CN1524857A - 一种用作生长激素促分泌素的取代二肽的酒石酸盐 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2－氨基－N－{1－(R)－(2，4－二氟－卞氧甲基)－2－氧代－2－[3－氧代－3a－(R)－吡啶－2－基甲基－2－(2，2，2－三氟－乙基)－2，3，3a，4，6，7－六氢化－吡唑子基[4，3－c]吡啶－5－基]－乙基}－2－甲基－丙酰胺的(L)－(+)－酒石酸盐，它是一种生长激素促分泌素，并且可用于提高内源性生长激素水平。另一方面，本发明提供可用于合成上述化合物的某些中间体。本发明化合物的(L)－酒石酸盐可用于治疗和/或预防骨质疏松症、胰岛素抵抗以及其他与生长激素缺乏有关的状态或疾病。当本发明化合物的(L)－酒石酸盐与一种双膦酸盐化合物；雌激素或妊马雌酮和可任意选择的孕酮；一种雌激素兴奋剂或对抗剂；或降钙素联合使用时，还可用于治疗骨质疏松症。而且，本发明涉及药物组合物。本发明还涉及包括给予人或其他动物一种α－2肾上腺素能兴奋剂和本发明化合物的(L)－酒石酸盐的方法。

Description

一种用作生长激素促分泌素 的取代二肽的酒石酸盐
背景技术
本申请是申请日为1998年6月5日，申请号为98806559.2，题为“一种用作生长激素促分泌素的取代二肽的酒石酸盐”申请的分案申请。
本发明涉及2-氨基-N-{1-(R)-(2，4-二氟-卞氧甲基)-2-氧代-2-[3-氧代-3a-(R)-吡啶-2-基甲基-2-(2，2，2-三氟-乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢化-吡唑[4，3-c]吡啶-5-基]-乙基}-2-甲基-丙酰胺的(L)-(+)-酒石酸盐，它是一种生长激素促分泌素。
生长激素(GH)是由腺垂体分泌的，它刺激机体各种可生长组织的生长。另外，已知生长激素对机体的新陈代谢有以下基本作用：
1、促进实际上机体所有细胞蛋白质的合成；
2、抑制机体细胞碳水化合物的利用；以及
3、增加游离脂肪酸的动员和脂肪酸的利用而提供能力。
生长激素缺乏导致各种疾病。儿童可发生侏儒症。在成人中获得性GH缺乏可造成机体非脂肪物质的显著减少，并伴随机体总脂肪的增加，特别是在躯干部分。骨骼肌和心肌质量以及肌肉力量的减少导致运动能力的明显下降。骨密度也下降。已经观察到外源性生长激素的应用可逆转许多代谢的改变。治疗的其他益处包括LDL胆固醇的下降和心理健康的改善。
假如需要生长激素的水平提高，通常是通过提供外源性生长激素，或者是通过应用可刺激生长激素生成和/或释放的药物来解决这个问题。在这两种情况下，此化合物的肽基性质决定它需要通过注射来给药。开始生长激素来源于尸体腺垂体的提取。这种产品比较昂贵，而且还伴随着一种危险，即与腺垂体来源相关的疾病有可能传递给生长激素的接受者(例如：克罗伊茨费尔特-雅各布综合征)。近来，已经可以应用重组生长激素，尽管这样不再伴随疾病传播的危险，但这种产品仍然非常昂贵，而且它必须通过注射剂或鼻气雾剂来给药。
大多数GH缺乏是由于GH分泌的缺陷，而不主要是垂体GH合成的缺陷。因此，使血清GH正常的替代方法是刺激它从亲躯体细胞的释放。通过刺激或抑制大脑和下丘脑中的各种神经递质系统可获得GH分泌的增加。所以正在开发可刺激垂体GH分泌的合成生长激素释放剂，而且它对于昂贵且不一致的GH取代疗法具有多种优势。由于这是通过生理调节途径来起作用，所以大多数合乎需要的药物可刺激搏动的GH分泌，并且凭借完整的负反馈环可避免GH水平的过高，而GH水平过高与应用外源性GH的副作用有关。
GH分泌的生理和药理刺激素包括精氨酸、L-3，4-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)、胰高血糖素、后叶加压素，并且胰岛素诱导的血糖过低症，以及诸如睡眠和运动的活动可间接地引起生长激素从垂体的释放，它是通过某种方式作用于下丘脑，以减少生长激素释放抑制因子的分泌，或增加已知促分泌生长激素释放因子(GHRF)或未知内源性生长激素释放激素，或者它们所有的分泌。
本发明还涉及一种治疗胰岛素抵抗状态的方法，胰岛素抵抗状态例如为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDD)和与哺乳动物的肥胖和衰老相关的血糖下降调节。所需要的这种方法包括将有效量的式I化合物的L-(+)-酒石酸盐应用于所提到的哺乳动物。式I化合物如下所示。
已经开发了其他刺激内源性生长激素释放的化合物，诸如与GRF相关的肽基类似化合物或美国专利4,411,890的肽。这些肽明显小于生长激素，还对各种蛋白酶敏感。对于大多数肽来说，它们的口服生物利用度的潜能是比较低的。
WO 94/13696提到某种螺旋哌啶和同系物，它们可促进生长激素的释放。优选化合物的通用结构如下：
Figure A20041000594100051
WO 94/11012提到可促进生长激素释放的某种二肽。这些二肽的通用结构如下：
其中L为
据报道WO 94/11012和WO 94/13696的化合物与甲状旁腺激素或一种双膦酸盐联合应用可治疗骨质疏松症。
公开了本申请的式I化合物药物可接受盐的一般说明书，而且公开了本发明的式I化合物的游离碱，并对其进行了权利要求，以上内容在同时待审的PCT申请No.PCT/IB 96/01353(国际申请日期为1996年12月4号，并转让给本发明的受让人)中。
已经发现下面式I化合物的L-(+)-酒石酸盐可以结晶的形式进行分离，这种形式具有如下优势：诸如容易制成一种制剂、有较高的溶解性和良好的稳定性，并且它比非结晶形式更易于提纯。
                      本发明的总结
本发明提供式I化合物的L-(+)-酒石酸盐。
其中“*”是指一个立体化学中心。式I化合物优选为立体化学混合物或分离的异构体，其异构体的构型为3a-(S)，1-(R)；3a-(S)，1-(S)；3a-(R)，1-(S)和/或3a-(R)，1-(R)异构体。
本发明还提供制备式(E)化合物(D)-酒石酸盐或(L)-酒石酸盐的方法，
此方法包括在0℃与室温之间，在约8∶1至9∶1的丙酮∶水的混合物中将式(D)化合物与(D)-酒石酸或(L)-酒石酸反应。
前面方法优选为(D)-酒石酸与式(D)化合物反应，式(E)化合物具有R-构型；
式(J)化合物的制备方法，
Figure A20041000594100071
此方法包括在大约-78℃至-20℃的温度下，在有机碱和肽偶合剂的存在下将式(E)化合物与式(X)化合物反应，
Figure A20041000594100072
其中Prt为一个胺保护基，X为OH、-O(C1-C4)烷基或卤素。刚在前面所述的方法优选是：肽偶合剂为1-丙烷膦酸环酐，式(X)化合物具有R-构型，并且式(E)化合物具有R-构型。而且更优选的是刚在前面所述的方法中的Prt为叔-丁氧基羰基；和
制备式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐的方法，
Figure A20041000594100073
此方法包括在大约-78℃至-20℃的温度下，在有机碱和肽偶合剂的存在下将式(E)化合物与式(X)化合物反应，以生成式(J)化合物，
Figure A20041000594100081
其中Prt为胺保护基，X为OH、-O(C1-C4)烷基或卤素，
在适宜的去保护条件下将式(J)化合物去保护而生成式(K)化合物，
Figure A20041000594100083
在一种反应惰性溶剂中将式(K)化合物与(L)-(+)-酒石酸反应而产生式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐。前面刚述的方法中Prt优选为叔-丁氧基羰基，更优选的是肽偶合剂为1-丙烷膦酸环酐，并且式I化合物具有3a-(R)，1-(R)的绝对和相对构型。
另一方面，本发明还提供
式
Figure A20041000594100091
化合物的R，S-对映体混合物、R-对映体或S-对映体，在此优选(D)-酒石酸盐或(L)-酒石酸盐；
式
Figure A20041000594100092
化合物的3a-(R，S)，1-(R)非对映体混合物、3a-(R)，1-(R)非对映体或3a-(S)，1-(R)非对映体，在此Prt为一种胺保护基，它选自t-BOC、FMOC和CBZ组成的组；和
式
Figure A20041000594100093
化合物的R，S-对映体混合物、R-对映体或S-对映体；
式
化合物的R，S-对映体混合物、R-对映体或S-对映体，在此X为OH、-O(C1-C4)烷基或卤素，Prt为一个胺保护基；并且优选X为OH，Prt为BOC，立构中心在R-构型中。
在另一方面，本发明提供(其中的式(I)化合物如上所示)：
提高人或其他动物的内源性生长激素水平的方法，它包括给予此人或动物有效量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；
药物组合物，它包括药物可接受的载体和一定量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；
用于增加人或其他动物生长激素内源性生成或释放的药物组合物，它包括药物可接受的载体、有效量的权利要求1的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，以及生长激素促分泌素。其中生长激素促分泌素选自GHRP-6、Hexarelin、GHRP-1、生长激素释放因子(GRF)、IGF-1、IGF-2和B-HT920或其类似物；
治疗或预防骨质疏松症的方法，它包括给予需要此治疗或预防的人或其他动物一定量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，此药物可有效地治疗或预防骨质疏松症；
治疗或预防可由生长激素治疗或预防的疾病或状态的方法，它包括给予需要此治疗或预防的人或其他动物一定量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，此药物可有效地促进内源性生长激素的释放；此方法中的疾病或状态优选为充血性心力衰竭、肥胖或与衰老有关的虚弱；此方法中的疾病或状态也优选为充血性心力衰竭；此方法中的疾病或状态进一步优选为与衰老有关的虚弱；
促进骨折修复、减轻大手术后的蛋白分解反应、减轻慢性疾病所致的恶病质和蛋白丢失、促进伤口修复或促进烧伤患者或经历大手术的患者的康复的方法。此方法包括给予需要此治疗的哺乳动物一定量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，此药物可有效地促进内源性生长激素的释放。此方法优选用于促进经历大手术患者的康复；此方法也优选用于促进骨折的修复；
提高肌肉力量及可动性、皮肤厚度(thickness)的维持、代谢自身稳定或肾自身稳定维持的方法，此方法包括给予需要此治疗的人或其他动物一定量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，此药物可有效地促进内源性生长激素的释放；
治疗或预防骨质疏松症的方法，它包括给予患有骨质疏松症的人或其他动物有效量的双膦酸盐和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；治疗骨质疏松症的方法中优选的双膦酸盐化合物为ibandronate；治疗骨质疏松症的方法中优选的双膦酸盐化合物为alendronate；
治疗或预防骨质疏松症的方法，它包括给予患有骨质疏松症的人或其他动物有效量的雌激素或妊马雌酮和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，以及孕酮(可任意选择)；
治疗骨质疏松症的方法，它包括给予患有骨质疏松症的人或其他动物有效量的降钙素和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；
提高缺乏IGF-1的人或其他动物IGF-1水平的方法，它包括给予缺乏IGH-1的人或其他动物有效量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；
治疗骨质疏松症的方法，它包括给予患有骨质疏松症的人或其他动物有效量的雌激素兴奋剂或对抗剂和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；此方法中优选的雌激素兴奋剂或对抗剂为他莫昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬或idoxfene；此方法中优选的雌激素兴奋剂或对抗剂也为顺式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；(-)-顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；顺式-1-[6’-吡咯烷子基(pyrrolodino)乙氧基-3’-吡啶基]-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢-萘；1-[4’-吡咯烷子基(pyrrolidino)乙氧基苯基]-2-(4”-氟苯基)-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉；顺式-6-(4-羟苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇或1-(4’-吡咯烷(pyrrolidino)基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉；
增加肌肉质量的方法，此方法包括给予需要这种治疗的人或其他动物有效量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；
促进生长激素缺乏的儿童发育的方法，此方法包括给予生长激素缺乏的儿童有效量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；
治疗哺乳动物胰岛素抵抗的方法，此方法包括给予所说哺乳动物有效量的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；此方法中与胰岛素抵抗相关的状态优选为I型糖尿病、II型糖尿病、高血糖、葡萄糖耐量下降或胰岛素抵抗综合征；此方法中与胰岛素抵抗相关的状态也优选为肥胖或老年；提高内源性生长激素水平的方法，此方法包括给予需要的人或其他动物有效量的功能性生长激素释放抑制因子拮抗剂和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐；此方法中功能性生长激素释放抑制因子拮抗剂优选为α-2肾上腺素能兴奋剂；和
治疗或预防充血性心力衰竭、肥胖或与衰老相关的虚弱的方法，此方法包括给予需要的人或其他动物有效量的功能性生长激素释放抑制因子拮抗剂和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐。
这种式I的化合物促进生长激素的释放、它在各种生理条件下是稳定的，而且可通过胃肠外、经鼻或口服给药。
                    本发明的详细说明
可通过下面的方法制备式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，此方法包括化合物生产的化学技术领域中已熟知的方法。生产式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐的某些方法可作为本发明进一步的特征，并且通过反应图解对其进行了说明，它们显示如下。
下面所示是本发明化合物的绝对和相对构型：
Figure A20041000594100121
它表示为3a-(R)，1-(R)构型。可通过下面所述的方法来制备它。
在阐明生长激素分泌是怎样在垂体水平进行调节方面，释放生长激素的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可用作体外唯一的一种工具。这包括在评价影响生长激素分泌的许多已知或设想的因素中的应用，这些因素诸如年龄、性别、营养因素、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸，以及禁食和非禁食状态。另外，式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可用于评价其它激素是怎样改变生长激素的分泌活动的。例如，已经证实生长激素释放抑制因子抑制生长激素释放。
式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可用于动物(包括人)，它在体内引起生长激素的释放。式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可用于治疗与GH缺乏有关的症状；可刺激提供肉产品的动物的生长，或提高喂养效率以改善生肉质量；可提高牛奶厂的奶收率；可改善骨或伤口的痊愈；并且可改善重要器官的功能。式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐通过诱导内源性GH分泌，可改变机体成分，并且可改变其它GH依赖的代谢、免疫或发育过程。例如，可将本发明的化合物用于家禽、火鸡、饲养动物(诸如羊、猪、马、牛等)、家养动物(例如狗)，或者可用于水产养殖以促进鱼的生长并改善其蛋白/脂肪比。另外，可将式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐给予人，用作直接确定垂体是否能释放生长激素的诊断工具。例如，可将式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐应用于儿童。可测定给药前后血清样本的生长激素。比较这些样本的生长激素的量，它可作为直接测定患者垂体释放生长激素能力的方法。
本发明在其范围内还相应地包括药物组合物，它含有与药物可接受的载体联合的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，其中此式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐为活性组分。除了式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐以外，此药物组合物还可任选地含有一种合成代谢剂，或者具有不同活性的其它化合物，例如：一种抗菌生长permittant或一种可治疗骨质疏松症的药物，或者与其它药物活性原料合用，这种合用可提高疗效并减小副作用。
生长促进和合成代谢剂在本领域是众所周知的，它们包括TRH、PTH、己烯雌酚、雌激素、β-兴奋剂、茶碱、促蛋白合成甾类、脑菲肽、E组前列腺素、美国专利3,239,345(此说明书在此作为参考)中公开的化合物(例如zeranol)、美国专利4,036,979(此说明书在此作为参考)中公开的化合物(例如氧苯噻脲)以及美国专利4,411,890(此说明书在此作为参考)公开的肽。
与其它生长激素促分泌素(诸如美国专利4,411,890(其说明书在此作为参考)、WO 89/07110、WO 89/07111说明书中所述的生长激素释放肽GHRP-6和GHRP-1，和B-HT920以及hexarelin和WO 93/04081中所述的新发现的GHRP-2或生长激素释放激素(GHRH，也表示为GRF)及其类似物)合用的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，或者生长激素及其类似物或包括IGF-1和IGF-2的促生长因子或肾上腺素能兴奋剂，诸如可乐定、甲苯噻嗪、地托咪定和美托咪定(可乐定、甲苯噻嗪和美托咪定分别公开于美国专利3,202,660、3,235,550和4,544,664中，它们的说明书在此均作为参考。)或者诸如sumitriptan的5-羟色胺5HTID兴奋剂，或诸如毒扁豆碱和吡啶斯的明的抑制生长激素释放抑制因子或其释放的药剂可用于提高哺乳动物的内源性GH水平。与GRF合用的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可导致内源性生长激素的协同性升高。
本领域的技术人员已经熟知，生长激素的已知或潜在的用途是多种多样的[参见《人的生长激素》，Strobel和Thomas，药理学综述， 46，1-34页(1994)；T.Rosen等，Horm Res，1995；43：93-99页；M.Degerblad等，《欧洲内分泌学杂志》，1995，133：180-188页；J.O.Jorgensen，《欧洲内分泌学杂志》，1994，130：224-228页；K.C.Copeland等，《临床内分泌与代谢杂志》，78卷，第5期，1040-1047页；J.A.Aloi等，《临床内分泌与代谢杂志》，79卷，第4期，943-949页；F.Cordido等，Metab.Clin.Exp.，(1995)，44(6)，745-748页；K.M.Fairhall等，J.Endocrinal.，(1995)，145(3)，417-426页；RM.Frieboes等，《神经内分泌学》，(1995)，61(5)，584-589页和M.Liovera等，Int.J.Cancer，(1995)，61(1)，138-141页]。因此式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐刺激内源性生长激素释放，它具有与生长激素相同的效果和作用。这些生长激素不同的作用可总结如下：刺激老年人生长激素的释放；治疗成人生长激素缺乏症；预防糖皮质激素分解代谢的副作用；治疗骨质疏松症；刺激免疫系统；促进伤口愈合；促进骨折修复；治疗发育迟缓；根据PCT公布WO 95/28173和WO 95/28174所公开的治疗充血性心力衰竭(R.Yang等在《循环》，92卷，第2期，262页，1995中公开了一种测定生长激素促分泌素治疗充血性心力衰竭的功效的方法的一种实例)；治疗急性或慢性肾功衰竭或不全；治疗生理性低矮，包括生长激素缺乏的儿童；治疗与慢性疾病相关的低矮；治疗肥胖；治疗与Prader-Willi综合征和特纳综合征相关的发育迟缓；加快烧伤患者或接受诸如消化道外科的大型外科手术患者的康复，并缩短其住院期；治疗宫内发育迟缓、骨骼发育不良、肾上腺皮质功能亢进和库欣综合征；替换精神紧张患者的生长激素；治疗骨软骨发育不良、Noonans综合征、睡眠紊乱、阿尔茨海默病、伤口延迟愈合和心理隔绝；治疗肺功能不良和呼吸机依赖；减轻大手术后的蛋白分解反应；治疗吸收障碍综合征；减轻如癌症或AIDS等慢性疾病引起的恶病质和蛋白低下；促进接受TPN(全胃肠外营养)患者的体重增加和蛋白质增加；治疗包括胰岛细胞增殖症的高胰岛素血症；用于排卵诱导和胃与十二指肠溃疡的预防和治疗的辅助治疗；刺激胸腺发育和预防年龄相关的胸腺功能下降；用于慢性血液透析患者的辅助治疗；治疗免疫抑制的患者，并增强疫苗注射后的抗体反应；提高老年虚弱者肌肉力量、增加肌肉量和机动性、保持皮肤厚度、维持代谢平衡和肾功稳定；刺激成骨细胞，骨重成型和软骨生长；治疗神经疾病，诸如末梢神经病和药物诱导的神经病、急性感染性多神经炎、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、脑血管意外和脱髓鞘疾病；刺激家养动物的免疫系统，并治疗家养动物衰老性疾病；加快牲口的生长；以及刺激羊毛的生长。
本领域技术人员已知现在有许多化合物用于治疗上面所列举疾病或治疗适应症。这些治疗药剂(某些在上面已经提到)与生长促进剂的联合应用具有这些不同治疗药剂的合成代谢的特性和所需的特性。在这些联合应用中，可在一种剂量水平的1/100至1倍的剂量范围内，将此治疗药剂和式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐进行独立和连续给药，或者进行联合给药，此一种剂量水平指这些化合物和促分泌素单独应用时有效的剂量。通过双膦酸盐与式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐联合应用可进行联合治疗，此联合治疗可抑制骨吸收、预防骨质疏松症、减少骨折、提高骨折的治愈、刺激骨形成、以及增加骨矿质密度。参见PCT WO 95/11029的公布，它讨论的是双膦酸盐与GH促分泌素的联合治疗。例如Hamdy，N.A.T.在《双膦酸盐在代谢性骨病中的作用》，Trend in Endocrinol.Metab.，1993， 4，19-25页中已经对双膦酸盐在这些方面的应用进行了综述。具有这方面用途的双膦酸盐包括alendronate、tiludronat、二甲基-APD、risedronate、etidronate、YM-175、clodronate、pamidronate和BM-210995(ibandronate)，但并不仅限于这些。根据它们的药效，给患者应用每天口服剂量为0.1mg至5g的双膦酸盐和每天剂量为0.01mg/kg体重至20mg/kg体重的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐，以取得对骨质疏松症有效的治疗。
式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可与哺乳动物的雌激素兴奋剂/对抗剂联合应用。任意雌激素兴奋剂/对抗剂都可用作本发明这方面的第二种化合物。术语雌激素兴奋剂/对抗剂是指可与雌激素受体结合、抑制骨更新和预防骨丢失的化合物。特别是，雌激素兴奋剂在此定义为可与哺乳动物组织中的雌激素受体结合，并模拟一个或多个组织中雌激素作用的化学化合物。雌激素对抗剂在此定义为可与哺乳动物组织中的雌激素受体结合，并阻断一个或多个组织中雌激素作用的化学化合物。按照标准的测定方法本领域的技术人员可容易地测定这种活性。这些标准的测定方法包括：雌激素受体结合测定法、标准骨组织形态测定法和密度测定法(参见Eriksen E.F.等，《骨组织形态测定法》，Raven出版社，纽约，1994，1-74页；Grier S.J.等，《双能X线吸收测定法在动物中的应用》，Inv.Radiol.，1996，31(1)：50-62；WahnerH.W和Fogelman I.，《骨质疏松症的评价：临床中的双能X线吸收测定法》，Martin Dunitz Ltd.，伦敦，1994，1-296页)。下面对这些用作参考的各种各样的化合物进行描述。但是本领域的技术人员应能熟知其它的雌激素兴奋剂/对抗剂。一种优选的雌激素兴奋剂/对抗剂是屈洛昔芬：(酚，3-[1-[4[2-(二甲氨基)乙氧基]-苯基]-2-苯基-1-丁烯基]-，(E)-)和相关的化合物，此化合物公开于美国专利5,047,43中，其说明书也在此作为参考。
另一个优选的雌激素兴奋剂/对抗剂为他莫昔芬：(乙胺，2-[-4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基，(Z)-2-，2-羟基-1，2，3-丙三-羧酸酯(1∶1))和相关的化合物，这些化合物公开于美国专利4,536,516中，其说明书在此用作参考。另一个相关的化合物为4-羟基他莫昔芬，它公开于美国专利4,623,660中，其说明书在此用作参考。
另一个优选的雌激素兴奋剂/对抗剂为雷洛昔芬：(甲酮，[6-羟基-2-(4-羟基苯基)苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-，盐酸化物)和相关的化合物，这些化合物公开于美国专利4,418,068中，其说明书在此用作参考。
另一个优选的雌激素兴奋剂/对抗剂为idoxifene：吡咯烷，1-[-[4-[[1-(4-碘苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]和相关的化合物，这些化合物公开于美国专利4,839,155中，其说明书在此用作参考。
其它优选的雌激素兴奋剂/对抗剂包括通常指定的美国专利5,552,412中所述的化合物，其说明书在此用作参考。尤其优选的本文描述的化合物为：
顺式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；
(-)-顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；
顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；
顺式-1-[6’-吡咯烷子基(pyrrolodino)乙氧基-3’-吡啶基]-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢萘；
1-(4’-吡咯烷子基(pyrrolidino)乙氧基苯基)-2-(4”-氟苯基)-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉；
顺式-6-(4-羟基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；和
1-(4’-吡咯烷子基(pyrrolidino)乙氧基苯基)-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉。
美国专利4,133,814中描述了其它的雌激素兴奋剂/对抗剂(其说明书在此用作参考)。美国专利4,133,814公开了2-苯基-3-芳酰基-苯并噻吩和2-苯基-3-芳酰基苯并噻吩-1-氧化物的衍生物。
下面段落提供了不同抗吸收剂的优选剂量范围。
通过它作为一种骨丢失抑制剂的活性来确定所用抗吸收剂的量。应用一种方案(诸如上面所参考的那些)，通过单个化合物的药物动力学及其抑制骨丢失的最小最大有效剂量而测定这种活性。
通常对于雌激素兴奋剂/对抗剂(当与本发明的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐联合应用时)，例如在骨质疏松症的治疗中，本发明活性的有效剂量为0.01至200mg/kg/天，优选为0.5至100mg/kg/天。
特别是屈洛昔芬的有效剂量为0.1至40mg/kg/天，优选为0.1至5mg/kg/天。
特别是雷洛昔芬的有效剂量为0.1至100mg/kg/天，优选为0.1至10mg/kg/天。
特别是他莫昔芬的有效剂量为0.1至100mg/kg/天，优选为0.1至5mg/kg/天。
特别是顺式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；
(-)-顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；
顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；
顺式-1-[6’-吡咯烷子基乙氧基-3’-吡啶基]-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢萘；
1-(4’-吡咯烷子基乙氧基苯基)-2-(4”-氟苯基)-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉；
顺式-6-(4-羟基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；和
1-(4’-吡咯烷子基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉的有效剂量为0.0001至100mg/kg/天，优选为0.001至10mg/kg/天。
特别是4-羟基他莫昔芬的有效剂量为0.0001至100mg/kg/天，优选为0.001至10mg/kg/天。
GH从大鼠垂体细胞释放的刺激作用的测定
应用下面的方案来鉴定能够刺激GH从培养的大鼠垂体细胞分泌的化合物。此试验也用于与标准进行比较以确定剂量水平。从6周龄的雄性Wistar大鼠的垂体分离细胞。进行断头术后，将垂体前叶放入冷的不含钙或镁的无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)中。细细地将组织切碎，然后在HBSS中用10U/ml细菌蛋白酶(EC 3.4.24.4，Sigma P-6141，圣路易斯，密苏里)给此组织进行两轮机械辅助酶分散。在37℃左右的5％CO2环境下，以30rpm在旋转烧瓶中将组织-酶混合物搅拌约30分钟，大约15分钟和30分钟后用10mL吸移管进行手工研制。以200×g将此混合物离心约5分钟。将马血清(35％终浓度)加入上层清液以中和过剩的蛋白酶。在新鲜蛋白酶(10U/mL)中再悬浮此丸，在前面的条件下搅拌约30分钟以上，最终通过23式针进行手工研制。再一次加入马血清(35％终浓度)，然后联合两个水解液的细胞，制成小丸(200×g约15分钟)，在培养介质(添加了4.5g/L葡萄糖、10％马血清、2.5％牛胎血清、1％非必需氨基酸、100U/mL制霉菌素和50mg/mL硫酸庆大霉素的Dulbecco改良Eagle介质(D-MEM)，Gibco，Grand Island，纽约)中再悬浮，并计数。以6.0-6.5×104/cm2细胞，将细胞置于48孔CostarTM(剑桥，马塞诸塞)平皿中，并在培养介质中培养3-4天。
在进行GH分泌测定之前，用释放介质将培养池冲洗两遍，然后在释放介质(在37℃用25mM Hepes缓冲的D-MEM，PH值为7.4，并且含有0.5％牛血清白蛋白)中平衡30分钟。将实验化合物溶解在DMSO中，然后在预热的培养介质中进行稀释。实验进行四次。实验开始是将0.5ml释放介质(含赋形剂或实验化合物)加入每个培养池中。培养在大约37℃进行15分钟，然后取出释放介质而终止培养，将此释放介质在2000×g离心约15分钟以除去细胞物质。通过下面描述的一种标准放射免疫测定方案来测定上清液中的大鼠生长激素的浓度。
大鼠生长激素的测定
应用从Dr.A.Parlow(Harbor-UCLA医疗中心，Torrence，CA)获得的大鼠生长激素参考制剂(NIDDK-rGH-RP-2)和在猴中产生的大鼠生长激素抗血清(NIDDK-anti-rGH-S-5)，通过双抗体放射免疫测定法测定大鼠生长激素的浓度。将另外的大鼠生长激素(1.5U/mg，#G2414，Scripps Labs，San Diego，CA)进行碘化而使其具有约为30μCi/μg的特殊活性，通过氯胺T方法而用作示踪物。加入抗猴IgG山羊抗血清(ICN/Cappel，Aurora，OH)加聚氧乙烯，分子量为10,000-20,000，至终浓度为4.3％而获得免疫复合物。通过离心完成回收。此测定的工作范围为在基础水平上，每试管的大鼠生长激素为0.08-2.5μg。
实验化合物静脉内给药后大鼠的外源性刺激生长激素释放的测定
在进行化合物实验前，使21天大的Sprague-Dawley雌性大鼠(CharlesRiver Laboratory，Wilmington，MA)适应本地的饲养环境(24℃，12小时的日光、12小时的黑夜循环)大约1周。让所有大鼠任意进食水和市售丸状食物(Agway Country Food，Syracuse NY)。按照实验动物饲养和应用的NIH指南指导此实验。
在实验的那天，将实验化合物溶解在含1％乙醇、1mM乙酸和含0.1％牛血清白蛋白的盐水的赋形剂中。每个实验都在3个大鼠中进行。对大鼠称重，并经腹膜内注射戊巴比妥钠(Nembutol，50mg/kg体重)进行麻醉。在麻醉给药14分钟后，切断大鼠尾尖，使血滴入一个微离心试管中而采集血样(基线血样，大约100μl)。麻醉给药15分钟后，将实验化合物通过尾静脉注射给大鼠，总注射量为1ml/kg体重。在应用化合物后的5、10和15分钟分别从尾部采集另外的血样。将血样放置在冰上，直到经离心(在10℃用1430×g离心10分钟)分离血清。在-80℃保存血清，直至用上述放射免疫测定法进行血清生长激素的测定。
口服给药后狗的外源性刺激生长激素释放的评定
给药的当天称出适宜量的实验化合物，将其溶解在水中。按0.5-3mL/kg的量通过管饲法给2-4条狗给药，此狗可接受每种剂量制度。在给药前和给药后的0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8和24小时，应用含肝素锂的5ml空针通过直接静脉穿刺，从颈静脉采集血样(5ml)。将此制备的血浆保存在-20℃，直至进行分析。
犬生长激素的测定
应用从Dr.A.Parlow(Harbor-UCLA医疗中心，Torrence，CA)获得的犬生长激素(碘化的抗原，和参考制剂AFP-1983B)和在猴中产生的犬生长激素抗血清(AFP-21452578)，通过一种标准放射免疫测定法方案测定犬生长激素的浓度。通过犬生长激素的氯胺T-碘化作用而形成示踪物，其特殊活性为20-40μCi/μg。加入抗猴IgG山羊抗血清(ICN/Cappel，Aurora，OH)加聚氧乙烯，分子量为10,000-20,000，至终浓度为4.3％而获得免疫复合物。通过离心完成回收。此测定的工作范围为每试管的犬生长激素为0.08-2.5μg。
长期口服给药后狗的犬生长激素和胰岛素样生长因子-1水平的评定
使狗每天接受实验化合物7至14天。在每天的给药中，称出适宜剂量的实验化合物，比将其溶解在水中。通过管饲法按0.5-3mL/kg的量，给接受每种剂量制度的狗给药。在0、3、7、10和14天采集血样。在第0、7和14天的给药前、给药后的0.17、0.33、0.5、0.754、1、2、3、6、8、12和24小时，应用含肝素锂的5ml空针通过直接颈静脉穿刺采集血样(5ml)。将此制备的血浆保存在-20℃，直至进行分析。
雌性大鼠研究
此研究评价用GHRP类似物长期治疗对雌激素缺乏和雌激素充实的雌性大鼠的体重、身体成分和葡萄糖、胰岛素、乳酸和脂类的非禁食血浆浓度的影响。在给药的最后一天评定血清GH水平对GH释放剂的静脉给药的急性反应性。在整个治疗期间每周监测体重；另外，在治疗结束时测定身体成分和葡萄糖、胰岛素、乳酸、胆固醇和甘油三酯的血浆水平。
从Charles River实验室(Wilmington，MA)获得未交配雌性Sprague-Dawley大鼠，并在其大约12周大时对其进行双侧卵巢切除术(Ovx)或假手术(Sham)。对于假手术者，将其卵巢外置，并放回至腹腔中。手术后让大鼠分别单独住在标准饲养环境下(约24℃，约12小时日光/12小时黑夜循环)的20cm×32cm×20cm的笼中。让所有大鼠任意进食水和市售丸状食物(Agway Prolab 3000，Agway Country Food，Inc.，Syracuse，NY)。按照实验动物饲养和应用的NIH指南指导此实验。
手术后的7个月左右，对Sham和Ovx大鼠称重，并随机分组。将1ml的赋形剂(含1％乙醇的蒸馏去离子水)，0.5mg/kg或者5mg/kg的生长激素释放剂每天通过经口管饲法向大鼠给药90天。在整个研究中每周对大鼠称重。在最后一次给药的24小时后，按照下面的步骤测定血清生长激素(GH)对实验剂的急性反应。用戊巴比妥钠50mg/kg麻醉大鼠。对麻醉大鼠称重，从其尾静脉采集基线血样(～100μl)。然后通过尾静脉将1ml实验剂(生长激素释放剂或赋形剂)进行静脉内给药。注射后的10分钟左右，从其尾部采集第2份100μl的血样。允许血液在4℃左右凝块，然后以2000×g离心10分钟左右。在-70℃左右保存血清。按照上述放射免疫测定法测定血清生长激素的浓度。此步骤后，通过双能X线吸收测定法(DEXA，Hologic QDR 1000/W，WalthamMA)对每个麻醉大鼠进行全身扫描。通过心脏穿刺将最后的血样采集在肝素化的试管中。通过离心分离血浆，并将其按上述方法冷冻保存。
应用Binax公司(Portland，Maine)的试剂盒通过放射免疫测定法测定血浆胰岛素。其测定间的可变性系数≤10％。分别应用Abbott VPTM和VP SuperSystem自动分析仪(Abbott实验室，Irving，Texas)、A-GentTM甘油三酯、胆固醇和葡萄糖试剂系统以及Sigma的乳酸试剂盒测定甘油三酯、总胆固醇、葡萄糖和乳酸的血浆水平。通过与赋形剂治疗组的统计学分析(不成对的T试验)，测定生长激素释放肽(GHRP)或GHRP类似物(诸如式I化合物)的血浆胰岛素、甘油三酯、总胆固醇和乳酸的下降活性。
式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐可通过口服、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内或皮下注射，或者植入)、鼻、阴道、直肠、舌下或表面给药途径给药，并且可与药物可接受的载体一起制备，以提供适宜于每种给药途径的给药形式。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在每种固体给药形式中，式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐与至少一种惰性药物可接受的载体(诸如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。如通常所进行的那样，除了这种惰性稀释剂外，此给药形式还可包含另外的物质，例如润滑剂(诸如硬脂酸镁)。在胶囊、片剂和丸剂中，此给药形式也可含有缓冲剂。片剂和丸剂可另外包括肠溶衣。
用于口服给药的液体剂型包括药物可接受的包含在本领域常用的惰性稀释剂(诸如水)的乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆、酏剂。除了这种惰性稀释剂外，组合物还可包括辅剂，诸如浸润剂、乳化剂和悬浮剂，以及香化剂、增香剂和加香剂。
本发明用于胃肠外给药的制剂包括无菌含水或不含水的溶液、悬浮剂或乳剂。不含水的溶剂或赋形剂的实例为丙二醇、聚氧乙烯、植物油(诸如橄榄油和玉米油)、凝胶和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。这种给药形式还可包含辅助剂，诸如防腐剂、浸润剂、乳化剂和分散剂。可通过例如经一种阻菌滤器过滤、通过将杀菌剂混合入此组合物、通过用放射线照射此组合物、或者通过加热此组合物而使它们无菌。它们还可以无菌固体组合物的形式进行制备，此组合物可在应用前立即溶解在无菌水或一些其它无菌注射介质中。
用于直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂。除了活性物质外，此栓剂还可包含诸如柯卡黄油或栓剂蜡的赋形剂。
用于鼻或舌下给药的组合物也可用本领域熟知的标准赋形剂进行制备。
本发明此组合物中的式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐的剂量是可变的，需要其量进行这种变化，这样才可获得适宜的给药形式。根据需要的治疗效果、给药途径和疗程选择其剂量。通常用于人和其它动物(例如哺乳动物)的剂量水平为每天0.0001至100mg/kg体重，以获得生长激素有效的释放。
优选的剂量范围为每天0.01至5.0mg/kg体重，它可一次给药或者分为多次来给药。
下面的图解说明式I化合物的(L)-(+)-酒石酸盐的合成。符号“*”表示一个立体化学中心。在图解中“Prt”指本领域的技术人员所熟知的任意适宜的胺保护基。
下面描述在前面图解中说明的反应步骤。在下面的描述中，用优选的胺保护基BOC来举例说明胺保护基Prt。
步骤a：在约0℃至室温，优选为0℃，将盐酸吡啶甲基氯化物、一种碳酸盐(诸如Li2CO3、CsCO3或优选为碳酸钾)和碘化钾或碘化四丁铵加入在一种反应惰性极性非质子传递溶剂中的化合物A的溶液中，此极性非质子传递溶剂诸如为丙酮、丁酮或优选为DMF(二甲基甲酰胺)。在-20℃至70℃左右，优选为0℃，搅拌约2至16小时，优选为2小时，然后移去冰浴，加入DABCO(1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷)。将反应混合物搅拌15至30分钟左右，然后将其倒入水和一种非极性有机溶剂的混合物中，此有机溶剂诸如为甲苯、乙醚或优选为IPE(异丙醚)。分离有机层，用本领域所熟知的标准方法进行处理而产生化合物B。
步骤b：一种70％CF3CH2NHNH2的水溶液用作在乙醇、水或甲苯中的一种水溶液，优选用甲苯提取此70％CF3CH2NHNH2的水溶液。先将含有无水2，2，2-三氟乙基肼的甲苯提取液加入在一种有机溶剂(诸如乙醇或优选为甲苯)中的化合物B的溶液中，然后加入乙酸。在约60℃-110℃，优选为70℃，将此反应混合物加热约30分钟至12小时，优选为2小时。将反应混合物冷却至室温，并用一种诸如NaHCO3的含水碱中和。分离有机层，用本领域所熟知的标准方法进行处理而生成化合物C。
步骤c：将一种酸加入在一种反应惰性有机溶剂(诸如EtOH、IPE或优选为CH2Cl2)中的化合物C的溶液中，此酸诸如为在IPE或乙醇中的HCl、三氟甲磺酸酸或一种诸如甲磺酸的烷基磺酸。将此混合物搅拌约1-2小时后，冷却至约0℃至室温，优选为0℃，然后将一种诸如三乙胺或NH4OH的胺碱加入此混合物中。使此混合物升温至室温，用另外的有机溶剂稀释，然后用本领域所熟知的标准方法处理而生成化合物D。
步骤d：在室温左右将(D)-或(L)-酒石酸，优选为(D)-酒石酸加入化合物D的丙酮/水(约8∶1至9∶1)中。在室温搅拌此混合物约15分钟至过夜，优选为过夜，过滤固体，收集并用冷丙酮进行冲洗，这样就产生了式E的化合物，优选化合物E为一种单对映体的(D)-酒石酸盐。
步骤e：在约0℃，将n-BuLi或叔丁氧化钾溶液加入N-BOC-丝氨酸，优选为N-BOC-(D)-丝氨酸(化合物F)的THF/DMF(约1∶1至2∶1)溶液中。在0℃左右将此反应混合物搅拌约10-30分钟，优选为20分钟，然后加入2，4-二氟苄基溴。在升温至室温并搅拌6-24小时左右后，在真空中浓缩此反应混合物以除去THF，并加入诸如1N HCl的含水酸，将其PH值调节至3左右。然后在水和一种有机溶剂(诸如CH2Cl2或IPE)之间分配此反应混合物。用本领域所熟知的标准方法处理此有机溶液，以产生化合物G，优选在立体中心为R-构型，亦即所谓的(D)-对映体。
步骤f：将诸如甲磺酸的烷基磺酸加入在一种有机溶剂中的化合物G的溶液，此有机溶剂诸如为THF、CH2Cl2、IPE或它们的一种混合物，优选为CH2Cl2/IPE(约1∶1)。过滤固体，并用CH2Cl2/IPE混合物(1∶1)冲洗，以生成化合物H，优选其在立体中心为R-构型，亦即所谓的(D)-对映体。
步骤g：将2-叔-丁氧羰基氨基-2-甲基-丙酸-2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯和诸如三乙胺的烷基胺加入化合物H的THF/水(约4∶1)溶液中。在室温下搅拌此反应混合物1-24小时左右，并用诸如10％柠檬酸水溶液的含水酸将其骤冷。用诸如乙酸乙酯的一种有机溶剂分配此混合物，然后分离有机层，并用本领域所熟知的标准方法进行处理而生成化合物X，优选其在立体中心为R-构型，亦即所谓的(D)-对映体。化合物X可为一种酸、烷基酯或酰基卤(X为OH、-O(C1-C4)烷基或卤)，优选为酸。
步骤h：(a)在约-35℃至0℃，优选为-6℃，将化合物E，优选为单对映体的(D)-酒石酸盐，加入乙酸乙酯。将此溶液冷却至-30℃至-50℃左右，然后加入诸如三乙胺的一种烷基胺。在约-78℃与-20℃之间，搅拌此反应混合物约30-90分钟，并进行过滤而获得化合物E的游离碱溶液。
(b)当化合物X中的X为OH时，在-78℃至-20℃左右，优选在-35℃，将化合物X，优选在立体中心为R-构型的化合物X，加入一种反应惰性有机溶剂，此有机溶剂诸如为含有从步骤h(a)中所得的化合物E的游离碱、一种诸如三乙胺的烷基胺，以及PPAA(1-丙烷膦酸环酐)(在乙酸乙酯中的含量为50％)的乙酸乙酯溶液。将反应混合物搅拌约1-24小时，用本领域所熟知的标准方法进行测定而生成化合物J，优选它具有绝对和相对3a-(R)，1-(R)构型。
当化合物X中的X为Cl时，在-78℃左右，将化合物X加入一种反应惰性溶剂，此溶剂诸如为含有化合物E的游离碱和一种诸如三乙胺的烷基胺的二氯甲烷溶液。在约0-30℃将反应混合物搅拌约1-24小时，然后用本领域所熟知的标准方法进行测定而生成化合物J，优选它具有绝对和相对3a-(R)，1-(R)构型。
当化合物X中的X为-O(C1-C4)烷基(在此优选为甲基)时，将化合物X加入在一种反应惰性溶剂中的化合物E的游离或共轭碱溶液[通过将游离胺碱与适宜的试剂(即M＝Li，丁基锂或LDA；M＝Na，NaH或NaH(SiMe3)2或M＝K，KH或KN(SiMe3)2，或者M＝Mg，任意烷基格利雅试剂，优选为二乙基溴化镁，或M＝Al，任意三烷基铝试剂，优选为三甲基铝)反应而制备化合物E(-NM，其中M＝Li、Na、K、Mg或Al，优选为铝)的共轭碱]，优选为铝，然后在约-20℃至110℃将反应混合物搅拌约1-24小时，并用本领域所熟知的标准方法进行测定而生成化合物J，优选它具有绝对和相对3a-(R)，1-(R)构型。
步骤i：在约0℃至室温将一种酸加入含化合物J的CH2Cl2、IPE或THF中，此酸诸如为含HCl的EtOH、甲磺酸或含三氟甲磺酸的CH2Cl2。在室温下将此混合物搅拌约40分钟至4小时，然后加入诸如NaHCO3的一种饱和含水碱，直到溶液的PH值为中性。分离有机层，用本领域所熟知的标准方法进行测定而生成化合物K，优选其具有绝对和相对3a-(R)，1-(R)构型。
步骤j：将L-(+)酒石酸加入在一种醇中的化合物K的溶液中，此醇优选为甲醇。将反应混合物搅拌约1-12小时，过滤并浓缩。用一种诸如乙酸乙酯的有机溶剂稀释粗制残余物，加热并慢慢地使其冷却至室温。过滤固体，然后干燥而获得为白色结晶的式I化合物的L-(+)酒石酸盐，优选其具有绝对和相对3a-(R)，1-(R)构型。
下面的实施例是为了进一步说明本发明，而不是要对本发明进行限制。
应用硅胶进行柱色谱法。在Buchi 510仪器上测定熔点，并未进行校正。在25℃，在Varian XL-300、Bruker AC-300、Varian Unity 400或Bruker AC-250上记录质子NMR谱。以百万分之几的三甲硅烷的低磁场表示化学位移。
实施例1
2-氨基-N-{1-(2，4-二氟-苄氧甲基)-2-氧代-2-[3-氧代-3a-吡啶-2-基甲基 -2-(2，2，2-三氟-乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑子基(pyrazolo)[4，3-c]吡啶-5-基]- 乙基}-2-甲基-丙酰胺L-(+)酒石酸盐
A. 4-氢代-3-吡啶-2-基甲基-哌啶-1，3-二羧酸1-叔-丁基酯3-乙酯
在约0℃，将盐酸吡啶甲基氯化物(5.7g，34.7mmol)、碳酸钾(14.4g，104.1mmol)和碘化钾(5.76g，34.7mmol)加入含4-氧代-哌啶-1，3-二羧酸1-叔-丁基酯3-乙酯(10.34g，38.2mmol)的DMF(40ml)溶液中。在0℃左右，搅拌约2小时，然后移去冰浴，加入DABCO(973mg，8.68mmol)。将反应混合物搅拌30分钟左右，然后将其倒入水和IPE的混合物中。分离有机层，并用饱和含水NaHCO3和饱和含水NaCl冲洗，通过Na2SO4干燥并在真空中浓缩。由己烷将此粗制残余物进行结晶而获得一种白色固体(8.19g，收率为65％)。1H-NMR(CDCl3)δ1.17(t，3H)，1.48(s，9H)，1.55(s，2H)，2.61(m，1H)，2.71(m，1H)，3.31-3.50(m，3H)，4.11(d，2H)，4.49(d，1H)，7.06(br s，1H)，7.17(d，1H)，7.54(m，1H)，8.40(s，1H)。
B. 3-氧代-3a-吡啶-2-基甲基-2-(2，2，2-三氟乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑 子基[4，3-c]吡啶-5-羧酸叔-丁基酯
用甲苯(3×1200ml)提取70％CF3CH2NHNH2的水溶液(325ml，1.986mol)(从Aldrich获得)。先将含有无水2，2，2-三氟乙基肼的结合甲苯提取液加入含步骤A中的产物(600g，1.655mol)的甲苯(900ml)溶液中，然后加入乙酸(121.4g，1.986mol)。在约70℃，将此反应混合物加热约2小时，然后加入另一份含70％含水2，2，2-三氟乙基肼(50g)的甲苯提取液。在约80℃将此反应混合物加热约3.5小时，然后冷却至室温，并用饱和含水NaHCO3(2L)稀释。分离甲苯层，用饱和含水NaCl冲洗，通过Na2SO4干燥并在真空中浓缩而获得一种油(754.8g)。由甲醇/水进行结晶而获得白色固体的所需产物(609.5g)。1H-NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，2.53(d，1H)，2.70(br s，2H)，2.88(br s，1H)，3.31(m，2H)，3.97(m，1H)，4.19(m，1H)，4.46(br s，1H)，4.63(br s，1H)，7.06(m，2H)，7.51(m，1H)，8.34(m，1H)。
C. 3a-吡啶-2-基甲基-2-(2，2，2-三氟乙基)-2，3a，4，5，6，7-六氢-吡唑子基 [4，3-c]吡啶-3-酮
将甲磺酸(11.6g，121mmol)在30分钟以上的时间内逐滴加入含步骤B所得产物(10g，24.2mmol)的CH2Cl2(100ml)溶液中。将此混合物搅拌约1小时后，冷却至约0℃，然后通过一个添加漏斗将三乙胺(18.6ml，133.1mmol)加入此混合物中。在1小时以上使此混合物升温至室温，用另外的CH2Cl2进行稀释，然后用饱和含水NaCl冲洗，通过Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩而获得一种白色固体(7.2g)。1H-NMR(CDCl3)δ2.51-2.72(m，4H)，3.35(m，2H)，3.49(m，2H)，4.03(m，1H)，4.25(m，1H)，7.08(d，2H)，7.51(t，1H)，8.37(d，1H)。
D. 3a-吡啶-2-基甲基-2-(2，2，2-三氟乙基)-2，3a，4，5，6，7-六氢-吡唑子基 [4，3-c]吡啶-3-酮(D)-酒石酸盐
在17℃左右，在一个装有机械搅拌器的干燥并用氮气清洗的5L圆底烧瓶中，将(D)-酒石酸(129g，0.86mol)加入含步骤C所得的化合物(243g，0.78mol)的丙酮/水(约9∶1，2430ml)中。在室温搅拌此混合物过夜，过滤固体，收集并用冷丙酮进行冲洗，在真空下干燥。获得为黄色固体的产物(284g，收率为78.8％)。
E. 2-叔-丁氧基羰基氨基-3-(2，4-二氟-苄氧基)-丙酸
在约0℃，将叔丁氧化钾溶液(515.8g，4.5963mol)加入含N-BOC-(D)-丝氨酸(452g，2.2026mol)的THF(7L)和DMF(3L)的混合物的溶液中。在0℃左右将此反应混合物搅拌约30分钟，然后加入2，4-二氟苄基溴(456.5g，2.2051mol)。在升温至室温后，在真空中浓缩此反应混合物以除去THF。然后在4.5L水和4.5LIPE之间分配此反应混合物。分离各层，并用1N HCl将含水层的PH值调节至3左右。各用4L IPE提取此含水层两遍。通过Na2SO4干燥此有机溶液，并在真空中浓缩而获得一种黄色蜡状固体(518.0g，收率为70.9％)。1H-NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，3.73(m，1H)，3.94(d，1H)，4.44(br s，1H)，4.54(s，2H)，5.34(m，1H)，6.78(m，1H)，6.84(m，1H)，7.30(m，1H)。
F. 2-氨基-3-(2，4-二氟-苄氧基)-丙酸，甲磺酸盐
在约10分钟以上的时间内通过一个注射管，将甲磺酸(1.72g，17.95mmol)加入含步骤E所得产物(1.19g，3.59mmol)的CH2Cl2/IPE(1∶1，12ml)的溶液中。溶液中立即沉淀出一种固体。约1小时后，过滤此固体，并用CH2Cl2/IPE混合物(1∶1)冲洗而获得939mg的产物(收率为80％)。
G.2-( 2-叔-丁氧基羰基氨基-2-甲基-丙酰氨基)-3-(2，4-二氟-苄氧基)-丙酸
将2-叔-丁氧羰基氨基-2-甲基-丙酸-2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(438mg，1.46mmol)和三乙胺(369mg，3.65mmol)加入含步骤F中所得的产物(520mg，1.46mmol)的THF/水(4∶1，10ml)的溶液中。在室温下搅拌此反应混合物1小时左右，并用10％柠檬酸水溶液(10ml)将其骤冷。约15分钟后，加入乙酸乙酯(50ml)，然后分离有机层，并用饱和含水NaCl冲洗，通过Na2SO4干燥，并在真空中浓缩而获得一种泡沫体(534.1mg，收率为88％)。1H-NMR(CD3OD)δ1.38(br s，15H)，3.77(d，1H)，3.92(d，1H)，4.52(m，3H)，6.92(m，1H)，7.41(m，1H)，7.58(d，1H)。
H.( 1-{1-(2，4-二氟-苄氧甲基)-2-氧代-2-[3-氧代-3a-吡啶-2-基甲基 -2-(2，2，2-三氟-乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑子基[4，3-c]吡啶-5-基]-乙基氨基 甲酰基}-1-甲基-乙基)-氨基甲酸叔-丁基酯
(1)在约-6℃，在一个装有机械搅拌器的干燥并用氮气清洗的12L圆底烧瓶中，将步骤D中所得的化合物(517g，1.12mol)加入乙酸乙酯(5170ml)中。将此溶液冷却至-40℃左右，然后在约45分钟以上加入三乙胺(398ml，2.86mol)。在约-50℃与-40℃之间，搅拌此反应混合物约90分钟，将其过滤至一个22L用氮气清洗的圆底烧瓶中，并用乙酸乙酯(2068ml，预冷却至-50℃)冲洗而获得为一种白色固体的游离碱。
(2)在-30℃左右，将步骤G中所得的化合物(425g，1.02mol)加入含有从步骤H(1)中所得的化合物、三乙胺(654ml，4.69mol)和PPAA(1-丙烷膦酸环酐)(在乙酸乙酯中的含量为50％，916ml，1.53mol)的乙酸乙酯溶液中。将反应混合物搅拌约1小时，用水和饱和含水NaCl冲洗，通过Na2SO4干燥，并在真空中浓缩而获得为一种油的产物(636g，收率为87.8％)。
I. 2-氨基-N-{1-(2，4-二氟-苄氧甲基)-2-氧代-2-[3-氧代-3a-吡啶-2-基甲基 -2-(2，2，2-三氟-乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑子基[4，3-c]吡啶-5-基]-乙基}-2-甲 基-丙酰胺
在约15℃，在约55分钟以内，在一个装有机械搅拌器的干燥并用氮气清洗的22L圆底烧瓶中将甲磺酸(258.3ml，3.98mol)逐滴加入含步骤H中所得的产物(566g，0.796mol)的CH2Cl2(11,320ml)中。在约20℃将此混合物搅拌约40分钟，然后加入饱和含水NaHCO3(8,490ml)，直到溶液的PH值为7.8。分离有机层，用水和饱和含水NaCl冲洗，通过Na2SO4干燥，并在真空中浓缩而获得一种油状产物(388.8g，收率为80％)。
J. 2-氨基-N-{1-(2，4-二氟-苄氧甲基)-2-氧代-2-[3-氧代-3a-吡啶-2-基甲基 -2-(2，2，2-三氟-乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑子基[4，3-c]吡啶-5-基]-乙基}-2-甲 基-丙酰胺L-(+)酒石酸盐
在一个装有机械搅拌器的12L圆底烧瓶中，将L-(+)酒石酸(90g，0.6mol)加入含步骤I中所得的产物(370g，0.6mol)的甲醇(4,070ml)溶液中。在22℃左右，将反应混合物搅拌约90分钟，过滤并浓缩。用乙酸乙酯(4,560ml)稀释此粗制残余物，在约70℃加热，并在17小时以上慢慢地使其冷却至室温。过滤固体，然后干燥而获得白色结晶，熔点为188-189℃(348.46g，收率为76％)。1H-NMR(MeOH，d4)δ：8.28(d，1H)，7.59(t，1H)，7.41-7.39(m，1H)，7.18-7.13(m，1H)，6.92(t，1H)，5.2(t，1H)，4.56(bs，3H)，4.36(s，2H)，4.31-4.25(m，1H)，4.13-4.06(m，1H)，3.78(d，2H)，3.21(t，1H)，3.18-2.96(m，2H)，2.65-2.55(m，2H)，1.57(d，6H)。MS：MH+  611。[a]589+22.03(c＝11.9，MeOH)。

Claims (5)

1、式
化合物的R，S-对映体混合物、R-对映体或S-对映体。
2、根据权利要求1所述的化合物的(D)-酒石酸盐或(L)-酒石酸盐。
3、式
化合物的R，S-对映体混合物、R-对映体或S-对映体。
4、式
化合物的R，S-对映体混合物、R-对映体或S-对映体，其中X为OH、-O(C1-C4)烷基或卤素，Prt为胺保护基。
5、根据权利要求4所述的化合物，其中X为OH，Prt为BOC，立构中心在R-构型中。
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