TW200408405A - Vaccine comprising HPV antigens - Google Patents

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Description

200408405 玫、發明說明： [技術領域] 本發明係有關新穎疫苗配方，其製法及其用於治療的用 途。特別本發明係有關一種投予青春期的組合疫苗。 [先前技術] 乳突瘤病毒（Papillomaviruses)為小型DNA腫瘤病毒，高 度具有物種特異性。至目前為止已經敘述超過70種人類乳 突瘤病毒（HPV)基因型。HPV通常對皮膚（例如HPV-1及-2) 或黏膜表面（例如HPV_6及-11)具有特異性且通常引起良性 腫瘤（疣）可持續數月或數年。此種良性腫瘤可能造成個體的 擔憂但除了少數例外之外通常不會致命。 某些HPV也與癌症有關。HPV與人類癌症間最強力的正 面關聯存在於HPV-16及HPV-18與子宮頸癌間的關聯。子宮 頸癌是開發中國家最常見的惡性病，全球每年出現的新病 例超過約50萬例。今日在技術上已經可以使用疫苗主動出 擊對抗原發性HPV-16感染及甚至已經確立的含HPV-16癌 症。有關抗HP V-16之預防性及治療性疫苗接種的展望综論 參考Cason J.，臨床免疫治療學1994 ; 1(4)293-306及 Hagenesee M.E.，内科感染 1997 14(7)555-556，559-564。 其它特別令人感興趣的HPV為血清型31，33及45。 今日已經單離不同類型的HPV且已經藉助於細菌的選殖 系統以及更為晚近利用PCR擴增方法特徵化。HPV基因組的 分子組織結構已經基於與明確特徵化的牛乳突瘤病毒1型 (BPV1)基於比較基礎定義。
O:\87\8797l.DOC 200408405 雖然確實有微小變異，但所述全部HPV基因組皆至少有7 個早期基因E1至E7及兩個晚期基因L1及L2。此外，上游調 節區載有調節順序其顯然可控制大半HPV基因組的轉錄事 件。 E1及E2基因分別涉及病毒的增生及轉錄控制，且容易受 到病毒整合破壞。E6及E7以及更為晚近的證據指出E5也涉 及病毒轉形。 涉及子宮頸癌的HPV例如HP V 16及18中，致腫瘤發生過 程始於病毒DNA整合之·後。整合導致編碼莢膜蛋白質L1& L2的基因失活化，以及導致兩種早期蛋白質別及£7的連續 過度表現，結果將導致正常細胞分化過程漸進喪失而出現 癌瘤。 子宮頸癌於女性常見，係經由癌前期中間階段發展成為 侵襲性癌，經常導致死亡。疾病的中間階段稱做子宮頸内 皮腫瘤，以嚴重程度遞增分成I至III級。 臨床上女性肛門陰道之HPV感染呈現子宮頸扁平濕疲， 其特點標記為漏斗狀細胞過多，主要影響子宮頸鱗狀上皮 的表淺及中間細胞。 漏斗形細胞係由於病毒造成細胞病變結果，呈現多核細 胞而核周圍有一圈透明。上皮增厚伴以異常角化造成病灶 的疣狀外觀。 此種扁平濕疣當對HPV 16或18血清型呈陽性反應時，乃 演變成子宮頸上皮内腫瘤（CIN)及原位癌（CIS)的高度風險 因子，CIN及CIS本身被視為侵襲性子宮頸癌的前驅病灶。
O:\87\87971.DOC 200408405 WO 96/19496揭示人類乳突瘤病毒E6及E7蛋白的變異 株，特別E6/E7融合蛋白質而於E6及E7蛋白質皆有刪失。此 種刪失融合蛋白質據稱具有免疫原性。 基於 HPV L1 的疫苗揭示於 W094/00152，WO94/20137， WO93/02184及WO94/05 792。此種疫苗包含L1抗原作為單 體、囊粒或病毒狀粒子。此種粒子額外包含L2蛋白質。基 於L2的疫苗述於例如W093/00436。其它HPV疫苗係基於早 期蛋白質例如E7或融合蛋白質如L2-E7。 HSV-2為生殖器疱疹的主要病原因子。HSV-2及HSV-1 (純 癌疼的病原因子）係以可謗發急性發病且建立潛伏感染主 要在神經元神經節細胞感染為其特徵。 生殖器疱疹估計單獨美國即約有5百萬個病人，每年記錄 500,000萬個臨床病例（原發及復發感染）。原發感染發生於 發身期之後，且以局部出現疼痛皮膚病灶持續2至3週時間 為其特徵。於原發感染後的6個月以内，50%病人將復發。 於25%病人每年復發1〇至15次。而免疫不全病人具有高頻 率復發率’其統計數字係高於正常病人族群。 HSV-1及HSV-2病毒有多個糖蛋白成分位在病毒表面 上。稱做gB，gC，gD及gE等。 需要有有效的組合疫苗來預防特別容易發病的青春期。 [發明内容] 本發明提供一種疫苗組合物，包含： (a) HPV 16主莢膜蛋白質L1病毒狀粒子；以及 (b) HPV 18主莢膜蛋白質L1病毒狀粒子
O:\87\87971.DOC 200408405 組合一種佐劑，佐劑為TH丨細胞反應的偏好刺激劑。 本發明之疫苗組合物投予特別有HPV感染風險的青春期 具有極大效果。 選擇性地，本發明之疫苗組合物額外包含下述多種其它 疫苗中之一或多者。 發現根據本發明之疫苗組合物出乎意外地顯示不會干 擾’換言之，對本發明組合物中各種抗原的免疫反應大致 同各種抗原個別結合T Η丨細胞反應偏好刺激劑的佐劑所得 免疫反應。 預防B型肝炎感染的疫苗包含一或多種b型肝炎抗原為 眾所周知。例如得自史克美占生物公司之疫苗安澤瑞 (Engerix)-B(商品名）用以預防b型肝炎。此種疫苗包含b型 肝炎表面抗原（特別226胺基酸S-抗原，由Harford等人述於 研死所内科期刊1987，63 (補遺2)65-70頁）且使用氫氧化鋁 作為佐劑配方。 疫苗哈福瑞(Havrix)(商品名）也得自史克美占生物公司 乃可用於預防A型肝炎感染之一例係使用氫氧化鋁作為佐 劑配方。此種疫苗包含HM-175 A型肝炎疫苗以甲酸失活化 的減毒株；參考Andre等人（研究所内科病毒學，第37期第 1-24頁）。 用方；此處A型肝炎病毒（H AV)抗原一詞用以表示衍生自a 型肝炎病毒或HAV選擇性例如以甲醛失活化的減毒株。若 H A V抗原為衍生自a型肝炎病毒的蛋白質，則可選擇性為重 組蛋白質。 200408405 疫苗吐恩瑞（Twinrix)(商品名）為重組B型肝炎抗原與前 述失活化減毒A型肝炎病毒的組合。疫苗可用於同時預防A 型肝炎及B型肝炎。 歐洲專利0 339 667 (Chemo Sero)說明組合A型肝炎抗原 及B型肝炎抗原製造組合疫苗的一般構想。於該說明書陳述 使用的佐劑並無特殊限制：僅須可提升免疫活性至預定程 度且不會造成任何副作用即可。陳述可使用鋁凝膠特別氬 氧化鋁凝膠及磷酸鋁凝膠。 根據本發明之疫苗組合物除了 HPV及HSV抗原外，包含 一種HAV抗原或一種HBV抗原或更佳包含HAV及HBV抗原 的組合。 此種疫苗投予青春期特別有效，青春期罹患HSV及/或 HPV感染，及/或HAV感染，及/或HBV感染的風險特別高。 免疫反應可廣義分成兩種極端類別，亦即體液媒介或細 胞媒介免疫反應（傳統分別係以抗體及細胞執行子保護機 轉特徵化）。此等反應類別稱做TH1-型反應（細胞媒介反應） 及TH2-型免疫反應（體液反應）。 極端TH1-型免疫反應可由產生抗原特異性、半抗原型約 束胞毒性T淋巴細胞及天然殺手細胞反應特徵化。於小鼠， TH1-型反應常以產生IgG2a亞型抗體特徵化，而人類則相當 於IgGl型抗體。TH2-型免疫反應係以產生免疫球蛋白同型 包括於小鼠之IgGl特徵化。 考慮發展出此二類型免疫反應背後的驅動力乃細胞激素 (cytokines)。高濃度TH1-型細胞激素有利於對指定抗原引
O:\87\8797l.DOC 200408405 發細胞媒介免疫反應，而高濃度TH2-型細胞激素有利於對 抗原引發體液免疫反應。 TH1與TH2-型免疫反應的區別並非絕對。實際上個體將 支持一種免疫反應，主要為ΤΗ 1或主要為TH2。但經常方便 地以Mosmann及Coffman於鼠CD4+ve T細胞來考慮細胞激 素族群（Mosmann，T.R.及 Coffman，R.L.(1989)TH1 及 TH2 細 胞：分泌不同類型細胞激素結果導致不同功能性質。免疫 學年報，7，145-173頁）。傳統上，TH1-型反應關聯T淋巴 細胞產生INF-γ細胞激素。其它經常直接關聯謗發TH1-型免 疫反應的細胞激素並非由T細胞產生，例如IL-12。相反地， TH2 -型反應關聯分泌IL-4 ’ IL_5 ’ IL-6，IL-10及腫瘤壞死 因子-p(TNF-p)。 已知某些疫苗佐劑特別適合刺激TH1或TH2-型細胞激素 反應。傳統上於疫苗接種或感染後ΤΗ 1 ·· TH2免疫反應平衡 的最佳指標包括直接量測試管試驗中，再度使用抗原刺激 後T淋巴細胞產生的ΤΗ14τΗ2細胞激素，及/或（至少一小 鼠）量測抗原特異性抗體反應之IgGi : igG2a比。 如此，TH1-型佐劑為當於試管試驗再度使用抗原刺激時 可刺激離體T細胞族群產生高濃度TH1-型細胞激素，以及誘 發關聯形成於同型之抗原特異性免疫球蛋白反應的佐劑。 偏好刺激ΤΗ 1細胞反應的佐劑述於國際專利申請案第 WO 94/00153及WO 95/17209號。 3去-O-St化一磷醯基脂質a(3D-MPL)屬於此種佐劑。由 〇6 2220211(11比丨）為已知。於化學上其為3去-〇_醯化一磷醯
O:\87\87971.DOC -10- 200408405 基脂質A與4、5或6醯化鏈之混合物且由蒙大拿州Ribi免疫 化學公司製造。3去-0-醯化一磷醯基脂質A揭示於歐洲專利 0 689 454 B1 (史克美占生物公司）。 較佳3D-MPL的粒子夠小而可經0.22微米膜（述於歐洲專 利第0 689 454號）無菌過濾。3D_MPL係以每劑1〇微克-1〇〇 微克較佳25-50微克之範圍存在，其中抗原之典型存在範圍 為每劑2-50微克。 另一種較佳佐劑包含QS21，為衍生自石鹼樹（Quillaj.a Saponaria Molina)樹皮的Hplc純化無毒部份。此部份可選擇 性混合3去-0-醯化一磷醯基脂質a(3D-MPL)選擇性連同載 劑混合。 QS21之製法揭示於美國專利第5,〇57,540號。 含QS21之無反應原性佐劑配方先前曾經說明（Wq 96/3 3739)。此種包含QS21及膽固醇的配方當連同抗原調配 時顯示為成功的TH1刺激佐劑。如此形成本發明之一部份 之疫苗組合物包括QS21及膽固醇的組合。
ΤΗ 1細胞反應之偏好刺激劑的進一步佐劑包括免疫調理 寡核菩酸，例如非甲基化CpG序列揭示於w〇 96/〇2555。 不同ΤΗ 1刺激佐劑例如前述組合預期也可提供TH丨細胞 反應偏好刺激劑的佐劑。例如qS2丨可連同3D_MPL配方。 QS21 · 3D-MPL之比典型為約丨：1〇至1〇 :丨，較佳丨：$至5 : 1及常見實質為1 : 1。最適當協同效果之範圍較佳為2.5 : i 至 1 : 1 3D-MPL : QS21。 較佳載劑也存在於根據本發明之疫苗組合物。載劑可為
O:\87\87971.DOC -11- 200408405 水包油乳液或鋁鹽如磷酸鋁或氫氧化鋁。 較佳水包油乳液包含可代謝油類例如角鯊締，以生育酚及 呑恩（TWeen)80。其它水包油乳液可含史班（span)85&/或卵 磷脂及/或三癸酸甘油酯。 於特佳特徵’根據本發明之疫苗組合物之抗原可組合 3D-MPL 及礬土。 典型供人類投藥，QS21及3D-MPL係以每劑1微克-200微 克，較佳10_100微克，更佳1〇-5〇微克之範圍存在於疫苗。 典型水包油包含2至10%角鯊烯，2至1〇生育紛及〇.3至3% 呑恩80。較佳角鯊晞：α生育酚之比係等於或小於1，原因 在於如此可提供更穩定的乳液。史班85也可以1 %濃度存 在。某些案例較佳本發明之疫苗進一步含有安定劑。 無毒水包油乳液較佳含有無毒油如角鯊烷或角鯊晞，乳 化劑例如呑恩80於水性載劑。水性載劑例如為磷酸鹽緩衝 食鹽水。 特別強力佐劑配方包括QS2卜3D-MPL及生育酚於水包油 乳液述於WO 95/17210。 本發明組合物之HPV抗原較佳衍生自Hpv 16及/或18以 及衍生自HPV 6及/或11或HPV 3 1、33或45。 較佳具體實施例中，根據本發明之疫苗組合物之HPV抗 原包含HPV之主莢膜蛋白質L1以及選擇性L2蛋白質，特別 得自HPV 16及/或HPV 18。本具體實施例中，L1蛋白質之 較佳形式為截頭L1蛋白質。較佳l卜選擇性L1-L2融合蛋白 質係呈病毒狀粒子（VLP)形式。L1蛋白質可融合至另一種 O:\87\87971.DOC -12- 200408405 HPV蛋白質特別E7而形成L1-E7融合體。以包含Ll-Ε或 L1-L2-E之嵌合體VLP為特佳。 另一較佳具體實施例中，本發明組合物之HPV抗原係衍 生自E6或E7蛋白質，特別E6或E7連結至具有T細胞抗原決 定部位的免疫融合相對部份。 本發明具體實施例之較佳形式中，免疫融合相對部份係 衍生自流行性感冒啥血桿菌（Heamophilus influenza)B的蛋 白質D。較佳蛋白質D衍生物約含蛋白質的前1/3，特別約為 第一 N-端100_110胺基酸。 本發明之具體實施例之較佳融合蛋白質包含得自HPV 16 的蛋白質D-E6，得自HPV 16的蛋白質D-E7，得自HPV 18 的蛋白質D_E7及得自HPV 18的蛋白質D-E6。蛋白質D部份 構成蛋白質D的前1/3。 又另一本發明之具體實施例中，HPV抗原係呈L2-E7融合 蛋白質形式，特別得自HPV 6及/或HPV 11。 本發明之蛋白質較佳係於大腸桿菌表現。較佳具體實施 例中，蛋白質係使用包含約5至9及較佳6組胺酸殘基的組胺 酸尾端表現。如此有助於純化。此種蛋白質之製造說明完 整述於同在審查中之英國專利申請案第GB 9717953.5號。 疫苗組合物之HP V抗原可吸附於氫氧化鋁上。 本發明組合物之HSV抗原較佳衍生自HSV-2,典型為糖蛋 白D。糖蛋白D係位在病毒膜上，也出現於感染細胞的胞質 (Eisenberg R.J.等人；病毒學期刊 1980，35_ ? 428-435)。包 含393胺基酸包括一個信號肽，分子量約60千道耳呑。全部 O:\87\87971.DOC -13- 200408405 HSV套膜糖蛋白中以此種被最佳決定特徵（CoHen等人病毒 學期刊，应，157-166)。於活體試驗已知對病毒附著於細胞 膜扮演關鍵要角。此外，糖蛋白D可於活體試驗提引出中和 抗體（Eing等人，内科病毒學期刊127: 59-65)。但潛伏HSV-2 病毒仍可被再度活化而誘使疾病復發，儘管病原血清存在 有南中和抗體力價亦如此。 本發明之較佳具體實施例中，HSV抗原為308胺基酸截頭 HSV-2糖蛋白D，包含天然胺基酸1至306糖蛋白加成天冬醯 胺及麩胺於截頭蛋白質·之C端而不含膜錨定區。此型蛋白質 包括信號肽，信號肽被割裂而獲得成熟283胺基酸蛋白質。 於中國倉鼠卵巢細胞產生此種蛋白質述於基因技術 (Genentech’s)公司的歐洲專利 EP-B-139 417。 重組成熟HSV-2糖蛋白D截頭部份較佳用於本發明之疫 苗配方且標示為rgD2t。 此種HSV-2抗原組合佐劑3D-MPL的組合述於WO 92/16231 。 當B型肝炎病毒（HBV)抗原涵括於本發明之組合物時，典 型為B型肝炎表面抗原。 B型肝炎表面抗原（HBsAg)的製備已經有明確文獻記 載。例如參考Harford等人，發展生物學標準54期125頁（1983 年），Gregg等人，生物技術第5期479頁（1987年），ΕΡ-Α-0 226 846，ΕΡ-Α-0 299 108及其中引述的參考文獻。 用於此處，「B型肝炎表面抗原」的表示法於此處縮寫為 「HBsAg」或「HBS」包括具有HBV表面抗原的抗原性的任 O:\87\87971.DOC -14- 200408405 何B 土肝人表面杬原或其片段。須了解除了 HBsAg s抗原的 226胺基酸序列（參考Ti〇llais等人，自然，π， 及a中引述的參考文獻）外，若有所需此處所述liBsAg可含 有前文參考文獻及EP-A-〇 278 94〇所述全部或部份pre_s， 歹J HBsAg用於此處也表示變異株，例如w〇 91/147们所述 「脫逃哭變株」。進一步，]^38八§可含歐洲專利申請案第〇 414 374號稱做L*的蛋白f，亦即一種蛋白冑，其胺基酸順 序係由B土肝灵病母大（L)蛋白質（“或叮亞型）的胺基酸順 序邵份組成，其特徵在.於蛋白質之胺基酸順序係由下列組 成·· (a) 該L蛋白質之殘基12_52,接著殘基133_145，接著殘基 175-400 ;或 (b) 孩L蛋白質之殘基12，接著殘基14_52，接著殘基 133-145，接著殘基 175-400。 HBsAg也稱做多肽，述於EP 〇 198 474或砂〇 3〇4 578。 通常HBsAg為粒子形式。單獨包含s蛋白質，或可呈複體 粒子例如（L*，S)，這種L*定義如前而S表示B型肝炎表面抗 原的S蛋白質。 HBsAg如W093/24148所述可吸附於磷酸鋁上。 較佳本發明配方使用的B型肝炎（HBV)抗原為商品安澤 瑞-B(商品名；史克美占生物公司）使用的HBsAgS抗原。 包含B型肝炎表面抗原結合3D-MPL的疫苗述於歐洲專利 申請案0 633 784。 現在說明可涵括於本發明組合物之得自額外病原之^原 O:\87\87971.DOC -15- 200408405 實例。 伊普斯坦巴爾病毒（Epstein Barr Virus)(EBV)屬於癌參病 毒的一員引發傳染性單核細胞增多乃人類的重大疾病。主 要感染兒童或年輕人。平均成人族群中有多於90%感染EBV 而終生維持於周邊B-淋巴細胞。病毒係終身由腮腺產生且 主要由交換潛藏有病毒的個體唾液傳播。感染EBV的兒童 大半無症狀，或有極為輕微的症狀，感染的青春期及成人 典型出現傳染性單核細胞增多，其特徵為發燒、咽炎及腺 體病變。感染病人可維持抗EBV抗體終生因而對進一步感 染免疫。 除了 EBV的感染性質外，EBV也可轉形淋巴細胞變成快 速分裂的細胞，因此可能引起不同的淋巴瘤包括非洲布吉 特氏淋巴瘤（African Burkitt’s lymphoma)(BL)。EBV也牽涉 引起鼻咽癌（NPC)。全球估計有約80,000例鼻咽癌病例較常 見於中華民族。傳染性單核細胞增多係由於感染EBV的主 要後果。若未存在有其它風險因子則非致命性疾病。 曾經說明四種組成所謂的膜抗原複體的EBV病毒套膜蛋 白。通常稱做gp 220/350或gp 250/350或簡稱gp 250或350(參 考EP-A-151079)。有相當證據證實gp 3 50及gp 250可謗發產 生中和抗體，對抗gp 350及gp 250的抗體具有中和能力。如 此此等蛋白質為EBV疫苗的可能候選者。有關gp 250/350 應用於預防及治療EBV關聯疾病的進一步資訊可參考EP 0 173 254 ° 主要EBV表面糖蛋白gp 350/220係經由與細胞膜蛋白質 O:\87\87971.DOC -16- 200408405 CD21交互作用而感染人類目標細胞。gp 350/220為人類 EBV中和抗體的主要目標，某些形式的gp 350/220顯示可保 護不患EBV關聯病。較佳本發明之疫苗組合物包含EBV之 gp 3 50，但也可使用其它保護性抗體。 於較佳特徵方面，本發明之疫苗組合物額外包含帶狀癌 疹病毒抗原（VZV抗原）。涵括於疫苗配方的適當VZV抗原包 括gpl-V述於Longnecker等人美國國家學術科學會議事錄 84，4303-4307(1987)。 較佳具體實施例係使用gpl(參考Ellis等人，美國專利 4,769,239)。也參考歐洲專利案第0 405 867 B 1號。 另一較佳特徵方面’本發明之疫苗組合物額外包含人類 細胞巨病毒（HCMV)抗原。HCMV為屬於疱疹病毒科的一種 人類DNA病毒。HCMV流行於全世界大半地區。有兩種族 群感染HCMV造成嚴重醫療情況。HCMV為新生兒先天缺陷 的主要起因。第二風險族群是免疫受損病人例如由於HIV 感染以及接受移植病人。臨床疾病引發多種症狀包括發 燒、肝炎、肺炎及傳染性單核細胞增多。用於對抗HCMV 疫苗的較佳抗原為gB685**述於WO 95/3 1555。用於HCMV 疫苗的免疫原也由pp65提供，pp65為HCMV基體蛋白質述 於wo 94/00150(希望城）。 於較佳特徵方面，本發明之疫苗組合物額外包含VZV及 HCMV抗原，特別前述抗原。 另一較佳特徵方面，本發明之疫苗組合物額外包含非洲 弓漿蟲抗原。非洲弓漿蟲是一種專性胞内原生動物寄生蟲 O:\87\87971.DOC -17- 200408405 造成溫血動物包括人類的弓漿蟲病。雖然通常於健康人體 無臨床症狀，但弓漿蟲病可能對孕婦及免疫不全病人造成 嚴重併發症。較佳用於抗非洲弓漿蟲的疫苗的抗原為SAG1 (也稱做 P30)述於 WO96/02654或 Tg34述於 W092/11366。 於較佳特徵方面，本發明之疫苗組合物額外包含VZV抗 原或HCMV抗原組合非洲弓漿蟲抗原特別前述抗原。 於較佳特徵方面，本發明之疫苗組合物為多價疫苗例如 四價或五價疫苗。 本發明之配方用於提·引出保護性免疫力極有效，甚至使 用極低劑量抗原（例如低抵5微克fgD2t)也有效。 提供對原發性感染以及刺激特異性體液（中和性抗體）以 及執行子細胞媒介（DTH)免疫反應具有絕佳保護效果。 於又一特徵方面，本發明提供此處所述疫苗配方用於醫 療，特別用於治療或預防人類乳突瘤病毒感染及單純疱疹 病毒感染。 本發明之疫苗含有免疫保護量的抗原而可藉習知技術製 備。 疫苗的製備概略述於醫藥生物技術第61期疫苗設計-亞 單位及佐劑辦法，Powell及Newman編輯，Plenum出版社 1995年；疫苗新趨勢及發展，Voller等人編輯，大學公圜出 版社，馬里蘭州巴爾地摩1978年。包囊於微脂粒例如由 Fullerton述於美國專利4,235，877。蛋白質接合巨分子例如 揭示於Likhite美國專利4,372,945及Armor等人美國專利 4,474,757 ° O:\87\87971.DOC -18- 200408405 蛋白質於各疫苗的用量係選擇可於典型疫苗被接種人提 引出免疫保護反應而不會造成顯著不良副作用。此種量隨 使用的特定免疫原而定。通常預期每劑包含微克蛋 白貝，較佳2-100微克，最佳4-40微克。特定疫苗之最適量 可由標準研究確定，涉及觀察個體的抗體力價及其它反 應。初步疫苗接種後，個體可在約4週後接受追加接種。 除了疫苗接種對HP V或HSV感染的易感性個體外，本發 明之醫藥組合物可用於患有該種病毒感染的免疫治療。 本發明之又一特徵方.面，提供一種此處所述之製法，其 中該方法包含混合人類乳突瘤病毒抗原及單純疱疹病毒抗 原與TH-1提引佐劑例如3D_MPL及較佳載劑例如礬土。 若有所需可以任一種方便順序加入其它抗原而提供此處 所述的多價疫苗組合物。 [實施方式] 下列實例係供舉例說明而非限制本發明。 實例1 : HPV Ags/HBs/gD於使用AS04調配的單價或組合 疫苗的免疫原性比較。 引言 免疫原性研究係使用四種不同的抗原於Balb/C小鼠進 行： 1.HPV16 L1 病毒狀粒子（VLP-16) 2.HPV18 L1 病毒狀粒子（VLP-18) 3. HSV-2之gD抗原 4. HBsAg O:\87\87971.DOC -19- 200408405 使用抗原或3D-MPL事先吸附於Al(OH)3或AlP〇4的單一本 體調配礬土 /3D-MPL(AS04)。 3D-MPL/A1(0H)3配方於此處稱做AS04D，而基於 3D-MPL/A1P04的配方稱做AS04C。 評估下列疫苗： 1. VLP16+VLP18 AS04D ； 2. gD AS04D ； 3. HBs AS04C。 及評估此等疫苗組合的·可能。 本實驗目標係比較由下列製成的兩種不同AS04組合的免 疫原性： 1. VLP16+VLP18及 gD。 2. VLP16+VLP18及 gD及 HBs Ag。 實驗性方案完整述於材料與方法乙節。 要言之，每組10頭小鼠間隔3週使用多種基於抗原的配方 做肌肉免疫接種兩次。由疫苗接種提引出對VLPs、gD及HBs Ag的抗體反應以及同型的反應係於接種II後14日藉ELISA 監視。同時於使用VLPs、gD或HBs抗原於試管試驗再度刺 激脾臟細胞後分析細胞激素的產量（IFNY/IL5)。 材料及方法 配方 配方組合物 VLP16、VLP18、gD及HBs係使用3D-MPL於鋁鹽配方。 使用成分 O:\87\87971.DOC -20- 200408405
成分 濃度 緩衝液 HPV 16 VLP 560微克/毫升 Tris 20 mM/NaCl 500 mM HPV 18 VLP 550微克/毫升 NaCl 500 mM/NaP04 20 mM AL(OH)3 10380微克/毫升 H20 HBs 1219微克/毫升 P04 10 mM/NaCl 150 mM gD 443微克/毫升 PBS pH 7.4 3D-MPL 1170微克/毫升 注射用水 A1P04 5微克/毫升 NaCl 150 mM 吸附 a) VLP吸附 VLP 16及VLP 18的純化成分添加至氫氧化鋁獲得2微克 VLP/10微克氫氧化鋁比例。混合物至最終配方前係儲存於 2-8〇C。 b) gD吸附 2微克gD混合10微克氫氧化鋁。混合物至最終配方前係儲 存於 2-8°C。 φ c) HBs吸附 2微克HBs混合10微克磷酸鋁。混合物至最終配方前係儲 存於2-8°C。 d) 3D-MPL 吸附 5微克3D-MPL混合10微克氫氧化鋁。混合物至最終配方 前係儲存於2-8°C。 5微克3D-MPL混合10微克磷酸鋁。混合物至最終配方前 係儲存於2-8°C。 O:\87\87971.DOC -21 - 200408405 配方 混合水及氯化鈉（10倍濃縮）於室溫攪動10分鐘後加入不 同成分：吸附抗原，吸附3D-MPL及氫氧化鋁（參考下表）。 於室溫振搖10分鐘及於注射前係儲存於4°C。 抗原 免疫刺激劑 媒劑 組別 類別 微克 類別 微克 類別 微克 A gD 2 ai(oh)3 10 VLP16 2 ai(oh)3 10 VLP18 2 ai(oh)3 10 3D-MPL 5 ai(oh)3 10 ai(oh)3 10 B g〇 2 Al(OH)3 10 VLP16 2 ai(oh)3 10 VLP18 2 ai(oh)3 10 HBs 2 A1P04 10 3D-MPL 5 Al(OH)3 10 C g〇 2 Al(OH)3 10 3D-MPL 5 ai(oh)3 10 Al(OH)3 30 D VLP16 2 ai(oh)3 10 VLP18 2 Al(OH)3 10 3D-MPL 5 Al(OH)3 10 Al(OH)3 20 E HBs 2 A1P04 10 3D-MPL 5 Al(OH)3 10 ai(oh)3 30 O:\87\87971.DOC -22- 200408405 小鼠血清學 抗VLP-16及抗VLP-18血清學 抗VLP16及抗VLP18抗體的定量係使用VLP16 503/1 (20/12/99)及 VLP18 504/2(25/10/99F)作為塗布抗原藉 ELISA進行。每孔使用50微升抗原及抗體溶液。抗原以終 濃度0.5微克/毫升稀釋於PBS，且於4°C吸附於96孔微力價 平板（美希索柏免疫平板（Maxi sorb Immuno-pi ate)，丹麥挪 克）的各孔隔夜。平板於37°C與含1%牛血清白蛋白的PBS共 同培育1小時。血清（始於1/400稀釋）於飽和緩衝液的兩倍稀 釋液添加至VLP塗布平板上且於3 7°C培育1小時30分鐘。平 板使用PBS 0.1%呑恩20洗4次，生物素接合抗小鼠Ig(阿莫 參（Amersham)公司，英國）稀釋1/1500於飽和緩衝液添加至 各孔且於37°C培育1小時30分。洗滌步騾後於飽和緩衝液稀 釋1/1000的鏈絲菌抗生物素-生物素化過氧化酶複體（阿莫 參公司，英國）添加至其中又於37°C培育30分鐘。平板如前 述洗滌且與鄰伸苯基二胺（希格瑪公司）〇.〇4%，過氧化氫 0.03%於0.1 %呑恩20，〇·〇5 μ磷酸鹽緩衝液pH 4.5之溶液培 育20分鐘。反應藉2 N硫酸中止且於490/630毫微米讀取。 ELIS A力{貝係藉板福馬斯普（§〇ftmaxpr〇)(使用四參數方程 式）由參考品算出且以EU/毫升表示。 抗gD反應： 使用gD(gD 43B318)作為塗布抗原，藉ELISA進行抗gD抗 體的定量。抗原及抗體溶液每孔使用5〇微升。抗原以終濃 度1微克/毫升稀釋於PBS且於4 °C吸附於96孔微力價平板 O:\87\87971.DOC -23- 200408405 (美希索柏免疫平板，丹麥挪克）各孔隔夜。然後平板於3 7 °C與含1%牛血清白蛋白及0.1%呑恩2〇(飽和緩衝液；1〇〇微 升/孔）的PBS共同培育1小時。血清（始於丨/丨⑼稀釋）於飽和 緩衝液的兩倍稀釋液添加至gD塗布平板且於3 7 °c培育i小 時30分。平板使用PBS 0.1 %呑恩20洗4次，生物素接合抗小 鼠IgGl，IgG2a，IgG2b或Ig(英國阿莫參公司）於飽和緩衝液 稀釋1/1000添加至各孔且於37°C培育1小時30分。洗務步驟 後於飽和緩衝液稀釋1/1000的鏈絲菌抗生物素-生物素化過 乳化酶複體（英國阿莫參公司）添加於其中又於3 7。〇培育3 〇 分鐘。平板如前述洗滌且使用鄰伸苯基二胺（希格瑪公 司）0.04%，過氧化氫0.03%於0.1 %呑恩20，〇·〇5 Μ磷酸鹽緩 衝液pH 4.5溶液共同培育20分鐘。反應藉2 Ν硫酸中止且於 490/630愛微米讀取。藉梭福馬斯普（使用四參數方程式）由 參考品計算ELISA力價且以EU/毫升表示。 抗HBs血清學 抗HBs抗體的定量係藉ELISA使用HBs(Hep 286)作為塗 布抗原進行。抗原及抗體溶液每孔使用50微升。抗原以終 濃度1微克/毫升稀釋於PBS且於4°C吸附於96孔微力價平板 (美希索柏免疫平板，丹麥挪克）各孔隔夜。然後平板於37 °C與含1%牛血清白蛋白及〇.1%呑恩20(飽和緩衝液）的？33 共同培育1小時。血清（始於1/100稀釋）於飽和緩衝液的兩倍 稀釋液添加至HBs塗布平板且於3 7°C培育1小時30分。平板 使用PBS 0.1 %呑恩20洗4次，及生物素接合抗小鼠ig(英國 阿莫參公司）稀釋1/1500或^01，；^023，1§〇21)(美國英泰克 O:\87\87971.DOC -24- 200408405 (IMTECH)公司）分別於飽和緩衝液稀釋1/4〇〇〇，ι/8〇⑼， 1/4000添加至各孔且於37t：培育丨小時3〇分。洗滌步驟後於 飽和緩衝液稀釋1/1000的鏈絲菌抗生物素_生物素化過氧化 酶複體（英國阿莫參公司）添加於其中又於3 1培育3 〇分 鐘。平板如前述洗滌且使用鄰伸苯基二胺（希格瑪公 司）0.04%，過氧化氫〇.〇3%於〇.1%呑恩20,〇〇51^磷酸鹽緩 衝液pH 4.5溶液共同培育20分鐘。反應藉2 N硫酸中止且於 490/630毫微米讀取。藉梭福馬斯普（使用四參數方程式）由 參考品計算ELISA力價且以EU/毫升表示。 細胞激素的製造 弟一次免疫接種後兩週殺此小鼠，以無菌方式取出脾臟 且匯集。於RPMI 1640培養基（GIBCO)製備細胞懸浮液， RPMI含有2 mM L-麩胺，抗生素，5χ10·5 Μ 2-巯乙醇，及 5%胎牛血清。細胞以終濃度5xl06細胞/毫升以每平底24孔 平板1毫升與各不同濃度（10-1微克/毫升）抗原（VLPs，gD或 HBs抗原）共同培育。96小時後收穫上清液且冷凍至藉 ELISA測試存在有IFNy及IL5為止。 IFNy(金載恩（Genzyme)公司） IFNY的定量係使用得自金載恩公司的試劑藉ELIS A進 行。試樣及抗體溶液每孔使用50微升。96孔微力價平板（美 希索柏免疫平板，丹麥挪克）於4°C與50微升倉鼠抗小鼠 IFNy以1.5微克/毫升稀釋於碳酸鹽緩衝液pH 9.5塗層隔 夜。然後平板於37°C與含1%牛血清白蛋白及〇·1%呑恩20(飽 和緩衝液）的100微升PBS共同培育。得自試管試驗刺激（始 O:\87\87971.DOC -25- 200408405 於1/2)上清液於飽和緩衝液的兩倍稀釋液添加至抗IFN丫塗 層平板且於37°C培育l小時30分。平板使用pBs呑恩0.1%(洗 滌緩衝液）洗4次，生物素接合山羊抗小鼠ΐρΝγ於飽和緩衝 液稀釋為終濃度0.5微克/毫升添加至各孔且於37°C培育i小 時。洗膝步驟後於37°C加入安德士（AMDEX)接合物（阿莫參 公司）於飽和緩衝液稀釋1/1 〇〇〇〇歷30分鐘。平板如前述洗滌 且與50微升TMB(百歐德（Biorad)公司）共同培育1〇分鐘。反 應藉0.4 N硫酸中止且於450/630毫微米讀取。濃度係藉梭福 馬斯普（四參數方程式}使用標準曲線（小鼠ΙΡΝγ標準品）計 算且以微微克/毫升表示。 IL5(法明真（Pharmingen)公司） IL5的定量係使用得自法明真公司的試劑藉ELIS A進行。 試樣及抗體溶液每孔使用50微升。96孔微力價平板（美希索 柏免疫平板，丹麥挪克）於4°C與50微升倉鼠抗小於IL5以1 微克/耄升稀釋於碳酸鹽緩衝液pH 9· 5塗層隔夜。然後平板 於37°C與含1%牛血清白蛋白及〇·ι%呑恩2〇(飽和緩衝液）的 100微升PBS共同培育。得自試管試驗刺激（始於1/2)上清液 於飽和緩衝液的兩倍稀釋液添加至抗IL5塗層平板且於37 °C培育1小時30分。平板使用PBS呑恩〇.1%(洗滌緩衝液）洗4 次，生物素接合大鼠抗小鼠IL5於飽和緩衝液稀釋為終濃度 1微克/毫升添加至各孔且於37°C培育1小時。洗滌步驟後於 37°C加入安德士（AMDEX)接合物（阿莫參公司）於飽和緩衝 液稀釋1/10000歷30分鐘。平板如前述洗滌且與50微升 TMB(百歐德（Biorad)公司）共同培育15分鐘。反應藉〇.4 ^^硫 O:\87\87971.DOC -26- 200408405 酸中止且於450/630毫微米讀取。濃度係藉梭福馬斯普（四參 數方程式）使用標準曲線（重組小鼠IL5)計算且以微微克/毫 升表示。 組別 每組10頭Balb/C小鼠使用下列配方做肌肉免疫接種： 表1 :組別及配方 組別 配 方 A VLP16 2 微克/VLP18 2 微克/gD 2 微克/3D-MPL 5 微 克/Al(OH)3 50 微克 B VLP16 2微克/VLP18 2微克/HBs 2微克/gD 2微克 /3D-MPL 5 微克/Al(OH)3 40 微克/A1P04 10 微克 C gD 2 微克 /3D-MPL 5 微克 /Al(OH)3 50 微克 D VLP16 2 微克 /VLP18 2 微克 /3D-MPL 5 微克 /A1(0H)3 50 微克 E HBs 2 微克/3D-MPL 5 微克/A1P04 10 微克/Al(OH)3 40微克 配方細節述於前文材料及方法乙節。 結果 1 ·血清學： a)抗VLP16反應： 體液反應（Ig)係以使用VLP16 503-1(20/12/99)作為塗布 抗原藉ELISA測量。分析II後14日血清。 圖1顯示於II後14日對各血清測量抗VLP16 Ig抗體反應。 使用VLPs、gD及HBs Ag(B組）的組合免疫接種後所得抗 O:\87\87971.DOC -27- 200408405 VLP16力價略低於VLPs及gD的組合（A組）或一價VLPs配方 (D 組）（GMT 分別為 27578 比 48105 EU/毫升比 44448 EU/毫 升）。於統計分析前，對資料排除的各族群應用T-格拉柏 (T-Grubbs)試驗。A及D組的兩種無反應小鼠不接受分析。 各組間觀察得的差異使用學生紐曼克氏試驗顯示於統計 上無意義。 b) 抗VLP18反應： 體液反應（Ig)係藉ELISA使用VLP18 504-2(25/10/99)作為 塗布抗原測量。分析II後14日血清。 圖2顯示於個別II後14日血清測量的抗VLP18 Ig抗體反 應。 使用VLPs、gD及HBs Ag的組合（B組）免疫接種後所得抗 VLP18力價與使用VLPs及gD組合（A組）或一價VLPs配方（D 組）所得力價相當（GMT分別為56078比88786 EU/毫升比 76991 EU/毫升）。 統計分析前對各族群應用T-格拉柏試驗做資料排除。A及 D組的兩種未反應小鼠排除不做分析。 使用變因試驗的單向分析，觀察得的差異顯示於統計上 無意義。 c) 抗gD反應： 藉ELISA使用gD作為塗布抗原測量體液反應（Ig及同 型）。分析II後14日血清。 圖3顯示於II後14日對各血清測量所得抗gD抗體反應： 有關抗gD反應，使用VLPs/gD/HBs組合（B組）所得GMT比 O:\87\87971.DOC -28- 200408405 較單獨使用gD(C組）或VLPs/gD組合（A組）觀察得略減（GMT 分別為1863 1比32675比2705 8 EU/毫升）。 統計分析前對各族群應用T-格拉柏試驗做資料排除。A組 兩頭無反應小鼠排除不接受分析。 變因的單向分析係於II後資料接受對數轉換之後的抗gD 力價進行。三種配方未見統計上的顯著差異。 對匯集血清進行同型再分配分析如下： 同型再分配（％) IgGl IgG2a IgG2b A組 96 3 2 B組 96 3 2 C組 97 1 1 由三種配方提引出的同型未觀察得差異··於下表報告3 組主要提引出IgGl反應（96-97% IgGl)。 d)抗HBs反應 體液反應（Ig及同型）係使用HBsAg(Hep286)作為塗布抗 原藉ELISA測量。分析II後14日血清。 圖4顯示於II後14日對各血清測量得的抗HBs抗體反應。 於含VLPs、gD及HBs抗原的B組組合觀察得的比單獨 HBs(E組）之抗HBs抗體反應略低（GMT為28996 EU/毫升相 對於20536 EU/毫升）。 變因單向分析係於對數轉換II後資料後對抗HBs力價進 行分析。使用學生紐曼克氏試驗，B組（VLP/HBs/gD)與E組 (HBs AS04)間未觀察得統計上有意義的差異。 O:\87\87971.DOC -29- 200408405 顯著差異，- 的IgG2a保留苗
2·細胞媒介免疫反應 對匯集血清做同型重新分西公士 贷—田 土 I新刀配刀析如下，顯示兩組間並無 細胞媒介免疫反應（IFNy/IL5產量）係於使用VLPs、§〇或 HBs抗原於喊管試驗再度刺激脾臟細胞後於η後14日評 估。對各組小鼠組成5種器官的匯集物。實驗程序完整敘述 於材料及方法乙節。 3 ·細胞激素的製造 a)使用VLP16及VLP18做試管試驗再度刺激 圖5顯示於試管試驗使用VLP16再度刺激後96小時於脾 細胞監視得的細胞激素產量。 圖6顯示於試管試驗使用VLP1 8再度刺激後96小時於脾 細胞監視得的細胞激素產量。 使用10微克及1微克抗原劑量對使用VLP抗原對兩種細 胞激素產量再度刺激未見明顯劑量範圍的影響。 全部配方皆觀察得清晰TH1側面圖。 表2 ··於試管試驗再度使用VLP16及VLP18刺激後的 IFN-y/IL-5之比。______ IFN/IL-5 比 A組 B組 D組 VLP16 10微克/毫升 5.2 8.9 11.8 VLP16 1微克/毫升 15.1 14.3 16.5
O:\87\87971.DOC -30- 200408405 IFN/IL-5 比 A組 B組 D組 VLP18 10微克/毫升 19.6 11.1 16.1 VLP18 1微克/毫升 23.2 14.3 18.2 b)於試管試驗再度gD刺激 圖7顯示於試管試驗再度使用gD抗原刺激後96小時於脾 臟細胞監視得的細胞激素產量。 比較10及1微克抗原劑量用於再度刺激未見明顯劑量範 圍影響。 · IFN-γ比較IL-5產生濃度遠更高（表3),指示評估各組皆有 清晰ΤΗ-1免疫反應側面圖（一價相對於組合）。 表3 ·於試管試驗再度使用gD刺激後的〗比。 IFN/IL-5 比 A組 B組 C組 gD 10微克/毫升 6.2 7.2 3.1 gD 1微克/毫升 6.2 11.2 2.3 c)於試管試驗再度使用HBs刺激 圖8顯示於試管試驗再度使用HBs刺激後96小時於脾臟細 胞監視得的細胞激素產量。 B組觀察得巧^^丫具有顯著的濃度而未產生IL_5。如表2所 示，E組比B組觀察得lFN-γ產量較高。但相對於不含抗原做 再度刺激的對照組，E組（HBs單價）觀察得IFN-Y背景值高。 使用一價疫苗觀察得IFN_Y/IL-5比極高，指示提引出強力 ΤΗ·1反應。同理，使用組合疫苗測量高IFN-Y/IL-5比，證實 O:\87\87971.DOC -31 - 200408405 此種配方也可提引出TH-l反應。 表4 :於試管試驗再度使用HBs刺激後的IFN-y/IL-5比〇 IFN/IL-5 比 B組 E組 HBs 10微克/毫升 15.8 65.3 HBs 1微克/毫升 7.6 67.6 於AS04調配的VLPs/gD或VLPs/gD/HBs Ag抗原組合對免 疫原性的影響係於Balb/C小鼠觀察。 結論 有關血清分析，對抗.VLPs、抗gD及抗HBs血清學未見抗 原組合造成的干擾。 組合VLPs及gD或VLPs、gD及HBs抗原不會干擾gD及HBs 一價疫苗表現出的抗體反應的同型側面圖。 評估細胞激素時，使用各一價疫苗觀察得ΤΗ-1側面圖 (IFN-y/IL-5比）證實各組組合疫苗。 [圖式簡單說明] 圖1顯示於II後14日對個別血清量測得之抗VLP16 Ig抗體 反應。 圖2顯示於II後14日對個別血清量測得之抗VLP18 Ig抗體 反應。 圖3顯示於II後14日對個別血清量測得之抗gD抗體反應。 圖4顯示於II後14日對個別血清量測得之抗hBs抗體反 應。 圖5顯示於試管試驗再度使用VLP 16刺激96小時後於脾 臟細胞監測得之細胞激素產量。 O:\87\87971.DOC -32- 200408405 圖6頭717於試管試驗再度使用VLP1 8刺激96小時後於脾 臟細胞監測得之細胞激素產量。 圖7顯示於試管試驗再度使用gD抗原刺激96小時後於脾 臟細胞監測得之細胞激素產量。 圖8顯示於試管試驗再度使用HBs刺激96小時後於脾臟細 胞監測得之細胞激素產量。
O:\87\87971.DOC 33-

Claims (1)

  1. 200408405 拾、申請專利範園： 1. 一 種疫苗，包含 HPV 16 LI VLP、HPV 18 LI VLP、氫 氧化鋁及3D-MPL。 2. 如申請專利範圍第1項之疫苗，其中利用事先吸附於氫 氧化鋁上之抗原或3D-MPL單一本體調配該等VLPs。 3·如申請專利範圍第1或2項之疫苗，其中將VLP 16及 VLP 1 8之經純化本體添加至氫氧化鋁以得到 2g VLP/10g A1 (OH)3 之比例。 4. 一種疫苗，其係由 HPV 16 LI VLP、HPV 18 LI VLP、 氫氧化鋁及3D-MPL所組成。 5. —種HPV 16 LI VLP，其係利用事先吸附於氫氧化鋁或 A1P04上之抗原或3D-MPL單一本體（礬土/3D-MPL) 調配。 6· —種HPV 18 LI VLP，其係利用事先吸附於氫氧化鋁或 A1P04上之抗原或3D-MPL單一本體（礬土/3D-MPL) 調配。 O:\87\87971.DOC
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