NO337129B1

NO337129B1 - IL-17 bindende antistoff for anvendelse ved behandling av psoriasis artritt

Info

Publication number: NO337129B1
Application number: NO20150065A
Authority: NO
Inventors: Hermann Gram; Franco E Di Padova; Hans Hofstetter; Margit Jeschke; Jean-Michel Rondeau; Wim Van Den Berg
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2016-01-25
Also published as: BE2015C041I2; PT2366405E; BRPI0513078C1; TR201808057T4; NO348010B1; KR20070036166A; EP2902039A1; BRPI0513078B1; SI2364729T1; ES2677245T3; CA2573586C; HRP20181069T1; CY1116256T1; NO20151787L; EP3409288A1; PL2364729T6; TNSN07034A1; TW200617025A; CN101001645A; BRPI0513078A

Description

Denne oppfinnelsen er relatert til et IL-17 bindende antistoff for anvendelsen ved behandlingen av den IL-17 medierte sykdommen psoriasis artritt.

IL-17, en T-celle derivert cytokin til stede f.eks. reumatoid artritt (RA), virker som et pro-inflammatorisk cytokin, spesielt i forbindelse med IL-1 og TNF-oc (Chabaud M & Miossec P (1999), Arthritis Rheu 42. 963-970; Awane M et al (1999) J. Immunol 162, 5337-5344). IL-17 induserer MMP produksjon og nedregulerer TIMP (Jovanovic DV et al (2001) J: Rheumatol. 28, 712-718), og blokkering av IL-1 og IL-17 har en synergistisk effekt på inflammasjon og bendestruksjon in vivo (Chabaud M & Miossec

(2001) Arthritis Rheum 44, 1493-1303). Uhensiktsmessig eller forhøyet produksjon av IL-17 er assosiert med patologien av ulike sykdommer og lidelser, slik som reumatoid artritt (Witowski et al., 2004 Cell Mol Life Sei 61:567-579), osteoartritt, tap av benimplantater, akutt transplantasjonsavstøtning (Antonysamy et al. 1999, J Immunol 162, 577-584; van Kooten et al., 1998, J Am Soc Nephrol 9, 1526-1534) septikemi, septisk eller endotoksisk sjokk, allergier, astma (Molet et al., 2001, J. Allergy Clin Immunol 108, 430-438, bentap psoriasis (Teunissen et al., 1998, J. Invest Dermatol 111,645-649, iskemi, systemisk sklerose (Kurasawa et al., 2000, Arthritis Rheum 43, 2455-2463), slag og andre inflammatoriske lidelser. Antistoffer til IL-17 har blitt foreslått for anvendelse i behandlingen av IL-17 medierte sykdommer og lidelser; se f.eks. WO 95/18826 og diskusjonen i introduksjonen derav. WO 02/058717 beskriver fremgangsmåter for å behandle pattedyr som har revmatoid artritt ved administrering av en løselig form av IL-17 reseptoren.

Vi har nå fremstilt forbedrede antistoffer mot humant IL-17 egnet for anvendelse i behandlingen av IL-17 medierte sykdommer og lidelser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer IL-17 bindende antistoff eller fragment derav som omfatter både tung (Vh) og lett kjede (Vl) variable domener for anvendelse ved behandling av psoriasis artritt; der nevnte IL-17 bindende antistoff eller fragment derav omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter: a) et Vrsom omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1, CDR2 og CDR3, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 2, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEG ID nr. 3, der nevnte hypervariable regioner er i hht Kabat-definisjonen; eller

et Vh som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x, CDR2-X og CDR3-X, nevnte CDRl-x har aminosyresekvensen SEG ID nr. 11, nevnte CDR2-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 12 og nevnte CDR3-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 13, der nevnte hypervariable regioner er i hht Chothia-definisjonen; og

b) et Vlsom omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte

CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6.

I en utførelsesform er det IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse ifølge oppfinnelsen et humant antistoff.

I en annen utførelsesform omfatter det IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse ifølge oppfinnelsen minst et antigenbindende sete som omfatter enten: a) Vh som har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 8;

b) et Vlsom har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 10; eller

c) et Vh som har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 8 og et Vlsom har en

aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 10.

I en ytterligere utførelsesform er det IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse ifølge oppfinnelsen tilsiktet ko-administrert, samtidig eller i sekvens, med minst en annen medikamentsubstans valg fra gruppen bestående av immunsuppressive midler, immunmodulerende midler, anti-inflammatoriske midler, kjemoterapeutiske midler eller anti-infeksiøse midler.

I en ytterligere utførelsesform er det IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse ifølge oppfinnelsen tilsiktet ko-administrert, samtidig eller i sekvens, med gullsalter, supfasalazin, antimalariamedisiner, metotreksat, D-penicillamin, azatioprin, mycofenolsyre, syklosporin A, tacrolimus, sirolimus, minocylclin, leflunomid, glukokortikoider; en kalsineurin inhibitor; en modulator av lymfocytt resirkulering, f.eks. FTY720 og FTY720-analoger; en mTOR inhibitor, f.eks. rapamycin, 40-O-(2-hydroksyetyl)-rapamycin, CCI779, ABT578, AP23573, eller TAFA-93; et ascomycin som har immunsuppressive egenskaper, f.eks. ABT-281, ASM981, etc; kortikosteroider; syklofosfamid; leflunomid; mizoribin; mykofenolsyre; mykofenolat-mofetil; 15-deoksyspergualin.

Med mindre annet er indikert er enhver polypeptidkjede her beskrevet ved å ha en aminosyresekvens som starter med den N-terminale enden og slutter ved den C-terminale enden. Når det antigenbindende setet omfatter både Vh og Vldomenene kan disse være lokalisert på det samme polypeptidmolekylet, eller hvert domene kan fortrinnsvis være på en forskjellig kjede, hvor Vh domenet blir del av en immunglobulin tung kjede eller fragment derav og Vlblir del av en immunglobulin lett kjede eller fragments derav.

Ved "IL-17 bindende molekyl" menes det ethvert molekyl som er i stand til å binde til IL-17 antigenet enten alene eller assosiert med andre molekyler. Bindingsreaksjonen kan bli vist ved standard fremgangsmåter (kvalitative tester) som for eksempel inkluderer en bindingstest, konkurrerende test eller bioassay for å bestemme inhiberingen av IL-17 binding til dets reseptor eller enhver type av bindingstester, med referanse til en negativ kontrolltest hvor et antistoff av ikke-relatert spesifisitet, men av den samme isotypen, f.eks. et anti-CD25 antistoff, er benyttet (se også eksempel 1).

Eksempler på antigenbindende molekyler inkluderer antistoffer som produsert ved B-celler eller hybridomer og kimærer, CDR-podete eller humane antistoffer eller ethvert fragment derav, f.eks. F(ab')2og Fab fragmenter, så vel som enkelkjede eller enkeldomene antistoffer.

Et enkelkjede antistoff består av de variable domene av de tunge og lette kjedene av et antistoff kovalent bundet ved en peptidlinker vanligvis bestående av fra 10 til 30 aminosyrer, fortrinnsvis fra 15 til 25 aminosyrer. En slik struktur inkluderer derfor ikke den konstante delen av de tunge og lette kjedene og det er antatt at den lille peptidspaceren burde være mindre antigent enn en hel konstant del. Ved "kimært antistoff menes et antistoff hvor de konstante regionene av tunge og lette kjeder begge er av human opprinnelse, mens de variable domene av både tunge og lette kjeder er av ikke-human (f.eks. murin) opprinnelse eller av human opprinnelse, men derivert fra et forskjellig humant antistoff. Ved "CDR-podet antistoff menes et antistoff hvor de hypervariable regionene (CDR) er derivert fra et donorantistoff, slik som et ikke-humant (f.eks. murint) antistoff eller et forskjellig humant antistoff, mens alle eller hovedsakelig alle de andre delene av immunglobulinet, f.eks. de konstante regionene og de sterkt konserverte delene av de variable domenene, dvs. rammeverksregionene, er derivert fra et akseptorantistoff, for eksempel et antistoff av human opprinnelse, Et CDR-podet antistoff kan imidlertid inneholde noen få aminosyrer av donorsekvensen i rammeverksregionene, for eksempel i delene av rammeverksregionene tilstøtende de hypervariable regionene. Ved "humant antistoff menes det et antistoff hvor de konstante og variable regionene av både de tunge og lette kjedene alle er av human opprinnelse, eller hovedsakelig identiske til sekvenser av human opprinnelse, ikke nødvendigvis fra det samme antistoffet og inkluderer antistoffer produsert ved mus hvor de murine genene til immunglobulin variabel del og konstant del har blitt erstattet med deres humane motstykker, f.eks. som generelt beskrevet i EP 0546073 Blm USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, ISP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 Bl og EP 0 463151 Bl.

Spesielt foretrukne IL-17 bindende antistoffer ifølge oppfinnelsen er humane antistoffer, spesielt AIN457 antistoffet som heretter beskrevet i eksempel 1 og 2.

De foretrukne kimære antistoffer er derfor de variable domenene av både tunge og lette kjeder av human opprinnelse, for eksempel dem av AIN457 antistoffet som er vist i SEQ ID nr.: 10 (= variabelt domene av lett kjede, dvs. aminosyre 1 til 109 av SEQ ID nr.: 10) og SEQ ID nr. 8 (= variabelt domene av tung kjede, dvs. aminosyre 1 til 127 av SEQ ID nr. 8). Konstant region domene omfatter også fortrinnsvis egnede humane konstant region domener, f.eks. som beskrevet i "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

Hypervariable regioner kan være assosiert med enhver type av rammeverksregioner, selv om human opprinnelse er foretrukket. Egnede rammeverksregioner er beskrevet i Kabat E.A. et al, ibid. Foretrukne tung kjede rammeverk er et humant tung kjede rammeverk, f.eks. det av AIN457 antistoffet. Det består i sekvens av f.eks. FRI (aminosyre 1 til 30 av SEQ ID nr.: 8), FR2 (aminosyre 36 til 49 av SEQ ID nr.: 8), FR3 (aminosyre 76 til 98 av SEQ ID nr.: 8) og FR4 (aminosyre 117 til 127 av SEQ ID nr.: 8) regioner. Tatt i betraktning de bestemte hypervariable regionene av AIN457 ved røntgenanalyse, består et annet foretrukket tungkjederammeverk i sekvens av FRI-x (aminosyre 1 til 25 av SEQ ID nr.: 8), FR2-x (aminosyre 36 til 49 av SEQ ID nr.: 8), FR3-x (aminosyre 61 til 95 av SEQ ID nr.: 8) og FR4 (aminosyre 119 til 127 av SEQ ID nr.: 8) regioner. På en lignende måte består lett kjede rammeverket i sekvens av FRI'

(aminosyre 1 til 23 av SEQ ID nr.: 10), FR2' (aminosyre 36 til 50 av SEQ ID nr.: 10), FR3' (aminosyre 58 til 89 av SEQ ID nr.: 10) og FR4' (aminosyre 99 til 109 av SEQ ID nr.: 10) regioner.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter enten et første domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk med den vist i SEQ ID nr.: 8 som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 127 eller et første domene som beskrevet ovenfor og et andre domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk med den vist i SEQ ID nr.: 10, som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 109.

Monoklonale antistoffer frembragt mot et protein naturlig funnet i alle mennesker er vanligvis utviklet i et ikke-humant system, f.eks. i mus, og er derfor vanligvis ikke-humane proteiner. Som en direkte konsekvens av dette, fremkaller et xenogent antistoff som produsert ved en hybridom, når det administreres til et menneske, en uønsket immun respons som hovedsakelig er mediert ved den konstante delen av det xenogene immunglobulinet. Dette begrenser klart anvendelsen av slike antistoffer ettersom det ikke kan bli administrert over en lengre tidsperiode. Derfor er det spesielt foretrukket å benytte enkelkjede, enkeldomene, kimære, CDR-podete eller spesielt humane antistoffer som trolig ikke fremkaller en vesentlig allogen respons når det administreres til mennesker.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl beskrevet heri bli valgt fra et enkel kjede bindende molekyl som omfatter et antigenbindende sete som omfatter

a) et førte domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 eller direkte CDR ekvivalenter derav, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen

SEQ ID nr.: 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 2, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 3; og

b) et andre domene som omfatter hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3' eller direkte CDR' ekvivalenter derav, nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID

nr. 4, nevnte CDR 2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6; og

c) en peptidlinker som er bundet til den N-terminale enden av det førte domene og til den C-terminale enden av det andre domene eller til den C-terminale enden av det første

domene og den N-terminale enden av det andre domene.

Det er velkjent at mindre endringer i en aminosyresekvens slik som delesjon, tilføying eller substitusjon av en, noen få eller til og med flere aminosyrer føre til en allel form av det opprinnelige proteinet som hovedsakelig har identiske egenskaper.

Med betegnelsen "direkte CDR ekvivalenter derav" menes det derfor IL-17 bindende molekyler som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;, CDR2; og CDR3i(i stedet for CDR1, CDR2 og CDR3, hvor

(i) den hypervariable regionene CDRli er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1; og (ii) den hypervariable regionen CDR2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionene CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2; og (iii) den hypervariable regionen CDR3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR 3 som vist i SEQ ID nr. 3; og (iv) et slikt molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;,

CDR2;og CDR3ier i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM, (=30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

På liknende måte menes det ved betegnelse "direkte CDR-x ekvivalenter derav" IL-17 bindende molekyler som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRl;-x, CDR2;-x og CDR3i-x (i stedet for CDRl-x. CDR2-x og CDR3-x), hvor

(v) den hypervariable regionen CDRi-x er forskjellig ved 2, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDRl-x som vist i SEQ ID nr. 11; og (vi) den hypervariable regionene CDR2i-x er forskjellig fra 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR2-X som vist i SEQ ID nr. 12; og (vii) den hypervariable regionen CDR3;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR3-X som vist SEQ ID nr. 13; og (viii) et slikt molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRlj-x,

CDR2i-x og CDR3;-x er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (=30 ng/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 med mer, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

På liknende måte menes det med betegnelsen "direkte CDR' ekvivalenter derav" et domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRl';, CDR2'; og CDR3'i, hvor

(i) den hypervariable regionen CDR1'; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR1' som vist i SEQ ID nr. 4; og (ii) den hypervariable regionen CDR2'ier forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR2' som vist i SEQ ID nr. 5; og (iii) den hypervariable regionen CDR3'; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionene CDR3' som vist i SEQ ID nr. 6; og (iv) et slikt molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1';,

CDR2'iog CDR3'ier i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 mg/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl beskrevet heri være et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter minst en immunglobulin tungt kjede variabelt domene (Vh), som omfatter i sekvens

a) hypervariable regioner CDR1 (SEQ ID nr. 1), CDR2 (SEQ ID nr. 2) og CDR3 (SEQ ID nr. 3); eller b) hypervariable regioner CDR1;, CDR2;, CDR3;, nevnte hypervariable region CDR1; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1, nevnte hypervariable region CDR2;, er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2, og nevnte hypervariable region CDR3ier forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR3 som vist i SEQ ID nr. 3; og nevnte bindende IL-17 molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRlx, CDR2Xog CDR3Xer i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 ng/ml humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl med 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster. På liknende måte kan et IL-17 bindende molekyl beskrevet heri være et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter minst et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens a) hypervariabel region CDRl-x (SEQ ID nr. 11), CDR2-X (SEQ ID nr. 12) og CDR3-X (SEQ ID nr. 13); eller b) hypervariabel region CDRl;-x, CDR2i-x, CDR3i-x, nevnte hypervariable region CDRlj-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDRl-x som vist i SEQ ID nr. 11, nevnte hypervariable region CDR2;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR2-X som vist i SEQ ID nr. 12; og nevnte hypervariable region CDR3-X er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR3-X som vist i SEQ ID nr. 13; og nevnte bindende IL-17 molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRlj-x, CDR2i-x og CDR3j-x er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl med 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert av hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster. På liknende måte kan et IL-17 bindende molekyl beskrevet heri være et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter minst et immunglobuling lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens a) hypervariable regioner CDR' 1 (SEQ ID nr. 5), CDR'2 (SEQ ID nr. 5) og CDR'3 (SEQ ID nr. 6); eller b) hypervariable regioner CDR'1;, CDR'2;, CDR'3;, nevnte hypervariable region CDR'I; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den

hypervariable regionen av CDR' 1 som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte hypervariable region CDR'2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR'2 som vist i SEQ ID nr. 5; og nevnte hypervariable region CDR'3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR'3 som vist i SEQ ID nr. 6; og nevnte bindende IL-17 molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR'l;, CDR'2; og CDR'3; er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl med 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl beskrevet heri være et IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (Vh) og lett kjede (Vl) variable domener og nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1 (SEQ ID nr. 1), CDR2 (SEQ ID nr. 2) og CDR3 (SEQ ID

nr. 3); og

et immunglobulin lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1'(SEQ ID nr. 4), CDR2' (SEQ ID nr. 5), og CDR3' (SEQ ID nr. 6); eller

b) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1;, CDR2; og CDR3;, nevnte hypervariable region CDR1; er

forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionene av CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1, nevnte hypervariable region CDR2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2; og nevnte hypervariable region CDR3ier forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionene av CDR3 som vist i SEQ ID nr. 3; og

et immunglobulin, lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1';, CDR2';, CDR3';, nevnte hypervariable region CDR'1; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra de hypervariable regionen av CDR' 1 som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte hypervariable region CDR'2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'2 som vist i SEQ ID nr. 5; og nevnte hypervariable region CDR'3; er

forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'3 som vist i SEQ ID nr. 6; og

nevnte bindende IL-17 molekyl definert i b) som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;, CDR2i, CDR3i, CDR'1;, CDR'2; og CDR'3; er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (=30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl med 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet ble målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl beskrevet heri være et IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (Vh) og lett kjede (VL) variable domener og nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter et antigenbindende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung kjede variabel domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x (SEQ ID nr. 11), CDR2-X (SEQ ID nr. 12) og CDR3-X

(SEQ ID nr. 13); og

et immunglobulin lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1' (SEQ ID nr. 4), CDR2'(SEQ ID nr. 5), og CDR3' (SEQ ID nr. 6; eller

b) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl;-x, CDRl;-x og CDR3;-x, nevnte hypervariable region

CDRli-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDRl-x som vist i SEQ ID nr. 11, nevnte hypervariable region CDR2;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR2-X som vist i SEQ ID nr. 12; og nevnte hypervariable region CDR3;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR3-X som vist i SEQ ID nr. 13; og et immunglobulin lett kjede variabelt domen (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1';, CDR2';, CDR3';, nevnte hypervariable region CDR'1; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'1 som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte hypervariable region CDR'2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'2 som vist i SEQ ID nr. 5; og nevnte hypervariable region CDR'3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'3 som vist i SEQ ID nr. 6; og

nevnte bindende IL-17 molekyl definert i b) som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;, CDR2;, CDR3;, CDR'1;, CDR'2; og CDR'3; er i stand til å inhibere

aktiviteten av 1 nM (=30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl med 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert av hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Inhiberingen av bindingen av IL-17 til dets reseptor kan hensiktsmessig bli testet i ulike tester som inkluderer slike tester som er beskrevet senere i teksten. Med betegnelsen "i den samme utstrekning" menes det at referansen og de ekvivalente molekylene viser, på et statistisk grunnlag, hovedsakelig identisk IL-17 inhibitorisk aktivitet i en av testene referert til her (se eksempel 1). For eksempel har IL-17 bindende molekyler beskrevet heri vanligvis IC50for inhiberingen av humant IL-17 på IL-6 produksjon indusert ved et humant IL-17 i humane dermale fibroblaster som er innenfor +/-x5, dvs. under 10 nM, mer foretrukket 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 eller 2 nM av den av, fortrinnsvis hovedsakelig den samme som, IC50av det korresponderende referansemolekylet når testet som beskrevet i eksempel 1.

Alternativt kan testen benyttet være en test for konkurrerende inhibering av binding av IL-17 ved løselige IL-17 reseptorer (f.eks. de humane IL-17 R/Fc konstruksjonene ifølge eksempel 1) og de IL-17 bindende molekylene ifølge oppfinnelsen.

Mest foretrukket omfatter det humane IL-17 antistoffet minst

a) en tung kjede som omfatter et variabelt domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk med den vist i SEQ ID nr. 8 som starter med aminosyren ved

posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 127 og den konstante delen av en human tung kjede; og

b) en lett kjede som omfatter et variabelt domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk med den vist i SEQ ID nr. 10 som starter med aminosyren ved

posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 109 og den konstante delen av en human lett kjede.

Den konstante delen av en human tung kjede kan være yi, j2,73,Y4, u, ai,0C2, 5 eller s typen, fortrinnsvis av y typen, mer foretrukket av yi typen, imens den konstante delen av en human lett kjede kan være av k eller X typen, (som inkluderer Xi, X2og X3subtypene), men er fortrinnsvis av k typen. Aminosyresekvensene til alle disse konstante delene er gitt i Kabat et al (supra).

Konjugater av bindingsmolekylene ifølge oppfinnelsen, f.eks. enzym eller toksin eller radioisotopkonjugater, er også inkludert innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Om ikke spesifisert på annen måte heri, inkluderer "polypeptid" ethvert peptid eller protein som omfatter aminosyrer sammenføyet til hverandre ved peptidbindinger, som har en aminosyresekvens som starter ved den N-terminale enden og slutter ved den C-terminale enden. Fortrinnsvis er polypeptidet ifølge den foreliggende oppfinnelsen en monoklonalt antistoff, mer foretrukket er det et kimært (også kalt V-podet) eller humanisert (også kalt CDR-podet) monoklonalt antistoff, mest foretrukket et fullstendig humant antistoff oppnåelig f.eks. ved teknologien eksemplifisert i eksempel 1. Det humaniserte (CDR-podete) eller fullstendige humane monoklonale antistoffet kan eller behøver ikke inkludere ytterligere mutasjoner introdusert i rammeverks (FR) frekvensene av akseptorantistoffet.

Et funksjonelt derivat av et polypeptid som benyttet her inkluderer et molekyl som har en kvalitativ biologisk aktivitet til felles med et polypeptid ifølge den foreliggende oppfinnelsen, dvs. har evnen til å binde til humant IL-17. Et funksjonelt derivat inkluderer fragmenter og peptidanaloger av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Fragmenter omfatter regioner innenfor sekvensen av et polypeptid i henhold til den forliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Betegnelsen "derivat" er benyttet for å definere aminosyresekvensvarianter, og kovalente modifikasjoner av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. De funksjonelle derivatene av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens, f.eks. av den hypervariable regionen av den lette og tunge kjeden, har fortrinnsvis minst omkring 65%, mer foretrukket minst omtrent 75%, mer foretrukket minst omkring 85%, mest foretrukket minst omkring 95, 96, 97, 98, 99% total sekvenshomologi med aminosyresekvensen av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, for eksempel av en spesifisert sekvens, og beholder hovedsakelig evnen til å binde humant IL-17 eller f.eks. nøytralisere IL-6 produksjon av IL-17 induserte humane dermale fibroblaster.

Betegnelsen "kovalent modifikasjon" inkluderer modifikasjoner av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens; eller et fragment derav med et organisk proteinaktig eller ikke-proteinaktig derivatiserende middel, fusjoner til heterologe polypeptidsekvenser, og post-translasjonelle modifikasjoner. Kovalent modifiserte polypeptider, f.eks. av en spesifisert sekvens, har fortsatt evnen til å binde humant IL-17 eller f.eks. nøytralisere IL-6 produksjon av IL-17 induserte humane dermale fibroblaster ved kryssforbinding. Kovalente modifikasjoner er tradisjonelt introdusert ved å reagere målrettede aminosyreresiduer med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å reagere med valgte sider eller terminale residuer eller ved å utnytte mekanismer av post-translasjonelle modifikasjoner som virker i valgte rekombinante vertsceller. Enkelte post-translasjonelle modifikasjoner er resultatet av virkningen av rekombinante vertsceller på det uttrykte polypeptidet. Glutaminyl og asparaginyl residuer er hyppig post-translasjonelt deamiert til de korresponderende glutamyl og aspartyl residuene. Alternativt er disse residuene deaminert under mildt sure betingelser. Andre post-translasjonelle modifikasjoner inkluderer hydroksylering av prolin og lysin fosforylering av hydroksylgrupper av seryl, tyrosin eler treonyl residuer, metylering av a-aminogruppene i lysin, arginin og histidin sidekjeder, se f.eks. T. E: Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, side 79-96 (1983). Kovalente modifikasjoner inkluderer f.eks. fusjonsproteiner som omfatter et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens og deres aminosyre sekvensvarianter, slik som immunadhesiner og N-terminale fusjoner til heterologe signalsekvenser.

"Homologi" med hensyn på et nativt polypeptid og dets funksjonelle derivat er definert her som prosentandelen av aminosyre residuer i kandidatsekvensen som re identiske med residuene av et korresponderende naturlig polypeptid, etter oppstilling av sekvensene og ved å introdusere åpninger, om nødvendig, for å oppnå den maksimale prosentandelen homologi, og ved ikke å betrakte noen konservative substitusjoner som del av sekvensidentiteten. Verken N- eller C-terminale forlengelser eller innsettinger skal bli oppfattet som å redusere identitet eller homologi. Fremgangsmåter computerprogrammer for oppstillingen er godt kjent.

"Aminosyre(er)" refererer f.eks. til alle naturlig forekomne L-oc-aminosyrer, og inkluderer D-aminosyrer. Aminosyrene er identifisert ved enten de velkjente enbokstavs- eller trebokstavsbetegnelsene.

Betegnelsen "aminosyresekvensvariant" refererer til molekyler med noen forskjeller i deres aminosyresekvenser sammenliknet med et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Aminosyresekvensvarianter av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens, har fortsatt evnen til å binde humant IL-17 eller f.eks. nøytralisere IL-6 produksjon av IL-17 induserte humane dermale fibroblaster. Substitusjonsvarianter er dem som har minst en aminosyreresidue fjernet og en forskjellig aminosyre satt inn ved dens plass med den samme posisjonen i et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Disse substitusjonene kan være enkle, hvor bare en aminosyre i molekylet har blitt substituert, eller de kan være multiple, hvor to eller flere aminosyrer har blitt substituert i det samme molekylet. Innsettingsvarianter er dem med en eller flere aminosyrer satt inn direkte tilstøtende til en aminosyre ved en bestemt posisjon i et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Direktetilstøtende til en aminosyre betyr forbundet til enten den oc-karboksy- eller oc-aminofunksjonelle gruppen av aminosyren. Delesjonsvarianter er dem der en eller flere aminosyrer i et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens, er fjernet. Vanligvis har delesjonsvarianter en eller to aminosyrer deletert i en bestemt region av molekylet.

Et IL-17 bindende molekyl ifølge oppfinnelsen kan bli produsert ved rekombinante DNA teknikker. I lys av dette må ett eller flere DNA molekyler som koder for bindingsmolekylet bli konstruert, plassert under hensiktsmessige kontrollsekvenser og overført inn i en egnet vertsorganisme for ekspresjon.

På en veldig generell måte beskrives

(i) DNA molekyler som kode for et enkel kjede IL-17 bindende molekyl ifølge oppfinnelsen, et IL-17 bindende molekyl som omfatter en tung og lett kjede som definert her, eller fragmenter av et IL-17 bindende molekyl ifølge oppfinnelsen; og (ii) anvendelsen av DNA molekylene ifølge oppfinnelsen for produksjon av et IL-17 bindende molekyl ifølge oppfinnelsen ved rekombinante midler.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen et DNA molekyl som kode for et IL-17 bindende molekyl som beskrevet ovenfor.

Videre beskrives en DNA konstruksjon som omfatter et DNA molekyl som er hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 7 eller SEQ ID nr. 9.

Videre beskrives en DNA konstruksjon som omfatter to DNA molekyler hvor et er hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 7 og den andre hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 9.

Foreliggende status av fagfeltet er slik at den øvede arbeideren i fagfeltet er i stand til å syntetisere DNA molekylene ifølge oppfinnelsen gitt i informasjonen tilveiebrakt her, dvs. aminosyresekvensene av de hypervariable regionene og DNA sekvensene som koder for dem. En fremgangsmåte for å konstruere et variabeldomene gen er for eksempel beskrevet i EP A 239 400 og kan i korthet bli oppsummert som følger: Et gen som koder for et variabelt domene av et MAb av hvilken som helst spesifisitet er klonet. DNA segmentene som koder for rammeverksregioner og hypervariable regioner er bestemt og DNA segmentene som koder for de hypervariable regionene er fjernet slik at DNA segmentene som koder for rammeverksregionene er fusjonert sammen med egnede restriksjonsseter ved forbindelsene. Restriksjonssetene kan bli generert ved de hensiktsmessige posisjonene ved mutagenese av DNA molekylet ved standard prosedyrer. Dobbeltrådede syntetiske CDR kassetter er preparert ved DNA syntese i henhold til sekvensene som koder for SEQ ID nr. 1 (CDR1), SEQ ID nr. 2 (CDR2), SEQ ID nr. 3 (CDR3), SEQ ID nr. 4 (CDR1'), SEQ ID nr. 5 (CDR2'). SEQ ID nr. 6 (CDR6'), SEQ ID nr. 11 (CDRl-x), SEQ ID r. 12 (CDR2-x), SEQ ID nr. 13 (CDR3-x). Disse kassettene er tilveiebrakt med klebrige ender slik at de kan bli ligert ved forbindelsespunktene av rammeverket.

Videre er det ikke nødvendig å ha adgang til mRNA fra en produserende hybridom cellelinje for å oppnå en DNA konstruksjon som kode for de IL-17 bindende molekylene ifølge oppfinnelsen. PCT søknad WO 90/07861 gir på denne måte fullstendige instruksjoner for produksjonen av et antistoff ved rekombinante DNA teknikker gitt bare skrevet informasjon om nukleotidsekvensen av genet. Fremgangsmåten omfatter syntesen av et antall oligonukleotider, deres amplifisering med PCR metoden, og deres spleising for å gi den ønskede DNA sekvensen.

Ekspresjonsvektorer som omfatter en egnet promoter eller gener som kode for tung og rett kjede konstante deler er offentlig tilgjengelige. Med en gang et DNA molekyl ifølge oppfinnelsen er preparert kan derfor bli bekvemmelig overført i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor. DNA molekyler som koder for enkelt kjede antistoffer kan også bli preparert ved standard fremgangsmåter, for eksempel som beskrevet i WO 88/1649.

Fortrinnsvis koder denne andre DNA konstruksjonen for et variabelt domene som omfatter alternativt rammeverk og hypervariable regioner, nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5, og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6. Mer foretrukket koder denne første delen av den andre DNA konstruksjonen for et variabelt domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk med aminosyresekvensen som vist i SEQ ID nr. 10 som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter ved aminosyren ved posisjon 109. Mer foretrukket har den første delen av nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID nr. 9 som starter med nukleotidet ved posisjon 1 og slutter med nukleotidet ved posisjon 327. Også foretrukket koder den andre delen for den konstante delen av en human lett kjede, mer foretrukket den konstante delen av human k.

Fortrinnsvis vil den første og andre delen av konstruksjonen bli benyttet sammen, men kan også bli benyttet separat.

Det beskrives også IL-17 bindende molekyler hvor en eller flere aminosyreresiduer av CDR1, CDR2, CDR3, CDRl-x, CDR2-x, CDR3-x, CDR1', CDR2' eller CDR 3' eller rammeverkene, vanligvis bare noen få (f.eks. 1-4), er endret; for eksempel ved mutasjon, f.eks. seterettet mutagenese av de korresponderende DNA sekvensene. Spesielt beskrives IL-17 bindende molekyler hvor en eller flere residuer av CDR1' eller CDR2' har blitt endret fra residuene vist i SEQ ID nr. 4 (for CDR1') og SEQ ID nr. 5 (for CDR2').

I de første og andre DNA konstruksjonene kan de første og andre delene være separert ved en intron, og en enhancer kan fortrinnsvis bli lokalisert i intronet mellom de første og andre delene. Tilstedeværelsen av en slik enhancer som er transkribert, men ikke translatert, kan assistere ved effektiv transkripsjon. Ifølge bestemte utførelsesformer omfatter de første og andre DNA konstruksjonen enhanceren til et tung kjede gen fortrinnsvis av human opprinnelse.

Hver av DNA konstruksjonene er plassert under kontroll av egnede kontrollsekvenser, spesielt under kontroll av en egnet promoter. Enhver type promoter kan bli benyttet, forutsatt at den er tilpasset vertsorganismen hvori DNA konstruksjonene vil bli overført for ekspresjon.

Det ønskede antistoffet kan bli produsert i en cellekultur eller i et transgent dyr. Et egnet transgent dyr kan bil oppnådd i henhold til standard fremgangsmåter som inkluderer mikroinjeksjon i egg av de første og andre DNA konstruksjonene kontrollert av egnede kontrollsekvenser ved å overføre de slik preparerte eggene inn i hensiktsmessige pseudogravide hunner og selektere en etterkommer som uttrykker det ønskede antistoffet.

Når antistoffkjedene er produsert i en cellekultur må DNA konstruksjonene først bli satt inn i enten en enkel ekspresjonsvektor eller inn i to separate, men kompatible ekspresjonsvektorer, der den sistnevnte muligheten er foretrukket.

Følgelig beskrives også en ekspresjonsvektor som er i stand til å replikere i en prokaryot eller eukaryot cellelinje som omfatter minst en av DNA konstruksjonene beskrevet ovenfor.

Hver ekspresjonsvektor inneholdende en DNA konstruksjon er så overført til en egnet vertsorganisme. Når DNA konstruksjonene er separat satt inn i to ekspresjonsvektorer kan de bli overført separat, dvs. en type av vektor per celle, eller ko-overført, hvor den sistnevnte muligheten er foretrukket. En egnet vertsorganisme kan være en bakterie, en gjær eller en mammalsk cellelinje, hvor den sistnevnte er foretrukket. Mer foretrukket er den mammalske cellelinjen av lymfoid opprinnelse, f.eks. e myelom, hybridom eller en normal immortalisert B-celle, som fortrinnsvis ikke uttrykker noen endogen antistoff tung eller lett kjede.

For ekspresjon i mammalske celler er det foretrukket at det IL-17 bindende molekylet som koder for sekvensen er integrert i vertscelle DNA i en lokus som tillater eller favoriseres ekspresjon i høyt nivå av det IL-17 bindende molekylet. Celler hvor den kodende sekvens for IL-17 bindende molekyl er integrert i slike gunstige loki kan bli identifisert og selektert på basisen av nivåene av det IL-17 bindende molekylet som blir uttrykket. Enhver egnet selekterbar markør kan bli benyttet for fremstilling av vertsceller som inneholder den IL-17 bindende molekyl kodende sekvensen; for eksempel kan et dhfir gen/metotreksat eller ekvivalent seleksjonssystem bli benyttet. Alternative systemer for ekspresjon av de IL-17 bindende molekylene ifølge oppfinnelsen inkluderer GS-baserte amplifisering/seleksjonssystemer, slik om dem beskrevet i EP 0256055 B, EP 0323997 B og europeisk patentsøknad 89303964.4.

Det beskrives også en fremgangsmåte for produksjonen av et IL-17 bindende molekyl som omfatter (i) å dyrke en organisme som er transformert med en ekspresjonsvektor som definert ovenfor og (ii) utvinne det IL-17 bindende molekylet fra kulturen.

For formålene ifølge den foreliggende beskrivelsen er et antistoff "i stand til å inhibere bindingen av IL-17 som ATN457" om antistoffet er i stand til å inhibere bindingen av IL-17 til et reseptor hovedsakelig i den samme utstrekningen som ATN457 antistoffet, hvor "i den samme utstrekningen" har betydning som definert ovenfor.

ATN457 antistoffet har bindingsaffinitet for IL-17 som er høyere enn affiniteter tidligere rapportert for anti IL-17 antistoffer, spesielt i forhold til hvilke som helst anti- humane IL-17 antistoffer. Derfor har AIN457 en dissosiasjon likevektskonstant Kdfor binding til IL-17 på omkring 0,188 ± 0,036 nM (bestemt ved BIAcore, f.eks. som vist i eksempel 2). Denne høye bindingsaffiniteten gjør ATN457 antistoffet spesielt egnet for terapeutiske anvendelser.

I den foreliggende beskrivelsen omfatter frasen "IL-17 mediert sykdom" alle sykdommer og medisinske tilstander hvor IL-17 spiller en rolle, enten direkte eller indirekte, i sykdommen eller den medisinske tilstanden, inkludert årsak, utvikling, progresjon, vedvarenhet eller patologi av sykdommen eller tilstanden.

I den foreliggende beskrivelsen refererer betegnelsene "behandling" eller "behandle" til både profylaktisk eller forebyggende behandling så vel som kurerende eller sykdomsmodifiserende behandling, som inkluderer behandling av pasient ved risiko for å pådra seg sykdommen eller mistenkt for å ha pådratt seg sykdommen så vel som pasienter som er syke eller som har blitt diagnostisert til å lide av en sykdom eller medisinsk tilstand, og inkluderer undertrykkelse av klinisk tilbakefall. IL-17 bindende molekyler som definert ovenfor som har bindingsspesifisitet for humant IL-17, spesielt antistoffer som er i stand til å inhibere bindingen av IL-17 til dets reseptor; og antistoffer til IL-17 som er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (=30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl med 50%, for nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert av hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster, er her referert til som antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Fortrinnsvis er antistoffene for anvendelse ifølge oppfinnelsen humane antistoffer, mest foretrukket AIN457 antistoffer.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen blokkerer effektene av IL-17 på dets målceller og er derfor indikert for anvendelse ved behandlingen av IL-17 medierte sykdommer og lidelser. Disse og andre farmakologiske aktiviteter til antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli demonstrert i standard testmetoder, f.eks. som beskrevet nedenfor: Nøytralisering av IL- 17 avhengig produksjon av interleukin- 6 ved primære humane fibroblaster: Produksjonen av IL-6 i primære humane (dermale) fibroblaster er avhengig av IL-17 (Hwang SY et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:rl20-128.

I korthet er humane dermale fibroblaster stimulert med rekombinant IL-17 i nærvær av ulike konsentrasjoner av antistoff ifølge oppfinnelsen eller human IL-17 reseptor med Fc del. Det kimære anti-CD25 antistoffet Sumulect® (basiliksimab) er benyttet som en negativ kontroll. Supernatant er tatt etter 16 timers stimulering og testet for IL-6 ved ELISA. Antistoffer ifølge oppfinnelsen har vanligvis IC50for inhibering av ny-produksjon (i nærvær av 1 nM humant IL-17) på omkring 50 nM eller mindre (f.eks. fra omkring 0,01 til omkring 50 nM) når testet som ovenfor, dvs. nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert av hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster. Fortrinnsvis har antistoffet ifølge oppfinnelsen en IC50for inhibering av IL-6 produksjon som definert ovenfor på omkring 20 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 10 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 5 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 2 nM eller mindre, mest foretrukket omkring 1 nM eller mindre.

Som indikert i testen ovenfor blokkerer antistoffer ifølge oppfinnelsen effekten av IL-17. Følgelig har antistoffene ifølge oppfinnelsen farmasøytisk utnyttelse som følger: Antistoffer ifølge oppfinnelsen er nyttige for profylaksen og behandlingen av IL-17 medierte sykdommer eller medisinske tilstander, f.eks. i inflammatoriske tilstander, allergier og allergiske tilstander, hypersentitivitetsreaksjoner, autoimmune sykdommer, alvorlige infeksjoner, og avstøting av organ eller vevstransplantater.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttig for behandlingen av psoriasis artritt.

Den hensiktsmessige doseringen vil variere avhengig av for eksempel det bestemte antistoffet ifølge oppfinnelsen som skal bli benyttet, verten, administrasjons måten og egenskapen og alvorlighetsgraden av tilstanden som skal bli behandlet. Ved profylaktisk anvendelse er imidlertid tilfredsstillende resultater generelt indikert til å bli oppnådd ved doseringer fra omkring 0,05 til omkring 10 mg per kilogram kroppsvekt, mer vanlig fra omkring 0,1 mg til omkring 5 mg per kilogram kroppsvekt. Hyppigheten av dosering for profylaktisk anvendelse vil normalt være i området fra omkring en gang per uke opptil omkring en gang hver 3 måned, mer vanlig i området fra omkring en gang hver 2 uke opptil omkring en gang hver 10 uke, f.eks. en gang hver 4 til 8 uke. Antistoff ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis administrert parenteralt, intravenøst, f.eks. inn i antecubital eller annen perifer vene, intramuskulært eller subkutant. En profylaktisk behandling omfatter vanligvis å administrere antistoffet ifølge oppfinnelsen en gang per måned til omkring hver 2 til 3 måned, eller mindre hyppig.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert som den eneste aktive ingrediensen eller sammen med, f.eks. som en adjuvans til eller i kombinasjon med, andre medikamenter, f.eks. immunsuppressive eller immunmodulerende midler eller andre anti-inflammatoriske midler, kjemoterapeutiske eller anti-infeksiøse medikamenter. For eksempel kan antistoffene ifølge oppfinnelsen bli benyttet i kombinasjon med DMARD, f.eks. gullsalter, supfasalazin, antimalariamedisiner, metotreksat, D-penicillamin, azatioprin, mycofenolsyre, syklosporin A, tacrolimus, sirolimus, minocylclin, leflunomid, glukokortikoider, en kalsineurin inhibitor,; en modulator av lymfocytt resirkulering, f.eks. FTY720 og FTY720 analogisk; en mTOR inhibitor, f.eks. rapamycin, 40-O-(2-hydroksyetyl)-rapamycin, CCI779, ABT578, AP23573, eller TAFA-93; en ascomycin som har immunsuppressive egenskaper, f.eks. ABT-281, ASM981, osv.; kortikosteroider, syklofosfamid; leflunomid; mizoribin; mykofenolsyre; mykofenolatemofetil; 15-deoksyspergualin.

Eller en terapeutisk kombinasjon, f.eks. et kit, som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av a) et IL-17 bindende molekyl, f.eks. et antistoff av oppfinnelsen og b)minst en andre substans valgt fra et immunundertrykkende/immunmodulerende, anti-inflammatorisk kjemoterapeutisk eller anti-infeksiøst medikament, f.eks. som indikert ovenfor. Kittet kan omfatte instruksjoner for dets administrasjon.

Der antistoffene ifølge oppfinnelsen er administrert sammen med annen immunsuppressive/immunmodulerende, anti-inflammatorisk kjemoterapeutisk eller anti-infeksiøs terapi, vil doseringer av den ko-administrerte kombinasjonsforbindelsen selvfølgelig variere avhengig av typen av ko-medikament benyttet, f.eks. hvorvidt det er en DMARD, anti-TNF, IL-1 blokker eller andre, av det spesifikke medikamentet benyttet, av tilstanden som skal bli behandlet osv.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt på konvensjonell måte. En sammensetning i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis tilveiebrakt i lyofilisert form. For øyeblikkelig administrasjon er den løst opp i en egnet vandig bærer, f.eks. sterilt vann for injeksjon eller steril bufret fysiologisk saltoppløsning. Om det er betraktet ønskelig å lage opp en løsning av større volum for administrasjon ved infusjon i stedet for en bolusinjeksjon, er det fordelaktig å inkorporere humant serum albumin eller pasientens eget heparinserte blod i saltoppløsningen ved formuleringstidspunktet. Alternativt gis formuleringen subkutant. Tilstedeværelsen av et overskudd av slikt fysiologisk inert protein forebygger tap av antistoff av adsorpsjon til veggene av beholderen og slanger benyttet med infusjonsløsningen. Om albumin er benyttet er en egnet konsentrasjon fra 0,5 til 4,5vekt% av saltløsningen. Andre formuleringer omfatter flytende eller lyofilisert formulering.

Oppfinnelsen er videre beskrevet ved illustrasjon i de følgende eksemplene.

EKSEMPLER

Transgene mus konstruert til å uttrykke det humane IgG/ k repertoaret i stedet for det murine immunglobulinreportoaret (Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851) er brukt for å generere antistoffer til humant IL-17. B-celler fra disse musene er immortalisert ved standard hybridomteknologi og murine hybridomceller er oppnådd som skiller ut det humane IgG/ k antistoffet AIN547.

Eksempel 1; Generering av hybridom, rensing av antistoffene, seleksjon av AIN457 antistoff

Produksjon av rekombinant humant IL-17 (huIL-17); Rekombinant huTL-17 er enten produsert i E.coli i inklusjonslegemer og refoldet ved konvensjonelle teknikker (produsert på stedet bærerfritt) (E.coli: Novartis Pharma, batch BM-E3141/98) eller kjøpt (bærerfri, E.coli; R&D Systems #317-IL/CF)) eller som skilt ut og delvis glykosylert protein i HEK.EBNA (rekombinant huTL-17, bærerfritt (IL-17 APP-C6 fra transfekterte HEK/EBNA celler; Novartis Pharma, batch En.E-338/82; 0,28 mg/ml; rekombinant huIL-17, bærerfritt (IL-17 APP-C4 fra transfekterte HEK/EBNA celler; Novartis Pharma, batch En.E-3382/83; 0,29 mg/ml )). Den sistnevnte formen viser en C-terminal 4 aminosyreforlengelse for rask rensing fra dyrkningssupernatanter ved immunaffinitets kromatografi. I dette tilfellet er dyrkningssupernatanter lastet på en kolonne av hensiktsmessig størrelse av et spesifikt immobilisert anti-tag antistoff koblet til CNBr aktivert Sefarose 4B ved en tetthet på 10 mg/ml resin ved å følge produsentens instruksjoner (Pharmacia). Etter basal vasking med PBS, er bundet huIL-17 eluert med 100 mM glysin, pH 2,7 og øyeblikkelig nøytralisert med fortynnet NaOH.

Kobling av huIL- 17 til Keyhole Limpet Hempcyanin ( KLH) ; HuIL-17 produsert i enten E.coli eller HEK.EBNA er koblet til KLH på forhånd aktivert med et overskudd av den homobifunksjonelle kryssbinderen disuksinimidyl suberat (DSS). I korthet er 20 mg lyofilisert Imject® Mariculture KLH (Pierce # 77600) rekondisjonert med 2 ml H2O for å få en 10 mg/ml løsning inneholdende fosfatbufret saltoppløsning (PBS), pH 7,2. Til denne løsningen er 400 ul av 250 mM DSS i dimetyl sulfoksid (DMSO) tilsatt og blanding omrørt i omkring 1 time ved romtemperatur (ikke all reagens oppløst og noe presipitat dannet). Etter en kort sentrifugering og filtrering (0,45 um) er løsningen så avsaltet på Sephadex G25 fin (Pharmacia) i PBS (strømningshastighet 2 ml/min.) som gir omkring 11 mg aktivert KLH ved 1,5 mg/ml (Bradford). 1 ml av aktivert KLH (1,5 mg) er blandet med 1 ml av en 9 mg/ml løsning i vann av lyofiliser E.coli derivert huIL-17 (batch BM-E3141/98). Løsningen forblir klar og er inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Konsentrasjonen av det resulterende komplekset er 1,4 mg/ml (målt ved Badford). 1 ml av aktivert KLH (1,5 mg) er blandet med 1 ml av HEK-EBNA og huIL-17 (omkring 3 mg i vann; batch En.E-3382/83). Løsningen forblir klar og er inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Konsentrasjon (Bradford) er 2,9 mg/ml.

Immunisering: Den genetisk konstruerte musen 27340 (hunn; MEDAREX Inc, Annandale, NJ) hvor de murine immunglobulin variabel del og konstant del genene er funksjonelt erstattet med deres humane motstykke (Genotype Tg kode 221100-TgH (CDM)++; TgN(Hco7)11952+; TgH(JKD)++; TgN(KC05)9572+ (se også Sherie L. Morrison 1994, Nature, årgang 368, side 812.813; Nils Lonberg et al., 1994, Nature, årgang 368, side 856-859) er immunisert ved å følge skjema rapportert i tabell 1. Serumprøver er oppnådd 35 og 99 dager etter starten av immuniseringsprotokollen, for å måle nivåer av anti-huIL-17 antistoff ved enzymbundet immunosorbent test (ELISA).

Generering av hybridomer: På dag 120 er mus 27340 avlivet ved CO2inhalering. Totale miltceller (1 x 10<8>) er fusjonert med PAI-0 celler (5 x IO7 celler) ved å benytte PEG

4000. Fusjonerte celler er sådd ut i 720 brønner (1 ml/brønn), inneholdende et feederlag av museperitoneale celler (Balb/c mus) i HAT medium (PRMI1640 inneholdende 2 g/g natriumbikarbonat, 5 x IO"<5>M P-merkaptoetanol, IO"<4>hypoksantin, 1,6 x 10"<5>Mtymidin 4 x IO"7 M aminopterin, 10% varmeinaktivert FCS og 50 ug/ml gentamycin). Ved dag 14 er HAT medium byttet med HT medium, dvs. HAT medium uten aminopterin. Screening starter på dag 10 og varer i 2 uker. Av de intielle 720 utsådde brønnene er 684 brønner (95%) positive for hybridomvekst. Supernatanter er samlet og screenet for huTL-17 reaktivt MAb i ELISA ved å benytte både E.coli og HEK/EBNA derivert huIL-17. Femtito primære brønner scoret positive for nærværet av anit-huIL-17 antistoffer. Tjueåtte hybridomer er klonet og de gjenværende er frosset. Kloning er gjort i 4 x 96 brønners mikrotiterplater i HT medium og et feederlag av museperitoneale celler. Hybridomer er sådd ut ved 0,5 celler/100 ul per brønner. Brønner er screenet mikroskopisk for vekst og positive er gitt 100 ul av HT medium. Den påfølgende dagen er supernatanter testet for antistoffproduksjon i en huIL-17 spesifikk ELISA. Ved kloning beholder hoved andelen av de klonede hybridomene kapasiteten til å skille ut anti-huIL-17 spesifikt monoklonalt antistoff (MAb).

Produksjon og rensing av antistoff: De selekterte klonene er overført til serumfritt medium (5 ml) i 25 cm TC (TC: celledyrkning) flasker. Hybridomer er progressivt ekspandert i serumfritt medium 75 cm TC flasker og rulleflasker. Alle de forskjellige anit-huIL-17 MAb som inkluderer NVP-ATN457-NX (340-110-28 dvs. musenummer-hybridomnummer-klonnummer) er renset ved protein A affinitetskromatografi. Dyrkningssupernatanter er juster til pH 7,3 og lastet på en kolonne av hensiktsmessig størrelse av protein A Sefarose 4 fast flow (Pharmacia). Etter basal vasking med 100 mM fosfatbuffer, pH 7,3 er bundede antistoffer eluert med 50 mM sitrat, pH 2,7, 140 mM NaCl. Den eluerte fraksjonen er øyeblikkelig nøytralisert (pH 7,0) og sterilfiltrert. Proteinkonsentrasjon er bestemt ved absorpsjon ved 280 nm ved å benytte en faktor på 1,35 absorpsjonsenhet (AU)/mg.

Inhibitorisk aktivitet av anti- huIL- 17 Mab på IL- 6 produksjon indusert av huIL- 17 i humane dermale fibroblaster: Humane dermale fibroblaster er dyrket i FBM supplementert med 2% FCS, insulin (5 ug/ml) huFGF-basisk (0,1 ug/ml) og gentamycin (50 ug/ml). Fibroblastene er løsnet fra plasten ved å benytte en trypsin/EDTA løsning. Fibroblaster er distribuert til 96-brønner mikrotiterplater ved en tetthet på 1 x IO<4>celler/brønn i FBM supplementert med 1% FSC. Fibroblaster er tillatt å feste seg til platene over natt. Den neste morgenen er medium fjernet og friskt FBM supplementert med 1% FCS, hulIL-17 (forskjellige konsentrasjoner varierende fra 30 til 500 ng/ml) og hybridomsupernatanter (1/5 endelig fortynning) eller rensede antistoffer er tilsatt til et endelig volum på 200 ul. Dyrkningssupernatanter er samlet etter en inkubering på 24 timer og huTL-6 produksjon er målt ved ELISA.

Elisa for deteksjon av anti- huIL- 17 antistoffer: ELISA mikrotiterplater er belagt med rekombinant huIL-17 (100 ul/brønn ved 3 ug/ml: batch BM-E3141/98 eller En.E-3382/82) i PBS med 0,02% NaN3og inkubert over natten ved romtemperatur. Den påfølgende dagen er mikrotiterplater blokkert med en 300 ul av PB S/2% BS A/0,02% NaN3i 2 timer ved 37°C. Plater er så vasket 4 ganger med PBS/0,05% Tween20/0,2% NaN3. Serumfortynninger av muse 27340 (endelig fortynningsområde ved dag 35: 1/100 til 1/3.200; endelig fortynningsområde ved dag 99: 1/200 til 1/1.2.800; 100 ul/brønn) eller dyrkningssupernatanter av hybridomer (endelig fortynning 1;3; 100 ul/brønn) er tilsatt. Etter en inkubering over natten ved romtemperatur er plater vasket 4 ganger med PBS/0,05% Tween 20/ 0,02% NaN3. Et biotinkonjugert must anti-hu-IgG, Fc fragment spesifikt antistoff er tilsatt ved en endelig fortynning av 1/20000 (100 ul/brønn). Prøver er latt reagere i 4 timer ved romtemperatur. Etter vaskingen (4 ganger) er alkalisk fosfatasekonjugert streptavidin tilsatt ved en endelig fortynning på 1/8000 ( 100 ul/brønn). Etter 40 min. ved romtemperatur er plater vasket igjen 4 ganger og substratet (p-nitrofenylfosfat i dietylaminobuffer pH 9,8; 150 ul/brønn) er tilsatt. Plater er avlest etter 30 eller 45 min. avhengig av utviklingen av reaksjonen i en mikrotiteravleser (Bio-Rad) ved å benytte filtre på 405 og 490 nm.

ELISA for deteksjon av antistoff isotype: For å bestemme isotypen til MAb, er dyrkningssupernatanter (100 ul; endelig fortynning 1/5) tilsatt til brønnene av mikrotiterplater belagt med huTL-17 (se ovenfor) og inkubert over natt ved romtemperatur. Etter vasking (4 ganger) er 100 ul/brønn av biotinkonjugerte muse MAb anti-human igGl (endelig fortynning 1/1.000), IgG2 (endelig fortynning 1/1.000) IgG3 (endelig fortynning 1/1.000), IgG4 (endelig fortynning 1/2.000) eller antihuman k lett kjede (endelig fortynning 1/1.000) tilsatt i 4 timer ved romtemperatur. Som en kontroll er et biotinkonjugert rotte anti-mus XI og X2 lett kjede spesifikt MAb benyttet (endelig fortynning 1/1.000). Dette er fullt som tidligere beskrevet ved vasking og tilsetting av alkalisk fosfatasekonjugert streptavidin (100 ul; endelig fortynning 1/8.000). Etter vasking (4 ganger) er substratet (p-nitrofenylfosfat i dietylaminobuffer; 100 ul) tilsatt. Plater er lest etter 30 eller 45 min. avhengig av utvikling av reaksjon i en mikrotiteravleser (Bio-Rad) ved å benytte filtre på 405 og 490 mm.

ELISA for deteksjon av huIL- 6produksjon: ELISA mikrotiterplater er belagt med anti-huIL-6 muse MAb (MAB 206 fra R&D system; 100 ul/brønn ved 4 ug/ml) i PBS med 0,02% NaN3og inkubert over natten ved romtemperatur. Den påfølgende dagen ble mikrotiterplater blokkert med 300 ul av PBS/ 2% BSA/ 0,02% NaN3i 3 timer ved 37°C. Plater ble så vasket 4 ganger med PBS/ 0,05% Tween 20/ 0,02% NaN3. Dyrkningssupernatanter fra humane dermale fibroblaster (endelig fortynning 1:3; 100 ul/brønn) ble tilsatt. For å etablere en titreringskurve er huIL6 (100 ul/brønn) titrert fra 400 pg/ml til 3,1 pg/ml i 1:2 fortynningstrinn. Etter natts inkubering over natten ved romtemperatur er plater vasket 4 ganger med PBS/ 0,05% Tween 20/ 0,02% NaN3. Et biotinkonjugert geit anti-huIL-6 antistoff (BAP206; R&D Systems) er tilsatt (25 ng/ml; 100 ul/brønn). Prøver er latt reagere i 4 timer ved romtemperatur. Etter vasking (4 ganger) er alkalisk fofatasekonjugert streptavidin tilsatt ved en endelig fortynning på 1/8000 (100 ul/brønn). Etter 40 min ved romtemperatur er plater vasket igjen 4 ganger og substratet (p-nitrofenylfosfat i dietylaminobufffer pH 9,8; 150 ul/brønn) er tilsatt. Plater er avlest etter 30 min. i en mikrotiteravleser (Bio-Rad) ved å benytte filtre på 405 og 490 nM.

Beregninger: Verdier er rapportert som opprinnelige O.D. verdier eller som % inhibering beregnet ved hjelp av duplikate verdier. Ytterligere data er rapportert som middelverdier ± SEM. En huIL-6 standardkurve ble benyttet for å måle huIL-6 konsentrasjon i dyrkningssupernatanter ved å benytte en kubisk kurvetilpasning.

Resultater

Serumtitere fra mus 27340:

Binding i ELISA av hybridomsupernatanter: 684 supernatanter er testet i ELISA for nærværet av anti-huIL-17 antistoffer, ved å benytte to preparater av rekombinant huTL-17, den første fra E.coli (BM-E3141/98) og den sistnevnte fra HEK/EBNA celler (En.E-3382/82). Femtito supernatanter scoret positive ved nærværet av anti-huIL-17 antistoffer (tabell 3). Foretrukken binding til det ene eller det andre preparatet av huTL-17 er observert i noen få tilfeller. De 28 hybridomene som deretter er klonet er understreket.

Binding i ELISA av dyrkningssupernatanter av hybridomklonene: Reaktiviteten i ELISA av supernatantene av klonene fra de 11 hybridomene, som opprettholdt den beste produksjonen av anti-huIL-17 MAb, er vist i tabell 4. Klonene, i uthevet tekst, er valgt for å produsere tilnærmet 1 liter av supernatant i rulleflasker for rensing og analyse av antistoffene. Med unntak av klonene derivert fra hybridome nr. 5, som produserte et huIgG3 k antistoff, produserte alle de andre klonene huIgGl k MAb, vurdert ved isotypespesifikke monoklonale antistoffer.

Mikrotiterplater er belagt med rekombinant huIL-17 (3 ug/ml) fra HEK/EBNA celler (En.E-33 82/82)-

Nøytraliserende aktivitet av dyrkningsupernantanter: Dyrkningssupernatanter er testet for inhibering av huTL-6 produksjon ved humane dermale fibroblaster stimulert med rekombinant huIL-17. Som vist i tabell 5 viser de fleste dyrkningssupernatantenes inhibitoriske aktivitet.

Tabell 5. Inhibering av IL-6 produksjon indusert av huTL-17 i humane dermale fibroblaster ved dyrkningsupernatanter

Inhibering av IL-6 produksjon (%)

Nøytraliserende aktivitet av AIN45: Valg av klon 110-28 for produksjonen av utviklingskandidat AIN457 (foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen) er basert på nøytraliserende aktivitet og affinitetsmåling på BIACORE 2000 av de rensede antistoffer (se eksempel 2 nedenfor)

Eksempel 2: AIN457 binder med veldig høy affinitet til rekombinant humant IL-17 (huIL-17); KDer 122 ± 22 pM (BIAcore) og nøytraliserer humant IL-6 produksjon indusert ved huIL-17 i humane dermale fibroblaster; IC50er 2,1 ± 0,1 nM ved en konsentrasjon på 1,87 nM huIL-17.

a) Fremgangsmåter

Reagenser: Generelle laboratoriereagenser er innkjøpt fra Merck eller Sigma og er av

den høyeste renhetsgraden tilgjengelig; kildene av spesielle reagenser er detaljert beskrevet nedenfor.

Proteiner: Monoklonale antistoffer er generert ved å immunisere MEDAREX transgene mus med rekombinant humant IL-17, og så følge standard prosedyren for å produsere cellelinjer, hvorfra det utskilte materialet kan bli renset ved Protein A Sefarose kromatografi (hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1). AIN 457 er lagret som en sterilfiltrert løsning i 50 mM Na-citrat, pH 7,0 140 mM NaCl ved 4°C. Rekombinant humant AIN457 (batch KB03303A) er oppnådd i steril stamløsning av enten 20 mM Na-citrat/40 mM fosfatbuffer, pH 7, 150 mM NaCl eller 20 mM eddiksyre pH 5,0 justert med IM Tris-base. Konsentrasjoner er vanligvis i området av 2 mg/ml og fortynnet til en endelig konsentrasjon på 5 ug/ml i BIA buffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 med mer NaCl, 0,05 volum-% Tween 20) for Biacore eksperimentene. Rekombinant humant IL-17 er produsert på stedet; batch EN/E 3882/83; 0,29 mg/ml.

BIAcore målinger

Bestemmelse av kinetiske bindingsparametere og nivåer av kryssreaktivitet er gjort ved overflate plasmonresonansmålinger ved å benytte den optiske biosensoren BIAcore 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Sverige, se Lit. HS 1,2 for detaljer). Denne teknologien muliggjør den merkingsfrie bestemmelsen av de mikroskopiske hastighetskonstantene for binding (kon) og dissosiasjon (k0fr) av en ligand til en reseptor. Den er derfor spesielt egnet for å karakterisere antistoff/antigen interaksjonene. Denne teknologien komplementerer og er på mange måter overlegen i forhold til ELISA målinger (Van Regenmortel, Dev Biol (Basel). 2003;112:141-51). Bindingsstudier av rekombinant IL-17 til IL-17 antistoffet AIN457 er utført på to måter. I standardprotokollen er AIN457 fanget ved et anti-humant Fcy antistoff (Jackson Immunochemicals; katalognr. 109-005-098) som tidligere er immbobilisert på en CM-5 BIAcore sensor chip (forskningsgrad). Kovalent binding av Fcy fangende antistoff er gjort med "aminkoblingskitet" tilveiebrakt ved BIAcore (BIAcore, katnr. BR-1000-50). Vanligvis er 3000 RU av fangende antistoff festet til den aktiverte dekstranoverflaten med en 30 ug/ml anti Fcy antistoffløsning i 10 mM Ac buffer, pH 4,5 ved en strømningshastighet på 5 ul/min som fører til omtrentlig 250 RU av ATN 547 immobilisering. Som en retningslinje korresponderer 1.000 RU til en masseoverføring på 1 ng/mm . Alternativt er IL-17 (avsnitt 3,2; tabell 4), ATN 457 antistoff koblet direkte til chip overflaten uten fangende antistoff. Resultatene er sammenlignet med protokollen beskrevet i tabell 9 (se nedenfor).

b) Resultater

Bindingskinetikk for IL-17/AIN457 komplekset

Likevektsdissosiasjonskonstanten Kdmuliggjør vurdering omkring stabiliteten av komplekser, med en gang de er dannet in vivo. Vi har derfor bestemt kinetiske konstanter for bindingen av humant IL-17 til det immobiliserte AIN457 antistoffet, og har derivert KDfor prosessen fra disse dataene. Tabell 3 viser oppsummeringen av data oppnådd når kurvene fra to eksperimenter er tilpasset Langmur modellen ved å benytte BIAevaluation 3.0 programvaren. Selv om antistoffet selvfølgelig er bivalent, kan bindingen bli behandlet som en 1:1 hendelse, med individuelle antistoffbindende seter presentert på overflaten som blir okkupert av monomere IL-17 molekyler. Dette eksperimentet viser både den ekstremt raske assosiasjonskinetikken så vel som den veldig sakte dissosiasjonskinetikken av antistoff-kjemokinkomplekset. Den beste datatilpasningen er oppnådd når sensorgrammene er behandlet individuelt (i stedet for globalt, som er antydet i BIAevaluation), Etter kombinering av titreringsseriene oppnådde vi på denne måten gjennomsnittlige verdier fra 12 sensorgrammer av kon =

(4,1 ± 0,1) xlO<5>l/M s; koff = (3,8 ± 0,5) xlO"4 l/s; og for KD 0 122 ± 22 pM.

Middelverdi KDberegnet fra individuelle noteringer (vertikalt), i stedet for å benytte ligningen KD= k0ff/k0n.

For AIN457 produsert i rekombinante celler (KB03303A) er affinitetsmålinger utført for IL-17 cytokinene fra henholdsvis menneske, silkeape, rhesusape og cynomolgusape. Eksperimentelle detaljer av Biacore målingene er de samme som beskrevet ovenfor for MAB110-28 antistoff. To uavhengige kjøringer som tester 6 IL-17 konsentrasjoner i hver kjøring er utført. Konsentrasjoner av humant IL-17 er 2, 4, 8, 12, 16, 20 nM og 10, 20, 30, 40, 50, 60 nM for alle andre arter. Fullstendig dataanalyse gir n = 12 individuelle målinger for hver IL-17 art. KDså vel som SEM er rapportert

Et fullstendig sett av data for BIAcore analysen for antistoff KB03303A med k<,n, k0ff og Kdog de respektive IL-17 artene er vist nedenfor i tabell 5 til 8.

Deretter er inhibitorisk aktivitet av renset ATN457 (Batch EN/E-10333/53; 0,54 mg/ml) på huTL-17 evaluert. IC50verdier er vist i tabell 6.1 disse eksperimentene er huIL-17 R/Fc og et mus anti-huIL-17 MAb inkludert som positive kontroller og Simulect som negativ kontroll.

I konklusjon opphever AIN457 den IL-17 avhengige sekresjonen av huTL-6 fra humane dermale fibroblaster. Styrken er sammenliknbar med den av huIL-17R/Fc og overlegen i forhold til den av kommersielt tilgjengelig mus anti-huIL-17 MAb. Det er interessant å notere at en mer fullstendig inhibering er observert med AIN457 enn med IL-17R/Fc.

Eksempel 3: Renhet og partielle aminosyresekvenser av tung og lett kjede aminosyresekvensering

Amino- terminale aminosyresekvenser avV^ ogVu regioner: De første 48 aminosyreresiduene av den tunge og lette kjeden til to anti-IL-17A antistoffer, klon 110-7 (se tabell 4) og 110-28 (se tabell 4), er bestemt ved Edmand degradering. Aminosyresekvensen er identisk for begge klonene. GeneBank er gjennomsøkt ved blastanalyse og den mest homologe DNA sekvensen funnet er benyttet for å designe kloningsprimerne.

Molekylær kloning av Vlog Vh regionene: Total RNA er preparert fra 2 x IO<7>hybridomceller (klon 110-7, klon 110-28) med RNeasy Midi Kit i henhold til

produsentens protokoll (Quagen Hilden Tyskland). Total RNA er eluert i 200 ul RNase-fritt vann og lagret ved -80°C. Første tråd cDNA syntesen er utført med M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WT), oligo dT-primer, PCR nukleotidmiks (dNTP) og RNAsin inhibitor (Roche, Mannheim). Fem ug av total RNA er blandet med 1 ul oligo-dT primer (0,5 ug/ul), og RNase-fritt vann er tilsatt til et endelig volum på 36 ul. Blandingen er inkubert ved 70°C i 10 min. og så lagret på is. Mens på is er følgende reagensene tilsatt: 10 ul 5 x RT buffer, 2 ul dNTP (lOmM hver)2 ul RNasin og 1 ul M-MLV revers transkriptase. Reaksjonen er utført ved 42°C i 1 time.

PCR reaksjonen er satt sammen ved å benytte 4 ul av cDNA templat, 2 ul av hver primer ved 10 uM hver, (se nedenfor og tabeller 10 og 11 for oversikt), 20 ul av 2 x Qiamix (inneholdende buffer, dNTP TAQpolymerase) og 1 ul av Pwo DNA polymerase i et totalt volum på 40 ul. PCR-betingelsene er satt til 35 sykluser av 94°C i 15 sek., 55°C i 20 sek. og 72°C i 30 sek. PCR produktet er subklonet inn i pCR4-TOPO-Zero (Stragagene, La jolla Ca.) kloningsvektoren. Flere kloner er plukket fra hver reaksjon og nukleotidsekvensen bestemt ved Solvias AG (Basel), ved å benytte primerne MV432 (SEQ ID nr. 21), MV433 (SEQ ID nr. 22), MV434 (SEQ ID nr. 23), MV435 (SEQ ID nr. 14) og standard primere i vektor DNA.

cDNA kodende for den tunge kjeden er amplifisert ved å benytte primerparene MV416 (SEQ ID nr. 15)/#265 (SEQ ID nr. 16) og MV418 (SEQ ID nr. 17)/#265 (SEQ ID nr. 16).

Primerne dekker nukleotidsekvensene som korresponderer med de følgende aminosyreposisjonene av den tunge kjeden: MV416 posisjon -19/-13 (signalpeptid); MV418 posisjon +1/+7; #265 posisjon +253/+259. Posisjon +1 er den første aminosyren av det modne proteinet.

cDNA som koder for den lette kjeden er amplifisert ved å benytte primerparene MV417 (SEQ ID nr. 18)/#223 (SEQ ID nr. 19) og MV419 (SEQ ID nr. 20)/#223 (SEQ ID nr. 19). Primerne dekker nukleotidssekvensene som korresponderer til de følgende aminosyreposisj onene av den lette kjeden: MV417 posisjon -20/-14 (signalpeptid); MV419 posisjon +1/+7; #223 posisjon +210/+215. Denne fremgangsmåten tillater å lage to uavhengige PCR amplifiseringer for hver immunglobulinkjede, som resulterer i to uavhengig etablerte DNA sekvenser.

Resultater og diskusjon

De klonede PCR produktene som kode for den tunge og lette kjeden fra to hybridomer (110-7 og 110-28, se tabell 4 ovenfor) erkarakterisert vedDNA-sekvensering. Fem av seks uavhengige sekvenser er benyttet for å sette sammen lett og tung kjedesekvensene. Lett kjede cDNA er alle identiske og deker den fullstendige kodende sekvensen (aminosyreposisjon -20 til +215). Tung kjede cDNA har to forskjellige feiltilpasninger i et cDNA hver. Disse er ekskludert fra den endelige sekvensen, som strekker seg fra startkodon til slutten av hengselregionen etter det konstante domene 1 (aminosyreposisjon -19 til +238). Sekvensene for begge hybridomene er identiske. cDNA oppnådd fra hybridom 110-28 er valgt og brukt i det videre. SEQ ID nr. 7 (cDNA av tungkjede av AIN457), SEQ ID nr. 8 (aminosyresekvens av tungkjede av AIN457), SEQ ID nr. 9 (cDNA av lett kjede av AIN457) og SEQ ID nr. 10 (aminosyresekvens av AIN457) viser DNA sekvensen som kode for den lette og tunge kjeden av ATN457, sammen med proteinsekvensen og posisjonen av primerne benyttet for PCR amplifisering og DNA sekvensering. DNA sekvensene har blitt registrert i PlasNova, aksesjonsnr. NPL003689 for den tunge kjeden og aksesjonsnr. NPL003690 for den lette kjeden.

Aminosyresekvensen funnet ved cDNA kloning er identisk med den tidligere oppnådd ved Edman degradering av de rensede immunglobulin tunge og lette kjedene, som indikerer at det korrekte cDNA har blitt klonet.

Eksempel 4: Tredimensjonal struktur av Fab fragmentet av det antihumane IL-17 A monoklonale antistoffet AIN 457

Fore å bestemme konformasjonen av de komplementaritet-bestemmende regionene (CDR) og strukturen av det antigen-bindende sete av AIN457, er Fab fragmentet generert, krystallisert og dets røntgenstruktur er bestemt ved protein krystallografi.

Fremgangsmåte: Fab fragmentet av NVP-AIN457 er produsert ved papainkløving fra det fullstendige antistoffet og renset ved protein A kromatografi etterfulgt av størrelses-eksklusjons kromatografi Det rensede materialet er så konsentrert ved ultrafiltrering til 20 mg/ml i 10 mM Tris-HCl pH 7,24, 25 mM NaCl, 5 mM TCEP. Krystallvekst er dyrket ved teknikken av dampdiffusjon i hengende dråper ved 19°C, fra 2,0 M ammoniumsulfat, 5% PEG 400, 0,2 M Na MES pH 6,5. Det er i spacergruppe P2x2i2imed enhet celledimensjoner a=90,3Å, b=106,7Å, c=131,4Å og 2 Fab molekyler per asymmetriske enhet. Før innsamling av røntgendata er en enkel krystall av ATN457 Fab kryssforbundet med glutaraldehyd ved å benytte fremgangsmåten til Lusty (J. Appl. Cryst. (1999) 32, 106-112) og så overført til en løsning inneholdende 2,OM Li2S04,2%PEG 400 og 0,1 M Na MES pH 6,5. Krystallet er deretter montert i en cryo-sløyfe og raskt frosset for innsamling av data ved 95M. 180 diffraksjonsbilder korresponderende til l,0deg oscillasjon hver er registrert. Diffraksjonsdataene er prosessert med HKL programpakken. Strukturen er bestemt til 2,5Å oppløsning ved molekylær erstatning. Strukturen er så forfinet ved torsjonsvinkeldynamikk og energiminimalisering ved å benytte programmet CNX.

Resultater: To ATN457 Fab molekyler er presentert i den asymmetriske enheten av krystallen, med H-CDR3 sløyfen ved begge Fab molekyler involvert i protein-protein kontakter til H-CDR3 sløyfen av symmetri-relaterte Fab. De to Fab molekylene viser forskjellige albuevinkler, men har ellers hovedsakelig identiske CDR sløyfekonformasj oner (se tabell 12 for aminosyresekvens av CDR sløyfene). H.CDR1 sløyfen adopterer den forventede Hl: 1 kanoniske strukturen, mens konformasjonen av H-CDR2 sløyfen matcher den av kanonisk struktur H2:3A. H-CDR3 sløyfen av ATN457 antistoffet er eksepsjonelt lang, som omfatter 18 residuer mellom Kabat posisjon 94 (Arg H98) og 101 (Asp Hl 15). Det viser den typiske uthulede torsostrukturen stabilisert ved en saltbro mellom Arg sidekjeden i posisjon 94 (ArgH98) og Asp karboksylatgruppen i posisjon H101 (Asp Hl 15), og ved en H-bundet interaksjon mellom sidekjeden av Trp Hl 17 og hovedkjede karbonylgruppen av Phe Hl 14. Hodet av H-CDR3 sløyfen har strukturen av en lang, tvunnet beta-hårnål med en andre beta-bulk ved dens base og en type F beta-dreining ved dens toppunkt. En påfallende egenskap av AIN457 H-CDR3 sløyfen er dens veldig høye innhold i aromatiske residuer: 6 tyrosiner, 2 tryptofaner, 1 fenylalanin. Siden alle andre CDR sløyfer bidrar til 1 mer tyrosin hver, har det antigen-kombinerende setet av ATN457 11 tyrosiner totalt. Konformasj onene av L-CDR1 og L-CDR2 sløyfene korresponderer til henholdsvis kanoniske strukturer LI:6 og L2:1.1 motsetning til H-CDR3 er L-CDR3 sløyfen kort (6 residuer) og viser at den alminnelige observerte kanoniske strukturen L3:l med en cis-prolin ved dens tupp (Pro L96), en glutamin ved Kabat posisjon 90 (Gin L91) og en treonin ved Kabat posisjon 97 (Thr L98). Imidlertid er nærværet av cysteinresiduet etter cis-prolinet (Cys L97) et veldig uvanlig trekk ved ATN457 L-CDR3 sløyfen . Sidekjeden av Cys L97 er ved bunnen av en grunn fordypning lokalisert ved Vl-Vh grenseflaten og kledd ved residuet Trp H 112, Trp H47 og Tyr L92.

Tabell 1: Aminosyresekvenser av de hypervariable regionene av AIN457 monoklonale antistoffene, basert på Kabat definisjonen og som bestemt ved røntgenanalyse, ved å benytte fremgangsmåten til Chotia og medarbeidere. De uthevete aminosyre er del av CDR sløyfene, mens dem vist i vanlig skrifttype er del av antistoff rammeverket.

Claims

1. IL-17 bindende antistoff eller fragment derav,karakterisertved som omfatter både tung (Vh) og lett kjede (Vl) variable domener for anvendelse ved behandling av psoriasis artritt; der nevnte IL-17 bindende antistoff eller fragment derav omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter: a) et Vh som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1, CDR2 og CDR3, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 2, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEG ID nr. 3, der nevnte hypervariable regioner er i hht Kabat-definisjonen; eller et Vh som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x, CDR2-X og CDR3-x, nevnte CDRl-x har aminosyresekvensen SEG ID nr. 11, nevnte CDR2-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 12 og nevnte CDR3-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 13, der nevnte hypervariable regioner er i hht Chothia-definisjonen; og b) et Vlsom omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6.

2. IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse i henhold til krav 1,karakterisert vedat det er et humant antistoff.

3. IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse i henhold et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter enten: a) Vh som har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 8; b) et Vlsom har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 10; eller c) et Vh som har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 8 og et Vlsom har en aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 10.

4. IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, som er et humant IgGl/ic antistoff omfattende: a) en lett kjede bestående av aminosyreresiduene begynnende på +1 i Tabell 10

og b) en tung kjede omfattende aminosyreresiduene begynnende på +1 i Tabell 11

5. IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte IL-17 bindende antistoff eller fragment derav ko-administreres, samtidig eller i sekvens, med minst en annen medikamentsubstans valg fra gruppen bestående av immunsuppressive midler, immunmodulerende midler, anti-inflammatoriske midler, kjemoterapeutiske midler eller anti-infeksiøse midler.

6. IL-17 bindende antistoff eller fragment derav for anvendelse i henhold til krav 5, der nevnte IL-17 bindende antistoff eller fragment derav ko-administreres, samtidig eller i sekvens, med gullsalter, supfasalazin, antimalariamedisiner, metotreksat, D-penicillamin, azatioprin, mycofenolsyre, syklosporin A, tacrolimus, sirolimus, minocylclin, leflunomid, glukokortikoider; en kalsineurin inhibitor; en modulator av lymfocytt resirkulering, f.eks. FTY720 og FTY720-analoger; en mTOR inhibitor, f.eks. rapamycin, 40-O-(2-hydroksyetyl)-rapamycin, CCI779, ABT578, AP23573, eller TAFA-93; et ascomycin som har immunsuppressive egenskaper, f.eks. ABT-281, ASM981, etc; kortikosteroider; syklofosfamid; leflunomid; mizoribin; mykofenolsyre; mykofenolat-mofetil; 15-deoksyspergualin.