TR201808057T4

TR201808057T4 - Il-17 antagonistik antikorları.

Info

Publication number: TR201808057T4
Application number: TR2018/08057T
Authority: TR
Inventors: E Di Padova Franco; Gram Hermann; Hofstetter Hans; Jeschke Margit; Rondeau Jean-Michel; Van Den Berg Wim
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2018-06-21
Also published as: NO2018007I1; HUS1500037I1; CY2018027I2; NO2015023I2; CY2018027I1; RU2011113153A; ZA200700242B; PT2366405E; NO2015023I1; AU2005268857B8; CA2573586A1; KR100852523B1; DK1776142T3; EP2366405A2; AU2010201689A1; HUE025815T2; NO20150064L; FR15C0048I1; CN101001645A; EP2364729B1

Abstract

Mevcut buluş bir IL-17 bağlayıcı molekül ile, daha özel olarak insan kökenli IL-17'ye yönelik bir antikor ile, daha fazla tercih edildiği haliyle insan kökenli IL-17'ye yönelik bir insan kökenli antikor ile ve bu tip antikorların, IL-17 aracılığındaki hastalıkların ve bozuklukların tedavisinde kullanımı ile ilgilidir.

Description

TARFNAME Mevcut bulus bir IL-17 baglayici molekül ile, daha özel olarak insan kökenli lL-17'ye yönelik bir antikor ile, daha fazla tercih edildigi haliyle insan kökenli IL-17'ye yönelik bir insan kökenli antikor ile ve bu tip antikorlarin, IL-17 araciligindaki hastaliklarin ve bozukluklarin tedavisinde kullanimi ile ilgilidir. Ornegin romatoit artrit (RA) durumunda görülen, T hücreden türeyen bir sitokin olarak inhibitör'ün'u azalacagi sekilde reg'ule eder (Jovanovic DV ve ark. (2001) J. Rheumatol. sayildigi 'üzere çesitli hastaliklar ve bozukluklarin patolojisi ile iliskilidir: romatoit artrit gevsemesi, akut transplant rejeksiyonu (Antonysamy ve ark., 1999, J lmmunol 162, veya endotoksik sok, alerjiler, astim (Molet ve ark., 2001, J Allergy Clin Immunol 108, 2463), inme ve diger enflamatuar bozukluklar. IL-17 araciligindaki hastalik ve bozukluklarin tedavisinde kullanilmak 'üzere lL-17'ye yönelik antikorlari önerilmistir; bkz. örnegin WO 95/18826 ve bu yayinin giris kismindaki bahisler. 17'ye yönelik iyilestirilmis antikorlar artik tarafimizca bulunmustur. Bu bulus, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik olarak, hem agir (VH) hem de hafif zincir (VL) degisken domenleri içeren bir IL-17 baglayici molekülü de saglamakta olup bahsedilen IL-17 baglayici molekül, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içermektedir: a) sirali olarak hiper degisken CDR1, CDR2 ve CDR3 bölgelerini, ya da bunlarin dogrudan CDR muadillerini içeren ve bahsedilen CDR1 bölgesinin SEQ ID No:1 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2 bölgesinin SEO ID No:2 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3 bölgesinin ise SEQ ID No:3 amino asit dizisine sahip oldugu bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH), ve b) sirali olarak hiper degisken CDR1', CDR2' ve CDR3' bölgelerini, ya da bunlarin dogrudan CDR' muadillerini içeren ve bahsedilen CDR1' bölgesinin SEQ ID No:4 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2' bölgesinin SEQ ID No:5 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3' bölgesinin ise SEQ ID No:6 amino asit dizisine sahip oldugu bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL). Bu bulus, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik olarak, hem agir (VH) hem de hafif zincir (VL) degisken domenleri içeren bir lL-17 baglayici molekülü de saglamakta olup bahsedilen lL-17 baglayici molekül, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içermektedir: a) sirali olarak hiper degisken CDR1-x, CDR2-x ve CDR3-x bölgelerini, ya da bunlarin dogrudan CDR-x muadillerini içeren ve bahsedilen CDR1-x bölgesinin SEQ ID NO:11 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2- X bölgesinin SEQ ID NO:12 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3-x bölgesinin ise SEQ ID NO:13 amino asit dizisine sahip oldugu bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH); ve b) sirali olarak hiper degisken CDR1', CDR2' ve CDR3' bölgelerini, ya da bunlarin dogrudan CDR' muadillerini içeren ve bahsedilen CDR1' bölgesinin SEQ ID No:4 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2' bölgesinin SEQ ID No:5 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3' bölgesinin ise SEO ID No:6 amino asit dizisine sahip oldugu bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL). Aksi belirtilmedigi takdirde, herhangi bir polipeptit zinciri bu dokümanda N-terminali ucundan baslayarak, C-terminali ucunda sonlanan bir amino asit dizisine sahip oldugu seklinde tanimlanir. Antijen baglayici pozisyon, hem VH hem de VL domenlerini içerdigi zaman, bunlarin ayni polipeptit molekülü üzerinde bulunmasi, ya da tercih edildigi üzere, her bir domenin farkli bir zincir üzerinde bulunmasi mümkündür; bu çerçevede, VH domeni, bir immünoglobulin agir zincirinin ya da buna ait bir fragmanin bir parçasiyken, VL domeni, bir immünoglobulin hafif zincirinin ya da buna ait birfragmanin bir parçasi olur. antijenine baglanabilen her molekülü ifade eder. Baglanma reaksiyonu standart metotlar (kalitatif testler) ile ortaya konulabilir ve bu tür testler, alakasiz spesifisiteden, ancak ayni izotipe ait bir antikorun (örnegin bir anti-CD25 antikoru) kullanildigi bir negatif kontrol testine göreli olarak, örnegin lL-17'nin kendi reseptörüne baglanmasinin inhibisyonunu tayin etmeye yönelik baglanma testleri, rekabet testleri, ya da biyolojik testleri, ya da her çesit baglanma analizlerini ihtiva eder. Antijen baglayici moleküllerin örnekleri; B hücreleri veya hibridomalar tarafindan üretilen antikorlari ve kimerik, CDR-greftli veya insan antikorlarini, ya da bunlara ait, örnegin F(ab')2 ve Fab fragmanlari gibi fragmanlari ve ayrica tek zincirli veya tek domenli antikorlari ihtiva eder. Tek zincirli bir antikor, genellikle 10 ila 30 adet amino asit, tercihen 15 ila 25 adet amino asitten olusan bir peptit bagi tarafindan kovalent sekilde baglanan bir antikorun agir ve hafif zincirlerine ait degisken domenlerden olusur. Dolayisiyla böyle bir yapi agir ve hafif zincirlerin sabit kismini içermez ve küçük peptit ara biriminin, bütün sabit kisimdan daha az antijenik olmasi gerektigine inanilir. "Kimerik antikor" ile kasit, agir veya hafif zincirlere ya da her ikisine ait sabit bölgeler insan kökenli olur iken, hem agir hem de hafif zincirlerin degisken domenlerinin insan harici (örnegin murin) kökenden oldugu veya insan kökenli oldugu, ancak farkli bir insan antikorundan türetildigi bir antikordur. (örnegin murin) bir antikor veya farkli bir insan kökenli antikor gibi bir donör antikorundan türetildigi, ancak immünoglobuline ait diger tüm ya da neredeyse tüm kisimlarin, örnegin degisken domenlerin sabit bölgelerinin ve yüksek derecede korunan kisimlarinin, yani çati bölgelerinin, örnegin insan kökenli bir antikordan gibi bir akseptör antikorundan türetildigi bir antikordur. Ancak CDR greftli bir antikor, çati bölgelerinde (örnegin hiper-degisken bölgelere bitisik olan çati bölgelerindeki kisimlarda) donör dizisine ait birkaç amino asidi içerebilir. "Insan (kökenli) antikor" ile kasit, içindeki hem agir hem de hafif zincirlere ait sabit ve degisken bölgelerin tümünün insan kökenli oldugu veya ayni antikordan gelmesi sart olmayan insan kökenli dizilerle neredeyse tamamen özdes oldugu bir antikordur ve genel hatlariyla EP 0546073 B1, üretilen ve murin menseli immünoglobuline ait degisken ve sabit kisimli genlerin, kendi insan kökenli muadilleri ile degistirilmis oldugu antikorlari ihtiva eder. Mevcut bulusun özellikle tercih edilen lL-17 baglayici molekülleri, asagidaki `Ornekler 1 ve 2 içerisinde tarif edildigi gibi, özellikle AIN457 antikoru olmak üzere insan kökenli antikorlardir. Böylece, tercih edilen kimerik antikorlarda hem agir hem de hafif zincirlerin degisken domenleri insan kökenlidir; buna örnek olarak, SEQ lD NO:10 (= hafif zincirin degisken domeni, yani SEO lD NO:10'un 1 ila 109. amino asitleri) ve SEO ID NO:8'de (= agir zincirin degisken domeni, yani SEO ID NO:8'in 1 ila 127. amino asitleri) gösterilen, AIN457 antikoruna ait olanlar verilebilir. Söz konusu sabit bölge domenleri, örnegin literatürde tarif edildigi gibi (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E.A. ve ark., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health), uygun insan kökenli sabit bölge domenlerini de tercihen Hiper degisken bölgeler, insan kökenli olanlari tercih edilmesine ragmen, herhangi bir çati bölgesi ile birlestirilebilir. Uygun çati bölgeleri, Kabat E.A. ve ark. tarafindan tarif edilmistir (ayni atifta). Tercih edilen agir zincirli çati bölgesi, örnegin AlN457 antikoruna ait olan gibi bir insan agir zincir çati bölgesidir. Sirasiyla, örnegin FR1 (SEO ID NO:8'in bölgelerinden olusur. AlN457'nin X-ray analizi ile belirlenmis hiper degisken bölgeleri dikkate alindiginda tercih edilen bir baska agir zincir çatisi sirasiyla FR1-x (SEQ lD asitleri) bölgelerinden olusur. Benzer olarak hafif zincir çatisi, sirasiyla FR1' (SEQ lD amino asitleri) bölgelerinden olusur. Bu anlatilanlara göre, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmak üzere bir lL-17 baglayici molekül de saglamakta olup bu molekül, ya 1. pozisyondaki amino asit ile baslayip 127. pozisyondaki amino asit ile sona erecek sekilde SEQ ID No:8 içerisinde gösterilenle büyük ölçüde özdes olan bir amino asit dizisine sahip bir birinci domeni, ya da yukarida tarif edilen bir birinci domeni ve 1. pozisyondaki amino asit ile baslayip 109. pozisyondaki amino asit ile sona erecek sekilde SEQ ID NO:10 içerisinde gösterilenle büyük ölçüde özdes olan bir amino asit dizisine sahip bir ikinci domeni ihtiva eden en az bir antijen baglayici pozisyon içerir. Tüm insanlarda dogal olarak bulunan bir proteine karsi yetistirilen monoklonal antikorlar, tipik olarak insan harici bir sistemde, örnegin farelerde gelistirilir ve dolayisiyla tipik olarak insan harici proteinlerdir. Bu durumun dogrudan bir sonucu olarak, bir hibridoma tarafindan üretilen bir ksenojenik antikor insanlara verildigi zaman, ksenojenik immünoglobulinin sabit kismi tarafindan baskin olarak aracilik gören, istenmeyen bir bagisiklik yanitini tetikler. Bu durum, uzun dönemler boyunca verilmeleri mümkün olmadigindan bu tür antikorlarin kullanimina bir tehdit getirir. Dolayisiyla insanlara verildiginde önemli bir allojenik yanit gelistirmesi muhtemel olmayan tek zincirli, tek domenli, kimerik, CDR-greftli veya özellikle insan antikorlarinin kullanimi bilhassa tercih edilir. Yukaridaki izahatlarin isiginda, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik olarak daha fazla tercih edilen bir IL-17 baglayici molekül; en azindan (a) (i) sirasiyla hiper degisken CDR1, CDR2 ve CDR3 bölgelerini veya bunlarin dogrudan CDR muadillerini ve (ii) bir insan agir zincirinin sabit kismini veya bunun bir fragmanini içeren ve bahsedilen CDR1 bölgesinin SEQ ID No:1 amino asit dizisine, bahsedilen CDR2 bölgesinin SEO ID No:2 amino asit dizisine ve bahsedilen CDR3 bölgesinin ise SEQ lD No:3 amino asit dizisine sahip oldugu bir immünoglobulin agir zincir veya bunun bir fragmanini; ve (b) (i) sirasiyla hiper degisken bölgeleri ve istege göre ayrica hiper degisken CDR1', CDR2' ve CDRS' bölgelerini veya bunlarin dogrudan CDR' muadillerini ve (ii) bir insan hafif zincirinin sabit kismini veya bunun bir fragmanini içeren ve bahsedilen CDR1' bölgesinin SEO lD No:4 amino asit dizisine, bahsedilen CDR2' bölgesinin SEQ lD No:5 amino asit dizisine ve bahsedilen CDR3' bölgesinin ise SEQ ID No:6 amino asit dizisine sahip oldugu bir immünoglobulin hafif zincir veya bunun bir fragmanini içeren bir insan anti lL-17 antikoru olarak seçilir. Alternatif olarak, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik bir lL-17 baglayici molekül, asagidaki sayilanlari ihtiva eden bir antijen baglayici pozisyonu içeren, tek zincirli bir baglayici molekül olarak seçilebilir: sirasiyla hiper degisken CDR1, CDR2 ve CDR3 bölgelerini, ya da bunlarin dogrudan CDR muadillerini içeren ve bahsedilen CDR1 bölgesinin SEQ ID No:1 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2 bölgesinin SEQ lD No:2 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3 bölgesinin ise SEQ lD No:3 amino asit dizisine sahip oldugu bir birinci domen; ve hiper degisken CDR1', CDR2' ve CDR3' bölgelerini, ya da bunlarin dogrudan CDR' muadillerini içeren ve bahsedilen CDR1' bölgesinin SEQ ID No:4 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2' bölgesinin SEO ID NO:5 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3' bölgesinin ise SEO ID No:6 amino asit dizisine sahip oldugu bir ikinci domen; ve ya birinci domenin N terminali ucuna ve ikinci domenin C terminali ucuna, ya da birinci domenin C terminali ucuna ve ikinci domenin N terminali ucuna bagli bir peptit bagi. Layikiyla bilindigi 'üzere amino asit dizisinden bir, birkaç ve hatta birçok amino asidin çikarilmasi, eklenmesi veya ikame edilmesi gibi yapilacak minör degisiklikler, orijinal proteinin esasen özdes özelliklere sahip bir allel formuna yol açabilir. Dolayisiyla "bunlarin dogrudan CDR muadilleri" ifadesiyle, sirasiyla hiper degisken CDR2 ve CDRS degil de) CDR1i, CDR2i ve CDR3i bölgelerini içeren ve asagidaki hususlarin geçerli oldugu lL-17 baglayici moleküller kastedilir: hiper degisken CDR1i bölgesi, SEQ ID NO:1 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve hiper degisken CDR2i bölgesi, SEQ lD No:2 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve hiper degisken CDR3i bölgesi, SEQ ID No:3 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR3 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve sirasiyla hiper degisken CDR1i, CDR2i ve CDRSi bölgelerini içeren böylesi bir molekül, 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'lik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe eder ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-IL-17 ile indüklenen lL-6 üretimi üzerinde ölçülür. Benzer olarak "bunlarin dogrudan CDR-x muadilleri" ifadesiyle, sirasiyla hiper degisken (CDR1-x, CDR2-x ve CDR3-x degil de) CDRfi-x, CDR2i-x ve CDR3i-x bölgelerini içeren ve asagidaki hususlarin geçerli oldugu lL-17 baglayici moleküller kastedilir: (v) hiper degisken CDR1i-x bölgesi, SEQ ID NO:11 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve (vi) hiper degisken CDR2i-x bölgesi, SEO ID NO:12 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve (vii) hiper degisken CDRSi-x bölgesi, SEQ ID NO:13 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR3-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve (viii)sirasiyla hiper degisken CDR1i-X, CDR2i-x ve CDR3i-x bölgelerini içeren böylesi bir molekül, 1 nM (= 30ng/ml) insan IL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'lik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe eder ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu- Benzer olarak "bunlarin dogrudan CDR' muadilleri" ifadesiyle, sirasiyla hiper degisken CDR1'i, CDR2'i ve CDRS'i bölgelerini içeren ve asagidaki hususlarin geçerli oldugu lL- 17 baglayici moleküller kastedilir: (i) hiper degisken CDRl'i bölgesi, SEQ lD No:4 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1' bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve (ii) hiper degisken CDR2'i bölgesi, SEQ lD No:5 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2' bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve hiper degisken CDRS'i bölgesi, SEQ lD No:6 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR3' bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve sirasiyla hiper degisken CDR1'i, CDR2'i ve CDR3'i bölgelerini içeren böylesi bir molekül, 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe eder ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu- Alternatif olarak bir lL-17 baglayici molekül, sirasiyla asagida sayilanlari içeren en az bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH) ihtiva eden en az bir antijen baglayici pozisyon içeren bir lL-17 baglayici molekül olabilir: hiper degisken CDR1 (SEO ID No:1), CDR2 (SEQ ID No:2) ve CDR3 (SEQ hiper degisken CDRti, CDR2i, CDRSi bölgeleri, burada bahsedilen hiper degisken CDR1i bölgesi, SEQ ID No:1 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR2i bölgesi, SEQ lD No:2 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDRSi bölgesi, SEQ ID No:3 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR3 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve sirasiyla hiper degisken CDR1x, CDR2x ve CDR3x bölgelerini içeren bahsedilen baglayici IL-17 molekülü, 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe etme becerisine sahiptir ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu- Benzer olarak, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik bir IL-17 baglayici molekül, sirasiyla asagida sayilanlari içeren en az bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH) ihtiva eden en az bir antijen baglayici pozisyon içeren bir IL-17 baglayici molekül olabilir: hiper degisken CDR1-x (SEO ID NO:11), CDR2-x (SEO ID NO:12) ve CDR3- x (SEO ID NO:13) bölgeleri; veya hiper degisken CDR1i-x, CDR2i-x, CDRSi-x bölgeleri, burada bahsedilen hiper degisken CDR1i-x bölgesi, SEO ID NO:11 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'1-X bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR2i- x bölgesi, SEO ID NO:12 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDR3i-x bölgesi, SEO ID NO:13 içerisinde gösterilen hiper degisken CDRB-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve sirasiyla hiper degisken CDR1i-x, CDR2i-x ve CDR3i-x bölgelerini içeren bahsedilen baglayici lL-17 molekülü, 1 nM (= 30ng/ml) insan IL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe etme becerisine sahiptir ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu- Benzer olarak, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik bir IL-17 baglayici molekül, sirasiyla asagida sayilanlari içeren en az bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL) ihtiva eden en az bir antijen baglayici pozisyon içeren bir IL-17 baglayici molekül olabilir: hiper degisken CDR'1 (SEO lD No:4), CDR'2 (SEO ID No:5) ve CDR'3 (SEO hiper degisken CDR1'i, CDR2'i, CDR3'i bölgeleri, burada bahsedilen hiper degisken CDR'1i bölgesi, SEO ID NO:4 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'1 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR'2i bölgesi, SEO ID No:5 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'2 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDR'3i bölgesi, SEO ID No:6 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'S bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen lL-17 baglayici molekül, sirasiyla hiper degisken CDR'1i, CDR'2i ve CDR'3i bölgelerini içerir ve 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda insan dermal fibroblastlarinda hu-lL-17 ile indüklenen IL-6 üretimi üzerinde Alternatif olarak, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik bir lL-17 baglayici molekül, hem agir (VH) hem de hafif zincir (VL) degisken domenleri içeren bir IL-17 baglayici molekül olabilir ve bahsedilen IL-17 baglayici molekül, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içerir: sirasiyla hiper degisken CDR1 (SEO ID No:1), CDR2 (SEO lD No:2) ve CDR3 (SEO ID No:3) bölgelerini içeren bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH); ve sirasiyla hiper degisken CDR1' (SEO lD No:4), CDR2' (SEQ lD No:5) ve CDR3' (SEO ID No:6) bölgelerini içeren bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL); veya sirasiyla hiper degisken CDR1i, CDR2i, CDRSi bölgelerini içeren bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH), burada bahsedilen hiper degisken hiper degisken CDR1i, CDR2i, CDRSi bölgeleri, bahsedilen hiper degisken CDR1i bölgesi, SEO ID NO:1 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR2: bölgesi, SEO lD No:2 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDRSi bölgesi, SEO ID No:3 içerisinde gösterilen hiper degisken CDRS bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve sirasiyla hiper degisken CDR1'i, CDR2'i, CDRS'i bölgelerini içeren bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL), burada bahsedilen hiper degisken CDR'1: bölgesi, SEQ ID NO:4 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'1 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR'2i bölgesi, SEQ ID No:5 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'2 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDR'3i bölgesi, SEQ kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve b) içerisinde tanimlanan bahsedilen baglayici IL-17 molekülü, sirasiyla hiper degisken CDRfi, CDR2i, CDRSi, CDR'1i, CDR'2i ve CDR'Bi bölgelerini içerir ve 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'lik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe etme becerisine sahiptir ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-lL-17 ile indüklenen lL-6 üretimi üzerinde Alternatif olarak, enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik bir lL-'l7 baglayici molekül, hem agir (VH) hem de hafif zincir (VL) degisken domenleri içeren bir IL-17 baglayici molekül olabilir ve bahsedilen IL-17 baglayici molekül, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içerir: a) sirasiyla hiper degisken CDR1-x (SEQ ID NO:11), CDR2-x (SEQ lD NO:12) ve CDR3-x (SEQ lD NO:13) bölgelerini içeren bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH); ve sirasiyla hiper degisken CDR1' (SEQ lD No:4), CDR2' (SEQ lD No:5) ve CDR3' (SEO ID No:6) bölgelerini içeren bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL); veya b) sirasiyla hiper degisken CDR1i-x, CDR2i-x, CDRSi-x bölgelerini içeren bir immünoglobulin agir zincir degisken domeni (VH), burada bahsedilen hiper degisken hiper degisken CDR1i-x, CDR2i-x, CDR3i-x bölgeleri, bahsedilen hiper degisken CDR1i-x bölgesi, SEO ID NO:11 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR2i-x bölgesi, SEQ lD NO:12 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDRSi-x bölgesi. SEQ ID NO:13 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR3-x bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve sirasiyla hiper degisken CDR1'i, CDR2'i, CDRS'i bölgelerini içeren bir immünoglobulin hafif zincir degisken domeni (VL), burada bahsedilen hiper degisken CDR'1i bölgesi, SEO lD NO:4 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'1 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir, bahsedilen hiper degisken CDR'2i bölgesi, SEQ ID No:5 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR'2 bölgesinden 3 kadar, tercihen 2 kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve bahsedilen hiper degisken CDR'3i bölgesi, SEO kadar, daha fazla tercih edildigi haliyle 1 kadar amino asit farkliligi gösterir; ve b) içerisinde tanimlanan bahsedilen baglayici lL-17 molekülü, sirasiyla hiper degisken CDR'li, CDR2i, CDRSi, CDR'1i, CDR'Zi ve CDR'3i bölgelerini içerir ve 1 nM (= 30ng/ml) insan IL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülun 50 nMi tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'lik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe etme becerisine sahiptir ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-IL-17 ile ind'üklenen IL-6 üretimi üzerinde Enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik lL-17 baglayici antikor veya bunun bir fragmani, asagida sayilanlari ihtiva eden bir insan IgG1/K antikorudur: (a) Tablo 10 içerisinde +1 rezid'i'is'ünde baslayan amino asit rezidL'iIerinden olusan bir hafif zincir lilVLIQSPGILSLSI'Gl:RA'I'LS(`R.-'\S()S\`SSS YI A WYQQK PGQ ~'\PRI [ IY (i -'\\`.\`R A T GIP DR F SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY(QQYGSS (i\Ql:S\-`I'liQDSIKD'›IYSLSS'I'lfI'LSlx-\L)\'l: 1. RHKVYA( [:\ AI HQÜ1.SSI'\A`I`KI\II~`I\I(G laf; (b) Tablo 11 içerisinde +1 rezidüsünde baslayan amino asit rezidülerinden olusan bir agir zincir Y w xi .x xx' \' R 0 .i\ ii (; K 0 L i; w \' .-\ ;\ i \ o 1)(i s 1-. K Y Y \s' (;5\-k(;i VTVSSASTKGPSVI'Pl APSSKSTSGGTAAI 0( li v K I) \' r' P ,: i› \-` 'r v 5 w \' su .-\1.T :s (1 \* ii T r P .x v1.0 ssrii YSiSSVVTVPsssi (iTQTYI(`\\"\`IIKPS NTKVOKRVI'PKSCDKTii'rrpprp ilerleyen kisimlarinda tarif edilenler testler de dahil olmak üzere muhtelif testlerde uygun sekilde test edilebilir. "Ayni derecede" ifadesiyle kasit, referans ve özdes moleküllerin, burada bahsedilen testlerin birinde (bkz. Ornek 1), istatistiksel olarak esasen özdes IL-17 inhibitör aktivitesi sergilemesidir. Ornegin, bulus konusu lL-17 baglayici moleküller, insan dermal fibroblastlarinda insan lL-17 tarafindan indüklenen testlerde incelendiginde, karsilik gelen referans molekülün IC50 degerinin +/- 5 misli, tipik IC50 degerlerine sahiptir. Alternatif olarak kullanilan test, örnegin IL-17'nin çözünür lL-17 reseptörleri (örnegin Ornek 1 içerisinde verilen insan kökenli IL-17 R/FC konstraktlari) ve bulus konusu lL- 17 baglayici moleküller tarafindan baglanmasinin rekabetçi olarak inhibe edildigi bir test olabilir. Söz konusu insan kökenli lL-17 antikoru, en çok tercih edildigi haliyle en az asagida sayilanlari içerir: a) SEO lD NO:8'de gösterilenle büyük ölçüde özdes olan ve 1. pozisyondaki amino asit ile baslayan ve 127. pozisyondaki amino asit ile sonlanan bir amino asit dizisine sahip bir degisken domen ve insan kökenli bir agir zincirin sabit kismini içeren bir agir zincir; ve b) SEQ lD NO:10'da gösterilenle büyük ölçüde özdes olan ve 1. pozisyondaki amino asit ile baslayan ve 109. pozisyondaki amino asit ile sonlanan bir amino asit dizisine sahip bir degisken domen ve insan kökenli bir hafif zincirin sabit kismini içeren bir agir zincir. Insan kökenli bir agir zincirin sabit kismi yi, V2, V3, V4, p, di, 02, 6 veya 8 tipinden, tercihen y tipinden, daha çok tercih edildigi haliyle Y1 tipinden olabilirken, insan kökenli bir hafif zincirin sabit kismi K veya A tipinden (A1, A2 ve A3 alt-tiplerini içerir), ancak tercihen K tipinden olabilir. Tüm bu sabit kisimlarin amino asit dizileri Kabat ve ark. tarafindan bildirilmistir (yukaridaki atifta). Mevcut bulusun baglayici moleküllerinin konjügatlari, Örnegin enzim veya toksin ya da radyoizotop konjügatlari da mevcut bulusun kapsamina girmektedir. Aksi belirtilmedigi takdirde "polipeptit" terimi, N-terminali ucundan baslayarak, C- terminali ucunda sonlanan bir amino asit dizisine sahip olan ve birbirlerine peptit baglari ile baglanan amino asitleri içeren herhangi bir peptit veya proteini ihtiva eder. Tercih edildigi haliyle mevcut bulusun polipeptidi bir monoklonal antikordur, daha fazla tercih edildigi haliyle bir kimerik (ayrica V-greftli olarak anilir) veya hümanize (ayrica CDR-greftli olarak anilir) monoklonal antikordur ve en çok tercih edildigi haliyle, Ornek 1 içerisinde örneklendirilen teknoloji ile elde edilebilen bir tam insan antikorudur. Hümanize (CDR-greftli) veya tam insan monoklonal antikoru, akseptör antikorun çati (FR) dizileri içerisine sokulmus baska mutasyonlar içerebilir veya içermeyebilir. Burada kullanildigi haliyle bir polipeptidin bir fonksiyonel türevi, mevcut bulusun bir polipeptidi ile ortak bir kalitatif biyolojik aktiviteye, yani insan IL-17'ye baglanma becerisine sahip bir molekülü ihtiva eder. Bir fonksiyonel türev, bulus konusu bir polipeptidin fragmanlarini ve peptit analoglarini ihtiva eder. Fragmanlar, bulus konusu bir polipeptidin dizisi içerisinde, Örnegin belirli bir dizinin bölgelerini ihtiva eder. "Türev" terimi, amino asit dizisi varyantlarini ve bulus konusu bir polipeptidin, örnegin belirli bir dizinin kovalent modifikasyonlarini tanimlamak için kullanilir. Bulus konusu bir polipeptidin, örnegin belirli bir dizinin, örnegin hafif ve agir zincirin hiper degisken bölgesinin fonksiyonel türevleri, bulus konusu bir polipeptidin, örnegin belirli bir dizinin amino asit dizisi ile tercihen en az yaklasik %65, daha fazla tercih edildigi haliyle en az yaklasik %75, daha fazla tercih edildigi haliyle en az yaklasik %85, en çok tercih ve insan lL-17'ye baglanma, örnegin insan dermal fibroblastlarinda IL-17 ile indüklenen ya da bunun bir fragmaninin, organik, proteinli veya proteinli olmayan bir türetici ajanla modifikasyonlarini, heterolog polipeptit dizilerine füzyonlari ve post-translasyonal modifikasyonlari ihtiva eder. Örnegin belirli bir dizinin kovalent sekilde degismis polipeptit, çapraz baglanma yoluyla, insan lL-17`ye baglanma, örnegin insan dermal fibroblastlarinda lL-17 ile indüklenen IL-6 üretimini nötrlestirme becerisine hala sahip olur. Geleneksel olarak kovalent modifikasyonlar, hedefli amino asit rezidülerinin, seçilen taraflar veya terminal rezidüleri ile tepkime verebilen bir organik türetici ajanla tepkimeye sokulmasi yoluyla, ya da seçilmis rekombinant konakçi hücrelerde islev gösteren post-translasyonal modifikasyonlarin mekanizmalarindan yararlanmak yoluyla sokulur. Belirli post-translasyonal modifikasyonlar, rekombinant konakçi hücrelerin ifade edilen polipeptit üzerindeki etkisinin sonucudur. Glutaminil ve asparaginil rezidüleri, siklikla post-translasyonal deamidasyon yoluyla karsilik gelen glutamil ve aspartil rezidülerini verir. Alternatif olarak bu rezidüler hafif asidik sartlar altinda deamidasyona tabi tutulur. Diger post-translasyonal modifikasyonlar, prolin ve lizin rezidülerinin hidroksilasyonunu, seril, tirozin veya treonil rezidülerine ait hidroksil gruplarinin fosforilasyonunu, Iizin, arginin ve histidin yan zincirlerindeki d-amino gruplarinin metilasyonunu ihtiva eder, bkz. örnegin T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, s. 79-86 (1983). Kovalent modifikasyonlar, örnegin belirli bir diziye veya bunun amino asit dizisi varyantlarina sahip bulus konusu bir polipeptidi içeren, immüno adhezinler gibi füzyon proteinleri ve heterolog sinyal dizilerine N-terminal füzyonlarini ihtiva eder. Burada kullanildigi haliyle, bir natif polipeptit ve kendi fonksiyonel türevi ile ilgili olarak hizalanmasindan ve bosluklarin eklenmesinden sonra ve herhangi bir konzervatif substitusyonu dizi özdesliginin bir parçasi olarak görmeyecek sekilde, aday dizide bulunan ve karsilik gelen bir natif polipetidin rezidüleri ile özdes olan amino asit rezidülerinin yüzdesi olarak tanimlanir. Ne N- veya C-terminal uzantilari, ne de eklemeler, özdesligi veya homolojiyi azalttigi yönünde yorumlanacaktir. Hizalama amaçli yöntemler ve bilgisayar programlari iyi bilinmektedir. D-amino asitleri ihtiva eder. Amino asitler, ya iyi bilinen tek harfli ya da 'üç harfli adlari ile tanitilir. bir polipeptit ile karsilastirildiginda, kendi amino asit dizilerinde bazi farkliliklara sahip moleküllerdir. Ornegin belirli bir diziye sahip bulus konusu bir polipeptidin amino asit dizisi varyantlari, insan lL-17'ye baglanma, örnegin insan dermal fibroblastlarinda IL- 17 ile ind'üklenen IL-6 üretimini nötrlestirme becerisine hala sahiptir. Substitusyon varyantlari, örnegin belirli bir diziye sahip bulus konusu bir polipeptitte en az bir amino asit rezidüs'u çikarilmis olan ve çikarilanla ayni pozisyona farkli bir amino asit sokulmus olan varyantlardir. Bu substitusyonlar, molekulde içindeki tek bir amino asidin ikame edilmis oldugu tekli substitusyonlar, ya da iki veya daha fazla amino asidin ayni molekülde ikame edilmis oldugu çoklu substitusyonlar olabilir. Insersiyon varyantlari, örnegin belirli bir diziye sahip bulus konusu bir polipeptitte, belirli bir pozisyondaki bir amino asidin hemen bitisigine bir veya daha fazla amino asidin sokulmus oldugu varyantlardir. Bir amino asidin hemen bitisiginde olmakla kasit, amino asidin gerek oi-karboksi gerekse oi-amino fonksiyonel grubuna baglanmaktadir. Delesyon varyantlari, örnegin belirli bir diziye sahip bulus konusu bir polipeptitte, bir veya daha fazla amino asidin çikarilmis oldugu varyantlardir. Normal olarak delesyon varyantlarinda bir veya iki adet amino asit, molekülün belirli bir bölgesinde çikarilmis olacaktir. Enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik bir IL-17 baglayici molekül, rekombinant DNA teknikleri ile üretilebilir. Bu husus ile ilgili olarak, baglayici molekülü kodlayan bir ya da daha fazla DNA molekülün'un kurulmasi, uygun kontrol dizileri altina yerlestirilmesi ve ifadelenmek 'üzere uygun bir konakçi organizmanin içerisine transfer edilmesi gerekir. Çok genel bir anlatim olmakla birlikte, bu çerçevede asagidaki husus ve ögeler temin (i) burada açiklanan tek domenli bir IL-17 baglayici m0lek'ül'ün`u, bulus konusu tek zincirli bir IL-17 baglayici molekül'unü, bulus konusu bir IL-17 baglayici molekülün, burada tanimlanan tipteki bir agir veya hafif zincirini, ya da bunlara ait fragmanlari içeren bir IL-17 baglayici molekülünü kodlayan DNA molekülleri; ve (ii) bulus konusu DNA moleküllerinin, bulus konusu bir IL-17 baglayici molekülünün rekombinant vasitalar ile üretilmesine yönelik kullanimi. Dolayisiyla burada açiklananlar, yukarida tarif edilen bir IL-17 baglayici molekülü kodlayan bir DNA molekülünü saglamaktadir. Dahasi bu bu bulus, SEQ ID NO:7 ya da SEO ID No:9 ile büyük ölçüde homolog olan bir DNA molekülünü içeren bir DNA konstrakti saglamaktadir. Dahasi burada açiklananlar, içlerinden birinin SEO ID No:7 ile büyük ölçüde homolog oldugu veya bunun bir direkt DNAH muadili oldugu ve digerinin ise, SEO lD No:9 ile büyük ölçüde homolog oldugu veya bunun bir direkt DNAL muadili oldugu iki DNA molekülünü içeren bir DNA konstrakti saglamaktadir. Teknigin bilinen durumu, burada açiklanan bilgilere (yani hiper degisken bölgelerin amino asit dizileri ve bunlari kodlayan DNA dizilerine yönelik bilgilere) sahip olmalari kosuluyla ilgili uzmanlarin bulus konusu DNA moleküllerini sentezleyebilecekleri bir durumdadir. Bir degisken domen geninin kurulmasina yönelik bir metot, örnegin EPA 239 400 içinde tarif edilir ve kisaca su sekilde özetlenebilir: Herhangi bir spesifisiteye sahip bir MAb degisken domenini kodlayan bir gen klonlanir. Çati bölgesini ve hiper degisken bölgeleri kodlayan DNA kisimlari belirlenir ve hiper degisken bölgeleri kodlayan DNA kisimlari çikarilarak, çati bölgelerini kodlayan DNA kisimlarinin, eklem yerlerindeki uygun restriksiyon yerleri ile birlikte kaynasmasi (fusion) saglanir. Söz konusu restriksiyon bölgeleri, DNA molekülünün standart prosedürler ile mutagenezi yoluyla uygun pozisyonlarda üretilebilir. Çift iplikIi sentetik CDR kasetleri; SEO lD NO:1 (CDR1), SEO ID No:2 (CDR2), SEO ID No:3 (CDRS), SEO ID No:4 (CDR1'), SEO lD No:5 (CDR2'), SEO ID No:6 (CDR6'), SEO ID NO:11 (CDR1-x), SEO lD NO:12 (CDR2-x), SEO ID NO:13'ün (CDRS-x) sentezlenmesini saglayan dizilere göre DNA sentezi yoluyla hazirlanir. Bu kasetler çati bölgesinin birlesim noktalarinda baglanabilecekleri (Iigasyon) sekilde, yapiskan uçlarla (sticky ends) donatilir. Ilave olarak, bulus konusu lL-17 baglayici molekülleri kodlayan bir DNA konstraktinin elde edilmesi amaciyla, üretici bir hibridoma hücre dizisinin mRNA'sina erismeye gerek yoktur. Böylece, sadece gene ait nükleotit dizisine ait yazili bilgilerin elde olmasiyla PCT basvurusu WO 90/07861, bir antikorun rekombinant DNA teknikleri ile üretilmesine yönelik tüm talimatlari saglamaktadir. Söz konusu metot, çok sayidaki oligon'ükleotitlerin sentezlenmesini, bunlarin PCR metodu ile amplifiye edilmesini ve istenen DNA dizisinin üretilmesi için bölünmesini kapsar. Agir ve hafif zincirli sabit kisimlari kodlayan genleri veya uygun bir promotöri'i içeren ekspresyon vektörleri, herkesin bilgisine açik vaziyettedir. Buna göre, bulus konusu bir DNA molekül'un'un hazirlanmasindan sonra, uygun bir ekspresyon vektörüne rahatlikla nakledilebilir. Tek zincirli antikorlari kodlayan DNA molekülleri, Örnegin WO 88/1649 içinde tarif edilen standart metotlar ile de hazirlanabilir. CDR muadilleri durumuna benzer olarak "bunlarin direkt DNAH muadilleri" ifadesiyle kasit, bulus konusu bir IL-17 baglayici molekül'un bir agir zincirini veya bunun bir fragmanini kodlayan bir birinci DNA konstraktidir ve asagida sayilanlari içerir: a) alternatif olarak çati ve hiper degisken bölgeler içeren bir degisken domeni kodlayan bir birinci kisim; burada bahsedilen hiper degisken bölgeler sirasiyla CDR1a, CDR2i ve CDRBi bölgeleridir ve bahsedilen CDR1i, SEO lD No:1 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1 bölgesi ile en az %50, tercihen en homolog durumdadir, bahsedilen CDR2: ise SEQ lD No:2 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2 bölgesi ile en az %50, tercihen en az %60, durumdadir ve CDR3i, SEQ ID No:3 icerisinde gösterilen hiper degisken fazla tercih edildigi haliyle en az %95 homolog durumda olur; bu birinci kisim, degisken domenin birinci amino asidini kodlayan bir kodon ile baslar ve degisken domenin son amino asidini kodlayan bir kodon ile sonlanir; ve b) bir agir zincirli sabit kismi veya bunun birfragmanini kodlayan bir ikinci kisim; bu kisim] agir zincirin sabit kisminin birinci amino asidini kodlayan bir kodon ile baslar ve sabit kismi veya bunun bir fragmaninin son amino asidini kodlayan bir kodon ile sonlanir ve bunu bir stop kodonu takip eder; ve c) bahsedilen DNA konstrakti; gerek tek basina, gerekse bir baska polipeptit ile birlikte, 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe eden bir polipeptidin sentezlenmesini saglar ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-lL-17 ile ind'L'iklenen IL-6 üretimi 'üzerinde ölçülür. Benzer olarak ""bunlarin direkt DNAH-X muadilleri" ifadesiyle kasit, bulus konusu bir IL- 17 baglayici molekül'un bir agir zincirini veya bunun bir fragmanini kodlayan bir birinci alternatif DNA konstraktidir ve asagida sayilanlari içerir: alternatif olarak çati ve hiper degisken bölgeler içeren bir degisken domeni kodlayan bir birinci kisim; burada bahsedilen hiper degisken bölgeler sirasiyla CDR1i-X, CDR2i-x ve CDRSi-x bölgeleridir ve bahsedilen CDR1i-x, SEQ lD NO:11 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR1 bölgesi ile en az %50, az %95 homolog durumdadir, bahsedilen CDR2i-x ise SEO ID NO:12 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2 bölgesi ile en az %50, tercihen en homolog durumdadir ve CDRSi-x, SEQ lD NO:13 içerisinde gösterilen hiper 90, daha fazla tercih edildigi haliyle en az %95 homolog durumda olur; bu birinci kisim, degisken domenin birinci amino asidini kodlayan bir kodon ile baslar ve degisken domenin son amino asidini kodlayan bir kodon ile sonlanir; bir agir zincirli sabit kismi veya bunun birfragmanini kodlayan bir ikinci kisim; bu kisim, agir zincirin sabit kisminin birinci amino asidini kodlayan bir kodon ile baslar ve sabit kismi veya bunun bir fragmaninin son amino asidini kodlayan bir kodon ile sonlanir ve bunu bir stop kodonu takip eder; ve bahsedilen DNA konstrakti; gerek tek basina, gerekse bir baska polipeptit ile birlikte, 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 anI, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'lik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe eden bir polipeptidin sentezlenmesini saglar ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-lL-17 ile ind'uklenen IL-6 'üretimi 'üzerinde ölçülür. Tercih edildigi haliyle bu DNA konstraktlari, alternatif olarak çati ve hiper degisken bölgeler içeren bir degisken domeni kodlar ve bahsedilen hiper degisken bölgeler ise sirasiyla CDR1, CDR2 ve CDR3 bölgeleridir; bahsedilen CDR1 bölgesi SEQ ID No:1 amino asit dizisine sahiptir, bahsedilen CDR2 bölgesi SEQ ID No:2 amino asit dizisine sahiptir ve bahsedilen CDR3 bölgesi ise SEQ ID No:3 amino asit dizisine sahiptir. Daha fazla tercih edildigi haliyle bu DNA konstraktlari, alternatif olarak çati ve hiper degisken bölgeler içeren bir degisken domeni kodlar ve bahsedilen hiper degisken bölgeler ise sirasiyla CDR1-x, CDR2-x ve CDR3-x bölgeleridir; bahsedilen CDRl-x bölgesi SEO lD NO:11 amino asit dizisine sahiptir, bahsedilen CDR2-x bölgesi SEQ amino asit dizisine sahiptir. Daha fazla tercih edildigi haliyle bu birinci kisim, 1. pozisyondaki amino asit ile baslayacak ve 127. pozisyondaki amino asit ile sonlanacak sekilde, SEQ ID No:8 içerisinde gösterilen amino asit dizisi ile büyük ölçüde özdes olan bir amino asit dizisine sahip bir degisken domeni kodlar. Daha çok tercih edildigi haliyle birinci kisim, SEQ ID No:7 içinde gösterilen ve 1. pozisyondaki nükleotit ile baslayip, 381. pozisyondaki nükleotit ile sonlanan nükleotit dizisine sahiptir. Gene tercih edildigi haliyle ikinci kisim, insan kökenli bir agir zincirin sabit kismini ve daha çok tercih edildigi haliyle insan kökenli y4 zincirinin sabit kismini kodlar. Bu ikinci kisim genomik kökenli (intronlar içeren) bir DNA fragmani veya bir cDNA fragmani (intron içermeyen) olabilir. Benzer olarak "bunlarin direkt DNAL muadilleri" ifadesiyle kasit, bulus konusu bir IL-17 baglayici molekül'un bir hafif zincirini veya bunun birfragmanini kodlayan bir ikinci DNA konstraktidir ve asagida sayilanlari içerir: a) alternatif olarak çati ve hiper degisken bölgeler içeren bir degisken domeni kodlayan bir birinci kisim; burada bahsedilen hiper degisken bölgeler sirasiyla CDR3i' ve istege göre CDR1i' ve CDR2i' bölgeleridir; bahsedilen CDR1i', SEQ az %95 homolog durumdadir, bahsedilen CDR2i' ise SEQ ID No:5 içerisinde gösterilen hiper degisken CDR2' bölgesi ile en az %50, tercihen en az %60, durumdadir ve CDRSi', SEQ ID No:6 içerisinde gösterilen hiper degisken fazla tercih edildigi haliyle en az %95 homolog durumda olur; bu birinci kisim, degisken domenin birinci amino asidini kodlayan bir kodon ile baslar ve degisken domenin son amino asidini kodlayan bir kodon ile sonlanir; ve b) bir hafif zincirli sabit kismi veya bunun bir fragmanini kodlayan bir ikinci kisim; bu kisim, hafif zincirin sabit kisminin birinci amino asidini kodlayan bir kodon ile baslar ve sabit kismi veya bunun bir fragmaninin son amino asidini kodlayan bir kodon ile sonlanir ve bunu bir stop kodonu takip eder; ve c) bahsedilen DNA konstrakti; gerek tek basina, gerekse bir baska polipeptit ile birlikte, 1 nM (= 30ng/ml) insan lL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe eden bir polipeptidin sentezlenmesini saglar ve bahsedilen inhibitör aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-lL-17 ile indüklenen IL-ö üretimi üzerinde ölçülür. Tercih edildigi haliyle bu ikinci DNA konstrakti, alternatif olarak çati ve hiper degisken bölgeler içeren bir degisken domeni kodlar ve bahsedilen hiper degisken bölgeler ise sirasiyla CDR1', CDR2' ve CDR3' bölgeleridir; bahsedilen CDR1' bölgesi SEQ ID NO:4 amino asit dizisine sahiptir, bahsedilen CDR2' bölgesi SEQ ID No:5 amino asit dizisine sahiptir ve bahsedilen CDR3' bölgesi ise SEQ ID No:6 amino asit dizisine sahiptir. Daha fazla tercih edildigi haliyle ikinci DNA konstraktinin bu birinci kismi, 1. pozisyondaki amino asit ile baslayacak ve 109. pozisyondaki amino asit ile sonlanacak sekilde, SEQ lD NO:10 içerisinde gösterilen amino asit dizisi ile büyük ölçüde özdes olan bir amino asit dizisine sahip bir degisken domeni kodlar. Daha çok tercih edildigi haliyle birinci kisim, SEO ID NO:9 içinde gösterilen ve 1. pozisyondaki nükleotit ile baslayip, 327. pozisyondaki nükleotit ile sonlanan nükleotit dizisine sahiptir. Gene tercih edildigi haliyle ikinci kisim, insan kökenli bir hafif zincirin sabit kismini ve daha çok tercih edildigi haliyle insan kökenli K zincirinin sabit kismini kodlar. Tercih edildigi haliyle birinci ve ikinci DNA konstrakti birlikte kullanilacaktir, ancak ayri ayri kullanilmalari da mümkündür. Mevcut bulus, içerisinde bulunan CDR1, CDR2, CDR3, CDR1-x, CDR2-x, CDR3-x, CDR1', CDR2' veya CDR3' bölgelerine veya çatilara ait bir veya daha fazla amino asit rezidüsünden tipik olarak sadece birkaçinin (örnegin 1 ila 4 adet), örnegin mutasyon yoluyla, mesela karsilik gelen DNA dizilerinin yönlendirilmis mutagenezi yoluyla degismis oldugu IL-17 baglayici molekülleri de kapsar. Mevcut bulus, bu tür degistirilmis lL-17 baglayici molekülleri kodlayan DNA dizilerini de kapsar. Mevcut bulus, özellikle de içerisinde bulunan CDR1' veya CDR2' bölgelerine ait bir veya daha fazla rezidünün, SEQ lD NO:4 (CDR1' için) ve SEO lD No:5 (CDR2' için) içerisinde gösterilen rezidülerden farklilastirilmis oldugu IL-17 baglayici molekülleri kapsar. Söz konusu birinci ve ikinci DNA konstraktlarindaki birinci ve ikinci kisimlar bir intron ile ayrilabilir ve bir hizlandirici (enhancer), birinci ve ikinci kisimlar arasinda bulunan introna uygun olarak yerlestirilebilir. Translasyona degil de transkripsiyona ugratilan böylesi bir hizlandiricinin mevcudiyeti, transkripsiyonun verimli sekilde gerçeklestirilmesine destek olabilir. Belirli yapilanmalara göre bu birinci ve ikinci DNA konstraktlari, avantajli olarak insan kökenli bir agir zincirli genin hizlandiricisini içerir. DNA konstraktlarinin her biri, uygun kontrol dizilerinin ve özellikle de uygun bir promotörün kontrolü altina yerlestirilir. DNA konstraktlarinin, ifadelenmede kullanilmak üzere transfer edilecegi konakçi organizmasina adapte edilmesi sartiyla, herhangi türden bir promotör kullanilabilir. Istenen antikor bir hücre kültüründe veya bir transgenik hayvanda üretilebilir. Böylesi uygun bir transgenik hayvan standart metotlara göre elde edilebilmekte olup, bu tür metotlar, uygun kontrol dizileri altina yerlestirilen birinci ve ikinci DNA konstraktlarinin yumurtalar içine mikro enjekte edilmesine, bu sekilde hazirlanan yumurtalarin uygun yalanci gebe disilere nakledilmesine ve istenen antikoru ifadelenmeye ugratan bir soydasin seçilmesine yer verir. Antikor zincirlerinin bir hücre kültüründe üretilmesi durumunda DNA yapilarinin öncelikli olarak ya bir tek ekspresyon vektörü içine ya da iki adet ayri, ancak uyumlu ekspresyon vektörü içine koyulmalari gerekmekte olup, bunlardan ikinci olasilik tercih Bu anlatilanlara göre mevcut bulus, yukarida tanimlanan DNA konstraktlarindan en az birini içeren ve bir prokaryotik veya ökaryotik hücre dizisinde replikasyon yapabilen bir ekspresyon vektörünü de saglamaktadir. Bir DNA konstrakti içeren her bir ekspresyon vektörü, akabinde uygun bir konakçi organizmaya transfer edilir. DNA konstraktlari iki ekspresyon vektörüne ayri ayri sokuldugunda, bunlar ayri ayri, yani hücre basina bir vektör tipi olacak sekilde transfer edilebilir veya birlikte de transfer edilebilirler; ve bu ihtimallerden ikincisi tercih edilir. Uygun bir konakçi organizmasi; bir bakteri, bir maya veya bir memeli hücre dizisi olabilmekte olup, bunlardan memeli hücre dizileri tercih edilir. Daha çok tercih edildigi haliyle söz konusu memeli hücre dizisi bir miyeloma, hibridoma veya herhangi bir endojen antikorun agir veya hafif zincirini kolayca ifadelenmeye ugratmayan bir normal ölümsüz B hücresi gibi Ienfoit kökenli olur. Memeli hücrelerindeki ifadelenme itibariyla, lL-17 baglayici molekülü kodlayan dizinin, bir lokus içerisine, konakçi hücresinin DNA'sina entegre edilmesi tercih edilir. lL-17 baglayici molekülü kodlayan dizinin bu tür uygun lokuslara entegre edildigi hücreler belirlenebilir ve ifadelenmeye ugrattiklari IL-17 baglayici molekülün seviyeleri esasinda seçilebilirler. lL-17 baglayici molekülü kodlayan diziyi içeren konakçi hücrelerinin hazirlanmasi için uygun herhangi bir seçilebilir belirteç kullanilabilir; bu dogrultuda, örnegin bir dhfr geni/metotreksat veya muadili bir seçim sistemini kullanmak mümkündür. Bulus konusu lL-17 baglayici moleküllerin ifadelenmesine basvurusu 893039644 içerisinde tarif edilenler gibi, GS-tabanli amplifikasyon/seleksiyon sistemlerini ihtiva eder. Mevcut bulusun bir baska yönüne göre, bir IL-17 baglayici molekülün üretilmesine yönelik bir prosedür de temin edilmekte olup bu prosedür, (i) yukarida tanimlandigi üzere bir ekspresyon vektörü ile transforme edilen bir organizmanin kültürlenmesini ve (ii) lL-17 baglayici molekülün söz konusu kültürden izole edilmesini içerir. Mevcut tarifnamenin amaçlari dogrultusunda bir antikor, eger ki lL-17'nin kendi reseptörüne baglanmasini, AlN457 antikoru ile neredeyse ayni derecede inhibe edebiliyorsa, "IL-17'nin baglanmasini AlN457 gibi inhibe edebildigi" anlamina gelir ve bu çerçevede "ayni derecede" ifadesi, yukarida verilen anlama sahiptir. AlN457 antikorunun IL-17'ye yönelik baglanma afinitesi, anti-IL-17 antikorlari, özellikle de anti insan lL-17 antikorlari için önceden bildirilmis olan afinitelerden daha yüksektir. Dolayisiyla AlN457'nin IL-17'ye baglanma yönünden sahip oldugu ayrisma denge sabiti KD, yaklasik 0.188 ± 0.036 nM seviyesindedir (örnegin Ornek 2 içerisinde gösterildigi üzere BlAcore ile belirlenir). Bu yüksek baglanma afinitesi, AlN457 antikorunu terapötik uygulamalar için özellikle elverisli kilmaktadir. Mevcut tarifname içinde kullanildigi haliyle "IL-17 araciligindaki hastalik" ifadesi, IL- 17'nin bir hastalik veya tibbi durumda, hastalik veya duruma sebep olma, gelistirme, ilerletme, sürdürme veya patolojisi gibi dogrudan veya dolayli olarak rol oynadigi tüm hastalik ve tibbi durumlari kapsar. Mevcut tarifnamede "tedavi" veya "tedavi etme" terimleri hem profilaktik veya koruyucu tedaviyi, hem de sagaltici/küratif veya hastaligin seyrini degistirici tedaviyi ifade eder ve hastaligi kapma riski tasiyan veya hastaligi kapmis olmasindan süphe edilen ve ayrica hasta olan veya bir hastalik veya tibbi durumdan mustarip oldugu yönünde teshis konulmus olan hastalarin tedavisini ve klinik anlamda yeniden kötülesmenin (relaps) baskilanmasini da ihtiva eder. Insan IL-17'ye baglanma spesifisitesine sahip, yukarida tanimlanan lL-17 baglayici moleküllere, daha özel olarak IL-17'nin kendi reseptörüne baglanmasini inhibe edebilen antikorlara; ve 1 nM (= 30ng/ml) insan IL-17'nin aktivitesini, bahsedilen molekülün 50 nM, tercihen 20 nM, daha fazla tercih edildigi haliyle 10 nM, ya da daha fazla tercih edildigi haliyle 5 nM'Iik bir konsantrasyonunda %50 kadar inhibe etme becerisine sahip antikorlara burada mevcut bulusun antikorlari denilir ve bahsedilen inhibitbr aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-IL-17 ile indüklenen lL-6 üretimi üzerinde ölçülür. Tercih edildigi haliyle burada açiklanan antikorlar insan antikorlaridir ve en çok tercih edildigi haliyle AIN457 antikoru veya bunun direkt muadilleri olmaktadir. Burada açiklanan antikorlar, lL-17'nin kendi hedef hücreleri üzerindeki etkilerini bloke eder ve dolayisiyla, lL-17 araciligindaki hastaliklar ve bozukluklarin tedavisinde kullanilmak üzere endikedir. Bulus konusu maddelerin bu ve diger farmakolojik aktiviteleri, örnegin asagida belirtilen standart test metotlarinda sergilenebilir: notrlestirilmesi: Ozetle insan dermal fibroblastlari, mevcut bulusun antikorunun veya Fc kismina sahip insan lL-17'nin çesitli konsantrasyonlari varliginda rekombinant IL-17 ile uyarilir. Negatif kontrol olarak, kimerik anti-CD25 Simulect® (basiliksimab) antikoru kullanilir. Süpematan, 16 saatlik uyarimdan sonra alinir ve ELISA ile lL-6 yönünden incelenir. Mevcut bulusun antikorlari, yukaridaki gibi test edildiginde, (1 nM insan lL-17 varliginda) IL-6 üretiminin inhibisyonu için yaklasik 50 nM veya altinda (örnegin yaklasik 0.01 ile yaklasik 50 nM araliginda) tipik ICso degerlerine sahiptir, yani bahsedilen inhibit'or aktivite, insan dermal fibroblastlarinda hu-lL-17 ile uyarilan IL-6 üretimi üzerinde ölçülür. Tercih edildigi haliyle mevcut bulusun antikorlari, yukarida tanimlandigi gibi lL-6 üretiminin inhibisyonu için yaklasik 20 nM veya altinda, daha fazla tercih edildigi haliyle yaklasik 10 nM veya altinda, daha fazla tercih edildigi haliyle yaklasik 5 nM veya altinda, daha fazla tercih edildigi haliyle yaklasik 2 nM veya altinda, daha fazla tercih edildigi haliyle yaklasik 1 nM veya altinda |C50 degerlerine sahiptir. Yukaridaki testte de gösterildigi üzere, mevcut bulusun antikorlari, IL-17'nin etkilerini güçlü sekilde bloke etmektedir. Bu anlatilanlara göre bulus konusu antikorlar asagida gösterilen farmasötik faydalara sahiptir: Burada açiklanan antikorlar, IL-17 aracili hastaliklarin veya tibbi durumlarin, örnegin enflamatuar durumlar, alerjiler ve alerjik durumlar, hipersensitivite reaksiyonlari, otoimmün hastaliklari, siddetli enfeksiyonlar ve organ veya doku transplant rejeksiyonu gibi durumlarin profilaksisi ve tedavisi için faydalidir. Burada açiklanan antikorlar; allogreft rejeksiyonu veya ksenograft rejeksiyonu da dahil olmak üzere, Örnegin kalp, akciger, birlesik kalp-akciger, karaciger, böbrek, pankreas, cilt veya kornea transplanti alicilarinin tedavisi için ve örnegin kemik iligi naklini takip eden greft-versus-host hastaliginin önlenmesi için ve organ nakli bir baglantili arterioskleroz için kullanilabilir. Burada açiklanan antikorlar, otoimmün hastaligin ve enflamatuar durumlarin, bilhassa bir otoimmün bilesen içeren bir etyolojiye sahip, mesela artrit (örnegin romatoit artrit, arthritis chronica progrediente ve arthritis deformans) ve romatizmal hastaliklar gibi enflamatuar durumlarin, örnegin kemik kaybi, enflamatuar agri, spondiloartropatiler, örnegin ankilozan spondilit, Reiter sendromu, reaktif artrit, psoriatik artrit ve enteropatik artrit, hipersensitivite (hem havayollari hipersensitivitesi hem de dermal hipersensitivite) durumlarinin görüldügü enflamatuar durumlarin ve romatizmal hastaliklarin tedavisi, önlenmesi veya iyilestirilmesi için özellikle faydalidir. Mevcut bulusun antikorlarinin kullanilabildigi spesifik otoimmün hastaliklar, asagida sayilanlari ihtiva eder: otoimmün hematolojik bozukluklar (örnegin hemolitik anemi, aplastik anemi, pür kirmizi hücre anemisi ve idiopatik trombositopeni de dahil), sistemik Iupus eritematozus, enflamatuar kas bozukluklari, polikondritler, sklerodoma, Wegener granülomatozu, dermatomiyozit, kronik aktif hepatit, myastenia gravis, psöriazis, Steven-Johnson sendromu, idiopatik spru, otoimmün enflamatuar bagirsak hastaligi (örnegin ülseratif kolit ve Crohn hastaligi, irritabl bagirsak sendromu), endokrin oftalmopatisi, Graves hastaligi, sarkoidoz, multipl skleroz, primer biliyer siroz, jüvenil diyabet (diabetes mellitus tip I), üveit (anterior ve posterior), keratokonjunktivitis sikka ve vernal keratokonjunktivitis, interstisyel akciger fibrozu, psöriatik artrit ve glomerülonefrit (idiopatik nefrotik sendromu veya minimal degisimli nefropati gibi nefrotik sendrom esliginde ve olmadan), tümörler, multipl skleroz, cildin ve korneanin enflamatuar hastaligi, miyozitis, kemik implantinin gevsemesi, metabolik bozukluklar, örnegin ateroskleroz, diyabet ve dislipidemi. Burada açiklanan antikorlar ayrica astim, bronsit, pnömokonyoz, pulmoner anfizem ve havayollarinin diger obstrüktif veya enflamatuar hastaliklarinin tedavi edilmesi, Önlenmesi veya hafifletilmesi için de faydalidir. Burada açiklanan antikorlar, IL-17 araciligindaki veya IL-17 üretiminin sürece karistigi, ya da IL-17 dolayisiyla TNF saliminin desteklendigi, örnegin akut enfeksiyonlar, mesela septik sok (örnegin endotoksik sok ve yetiskinlerde solunum güçlügü sendromu), menenjit, pnömoni gibi istenmeyen akut ve hiperakut enflamatuar reaksiyonlarin; ve siddetli yaniklarin tedavi edilmesi; ve enfeksiyon, kanser ya da organ disfonksiyonu sonucundaki, morbid TNF salimi ile baglantili tükenme (wasting) sendromu veya kaseksinin, özellikle HIV enfeksiyonu ile baglantili veya takiben cereyan eden AIDS ile ilgili kaseksinin tedavi edilmesi için faydalidir. Burada açiklanan antikorlar osteoartrit, osteoporoz gibi kemik metabolizmasi hastaliklari ve diger enflamatuar arterit durumlarinin ve genel olarak kemik erimesi (yasla ilgili kemik erimesi de dahil) ve özellikle periodontal hastaligin tedavi edilmesinde de özellikle faydalidir. Bu endikasyonlar itibariyla, uygulanacak elverisli dozaj, haliyle, örnegin kullanilacak bulus konusu antikora, tedavi edilen bireye, ilaç verme sekline ve tedavi edilen durumun dogasina ve siddetine bagli olarak degisecektir. Ancak profilaktik kullanimda, tatmin edici sonuçlarin genel olarak birim kilogram vücut agirligi için yaklasik olarak 0.05 mg ila yaklasik olarak 10 mg ve daha genel olarak yaklasik 0.1 mg ila yaklasik 5 mg'lik dozajlarda elde edilebilecegi belirtilir. Profilaktik kullanima yönelik doz sikligi, normal olarak haftada birden üç ayda bir ve daha genel olarak iki haftada birden 10 haftada bir, örnegin 4 ila 8 haftada bir olacak sekilde belirlenecektir. Bulus konusu antikor parenteral, intravenöz (örnegin antekubital veya baska bir periferal ven), intramusküler veya subkütanöz sekillerde rahatlikla uygulanabilir. Bir profilaktik tedavi, bulus konusu antikorun tipik olarak ayda birden her iki ila üç ayda bire veya daha düsük bir siklikta uygulanmasini içerecektir. Burada açiklanan antikorlar, tek etkin madde olarak verilebilir veya örnegin yukarida bahsedilen hastaliklarin tedavisi veya önlenmesi için, Örnegin immün baskilayici ajanlar veya immün modülatörleri veya baska anti-enflamatuar ajanlar gibi baska ilaçlarla birlikte, örnegin bunlara adjuvan olarak veya bunlarla kombinasyon halinde birlikte verilebilir. Bulus konusu antikorlar, örnegin asagida sayilanlar ile kombinasyon halinde kullanilabilir: DMARD, mesela altin tuzlari, sülfasalazin, Sitma karsiti ajanlar, metotreksat, D-penisilamin, azatioprin, mikofenolik asit, siklosporin A, takrolimus, sirolimus, minosiklin, Ieflunomid, glukokortikoitler; bir kalsineurin inhibitörü, örnek olarak siklosporin A veya FK 506; Ienfosit resirkülasyonunun bir modülatörü, örnek olarak FTY720 ve FTY720 analoglari; bir mTOR inhibitörü, örnek olarak rapamisin, 40- immünsupresif özelliklere sahip bir askomisin, örnek olarak ABT-281, ASM981 vs.; kortikosteroitler; sikIo-fosfamid; azatiopren; metotreksat; leflunomid; mizoribin; mikofenolik asit; miko-feno-Iat mofetil; 15-deoksispergualin veya bunlarin bir immünsupresif homologu, analogu veya türevi; immünsupresif monoklonal antikorlar, örnek olarak Iökosit reseptörlerine yönelik monoklonal antikorlar, örnek olarak MHC, bunlarin Iigantlari; diger immün modülatuar bilesikler, örnek olarak CTLA4 veya bunun bir mutantinin ekstraselüler domeninin en azindan bir kismina sahip bir rekombinant baglayici molekül, örnek olarak CTLA4'ün veya örnek olarak CTLA4Ig ya da bunun bir mutanti (mesela ATCC 68629) gibi bunun CTLA4 harici bir protein dizisine bagli bir mutantinin en azindan ekstraselüler kismina sahip bir rekombinant baglayici molekül, örnek olarak LEA29Y; adhezyon molekülü inhibitörleri, örnek olarak LFA-1 antagonistleri, lCAM-1 veya -3 antagonistleri, VCAM-4 antagonistleri veya VLA-4 antagonistleri; veya bir kemoterapötik ajan, örnek olarak paklitaksel, gemsitabin, sisplatin, doksorubisin veya 5-fl0r0urasil; anti TNF ajanlari, örnek olarak TNF'ye yönelik monoklonal antikorlar, örnek olarak infliksimab, adalimumab, CDP870, ya da TNF-RI veya TNF-Rll'ye yönelik reseptör konstraktlari, örnek olarak etanersept, PEG- TNF-RI; proenflamatuar sitokinlerin blokerleri, lL-1 blokerleri, örnek olarak anakinra veya IL-1 trap, AAL160, ACZ 885, IL-ö blokerleri; kemokinler blokerleri, örnegin metalloproteazlar gibi proteazlarin inhibitörleri veya aktivatörleri, anti-IL-15 antikorlari, anti-IL-6 antikorlari, anti-CD20 antikorlari, NSAID'Ier, mesela aspirin veya bir anti- enfeksiyöz ajan (bu liste bahsedilen ajanlar ile sinirli degildir). Yukarida belirtilenler itibariyla burada açiklananlar, daha baska bir yönüne göre, asagida sayilanlari saglamaktadir: Yukarida tanimlandigi gibi, bir IL-17 baglayici molekülün, örnegin bulus konusu bir antikorun terapötik olarak etkili biri miktarinin ve en az bir ikinci ilaç maddesinin birlikte uygulanmasini, örnegin ayni zamanda veya sirali olarak verilmesini ihtiva eden ve bahsedilen ikinci ilaç maddesinin ise yukarida belirtildigi üzere bir immünsupresif / immün modülatuar, anti-enflamatuar kemoterapötik veya anti-enfektif bir ilaç oldugu bir metot. Veya, a) bir lL-17 baglayici molekülün, örnegin bulus konusu bir antikorun terapötik olarak etkili biri miktarini ve b) mesela yukarida belirtildigi üzere immünsupresif / immün modülatuar, anti-enflamatuar kemoterapötik veya anti-enfektif ilaçlarin arasindan seçilen en az bir ikinci maddeyi ihtiva eden bir terapötik kombinasyon. Söz konusu kit, uygulanmasina yönelik talimatlari içerebilir. Burada açiklanan antikorlar; baska immünsupresif / immün modülatuar, anti- enflamatuar kemoterapötik veya anti-enfektif tedaviler ile birlikte uygulandigi durumlarda birlikte verilen kombinasyon bilesiginin dozajlari elbette ki kullanilan ortak ilacin tipine, örnegin bir DMARD, anti-TNF, IL-1 blokeri veya bir baska ajan olduguna, kullanilan spesifik ilaca, tedavi edilen durumu vs. bagli olacaktir. Burada açiklanan farmasötik bilesimler, konvansiyonel usullerle üretilebilir. Burada açiklanan bir bilesim tercihen liyofilize formda saglanir. Hemen uygulanmasi için uygun bir sulu tasiyici, örnegin steril enjeksiyonluk su veya steril tamponlu fizyolojik salin içinde çözülür. Bir bolus enjeksiyonu yerine, infüzyon saglamak üzere daha büyük hacimli bir çözelti olusturmak istendigi takdirde insan kökenli serum albüminini veya hastanin kendi heparinize kanini formülasyon zamaninda salin içine katmak faydali olacaktir. Alternatif olarak formülasyon subkütanöz olarak uygulanabilir. Fizyolojik olarak inert özellikteki böylesi bir proteinin asiri miktarda kullanilmasi, infüzyon çözeltisi ile kullanilan kap ve tüplerin cidarlarina adzorpsiyon yoluyla meydana gelecek antikor kaybini önleyecektir. Albümin kullanilmasi halinde, salin çözeltisinin agirligi itibariyla veya liyofilize formülasyonlari ihtiva eder. Bu bulus, asagida gösterilen Ornekler ile baskaca açiklanacaktir. ORNEKLER Insan kökenli lL-17'ye karsi antikorlar üretmek üzere, murin kökenli immünoglobulin repertuvari yerine insan kökenli lgG/K repertuvarini ifadelemek üzere dizayn edilmis farelerin B hücreleri standart hibridoma teknolojisi ile immortalize edilir ve insan kökenli Ornek 1: Hibridomanin 'üretilmesi, antikorlarin saflastirilmasi ve AIN457 antikorunun seçilmesi Rekombinant insan IL-17 (hulL-17) üretimi: Rekombinant hulL-17. gerek inklüzyon cisimciklerinde E. coli içerisinde üretilir ve konvansiyonel teknikler ile geri katlanir (kurum içinde tasiyicisiz olarak üretilir (E. coli; Novartis Pharma, Parti No. BM- E3141/98) veya satin alinir (tasiyici olmadan, E. coli; R&D Systems No. 317-lL/CF)), gerekse HEK.EBNA içerisinde salinan ve kismi olarak glikozillenen protein olarak üretilir (Recombinant huIL-17, tasiyici olmadan (IL-17 APP-Cö, transfekte HEK/EBNA hücrelerinden; Novartis Pharma, Parti No. En.E-3382/82; 0.28 mg/ml; recombinant huIL-17, tasiyici olmadan (iL-17 APP-C4, transfekte HEK/EBNA hücrelerinden; Novartis Pharma, Parti No. En.E-3382/83; 0.29 mg/ml)). Son bahsedilen form, immüno afinite kromatografisi yoluyla kültür süpernatanindan hizli aritim için C-terminalinde 4 amino asitlik bir uzanti saglar. Bu durumda iken kültür süpernatanlari, CNBr ile aktiflesmis Sepharose 4B'ye kenetli özel sabitlenmis bir anti-tag antikorunun uygun boyuttaki bir kolonu üzerine, üretimi talimatlarina (Pharmacia) uygun olarak 10 mg/ml'lik bir yogunlukta doldurulur. PBS ile bazal yikamadan sonra baglanmis olan huIL-17, ile elüe edilir ve seyreltik NaOH ile hemen nötrlestirilir. huIL-17'nin Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) ile kenetlenmesi: Gerek E. coli, gerekse HEK.EBNA içinde üretilen HulL-17. asiri miktarda kullanilan homo- bifonksiyonel çapraz baglayici disüksinimidil suberat (DSS) ile önceden aktiflestirilmis KLH'ye kenetlenir. Ozetle, 20 mg Iiyofilize lmject® Mariculture KLH (Pierce # 77600), 2 ml H20 ile hazirlanarak, fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 10 mg/ml'lik bir çözelti (pH eklenir ve karisim oda sicakliginda yaklasik 1 saat karistirilir (reaktifin tamami çözülmez ve bir miktar çökelti meydana gelir). Kisa bir santrifüjleme ve filtreleme (0.45 um) yapildiktan sonra çözeltinin tuzu, Sephadex G25 fine (Pharmacia) / PBS (debi 2 mI/dk) ile alinir ve böylece 1.5 mg/ml (Bradford) yogunlugunda yaklasik 11 mg aktiflesmis KLH elde edilir. 1 ml aktiflesmis KLH (1.5 mg), Iiyofilize E. coliden t'üretilmis huIL-17'nin (Parti No. BM-E3141/98) su içerisindeki 1 ml'lik 9 mg/ml çözeltisi karistirilir. Çbzelti berrak sekilde kalir ve oda sicakliginda 2 saat ink'ube edilir. Meydana gelen kompleksin konsantrasyonu , 1 ml HEK.EBNA huIL-17 (su içerisinde yaklasik 3 mg; Parti No. En.E-3382/83) ile karistirilir. Çözelti berrak sekilde kalir ve oda sicakliginda 2 saat inkübe edilir. Konsantrasyon (Bradford) 2.9 mg/ml'dir. Bagisiklama: Murin immünoglobulin degisken ve sabit kisim genlerinin, kendi insan muadilleri ile fonksiyonel sekilde ikame edilmis oldugu, genetigi dizayn edilmis 27340 faresi (disi; MEDAREX lnc, Annandale, NJ) (genotip Tg kodu 221100-TgH (CMD)++;TgN(Hc9272+ (ayrica bkz. Sherie L. Tablo 1. Bagisiklama programi Gün Tarih Immünojen Bagisiklama dozu ve yolu 0 07.06.01 KLH'ye kenetli HuIL-17 (BM- iki noktada her birinden karistirilmis huIL-17 (BM- adjuvan ile toplam E3141/98) / Gerbu adjuvani hacim/fare karistirilmis huIL-17 (En.E- adjuvan ile toplam 3382/83) / Gerbu adjuvani hacim/fare (En.E-3382/83) / Gerbu adjuvani adjuvan ile toplam hacim/fare Gün Tarih /mmünojen Bagisiklama dozu ve yolu 12.07.01 ELlSA için serum alimi (3. boost) oranda karistirilmis, KLH'ye 8.0. olarak 20 ug; 100 ul kenetli huIL-17 (En.E-3382/83)/ adjuvan ile toplam Gerbu adjuvani hacim/fare karistirilmis huIL-17 (En.E- adjuvan ile toplam 3382/83) / Gerbu adjuvani hacim/fare oranda karistirilmis hulL-17 s.c. olarak 20 pg; 100 pl (En.E-3382/83) / Gerbu adjuvani adjuvan ile toplam hacim/fare . boost 99 14.09.01 ELlSA için serum alimi KLH'ye kenetli HulL-17 (En.E- 10 ug/fare i.p. 3382/83) 3382/83) 3382/83) 120 05.10.01 füzyon Serum örnekleri, bagisiklama protokolü basladiktan 35 ve 99 gün sonra alinir ve böylece enzime bagli immünosorbent testi (ELISA) ile anti-hulL17 antikorunun düzeyleri ölçülür. Birlestirilen hücreler, HAT ortaminda (2 g/l sodyum bikarbonat, 5 x 10*5 MB- isiyla etkisizlesmis FCS ve 50 pg/ml gentamisin içeren RPMl 1640) besleyici bir fare peritoneal hücreleri (BaIb/c fareleri) tabakasi içeren 720 göz içine kaplanir (1 mI/göz). 14. günde HAT ortami, HT ortami ile, yani aminopterin içermeyen HAT ortami ile degistirilir. Tarama çalismasi 10. günde baslar ve iki hafta sürer. Kaplanan ilk 720 gözden 684'ü (%95), hibridoma büyümesi yönünden pozitiftir. Süpernatanlar toplanir ve hem E. coli hem de HEK/EBNA'dan türetilen huIL-17 kullanilarak huIL-17'ye reaktif MAb yönünden ELISA çalismasinda taranir. Elli iki primer göz, anti-hulL-17 antikorlarin varligi bakimindan pozitif sonuçlar verir. Yirmi sekiz hibridoma klonlanir ve geriye kalanlari dondurulur. 4 x 96 gözlü mikrotitre plaklarda HT ortaminda ve fare peritoneal hücrelerinin besleyici bir tabakasinda klonlama yapilir. Hibridomalar, birim gözde 0.5 hücre/100 pl yogunlugunda kaplanir. Gözler, büyüme yönünden mikroskopla taranir ve pozitif olanlari 100 ul HT ortami ile beslenir. Sonraki gün süpernatanlar, huIL-17'ye spesifik bir ELISA çalismasinda antikor üretimi yönünde test edilir. Klonlama üzerinei klonlanmis olan hibridomalarin çogunlugu, anti-huIL-17'ye spesifik mono antikor (MAb) salma kapasitesini muhafaza eder. Antikor üretimi ve aritimi: Salman klonlar, serumsuz ortamda (5 ml), 25 cm2 boyuttaki TC (TC, tissue culture; doku kültürü) kaplarina aktarilir. Hibridomalar, serumsuz ortamda adim adim büyütülerek 75 cm2 TC kaplara ve roller tipi kaplara alinir. NVP- dahil olmak üzere tüm farkli anti-hu-lL-17 MAb'ler, protein A afinite kromatografisi yoluyla saflastirilir. Kültür süpernatanlari, pH 7.3 seviyesine ayarlanir ve uygun boyuttaki bir Protein A Sepharose 4 fast flow (Pharmacia) kolonuna doldurulur. ile bazal yikama yapildiktan sonra baglanmis olan antikorlar 50 mM sitrat, pH 2.7, 140 mM NaCI ile elüe edilir. Elüe olan fraksiyon derhal nötrlestirilir (pH 7.0) ve steril olarak filtrelenir. Protein konsantrasyonu, 1.35 abzorpsiyon ünitesi (AU)/mg'lik bir faktör kullanilarak 280 nM'de abzorpsiyon ile belirlenir. Anti-hulL-17 MAb'nin insan dermal fibroblastlarinda hulL-17 ile uyarilan IL-6 üretimi huFGF-bazik (0.1 ug/ml) ve gentamisin (50 tig/ml) ile takviyeli FBM içerisinde kültürlenir. Fibroblastlar, bir tripsin/EDTA çözeltisi kullanilarak plastikten ayrilir. Fibroblastlar, 96 gözlü mikrotitre plaklarina, %1 FCS ile takviyeli FBM içerisinde 1x104 hücre/göz yogunlugunda dagitilir. Fibroblastlarin gece boyu plaklara yapismasina imkan verilir. Söz konusu ortam sonraki sabah uzaklastirilir ve %1 FCS, hulL-17 (30 ve 500 ng/ml araliginda farkli konsantrasyonlar) ve hibridoma süpernatanlari (1/5'Iik son seyrelti) ile takviyeli taze FBM veya saflastirilmis antikorlar, 200 ul'lik bir son konsantrasyonda eklenir. Kültür süpernatanlari, 24 saat ink'ubasyondan sonra toplanir ve huIL-6 üretimi ELlSA ile ölçülür. Anti-hulL-17 antikorlarin 'üretimi için ELISA çalismasi: ELISA mikrotitre plaklari, PBS hibridomalarin kültür süpernatanlari (son seyrelti 123; ilave edilir. Oda sicakliginda gecelik ink'ubasyondan sonra plaklar 4 kere PBS / %005 Tween 20 / antikor, 1/20000'lik bir son seyreltide ( eklenir. Ornekler, oda sicakliginda 4 saat tepkimeye girmeye birakilir. Yikamadan sonra (4 kere) alkalin fosfataz-konjüge streptavidin, 1/8000'Iik ( bir son seyreltide eklenir. Oda sicakliginda 40 dakika geçtikten sonra plaklar yeniden 4 kere yikanir ve substrat (p-nitrofenilfosfat / dietilamino tamponu pH 9.8; 150 pl/göz) ilave edilir. Kaplar, bir mikrotitre okuyucuda dakika sonra okunur. Antikor izotipinin saptanmasi için ELISA çalismasi: MAb izotipinin açiga çikarilmasi amaciyla, huIL-17 ile kaplanmis mikrotitre plaklarin gözlerine kültür süpernatanlari (100 pl; son seyrelti orani 1/5) eklenir (bkz. yukari) ve oda sicakliginda gece boyu ink'ube edilir. Yikama yapildiktan (4 kere) sonra oda sicakliginda 4 saat boyunca 100 pl/göz yogunlugunda biotin-konjüge fare MAbs anti-insan lgG1 (son seyreltme orani eklenir. Kontrol olarak, biotin-konjüge siçan anti-fare A1 ve A2 hafif zincirine spesifik bir MAb kullanilir (son seyreltme orani 1/1000). Daha sonra, önceden tarif edildigi gibi yikama yapilir ve alkalin fosfataz-konj'üge streptavidin (100 pl; son seyreltme orani 1/8000) eklenir. Yikama (4 kere) yapildiktan sonra substrat (p-nitrofenilfosfat / dietilamino tamponu; 100 pl) ilave edilir. Kaplar, bir mikrotitre okuyucuda (Bio-Rad) 405 ve 490 nM'lik filtreler ile reaksiyonun gelisimine bagli olarak 30 veya 45 dakika sonra huIL-6 üretiminin saptanmasi için ELlSA çalismasi: ELISA mikrotitre plaklari, PBS 4 pg/ml) ile kaplanir ve oda sicakliginda gece boyu ink'ube edilir. Sonraki gün mikrotitre Plaklar daha sonra 4 kere PBS / %005 Tween 20 / %002 NaNs ile yikanir. Insan dermal fibroblastlarinin kültür süpernatanlari (son seyreltme orani 113; 100 ul/göz) ilave edilir. Bir titrasyon egrisi olusturmak 'üzere hulL-6 (, 1:2'Iik seyreltme adimlarinda 400 pg/ml'den 3.1 pg/ml'ye kadar titre edilir. Oda sicakliginda gecelik inkübasyondan sonra plaklar 4 kere PBS / %005 Tween 20/ %002 NaNs ile yikanir. Biotin-konjüge bir keçi anti-huIL-ö antikoru (BAP206; R&D Systems) eklenir (25 ng/ml; 100 ul/göz). Ornekler, oda sicakliginda 4 saat tepkimeye girmeye birakilir. Yikamadan sonra (4 kere) alkalin fosfataz-konj'uge streptavidin, 1/8000'lik ( bir son seyreltide eklenir. Oda sicakliginda 40 dakika geçtikten sonra plaklar yeniden 4 kere yikanir ve substrat (p-nitrofenilfosfat / dietilamino tamponu pH 9.8; ilave edilir. Kaplar, bir mikrotitre okuyucuda (Bio-Rad) 405 ve 490 nIVI'lik filtreler ile 30 dakika sonra okunur. Hesaplamalar: Degerler, orijinal O.D. degerleri olarak veya ikiser degerin ortalamasi esasinda hesaplanan inhibisyon yüzdesi (%) olarak bildirilir. Ilave veriler, ortalama ± SEM olarak bildirilir. Bir kübik egri grafigi temelinde kültür süpernatanlarindaki hulL-ö konsantrasyonunu ölçmek için bir hulL-ö standart egrisi kullanilir. Sonuçlar 27340 faresinin serum titreleri: Tablo 2. Anti-huIL-17 serum titreleri (27340 faresi) Serum seyreltme oranlari Parti No* * Mikrotitre plaklar, E. coli (BM-E ait huIL-17 (3 ug/ml) ile kaplanmistir. 27340 faresinin serumu, iki farkli hulL-17 preparati üzerinde anti-huIL-17 antikorlarinin varligina karsi 35 ve 99. günlerde ELlSA çalismasiyla analiz edilir (Tablo 2). Elde edilen sonuçlar, 27340 faresine ait serum titrelerinin 35 ve 99. günler arasinda yaklasik dört misli arttigini ve her iki huIL-17 preparatinin da tanindigini gösterir. ELISA ile hibridoma süpernatanlarin baglanma çalismasi: 684 süpernatan, ELISA çalismasinda anti-hulL-17 antikorlarin varligi bakimindan test edilir ve bu amaçla, ilki E coli (BM-E gelen rekombinant huIL-17'nin iki preparati kullanilir. Elli iki süpernatan, anti-hulL-17 antikorlarin varligi bakimindan pozitif sonuçlar verir (Tablo 3). Birkaç durumda hulL- 17'nin bir veya diger preparatina tercihli baglanma gerçeklestigi gözlenir. Sonradan klonlanan 28 hibridomanin alti çizili gösterilir. Tablo 3. Kültür süpernatanlarin ELlSA reaktivitesi Hibridoma HulL-17 HEK/EBNA Hibridoma HulL-17 HEK/EBNA (No) karisimi* E. CD. (NO) karisimi E. O.D. coli DD. degerleri coli O.D. degerleri degerleri degerleri 1.830 1.812 1.928 2.139 1.471 1.236 2.078 1 066 1.619 2.209 2.716 1.348 1.371 2.078 2.363 1 559 Hibridoma HulL-17 HEK/EBNA Hibridoma HuIL-17 HEK/EBNA (No) karisimi* E. CD. (NO) karisimi E. O.D. coli DD. degerleri coli O.D. degerleri degerleri degerleri 0.857 2.455 1.652 1.196 1.669 0.750 1.322 0.811 2.108 2.326 0.903 0.675 2.084 1.068 1.305 0.928 1.146 0.821 1.990 1 777 1.640 2.230 Hibridoma HulL-17 HEK/EBNA Hibridoma HuIL-17 HEK/EBNA (No) karisimi* E. O.D. (No) karisimi E. O.D. coli DD. degerleri coli O.D. degerleri degerleri degerleri 0.789 1.077 2.677 1.389 1.789 1.297 1.073 1.087 1.762 1.549 2.702 1.803 1.194 2.420 * Plaklar, E. coli (BM-E ait rekombinant hulL-17 (3 pg/ml) ile kaplanir. Süpernatanlar, 1/3'I'L'ik son seyreltme oraninda test edilir. Hibridoma klonlarina ait kültür süpernatanlarinda ELISA ile baglanma çalismasi: En iyi anti-hulL-17 MAb üretimini koruyan 11 hibridomaya ait klonlarin süpernatanlarin ELISA çalismasindaki reaktivitesi Tablo 4 içerisinde gösterilir. Kalin olarak vurgulanmis olan klonlar, antikorlarin aritilmasi ve analizi için roller tipi siselerde yaklasik 1 litre süpernatan üretmek 'üzere seçilir. hulgG3K antikorunu `üreten 5 numarali hibridomadan türetilen klonlar hariç ve izotipe spesifik monoklonal antikorlar ile degerlendirildigi üzere, diger tüm klonlar hulgG1 K MAb üretmistir. Tablo 4. hu-IL-17'ye yönelik kültür süpernatanlarin ELISA reaktivitesi. Klon Süpernatanlarin* Klon Süpernatanlarin** Klon Süpernatanlarin* (No) CD. degerleri (No) CD. degerleri (No) DD. degerleri Klon Süpernatanlarin* Klon Süpematanlarin** Klon Süpernatanlarin* (No) CD. degerleri (No) CD. degerleri (No) CD. degerleri * Mikrotitre plaklari, HEK/EBNA hücrelerine (En.E-3382/82) ait rekombinant hulL-17 (3 tig/ml) ile kaplanir. Kültür süpernatanlarin nötrlestirici aktivitesi: Kültür süpernatanlari, insan dermal fibroblastlarinda rekombinant hulL-17 ile uyarilan hulL-6 `üretiminin inhibisyonu yönünden test edilir. Tablo 5 içerisinde gösterildigi 'üzere kültür süpernatanlarin çogunlugu inhibitör aktivite sergilemektedir. Tablo 5. Kültür süpernatanlari ile insan dermal fibroblastlarinda huIL-17 ile uyarilan IL- 6 üretiminin inhibisyonu lL-6 'üretiminin inhibisyonu (%) Klon (No) Uyaran olarak kullanilan huIL-17 miktari (ng/ml) bulusun tercih edilen yapilanmasi) üretimi için seçilmesi, saflastirilan antikorlarin n'otrlestirici aktivitesine ve BIACORE 2000 üzerindeki afinite Ölçümüne dayandirilir (bkz. asagi Ornek 2). Ornek 2: AIN457, rekombinant insan IL-17'ye (hulL-17) çok yüksek afinite ile baglanir; Ko degeri 122 ± 22 pM'dir (BlAcore) ve insan dermal fibroblastinda huIL- konsantrasyonunda 2.1±0.1 nM'dir. a) Metotlar Reaktifler: Genel laboratuvar reaktifleri, Merck ve Sigma firmasindan satin alinir ve mevcut en saf kalitedeki ürünlerdir; özel reaktiflerin kaynaklari asagida detaylandirilir. Proteinler: Monoklonal antikorlar, MEDAREX transgenik farelerin rekombinant insan kromatografi yoluyla saflastirilabilecegi hücre dizilerini 'üretmek 'üzere standart prosedürlerin takip edilmesi yoluyla 'üretilir (esas olarak 'Ornek 1 içerisinde tarif edildigi sekilde filtrelenmis bir çözelti formunda saklanir. Rekombinant insan AlN457 (Parti No gerekse 20 mM asetik asidin (1 M Tris bazi ile pH 5.5 seviyesine ayarlanmis) steril stok çözeltisinde elde edilir. Konsantrasyonlar, tipik olarak 2 mg/ml civarindadir ve Biacore deneyleri için BlA tamponunda 5 pg/ml'lik bir son konsantrasyona seyreltilir (20 mM BlAcore ölçümleri Kinetik baglanma parametrelerinin ve çapraz reaktivitesi düzeylerinin belirlenmesi, optik biyo-sensör BlAcore 2000 kullanilarak yüzey plazmon rezonansi ölçümleri yoluyla gerçeklestirilir (BlAcore AB, Upsalla, Isveç, detaylar için bkz. Lit. HS 1,2). Bu teknoloji, bir Iigandin bir reseptöre baglanmasi (kon) ve ayrismasina (koff) yönelik mikroskobik hiz sabitlerinin isaretsiz olarak belirlenmesine imkan verir. Dolayisiyla, antikor-antijen etkilesimlerinin karakterize edilmesi için özellikle uygundur. Bu teknoloji tamamlayicidir ve pek çok yönden ELISA ölçümlerine göre daha üstündür (Van antikoru AIN457'ye baglanmasina yönelik çalismalar iki sekilde gerçeklestirilir. Standart protokolde AIN önceden sabitlenmis olan bir anti-insan Fcy antikoru (Jackson Immunochemioals; Cat.No. 109- 005-098) ile yakalanir. Fcy yakalama antikorunun kovalent baglanmasi, BlAcore tarafindan saglanan 'Amine coupling kit' (BlAcore, Kat. No. BR-1000-50) ile gerçeklestirilir. Tipik oldugu üzere 3000 RU yakalama antikorui aktiflesmis dekstran yüzeye baglanir; bu amaçla 10 mM Ac tamponunda (pH 4.5) 30ug/ml anti Fcy antikor çözeltisi 5 ul/dk'lik bir akis hizinda kullanilir ve böylece yaklasik olarak 250 RU seviyesinde AIN457 sabitlesmesi saglanir. Prensip olarak 1000 RU, 1 ng/mmz'lik bir kütle transferine karsilik gelir. Alternatif olarak IL-17 (Kisim 3.2; Tablo 4), AlN457 antikoru, yakalama antikoru olmaksizin çip yüzeyine direkt olarak kenetlenir. Sonuçlar, Tablo 9 içerisinde tarif edilen protokol ile karsilastirilir (bkz. asagi). b) Sonuçlar Dengedeki ayrisma sabiti KD, in vivo olarak olusmalari üzerine komplekslerin stabilitesi hakkinda fikir yürütülmesine imkan verir. Dolayisiyla, insan lL-17'nin sabitlenmis AIN457 antikoruna baglanmasina yönelik kinetik sabitleri tarafimizca belirlenmis olupi bu verilerden KD degerleri tarafimizca türetilmistir. Tablo 3, 2 deneye ait egrilerin, BIAevaluation 3.0 yazilimi kullanilarak Langmuir modeline girilmesi üzerine elde edilen verilerin özetini gösterir. Antikor elbetteki çift degerlikli olmasina ragmen baglanma, 1:1'Iik bir olay olarak görülebilir ve monomerik IL-17 molekülleri tarafindan isgal edilecek olan ayri antikor baglayici pozisyonlar yüzeyde sunulur. Bu deney. antikor-kemokin kompleksinin hem son derece hizli olan ayrisma, hem de çok yavas olan ayrisma kinetiklerini gösterir. Sensörgramlar (BIAevaluation içerisinde önerildigi gibi birlikte degil de) ayri ayri ele alindiginda, en iyi veri uyumu elde edilir. Dolayisiyla, titrasyon dizilerinin birlestirilmesinden sonra 12 sensörgramin ortalama degerleri tarafimizca asagidaki gibi elde edilir: kon ( Tablo 3. Rek insan IL-17'nin NVP-AlN457'ye 1:1'Iik baglanmasina ait kinetik sabitleri Kons [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Den. IL-314 7.73E + 04 4.51E - 06 2.21E - 11 KD=koff/kon denklemini uygulamak yerine ayri kayitlardan (dikey) hesaplanan ortalama Rekombinant hücrelerde (KBOSBOSA) üretilen AIN457 için afinite ölçümleri, sirasiyla insan, ipek maymunu, rhesus maymunu ve sinomolgus maymunu kökenli lL-17 sitokinleri için gerçeklestirilir. Biacore ölçümlerinin deneysel detaylari, yukarida MAB110-28 antikoru için tarif edilen ile aynidir. Her bir turda 6 adet lL-17 konsantrasyonunu test eden iki bagimsiz tur gerçeklestirilir. Insan IL-17'ye yönelik konsantrasyonlar 2. 4, 8, 12. 16, 20 nM olur iken diger tüm türlere yönelik türü için n=12 ayri ölçüm saglanir. KD ve ayrica SEM bildirilir. Tablo 4. Ozet: Rek insan, ipek maymunu, rhesus maymunu ve sinomolgus maymunu kökenli lL-17'nin NVP-AIN 1:1'Iik baglanmasina ait kinetik sabitleri Rhesus maymunu 9 nM +/- 1 nM Sinomolgus maymunu 6 nM +/- 0.7 nM KBOSSOSA antikoruna ve ilgili IL-17 türlerine yönelik BlAcore analizinin, kon, koff ve KD ile birlikte tam veri kümesi, asagidaki Tablolar 5 - 8 içerisinde verilir. Tablo 5. Rek insan lL-17'nin AlN 1:1'Iik baglanmasina ait kinetik sabitleri Kons [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Den. iL-355/ iL-355 Tablo 6. Rek ipek maymunu baglanmasina ait kinetik sabitleri Kons [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Den. IL-366/ IL-365 Kons [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Den. iL-366/ iL-365 Tablo 7. Rhesus maymunu lL-17'nin AIN 1:1'Iik baglanmasina ait kinetik sabitleri Kons [nM] kon [1/Ms] koff[1/s] KD [M] Den. IL-366/ lL-365 Kons [nM] kon [1/Ms] koff[1/s] KD [M] Den. iL-355/ iL-355 Tablo 8. Sinomolgus maymunu baglanmasina ait kinetik sabitleri Kons [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Den. iL-355/ iL-355 Kons [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Den. iL-366/ iL-365 Bu deneylerde huIL-17R/Fc ve bir fare anti-huIL-17 MAb, pozitif kontroller olarak katilir ve Simulect ise negatif kontrol olarak kullanilir. Tablo 9. lL-17RIFc ve bir fare anti-huIL-17 MAb (R&D System) ile karsilastirmali olarak hu-lL-17'nin insan anti-huIL-17 MAb AIN457 tarafindan nbtrlestirilmesi *Ortalama ve SEM degerleri, 'üç farkli ve bagimsiz deneyden hesaplanir. Sonuç olarak AIN457, insan dermal fibroblastlarinda huIL-6'nin lL-17'ye bagimli olarak salinmasini elimine eder. Buradaki etkinlik, hulL-17R/Fc'nin etkinligi ile benzerdir ve piyasadan temin edilebilen bir fare anti-hulL-17 MAb'ninkinden daha üstünd'ür. lL- 17R/Fc ile degil de AlN457 ile daha eksiksiz bir inhibisyon gözlenmesi ilgi çekicidir. Ornek 3: Agir ve hafif zincir amino asit dizilerinin safligi ve bunlarin kismi amino asit dizileri VL ve VH bölgelerinin amino-terminal amino asit dizileri: Iki anti-lL-17A antikor olarak amino asit rezid'us'u, Edman yikimi prosedürüyle belirlenir. Amino asit dizisi, her iki klon için de aynidir. GeneBank, blast analizi ile taranir ve bulunan en fazla homolog DNA dizisi, klonlayici primerleri dizayn etmek için kullanilir. VL ve VH bölgelerinin moleküler klonlamasi: Total RNA, 2x107 hibridoma hücresinden (klon 110-7, klon 110-28), saticinin protokolüne uygun olarak RNeasy Midi Kit (Quiagen Hilden Almanya) ile hazirlanir. Total RNA, 200pl RNase'siz su içinde elüe edilir ve -80°C sicaklikta saklanir. Birinci cDNA iplik sentezini için M-MLV ters transkriptaz (Promega, Madison, WI), oligo-dT primer, PCR nükleotit miks (dNTPs) ve RNAsin inhibitör'u (Roche, Mannheim) kullanilir. Bes ug total RNA, 1 pl oligo-dT primer (0.5 pg/ul) ile karistirilir ve 36 ul'lik bir son hacim elde edilecek sekilde RNase'siz su eklenir. Karisim 70°C sicaklikta 10 dakika ink'übe edilir ve daha sonra buz 'üzerinde saklanir. Buz 'üzerinde iken asagidaki reaktifler eklenir: 10p| 5x RT tampon, 2pl dNTP (her biri 10 mM), 2 ul RNasin ve ipi M-MLV ters transkriptaz. Reaksiyon 42°C sicaklikta 1 saat gerçeklestirilir. PCR reaksiyonunu gerçeklestirmek için toplam 40 pl hacimde 4 pl cDNA sablonu, her birinden 10 uM olacak sekilde 2 pl primer (konu hakkinda genel bilgiler için bkz. asagi ve Tablolar 10 ve 11) 20 pl 2xQiamix (içerigi tampon, dNTP, TAQPoIymerase) ve 1 ul Pwo DNA polimeraz kullanilir. PCR sartlari 94°C'de 15 saniye, 55°C'de 20 saniye 72°C'de 30 saniye 35 siklus olarak belirlenir. PCR ürünü, pCR4-TOPO-Zero (Stragagene, La Jolla, Ca.) klonlama vektör'une alt klonlanir. Her bir reaksiyondan birkaç klon alinir ve nükleotit dizisi; primerler MV, MV433 (SEQ standart primerler kullanilarak Solvias AG (Basel) tarafindan belirlenir. Agir zinciri kodlayan cDNA, primer çiftleri MV/#265 (SEQ ID NO:16) ve MV kullanilarak amplifiye edilir. Primerler, agiz zincirin asagidaki amino pozisyonlarina karsilik gelen nükleotit dizilerini pozisyon +253l+259. Pozisyon +1, mat'ür proteinin birinci amino asitidir. Hafif zinciri kodlayan cDNA, primer çiftleri MV/#223 (SEO lD NO:19) ve MV kullanilarak amplifiye edilir. Primerler, hafif zincirin asagidaki amino pozisyonlarina karsilik gelen nükleotit dizilerini pozisyon +210/+215. Bu yaklasim, her bir immünoglobulin zinciri için iki bagimsiz PCR amplifikasyonunun yapilmasina imkan vermis ve bagimsiz olarak iki DNA dizisinin olusturulmasini saglamistir. Sonuçlar ve Tartisma sentezlenmesini saglayan klonlanmis PCR 'ürünleri, DNA dizileri belirlenerek karakterize edilir. Hafif ve agir zincir dizilerini birlestirmek 'üzere bes ve alti bagimsiz dizi kullanilir. Hafif zincir cDNA'Iarinin tamami aynidir ve tüm kodlayici diziyi kapsar (amino asit pozisyonu -20 -› +21 5). Agir zincir cDNA'Iari, her bir cDNA'da 2 farkli hatali eslesme sergiler. Bunlar, baslatma kodonundan, sabit domen 1'den (amino asit pozisyonu -19 -› +238) sonraki mentese bölgesinin sonuna kadar uzanan son diziden çikarilir. Her iki hibridomaya yönelik diziler aynidir. Hibridoma 110-28'den elde edilen cDNA seçilir ve diger tüm ekspresyon çalismasi için kullanilir. SEO ID No:7 (AlN457 agir zinciri cDNA'si), SEQ ID No:8 (AlN457 agir zincir amino asit dizisi), SEQ ID No:9 (AlN, AIN457'nin hafif ve agir zincirinin sentezlenmesini saglayan DNA dizisi ile birlikte protein dizisini ve PCR amplifikasyonu ve DNA dizi belirlemesi için kullanilan primerlerin pozisyonunu gösterir. DNA dizileri, PlasNova kapsaminda agir zincir için erisim numarasi cDNA klonlamasi ile bulunan amino asit dizisi, aritilan imm'unoglobulin agir ve hafif zincirlerin Edman yikimi ile önceden elde edilmis olanla özdestir ve dogru cDNA'nin klonlanmis oldugunu gösterir. Tablo 10: Hafif zincirin nükleotit ve amino asit dizisi Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama için kullanilan oligonükleotit primerleri gösterilir (alti i›_: î"'f..; L`- ..L "'.. ., I. J- ~ i`. v'i &find-,AL 7` In i i_ EPJQA91LLIYGASSPAIIZI Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama için kullanilan oligonükleotit primerleri gösterilir (alti °D=7SGSI`=Ç`D=`"`ISÄL EE'EDI'AVYYC'QQYJSEP'I'IF Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama için kullanilan oligonükleotit primerleri gösterilir (alti Tablo 11: Agir zincirin nükleotit ve amino asit dizisi Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama ve dizi belirleme için kullanilan oligonükleotit primerleri gösterilir. Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama ve dizi belirleme için kullanilan oligonükleotit primerleri gosterilir. t\QLVL:GSG. QP'S'SCLPL E"AASG}'IFE.\`(VHHV HER UE'-'.'.|ERI'TIE-EDNA!SSL`I LQHSELE'EEDIATI!53'sz Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama ve dizi belirleme için kullanilan oligonükleotit primerleri gösterilir. - 1 ~ 3 = - . Degisken domenin sentezlenmesini saglayan amino asit dizisi kalin ve alti çizili sekilde vurgulanir. Klonlama ve dizi belirleme için kullanilan oligonükleotit primerleri gosterilir. "81 --- "8.5 Ornek 4: Anti insan lL-17A monoklonal AIN457 antikoruna ait Fab fragmaninin üç boyutlu yapisi Komplementerlik belirleyici bölgelerin (CDR) konformasyonunu ve AIN457'nin antijen baglayici pozisyonuna ait yapiyi belirlemek amaciyla Fab fragmani üretilir, kristalize edilir ve X-isini yapisi, protein kristalografi çalismasi ile belirlenir. Metot: NVP-AIN457'nin Fab fragmani, tam antikorun papain bölünmesiyle üretildi ve önce protein A kromatografii akabinde büyüklükçe ayirma kromatografisi ile saflastirildi. Saflastirilan materyal daha sonra 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 25 mM NaCl, 5 mM TCEP içerisinde ultra-filtrasyon yoluyla 20 mg/ml seviyesine konsantre edilir. Kristaller, kullanilarak asili damlalarda 19°C'de buhar difüzyon teknigi ile büyütülür. Bu kristaller, a=90.3A, asimetrik ünitede 2 Fab molekülü vardir. X-ray verileri toplanmadan önce AIN457 MES (pH 6.5) içeren bir çözeltiye aktarilir. Söz konusu kristal daha sonra bir cryo-loop içerisine takilir ve verilerin toplanmasi için 95K'de ani olarak dondurulur. Her biri 1.0 derece osilasyona karsilik gelen 180 kirinim görüntüsü kaydedilir. Kirinim verileri, HKL program paketi ile islemden geçirilir. Moleküler replasman yoluyla yapi, 2.5Ä çözünürlüginde belirlenir. Bu yapi daha sonra torsiyon açi dinamikleri ve enerji minimizasyonu üzerinden CNX programi kullanilarak rafine edilir. Sonuçlar: Kristalin asimetrik ünitesinde iki AlN457 Fab molekülü bulunur ve her iki Fab molekülünün H-CDR3 ilmegi, simetrik olarak ilgili Fab'lerin H-CDRB ilmegi ile proteinler arasi temas süreçlerine katilir. Iki Fab molekülü farkli dirsek açilari sergiler, ancak diger yönlerden esasen ayni CDR ilmek konformasyonlarina sahiplerdir (CDR kanonik yapisina gelirken, H-CDR2 ilmeginin konformasyonu, kanonik H2:3A yapisininki ile eslesir. AIN457 antikorunun H-CDR3 ilmegi son derece uzundur ve Kabat pozisyonlari 94 (Arg H98) ve arasinda 18 rezidü ihtiva eder. 94. pozisyondaki Arg yan zinciri ile H101. pozisyondaki Asp karboksilat grubu arasindaki bir tuz köprüsü ile ve Trp H117 yan zinciri ve Phe H114 ana zincir karbonil grubu arasindaki H-bagli etkilesim ile stabilize olan tipik t'umsekli torso yapisini sergiler. H- CDR3 ilmeginin basi, uzun ve burulmus bir beta firkete yapisina sahiptir ve kendi tabaninda bir ikinci beta tümsekligi ve kendi tepesinde bir tip I' beta kivrimi bulunur. AIN457 H-CDR3 ilmeginin çarpici bir özelligi, aromatik rezid'uler bakimindan çok yüksek bir içerige sahip olmasidir: 6 tirosin, 2 triptofan, 1 fenilalanin. Diger tüm CDR ilmekleri birer tirozin daha katki sagladigindan, AlN457'nin antijen birlestirici pozisyonu toplam olarak 11 tirozine sahiptir. L-CDR1 ve L-CDR2 ilmeklerinin konformasyonlari, sirasiyla kanonik L116 ve L2:1 yapilarina karsilik gelir. H-CDR3'ün aksine L-CDR3 ilmegi kisadir (6 rezid'u) ve yaygin olarak gözlenen kanonik L3:1 yapisini gösterir; kendi ucunda bir cis-prolin (Pro L96), Kabat pozisyonu 90'da bir glutamin (Gln L91) ve Kabat pozisyonu 97'de bir treonin (Thr L98) bulunur. Ancak AIN457 L-CDRS ilmeginin çok sira disi bir özelligi, cis-prolin (Cys L97) rezid'us'unden sonra bir sistein rezidüsünün bulunmasidir. Cys L97'nin yan zinciri, VL-VH ara yüzünde bulunan sig bir girintinin tabaninda bulunur ve Trp H112, Trp H47 ve Tyr L92 rezid'üleri ile siralanir. Hafif zincir o L-CDR1 Kabat tanimi R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A Chothia/ X-ray tanimi R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A o L-CDR2 Kabat tanimi G-A-S-S-R-A-T Chothia/ X-ray tanimi G-A-S-S-R-A-T o L-CDR3 Kabat tanimi Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T Chothia/ X-ray tanimi Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T Agir zincir o H-CDR1 Kabat tanimi N-Y-W-M-N Chothia/ X-ray tanimi G-F-T-F-S-N-Y-W-M-N o H-CDR2 Kabat tanimi A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y-V-G-S-V-K-G Chothia! X-ray tanimi A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y o H-CDR3 Kabat tanimi D-Y-Y-D-l-L-T-D-Y-Y-l-H-Y-W- Chothia/ X-ray tanimi C-V-R-D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W- Y-F-D-L-W-G Tablo 1: Kabat tanimi esasinda ve Chothia ve arkadaslarinin yaklasimi kullanilarak X- ray analizi ile belirlendigi 'üzere AIN457 monoklonal antikorlarina ait hiper degisken bölgelerin amino asit dizileri. Kalin olarak vurgulanan amino asit, CDR ilmeklerinin bir parçasi olur iken, düz stilde gösterilenler antikor çatisinin parçalaridir. DIZI LISTESI <110 Novartis AG <120 Organik Bilesik <160 23 <170 Patentln sürüm 3.2 <210 1 <211 5 <212 PRT <213 yapay <220 <223 AIN457'nin CDR1 bölgesi <220 <221 DOMEN <222 (1) .. (5) <223 CDR1 = AIN457 agir zincirinin hiper degisken bölgesi 1 <400 1 <210 2 <211 17 <212 PRT <213 yapay <220 <223 AIN457'nin CDR2 bölgesi <220 <221 DOMEN <222 (1)..(17) <223 CDR2 = AIN457 agir zincirinin hiper degisken bölgesi 2 <400 2 Ala Ile Aan Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val Lys 1 5 10 15 <210 3 <21118 <212 PRT <213 yapay <220 <223 AIN457'nin CDR3 bölgesi <220 <221 DOMEN <222 (1) .. (18) <223 CDR3 = AIN457 agir zincirinin hiper degisken bölgesi 3 <400 3 Asp Tyr Ty: Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp Tyr Phe 1 5 10 15 <210 4 <211 12 <212 PRT <213 yapay <220 <220 <221 DOMEN <222 (1)..(12) <223 CDR1' = AIN457 hafif zincirinin hiper degisken bölgesi 1 <4004 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala <210 5 <211 7 <212 PRT <213 yapay <220 <220 <221 DOMEN <222 (1) .. (7) <223 CDR2' = AIN457 hafif zincirinin hiper degisken bölgesi 2 <400 5 <210 6 <211 9 <212 PRT <213 yapay <220 <220 <221 DOMEN <222 (1) .. (9) <223 CDRS' = AIN457 hafif zincirinin hiper degisken bölgesi 3 <400 6 Gln Gln Ty: Gly Ser Ser Pro Cys Thr <210 7 <211 381 <212 DNA <213 Homo sapiens <220 <221 CDS <222 (1) .. (381) <223 AIN457 agir zincir domeninin DNA'si <400 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Liu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asu Ty: 25 30 Trp Met Asu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45 Ala Ala Ile Aan Gln Asp Gly Ser Glu Lya Ty: Tyr Val Gly Ser Val 50 55 60 Lya Gly Arg Ph. Thr Ile Ser Arg Asp Ana Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Ty: Ty: Cys 85 90 95 Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Lou Thr Asp Ty: Tyr Ile His Tyr Trp 100 105 110 Tyr Phe Asp ben Trp Gly Arg Gly Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210 8 <211 127 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly <210 9 <211 327 <212 DNA <213 Homo sapiens <220 <221 CDS <222 (1) .. (327) <223 AIN457 hafif zincirine ait degisken kismin DNA'si <400 9 <210 10 <211 109 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Lou Ser Cys Arg Ala Ser Gln Sor Val Ser Ser Ser 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 40 45 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Gln Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Cys Thr Pho Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210 11 <211 10 <212 PRT <213 yapay <220 <223 AIN457'nIn CDR1-X bölgesi <220 <221 DOMEN <222 (1) .. (10) <223 CDR1-x = AIN457 agir zincirinin hiper degisken bölgesi x <400 11 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn <210 12 <211 11 <212 PRT <213 yapay <220 <223 AIN457'nin CDRz-x bölgesi <220 <221 domen <222 (1) .. (11) <223 CDR2-x = AIN457 agir zinciri x'in hiper degisken bölgesi <400 12 Ala Ile Aan Gln Asp Gly Ser Glu Lys 'ryr Tyr <210 13 <211 23 <212 PRT <213 yapay <220 <223 AIN457'nin CDR3-x bölgesi <220 <221 domen <222 (1) .. (23) <223 CDR3-x = AIN457 agir zincirinin hiper degisken bölgesi x <400 13 Cys Val Arg Asp Ty: Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr 1 5 10 15 Trp 'ryr Phe Asp Leu Trp Gly <210 14 <211 20 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirini klonlamaya yönelik primer <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (20) <223 MV432 <400 14 <210 15 <211 20 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirini klonlamaya yönelik primer <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (20) <223 MV433 <400 15 <210 16 <211 20 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirini klonlamaya yönelik primer <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (20) <223 MV434 <400 16 <210 17 <211 20 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirini klonlamaya yönelik primer <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (20) <223 MV435 <400 17 <210 18 <211 24 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirinin PCR'si <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (24) <223 MV416 <400 18 <210 19 <211 26 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirinin PCR'si <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (26) <223 #265 <400 19 <210 20 <211 21 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 agir zincirinin PCR'si <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (21) <223 MV418 <400 20 <210 21 <211 24 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 hafif zincirinin PCR'si <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (24) <223 MV417 <400 21 <210 22 <211 22 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 hafif zincirinin PCR'si <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (22) <223 #223 <400 22 <210 23 <211 21 <212 DNA <213 yapay <220 <223 AIN457 hafif zincirinin PCR'si <220 <221 primer_bind <222 (1) .. (21) <223 MV419 <400 23 AIN457 Fab'nin X-ray yapisi AIN457 Fab'ye ait degisken domenin, komplementerlik belirleyici bölgelerin vurgulandigi yakindan görünüsü (CD izi). AIN457'nin antijen birlestirici pozisyonunun tirozin rezidüleri bakimindan son derece zengin oldugunu göstermek bakimindan, CDR ilmeklerinin sagladigi tüm tirozin yan zincirleri gösterilir. Cys L97'nin VL-VH arayüzündeki yan zinciri de gösterilir (ok). H-CDR3 ilmegi AIN457 Fab'nin X-ray yapisi, genel bakis AIN457 Fab'nin Van der Waals yüzey sunumu. Hafif ve agir zincir, sirasiyla açik ve koyu gri olarak renklendirilir. CDR ilmekleri, farkli renklerde vurgulanir. Antikora ait antijen birlestirici pozisyondan çikinti yapan H-CDR3 ilmeginin varligina dikkat edilmelidir. TR

Claims

1.ISTEMLER Enflamatuar artrit tedavisinde kullanilmaya yönelik olarak, hem agir (VH) hem de hafif zincir (VL) degisken domenleri içeren bir lL-17 baglayici antikor veya bu antikorun bir fragmani olup, bahsedilen IL-17 baglayici antikor veya bu antikorun fragmani, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içermektedir: sirali olarak hiper degisken CDR1, CDR2 ve CDR3 bölgelerini içeren ve bahsedilen CDR1 bölgesinin SEQ ID No:1 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2 bölgesinin SEQ ID No:2 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3 bölgesinin ise SEQ ID No:3 amino asit dizisine sahip oldugu ve hiper degisken bölgelerin Kabat tanimina uygun oldugu bir VH; veya sirali olarak hiper degisken CDR1-x, CDR2-x ve CDR3-x bölgelerini içeren ve bahsedilen CDR1-x bölgesinin SEO ID NO:11 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2-x bölgesinin SEQ ID NO:12 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDRS-x bölgesinin ise SEQ lD NO:13 amino asit dizisine sahip oldugu ve hiper degisken bölgelerin Chothia tanimina uygun oldugu bir VH; ve sirali olarak hiper degisken CDR1', CDR2' ve CDR3' bölgelerini içeren ve bahsedilen CDR1' bölgesinin SEQ ID No:4 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2' bölgesinin SEQ ID No:5 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3' bölgesinin ise SEQ ID No:6 amino asit dizisine sahip oldugu ve hiper degisken bölgelerin Kabat tanimina uygun oldugu bir VL. 1. Istemde tanimlanan kullanima yönelik lL-17 baglayici antikor veya bunun bir fragmani olup bu antikor, bir insan antikoru olmaktadir. 1. Istemde veya 2. Istemde tanimlanan kullanima yönelik lL-17 baglayici antikor veya bunun birfragmani olup, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içerir: 1. pozisyondaki amino asit ile baslayacak ve 127. pozisyondaki amino asit ile sonlanacak sekilde, SEQ ID NO:8 içinde gösterilen amino dizisine sahip bir birinci domen; veya b. 1. pozisyondaki amino asit ile baslayacak ve 127. pozisyondaki amino asit ile sonlanacak sekilde, SEQ ID No:8 içinde gösterilen amino dizisine sahip bir birinci domen ve 1. pozisyondaki amino asit ile baslayacak ve 109. pozisyondaki amino asit ile sonlanacak sekilde, SEQ ID NO:10 içinde gösterilen amino dizisine sahip bir ikinci domen. 4. Onceki istemlerin herhangi birinde tanimlanan kullanima yönelik lL-17 baglayici antikor veya bu antikorun bir fragmani olup bu antikor, asagida sayilanlari ihtiva eden bir insan lgG1/K antikorudur: (a) Tablo 10 içerisinde +1 rezidüsünde baslayan amino asit rezid'ulerinden olusan bir hafif zincir (b) Tablo 11 içerisinde +1 rezidüsünde baslayan amino asit rezidülerinden olusan bir agir zincir R('i'l`[ VTVSSASTKGPSVI'PI :\PSSKSTS(;(ET l`P-'\\"I 05%(51 Ysi SSVVTVPSRSI (jTQTYIfI 5. Hem agir (VH) hem de hafif zincir (VL) degisken domenleri içeren bir lL-17 baglayici antikorun veya bu antikorun birfragmaninin, ankilozan spondilit tedavisine yönelik bir ilacin 'üretimi için kullanimi olup, burada bahsedilen IL-17 baglayici antikor veya bu antikorun fragmani, asagida sayilanlari ihtiva eden en az bir adet antijen baglayici pozisyon içermektedir: sirali olarak hiper degisken CDR1, CDR2 ve CDR3 bölgelerini içeren ve bahsedilen CDR1 bölgesinin SEQ ID No:1 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2 bölgesinin SEQ ID No:2 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3 bölgesinin ise SEQ ID No:3 amino asit dizisine sahip oldugu ve hiper degisken bölgelerin Kabat tanimina uygun oldugu bir VH; veya sirali olarak hiper degisken CDR1-x, CDR2-x ve CDR3-X bölgelerini içeren ve bahsedilen CDR1-x bölgesinin SEQ ID NO:11 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2-x bölgesinin SEQ ID NO:12 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3-x bölgesinin ise SEQ lD NO:13 amino asit dizisine sahip oldugu ve hiper degisken bölgelerin Chothia tanimina uygun oldugu bir VH; ve sirali olarak hiper degisken CDR1', CDR2' ve CDR3' bölgelerini içeren ve bahsedilen CDR1' bölgesinin SEO lD No:4 amino asit dizisine sahip oldugu, bahsedilen CDR2' bölgesinin SEQ ID No:5 amino asit dizisine sahip oldugu ve bahsedilen CDR3' bölgesinin ise SEQ ID No:6 amino asit dizisine sahip oldugu ve hiper degisken bölgelerin Kabat tanimina uygun oldugu bir VL. 6. 5. Istemde tanimlanan bir IL-17 baglayici antikorun veya bu antikorun bir fragmaninin kullanimi olup, burada bahsedilen antikor, asagida sayilanlari ihtiva eden bir insan lgG1/K antikoru olmaktadir: Tablo 10 içerisinde +1 rezidüsünde baslayan amino asit rezid'ulerinden olusan bir hafif zincir TR