EA000528B1

EA000528B1 - Полиморфные формы стимулятора секреции гормона роста

Info

Publication number: EA000528B1
Application number: EA199800335A
Authority: EA
Inventors: Джером П. Драпер; Дэвид К. Дюбост; Майкл Дж. Кауфман; Джеймс А. МакКоли; Дженнифер Л. Вандрилла; Ричард Дж. Варсолона
Original assignee: Мерк Энд Ко., Инк.
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-10-28
Also published as: IS4721A; NO310556B1; EA199800335A1; HUP9902208A3; JPH10512295A; NO981867D0; BR9611229A; WO1997015574A1; YU56696A; EP1019402A1; AU707946B2; KR19990067098A; NZ321370A; CN1205703A; JP3204266B2; BG102476A; HK1017894A1; MX9803351A; CO4770956A1; CZ128098A3

Description

Гормон роста, который секретируется питуитарной железой стимулирует рост всех тканей организма, способных к росту. Кроме того известно, что гормон роста имеет следующие основные эффекты на метаболические процессы организма: (1) повышенную скорость синтеза белка во всех клетках организма; (2) пониженную скорость утилизации углеводов в клетках организма; (3) повышенную мобилизацию свободных жирных кислот и использование жирных кислот для получения энергии. Недостаточность секреции гормона роста может приводить к различным медицинским нарушениям, таким как карликовость.

Известны различные пути высвобождения гормона роста. Например, химические вещества, такие как аргинин, L-3,4,-дигидроксифенилаланин (L-DOPA), глюкагон, вазопрессин, а также инсулинзависимая гипогликемия и такие активные процессы как сон и физическая нагрузка косвенно вызывают высвобождение гормона роста из питуитарной железы [гипофиза], действуя каким-то образом на гипоталамус, возможно, снижая секрецию соматостатина, либо повышая секрецию известного фактора высвобождения стимулятора секреции гормона роста (GRF) или неизвестного эндогенного гормона, высвобождающего гормон роста либо всех их.

В случаях, когда желательно повышение уровня гормона роста, проблема обычно решалась введением экзогенного гормона роста или введением GRF или пептидного соединения, которое стимулирует продуцирование и/или высвобождение гормона роста. В любом случае пептидная природа соединения требует, чтобы оно вводилось в форме инъекций. Первоначально источником гормона роста служили экстракты из питуитарных желез [гипофизов] трупов. Это, в результате, давало очень дорогостоящий продукт и имел место риск переноса реципиенту гормона роста болезни, связанной с источником питуитарной железы. Доступен рекомбинантный гормон роста, который, несмотря на отсутствие риска передачи болезни, все же остается, несмотря на отсутствие риска передачи болезни, очень дорогостоящим продуктом, который нужно вводить путем инъекций или назального спрея. Разработаны другие соединения, которые стимулируют высвобождение эндогенного гормона роста.

В частности, определенные спиросоединения раскрыты в патенте США U.S.Patent № 5,536,716, РСТ Patent Publication WO

94/13696 и в Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 70017005 (July 1995) как непептидные стимуляторы секреции гормона роста. Эти соединения обладают способностью стимулировать высвобождение естественного или эндогенного гормона роста и могут, таким образом, быть использованы для лечения состояний, требующих стимуляции продуцирования или секреции гормона роста, как это имеет место у людей с дефицитом естественного гормона роста или у животных, предназначенных для производства продуктов питания или шерсти, где результатом стимуляции гормона роста будет получение более крупного и более продуктивного животного.

Среди предпочтительных веществ, раскрытых в вышеуказанных работах, назван спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил) карбонил] -2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид метансульфонат, который имеет струк^туру^:

В патенте США U.S.Patent № 5,536,716 и публикации РСТ Patent Publication WO 94/1 3696 раскрыты способы получения этого вещества (смотри примеры 18,19 и 55). В частности, в примере 55 определено, что соединение, полученное перекристаллизацией из смеси этилацетат - этанол - вода имеет точку плавления 1 66168°С. Это соединение было в последующем идентифицировано как имеющее полиморфную форму, обозначенное здесь как Форма II. В публикации Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 92, 70017005 (July 1995) отмечено, что соединение, выделенное как моногидрат, имеет точку плавления 168-170°С, однако, раскрыты только общие способы получения вещества и не раскрыто, как вещество было кристаллизировано.

Морфологические формы фармацевтических соединений могут представлять интерес в плане разработки подходящей дозированной формы, потому что, если морфологическая форма не сохраняется постоянной во время клинических исследований или исследований на стабильность, точная доза, употребляемая или отмеряемая, не может быть сравнимой от одной партии к другой. Поскольку фармацевтическое соединение производится для применения, важно знать морфологическую форму, содержащуюся в каждой дозированной форме для того, чтобы быть уверенным, что в процессе получения использована та же форма и то же самое количество препарата включено в каждую дозу. Поэтому необходимо точно знать, присутствует ли единственная морфологическая форма или какая-либо известная комбинация морфологических форм. Кроме того, определенные морфологические формы могут обладать повышенной термодинамической или гидроскопической стабильностью и могут быть более подходящими, чем другие морфологические формы для включения их в фармацевтические композиции. Термин полиморфная форма химического соединения, используемый здесь, обозначает ту же самую химическую природу, но с другой кристаллической решеткой.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение относится к полиморфным формам соединения: N-[1(R)-(1,2дигидро-1 -метансульфонил-спиро- [3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил) карбонил]-2-(фенилметилокси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, а также способу получения таких полиморфных форм.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим эти полиморфные формы в качестве активного ингредиента и использованию этих полиморфных форм и композиций для лечения определенных нарушений.

Полиморфные формы данного изобретения, представляющие собой стимулятор секреции гормона роста, полезны для введения мясным животным для инициирования их роста, что приводит к более эффективному производству мясных пищевых продуктов, а также людям для лечения физиологических или медицинских состояний, характеризующихся недостаточностью секреции гормона роста, а также для лечения медицинских состояний, которые улучшаются за счет анаболических эффектов гормона роста.

Эти полиморфные формы обладают преимуществами перед другими известными формами N-[1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонилспиро-[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси(этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в параметрах термодинамической стабильности и удобства для включения в фармацевтические композиции.

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым полиморфным формам соединения N-[1(R)-(1,2дигидро-1 -метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил)кар бонил]-2 -(фенилметилокси)этил] -2-амино-2-метилпропанамид метансульфонат и способам получения этих полиморфных форм.

Соединение N-[1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро-[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'ил) карбонил] -2-(фенилметил-окси)-этил] -2амино-2-метилпропанамид метансульфонат имеет структуру:

и является стимулятором секреции гормона роста, который индуцирует высвобождение гормона роста у людей и животных. Это свойство может быть использовано для инициирования роста мясных животных в целях более эффективного производства мясных пищевых продуктов, а также для лечения у людей физиологических и медицинских состояний, характеризующихся недостаточностью секреции гормона роста и лечения медицинских состояний, которые улучшаются за счет анаболических эффектов гормона роста.

Конкретные полиморфные формы (обозначенные здесь Форма I, Форма II, Форма III, Форма IV, Форма V, Форма VI, Форма VII, Форма VIII, Форма IX, Форма X) имеют преимущественные свойства по сравнению с другими кристаллическими формами соединения в том, что они более удобны для включения в фармацевтические композиции. Предпочтительной кристаллической формой для фармацевтической разработки является форма I, что связано с ее термодинамической стабильностью и негигроскопическими свойствами. Другой предпочтительной кристаллической формой для фармацевтической разработки является форма IV, что связано с ее препаративными свойствами, в частности, с сжимаемостью при изготовлении таблеток. Найдено, что форма IV имеет более высокую объемную плотность, чем другие формы.

Настоящее изобретение также относится к способу получения формы I N-[1(R)-(1,2дигидро-1 -метансульфонил-спиро[3Н-индол3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает обработку раствора свободного основания N-[1 -(R)-(1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1'-ил)карбонил]-2(фенилметилокси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида в этилацетате, содержащем этанол (около 8 объемных %) метансульфоновой кислотой (около 1 ,1 эквивалента) приблизительно при 50°С, нагревание приблизительно до 55°С и охлаждение приблизительно до 45°С.

Необязательно температура в дальнейшем может быть повышена приблизительно до 51°С, на котором ее поддерживают в течение 2-24 ч.

Настоящее изобретение далее относится к альтернативному способу получения формы I N[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонилэтил] -2амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает альтернативное добавление к раствору свободного основания N-[1(R)-( 1,2-дигидро-1метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил] -2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2-метил-пропанамида в этилацетате, содержащем этанол (около 8 объемных %) приблизительно при 50-55°С, метансульфоновой кислоты (около 1,1 эквивалента) и формы I N-[ 1 (R)-( 1,2-ди1тщро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'5 ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната (где относительный порядок добавления не является критическим), с последующим нагреванием приблизительно до 55°С приблизительно в течение 2-15 ч, охлаждением приблизительно до 25-30°С и старением приблизительно в течение 2-3 ч.

Настоящее изобретение далее относится к альтернативному способу получения формы I N[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2(фенилметил-окси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает перемешивание раствора формы II N[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонилспиро [3Ниндол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в изопропаноле приблизительно при 25°С в течение приблизительно 2-24 ч.

Настоящее изобретение относится также к способу получения формы II N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил) карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает обработку раствора свободного основания N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил) карбонил]-2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида в этилацетате, содержащем этанол (около 8 объемных %), метансульфоновой кислотой (около 1,1 эквивалента) приблизительно при 50°С, нагревание приблизительно до 55°С и охлаждение до температуры окружающей среды.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы IV N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает растворение N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната неопределенного морфологического состава в растворе этанол/вода (в предпочтительном 25:75 об/об);

выпаривание растворителя из раствора, предпочтительно при температуре 40°С;

измельчение полученного в результате твердого вещества в тонкий порошок; и выдерживание тонкого порошка при относительной влажности приблизительно 75%.

Настоящее изобретение относится далее к альтернативному способу получения формы IV N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро 3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает перекристаллизацию N- [ 1 (R) -(1,2-дигидро 1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната неопределенного морфологического состава из раствора этилацетат/этанол/вода (предпочтительно 24,8/1,6/1,95 об/об/об).

Настоящее изобретение относится далее к альтернативному способу получения формы IV Н-|(Л)-(1.2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2(фенилметил-окси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает выдерживание формы I N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при относительной влажности более, чем приблизительно 75%, предпочтительно приблизительно 88%, при температуре окружающей среды, в течение достаточного времени.

Настоящее изобретение относится далее к альтернативному способу получения формы IV N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2(фенилметил-окси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает выделение из суспензии формы I N-[1(R)(1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в смеси изопропил ацетат/ этанол (объемное соотношение 90:10), содержащей приблизительно 2,8 вес.% воды при приблизительно 25°С.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы V N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает выдерживание формы IV N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1'-ил) карбонил]-2- (фенилметилок-си)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при относительной влажности ниже, чем приблизительно 30% при температуре окружающей среды.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы VI N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(амино-2метилпропанамида метансульфоната, который включает:

высушивание формы V N-[I(R)-(1,2дигидро-3-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при отсутствии влаги приблизи7 тельно при комнатной температуре, такое как, например, в атмосфере азота, высушенного над молекулярными ситами, приблизительно при 25°С.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы VII N-[1(R)-(1,2дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает выделение из суспензии формы I или формы IV N-[1(R)-( 1,2-дигидро-1-метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2(фенилметилокси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в изопропил ацетате/этаноле (объемное соотношение 90:10), содержащем приблизительно 1,5 мас.% воды.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы VIII N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает дегидратацию формы VII N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в атмосфере сухого инертного газа, такого как сухой азот, в течение достаточного времени.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы IX N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает получение раствора ^[1Щ)-(1,2-дигидро1- метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]2- амино-2-метилпропанамида метансульфоната неопределенного морфологического состава в воде, с последующим выделением образовавшегося твердого вещества путем контролируемого выпаривания при 20% относительной влажности приблизительно при комнатной температуре.

Настоящее изобретение относится далее к способу получения формы Х N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает высушивание формы IX N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната приблизительно при комнатной температуре и влажности в течение достаточного времени.

Настоящее изобретение относится далее к альтернативному способу получения формы Х N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2(фенилметил-окси)-этил]-2-амино-2метилпропанамида метансульфоната, который включает выдерживание формы I N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметилокси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при 1 00% относительной влажности приблизительно в течение от 1 до 4 дней.

Кроме того, настоящее изобретение относится также к способу получения морфологически гомогенного ^[1Щ)-(1,2-дигидро-1метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, который включает любой из способов, упомянутых здесь.

Соединения настоящего изобретения, новые полиморфные формы ^[1Щ)-(1,2-дигидро1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)] этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната, представляют собой стимуляторы секреции гормона роста, которые полезны для введения мясным животным для инициирования их роста, способствуя таким образом более эффективному производству мясных пищевых продуктов, а также людям для лечения физиологических и медицинских состояний, характеризующихся недостаточностью секреции гормона роста, а также для лечения медицинских состояний, которые улучшаются за счет анаболических эффектов гормона роста. Соответственно, настоящее изобретение относится далее к фармацевтическим композициям, включающим полиморфную форму в качестве активного ингредиента и к применению таких полиморфных форм и композиций, содержащих их для лечения определенных нарушений.

Калориметрическая камера дифференциального сканирования [Differential Scanning Calorimentic Cell (DSC)]

DSC-кривая для формы I N-[1(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при 10°С/мин в открытой кювете в потоке азота представляет собой одиночную эндотерму плавления, с пиковой температурой приблизительно 180°С и экстраполированной начальной температурой (точка плавления) приблизительно 170°С, соответствующей теплоте приблизительно 53 Дж/г.

DSC-кривая для формы II N-[1-(R)-(1,2дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1'-ил) карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при 10°С/мин в открытой кювете в потоке азота представляет собой одиночную эндотерму плавления, с пиковой температурой приблизительно 1 74°С и экстраполированной начальной температурой (точка плавления) приблизительно 165°С, соответствующей теплоте приблизительно 37 Дж/г.

DSC-кривая для формы IV N-[1-(R)-(1,2дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3, 4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)-этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната при 10°С/мин в открытой кювете в потоке азота представляет собой эндотерму потери воды при приблизительно 45°С, с последующей эндотермой с пиковой температурой приблизительно 134°С и экстраполированной начальной температурой (точка плавления) приблизительно 129°С, плавления формы VI соответствующей теплоте приблизительно 23 Дж/г.

DSC данные [пробы нагревают со скоростью 10°С/мин в атмосфере азота (экстраполированная начальная температура)]:

Форма I: 170°С (эндотерма плавления)

Форма II: 165°С (эндотерма плавления)

Форма VI: 129°С (эндотерма плавления)

Форма I N-| 1(Л)-(1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 '-ил) карбонил] -2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2метилпропанамида метансульфоната представляет собой относительно безводный полиморф. характеризующийся следующими свойствами: т.пл. 169°С и растворимостью в изопропаноле 4.6 мг/мл.

Форма II N₄ 1(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3. 4'-пиперидин]-1'карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2метилпропанамида метансульфоната представляет собой безводный полиморф. характеризующийся следующими свойствами; т.пл. 158°С и растворимостью в изопропаноле 12.3 мг/мл.

Форма III N-[(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната представляет собой гидрат. характеризующийся следующими свойствами: эндотеромой потери воды с пиковой температурой 46°С. с последующей незначительной эндотермой плавления/ разложения с экстраполированной начальной температурой 123°С.

Форма IV N₄ 1-(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил] -2амино-2-метил-пропанамида метансульфоната представляет собой гидрат. характеризующийся следующими свойствами: эндотермой потери воды с пиковой температурой 45°С, с последующей эндотермой плавления/ разложения с экстраполированной начальной температурой 129°С (предположительно, плавления/ разложения формы VI).

Форма IV N₄ 1(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната проявляет себя как гигроскопический гидрат. содержащий 3.5 моля воды на моль N-[ 1 (R)-( 1.2дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3. 4'-пиперидин]-1'-ил) карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Форма V N₄ 1(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3.4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната проявляет себя как гигроскопический гидрат. содержащий 1 моль воды на моль N-[1(R)-(1.2дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3. 4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметилокси)-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Форма VI N₄ 1(Л)-(1.2-дигиро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3.4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната проявляет себя как безводный полиморф и характеризуется температурой плавления 129°С.

Форма VII ^[1Щ)-(1.2-дигидро-1метансульфонил-спиро [3Н-индол-3.4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната представляет собой гидрат. характеризующийся следующими свойствами: широкой эндотермой потери воды с пиковой температурой 60°С. с последующей эндотермой плавления/ разложения с экстраполированной начальной температурой 144°С (предположительно. плавления/ разложения формы VIII).

Форма VIII N₄ 1(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3.4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната представляет собой безводный полиморф. характеризующийся т. пл. 1 44°С.

Форма Х N₄ 1(R)-( 1.2-дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3.4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната характеризуется широкой эндотермой потери воды с пиковой температурой 49°С.

Рентгеновская порошковая дифракция [XRay Powder Diffraction (XRPD)]

Исследования методом рентгеновской порошковой дифракции широко используются для установления молекулярной структуры. кристалличности и полиморфизма. Диаграммы рентгеновской порошковой дифракции (XRPD) снимали с использованием автоматического прибора Philips APD3720 Automated Powder Diffraction instrument с медным источником Ка излучением. Измерения проводились от 2 до 40° (2 тета) с образцом. поддерживаемым при температуре окружающей среды.

Форма I характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 6.5; 14.7; 16.9; 17.1; 17.9; 19.5; 21.1; 21.7 и 22.0° (2 тета).

Форма II характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 4,8; 11,8; 17,5; 19,4; 21,6; 21,9; 22,5 и 22,7° (2 тета).

Форма III характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 13,8; 14,1; 18,0; 18,8; 19,5; 20,1; 20,6; 21,8 и 25,7° (2 тета).

Форма IV характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 16,0; 16,2; 18,3; 20,1; 21,0 и 24,2° (2 тета).

Форма V характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 14,8; 17,1; 17,6; 19,0; 19,1; 19,4; 20,6; 21,5 и 21,8 (2 тета).

Форма VI характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 9,8; 14,0; 14,8; 17,1; 17,6; 19,0; 19,5; 20,6 и 21,6° (2 тета).

Форма VII характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 9,1; 11,3; 17,1; 17,4; 20,0; 21,1 и 24,5° (2 тета).

Форма VIII характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 11,5; 11,6; 18,1; 19,6; 22,5; 24,7 и 24,8° (2 тета).

Форма IX характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 8,0; 12,1; 15,3; 15,8; 19,6; 19,7; 21,1; 22,3 и 23,7° (2 тета).

Форма Х характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями при приблизительно: 15,5; 15,8; 18,0; 18,4; 18,6; 19,4; 20,7; 20,8; 23,9 и 24,8° (2 тета).

Эти XRPD-диаграммы подтверждают, что все формы I-Х являются различными кристаллическими формами.

Микроскопирование

Исследование полиморфных форм проводилось при 100х увеличении в обычном и поляризованном свете. Форма I и форма II представляли собой частицы игольчатой формы. Как форма I, так и форма II, обладали двойным лучепреломлением в поляризованном свете.

Гигроскопичность

Общее содержание летучих компонентов (установленное TGA анализом) в твердых образцах форм I, II, III и IV после воздействия различных контролируемых режимов влажности показано в таблице ниже. Было найдено, что форма I содержит 0,79 вес.% воды; форма II содержит 0,56 вес.% воды; форма III содержит 4,5-5,0 вес.% воды; и форма IV содержит 9,510,0 вес.% воды.

Гигроскопичность оценивалась при хранении твердого соединения в камерах с постоянной относительной влажностью. Сравнение безводных форм I и II при комнатной температуре показало, что форма II является гигроскопичной и обнаруживает большое увеличение влажности, начиная с 65% Ob [относительной влажности]. Форма I не обнаруживает никакого существенного увеличения влажности за исключением хранения при влажности выше 76% Ob. Результаты представлены ниже в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Комнатная температура (48 ч)

	Форма I	Форма II
% OB	% прирост/потери	% прирост/потери
0	-0,02	+0,08
11	-0,05	+0,02
33	-	+0,33
47	+0,21	+0,39
65	+0,37	>10,0^a
76	+0,12	>10,0^a
100	>12,0	>10,0^a’^b

(^образец становится полутвердым, наподобие резины) (^1:,=переходит в форму IV после выдерживания при влажности окружающей среды)

Таблица 2

Комнатная температура (96 ч)

	Форма I
% OB	% прирост/потери
7	+0,4
22	+0,3
47	+0,5
68	+0,6
88	+12,9*
100	+23,9*

(*=легко поглощающий влагу и разжижающийся материал)

Гидратированные формы III и IV VIII N[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил] -2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната также оценивали при хранении в камерах с относительной влажностью в течение 48 ч при комнатной температуре. Форма III показывает увеличение влажности после 48-часового хранения при 33% Ob. Форма IV, хотя и не прибавляет существенного количества влажности до хранения ее при 1 00% ОВ, теряет свою гидратационную воду, когда хранится при 11% ОВ или ниже. Результаты представлены ниже в таблице 3.

Таблица 3

Комнатная температура (48 ч)

	Форма III	Форма IV
% OB	-	-7,8
11	-0,15	-4,9
33	+2,23	+0,3
47	+3,99	+0,7
66	-	+1,4
76	+3,76	+1,5
100	-	+5,3

Эти данные показывают, что форма I является относительно безводной.

Растворимость

Растворимость формы I в дистиллированной воде при комнатной температуре составляет >100 мг/мл. Растворимость в воде (комнатная температура) формы II в забуференных растворах (рН 4-9): > 100г/мл. Растворимость формы I в смесях этанол/вода показана ниже:

	Растворимость
% Этанол/Н₂О	(мг/мл)
25/75	>100
50/50	>100
75/25	>90
100% этанол	>90

Термическая стабильность - чистое соединение

Стабильность твердого состояния чистого соединения оценивали при хранении препарата в пробирках с завинчивающейся крышкой в темноте. Пробы анализировали методом ЖХВР и основное вещество анализировали количественно. Ниже приведены условия примененного изократического метода:

Колонка: Beckman Ultrasphere ODS (250х4,6 мм, 5 μ)

Подвижная фаза	0,1% ТЭА, рН 4,0 с НзРO4: Ацетонитрил (65:35)
Скорость потока	1,0 мл/мин
Длина волны детекции:	228 нм
Время пробега	14 мин
Температура колонки	Температура окружающей среды
Объем инъекции	20 мкл N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 - метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил) карбонил]-2-(фенилметил-окси) этил-2амино-2-метилпропанамида метансульфоната (50 мкг/мл)

Результаты, приведенные ниже для форм I и II, рассчитаны в весовых процентах.

Форма I

% исходный
°С	6 недель	17 недель
40	100,1	98,7
60	100,7	101,3
80	100,7	99,4

Форма II

% Исходный
°С	1 неделя	2 недели	4 недели	8 недель	12 недель	24 недели
40	99,7	100,7	99,5	-	100,1	100,1
60	99,4	99,6	100,3	100,0	101,0	100,8
80	99,2	100,3	99,2	99,8	100,4	-

Эти результаты показывают, что чистая твердая форма I и форма II обладают хорошей термической стабильностью.

Способы получения соединения настоящего изобретения представлены ниже.

Схема I

Как показано на схеме I перед гидрированием CBZ-спироиндолин 1 обрабатывают Darco (20% по весу). Гидрирование осуществляют в этаноле при 65°С над 1 0% Pd/C при энергичном перемешивании.

Раствор 1 b в изопропиле ацетате и воде сочетают с коммерчески доступным Н-ВОС-0бензил^-серином в присутствии дициклогексилкарбодиимида (DCC) и 1 -гидроксибензотриазола (HOBt). После фильтрации побочного продукта дициклогексилмочевины (DCU) 2фазный фильтрат отделяют и органический слой промывают последовательно 1М водным раствором гидроокиси натрия, 0,5М водным раствором соляной кислоты и, в заключение, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Лучших результатов такого сочетания достигают, когда раствор свободного амина в iPrOAc/H₂O обрабатывают DCC, HOBT, с последующим добавлением аминокислоты при температуре окружающей среды и последующей реакцией в течение 3-5 ч. Реакционную массу затем концентрируют в вакууме и растворитель заменяют сизопропилацетата на этанол. Замену растворителя проводят быстро путем подачи и вытекания трехкратных объемов реакционной смеси для удаления изопропилацетата.

ВОС-группу вещества 11 удаляют обработкой метансульфоновой кислотой (МsОН) (3 экв.) в этаноле при 35-40°С. Разделение между изопропилом ацетатом и водным 1М раствором натрия гидроксида дает 1 2.

Сочетание 12 с N-BOC-a-аминоизомасляной кислотой предпочтительно проводить в двухфазной системе растворителей изопропил ацетат/вода (1:1) в присутствии DCC и HOBt (1,1 экв. каждого). Удаление DCU фильтрованием, разделение слоев и промывка органического слоя последовательно 1М водным раствором гидроксида натрия, 0,5М водным раствором соляной кислоты и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия дает 1 4.

В смеси растворитель заменяют на этанол для последующего отщепления метансульфоновой кислотой ВОС-группы. Снятие защиты 1 4 является более трудной, чем у 11 и требует концентрированного раствора этанола/ метансульфоновой кислоты и нагревания до 35-40°С. После экстракционной обработки (EtOAc-NaOH) выделяют свободный амин 15. Органический слой хорошо промывают 1 N NaOH, чтобы обеспечить полное удаление метансульфоновой кислоты.

Раствор этилацетата свободного основания 1 5 концентрируют до маленького объема в вакууме и азеотропируют досуха (KF<500 мг/мл^-1) способом подачи и вытекания с 2-мя загрузочными объемами смеси этилацетат/этанол в соотношении 90/10 и далее с 2-мя загрузочными объемами этилацетата. Полученный в результате сухой, слегка мутный раствор свободного основания 1 5 в этилацетате обрабатывают Darco G-60 (25 вес.%) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 0 ч. Удаление Darco фильтрованием с помощью фильтрующего агента дает свободное основание 15.

Образование соли метансульфоновой кислоты 16 из 15 проводят в EtOAc с 1,1 экв. МsОН приблизительно при 50°С. Свободное основание 15 обрабатывают 8 об.% EtOH и 1 экв. Н₂О и нагревают до 55°С до полного растворения. Охлаждение до температуры окружающей среды и перемешивание полученной суспензии в течение 4 ч дает кристаллический материал 1 6, обозначенный как кристаллическая форма II [растворимость в ИПА=12 мкг/мл].

Превращение формы II в форму I достигается, когда образуется соль в EtOAc-EtOH как указано выше, но вместо охлаждения исходного раствора соли (при 55°С) до температуры окружающей среды его охлаждают до 45°С. При этой температуре должны начать появляться кристаллы, и суспензия должна становиться гуще со временем. Температуру затем повышают до 51°С и суспензию подвергают старению в течение ночи. Предполагается, что должно пройти полное превращение 1 6 в форму I.

Предпочтительно, превращение формы II в форму I достигают добавлением затравочных кристаллов формы I к раствору свободного основания в EtOAc-EtOH при 50-55°С с последующим старением. Соответственно, свободное основание 15 может быть обработано 1,1 эквивалентом метансульфоновой кислоты в 8% этаноле в этилацетате при 50-55°С. Реакционную массу затем затрагивают с помощью приблизительно 2% по весу формы I метансульфоновой соли 16, а затем подвергают старению при 55°С в течение ночи. Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры и подвергают старению приблизительно в течение 2-3 ч. Продукт выделяют фильтрованием при комнатной температуре в атмосфере азота, высушивают при 35°С в вакууме, просеивают и получают метансульфоновую соль 16.

Соль метансульфоновой кислоты 1 6 может также быть образована альтернативным постадийным добавлением МsОН (1,1 экв.) и затравочных кристаллов формы I к раствору свободного основания в EtOAc-EtOH приблизительно при 50°С, где порядок добавления МsОН и затравки не является критическим.

Полезность полиморфных соединений настоящего изобретения в качестве стимуляторов секреции гормона роста может быть продемонстрирована методами, известными в данной области, такими, например, как исследования, описанные в работе Smith et el., Science, 260, 1640-1643 (1993) (см. текст к фиг. 2 в этой работе). В частности, все полиморфные формы настоящего изобретения обладали активностью, как стимуляторы секреции гормона роста в указанном выше тексте. Такой результат служит показателем действительно существующей активности полиморфных форм настоящего изобретения как стимуляторов секреции гормона роста.

Соединения настоящего изобретения, высвобождающие гормон роста, могут быть использованы in vitro как уникальные инструменты для понимания того, как секреция гормона роста регулируется на питуитарном [гипофизарном] уровне. Этот анализ включает исполь17 зование в их оценке многих факторов, изучаемых или известных как оказывающие влияние на секрецию гормона роста, таких как возраст, пол, факторы питания, глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты, а также состояния при голодании и не голодании. Кроме того, соединения настоящего изобретения могут быть использованы для оценки того, как другие гормоны модулируют активность высвобождения гормона роста. Например, уже установлено, что соматостатин ингибирует высвобождение гормона роста. Другие гормоны, которые являются важными и требуют изучения в отношении их действия на высвобождение гормона роста, включают гонадальные гормоны, например тестостерон, эстрадиол и прогестерон; гормоны коры надпочечников, например кортизол и другие кортикоиды, эпинефрин и норэпинефрин; панкреатический и гастроинтестинальный гормоны, например инсулин, глюкагон, гастрин, секретин; вазоактивные пептиды, например бомбезин, нейрокинины; тироидные гормоны, например тироксин и трийодотиронин. Соединения настоящего изобретения могут быть также использованы для исследования возможных эффектов отрицательной или положительной обратной связи некоторых питуитарных [гипофизарных] гормонов, например, гормона роста и эндорфиновых пептидов, на гипофиз для модулирования высвобождения гормона роста. Особое научное значение представляет использование этих соединений для выяснения субклеточных механизмов, медиирующих высвобождение гормона роста.

Соединения настоящего изобретения могут быть введены животным, включая человека, для высвобождения гормона роста in vivo. Например, соединения могут быть введены коммерчески значимым животным, таким как свиньи, крупный рогатый скот, овцы и им подобные, для повышения интенсивности роста и увеличения их размеров, для улучшения эффективности откорма и повышения молочной продуктивности таких животных. Кроме того, эти соединения могут быть введены людям in vivo в качестве диагностических средств для непосредственного определения, способен ли гипофиз высвобождать гормон роста. Например, соединения настоящего изобретения могут назначаться in vivo детям. Образцы сыворотки, взятые до и после такого введения могут быть исследованы на содержание гормона роста. Сравнение количеств гормона роста в каждом из этих образцов позволяет непосредственно определить способность гипофиза пациента высвобождать гормон роста.

Соответственно, настоящее изобретение включает свой объем в фармацевтические композиции, включающие, в качестве активного ингредиента, по крайней мере, одно из соединений настоящего изобретения в сочетании с фармацевтическим носителем или растворителем.

Необязательно, активный ингредиент фармацевтических композиций может включать анаболический агент дополнительно, по крайней мере, к одному из соединений настоящего изобретения или другую композицию, которая имеет иную активность, например фактор роста антибиотика или агент для лечения остеопороза, либо использовался в сочетании с кортикостероидами, для минимизации катаболических побочных эффектов или с другими фармацевтически активными агентами в случаях, когда данное сочетание повышает эффективность и минимизирует побочные эффекты.

Стимулянты роста и анаболические агенты включают, но не ограничиваются ими, TRH, диэтилстилбестерол, эстрогены, (β-агонисты, теофиллин, анаболические стероиды, энкефалины, простогландины Е-ряда, соединения, раскрытые в патенте США № 3,239,345, например, зеранол и соединения, раскрытые в патенте США № 4,036,979, например сульбенокс или пептиды, раскрытые в патенте США № 4,411,890.

Еще одно применение соединений данного изобретения - это использование их в комбинации с другими стимуляторами секреции гормона роста, такими как пептиды, высвобождающие гормон роста GHRP-6, GHRP-1 , описанные в патенте США Nos 4,411,890 и в публикациях WO 89/07110, WO 89/07111 и В-НТ920, а также гексарелин и GHRP-2, как описано в WO 93/04081 или гормон, высвобождающий гормон роста (GHRH, обозначаемый как GRF) и его аналоги, либо гормон роста и его аналоги, либо соматомедины, включая IGF-1 и IGF-2, либо αадренергические агонисты, такие как клонидин или серотонин 5HTID агонисты, такие как сумитриптан, либо агенты, которые ингибируют соматостатин или его высвобождение, такие как физостигмин и пиридостигмин. В частности, соединения данного изобретения могут применяться в комбинации с фактором высвобождения гормона роста, аналогом фактора высвобождения гормона роста, IGF-1 и IGF-2. Например, соединение настоящего изобретения может быть использовано в комбинации с IGF-1 для лечения или предупреждения ожирения. Кроме того, соединение настоящего изобретения может быть использовано в сочетании с ретиноевой кислотой для улучшения состояния мускулатуры и кожи, связанного с процессом старения.

Настоящее изобретение относится также к способу получения медикамента для стимуляции высвобождения гормона роста у людей и животных, включающему соединение полиморфной формы настоящего изобретения с фармацевтическим носителем или растворителем.

Как хорошо известно специалистам, известные и потенциальные возможности приме19 нения гормона роста разнообразны и многочисленны. Введение соединений данного изобретения в целях стимуляции высвобождения эндогенного гормона роста может иметь те же самые результаты и полезные эффекты, что и от самого гормона роста. Различные применения настоящих соединений можно суммировать следующим образом: стимулирование высвобождения гормона роста у пожилых людей; лечение взрослых с дефицитом гормона роста; предупреждение катаболических побочных эффектов глюкокортикоидов; лечение остеопороза; стимуляция иммунной системы, ускорение заживления ран; ускорение срастания переломов костей; лечение отставания в росте; лечение острой и хронической почечной недостаточности; лечение физиологического малого роста, включая детей с дефицитом гормона роста; лечение малого роста, связанного с хроническим заболеванием; лечение ожирения и задержки роста, связанной с ожирением; лечение задержки роста, связанной с синдромом Prader-Willi и синдромом Turner'a; ускорение восстановления и сокращение госпитализации больных с ожогами или после таких хирургических операций, как операции на желудочно-кишечном тракте; лечение задержки внутриутробного роста и дисплазии скелета, лечение периферических нейропатий; восполнение гормона роста у больных со стрессовыми состояниями; лечение остеохондродисплазий, синдрома Нунан (Noonan' syndrome), шизофрении, депрессии, болезни Альцгеймера, замедленного заживления ран, а также психосоциальной депривации; лечение легочной дисфункции и вентиляторной зависимости; аттенуация белковой катаболической реакции после больших операций; лечение малабсорбционных синдромов; снижение степени кахексии и потери белка в связи с хроническими заболеваниями, такими как рак или СПИД; ускорение прибавления в весе и наращивание белка у больных на полном парентеральном питании [TPN (total parenteral nutrition)]; лечение гиперинсулинемии, включая незидиобластоз (гиперплазию панкреатических островков); индуцированной овуляции и предупреждении и лечении язвы желудка и двенадцатиперстной кишки; стимулирование развития тимуса и предупреждение возрастного упадка тимусной функции; дополнительная терапия в лечении больных на хроническом гемодиализе; лечение больных с угнетенным иммунитетом и активация реакции выработки антител после вакцинации; повышение общего числа лимфоцитов у людей, в частности, повышение соотношения Т₄/Т₈-клеток в организме людей с угнетенным соотношением Т4/Т8-клеток в результате, например, физической травмы, такой как закрытая травма головы, или в результате инфекции, бактериальной или вирусной, особенно в случае инфицирования вирусом иммунодефицита человека; повышение мышечной силы, подвижности, поддержание толщины кожи, метаболического гомеостаза, почечного гомеостаза у дряхлых пожилых людей; стимуляция остеобластов, реконструкции костей, роста хрящей; стимуляция иммунной системы у домашних животных и лечение расстройств старения у домашних животных; стимулирование роста скота; стимулирование роста шерсти у овец. Далее, соединения полезны для повышения эффективности кормов, усиления роста, повышения производства молока и улучшения качества туши скота. Аналогично этому, соединения настоящего изобретения полезны в методе лечения заболеваний или состояний, улучшающихся под влиянием анаболических эффектов повышенных уровней гормона роста, который включает введение соединений настоящего изобретения.

В частности, соединения полезны для предупреждения или лечения состояний, включающих остеопороз; катаболическую болезнь; иммунодефицит, включая таковой у индивидуумов с подавленным соотношением Т4/Т8клеток; перелом бедра; костно-мышечные нарушения у людей пожилого возраста; недостаточность гормона роста у взрослых и детей; ожирение; кахексию и потерю белка, связанные с хроническими заболеваниями, такими как СПИД или рак; для лечения больных, выздоравливающих после больших операций, ран или ожогов.

Кроме того, соединения настоящего изобретения могут быть полезны для лечения болезней, вызванных или ставших возможными в результате действия кортикотропинвысвобождающего фактора или расстройств, связанных со стрессом или беспокойством, включая стресс-обусловленную депрессию и головную боль, абдоминальный кишечный синдром, иммуносупрессию, ВИЧ-инфекции, болезнь Альцгеймера, желудочно-кишечную болезнь, нервную анорексию, геморрагический стресс, симптомы алкогольной и наркотической абстиненции, наркотическую зависимость, проблемы фертильности [способности к деторождению].

Специалистам хорошо известно, что имеются многочисленные соединения, применяемые в настоящее время для лечения болезней или с терапевтических показаний, перечисленных выше. Комбинации этих терапевтических агентов, некоторые из которых также были упомянуты выше вместе со стимуляторами секреции гормона роста данного изобретения, внесут дополнительные, комплементарные и часто синергические свойства, усиливающие стимулирующие рост, анаболические и желательные свойства этих разнообразных терапевтических агентов. В этих комбинациях терапевтические агенты и стимуляторы секреции гормона роста данного изобретения могут независимо присутствовать в дозе, в пределах от одной сотой доли до одной дозы, которые являются эффективны21 ми, когда эти соединения и стимуляторы секреции применяются отдельно.

Комбинированная терапия, направленная на ингибирование резорбции кости, предупреждение остеопороза и ускорение заживления переломов костей, может быть проиллюстрирована комбинациями бифосфонатов и стимуляторов секреции гормона роста данного изобретения. Использование бифосфонатов для этих целей описано, например, в публикации Hamdy, N.A.T., Role of Biphosphonates in Metabolic Bone Diseases, Trends in Endocrinol. Metab., 4, 19-25 (1993). Бифосфонаты, полезные для этих целей, включают алендронат, тилундронат, диметилAPD, ризедронат, этидронат, YM-175, клодронат, памидронат и ВМ-210995. Соответственно их активности, пероральные дневные дозы бифосфоната, составляющие от 0,1 до 5 г и пероральные дневные дозы стимуляторов секреции гормона роста данного изобретения, составляющие от 0,01 мг/кг до 20 мг/кг веса тела вводят пациентам для эффективного лечения остеопороза.

В случае алендроната пероральные дневные дозы, составляющие от 0,1 мг до 50 мг комбинируются, в целях эффективной терапии остеопороза, со стимуляторами секреции гормона роста данного изобретения в количестве от 0,01 мг/кг до 20 мг/кг. Остеопороз и другие нарушения в костях можно также лечить соединениями данного изобретения в комбинации с кальцитонином, эстрогенами, ралоксифеном и источниками кальция, такими как цитрат кальция.

Анаболические эффекты, особенно при лечении гериатрических пациентов мужского пола, получают с помощью соединений данного изобретения в комбинации с анаболическими стероидами, такими как оксиметолон, метилтестостерон, флуоксиместерон и станозолол.

Соединения данного изобретения могут быть введены перорально, парентерально (например, в форме внутримышечных, интраперитонеальных, внутривенных или подкожных инъекций, или путем имплантации), интраназальным, интравагинальным, интраректальным, сублингвальным или местным путем и могут быть сформулированы в виде дозированных форм дозировок, соответствующих для каждого способа введения.

Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах активное соединение смешивают, по крайней мере, с одним инертным, фармакологически приемлемым носителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозированные формы могут также включать обычно используемые дополнительные вещества, не являющиеся инертными растворителями, например, смазочные агенты, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль, дозированные формы могут также включать буферирующие агенты. Таблетки и пилюли могут, кроме того, изготовляться с энтеросолюбильной оболочкой.

Жидкие дозированные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы, элексиры, содержащие инертные растворители, обычно применяемые в практике, такие как вода. Кроме таких инертных растворителей, композиции могут также включать адьюванты, такие как смачивающие агенты, эмульсифицирующие и суспендирующие агенты, а также подслащивающие, придающие вкус и ароматизирующие агенты.

Соответственно данному изобретению, композиции для парентерального введения включают стерильные водные и неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей или носителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое и кукурузное масло, желатин, а также инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Такие дозированные формы могут также содержать адьюванты, такие как консервирующие, смачивающие, эмульсифицирующие и диспергирующие агенты. Они могут быть простерилизованы, например, фильтрацией через задерживающий бактерии фильтр, включением стерилизующих агентов в композиции, облучением композиций или их нагреванием. Они могут также быть произведены в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены в стерильной воде или в другой стерильной инъекционной среде непосредственно перед применением.

Композиции для ректального или вагинального введения представляют собой преимущественно свечи, которые могут содержать дополнительно к активному веществу такие наполнители как масло какао или суппозиторный воск.

Композиции для интраназального и сублингвального введения также готовятся со стандартными наполнителями, хорошо известными в данной области.

Соединение данного изобретения может назначаться пациенту (животному или человеку), нуждающемуся в таком лечении, в дозах, которые обеспечат оптимальную фармацевтическую эффективность. Желательно, чтобы доза, необходимая для использования в любом конкретном случае применения, изменялась от пациента к пациенту, в зависимости не только от выбора конкретного соединения или композиции, но и от способа введения, от природы состояния, подвергаемого лечению, возраста и состояния пациента, сопутствующего лечения или специальной диеты, которой следует пациент, а также других факторов, известных компетентными в этой области специалистам, с тем, чтобы лечащий врач в конечном итоге имел возможность выбора соответствующей дозы.

Доза активного ингредиента в композициях данного изобретения может изменяться; необходимо, однако, чтобы количество активного ингредиента было таким, чтобы была получена подходящая дозированная форма. Выбираемая доза зависит от желаемого терапевтического эффекта, способа введения и от длительности лечения. Обычно, уровни от 0,0001 до 10 мг/кг веса тела в день вводят пациентам и животным, например млекопитающим, для получения эффективного высвобождения гормона роста. Предпочтительно, чтобы уровень был приблизительно от 0,001 до 25 мг/кг в день; более предпочтительно - приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг в день.

Методы получения полиморфных форм настоящего изобретения иллюстрируются в следующих далее примерах. Следующие далее примеры даны в целях иллюстрирования настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие объем данного изобретения.

Пример 1 .

N-[ 1 (R)-( 1,2-Дигидро-1 -метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2 метилпропанамид.

Стадия А. 1,2-Дигидро-1-метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]гидрохлорид.

К раствору 1,20 г (5,8 ммолей) 1'-метил1,2-дигидро-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] (приготовленному, как описано Н. О ng, et al., J. Med. Chem., 23, 981-986 (1983), в 20 мл сухого дихлорметана при 0°С добавляли триэтиламид (0,90 мл; 6,4 ммолей) и метансульфонил хлорид (0,49 мл; 6,35 ммолей) и перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь выливали в 15 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и экстрагировали дихлорметаном (2х10 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (20 мл), высушивали над безводным карбонатом калия, фильтровали и удаляли растворитель при пониженном давлении до получения 1,44 г производного метансульфонамида в виде бледножелтого масла, которое использовали далее без очистки.

К раствору сырого продукта в 20 мл 1,2дихлорэтана при 0°С добавляли 1,0 мл (9,30 ммолей) 1-хлорэтил хлороформата и перемешивали затем при комнатной температуре в течение 30 мин и наконец при кипячении с обратным холодильником в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали до приблизительно одной трети объема и затем разбавляли 20 мл сухого метанола и кипятили с обратным холодильником в течение 1,5 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали до приблизительно половины объема. Осадок фильтровали и промывали небольшим объемом холодного метанола. Получали 1,0 г НО соли пиперидина в виде белого твердого вещества. Фильтрат концентрировали и добавляли небольшой объем метанола, а затем эфир. Осажденный материал еще раз фильтровали, промывали холодным метанолом и сушили. Дополнительно получали 0,49 г желаемого продукта. Общий выход составлял 1,49 г (70%).

¹H ЯМР (CDCl₃, 200 МГц) δ 7,43-7,20 (м, 3Н), 7,10(дд 1Н), 3,98 (шир.с, 2Н), 3,55-3,40 (шир.дд, 2Н), 3,55-3,10 (м, 2Н), 2,99 (с, 3Н), 2,15 (т, 2Н), 2,00 (т, 2Н).

Стадия В. М1Щ)-[(1,2-Дигидро-1-метансульфонил-спиро[3-индол-3,4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил]-2-[(1,1диметилэтокси)карбонил]амино-2-метилпропанамид.

К 0,35 г (1,15 ммоля) ^)-2-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]амино-3-[2-(фенилметилокси)этил]-1-пропановой кислоты в 13 мл дихлорметана добавляли 1,2-дигидро-1-метансульфонилспиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин] гидрохлорид (0,325 г, 1,07 ммоля), 0,18 мл (1,63 ммоля) N-метилморфолина, 0,159 г (1,18 ммоля) 1гидроксибензтриазола (НОВТ) и перемешивали в течение 15 мин. Добавляли EDC (0,31 г, 1,62 моля) и продолжали помешивание в течение 1 ч. Добавляли дополнительно 60 мкл N-метилморфолина и перемешивали в течение 45 мин. Реакционную смесь выливали в 5 мл воды и отделяли органический слой. Промывали органический слой 5 мл 0,5N водного водного раствора соляной кислоты и 5 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия. Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали до получения 0,627 г продукта в виде желтой пены, которую использовали далее без чистки.

К 0,627 г (1,07 ммоля) вышеуказанного продукта в 5 мл дихлорметана добавляли 1,0 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали при КТ в течение 75 мин. Добавляли дополнительно 1 ,00 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали в течение 1 0 мин. Реакционную смесь концентрировали, разбавляли с помощью 5 мл дихлорметана и осторожно подщелачивали, выливая в 1 0 мл 1 0% водный раствор карбоната натрия. Отделяли органический слой и затем экстрагировали водный слой 2х15 мл дихлорметана. Объединенные органические слои промывали 5 мл воды, сушили над карбонатом калия, фильтровали и концентрировали, получая 0,486 г амина в виде светло-желтой пены, которую использовали далее без очистки.

К 0,486 г (1,01 ммоля) амина и 10 мл дихлорметана добавляли 0,26 г (1,28 ммоля) 2[(1,1-диметилэтокси)карбонил]амино-2-метилпропановой кислоты, 0,173 г (1,28 ммоля) 1гидрокси-бензтриазол (НОВТ) и EDC (0,245 г, 1 ,28 моля) и перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь выливали в 5,0 мл воды и отделяли органический слой. Экстраги25 ровали обратно водный слой с помощью 5 мл дихлорэтана. Промывали объединенные органические слои 5,0 мл 0,5N водного раствора соляной кислоты, 5 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали до получения 0,751 г сырого продукта в виде желтой пены. Раствор сырого продукта в дихлорметане хроматографировали на 25 г силикагеля и элюировали сначала смесью гексан/ацетон/дихлорметаном (65/30/5). Получали 0,63 г заглавного соединения в виде белого твердого вещества.

¹Н ЯМР (СОС1₃, 400 МГц). Соединение существует как смесь 3:2 ротамеров δ 7,40-7,10 (м, 6Н) , 7,06 (д, 1/3Н), 7,02 (т, 1/3Н), 6,90 (т, 1/3Н)^-, 6,55 (д, 1/3Н), 5,15 (м, 1Н), 4,95 (шир.с., 1Н), 4,63 (шир.д, 1/3Н), 4,57-4,40 (м, 2 2/3Н), 4,10 (шир.д, 1/3Н), 4,00 (шир.д, 1/3Н), 3,82 (т, 1Н), 3,78-3,62 (м, 2Н), 3,60-3,50 (м, 1Н), 3,04 (кв, 1Н), 2,87 (с, 1Н), 2,86 (с, 2Н), 2,80-2,60 (м, 1Н), 1,90 (шир.с, 1Н), 2,85-2,75 (м, 1Н), 1,82-1,60 (м, 3Н), 1,55-1,45 (м, 1Н), 1,45 (с, 4Н), 1,42 (с, 2Н), 1,39 (с, 9Н).

Стадия С. N-[ 1(R)-( 1,2-Дигидро-1-метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2-метилпропанамид гидрохлорид.

К 0,637 г (0,101 ммоля, промежуточного продукта стадии В в 5 мл дихлорметана добавляли 2,5 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали при КТ в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали до масла, помещали в 1 0 мл этилацетата и промывали 8 мл 1 0% водного раствора карбоната натрия. Водный слой затем экстрагировали с помощью 5 мл этилацетата. Объединенные органические слои промывали 1 0 мл воды, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая 0,512 г свободного основания в виде белой пены.

К 0,512 г свободного основания в 5 мл этилацетата при 0°С добавляли 0,2 мл насыщенный раствор соляной кислоты в этилацетате и перемешивали в течение 1,5 ч. Белый осадок фильтровали в атмосфере азота, промывали эфиром и сушили, получая 0,50 г заглавного соединения в виде белого твердого вещества.

'Н ЯМР (400 МГц, СЭ₃,ОО). Соединение существует как смесь 3:2 ротамеров δ 7,40-7,28 (м, 4Н), 7,25-7,17 (м, 2Н), 7,08 (т, 1/3Н), 7,00 (т, 1/3Н), 6,80 (д, 1/3Н), 5,16 (ддд, 1Н), 4,60-4,42 (м, 3Н), 4,05 (т, 1Н), 3,90 (шир.с, 2Н), 3,83-3,70 (м, 2Н), 3,30-3,15 (м, 1Н), 2,97 (с, 1Н), 2,95 (с, 2Н), 2,90-2,78 (м, 1Н), 1,96 (т, 1/3Н), 1,85-1,65 (м, 4Н), 1,63 (c, 2Н), 1,60 (с, 4Н).

Пример 2.

N-[ 1 (R)-( 1,2-Дигидро-1 -метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 '-карбонил]2-(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид.

Стадия A. (2R)-[[[-2-[(1,1-диметилэтокси) карбонил]амино]2,2-диметил-1-оксоэтил]-1пропановой кислоты аллиловый эфир.

Получают из (2R)-2-[(1,1-диметилэтокси) карбонил]амино-3-[фенилметилокси)этилпропановой кислоты и аллилового спирта реакцией сочетания в CH₂Cl₂ в присутствии EDC и DMAR.

'Н ЯМР (400 МГц, СDС1з) δ 7,25 (с, 5Н), 5,8 (м, 1Н), 5,2 (дд, 2Н), 5,0 (шир.с, 1Н), 4,7 (м, 1Н), 4,6 (м, 2Н), 4,4 (дд, 1Н), 3,9 (дд, 1Н), 3,6 (дд, 1Н), 1,45 (д, 6Н), 1,39 (с, 9Н).

Стадия В. (2R)-[[[-2-[(1,1-диметилэтокси) карбонил]амино]-2,2-диметил-1-оксоэтил]амино-2-(фенилметилокси)этил)-1 -пропановая кислота.

К перемешиваемому раствору сырого промежуточного продукта стадии А (6,7 г, 15,9 ммолей), тетракис (трифенилфосфин)палладия (1,8 г, 0,1 экв.) и трифенилфосфина (1,25 г, 0,3 экв.) добавляли раствор 2-этилгексаноата калия (35 мл 0,5М раствор в EtOAc). Реакционную смесь помешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 1 ч и затем разбавляли эфиром (100 мл) и выливали в ледяную воду. Отделяли органический слой и подкисляли водную фракцию лимонной кислотой (20%), затем экстрагировали с помощью EtOAc. Экстракты EtOAc промывали солевым раствором, сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали, получая заглавное соединение в виде твердого вещества.

¹H ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 7,3 (с, 5Н), 4,7 (м, 1Н), 4,5 (с, 2Н), 4,0 (м, 1Н), 3,6 (м, 1Н), 1,4 (д, 6Н), 1,3 (с, 9Н) .

Стадия С. ^[1Щ)-(1,2-дигидро-1метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-карбонил]-2-фенилметокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид гидрохлорид.

К раствору 1,0 г (3,44 ммоля) 1-метансульфонилспиро[3Н-индолин-3,4'-пиперидин]гидрохлорида, 1,44 г (3,78 ммоля) (2R)[[-2-(1,1диметилэтокси)карбонил]амино-2,2-диметил-1оксоэтил]-амино-2-(фенилметилокси)этил)-1пропановой кислоты, N-метил морфолина (0,58 мл, 5,20 ммолей) и 1-гидроксибензтриазола (НОВТ) (0,58 г, 3,78 моля) в 50 мл дихлорметана добавляли EDC (1,03 г, 5,20 моля) и перемешивали при КТ в течение 1 6 ч. Реакционную смесь разбавляли дополнительными 50 мл дихлорметана и промывали водным раствором бикарбоната натрия (50 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Флэш-хроматография (50 г силикагеля) сырого маслянистого остатка давала 2,148 г (90%) желаемого продукта в виде бесцветной пены.

'll ЯМР (ODOls, 400 МГц). Соединение существует как смесь 3:2 ротамеров δ 7,40-7,10 (м, 6Н), 7,06 (д, 1/3Н) , 7,02 (т, 1/3Н), 6,90 (т, 1/3Н), 6,55 (д, 1/3Н), 5,15 (м, 1Н), 4,95 (шир.с,

1Н), 4,63 (шир.д, 1/3Н), 4,57-4,40 (м, 2 2/3Н), 4,10 (шир.д, 1/3Н), 4,00 (шир.д, 1/3Н), 3,82 (т, 1Н), 3,78-3,62 (м, 2Н), 3,60-3,50 (м, 1Н), 3,04 (кв, 1Н), 2,87 (с, 1Н), 2,86 (с, 2Н), 2,80-2,60 (м, 1Н), 1,90 (шир.с, 1Н), 2,85-2,75 (м, 1Н), 1,82-1,60 (м, 3Н), 1,55-1,45 (м, 1Н), 1,45 (с, 4Н), 1,42 (с, 2Н), 1,39 (с, 9Н).

Стадия D. N-[1(R)-( 1,2-Дигидро-1-метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 'ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид гидрохлорид.

К раствору 2,148 г (3,41 ммоля) промежуточного продукта стадии С в 10 мл дихлорметана добавляли 5 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали и подщелачивали с помощью 100 мл 5% водного раствора карбоната натрия и экстрагировали с помощью дихлорметана (3х50 мл). Промывали объединенные органические слои солевым раствором (50 мл), сушили над безводным карбонатом калия, фильтровали и концентрировали бесцветную пену. К раствору пены в 25 мл этилацетата при 0°С добавляли 4 мл 1М раствора соляной кислоты в этилацетате. Осадок фильтровали и промывали сначала этилацетатом, а затем этилацетатомэфиром (1:1), сушили и получали 1,79 г (93%) заглавного соединения в виде бесцветного твердого вещества.

'H ЯМР (400 МГц, СDзOD). Соединение существует как смесь 3:2 ротамеров. δ 7,40-7,28 (м, 4Н), 7,25-7,17 (м, 2Н), 7,08 (т, 1/3Н), 7,00 (т, 1/3Н), 6,80 (д, 1/3Н), 5,16 (ддд, 1Н), 4,60-4,42 (м, 3Н), 4,05 (т, 1Н), 3,90 (шир.с, 2Н), 3,83-3,70 (м, 2Н), 3,30-3,15 (м, 1Н), 2,97 (с, 1Н), 2,95 (с, 2Н), 2,90-2,78 (м, 1Н), 1,96 (т, 1/3Н), 1,85-1,65 (м, 4Н), 1,63 (с, 2Н), 1,60 (С, 4Н).

Пример 3.

N-[ 1 (R)-( 1,2-Дигидро-1 -метансульфонилспиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида мезилат.

Это соединение получали обработкой свободного основания, полученного в примере 5, стадии D, метансульфоновой кислотой. Заглавное соединение получали перекристаллизацией из смеси этил - ацетат - этанол - вода. Т.пл. 166168°С. Этот образец был затем идентифицирован как полиморфная форма II. Она характеризовалась диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями приблизительно при: 4,7, 11,6, 17,4, 19,2 и 21,6° (2 тета). Далее она характеризовалась DSC при градиенте 10°С/мин в открытой кювете в потоке азота и имела одну эндотерму плавления с пиком температуры около 1 74°С и экстраполированной начальной температурой (точкой плавления) приблизительно 165°С, соответствующей теплоте приблизительно 37 Дж/г.

Пример 4. О^ЮВп

со₂н

Изонипекотовая кислота-Л-бензил карбамат (3).

Материалы:

Изонипекотовая кислота (2) T.C.I.	4,02 кг (31,1 молей
Бензил хлорформиат (Schweitzerhall)	6,91 кг (40,5 молей
К2СО3	10,1 кг (72,9 молей)
Вода	40,2 л

Растворяли изонипекотовую кислоту (2) и К₂СО₃ в 40,2 л воды в 100 л 4-горлой колбе с механическим перемешиванием в атмосфере N₂и охлаждали раствор до 10°С. Добавляли бензил хлорформиат, поддерживая температуру между 9 и 14°С и после завершения добавления и выстаивания в течение 58 ч нагревали смесь до 22°С. Добавление завершали через 4 ч, когда рН было равно 9,0. После выдерживания в течение 58 ч изменения в рН не было.

Переносили реакционную смесь в 200 л экстрактор и промывали 3х13 кг (15 л) IP AC и 1х12 л EtOAc. Экстрагировали водный слой 8 л толуола. После промывок содержание бензилового спирта снижалось от 3,8% до 1,4% по анализу ЖХВР. ЖХВР анализ: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax с потоком 1,5 мл/мин и детекцией при 254 нм; изократическая смесь с 35% MeCN, 65% с 0,1% водного НзРO₄; время удерживания: 3=6,9 мин, бензиловый спирт=3,3 мин, толуол=17,3 мин.

Подкисляли водную фазу 37% водным раствором НО до рН 1,8.

Выделялась двуокись углерода во время добавления, но выделение газа легко контролировали. Добавление НО занимало <1 ч и потребовало 10 л конц. НО. Водную фазу экстрагировали 3х6,6 л толуола. Экстракты толуола сушили 2 кг сульфата натрия и фильтровали через слой Solka-floc™. Вес объединенных фильтратов составлял 17,8 кг. Выход сырого карбамата 3 составил 7,89 кг (97%) полученный выпариванием досуха весовых аликвот фильтратов). Фильтраты пропускали через 10 мкм внутрилинейный фильтр в 1 00 л колбу. Экстракты концентрировали при 10 мбар при <25°С до объема 1 8 л. Конечная концентрация карбамата 3 составляла 440 г/л. Концентрация фильтрата толуола служила для азеотропического удаления последних следов воды (окончательно KF=170 мг/л). Продукт имел чистоту 99,1% с 0,9% бензилового спирта в качестве единственной примеси.

Пример 5.

coci

Хлорангидрид-N-бензил карбамат изонипекотовой кислоты (4).

Материалы:

Изонипекотовая кислота -N-бензил карбамат (3) в толуоле (М.В.=263,30)	7,89 кг (30,0 молей) в 17,9 л
Оксалилхлорид (М.В .= 126,93)	3,94 кг (31,0 молей)
DMF (М.В.=73,10)	10 мл
Толуол	12 л

К толуоловому раствору бензилкарбамата 3 из предшествующей стадии добавляли 5 мл DMF и 10 л толуола. Через 20 мин добавляли оксалилхлорид. Реакционную смесь выдерживали в течение 16 ч при 18°С в медленном потоке азота. ЖХВР анализ реакционной смеси показал, что 1,3% карбоновой кислоты 3 остались непрореагировавшими. Реакционную смесь нагревали до 26°С и добавляли 5 мл DMF. Смесь выдерживали в течение 2,5 ч, 1 ,0 мл аликвоту реакционной смеси гасили 5,0 мл третбутиламина и после выпаривания анализировали с ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax при 50°С, скорость потока 1 мл/мин и детекцией при 220 нм; изократические 42% MeCN, 58% с 0,1% водного Данный метод показал, что оставалось <0,05% кислоты 3 (судя по А), и показал >3% В (>1 моль% (COCl)₂).

Смесь концентрировали при 1 0 мбар и температуре 20-25°С до удаления 5 л растворителя.

Типичная картина ЖХВР концентрированного раствора толуола после описанного выше гашения T-BuNH₂ выглядит следующим образом:

Время удерживания (мин)	% поверхности	Идентичность
2,1	<0,5%	Карбоновая кислота 3
7,8	<0,5%	Бензилхлорид
11,0	>99%	Cbz-Бутилкарбоксамид А
12,1	NA	Толуол
12,7	<0,5	ди-трет-Бутилоксамид В

Пример 6.

сно

Пиперидин-4-карбоксальдегид-1 -бензилкарбамат (5).

Материалы:

Хдорангидрид-\-бензид карбамат изонипекотовой кислоты (4) в толуоле (М.В.=281,74)	3,38 кг (12,0 молей) в 5,54 кг
DIEA (KF=18 мг/л)	1,55 кг (15,0 молей)
10% Pd/C (KF<20 мг/г)	101 г
тиоанизол (М.В.=124,21, d= 1,058)	0,56 г

DIEA и тиоанизол добавляли к раствору (4) в толуоле из предшествующей стадии, и в этой смеси суспендировали катализатор. Смесь немедленно помещали в 18,9 л автоклав и гидрировали при 20°С и 2,8 кг/см² Н₂. Через 18 ч реакционная смесь поглотила 70% теоретического количества водорода, и ЖХВР анализ аликвоты, которая была погашена третбутиламином, показал, что осталось 1 4,2% хлорангидрида кислоты 2. Условия ЖХВР те же, что и выше. Время удерживания: 5=8,1 мин.

Добавляли вторую загрузку катализатора (101 г) и тиоанизола (0,54 г) в гидрогенератор в виде суспензии в 1 375 мл толуола. Через 23 ч ЖХВР анализ аликвоты, которая была погашена трет-бутиламином, показал, что осталось 1,8% хлорангидрида кислоты.

Смесь продували азотом и удаляли катализатор и осажденный DIEA · Hd фильтрованием через Solka-floc™. Фильтровальную лепешку промывали 10 л толуола. Фильтраты пропускали через 10 мкм внутрилинейный фильтр в 50 л экстрактор и промывали 2х7,2 л 1М водного раствора Hd и 2х7,2 л воды. Смесь концентрировали при 10 мбар и температуре 25-30°С до получения остатка 5 л.

Время удерживания	Поверхн.%	Индентичность
2,1	<2	карбоновая кислота 3
6,6	<1	димер 21
8,1	>95	альдегид 5

Экспериментальный выход альдегида 3 составил 94% согласно анализу ЖХВР.

Пример 7.

CDZ-Спироиндолин (9). Материалы:

Раствор пиперидин-4-карбоксальдегид-1-бензил карбамата (5) в толуоле	1,71 кг (6,89 молей) 21,4 кг
Фенилгидразин	900 мл, 981 г (9,15 молей)
Трифторуксусная кислота (TFA)	2,20 л, 3,26 кг (28,6 молей
NaBH4	300 г, (7,93 молей)
Толуол	34,4 кг
MeCN	7,0 л
МеОН	7,0 л

Раствор сырого альдегида 5 из предшествующей стадии пропускали через 10 мкм внутрилинейный фильтр в 100 л реактор, оборудованный облицованными тефлоном (Teflon) медными змеевиками для охлаждения или нагревания и механической мешалкой. Добавляли толуол (34,4 кг) и MeCN (7 л) и полученный раствор охлаждали до 0°С. Добавляли порциями фенилгидразин и поддерживали температуру от -1 до 3°С при непрерывном барботировании азота в реакционную смесь.

Фенилгидразин добавляли до тех пор пока анализы ТСХ и ЖХВР не показали полное израсходование альдегида 5 и появление небольшого избытка (<5%) фенилгидразина. Условия ТСХ: Silica, E.Merck Kieselgel G60 F254 0,25 mm; диэтил/пентан (4/1); проявляющий агент 0,5% сульфат церия, 14% молибдат аммония в 10% водной серной кислоте и затем нагревание; Rf: альдегид 5=0,52, фенилгидразон 7=0,61, фенилгидразин 6=0,21.

Условия ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax при 30°С с потоком 1,0 мл/мин и детекцией при 254 нм; градиентная шкала:

Время (мин)	Ацетонитрил: вода
0	57:43
10	65:35
15	75:25
18	75:25

Время удерживания: фенилгидразин 6=4,5 мин, толуол=7,2 мин, фенилгидразон 7=11,4.

Реакционную смесь выдерживали в течение 30 мин при 0-2°С, добавляли TFA, поддерживая температуру между 2 и 7°С. Реакционную смесь подогревали до 50°С в течение 30 мин и поддерживали в течение 17 ч. Прекращали барботирование азота через реакционную смесь и поддерживали медленный ток азота над реакционной смесью. В течение первого часа при 5°С раствор постепенно темнел до темнозеленого и образовывалось относительно небольшое количество белого кристаллического осадка (трифторацетата аммония). Спустя 17 ч анализ ЖХВР (условия те же, что и выше) показывал, что реакционная смесь содержала 91,6% индоленина 8 и что оставалось 1,5% непрореагировавшего фенилгидразона. Выстаивание смеси в течение более длительных периодов времени не повышало выхода индоленина 8.

Реакционную смесь охлаждали до 12°С и добавляли 7,0 л МеОН. Добавляли небольшими порциями (<20 г) NaBN₄, поддерживая температуру ниже 15°С. Добавление заняло 30 мин. Умеренное выделение водорода наблюдали в течение добавления, но его легко удавалось контролировать и вспенивания практически не было. Незадолго до конца добавления цвет быстро изменился от зеленого к коричневому, а затем к ярко оранжевому. Отделилось небольшое количество (<200 мл) более тяжелой фазы (предположительно, водные соли). Анализ ЖХВР (условия те же, что и прежде) показывал, что весь индоленил 8 израсходован (90,4% CBZиндолина); время удерживания: индоленин 8=7,5 мин, индолин 9=8,2 мин. ТСХ: этиловый эфир в качестве растворителя, проявление аммония молибдатом, церия сульфатом или 1 % анизальдегидом; факторы удерживания: индоленин 8=0,18, CBZ-индолин 9=0,33.

Момент изменения цвета от зеленого к оранжевому очень близко от конечной точки реакции. Количество NaBH₄, требуемое для завершения реакции, сильно зависит от температуры и скорости добавления NaBH₄, но не влияют на выход и качество продукта при условии, что реакция завершена. Реакционную смесь охлаждали до 5°С в течение 30 мин. Затем добавляли 8 л 3% водного NH₄OH (8 л) для доведения рН водной фазы до 7,4, перемешивали смесь и оставляли для осаждения. Температура поднималась до 15°С. Мутную желтую нижнюю водную фазу отделяли. Промывали органическую фазу 4 л 3% водного NH₄OH, 2х4 л воды и 2х4 л солевого раствора. Вес органической фазы после промывок составлял 53,5 кг, а экспериментальный выход 94%.

Промытый толуоловый раствор объединяли с промытыми органическими фазами двух других подобных реакций. Общее количество альдегида, использованное в трех реакциях, составило 5,06 кг (20,0 молей). Общий вес CBZиндолина 9, обнаруженного в объединенных органических фазах составил 5,91 кг (18,3 молей, экспериментальный вход 90%). Объединенные органические фазы сушили 5 кг сульфата натрия, обрабатывали 250 г угля Darco G-60 в течение 30 мин и фильтровали через Solkafloc™. Фильтраты концентрировали в вакууме при 10 мбар при <25°С до почти сухого остатка. Замену растворителя завершали медленно, подавая 30 л IPAC и повторно концентрируя до 1 4 л при 200 мбар при 50-60°С. Смесь нагревали с обратным холодильником и получали чистый гомогенный темно-оранжевый раствор. MmP анализ показывал, что раствор содержал около 6 мол.% остаточного толуола после замены растворителя.

Раствор охлаждали до 68°С и затравляли 4 г кристаллического CBZ-индолина 9. Раствору давали постепенно остыть до 26°С в течение 6 ч и выстаивали в течение 9 ч при 20-26°С. Суспензию охлаждали до 2°С в течение 1 ч и выдерживали при 2°С в течение 1 ч. Продукт выделяли фильтрованием, а фильтровальную лепешку промывали 2х2 л 5°С IP AC и 2х2 л 5°С МТВЕ. Продукт сушили в вакуумной печи при 30°С в слабом потоке азота и получали 4,37 кг (74%) заглавного соединения 9 в виде светлого рыжевато-коричневого кристаллического порошка. ЖХВР анализ продукта показывал 99,5% чистоту. Маточный раствор (11 л) и промывки содержали 1,15 кг (19%) дополнительного про33 дукта 9 и около 3% Cbz-фенилгидразида изонипекотовой кислоты (время удерживания=4,8 мин.).

CBZ-Спироиндолин-метансульфонамид (1).

Материалы:

CBZ-Спироиндолин (9)	1,69 кг (5,23 молей)
Метансульфонилхлорид	599 г (5,23 молей)
Et3N (KF=151)	635 г (6,27 молей)
ТГФ (KF=41 мг/г)	12 л

В 22 л колбу загружали твердый CBZспироиндолин 9 и затем через 10 мкм внутрилинейный фильтр пропускали в колбу 11,5 л ТГФ и Et₃N. Полученный гомогенный раствор охлаждали до 0°С. В 1 л капельную воронку загружали метансульфонилхлорид и 500 мл ТГФ. В реакционную смесь добавляли раствор MsCl в ТГФ, поддерживая температуру между 0 и 4°С. Добавление занимало 5 ч и было экзотермическим. Во время добавления образовывался белый осадок, предположительно гидрохлорид триэтиламмония. Анализ ЖХВР показывал, что реакция завершилась в конце добавления (9 не было обнаружено).

Условия ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax при 30°С с потоком 1,5 мл/мин и детекцией при 254 нм. Градиентная шкала:

Время (мин)	0,1% водн.Н₃РO₄:МеСN
0	70:30
3	70:30
12	20:80
25	20:80

Время удерживания: 9=7,6 мин, 1=13,6 мин.

После завершения добавления реакционную смесь нагревали до 1 8°С и выдерживали в течение 16 ч. Изменений реакционной смеси и в ЖХВР картине между концом добавления и после 1 6 ч выдерживания не отмечалось. Реакционную смесь медленно переносили в течение 1 ч в энергично перемешиваемый раствор 30 л воды и 200 мл 37% водной НО в 50 л колбе. Температура в 50 л колбе поднималась с 22 до 28°С. Отделяли продукт в виде бледнорыжевато-коричневого смолообразного твердого вещества, которое превращалось в гранулированное твердое вещество. Водную суспензию охлаждали до 22°С и выдерживали в течение 1 ч. Фильтровали суспензию и промывали фильтровальную лепешку 2х4 л МеОН/вода (50/50) . ЖХВР анализ показывал, что в маточных жидкостях было <0,1% CBZ-спироиндолинме тансульфонамида 1 .

Фильтровальную лепешку промывали 4 л МеОН/вода (50/50), к которому было добавлено 50 мл 28% водного NH₄OH. Фильтровальную лепешку промывали 2х4 л МеОН/вода (50/50) и сушили твердое вещество в вакуумной печи при 50°С в потоке азота, получая 2,03 кг (97%) заглавного продукта 1 в виде не совсем белого порошка. ЖХВР анализ твердых веществ показывал 93,7% продукта 1.

Пример 9.

Необязательная стадия выделения промежуточного продукта CBZ-спироиндоленина (8). Материалы:

Пиперидин-4-карбоксальдегид1-бензил карбамат (5)	12,37 г (0,050 моля)
Фенилгидразин	5,41 г (0,050 моля)
Трифторуксусная кислота (TFA)	11,56 мл, 17,10 г (0,150 моля)
Метиленхлорид	500 мл

CBZ-альдегид 5 растворяли в дихлорметане в 1 л колбе, оборудованной магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием. Полученный раствор охлаждали до 0°С. Фенилгидразин добавляли через подвешенный шприц в течение 5 мин и поддерживали температуру от -1 до 3°С, в то время как азот непрерывно барботировали через реакционную смесь. ТСХ и ЖХВР анализы показывали полное расходование CDZальдегида 5 и появление незначительного избытка (<2%) фенил-гидразина. Условия ТСХ: Silica, E.Merck Kieselgel G-60 F254 0,25 mm; диэтиловый эфир/пентан (4/1 ); проявляющий агент 0,5% сульфат церия, 14% молибдат аммония в 1 0% водной серной кислоте с нагреванием; Rf: альдегид 5=0,52, фенилгидразон 7=0,61, фенилгидразин 6+0,21 . Условия ЖХВР 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax при 30°С с потоком 1,0 мл/мин и детекцией при 254 нм; градиентная шкала:

Время удерживания: фенилгидразин 6=4,5 мин, толуол=7,2 мин, фенилгидразон 7=11,4 мин.

Реакционную смесь выдерживали в течение 1 0 мин при 0-2°С и добавляли TFA с помощью шприца, поддерживая температуру 2 и 7°С. Реакционную смесь нагревали в течение 30 мин до температуры 35°С, которую поддерживали в течение 1 7 ч. Прекращали барботировать азот через реакционную смесь и поддерживали медленный ток азота над реакционной смесью. В течение первого часа при 35°С раствор постепенно темнел до розово-фиолетового, а затем до темно-зеленого и образовывалось относительно небольшое количество белого кристаллического осадка (трифторацетата аммония). После выдерживания в течение 17 ч анализ ЖХВР (условия те же, что выше) показывал, что реакционная смесь содержала 93% индоленина 8 и оставалось <0,5% непрореагировавшего фенилгидразона. Выдерживание смеси в течение более длительных периодов времени не повышало экспериментального выхода индоленина 8. Реакционную смесь охлаждали до 10°С и добавляли смесь, содержащую 60 мл 28-30% гидроксида аммония 90 мл воды и 1 50 г измельченного льда при хорошем перемешивании. Цвет смеси менялся до лососиного. Отделяли органическую фазу и промывали дважды 400 мл воды, а затем 100 мл насыщенной водной НС1. Сушили органическую фазу над сульфатом магния и фильтровали через слой 5 г двуокиси кремния. Выпаривали фильтрат и получали 15,87 г (99%) индоленина 8 в виде бледно-оранжевого масла.

Пример 10.

Методика получения CBZСпироиндолина-метансульфонамида (1) без выделения промежуточного продукта CBZСпироиндолин (9).

Стадия 1. CBZ-Спироиндолин (9).

Материалы:

Пиперидин-4-карбоксальдегид-1 бензил карбамат (5)	49,5 г (0,20 моля
Фенилгидразин (Aldrich)	23,7 г (0,22 моля
Трифторуксусная кислота (TFA)	75, 4 г (0, 66 моля
Толуол (KF<250 мл/г)	654 мл
МеСЫ (KF<250 мл/л)	13,3 мл
NaBN₃	11,3 г (0,20 моля
Толуол	20 мл
МеОН	50 мл

Готовили 2% (по объему) раствор МеОН в толуоле, используя 654 мл толуола и 13,3 мл МеСЫ. В 2 л 3-горлой колбе, оборудованной механической мешалкой, дегазировали 617 мл указанного выше раствора путем пропускания тонкой струи азота через раствор в течение 5 мин. Добавляли фенилгидразин и TFA к раствору еще при дегазации.

Растворяли CBZ-альдегид 5 в оставшемся растворе, приготовленном выше (50 мл) и дегазированном путем барботирования азота через раствор в капельной воронке. Раствор в колбе нагревали до 35°С и медленно добавляли раствор альдегида к фенилгидразину-TFA в течение 2 ч. Смесь выстаивали при 35С в течение 16 ч.

Условия ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax при 50°С с потоком 1 мл/мин и детекцией при 220 нм; изократические 55% MeCN, 45% 0,1% водной Н₃РО₄. Типичная ЖХВР картина после 1 6 ч выстаивания:

Время удерживания (мин)	Поверхн.%	Идентичность
1,6	0,1-0,5	Фенилгидразин 6
4,1	<0,1	Димер 21
4,7	<0,1	Альдегид 5
5,0	NA	Спироиндолин 9
6,3	NA	Толуол
6,9	97	Спироиндоленин 8
10,3	<0,2	Фенилгидразон 7
	2-3 всего	Другие примеси <0,2% еа.

Смесь охлаждали до -10°С и добавляли МеОН. Добавляли суспензию боргидрида натрия в 20 мл толуола небольшими порциями (1 мл) в течение 30 мин, следя, чтобы температура не превышала -2°С.

Поверхн.%	Идентичность
0,1-1	Фенилгидразин 6
85-90	CBZ-Спироиндолин 9
<0,1	CDZ-Спироиндоленин 8
10-15 всего	Другие примеси (<3% еа.)

Повышали температуру до 1 0°С за 1 ч и добавляли 6% водный аммиак (200 мл). Смесь перемешивали в течение 1 0 мин, давали осесть в течение еще 1 0 мин и удаляли нижнюю водную фазу. Добавляли ацетонитрил (20 мл) и МеОН (20 мл) к органической фазе и промывали ее 150 мл 15% (солевого раствора). Установили, что органическая фаза содержала CBZспироиндолина 9 с 92% экспериментальным выходом.

Стадия 2. CBZ-Спироиндолинметансульфонамид (1 ).

Материалы:

CBZ-Спироиндолин (9) (м.в.=322,51)	(0,184 моля)
Метансульфонилхлорид	21,1 г (0,184 моля)
DIEA (KF=150 мг/л)	29,7 г, 40 мл (0,230 моля)
THF (KF=41 мг/л)	150 мл

Сырой раствор раствора CBZспироиндолина 9 из стадии 1 , представленной выше, концентрировали в 1 л 3-горлой колбе (60-70°С, 150-200 Torr) до получения 250 г остатка. Добавляли TNF и DIEA и полученный гомогенный раствор охлаждали до 0°С. Загружали 1 25 мл капельную воронку метансульфонилхлоридом и 50 мл THF. Добавляли в течение 2 ч раствор MsCl в THF к реакционной смеси, поддерживая температуру от 0 до 4°С и выдерживали смесь в течение 2 ч при 5-8°С. Добавление было слегка экзотермическим. Во время добавления образовывался белый осадок, предположительно DIEA-гидрохлорид. Условия ЖХВР были те же, что и выше. Анализ ЖХВР показал, что реакция завершилась через 1 ч после завершения добавления (9 не было обнаружено) и экспериментальный выход 9 составил 94%. Время удерживания: 1=7,8 мин.

Типичная ЖХВР картина реакционной смеси после 2 ч выдерживания:

Поверхн.%	Идентичность
<0,1	CBZ-Спироиндолин 9
90-92	CDZ-Сульфонамид 1
8-10 всего	Другие примеси (<2% еа.)

Смесь нагревали до 20°С и добавляли 200 мл 1М водной НС1. Смесь нагревали до 50°С и отделяли водную фазу. Промывали органическую фазу последовательно 100 мл воды, 100 мл водного раствора бикарбоната натрия и 1 00 мл воды. Органическую фазу переносили в 1л 3горлую колбу, оборудованную механической мешалкой и устройством для дистилляции. Смесь (около 400 мл) дистиллировали при атмосферном давлении до получения 150 мл дистиллята. Температура верха достигала 107°С; температура в кубе составляла 110°С. Дистилляция продолжалась при непрерывном добавлении нпропанола с такой скоростью, чтобы поддерживать постоянный объем (около 350 мл) в кубе. Прекращали дистилляцию, когда было добавлено общее количество 525 мл н-РгОН и собирали общее количество дистиллята 800 мл.

Во время замены растворителя температура как верха, так и куба повышалась с 94°С до 98°С. Толуол и н-РгОН образовывали азеотроп, кипящий при 97°С, состоящий из 47% толуола и 52,5% н-РгОН. Смеси давали охладиться постепенно до 20°С в течение 3 ч и выдерживали в течение 1 2 ч. Найдено, что маточный раствор содержал 2% толуола и 4 мг/мл сульфонамида. Растворимость сульфонамида в различных смесях толуола и н-РгОН определяли анализом ЖХВР:

% толуола в н-РгОН	Растворимость 1 в мг/мл
0	2,36
5	3,02
10	4,23
20	7,51
25	10,3

Кристаллическую суспензию фильтровали и промывали 3х10 мл н-РгОН. Продукт сушили в вакуумной печи при 50°С с пропусканием азота в течение 16 ч и получали 65,6 г (82% от альдегида 5) продукта 6 в виде рыжеватокоричневого твердого вещества с 93,5 вес.% чистоты.

Типичная ЖХВР картина твердого вещества:

Поверхн.%	Идентичность
<0,1	CBZ-спироиндолин
>99	CBZ-сульфонамид 1
<1 всего	другие примеси (<0,2% еа.)

Для дополнительной очистки растворяли 40,0 г образец сульфонамида, кристаллизованного из н-РгОН в 134 мл EtOAc при 60°С и обрабатывали с помощью 8,0 г Darco G-60 в течение 1 ч при 60°С. После добавления 2,0 г So1kafloc™ суспензию фильтровали через слой 4,0 г Solka-floc™ и промывали слой 90 мл EtOAc при 60°С. Перед добавлением угля раствор имел коричневый цвет. Фильтрование протекало хорошо, без закупоривания и давало золотистожелтый фильтрат. Фильтрат перегоняли при атмосферном давлении в 500 мл колбе (температура куба 80-85°С) до 100 г (100 мл) остатка. Этому раствору давали охладиться до 35°С в течение 3 ч. В течение 1 ч добавляли 116 мл циклогексана при хорошем перемешивании при 35°С. Смесь охлаждали до 20°С в течение 1 ч и выдерживали при 20°С в течение 12 ч. При 35°С кристаллизовалось большее количество сульфонамида и смесь становилась густой. Добавление циклогексана при 20°С делает перемешивание затрудненным. После выстаивания найдено, что надосадочная жидкость содержит 2,5 мг 1/г. Фильтровали кристаллическую суспензию и промывали фильтровальную лепешку 77 мл циклогексана/EtOAc (2:1) и 2х77 мл циклогексана. Сушили продукт в вакуумной печи при 50°С под потоком азота в течение 1 6 ч, получая 34,2 продукта 1 (М.В.=400,3) в виде белого кристаллического твердого вещества (85% выделение из сырого 1, 70% из 5 с >99,9 вес.% чистотой).

Пример 11.

НО соль спироиндолина-метансульфонамид (1а).

Материалы:

CBZ-Cпироиндолин-метансульфонамид (1)	941 г (2,35 молей)
Катализатор Пирлмана (Pearlman) 20% Pd(OH)2/C	188 г
THF	8 л
МеОН	7 л

Катализатор суспендировали в 7 л МеОН и переносили в 18,9 л автоклав с последующим добавлением раствора 1 в 8 л THF. Смесь гидрировали при 25°С при 5,62 кг/см² Н₂. Через 2,5 ч температуру повышали до 35°С в течение 30 мин. ЖХВР анализ показывал полную утилизацию CBZ-спироиндолин-метансульфонамида. Условия ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax с потоком 1,5 мл/мин и детекцией при 254 нм.

Градиентная шкала:

Время (мин)	0,1% водн. РзРO₄:МеСN
0	70:30
3	70:30
12	20:80
25	20:80

время удерживания спироиндолин=7,6 мин; СВ2-спироиндолин-метансульфонамид=3,6.

Смесь продували азотом и удаляли катализатор фильтрованием через Solka-floc™ пока еще смесь была теплой. Катализатор промывали 4 л THF и 2 л МеОН. Бледно-желтые фильтраты концентрировали до густого масла при 10 мбар и <25°С. Замену растворителя проводили медленно, добавляя в 15 л EtOAc и повторно концентрируя до сухого состояния. Остаток отверждался с получением твердой не совсем белой массы. Добавляли МеОН (1,5 л) и смесь нагревали до 70°С, получая гомогенный раствор. Пока раствор находился при температуре 70°С, добавляли 10,5 л EtOAc при 20°С. Температура опускалась до 40°С, и смесь оставалась гомогенной.

Последующие эксперименты давали основание полагать, что нам более удобно заменять растворитель фильтратов MeOH-THF на МеОН, концентрировать до желаемого объема, а затем добавлять EtOAc. Это позволяет избежать затвердения остатка после концентрирования раствора EtOAc.

Хлорид водорода, разбавленный приблизительно равным объемом азота, пропускали в раствор. Температура поднималась до 60°С в течение 1 5 мин, и образовывался белый осадок гидрохлоридной соли. Разбавление НО азотом лишь позволяет избежать засасывания реакционной смеси обратно и не является обязательным.

Смесь охлаждали на ледяной бане и продолжали в течение 1 ч добавлением хлорида водорода. Температура постепенно опускалась до 20°С. Суспензию выдерживали в течение 2ч, в то время как температура снижалась до 10°С. Кристаллический продукт выделяли фильтрованием и промывали фильтровальную лепешку 3 л EtOAc. Сушили в вакуумной печи при 35°С, получая 1,18 кг (86%) заглавного продукта 1а в виде не совсем белого кристаллического твердого вещества >99% чистоты, согласно анализу ЖХВР. Условия ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax с потоком 1,5 мл/мин и детекцией при 230 нм; изократический 35% MeCN, 65% с 0,1% водного ацетата аммония. Время удерживания: 1а=5,4 мин.

Пример 12.

Спироиндолин-метансульфонамид (форма свободного основания) (1 b).

250 мл аликвоты фильтрата из Cbzгидрогенолиза, содержащую 4,67 вещества 1b (свободное основание), концентрировали приблизительно до 1 0 мл. Остаток растворяли в 20 мл EtOAc, и раствор концентрировали снова приблизительно до 1 0 мл. Эту операцию повторяли еще раз и к остатку добавляли 1 0 мл EtOAc. Начинал образовываться кристаллический осадок. МТВЕ (20 мл) добавляли с одной порцией. Дополнительно осаждалось кристаллическое твердое вещество, но надосадочная жидкость еще содержала значительное количество растворенного продукта, который не выпадал в осадок при отстаивании. В течение 2 ч добавляли в смесь по каплям гексаны (70мл) при энергичном перемешивании. Медленное добавление гексанов необходимо, чтобы избежать вымасливания амина.

Перемешиваемую смесь выдерживали в течение 1 ч и фильтровали. Фильтровальную лепешку промывали 20 мл МТВЕ-гексанов, а затем 20 мл гексанов. Продукт сушили под потоком азота, получая 3,86 г (82%) свободного амина вещества 1 b в виде не совсем белого кристаллического твердого вещества >99,5% чистоты. Условия ЖХВР: 25 см колонка RXC8 Dupont Zorbax с потоком 1,5 мл/мин и детекцией при 230 нм; изократический 35% MeCN, 65% с 0,1% водного аммония ацетат. Время удерживания: 1b=5,4 мин.

Пример 13 А.

Спироиндолин-метансульфонамид (форма свободного основания) (1 b). Материалы:

CDZ-Спироиндолин-сульфонамид (1)	833,5 г (2,08 моля)
Pd(OH)2 (20% веса Pd(OH)2	124,5 (15%)
THF	6,5л
МеОН	19,5 л
NH4OH (конц.)	60 мл

Гидрирования проводили три (3) раза по причине ограничений, связанных с оборудованием; способ же этот рассчитан на один прогон. CBZ-спироиндолин сульфонамид 1 растворяли в THF (6,5 л, KF=53 мкг/мкл) и затем добавляли МеОН (KF=1 8 мкг/мкл, 4л), с последующим добавлением катализатора, и суспензию переносили в 18,9 л автоклав. Остаток МеОН (2,5 л) использовали для орошения. Смесь нагревали до 40°С при 3,5 кг/см² в течение 24 ч. Загрузка катализатора и время реакции являются функцией от чистоты исходного материала 1 . Материал был уникальный, требующий >15% катализатора и длительного времени реакции. Более чистые партии спироиндолина требовали лишь 5% катализатора и 4-6 ч времени реакции.

По завершении (<0,1 A% 1 по ЖХ) смесь фильтровали через Solka-floc™ и угольную лепешку промывали МеОН (13 л), содержащего NH₄OH (0,5%, 60 мл). Объединенные фильтраты (анализ показывает 1587 г амина спироиндолина 1 b) концентрировали в вакууме и полученные в результате твердые вещества разделяли между 40 л (толуола: TNF (3:1) и 0,5N NaOH (18 л)). Хотя слои разделялись легко, в водном слое можно было видеть тяжелый осадок. Водную суспензию экстрагировали CH₂Cl₂ (15 л). Водный и органический слои разделялись медленно. До добавления СН₂С1₂ добавляли TNF в водный слой вместе с достаточным количеством NaCl для насыщения слоя. Однако растворение продукта не достигалось, что обусловливало необходимость применения CH₂Cl₂.

Объединенные слои толуола, TNF и СР₂С1₂объединяли и концентрировали в концентраторе непрерывного действия. Остаток промывали 7 л CH3CN. В завершение добавляли 1 0 л CH3CN, и раствор оставляли стоять в течение ночи в атмосфере N2.

Пример 13В.

CDZ-Спироиндолин-сульфонамид (1)	3 кг (7,49 молей)
Darco G-60	600 кг
Этилацетат	36 л
Абсолютный этанол	189 л
10% Pd/C	450 г
Раствор аммиака	500 мл
Solka-floc™	2,5 кг
Изопропилацетат	65 л

Смесь CBZ-Спироиндолина (1) (1 кг) и Darco G-60 (200 г) в этилацетате (9 л) перемешивали и нагревали при 60-65°С в атмосфере азота в течение 8 ч. Удаляли Darco фильтрованием при 60-65°С, промывали твердое вещество этилацетатом (3 л) и объединяли фильтрат и промывки. ЖХ вес/вес анализ подтвердил незначительную потерю Darco. Раствор этилацетата выпаривали досуха в вакууме, используя 20 л аппарат Buchi, а затем промывали абсолютным этанолом (2х5 л) . Этот материал затем суспендировали в абсолютном этаноле (8 л), нагревали до 65-70°С и помещали в 20 л автоклав. Загрузочную партию затем орошали абсолютным этанолом (1 л). Суспензию 10% палладия на древесном угле (75 г, 7,5% по весу) в абсолютном этаноле (750 мл) затем добавляли в автоклав и орошали внутри дополнительной порцией абсолютного этанола (250 мл).

Загрузочную партию затем гидрировали при 65°С и энергичном помешивании при давлении водорода 2,8 кг/см² в течение 3 ч, добавляли вторую порцию 1 0% палладия на древесном угле (75 г), партию гидрировали дополнительно в течение 2 ч и герметически закрывали на ночь. Загрузочную партию переносили (еще горячую, 60-65°С) в аппарат Buchi и дегазировали в вакууме, удаляя муравьиную кислоту путем подачи и вытекания абсолютного этанола (всего 1 8 л).

Процедуру повторяли дважды и три загрузочных партии объединяли в 38-литровом реакторе с внутренним стеклянным покрытием и вновь дегазировали объединенную партию добавлением и дистилляцией (в вакууме) абсолютного этанола (2х10 л). Добавляли Solkafloc™ (0,5 кг) к партии и орошали внутри этанолом (10 л). Загружали фильтр Estrella Solkafloc™ (2 кг) в виде суспензии в этаноле (20 мл). Полученную в результате смесь нагревали до 60-65°С и затем пропускали при этой температуре через нагретый фильтр с помощью насоса в два бункера из нержавеющей стали. Исходный реактор, фильтр, насос и трубопроводы промывали горячей (60-65°С) смесью водного аммиака (500 мл) в абсолютном этаноле (25 л). Объединяли фильтрат и промывки в двух бункерах из нержавеющей стали.

Загрузочную партию затем переносили в сосуд с помощью внутрилинейного фильтра, со вставленным 1 0-микронным картриджем, затем концентрировали в вакууме до незначительного объема (~1 5 л). Этанол заменяли изопропилацетатом путем подачи и вытекания 3-х загрузочных объемов изопропилацетата (всего 45 л), поддерживая загрузочный объем, равный ~1 5 л. После завершения замены растворителя, по завершении, загрузка содержала <1% по данным ГХ. Загрузочную партию затем разбавляли до ~33 л, добавляя изопропилацетат (20 л) и этот раствор спироиндолина-амина 1 b (1 ,855 кг по ЖХ анализу) в изопропилацетате использовали на следующей стадии процесса.

Вос-0-Бензилсерин спироиндолин (11).

Материалы:

Спироиндолин (1b) 1587 г (5,966 молей)

Аминокислота (10) 1938 г (6,563 молей

P_h^o-Y^C°^2H

NHBOC

DCC	1334,5 г (6,563 молей)
HOBT	884 г (6,563 молей)
СНзСN	25 л
0,5N NaOH	18 л
0,5N HCl	18 л
насыщ. Nil 1СХО	18 л
изо РгОАс	28 л

Спироиндолин-амин 1b в СНзСN или изо РгОАс : H₂O (25 л) при температуре окружающей среды в атмосфере N₂ обрабатывали последовательно HOBT (884 г, 1,1 экв.) в виде твердого вещества, DCC (1334,5 г, 1,1 экв.) в виде расплава (нагревание в горячей воде при 60°С приблизительно в течение 1 ч) и, в конце, аминокислотой 10 (1938 г) в виде твердого вещества. Смесь перемешивали в течение 3 ч, по истечении которых образовался тяжелый осадок DCU, и ЖХ анализ показывал приблизительно 0,5 А% оставшегося амина lb. Добавляли IP Ac (9л), кашицу фильтровали через Solka-floc™ и промывали с помощью IPAc (19 л). Объединенный органический раствор промывали последовательно 0,5N NaOH (18 л), 0,5N HCl (18 л) и насыщенным №НС(О (18 л). Последняя промывка водой давала в результате эмульсию и поэтому была исключена.

Органический слой концентрировали в вакууме, и остаток растворяли в МеОН или EtOH (10 л конечный объем). Экспериментальный выход 3026 г (89%).

Использование альтернативных пептидных агентов сочетания, таких как карбонилдиимидазол, или образование смешанных ангидридов, таких как вторбутил карбонат, давало более низкий выход вещества 11 и/или 1 4 с высокой степенью эпимеризации в случае первого соединения. Другие пептидные агенты сочетания были недоступны из-за дороговизны.

Вос-0-Бензилсерин Спироиндолин (11). Материалы:

Спироиндолин-амин (1b)	1,855 кг (6,96 молей)
Изопропилацетат	29 л
Дициклогексилкарбодиимид (DCC)	1,58 кг (7,65 молей)
1-Гидроксибензтриазол (HOBt)	1,03 кг (7,62 молей)
^Вос-0-бензил-О-Серин	2,26 кг (7,65 молей)
1М водный раствор гидроксида натрия	26 л
0,5М водный раствор соляной кислоты	26 л
Насыщ. водный раствор гидрокарбоната натрия	26 л
Абсолютный этанол	50 л

Добавляли воду (20 л) к помешиваемому раствору спироиндолин-амина 1 b (1 ,855 кг) в изопропилацетате (33 л) в реакционном сосуде, затем последовательно добавляли следующие химические вещества при комнатной температуре в атмосфере азота: DCC (1,58 кг, 1,1 экв.), HOBt (1,03 кг, 1,1 экв.) и в конце N-Boc-0бензил-О-Серин (2,26 кг, 1,1 экв.). Смывали реагенты изопропил-ацетатом (7 л). Загрузочную партию перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 5 ч, когда ЖХ показывала соотношение продукт/исходный материал, равное 99,4/0,6. Смесь затем фильтровали в другой сосуд, используя насос через фильтр Estrella с применением лишь ткани и картона. Сосуд, из которого удаляли смесь, ополаскивали изопропилацетатом (22 л) и им же ополаскивали фильтр, насос и шланги, соединяющие с принимающим сосудом. Перемешивали 2-фазную смесь в сосуде в течение 1 0 мин и затем давали осесть в течение 1 5 мин. Нижний водный слой отделяли и оставляли органический слой отстаиваться в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день промывали органический слой 1М водным раствором гидроксида натрия (26 л), затем 0,5М водным раствором соляной кислоты (26 л) и, в конце насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (26 л). ЖХ анализ показывал экспериментальный выход 3,787 кг, 93% от общего выхода, исходя из 7,49 молей (3 кг) исходного CBZспироиндолина (1). Партию концентрировали в вакууме (внутренняя температура=13-15°С, температура кожуха=40°С, вакуум=36 мм) до незначительного объема (~15 л) и заменяли растворитель на этанол путем подачи и вытекания этанола (50 л) при одновременном поддержании объема на уровне ~15 л ГХ показывала <1% оставшегося изопропил ацетата. Этот раствор использовали на следующей стадии процесса.

0-Бензилсерин спироиндолин (форма свободного основания) (1 2). Материалы:

Вос-0-Бензилсерин спироиндолин (11)	3026 г (5,57 молей)
Метансульфоновая кислота ^sOH)	1,16 л (17,9 молей)
МеОН	10 л
изо РгОАс	24 л
0,5N NaOH	35 л

Вос-0-Бензилсерин спироиндолин 11 в 1 0 л МеОН (или EtOH) обрабатывали с помощью чистой Ms ОН (1,16 л), которую добавляли при45 близительно в течение 30-40 мин (начальная температура 16°С, конечная температура 28°С). Темно-красный раствор выдерживали в течение ночи в атмосфере N₂. Смесь затем подавали насосом в 100 л экстрактор, содержащий 24 л изо РгОАс и 35 л 0,5N NaOH. рН водного слоя равно 7. Добавляли NaOH (6M) до тех пор пока рН не становилось >10,5. По мере возрастания рН раствор изменял цвет от красного к желтому. Слои разделяли, и органический слой по данным ЯМР, содержал 13 моль% МеОН в изо РгОАс [5 об.%] . ЖХ анализ 2,48 кг.

Вос-0-Бензилсерин спироиндолин (11)	3,787 кг (6,96 молей)
Метансульфоновая кислота	2,006 кг (20,87 молей)
Изопропилацетат	38 л
1М водный раствор гидроксида натрия	16 л
50% водный раствор гидроксида натрия	1,6 л

Метансульфоновую кислоту (2,006 кг, 1,355 л ~3 эквивалента) добавляли к перемешиваемому раствору Вос-0-бензилсерина спироиндолина (11) (3,787 кг) в этаноле (общий объем ~15 л) в реакционном сосуде. Загрузочную партию нагревали до 35-40°С. Через 7 ч ЖХ показывала отсутствие исходного материала и реакционной массе давали охладиться до комнатной температуры в течение ночи. На следующий день в загрузочную партию добавляли воду (44 л) при помешивании. Партию охлаждали до ~5°С, перемешивали в течение 30 мин, а затем фильтровали через внутрилинейный фильтр (с вставленным 1 0 мкм картриджем) в бункер. Затем партию перекачивали обратно в сосуд. Ополаскивали водой (1 0 л) сосуд и трубки, ведущие в бункер, и тем же объемом перекачивали жидкость после ополаскивания обратно в сосуд. Доблавляли изопропилацетат (38 л), а затем 1М водный раствор гидроксида натрия (16 л). Партию охлаждали до 10-15°С, устанавливали, что рН нижнего водного слоя равно ~7 и добавляли 50% водный раствор гидроксида натрия (1,6 л) (рН>1 0). Партию перемешивали при 10-1 5°С в течение 25 мин и затем давали осесть в течение 10-15 мин. Отделяли нижний водный слой (78,1 кг). Проба ЖХ показывала, что в водных растворах содержалось 28,4 г вещества 1 2 (0,85% от теории). Объем органического раствора составлял 51 л. Проба ЖХ показывала 3,057 кг, 92% общего выхода из 3 кг, 7,49 молей CBZспироиндолина сульфонамида (1). Этот раствор использовали на следующей стадии.

Вос-Аминоизобутирил 0-бензилсерин спироиндолин (1 4).

Материалы:

Спироиндолин амин (12) 2481 г (5,57 молей)

Пептид аминокислоты (13) 1247,1 г (6,16 молей) сн₃ сн₃HOgC^SjH-BOC

DCC	1266,7 г (6,16 молей
новт	827 г (6,16 молей)
IPAc	52 л
H2O	37 л
0,5N NaOH	36 л
0,5N HC1	36 л
насыщ. №11СО₃	36 л

Раствор амина 1 2 в IPAc разбавляли до общего объема 39 л с помощью IPAc и добавляли 37 л H₂O. Двухфазную смесь затем обрабатывали последовательно НОВТ (827 г) в виде твердого вещества, DCC (1266,7 г) в виде расплава и аминокислотой 1 3 при температуре окружающей среды в атмосфере. Реакционную смесь перемешивали в течение 2ч, по истечении которых ЖХ анализ показывал исчезновение исходного материала 1 2 (<0,3 А%). Смесь фильтровали Solka-floc™ и твердые вещества промывали с помощью 1 3 л IPAc. Материал может на данной стадии храниться в виде двухфазной смеси, в течение ночи.

Смесь переносили в 1 00 л экстрактор, отделяли водный слой и промывали органический слой последовательно 36 л 0,5N NaOH, 0,5N HCl и насыщенного №НСХ')₃. Экспериментальный выход 3160 г (81% от спироиндолина ± 5% на ошибку измерения объема). Раствор концентрировали до небольшого объема и промывали этанолом (2х4 л). По желанию промежуточное соединение 1 4 может быть выделено добавлением воды для кристаллизации.

Использование альтернативных пептидных агентов сочетания, таких как карбонилдиимидазол, или образование смешанных ангидридов, таких как вторбутил карбонат, давало более низкий выход вещества 1 4 с высокой степенью эпимеризации. Другие пептидные реагенты сочетания были недоступны из-за высокой стоимости.

Вос-Аминоизобутирил 0-Бензилсерин спироиндолин (14) Материалы:

Спироиндолин-амин (12)	3,057 кг (6,89 молей)
Дициклогексилкарбдиимид (DCC)	1,56 кг (7,56 молей)
1-Гидроксибензтриазол (HOBt)	1,02 кг (7,55 молей)
Вос-2-Аминоизомасляная кислота (13)	1,54 кг (7,58 молей)
Изопропилацетат	32 л
1М водный раствор гидроксида натрия	38 л
0,5М водный раствор соляной кислоты	38 л
Насыщ. водный раствор гидрокарбоната натрия	38 л
Абсолютный этанол	45 л

Добавляли воду (49 л) к перемешиваемому раствору спироиндолина амина 12 (3,057 кг) в изопропилацетате (общий объем ~51 л) в реакционном сосуде при комнатной температуре в атмосфере азота. Затем последовательно использовали следующие химические вещества: DCC (1,56 кг, ~1,1 экв.), HOBt (1,02 кг, ~1,1 экв.) и, в конце N-Boc-2-аминоизомасляная кислота 13 (1,54 кг, ~1,1 экв.). Смесь энергично перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч до тех пор, пока ЖХ не показывает завершения реакции. Смесь фильтровали в другой сосуд через фильтр Estrella с помощью насоса. Использовали изопропилацетат (22 л) для ополаскивания сосуда, фильтра, насоса и шлангов, связывающих с принимающим сосудом. Перемешивали затем 2-фазную смесь в течение 5 минут и давали слоям разделиться. Отделяли, без затруднений, нижний водный слой (вес водных растворов = 51,1 кг). Органический раствор затем последовательно промывали 1М водным раствором гидроксида натрия (38 л), 0,5М водной соляной кислотой (38 л) и, в конце, без затруднений, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (38 л).

Органический раствор затем переносили с помощью насоса через внутрилинейный фильтр (содержащий 1 0 мкм картридж) в другой сосуд для замены растворителя на этанол. Сосуд ополаскивали изопропилацетатом (10 л) и его же использовали для ополаскивания насоса, фильтра и трубок, связывающих с принимающим сосудом. Объединяли фильтрат и промывки. Общий объем = 75 л (с помощью измерительного стержня). Проба ЖХ давала 4,395 кг Восаминоизобутирила 0-бензилсерина спироиндолина (14), т.е. 93% всего от 7,49 молей исходного CBZ-спироиндолина сульфонамида (1).

Загрузочную партию концентрировали в вакууме до небольшого объема (~1 5 л) и заменяли изопропилацетат на этанол путем подачи и вытекания абсолютного этанола (всего 45 л). В конце замены растворителя анализ ГХ показывал <1% остаточного изопропила ацетат. Этот раствор (25 л), содержащий 4,395 кг вещества 1 4, использовали на следующей стадии. По желанию, промежуточное соединение 1 4 можно выделить добавлением воды для кристаллизации.

Аминоизобутирил 0-Бензилсерин спироиндолин (15).

Материалы:

Вое Спироиндолин (14)	3160 г (5,03 молей
Метансульфоновая кислота (MsOH)	979 мл (15,1 молей
EtOH	6,2 л
H2O	30 л
IN NaOH	11 л
EtOAc	26 г
Активированный уголь Darco 60	1 кг

Растворяли Вос-Спироиндолин 14 в 6,2 л EtOH и обрабатывали с помощью МsОН (979 мл). Температура повышалась с 20 до 30°С и реакции давали протекать в течение ночи. Через 1 2 ч при 20°С еще оставалось 1 5 А% исходного материала, и смесь нагревали до 35°С в течение 6 ч. По завершении (<0,1 А% 1 4) реакцию охлаждали до 20°С и добавляли 30 л Н₂О, а раствор фильтровали через стеклянную воронку с полипропиленовым фильтром и отфильтровывали остаток DCU. Смесь переносили в 1 00 л экстрактор и добавляли 26 л EtOA. Водный слой подщелачивали добавлением охлажденного 1 N NaOH (11 л) и 1 л 50% NaOH. Для подтверждения температуры ниже 1 4°С требовалось добавление льда. Более высокие температуры приводили к большим трудностям, связанным с эмульгированием.

Органический слой перегоняли при 50°С приблизительно при 533 Hg до KF <1000 мкг/мл. Более низкие KF приводят к более эффективным обработкам углем и лучшему выделению на стадии образования соли. KF, равный 1 60 мкг/мл был достигнут при загрузке 700 г. Раствор разбавляли этилацетатом до общего объема 31 л (анализ ЖХ 2,40 кг). Добавляли активированный уголь (Darco G-60), и смесь перемешивали в течение 24 ч. Фильтровали смесь через Solka-floc™ и промывали фильтро49 вальную лепешку этилацетатом (16 л), анализ

2,34 кг.

Материалы:

Воc Спироиндолин (14)	4,395 кг (6,99 молей)
Метансульфоновая кислота	2,017 кг (20,99 молей
Этилацетат	185 л
1М водный раствор гидроксида натрия	16 л
50% водный раствор гидроксида натрия	2,6л
Darco G-60	900 г
Solka-floc™	2,5 кг

Добавляли метансульфоновую кислоту (2,017 кг, 1,36 л, ~3 экв.) к перемешиваемому раствору Воc спироиндолина 14 (4,395 кг) в этаноле (общий объем ~25 л) в реакционном сосуде при комнатной температуре. Загрузочную партию нагревали до 35-40°С и перемешивали в течение ночи. На следующий день партия содержала ~1,1 А исходного материала, и реакцию продолжали еще 4 ч, по истечении которых ЖХ показывали соотношение продукт/исходный материал, равное 99,6/0,4. Партию концентрировали в вакууме до объема ~15 л и затем разбавляли водой (44 л). Партию охлаждали до 5°С, перемешивали в течение 30 мин, а затем фильтровали через внутрилинейный фильтр Sparkler (содержащий 1 0 мкм картридж), используя насос, в другой сосуд и удаляли небольшое количество остаточного DCU.

Сосуд, насос, фильтр и шланги ополаскивали водой (10 л), и эту же воду добавляли в сосуд. Добавляли в сосуд этилацетат (36 л) и, перемешивая смесь, охлаждали ее до 1 0°С. Добавляли раствор холодного (5-10°С) 1М водного раствора гидроксида натрия (16 л) и холодного (5-10°С) 50% водного раствора гидроксида натрия (2,6 л) при 1 0°С и повышали температуру до 1 4°С. Полученную в результате смесь помешивали в течение 15 мин при <14°С, а затем отделяли нижний водный слой.

Загрузочную партию концентрировали в вакууме до объема ~20 л, а затем подавали внутрь смесь этилацетата (35 л) и этанола (5 л) при поддержании объема на уровне ~20 л. В конце этой дистилляции KF равнялось 9160 мг/мл^-1. Заменяли растворитель на этилацетат путем подачи и вытекания этилацетата (всего 40 л). В конце перегонки KF равнялось 446 мг/мл^-1. Партию разбавляли этилацетатом (10 л).

Добавляли Darco G-60 (900 г) к мутной смеси. Его смывали этилацетатом (6 л). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день добавляли Solka-floc™ (0,5 кг) к перемешиваемой в сосуде, а затем перемешивали Solka-floc™ (0,5 кг) в небольшом количестве этилацетата и загружали в фильтр Estrella. Избыточный растворитель откачивали через внутрилинейный фильтр Sparkler, содержащий 1 0 мкм картридж. Суспензию удаляли из сосуда через фильтр с помощью насоса, а затем через еще один фильтр в 2х40 л бункеры из нержавеющей стали. Визуальный осмотр показывал, что жидкости были прозрачными и чистыми. Сосуд ополаскивали этилацетатом (22 л) и использовали его же для прополаскивания трубопровода над бункерами из нержавеющей стали. Содержимое обоих бункеров переносили в реакционный сосуд и раствор тщательно перемешивали.

Загрузочную партию (58 л), которая имела KF 2950 мг/мл^-1, снова сушили, концентрируя в вакууме до объема 20-25 л. Партию разбавляли до объема 46 л (измерительный стержень) добавлением этилацетата (25 л). KF равнялось 363 мг/мл^-1. Партию разбавляли до объема 62 л добавлением этилацетата (1 7 л) и использовали на заключительной стадии процесса.

Спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил) карбонил]-2-(фенил-метил-окси)-2-амино-2метилпропанамид метансульфонат (1 6).

Материалы:

Амин (15)	2340 г (4,43 молей)
Метансульфоновая кислота (МsОН)	316 г (4,88 молей)
EtOAc	60 л
EtOH	4,8 л
8% EtOH и EtOAc	20 л

Объем раствора 15 из предшествующей стадии доводили до 60 л с помощью этилацетата и добавляли EtOH (4,8 л). Добавляли МsОН (316 мл) в 3 л EtOAc при 45 °С. К темно-красному гомогенному раствору добавляли 496 г затравки заглавного соединения формы I (использовалась 1 0% затравка, по весу от свободного амина). Температура повышалась приблизительно до 48 С, и реакционную смесь выдерживали при 52°С в течение 1 ,5 ч. Анализ показывал полное превращение в заглавное соединение (форму I) . (При менее, чем 1 0% затравке требовалось более длительное (>3 ч) выдерживания. Суспензии давали охладиться до 20°С в течение ночи и фильтровали в центрифуге в атмосфере N₂. Лепешку промывали 20 л 8% EtOH в EtOAc. Су51 щественным во время фильтрации является атмосфера N₂, потому что влажные кристаллы очень гигроскопичны. Партию сушили при 35°С в вакууме и получали 2,7 кг (56% общий выход) заглавного соединения (форма I) (99,9 А% чистоты; <0,1% энантиомера).

Конверсию формы II в форму I проводят также, получая соль в EtOAc-EtOH при добавлении М^ОН, как указано выше, и исходный раствор соли (при 55°С) охлаждают до 45 °С. При этой температуре начинают появляться кристаллы, и суспензия становится гуще со временем. Температуру затем поднимают до 51 °С, и суспензию выдерживают в течение ночи. Ожидается полное превращение соединения 16 в форму I. Этот способ можно также использовать для получения затравочных кристаллов формы I продукта 1 6.

Спиро[3Н-индол-3,4'-пипepидин)-1'-ил) карбонил]-2-(фенилметил-окси)-этил]-2-амино2-метилпропанамид метансульфонат (1 6).

Материалы:

Амин (15)	3,1 кг (5,86 молей
Метансульфоновая кислота	620 г (6,45 молей)
Этилацетат	37 л
Абсолютный этанол	8,7 л
Спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 'ил)карбонил]-2-фенилметил-окси) этил]-2-амино-2-метилпропанамид метансульфонат(форма I)	70 г (0,11 моля)

Добавляли абсолютный этанол (6,4 л) к раствору амина (15) (3,1 кг) в этилацетате (общий объем ~62 л) в реакционном сосуде. Партию нагревали до 50°С и добавляли раствор метансульфоновой кислоты (620 г, 41 2 мл, 1 ,1 экв.) в этилацетате (11 л) за ~5 мин при 50-54°С. Партию затравляли спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]2-амино-2-метил-пропанамидом метансульфонатом (форма I) (70 г) и полученную в результате суспензию перемешивали и нагревали при 55°С в атмосфере азота в течение ночи.

На следующий день суспензию охлаждали до 15-20°С, выдерживали в течение 2 ч и затем добавляли по каплям в 50 см полиэтиленовый фильтр в атмосфере азота. Твердый продукт промывали смесью абсолютного этанола (2,3 л) в этилацетате (26 л). Белый, твердый продукт соскребали и сушили в печи Apex в вакууме при 35°С в течение соответствующего периода времени (приблизительно два дня). Высушенный спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]- 1 '-ил)карбонил]-2(фенилметилокси)этил]-2-амино-2метилпропанамид метансульфонат (3,352 кг) просеивали, используя сито Jackson-Crockatt и получали 3,347 кг (включая затравку, 70 г), выход = 3,277 кг.

Условия ЖХВР.

ЖХ время удерживания на Zorbax RX-C8 (4,6 мм х 25 см), λ=210 нм, скорость потока = 1,5 мл/мин.

Соединение 1: 60:40 СН_;С\'-П_:О (1% Н^₄) RT=5,0 мин;

Соединение 1b: 35:65 СН_;С\'-П_:О (0,1 вес.% NH4OAc) RT=6,2 мин;

Соединение 10: 60:40 СН_;С\'-Н_:О (0,1 Н^₄) RT=2,9 мин;

Соединение 11: 60:40 СН3СН-Н2О (0,1% НзРO4) RT=5,4 мин;

Соединение 12: 40:60 СН_;С\'-Н_:О [рН 5,25 NaH₂PO₄ (6,9 г/л H₂O) (доведение рН с помощью NaOH)] RT=5,6 мин;

Соединение 14: 60:40 СН_;СХ-П_:О (0,1% НзРO4) RT=4,65 мин;

Соединение 15: 40:60 CH3CN-H2O [pH 5,25 NaH₂PO₄ (6,9 г/л H₂O)] доведение pH с помощью NaOH) RT=4,9 мин;

ЖХ время удерживания на Zorbax RX-C8 (4,6 мм х 25 см), λ=210 нм, скорость потока =1,2 мл/мин, температура колонки = 48°С. Растворитель А=0,05%. Фосфорная кислота +0,01%. Триэтиламин в воде.

Растворитель В - Ацетонитрил. Градиентная система:

Время, мин	% А	% В
0	95	5
35	10	90
38	95	5
40	95	5

Время удерживания (мин.).

Соединение 1	25,2
Соединение 1 b	8,5
Соединение 1 0	20,5
Соединение 11	26,3
Соединение 1 2	14,8
Соединение 1 4	25,6
Соединение 1 5	15,7
Пример 1 9.

Получение формы IN-[1(R)-(1 ,2-дигидро-1метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]- 1 '-ил)карбонил] -2-(фенилметил-окси)этил]2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Превращение формы II в форму I можно проводить по методике примера 18А, где образуется соль в EtOAc-EtOH при добавлении МsОН, и исходный раствор соли (при 55°С) охлаждают до 45°С. При этой температуре должны начинать появляться кристаллы и суспензия становиться гуще со временем. Температуру затем поднимают до 51°С, и суспензию выдерживают в течение ночи. Нужно ожидать полного превращения в форму 1 .

Пример 20.

Получение формы I N-| 1(%)-(1.2-дигидро1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]- 1'-ил)карбонил] -2-(фенилметил-окси)этил]2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Превращение формы II в форму I проводят перемешиванием раствора формы II N-| 1 (R)(1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4 '-пиперидин] -1 '-ил)карбонил]-2 -(фенилметил-окси)этил-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в изопропаноле приблизительно при 25°С в течение приблизительно 2-24

ч.

Пример 21.

Получение формы IV №[1Щ)-(1,2-дигидро-1-метансульфонил-спиро|3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил]карбонил]-2-(фенилметил-окси) этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Образец 8,4 г ^[1Щ)-(1,2-дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'-пиперидин]1'-ил)карбонил]-2-(фенилметил-окси)-этил]-2амино-2-метилпропанамида метансульфоната неопределенной морфологической формы растворяют в смеси 24,8 мл этилацетата 1,6 мл этанола и 1,95 мл воды с помешиванием при 42°С. Растворитель выпаривают из раствора при температуре 40°С, полученное в результате твердое вещество растирают в ступке до тонкого порошка и подвергают этот тонкий порошок воздействию относительной влажности приблизительно 75%, получая заглавную форму IV.

Пример 22.

Получение формы IV ^[1Щ)-(1,2-дигидро-1-метансульфонил-спиро[3Н-индол-3,4'пиперидин]-1'-ил)карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Пробу N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 '-ил) карбонил] -2-(фенилметил-окси)этил] -2-амино-2метилпропанамида метансульфоната неопределенной морфологической формы перекристаллизируют из раствора этилацетат - этанол - вода (в объемном соотношении 24,8/1,6/1,95) и получают заглавную форму IV.

Пример 23.

Получение формы IV ^[1Щ)-(1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин] -1 '-ил)карбонил] -2-(фенилметил-окси) этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната.

Суспензию формы I ^[1Щ)-(1,2-дигидро1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил] -2-(фенилметил-окси)-этил] -2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в смеси изопропилацетат/этанол (в объемном соотношении 90:10), содержащую приблизительно 2,8 вес.% воды перемешивают приблизительно при 25°С в течение ночи и выделяют полученное в результате твердое вещество.

Специалистам в данной области понятно, что, несмотря на описание настоящего изобретения и иллюстрирование его с помощью соответствующих конкретных включений и ссылок, могут быть сделаны без отрыва от сущности и диапазона вариантов изобретения различные изменения модификации, замены, удаления или добавления, могут быть использованы в методиках способов. Например, могут быть применены, в зависимости от различных реакций млекопитающего, подвергаемого лечению по поводу любых из показаний с помощью указанных выше соединений изобретения, эффективные дозы, отличающиеся от тех, которые приведены здесь. Подобным же образом, наблюдаемые специфические фармакологические реакции могут варьировать соответственно и в зависимости от выбранного конкретного активного соединения или имеющегося фармацевтического носителя, так же как и от типа композиции и используемого способа введения, и такие ожидаемые варианты или различия в результатах рассматриваются в соответствии с объектами и практическими способами применения данного изобретения. Желательно, поэтому чтобы изобретение рассматривалось в диапазоне заявленных пунктов формулы изобретения, которые следуют ниже и чтобы в пределах разумного эти пункты толковались как можно шире.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1 . Полиморфная форма соединения N[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил] -2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид метансульфонат, обозначенная как форма I, которая характеризуется диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями приблизительно при: 6,5; 14,7; 16,9; 17,1; 17,9; 19,5; 21,1; 21,7 и 22,0° (2 тета).
2. Полиморфная форма по п.1, характеризующаяся эндотермой плавления с экстраполированной начальной температурой приблизительно 170°С при нагревании в калориметрической камере дифференциального сканирования при скорости нагревания 10°С/мин в атмосфере азота.
3. Полиморфная форма по п.1, которая имеет растворимость в изопропаноле 4,6 мг/мл.
4. Полиморфная форма по п.1, которая имеет двойное лучепреломление в поляризованном свете.
5. Полиморфная форма соединения N[ 1 (R')-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил] -2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид метансульфонат, обозначенная как форма IV, которая характеризуется диаграммой рентгеновской порошковой дифракции с основными отражениями приблизительно при: 16,0; 16,2; 18,3; 20,1; 21,0 и 24,2° (тета).
6. Полиморфная форма по п.5, характеризующаяся эндотермой потери воды при температуре приблизительно 45°С с последующей эндотермой с экстраполированной начальной температурой приблизительно 129°С при нагревании в калориметрической камере дифференциального сканирования при скорости нагревания 1 0°С/мин в атмосфере азота.
7. Полиморфная форма по п.5, которая содержит приблизительно 3,5 моля воды на моль N-[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1 '-ил)карбонил] -2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид метансульфоната.
8. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество полиморфной формы по п. 1 .
9. Фармацевтическая композиция, полезная для лечения остеопороза, которая включает комбинацию бисфосфонатного соединения и полиморфной формы по п. 1.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, где бисфосфонатным соединением является алендронат.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество полиморфной формы по п.5.
1 2. Фармацевтическая композиция, полезная для лечения остеопороза, которая включает комбинацию бисфосфонатного соединения и полиморфной формы по п.5.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, где бисфосфонатным соединением является алендронат.
1 4. Способ повышения уровней эндогенного гормона роста у человека или у животного, который включает введение такому человеку или животному эффективного количества полиморфной формы по п. 1 .
1 5. Способ повышения уровней эндогенного гормона роста у человека или у животного, который включает введение такому человеку или животному эффективного количества полиморфной формы по п. 1 и дополнительного стимулятора секреции гормона роста.
16. Способ по п.15, где дополнительный стимулятор секреции гормона роста выбирают из группы, включающей пептид, высвобождающий гормон роста GHRP-6; пептид, высвобождающий гормон роста GHRP-2; пептид, высвобождающий гормон роста GHRP-1 ; ВНТ920; фактор высвобождения гормон роста; аналог фактора высвобождения гормон роста роста; IGF-1 и IGF-2.
1 7. Способ повышения эффективности кормов, усиления роста, повышения производства молока и улучшения качества туши домашнего скота, включающий введение таким домашним животным эффективного количества полиморфной формы по п. 1 .
1 8. Способ лечения или предупреждения состояний, выбранных из группы, включающей: остеопороз; катаболическую болезнь; иммунодефицит, включая таковой у индивидуумов с депрессией соотношения Т₄/Т₈-клеток; перелом бедра; мышечно-скелетные нарушения у пожилых людей, дефицит гормона роста у взрослых и детей; ожирение; кахексию и потерю белка, связанные с хроническим заболеванием, таким как СПИД или рак; лечение пациентов, выздоравливающих после обширных хирургических вмешательств, ран и ожогов, у больных, нуждающихся в таком лечении, который включает введение пациенту эффективного количества полиморфной формы по п. 1 .
19. Способ лечения остеопороза, который включает введение пациенту с остеопорозом комбинации бисфосфонатного соединения и полиморфной формы по п. 1 .
20. Способ по п.19, где бисфосфонатным соединением является алендронат.
21 . Способ повышения уровней эндогенного гормона роста у человека или животного, который включает введение такому человеку или животному эффективного количества полиморфной формы по п.5.
22. Способ повышения уровней эндогенного гормона роста у человека или животного, который включает введение такому человеку или животному эффективного количества полиморфной формы по п.1 и дополнительного стимулятора секреции гормона роста.
23. Способ по п.22, где дополнительный стимулятор секреции гормона роста выбирают из группы, включающей пептид, высвобождающий гормон роста GHRP-6; пептид, высвобождающий гормон роста GHRP-2; пептид, высвобождающий гормон роста GHRP-1; ВНТ920; фактор высвобождения гормона роста; аналог фактора высвобождения гормона роста; IGF-1 и IGF-2.
24. Способ повышения эффективности кормов, усиления роста, повышения производства молока и улучшения качества туши домашнего скота, включающий введение таким домашним животным эффективного количества полиморфной формы по п.5.
25. Способ лечения или предупреждения состояний, выбранных из группы, включающей: остеопороз; катаболическую болезнь; иммунодефицит, включая таковой у индивидуумов с депрессией соотношения Т4/Т8-клеток; перелом бедра; мышечно-скелетные нарушения у пожилых людей, дефицит гормона роста у взрослых и детей; ожирение; кахексию и потерю белка, связанные с хроническим заболеванием, таким как СПИД или рак; лечение пациентов, выздоравливающих после обширных хирургических вмешательств, ран и ожогов у больных, нуждающихся в таком лечении, который включает введение пациенту эффективного количества полиморфной формы по п.5.
26. Способ лечения остеопороза, который включает введение пациенту с остеопорозом комбинации бисфосфонатного соединения и полиморфной формы по п.5.
27. Способ по п.26, где бисфосфонатным соединением является алендронат.
28. Способ получения полиморфной формы по п.1 , обозначенной как форма I, который включает помешивание раствора формы II N[ 1 (R)-( 1,2-дигидро-1 -метансульфонил-спиро [3Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил)карбонил] -2(фенилметил-окси)этил]-2-амино-2-метилпропанамида метансульфоната в изопропаноле приблизительно при 25°С в течение приблизительно 2-24 ч.