SK51398A3 - Polymorphic forms of n-[1(r)-[(1,2-dihydro-1- -methanesulfonylspiro[3h-indole-3,4'-piperidin]-1'-yl)carbonyl]- -2-(phenylmethyloxy)ethyl]-2-amino-2-methyl-propanamide- -methanesulfonate, the preparation thereof, pharmaceutical composition containing them and their use - Google Patents

Description

Polymorfné formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka polymorfných foriem látok, podporujúcich sekréciu rastového hormónu a použiteľných na výrobu prostriedkov na urýchlenie rastu živočíchov a v rôznych kombináciách aj na ďalšie účely, napríklad na liečenie osteoporózy.

Doterajší stav techniky

Rastový hormón, ktorý je vylučovaný hypofýzou, podporuje rast všetkých tkanív v organizme, ktoré sú ešte schopné rastu. Okrem toho je známe, že rastový hormón má nasledujúce základné účinky na metabolické pochody v organizme:

1) zvyšuje rýchlosť syntézy bielkovín v bunkách,

2) znižuje rýchlosť využitia uhľohydrátov v bunkách,

3) zvyšuje mobilizáciu voľných mastných kyselín a využitie mastných kyselín na získanie energie.

V prípade, že je rastového hormónu nedostatok, môžu vznikať rôzne poruchy, jednou z najzávažnejšou je trpaslíctvo.

Na uvoľnenie rastového hormónu je známy celý rad postupov. Je napríklad možné nepriamo vyvolať uvoľnenie rastového hormónu chemickými látkami, ako je arginín, L-3,4-dihydroxyfenylalanín, L-DOPA, glukagón, vazopresín, alebo je možné vyvolať inzulínom hypoglykémiu, okrem toho zvyšuje uvoľnenie rastového hormónu tiež spánok a telesné cvičenie. Tieto účinky sú nepriamo vyvolané zrejme cez hypotalamus buď znížením sekrécie somastatínu alebo zvýšením sekrécie známeho hormónu GRF, uvoľňujúceho rastový hormón alebo neznámeho hormónu s podobným účinkom.

-2V prípadoch, kedy je žiadúce zvýšiť hladinu rastového hormónu v organizme sa až dosiaľ tento problém zvyčajne rieši podávaním exogénneho rastového hormónu, podávaním GRF alebo iných peptidových látok, stimulujúcich produkciu a/alebo uvoľnenie rastového hormónu. Vo všetkých prípadoch je vzhľadom na peptidovú povahu uvedených látok nutné podávať tieto látky injekčným spôsobom. Počiatočným zdrojom rastového hormónu bola extrakcia hypofýz z mŕtvych tiel. Takto získaný produkt bol veľmi drahý a okrem toho bolo jeho použitie spojené s rizikom prenosu rôznych chorôb. V poslednej dobe je k dispozícii rekombinantný rastový hormón, s použitím ktorého je teraz spojené riziko prenosu chorôb. Ide však stále o veľmi nákladný výrobok, ktorý je nutné podávať injekčné alebo do nosa vo forme spreja. Okrem toho boli vyvinuté ďalšie látky, ktoré podporujú uvoľňovanie endogénneho rastového hormónu.

Zvlášť ide o spirozlúčeniny, opísané v US patentovom spise č. 5 536 716, v PCT patentovej prihláške WO 94/13696 a v publikácii Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7001 až 7005, júl 1995 ako nepeptidové látky, podporujúce uvoľnenie rastového hormónu. Uvedené zlúčeniny majú schopnosť stimulovať uvoľnenie prírodného endogénneho rastového hormónu a je teda možné ich využiť na liečenie stavov, pri ktorých je potrebné stimulovať produkciu alebo sekréciu rastového hormónu, napríklad u ľudí s nedostatkom prírodného rastového hormónu alebo u hospodárskych zvierat, chovaných na mäso alebo na produkciu vlny, kde stimulácia produkcie rastového hormónu vedie k získaniu väčších a produktívnejších hospodárskych zvierat.

Z výhodných zlúčenín, opísaných v uvedených publikáciách je možné uviesť napríklad spiro[3H-indol-3,4‘-piperid í n]-1 ‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etylj2-amino-2-metyl-propánamidmetánsulfonát vzorca

-3^;

US patentový spis č. 5 536 716 a PCT patentová prihláška WO 94/13696 opisujú spôsob výroby uvedenej látky (príklady 18, 19 a 55). Najmä v príklade 55 sa uvádza, že zlúčenina má po prekryštalizovaní zo zmesi etylacetátu, etanolu a vody teplotu topenia 166 až 168 °C. Táto látka bola neskoršie identifikovaná ako jedna z polymorfných foriem označovaná forma II. V Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7001 až 7005, júl 1995 sa uvádza, že táto látka, izolovaná vo forme monohydrátu má teplotu topenia 168 až 170 °C, avšak uvádza sa len všeobecný postup na výrobu tejto látky a vôbec sa neuvádza, akým spôsobom bola dosiahnutá jej kryštalizácia.

Pri výrobe vhodných liekových foriem môžu byť dôležité morfologické formy účinných látok vzhľadom na to, že v prípade, že morfologická forma nie je stála v priebehu klinických skúšok a skúšok na stálosť, nie je možné porovnávať použité látky z rôznych šarží. V prípade výroby farmaceutický účinnej látky na ďalšie použitie je dôležité identifikovať jej morfologickú formu v každej liekovej forme tak, aby bolo možné overiť, ž v každej liekovej forme je prítomná rovnaká forma a rovnaké množstvo účinnej látky. Z týchto dôvodov je najskôr nutné zistiť, či sa účinná látka vyskytuje v jedinej forme alebo v niekoľkých morfologických formách. Okrem toho môžu mať niektoré morfologické formy vyššiu termodynamickú alebo hygroskopickú stálosť a môžu byť vhodnejšie na použitie vo farmaceutických prostriedkoch ako iné formy. Pod pojmom „polymorfná forma“ chemickej zlúčeniny sa rozumie tá istá chemická látka v rôznych kryštalických usporiadaniach.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoria polymorfné formy N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, spôsob výroby týchto polymorfných foriem a farmaceutický prostriedok s obsahom týchto látok.

Farmaceutické prostriedky obsahujú vyššie uvedenú látku ako svoju účinnú zložku a sú použiteľné v prípade rôznych ochorení. Polymorfné formy podľa vynálezu podporujú vylučovanie rastového hormónu a je teda možné ich použiť u

-4domácich zvierat, chovaných na mäso na podporu rastu a na účinnejší chov, U človeka je možné uvedené formy použiť v prípadoch príliš nízkej sekrécie rastového hormónu a na liečenie chorobných stavov, ktoré môžu byť zlepšené anabolickým pôsobením rastového hormónu.

Polymorfné formy podľa vynálezu majú v porovnaní s inými známymi formami tejto zlúčeniny tú výhodu, že majú vyššiu termodynamickú stálosť a sú teda vhodnejšie na použitie vo farmaceutických prostriedkoch.

N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)-karbonyI]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonát, je možné vyjadriť vzorcom

Ide o látku, podporujúcu sekréciu a uvoľnenie rastového hormónu u človeka a u iných živočíchov. Túto vlastnosť je možné využiť na podporu rastu hospodárskych zvierat, chovaných na mäso a u človeka na liečenie stavov, u ktorých dochádza k zníženiu sekrécie rastového hormónu a tiež na zlepšenie stavov, u ktorých je možné využiť anabolických účinkov rastového hormónu.

Polymorfné formy, ktoré budú ďalej označované ako forma I, forma II, forma III, forma IV, forma V, forma VI, forma VII, forma VIII, forma IX a forma X majú výhodnejšie vlastnosti v porovnaní s ostatnými kryštalickými formami N-[1-(R)[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-ľ-yl)-karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonát a sú teda vhodnejšie na

-5použitie vo farmaceutických prostriedkoch. Výhodnou kryštalickou formou na farmaceutické použitie je forma I vzhľadom na svoju termodynamickú stálosť a tie na to, že nie je hygroskopická. Ďalšou výhodnou kryštalickou formou na farmaceutické použitie je forma IV, ktorá je zvlášť vhodná na použitie pri výrobe lisovaných tabliet. Forma IV má vyššiu sypnú hmotnosť ako ostatné formy.

Podstatu vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy I N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, tento postup spočíva v tom, že sa na roztok voľného N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]1 ‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etylj-2-amino-2-metylpropánamid v etylacetáte, obsahujúcom približne 8 % objemových etanolov pôsobí približne 1,1 ekvivalentu kyseliny metánsulfónovej s teplotou približne 50 °C, zmes sa zahreje na teplotu približne 55 °C a potom sa ochladí na približne 45 °C.

Prípadne je ešte možné potom teplotu zvýšiť na približne 51 °C a na tejto teplote zmes udržovať po dobu 2 až 24 hodín.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj ďalší spôsob výroby vyššie uvedenej formy I, ktorý spočíva v tom, že sa k roztoku voľného N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘piperidín]-1 ‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidu v etylacetáte s obsahom približne 8 % objemových etanolu pri teplote 50 až 55 °C striedavo pridáva, približne 1,1 ekvivalentu kyseliny metánsulfónovej a forma I N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, pričom poradie pridávania nie je kritické, potom sa zmes zahrieva na približne 55 °C po dobu približne 2 až 15 hodín, potom sa ochladí na približne 25 až 30 °C a pri tejto teplote sa nechá stáť 2 až 3 hodiny.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj ďalší možný spôsob výroby vyššie uvedenej formy I, ktorý spočíva vtom, že sa mieša roztok formy II N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyl-6oxy)-etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu v izopropanole pri teplote približne 25 °C po dobu 2 až 24 hodín.

Súčasť podstaty vynálezu je tiež spôsob výroby formy II N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)-etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa na roztok voľného N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4*-piperidín]-1 ‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidu v etylacetáte, obsahujúcom približne 8 % objemových etanolu pôsobí približne 1,1 ekvivalentom kyseliny metánsulfónovej pri teplote približne 50 °C, potom sa roztok zahreje na približne 55 °C, potom sa ochladí na teplotu miestnosti.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy IV N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa rozpustí N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonát v niektorej z morfologických foriem v roztoku v zmesi etanolu s vody, s výhodou v objemovom pomere 25:75, rozpúšťadlo sa z roztoku odparí, s výhodou pri teplote 40 °C, tuhý podiel sa zomelie na jemný prášok a získaný tuhý prášok sa nechá stáť pri relatívnej vlhkosti približne 75 %. Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj ďalší možný spôsob výroby formy IV N-[1(R)-[(1,2-d ihyd ro-1 -metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-1 ‘-yl)karbonyl]-2-(fenyl-metyloxy)etylj-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa nechá prekryštalizovať roztok N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropán-amidmetánsulfonátu s ľubovoľným morfologickým zložením zo zmesi etylacetátu, etanolu a vody, s výhodou v objemovom pomere 24,8:1,6:1,95.

Súčasť podstaty tvorí aj ďalší spôsob na výrobu formy IV N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa forma I tejto látky vystaví pôsobeniu relatívnej vlhkosti vyššej ako 75 %, s výhodou

-7pôsobeniu relatívnej vlhkosti približne 88 % pri teplote miestnosti po dostatočne dlhú dobu.

Podstatu vynálezu tvorí aj ďalší spôsob výroby formy IV N-[1-(R)-[(1,2dÍhydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa táto forma izoluje zo suspenzie formy I tejto látky v zmesi izopropylacetátu a etanolu v objemovom pomere 90:10 s obsahom približne 2,8 % hmotnostných vody pri teplote približne 25 °C.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy V N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]~2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa vystaví forma IV tejto látky relatívnej vlhkosti nižšej ako 30 % pri teplote miestnosti.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy VI N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperídín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa suší forma V tejto látky v neprítomnosti vody približne pri teplote miestnosti, napríklad pod dusíkom, vysušeným molekulovým sitom pri teplote približne 25 °C.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy VII N-[1-(R)-[(1,2díhydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)-etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa táto látka izoluje zo suspenzie formy I alebo formy IV uvedenej látky v zmesi izopropylacetátu a etanolu v pomere 90:10 (objemový priemer) s obsahom približne 1,5 % hmotnostných vody.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy VIII N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, pri ktorom sa dehydratuje forma VII tejto látky v atmosfére bezvodého inertného plynu, napríklad v atmosfére bezvodého dusíka po dostatočne dlhú dobu.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí taktiež spôsob výroby formy IX N-[1-(R)[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-y|)karbonyl]-2-(fenylmetyl-oxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom,

-8že sa pripraví roztok tejto látky vo vode s akýmkoľvek morfologickým zložením, potom sa izoluje tuhá látka, ktorá sa vytvorí riadeným odparovaním roztoku pri relatívnej vlhkosti 20 % približne teplote miestnosti.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby formy X N-[1-(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, ktorý spočíva v tom, že sa suší forma IX uvedenej látky pri teplote miestnosti a vlhkosti okolia po dostatočne dlhú dobu.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj ďalší možný spôsob výroby formy X N-[1 (RHÍI^-dihydro-l-metánsulfonylspirotSH-indol-S^'-piperidínj-ľ-yOkarbonylj-ľ-ífenyl-metyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu, pri ktorom sa vystaví forma I tejto látky pôsobeniu 100% relatívnej vlhkosti na dobu približne 1 až 4 dni.

Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj spôsob výroby morfologicky homogénneho N-[1 -(R)-[( 1,2-dihydro-1 -metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1 ‘-y I)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu ktorýmkoľvek z vyššie uvedených spôsobov.

Všetky vyššie uvedené nové polymorfné formy N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu sú látky, zvyšujúce sekréciu rastového hormónu, ktoré je možné využiť u hospodárskych zvierat, chovaných na mäso na podporu ich rastu a tým na dosiahnutie vyššej efektívnosti produkcie mäsa. U človeka je možné tieto látky použiť v prípade stavov, pri ktorých je znížená sekrécia rastového hormónu a tiež v prípade stavov, u ktorých je možné využiť anabolický účinok rastového hormónu. Súčasť podstaty vynálezu tvorí aj farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje vyššie uvedené polymorfné formy ako svoju účinnú zložku.

Údaje, získané v komore na diferenciálnu kalorimetriu DSC

Krivka pre formu I N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyIspiro[3H-indol-3,4‘piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamid-metán-9sulfonátu pri zvyšovaní teploty o 10 °C/min v otvorenej nádobke pod dusíkom prebieha v priebehu topenia ako jediná endotermická krivka s najvyššou teplotou približne 180 °C a extrapolovanou teplotou pri teplote topenia približne 170 °C, teplo, spojené s touto krivkou je približne 53 J/g.

Krivka pre formu II N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu pri zvyšovaní teploty o 10 °C/min v otvorenej nádobe pod dusíkom prebieha v priebehu topenia ako jediná endotermická krivka pri najvyššej teplote približne 174 °C a extrapolovanej teplote pri teplote topenia približne 165 °C, teplo, spojené s touto krivkou je približne 37 J/g.

Krivka pre formu IV N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu pri zvyšovaní teploty o 10 °C/min v otvorenej nádobe pod dusíkom prebieha ako endotermická krivka, spojená so stratou vody pri teplote približne 45 °C a potom ako endotermická krivka s najvyššou teplotou približne 134 °C a extrapolovanou teplotou pri teplote topenia približne 129 °C vzhľadom na topenie formy VI, teplo, spojené s touto krivkou je približne 23 J/g.

Ďalej sú uvedené zhrnuté údaje pre DSC, pri ktorých bola vzorka zahrievaná pri zvyšovaní teploty o 10 °C/min pod dusíkom, uvedená je extrapolovaná teplota pri začiatku topenia danej formy.

Forma I 170 °C (endotermická krivka)

Forma II 165 °C (endotermická krivka)

Forma VI 129 °C (endotermická krivka).

Forma I N-[1 ~(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je bezvodá látka s teplotou topenia 169 °C a s rozpustnosťou v izopropanole 4,6 mg/ml.

Forma II N-[1 -(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je bezvodá látka, ktorá má teplotu topenia 158 °C a rozpustnosť v izopropanole 12,3 mg/ml.

- 10Forma III N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je hydrát, charakterizovaný endotermickou krivkou so stratou vody pri prvom teplotnom vrchole 46 °C, nasledovaným endotermickou krivkou s topením a malým rozkladom pri extrapolovanej teplote začiatku topenia 123 °C.

Forma IV N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je hydrát, charakterizovaný endotermickou krivkou so stratou vody pri prvom teplotnom vrchole 45 °C s následnou endotermickou krivkou pre topenie a rozklad s extrapolovanou teplotou začiatku topenia 129 °C (pravdepodobne v dôsledku topenia a rozkladu formy VI).

Forma IV uvedenej látky je hygroskopický hydrát, ktorý obsahuje 3,5 mol vody na mol uvedenej látky.

Forma V N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je hygroskopický hydrát, obsahujúci jeden mol vody na 1 ml vyššie uvedenej formy V.

Forma VI N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je bezvodá látka s teplotou topenia 129 °C.

Forma VII N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je hydrát so širokou endotermickou krivkou so stratou vody pri teplotnom vrchole 60 °C a nasledovanou endotermickou krivkou pre topenie a rozklad pri extrapolovanej teplote začiatku topenia 144 °C (pravdepodobne v dôsledku topenia a rozkladu formy VIII).

Forma VIII N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-ľ-yl)karbonylj-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu je bezvodá látka s teplotou topenia 144 °C.

Forma X N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfo- 11 nátu je charakterizovaná širokou endotermickou krivkou pri strate vody pri teplotnom vrchole 49 °C.

Difrakcia v rtg-žiarení, XRPD

Difrakcia v rtg-žiarení je široko využívaná na osvetľovanie molekulovej štruktúry, kryštalickej formy a polumorfia rôznych látok. Skúšky boli uskutočňované pri použití prístroja Philips APD3720, ide o automatické zariadenie, pri ktorom bolo použité zariadenie Kalfa medi. Meranie bolo uskutočňované so 2 do 40° (2 teta), vzorka bola udržovaná na teplote miestnosti.

Pre formu I boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 6,5, 14,7, 16,9,

17,1, 17,9, 19,5,21,1, 21,7 a 22,0° (2 teta).

Pre formu II boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 4,8, 11,8, 17,5, 19,4, 21,6, 21,9, 22,5 a 2,7° (2 teta).

Pre formu III boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 13,8, 14,1, 18,0, 19,5, 20,1, 20,6, 21,8 a 25,7° (2 teta).

Pre formu IV boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 16,0, 16,2, 18,3, 20,1, 21,0 a 24,2° (2 teta).

Pre formu V boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 14,8, 17,1, 17,6, 19,0, 19,1, 19,4, 20,6, 21,5 a 21,8° (2 teta).

Pre formu VI boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 9,8, 14,0, 14,8,

17,1, 17,6, 19,0, 19,5, 20,6 a 21,6° (2 teta).

Pre formu VII boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 9,1, 11,3,

17.1, 17,4, 20,0, 22,1 a 24,5° (2 teta).

Pre formu VIII boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 11,5, 11,6,

18.1, 19,6, 22,5, 24,7 a 24,8° (2 teta).

Pre formu IX boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 8,0, 12,1, 15,3, 15,8, 19,6, 19,7, 21,1, 22,3 a 23,7° (teta).

Pre formu X boli získané nasledujúce hlavné hodnoty ohybu 15,5, 15,8, 18,0, 18,4, 18,6, 19,4, 20,7, 20,8, 23,9 a 24,8° (2 teta).

Vyššie uvedené hodnoty ukazujú, že všetky uvedené formy I až X sú odlišné kryštalické formy.

- 12Vyššie uvedené hodnoty ukazujú, že všetky uvedené formy I až X sú odlišné kryštalické formy.

Mikroskopické sledovanie

Polymorfné formy boli sledované pri zväčšení 100x v bežnom aj v polarizovanom svetle. Forma I a forma II tvorí ihličkové častice a obe tieto formy sú v polarizovanom svetle dvojlomé.

Hygroskopickosť

Celkový obsah prchavého podielu (pri stanovení analýzou TGA) pre tuhé vzorky foriem I, II, III a IV po vystavení rôznym hodnotám riadenej vlhkosti je zhrnutý v nasledujúcej tabuľke. Bolo ukázané, že forma I obsahuje 0,79 % hmotnostných vody, forma II obsahuje 0,56 % hmotnostných vody, forma III obsahuje 4,5 až 5,0 % hmotnostných vody a forma IV obsahuje 9,5 až 10,0 % hmotnostných vody.

Hygroskopickosť bola sledovaná uložením tuhých látok v uzavretom priestore so stálou relatívnou vlhkosťou. Pri porovnaní bezvodých foriem I a II pri teplote miestnosti bolo zistené, že forma II je hygroskopická a prijíma veľké množstvo vody od relatívnej vlhkosti 65 %. Príjem vody vo väčšom množstve nie je možné dokázať pre formu I s výnimkou prípadov, keď bola skladovaná pri relatívnej vlhkosti vyššej ako 76%. Získané výsledky sú uvedené v tabuľkách 1 a 2.

Tabuľka 1

% RH	forma I % zmeny	forma II % zmeny
0	-0,02	+0,08
11	-0,05	+0,02
33	-	+0,33
47	+0,21	+0,39
65	+0,37	>10,0a
76	+0,12	>10,oa
100	>12,0	>10,0ab

- 13^a vzorka sa mení na gumovitú polotuhú látku ^b premena na formu IV pôsobením vlhkosti okolia

Údaje ukazujú, že forma I uvedenej látky je v podstate bezvodá.

Tabuľka 2

% RH	forma I, % zmeny
7	+0,4
22	+0,3
47	+0,5
68	+0,6
88	+12,9*
100	+23,9X

^x materiál sa roztápa RH = relatívna vlhkosť

Hydrtatované formy III a IV N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3Hindol-3,4‘-piperi-dín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidu boli tiež vyhodnotené uložením pri stálej relatívnej vlhkosti na dobu 48 hodín pri teplote miestnosti. U formy III bolo možné pozorovať príjem vody po 48 hodinách pri relatívnej vlhkosti 33 %. U formy IV nedošlo k príjmu vyššieho množstva vody až do relatívnej vlhkosti 100 %, došlo však ku strate hydratačnej vody pri uložení pri relatívnej vlhkosti 11 % alebo nižšej. Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 3.

- 14Tabuľka 3

Príjem vlhkosti pri teplote miestnosti v priebehu 48 hodín

% RH	forma III, % zmeny	forma IV, % zmeny
0	-	-7,8
11	-0,15	-4,9
33	+2,23	+0,3
47	+3,99	+0,7
66	-	+1,4
76	+3,76	+1,5
100	-	+5,3

Rozpustnosť

Rozpustnosť formy I v destilovanej vode pri teplote miestnosti je vyššia ako 100 mg/ml. Rozpustnosť formy II vo vode pri teplote miestnosti v roztoku, pufrovanom na pH 4 až 9 je taktiež vyššia ako 100 mg/ml. Ďalej nie je uvedená rozpustnosť formy I v zmesi etanolu a vody.

etanol/voda, %	>100
25/75	>100
50/50	>90
75/25	>90
100% etanol

Teplotná stálosť

Stálosť uvedených foriem v tuhom stave bola sledovaná uložením v sklenených fľaštičkách so skrutkovým vekom v tme. Vzorky boli analyzované

pomocou HPLC,	pôvodná látka bola analyzovaná kvantitatívne. Bol použitý
nasledujúci postup:
stĺpec:	Beckman Ultrasphere ODS (250 x 4,6 mm, 5 μ)
mobilná fáza:	0,1% TEA, pH 4,0, H3PO4:acetonitril (65:35)
rýchlosť prietoku:	1,0 ml/min
detekcia pri:	228 nm
doba prietoku:	14 minút
teplota stĺpca:	teplota miestnosti
objem materiálu:	20 μΙ roztoku N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H- indol-3,4‘-piperi-dín]-1 ‘-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2- amino-2-metylpropánamidmetánsulfonátu s obsahom 50 pg/ml.

Výsledky pre formu I a II sú ďalej uvedené v % hmotnostných počiatočného množstva.

Forma I - % počiatočného množstva

°C	6 týždňov	17 týždňov
40	100,1	98,7
60	100,7	101,3
80	100,7	99,4

Forma II - % počiatočného množstva po týždňoch

°C	1	2	4	8	12	24
40	99,7	100,7	99,5	-	100,1	100,1
60	99,4	99,6	100,3	100,0	101,0	100,8
80	99,2	100,3	99,2	99,8	100,4	-

- 16Získané výsledky ukazujú, že čisté tuhé formy I a II majú dobrú tepelnú stálosť.

Spôsob výroby účinnej látky je možné vyjadriť nasledujúcou reakčnou schémou:

Schéma I

O^OBn

H I

BnOCOCI _ ^{104 eq}· (^COCI)gK₂CO₃, H₂O < kat. DMF

O^OBn

W Pd/C, H₂

DIEA tioanizol

COCI

O

OBn

NaBH₄/MeOH

COOH

O.

COOH

O^OBn N

TFA

y~OBn

H

CH=NNHPh

1b

- 17Schéma 1 - pokračovanie

l

SO₂Me

Ph^/''O^/'Y^C°^{2H 10} NHBOC

S O₂Me

DCC

HOBT iPrOAc:H₂O

18Ako je zrejmé zo schémy I, spracováva sa CBZ-spiroindolín pred hydrogenáciou aktívnym uhlím Darco (20 % hmotnostných). Hydrogenácia sa uskutočňuje v etanole pri 65 °C za energického miešania pri použití 10% Pd/C.

Roztok zlúčeniny 1b v izopropylacetáte a vode sa nechá reagovať s bežne dodávaným N-BOC-O-benzyl-D-serínom v prítomnosti dicyklohexylkarbodiimudy DCC a 1-hydroxybenzotriazolu HOBt. Po odfiltrovaní dicyklohexylmočoviny DCU ako vedľajšieho produktu sa dvojfázový filtrát rozdelí a organická vrstva sa postupne premýva 1M vodným hydroxidom sodným, 0,5M vodnou kyselinou chlorovodíkovou a nakoniec nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Zlepšené výsledky tejto väzby je možné dosiahnuť tak, že sa na roztok voľnej aminokyseliny v zmesi izopropylacetátu a vody pôsobí DCC, HOBT a potom sa pridá pri teplote miestnosti aminokyselina a reakcia sa nechá prebiehať 3 až 5 hodín. Potom sa zmes zahustí vo vákuu a rozpúšťadlo sa vymení, namiesto izopropylacetátu sa použije etanol. Zmena rozpúšťadla sa zvyčajne uskutočňuje pridaním nového rozpúšťadla v množstve, rovnom trojnásobku objemu zmesi a potom odparením zmesi na pôvodný objem.

Zo zlúčeniny vzorca 11 sa odstráni skupina BOC pôsobením troch ekvivalentov kyseliny metánsulfónovej MsOH v etanole pri teplote 35 až 40 °C. Potom sa roztok delí medzi isopropylacetát a 1M vodný roztok hydroxidu sodného, čím sa získa zlúčenina vzorca 12.

Táto látka sa nechá reagovať s kyselinou N-BOC-alfa-aminomaslovou, reakcia dobre prebieha v dvojfázovom systéme rozpúšťadiel, napríklad v zmesi izopropylacetátu a vody 1:1 v prítomnosti 1,1 ekvivalentu DCC a HOBt DCU sa odfiltruje, vrstvy sa oddelia a organická vrstva sa postupne premýva 1M hydroxidom sodným, 0,5 M vodnou kyselinou chlorovodíkovou a nasýteným vodným hydrogénuhličitanom sodným, čím sa získa zlúčenina vzorca 14.

Rozpúšťadlo sa nahradí etanolom tak, aby bolo možné odštiepiť skupinu Boe kyselinou metánsulfónovou. Odstránenie ochrannej skupiny zo zlúčeniny vzorca 14 je ťažšie ako jej odstránenie zo zlúčeniny vzorca 11, je nutné použiť koncentrovaný roztok kyseliny metánsulfónovej v etanole a teploty 35 až 40 °C. Potom sa reakčná zmes extrahuje etylacetátom s obsahom hydroxidu sodného a

- 19izoluje sa voľný amín vzorca 15. Organická vrstva sa dobre premyje 1N hydroxidom sodným na zaistenie úplného odstránenia kyseliny metánsulfónovej.

Etylacetátový roztok voľnej bázy vzorca 15 v etylacetáte sa zahustí vo vákuu a potom sa aezotrópne vysuší až na hodnotu KF nižšiu ako 500 mg/ml tak, že sa pridajú dva objemy zmesi etylacetátu a etanolu 90:10 a potom dva objemy etylacetátu. Výsledný bezvodý, mierne zakalený roztok voľnej bázy vzorca 16 v etylacetáte sa spracováva pôsobením 25 % hmotnostných aktívneho uhlia Darco G-60 pri teplote miestnosti na dobu 10 hodín. Potom sa aktívne uhlie odfiltruje, čím sa získa voľná báza vzorca 15.

Tvorba soli vzorca 16 s kyselinou metánsulfónovou zo zlúčeniny vzorca 15 sa uskutočňuje v etylacetáte pôsobením 1,1 ekvivalentu MsOH pri teplote 50 °C.. Voľná báza vzorca 15 sa spracuje pôsobením 8 % objemových etanolu a jedného ekvivalentu vody a zmes sa zahrieva na 55 °C až do úplného rozpustenia. Ochladením na teplotu miestnosti a miešaním výslednej suspenzie 4 hodiny sa získa kryštalická látka vzorca 16, ide o kryštalickú formu II, ktorej rozpustnosť v izopropylacetáte je 12 g/ml.

Premena formy II na formu I sa uskutoční tak, že sa soľ vytvorí v zmesi etylacetátu a etanolu ako je uvedené vyššie, avšak namiesto ochladenia počiatočného roztoku soli z teploty 55 °C na teplotu miestnosti sa roztok ochladí len na 45 °C. Pri tejto teplote sa začnú tvoriť kryštáliky a suspenzia v priebehu času zhustne. Potom sa teplota zvýši na 51 °C a pri tejto teplote sa suspenzia nechá stáť cez noc. Týmto spôsobom dôjde k úplnej premene na formu I zlúčeniny vzorca 16.

S výhodou sa premena formy II na formu I uskutočňuje tak, že sa k roztoku voľnej bázy v zmesi etylacetátu a etanolu pri teplote 50 až 55 °C pridajú očkovacie kryštáliky formy I a potom sa zmes nechá stáť. Je možné postupovať tak, že sa voľná báza vzorca 15 uvedie do styku s 1,1 ekvivalentom kyseliny metánsulfónovej v 8% etanole v etylacetáte pri teplote 50 až 55 °C. Zmes sa potom naočkuje približne 2 % hmotnostnými formy I metánsulfonátu vzorca 16 a potom sa nechá stáť cez noc pri teplote 55 °C. Potom sa zmes ochladí na teplotu miestnosti a nechá sa stáť približne 2 až 3 hodiny. Produkt sa oddelí filtráciou pri teplote

-20miestnosti pod dusíkom, vysuší sa pri 35 °C vo vákuu a preosieva sa sitom za vzniku metánsulfonátu vzorca 16.

Soľ kyseliny metánsulfónovej vzorca 16 môže byť vytvorená aj tak, že sa striedavo pridáva 1,1 ekvivalentu MsOH a očkovacích kryštálikov formy I k roztoku voľnej bázy v zmesi etylacetátu a etanolu pri teplote približne 50 °C, pričom poradie pridávania MsOH a očkovacích kryštálikov nie je kritické.

Využiteľnosť polymorfných zlúčenín podľa vynálezu ako látok, zvyšujúcich sekréciu rastového hormónu je možné dokázať známymi postupmi, napríklad podľa publikácie Smith a ďalší, Science, 260, 1640 až 1643, 1993, najmä podľa obr. 2 a príslušného textu v tejto publikácii, pri tomto postupe boli všetky polymorfné formy podľa vynálezu účinné ako látky, zvyšujúce sekréciu rastového hormónu. Je teda možné považovať za dokázané, že polymorfné formy podľa vynálezu zvyšujú sekréciu prírodného rastového hormónu.

Polymorfné látky podľa vynálezu je možné využiť in vitro ako veľmi dobrý nástroj na porozumenie regulácie sekrécie rastového hormónu na úrovni hypofýzy. V týchto prípadoch je nutné vyhodnotiť veľké množstvo faktorov, o ktorých je známe alebo ktoré pravdepodobne môžu ovplyvniť sekréciu rastového hormónu, ako sú vek, pohlavie, výživa, koncentrácia glukózy, aminokyselín a mastných kyselín, dôležitý je aj stav výživy, napríklad hladovanie. Okrem toho je možné využiť uvedené látky na vyhodnotenie možnej modifikácie uvoľnenia rastového hormónu inými hormónmi. Bolo už napríklad dokázané, že somatostatín bráni uvoľneniu rastového hormónu. Z ďalších hormónov, ktorých vplyv na uvoľnenie rastového hormónu je dôležitý a je ešte nutné ich úplne objasniť, je možné uviesť pohlavné hormóny, ako testosterón, estradiol a progesterón, hormóny, ako testosterón, estradiol a progesterón, hormóny nadobličiek, ako kortisol a ďalšie kortikoidy, epinefrín a norepinefrín, hormóny slinivky brušnej a ďalších častí tráviacej sústavy, ako inzulín, glukagón, gastrín a sekretín, niektoré vazoaktívne peptidy, ako bombesín, neurokiníny a hormóny štítnej žľazy, ako tyroxín a trijódtyronín. Polymorfné zlúčeniny podľa vynálezu je tiež možné použiť na sledovanie negatívnych alebo pozitívnych spätných väzieb hormónov hypofýzy, napríklad rastového hormónu a peptidov typu endorfínu na hypofýzu na

- 21 modifikáciu uvoľnenia rastového hormónu. Zvláštny záujem vedeckých pracovníkov sa sústredí na použitie uvedených látok na osvetlenie subcelulárneho mechanizmu, ktorým je ovplyvnené uvoľnenie rastového hormónu.

Polymorfné látky podľa vynálezu je možné podávať in vivo živočíchom vrátane človeka na uvoľnenie rastového hormónu. Je napríklad možné tieto látky podávať hospodárskym zvieratám, ako prascom, hovädziemu dobytku, ovciam a podobne na urýchlenie rýchlosti ich rastu a na zvýšenie ich konečnej hmotnosti, na zlepšené využitie krmiva a na zvýšenie produkcie mlieka. Okrem toho je možné uvedené látky použiť in vivo ako diagnostický prostriedok na priame stanovenie, či je hypofýza schopná uvoľňovať rastový hormón. Je napríklad možné podávať uvedené látky in vivo a pred aj po podaní odoberať vzorky séra a v týchto vzorkách stanoviť koncentráciu rastového hormónu. Porovnaním množstva rastového hormónu v týchto vzorkách je potom možné získať priamy obraz schopnosti hypofýzy uvoľňovať rastový hormón.

Ako už bolo uvedené, tvorí súčasť podstaty vynálezu aj farmaceutický prostriedok, obsahujúci ako svoju účinnú zložku aspoň jednu polymorfnú látku podľa vynálezu spolu s farmaceutickým nosičom alebo riedidlom. Farmaceutický prostriedok môže prípadne obsahovať ešte ďalšiu účinnú látku, napríklad anabolickú látku, antibiotikum alebo látku na liečenie osteoporózy alebo tiež kortikosteroid na zníženie katabolických vedľajších účinkov alebo iné farmaceutický účinné látky, zvyšujúce účinnosť a znižujúce vedľajšie účinky.

Z rastových a anabolických látok je možné uviesť: TRH, dietylstilbestrol, estrogény, beta-agonisty, teofylín, anabolické steroidy, enkefalíny, prostaglandíny rady E, zlúčeniny z US č. 3 239 345, ako zeranol, zlúčeniny z US č. 4 036 979, ako sulbenox alebo tiež peptidy, opísané v US č. 4 411 890.

Ďalšou možnou kombináciou je kombinácia zlúčenín podľa vynálezu s inými látkami, zvyšujúcimi sekréciu rastového hormónu, ako sú GHRP-6 a GHRP-1, opísané v US 4 411 890 a vo zverejnených prihláškach WO 89/07110, WO 89/07111 a B-HT920 a tiež hexarelín a GHRP-2 podľa WO 93/04081, okrem toho je možné použiť hormón, napomáhajúci uvoľneniu rastového hormónu, označovaný GHRH alebo aj GRF a jeho analógy alebo vlastný rastový hormón a jeho analógy a tiež somatomedíny vrátane IGF-1 a IGF-2 alebo a-adrenergné

-22agonisty, ako clonidín alebo sérotonín a tiež 5HTID agonisty, ako sumitriptan alebo látky, inhibujúce somatostatín alebo jeho uvoľnenie, ako sú fysostigmín a pyridostigmín. Zvlášť výhodné je použitie zlúčenín podľa vynálezu v kombinácii s faktorom, uvoľňujúcim rastový hormón alebo jeho analógy, IGF-1 alebo IGF-2. Napríklad je možné použiť zlúčeniny podľa vynálezu spolu s IGF-1 na liečenie alebo prevenciu obezity. Okrem toho je napríklad možné použiť zlúčeniny podľa vynálezu spolu s kyselinou retínovou na zlepšenie stavu svalstva a pokožky v priebehu starnutia.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu je možné pripraviť tak, že sa polymorfné látky podľa vynálezu spracujú s farmaceutickým nosičom alebo riedidlom.

Je známe, že možné použitie rastového hormónu je veľmi všestranné. Podávanie zlúčenín podľa vynálezu môže mať rovnaké účinky ako podávanie vlastného endogénneho rastového hormónu. Je teda možné zhrnúť použitie uvedených látok tak, že je možné ich využiť napríklad na stimuláciu uvoľnenia rastového hormónu u starších osôb, na liečenie nedostatku rastového hormónu u dospelých, na prevenciu katabolických vedľajších účinkov glukokortikoidov, na liečenie osteoporózy, na stimuláciu imunitného systému, na urýchlenie hojenia rán alebo hojenia kostných zlomenín, na liečenie retardácie rastu, na liečenie akútneho alebo chronického zlyhania alebo nedostatočnosti obličiek, na liečenie malého vzrastu, vrátane detí s nedostatkom rastového hormónu, na liečenie malého vzrastu spojeného s chronickými chorobami, na liečenie obezity a oneskorenia rastu, spojené ho s obezitou, na liečenie oneskorenia rastu, spojeného so syndrómom Prader-Willi a sTurnerovým syndrómom, na urýchlenie rekonvalescencie a skrátenie doby hospitalizácie u chorých s popáleninami alebo závažnými chirurgickými zákrokmi, napríklad na tráviacej sústave, na liečenie oneskorenia rastu plodu vo vnútri maternice a kostnej dysplazie, na liečenie neuropatií, na náhradu rastového hormónu u stresovaných chorých, na liečenie osteochondrodysplazií, Noonanovho syndrómu, schizofrénie, depresie, Alzheimerovej choroby, na liečenie spomaleného liečenia rán a psychosociálnej deprivácie, na liečenie pľúcnej dysfunkcie vrátane závislosti na umelom dýchaní, na zníženie katabolickej odpovede po chirurgických zákrokoch, na liečenie mal-23absorpčných syndrómov, na zníženie tachexie a straty bielkovín pri chronických ochoreniach, napríklad pri rakovine alebo AIDS, na urýchlenie prírastku na váhe a na vytváraní bielkovín u chorých s parenterálnou výživou, pri liečení hyperinzulinémie vrátane nesidioblastózy, na pomocné liečenie pri pokusoch o vyvolanie ovulácie a na prevenciu a liečenie žalúdočných a dvanástnikových vredov, na stimuláciu vývoja brzlíka a na prevenciu znižovania funkcie brzlíka s vekom, na pomocné liečenie chorých s chronickou hemodialýzou, na liečenie chorých s nedostatočnosťou imunitného systému a na podporu tvorby protilátok po očkovaní, na zvýšenie počtu lymfocytov u človeka a najmä na zvýšenie pomere buniek T₄/T₈ u chorých s poklesom tohto pomeru napríklad po traumatoch, ako sú uzavreté poranenia hlavy alebo po infekciách, napríklad bakteriálnych alebo vírusových, najmä pri infekcii HIV, na zlepšenie sily svalov, pohyblivosti, na udržanie dobrého stavu pokožky, metabolickej homeostázy alebo obličkovej hemeostázy u starších osôb, na stimuláciu osteoblastov, rastu chrupavky a na stimuláciu imunitného systému u rôznych živočíchov, vrátane porúch pri ich starnutí. Ďalej je možné tieto látky použiť na stimuláciu rastu vlny u oviec, na zvýšenie využitia krmiva, na urýchlenie rastu, zvýšenie produkcie mlieka a na zlepšenie kvality karkasu u hospodárskych zvierat. Okrem toho je ešte možné tieto látky použiť na liečenie ochorenia a stavov, ktoré je možné upraviť anabolickým účinkom rastového hormónu.

Zvlášť užitočné môžu byť zlúčeniny podľa vynálezu pri liečení stavu zo skupiny osteoporóza, katabolické ochorenia, nedostatočnosť imunitného systému vrátane ochorenia so zníženým pomerom buniek T4/T8, zlomeniny bedrových kĺbov, poruchy kostného a svalového systému u starých ľudí, znížená koncentrácia rastového hormónu u dospelých alebo u deti, obezita, kachexia a strata bielkovín v dôsledku chronického ochorenia, napríklad AIDS alebo zhubných nádorov a tiež na liečenie chorých, zotavujúcich sa po rozsiahlych chirurgických zákrokoch, poraneniach alebo popáleninách

Okrem toho je možné nové zlúčeniny podľa vynálezu využiť pri liečení chorôb, vyvolaných faktorom na uvoľnenie kortikotropínu alebo u chorôb, ktorých vznik je týmto faktorom uľahčený, pri liečení porúch, súvisiacich so stresom a úzkostnými stavmi, vrátane depresie a bolesti hlavy, na liečenie porúch hrubého

-24čreva, pri poklese imunity, pri infekciách HIV, pri Alzheimerovej chorobe, pri chorobách tráviacej sústavy, anorexii nervosa, pri hemorhagickom strese, v prípade abstinenčných príznakov po vysadení drog alebo alkoholu, v prípade návykov na určité látky a pri neplodnosti.

Je známe, že na liečenie vyššie uvedených ochorení a chorobných stavov sa v súčasnej dobe používa celý rad známych látok. Už vyššie bolo uvedené, že v prípade kombinácie takýchto látok, z ktorých niektoré boli uvedené, spolu s novými polymorfnými látkami podľa vynálezu je možné dosiahnuť ďalšie a často synergné účinky pri dosahovaní zvýšenej rýchlosti rastu, anabolických alebo iných žiadúcich účinkov týchto látok. V týchto kombináciách môžu byť známe účinné látky a nové zlúčeniny podľa vynálezu prítomné nezávisle v množstve jednej desatiny až niekoľkonásobku dávok, v ktorých sú tieto látky účinné v prípade, že sú použité jednotlivo.

Možnosť kombinovaného liečenia za účelom inhibície resorpcie kostného tkaniva, na prevenciu osteoporózy a na urýchlenie hojenia kostných zlomenín je možné ilustrovať na kombinácii bifosfonátov a zlúčenín podľa vynálezu, podporujúcich sekréciu rastového hormónu. Použitie bifosfonátov na uvedený účel je opísané napríklad v publikácii Hamdy N. A. T., Role of Bisphosphonates in Metabolic Bone Diseases, Trends in Endocrinol. Metab., 4, 19 až 25, 1993. Bifosfonáty, vhodné na toto použitie zahrnujú napríklad alendronát, tiludronát, dimetyl-APD, risedronát, etidronát, YM-175, clodronát, pamidronát a BM-210995. V súvislosti na účinnosti uvedených látok sa denná dávka bisfosfonátov pri perorálnom podaní pohybuje v rozmedzí 0,1 mg až 5 g a denná dávka látok, podporujúcich sekréciu rastového hormónu podľa vynálezu sa pohybuje v rozmedzí 0,01 mg až 20 mg/kg telesnej hmotnosti, tieto dávky je možné chorým podávať na účinné liečenie osteoporózy.

V prípade aiendronátu sa denná dávka 0,1 mg až 50 mg pri perorálnom podaní môže pre efektívne liečenie osteoporózy kombinovať s dávkou 0,01 mg až 20 mg/kg telesnej hmotnosti zlúčenín podľa vynálezu, zvyšujúcich sekréciu rastového hormónu. Pri liečení osteoporózy a ďalších porúch kostného systému je tiež možné použiť zlúčeniny podľa vynálezu v kombinácii s kalcitonínom,

-25estrogénmi, raloxifénom a látkami na doplnenie vápnika, napríklad citronanom vápenatým.

Anabolické účinky, najmä pri liečení geriatrických chorých mužského pohlavia je možné zaistiť kombináciou zlúčenín podľa vynálezu s anabolickými steroidmi, napríklad s oxymetanolom, metyltestosterónom, fluoxymesterónom, a stanozolom.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť podávané perorálne, parenterálne, napríklad vnútrosvalovo, intraperitonálne, vnútrožilovo, podkožnou injekciou alebo vo forme implantátu, ďalej do nosa, pošvy, konečníka, pod jazyk alebo aj miestne. Na tento účel sa zlúčeniny podľa vynálezu spracovávajú na liekové formy, vhodné pre jednotlivé spôsoby podania.

Tuhé liekové formy na perorálne podanie zahrnujú kapsuly, tablety, pilulky, prášky a granuláty. V týchto tuhých liekových formách sa účinná látka mieša s najmenej jedným inertným farmaceutický prijateľným nosičom, ako je sacharóza, laktóza alebo škrob. Tieto liekové formy môžu taktiež obsahovať, ako je vo farmaceutických prostriedkoch bežné, ešte ďalšie látky okrem inertných riedidiel, napríklad klzné látky, ako je stearan horečnatý. V prípade kapsúl, tabliet a piluliek môžu liekové formy obsahovať aj pufre. Okrem toho je možné tablety a pilulky opatriť enterosolventným povlakom.

Kvapalné liekové formy na perorálne podanie zahrnujú farmaceutický prijateľné emulzie, roztoky, suspenzie, sirupy, elixíry, tieto formy obsahujú bežné inertné riedidlá, napríklad vodu. Okrem toho môžu obsahovať ďalšie pomocné látky, ako zmáčadlá, emulgátory, suspenzné činidlá, sladidlá, látky na úpravu chuti a parfumy.

Prostriedky na parenterálne podanie zahrnujú sterilné vodné alebo nevodné roztoky, suspenzie alebo emulzie. Ako príklad nevodných rozpúšťadiel alebo nosných prostredí je možné uviesť propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje, ako olivový alebo kukuričný olej, želatínu a organické estery, vhodné na injekčné podanie, napríklad etyloleát. Tieto liekové formy môžu tiež obsahovať pomocné látky, ako konzervačné činidlá, zmáčadlá, emulgátory a dispergačné činidlá, prostriedky môžu byť sterilizované napríklad filtráciou cez filter, zadržujúci baktérie, pridaním sterilizačného činidla, ožiarením prostriedku alebo jeho zahrievaním.

-26Prostriedky taktiež môžu byť dodávané ako sterilné tuhé látky, určené na rozpustenie v sterilnej vode alebo inom sterilnom prostredí na injekčné podanie tesne pred použitím.

Prostriedky na rektálne alebo vaginálne podanie sú s výhodou čapíky, obsahujúce okrem účinnej látky pomocné látky, ako je kakaové maslo alebo iný základ na výrobu čapíkov.

Prostriedky na podanie nosnou sliznicou alebo pod jazyk je taktiež možné pripraviť pri použití bežných pomocných látok.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa podávajú človeku a iným živočíchom v dávkach, ktoré zaistia optimálnu účinnosť. Je zrejmé, že sa dávka v každom jednotlivom prípade môže meniť nielen v závislosti na zvolenej účinnej látke alebo liekovej forme, ale tiež na spôsobe podania, na povahe liečeného ochorenia, na veku a celkovom stave chorého, na výžive a na ďalších faktoroch, ktoré môže vyhodnotiť odborník. Výslednú dennú dávku musí v jednotlivých prípadoch vždy určiť ošetrujúci lekár.

Dávkovanie účinnej zložky vo farmaceutickom prostriedku podľa vynálezu sa môže meniť, množstvo účinnej zložky v prostriedku však musí byť také, aby bolo možné pripraviť vhodnú liekovú formu. Zvolená dávka závisí na požadovanom liečebnom účinku, na spôsobe podania a na celkovej dobe podania prostriedku. Na účinné uvoľnenie rastového hormónu u človeka a iných živočíchov, napríklad u cicavcov sa zvyčajne podávajú denné dávky v rozmedzí 0,001 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, s výhodou 0,001 až 25 mg/kg a najmä 0,01 až 10 mg/kg denne.

V nasledujúcich príkladoch budú vysvetlené rôzne spôsoby na prípravu polymorfných foriem podľa vynálezu, príklady sú určené na ilustráciu týchto postupov, v žiadnom smere však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

N-[1 -(R)-[(1,2-dihydro-1 -metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1 ‘-y I) ka rbo ny lj2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamid

-27Časť A: 1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]hydrochlorid

Do roztoku 1,20 g (5,8 mmol) 1‘-metyl-1,2-dihydrospiro[3H-indol-3,4‘piperidínu], ktorého príprava je opísaná H. Ongem a spol. v J. Med. Chem., 23, 981 až 986 (1983) v 20 ml dichlórmetánu sa pri teplote 0 °C pridá 0,90 ml (6,4 mmol) trietylamínu a 0,49 ml (6,35 mmol) metánsulfonylchloridu. Reakčná zmes sa 30 minút mieša, vleje sa do 15 ml nasýteného vodného roztoku uhličitanu sodného a dvakrát sa extrahuje 10 ml dichlórmetánu. Zlúčené organické extrakty sa premyjú 20 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, sušia sa nad bezvodým uhličitanom draselným, filtruje sa a rozpúšťadlo sa odstráni za zníženého tlaku. Vznikne 1,44 g svetložltého oleja metánsulfónamidu ako derivátu, ktorý sa bez ďalšieho čistenia použije v nasledujúcej syntéze.

Do roztoku surového produktu v 20 ml bezvodého 1,2-dichlóretánu sa pri teplote 0 °C pridá 1,0 ml (9,3 mmol) 1-chlóretylchlórformátu. reakčná zmes sa 30 minút mieša pri teplote miestnosti a následne 1 hodinu pri teplote refluxu. Zmes sa zahustí približne na jednu tretinu objemu, a následne sa zriedi 20 ml bezvodého metanolu. Po 1,5 hodine zahrievania pri teplote refluxu sa reakčná zmes ochladí na teplotu miestnosti a zahustí sa na približne jednu polovicu objemu. Zrazenina sa oddelí filtráciou a premyje sa malým množstvom studeného metanolu. Vznikne 1,0 g bielej tuhej látky ako piperidínhydrochloridu. Filtrát sa zahustí a pridá sa malé množstvo najskôr metanolu a následne éteru. Zrazenina sa znova oddelí filtráciou, premyje sa studeným metanolom a suší sa za vzniku ďalších 0,49 g požadovaného produktu. Celkom vznikne 1,49 g výslednej zlúčeniny s výťažkom 70 %.

¹H NMR (CDCI₃, 200 MHz) δ 7,43 - 7,20 (m, 3H), 7,10 (dd, 1H), 3,98 )bs, 2H), 3,55 - 3,40 (bd, 2H), 3,35 - 3,10 (m, 2H), 2,99 (s, 3H), 2,15 (t, 2H), 2,00 (t, 2H).

Časť B: N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘yl)karbonyl]-1‘-(fenylmetyloxy)etyl]-2-[1,1-dimetyletoxy)karbonyl)amino2-metylpropánamid

-28Do 0,35 g (1,15 mmol) (2R)-2-[(1,1-dimetyietoxy)karbonyl]amino-3-[2(fenylmetyloxy)etyl]-1-propánovej kyseliny v 13 ml dichlórmetánu sa pridá 0,325 g (1,07 mmol) 1,2-dihydro-1 -metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]hydrochloridu, 0,18 ml (1,63 mmol) N-metylmorfolínu, 0,159 g (1,18 mmol) 1-hydroxybenztriazolu (HOBT) a reakčná zmes sa 15 minút mieša. Po pridaní 0,31 g (1,62 mol) EDC sa zmes mieša ďalšiu 1 hodinu a pridá sa 60 μΙ N-metylmorfolínu. reakčná zmes sa mieša 45 minút, vleje sa do 5 ml vody. Organický podiel sa oddelí, premyje sa 5 ml 0,5N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej a 5 ml nasýteného vodného roztoku uhličitanu sodného. Zlúčené organické podiely sa sušia nad bezvodým síranom horečnatým a zahustia sa za vzniku 0,627 g žltej peny výsledného produktu, ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia v nasledujúcom postupe.

Do 0,627 g (1,07 mmol) vyššie uvedeného produktu v 5 ml dichlórmetánu sa pridá 1,0 ml kyseliny trifluóroctovej a reakčná zmes sa pri teplote miestnosti 75 minút mieša, pridá sa ďalší 1 ml kyseliny trifluóroctovej, reakčná zmes sa 10 minút mieša a potom sa zahustí a zriedi 5,0 ml dichlórmetánu. Po opatrnom prevedení na zásadité pH vliatím do 10 ml 10% vodného roztoku uhličitanu sodného sa organický podiel oddelí a vodný podiel sa ďalej extrahuje dvakrát 15 ml dichlórmetánu. Zlúčené organické podiely sa premyjú 5 ml vody, sušia sa nad uhličitanom draselným, filtrujú sa a zahustia za vzniku 0,486 g amínu ako svetložltej peny, ktorá sa použije pre nasledujúcu syntézu bez ďalšieho čistenia.

Do 0,486 g (1,01 mmol) amínu a 10 ml dichlórmetánu sa pridá 0,26 g (1,28 mmol) 2-[(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino-2-metylpropánovej kyseliny, 0,173 g (1,28 mmol) 1-hydroxybenztriazolu (HOBT) a 0,245 g (1,28 mol) EDC a vytvorená reakčná zmes sa mieša cez noc pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa vleje do 5,0 ml vody a organický podiel sa oddelí. Vodný podiel sa ďalej extrahuje 5 ml dichlórmetánu. Zlúčené organické podiely sa premyjú 5,0 ml 0,5N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej, 5 ml nasýteného vodného roztoku uhličitanu sodného, sušia sa nad bezvodým síranom horečnatým a zahustia sa za vzniku 0,751 g surového produktu ako žltej peny. Roztok tohto produktu v dichlórmetáne sa po absorpcii na 25 g silikagélu čistí chromatografiou pri elúcii najskôr zmesou hexánov, acetónu a dichlórmetánu v pomere 70:25:5 a následne zmesou hexánov,

-29acetónu a dichlórmetánu v pomere 65:30:5. Vznikne 0,63 g bielej tuhej látky výslednej zlúčeniny.

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) zlúčenina je zmesou rotamérov v pomere 3:2, δ 7,40 7,10 (m, 6H), 7,06 (d, 1/3H), 7,02 (t, 1/3H), 6,90 (t, 1/3H), 6,55 (d, 1/3H), 5,15 (m, 1H), 4,95 (bs, 1H), 4,63 (bd, 1/3H), 4,57 - 4,40 (m, 2 2/3H), 4,10 (bd, 1/3H), 4,00 (bd, 1/3H), 3,82 (t, 1 H), 3,78 - 3,62 (m, 2H), 3,60 - 3,50 (m, 1 H), 3,04 (q, 1 H), 2,87 (s, 1 H), 2,86 (s, 2H), 2,80 - 2,60 (m, 1 H), 1,90 (bs, 1 H), 2,85 - 2,75 (m, 1 H), 1,82 1,60 (m, 3H), 1,55 - 1,45 (m, 1 H), 1,45 (s, 4H), 1,42 (s, 2H), 1,39 (s, 9H).

Časť C: N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidhydrochlorid

Do 0,637 g (0,101 mmol) medzipriduktu časti B v 5 ml dichlórmetánu sa pridá 2,5 ml kyseliny trifluóroctovej a reakčná zmes sa 30 minút mieša pri teplote miestnosti. Zmes sa zahustí na olej, spracuje sa v 10 ml etylacetátu a premyje sa 8 ml 10% vodného roztoku uhličitanu sodného. Vodný diel sa ďalej extrahuje 5 ml etylacetátu. Zlúčené organické podiely sa premyjú 10 ml vody, sušia sa nad síranom horečnatým, filtrujú sa a zahustia sa za vzniku 0,512 g voľných báz ako biela pena.

Do roztoku 0,512 g voľných báz v 5 ml etylacetátu sa pri teplote 0 °C pridá 0,2 ml nasýteného roztoku kyseliny chlorovodíkovej v etylacetáte a 1,5 hodiny sa mieša. Biela zrazenina sa oddelí filtráciou pod dusíkom, premyje sa éterom a suší sa za vzniku 0,50 g výslednej zlúčeniny ako biela tuhá látka.

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): zlúčenina je zmesou rotamérov v pomere 3:2, δ 7,40 - 7,28 (m, 4H), 7,25 - 7,17 (m, 2H), 7,08 (t, 1/3H), 7,00 (t, 1/3H), 6,80 (d, 1/3H), 5,16 (ddd, 1H), 4,60 - 4,42 (m, 3H), 4,05 (t, 1H), 3,90 (bs, 2H), 3,83 - 3,70 (m, 2H), 3,30 - 3,15 (m, 1H), 2,97 (s, 1H), 2,95 (s, 2H), 2,90 - 2,78 (m, 1H), 1,96 (t, 1/3H), 1,85 - 1,65 (m, 4H), 1,63 (s, 2H), 1,60 (s, 4H).

-30Príklad 2

N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamid

Časť A: alylester kyseliny (2R)-[[[2-(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino]-2,2-dimetyl1-oxoetyl]amino-2-(fenylmetoxy)etyl

Výsledná zlúčenina sa pripraví z (2R)-2-[(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino3-(fenylmetyloxy)etyl-propánovej kyseliny a alylalkoholu väzbovou feakciou v metylénchloride za prítomnosti EDC a DMAP.

¹H NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 7,25 (s, 5H), 5,8 (m, 1H), 5,2 (dd, 2H), 5,0 (bs, 1H),

4.7 (m, 1H), 4,6 (m, 2H), 4,4 (dd, 2H), 3,9 (dd, 1H), 3,6 (dd, 1H), 1,45 (d, 6H), 1,39 (s, 9H).

Časť B: (2R)-[[[2-(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino]-2,2-dimetyl-1-oxoetyl]amino-2(fenylmetoxy)etyl]-1 -propánová kyselina

Do miešaného roztoku 6,7 g (15,9 mmol) surového medziproduktu časti A,

1.8 g (0,1 ekvivalentu) tetrakis(trifenylfosfín)paládia a 1,25 g (0,3 ekvivalenty) trifenylfosfínu sa pridá 35 ml 0,5M roztoku 2-etylhexanoátu draselného v etylacetáte. Reakčná zmes sa 1 hodinu mieša pri teplote miestnosti v atmosfére dusíka a potom sa zriedi 100 ml éteru a vleje sa do ľadovej vody. Organický podiel sa oddelí a vodný podiel sa okyslí pridaním 20% roztoku kyseliny citrónovej. Po extrakcii etylacetátom sa extrakty premyjú nasýteným roztokom chloridu sodného, sušia sa nad síranom horečnatým, filtrujú sa a odparujú za vzniku výslednej zlúčeniny ako tuhej látky.

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,3 (s, 5H), 4,7 (m, 1H), 4,5 (s, 2H), 4,0 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 1,4 (d, 6H), 1,3 (s, 9H).

-31 Časť C: N-[1-(R)-[(1_>2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-1‘yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-(1,1 -dimetyl-etoxy)karbonyl]amino-2-metyl-propánamid

Do reakčného roztoku 1,0 g (3,44 mmol) 1-metánsulfonylspiro[indolín-3,4'piperidín]hydrochloridu, 1,44 g (3,78 mmol) (2R)-[[2-(1,1-dimetyletoxy)karbo-nyl)amino]-2,2-dimetyl-1-oxoetyl]amino-2-(fenylmetyloxy)etyl]-1-propánovej kyseliny, 0,58 ml (5,20 mmol) N-metylmorfolínu a 0,58 g (3,78 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT) v 50 ml dichlórmetánu sa pridá 1,03 g (5,20 mmol) EDC a reakčná zmes sa 16 hodín mieša pri teplote miestnosti. Zmes sa zriedi 50 ml dichlórmetánu a premyje sa 50 ml vodného roztoku uhličitanu sodného, suší sa nad bezvodým síranom horečnatým, filtruje sa a zahustí. Vytvorený zvyšok sa po absorpcii na 50 g silikagélu čistí rýchlou chromatografiou za vzniku 2,148 g bezfarebnej peny výslednej zlúčeniny s výťažkom 90 %.

¹H NMR (400 MHz, CDCb) zlúčenina je zmesou rotamérov v pomere 3:2, δ 7,40 7,10 (m, 6H), 7,06 (d, 1/3H), 7,02 (t, 1/3H), 6,90 (t, 1/3H), 6,55 (d, 1/3H), 5,15 (m, 1H), 4,95 (bs, 1H), 4,63 (bd, 1/3H), 4,57 - 4,40 (m, 2 2/3H), 4,10 (bd, 1/3H), 4,00 (bd, 1/3H), 3,82 (t, 1H), 3,78 - 3,62 (m, 2H), 3,60 - 3,50 (m, 1H), 3,04 (q, 1H), 2,87 (s, 1H), 2,86 (s, 2H), 2,80 - 2,60 (m, 1H), 1,90 (bs, 1H), 2,85 - 2,75 (m, 1H), 1,82 1,60 (m, 3H), 1,55- 1,45 (m, 1 H), 1,45 (s, 4H), 1,42 (s, 2H), 1,39 (s, 9H).

Časť D: N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-pÍperÍdín]-1‘yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidhydrochlorid

Do roztoku 2,148 g (3,41 mmol) medziproduktu časti C v 10 ml dichlórmetánu sa pridá 5 ml kyseliny trifluóroctovej. Zmes sa 1 hodinu mieša, zahustí sa a premení na bázické pH pridaním 100 ml 5% vodného roztoku uhličitanu sodného a trikrát sa extrahuje 50 ml dichlórmetánu. Zlúčené organické extrakty sa premyjú 50 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, sušia sa nad bezvodým uhličitanom draselným, filtruje sa a zahustí za vzniku bezfarebnej peny.

-32Do roztoku tejto peny v 25 ml etylacetátu sa pri teplote 0 °C pridajú 4 ml 1M roztoku kyseliny chlorovodíkovej v etylacetáte. Zrazenina sa oddelí filtráciou, premyje sa najskôr etylacetátom a následnej zmesou etylacetátu a éteru v pomere 1:1 za vzniku 1,79 g bezfarebnej tuhej látky výslednej zlúčeniny s výťažkom 93 %. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) zlúčenina je zmesou rotamérov v pomere 3:2, δ 7,40 7,28 (m, 4H), 7,25 - 7,17 (m, 2H), 7,08 (t, 1/3H), 7,00 (t, 1/3H), 6,80 (d, 1/3H), 5,16 (ddd, 1H), 4,60 - 4,42 (m, 3H), 4,05 (t, 1H), 3,90 (bs, 2H), 3,83 - 3,70 (m, 2H), 3,30 - 3,15 (m, 1H), 2,97 (s, 1H), 2,95 (s, 2H), 2,90 - 2,78 (m, 1H), 1,96 (t, 1/3H), 1,85 1,65 (m, 4H), 1,63 (s, 2H), 1,60 (s, 4H).

Príklad 3

N-[1-(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4‘-piperidín]-1‘-yl)karbonyl]2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmesylát

Výsledná zlúčenina sa pripraví pôsobením kyseliny metánsulfónovej na voľnej báze výslednej zlúčeniny časti D príkladu 5. Po kryštalizácii zo zmesi etylacetátu a etanolu a vody vznikne produkt s teplotou topenia 166 až 168 °C. Ide o polymorfnú formu II, ktorá sa určovala difrakciou RTG žiarenia na práškovom materiáli s hlavnými ohybmi pri 4,7, 11,6, 17,4, 19,2 a 21,6° (2 teta). Ďalej sa určovala diferenciálna kalorimetria pri stúpaní teploty o 10 °C/minútu v otvorenej nádobe pod dusíkom. Bolo možné pozorovať jedinú endotermickú krivku s vrcholom pri teplote okolo 174 °C a extrapolovaný začiatok teploty topenia okolo 165 °C so spotrebou tepla približne 37 J/g.

Príklad 4

OBn .N (3)

CO₂H

-33N-benzylkarbamát kyseliny izonipekotínovej (3)

Východiskové zlúčeniny: izonipekotínová kyselina (2) T.C.I. benzylchloroformát (Schweitzerhall) uhličitan draselný voda

4,02 kg (31,1 mol) 6,91 kg (40,5 mol)

10.1 kg (72,9 mol)

40.2 i

V 100 I nádobe so štyrmi hrdlami, mechanickým miešadlom a v atmosfére dusíka sa rozpustí v 40,2 I vody kyselina izonipekotínová (2) a uhliičtan draselný a roztok sa ochladí na teplotu 10 °C. Počas pridávania benzylchlórformátu sa teplota reakčnej zmesi udržuje v rozmedzí 9 až 14 °C. PO skončení adície sa reakčná zmes zohreje na teplotu 22 °C a 58 hodín sa nechá stáť. Adícia sa ukončí po 4 hodinách pri pH 9,0. Po 58 hodinách státia nedošlo k zmene pH.

Reakčná zmes sa prenesie do extrakčného zariadenia s objemom 200 I, premyje sa trikrát 13 kg (15 I) izopropylacetátu (IPCA) a raz 12 I etylacetátu. Vodný podiel sa extrahuje 8 I toluénu. Podľa HPLC analýzy sa po premytí obsah benzylalkoholu zníži z 3,8 % na 1,4 %.

Analytická HPLC: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8, rýchlosť prietoku 1,5 ml/minútu, detekcia pri 254 nm, izokratická elučné zmes obsahujúca 35 % metylkyanidu MeCN a 65 % 0,1% vodného roztoku kyseliny trihydrogénfosforečnej, doba retencie: (3) = 6,9 minút, benzylakohol = 3,3 minúty, toluén = 17,3 minút.

Vodný podiel sa okyslí na pH 1,8 pridaním 37% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej, čo vyvolá vývoj oxidu uhličitého, ktorý je ľahké udržať pod kontrolou. Pridávanie kyseliny chlorovodíkovej trvalo menej ako 1 hodinu a vyžaduje 10 I koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Vodný podiel sa trikrát extrahuje 6,6 I toluénu, extrakty sa sušia s 2 kg síranu sodného a filtrujú sa cez vrstvu Solka-floc™. Zlúčené filtráty majú hmotnosť 17,8 kg. Odparovaním dosucha vážených podielov filtrátu vznikne 7,89 kg surového karbamátu (3) s výťažkom 97 %. Filtráty sa po filtrácii cez zabudovaný filter s veľkosťou otvorov 10 μιτι umiestnia do 100 I nádoby. Extrakty sa pri teplote menšej ako 25 °C zahustia pri tlaku

-341000 Pa na objem 18 I. Výsledná koncentrácia karbamátu 3 je 440 g/l. Koncentrácia toluenového filtrátu slúži na azeotropické odstránenie posledných stôp vody (konečný KF = 170 mg/ml). Výsledný produkt je na 99,1 % čistý, obsahuje 0,9 % plochy pod krivkou benzylalkoholu ako jedinú prítomnú nečistotu.

Príklad 5

COCI

Chlorid-N-benzylkarbamát izonipekotínovej kyseliny (4)

Východiskové zlúčeniny:

N-benzylkarbamát izonipekotínovej kyseliny (3) v toluéne (molekulová hmotnosť = 263,3) oxalylchlorid (molekulová hmotnosť = 126,93)

Ν,Ν-dimetylformamid (molekulová hmotnosť = 73,10)10 ml toluén 12 1

7,89 kg (30,0 mol) v 17,91

3,94 kg (31,0 mol)

Do roztoku výsledného benzylkarbamátu (3) z predchádzajúceho príkladu v toluéne sa pridá 5 ml Ν,Ν-dimetylformamidu a 10 I toluénu. Počas 20 minút sa pridá oxalylchlorid a reakčná zmes sa nechá 16 hodín stáť pri teplote 18 °C v pomalom prúde dusíka. Následná HPLC analýza dokázala 1,3 % nespracovanej kyseliny karboxylovej (3). Reakčná zmes sa zohreje na 26 °C, pridá sa 5 ml Ν,Νdimetylformamidu a zmes sa nechá 2,5 hodiny stáť. Reakcia 1,0 ml podielu reakčnej zmesi sa ukončí pridaním 5,0 ml terc.butylamínu a analyzuje sa po odparovaní pomocou HPLC.

Analytická HPLC: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8, teplota 50 °C, rýchlosť prietoku 1 ml/minútu, detekcia pri 220 nm, izokratická elučná zmes

-35obsahujúca 42 % metylkyanidu (MeCN) a 58 %, 0,1% vodného roztoku kyseliny trihydrogén-fosforečnej.

Týmto postupom sa dokáže pretrvávanie menej ako 0,05 % kyseliny (3) vzorec A a viac ako 3 % plochy pod krivkou zlúčeniny vzorca B (viac ako 1 molárne % (COCI₂).

N

OBn

0^ NH-t-Bu

Y O NH-t-Bu

CONH-t-Bu (A) (B)

Na odstránenie 5 I rozpúšťadla sa reakčná zmes zahustí pri tlaku 1000 Pa a teplote 20 až 25 °C.

Typický HPLC výsledok roztoku koncentrovaného toluénu po ukončení reakcie terc.butylamínom:

zlúčenina	doba retencie	% plochy pod krivkou
kyselina karboxylová (3)	2,1	<0,5 %
benzylchlorid	7,8	<0,5 %
Cbz-t-butylkarboxamid A	11,0	>99 %
toluén	12,1	NA
diterc.butyloxamid B	12,7	<0,5 %

Príklad 6

CHO

-36Piperidíη-4-karboxaIdehyd-1 -benzylkarbamát (5)

Východiskové zlúčeniny:

N-benzylkarbamát izonikopekotínovej kyseliny (4) 3,38 kg (12,0 mol) v toluéne (molekulová hmotnosť = 281,74) v 5,54 kg

DIEA (KF = 18 mg/l)

10% Pd/C (KF <20 mg/g)

1,55 kg (15,0 mol) 101 g tioanizol (molekulová hmotnosť = 124,21, d = 1,058) 0,56 g

Do roztoku zlúčeniny (4) v toluéne sa pridá DIEA a tioanizol a v tejto zmesi sa uvedie do suspenzie katalyzátor. Reakčná zmes sa ihneď umiestni do autoklávu s objemom 19 1a hydrogenuje sa pri teplote 20 °C a tlaku vodíka 2800 kPa. Počas 18 hodín sa reakcia spracuje 70 % teoretického množstva vodíka. Podiel zmesi, v ktorej je reakcia pridaním terc.butylamínu ukončená, sa sleduje analytickou HPLC, ktorá dokáže 14,2 % plochy pod krivkou prítomnosti kyslého chloridu (2). Podmienky pre HPLC zodpovedajú vyššie uvedeným podmienkam. Doba retencie: (5) = 8,1 minút.

Do hydrogenačného zariadenia sa pridá podobná suspenzia 101 g katalyzátora a 0,54 g tioanizolu v 1375 ml toluénu. Po 23 hodinách hydrogenácie sa uskutoční HPLC analýza podielu, v ktorom bola reakcia skončená pridaním terc.butylamínu. Podľa HPLC zostáva 1,8 % plochy pod krivkou kyslého chloridu (2). Reakčná zmes sa prebubiáva dusíkom a katalyzátor a zrazenina DIEA.HCI sa odstráni filtráciou Solka-floc™. Filtračný koláč sa premyje 10 I toluénu. Filtráty sa cez zabudovaný filter s veľkosťou otvorov 10 μιη premiestnia do extrakčného zariadenia s objemom 50 I a dvakrát sa premyjú 7,2 I 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej a dvakrát 7,2 I vody. Reakčná zmes sa pri 1000 Pa a teplote 25 až 30 °C zahusti na zvyšok s objemom 5 I.

zlúčenina doba retencie (min) % plochy pod krivkou karboxylová kyselina (3) 2,1 <2 dimér(21) 6,6 <1 aldehyd (5) 8,1 >95

-37Podľa HPLC je výťažok aldehydu (3) 94 %.

Príklad 7

(9)

CBZ-spiroindolín (9)

Východiskové zlúčeniny: piperidín-4-karboxaldehyd-1-benzyl karbamát (5) v toluéne fenylhydrazín trifluóroctová kyselina (TFA) hydroborát sodný (NaBH₄) toluén metylkyanid metanol

1,71 kg (6,89 mol) v 21,4 kg

900 ml, 981 g (9,15 mol) 2,20 I, 3,26 kg (28,6 mol) 300 g (7,93 mol)

34,4 kg

7,0 i

7,0 I

Roztok surového aldehydu (5) z predchádzajúcej časti sa cez filter s veľkosťou otvorov 10 pm premiestni do reakčnej nádoby s objemom 100 I, vybavenej medenou manžetou pokrytou teflonom na ochladenie alebo ohrievanie a mechanickým miešadlom. Po pridaní 34,4 kg toluénu a 7 I metylkyanidu sa vytvorený reakčný roztok ochladí na teplotu 0 °C. Po častiach sa pridá fenylhydrazín a počas nepretržitého prebublávania dusíkom sa teplota reakčnej zmesi udržuje v rozmedzí -1 až 3 °C.

Fenylhydrazín sa pridáva tak dlho, pokiaľ TLC a HPLC neukazuje úplné spotrebovávanie aldehydu (5) a malý prebytok (<5%) fenylhydrazínu.

-38Podmienky TLC: ocňxid kremičitý, E. Merck Kieselgel G60 F254 0,25 mm; dietyléter/penát (4/1); vyvíjacia zmes: 0,5% sulfát cernatý, 14% molybdenan amňonny v 10% vodnom roztoku kyseliny sírovej s následným zahrievaním; Rf: aldehyd (5) = 0,52, fenylhydrazón (7) = 0,61, fenylhydrazín (6) = 0,21. HPLC podmienky: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8 pri teplote 30 °C, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu, detekcia pri 254 nm; prehľad gradientov koncentrácií elučnej zmesi:

čas (minúty)	acetonitril: voda
0	57:43
10	65 : 35
15	75:25
18	75 :25

doba retencie: fenylhydrazín (6) = 4,5 minút, toluén = 7,2 minút, fenylhydrazón (7) = 11,4 minút.

Reakčná zmes sa nechá 30 minút stáť pri teplote 0 až 2 °C a pri zachovaní teploty v rozmedzí 2 až 7 °C sa pridá kyselina trifluóroctová. Reakčná zmes sa zohreje počas 30 minút na teplotu 50 °C, ktorá sa udržuje 17 hodín. Prebublávanie dusíkom reakčnej zmesi sa zastaví a udržuje sa len pomalý prúd dusíka. Farba počas prvej hodiny pri teplote 5 °C postupne tmavne na tmavozelenú. Vytvorí sa relatívne malé množstvo bielej kryštalickej zrazeniny (trifluóracetát amónny). Po 17 hodinách dokáže HPLC, ktorej podmienky zodpovedajú vyššie uvedeným, že reakčná zmes obsahuje 91,6 % plochy pod krivkou indolenínu a 1,5 % nespracovaného fenylhydrazónu. Státím zmesi počas dlhšieho časového obdobia sa nezvýši výťažok indolenínu (8).

Po ochladení reakčnej zmesi na 12 °C sa pridá 7,0 I metanolu. Po častiach menších ako 20 g sa pridá hydroborát sodný tak, aby sa teplota udržala pod 15 °C. Táto adícia prebieha 30 minút, V jej priebehu sa objavil mierny vývoj vodíka, ktorý sa ľahko kontroluje. Počas adície nedošlo k peneniu. Ku koncu adície sa farba rýchlo zmení zo zelenej na hnedú a potom na jasno oranžovú. Oddelí sa malé množstvo (<200 ml) ťažšej fázy (pravdepodobne vodný roztok soli). HPLC analýzou (podmienky vyššie uvedené) sa dokáže spotrebovanie všetkého

-39množstva indolenínu (8) (90,4 % plochy pod krivkou CBZ-indolínu (9)); doba retencie: indolenín (8) = 7,5 minút, indolín (9) = 8,2 minút.

TLC: etyléter ako rozpúšťadlo, škvrna farbiva obsahujúceho sulfát ceritý a melybdenan amónny alebo škvrna 1% anizaldehydu; Rf : indolenín (8) = 0,18, CBZ-indolín (9) = 0,33.

Ku koncu reakcie dôjde k zmene reakčnej zmesi zo zelenej na oranžovú. Množstvo hydroborátu sodného, ktoré je potrebné na skončenie reakcie, je významne závislé na teplote a na už pridanom množstve. Množstvo a kvalita produktu nie je v konečnom dôsledku týmto ovplyvnená.

Reakčná zmes sa ochladí na 30 minút na teplotu 5 °C, pridá sa 8 I 3% vodného roztoku hydroxidu amónneho, čím sa privedie pH vodného podielu na pH 7,4. Zmes sa mieša a potom sa nechá usadiť, teplota sa zvýši na 15 °C a oddelí sa žlto zakalený spodný vodný podiel. Organický podiel sa premyje raz 4 I 3% vodného roztoku hydroxidu amónneho, dvakrát 4 I vody a dvakrát 4 I nasýteného roztoku chloridu sodného. Po premytí vzniklo 53,5 kg organického podielu s výťažkom 94 %.

Premytý toluénový roztok sa zlúči s premytými organickými podielmi dvoch ďalších podobne vedených reakcií. Celkové množstvo aldehydu použité v troch reakciách je 5,06 kg (20,5 mol). Celková hmotnosť CBZ-indolínu (9) zo zlúčených organických podielov je 5,91 kg (18,3 mol) s výťažkom 90 %. Zlúčené organické podiely sa sušia s 5 kg síranu sodného, 30 minút sa na ne pôsobí 250 g aktívneho uhlia zn. Darco G60 a filtrujú sa cez Solka-floc™. Filtráty sa zahustia vo vákuu pri tlaku 1000 Pa a teplote menšej ako 25 °C takmer dosucha. Výmena rozpúšťadla sa uskutoční pomalým vliatím do 30 I izopropylacetátu a zahustením na objem 14 I pri tlaku 2000 Pa a teplote 50 až 60 °C. Zmes sa zahrieva do teploty refluxu za vzniku číreho homogénneho tmavooranžového roztoku. Po výmene rozpúšťadla tento roztok podľa ¹H NMR obsahuje približne 6 % molárnych zvyškového toluénu.

Roztok sa ochladí na 68 °C a naočkuje sa 4 g kryštalického CBZ-indolínu (9). Roztok sa nechá postupne počas 6 hodín ochladiť na teplotu 26 °C a 9 hodín sa nechá stáť pri teplote 20 až 26 °C. Suspenzia sa počas 1 hodiny ochladí na teplotu 2 °C a 1 hodinu sa nechá stáť pri teplote 2 °C. Produkt sa oddelí filtráciou a

-40filtračný koláč sa dvakrát premyje 2 I izopropylacetátu s teplotou 5 °C a dvakrát 2 I MTBE s teplotou 5 °C. Produkt sa suší vo vákuovej peci pri teplote 30 °C a v atmosfére dusíka za vzniku 4,37 kg výslednej zlúčeniny (9) ako svetlej žltohnedej kryštalickej tuhej látky s výťažkom 74 %.

Podľa HPLC ide o produkt s čistotou 99,5 % plochy pod krivkou. Premývacie podiely a 11 I materskej kvapaliny obsahujú ďalších 1,15 kg (19 %) prosuktu (9) a približne 3 % fenylhydrazidu kyseliny Cbz-izopekotínovej (doba retencie = 4,8 minút).

Príklad 8

CBZ-spiroindolín-metánsuIfónamid (1)

Východiskové zlúčeniny: CBZ-spiroindolín (9) metánsulfonylchlorid trietylamín (KF =151) tetrahydrofurán (KF = 41)

1,69 kg (5,23 mol) 599 g (5,23 mol) 635 g (6,27 mol) 12 I

Nádoba s objemom 22 I sa naplní tuhým CBZ-spiroindolínom (9) a potom sa do tejto nádoby cez filter s veľkosťou otvorov 10 μίτι pridá 11,5 I tetrahydrofurán u a trietylamín. Vytvorí sa homogénny roztok, ktorý sa ochladí na teplotu 0 °C. Pridávací lievik s objemom 1 I sa naplní metánsulfonylchloridom a 500 ml tetrahydrofuránu. Tento roztok sa pridáva do reakčnej zmesi pri zachovaní

-41 jej teploty v rozmedzí 0 až 4 °C. Adícia, ktorá prebieha exotermicky, trvá 5 hodín. Počas pridávania sa vytvorí biela zrazenina, pravdepodobne trietylamóniumhydrochlorid. Podľa HPLC analýzy je reakcia skončená po ukončení adície a nie je prítomný žiadny CBZ-spiroindolín (9). Podmienky HPLC: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8, rýchlosť prietoku 1,5 ml/minútu, detekcia pri 254 nm; prehľad gradientov koncentrácií elučnej zmesi:

čas (minúty) 0,1% vodný roztok kyseliny trihydrogén-

0	fosforečnej: metylkyanid 70 : 30
10	70 : 30
12	20 : 80
25	20 : 80

doba retencie: (9) = 7,6 minút, (1) = 13,6 minút.

Po skončení adície sa reakčná zmes zohreje na teplotu 18 °C a nechá sa 16 hodín stáť. Porovnaním vzhľadu reakčnej zmesi a výslednou HPLC po skončení adície a po 16 hodinách státia sa došlo k záveru, že nedošlo k žiadnym zmenám. Reakčná zmes sa počas 1 hodiny pomaly premiestni do energicky miešaného roztoku 30 I vody a 200 ml 37% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej umiestneného v 50 I nádobe. Teplota nádoby sa zvýši z 22 °C na 28 °C. produkt sa oddelí ako svetlá žltohnedá gumovitá tuhá látka, ktorá sa zmení na granulárnu tuhú látku. Vodná suspenzia sa ochladí na 22 °C a 1 hodinu sa nechá stáť. Suspenzia sa filtruje a filtračný koláč sa dvakrát premyje 4 I zmesi metanolu a vody v pomere 50 : 50. Podľa HPLC analýzy je prítomných v materskej kvapaline menej ako 0,1 % CBZ-spiroindolín-metánsuIfónamidu (1).

Filtračný koláč sa premyje 4 I zmesi metanolu a vody v pomere 50 : 50, ktorá obsahuje 50 ml 28% vodného roztoku hydroxidu amónneho. Filtračný koláč sa premyje dvakrát 4 I zmesi metanolu a vody v pomere 50 : 50 a tuhá látka sa suší vo vákuovej peci v atmosfére dusíka a pri teplote 50 °C. Vznikne 2,03 kg

-42špinavobieleho prášku výslednej zlúčeniny (1) s výťažkom 97 %. Podľa HPLC analýzy obsahuje tuhá látka 93,7 % plochy pod krivkou výslednej zlúčeniny (1).

Príklad 9

(8)

Alternatívny postup izolácie medziproduktu CBZ-spiroindolenínu (8)

Východiskové zlúčeniny piperidín-4-karboxaldehyd-1-benzyl karbamát (5) fenylhydrazín trifluóroctová kyselina (TFA) metylénchlorid

12,37 g (0,050 mol)

5,41 g (0,050 mol)

11,56 ml, 17,10 g (0,150 mol) 500 ml

V reakčnej nádobe s objemom 1 I, vybavenej magnetickým miešadlom pokrytým teflonom, sa rozpustí CBZ-aldehyd (5) v dichlórmetáne. Vytvorený roztok sa ochladí na teplotu 0 °C. Kalibrovanou injekčnou striekačkou sa počas 5 minút pridá fenylhydrazín a počas nepretržitého prebublávania dusíkom sa teplota reakčnej zmesi udržuje v rozmedzí -1 až 3 °C.

Podľa TLC a HPLC dôjde k úplnému spotrebovaniu aldehydu (5) a vznikne malý prebytok (<2 %) fenylhydrazínu.

Podmienky TLC: oxid kremičitý, E. Merck Kieselgel G60 F254 0,25 mm; dietyléter/pentán (4/1); vyvíjacia zmes: 0,5 % sulfát cernatý, 14 % molybdenan amónny v 10% vodnom roztoku kyseliny sírovej s následným zahrievaním; Rf : aldehyd (5) = 0,52, fenylhydrazón (7) = 0,61, fenylhydrazín (6) = 0,21.

HPLC podmienky: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8 pri teplote 30 °C,
rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu, detekcia pri 254 nm; prehľad gradientov
koncentrácií elučnej zmesi:
čas (minúty)	acetonitril: voda
0	57 : 43
10	65 : 35
15	75 : 25
18	75 :25

doba retencie: fenylhydrazín (6) = 4,5 minút, toluén = 7,2 minút, fenylhydrazón (7) = 11,4 minúty.

Reakčná zmes sa nechá 10 minút stáť pri teplote 0 až 2 °C a pri zachovaní teploty v rozmedzí 2 až 7 °C sa pridá kanylou kyselina trifluóroctová. Reakčná zmes sa zohreje počas 30 minút na teplotu 35 °C, ktorá sa udržuje 17 hodín. Prebublávanie dusíka reakčnou zmesou sa zastaví a udržuje sa len pomalý prúd dusíka. Počas prvej hodiny pri teplote 35 °C farba postupe tmavne na ružovú a potom na tmavozelenú. Vytvorí sa relatívne malé množstvo bielej kryštalickej zrazeniny (trifluóracetát amónny). Po 17 hodinách dokáže HPLC, ktorej podmienky zodpovedajú vyššie uvedeným, že reakčná zmes obsahuje 93 % plochy pod krivkou indolenínu (8) a menej ako 0,5 % nespracovaného fenylhydrazónu. Státie zmesi počas dlhšieho časového obdobia nezvýši výťažok indolenínu (8).

Po ochladení reakčnej zmesi na 10 °C sa za stáleho dôkladného miešania pridá zmes obsahujúca 60 ml 28 až 30% roztoku hydroxidu amónneho, 90 ml vody a 150 g drveného ľadu. Farba zmesi sa zmení na lososovú červenú. Organický podiel sa oddelí a dvakrát sa premyje 400 ml vody a potom 100 ml nasýteného vodného roztoku chloridu sodného. Organický podiel sa suší nad síranom horečnatým a filtruje sa cez vrstvu 5 g oxidu kremičitého. Po odparení filtrátu vznikne 15,84 g svetlooranžového oleja indolenínu (8) s výťažkom 99 %.

-44Príklad 10

Príprava CBZ-spiroindolín-metánsuIfónamidu (1) bez izolácie medziproduktu CBZspiroindolínu (9)

Časť 1: CBZ-spiroindolín (9)

Východiskové zlúčeniny:

piperidín-4-karboxaldehyd-1-benzyl karbamát (5) fenylhydrazín (Aldrich) trifluóroctová kyselina (TFA) toluén (KF < 250 mg/l) metylkyanid (MeCN) (KF < 250 mg/l) hydroborát sodný toluén metanol

49,5 g (0,20 mol) 23,7 g (0,22 mol) 75,4 g (0,66 mol) 654 ml

13.3 ml

11.3 g (0,30 mol) 20 ml ml

Za použitia 654 ml toluénu a 13,3 ml metylkyanidu sa pripraví roztok metylkyanidu s koncentráciou 2 % objemové. Do nádoby s tromi hrdlami s objemom 2 I a vybavenej mechanickým miešadlom sa pridá 617 ml vyššie uvedeného roztoku, ktorý sa zbaví plynu prebublávaním jemným prúdom dusíka po dobu 5 minút. Počas prebublávania sa pridá fenylhydrazín a kyselina trifluóroctová. Vo zvyšnej časti vyššie uvedeného roztoku (50 ml) sa rozpustí CBZ-aldehyd (5) a tento roztok sa v pridávacom lieviku zbaví plynu prebublávaním dusíkom. Roztok

-45v nádobe sa zahreje na teplotu 35 °C a roztok aldehydu sa počas 2 hodín pomaly pridá do zmesi fenylhydrazínu a kyseliny trifluóroctovej. Reakčná zmes sa nechá stáť 15 hodín pri teplote 35 °C.

HPLC podmienky: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8 pri teplote 50 °C, rýchlosť prietoku 1 ml/minútu, detekcia pri 220 nm; izokratická elučná zmes 55 % metylkyanidu a 45 % 0,1% vodného roztoku kyseliny trihydrogénfosforečnej.

Prehľad výsledkov HPLC po 16 hodinách státia:

zlúčenina	doba retencie (minúty)	% plochy pod krivkou
fenylhydrazín	1,6	0,1 až 0,5
dimér (21)	4,1	<0,1
aldehyd (5)	4,7	<0,1
spiroindolín (9)	5,0	NA
toluén	6,3	NA
spiroindolenín (8)	6,9	97
fenylhydrazón (7)	10,3	<0,2
ostatné prímesi (každá <0,2 %)	celkom 2 až 3

Reakčná zmes sa ochladí na teplotu -10 °C a pridá sa metanol. Po malých (1 ml) častiach sa počas 30 minút pridá suspenzia bórhydridu sodného v 20 ml toluénu tak, aby teplota sa nezvýšila nad -2 °C.

zlúčenina % plochy pod krivkou fenylhydrazín (6) 0,1-1

CBZ-spiroindolín (9) 85-90

CBZ-spiroindolenín (8) <0,1 ostatné nečistoty (každá <3%) celkom 10-15

Pred pridaním 200 ml 6% vodného roztoku amoniaku sa teplota reakčnej zmesi počas 1 hodiny zvýši na 10 °C. Reakčná zmes sa mieša 10 minút, nechá sa 10 minút ustáť a spodná vodná fáza sa oddelí. Do organickej fázy sa pridá 20 ml

-46acetonitrilu a 20 ml metanolu a roztok sa premyje 150 ml 15% roztoku chloridu sodného. Organický podiel obsahuje podľa analýzy 92 % CBZ-spiroindolínu (9).

Časť 2: CBZ-spiroindolín-metánsuifónamid (1)

Východiskové zlúčeniny:

CBZ-spiroindolín (9) (molekulová hmotnosť = 322,51) metánsulfonylchlorid

DIEA(KF = 150 mg/l) tetrahydrofurán (THF) (KF = 41 mg/l) (0,184 mol)

21,1 g (0,184 mol) 29,7 g, 40,1 ml (0,230 mol)

150 ml

V nádobe s tromi hrdlami s objemom 1 I sa pri teplote 60 až 70 °C a tlaku

24,4 až 33,2 kPa sa surový roztok CBZ-spiroindolínu (9) z vyššie uvedenej časti 1 zahustí na 250 g zvyšok. Pridá sa tetrahydrofurán a DIEA za vzniku homogénneho roztoku, ktorý sa ochladí na teplotu 0 °C. Pridávací lievik s objemom 125 ml sa naplní metánsulfonylchloridom a 50 ml tetrahydrofuránu. Tento roztok sa pridá do reakčnej zmesi pri zachovaní jej teploty v rozmedzí 0 až 4 °C a reakčná zmes sa nechá 2 hodiny stáť pri teplote 5 až 8 °C. Adícia prebieha mierne exotermicky. Počas pridávania sa vytvorí biela zrazenina, pravdepodobne DIEA hydrochloridu. Podmienky HPLC sú uvedené vyššie. Podľa HPLC analýzy je reakcia skončená 1 hodinu po ukončení adície, kedy nie je prítomný žiadny CBZ-spiroindolín (9) a výťažok vztiahnutý na zlúčeninu (9) je 94 %. Doba retencie: (1) = 7,8 minút. Typický HPLC výsledok reakčnej zmesi po 2 hodinách státia:

zlúčenina % plochy pod krivkou

CBZ-spiroindolín (9) CBZ-suifónamid (1) ostatné nečistoty (každá <2%) <0,1 90-92 celkom 8-10

-47 Reakčná zmes sa zohreje na 20 °C a pridá sa 200 ml 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa zohreje na 50 °C a vodná fáza sa oddelí. Organický podiel sa premyje postupne raz 100 ml vody, raz 100 ml 5% vodného roztoku uhličitanu sodného a raz 100 ml vody. Organický podiel sa prenesie do nádoby s tromi hrdlami s objemom 1 I vybavenej mechanickým miešadlom a destilačným zariadením. Približne 400 ml zmesi sa destiluje pri atmosférickom tlaku, pokiaľ sa neodoberie 150 ml destilátu. Teplota hlavy destilačnej kolóny dosiahne 107 °C a teplota spodku destilačnej kolóny je 110 °C. Destilácia sa uskutočňuje za neustáleho pridávania n-propanolu v takom množstve, aby na spodku destilačnej kolóny zostávalo konštantné množstvo, približne 350 ml. Destilácia sa ukončí pridaním 525 ml n-propanolu s celkovým množstvom 800 ml odobratého destilátu.

Počas výmeny rozpúšťadla sa teplota hlavy a spodku destilačnej kolóny zvýši z 94 na 98 °C. Toluén a n-propanol vytvoria azeotropickú látku s teplotou varu 97,2 °C, skladajúcu sa zo 47,5 % toluénu a 52,5 % n-propanolu. Reakčná zmes sa nechá postupne ochladiť na 20 °C počas 3 hodín a nechá sa 12 hodín stáť. Materská kvapalina obsahuje 2 % toluénu a 4 mg/ml sulfónamidu. Rozpustnosť sulfónamidu v rôznych zmesiach toluénu a n-propanolu sa určí použitím HPLC.

% toluénu v n-propanole rozpustnosť (1) v mg/ml

0	2,36
5	3,02
10	4,23
20	7,51
25	10,3

Kryštalická suspenzia sa filtruje a premyje sa trikrát 100 ml n-propanolu. Po 16 hodinách sušenia vo vákuovej peci pri teplote 50 °C a v atmosfére dusíka vznikne 65,5 g zlúčeniny (6) ako žltohnedej látky s výťažkom 82 % vztiahnutých na aldehyd (5) a s čistotou 93,5 % objemových.

‘48Typický HPLC výsledok:

zlúčenina

CBZ-spiroindolín (9)

CBZ-suIfónamid (1) ostatné nečistoty (každá <0,2%) % plochy pod krivkou <0,1 >99 celkom <1

Na ďalšie čistenie sa vzorka 40,0 g sulfónamidu kryštalizovaného z npropanolu pri teplote 60 °C rozpustí v 134 ml etylacetátu a na roztok sa 1 hodinu pôsobí 8,0 g aktívneho uhlia zn. Darco G-60 pri teplote 60 °C. Po pridaní 2,0 g Solka-floc™ sa suspenzia filtruje cez vrstvu 4,0 g Solka-floc™ a vrstva sa pri teplote 60 °C premyje 90 ml etylacetátu. Pred pridávaním aktívneho filtrátu sa zmení na zlatožltý filtrát. Filtrát sa destiluje pri atmosférickom tlaku v nádobe s objemom 500 ml a teplote spodku destilačnej kolóny 80 až 85 °C za vzniku 100 g (100 ml) zvyšku. Roztok sa nechá počas 3 hodín ochladiť na teplotu 35 °C. Počas 1 hodiny sa do roztoku za stáleho dokonalého miešania pridá pri teplote 35 °C 116 ml cyklohexánu. Reakčná zmes sa ochladí počas 1 hodiny na teplotu 20 °C a 12 hodín sa nechá stáť pri teplote 20 °C. Pri teplote 35 °C dôjde ku kryštalizácii veľkého množstva sulfónamidu a zmes zhustne. Pridávaním cyklohexánu pri teplote 20 °C sa miešanie stane veľmi ťažké. Po určitej dobe státia sa v supernatante zistí množstvo zlúčeniny (í) 2,5 mg/g. Kryštalická suspenzia sa filtruje a filtračný koláč sa premyje 77 ml zmesi cyklohexánu a etylacetátu v pomere 2:1 a dvakrát sa premyje 77 ml cyklohexánu. Produkt sa 16 hodín suší vo vákuovej peci v atmosfére dusíka a pri teplote 50 °C. Vznikne 34,2 g zlúčeniny (1) (molekulová hmotnosť = 400,3) ako bielej kryštalickej tuhej látky (85 % výťažok zlúčeniny (1), 70 % zlúčeniny (5)) s čistotou vyššou ako 99 % hmotnostných.

Príklad 11

H

I

· HCI (1a)

SO₂Me

-49Sodná soľ spiroindolín-metánsulfónamidu (1a)

Východiskové zlúčeniny

CBZ-spiroindolín-metánsuIfónamid (1) Pearlmanov katalyzátor 20% Pd(OH)₂/C THF

MeOH

941 g (2,35 mol) 188g 8 I 7I

Katalyzátor bol uvedený do suspenzie v 7 I MeOH a premiestnený do 19 I autoklávu s obsahom roztoku zlúčeniny (1) v 8 I THF. Zmes bola hydrogenovaná pri teplote 25 °C a tlaku vodíka 56 MPa (80 psi). Po 2,5 hodinách bola teplota zvýšená na 35 °C na 30 minút.

HPLC analýza indikovala úplne spotrebovanie Cbz-spiroindolínmetánsulfónamídu. HPLC podmienky: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 stĺpec s prietokom 1,5 ml/minútu a detekciou pri 254 nm.

Prehľad gradientov:

čas (minúty) 0,1% vodný roztok kyseliny trihydrogénforforečnej: metylkyanid

70:30

70:30

20 : 80

20 : 80

Doba retencie: spiroindolín = 7,6 minút, Cbz-spiroindolín-metánsulfónamid = 13,6 minút.

Zmes sa prebubláva dusíkom a katalyzátor sa z ešte teplej reakčnej zmesi odstráni filtráciou cez Solka-floc™. Katalyzátor sa premyje 4 I tetrahydrofuránu a 2 I metanolu. Svetložlté filtráty sa zahustia pri tlaku 1000 Pa a pri teplote menšej ako 25 °C na hustý olej. Výmena rozpúšťadla sa ukončí pomalým vliatím do 15 I

-50etylacetátu a zahustením dosucha. Vytvorený zvyšok tuhne na tvrdý špinavobiely materiál, do ktorého sa pridá 1,5 I metanolu a zmes sa zahrieva na teplotu 70 °C za vzniku homogénneho roztoku. Pri teplote roztoku 70 °C sa pridá 10,5 I etylacetátu s teplotou 20 °C. teplota sa zníži na 40 °C a zmes zostane homogénna. V nasledujúcich experimentoch sa predpokladá, že vhodnejšou výmenou rozpúšťadla vo filtráte je výmena zo zmesi metanolu a tetrahydrofuránu na metanol, zahustenie na požadovaný objem a následné pridanie etylacetátu. tento postup nevedie k tuhnutiu zvyšku počas zahustenia etylacetátového roztoku.

Do roztoku sa pridá chlorovodík približne rovnakým objemom dusíka. Teplota sa počas 15 minút zvýši na 60 °C za vzniku bielej zrazeniny hydrochloridu. Zriedený roztok chlorovodíka len zamedzuje nasávanie zmesi späť a tento postup najskôr nie je nutný.

Reakčná zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli a pridávanie chlorovodíka pokračuje ďalšiu 1 hodinu. Teplota sa postupne zníži na 20 °C a suspenzia sa nechá 2 hodiny stáť pri znižovaní teploty na 10 °C. Vytvorený kryštalický produkt sa oddelí filtráciou a filtračný koláč sa premyje 3 I etylacetátu. Po sušení vo vákuovej peci pri teplote 35 °C vznikne 1,18 kg výslednej zlúčeniny (1a) s výťažkom 86 % ako špinavobielej kryštalickej tuhej látky s čistotou podľa HPLC vyššou ako 99,5 % plochy pod krivkou. Podmienky HPLC: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8, rýchlosť prietoku 1,5 ml/minútu, detekcia pri 230 nm; izokratická elučná zmes 35 % metylkyanidu, 65 % 0,1% vodného roztoku octanu amónneho. Doba retencie: (1a) = 5,4 minút.

Príklad 12 (1b)

SO₂Me

-51 Spiroindolín-metánsulfónamid (vo forme voľných báz) (1b)

Na približne 10 ml sa zahustí 250 ml časť filtrátu Cbz-hydrogenolýzy, obsahujúca 4,67 g zlúčeniny (1b) (voľnej bázy). Vytvorený zvyšok sa rozpustí v 20 ml etylacetátu a roztok sa zahustí na približne 10 ml. Tento postup sa ešte raz opakuje, a potom sa do zvyšku pridá 10 ml etylacetátu. Keď sa začne vytvárať kryštalická zrazenina, pridá sa naraz 20 ml MTBE. Dôjde k ďalšej kryštalizácii, ale supernatant aj naďalej obsahuje značné množstvo rozpusteného produktu, z ktorého sa státím zrazenina nevytvorí. Za stáleho energického miešania sa do zmesi po kvapkách počas 2 hodín pridá 70 ml zmesi hexánov. Pomalé pridávanie hexánov je nutné na zabránenie vylúčenia amínu ako oleja.

Reakčná zmes sa 1 hodinu nechá stáť a potom sa filtruje. Filtračný koláč sa premyje 20 ml zmesi MTBE a hexánov v pomere 1:1 a potom 20 ml zmesi hexánov. Produkt sa suší v prúde dusíka za vzniku 3,86 g voľných amínov zlúčeniny (1b) ako špinavobielych kryštálov s čistotou vyššou ako 99,5 % plochy pod krivkou a s výťažkom 82 %.

Podmienky HPLC: 25 cm stĺpec Dupont Zorbax RXC8, rýchlosť prietoku 1,5 ml/minútu, detekcia pri 230 nm; izokratická elučná zmes 35 % metylkyanidu, 65 % 0,1% vodného roztoku octanu amónneho. Doba retencie: (1b) = 5,4 minút.

Príklad 13A

Spiroindolín-metánsulfónamid (vo forme voľných báz) (1b)

Východiskové zlúčeniny: CBZ-spiroindolín-suIfónamid (1)

833,5 g (2,08 mol)

-52paládium na aktívnom uhlí (20 % hmotnostných oxidu paladnatého na aktívnom uhlí) tetrahydrofurán metanol hydroxid amónny - koncentrovaný roztok

124,5(15%) 6,5 I 19,51 60 ml.

Vzhľadom na obmedzené vybavenie sa hydrogenácia uskutočňovala trikrát. Uvedený postup syntézy zodpovedá jednoduchému postupu. CBZ-spiroindolínsulfónamid (1) sa rozpustí v 6,5 I tetrahydrofuránu (KF = 53 μg/μl) a potom v 4 I metanolu (KF =18 μg/ml). Po pridaní katalyzátora sa suspenzia prenesie do autoklávu s objemom 19 I. Zvyšná časť 2,5 I metanolu sa použije na premytie. Zmes sa 24 hodín zahrieva pri tlaku 3500 Pa na teplotu 40 °C. Množstvo prítomného katalyzátora a reakčný čas sú funkciami čistoty východiskovej zlúčeniny (1). Tento materiál vyžadoval viac ako 15 % katalyzátora a dlhý reakčný čas. Čistejšie dávky spiroindolínu vyžadovali len 5 % katalyzátora a 4 až 6 hodín reakcie.

Po dokončení reakcie (prítomnosť zlúčeniny (1) <0,1 % plochy pod krivkou podľa kvapalinovej chromatografie) sa zmes filtruje cez Solka-floc™ a filtračný koláč uhlíka sa premyje 13 I roztoku metanolu, obsahujúceho 60 ml 0,5% roztoku hydroxidu amónneho. Zlúčené filtráty (podľa skúšky 1587 g spiroindolínamín 1b) sa zahustia vo vákuu a vytvorená tuhá látka sa rozdelí do 40 I zmesi toluénu a tetrahydrofuránu v pomere 3:1 a 18 I 0,5N roztoku hydroxidu sodného a vo vodnom podiele sa objaví hustá zrazenina. Podiely sa ľahko oddelia. Vodná suspenzia sa extrahuje 15 I metylénchloridu. Vodný a organický podiel sa pomaly oddelí. Pred pridaním metylénchloridu sa do vodného podielu pridá tetrahydrofurán spolu s dostatočným množstvom chloridu sodného do nasýtenia podielu. Na rozpustenie produktu však týmto postupom nedôjde a je nutné použiť metylénchlorid.

Zlúčené toluénové, tetrahydrofuránové a metylénchloridové podiely sa zlúčia a zahustia v koncentrátore vsádzok. Vytvorený zvyšok sa prepláchne so 7 I

-53metylkyanidu. Nakoniec sa pridá 10 I metylkyanidu a roztok sa nechá cez noc stáť v atmosfére dusíka.

Príklad 13B

Spiroindolín-metánsulfónamid (vo forme voľných báz) (1b)

Východiskové zlúčeniny:

CBZ-spiroindolín-suIfónamid (1) 3 kg (7,49 mol) aktívne uhlie zn. Darco G-60 600 g etylacetát 361 absolútny etanol 189 I

10% roztok paládia na aktívnom uhlí 450 g roztok amoniaku 500 ml

Solka-floc™ 2,5 kg izopropylacetát 651

Zmes 1 kg CBZ-spiroindolínu (1) a 200 g aktívneho uhlia zn. Darco G-60 v 9 I etylacetátu sa za stáleho miešania 8 hodín zahrieva v atmosfére dusíka na teplotu 60 až 65 °C. Darco sa odstráni filtráciou pri teplote 60 až 65 °C, tuhá látka sa premyje 3 I horúceho etylacetátu a filtrát a premývacie podiely sa zlúčia. Kvapalinovou chromatografiou sa potvrdí zanedbateľná strata vzhľadom na použitie aktívneho uhlia zn. Darco G-60. Etylacetátový roztok sa vo vákuu odparí dosucha za použitia Buchiho prístroja s objemom 20 I, a potom sa dvakrát prepláchne 5 I absolútneho etanolu, zahrieva sa na 65 aý 70 4 a umiestni sa do

-54autoklávu s objemom 20 I. Reakčná zmes sa premyje 1 I absolútneho etanolu. Do auktolávu sa následne pridá suspenzia 75 g 10% paládia na aktívnom uhlí (7,5 % hmotnostných) v 750 ml absolútneho etanolu a následne sa premyje ďalšími 250 ml absolútneho etanolu.

Reakčná zmes sa za stáleho energického miešania 3 hodiny hydrogenuje pri tlaku vodíka 2800 Pa a teplote 65 °C. Pridá sa ďalších 75 g paládia na aktívnom uhlí, reakčná zmes sa ďalšie dve hodiny hydrogenuje a cez noc sa nechá stáť v uzavretej nádobe. Po premiestnení reakčnej zmesi, ktorá má stále teplotu 60 až 65 °C, do Buchiho zariadenia s objemom 20 I sa vsádzka zbaví plynu za ostránenia kyseliny mravčej metódou „feeding and bleeding“ t.j. pridávaním a preplachovaním celkom 18 I absolútneho etanolu.

tento postup sa ešte dvakrát opakuje a tri vsádzke sa zlúčia v nádobe vyloženej sklom s objemom 36 I. Zlúčené vsádzky sa znovu zbavia plynu dvojitým opakovaním pridania vždy 10 I absolútneho etanolu a následnou destiláciou vo vákuu. Do vsádzky sa pridá 0,5 kg Solka-floc™ a zmes sa premyje 10 I etanolu. Suspenziou Solka-floc™ v 20 I etanolu sa naplní filter Estrella a vytvorená zmes sa zahreje na 60 až 65 °C. Pri tejto teplote sa reakčná zmes filtruje cez zahrievaný filter pomocou čerpadla do dvoch vydechtovaných nerezových nádob. Prvá reakčná nádoba, filter, čerpadlo a trubica sa premyjú horúcou zmesou 500 ml vodného roztoku amoniaku v 25 I absolútneho etanolu s teplotou 60 až 65 °C.

Vsádzka sa prefiltruje do reakčnej nádoby za použitia zabudovaného filtra, obsahujúceho vopred pripravený stĺpec s veľkosťou otvorov 10 μιτι, a potom sa zahustí vo vákuu na objem približne 15 I. Etanol sa nahradí celkom 45 I izopropylacetátu metódou „feeding and bleeding“, tzn. pridávaním a preplachovaním trikrát 15 I izopropylacetátu. Podľa plynovej chromatografie obsahuje reakčná zmes po dokončení výmeny rozpúšťadiel menej ako 1 % etanolu. Reakčná zmes sa zriedi na objem približne 33 I pridaním 20 I izopropylacetátu. tento roztok spiroindolínamínu (1b), ktorého hmotnosť je podľa kvapalinovej chromatografie 1,855 kg, v izopropylacetáte sa použije v nasledujúcej syntéze.

- 55Príklad 14A

Boc-O-benzykserín-spiroindolín (11)

Východiskové zlúčeniny: spiroindolínamín (1b) aminokyselina (10)

1587 g (5,966 mol) 1938 g (6,563 mol)

Ph .CO₂H

NHBOC dicyklohexylkarbodiimid (DCC)

N-hydroxybenztriazol (HOBt) metylkyanid

0,5N roztok hydroxidu sodného

0,5N kyselina chlorovodíková nasýtený roztok hydrogénuhličitanu sodného izopropylacetát

1334,5 g (6,563 mol) 884 g (6,563 mol)

I 18 I 18 I 18 I 28 I

Na roztok spiroindolínamínu (1b) v 25 I metylkyanidu alebo vodného roztoku izopropylacetátu sa postupne pri teplote miestnosti a pod dusíkom pôsobí 884 g (1,1 ekvivalentov) HOBT ako tuhej látky, 1334,5 g DCC (1,1 ekvivalentov) ako taveniny (pripravenej zahrievaním 1 hodinu v horúcej vode s teplotou 60 °C) a

-56nakoniec 1938 g aminokyseliny (10) ako tuhej látky. Reakčná zmes sa tri hodiny mieša za vzniku hustej zrazeniny DCU. Podľa kvapalinovej chromatografíe zostáva v reakčnej zmesi 0,5% plochy pod krivkou amínu (1b). Pridá sa 9 I izopropylacetátu, suspenzia sa filtruje cez Solka-floc™ a filtračný koláč sa premyje 19 I izopropylacetátu. Zlúčený organický roztok sa postupne premyje 18 I 0,5N roztoku hydroxidu sodného, 18 I 0,5N roztoku kyseliny chlorovodíkovej a 18 I nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného.

Premytím vodou vznikla emulzia, ktorá bola odložená. Organický podiel sa zahustí vo vákuu a zvyšok sa rozpustí v metanole alebo v etanole do konečného objemu 10 I roztoku. Výťažok je 3026 g t.j. 89 %.

Výťažok zlúčeniny 11 alebo 14 z reakcie, v ktorej sa použijú alternatívne peptidové väzbové činidlá, ako je karbonyldiimidazol. alebo zmes anhydridov, ako je sek.butylkarbonát, je nižší. V prípade zlúčeniny (11) dôjde k epimerizácii vysokého stupňa. Ostatné peptidové väzbové činidlá sú finančne nedostupné.

Príklad 14b

O (11)

SO₂Me

Boc-O-benzylserín-spiroindolín (11)

Východiskové zlúčeniny: spiroindolín-amín (1b) izopropylacetát dicyklohexylkarbodiimid (DCC)

1,855 kg (6,96 mol) 29 I

1,58 kg (7,65 mol)

- 571-hydroxybenztriazol (HOBt)

N-Boc-O-benzyl-D-serín

1M vodný roztok hydroxidu sodného nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného absolútny etanol

1,03 kg (7,62 mol) 2,26 kg (7,65 mol) 26 I

I

I

Do miešaného roztoku 1,855 kg spiroindolínamínu (1b) v 33 I izopropylacetátu sa v reakčnej nádobe pridá 20 I vody. Postupne sa pri teplote miestnosti a v atmosfére dusíka pridá 1,58 kg (1,1 ekvivalentov) DCC, 1,03 kg (1,1 ekvivalentov) HOBt, a nakoniec (1,1 ekvivalentov) 2,26 kg N-Boc-O-benzyl-Dserínu. Reakčné činidlá sa premývajú 7 I izopropylacetátu. Po 5 hodinách miešania pri teplote miestnosti a v atmosfére dusíka sa kvapalinocou chromatografiou potvrdil pomer produktu a východiskovej zlúčeniny v reakčnej zmesi 99,4:0,6. Reakčná zmes sa filtruje do inej nádoby cez filter Estrella pri použití len tkaniny upevnenej v lepenke a čerpadla. Prvá nádoba sa prepláchne 22 I izopropylacetátu a týmto materiálom sa prepláchne filter, čerpadlo a trubica spojujúcej nádoby. Zmes dvoch fáz sa v nádobe 10 minút mieša a potom sa počas 15 minút nechá stáť cez noc pri teplote miestnosti.

Nasledujúci deň sa organický roztok premyje 26 I 1M vodného roztoku hydroxidu sodného, 26 I 0,5M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej a nakoniec 26 I nasýteného vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného. Výťažok výslednej zlúčeniny podľa kvapalinovej chromatografie je 3,787 kg, t.j. 93 % z 3 kg (7,49 mol) CBZ-spiroindolínu (1) ako východiskovej zlúčeniny. Reakčná zmes sa zahustí vo vákuu (vnútorná teplota -13 až 15 °C, teplota manžety = 40 °C, vákuum = 3857 Pa) na približne 15 I. Rozpúšťadlo sa zamení na etanol pomalým pridávaním a preplachovaním 50 I etanolu do konečného objemu roztoku približne 15 I. Podľa plynovej chromatografie je v roztoku prítomných menej ako 1 % izopropylacetátu. Roztok sa použije v nasledujúcej syntéze.

-58Príklad 15A

O-benzylserín-spiroindolín (vo forme voľných báz) (12)

Východiskové zlúčeniny: Boc-O-benzylserín-spiroindolín (11) kyselina metánsulfónová (MsOH) metanol izopropylacetát (iPrOAc)

0,5N roztok hydroxidu sodného

3026 g (5,57 mol) 1,161(17,9 mol) 10 I 24 I 35 I

Na roztok Boc-O-benzylserín-spiroindolínu (11) v 10 I metanolu (alebo etanolu) sa pôsobí 1,16 I kyseliny metánsulfónovej ako čistej látky, ktorá sa pridávala približne 30 až 40 minút (počiatočná teplota 16 °C, konečná teplota 28 °C). Tmavočervený roztok sa cez noc nechá stáť pod dusíkom. Reakčná zmes sa prečerpá do extrakčného zariadenia s objemom 100 I, ktoré obsahuje 24 I izopropylacetátu a 35 I 0,5N roztoku hydroxidu sodného. Počiatočné pH vodného podielu je 7. Po pridaní 6M roztoku hydroxidu sodného sa zvýši pH na alebo dosiahne hodnotu = 10,5. Počas zvyšovania pH roztoku sa jeho farba mení z červenej na žltú. Podiely sa oddelia a 24 I organického podielu podľa NMR obsahuje 13 % molárnych metanolu v izopropanole (5 % objemových). Výťažok skúšky podľa kvapalinovej chromatografie je 2,48 kg.

O-benzylserín-spiroindolín (vo forme voľných báz) (12)

Východiskové zlúčeniny: Boc-O-benzylserín-spiroindolín (11) kyselina metánsulfónová izopropylacetát

1M vodný roztok hydroxidu sodného 50% vodný roztok hydroxidu sodného

3,787 kg (6,96 mol) 2,006 kg (20,87 mol) 38 I

I

1,6 1

Do približne 15 I miešaného roztoku 3,787 kg Boc-O-benzylserín-spiroindolínu (11) v etanole sa v reakčnej nádobe pridá 2,006 kg (1,355 I, približne 3 ekvivalenty) kyseliny metánsulfónovej. Reakčná zmes sa zohreje na teplotu 35 až 40 °C. Po 7 hodinách sa kvapalinovou chromatografiou dokáže vymiznutie počiatočného materiálu a reakcia sa cez noc ochladí na teplotu miestnosti. Nasledujúci deň sa počas miešania pridá 44 I vody. Po ochladení na asi 5 °C a 30 minútach miešania sa zmes filtruje do druhej nádoby cez zabudovaný filter s veľkosťou otvorov 10 pm a prečerpá sa späť do reakčnej nádoby. Nádoby, filtračné zariadenia a nakoniec roztok v reakčnej nádobe sa prepláchne 10 I vody a následne sa postupne pridá 38 I izopropylacetátu a 16 I 1M vodného roztoku hydroxidu sodného. Reakčná zmes sa ochladí na 10 až 15 °C. Hodnota pH spodnej fázy je približne 7 a pridá sa 1,6 I 50% vodného roztoku hydroxidu

-60sodného na zvýšenie hodnoty pH na viac ako 10. Po 15 minútach miešania pri teplote 10 až 15 °C sa zmes nechá počas 10 až 15 minút usadiť. Oddelí sa 78,1 kg spodnej vodnej fázy, ktorá podľa kvapalinovej chromatografíe obsahuje 28,4 g zlúčeniny (12) s teoreticky vypočítaným výťažkom 0,85 %. Organický podiel s objemom 51 I obsahuje podľa kvapalinovej chromatografíe 3,057 kg výslednej zlúčeniny s výťažkom 92 % vztiahnutým na 3 kg (7,49 mol) CBZspiroindolínsulfónamidu (1). Výsledný roztok sa použije v nasledujúcej syntéze.

Príklad 16A

(14)

Boc-aminoizobutyryl-O-benzylserín-spiroindolín (14)

Východiskové zlúčeniny: spiroindolínamín (12) peptid aminokyseliny (13) dicyklohexylkarbodiimid (DCC)

1-hydroxybenzotriazol (HOBt) izopropylacetát (IPAc) voda

0,5N roztok hydroxidu sodného 0,5N roztok kyseliny chlorovodíkovej nasýtený roztok hydrogénuhličitanu sodného

2481 g (5,57 mol) 1247,1 g (6,16 mol)

1266,7 g (6,16 mol) 827 g (6,16 mol)

I 37 I 36 I 36 I 36 I

-61 Roztok amínu (12) v izopropylacetáte sa použitím izopropylacetátu (IPAc) zriedi na celkový objem 39 I a pridá sa 37 I vody. Na zmes s dvoma fázami sa pri teplote miestnosti a pod dusíkom pôsobí postupne 827 g HOBT ako tuhej látky,

1266,7 g DCC ako taveniny a aminokyselinou (13). Reakčná zmes sa 2 hodiny mieša a vymiznutie (<0,3 % plochy pod krivkou) východiskovej zlúčeniny (12) sa dokáže kvapalinovou chromatografiou. Reakčná zmes sa filtruje cez Solka-floc™ a tuhá látka sa premyje 13 I izopropylacetátu. Reakčná zmes sa takto môže uchovať cez noc.

Po premiestnení reakčnej zmesi do extrakčného zariadenia s objemom 100 I sa oddelí vodný podiel a organický podiel sa premyje postupne 36 I 0,5N roztoku hydroxidu sodného, 0,5N roztoku kyseliny chlorovodíkovej a nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Výťažok skúšky je 3160 g (81% zo spiroindolínu s chybou merania objemu ± 5 %). Roztok sa zahustí na malý objem a dvakrát sa premyje 4 I etanolu. Medziprodukt (14) sa môže oddeliť kryštalizáciou pridaním vody.

Výťažok zlúčeniny (14) z reakcie, v ktorej sa použijú alternatívne peptidové činidlá, ako je karbonyldiimidazol, alebo zmes anhydridov (sek.butylkarbonát) je nižší a s vysokým stupňom epimerizácie. Ostatné peptidové väzbové činidlá sú finančne nedostupné.

Príklad 16B

-62Boc-aminoizobutyryl-O-benzylserín-spiroindolín (14)

Východiskové zlúčeniny: spiroindolínamín (12) dicyklohexylkarbodiimid (DCC) 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) Boc-2-aminoizomaslová kyselina (13) izopropylacetát

1M vodný roztok hydroxidu sodného

3,057 kg (6,89 mol) 1,56 kg (7,56 mol) 1,02 kg (7,55 mol) 1,54 kg (7,58 mol) 32 I

I 38 I

0,5M vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej 38 I nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného 38 I absolútny etanol

I

Do približne 51 I miešaného roztoku 3,057 kg spiroindolínamínu (12) v izopropylacetáte sa v atmosfére dusíka a pri teplote miestnosti pridá 49 I vody. Postupne sa do reakčnej nádoby pri teplote miestnosti a v atmosfére dusíka pridá (približne 1,1 ekvivalent) 1,56 kg DCC, 1,02 kg (približne 1,1 ekvivalent) HOBt a nakoniec 1,54 kg (približne 1,1 ekvivalent) N-Boc-O-benzyl-D-serínu. Po 2 hodinách energického miešania pri teplote miestnosti v atmosfére dusíka sa kvapalinovou chromatografiou potvrdí dokončenie reakcie. Reakčná zmes sa filtruje cez filter Estrella pri použití čerpadla. Prvá nádoba, filter, čerpadlo a spojujúca trubica sa prepláchnu 22 I izopropylacetátu. Zmes dvoch fáz sa v nádobe 5 minút mieša a podiely sa oddelia. Spodný vodný podiel s hmotnosťou

51,1 kg sa oddelí. Organický roztok sa postupne premyje 38 I 1M vodného roztoku hydroxidu sodného, 38 I 0,5M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej a nakoniec 38 I nasýteného vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného.

Organický roztok sa čerpadlom cez zabudovaný filter (obsahujúci vopred pripravený stĺpec s veľkosťou otvorov 10 pm) premiestni do inej nádoby, kde sa vykoná výmena rozpúšťadla na etanol. Nádoba sa prepláchne 10 I izopropylacetátu a týmto roztokom sa premyje čerpadlo, filter a trubica do nádoby s reakčnou zmesou. Filtrát a premývacie podiely sa zlúčia. Celkový objem, meraný ponorným meradlom je 75 I. Podľa kvapalinovej chromatografie vznikne 4,395 kg

-63Boc-aminoizobutyryl-O-benzylserín-spiroíndolínu (14) s celkovým výťažkom 93 % (z 7,49 ml východiskového CBZ-spíroindolín-suIfónamidu (1)).

Reakčná zmes sa zahustí vo vákuu na objem približne 15 1. Uskutoční sa výmena rozpúšťadla na etanol pomalým pridávaním a preplachovaním celkom 5 I absolútneho etanolu. Podľa plynovej chromatografie zostáva v vsádzke menej ako 1 % izopropylacetátu. Roztok s objemom 25 I obsahuje 4,395 kg zlúčeniny (14), ktorá sa použije v ďalšej syntéze. Pokiaľ je to potrebné, je možné zlúčeninu (14) pridaním vody nechať kryštalizovať.

Príklad 17A

Aminoizobutyryl-O-benzylserín-spiroindolín (15)

Východiskové zlúčeniny: Boc-spiroindolín (14) metánsulfónová kyselina (MsOH) etanol voda

1N roztok hydroxidu sodného etylacetát aktívne uhlie Darco 60

3160 g (5,03 mol)

979 ml (15,1 mol)

6,2 I 30 I 11 I 26 I 1 kg

Na roztok Boc-spiroindolínu (14) v 6,2 I etanolu sa pôsobí 979 ml kyseliny metánsulfónovej. Teplota sa tým zvýši z 20 na 30 °C a reakcia sa nechá prebiehať

-64cez noc. Po 12 hodinách pri teplote 20 °C zostáva v zmesi stále 15 % plochy pod krivkou východiskovej zlúčeniny. Zmes sa preto zahrieva 6 hodín na teplotu 35 °C. Po ukončení reakcie (menej ako 0,1 % plochy pod krivkou zlúčeniny (14)) sa reakčná zmes ochladí na teplotu 20 °C a pridá sa 30 I vody. Roztok sa filtruje cez sklenený lievik a polypropylénovým filtrom, čím sa odstráni zvyšné množstvo DCU. Zmes sa premiestni do extrakčného zariadenia s objemom 100 I a pridá sa 26 I etylacetátu. Vodný podiel sa privedie na zásadité pH pridaním 11 I ochladeného 1N roztoku hydroxidu sodného a 1 I 50% roztoku hydroxidu sodného. Aby sa teplota udržala pod 14 °C, je potrebné pridať ľad. Vyššia teplota vedie k vzniku emulzie.

Organický podiel sa destiluje pri teplote 50 °C a tlaku 2793 Pa na hodnotu KF nižšiu ako 1000 pg/ml. Nižšie KF je výsledkom účinnejšieho pôsobenia aktívneho uhlia a jeho lepšej izolácie po tvorbe soli. Za vzniku 700 g produktu bola dosiahnutá hodnota KF = 160 pg/ml. Roztok sa zriedi etylacetátom do celkového objemu 31 I (roztok obsahuje podľa kvapalinovej chromatografie 2,40 kg produktu). Pridá sa aktívne uhlie Darco G-60 a zmes sa 24 hodín mieša. Po filtrácii cez Solkafloc™ sa filtračný koláč premyje 16 I etylacetátu za vzniku 2,34 kg produktu.

Príklad 17B ··

(15)

Aminoizobutyryl-O-benzylserín -spiroindolín (15)

-65Východiskové zlúčeniny: Boc-spiroindolín (14) metánsulfónová kyselina etylacetát

1M vodný roztok hydroxidu sodného 50% vodný roztok hydroxidu sodného Darco G-60

Solka-floc™

4,395 kg (6,99 mol) 2,017 kg (20,99 mol)

1851 161 2,6 1 900 g 2,5 kg

Do približne 25 I miešaného roztoku 4,395 kg Boc-spiroindolínu (14) v etanole, umiestneného v reakčnej nádobe, sa pri teplote miestnosti pridá 2,017 kg (1,36 I, približne 3 ekvivalenty) kyseliny metánsulfónovej. Reakčná zmes sa zohreje na 35 až 40 °C a cez noc sa mieša. Nasledujúci deň obsahuje reakčná zmes približne 1,1% plochy pod krivkou východiskového materiálu a preto reakcia pokračuje ďalšie 4 hodiny. Podľa kvapalinovej chromatografie bol pomer produktu a východiskového materiálu 99,6:0,4. Reakčná zmes sa zahustí vo vákuu na objem okolo 15 1a následne sa zriedi 44 I vody. Reakčná zmes sa ochladí na 5 °C, 30 minút sa mieša a filtruje sa za použitia čerpadla cez zabudovaný filter Sparkler (obsahujúci vopred vyrobený stĺpec s veľkosťou otvorov 10 pm) do druhej nádoby na odstránenie malého množstva zvyškového DCU.

Nádoba, čerpadlo, filter a trubica sa premyjú 10 I vody, ktorá sa potom pridá do nádoby s reakčnou zmesou. Pridá sa 36 I etylacetátu a miešaná zmes sa ochladí na teplotu 10 °C. Pri tejto teplote sa pridá 16 I studeného 1M vodného roztoku hydroxidu sodného s teplotou 5 až 10 °C a 2,6 I studeného 50% vodného roztoku hydroxidu sodného s teplotou 5 až 10 °C. Teplota sa zvýši na 14 °C. Výsledná zmes sa 15 minút mieša pri teplote nižšej ako 14 °C a spodný vodný podiel sa oddelí.

Reakčná zmes sa zahustí vo vákuu na objem približne 20 I a do zmesi sa pridá zmes 35 I etylacetátu a 5 I etanolu do konečného objemu 20 I. Ku koncu destilácie je KF 9160 mg/ml. Rozpúšťadlo sa vymení za etylacetát pri pomalom

-66pridávaní preplachovaní celkom 40 I etylacetátu. Ku koncu tejto destilácie je hodnota KF 446 mg/ml. Reakčná zmes sa zriedi 10 I etylacetátu.

Do zmesi sa pridá 900 g aktívneho uhlia zn. Darco G-60 a zmes sa premyje 6 I etylacetátu. Zmes sa mieša cez noc pri teplote miestnosti a nasledujúci deň sa za stáleho miešania k reakčnej zmesi za stáleho miešania pridá 0,5 kg Solkafloc™. V malom množstve etylacetátu sa mieša 2,0 kg Solka-floc™ a týmto materiálom sa naplní filter Estrella. Prebytok rozpúšťadla sa odčerpá cez zabudovaný filter Estrella. Prebytok rozpúšťadla sa odčerpá cez zabudovaný filter Sparkler obsahujúci stĺpec s veľkosťou otvorov 10 μίτι. Suspenzia sa dvakrát filtruje pomocou čerpadla do dvoch nerezových zásobných nádob s objemom 40 I. Kvapalinba je čistá a číra. Reakčná nádoba sa premyje 22 I etylacetátu a týmto materiálom sa premyje ostatné zariadenie a vleje do zásobných nádob. Obsah oboch zásobných nádob sa premiestni do reakčných nádob a roztok sa dokonale premieša.

Reakčná zmes s objemom 58 I má hodnotu KF = 2950 mg/ml a preto sa znova suší vo vákuu na objem 20 až 25 I. Po zriedení reakčnej zmesi na objem 46 I (merané ponorným meradlom) pridaním 25 I etylacetátu je hodnota KF = 363 mg/ml. Reakčná zmes sa zriedi na objem 62 I pridaním 17 I etylacetátu a použije sa v ďalšom konečnom postupe syntézy.

Príklad 18A

(16)

-67Spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2metylpropánamid-metansulfonát (16)

Východiskové zlúčeniny: amín (15) metánsulfónová kyselina (MsOH) etylacetát etanol

8% roztok etanolu v etylacetáte

2340 g (4,43 mol)

316 ml (4,88 mol)

I

4,8 I 20 I.

Objem roztoku zlúčeniny (15) z predchádzajúcej časti sa privedie pridaním etylacetátu a 4,8 I etanolu na objem 60 I. Pri teplote 45 °C sa pridá roztok 316 ml kyseliny metánsulfónovej v 3 I etylacetátu. Do tmavočerveného homogénneho roztoku sa kvôli naočkovaniu pridá 496 g výslednej zlúčeniny všeobecného vzorca I (10% hmotnostných voľného amínu ako očkovacieho materiálu). Teplota sa zvýši na približne 48 °C a reakčná zmes sa nechá stáť 1,5 hodiny pri teplote 52 °C. Podľa analýzy dôjde k úplnému vytvoreniu výslednej zlúčeniny všeobecného vzorca I. Použitím menej ako 10 % očkovacieho materiálu sa predĺži doba státia (vyššia ako 3 hodiny). Suspenzia sa nechá cez noc ochladiť na teplotu 20 °C a pod dusíkom sa filtruje v centrifúge. Filtračný koláč sa premyje 20 I 8% roztoku etanolu v etylacetáte. Prítomnosť dusíka je veľmi dôležitá, pretože mokré kryštáliky sú veľmi hygroskopické. Reakčná zmes sa vo vákuu suší za teploty 35 °C za vzniku

2,7 kg výslednej zlúčeniny všeobecného vzorca I s celkovým výťažkom 56 % a s čistotou 99,9 % plochy pod krivkou a s prítomnosťou menej ako 0,1 % enantioméru.

Premena zlúčeniny všeobecného vzorca II na zlúčeninu všeobecného vzorca I sa uskutoční tvorbou soli v zmesi etylacetátu a etanolu pridaním kyseliny metánsulfónovej, ako bolo vyššie uvedené, a počiatočný roztok soli s teplotou 55 °C sa ochladí na teplotu 45 °C. pri tejto teplote sa začnú objavovať kryštáliky a suspenzia zhustne. Teplota sa zvýši na 51 °C a suspenzia sa nechá cez noc stáť. Dôjde k premene zlúčeniny (16) na zlúčeninu všeobecného vzorca I. Týmto

-68postupom je možné vytvoriť očkujúce kryštáliky zlúčeniny (16) všeobecného vzorca

Príklad 18B

Východiskové zlúčeniny: amín (15) metánsulfónová kyselina etylacetát absolútny etanol

SpirofSH-indol-SÁ'-piperÍdínj-ľ-yOkarbonyl]2-(fenylmetyloxy)etylj-2-amino-2-metylpropánamid-metánsulfonát (všeobecný vzorec I)

Spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2metylpropánamid-metánsulfonát (16)

3,1 kg (5,86 mol)

620 g (6,45 mol)

I

8,7 I g (0,11 mol)

Do roztoku s objemom približne 62 I 3,1 kg amínu (15) v etylacetáte sa v reakčnej nádobe pridá 6,4 I absolútneho etanolu. Reakčná zmes sa v reakčnej nádobe zohreje na teplotu 50 °C a počas približne 5 minút sa pri teplote 50 až 54 °C pridá roztok 620 g (412 ml, 1,1 ekvivalentu) kyseliny metánsulfónovej v 11 I etylacetátu. Reakčná zmes sa naočkuje 70 g spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-1 yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamid-metánsulfonátu

-69(všeobecného vzorca l). Vytvorená suspenzia sa cez noc mieša a pod dusíkom zahrieva na teplotu 55 °C.

Nasledujúci deň sa suspenzia ochladí na teplotu 15 až 20 °C, pri ktorej sa udržuje 2 hodiny a potom sa po kvapkách v atmosfére dusíka filtruje cez 50 cm polypropylénový filter, produkt ako tuhá látka sa premyje zmesou 2,3 I absolútneho etanolu v 26 I etylacetátu. Biely produkt ako tuhá látka sa oddelí a približne dva dni sa suší v peci Apex vo vákuu pri teplote 35 °C. Sušený spiro[3H-indol-3,4'piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropánamidmetánsulfonát s hmotnosťou 3,352 kg sa preoseje cez Jackson-Crockattovo sito za vzniku 3,347 kg výslednej zlúčeniny vrátane 70 g očkujúcej látky. Celkový výťažok je 3,277 kg.

Podmienky HPLC:

Kvapalinová chromatografia:

Doba retencie na stĺpci Zorbax RX-C8 (4,6 mm x 25 cm), detekcia pri 210 nm, rýchlosť prietoku = 1,5 ml/minútu.

zlúčenina 1: 60:40 CH3CN-H2O (1% H3PO4) RT = 5,0 minút zlúčenina 1b: 35:65 CH3CN-H2O (0,1 % objemové NH₄Oac) RT = 6,2 minút zlúčenina 10: 60:40 CH3CN-H2O (0,1% H3PO4) RT = 2,9 minút zlúčenina 11: 60:40 CH3CN-H2O (1% H3PO4) RT = 5,4 minút zlúčenina 12: 40:60 CH3CN-H2O (pH 5,25 NaH₂PO₄ ) (6,9 g/l vody) (pH dosiahnuté pridaním hydroxidu sodného) RT = 5,6 minút zlúčenina 14: 60:40 CH3CN-H2O (0,1% H3PO4) RT = 4,65 minút zlúčenina 15: 40:60 CH₃CN-H₂O (pH = 5,25 NaH₂PO₄) (6,9 g/l vody) (pH dosiahnuté pridaním hydroxidu sodného) RT = 4,9 minút

Kvapalinová chromatografia:

Doba retencie na stĺpci Zorbax RX-C8 (4,6 mm x 25 cm), detekcia pri 210 nm, rýchlosť prietoku = 1,2 ml/minútu, teplota stĺpca = 48 °C.

Rozpúšťadlo A = 0,05% roztok kyseliny fosforečnej + 0,01% roztok trietylamínu vo vode.

-70Rozpúšťadlo B = acetonitrii.

Prehľad gradientu koncentrácii rozpúšťadiel:

čas	%A	% B
0 minút	95	5
35 minút	10	90
38 minút	95	5
40 minút	95	5

zlúčenina 1 zlúčenina 1b zlúčenina 10 zlúčenina 11 zlúčenina 12 zlúčenina 14 zlúčenina 15

Doba retencie (minúty)

25.2

8.5

20.5

26.3

14,8

25.6

15.7

Príklad 19

Príprava zlúčeniny všeobecného vzorca I, N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsuIfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu

Premena zlúčeniny všeobecného vzorca II na zlúčeninu všeobecného vzorca I sa uskutoční podľa postupu uvedeného v príklade 18A. V zmesi etylacetátu a etanolu sa vytvorí soľ, pridaním kyseliny metánsulfónovej a počiatočný roztok soli s teplotou 55 °C sa ochladí na 45 °C. Po dosiahnutí tejto teploty sa začnú tvoriť kryštály a suspenzia zhustne. Po zvýšení teploty na 51 °C sa suspenzia nechá cez noc stáť, čím by mala byť premena zlúčenín skončená.

-71 Príklad 20

Príprava N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4^,-piperidín]-1^,-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu (všeobecný vzorec I)

Premena zlúčeniny všeobecného vzorca II na zlúčeninu všeobecného vzorca I sa uskutoční miešaním 2 až 24 hodín roztoku zlúčeniny N-[1 (R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamidu všeobecného vzorca II v izopropanole pri teplote približne 25 °C.

Príklad 21

Príprava N-flíRj-IXI^-dihydro-l-metánsulfonyl-spirojOH-indol-S/'-piperidínj-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu (všeobecný vzorec IV)

V zmesi 24,8 ml etylacetátu, 1,6 ml etanolu a 1,95 ml vody sa pri teplote 42 °C a za stáleho miešania rozpustia 8,4 g N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu vo vhodnej morfologickej forme. Pri teplote 40 °C sa odparí rozpúšťadlo a vytvorená tuhá látka sa rozomelie na jemný prášok, ktorý sa vystaví účinku približne 75 % relatívnej vlhkosti za vzniku výslednej zlúčeniny všeobecného vzorca IV.

Príklad 22

Príprava N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu (všeobecný vzorec IV)

-72Z roztoku etylacetátu, etanolu a vody v pomere objemov 24,8:1,6:1,95 sa vo vhodnej morfologickej forme nechá kryštalizovať N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-1 '-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonát za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca IV.

Príklad 23

Príprava N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu všeobecného vzorca IV

Pri teplote približne 25 °C sa cez noc mieša suspenzia zlúčeniny N-[1(R)[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu všeobecného vzorca I v zmesi izopropylacetátu a etanolu v pomere objemov 90:10 obsahujúcej približne

2,8 % objemových vody. Vznikne výsledná zlúčenina ako tuhá látka.

V opise a príkladovej časti bol predmet vynálezu opísaný v súvislosti s niektorými zvláštnymi a výhodnými uskutočneniami, je však zrejmé, že by odborník mohol navrhnúť rôzne úpravy, zmeny, modifikácie uvedených postupov, najmä pokiaľ ide o vypustenie, náhradu alebo pridanie niektorých častí postupov, bez toho aby pri tom došlo k odchýleniu od zmyslu vynálezu.

Bolo by napríklad možné použiť iné účinné dávky, ako sú uvedené, najmä v dôsledku zmien v reakcii cicavca na liečenie alebo vzhľadom na ochorenie, pri ktorom by boli účinné látky použité. Špecifické reakcie na účinnú látku sa totiž môžu meniť v závislosti na type účinnej látky alebo na zvolenom farmaceutickom nosiči, na zvolenej liekovej forme a spôsobe podávania a takéto očakávané zmeny je potrebné brať do úvahy. Vyššie uvedené údaje teda nemajú slúžiť na obmedzenie vynálezu.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polymorfné forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamidmetánsulfonátu, označovaná ako forma I, u ktorej je možné pozorovať pri difrakcii v rtg-žiarení základné hodnoty ohybu 6,5, 14,7, 16,9, 17,1, 17,9, 19,5, 21,1, 21,7 a 22,0° (2 teta).
2. 2. Polymorfné forma forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3Hindol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyioxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1, ktorej krivka pri zahrievaní v diferenciálnom kalorimetri rýchlosťou 10 °C/minútu pod dusíkom je endotermická krivka pre topenie s extrapolovanou teplotou začiatku topenia 170 °C.
3. 3. Polymorfné forma forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3Hindol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1, ktorej rozpustnosť v izopropanole je 4,6 mg/ml.
4. 4. Polymorfné forma forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3Hindol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1, ktorá sa javí v polarizovanom svetle ako dvojlomá.
5. 5. Polymorfná forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamidmetánsulfonátu, označovaná ako forma IV, u ktorej je možné pozorovať pri difrakcii rtg-žiarenia základné hodnoty ohybu 16,0, 16,2, 18,3, 20,1, 21,0 a 24,2° (2 teta).
6. 6. Polymorfná forma forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3Hindol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propán- 74 amid-metánsulfonátu podľa nároku 5, ktorej krivka pri zahrievaní v diferenciálnom kalorimetri rýchlosťou 10 °C/minútu pod dusíkom je endotermická krivka pre stratu vody pri teplote 45 °C, nasledovaná endotermickou krivkou pre topenie a extrapolovanú teplotou začiatku topenia 129 °C.
7. 7. Polymorfná forma forma N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3Hindol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etylj-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 5, obsahujúca 3,5 mol vody na 1 mol N-[1(R)[(1,2-dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu.
8. 8. Spôsob výroby polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-pipendín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 1, označovanej ako forma I, vyzná č u j ú c i sa tým, že sa mieša roztok formy II N-[1 (R)-[(1,2-dihydro-1 metánsuifonyl-spirotSH-indol-S^'-piperidínj-ľ-yOkarbonylJ-Ž-ífenylmetyl-oxyJetyl]2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu v izopropanole pri teplote približne 25 °C po dobu 2 až 24 hodín.
9. 9. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický nosič a účinné množstvo polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2amino-2-metyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 1.
10. 10. Farmaceutický prostriedok na liečenie osteoporózy, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje kombináciu bifosfonátu a polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 1.

    -7511. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa t ý m , že ako bifosfonát obsahuje alendronát.
11. 12. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický nosič a účinné množstvo polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2amino-2-metyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 5.
12. 13. Farmaceutický prostriedok na liečenie osteoporózy, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje kombináciu bifosfonátu a polymorfnej formy N-[1 (R)-[(1,2dihydro-1-metánsulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 5.
13. 14. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m, že ako bifosfonát obsahuje alendronát.
14. 15. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1, na výrobu liečiva na zvyšovanie koncentrácie endogénneho rastového hormónu u človeka alebo iného živočícha.
15. 16. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1 v kombinácii s ďalšou látkou, zvyšujúcou sekréciu rastového hormónu na výrobu liečiva na zvyšovanie sekrécie endogénneho rastového hormónu u človeka alebo iného živočícha.
16. 17. Použitie podľa nároku 16, kde sa ďalšia látka, zvyšujúca sekréciu rastového hormónu volí zo skupiny peptidu GHRP-6, uvoľňujúceho rastový hormón, peptidu GHRP-2, uvoľňujúceho rastový hormón, peptidu GHRP-1,

    -76uvoľňujúceho rastový hormón, B-HT920, faktora na uvoľňovanie rastového hormónu, faktora na uvoľnenie analógu rastového hormónu, IGF-1 a IGF-2.
17. 18. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1 na výrobu liečiva na zvyšovanie využitia krmiva, podpory rastu, zvyšovania produkcie mlieka a zlepšenia kvality mäsa u hospodárskych zvierat.
18. 19. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu stavov zo skupiny osteoporóza, katabolické ochorenia, nedostatočnosť imunitného systému vrátane stavov so zníženým pomerom buniek T₄/T₈, zlomeniny bedrového kĺbu, poruchy svalového a kostrového systému u starých ľudí, nedostatok rastového hormónu u dospelých alebo u detí, obezita, kachexia a strata bielkovín pri chronických ochoreniach, ako AIDS alebo zhubných nádoroch, liečenie chorých, zotavujúcich sa po závažných chirurgických zákrokoch, poraneniach alebo popáleninách.
19. 20. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 1 v kombinácii s bifosfonátom na výrobu liečiva na liečenie osteoporózy.
20. 21. Použitie podľa nároku 20, kde sa ako bifosfonát podáva alendronát.
21. 22. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 5, na výrobu liečiva na zvyšovanie koncentrácie endogénneho rastového hormónu u človeka alebo iného živočícha.

    -77
22. 23. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 5 v kombinácii s ďalšou látkou, zvyšujúcou sekréciu rastového hormónu na výrobu liečiva na zvyšovanie sekrécie endogénneho rastového hormónu u človeka alebo iného živočícha.
23. 24. Použitie podľa nároku 23, kde sa ďalšia látka, zvyšujúca sekréciu rastového hormónu volí zo skupiny peptidu GHRP-6, uvoľňujúceho rastový hormón, peptidu GHRP-2, uvoľňujúceho rastový hormón, peptidu GHRP-1, uvoľňujúceho rastový hormón, B-HT920, faktora na uvoľňovanie rastového hormónu, faktora na uvoľnenie analógu rastového hormónu, IGF-1 a IGF-2.
24. 25. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 5 na výrobu liečiva na zvyšovanie využitia krmiva, podpory rastu, zvyšovania produkcie mlieka a zlepšenia kvality mäsa u hospodárskych zvierat.
25. 26. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-met tyl-propánamid-metánsulfonátu podľa nároku 5 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu stavov zo skupiny osteoporóza, katabolické ochorenia, nedostatočnosť imunitného systému vrátane stavov so zníženým pomerom buniek T4/T8, zlomeniny bedrového kĺbu, poruchy svalového a kostrového systému u starých ľudí, nedostatok rastového hormónu u dospelých alebo u detí, obezita, kachexia a strata bielkovín pri chronických ochoreniach, ako AIDS alebo zhubných nádoroch, liečenie chorých, zotavujúcich sa po závažných chirurgických zákrokoch, poraneniach alebo popáleninách.
26. 27. Použitie polymorfnej formy N-[1(R)-[(1,2-dihydro-1-metánsulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidín]-ľ-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-me-78tyl-propán-amid-metánsulfonátu podľa nároku 5 v kombinácii s bifosfonátom na výrobu liečiva na liečenie osteoporózy.
27. 28. Použitie podľa nároku 27, kde sa ako bifosfonát podáva alendronát.