.0245。
步驟2：2-(十一-10-炔-1-基)丙二酸二第三丁酯
在0℃下在N2下，將丙二酸二第三丁酯(800mg，3.70mmol)溶解於DMF(9mL)中且添加NaH(148mg，3.70mmol)。在0℃下攪拌反應物30分鐘且緩慢逐滴添加11-溴-癸-1-烯(3.33mmol)，產生黃色溶液。在0℃下攪拌反應物2小時，接著升溫至室溫且攪拌16小時。將混合物溶解於EtOAc(75mL)中且用H2O(25mL)洗滌。用EtOAc(75mL)萃取水層且經Na2SO4乾燥合併之有機層，過濾且濃縮。經由急驟管柱(12g二氧化矽濾筒，0-20% EtOAc/庚烷)純化混合物且濃縮溶離份以產生所需產物。
步驟3：二十二-21-烯-1,11,11-三甲酸11,11-二第三丁基1-乙基酯
在0℃下將步驟2之化合物(0.442mmol)溶解於DMF(2mL)中且添加NaH(21.23mg，0.531mmol)。在0℃下攪拌反應物15分鐘且緩慢逐滴添加11-溴十一酸乙酯(143mg，0.486mmol)。使反應物升溫至室溫且攪拌16小時。用EtOAc(40mL)稀釋混合物且用H2O(20mL)洗滌一次。用EtOAc(40mL)萃取水層一次且合併有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。將樣品溶解於1mL DCM中且經由急驟管柱(12g二氧化 矽管柱，0-20% EtOAc/庚烷，15分鐘)純化。合併溶離份且濃縮以得到所需產物。
步驟4：12,12-雙(第三丁氧基羰基)二十三-22-烯酸
在30℃下在N2下，向步驟3之化合物(0.037mmol)於tBuOH(1mL)中之溶液中添加KOtBu(114mg，1.012mmol)於tBuOH(2mL)中之溶液。在室溫下攪拌混合物且藉由TLC(1：1 EtOAc/己烷，KMnO4，回流)監測。在反應完全後，用1M HCl(20mL)淬滅反應混合物且用EtOAc(25mL)萃取兩次。合併有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。該物質未經進一步純化即繼續進行下一步驟。
步驟5：二十二-21-烯-1,11,11-三甲酸
將TFA(2mL)添加至步驟4之化合物(0.022mmol)且在室溫下攪拌反應物1小時。用DCM(10mL)稀釋混合物且濃縮。將物質溶解於EtOAc(10mL)中且用H2O(20mL)洗滌。經Na2SO4乾燥有機層，過濾且濃縮。將粗物質溶解於1mL MeOH中且經由MS觸發之HPLC(Sunfire 30×50mm 5μm管柱ACN/具有0.1% TFA之H2O 75ml/min，1.5ml注射量，經3.5min之45-70% ACN)純化。
步驟6：2-(((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)羰基)-2-(十一-10-烯-1- 基)十三烷二酸
向N-羥基丁二醯亞胺(99mg，0.862mmol)及二十二-21-烯-1,11,11-三甲酸(中間物45：400mg，0.908mmol)於DCM(7mL)及THF(0.7mL)中之溶液中添加含DCC(187mg，0.908mmol)之DCM(2mL)。攪拌反應物隔夜，隨後蒸發溶劑。藉由HPLC(Sunfire C18 30×50mm；55-80%ACN/水+0.1% TFA)純化殘餘物以產生標題化合物(155mg，0.288mmol，32%)：藉由LCMS方法D Rt=1.51min,M+H 538.3；1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 1.16-1.46(m,28 H)1.60-1.87(m,3 H)1.91-2.17(m,5 H)2.38(t,J=7.03Hz,2 H)2.86(br.s.,4 H)3.68(dd,J=11.25,7.34Hz,1 H)3.78(dd,J=11.31,5.20Hz,1 H)3.99-4.10(m,1 H)。
步驟7：脂肪酸-PEG連接子
將疊氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign：164mg，0.149mmol)及步驟6之化合物(80mg，0.149mmol)溶解於THF(2.5mL)中。添加DIPEA(39μL，0.233mmol)且攪拌反應物隔夜。蒸發溶劑且藉由HPLC(Sunfire C18 30×50mm；45-70% ACN/水+0.1% TFA)純化殘餘物，產生化合物A(97mg，0.061mmol，41%)及B(32mg，0.021mmol，14%)：LCMS方法D Rt=1.35min,[M+2H]+2 761.9；1H NMR(400MHz，乙腈-d3)δ ppm 1.05-1.18(m,3 H)1.19-1.32(m,20 H)1.36(t,J=7.15Hz,1 H)1.48-1.59(m,2 H)1.65-1.75(m,2 H)2.01-2.06(m,2 H)2.25(t,J=7.46Hz,2 H)3.33-3.39(m,2 H)3.39-3.44(m,2 H)3.50-3.67(m,98 H)4.84-4.95(m,1 H)4.95-5.06(m,1 H)5.83(ddt,J=17.07,10.29,6.68,6.68Hz,1 H)7.31(t,J=5.44Hz,1 H)；LCMS方法D Rt=1.50min,[M+2H]+2 739.9；1H NMR(400MHz，乙腈-d3)δ ppm 1.16-1.42(m,30 H)1.42-1.63(m,5 H)2.00-2.07(m,2 H)2.22-2.28(m,2 H)2.40-2.52(m,2 H)3.25-3.33(m,2 H)3.33-3.42(m,2 H)3.42-3.50(m,2 H)3.50-3.68(m,88 H)4.86-5.06(m,2 H)5.83(ddt,J=17.04,10.26,6.71,6.71Hz,1 H)6.40-6.74(m,1 H)。
步驟8：
在室溫下攪拌pE-R-P-R-L-C*-H-N 6-[[(1α,8α,9α)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-K-G-P-Nle-C*-F-OH(二硫鍵C6-C12)(21.33mg，0.014mmol)及步驟7之化合物(24mg，0.014mmol)之混合物約3小時。反應藉由LCMS完全且凍乾以得到標題產物(23mg，48%)。LCMS(Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm,50℃，溶離劑A：水+0.1%甲酸，溶離劑B：乙腈+0.1%甲酸，經5.15min之梯度2%至98%B/A)：滯留時間：2.22min；MS[M+2]2+：觀測值：1616.9464，計算值：1616.976。
實例21：使用轉肽酶及轉肽酶識別基元之Fc與APJ肽之結合.
通用流程：
步驟1：Fc-轉肽酶構築體之製備：構築體選殖：
藉由基因合成(GeneArt)使含有小鼠Ig κ鏈信號肽後為人類Fc及轉肽酶識別序列(LPXTG)之DNA片段之密碼子最佳化而具有5'-NheI及3'-EcoRI限制位點。所得序列用NheI及EcoRI限制消化且接合至CMV啟動子下游之載體pPL1146的NheI及EcoRI位點。將接合物轉形至大腸桿菌DH5α細胞中，且藉由DNA定序鑑別出含有正確插入物之菌落。所展示之序列屬於有義股且以5'及3'方向延伸。
Fc-轉肽酶
Fc轉肽酶構築體之序列：
其中GGGGS表示連接子且LPETGGLEVLFQGP表示轉肽酶識別基元(注意：GGLEVLFQGP在轉肽酶處理期間經剪除)。
蛋白質表現及純化：
Fc-轉肽酶表現質體DNA係使用標準聚乙烯亞胺方法以每毫升1×106個細胞之密度下轉染至HEK293T細胞中。500ml培養物接著在37℃下於3L燒瓶中之FreeStyle 293培養基(Life Technologies)中生長4天。
Fc-轉肽酶蛋白質自澄清條件培養基純化。簡言之，500ml條件培養基以4ml/min流經5ml HiTrap MabSelect SuRe管柱(GE Life Sciences)。管柱用20管柱體積之含有0.1% Triton X-114之PBS洗滌，且隨後Fc-轉肽酶蛋白質用0.1M甘胺酸pH 2.7溶離，用1M Tris-HCl pH 9中和且相對於PBS進行透析。蛋白質產量為每500ml條件培養基10至20mg，且內毒素含量<1EU/mg，如藉由Charles River ENDOSAFE PTS測試所量測。
Fc-轉肽酶蛋白質之品質控制
天然Fc-轉肽酶蛋白質之LC/MS：峰為非均質的且比二聚體之預期值大約3kDa。此為具有共同N-連接糖基化位點之Fc所預期的N-連接糖基化的特徵。
經還原、N-去糖基化之Fc-轉肽酶蛋白質之LC/MS：峰為尖銳的。分子量比理論值小2道爾頓，可能歸因於半胱胺酸x2還原。
在Superdex 200上之分析型尺寸排阻：Fc-轉肽酶蛋白質具有89%至100%之二聚體、0至10%之四聚體及0至1%之聚集物。
還原SDS/PAGE：蛋白質主要以預期尺寸之單體形式遷移。
步驟2：用於轉肽酶結合之Apelin肽H2N-GGGGGQRPRLC*HKGP(Nle)C*F-COOH之製備
步驟2a：中間物21A之製備
在自動肽合成器(CEM LIBERTY)上使用Arg殘基之標準雙重Arg對兩個批次之H-Phe-2-ClTrt樹脂(Novabiochem，0.342g，0.25mmol，0.73mmol/g)進行固相肽合成。將胺基酸製備為於DMF中之0.2M溶液。
偶合循環定義如下：
●胺基酸偶合：AA(4.0當量)、HATU(4.0當量)、DIEA(25當量)
●洗滌：DMF(3×10mL，每次1min)。
●脫除Fmoc保護基：哌啶/DMF(1：4)(10mL，75℃持續1min，接著10mL，75℃持續3min)。
●洗滌：DMF(4×10mL，每次1min)。
在肽組裝後，用DMF(3×10mL)、DCM(3×10mL)洗滌各批次樹脂。在室溫下真空乾燥合併之肽樹脂以得到中間物21A(1.454g，0.5mmol)。
步驟2b：中間物21B,H2N-GGGGGQRPRLCHKGP(Nle)CF-COOH之製備
1)裂解及保護基移除
向中間物21A(1.454g，0.5mmol)中添加95% TFA/2.5% H2O/2.5% TIPS之6mL溶液及DTT(1.452g，10.00mmol)，在室溫下震盪所得混合物3小時，隨後過濾。將濾液滴至80mL冷的乙醚中，接著在4000rpm下離心5分鐘。移除溶劑且用乙醚(3×80mL)洗滌白色固體，渦旋並離心。在25℃下高真空乾燥固體1小時。
2)純化
以上白色固體接著藉由製備型HPLC(SunfireTM Prep C18 OBDTM 30×50mm 5μm管柱ACN/H2O w/0.1% TFA 75ml/min，10-30% ACN 8min梯度)純化。凍乾產物部分得到呈TFA鹽形式之中間物21B(213mg，23%)。
步驟3：H2N-GGGGGQRPRLC*HKGP(Nle)C*F-COOH(二硫鍵C11-C17)，中間物21C之製備
向中間物21B(213mg，0.166mmol)於3.85mL H2O中逐滴添加I2 (50mM於AcOH中，4.63mL，0.232mmol)。在室溫下震盪混合物隔夜。LC/MS顯示反應完全。向反應混合物中添加數滴0.5M抗壞血酸溶液(MeOH/H2O=1/1)，直至溶液之顏色消失。用MeOH稀釋混合物用於HPLC純化。藉由製備型HPLC(SunfireTM Prep C18 OBDTM 30×50mm 5μm管柱ACN/具有0.1% TFA之H2O 75ml/min，7.5-20% ACN 8min梯度)進行純化。凍乾產物部分得到呈TFA鹽形式之H2N-GGGGGQRPRLC*HKGP(Nle)C*F-COOH(二硫鍵C11-C17)，亦即中間物21C(65mg，31%)。LC/MS(QT2,ProductAnalysis-HRMS-Acidic，Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm，50℃，溶離劑A：水+0.1%甲酸，溶離劑B：乙腈+0.1%甲酸，經5.15min之梯度2%至98%B/A)：滯留時間：0.79min；MS[M+2]2+：觀測值：919.9562。
步驟3：Fc-轉肽酶與中間物21C之轉肽酶結合 1)化學酶促轉肽酶結合
在冰浴上，向含Fc-LPETGG(1397μl，0.081μmol)之PBS(pH7.4)緩衝溶液中添加H2N-GGGGGQRPRLC*HKGP(Nle)C*F-COOH(二硫鍵C11-C17)(148μL，4.04μmoL，50mg/mL)於Tris-8.0緩衝液中之溶液，繼而含520μM轉肽酶A*(155μL，0.081μmoL)之50mM Tris-Cl pH7.4、150mM NaCl。在室溫下震盪混合物隔夜。LC/MS顯示反應完全。
(轉肽酶A*)：轉肽酶A突變體之序列：
其中粗體字母表示突變胺基酸且帶下劃線的字母表示(Chen等人，PNAS，第108卷，第28號，2011,11399-11403)所述之胺基酸，其在金 色葡萄球菌(S aureus)轉肽酶A之原始序列中並非保守的(Mazmanian等人Science(Washington,D.C.)(1999),285(5428),760-763)
按照現有方案，轉肽酶A突變體在大腸桿菌中表現且藉由探究在C端包含聚組胺酸標記之親和層析純化(Carla P.Guimaraes等人：「Site.specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions」,Nature protocols，第8卷，第9號，2013,1787-1799)。
2)純化及脫鹽
使以上溶液在ATTA XPRESS上以4mL/min流經5mL HiTrap Mab Select SuRe管柱(GE Lifesciences # 11-0034-95)。在管柱上用20管柱體積(CV)PBS+0.1% Triton 114洗滌實例21，且用0.1M甘胺酸pH 2.7溶離，用1M tris-HCl pH 9中和並相對於PBS進行透析。經純化溶液藉由使用Zeba Sping脫鹽管柱5mL(89891)脫鹽以得到2mL目標溶液，平均濃度為1.62mg/mL且回收率為68%。LCMS(QT2，Protein_20-70 kDa_3min，AcQuity ProSwift RP-3U 4.6×50mm，1.0mL/min，溶離劑A：水+0.1%甲酸，溶離劑B：乙腈+0.1%甲酸，經3min之梯度2%至98% B/A)：Rt=1.55min,MS[M+H]59346.5000。
已發現上文實例中之生物結合物在APJ受體效能方面具有在約0.01nM至約1100nM範圍內之EC50值。已發現上文實例中之生物結合物具有高於2分鐘、高於5分鐘、高於10分鐘、高於20分鐘、高於50分鐘及高於60分鐘之血漿穩定性。
可見本發明之生物結合物適用作APJ受體之促效劑且因此適用於治療對APJ受體之活化有反應之疾病及病狀，諸如本文所揭示之疾病。
已如此描述本發明之例示性實施例，但一般熟習此項技術者應注意，揭露內容內之事實例僅為例示性，且可在本發明之範疇內進行 各種其他替代、修改及變更。因此，本發明不限於如本文中所說明之特定實施例。

Claims (41)

  1. 一種生物結合物或其多聚體，其包含：a. 具有下式I'之肽或多肽： 其中：X1為該多肽之N端且為不存在的或係選自pE、R、Isn、Q、A、K及5-胺基-戊酸；X2為R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK、F、E或Orn；X3為P、A、a、p、4-PhP、K、D、哌啶甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X4為R、A、r、N-Me-R、F、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X5為L、Cha、A、D-L、N-Me-L、K、D、4-PhF或F；X6及X12獨立地為選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6及X12之側鏈經由共價鍵連接在一起形成單硫鍵(-S-)、二硫鍵(-S-S-)或醯胺鍵(-NHC(O)-或-C(O)-NH-)；或者X6為K，X13不存在且X12為F或f，其中X12之C端與X6之胺基側鏈一起形成醯胺鍵；X7為H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N、E或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位之半胱胺酸之側鏈或與X4位之半胱胺酸之側鏈一起形成二硫鍵；X8為K、k、F、f、A、hF、N-Me-R、E或4-胺基-Isn；X9為G、N-Me-G、A、D、L、R或Aib；X10為P、A、p、4-PhP或哌啶甲酸，X11為M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、 K、3-PyA或Cha；及X13為C端且為不存在的或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap、H及E；其中：Nle為L-正白胺酸；D-hC為D-高半胱胺酸hC為L-高半胱胺酸；hF為L-高苯丙胺酸；hK為L-離胺酸；Nal為L-萘基丙胺酸；Orn為鳥胺酸；Aib為α-胺基異丁酸；Dab為(S)-二胺基丁酸；Dap為(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)為甲硫胺酸碸；Cha為(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn為4-胺基哌啶-4-甲酸；Isn為異哌啶甲醯基；pE為L-焦麩胺酸；3-PyA為3-(3-吡啶基)-L-丙胺酸；4-PhF為4-苯基-L-苯丙胺酸；其中N端及C端視情況連同1、2、3或4個甘胺酸胺基酸形成環；及或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽；及b. 半衰期延長部分；及其中該肽或多肽及半衰期延長部分視情況經由連接子共價連接或融合。
  2. 如請求項1之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有下式： X1為不存在的、pE、R、Q或Isn；X5為L或Cha；X7為H、Aib、F、K；X8為K、F或4-胺基-Isn；X9為G或Aib；X11為Nle或Cha；X13為不存在的或為F、f、K；X6及X12獨立地為選自C、c、hc、D-hc、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6及X12之側鏈經由共價鍵連接在一起形成二硫鍵或醯胺鍵；及其中N端及C端視情況連同1、2、3或4個甘胺酸胺基酸形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或與其實質上等效之多肽。
  3. 如請求項1或2之生物結合物或其多聚體，其中：X6及X12獨立地選自K、Orn、Dab、E及D且其中X6及X12之側鏈一起形成醯胺鍵。
  4. 如請求項1或2之生物結合物或其多聚體，其中：X6及X12獨立地為C、c、D-hC或hC，其中X6及X12之側鏈一起形成二硫鍵。
  5. 如請求項1或2之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式III： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  6. 如請求項1或2之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式IV： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  7. 如請求項1或2之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式V： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  8. 如請求項1之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式VI： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  9. 如請求項1之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式VII： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  10. 如請求項1或2之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式VIII： 其中X1之N端及X13之C端連同連接子L形成環；及其中L為(G)r，G為甘胺酸且r為1、2、3或4；或該多肽之鹽；及其中該半 衰期延長部分共價連接於X2、X3、X5、X7、X8或X11之側鏈。
  11. 如請求項1之生物結合物或其多聚體，其中該多肽具有式IX： 其中X12為F或f，其中X12之C端與X6之胺基側鏈一起形成醯胺鍵；或該多肽之酯、醯胺或鹽。
  12. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之生物結合物或其多聚體，其中X1為pE；或該多肽之醯胺、酯或鹽，其中該半衰期延長部分視情況經由連接子連接於該多肽之C端或側鏈胺基官能基。
  13. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之生物結合物或其多聚體，其中X13為F；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  14. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之生物結合物或其多聚體，其中X5為L；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  15. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之生物結合物或其多聚體，其中X7為H；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  16. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之生物結合物或其多聚體，其中X8為K；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  17. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之生物結合物或其多聚體，其中X9為G；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  18. 如請求項1、2、8、9及11中任一項之多肽，其中X11為Nle，或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  19. 如請求項1之生物結合物或其多聚體，其中該多肽係選自：pE-R-P-R-L-K*-H-F-G-P-Nle-D*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-K*-H-F-G-P-Nle-E*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-Orn*-H-F-G-P-Nle-D*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-Dab*-H-F-G-P-Nle-D*-苯乙胺， pE-R-P-R-L-K*-F-K-G-P-Nle-F*，pE-R-P-R-L-K*-F-K-G-P-Nle-f*，**Q-R-P-R-L-C*-F-K-G-P-Nle-C*-F-G-G**，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-f-OH，pE-R-P-R-Cha-C*-H-K-G-P-Cha-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-F-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-C*-H-K-Aib-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-(4-NH-Isn)-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-C**-L-C*-C**-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-C**-R-L-C*-C**-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-r-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-F-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-E-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-p-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-K-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-D-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-F-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH； pE-R-P-R-K-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-E-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-D-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-E-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-(4-PhF)-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-D-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-E-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-L-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-R-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-(哌啶甲酸)-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(3-PyA)-C-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-H-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-E-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-NH 2 ；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-NH 2 ；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-hC*-F-OH；pE-R-P-R-L-hC*-H-K-G-P-Nle-hC*-F-OH；pE-R-P-R-L-c*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-(D-hC)*-F-PH；pE-R-P-R-L-(D-hC)*-H-K-G-P-Nle-(D-hC)*-F-OH；pE-R-P-R-L-C*H-K-G-P-Nle-c*-F-OH；pE-R-P-R-L-c*-H-K-G-P-Nle-c*-F-OH；pE-R-P-R-L-C***-H-K-G-P-Nle-C***-F-OH Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，及Q-R-P-R-L-C*H-K-G-P-M-C*-F-OH； 其中用「*」標記之兩個胺基酸表示分別經由側鏈或端形成二硫鍵或醯胺鍵之胺基酸，及其中用「**」標記之兩個胺基酸表示經由側鏈形成二硫鍵或經由端形成醯胺鍵之胺基酸；及其中用「***」標記之2個胺基酸表示經由側鏈形成單硫鍵之胺基酸；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  20. 如請求項19之生物結合物，其中該多肽係選自：Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-M-C*-F-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH，H-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH；其中該2個半胱胺酸胺基酸C*之側鏈一起形成二硫鍵；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  21. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之生物結合物或其多聚體，其中該半衰期延長部分為IgG恆定結構域或其片段或人類血清白蛋白。
  22. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之生物結合物，其中該半衰期延長部分為具有LALA突變(L234A、L235A)之FcLALA經修飾Fc片段。
  23. 如請求項1之生物結合物，其中該半衰期延長部分為經由連接子融合於根據式I及III至IX中之任一者之多肽的Fc結構域且其中該連接子具有下式：-[GGGGS]n-，n為1、2或3或該連接子為GG或GS，且根據式I及III-IX中之任一者之多肽含有天然存在之胺基酸。
  24. 如請求項23之生物結合物，其中該半衰期延長部分為C端離胺酸 已缺失或經丙胺酸置換之Fc變異體。
  25. 如請求項23或24之生物結合物，其中該多肽為式I之多肽，其中：X1為該多肽之N端且為不存在的或係選自R、Q、A及K；X2為R、A、K、H、F或E；X3為P、A、K或D；X4為R、A、F或E；X5為L、A、K、D或F；X6及X12為C且經由二硫(-S-S-)鍵連接在一起；X7為H、A、K、F、P、N或EX8為K、F、A或E；X9為G、A、D、L或R；X10為P或A；X11為M、A、F、Y、L或K；及X13為C端且為不存在的或係選自F、I、A、K、H及E。
  26. 如請求項22之生物結合物，其中該多肽為：Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-M-C*-F。
  27. 如請求項23或24之生物結合物，其中該多肽為：Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-M-C*-F。
  28. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之生物結合物或其多聚體，其中該半衰期延長部分為人類血清白蛋白。
  29. 如請求項28之生物結合物，其中該人類血清白蛋白經由下式之連接子化學連接於式I至VII及IX中之任一者之多肽的N端： 其中x為1至20，R為直鏈或分支鏈伸烷基、環烷基、芳基或雜芳基或其組合，R'為直鏈或分支鏈伸烷基、芳基或環烷基或其組合。
  30. 如請求項28之生物結合物，其中該人類血清白蛋白經由下式之連接子化學連接於式I至VII中之任一者之多肽的C端： 其中x為1至20，R為直鏈或分支鏈伸烷基、環烷基、芳基或雜芳基或其組合，R'為直鏈或分支鏈伸烷基、芳基或環烷基或其組合。
  31. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之生物結合物，其中該半衰期延長部分為脂肪酸。
  32. 如請求項31之生物結合物，其中該脂肪酸係選自： 其中Ak2、Ak3、Ak4、Ak5及Ak6獨立地為(C8-20)伸烷基，R6及R7獨立地為(C8-20)烷基。
  33. 如請求項1之生物結合物，其具有下式： 其中肽為該肽之N端，m為0或1，n為1、2或3，A為丙胺酸，H為組胺酸，L2為連接子，C1為視情況經氟取代之單、二或三環碳環或雜環系統且L1為C1-C20伸烷基連接子，其中該伸烷基鏈視情況經側氧基(=O)取代，且其中一或多種碳經O或NH置換。
  34. 一種如請求項1至33中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之個體對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病症的藥劑。
  35. 如請求項34之用途，其中該疾病或病症係選自急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群(Brugada syndrome)、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖 維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
  36. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，其用作藥劑。
  37. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，其用於治療或預防對APJ受體之促效作用有反應之疾病或病症。
  38. 如請求項1、2、8、9、11、19及20中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，其用於治療急性失代償心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺高血壓、心房纖維性顫動、布魯加達症候群、心室性心搏過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠期糖尿病)、肥胖症、周邊動脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血性發作、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
  39. 一種組合，其包含治療有效量之如請求項1至33中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，及一或多種治療活性輔劑。
  40. 如請求項39之組合，其中該輔劑係選自收縮影響劑、β腎上腺素激導性受體阻斷劑、HMG-Co-A還原酶抑制劑、血管收縮素II受體拮抗劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、鈣離子通道阻斷劑(CCB)、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、利尿劑、ApoA-I模擬物、抗糖尿病劑、減肥劑、醛固酮受體阻斷劑、內皮素受體阻斷劑、醛固酮合成酶抑制劑(ASI)、CETP抑制劑、抗凝劑、鬆弛素、BNP(奈西立肽(nesiritide))及/或NEP抑制劑。
  41. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至33中任一項 之多肽或其醯胺、酯或鹽，及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
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