SE468746B - Saarbehandlingsmedel och kosmetika innehaallande ovomakroglobulin - Google Patents

Description

(LN CIO w 10 20 25 30 ('j\ 2 uppträdandet av muskelstörningar (japanska offentliga patentansökan nr ll6225/1984). En hudkosmetisk kompo- sition framställd genom att införliva torkat äggalbumin (egg albumen) som basmaterial har även föreslagits (japanska offentliga patentansökan nr 6801/1986).

Dessa föreningar eller kompositioner har ändå otill- fredsställande effekt för läkning av sår. Läkemedel innehållande ägg eller äggalbumin har problem med dålig lagringsstabilitet, eftersom de är benägna att ruttna även då antiseptiska medel är införlivade däri.

Andra svårigheter vid användning av äggalbumin ligger i det faktum att denna förening endast löser sig i en alkalisk lösning, har dålig affinitet till andra ingredienser i kosmetika eller salvor som är den konven- tionella appliceringsformen för ett sårläkningsmedel, och tenderar att åstadkomma en vit fällning innehållande proteiner.

Det har även föreslagits inom tekniken ett antal olika hårtonika eller hårregenererande medel som verkar på hårrötter och gynnar hårtillväxt. Inga av dessa föreningar som hittills föreslagits är emellertid tillräckligt effektiva.

Vidare har det funnits ett behov av utveckling av ett kosmetikum som uppvisar utmärkt effekt på huden och skyddar denna från att rodna och ändå har en upp- mjukande verkan (en förmåga att bibehålla smörjför- mágan), en hudbehandlingsverkan och en god affinitet.

Beskrivning av uppfinningen Som resultat av intensiva studier av föreliggande uppfinnare har man funnit att ovomakroglobulin uppvisar utmärkta effekter vid sårterapi, har hårtillväxtfräm- jande verkan och hudskyddande verkan och vidare att sårläkningsmedel, hårregenererande medel, såsom hårto- nikum eller hårtillväxtmedel, och kosmetika kan erhållas genom användning av denna förening. Sådana resultat har lett till åstadkommandet av föreliggande uppfinning. 10 15 20 25 30 35 'ß (_1\ co \a 4> O\ 3 Följaktligen är ett ändamål med föreliggande uppfinning att åstadkomma ett sårläkningsmedel, hårre- genererande medel och kosmetikum omfattande ovomakro- globulin som en effektiv komponent.

Kort beskrivning av ritningarna Fig l är en graf som visar förändringar i kropps- vikten hos möss som led av brännskador och var utsatta för ett sårläkningstest.

Fig 2 är ett tvärsnitt av vävnad från en modell- mus, som hade fått en inflammation och hade fått behand- lingsmedlet enligt uppfinningen, 8 dagar efter att ha fått inflammationen, och fig 3 visar ett liknande snitt av vävnaden från en kontrollmus som fick en hydrofil salva.

Fig 4 visar utseendet på en skada på en mus som hade fått en brännskada och som hade fått behandlings- medlet enligt uppfinningen, 6 dagar efter att ha fått brännskadan, och fig 5 visar en liknande bild av skadan på en kontrollmus.

Fig 6 visar ett tvärsnitt av vävnad från en mus som hade fått en brännskada och hade fått behandlings- medlet enligt uppfinningen, på 4:e dagen av bränn- skadan, och fig 7 visar ett liknande snitt av vävnad från en kontrollmus.

Fig 8 och 9 visar var och en utseendet hos skadan på en kanin som hade ihärdig hudavflagning och hade fått behandlingsmedlet enligt uppfinningen, på den 7:e dagen av hudavflagningen, och fig 10 visar en liknande bild av skadan hos en kontrollkanin.

Fig ll och 12 visar var och en utseendet av en skada på en mus som hade avflagnad hud och hade fått behandlingsmedlet enligt uppfinningen, på den 2l:a dagen av avflagningen, och fig 13 visar en liknande bild av skadan på en kontrollmus.

Fig 14 är en graf som visar utvecklingen av horn- hinneepitelceller.

Fig 15 visar ett tvärsnitt av parodontium från .En (§\ CO -q .ß Ö\ 10 15 20 25 30 35 4 en mus som hade fått ett sår och fick behandlingsmedlet enligt uppfinningen, på den 7:e dagen av såret och fig l6 visar en liknande vy av en kontrollmus.

Bästa sätt att genomföra uppfinningen Sàrläkningsmedlen enligt föreliggande uppfinning inbegriper medel för behandling eller läkning av yttre skador eller sår, såsom skavsår, skärsår, brännskador (thermal burn, ambustion), frostskada, hudsàr, hud- sprickor, cutis hyperkeratosis, småsprickor, brist- ningar, dermatit, dermatomykosis pedis-sår, snittsår, hornhinnesár och liknande; medel för läkning av en analfistel och liggsår; inflammationsbehandlingsmedel för alveolar-pyorrê, finnar och solbränna; och hårregene- rerande medel inklusive hårtillväxtfrämjande medel och hàrtonika. i Kosmetikan enligt föreliggande uppfinning inbegri- per hudkosmetika av olika former, såsom lotion, kräm, mjölklotion, puderunderlag (foundation), såväl som olika typer av hårkosmetika att påföras på hårbotten eller håret, såsom shampoo, sköljmedel, hårvatten, läggningslotion och hårtonikum. Dessa kosmetika kan anbringas på huden vid sådana tillfällen som efter rakning, efter anbringande av hårborttagningsmedel eller efter användningen av en detergent, eller kan anbringas på hud som blivit grov; och kan uppvisa hudskyddande eller -förbättrande effekter, förse huden med fuktig eller slät känsel och märkbart förbättra mjukningsbehandlingseffekt och affinitet hos huden.

Det är väsentligt att sårläkningsmedlet, det hârregenererande medlet och kosmetikat enligt förelig- gande uppfinning innehåller ovomakroglobulin som aktiv komponent.

Ovomakroglobulin är känd som ett sockerprotein som finns i äggalbumin och metoderna för framställning därav är även kända inom tekniken [Feeney R. E. et al, Comp. Biochem. Physiol., 54A, 281 (l976); Ikari 92, 1679-1682 (1982), Ibid. 93, et al, J. Biochem., 10 15 20 25 30 35 -h- O\ CG <1 _f>.

Ch 5 121-127 (l983); och Nagase et al, J.B.C. vol. 258, Nr 12, 7481-7489 (1983)].

Användningen av ovomakroglobulin som tillsats till cellodlingsmedier är redan känd inom tekniken (t ex genom japanska offentliga patentansökan nr 237989/1985).

Det finns ingen specifik begränsning beträffande äggalbuminers användning som råmaterial för framställ- ning av ovomakroglobulin. Allmänt föredragna sådana kan vara de från lättillgängliga ägg, såsom ägg från höns, ankor, vaktlar, kalkoner och liknande, även om sådana från olika andra djur även kan användas.

Det föreligger inte heller någon speciell begränsning beträffande metoden för framställning av ovomakroglo- bulin från äggalbumin. Olika förfaranden som använder sig av ovomakroglobulinets fysikalisk-kemiska egenskaper kan användas enligt konventionellt använd teknik för separering av proteinkomponenter. Dessa förfaranden inbegriper t ex behandling med ett proteinfällningsmedel, molekylsiktskromatografi (gelfiltrering), jonbytes- kromatografi, centrifugering, elektrofores, dialys och liknande. De kan användas antingen oberoende eller i kombination med andra förfaranden.

Ett exempel på ett förfarande för framställning av ovomakroglobulin från äggalbumin inbegriper att man först avlägsnar olösliga proteiner, såsom ovomucin, antingen genom att blanda äggalbuminet med en vatten- haltig lösning, såsom Tris-HC1-buffert, eller genom att till äggalbuminet sätta polyetylenglykol eller liknande förening, och därefter utsätter man det olös- liga proteinfria äggalbuminet för gelfiltrering, vari- genom man erhåller ovomakroglobulin som ett sockerpro- tein med en molekylvikt av 600000-800000.

Sårläkningsmedlet enligt föreliggande uppfinning kan framställas genom att blanda dess beståndsdelar till konventionella doseringsformer enligt metoder som är kända med undantag av införlivandet av ovomakro- globulin. !'\ .rd- Gfi CO ~<1 42:. 10 15 20 25 30 35 Cfi 6 En lämplig doseringsform kan väljas bland olika former beroende på användningsändamålet. Sådana dose- ringsformer kan vara antingen konventionella former för yttre applicering, såsom vätskeformigt överdrag- ningsmedel, lotion, aerosol, liniment, salva och gröt- omslag, eller någon annan speciell doserings- eller appliceringsform, såsom suppositorium, injektions- lösning etc. Olika spädmedel och bärare kan användas alltefter vad som är lämpligt vid framställningen av ovannämnda olika former. Exempelvis vid framställ- ning av salvor för yttre påföring kan konventionella hydrofila eller lipofila basmaterial, inklusive fetter, feta oljor, lanolin, vaselin, vax, glykoler, högre alkoholer, glycerol, vatten och liknande, användas.

Förutom dessa basmaterial kan även olika tillsatser som i och för sig är kända inom tekniken, såsom stabili- seringsmedel, lukt- och smakgivande medel och färgmedel, även införlivas alltefter vad som erfordras.

Det finns ingen speciell begränsning beträffande mängden av den aktiva komponenten, ovomakroglobulin, som skall införlivas i behandlingsmedlet enligt före- liggande uppfinning. Den specifika mängden kan bestäm- mas inom ett vidare område, även om den vanligen ligger inom området 0,000l-30 vikt%.

Mängden och metoden för anbringande av behand- lingsmedlet enligt uppfinningen kan bestämmas beroende på doseringsformen, mängden av den aktiva komponenten som finns däri, patientens ålder, kön eller andra betingelser, och graden eller utsträckningen av såret eller skadan. I fallet med behandlingsmedel i en form för yttre applicering kan det t ex anbringas en eller flera gånger per dag, genom att pudra med det eller belägga det på skadan i en sådan mängd att medlet kan sträcka sig över hela skadans område.

Ett hàrregenererande medel i synnerhet kan t ex anbringas i hårbotten eller på håret. 10 15 20 25 30 35 __: a.

GW C' O “<1 -F.>.

O\ 7 Kosmetikan enligt uppfinningen kan även beredas till olika former såsom nämnts ovan, t ex former för applicering på huden, såsom lotioner, krämer, mjölk- lotioner och puderunderlag, och former för applicering i hårbotten eller på håret, såsom shampoo, sköljmedel, hårvatten, läggningsvätska och hàrtonika. Beredningen av dessa former kan åstadkommas enligt konventionella metoder med undantag av införlivandet av ovomakroglo- bulin i kosmetikat. Olika kända kosmetikabaser såväl som olika kända tillsatser, såsom lukt- och smakgivande medel, antioxidant, ytaktivt medel, antiseptika, används likaså.

Mängden ovomakroglobulin som skall införlivas i kosmetikat enligt uppfinningen kan bestämmas inom ett vidsträckt område beroende på kosmetikats form, den avsedda effekten och liknande. Den kan vanligen vara från 0,000l till 30 vikt%, företrädesvis 0,000l-0,1 vikt%.

Föreliggande uppfinning kommer nu att beskrivas närmare med hjälp av exempel och referensexempel.

Referensexempel 1 Framställning av ovomakroglobulin: 20 kg äggalbumin suspenderades i 10 mM Tris-HCl- -buffert (pH 7,7) innehållande samma mängd 1% NaCl.

Till suspensionen sattes polyetylenglykol (molekyl- vikt = 8500; produkt från Tokyo Chemicals Co, Ltd) i en sådan mängd att dess koncentration blev 2,5%.

Blandningen utsattes för en kontinuerlig centrifugering vid 10000 r/min för uppsamling av en supernatant, till vilken sattes vidare samma polyetylenglykol till en koncentration av 10%. Den centrifugerades återigen kontinuerligt vid 10000 r/min för uppsamling av fäll- ning. Fällningen löstes i samma buffert som ovan och centrifugerades vid 10000 r/min i 10 min för uppsamling av en supernatant, vilken anbringades på en 252 x 900 mm Cephalose CL-6B-kolonn (varumärke: produkt från Pharma- cia Co.) och eluerades med ovannämnda buffertlösning med en flödeshastighet av 3,6 liter per h.

I* -1- O\ CI) 10 15 20 25 30 35 4-3 8 Från de eluerade fraktionerna uppsamlades trypsin- inhiberingsaktiva fragment genom användning av den metod för mätning av trypsininhiberingsaktivitet, baserad på ett kaseinsubstrat, som föreslagits av Kitamoto et al [T. Kitamoto, M. Nakashima och A. Ikai, J. Biochem.,192, 1679-1682 (1982)).

De sålunda erhållna aktiva fraktionerna koncent- rerades därefter med Pelicon-kassett (varumärke: till- verkare Millipore Co.) försedd med ett 100000 molekyl- siktsmembran, under utbyte av bufferten mot en 5 mM Tris-HCl-buffert (pH 7,7). Det sålunda erhållna provet anbringades på en 50 x 800 mm DEAE Trisacryl M-kolonn (varumärke: produkt från LKB Co.), som hade inställts på jämvikt med en 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7,7) försatt med 10 mM NaCl. Efter att ha tvättats noga med 10 mM Tris-HCl-buffert eluerades kolonnen med 675 ml av en 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7,7) innehållande 50 mM NaCl i 2,5 h och 675 ml av en 10 mM Tris-HCl- -buffert (pH 7,7) innehållande 150 mM NaCl i 2,5 h.

De trypsininhiberingsaktiva fraktionerna eluerades mellan 70 mM och 120 mM NaCl-koncentrationer under dessa betingelser.

De trypsininhiberingsaktiva fraktionerna uppsam- lades och dialyserades mot en 1 mM fosfatbuffert (pH 7,4). Efter att ha dialyserats noggrant lyofiliserades den dialyserade inre vätskan med hjälp av en frystork- ningsanläggning (tillverkad av Labocorn Co.).

Ett prov av ett renat ovomakroglobulin som vägde 5,9-7,1 g erhölls genom ovannämnda förfaranden.

Det sålunda erhållna renade provet hydrolyserades i en tillsluten behållare under reducerat tryck vid 1l0°C i 24 h och analyserades med hjälp av en amino- syraanalysator (typ 835-50 Hitachi High Performance Amino Acid Analyzer; varumärke, tillverkad av Hitachi Ltd.).

Resultaten visas i nedanstående tabell l. 10 15 20 25 30 35 gs Cm Co \'l -l> O\ 9 Tabell 1 Aminosyra Halt (mo1%) Asp 10,3 Thr 6,4 Ser 8,0 Glu 11,6 Pro 4,3 Gly 5,1 Ala 5,8 Cys/2 1,8 Val 8,2 Met 2,0 Ile 6,5 Try 3,9 Phe 4,8 Lys 4,6 His 1,8 Arg 3,6 Exempel 1 Test av inhibering av vaskulär permeabilitet vid bränn- skada: Ändamålet med detta test är att utvärdera den sàrläkande effekten hos behandlingsmedlet enligt upp- finningen, varvid man såsom indikator tar den vaskulära permeabiliteten hos en råtta, vilken bestäms genom mätning av mängden av ett transuderat färgat ämne som finns i kroppsvätskan, vilket läcker ut ur bränn- skadan på råttan. Råttan hade en brännskada på huden som upprätthållits med hjälp av ett elektriskt järn och hade fått det färgade ämnet (Evans blue).

Testet genomfördes enligt följande: De använda djuren var 10 Wistar hanråttor som vägde 200-250 g. Ráttorna uppdelades i tvâ grupper om vardera 5. På varje råtta i grupperna klipptes håret symmetriskt längs ryggens medianlinje med en hàrklippningsanordning. En cirkulär brännskada med 1 cm diameter gjordes på den ena sidan av varje djurs <1» C3- 10 15 20 25 30 35 10 rygg genom att därpå sätta ett elektriskt järn (tempe- raturen på termometerskalan: 100-ll0°C) i 20 s. Den andra sidan av ryggen lämnades obränd.

Varje råtta i den första gruppen fick intradermala injektioner av en 0,2 ml fysiologisk saltlösning på både brända och obrända ställen på sin rygg, omedelbart efter den termiska bränningen och 24 h därefter. Denna grupp kallas gruppen som fick fysiologisk saltlösning eller kontrollgruppen. Djuren i den andra gruppen fick intrakutant på samma sätt som ovan 0,2 ml av en ovomakroglobulinlösning med en koncentration av 10 mg/ml. Denna grupp av djur kallas gruppen som fick ovomakroglobulin eller testgruppen. 23,5 h efter administrationen av den fysiologiska saltlösningen eller ovomakroglobulinlösningen'fick varje råtta i båda grupperna intravenöst 0,5 ml/kg av en 0,5% färgvätska av Evans blue. 30 min därefter, dvs 48 h efter brännskadan, fick varje råtta förblöda och både dess brända och obrända hud drogs av. Efter avlägsnande av fettet som häftade vid huden skars den till en fyrkant av 1 cmz. l cmz fyrkanten av huden doppades i 1 ml av en lN vattenhaltig KOH-lösning, lämnades i 20 h vid 37°C för att lösas upp i lösningen, försattes med 9 ml (5:l3): omrördes med en blandare och centrifugerades vid 3000 av en blandad lösning av 0,6N H3PO4 och aceton r/min och 25fC för uppsamling av en supernatant.

Den optiska densiteten för supernatanten mättes med en spektrofotometer vid en våglängd av 620 nm.

Mängden transuderad Evans blue (pg) bestämdes från den optiska densiteten genom användning av en tidigare “ framställd standardkurva. De erhållna värdena är be- tecknade med (medelvärde É standardavvikelse).

Resultaten visas i tabell 2. 10 15 20 25 30 35 746 4*- Cm CJ 11 Tabell 2 Kontrollgrupp Testad grupp Dos (ml/ställe) 0,2 0,2 (10 mg/ml) Bränt ställe 28,7j5,49 l6,2j3,82 Obränt ställe 3,6j0,4l 4,4f0,4O Bränt ställe - obränt ställe 25,0j5,32 ll,8f3,55 Man ser av ovanstående tabell att det transuderade Evans blue representerat av värdet [(bränt ställe) - (obränt ställe)] är 25,0j5,32 för kontrollgruppen (gruppen som fått fysiologisk saltlösning), medan motsvarande värde var ll,8f3,55 för testgruppen (grup- pen som fick ovomakroglobulin). Dessa resultat visar en markerad inhibering av den vaskulära permeabiliteten genom administration av ovomakroglobulin.

Exempel 2 Terapeutiskt test av hårborttagningskrämspåverkad hud Inflammation Tjugo Balb/c hanmöss som var och en vägde 25-30 g användes för testet. Hår på ryggen av varje testad mus klipptes noga med en hårklippningsapparat och 0,5 g av hàrborttagningskrämen (Mavi Hair Remover; varumärke, Kanebo Co., Ltd.) anbringades jämnt på det 2,0 x 2,5 cmz torkades krämen bort med varmt vatten, vilket åstadkom stora klippta området. 30 min därefter den inflammerade hudmodellen.

Mössen uppdelades i 5 grupper, med 4 i varje grupp, och varje mus i 4 grupper fick ett testsalv- prov såsom beskrivs nedan på dagen för inflammationen, påföljande dag och de 3:e och 6:e dagarna, en gång om dagen 4 gånger totalt, genom anbringande av 0,3 g av nämnda salva på det inflammerade stället av huden.

Var och en av dessa grupper betecknas testgrupperna nr 1-4. 468 746 10 15 20 25 30 12 Testgrupp l: Japanese Pharmacopeia hydrofil salva (produkt från Yoshida Pharmaceutical Co., Ltd.) anbringades.

Testgrupp 2: Ovanstående salva försatt med 0,01% ovo- makroglobulin anbringades.

Testgrupp 3: Ovanstående salva försatt med 0,005% ovomakroglobulin anbringades.

Testgrupp 4: Ovanstående salva försatt med 0,00l% ovomakroglobulin anbringades.

Mössen i den kvarstående gruppen lämnades som de var utan behandling för iakttagelse av dem såsom kontroller (kontrollgruppen).

Efter anbringande av salvorna gjordes makroskopiska och histologiska iakttagelser varje dag beträffande tillståndet hos huden på varje mus, både i testgrupperna och i kontrollgruppen. De histologiska iakttagelserna genomfördes med hjälp av ett mikroskop på prover färga- de med hematoxylin och eosin (HE-färg). I Som ett resultat härav fann man att på den första dagen av hårborttagningsbehandlingen hade mössen i kontrollgruppen inflammationer i överhud och läderhud, varvid inflammatoriska celler såsom histiocyter och neutrofiler koagulerade, varvid särskilt intensiv inflammation iakttogs i överhuden och läderhuden där intill och ämnen som var starkt färgade av eosin sträckte sig ut där omkring. På den fjärde dagen såg man att vävnadsbilden från överhuden och läderhuden intill denna hade förändrats till en inflammatorisk bild och inflammationen hade sträckt sig ut över hela hårsäcks- området.

Man iakttog inga skillnader mellan testgruppen l (mössen på vilka den hydrofila salvan applicerades) och kontrollgruppen. 10 15 20 25 30 35 746 CO 46 13 Däremot iakttogs med avseende på mössen i test- grupperna 2-4 markant inhibering av inflammationen i överhuden, läderhuden och hárfolliken, och Vävnads- bilden ansågs ha återhämtat sig väl. Det visar sig att med avseende på mössen i gruppen som fick salvan med den minsta ovomakroglobulinkoncentrationen (test- grupp 4) var läkningen eller de inhiberande effekterna mindre.

Vid den histologiska iakttagelsen av testgrupp 3 (mössen som fick salva med en 0,005% ovomakroglobulin- koncentration) var vävnadsbilden på den 8:e dagen efter hårborttagningsbehandlingen klarare än den som iakttogs på den 4:e dagen och det bekräftades att nya hårsäckar hade växt in i den subkutana vävnaden (fig 2). Resultaten som iakttogs i testgrupp Å på den 4:e dagen liknar dem hos mössen i testgrupp 1, dvs de som fick ovomakroglobulinfri hydrofil salva (fig 3).

Det skall noteras att överhuden hos en mus normalt har en ojämn, grov form. Man såg på de testade mössen i testgrupperna 2-4 att läkningen av skador hade fram- skridit i en sådan utsträckning att deras överhud hade börjat anta den ovannämnda normala ojämna eller grova formen och cellerna avseende hårtillväxt hade ökat och utvecklats markant, med en därmed sammanhängan- de tidig reproduktion av hår (se t ex fig 2).

Exempel 3 Brännskadeläkningstest: Fem grupper av möss, varvid varje grupp bestod av 4 Balb/c hanmöss som var och en vägde 25-30 g använ- des för testet.

Hår på ryggen på varje testad mus skars noga av med en hårskärningsapparat och en hårborttagnings- kräm anbringades på huden med det avklippta håret.

Efter att ha lämnat musen i 5 min (varvid inflammation sannolikt inte inträffar) torkades krämen bort med varmt vatten. 468 746 10 15 20 25 30 35 14 Därefter brändes ett 1,5 x 2,5 cmz område av musens rygg, där håret klippts, genom anbringande av ett elektriskt järn (T-27, Paraffin Cutting Fuse Iron; varumärke, produkt från Takashima Shoten, Japan) vid en temperatur av 350-400°C i 5 min.

Med början dagen efter brännskadan och var tredje dag därifrån anbringades salvorna som beskrivs nedan på varje testad mus i en mängd av 0,2 g per mus varje gång och man gjorde iakttagelser beträffande viktför- ändringar såväl som både makroskopiska och histologiska iakttagelser av skadorna.

Testgrupp 1: Japanese Pharmacopoeia hydrofil salva (produkt från Yoshida Pharmaceutical Co., Ltd.) anbringades.

Testgrupp 2: Ovanstående salva försatt med 0,Öl% ovo- makroglobulin anbringades.

Testgrupp 3: Ovanstående salva försatt med 0,005% ovomakroglobulin anbringades.

Ovanstående salva försatt med 0,00l% ovomakroglobulin anbringades.

Testgrupp 4: Mössen i den kvarvarande gruppen lämnades som de var utan behandling för att kunna betrakta dem som kontroller (kontrollgruppen).

Resultaten av kroppsviktsförändringarna hcs de testade mössen visas i fig l, vari antalet dagar och viktförändringsförhållandet är uppritade längs abskissan respektive ordinatan. Figuren visar viktförändringarna uttryckta som ett förhållande mellan kroppsvikten mätt varje dag efter det att djuren utsatts för bränn- skadan (l-4 dagar i fig l) och kroppsvikten mätt på själva dagen för brännskadan (dag 0 i fig l). I figuren avser den streckprickade linjen (1) värden erhållna för testgrupp 4 (gruppen som fick salva innehållande 0,00l% ovomakroglobulin), den streckade linjen (2) avser värdena för testgrupp 1 (den grupp som fick ovomakroglobulinfri hydrofil salva) och den heldragna linjen (3) avser värdena för kontrollgruppen. 10 15 20 25 30 35 468 746 15 Resultaten av de erhållna viktförändringarna återspeglar noga graden av brännskada, Kroppsvikten ökade nämligen efter det att djuren fått brännskadan, eftersom framskridandet av den vaskulära permeabiliteten och okänsliga perspirationen förorsakade av lokal inflammation producerar ödem, som blir större beroende på storleken på området som utsatts för brännskadan.

Fig l visar tydligt att det inte föreligger någon indikation på en ökning av kroppsvikten beträffande testgrupp 4, eftersom tillväxten av ödem undertrycktes hos djur i denna grupp i jämförelse med kontrollgruppen och testgruppen 1, dvs den grupp som fick ovomakro- globulinfri hydrofil salva.

Som resultat av makroskopiska iakttagelser i ovanstående test fann man att djur som tillhörde test- grupperna 2-4 markant hade återhämtat sig från bränn- skadan i jämförelse med dem som tillhörde kontroll- gruppen och testgrupp l. Detta visas klart även genom en jämförelse mellan fig 4 (ett fotografi av skadan på ett djur i testgrupp 4 den 6:e dagen efter brännskadan) och fig 5 (ett liknande fotografi av en kontrollmus).

Histologiska iakttagelser med hjälp av HE-färger gjordes enligt samma metod som i exempel 2.

Resultaten var att på den 4:e dagen efter bränn- skadan hade mössen i kontrollgruppen och testgrupp 1 överhud och läderhud fullständigt ersatta av eosin- färgade material, vilket är karaktäristiskt för en brännskada, och hade hårsäcken endast som sin form (se fig 7 som är ett mikroskopfotografi på den 4:e dagen efter bränningen hos kontrollgruppen). I motsats härtill visade de grupper som hade fått sårläknings- medlet enligt uppfinningen (t ex testgrupp 3) det faktum att vävnaderna höll på att läka intill de sub- kutana vävnaderna i läderhuden, i vilken bildning av läderhudsliknande vävnader hade börjat och hårrötter gynnsamt växte (se fig 6; ett mikroskopfotografi den 4:e dagen efter förbränningen hos testgrupp 3, 468 746 10 15 20 25 30 35 16 som hade fått salva innehållande 0,005% ovomakroglo- bulin).

Sammanfattningsvis konstateras att den ödeminhi- berande effekten och den sårläkande effekten bekräf- tades makroskopiskt och vidare att hud- eller hår- återhämtningseffekterna, dvs effekter som befrämjar vävnadsbildningen, iakttogs histologiskt. ësfflêsli Organoleptisk utvärdering av kosmetikan enligt uppfin- ningen: En panel på 10 kvinnor (ålder 25-35) med en känsla av förgrovad hud utvaldes för testet. Varje panel- deltagare fick kosmetikat enligt uppfinningen (hud- mjölk enligt beredning l nedan) anbringad på huden två gånger per dag, efter att ha stigit upp och innan man gick till sängs, i 2 veckor och efter slutet av perioden besvarade de tre frågor som beskrivs nedan.

Som kontrolltest utvärderades ett kosmetiskt kontrollprov framställt på samma sätt som ovanstående kosmetikum enligt uppfinningen men under uteslutning av ovomakroglobulin, på samma sätt som ovan av 5 panel- deltagare med liknande känsla av förgrovad hud.

Resultaten av den organoleptiska utvärderingen visas i tabell 3, vari värdet (täljare/nämnare) visar (antalet paneldeltagare som svarade gynnsamt på den utvärderade frågan/totala antalet paneldeltagare).

.Tabell 3 Utvärderad fråga Kosmetikum enligt Kontroll- uppfinningen kosmetikum Fuktighetskänsla 9/10 1/5 Släthetskänsla 10/10 2/5 Upplösning av hud- grovhet 9/10 2/5 Det framgår av ovanstående tabell 3 att kosmetika- provet enligt uppfinningen med införlivat ovomakro- globulin uppvisar utmärkta resultat i det organolep- tiska testet. 10 15 20 25 30 35 468 746 17 Exempel 5 Test avseende läkning av hudskärsår: (1) att åstadkomma 5 tjocka uppsplittrade sår (thick-split Ryggen på en kanin skars med en silverkniv för broken wounds), vart och ett med en storlek av 25 mm x 25 mm och ett djup av 1,2 mm. Vart och ett av såren befann sig åtminstone 30 mm från de andra för att eliminera effekten av sårläkningsmekanismer mellan dem.

(A)-(D) som beskrivs nedan anbringades på varje sår en gång om dagen, varvid Var och en av medicinerna ett sår lämnades utan någon behandling för att utvärdera detta som en kontroll. Efter appliceringen täcktes såren med gasväv (storlek 25 mm x 25 mm), förseglades med luftgenomtränglig nylonfilm (Tegadam; registrerat 3M Ltd.) för att undvika kontamination med andra läkemedel och hela sårområdet tillslöts varumärke, med ett elastiskt bandage. Dessa behandlingar följdes under hela iakttagelseperioden.

Läkemedel (A) Hydrofil vaselinsalva Blekt bivax Stearylalkohol Kolesterol Vitt vaselin 86 0,0625 (100 Propylparaben fl-QLQKQLQLQLQ Hydrofil vaselinsalva innehållande 1% ovomakroglobulin % vattenhaltig ovomakroglobulin- lösning (innehållande 40 mg metyl- paraben) 20 g Hydrofilt vaselinbasmaterial 80 g Hydrofil vaselinsalva innehållande 0,l% ovomakroglobulin 0,5% vattenhaltig ovomakroglobulin- lösning (innehållande 40 mg metyl- paraben) 20 9 468 74-6 10 15 20 25 30 35 18 Hydrofilt vaselinbasmaterial 80 g (D) Hydrofil vaselinsalva innehållande 0,01% ovomakroglobulin 0,05% vattenhaltig ovomakroglobulin- lösning (innehållande 40 mg metyl- paraben) 20 g 80 g Utvärdering av sårläkemedlen genomfördes genom Hydrofilt vaselinbasmaterial (2) iakttagelser av följande punkter omedelbart efter åstadkommandet av såret och 7, 14 och 21 dagar därefter. (a) Epitelisering av såret Framskridandet av läkningen utvärderades genom att ta fotografier vid varje iakttagelse. (b) Histologiska iakttagelser En skadad fas undersöktes och mängden kollagen- fibrer, dess morfologi i granulationsvävnader och det bildade epiteliet iakttogs med avseende pà HE-fär- gade prover. (c) Utvärdering av bieffekter.

Närvaron eller frånvaron av stimulering på normal hud (rodnad) och hudinflammation iakttogs.

Resultat I ovanstående försök var den 7:e dagen efter sårskadan storleken på såren, på vilka salvor inne- hållande 0,01% och 0,l% ovomakroglobulin anbringats, något mindre (se fig 8 och 9) än på dem på vilka den hydrofila salvan anbringats (se fig 10) och de histo- logiska iakttagelserna avslöjade bildningen av granu- lationsvävnader. Man iakttog vidare framskridande av sårläkningseffekterna av ovomakroglobulin på den 14:e dagen, dvs den iakttagna storleken på sår, på vilka salvor innehållande 0,01% och 0,l% ovomakro- globulin hade applicerats, var markant mindre än de på vilka den hydrofila salvan applicerats. Skillnaderna mellan dem var likaså tydliga vid de histologiska iakttagelserna, uttryckta som bildning av granulations- vävnader, mängd kollagen och tillväxt av epitelvävnader.

Iakttagelserna pá dag 21 efter åstadkommandet av såret 10 15 20 25 30 35 468 746 19 avslöjade den märkbart avkortade tiden för läkning av de ställen på vilka de 0,01% och 0,l% ovomakroglobu- lininnehållande salvorna applicerades (fig ll och 12) jämfört med de ställen på vilka vaselinsalvan anbringats (fig 13). Effekten iakttogs likaså vid de histologiska observationerna, dvs granulationen, ökningen av kollagenfibrer och tillväxten av epitel- celler var anmärkningsvärd. Som ett annat försök app- licerades en ovomakroglobulinsalva på normal hud för att iaktta dess bieffekter. Som resultat härav sågs varken några röda fläckar på huden eller någon förekomst av dermatitis.

Försöket med användning av salvan med en 0,l% ovomakroglobulinhalt gav liknande resultat som det med användning av salvan med en 0,l% ovomakroglobulin- halt.

Exemgel 6 Utsträckningstest på hornhinneepitelceller: En kanin som vägde 2,5-3,0 kg bedövades genom intravenös administration av pentobarbital (produkt från Pitman-Moor Co.) i en mängd av 30 mg/kg. Hornhinnan togs därefter ut och man gjorde 2-4 mn remsor av horn- hinnebitar.

De sålunda erhållna hornhinnebitarna odlades i 24 h i TC-199 kulturlösningar, i vilka ovomakro- globulin lösts till koncentrationer av 0,05 pg/ml, 0,5 pg/ml och 5 pg/ml. Efter odling fixerades Vävnads- bitarna med en blandad lösning av 5% isättiksyra och 95% etanol och inbäddades i paraffin, varur skars 4 pm bitar. Dessa bitar utsattes för konventionella HE-färgningar och längden på de utsträckta hornhinne- epitelcellerna mättes genom iakttagelse genom ett mikroskop.

Som resultat fann man att ovomakroglobulin befräm- jade utsträckningen av hornhinneepitelceller på ett dosberoende sätt, såsom visas i fig 14, varvid A visar kontrollerna, TC-199 kulturlösningen, och B, C och D anger samma kulturlösningar, till vilka satts 0,05 ug/- ml, 0,5 ag/ml respektive 5 ng/ml ovomakroglobulin. 468 746 10 15 20 25 30 20 ggempel 7 Terapeutiskt test avseende parodontiumsår: Sår bildades på parodontium hos råttor enligt följande metoder l och 2 för att studera den terapeu- tiska verkan av behandlingsmedlet enligt uppfinningen.

Beredning av sår l. En hakeförsedd sond insattes runt centrum av de högra och vänstra övre bakre tänderna från gomsidan på en råtta (ålder 12 veckor). Efter det att sonden nått benet fördes den fram och tillbaka flera gånger längs kronan för att bilda ett sår. Därefter insattes en rotkanalterapi K file nr 40 alldeles under kontakt- punkten för den högra andra bakre tanden, varigenom man åstadkom en väg mellan kindsidan och gomsidan.

En silketråd (bladsilke) 4-0 lindades en gång runt den andra bakre tanden och knöts på kindsidan. Efter bekräftande hemostas anbringades pastan. Alla dessa förfaranden genomfördes under abdominal anestesi med användning av Ketaral. 2. Avlägsnande av tandköttet genomfördes genom att göra ett snitt från den efferenta delen av den tredje bakre tanden genom den mesiala delen av den första bakre tanden med användning av en #12 sax med fågel- näbbsblad och sätta in en sond med hake och vrida fram och tillbaka därigenom. En benfas exponerades ungefär 0,5 mm.

Testpasta (A) Kontrollpasta Hydrofil vaselinpastax 100 g (B) Pasta med en 0,005% ovomakroglobulin- halt 0,025% vattenhaltig ovomakroglobulin- lösning (innehållande 40 mg metyl- paraben) 20 g Hydrofilt vaselinx 80 g (C) Pasta med en 0,l% ovomakroglobulinhalt l0 15 20 25 30 468 746 21 0,5% vattenhaltig ovomakroglobulin- lösning (innehållande 40 mg metyl- 0 20 g 80 g x Sammansättning av det hydrofila vaselinet (per 100 9) paraben) Hydrofilt vaselinx Blekt bivax 8 g Stearylalkohol 3 g Kolesterol 3 g Vitt vaselin 86 g Propylparaben 0,0625 g Administrationssätt Var och en av ovanstående pastor placerades på en bricka och anbringades på en råtta en gång om dagen, under 15 min varje gång, i en mängd av ca 0,32 g i medeltal. Den första appliceringen gjordes efter be- kräftelse av hemostas och djuren fick inte dricksvatten 2 h efter appliceringen. Ovanstående förfaranden genom- fördes under abdominal anestesi med Nembutal (0,1 ml) Utvärdering De behandlade råttorna dödades den första dagen efter experimentets början och de 2:a och 7:e dagarna.

Skadorna togs bort, fixerades med Bouin fixativ, av- kalkades med triklorättiksyra, inbäddades i paraffin, färgades med HE eller azan och iakttogs med avseende på undersökning av antalet inflammerade celler och förändringar i kollagenfibrer.

Resultat De terapeutiska effekterna av sårläkningsmedlet enligt uppfinningen på dagen efter sårberedningen och appliceringen av medlet enligt uppfinningen därpå, uttryckt som befuktning av inflammatoriska celler, blödningstillståndet i vävnaderna och kollagenfibrernas tillstånd, var följande: (1) tillstånd i vävnaderna: Befuktning av inflammatoriska celler och blödnings- 10 15 20 25 30 35 22 Iakttagelse av kontrollen avslöjade det faktum att det förelåg intensiva kapillarektasi- och blödnings- bilder i området för den gingivala lamina propria som sträcker sig från den gingivala fàrans epitel genom toppen av alveolarbenet, varvid den befuktande fibrinnivån och de skingrade neutrofilerna omger detta område (fig 16). Å andra sidan var blödningstillstàn- det i sår, till vilka det yttre medlet enligt uppfin- ningen givits, inte så intensiv och lamina propria syntes redan ha täckts av fibrinnivàn, även om man iakttog kapillarektasi i lamina propria. Befuktningen av lamina propria neutrofiler var mindre än hos kontrol- lerna, även om de intensiva lokaliserade bilderna av befuktande neutrofiler iakttogs på den gingivala fårans epitel och fibrinnivåytan av det förenande epiteliet. När grupperna som fått pastan med 0,005% och O,l% ovomakroglobulinhalt jämfördes hade den senare mindre kapillarektasi och blödningsbilder i lamina propria och syntes ha mindre befuktande neutrofiler i epiteliet är den förra. I fig 15 visas ett fotografi av ett tvärsnitt av vävnad till vilken pastan med en 0,005% ovomakroglobulinhalt hade getts. (2) Kollagenfibertillstánd: Färgningen av kollagenfibrerna gjordes med hjälp av azanfärg. Med användning av HE-färg iakttogs plasmo- tomier, förändringar och liknande hos kollagenfibrer i närheten av och runt såret på kontrollen, medan i sàrproverna, till vilka det yttre medlet enligt uppfinningen hade getts, syntes plasmotomi av kollagen- fibrerna inte ha sträckt sig till området runt såret, även om det förelåg plasmotomier i dess omedelbara närhet. Tendensen var mer intensiv i den grupp som fick pastan med en 0,l% ovomakroglobulinhalt än den som fick pastan med en 0,005% ovomakroglobulinhalt. ëêflßêlå Nedan ges exempel på beredningar av behandlings- medlen enligt uppfinningen. I följande beredningar 10 l5 20 25 30 468 746 23 betecknar siffrorna för de olika beståndsdelarna “vikt- delar".

Beredning 1: Kosmetikum enligt uppfinningen Beredning av hudmjölk Flytande paraffin (100-110 cP) 7 Cetylalkohol 0,5 85% glycerol 7 Ovomakroglobulin 0,01 Dimetylaminopropyllanolinsyraamid- disulfat 0,03 Antiseptika (metylparaben) 0,2 Aromämne lämplig mängd Vatten resten 100 En homogen blandning framställdes genom att först blanda ovomakroglobulin, dimetylaminopropyllanolinsyra- disulfat och glycerol och därefter tillsätta vatten under omröring vid 75°C. En annan homogen blandning framställdes genom att blanda flytande paraffin, cetyl- alkohol och metylparaben under omröring och uppvärma vid 75°C. Därefter tillsattes den förra blandningen gradvis till den senare medan den senare omrördes och hölls vid en temperatur av 75°C. Efter tillsatsen lämnades blandningen för att svalna till rumstemperatur och därefter tillsattes aromämnet för att erhålla en hudmjölk enligt uppfinningen.

Beredning 2: Kosmetikum enligt uppfinningen Beredning av hudkräm Flytande paraffin (100-110 CP) 5 Isopropylmyristat 10 Stearinsyra Cetanol 2 85% glycerol 10 Polyoxietylenstearat (EO = 4) l Ovomakroglobulin 0,001 Dimetylaminopropyllanolinsyraamid- disulfat 0,04 CO sa 10 15 20 25 30 35 <4» 24 Antiseptika (metylparaben) 0,2 Aromämne lämplig mängd Vatten resten 100 Hudkrämen enligt uppfinningen bereddes baserad på ovanstående recept och enligt samma metod som vid ovanstående hudmjölk enligt beredningen 1.

Beredning 3: Kosmetikum enligt uppfinningen Beredning av hudlotion 95% etylalkohol 20 85% glycerol 5 Polyoxietylensorbitanlanolinsyra- monoester (EO = 20) 0,5 Ovomakroglobulin 0,005 Dimetylaminopropyllanolinsyraamid- disulfat 0,04 Antiseptika (metylparaben) 0,2 Aromämne och färgämne Vatten lämplig mängd šÉ§ÉÉE__ 100 En homogen blandning framställdes genom att först noga blanda ovomakroglobulin, dimetylaminopropyllano- linsyraamiddisulfat och glycerol och därefter tillsätta vatten under omröring. En annan homogen blandning framställdes genom att lösa aromämnet och färgämnet och antiseptikan i etylalkohol, varefter den förra blandningen sattes till den senare under omröring och filtrerades därefter för erhållande av hudlotionen enligt uppfinningen.

Beredning 4: Kosmetikum enligt uppfinningen Beredning av en hudlotion Hudlotionen framställdes enligt samma recept och på samma sätt som ovanstående hudlotion enligt beredning 3, med undantag av att mängden ovomakroglo- bulin som tillsattes var 0,000l viktdel i denna be- redning 4. 10 15 20 25 30 35 468 746 25 Beredning 5: Behandlingsmedel enligt uppfinningen Ovomakroglobulin 0,01 g Antiseptikum lämplig mängd Aromämne lämplig mängd Destillerat vatten resten ' 100 m1 Destillerat vatten sattes till ovomakroglobulin, antiseptikan och aromämnet för att göra hela volymen till 100 ml. Efter sterilisering omvandlades lösningen till en spraylösning för erhållande av ett sàrläknings- medel enligt uppfinningen.

Beredning 6: Behandlingsmedel enligt uppfinningen Ovomakroglobulin 0,05 g Antiseptika lämplig mängd Aromämne lämplig mängd Destillerat vatten resten 100 ml Ett behandlingssmedel enligt uppfinningen av spraylösningstyp framställdes baserat på ovanstående recept och på samma sätt som vid ovanstående beredning av behandlingsmedlet enligt uppfinningen enligt bered- ning 5.

Beredning 7: Behandlingsmedel enligt uppfinningen Beredning av en hydrofil salva Ovomakroglobulin 0,5 g Vitt vaselin 250 g Stearylalkohol 220 g Propylenglykol 120 g Natriumlaurylsulfat 15 g Etyl-(eller metyl-)p-oxibensoat 0,25 g Propyl-p-oxibensoat 0,15 g Renat vatten lämplig_m§ng§ 1000 g Ett behandlingsmedel enligt uppfinningen innehål- lande ovomakroglobulin i form av en hydrofil salva bereddes enligt ovanstående recept.

Beredningar 8-ll: Behandlingsmedel enligt uppfinningen Co -I-S- Qx 10 15 20 26 Behandlingsmedel enligt uppfinningen bereddes enligt ovanstående beredning 7, med undantag av att mängden ovomakroglobulin som inblandades i beredningarna 8, 9, 10 och ll var 0,01 g, 0,05 g, 0,1 g respektive l g.

Industriellianvändning Behandlingsmedlet enligt föreliggande uppfinning, framställt såsom beskrivits ovan, uppvisar, när det appliceras som ett sårläkningsmedel, en utmärkt sårläk- ningsbefrämjande effekt som är vida överlägsen andra sårläkningsmedel eller metoder.

När medlet används som ett hårregenererande medel kan det inte endast uppvisa hårtillväxtfrämjande effekt utan även åstadkomma hårskyddande eller hårförbättrande effekt. Dessa effekter kan t ex ge upphov till en upplösning av förgrovade här och förbättring av hârglans.

När medlet vidare används som ett kosmetikum kan det uppvisa skyddande eller förbättrande effekter pà huden eller håret och har olika fördelar framför andra kosmetika av detta slag.

Behandlingsmedlen eller kosmetikan enligt uppfin- ningen har även utmärkt lagringsstabilitet och säkerhet.

Claims (16)

10 15 20 25 30 468 746 27 PATENTKRAV

1. Behandlingsmedel valt ur den grupp som består av ett sårläkningsmedel och hårregenererande medel, k ä n n e t e c k n a t av att det omfattar ovomakro- globulin som en effektiv komponent tillsammans med spädmedel eller bärare.

2. Sårläkningsmedel enligt krav l för läkning av ett sår valt ur den grupp som utgöres av skavsår, skärsår, brännskador, frostskada, hudsár, hudsprickor, kutis hyperkeratosis, småsprickor, bristningar, derma- titis, dermatomykosis pedis-sår, snittsâr, hornhinnesår, analfistel och liggsår.

3. Sårläkningsmedel enligt krav 1 för läkning av inflammationer.

4. Sárläkningsmedel enligt krav 3 för läkning av alveolar-pyorré. _

5. Hårregenererande medel enligt krav 1 i form av ett hårtillväxtmedel eller hártonikum.

6. Behandlingsmedel enligt ett eller flera av kraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t av att det om- fattar 0,000l-30 vikt% ovomakroglobulin.

7. Kosmetikum, k ä n n e t e c k n a t av att det omfattar ovomakroglobulin som effektiv komponent tillsammans med spädmedel eller bärare.

8. Kosmetikum enligt krav 7, k ä n n e t e c k - n a t av att det är ett hudkosmetikum.

9. Kosmetikum enligt krav 8, k ä n n e t e c k - n a t av att det är i form av en lotion, kräm, emulsion eller puderunderlag.

10. Kosmetikum enligt krav 7, k äun n e t e c k - n a t av att det är ett hårkosmetikum.

11. ll. Kosmetikum enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a t av att det är ett shampoo, sköljmedel, hárvatten, läggningsvätska eller hårtonikum. Cm CO 10 746 28

12. Kosmetikum enligt ett eller flera av kraven 7-ll, k ä n n e t e c k n a t av att det omfattar 0,000l-0,1 vikt% ovomakroglobulin.

13. Användning av ovomakroglobulin för framställ- ning av ett läkemedel för behandling av sår.

14. Användning av ovomakroglobulin ning av ett läkemedel för behandling av

15. Användning av ovomakroglobulin för framställ- inflammationer. för framställ- ning av ett medel för regenerering av hår, såsom ett hàrtillväxtmedel eller hårtonikum.

16. Användning av ovomakroglobulin för beredning av ett kosmetiskt medel för behandling av hud eller hår.