CN1205703A

CN1205703A - 生长激素促分泌素的多晶型物

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Publication number: CN1205703A
Application number: CN96199328A
Authority: CN
Inventors: J·P·德拉佩; D·C·杜波斯特; M·J·考夫曼; J·A·麦考莱; J·L·范德里拉; R·J·瓦索罗纳
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-01-20
Anticipated expiration: 2016-10-23
Also published as: CZ128098A3; EA000528B1; JP3204266B2; SK51398A3; JPH10512295A; CO4770956A1; EP1019402A1; YU56696A; NO981867D0; NO310556B1; MX9803351A; AU7468696A; CN1067687C; WO1997015574A1; EE9800147A; KR19990067098A; NZ321370A; CA2235371A1; EA199800335A1; BG102476A

Abstract

本发明是关于多晶型化合物N－[1(R)－[(1,2－二氢－1－甲磺酰基螺[3H－吲哚－3,4′－哌啶]－1′－基)羰基]－2－(苯基甲氧基)乙基]－2－氨基－2－甲基丙酰胺甲磺酸盐,它是生长激素的促分泌素,用于食用动物促进其生长,从而更有效地提供食用肉产物的生产,和用于人治疗以生长激素分泌不足为特征的生理或内科疾病,和治疗需要将生长激素的合成代谢作用加以改善的内科疾病。就药物制剂中所含物的热力学稳定性和适应性而言,本发明的多晶型化合物优于其他已知晶型的化合物N－[1(R)－[(1,2－二氢－1－甲磺酰基螺[3H－吲哚－3,4′－哌啶]－1′－基)羰基]－2－(苯基甲氧基)乙基]－2－氨基－2－甲基丙酰胺甲磺酸盐。本发明还涉及制备这些多晶型化合物的方法,含有这些多晶型化合物作为活性组分的药物制剂,以及所述多晶型化合物和其制剂在治疗某些疾病中的用途。

Description

生长激素促分泌素的多晶型物

发明背景

从垂体中分泌的生长激素刺激能生长的身体的所有组织的生长。此外，已知生长激素对身体的代谢过程具有下面主要作用：(1)在身体的所有细胞中蛋白质合成的速度增加；(2)在身体的细胞中碳水化合物的利用速度减小；(3)游离脂肪酸的移动增大和利用脂肪酸的能量提高。生长激素分泌的不足可导致各种内科疾病，例如侏儒症。

已知有各种方法释放生长激素。例如化学药品，例如精氨酸、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、胰高血糖素、抗利尿激素和胰岛素诱导的血糖过低症，以及活动度，例如睡眠和运动，通过以某种方式作用于下丘脑直接引起从垂体中释放生长激素，或降低生长激素释放抑制因子的分泌，或提高已知的促分泌素生长激素释放因子(GRF)，或未知的内生生长激素释放激素，或者所有这些因素。

在希望提高生长激素水平的情况下，一般通过提供外源生长激素，或给与GRF或刺激生长激素产生和／或释放的肽化合物解决所述问题。两种情况都需要化合物的肽基特性，所以需注射给药。最初，生长激素的来源是尸体的垂体腺的提取物。结果得到的产物很昂贵，同时随之也给生长激素受体带来传播与垂体腺来源有关的疾病之危险。重组体生长激素是可得到的，同时不再有疾病传染的任何危险，但仍是很昂贵的产物，必须通过注射或鼻喷雾给药。也已经开发了刺激内源生长激素释放的其他化合物。

特别是一些螺环化合物作为非肽生长激素促分泌素在美国专利5，536，716，PCT专利申请WO94／13696和Proc．Natl．Acad．Sci．USA，927001-7005(1995．7．)中公开。这些化合物具有刺激固有的或内生的生长激素释放的能力。因此例如对于固有生长激素不足的人用于治疗需要刺激生长激素产生或分泌的疾病，或用于为食用或羊毛而生产的动物其中刺激生长激素结果将得到较大的产量更多的动物。

具有下面结构式的螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是这里公开的优选化合物：

美国专利5，536，716和PCT专利公开WO94／13696公开了制备该化合物的方法(参见实施例18，19和55)。特别是实施例55说明通过从乙酸乙酯-乙醇-水中重结晶所制备的化合物的熔点是“166-168℃”。随后该化合物鉴定为在这里称为“Ⅱ型”的多晶型化合物。Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，7001-7005(1995．7．)说明以单水合物分离出的该化合物的熔点是168-170℃，但是仅公开了制备该化合物的很一般的方法，未公开怎样结晶该化合物。

药物化合物的形态对涉及开发合适剂型方面是有意义的，因为如果在临床和稳定性研究中形态不保持恒定，则应用或测定的准确剂量各批之间便不可比较。在药物化合物为应用而生产时，重要的是识别提供给各剂型中的形态，以保证生产过程中使用相同的形式，并且保证各剂型包含相同量的药物。因此，绝对必要保证是以单一形态存在，或一些已知形态共同存在。此外，一些形态可以显示热力学或吸水稳定性提高，和比药物制剂中包含物的其他形态更为适宜。本发明中用语“多晶型化合物”的化学实体相同，但是结晶结构不同。

发明概要

本发明是关于多晶型化合物：N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐，以及制备所述多晶型化合物的方法。

本发明还涉及含有上述多晶型化合物作为活性组分的药物制剂，和上述多晶型化合物和其制剂在治疗一些疾病中的用途。

本发明的多晶型化合物是生长激素的促分泌素，用于食用动物促进其生长，从而更有效地提供食用肉产物的生产，和用于人治疗以生长激素分泌不足为特征的生理或内科疾病，或治疗通过生长激素的合成代谢作用可使之改善的内科疾病。就药物制剂中的内含物的热力学稳定性和适合性方面而言，所述多晶型化合物优于其他已知晶型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐。

发明的详细说明

本发明是关于新的多晶型化合物N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐和制备所述多晶型化合物的方法。

化合物N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐具有下式结构：

该化合物是诱导人和动物生长激素释放的生长激素的促分泌素。该性能可用于促进食用动物的生长以更有效的提供食用肉产物的生产，和可用于人治疗以生长激素分泌不足为特征的生理或内科疾病，以及治疗通过生长激素的合成代谢作用可改善的内科疾病。

这些具体的多晶型化合物(在本发明中称为“Ⅰ型”，“Ⅱ型”，“Ⅲ型”，“Ⅳ型”，“Ⅴ型”，“Ⅵ型”，“Ⅶ型”，“Ⅷ型”，“Ⅸ型”和“Ⅹ型”结晶的化合物)具有优于该化合物其他晶型的性质，以至它们更适宜包含在药物制剂中。根据晶型的热力学稳定性和不吸湿特性，药物开发的优选晶型是Ⅰ型。而根据制剂的性质，特别是就制片的压缩性质而言，药物开发的其他优选晶型是Ⅳ型。已经发现Ⅳ型比其他晶型有更高的堆积密度。

本发明还涉及制备Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶的方法，包括：

在约50℃用甲磺酸(约1．1当量)处理N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺的游离碱在含有乙醇(约8％(体积))的乙酸乙酯中的溶液，加热至约55℃，并冷却至约45℃。

然后，可任选将温度升至约51℃，保持2-24小时。

本发明还关系到制备Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的另一种方法，包括：

在约50-55℃将甲磺酸(约1．1当量)和Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基-丙酰胺甲磺酸盐交替加入N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺的游离碱在含有乙醇(约8％(体积))的乙酸乙酯中的溶液中(其中加入的相对顺序不严格要求)，接着在约55℃加热约2-15小时，冷却至约25-30℃，陈化约2-3小时。

本发明还涉及制备Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的另一种方法，包括：

在约25℃搅拌Ⅱ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的异丙醇溶液约2-24小时。

本发明也涉及制备Ⅱ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

在约50℃用甲磺酸(约1．1当量)处理N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺的游离碱在含有乙醇(约8％(体积))的乙酸乙酯中的溶液，加热至约55℃，并冷却至室温。

本发明还涉及制备Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

将任意形态组成的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐溶于乙醇／水(优选25∶75v／v)的溶液中；

优选在温度40℃从溶液中蒸发溶剂；

将得到的固体研磨成细粉；和

将细粉暴露于约75％的相对湿度下。

本发明还涉及制备Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的另一种方法，包括：

从乙酸乙酯／乙醇／水(优选24．8／1．6／1．95(v／v／v))的溶液中重结晶任意形态组成的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐。

在室温下将Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐暴露于大于约75％，优选约88％的相对湿度下足够长时间。

本发明还涉及制备Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的另一种方法，包括：

在约25℃下从Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐在含有约2．8％(重量)水的乙酸异丙酯／乙醇(90∶10(v／v))中的浆液中分离。

本发明还涉及制备Ⅴ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

在室温下将Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐暴露于低于30％的相对湿度下。

本发明还涉及制备Ⅵ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

在接近室温无水分条件下，例如在约25℃的过滤的干燥氮气氛下，干燥V型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐。

本发明还涉及制备Ⅶ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

从Ⅰ型或Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐在含有约1．5％(重量)水的乙酸异丙酯／乙醇(90∶10(v／v))中的浆液中分离。

本发明还涉及制备Ⅷ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

在干燥惰性气体，例如干燥氮气氛下将Ⅶ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐脱水足够长时间。

本发明还涉及制备Ⅸ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

制备任意形态组成的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的水溶液，接着在接近室温和20％相对湿度下通过控制蒸发分离形成的固体。

本发明还涉及制备Ⅹ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括：

在室温和室内湿度下干燥Ⅸ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐足够长时间。

本发明还涉及制备X型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的另一种方法，包括：

将Ⅰ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐暴露于100％的相对湿度下约1-4天。

同样，本发明还针对制备形态同一的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的方法，包括本说明书中记述的任何方法。

本发明的化合物，即新的多晶型化合物N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐，是生长激素促分泌素，将其用于食用动物促进其生长，因而更有效地提供食用肉产物的生产，和用于人治疗以生长激素分泌不足为特征的生理或内科疾病，和治疗通过生长激素的合成代谢作用可加以改善的内科疾病。因此，本发明还涉及含有多晶型化合物作为活性组分的药物制剂，和所述多晶型化合物和其制剂在治疗一些疾病中的用途。

差示扫描量热池[DSC]

在敞口杯中，在氮气流下，以10℃／分加热时Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的DSC曲线表示由于熔化简单吸热，峰值温度约180℃和外推得出熔化开始温度(熔点)约170℃，缔合热约53J／g。

在敞口杯中，在氮气流下，以10℃／分加热时，Ⅱ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的DSC曲线表示由于熔化简单吸热，峰值温度约174℃和外推得出开始熔化温度(熔点)约165℃，缔合热约37J／g。

在敞口杯中，在氮气流下，以10℃／分加热时，Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的DSC曲线表示在约45℃失水吸热，接着由于Ⅵ型结晶熔化吸热，峰值温度约134℃，外推得出熔化开始温度(熔点)约129℃，缔合热约23J／g。

DSC数据[试样在氮气氛下以10℃／分的速度加热(外推得出熔化开始温度)]：

Ⅰ型：170℃(熔化吸热)

Ⅱ型：165℃(熔化吸热)

Ⅵ型：129℃(熔化吸热)

Ⅰ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是相对无水的多晶型化合物，具有下列特性：熔点169℃，在异丙醇中的溶解度4．6mg／mL。

Ⅱ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是无水的多晶型化合物，具有下列特性：熔点158℃，在异丙醇中的溶解度12．3mg／mL。

Ⅲ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是水合物，具有下列特性：失水吸热峰值温度46℃，接着微熔／分解吸热，外推得出熔点开始温度123℃。

Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是水合物，具有下列特性：失水吸热峰值温度45℃，接着熔化／分解吸热，外推得出熔化开始温度129℃(据推测由于Ⅵ型结晶的熔化／分解)。

Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐看来是吸湿的水合物，每摩尔N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐含有3．5摩尔水。

Ⅴ型的N[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐看来是吸湿的水合物，每摩尔N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐含有1摩尔水。

Ⅵ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐看来是无水的多晶型化合物，其特征是熔点129℃。

Ⅶ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是水合物，具有下列特性：广泛失水吸热峰值温度60℃，接着熔化／分解吸热，外推得出熔化开始温度144℃(推测由于Ⅷ型结晶的熔化／分解)。

Ⅷ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐是无水的多晶型化合物，其特征是熔点144℃。

Ⅹ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的特征是广泛失水吸热峰值温度49℃。

Ⅹ-射线粉末衍射(XRPD)

Ⅹ-射线粉末衍射研究广泛用于说明分子结构、结晶度和多晶现象。用具有铜Kα辐射的philips APD3720自动粉末衍射仪采集Ⅹ-射线粉末衍射(XRPD)图象。用保持在室温下的试样从2°至40°(2θ)范围测定。

Ⅰ型结晶的特征是在约6．5，14．7，16．9，17．1，17．9，19．5，21．1，21．7和22．0°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅱ型结晶的特征是在约4．8，11．8，17．5，19．4，21．6，21．9，22．5和22．7°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅲ型结晶的特征是在约13．8，14．1，18．0，18．8，19．5，20．1，20．6，21．8和25．7°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅳ型结晶的特征是在约16．0，16．2，18．3，20．1，21．0和24．2°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

V型结晶的特征是在约14．8，17．1，17．6，19．0，19．1，19．4，20．6，21．5和21．8°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅵ型结晶的特征是在约9．8，14．0，14．8，17．1，17．6，19．0，19．5，20．6和21．6°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅶ型结晶的特征是在约9．1，11．3，17．1，17．4，20．0，22．1和24．5°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅷ型结晶的特征是在约11．5，11．6，18．1，19．6，22．5，24．7和24．8°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅸ型结晶的特征是在约8．0，12．1，15．3，15．8，19．6，19．7，21．1，22．3和23．7°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

Ⅹ型结晶的特征是在约15．5，15．8，18．0，18．4，18．6，19．4，20．7，20．8，23．9和24．8°(2θ)出现主要反射Ⅹ-射线粉末衍射图象。

这些XRPD图象证明所有Ⅰ-Ⅹ型结晶是不同的晶形。

显微镜观察法

在单色偏振光放大100倍条件下进行多晶型化合物观察。Ⅰ型和Ⅱ型结晶是针状颗粒。Ⅰ型和Ⅱ型结晶在偏振光下看来是双折射的。

吸湿性

在暴露于不同的控制湿度时Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型结晶的固体试样的总挥发量(由TGA分析测定)列于下面表中。发现Ⅰ型结晶含有0．97wt％水；Ⅱ型结晶含有0．56wt％水；Ⅲ型结晶含有4．5-5．0wt％水；Ⅳ型结晶含有9．5-10．0wt％水。

吸湿性通过将固体化合物保存于恒定相对湿度的室中测定。在室温下无水的Ⅰ型和Ⅱ型结晶相比较表明Ⅱ型结晶是吸湿的，并表明在65％RH(相对湿度)下水分开始大大增加。除了在大于76％RH存放外，Ⅰ型结晶的水分未表现出显著增加。结果列于下面的表1和2中。

表1

室温(48小时)

Ⅰ型 Ⅱ型

％RH ％增加／减少％增加／减少

0 -0．02 +0．08

11 -0．05 +0．02

33 - +0．33

47 +0．21 +0．39

65 +0．37 ＞10．0^a

76 +0．12 ＞10．0^a

100 ＞12．0 ＞10．0^a，b

(^a=试样变成粘性半固体)

(^b=在暴露于环境湿度下时转化为Ⅳ型)

表2

室温(96小时)

Ⅰ型

％RH ％增加／减少

7 +0．4

22 +0．3

47 +0．5

68 +0．6

88 +12．9*

100 +23．9*

(*=潮解的物质)

通过在室温及室内相对湿度下将水合的Ⅲ型和Ⅳ型的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐存放48小时，评价水合的Ⅲ型和Ⅳ型结晶。Ⅲ型结晶表示在33％RH下48小时后水分增加。虽然直到在100％RH下存放Ⅳ型结晶也未明显增加水分，但是在11％RH或低于11％RH下存放时Ⅳ型结晶失去水合水。结果列于下面表3中。

表3

室温(48小时)

Ⅲ型 Ⅳ型

％RH ％增加／减少％增加／减少

0 - -7．8

11 -0．15 -4．9

33 +2．23 +0．3

47 +3．99 +0．7

66 - +1．4

76 +3．76 +1．5

100 - +5．3

该数据表明Ⅰ型化合物是相对无水的。

溶解度

室温下蒸馏水中I型结晶的溶解度＞100mg／mL。在缓冲溶液(pH4-9)中Ⅱ型结晶的溶解度(RT)＞100mg／mL。在乙醇／水混合物中Ⅰ型结晶的溶解度如下所示：

溶解度

％乙醇／H₂O (mg／mL)

25／75 ＞100

50／50 ＞100

75／25 ＞90

100％乙醇＞90

热稳定性-纯化合物

纯固体化合物的稳定性通过在玻璃螺丝帽管形瓶中将药物存放于暗处测定。试样用HPLC分析，定量分析母体化合物。使用的恒溶剂洗脱法概述如下：

柱： Beckman Ultrasphere ODS(250×4．6mm，5μ)

流动相： 0．1％TEA，pH4．0，H₃PO₄∶乙腈(65∶35)

流速： 1．0mL／min

检测波长： 228nm

试验时间： 14min

柱温度：室温

注入体积：20μL N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐(50μg／mL)

如下所示，Ⅰ型和Ⅱ型结晶计算结果均按重量计。

Ⅰ型结晶

初始％

℃ 6周 17周

40 100．1 98．7

60 100．7 101．3

80 100．7 99．4

Ⅱ型结晶

初始％℃ 1周 2周 4周 8周 12周 2440 99．7 100．7 99．5 - 100．1 100．160 99．4 99．6 100．3 100．0 101．0 100．880 99．2 100．3 99．2 99．8 100．4 --这些结果表明纯固体的Ⅰ型和Ⅱ型结晶具有良好的热稳定性。制备目的化合物的方法概述如下：

方案Ⅰ：

方案Ⅰ(续)

如方案1所述，在加氢之前CBZ-螺二氢吲哚1用Darco(20％(重量))处理。激烈搅拌下在乙醇中于65℃用10％ Pd／C进行催化加氢。

在二环己基碳化二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，使1b在乙酸异丙酯和水中的溶液与市售N-BOC-O-苄基-D-丝氨酸偶合。在过滤出二环己基脲(DCU)副产物后，分离两相滤液，有机层依次用1M氢氧化钠水溶液，0．5M盐酸水溶液和最后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。如果在iPrOAc／H₂O中的游离胺溶液用DCC和HOBT处理，接着在室温下加入所述氨基酸并反应3-5小时，可改进该偶合作用。然后真空浓缩反应混合物，并将溶剂乙酸异丙酯换成乙醇。该溶剂转换一般通过快速“加入和放出”3倍物料体积溶剂以除去乙酸异丙酯。

通过在35-40℃在乙醇中用甲磺酸(MsOH)(3当量)处理，除去11的BOC-基。在乙酸异丙酯和1M氢氧化钠水溶液之间分配，得到12。

12与N-BOC-α-氨基异丁酸的偶合最好在DCC和HOBt(各1．1当量)存在下，在两相溶剂体系，乙酸异丙酯／水(1∶1)中进行。通过过滤、除去DCU、分层和依次用1M氢氧化钠水溶液，0．5M盐酸水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机层，得到14。

为了随后用甲磺酸解离BOC基，将混合物中的溶剂转换成乙醇。14脱保护基比11脱保护基更难，需要浓的乙醇／甲磺酸溶液，和加热至35-40℃。在萃取处理(EtOAc-NaOH)后，分离游离胺15。有机层用1N NaOH充分洗涤，以保证完全除去甲磺酸。

游离碱15的乙酸乙酯溶液真空浓缩至小体积，通过“加入和放出”2倍物体体积90／10乙酸乙酯／乙醇，接着2倍物料体积乙酸乙酯进行共沸干燥。得到干燥的稍微混浊的游离碱15的乙酸乙酯溶液，用DarcoG60(25％(重量))在室温下处理约10小时。加滤剂过滤分离Darco，得到游离碱15。

由15生成甲磺酸盐16的反应在约50℃，在EtOAc中用1．1当量MsOH进行。游离碱15用8％(体积)EtOH和1当量H₂O处理，并加热至55℃直到全部溶解。冷却至室温并搅拌得到的浆液4小时，得到称为Ⅱ型结晶的结晶物质16[在IPA中的溶解度=12mg／mL]。

进行Ⅱ型结晶向Ⅰ型结晶的转化，其中按上述方法在EtOAc-EtOH中形成盐，但是将初始盐溶液(55℃)冷却至45℃，而不是冷却至室温。结晶在所述温度下开始出现，浆液随时间变得更稠。将温度升至51℃，浆液陈化过夜。预期完全转化为16的Ⅰ型结晶。

优选通过在50-55℃下将I型结晶的种晶加入游离碱在EtOAc-EtOH中的溶液中，接着陈化，进行Ⅱ型结晶向Ⅰ型结晶的转化。因此，游离碱15可以在50-55℃下在8％乙醇的乙酸乙酯溶液中用1．1当量甲磺酸处理。然后整批反应混合物用约2％(重量)Ⅰ型的甲磺酸盐16接种，然后在55℃陈化过夜。将该批反应混合物冷却至室温，并陈化2-3小时。产物在室温和氮气氛下过滤分离，在35℃真空干燥，筛分，得到甲磺酸盐16。

通过在约50℃将MsOH(1．1eq)和I型结晶的种晶加入游离碱在EtOAc-EtOH中的溶液中的步骤改变，也可以生成甲磺酸盐16，因而MsOH和种晶的加入顺序并不严格要求。

本发明的多晶型化合物作为生长激素的促分泌素的用途，可以用现有技术中的已知方法，例如Smith等在Science．260，1640-1643(1993)中描述的测试方法(参见其中图2的内容)证明。用上述测试方法，本发明的所有多晶型化合物均具有生长激素的促分泌素的活性。上述结果表示本发明的多晶型化合物作为生长激素的促分泌素的固有活性。

本发明的释放生长激素的化合物作为唯一的手段用于体外了解在垂体水平上如何调节生长激素的分泌。这包括用于评价设想的和已知的影响生长激素分泌的许多因素，例如年龄、性别、营养因素、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸，以及禁食和非禁食状况等。另外，本发明的化合物可用于评价其他激素如何改变生长激素释放活性。例如已经证实生长激素释放抑制因子抑制生长激素释放。重要的且需要研究的有关影响生长激素释放的其他重要激素包括性腺激素，例如睾酮、雌二醇，和黄体酮；肾上腺激素，例如皮质醇和其他皮质激素类，肾上腺素和去甲肾上腺素；胰和胃肠激素，例如胰岛素、胰高血糖素、促胃液激素、肠促胰液肽；血管作用肽，例如韩蛙皮素、神经激肽；和甲状腺激素，例如甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸。本发明的化合物还用于研究某些垂体激素，如生长激素和内啡肽对垂体可能产生负面或正面反馈作用，以改善生长激素释放。科学上的特殊重要性是使用这些化合物来说明介导生长激素释放的亚细胞机理。

本发明的化合物可以施用于动物，包括人，使之在体内释放生长激素。例如所述化合物可施用于有重要商业价值的动物，例如猪、牛、羊，等等，加速和提高动物生长的速度和程度，以改善饲料效率和提高所述动物奶产量。此外，本发明的化合物也可以用于人体内作为诊断手段直接测定垂体是否能释放生长激素。例如本发明的化合物可施用于儿童体内。可以测定给药前和给药后所取血清试样的生长激素。比较每个试样中生长激素的量，这是直接测定病人垂体释放生长激素能力的手段。

因此，在本发明范围内还包括药物组合物，其中含有至少一种本发明的化合物作为活性组分并结合药物载体或稀释剂。所述药物组合物的活性组分除了包括至少一种本发明的化合物或具有不同活性的其他组分，例如允许抗菌素生长的物质，或治疗骨质疏松的药剂或与使分解代谢副作用减至最小的皮质甾类结合，或与提高效率和使副作用减至最小的其他药物活性物质组合外，还可任选包括合成代谢剂。

生长促进剂和合成代谢剂包括(但不限于)TRH、二乙基己烯雌酚、雌激素、β-兴奋剂、茶碱、促蛋白合成甾醇、脑啡肽、E系列前列腺素、美国专利3，239，345中公开的化合物，例如右环十四酮酚，和美国专利4，036，979中公开的化合物，例如氧苯噻脲，和美国专利4，411，890公开的肽。

本发明的化合物还与其他生长激素的促分泌素共同使用，所述生长激素的促分泌素例如美国专利4，411，890和PCT公开WO89／07110，WO89／07111和B-HT 920中描述的生长激素释放肽GHRP-6，GHRP-1，以及WO93／04081中描述的hexarelin和GHRP-2，或生长激素释放激素(GHRH，也称为GRF)和其类似物，或生长激素和其类似物，或生长调节素包括IGF-1和IGF-2或α肾上腺素兴奋剂，例如氯压定或5-羟色胺5HTID兴奋剂，例如sumitriptan或抑制生长激素释放抑制剂或其释放的药剂，例如毒扁豆碱和吡啶斯的明。本发明的化合物尤其可以与生长激素释放因子、其类似物、IGF-1或IGF-2结合。例如，本发明的化合物可以与IGF-1结合治疗或预防肥胖症。此外，本发明的化合物可以与视黄酸共同使用以改善由内在老化引起的肌肉和皮肤的疾病。

本发明还涉及制备刺激人和动物生长激素释放的药物的方法，包括将本发明的多晶型化合物与药物载体或稀释剂混合。

正如本领域技术熟练的人员熟知的那样，生长激素已知的和潜在的用途是不同的和多种多样的。为了刺激内源生长激素的释放，本发明化合物的施用可以具有与生长激素本身相同的作用和用途。因此本发明化合物的这些不同的用途可以概述如下：刺激中老年人生长激素释放；治疗成年人生长激素不足；预防糖皮质激素分解代谢的副作用；治疗骨质疏松症；刺激免疫系统加速伤口愈合；加速骨折的修复；治疗生长发育迟缓；治疗急性或慢性肾衰竭或功能不全；治疗生理上的身材矮小，包括生长激素不足的儿童；治疗与慢性疾病有关的身材矮小；治疗肥胖症及与其有关的发育迟缓；治疗与Prader-Willi综合症和Turner氏综合症有关的生长发育迟缓；加速烧伤病人和大型手术如胃肠手术后的康复和缩短住院时间；治疗子宫生长发育迟缓和骨骼发育异常；治疗外周神经病；替代应激反应病人的生长激素；治疗骨软骨发育不良、Noonans综合症、精神分裂症、抑郁症、Alzheimer氏病、被延误的伤口愈合和精神丧失；治疗肺机能障碍和呼吸器依赖性；治疗大型手术后蛋白质分解代谢应答减弱；治疗呼吸障碍综合症；减少由于慢性病如癌或艾滋病引起的恶病质和蛋白质损失；使TPN(肠胃外营养总量)异常患者快速增加体重和蛋白质增积；治疗血胰岛素过多症，包括胰岛细胞增殖症；辅助治疗排卵诱导作用和预防及治疗胃和十二指肠溃疡；刺激胸腺发育和防止与年龄有关的胸功能衰退；病人长期的血液透析的辅助治疗；治疗免疫抑制病人和提高接种后的抗体反应；增加人的总淋巴细胞数，特别是使由于身体创伤，如封闭性头伤或由感染，如细菌或病毒感染，特别是由人的免疫缺陷病毒感染引起的T₄／T₈细胞比例过低的人T₄／T₈细胞比例提高；改善肌肉韧力活动性，保持皮肤厚度，维持代谢体内平衡，维持虚弱的中老年人的肾体内平衡；刺激成骨细胞、骨再构，和软骨生长；刺激伴生动物的免疫系统，和治疗伴生动物的老化病症；家畜生长促进剂；和刺激羊毛生长。另外，本发明的化合物用于提高饲料效率，促进生长，提高奶产量和改善家畜肉质量。同样，本发明的化合物用于需要较高生长激素水平合成代谢作用得以治愈的疾病或症状的治疗方法，包括施用本发明的化合物。

本发明的化合物特别用于预防或治疗选自下列的疾病：骨质疏松症；分解代谢病；免疫缺陷，包括T₄／T₈细胞比例低于正常水平的个体的免疫缺陷；髋关节骨折；中老年人的肌肉骨骼损伤；成年人或儿童生长激素不足；肥胖症；由于慢性病如艾滋病或癌引起的恶病质和蛋白质损失；和在需要时治疗由大型外科手术，损伤或烧伤正恢复的病人。

此外，本发明的化合物可用于治疗由促肾上腺皮质激素释放因子或由与应激反应和焦虑有关的失调诱导或加重的疾病，包括应激反应诱导的抑郁症和头痛，腹肠综合症，免疫抑制，HIV感染，Alzheimer氏病，胃肠病，神精性厌食症，出血应激反应，药物和酒精脱瘾综合症，药瘾，和生育力问题。

本领域技术人员已知，现有许多用于试图治疗上面列举的疾病或指征的化合物。其中一些上面描述过的治疗剂与本发明的生长激素促分泌素组合，得到附加的、补偿的、且通常是增效的性质，提高这些各种治疗剂的生长促进作用、合成代谢和合乎需要的性质。在这些组合中，所述治疗剂和本发明的生长激素促分泌素于药剂中之剂量范围，分别是这些化合物和促分泌素单独使用时的有效剂量乘以1／100至1所得之剂量。

抑制骨吸收的组合疗法，预防骨质疏松症和提高骨折的愈合，可用二膦酸盐与本发明的生长激素促分泌素的组合来举例说明。二膦酸盐的这些用途已经由Hamdy，N．A．T．，在Trends in Endocrinol．Metab．，4，19-25(1993)中题为“代谢骨病中二膦酸盐的作用”一文中加以综述。具有这些用途的二膦酸盐包括阿仑膦酸盐(alendronate)、替鲁膦酸盐、二甲基-APD、利塞膦酸盐、依替膦酸盐、YM-175、氯膦酸盐、帕米膦酸盐和BM-210995。根据二膦酸盐的效力以其日口服量0．1mg-5g和本发明的生长激素促分泌素日用量0．01mg／kg体重-20mg／kg体重给药于病人，可得到骨质疏松症的有效治疗。

在使用阿仑膦酸盐的情况下，为了有效的治疗骨质疏松症，将日口服量0．1mg-50mg阿仑膦酸盐与0．01mg／kg体重-20mg／kg体重本发明的生长激素促分泌素组合。骨质疏松症和其他骨病症也可以用本发明的化合物与降钙素、雌激素、雷洛昔芬和钙补充物，例如柠檬酸钙结合治疗。

用本发明的化合物与促蛋白质合成甾醇，例如羟甲希龙、甲睾酮(methyltesterone)、氟甲睾酮和司坦唑醇结合，特别在治疗老年男性病人中得到合成代谢效果。

本发明的化合物可以通过口，胃肠外(例如，肌肉内，腹膜内，静脉内或皮下注射，或植入)，鼻，阴道，直肠，舌下或局部给药途径给药，可以配制成适合于各种给药途径的剂型。

口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在上述固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的可药用载体，如蔗糖、乳糖或淀粉混合。上述剂型还可以含有惰性稀释剂以外的常用添加物质，例如润滑剂，如硬脂酸镁。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以含有缓冲剂。片剂和丸剂还可以用肠衣制备。

口服的液体剂型包括可药用的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂、含有本技术领域中普通使用的惰性稀释剂，如水。除了上述惰性稀释剂外，组合物中还可以含有佐剂，例如湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和香味剂。

胃肠外给药的本发明制剂包括消毒水溶液或非水溶液，悬浮液或乳液。非水溶剂或赋形剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如橄榄油和玉米油、明胶，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。上述剂型还可以含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。上述剂型可用下述方法消毒，例如，以隔菌滤器过滤，将消毒剂加入组合物中，照射组合物，加热组合物。上述制剂也可以配制成消毒固体组合物形式，可在使用前直接溶于消毒水或某些其他消毒的可注射介质中。

直肠或阴道给药的组合物优选栓剂，其中除了活性组分外还含有赋形剂，例如可可脂或栓剂蜡。

鼻和舌下给药的组合物也用现有技术中熟知的一般赋形剂制备。

本发明的化合物可以以能提供最佳药物效能的剂量给药于需要治疗的患者(动物或人)。应该认识到任何具体应用中所需之量随不同患者而异，不仅与选择的具体化合物或组合物有关，而且也与给药途径，被治疗的病症性质，病人的年龄和身体状况，同时进行的药疗法，或病人随后的特定饮食和本领域技术人员认识的其他因素有关，但归根到底所述适宜剂量还要由主治医生决定。

本发明的组合物中活性组分的剂量可以改变，但是活性组分的量必须保证能得到合适的剂型。选择的剂量取决于希望的治疗效果，给药途径，治疗周期。一般，对病人和动物，例如哺乳动物，给药剂量是每天0．0001-10mg／kg体重，以得到生长激素的有效释放。优选给药剂量每天约0．001-约25mg／kg体重；更优选给药剂量每天约0．01-约10mg／kg体重。

本发明的多晶型化合物的制备方法用下列实施例说明。下列实施例为举例说明本发明之目的而给出，并不应构成对本发明范围和精神之限制。

实施例1N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺

步骤A：1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺

[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]盐酸盐

在0℃下向1．20g(5．8mmol)1＇-甲基-1，2-二氢-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶](按照H．Ong，等在J．Med．Chem．，23，981-986(1983)中描述的方法制备的)在20mL无水二氯甲烷中的溶液中加入三乙胺(0．90mL；6．4mmol)和甲磺酰氯(0．49mL；6．35mmol)，搅拌30min。将反应混合物倒入15mL饱和碳酸氢钠水溶液中，并用二氯甲烷(2×10mL)萃取。合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，用无水碳酸钾干燥、过滤，减压下除去溶剂，得到1．44g甲磺酰胺衍生物，浅黄色油状物，不用提纯即可使用。

在0℃下向上述粗产物在20mL无水1，2-二氯乙烷中的溶液中加入1．0mL(9．30mmol)氯甲酸1-氯乙基酯，然后在室温下搅拌30分钟，最后在回流下搅拌1小时。反应混合物浓缩至约为原体积的三分之一，用20mL无水甲醇稀释，回流1．5小时。将反应混合物冷却至室温，和浓缩至约为原体积的一半。过滤沉淀物，用少量冷甲醇洗涤。得到1．0g哌啶HCl盐，白色固体。浓缩滤液，加入少量甲醇，接着加入乙醚。沉淀的物质再过滤一次，用冷甲醇洗涤，和干燥。得到另外的0．49g所需产物。总产量1．49g(70％)。¹H NMR(CDCl₃，200MHz)δ7．43-7．20(m，3H)，7．10(dd，1H)，3．98(bs，2H)，3．55-3．40(bd，2H)，3．35-3．10(m，2H)，2．99(s，3H)，2．15(t，2H)，2．00(t，2H)。

步骤B：N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺

[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2

-(苯基甲氧基)乙基]-2-[(1，1-二甲基

乙氧基)羰基]氨基-2-甲基丙酰胺

向0．35g(1．15mmol)(2R)-2-(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基-3-[2-(苯基甲氧基)乙基]1-丙酸在13mL二氯甲烷中的溶液中，加入1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]盐酸盐(0．325g；1．07mmol)，0．18mL(1．63mmol)N-甲基吗啉，0．15g(1．18mmol)1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌15min。加入EDC(0．31g；1．62mol)，继续搅拌1小时。再加入60μl N-甲基吗啉，搅拌45分钟。将反应混合物倒入5mL水中，分离出有机层。有机层用5mL 0．5N盐酸水溶液和5mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。混合的有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩，得到0．627g产物，黄色泡沫状物，不用提纯即可使用。

向0．627g(1．07mmol)上述产物在5mL二氯甲烷中的溶液中加入1．0mL三氟乙酸，和在室温下搅拌75分钟。再加入1．00mL三氯乙酸，搅拌10分钟。浓缩反应混合物，用5．0mL二氯甲烷稀释，通过倾入10mL10％碳酸钠水溶液中小心地碱化。分离有机层，水层进一步用2×15mL二氯甲烷萃取。合并的有机层用5mL水洗涤。用碳酸钾干燥，过滤，浓缩，得到0．486g胺，浅黄色泡沫状物，不用提纯即可使用。

将0．26g(1．28mmol)2-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基-2-甲基-丙酸；0．173g(1．28mmol)1-羟基苯并三唑(HOBT)和EDC(0．245g，1．28mmol)加入0．486g(1．01mmol)上述胺和10mL二氯甲烷中，在室温下搅拌过夜。反应混合物倒入5．0mL水中，分离有机层。水层用5mL二氯甲烷反萃取。合并的有机层用5mL 0．5N盐酸水溶液，5mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，浓缩，得到0．751g粗产物，为黄色泡沫状物。该粗产物的二氯甲烷溶液在25g硅胶柱中进行色谱分离，首先用己烷／丙酮／二氯甲烷(70／25／5)洗脱，然后用己烷／丙酮／二氯甲烷(65／30／5)洗脱。得到0．63g标题化合物，白色固体。¹H NMR(CDCl₃ 400MHz)该化合物以3∶2的旋转异构体混合物存在。δ7．40-7．10(m，6H)，7．06(d，1／3H)，7．02(t，1／3H)，6．90(t，1／3H)，6．55(d，1／3H)，5．15(m，1H)，4．95(bs，1H)，4．63(bd，1／3H)，4．57-4．40(m，2 2／3H)，4．10(bd，1／3H)，4．00(bd，1／3H)，3．82(t，1H)，3．78-3．62(m，2H)，3．60-3．50(m，1H)，3．04(q，1H)，2．87(s，1H)，2．86(s，2H)，2．80-2．60(m，1H)，1．90(bs，1H)，2．85-2．75(m，1H)，1．82-1．60(m，3H)，1．55-1．45(m，1H)，1．45(s，4H)，1．42(s，2H)，1．39(s，9H)。

步骤C：N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H

-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基

甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺盐酸盐

将2．5mL三氟乙酸加入0．637g(0．101mmol)步骤B中得到的中间体在5mL二氯甲烷中的溶液中，在室温下搅拌30分钟。反应混合物浓缩成油状物溶于10mL乙酸乙酯中，用8mL 10％碳酸钠水溶液洗涤。水层再用5mL乙酸乙酯萃取。合并的有机层用10mL水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤和浓缩，得到0．152g游离碱，白色泡沫状物。

在0℃下向0．512g上述游离碱在5mL乙酸乙酯中的溶液中加入0．2mL盐酸在乙酸乙酯中的饱和溶液，搅拌1．5小时。氮气氛下过滤出白色沉淀，用乙醚洗涤，干燥，得到0．50g标题化合物，白色固体。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)该化合物以3∶2的旋转异构体形式存在。δ7．40-7．28(m，4H)，7．25-7．17(m，2H)，7．08(t，1／3H)，7．00(t，1／3H)，6．80(d，1／3H)，5．16(ddd，1H)，4．60-4．42(m，3H)，4．05(t，1H)，3．90(bs，2H)，3．83-3．70(m，2H)，3．30-3．15(m，1HO，2．97(s，1H)，2．95(s，2H)，2．90-2．78(m，1H)，1．96(t，1／3H)，1．85-1．65(m，4H)，1．63(s，2H)，1．60(s，4H)。

实施例2N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺

步骤A：(2R)-[[[2-(1，1-二甲基乙氧基)羰基]

氨基]-2，2-二甲基-1-氧代乙基]氨基-

2-(苯基甲氧基)乙基]-1-丙酸烯丙基酯

在CH₂Cl₂中在EDC和DMAP存在下，用(2R)-2-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-(苯基甲氧基)乙基]-丙酸和烯丙醇进行偶合反应制备上述化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7．25(s，5H)，5．8(m，1H)，5．2(dd，2H，5．0(bs，1H)，4．7(m，1H)，4．6(m，2H)，4．4(dd，2H)，3．9(dd，1H)，3．6(dd，1H)，1．45(d，6H)，1．39(s，9H)。

步骤B：(2R)-[[[2-(1，1-二甲基乙氧基)羰基]

氨基]-2，2-二甲基-1-氧代乙基]氨基-

2-(苯基甲氧基)乙基]-1-丙酸

搅拌下，步骤A中得到的粗制中间体(6．7g，15．9mmol)，四(三苯膦)合钯(1．8g，0．1eq)和三苯膦(1．25g，0．3eq)的溶液中加入2-乙基己酸钾(35mL，0．5M的EtOAc溶液)。反应混合物在室温和氮气氛下搅拌1小时，然后用乙醚(100mL)稀释，倒入冰水中。分离有机层，用柠檬酸(20％)酸化水层，然后用EtOAc萃取。EtOAc萃取液用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤和蒸发，得到标题化合物，固体。

¹H NMR(400Hz，CD₃OD)δ7．3(s，5H)，4．7(m，1H)，4．5(s，2H)，4．0(m，1H)，3．6(m，1H)，1．4(d，6H)，1．3(s，9H)。

步骤C：N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺

[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2

-(苯基甲氧基)乙基]-2-(1，1-二甲基

乙氧基)羰基]氨基-2-甲基丙酰胺

将EDC(1．03g，5．20mmol)加入1．0g(3．44mmol)1-甲磺酰基螺[二氢吲哚-3，4′-哌啶]盐酸盐，1．44g(3．78mmol)(2R)-[[2-(1，1-二甲基乙氧基)羰基)氨基]-2，2-二甲基-1-氧代乙基]-氨基-2-(苯基甲氧基)乙基]-1-丙酸，N-甲基吗啉(0．58mL，5．20mmol)，和1-羟基苯并三唑(HOBT)(0．58g，3．78mmol)在50mL二氯甲烷中的溶液中，在室温下搅拌16小时。反应混合物用另外的50mL二氯甲烷稀释，用碳酸氢钠水溶液(50mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤和浓缩。将粗制油状剩余物快速色谱分离(50g硅胶)得到2．148g(90％)希望的物质，无色泡沫状物。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)该化合物以3∶2的旋转异构体形式存在。δ7．40-7．10(m，6H)，7．06(d，1／3H)，7．02(t，1／3H)，6．90(t，1／3H)，6．55(d，1／3H)，5．15(m，1H)，4．95(bs，1H)，4．63(bd，1／3H)，4．57-4．40(m，22／3H)，4．10(bd，1／3H)，4．00(bd，1／3H)，3．82(t，1H)，3．78-3．62(m，2H)，3．60-3．50(m，1H)，3．04(q，1H)，2．87(s，1H)，2．86(s，2H)，2．80-2．60(m，1H)，1．90(bs，1H)，2．85-2．75(m，1H)，1．82-1．60(m，3H)，1．55-1．45(m，1H)，1．45(s，4H)，1．42(s，2H)，1．39(s，9H)。

步骤D：N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H

-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基

甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺盐酸盐

将5mL三氟乙酸加入2．148g(3．41mmol)步骤C中得到的中间体在10mL二氯甲烷中的溶液中，搅拌1小时。浓缩反应混合物，用100mL 5％碳酸钠水溶液碱化，用二氯甲烷(3×50mL)萃取。mL合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，用无水碳酸钾干燥，过滤，和浓缩，得到无色泡沫状物。在0℃下向所述泡沫物在25mL乙酸乙酯中的溶液中加入4mL 1M盐酸的乙酸乙酯溶液。过滤出沉淀物，首先用乙酸乙酯洗涤，然后用乙酸乙酯／乙醚(1∶1)洗涤，干燥，得到1．79g(93％)标题化合物，无色固体。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)该化合物以3∶2的旋转混合物形式存在。δ7．40-7．28(m，4H)，7．25-7．17(m，2H)，7．08(t，1／3H)，7．00(t，1／3H)，6．80(d，1／3H)，5．16(ddd，1H)，4．60-4．42(m，3H)，4．05(t，1H)，3．90(bs，2H)，3．83-3．70(m，2H)，3．30-3．15(m，1HO，2．97(s，1H)，2．95(s，2H)，2．90-2．78(m，1H)，1．96(t，1／3H)，1．85-1．65(m，4H)，1．63(s，2H)，1．60(s，4H)。

实施例3N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐

该化合物通过用甲磺酸处理实施例5步骤D中得到的游离碱制备。标题化合物从乙酸乙酯／乙醇／水中重结晶得到，m． p．=166-168℃。随后该试样鉴定为多晶型化合物Ⅱ型，其特征是X-射线粉末衍射图象在约4．7，11．6，17．4，19．2和21．6(2θ)有主要反射。在氮气流下在敞口杯中以10℃／分钟的DSC显示，由于熔化单纯吸热，峰值温度约174℃，外推得出熔化开始温度(熔点)约165℃，缔合热约37J／g。

实施例4

哌啶-4-甲酸-N-氨基甲酸苄酯(3)

原料：

哌啶-4-甲酸(2)T．C．I 4．02kg(31．1mol)

氯甲酸苄酯(Schweitzerhall) 6．91kg(40．5mol)

K₂CO₃ 10．1kg(72．9mol)

水 40．2L

在N₂气氛和机械搅拌下，将4-哌啶甲酸(2)和K₂CO₃溶于在100L 4颈烧瓶中的40．2L水中，溶液冷却至10℃。加入氯甲酸苄酯，保持温度9-14℃，在加完后混合物加热至22℃，陈化58小时。在4小时内加完，这时pH是9．0。在陈化58小时后pH不变。

将反应混合物加入200L提取器中，用3×13kg(15L)IPAC和1×12L EtOAc洗涤。水层用8L甲苯萃取。在洗涤后通过HPLC分析苄醇含量从3．8％降低至1．4％。HPLC分析：Dupont Zorbax 25cm RXC8柱，流速1．5mL／min，在254nm检测；恒洗脱液混合物含有35％MeCN和65％的0．1％H₃PO₄水溶液。保留时间：3=6．9min，苄醇=3．3min，甲苯=17．3min。

水相用37％HCl水溶液酸化至pH1．8。在加入HCl时释放二氧化碳，但是气体释放容易控制。加入HCl时间短于1小时，需要10L浓HCl。水相用3×6．6L甲苯萃取。甲苯萃取液用2kg硫酸钠干燥，通过Solka-floc^TM填料过滤。合并的滤液重17．8kg。氨基甲酸酯3的粗产量是7．89kg(97％)(称重的各份滤液蒸发至干得到的)。滤液通过l0μ管内的滤器送入l00L烧瓶中。提取液在10mbar和25℃以下浓缩至体积18L。氨基甲酸酯3的最终浓度是440g／L。甲苯滤液的浓度适于共沸除去最终的微量水(最终的KF=170mg／L)。产物纯度99．1％(面积)，仅有的杂质苄醇0．9％(面积)。

实施例5

哌啶-4-甲酰氯-N-氨基甲酸苄酯(4)

原料：

7．89kg(30．0mol)哌啶-4-甲酸-N-氨基甲酸苄酯

在17．9L甲苯中的溶液(MW=263．30)

草酰氯(MW=126．93) 3．94 kg(31．0mol)

DMF(MW=73．10) 10mL

甲苯 12L

将5mL DMF和10L甲苯加入上面步骤中得到的氨基甲酸苄酯3的甲苯溶液中。在20分钟内加入草酰氯。慢通氮气流下在18℃将反应混合物陈化16小时。反应混合物的HPLC分析表明有1．3％羧酸3未反应。反应混合物加热至26℃，加入5mL DMF。混合物陈化2．5小时。1．0mL反应混合物的等分试样用5．0mL叔丁胺骤冷，蒸发后用HPLC分析，其条件是：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，50℃，流速1mL／min，在220nm检测；恒洗脱液组成：42％MeCN和58％的0．1％H₃PO₄水溶液。该方法表明残留＜0．05％酸3(根据A判断)和＞3％(面积)B(＞1％(mol)(COCl)₂)。

混合物在10mbar和温度20-25℃下浓缩，直到除去5L溶剂。上述t-BuNH₂骤冷后浓甲苯溶液的典型的HPLC分析结果如下：

保留时间面积％鉴定物

2．1 ＜0．5％羧酸3

7．8 ＜0．5％苄氯

11．0 ＞99％叔丁基甲酰胺A

12．1 NA 甲苯

12．7 ＜0．5％二叔丁基草酰胺B

实施例6

哌啶-4-甲醛-1-氨基甲酸苄酯(5)原料：3．38kg(12．0mol)哌啶-4-甲酰氯-N-氨基甲酸苄酯(4)在5．54kg甲苯中的溶液(MW=281．74)DIEA(KF=18mg／L) 1．55kg(15．0mol)10％Pd／C(KF＜20mg／g) 101g苯硫基甲烷(MW=124．21，d=1．058) 0．56g

将DIEA和苯硫基甲烷加入从上面步骤得到的(4)的甲苯溶液中，催化剂悬浮于该混合物中。所述混合物立即放入5加仑高压釜中，在20℃和40psi H₂下加氢。18小时后反应吸收了理论量70％的氢，用叔丁胺骤冷等分试样HPLC分析表明，还有14．2％(面积)酰氯2。HPLC条件同上述条件。保留时间5=8．1分钟。

将第二批催化剂(101g)和苯硫基甲烷(0．54g)以在1375mL甲苯中的浆液形式加入加氢器中。在23小时后用叔丁胺骤冷等分试样进行HPLC分析表明，还有1．8％(面积)酰氯2。混合物用氮气清吹，通过Solka-floc^TM过滤分离催化剂和沉淀的DIEA·HCl。滤饼用10L甲苯洗涤。滤液通过10μ管线内滤器加入50L萃取器中，用2×7．2L 1MHCl水溶液和2×7．2L水洗涤。混合物在10mbar和温度25-30℃下浓缩，直到剩余5L为止。

保留时间面积％鉴定物

2．1 ＜2 羧酸3

6．6 ＜1 二聚物21

8．1 ＞95 醛5

用HPLC分析醛3的检测收率是94％。

实施例7

CBZ-螺二氢吲哚(9)原料：1．71kg(6．89mol)哌啶-4-甲醛-1-氨基甲酸苄酯(5)在21．4kg甲苯中的溶液苯肼 900mL，981g(9．15mol)三氟乙酸(TFA) 2．20 L，3．26kg(28．6mol)NaBH₄ 300g(7．93mol)甲苯 34．4kgMeCN 7．0LMeOH 7．0L

上面步骤中得到的粗制醛5的溶液通过10μ管线内滤器加入100L反应器中，该反应器装有冷却或加热用的特氟隆(Teflon)涂层的铜盘管和机械搅拌器。加入甲苯(34．4kg)和MeCN(7L)，将得到的溶液冷却至0℃。分几次加入苯肼，温度保持在-1～3℃，同时连续地将氮气通入反应混合物。

加入苯肼直到TLC和HPLC分析表明醛5完全耗尽并出现稍微过量(＜5％)苯肼。TLC条件：Silica，E．Merck Kieselgel G60 F254 0．25mm；乙醚／戊烷(4／1)；展开剂：硫酸高铈，14％钼酸铵在10％硫酸水溶液中的溶液，然后加热；R_f：醛5=0．52，苯腙7=0．61，苯肼6=0．21，HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，30℃，流速1．0mL／min，在254nm检测；梯度程序：

时间乙腈∶水

0 57∶43

10 65∶35

15 75∶25

18 75∶25保留时间：苯肼6=4．5分钟，甲苯=7．2分钟，苯腙7=11．4分钟。

反应混合物在0-2℃陈化30分钟，加入TFA，保持温度2-7℃。反应混合物在30分钟内加热至50℃，保持17小时。停止通过反应混合物喷氮气，而在反应混合物上面保持缓慢的氮气流。在5℃下，第1个小时内颜色逐渐变暗至深绿色，生成较少量白色结晶的沉淀(三氟乙酸铵)。在17小时后HPLC分析(与上述条件相同)表明，反应混合物含有91．6％(面积)二氢吲哚8和1．5％未反应的苯腙。陈化混合物更长时间未提高二氢吲哚8的测试收率。

将反应混合物冷却至12℃，加入7．0L MeOH。分几次(每次＜20g)加入NaBH₄，保持温度低于15℃。共加30分钟。添加时观察到缓和地释放氢，但是容易控制，实际上未起泡。在添加接近结束时颜色很快从绿色变为褐色，然后变为鲜橙色。分离出小量(＜100mL)重相(可能是含水的盐)。HPLC分析(与上述条件相同)表明所有二氢吲哚8均被消耗(90．4％(面积)CBZ-二氢吲哚9)；保留时间：假吲哚8=7．5min，二氢吲哚9=8．2min。TLC：乙酸乙酯作溶剂，硫酸高铈／钼酸铵染色或1％茴香醛染色；保留因子：假吲哚8=0．18，CBZ-二氢吲哚9=0．33。

颜色由绿色变为橙色表示确实接近反应终点。完成反应所需的NaBH₄的量取决于温度和NaBH₄的加入速度，但是产物收率和质量实际上不受影响，只要反应完成。在30分钟内将反应混合物冷却至5℃。然后加入8L 3％NH₄OH水溶液(8L)以使水相pH到7．4，陈化混合物，使其沉降，温度升至15℃。分离出下面的混浊黄色水相。有机相用4L 3％NH₄OH水溶液，2×4L水，和2×4L盐水洗涤。洗涤后有机相的重量是53．5kg，测试收率是94％。

将洗涤的甲苯溶液与另外两次类似处理的反应物洗涤有机相混合。三次反应中使用的醛总量是5．06kg(20．5mol)。在合并的有机相中测定的CBZ-二氢吲哚9的总重量是5．91kg(18．3mol，测试收率90％)。合并的有机相用5kg硫酸钠干燥，用250g Darco G60碳处理30分钟，通过Solka-floc^TM过滤。滤液在10mbar和＜25℃下真空浓缩，直至剩余物接近干燥。通过缓慢放出将溶剂完全转换为30L IPAC，在200mbar和50-60℃下再浓缩至14L。将混合物加热至回流以便得到透明均匀的深橙色溶液。¹H NMR分析表明在溶剂转换后该溶液含有约6％(mol)剩余的甲苯。

将溶液冷却至68℃，用4g结晶的CBZ-二氢吲哚9接种。在6小时内使溶液逐渐冷却至26℃，在20-26℃陈化9小时。在1小时内使浆液冷却至2℃，在2℃陈化1小时。过滤分离产物，滤饼用2×2L5℃IPAC和2×2L 5℃MTBE洗涤。产物在放出氮气下在30℃的真空烘箱中干燥，得到4．37kg(74％)标题化合物9，浅褐色结晶粉末。产物的HPLC分析表明纯度是99．5％(面积)。母液(11L)和洗涤液还含有1．15kg(19％)产物9和约3％Cbz-哌啶-4-甲酸苯酰肼(保留时间=4．8min)。

实施例8

CBZ-螺二氢吲哚-甲磺酰胺(1)

原料：

CBZ-二氢吲哚9 1．69kg(5．23mol)

甲磺酰氯 599g(5．23mol)

Et₃N(KF=151) 635g(6．27mol)

THF(KF=41) 12L

22L烧瓶中加入固体CBZ-螺二氢吲哚9，然后通过10μ管内滤器将11．5L THF和Et₃N加入上述烧瓶中。得到的均匀溶液冷却到0℃。1L滴液漏斗中加入甲磺酰氯和500mL THF。将MsCl的THF溶液加入温度保持在0-4℃的反应混合物中。加入时间5小时，放热。在加入过程中生成白色沉淀，可能是三乙胺盐酸盐。HPLC分析表明加入结束时反应完成(未检测出9)。

HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，流速1．5mL／min，在254nm检测。梯度程序：

时间(min) 0．1％aq．H₃PO₄∶MeCN

0 70∶30

3 70∶30

12 20∶80

25 20∶80

保温时间：9=7．6min，1=13．6min。

在加完后反应混合物加热至18℃，陈化16小时。在加入结束和陈化16小时期间反应混合物外观和HPLC图无变化。将反应混合物在1小时内加入50L烧瓶中的强烈搅拌的30L水和200mL 37％HCl水溶液的溶液中。该烧瓶中的温度从22℃升至28℃。产物以浅褐色粘性固体分离出，变成颗粒状固体。含水悬浮液冷却至22℃，陈化1小时。过滤悬浮液，滤饼用2×4L MeOH／水(50／50)洗涤。HPLC分析表明母液中有不到0．1％CBZ-螺二氢吲哚甲磺酰胺1。

滤饼用4L MeOH／水(50／50)洗涤，其中加入50mL 28％ NH₄OH水溶液。滤饼用2×4L MeOH／水(50／50)洗涤，固体在50℃(并放出氮气下在真空烘箱中干燥，得到2．03kg(97％)标题产物1，灰白色粉末。HPLC分析表明该固体含有93％(面积)化合物1。

实施例9

分离中间体CBZ-螺假吲哚(8)的任选方法

原料：

哌啶-4-甲醛-1-氨基甲酸苄酯(5) 12．37g(0．050mol)

苯肼 5．41g(0．050mol)

三氟乙酸(TFA) 11．56mL，17．10g

(0．150mol)

二氯甲烷 500mL

将CBZ-醛5溶于1L烧瓶中的二氯甲烷中，所述烧瓶装有特氟隆涂层的磁力搅拌棒。得到的溶液冷却至0℃。在5分钟内借助称重的注射器加入苯肼，保持温度在-1～3℃，同时连续地使氮气通过反应混合物。TLC和HPLC分析表明CBZ-醛5完全消耗和出现微过量苯肼(＜2％)。TLC条件：Silica，E．Merck Kieselgel G60 F254 0．25mm；乙醚／戊烷(4／1)；展开剂：0．5硫酸高铈，14％钼酸铵在10％硫酸水溶液中的溶液，然后加热；R_f：醛5=0．52，苯腙7=0．61，苯肼6=0．21。HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，30℃，流速1．0mL／min，在254nm检测：梯度程序：

时间(min) 乙腈∶水

0 57∶43

10 65∶35

15 75∶25

18 75∶25

保留时间：苯肼6=4．5分钟，甲苯=7．2分钟，苯腙=11．4分钟。

反应混合物在0-2℃陈化10分钟，用注射器加入TFA，同时保持温度2-7℃。在30分钟内将反应混合物加热至35℃，保持17小时。停止喷氮气入反应器，在反应混合物上面保持缓慢的氮气流。在35℃的第一小时内，颜色逐渐变暗成为玫瑰红色，然后变深绿色，生成较少量的白色结晶状沉淀(三氟乙酸铵)。在陈化17小时后HPLC分析(与上述条件相同)表明反应混合物含有93％(面积)假吲哚8和＜0．5％未反应的苯腙。陈化所述混合物更长时间不会提高假吲哚8测试收率。将反应混合物冷却至10℃，充分搅拌下加入含有60mL28-30％氢氧化铵，90mL水和150g碎冰的混合物。混合物的颜色变为橙红色。分离有机相，用400mL水洗涤两次，然后用100mL饱和NaCl水溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，通过5g氧化硅填料过滤，蒸发滤液，得到15．84g(99％)假吲哚8，浅橙色油状物。

实施例10

制备CBZ-螺二氢吲哚甲磺酰胺(1)的方法，

不分离中间体CBZ-螺二氢吲哚(9)

步骤1：CBZ-螺二氢吲哚(9)

原料：

哌啶-4-甲醛-1-氨基甲酸苄酯(5) 49．5g(0．20mol)

苯肼(Aldrich) 23．7g(0．22mol)

三氟乙酸(TFA) 75．4g(0．66mol)

甲苯(KF＜250mg／L) 654mL

MeCN(KF＜250mg／L) 13．3mL

NaBH₄ 11．3g，(0．30mol)

甲苯 20mL

MeOH 50mL

用654mL甲苯和13．3mL MeCN制备2％(体积)MeCN的甲苯溶液。在装有机械搅拌器的2L三口烧瓶中，617mL上述溶液中通入细氮气流5分钟脱气。将苯肼和TFA加入混合物中，同时继续脱气。

将CBZ-醛5溶于上面制备的剩余溶液(50mL)中，使氮气通过所述溶液进行脱气，同时使氮气通过加料漏斗。烧瓶中的溶液加热至35℃。在2小时内将醛溶液缓慢地加入苯肼-TFA中。混合物在35℃陈化16小时。

HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，50℃流速1mL／min，在220nm检测；恒洗脱液：55％ MeCN，45％的0．1％ H₃PO₄水溶液。陈化16小时后典型的HPLC分析结果：

保留时间(分) 面积％鉴定

1．6 0．1-0．5 苯肼6

4．1 ＜0．1 二聚物21

4．7 ＜0．1 醛5

5．0 NA 螺二氢吲哚9

6．3 NA 甲苯

6．9 97 螺假吲哚8

10．3 ＜0．2 苯腙7

共2-3 其他杂质＜0．2％

将混合物冷却至-10℃，加入MeOH。在30分钟内将硼氢化钠在20mL甲苯中的悬浮液分成小份(每份1mL)加入，注意温度不超过-2℃。

面积％鉴定

0．1-1 苯肼6

85-90 CBZ-螺二氢吲哚9

＜0．1 CBZ-螺假吲哚8

共10-15 其他杂质(＜3％ea．)

在1小时内将温度升至10℃，加入6％氨水(200mL)。搅拌混合物10分钟，再沉降10分钟，排除下面水相。将乙腈(20mL)和MeOH(20mL)加入有机相中，用150mL 15％盐水洗涤。发现有机相含CBZ-螺二氢吲哚9，测试收率92％。

步骤2：CBZ-螺二氢吲哚-甲磺酰胺(1)

原料：

CBZ-螺二氢吲哚(9)(MW=322．51) (0．184mol)

甲磺酰氯 21．1g(0．184mol)

DIEA(KF=150mg／L) 29．7g，40．1mL

(0．230mol)

THF(KF=41mg／L) 150mL

从上面步骤1中得到的粗CBZ-螺二氢吲哚9的溶液在1L 3口烧瓶中浓缩(60-70℃，150-200Torr)，直到留下250g剩余物。加入THF和DIEA，得到的均匀溶液冷却至0℃。125mL滴液漏斗中装入甲磺酰氯和50mL THF。在2小时内向反应混合物中加入MsCl的THF溶液，保持温度0-4℃，混合物在5-8℃陈化2小时。加入过程中稍有热放出。该过程中生成白色沉淀，可能是DIEA-盐酸盐。HPLC条件与上面的相同。HPLC分析表明反应在加完后1小时结束(没有检测出来)，来自9的测试收率是94％。保留时间：1=7．8分钟。陈化2小时后反应混合物的典型HPLC分析结果：

面积％鉴定

＜0．1 CBZ-螺二氢吲哚9

90-92 CBZ-磺酰胺1

共8-10 其他杂质(＜2％ea．)

将混合物加热至20℃，加入200mL 1M HCl水溶液。混合物加热至50℃，分离水相。有机相依次用100mL水，100mL 5％碳酸氢钠水溶液，和100mL水洗涤。将有机相加入装有机械搅拌器和蒸馏柱的1L三口烧瓶中，在大气压下蒸馏混合物(约400mL)，直到收集150mL馏出物为止。顶部温度达到107℃，釜温110℃。不断加入正丙醇继续蒸馏，其正丙醇加入速度以保持釜中体积不变为准(约350mL)。当加入正丙醇总量达525mL时停止蒸馏，总共收集馏出物800mL。

在溶剂转换过程中，顶温和釜温均从94℃升至98℃。在97．2℃形成的甲苯和n-PrOH共沸物由47．5％甲苯和52．5％n-PrOH组成。在3小时内使混合物逐渐冷却至20℃，陈化12小时。发现母液含有2％甲苯和4mg／mL磺酰胺。该磺酰胺在甲苯和n-PrOH的各种混合物中的溶解度用HPLC分析测定：

甲苯的n-PrOH溶液％化合物1的溶解度mg／mL

0 2．36

5 3．02

10 4．23

20 7．51

25 10．3

过滤结晶的浆液，用3×100mL n-PrOH洗涤。产物在50℃下在真空烘箱中干燥16小时，同时放出氮气，得到的化合物6为65．5g(从醛5得收率82％)，棕黄色固体，纯度93．5％(重量)。

该固体典型的HPLC分析结果：

面积％鉴定

＜0．1 CBZ-螺二氢吲哚9

＞99 CBZ-磺酰胺1

共＜1 其他杂质(＜0．2％ea．)

为了再提纯，在60℃下将40．0g从n-PrOH中结晶的磺酰胺化合物的试样溶于134mL EtOAc中，在60℃下用8．0g Darco G-60碳处理1小时。加入2．0g Solkafloc^TM后，浆液通过4．0g Solkafloc^TM填料过滤，该填料在60℃用90mL EtOAc洗涤。在加入所述碳前溶液是棕色。无堵塞地良好过滤，得到金黄色滤液。滤液在500mL烧瓶中在大气压下蒸馏(釜温80-85℃)，直到留下100g(100mL)剩余物为止。3小时内将该溶液冷却至35℃。在35℃和充分搅拌下1小时内加入116mL环己烷。混合物在1小时内冷却至20℃，20℃陈化12小时。35℃结晶出大量磺酰胺化合物，混合物变稠。20℃加入环己烷使搅拌困难。陈化后发现上清液每克中含有2．5mg化合物1。过滤结晶的浆液，滤饼用77mL 2∶1环己烷／EtOAc和2×77mL环己烷洗涤。产物在真空烘箱中在50℃下干燥16小时，同时放出氮气，得到34．2g化合物1(MW=400．3)，为白色结晶固体(从粗制1回收率85％，从5回收率70％，纯度＞99．9％(重量)。

实施例11

螺二氢吲哚-甲磺酰胺的HCl盐(1a)

原料：

CBZ-螺二氢吲哚-甲磺酰胺(1) 941g(2．35mol)

Pearlman催化剂20％Pd(OH)₂／C 188g

THF 8L

MeOH 7L

将催化剂悬浮于7L MeOH中，加入5加仑高压釜中，接着其中加入化合物1在8L THF中的溶液。混合物在25℃在80 psi H₂下加氢。2．5小时后在30分钟内将温度升至35℃。

HPLC分析表明CBZ-螺二氢吲哚-甲磺酰胺完全消耗掉。HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，流速1．5mL／min，在254nm检测。梯度程序：

时间(min) 0．1％H₃PO₄∶MeCN水溶液

0 70∶30

3 70∶30

12 20∶80

25 20∶80

保留时间：螺二氢吲哚=7．6分钟，

CBZ-螺二氢吲哚-甲磺酰胺=13．6分钟

混合物用氮气清洗，在仍加热的同时通过Solka-floc^TM过滤除去催化剂。催化剂用4L THF和2L MeOH洗涤。在10mbar和25℃以下将浅黄色滤液浓缩成粘稠油状物。以15L EtOAc之量通过缓慢放出完成溶剂的转换。再浓缩至干燥。剩余物固化为硬的灰白色物质。加入MeOH(1．5L)，混合物加热至70℃，得到均匀的溶液。该溶液在70℃时加入10．5L 20℃的EtOAc。温度降低至40℃，混合物保持均匀状态。

随后的试验表示可更方便的将MeOH-THF滤液的溶剂转换为MeOH，浓缩至希望的体积，然后加入EtOAc。这可防止一旦EtOAc溶液浓缩时剩余物固化。

将用大约等体积氮气稀释过的氯化氢通入所述溶液。在15分钟内温度升至60℃，生成白色盐酸盐沉淀。用氮气稀释HCl仅仅为避免反应混合物倒吸，不一定必要。

混合物用冰浴冷却，继续加入氯化氢1小时。温度逐渐降低到20℃。将悬浮液陈化2小时，同时温度降低至10℃。过滤分离结晶的产物，滤饼用3L EtOAc洗涤。真空烘箱中于35℃将其干燥，得到1．18kg(86％)标题产物1a，灰白色结晶固体，用HPLC分析的纯度＞99．5％(面积)。HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，流速1．5mL／min，在230nm检测；恒洗脱液：35％MeCN，65％的0．1％乙酸铵水溶液。保留时间：1a=5．4分钟。

实施例12

螺二氢吲哚-甲磺酰胺(游离碱形式)(1b)

将250mL由CBZ加氢得到的含有4．67g 1b(游离碱)的滤液的等分试样浓缩至约10mL。剩余物溶于20mL EtOAc中，该溶液再浓缩至约10mL。该操作再重复一次，剩余物中加入10mL EtOAc。开始生成结晶沉淀。一次加入MTBE(20mL)，另外的结晶的固体沉淀出，但是上清液还含有大量在放置时不沉淀的溶解的产物。强力搅拌下在2小时内于混合物中滴加己烷(70mL)。必须缓慢的加入己烷以防止呈油状而得不到胺。

搅拌的混合物陈化1小时，过滤。滤饼用20mL 1∶1的MTBE-己烷洗涤，然后用20mL己烷洗涤。产物在氮气流下干燥，得到3．86g(82％)游离胺1b，为灰白色结晶／固体，纯度＞99．5％(面积)。HPLC条件：25cm Dupont Zorbax RXC8柱，流速1．5mL／min，在230nm检测；恒洗脱液：35％ MeCN，65％的0．1％乙酸铵水溶液。保留时间：1b=5．4分钟。

实施例13A

螺二氢吲哚-甲磺酰胺(游离碱形式)(1b)

原料：

CBZ-螺二氢吲哚-磺酰胺化合物(1) 833．5gr(2．08mol)

Pd(OH)₂／C(20％(重量)Pd(OH)₂) 124．5(15％)

THF 6．5L

MeOH 19．5L

NH₄OH(浓的) 60mL

由于设备限制加氢分3次进行；这里所述方法仅就一次而言。将CBZ-螺二氢吲哚磺酰胺化合物溶于THF(6．5L，KF=53μg／μl)，然后加入MeOH(KF=18μg／mL，4L)，再加入催化剂，将浆液转移到5加仑高压釜中。剩余的MeOH(2．5L)用于洗涤。在50psi下混合物加热至40℃保持24小时。催化剂填充量和反应时间随原料化合物1纯度而变化。此处原料需要≥15％催化剂和较长反应时间，而较纯的螺二氢吲哚原料仅需要5％催化剂和4-6小时反应时间。

反应完成(用LC分析化合物1不到0．1％(面积))后，混合物通过Solka Floc^TM过滤，滤饼用含有NH₄OH(0．5％，60mL)的MeOH(13L)洗涤。合并的滤液(分析表明含有1587g螺二氢吲哚胺1b)真空浓缩，得到的固体在40L甲苯／THF(3∶1)和0．5N NaOH(18L)间分配。虽然容易分层，但是在水层中仍可看到重沉淀。含水悬浮液用CH₂Cl₂(15L)萃取。缓慢分离水层和有机层。加入CH₂Cl₂之前将THF与使水层饱和的足够的NaCl一起加入水层中。但是产物不能溶解，需要使用CH₂Cl₂。

将合并的甲苯、THF和CH₂Cl₂层在间歇式浓缩器中浓缩。剩余物用7L CH₃CN冲洗。最后加入10L CH₃CN，溶液在N₂气下放置过夜。

实施例13B

螺二氢吲哚-甲磺酰胺(游离碱形式)(1b)

原料：

CBZ-螺二氢吲哚磺酰胺化合物(1) 3g(7．49mol)

Darco G-60 600g

乙酸乙酯 36L

无水乙醇 189L

10％ Pd／C 450g

氨溶液 500mL

Solka Floc^TM 2．5kg

乙酸异丙酯 65L

在60-65℃和氮气氛下，将CBZ-螺二氢吲哚(1)(1kg)和Darco G60(200g)在乙酸乙酯(9L)中的混合物搅拌和加热8小时。在60-65℃过滤除去Darco，固体用热的乙酸乙酯(3L)洗涤，合并滤液和洗涤液。LC(wt／wt)分析证明Darco的损失可忽略不计。用20L Buchi装置真空蒸发乙酸乙酯溶液至干燥，然后用无水乙醇(2×5L)冲洗。该物料在加热至65-70℃的无水乙醇中形成浆液，加入20L高压釜中。该物料用无水乙醇(1L)洗涤。将10％钯／炭(75g，7．5％(重量))在无水乙醇(750mL)中的浆液加入高压釜中，用另一份无水乙醇(250mL)洗涤。

强力搅拌和40psi氢气压下，在65℃将上述物料加氢3小时，加入第二部分10％钯／炭(75g)。该物料再加氢2小时，密封过夜。所述物料(仍是热的，60-65℃)加入20L Buchi装置中，通过“加入和放出”无水乙醇(共18L)并真空脱气以除去甲酸。

再重复上述操作两次，在10加仑衬玻璃容器中将三批物料合并，混合物料通过加入和蒸馏(真空)无水乙醇(2×10L)再脱气。所述物料中加入Solka floc^TM(0．5kg)，用乙醇(10L)漂洗。Estrella滤器中装载Solka floc^TM(2kg)在乙醇(20L)中的浆液。得到的混合物加热到60-65℃，然后在该温度下经加热的过滤器用泵加入两个称过皮重的不锈钢罐中。开始用的容器、过滤器、泵和管线用氨水(500mL)在无水乙醇(25L)的热(60-65℃)混合物清洗。在该两个不锈钢罐中将滤液和洗涤液混合。

然后将所述物料用含有10微米心子的管内滤器转移进容器中，然后真空浓缩至体积缩小(～15L)。通过“加入和放出”3批乙酸异丙酯(共45L)用乙酸异丙酯替换乙醇，同时保持物料体积～15L。当溶剂替换完成时，用GC分析物料含有不到1％的剩余乙醇。所述物料通过加入乙酸异丙酯(20L)稀释至～33L，螺二氢吲哚-胺1b(用LC分析，1．855kg)的乙酸异丙酯溶液用于所述方法的下一步骤中。

实施例14A

Boc-O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(11)

原料：

螺二氢吲哚-胺(1b) 1587g(5．966mol)

氨基酸(10) 1938g(6．563mol)

DCC 1334．5g(6．563mol)

HOBT 884g(6．563mol)

CH₃CN 25L

0．5NNaOH 18L

0．5NHCl 18L

NaHCO₃(饱和的) 18L

iPrOAc 28L

室温和N₂气氛下，在CH₃CN或iPrOAc／H₂O(25L)中的螺二氢吲哚-胺1b依次用固体HOBT(884g，1．1eq)，熔融的DCC(1334．5g，1．1eq)(在热水中于60℃加热约1小时)，和最后用固体氨基酸10(1938g)处理。混合物搅拌3小时，在搅拌时出现DCU重沉淀，LC分析表明剩余约0．5％(面积)胺1b。加入IPAc(9L)，通过Solkafloc^TM过滤浆液，滤饼用IPAc(19L)洗涤。合并的有机溶液依次用0．5N NaOH(18L)，0．5N HCl(18L)和饱和NaHCO₃(18L)洗涤。最后的水洗涤得到的乳状液放掉。

将得到的有机层真空浓缩，剩余物溶于MeOH或EtOH中(最终体积10L)。测试产量3026g(89％)。

使用其它的肽偶合剂如羰基二咪唑，或生成混合酐，例如碳酸仲丁酯，得到的化合物11和／或14收率差，且前者出现高度差向异构化。其他肽偶合试剂是相当昂贵的。

Boc-O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(11)

原料：

螺二氢吲哚-胺(1b) 1．855kg(6．96mol)

乙酸异丙酯 29L

二环己基碳化二亚胺(DCC) 1．58kg(7．65mol)

1-羟基苯并三唑(HOBt) 1．03kg(7．62mol)

N-Boc-O-苄基-D-丝氨酸 2．26kg(7．65mol)

1M氢氧化钠水溶液 26L

0．5M盐酸水溶液 26L

饱和碳酸氢钠水溶液 26L

无水乙醇 50L

将水(20L)加入在反应器中搅拌的螺二氢吲哚-胺1b(1．855kg)在乙酸异丙酯(33L)中的溶液中。然后在室温和氮气氛下依次加入下列化学产品：DCC(1．58kg，1．1eq)，HOBt(1．03kg，1．1eq)，最后N-Boc-O-苄基-D-丝氨酸(2．26kg，1．1eq)。试剂用乙酸异丙酯(7L)漂洗。将混合物在室温和氮气氛下搅拌5小时，此时LC分析表明产物／原料比是99．4／0．6。然后混合物通过只用布和纸板的Estrella过滤器过滤，用泵送至另一容器中。输送物料的容器用乙酸异丙酯(22L)漂洗，该乙酸异丙酯又用于漂洗滤器、泵和管线，然后放入所述接收容器中。将所述容器中的二相混合物搅拌10分钟，然后沉降15分钟。分离出下面的水层，有机溶液在室温下放置过夜。

第二天，有机溶液用1M氢氧化钠水溶液(26L)，0．5M盐酸水溶液(26L)和最后用饱和碳酸氢钠水溶液(26L)洗涤。LC分析得到测试产量3．787kg，从7．49mol(3kg)起始CBZ-螺二氢吲哚(1)计算的总收率为93％。混合物真空浓缩(内部温度=13-15℃，夹套温度=40℃，真空度=29”)至小体积(～15L)，通过“加入和放出”乙醇(50L)将溶剂转换为乙醇，同时保持体积～15L。GC分析表明剩余＜1％乙酸异丙酯。该溶液用于所述方法的下一步骤。

实施例15A

O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(游离碱形式)(12)

原料：

苄基丝氨酸螺二氢吲哚(11) 3026g(5．57mol)

甲磺酸(MsOH) 1．16L(17．9mol)

MeOH 10L

iPrOAc 24L

0．5NNaOH 35L

在约30-40分钟内在10L MeOH(或EtOH)中的Boc-O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚11加入纯的MsOH(1．16L)处理，(起始温度16℃，最终温度28℃)。在N₂气氛下将暗红色溶液陈化过夜。然后混合物泵送入含有24L iProAc和35L 0．5N NaOH的100L萃取器中。水层的pH是7。加入NaOH(6M)直到pH≥10．5。随着pH增加颜色由红色变为黄色。分离各层，有机层(24L)用NMR分析表明在iPrOAc中含有13％(mol)MeOH[5％(体积)]。LC测定为2．48kg。

实施例15B

O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(游离碱形式)(12)

原料：

BOC-O-苄基丝氨酸螺 3．787kg(6．96mol)

二氢吲哚(11)

甲磺酸 2．006kg(20．87mol)

乙酸异丙酯 38L

1M氢氧化钠水溶液 16L

50％氢氧化钠水溶液 1．6L

将甲磺酸(2．006kg，1．355L，～3eq)加入反应器中搅拌的BOC-O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(11)(3．787kg)在乙醇中的溶液(总体积～15L)中。混合物加热至35-40℃。7小时后LC表明已无原料，将反应混合物冷却至室温过夜。第二天，搅拌下将水(44L)加入混合物中，混合物冷却至～5℃，搅拌30分钟，然后通过管内滤器(装入10μ心子)过滤入贮罐中。然后整批料倒吸到反应器中。用水(10L)清洗反应器和管线，洗涤水进入所述贮罐中，洗涤水用于清洗并送回反应器中，加入乙酸异丙酯(38L)，接着加入1M氢氧化钠水溶液(16L)。该批料冷却至10-15℃，下面水层的pH约7，加入50％氢氧化钠水溶液(1．6L)(pH＞10)。混合物在10-15℃搅拌25分钟，然后沉降10-15分钟。分离下面的水层(78．1kg)。LC分析表明水溶液中含有28．4g化合物12(理论量的0．85％)。有机溶液的体积=51L。LC分析表明得到3．057kg产物，从3kg，7．49mol CBZ-螺二氢吲哚磺酰胺化合物(1)计算的总收率是92％。该溶液用于下一步骤中。

实施例16A

Boc-氨基异丁酰O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(14)

原料：

螺二氢吲哚-胺(12) 2481g(5．57mol)

氨基酸肽(13) 1247．1g(6．16mol)

DCC 1266．7g(6．16mol)

HOBT 827g(6．16mol)

IPAc 52L

H₂O 37L

0．5NNaOH 36L

0．5NHCl 36L

饱和的NaHCO₃ 36L

用IPAc稀释胺12的IPAc溶液至总体积39L，加入37L水。在室温和氮气氛下两相混合物依次用固体HOBT(827g)，熔融的DCC(1266．7g)，和氨基酸13处理。将反应混合物搅拌2小时，搅拌时LC分析表明原料12逐渐消失(＜0．3％(面积))。通过Solka Floc^TM过滤混合物，固体用13L IPAc洗涤。物料以两相混合物形式存放过夜。

将混合物加入100L萃取器中，分离水层，有机层依次用36L 0．5NNaOH，0．5N HCl和饱和NaHCO₃洗涤。测试产量3160g(由螺二氢吲哚计算的收率是81％，体积测定误差±5％)。浓缩溶液至小体积，用乙醇(2×4L)冲洗。在需要时中间体化合物14可以通过加入水结晶出来进行分离。

使用其它肽偶合剂如羰基二咪唑或形成混合酐，例如碳酸仲丁酯，得到低产率高度差向异构化的14。而其他肽偶合剂很昂贵。

实施例16B

Boc-氨基异丁酰O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(14)

原料：

螺二氢吲哚胺(12) 3．057kg(6．89mol)

二环己基碳化二亚胺(DCC) 1．56kg(7．56mol)

1-羟基苯并三唑(HOBt) 1．02kg(7．55mol)

Boc-2-氨基异丁酸(13) 1．54kg(7．58mol)

乙酸异丙酯 32L

1M氢氧化钠水溶液 38L

0．5M盐酸水溶液 38L

饱和碳酸氢钠水溶液 38L

无水乙醇 45L

在室温和氮气氛搅拌下将水(49L)加入反应器中的螺二氢吲哚12(3．057kg)在乙酸异丙酯中的溶液中(总体积～51L)。然后依次加入下列化学品：DCC(1．56kg，～1．1eq)，HOBt(1．02kg，～1．1eq)和最后N-Boc-2-氨基异丁酸13(1．54kg，～1．1eq)。将混合物在室温下强力搅拌2小时。此时LC分析表明反应完成。用泵经过Estrella滤器过滤混合物进入另一容器中。使用乙酸异丙酯(22L)洗涤容器、过滤器、泵和管线，流入接受容器中。然后两相混合物搅拌5分钟，分层。下面的水层(水溶液重量=51．1kg)顺利地分离出。有机溶液依次用1M氢氧化钠水溶液(38L)，0．5M盐酸水溶液(38L)，和最后用饱和碳酸氢钠水溶液(38L)顺利洗涤。

有机溶液用泵经管内滤器(含有10μ心子)送入为使溶剂转换为乙醇的另一容器中。用乙酸异丙酯(10L)洗涤所述容器，再洗涤泵、过滤器和管线，进入接受容器中。将滤液和洗涤液合并。总体积=75L(用水位指示器测量)。LC分析得到4．395kg Boc-氨基异丁酰O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(14)，即从7．49mol起始的CBZ-螺二氢吲哚磺酰胺(1)计算总收率是93％。

混合物真空浓缩至小体积(～15L)，通过“加入和放出”无水乙醇(共45L)将乙酸异丙酯转换为乙醇。在溶剂转换结束时，GC分析表明剩余＜1％乙酸异丙酯。含有4．395kg化合物14的溶液(25L)用于下一步骤。需要时，中间体化合物14可以通过加入水结晶出来进行分离。

实施例17A

氨基异丁酰O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(15)

原料：

Boc螺二氢吲哚(14) 3160g(5．03mol)

甲磺酸(MsOH) 979mL(15．1mol)

EtOH 6．2L

H₂O 30L

1NNaOH 11L

EtOAc 26L

Daro 60活性炭 1Kg

将Boc螺二氢吲哚14溶于6．2L EtOH中，用MsOH(979mL)处理。温度从20℃升至30℃，反应进行一夜。在20℃12小时后，还有15％(面积)原料，这样将混合物加热至35℃保持6小时。在反应完成(化合物14＜0．1％(面积))时，将反应混合物冷却至20℃，加入30L H₂O，溶液用装有聚丙烯滤布的玻璃漏斗过滤出剩余的DCU。将混合物转移到100L萃取器中，加入26L EtOAc。水层加入冷却的1NNaOH(11L)和1L 50％NaOH碱化。需要加入冰以保持温度低于14℃。较高温度将导致明显乳化问题。

有机层在50℃和约21″Hg下蒸馏，直到KF＜1000μg／mL。较低的KF使成盐步骤中碳处理更有效和回收更好。在700g规模生产时KF能降为160μg／mL。溶液用乙酸乙酯稀释至总体积31L(LC测定为2．40kg)。加入活性炭(Darco G-60)，混合物搅拌24小时。混合物通过Solka Floc^TM过滤，滤饼用乙酸乙酯(16L)洗涤，经测定为3．24kg。

实施例17B

氨基异丁酰O-苄基丝氨酸螺二氢吲哚(15)

原料：

Boc螺二氢吲哚(14) 4．395kg(6．99mol)

甲磺酸 2．017kg(20．99mol)

乙酸乙酯 185L

1M氢氧化钠水溶液 16L

50％氢氧化钠水溶液 2．6L

Darco G-60 900g

Solka Floc^TM 2．5Kg

在室温下将甲磺酸(2．017kg，1．36L，～3eq)加入反应器中搅拌的Boc螺二氢吲哚14(4．395kg)在乙醇中的溶液(总体积～25L)中。混合物加热至35-40℃，搅拌过夜。第二天，混合物仍含有～1．1％(面积)原料，这样继续反应4小时，LC表明产物／原料比例是99．6／0．4。混合物真空浓缩至体积～15L，然后用水(44L)稀释。混合物冷却至5℃，搅拌30分钟，然后用泵通过Sparkler管内滤器(含有10μ心子)过滤至另一容器中以除去少量剩余的DCU。

所述容器，泵，滤器和管线用水(10L)洗涤，洗涤水放入所述容器中。将乙酸乙酯(36L)加入所述容器中，搅拌的混合物冷却至10℃。在10℃加入冷的(5-10℃)1M氢氧化钠水溶液(16L)和冷的(5-10℃)50％氢氧化钠水溶液(2．6L)并将温度升至14℃。得到的混合物在＜14℃搅拌15分钟，然后分离出下面的水层。

混合物真空浓缩至体积～20L，加入乙酸乙酯(35L)和乙醇(5L)的混合物，同时保持体积～20L。蒸馏结束时KF是9160mg／mL。通过“加入和放出”乙酸乙酯(共40L)将溶剂转换为乙酸乙酯。蒸馏结束时，KF是446mg／mL。混合物用乙酸乙酯(10L)稀释。

将Darco G-60(900g)加入浑浊的混合物中。混合物用乙酸乙酯(6L)洗涤。混合物在室温下搅拌过夜。第二天，将Solka Floc^TM(0．5kg)加入在容器中搅拌的混合物中，然后在小量乙酸乙酯中搅拌Solka Floc^TM(2．0kg))，装填入Estrella滤器中。过量的溶剂通过含有10μ心子的Sparkler管内滤器用泵抽出。浆液用泵从容器中经过滤器，再通过另一滤器送入2×40L不锈钢贮罐中。目测看出液体清澈透明。容器用乙酸乙酯(22L)洗涤，用该乙酸乙酯通过上述路线进行洗涤放入不锈钢罐中。将两个罐中的物料都送入反应器中，将溶液充分混合。

混合物(58L)KF是2950mg／mL，用真空浓缩再干燥至体积20-25L。加入乙酸乙酯(25L)将整批料稀释至体积46L(用水位指示器测)。KF是363mg／mL。加入乙酸乙酯(17L)将混合物稀释至体积62L，用于所述方法的最后步骤。

实施例18A

螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐(16)

原料：

胺(15) 2340g(4．43mol)

甲磺酸(MsOH) 316mL(4．88mol)

EtOAc 60L

EtOH 4．8L

8％EtOH的EtOAc溶液 20L

将上面步骤中得到的15的溶液体积用乙酸乙酯调节至60L，加入EtOH(4．8L)。在45℃，将MsOH(316mL)在3L EtOAc中加入。将496g标题化合物Ⅰ型种晶(使用占游离胺重量10％的种晶)加入深红色均匀的溶液中。温度升至约48℃，反应混合物在52℃陈化1．5小时。分析表明完全转化为标题化合物(Ⅰ型)。(若使用小于10％种晶则需要更长的陈化时间(＞3小时))。使浆液冷却至20℃过夜，在N₂气氛下离心过滤。滤饼用20L 8％EtOH的EtOAc溶液洗涤。在过滤过程中N₂是必需的，因为湿结晶吸水性很强。混合物在真空和35℃下干燥，得到2．7kg(总收率56％)标题化合物(I型)(纯度99．9％(面积)；对映体＜0．1％)。

也可将Ⅱ型结晶转化为Ⅰ型结晶，其中按上述方法通过加入MsOH在EtOAc-EtOH中形成盐，初始盐溶液(55℃)冷却至45℃未完成转换。在该温度下结晶开始出现，随着时间浆液变得更稠。温度升至51℃，使浆液陈化过夜。可预期完全转化为16的Ⅰ型结晶。该方法也可以用于制备16的Ⅰ型结晶种晶。

实施例18B

螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐(16)

原料：

胺(15) 3．1kg(5．86mol)

甲磺酸 620g(6．45mol)

乙酸乙酯 37L

无水乙醇 8．7L

螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-

1＇-基)羰基]-2-(苯基甲

氧基)乙基]-2-氨基-2-

甲基丙酰胺甲磺酸盐(Ⅰ型) 70g(0．11mol)

将无水乙醇(6．4L)加入反应器中的胺(15)(3．1kg)在乙酸乙酯中的溶液中(总体积～62L)。混合物加热至50℃，50-54℃，～5分钟内加入甲磺酸(620g，412mL，1．1eq)在乙酸乙酯(11L)中的溶液。混合物用螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐(I型)(70g)接种，得到的浆液搅拌下，在55℃和氮气氛下加热过夜。

第2天，将浆液冷却到15-20℃，保持2小时，然后在氮气氛下滴加于50cm聚丙烯滤布上。固体产物用无水乙醇(2．3L)在乙酸乙酯(26L)中的混合物洗涤。取出白色固体产物，在Apex烘箱中，35℃真空干燥适当时间(约两天)，用Jackson-Crockatt筛筛分干燥的螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐(3．352kg)，得到3．347kg(包括种晶70g)，产量=3．277kg。

HPLC条件：

在Zorbax RX-C8(4．6mm×25cm)中LC保留时间，λ=210nm，流速=1．5mL／min。化合物1： 60∶40 CH₃CN-H₂O(1％H₃PO₄)RT=5．Omin化合物1b： 35∶65 CH₃CN-H₂O(O．1w％NH₄OAc)RT=6．2min化合物10： 60∶40 CH₃CN-H₂O(0．1H₃PO₄)RT=2．9min化合物11： 60∶40 CH₃CN-H₂O(0．1％H₃PO₄)RT=5．4min化合物12： 40∶60 CH₃CN-H₂O[pH 5．25 NaH₂PO₄(6．9g／L of H₂O)

(用NaOH调节pH)]RT=5．6min

化合物14：60∶40％CH₃CN-H₂O(0．1％H₃PO₄)RT=4．65min

化合物15：40∶60％CH₃CN-H₂O[pH=5．25 NaH₂PO₄(6．9g／L of H₂O)]

用NaOH调节pH)RT=4．9min

在Zorbax RX-C8(4．6mm×25cm)中LC保留时间λ=210nm，流速=1．2mL／min，柱温度=48℃，溶剂A=0．05％磷酸+0．01％三乙胺水溶液，溶剂B=乙腈

梯度系统：

时间％A ％B

0min 95 5

35min 10 90

38min 95 5

40min 95 5

保留时间(min)化合物1： 25．2化合物1b： 8．5化合物10： 20．5化合物11： 26．3化合物12： 14．8化合物14： 25．6化合物15： 15．7

实施例19Ⅰ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶的制备

按照实施例18A的方法，可进行Ⅱ型结晶向Ⅰ型结晶的转化，其中通过加入MsOH在EtOAc-EtOH中生成盐，初始盐溶液(55℃)冷却至45℃。在该温度下结晶开始出现，随着时间延长浆液变成更稠。温度升至51℃，浆液陈化过夜。可期望完全转化为Ⅰ型结晶。

实施例20Ⅰ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶的制备

在约25℃搅拌Ⅱ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的异丙醇溶液约2-24小时，进行Ⅱ型结晶向Ⅰ型结晶的转化。

实施例21Ⅳ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶的制备

在42℃和搅拌下将8．4gN-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的任意形态试样溶于24．8mL乙酸乙酯，1．6mL乙醇和1．95mL水的混合物中。在温度40℃从溶液中蒸发溶剂，得到的固体用研钵研磨成细粉，将细粉暴露在约75％的相对湿度下，得到标题所述Ⅳ型结晶。

实施例22Ⅳ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶的制备

将N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的任意形态试样从乙酸乙酯／乙醇／水(24．8／1．6／1．95(v／v／v))的溶液中重结晶，得到标题所述Ⅳ型结晶。

实施例23Ⅳ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶的制备

在约25℃将Ⅰ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐结晶在含有约2．8％(重量)水的乙酸异丙酯／乙醇(90∶10(v／v))中的浆液搅拌过夜，分离得到的固体。

在本发明被介绍及参考一些具体实施方案举例说明后，本领域熟练技术人员将领会到可对其程序和方法做出各种修改、变化、改进、替换、删除，或增加，均不背离本发明的精神和范围。例如，可用本文列举的具体剂量之外的有效剂量，来作为以本发明上述化合物治疗哺乳动物任何适应症的不同效应之结果。同样，根据选择的具体活性化合物或是否存在药物载体，以及制剂的类型和使用的给药方式，可观察到不同的具体药物学反应，而根据本发明的目的和实践可以构想出此种预期的变化和差别。因此，本发明试图由后面所附权利要求来加以限定，并且应对该权利要求之宽度作出合理解释。

Claims

1．指定为Ⅰ型结晶的多晶型化合物N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐。

2．根据权利要求1的多晶型化合物，其特征是在氮气氛下，在差示扫描量热器池中，以10℃／分钟的速度加热时熔化吸热，外推得出开始熔化温度约170℃。

3．根据权利要求1的多晶型化合物，其特征是其X射线粉末衍射图象在约6．5，14．7，16．9，17．1，17．9，19．5，21．1，21．7和22．0°(2θ)处有主要反射。

4．指定为Ⅳ型结晶的多晶型化合物N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐。

5．根据权利要求4的多晶型化合物，其特征是在氮气氛下在差示扫描量热器池中以10℃／分钟的速度加热时，在温度约45℃吸热失水，接着吸热，外推得出开始温度约129℃。

6．根据权利要求4的多晶型化合物，其中每摩尔N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐含有约3．5摩尔水。

7．根据权利要求4的多晶型化合物，其特征是其Ⅹ-射线粉末衍射图象在约16．0，16．2，18．3，20．1，21．0和24．2°(2θ)处有主要反射。

8．药物组合物，含有可药用载体和有效量权利要求1的多晶型化合物。

9．用于治疗骨质疏松症的药物组合物，含有二膦酸盐化合物和权利要求1的多晶型化合物相结合。

10根据权利要求9的药物组合物，其中二膦酸盐化合物是阿仑膦酸盐(alendronate)。

11．药物组合物，含有可药用载体和有效量权利要求4的多晶型化合物。

12．用于治疗骨质疏松症的药物组合物，含有二膦酸盐化合物和权利要求4的多晶型化合物相结合。

13．根据权利要求12的药物组合物，其中二膦酸盐化合物是阿仑膦酸盐(alendronate)。

14．提高人或动物内生生长激素水平的方法，包括将有效量的权利要求1的多晶型化合物施用于所述人或动物。

15．提高人或动物内生生长激素水平的方法，包括将有效量的权利要求1的多晶型化合物和另外的生长激素促分泌素施用于所述人或动物。

16．根据权利要求15的方法，其中另外的生长激素促分泌素选自生长激素释放肽GHRP-6；生长激素释放肽GHRP-2；生长激素释放肽GHRP-1；B-HT920；生长激素释放因子；生长激素释放因子类似物；IGF-1和IGF-2。

17．提高饲料效率，促进家畜生长，提高其奶产量和改进其肉体质量的方法，包括将有效量的权利要求1的多晶型化合物施用于所述家畜。

18．治疗或预防选自下列疾病：骨质疏松症，分解代谢病，免疫缺陷，包括具有低于正常水平T₄／T₈细胞比例的个体的免疫缺陷，髋关节骨折，中老年人的肌肉骨骼损伤，成年人和儿童生长激素不足，肥胖症，由于慢性病如艾滋病或癌引起的恶病质和蛋白质损失的方法；以及在需要时治疗由大型外科手术、损伤或烧伤后康复期病人的方法，包括将有效量权利要求1的多晶型化合物施用于所述病人。

19．治疗骨质疏松症的方法，包括将二膦酸盐化合物和权利要求1的多晶型化合物相结合施用于患有骨质疏松症的病人。

20．根据权利要求19的方法，其中二膦酸盐化合物是阿仑膦酸盐(alendronate)。

21．提高人或动物内生生长激素水平的方法，包括将有效量的权利要求4的多晶型化合物施用于所述人或动物。

22．提高人或动物内生生长激素水平的方法，包括将有效量的权利要求1的多晶型化合物和另外的生长激素促分泌素施用于所述人或动物。

23．根据权利要求22的方法，其中另外的生长激素促分泌素选自：生长激素释放肽GHRP-6；生长激素释放肽GHRP-2；生长激素释放肽GHRP-1；B-HT920；生长激素释放因子；生长激素释放因子类似物；IGF-1和IGF-2。

24．提高饲料效率，促进家畜生长，增加其奶产量和改进其肉体质量的方法，包括将有效量权利要求4的多晶型化合物施用于所述家畜。

25．治疗或预防选自下列疾病：骨质疏松症，分解代谢病，免疫缺陷，包括具有低于正常水平T₄／T₈细胞比例的个体的免疫缺陷，髋关节骨折，中老年人的肌肉骨骼损伤，成年人和儿童生长激素不足，肥胖症，由于慢性病如艾滋病或癌引起的恶病质和蛋白质损失的方法，以及在需要时治疗由大型外科手术、损伤或烧伤后康复期病人的方法，包括将有效量的权利要求4的多晶型化合物施用于病人。

26．治疗骨质疏松症的方法，包括将二膦酸盐化合物和权利要求4的多晶型化合物相结合施用于患有骨质疏松症的病人。

27．根据权利要求26的方法，其中二膦酸盐化合物是阿仑膦酸盐(alendronate)。

28．制备权利要求1指定为Ⅰ型结晶的多晶型化合物的方法，包括在约25℃搅拌Ⅱ型N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基-螺[3H-吲哚-3，4＇-哌啶]-1＇-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐的异丙醇溶液约2-24小时。