SA99191283B1 - بروتين كلاميديا chlamydia proteinوتسلسل الدين واستخداماته - Google Patents

Abstract

الملخص: يتعلق الاختراع ببروتين كلاميديا protein chlamydia له وزن جزيئي عالي HMW&")&") وتسلسل حمض أميني amino acid منه، وأجسام مضادة تربط تحديدا بروتين HMW وكذلك تسلسل الحمض الأميني amino acid التي ترمزه. كما يتعلق الاختراع بالتركيبات الوقائية والعلاجية، التي تشكل بروتين HMW، أو قطعة منه، أو جسما مضادا يربط تحديدا بروتين HMW أو بروتين منه، أو تسلسل النيوكليوتيد nucleotide التي ترمز بروتين HMW أو قطعة منه، بما في ذلك اللقاحات.

Description

د بروتين كلاميديا ‎chlamydia protein‏ وتسلسل الجين واستخداماته ‎Cha gl)‏ الكامل

خلفية الاختراع

يتعلق الاختراع الحالي بصفة عامة ببروتين كلاميديا ‎protein chlamydia‏ له وزن جزيئي ‎Se‏

‎(HMW)‏ ؛٠‏ وتسلسل الحمض الأميني ‎amino acid‏ منه؛ وأجسام مضادة؛ بما في ذلك الأجسام

‏المضادة للخلايا السامة؛ التي تربط تحديدا بروتين كما يشتمل الاختراع على تركيبات ‎o‏ وقائية وعلاجية تشتمل على بروتين ‎HMW‏ أو قطعة_ منه؛ أو جسم مضاد يربط تحديدا بروتين

‏7 أو بروتين منه أو تسلسل النيوكليوتيد ‎nucleotide‏ التي ترمز بروتين ‎HMW‏ أو قطعة

‏منه؛ بما في ذلك لقاحات. يوفر الاختراع بشكل إضافي طرقا للوقاية من أو علاج أو تخفيف

‏اضطرابات في كائنات ثديية وطيور تتعلق هذه الطرق بأمراض عدوى من كلاميديا ‎chlamydia‏

‏ولحث استجابات مناعية للكلاميديا ‎chlamydia‏ يوفر الاختراع أيضاً تسلسلات نيوكليوتيد ‎nucleotide)»‏ معزولة ويحلل تسلسلات ترمز بروتين ‎HMW‏ ونواقل تحتوي على التسلسلات

‏المذكورة؛ وخلايا عائلة تحتوي على النواقل المذكورة. كما يتتاول الاختراع طرقاً وأطقم

‏تشخيصية.

‏تعتبر الكلاميديا ‎chlamydia‏ كائنات ممرضة بشرية سائدة تسبب اضطرابات ‎Jia disorders‏ ا

‏الأمراض المنقولة جنسيا ‎sexually transmitted diseases‏ ¢ وأمراض الجهاز التنفسي ‎«respiratory diseases Vo‏ ما في ذلك الالتهاب الرئوي ‎pneumonia‏ ؛ والتهاب الملتحمة ‎neonatal‏

‎chlamydia ‏تعد الكلاميديا‎ blindness ‏والعمي‎ 33Y 5) ‏لدى الأطفال حديثي‎ conjunctivitis

‏بكتيريا ملزمة داخل الخلية تصيب البطانة الظاهرية للرئة؛ أو الملتحمة أو القناة التناسلية. تشتمل

‏أشهر أنواع بروتين كلاميديا ‎protein chlamydia‏ على ؛ كلاميديا بسيتاسي ‎C.trachomatis‏ ؛

م بيكورام ‎chlamydia pecorum‏ وكلاميديا ‎chlamydia‏ الالتهاب الرئوي. ‎dase‏ تم إدراج النوع المحدد حديثا من الكلاميديا ‎chlamydia‏ 6 وهي كلاميديا ‎chlamydia‏ الالتهاب الرشوي؛ (كانت تعرف سابقا باسم ‎(TWAR C trachomatis‏ كسبب رئيسي للالتهاب الرئوي البشري الوبائي وربما تلعب دورا في التصلب العصيدي بالشرايين.

م يوجد حاليا ‎VA‏ نوعا معروفا من الأنماط المصلية ل ‎«Cotrachomatis‏ مسببة للتراكوما ‎trachomatis‏ ونطاق واسع من الأمراض المنقولة جنسياً: بحيث تكون الأنماط المصلية ‎Bs A‏ وج الأكثر ‎Wal‏ بالتراكوما ‎trachomatis‏ بينما يكون 0-6 السبب الأكثر شيوعا للأمراض التناسلية. يعد 018102115 سببا رئيسيا للمرض المتقول جنسياً في الكثير من البلاد الصناعية؛ بما فيها

‎٠‏ _ الولايات المتحدة. بينما لا يزال العدد الدقيق لحالات الإصابة بمرض تراكوما كلاميديا في الولايات المتحدة غير معلوماء تشير الدراسات الوبائية الحالية إلى أن هناك أكثر من ؛ ملايين حالة إصابة بمرض تراكوما كلاميديا تحدث كل عام؛ مقارنة بما يقدر ب ؟ مليون ‎Als‏ إصابة بميكروب السيلان. في حين تتعرض للإصابة جميع المجموعات من مختلف الأجناس؛ و الطوائف ‎A el‏ وفئات المجتمعات؛ إلا أن أعلى انتشار للكلاميديا ‎chlamydia‏ يحدث بين الشباب من عمر

‎١١“ oe‏ إلى ‎Lie Y‏ والأفراد الفعالين جنسيا. تعتبر معظم الإصابات بالكلاميديا ‎chlamydia‏ المتعلقة بالجهاز البولي والتناسلي بلا أعراض ظاهرة إكلينيكيا. حيث تشيع فترة الحمل المطولة للمرض لدى كل من الرجال والنساء. إذ أنه يتم تشخيص ما يبلغ ‎Yo‏ 7 من الرجال و7709 من السيدات على أنهم مصابين بالكلاميديا ‎chlamydia‏ بدون علامات ظاهرة للإصابة بهذا المرض. ونتيجة لذلك؛ يشكل هؤلاء الأفراد المفتقرين للأعراض الظاهرة للمرض مخزنا كبيرا يمكن أن يعمل على

‎٠‏ استمرار نقل العامل المرضي داخل المجتمع.

‏ا

‎os _‏ - مع كون هذا المرض ليس حميدا على الإطلاق؛ فإن هناك أمراض خطيرة يمكن أن تتجم عن إصابات بعدوى معينة من بينها: التهاب قناة مجرى البول؛ و الورم الحبيبي الليمفاوي ‎(LGV)‏ ‏التناسلي؛ والتهاب عنق الرحم؛ والتهاب بربخ الخصية لدى الذكور. الأمراض المتكونة من ‎Alay‏ ‏عنق الرحم تكون بشكل عام التهاب بطانة الرحم؛ ومرض التهاب الحوض ‎(PID)‏ والتهاب أنبوبة م الرحم التي يمكن أن تسبب انسداد أنبوبي وتؤدي في النهاية إلى العقم. تنتج الإصابة بتراكوما كلاميديا ‎trachomatis‏ © لدى الأطفال حديثي الولادة من تعرض الأم حول ميعاد الولادة إلى إصابة في عنق الرحم. إن ما يقرب من ‎7١‏ / من الأطفال حديثي الولادة مهبليا لأمهات مصابة بالتهاب عنق الرحم ببروتين كلاميديا ‎protein chlamydia‏ يصبحون مصابين أثناء الولادة. وتعتبر الأغشية المخاطية للعين؛ والبلعوم الفمي؛ والقناة البولية التناسلية والمستقيم مواقع الإصابة الرئيسية. وقد أصبح التهاب الملتحمة الشكل الأكثر شيوعا في الشهر الأول بعد الولادة. ما يقرب من ‎77١-7١‏ من الأطفال المعرضين يتكون لديهم التهاب الملتحمة خلال ‎VE‏ يوما من الولادة حتى بعد تلقي العلاج الوقائي إما بنترات الفضة أو مرهم مضاد حيوي. كذلك يعتبر مرض ‎C. trachomatis‏ سببا رئيسيا للالتهاب )$$ عند الأطفال في الولايات المتحدة. فما يقرب من ‎/70-٠‏ من الأطفال حديثي الولادة المولودين من خلال رحم مصاب سيتكون لديهم التهاب ‎Ne‏ رئوي من بروتين الكلاميديا ويحتاجون إلى نوع ما من التدخل الطبي. في الدول النامية؛ تسبب حالات الإصابة في العين ب ‎trachomatis‏ .© الإصابة بالتراكوما ‎«trachomatis‏ والتهاب الملتحمة الحويصلي المزمن حيث يؤدي تكون الندبات المتكرر إلى تشويه جفون العين وفقد البصر في النهاية. تعتبر التراكوما 5 السبب الرئيسي للعمي القابل لمنعه على مستوى العالم. إذ تقدر منظمة الصحة العالمية أن ما يزيد على ‎50٠0‏ مليون نسمة oe =

حول العالم؛ بما في ذلك حوالي ‎١٠5١‏ مليون طفل؛ يعانون حاليا من تراكوما ‎sal trachomatis‏

وقد أصيب أكثر من ‎١‏ ملايين نسمة منهم بالعمى بهذا المرض.

في الدول الصناعية؛ تعتبر التكاليف المرتبطة بعلاج الإصابات بالكلاميديا ‎chlamydia‏ ضخمة. في

الولايات المتحدة؛ قدرت التكاليف السنوية لعلاج هذه الأمراض 0 ‎YoY,‏ بليون دولار في ‎١997 ٠‏ وقد توقع أن تتجاوز ‎A‏ بليون دولار بحلول عام ‎Yoo‏

يتمثل أحد الحلول الممكنة لهذه الأزمة الصحية في استخدام لقاح كلاميدي فعال

‎effective chlamydial vaccine‏ . يقترح العديد من السلالات ذات الدلالة أن تكوين لقاح فعال يعد

‏مجديا.

‏وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على كل من البشر والكائنات من الرئيسيات أن المناعة ‎٠‏ - الوقائية قصيرة المدى من ‎C trachomatis‏ يمكن إحداثها بالتلقيح بكلاميديا ‎chlamydia‏ كامل. ومع

‏ذلك؛ اتصفت الحماية المحدثة بأنها قصيرة المدى؛ ومحددة النمط المصلي؛ وناتجة عن جسم

‏مضاد مخاطي. على نحو إضافي؛ اشتدت حدة المرض لدى بعض من تم حقنهم باللقاح عندما

‏أصيب هؤلاء الأفراد بالعدوى بشكل طبيعي بنمط مصلي مختلف عن ذلك المستخدم التحمصين

‏المناعي. وقد اتضح أن رد الفعل غير الملائم هذا راجع في النهاية إلى استجابة فرط حساسية من ‎١‏ _ النوع المتأخر. وبالتالي؛ توجد الحاجة إلى تكوين لقاح كلاميديا ‎chlamydia‏ مبني على وحدة

‏فرعية قادر على إنتاج استجابة مناعية فعالة ولكن لا تكون مسببة للحساسية. يمكن أن يحتاج ‎Sie‏

‏هذا اللقاح المبني على وحدة فرعية إلى استثارة جسم مضاد ‎TgA‏ إفرازي معادل مخاطي و/ أو

‏استجابة مناعية خلوية لتكون فعالة.

‏وقد ركزت الجهود الخاصة باللقاحات المبنية على الوحدات الفرعية حتى اليوم على البروتين الغشاء الخارجي الرئيسي بشكل حصري تقريبا ‎(MOMP)‏ . يعد ‎(MOMP)‏ بروتين غشاء متكامل

من ‎5٠0‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ تقريبا في الحجم ويشتمل على حوالي ‎٠٠‏ من بروتين الغشاء الجسم العنصري المعدي : ‎(Caldwellc 11. 10.0. Kromhout¢ and L.

Schachter. 1981. Infect.

Immun.« 31:1161-‏ .)1176 © يعمل ‎MOMP‏ على إضعاف التكامل التركيبي ل ‎EB‏ الخلوي الخارجي ويعتقد أنه يقوم بوظيفة جزيء شبيه بالبورين عند نمو الكائن الحي داخل الخلية ويكون فعالا أيضيا. باستثناء النطاقات الأربعة المتغيرة ذات السطح المعرض (701-177017)؛ يتم الاحتفاظ ب01/0 بدرجة ‎Ale‏ ‏صمن جميع } لأنماط المصلية هل يعتبر ‎MOMP‏ مولد مناعي بدرجة عالية ويمكن أن يستثير جسم مضاد للكلاميديا ‎chlamydia‏ موضعي ومعادل ‎٠‏ ومع ذلك توجد مشسكلات متعلقة بهذه ‎٠‏ الطريقة. حتى اليوم؛ توجد القمم اللاصقة المعادلة لمحدد ‎MOMP‏ والتي تم تخطيطها داخل مناطق ‎VD‏ ‏وبالتالي تكون جسما مضادا محدد لنمط مصلي فقط. وقد ثم ‎Jal‏ نجاح هامشي من المحاولات التي أجريت لدمج القمم اللاصقة المحددة لنمط مصلي في نواقل لقاحات متنوعة ‎Sls)‏ فيروس شال الأطفال) لتكوين أجسام مضادة معادلة ذات تفاعل تبادلي على نحو واسع : ‎A.

D.« H.

Su¢ D. 5 Manning« M.

H.

Klein« M.

I.

Parnell: and H D.

Vo‏ لمتلسطط) ‎Caldwell. 1993. Infect.

Immun. 61:4406-44 14; Murdinc A. 0.11. 50341 H.

Klein‏ ‎and H D.

Caldwell. 1995. Infect.

Immun.< 63:1116-112 1).‏ هناك نوعان آخران رئيسيان من بروتينات الغشاء الخارجي في 5 + البروتينات الغنية ‎sadly‏ لسيستين ‎٠١ cysteine‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ تقريبا و ‎١١‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ تقريباء وكذلك

= ل - > عديد السكريات الدهني المكشوف السطح؛ يعتبرا مولدين للمناعة ولكن 6 بخلاف ‎al «MOMP‏ ينضح أنهما يحثان جسما مضادا معادلا ¢ ‎(Cerrone et al, 1991, Infect.

Immun, 59:79-90(‏ لذلك لا تزال هناك حاجة إلى لقاح كلاميديا ‎chlamydia‏ جديد مبني على وحدة فرعية. وصف عام للاختراع يهدف الاختراع الحالي إلى توفير بروتين من نوع كلاميديا ‎chlamydia‏ معزول ومنقى بشكل كبير وله وزن جزيئي عالي ("بروتين ‎(("HMW‏ حيث يكون لبروتين ‎HMW‏ وزن جزيئني واضح يقدر بحوالي م . ٠١-هما١ا‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ تقريباء؛ وفقا لما يحدده ‎«SDS-PAGE‏ أو قطعة أو جزء مناظر منه. يفضل أن يحتوي البروتين ‎HMW‏ على تسلسل حمض أميني ‎amino acid).‏ من أي تسلسلات ‏ رقم : ‎١٠5 oY‏ و1. ويفضل أن تتضمن ‎ahd‏ من بروتين ‎HMW‏ تسلسلات أرقام ا ولا ‎١‏ 6و ‎YY=Yo‏ وفقا لما يستخدم في السياق 1 يقصد من عبلرة " التسلسل إلى حد كبير" أنها تعني أن التسلسل تكون ‎٠‏ 78 على الأقل؛ ويفضل أكثر أن تكون ‎٠‏ على الأقل؛ وعلى أفضل نحو تكون على الأقل 790 مطابقة للتسلسل المرجعية. على نحو ‎«una‏ يكون بروتين ‎HMW‏ عبارة عن بروتين غشاء خارجي. ويفضل أكثر؛ أن يكون وأ الغشا ع الخارجي محدد بالسطح . يفضل أن يحتوي 0 5 ‎HMW O—‏ على نطاق شبيه بالبورتين. ويقصد منه أن تكون جميع أنواع بروتين كلاميديا ‎protein chlamydia‏ متضمنة في هذا الاختراع؛ ومع ذلك؛ تتضمن الأنواع المفضلة : ‎Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia percorum and Chlamydia‏ ‎pneumoniae‏

م - يكون بروتين ‎HMW‏ المنقى بشكل كبير نقي بنسبة ‎77٠0‏ بالوزن على الأقل؛ ويفضل أن يكون نقيا بنسبة 795 بالوزن على الأقل؛ ويمكن أن يكون على شكل محلول مائي منه. كما ينتدرج تحت هذا الاختراع صور ناتج عودة ارتباط من بروتين 117417 حيث تتصف خلايا إشرشيا كولاي ناه» .2 المتحولة؛ والشكل ناتج عودة الارتباط ‎recombinant‏ المعبر عنه من © بروتين ‎HMW‏ وزن جزيئي واضح يبلغ حوالي ‎١١9-٠١٠١‏ كيلو دالتون ‎ly Bi kDa‏ وفقا لما يحدده ‎(SDS-PAGE‏ أو قطعة أو جزء مناظر منه. يقصد بالمصطلح عديد الببتيدات ‎polypeptide‏ المشتق من 1131777 أنه يتضمن ‎gal‏ من بروتين ‎HMW‏ وأنواع مختلفة من بروتين ‎HMW‏ من النوع غير المألوف؛ أو قطعة منه؛ أو تحتوي على واحد أو اكثر من محاليل تخفيف؛ أو مواد مدخلة أو مجموعات استبدال ؛ وبروتينات خميرية تشتمل على عديد .1 ببتيدات ‎polypeptide‏ متماثل غير متجانس مندمج مع طرفية-© أو طرفية ‎N-‏ أو جزء داخلي من كل أو جزء من بروتين ‎HMW‏ ‏وفقا لما يستخدم في السياق وفي عناصر الحماية؛ يشير "بروتين 1184777 إلى بروتين من نوعية كلاميديا ‎chlamydia‏ أصلي متقى أو متقى من ناتج عودة ارتباط له وزن جزيئي ‎Je‏ حيث يكون الوزن الجزيئي الواضح (وفقا لما يحدده ‎(SDS-PAGE‏ حوالي ‎١١٠-٠١١‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ ‎vo‏ تقريبا. وفقا لما يستخدم في السياق وفي عناصر الحماية؛ يشير مصطلح بروتين 11041577" إلى بروتين ‎HMW‏ ناتج عودة ارتباط. من أهداف الاختراع ‎AY‏ توفير جزيئ حمض نووي ‎acid‏ 00016:6_معزول ونقي إلى حد كبير يرمز بروتين 1184777 أو قطعة منه أو جزء مناظر منه. ويفضل أن يكون تسلسل الحمض الأميني ‎amino acid‏ حيث يشتمل بروتين ‎HMW‏ المرمز على تسلسل حمض أميني ‎amino acid‏ من أي من تسلسلات أرقام: ‎Vo oY‏ 7-75. كما يتم إدراج جزيء حمض

PE

‏من أي‎ DNA nucleic acid ‏يشتمل على تسلسل حمض نووي‎ Je nucleic acid ‏نووي‎ ‏من تسلسل متممة منه؛ أو قطعة من تسلسل حمض‎ 71-77 ٠ ‏من تسلسلات أرقام:‎ ‏من أي من تسلسلات أرقام:‎ nucleic acid ‏تحتوي على تسلسل حمض نووي‎ HMW DNA ‏تتهجن تحت‎ nucleic acid ‏أو تسلسل متممة له؛ وتسلسل حمض نووي‎ ؟؟-١8و‎ ء٠؛-4‎ ‏تأثير ظروف ضيقة لأي من التسلسلات المذكورة أعلاه. يفضل أن يتصف الحمض النووي‎ ‏الذي يتهجن تحت تأثير ظرف ضيق بهوية تسلسل حوالي 7/70 مع أي من التسلسلات‎ 7160 ‏ويفضل أكثر أن تكون النسبة حوالي‎ code ‏المحددة‎ ‏في نطاق الاختراع الحالي.‎ HMW ‏يقع إنتاج واستخدام مشتقات وأشكال مناظرة من بروتين‎ ‏في أحد النماذج المحددة؛ يكون المشتق أو الجزء المناظر فعالا وظيفياء أي؛ قادر على إظهار‎ ‏بطول كامل ونوع غير‎ HMW ‏واحدة أو أكثر من الأنشطة الوظيفية المرتبطة ببروتين‎ ٠ ‏مألوف. كمثال على ذلك؛ يمكن استخدام المشتفات أو الأشكال المناظرة التي لها قدرة توليد‎ ‏مناعية أو قدرة توليد مولد الضد؛ على سبيل المثال. في التجارب المناعية؛ للتحصين‎ ‏المناعي؛ الخ. يتعلق نموذج محدد بقطعة /1041 والتي يمكن أن ترتبط بجسم مضاد ل‎ ‏للتأكد من النشاط‎ HMW ‏اختبار مشتقات أو أشكال مناظرة من بروتين‎ (Sa .7 ‏المطلوب بإجراءات تعرف في الفن.‎ ve

HMW ‏بتغيير تسلسلات بروتين‎ HMW ‏على وجه التحديد؛ يمكن عمل مشتقات بروتين‎

Gas ‏أو إضافات؛ أو محاليل مخففة توفر جزيئات مكافئة وظيفيا. نتيجة‎ clad) ‏بمجموعات‎ ‏الأخرى التي‎ DNA ‏؛ يمكن استخدام تسلسلات‎ nucleotides ‏للتسلسلات المرمزة للنوويد‎

HMW ‏في صورة جين بروتين‎ amino acid ‏ترمز إلى حد كبير نفس تسلسل الحمض الأميني‎ ‏وذلك في تطبيق موافق للاختراع الحالي. تشمل هذه التسلسلات ولكنها ليست محصورة على‎ ©

- ١. ‏التي تشتمل على جميع أو بروتينات الجينات التي يتم‎ nucleotides ‏تسلسلات النوويد‎ amino ‏أميني‎ aan] ‏ترمز وحدة بنائية‎ different codons ‏تغييرها باستبدال كودونات مختلفة‎ ‏تتضمن مشتقات‎ (Jal ‏متكافئة وظيفيا داخل المتوالية؛ وبالتالي تنتج تغييرا صامتاً.‎ acid ‏وفقا للاختراع؛ ولكن ليس على سبيل الحصر؛ تلك التي تحتوي؛ في صورة‎ HMW ‏بروتين‎ ‏رئيسية؛ على جميع أو جزء من تسلسل الحمض الأمينسي‎ amino acid ‏تسلسل حمض أميني‎ oo ‏في ذلك التسلسلات المتغيرة التي يتم فيها استبدال وحدات‎ La HMW ‏لبروتين‎ amino acid ‏بنائية لمحض أميني متكافئة وظيفيا بوحدات بنائية داخل التسلسل الناتجة عن التغيير‎ ‏الصامت.على سبيل المثال؛ يمكن استبدال واحد أو أكثر من الوحدات البنائية للحمض الأميني‎ ‏تعمل‎ lly ‏من نفس القطبية‎ HAT amino acid ‏داخل التسلسل بحمض أميني‎ amino acid ‏كمكافئ وظيفي؛ مما ينتج عنه تغيير صامت. يمكن انتقاء مجموعات الاستبدال لحمض أميني‎ ٠ ‏التسلسل من أعضاء أخرى من الفئة التي ينتمي إليها الحمض الأميني‎ Jala amino acid ‏غير القطبية (غير‎ amino acids ‏على سبيل المثال؛ تشتمل الأحماض الأمينية‎ amino acid

LY) ‏تشتمل الأحماض‎ leucine ‏؛ وليوسين‎ alanine ‏على ألانين‎ (hydrophobic ‏الآلفة للماء‎ ‏وتريونين‎ «serine ‏وسيرين‎ ¢ glycine ‏المحايدة القطبية على جلايسين‎ amino acids ‏وجلوتامين‎ ¢ asparagine ‏وأسبراجين‎ ¢ tyrosine ‏وتيروسين‎ ¢ cysteine ‏وسيستين‎ 6 threonine ٠ ‏موجبة الشحنة (قاعدية :)على أرجنين‎ amino acids ‏تشتمل الأحماض الأمينية‎ glutamine amino acids ‏وتشتمل الأحماض الأمينية‎ histidine ‏وهستيدين‎ dysine ‏وليسين‎ ¢ arginine ‏وحمض الجلوتاميك‎ aspartic acid ‏على حمض الأسبراتيك‎ (acidic ‏سالبة الشحنة (حامضية‎ -glutamic acid ‏في نموذج محدد من الاختراع ؛ يتم توفير بروتينات تتكون من أو تشتمل على قطعة من‎ © ‏على الأقل (متواصلة) من بروتين‎ amino acids ‏تتكون من 6 أحماض أمينية‎ HMW ‏بروتين‎

‎١١ -‏ - 77. في نماذج أخرى؛ تتكون القطعة من عدد يتراوح من ‎١‏ إلى 50 حمض أميني ‎amino acid‏ = بروتين ‎HMW‏ في نماذج محددة؛ لا تكون مثل هذه القطع أكبر من ‎Yo‏ ‏أو ‎٠٠١‏ أو ‎Yeo‏ حمض أميني ‎amino acid‏ تتضمن المشتقات أو الأشكال المناظرة من بروتين ‎(HMW‏ ولكن ليس على سبيل الحصر؛ تلك الجزيئات التي تشتمل على مناطق تكون م متماثلة إلى حد كبير لبروتين ‎HMW‏ أو قطع منه ‎Oli)‏ في نماذج عديدة؛ على الأقل 770 أو ‎7٠‏ أو ‎yA‏ 790 أو 795 هوية على تسلسل حمض أميني ‎amino acid‏ ذات حجم متطابق أو عند مقارنتها بتسلسل محاذية والتي تتم المحاذاة فيها بواسطة برنامج تماثل كمبيوتر معروف في الفن) أو التي يكون الحمض النووي المرمز منها قادر على التهجين وفقا لتسلسل بروتين ‎HMW‏ مرمزة؛ تحت تأثير ظروف ضيقة؛ أو ضيقة إلى حد معتدل ؛ أو ‎٠‏ غير ضيقة.

‏يمكن إنتاج مشتقات وأشكال مناظرة من بروتين ‎HMW‏ وفقا للاختراع بطرق متنوعة معروفة في الفن. يمكن أن تجرى العمليات التي تؤدي إلى إنتاجها على مستوى الجين أو البروتين. على سبيل ‎Jl)‏ يمكن تعديل تسلسل جين بروتين ‎HMW‏ المستنسخ بواسطة أي من

‏الاستراتيجيات العديدة المعروفة في الفن : ‎2d Ed « Cold Spring Vo‏ بلمنصمكة ‎(Sambrook et al « 1989: Molecular Cloning: A Laboratory‏ ‎Harbor Laboratory Press« Cold Spring Harbor« N.Y.)‏ يمكن تجزئة التسلسل عند مواضع مناسبة بإنزيم نووي خارجي للتقييد؛ يتبعه تعديل إنزيمي آخر إذا لزم الأمرء وعزله وربطه في المعمل. عند إنتاج الجين الذي يرمز المشتق أو الشكل المناظر من بروتين ‎(HMW‏ ينبغي توخي الحذر لضمان بقاء الجين المعدل داخل نفس إطار

- ١ ‏قراءة الترجمة الوراثية المشابه لبروتين 77): بغير مقاطعة من إشارات إيقاف التحويل‎ ‏المطلوب.‎ HMW ‏الوراني؛ في منطقة الجين حيث يتم ترميز نشاط بروتين‎ ‏على نحو إضافي؛ يمكن إحداث طفرة من تسلسل الحمض النووي المرمز بروتين 11207 في‎ ‏المعمل أو في الكائن الحي؛ لإحداث و/أو إتلاف الترجمة الوراثية؛ و/أو بدء؛ و/ أو إنهاء‎ ‏المتوالية؛ أو لتكوين أنواع متغيرة في مناطق الترميز و/ أو من مواقع إنزيمات نووية‎ ٠م‎ ‏خارجية جديدة للتفييد أو لإتلاف مواقع موجودة مسبقاء لتسهيل تعديل إضافي في المعمل.يكن‎ رصحلا ‏استخدام أي أسلوب معروف في الفن لتكوين الطفرة؛ بما في ذلك وليس على سبيل‎ : ‏تكوين الطفرة الكيميائي؛ وتكوين الطفرة الموجه بالموقع في المعمل‎ ‏لصميمنط)0)‎ Ce ct al.« 1978 J.

Biol.

Chem 298 5 1)< use of TAB® linkers (Pharmacia)« etc. \ ‏على مستوى البروتين. يندرج تحت مجال‎ HMW ‏يمكن إجراء عمليات على تسلسلات بروتين‎ ‏أو مشتقات أو أشكال مناظرة أخرى يتم تعديلها على نحو‎ HMW ‏الاختراع قطع من بروتين‎ glycosylationdi— sal ‏مختلف أثناء أو بعد الترجمة الوراثية ؛ الخ؛ بإدخال مجموعة‎ ‏عليهاء أو‎ acetylation ‏أو بإدخال مجموعة الأسيل‎ « lipidation ‏عليهاء أو بمعالجتها بالدهون‎ ‏عليهاء أو بالاشتقاق‎ amidation ‏أو بإدخال الأميد‎ (lle phosphorylation ‏بإدخال الفوسفوريل‎ 10 ‏بواسطة مجموعات حماية/ إعاقة؛ أو بتجزئة بتحليل بروتيني؛ أو بالربط بأي جزيء جسم‎ ‏مضاد أو مجموعة رابطة خلوية أخرىء الخ. يمن تنفيذ أي من طرق التعديل الكيميائية‎ ‏العديدة بالأساليب المعروفة؛ بما في ذلك ولكن ليس على سبيل الحصر انقسام كيميائي محدد‎ ‏وتريسبين الكيميائي‎ «trypsin ‏وتريسبين‎ » cyanogen bromide ‏بواسطة سيانوجين بروميد‎ ‏وإدخال‎ €NaBH4 5 « V8 protease ‏؛ ووإنزيم البروتين‎ papain ‏وبابئين‎ « chymotrypsin.

اس — مجموعة الأسيل ‎acetylation‏ ؛ وإدخال مجموعة الفورميل ‎formylation‏ « والأكسدة ‎coxidation‏ والاختزال ‎reduction‏ » والتخليق الأيضي في وجود تونيكاميسين ‎tunicamycin‏ ؟ الخ .

‎٠‏ علاوة على ما سبق؛ يمكن إجراء تخليق كيميائي للأشكال المناظرة والمشتقات من بروتين 77. على سبيل المثال»؛ يمكن تخليق ‎peptide ain‏ مناظر لبروتين ‎HMW‏ ويشتمل على النطاق المطلوب»؛ أو الذي يتوسط في النشاط المطلوب في المعمل؛ وذلك بامستخدام وسيلة تخليق ببتيدات ‎peptides‏ علاوة على ذلك؛ إذا لزم الأمرء يمكن تقديم أحماض أمينية ‎amino‏ ‎acids‏ غير تقليدية أو أشكال مناظرة من أحماض أمينية ‎amino acids‏ كيميائية على ‎Le‏

‎amino ‏تشتمل الأحماض الأمينية‎ HMW ‏مجموعة استبدال أو مادة مضافة في تسلسل بروتين‎ ٠ ‏من الأحماض‎ D- ‏متجاسمات‎ andl ‏غير التفليدية على؛ ولكن ليس على سبيل‎ acids ¢ 0- amino ‏أمينو‎ isobutyric acid ‏وحمض أيزوبيوتريك‎ (ALi amino acids ‏الأمينية‎ ‏؛ وحمض “-أمينو أيزو‎ Abu slg 4-aminobutyric acid ‏وحمض ؛ -أمينو بيوتريك‎ -١ ‏أهاكس -» ؛ وحمض هكسلنويك‎ Ahx ‏و‎ 7 -Abu ‏وأبو‎ + 2-amino butyric acid ‏بيوتريك‎

‎ial Y ‏وحمض أيزو بيوتريك‎ ¢ Alb ‏؛ وأيب‎ 6-amino hexanoic acid ‏أمينو‎ yo ‏مصنطتة- 3 وأورنيثين‎ propionic acid ونيمأ-١ ‏وحمض بروبيونيك‎ ¢ 2-amino 15001117116 acid ‏؛ وهيدروكسي برولين‎ norvaline ‏وتورفالين‎ « norleucine ‏ونورليوسين‎ ¢ ornithine cysteic ‏وحمض سيستيك‎ ¢ citrulline ‏وسترولين‎ « sarcosine ‏وسركوسين‎ © hydroxyproline ‏وفينيل‎ t-butylalanine ‏؛» و-) بيوتيل ألانين‎ t-butylglycine ‏بيوتيل جلايسين‎ t- 5 ¢ acid

‎« alanine ‏ألانين‎ B- 5 » cyclohexylalanine ‏وسيكلو هكسيل الانين‎ ¢ phenylglycine ‏جلايسين‎ ٠ ‏؛ وأحماض أمينو مصممة مثل أحماض أمينية‎ fluoro-amino acids sisal ‏وأحماض فلورو‎

- yg methyl ‏ميقيل‎ Ca- amino acids ‏وأحماض أمينية‎ ٠» methyl Jue B- amino acids amino ‏لأميني‎ ١ ‏وأشكال مناظرة للحمض‎ «methyl ‏ميثئيل‎ Na- amino acids ‏وأحماض أمينية‎

D amino acid ‏بصفة عامة. علاوة على ما سبق يمكن أن يكون الحمسض الأميني‎ acid ‏(أيسر الدوران).‎ Lf ‏(أيمن الدوران)‎ 0 يهدف الاختراع أيضا إلى توفير ناقل تعبير ناتج عودة ارتباط مهياً لتحويل خلية عائلة أو لتقديم بروتين ‎HMW‏ إلى خلية عائلة تشتمل على جزيء الحمض النووي ‎nucleic acid‏ لتسلسل رقم ١ء‏ أو 7 أو ‎YE‏ أو أي قطعة منه. من المفضل؛ ان يكون ناقل تعبير ناتج عودة الارتباط ‎recombinant‏ لتحويل خلية ‎Ale‏ ويشتمل على وسيلة تعبير مقترنة على نحو فعال بجزيء الحمض النووي بواسطة استضافة بروتين ‎HMW‏ أو قطعة ‎die‏ أو شكل مناظر ‎٠‏ كا له. وعلى نحو أكثر تفضيلا؛ ناقل التعبير حيث تتضمن وسيلة التعبير بروتين حمض نووي ‎nucleic acid‏ يرمز تسلسل رائدة لإفراز من الخلية العائلة أو نطاق ميل مقترن إما بطرفية 1 أو -© للبروتين أو القطعة أو الشكل المناظر له. يشتمل جانب آخر من الاختراع على خلية عائلة محولة تحتوي على ناقل تعبير مبين أعلاه و بروتين ‎HMW‏ ناتج عودة الارتباط أو قطعة منه أو شكل مناظر له قابل لإنتاجه بواسطة ‎٠‏ الخلية العائلة المتحولة. هناك جانب آخر من الاختراع يكون موجها لبروتين ‎HMW‏ المعروف من تحضير جسم مضاد يربط تحديدا ببتيد ‎peptide‏ يحتوي على تسلسل حمض أميني ‎oY a3) amino acid‏ أو ‎١1-١‏ أو قطعة منه أو على نحو تحفظي شكل مناظر مستبدل منه. تعتبر التركيبات المكونة لمولد الضد و/أو المولدة للمناعة ‎Lila‏ آخر من الاختراع حيث © تشتمل التركيبات على مكون واحد على الأقل مختار من المجموعة التالية: .

— مج \ _ أ) بروتين ‎(HMW‏ حيث يكون وزنه الجزيئي حوالي ‎١١٠-٠١١١‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ تقريباء وفقا لما يحدده ‎(SDS-PAGE‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له؛ ب جزيء حمض نووي ‎nucleic acid‏ معزول يرمز بروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له؛

° ج جزيء حمض نووي ‎nucleic acid‏ معزول يحتوي على التسلسلات أرقام: 77 ‎YY‏ ‏أو ؛؟؛ والتسلسل المتممة له أو تسلسل الحمض النووي التي تتهجن تحت تأثير ظروف ضيقة له أو قطعة منه؛

د) بروتين ‎HMW‏ معزول ناتج عودة ارتباط؛ أو قطعة منه شكل مناظر له؛ قابل لإنتاجه في خلية عائلة متحولة تشتمل على ناقل تعبير ‎daily‏ علىجزيء حمض نوري ‎nucleic acid‏ ‎٠‏ وفقا للمعرف في ب) أو ج) ووسيلة تعبير بواسطة خلية بروتين ‎HMW‏ المذكور ‎dais‏ ‏على وسيلة تعبير مقترنة على نحو فعال بجزيء الحمض النووي ‎nucleic acid‏ للتعبير بواسطة الخلية العائلة لبروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له؛ ه) ناقل عودة ناتج ارتباط يشتمل على حمض أميني ‎ja amino acid‏ بروتين ‎HMW‏ ‏أو قطعة ‎Ade‏ أو شكل ‎bla‏ له؛ ‎eo‏ 5( خلية متحولة تشتمل على الناقل وفقا ل ه) واختياريا مادة مساعدة؛ ومادة حاملة أو محلول مخفف ‎dia‏ مقبول صيد لانيا»بحيث تنتج التركيبة المذكورة استجابة مناعية عند إعطا ‎oe‏ ‏المريض. ‏تشتمل المواد المساعدة المفضلة على هولوتوكسين كوليرا ‎cholera holotoxin‏ أو وحدات ‎(ue ji‏ أو هولوتوكسين ‎holotoxin‏ غير ثابت الحرارة لإشرشيا ‎heat labile 5% 5S‏ تام 12

ووحدات فرعية وأشكال مطفرة ‎(dla‏ وشبة؛ 3 1 ‎MPL 5 «QS2‏ على وجه التحديد تكون

المواد المساعدة المفضلة عبارة عن ‎«LTR12Gs Ad‏ و 1.1و 0521.

كما يتضمن الاختراع طرقاً لإحداث استجابة مناعية في كائن ثديي أو طائر تشضتمل على

إعطاء الكائن الثديي المذكور كمية مؤثرة من مادة مولدة للضد أو التركيبة المولدة للمناعة

م المبينة ‎ed‏

يتم توجيه جانب آخر من الاختراع إلى مقاومة مضادة للأمصال ضد تركيبة مكونة لمولد

الضد أو مولدة لمناعة وفقا للاختراع؛ وأجسام مضادة موجودة في مقاومة الأممصسال تربط

على وجه التحديد بروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له. ويفضل أن تحتوي

ا لأجسام المضادة التي تربط بروتين ‎HMW‏ على تسلسلات أرقام : ‎١ 4 - \ Co Y‏ أو قطعة \ منها 0 شكل مناظر لهابه استبدال على نحو متحفظ. كما يتم تضمين | لأجسام المضادة وحيدة

النسيلة التي تربط تحديدا بروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له.

يشتمل جانب آخر من الاختراع على تركيبات صيدلانية ولقاحية تشتمل على كمية مؤثرة من

مكون واحد على الأقل يتم انتقاؤه من المجموعة التالية:

أ) بروتين ‎Cua HMW‏ يكون الوزن الجزيئي للبروتين المعزول حوالي ‎١١9-٠٠١٠‏ كيلو ‎\o‏ دالتون ‎kDa‏ تقريباء وفقا لما يحدده ‎«SDS-PAGE‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر ‎ta]‏

ب) ‎esa‏ حمض نووي ‎nucleic acid‏ معزول يرمز بروتين ‎(HMW‏ أو قطعة منه أو شكل

مناظر له؛

ج جزيء حمض ‎nucleic acid SIF‏ معزول يحتوي على التسلسلات أرقلم: )0 ‎YY (YY‏ أو ‎(Ye‏ والتسلسل المتممة له أو تسلسل حمض نووي ‎nucleic acid‏ تتهجن تحت تأتثير ظروف ضيقة له أو قطعة منه؛

د) بروتين ‎HMW‏ معزول ناتج عودة ارتباط؛ أو قطعة منه شكل مناظر له.؛ قابل لإنتاجه في

0 خلية عائلة متحولة تشتمل على ناقل تعبير يشتمل على جزيء حمض نووي ‎nucleic acid‏ وفقا للمعرف في ب) أو ج) ووسيلة تعبير مقترنة على نحو فعال بجزيء الحمض النووي للتعبير بواسطة الخلية العائلة لبروتين ‎HMW‏ المذكور من نوع كلاميديا ‎chlamydia‏ أو القطعة المشتقة منه أو الشكل المناظر له؛

ه) ناقل ناتج عودة ارتباط يشتمل على حمض أميني ‎amino acid‏ يرمز بروتين ‎HMW‏

‎٠‏ أو قطعة منه أو شكلا مناظرا له؛

‎(s‏ خلية متحولة تشتمل على الناقل ‎J Lad‏ ه)

‏ز الأجسام المضادة التي تربط تحديدا المكون من أ)أو ب أو ‎(z‏ أو د أو ه) ومادة نقالة صيدلانيا أو محلول مخفف منه. يفضل تركيبات لقاحية تكون فعالة على المستوى المخاطي.

‎١‏ يشتمل الاختراع أيضا على كاشف تشخيصي ‎٠‏ يمكن أن يتضمن واحدا أو أكثر من الجوانب المذكورة أعلاه؛ مثل بروتين ‎HMW‏ أصلي؛ و بروتين ‎HMW‏ ناتج عودة ارتباط» وجزيء الحمض النووى؛ والتركيبة المولدة للمناعة؛ والتركيبة المكونة لمولد الضدء والتركيبة المضادة للأمصال؛ والأجسام المضادة؛ والناقل الذي يشتمل على الحمض النووي ‎nucleic‏ ‎«acid‏ والخلية المتحولة التي تشتمل على الناقل.

‎A -_—‏ \ _ كما يتم إدراج الطرق والأطقم التشخيصية لكشف الكلاميديا ‎chlamydia‏ أو الأجسام المضادة للكلاميديا ‎chlamydia‏ في عينة ‎dua lial‏ تشتمل الطرق على الخطوات التالية: ‎)١‏ ملامسة العينة المذكورة مع تركيبة مكونة لمولد الضد تشتمل على بروتين ‎HMW‏ ‏كلاميديا ‎chlamydia‏ أو قطعة ‏ منه أو شكل مناظر له أو تركيبة ‎Sa‏ للمناعة أو أجسام ° مضادة منها لتكوين مولد ضد من الكلاميديا 0118007018: ومعقدات مناعية لأجسام مضادة للكلاميديا ‎«chlamydia‏ وكذلك؛ ‎(Y‏ كشف وجود أو قياس كمية من المعقدات المناعية المذكورة المكونة أثناء الخطوة أ) كمؤشر على وجود الكلاميديا ‎chlamydia‏ المذكورة أو الأجسام المضادة للكلاميديا ‎chlamydia‏ في عينة الاختبار.

‎٠‏ تشتمل الأطقم التشخيصية لكشف الكلاميديا ‎chlamydia‏ أو الأجسام المضادة للكلاميديا ‎chlamydia‏ منها على أجسام مضادة؛ أو تركيبات مكونة لمولدات الضد؛ أو مولدة للمناعة على بروتين ‎HMW‏ كلاميديا ‎chlamydia‏ أو على قطعة_منه أو على شكل مناظر له ووسيلة حاوية لملامسة الأجسام المضادة المذكورة أو تركيبة بعينة اختبار محل شك في أنها تحتوي على أجسام مضادة للكلاميديا ‎chlamydia‏ أو كلاميديا ‎chlamydia‏ ووسيلة كاشفة لكشف أو لقياس مولد

‎٠‏ الضد للكلاميديا 018:07018: ومعقدات مناعية لأجسام مضادة للكلاميديا ‎chlamydia‏ مشكلة بيسن التركيبة المذكورة المكونة لمولد الضد أو ‎al gall‏ للمناعة أو الأجسام المضادة المذكورة وعينة الاختبار المذكورة. يوفر جانب آخر من الاختراع طرقا لتحديد وجود الأحماض الأمينية المرمزة لبروتين 1104177 أو قطعة منه أو شكل مناظر له في عينة ‎Glial‏ وتشتمل على الخطوات التالية:

١)ملامسة‏ العينة المذكورة مع جزيء الحمض النووي ‎nucleic acid‏ المقدم هنا لإنتاج مزدوجات تشتمل على جزيء الحمض النووي ‎nucleic acid‏ وجزيء حمض نووي ‎nucleic acid‏ مذكور يرمز بروتين ‎HMW‏ في عينة الاختبار ويكون على وجه التحديد ‎SLE‏ للتهجين معه؛ و ") تحديد إنتاج المزدوجات. يوفر الاختراع الحالي أيضا طقما تشخيصيا ومواد كاشفة منه؛ لتحديد وجود الحمض النووي ‎nucleic acid‏ الذي يرمز بروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له في ‎daily die‏ على: ( جزيء الحمض النووي ‎nucleic acid‏ وفقا لما يتم توفيره في السياق؛ ‎Va‏ ب ( وسيلة لملامسة الحمض النووي ‎nucleic acid‏ مع عينة الاختبار لإنتاج مزدوجات تشتمل على جزيء الحمض النووي ‎nucleic acid‏ وأي جزيء حمض نووي ‎nucleic‏ ‎acid‏ مذكور يرمز بروتين ‎HMW‏ في عينة الاختبار ويكون قابلا على وجه التحديد للتهجين معه؛ء و ج) وسيلة لتحديد إنتاج المزدوجات. كما يتم تضمين الاختراع طرقا للوقاية؛ لعلاج أو تخفيف الاضطرابات المتعلقة بالكلاميديا ‎chlamydia‏ في كائن بما في ذلك الثدييات والطيور التي بحاجة إلى مشل هذا العلاج وتشتمل الطرق على إعطاء كمية مؤثرة من التركيبة الصيدلانية أو اللقاح وفقا للاختراع. تشتمل الاضطرابات المفضلة على عدوى ببكتيريا كلاميديا ‎«chlamydia‏ وتراكوما 0585 ) والتهاب الملتحمة؛ والتهاب قناة البول؛ وورم = ليمفاوي تناسلي

‎(LGV)‏ والتهاب عنق الرحم؛ والتهاب البربخ؛ والتهاب بطانة الرحم؛. ومرض التهاب ‎«(PID) Ua gal!‏ والتهاب البوق الرحمي»؛ والانسداد الأنبوبي؛ والعقم؛ وسرطان عنق ‎cpa‏ والتصلب العصيدي بالشرايين. تشتمل اللقاحات أو التركيبات الصيدلانية المفضلة على تلك المصاغة للإعطاء في الكائن الحي إلى خلية عائلة لنقل الحماية من مرض أو ° لعلاج له ناتج عن نوعية من الكلاميديا ‎chlamydia‏ كما يفضل التركيبات المصاغة على ‎Aa‏ جزيئات دقيقة أو في صورة كبسولة؛ أو مستحضر دهني أو مستحلب . الاختصارات ‎i J pi 5 ee‏ ‎ATCC-‏ مجموعة مزرعة من النوع الأمريكي قادر على استثارة استجابة مناعية خلوية أو خلطية احوصر 0 كيلو دالتونات ‎kilodaltons‏ ‎n-octyl .beta.-D-glucopyranoside‏ او ‎octyl glucoside‏ حصي ‎CC‏ بروتين غشاء خارجي ‎outer membrane protein‏ بروتينات ‎elie‏ خارجي ‎outer membrane proteins‏ محلول ملحي منظم فوسفات ‎phosphate buffered saline‏ استشراد ‎electrophoresis‏ ب ‎polyacrylamide gel‏ ‎polypeptide =‏ ببتيد ‎peptide‏ من أي طول بفضل الببتيد ‎peptide‏ الذي يحتوي على عشر وحدات بنائية لل ‎amino acid‏ أو أكثر من ذلك. ‎sodium dodecylsulfate‏ ‎SDS-PAGE =‏ استشراد ‎electrophoresis‏ ب ‎sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel‏

يتم تمثيل النوويد ‎nucleotides‏ أو تسلسلات الحمض النووي المعرفة هنا في السياق برموز مكونة من حرف واحد للقواعد كالتالي: ‎A (adenine)‏ ‎C (cytosine)‏ ‎G (guanine)‏ ‎T (thymine)‏ ‎U (uracil)‏ بن ‎M (Aor‏ ‎R (Aor G)‏ ‎W (A or T/U)‏ ‎S (Cor G)‏ ‎(CorT/U) Y‏ ‎K (G or TAJ)‏ ‎AaCaGmtTU) V‏ ‎Aor Cor TU; nt G) H‏ ‎AaGoaTUmtC)D‏ ‎CoaGaTU;notA)B‏

- YY — ‏ملومة)‎ 2) JAXCaGa TU) N ‏هنا في السياق‎ Zeal polypeptide ‏أو تسلسلات عديد الببتيدات‎ peptide ‏يتم تمثيل الببتيد‎ ‏برموز مكونة من حرف واحد للقواعد كالتالي:‎

A (alanine)

R (arginine)

N (asparagine)

D (aspartic acid)

C (cysteine)

Q (glutamine)

E (glutamic acid)

G (glycine)

H (histidine)

I (isoleucine)

L (leucine)

K (lysine)

M (methionine)

F (phenylalanine)

P (proline)

S (serine)

T (threonine) :

W (tryptophan).

Y (tyrosine,)

V (valine) ‎X‏ (غير معلوم) ‏يمكن أن يفهم الاختراع بشكل أتم بالإشارة إلى الوصف التفصيلي للاختراع؛ والأمثلة غير المحددة لنماذج معينة من الاختراع والأشكال المرفقة. ‏تشبرح مختصر للرسومات ‏شكل ‎١‏ : عبارة عن تحليل ‎Western blot‏ لأجسام عنصرية 12 ‎.C. trachomatis‏ تم جعل ‏م 889 المنقاة تدريجيا قابلة للتحلل في محلول منظم من عينة ‎Laemmli SDS-PAGE‏ قياسية ‏تحتوي على ؟- مكرابتو إيثانول ‎2-mercaptoethanol‏ « مغلي لمدة حوالي ‏ دقيقة ومحمل على ‏؛؟-١‏ 7 هلام مدرج من تراي-جلايسين ‎Tris-glycine gradient gel‏ يحتوي على ‎SDS‏ وتم ‏إجرا ع استشراد عليه؛ ثم تعريض البروتينات للطخ كهربائي على أغشية ‎PVDF‏ عند درجة ّ ‎La‏ لمدة ©, ‎Ov Jie aclu Y‏ فولت . ثم جس الغشاء المعاق باستخدام \ / ‎07٠6‏ تخفيف لجسم ‎٠‏ مضاد ‎(K196) rHMWP‏ لمدة ‎١,0‏ ساعة عند درجة حرارة الغرفة. عقب الغسل؛ تمت معالجبة

الغشاء ب ‎oY‏ 50,00 تخفيف لجسم ‎IgG alias‏ مأخوذ من ماعز ومضاد للأرنب مقترن ‎HPR—‏ ‏لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تكوين ال ‎Western blot‏ باستخدام نظام ركيزة تفاعل ‎TMB‏ قياسية. تم اكتشاف ثلاث نطاقات متفاعلة مناعيا في ‎EBs‏ و855. تشير النقطة إلى بروتين ‎HMW‏ بكمية حوالي ‎١١5-٠١١‏ كيلو دالتون. 0 الأشكال ‎iy‏ -اج : عبارة عن تسلسل ‎aan‏ نووي ‎nucleic acid‏ إحصائية ترمز إطار القرا ء المفتوح لبروتين ‎HMW‏ من ‎C. trachomatis LGV L2‏ (متواليقرقم:١).‏ الشكل “ : عبارة عن تسلسل حمض أميني ‎amino acid‏ مشتقة من بروتين ‎HMW‏ من إطار قراءة ‎PCR‏ مفتوح من 12 ‎C. trachomatis LGV‏ (تسلسل رقم ؟). الشكل ؛ : عبارة عن ‎SDS-PAGE‏ من بروتين ‎HMW‏ ناتج عودة ارتباط منقى جزئيا من ‎C.‏ ‎trachomatis LGV L2 ٠‏ معبر عنه في إشرشيا كولاي. تم استخدام مقاييس ‎SDS-PAGE‏ ‏ملطخة مناظرة وملطخة مسبقًا كمرقمات وزن ‎SH‏ . تمت ملاحظة مواضع مرقمات الوزن الجزيئي في الهلام على الجانب الأيسر والجانب الأيمن من الشكل بواسطة خطوط وفقا للأوزان الجزيئية (كيلو دالتون) لبعض المرقمات. انظر نص مثال ‎٠١‏ لمزيد من التفاصيل. ‎Lane A: Mark 12 Wide Range Molecular Weight Markers (Novex): myosin 200‏ ‎Kdal; Ve‏ ‎B-galactosidase« 116.3 Kdal, phosphorylase 8 97.4 Kdal: bovine serum‏ ‎albumin 66.3 Kdal.

Lane B: © trachomatis L2 recombinant HMWP.

Lane C-‏ ‎SeeBlue Prestained Molecular Weight markers (Novex); myosine 250 Kdal;‏

دده ‎bovine serum albumin¢ 98 Kdal; glulamic dehydrogenase: 64 Kdal.‏ الشكل © : عبارة عن خريطة بلازميدات ‎pAH312¢ pAH310¢pAH306 plasmids‏ « و011316 و إطار قراءة ‎PCR‏ مفتوح. الشكلان ‎١١‏ و+7ب + عبارة عن تسلسلات حمض أميني ‎amino acid‏ لبروتين ‎HMW‏ ‏0 الخاص ‎C trachomatis LGV L2—‏ + و3 و12. يتم تقديم ‎Jedi‏ ‎C. trachomatis LGV 2‏ (تسلسل رقم:7؛) في الخط العلوي ‎Taig‏ من الوحدة البنائية الأولى للبروتين ‎BedasSall‏ (انظرء الوحدات البنائية للحمض الأميني ‎amino‏ ‎٠١١-75 40‏ من تسلسل ‎(Vial‏ يتم وضع خط تحت تسلسلات محتملة حقيقية النواة ]1-تم إدخال مجموعة الجلايكوسيل ‎Neglycosylation‏ عليها. يتم وضع خط تحت ‎٠‏ > منطقة حلزونية غير آلفة للماء ‎hydrophobic‏ مجزأة بواسطة أجزاء غنية بالبرولين وذات طول مناسب لسد الطبقة الثنائية الدهنية وتم حصرها بين أقواس. يتم تحديد الفروق في الحمض الأميني ‎amino acid‏ المعرفة في ‎B‏ (انظر الوحدات البنائية للحمض الأميني ‎٠١٠-7١ amino acid‏ للتسلسل رقم ‎Fy (Vo‏ (انظر الوحدات البنائية للحمض الأميني ‎٠١٠١-7” ١ amino acid‏ للتسلسل رقم ‎(V1‏ يتم تحديد الأنماط المصلية أدنى من ‎Vo‏ تسلسل بروتين ‎HMWP‏ 12. الشكلان ١أ-لاب‏ : يوضحان اللطخ غير المباشر للجسم المضاد بالتألق الوميضي لأجسام إدراج 1111 ‎C. trachomatis‏ (نمط مصلي ‎(F‏ بامستخدام أجسام مضادة ‎THMWP‏ ‏اللوحة ‎tA‏ أمصال بعد التحصين المناعي من جسم 16196 لأرنب. يتم لطخ أجسام © مشتملة على كلاميديا ‎chlamydia‏ باللون الأصفر. ..

‎7١ -‏ - اللوحة 8: أمصال قبل التحصين المناعي من جسم 16196 لأرنب. يشير مصطلح "مولدات الضد ‎antigens‏ " والمصطلح المتعلق به "مكون ‎A gal‏ الضد ‎"antigenic‏ ‏وفقا لاستخدامه في السياق وفي عناصر الحماية إلى مادة تربط تحديدا جسم مضاد أو مستقبل © خلية ‎JT‏ يفضل ان تكون مولدات الضد المذكورة مولدة للمناعة.

‏يشير مصطلح "مولدة للمناعة ‎immunogenic‏ " وفقا لاستخدامه في السياق وفي عناصر ‎lal‏

‏إلى القدرة على الحث على استجابة مناعية؛ ‎Ole‏ استجابة مناعية لجسم مضاد و/أو خلوية في

‏كائن يفضل أن يكون تديي أو طائر.

‏ويشير مصطلح "عائل ‎host‏ " كما هو مستخدم هنا وفي عناصر الحماية إلى الجسم الحي لحيوان ‎٠‏ أو إلى مزارع خلوية معملية لكائنات ‎pd‏

‏ينبغي إعطاء كمية مؤثرة من تركيبة مكونة ‎(daca Al gal‏ ومولدة ‎cde lial‏ وصيد لانية؛ بما في ذلك

‏وليس على سبيل الحصرء لقاح من الاختراع؛ والتي تعرف "الكمية الفعالة" فيها بأنها كمية تكون

‏كافية لإحداث استجابة وقائية؛ أو علاجية أو مخففة بما في ذلك وليس على سبيل الحصر ¢

‏استجابة مناعية في مريض. ستتفاوت الكمية المطلوبة تبعا لتكوين المناعة لبروتين 004777 أو ‎١‏ قطعة_منه؛ أو حمض نووي ‎nucleic acid‏ أو مشتق مستخدم؛ ونوع ووزن المريض الذي يتم

‏إعطاؤه؛ ولكن يمكن تأكيدها باستخدام أساليب قياسية. تحدث التركيبة استجابة مناعية في مريسض

‏ينتج أجسام مضادة بما في ذلك أجسام مضادة لبروتين ‎HMW‏ وأجسام مضادةٌ تكون | لأبسونين

‎antibodies‏ أو تكون قاتلة للبكتيريا ل08000102. في نماذج؛ مفضلة وغير محددة من الاختراع؛

‏تنتج كمية مؤثرة من تركيبة من الاختراع ارتفاع لعيار جسم مضاد وفقا لثلاثة أضعاف على الأقل

‎yy -‏ - من عيار الجسم المضاد قبل الإعطاء. في نموذج مفضل؛ ومحدد؛ وغير مقيد من الاختراع؛ يتم إعطاء ‎١.0٠‏ إلى ‎٠0060‏ ميكرو جرام تقريبا ويفضل من ‎١١‏ إلى ‎50٠0‏ ميكرو جرام إلى خلية عائلة. وتفضل التركيبات التي تشتمل على نحو إضافي على مادة مساعدة. يمكن تحضير تركيبات مولدة للمناعة؛ ومكونة لمولد ‎call‏ وصيدلانية؛ و لفاحية في صورة © مركبات قابلة للحقن؛ أو على هيئة محاليل سائلة أو مستحلبات. يمكن خلط بروتين ‎HMW‏ مع واحد أو اكثر من السواغات ‎excipient‏ المقبولة صيدلانيا والتي تكون متوائمة مع بروتين ‎(Sar HMW‏ ان تشتمل ‎Jia‏ هذه السواغات ‎excipient‏ على ماء؛ ومحلول ملحي؛ ودكستروز ‎dextrose‏ ؛ وجليسيرول ‎glycerol‏ « ولإيثانول ‎ethanol‏ ؛ وتوليفات منها. يمكن أن تحتوي التركيبات مكونة مولد الضد؛ والصيدلانية واللقاحية أيضا على واحد أو أكثر من ‎٠‏ _ المواد المساعدة؛ ‎Jie‏ عوامل مرطبة أو مستحلبة؛ أو محاليل منظمة للرقم الهيدروجيني ‎SH‏ ‏مواد مساعدة لتعزيز فعاليتها. يمكن إعطاء التركيبات المولدة للمناعة؛ والمكونة لمولد الضدء والصيدلانية واللقاحية عن طريق غير القناة الهضمية؛ أو بالحقن؛ أو تحت الجلد أو في العضلات. على نحو بديل؛ يمكن صياغة التركيبات المولدة للمناعة؛ والمكونة لمولد الضد؛ والصيدلانية واللقاح المشكلة وفقا للاختراع الحالي؛ وتقديمها بطريقة معينة لتثير استجابة مناعية عند الأسطح ‎yo‏ المخاطية. وبالتالي؛ يمكن إعطاء التركيبات المولدة للمناعة؛ والمكونة لمولد الضد؛ والصيدلانية واللقاح على أسطح الغشاء المخاطي بواسطة على سبيل المثال؛ الأنف»؛ أو ‎al)‏ (في الأمعاء)؛ أو العين؛ أو الحويصلات الهوائية؛ أو في المهبل أو مسالك في الكبد. على نحو بديل؛ يمكن أن تكون طرق إعطاء أخرى محبذة وتشمل صيغ التحاميل وصيغ الإعطاء عن طريق الفم. بالنسبة للتحاميل؛ يمكن أن تشتمل المواد الرابطة والناقلة على سبيل المثال؛ بولي ألكالين جلايكولات ‎polyalkalene glycols ٠ ٠‏ أو تراي جلايسيريدات ‎triglycerides‏ يمكن أن تشمل صيغ الإعطاء عن

‎YA -‏ - طريق الفم السواغات ‎excipient‏ المستخدمة بشكل طبيعي مثلا. على سبيل المثال؛ درجات صيدلانية من السكارين ‎saccharine‏ ¢ والسليلوز ‎cellulose‏ وكربونات الماغنيسيوم ‎magnesium carbonate‏ يمكن أن تكون هذه التركيبات على صورة محاليل ‎solutions‏ « أو معلقات ‎suspensions‏ ¢ أو أقراص ‎tablets‏ « أو حبوب ‎pills‏ ؛ أو كبسولات ‎«capsules‏ أو صيغ أو مساحيق إطلاق بتأثير مستمر وتحتوي على

‏حوالي ‎00٠‏ إلى 198 بالوزن من بروتين ‎MW‏ يتم إعطاء التركيبات المولدة للمناعة والمكونة لمولد الضد والصيدلانية واللقاح بطريقة متوائمة مع صيغة الجرعات؛ وبكمية معينة بحيث تكون مؤثرة ‎Ladle‏ أو واقية أو مولدة للمناعة. إضافة إلى ما سبق؛ يمكن استخدام التركيبات المولدة للمناعة والمكونة لمولد الضد والصيدلانئية

‎pW, ٠‏ توليفة مع أو تكون مقترنة بواحد أو أكثر من الجزيئات المستهدفة التقديم لخلايا معينة من النظام المناعي؛ ‎Jie‏ السطح المخاطي. تشتمل بعض الأمثلة؛ ولكن ليس على سبيل ‎and)‏ ‏على فيتامين ‎(B12‏ أو توكسينات بكتيرية ‎bacterial toxins‏ أو قطع منهاء أو أجسام مضادة وحيدة التسيلة ودهون؛ وبروتينات؛ وأحماض أمينية ‎amino acids‏ أو كربوهيدرات ‎carbohydrates‏ ‏مستهدفة معينة أخرى.

‎ye‏ تتوقف الكمية المطلوب إعطاؤها على المريض المطلوب علاجه؛ ‎Ly‏ في ذلك؛ على سبيل المثال؛ قدرة الجهاز المناعي للفرد على تخليق الأجسام المضادة؛ وإذا استدعى الأمر على إنتاج استجابة مناعية تكون الخلية وسيطا فيها. تعتمد الكميات الدقيقة للمكون الفعال المطلوب إعطاؤها على حكم الممارس. ومع ذلك؛ يكن أن يكون مدى الجرعات المناسبة ‎ALE‏ للتحديد بسهولة بواسطة المتمرس في الفن ويمكن أن تكون في حدود تتراوح من ‎١١‏ إلى ‎٠٠٠١‏ ميكرو جرام. كما تكون

‎vy.‏ طرق العلاج المناسبة للإعطاء الأولي والجرعات المعززة متفاوتة؛ ولكن يمكن أن تتضمن

‎v4 -‏ - إعطاءا أوليا يتبعه إعطاءات لاحقة. يمكن أيضا أن تعتم الجرعة على مسلك (مسالك) الإعطاء وستتفاوت تبعا لحجم الخلية العائلة. يكون تركيز بروتين ‎HMW‏ في التركيبات المكونة لمولد الضدء أو المولدة للمناعة أو الصيدلانية وفقا للاتراع بصفة عامة في مدى يتراوح من حوالي ‎١.00٠‏ إلى 795 بالوزن. يكون اللقاح الذي ‎٠‏ يحتوي على مادة مكونة لمولد الضد لكائن ممرض واحد فقط عبارة عن لقاح أحادى التكافؤ. أما اللقاحات التي تحتوي على مادة مكونة لمولد الضد للعديد من الكائنات الممرضة عبارة عن لقاحات متوالفة وتنتمي أيضا إلى الاختراع الحالي. تحتوي مثل هذه اللقاحات ‎Al gall‏ على سبيل ‎(Jl‏ على مادة متكونة من كائنات ممرضة متنوعة أو من سلالات متنوعة من نفس الكائن الممرض؛ أو من توليفات من كائنات ممرضة متنوعة.

‏0 يمكن أن تشتمل المستحضرات المكونة لمولد الضدء أو المولدة للمناعة أو الصيدلانية؛ بما في ذلك اللقاحات؛ على ناقل نوويد ‎nucleotides‏ كمادة محفزة للمناعة يشتمل على جزء على الأقل من الجين المرمز لبروتين ‎(HMW‏ أو يمكن استخدام جزء على الأقل من الجين مباشرة التحصين المناعي. لحث الاستجابات المناعية الخلطية ‎(HIR)‏ بفعالية والمناعة التي تكون الخلية وسيطا فيها ‎(CMI)‏

‏يتم نمطيا استحلاب مولدات المناعة في المواد المساعدة. يمكن تحسين توليد المناعة بشكل كبير في حالة إعطاء مولد المناعة مشتركا مع مادة مساعدة. يمكن أن تعمل المواد المساعدة باحتجاز مولد المناعة موضعيا بالقرب من موضع الإعطاء لإحداث تأثير موضعي لتسهيل الإطلاق البطيء أو المستديم لمولد الضد على خلايا الجهاز المناعي. يمكن أيضا أن تجذب المواد المساعدة ‎LA‏ النظام المناعي إلى موضع مولد المناعة وأن تحفز ‎Jia‏ هذه الخلايا على استثارة

‎x.‏ استجابات مناعية.

!ا يكون الكثير من المواد المساعدة ‎cla‏ أو محث على تكون الأورام الحبيبية؛ والالتهابات الحادة والمزمنة (مادة ‎Freud‏ المساعدة الكاملة؛ ‎(FCA‏ وانحلال الخلايا (الصابونيات وبوليمرات ‎(Pluronic‏ وتكون الحمى؛ والتهاب المفاصل والتهاب عنبة العين الأمامية ‎(MDP 5 LPS)‏ برغم أن ‎FCA‏ يعد مادة مساعدة ممتازة ومستخدمة على نطاق واسع في الأبحات.؛ إلا أنها ليست © مسموحا باستخدامها في اللقاحات البشرية أو البيطرية لسميتها. تشتمل الخصائص المحبذة للمواد المساعدة المثالية على: ‎١‏ ( عدم وجود سمية؛ ‎(Y)‏ القدرة على تحفيز استجابة مناعية طويلة المدى؛ (©) البساطة في التصنيع والثبات في التخزين على المدى الطويل؛ ‎٠‏ (؟) القدرة على استثارة إما ‎CMI‏ أو 1118 أو كلاهما لمولدات الضد المعطاة عن طريق العديد من المسالك؛ إذا لزم الأمر ذلك؛ )0( التآزر مع المواد المساعدة الأخرى؛ (+) القدرة على التفاعل ‎SEY‏ مع مجموعات مولدات الضد التي تقدم الخلايا ‎((APC)‏ ‏)7( القدرة على استثارة استجابات مناعية محددة للخلية في ‎HI‏ أو 1112 المناسبة؛ ‎(A) vo‏ القدرة على زيادة المستويات متماثلة النوع من الأجسام المضادة المناسبة بشكل انتقائي (على سبيل المثال؛ ‎(IgA‏ ضد مولدات الضد.

دام تم استخدام العوامل أو المواد المساعدة المحفزة للمناعة لسنوات عديدة لتحسين استجابات مناعية للخلية ‎(Alita)‏ على سبيل المثال؛ للقاحات. تعتبر المواد المساعدة الأساسية؛ ‎Jie‏ عديد السكريات الدهني؛ في المعتاد مكونات من البكتيريا المدمرة أو المتلفة المستخدمة كلقاحات. تكون المواد المساعدة الأساسية معدلة للمناعة والتي تكون مرتبطة نمطيا بشكل غير مشترك التكافؤ بمولدات م الضد ويتم صياغتها لتعزيز استجابات المناعة للخلية العائلة. وبالتالي؛ تم تمييز المواد المساعدة بأنها تعزز الاستجابة المناعية لمولدات الضد المقدمة عن طريق غير القناة ‎A aad‏ يستخدم هيدروكسيد الألومنيوم ‎aluminum hydroxide‏ و فوسفات الألومنيوم ‎aluminum phosphate‏ (التي يشار إليها مجتمعة بشكل شائع بالشبة) بشكل روتيني كمواد مساعدة في اللقاحات البشرية والبيطرية. وتكون فعالية الشبة في زيادة استجابات الجسم المضاد لسميات الديفتيريا والتيتانوس ‎٠‏ - مقررة بشكل جيد وتم دمج لقاح ‎HbsAg‏ كمادة مساعدة مع الشبة. يمكن أن تشتمل المواد المساعدة الأساسية الأخرى على صابونيات معقدة في مولدات الضد للبروتين الغشائي(معقدات محفزة للمناعة)؛ وبوليمرات بلورونيك مع الزيت المعدني؛ والعصيات الفطرية التالفة في الزيت المعدني» ومادة ‎Freund‏ المساعدة التامة؛ والمنتجات البكتيرية؛ ‎de‏ ‏الببتيد موراميل ‎(MDP)‏ وعديد السكريات الدهني ‎(LPS)‏ وكذلك دهن ‎(A‏ والأجسام الدهنية. ‎vo‏ يصف الطلب الدولي 5 المدرج في السياق بالإشارة الأشكال المكونة بالطفرات من توكسين ثابت الحرارة من إشرشيا كولاي ‎E.coli‏ مولد للسميات المعوية(1.1]:"). وتصسف البراءة الأمريكية رقم5057540؛ والمدمجة في السياق بالإشارة؛ المادة المساعدة 0521 وجزء غير سام منقى باستخدام ‎HPLC‏ من مادة صابونية من لحاء شجرة ‎Quiliaja‏ الجنوبي أمريكية. كما يتم وصف سابورنيا مولينا ‎3D-MPL‏ في البراءة البريطانية رقم 2220211 وتدمج في السياق ‎٠‏ بالإشارة.

‎ry —‏ - وتدرس البراءة الأمريكية رقم 4855283 المودعة باسم ‎Lockoffet al‏ في ‎A‏ أغسطس ‎١85‏ ‏والتي يتم دمجها في السياق بالإشارة الأشكال المناظرة للجلايكوليبيد ‎glycolipid‏ بما فيها ‎N-glycosylureas 5 « N-glycosylamides‏ و ‎N-glycosylcarbamates‏ ؛ وكل منها يتم استبداله في الوحدة البنائية للسكر بواسطة الحمض الأميني ‎amino acid‏ في صورة معدلات مناعية أو مواد م مساعدة. وقد ذكر ‎Lockoff‏ أن ‎N-glycosphospholipids‏ و جلايكو جليسيروليبدات ‎glycoglycerolipids‏ »+ تكون قادرة على استثارة استجابات مناعية قوية في كل من لقاح فيروس مرض الحلاء البسيط ولقاح فيروس سودورابيز ‎virus‏ 086000:801685. تم تخليق بعض الجلايكوليبدات ‎glycolipids‏ من مركبات ألكيل أمين طويلة السلسلة والأحماض الدهنية المرتبطة مباشرة مع السكريات من خلال ذرة كربون أنومرية؛ لمحاكاة وظائف الوحدات البنائية الدهنية ‎٠‏ المتكونة طبيعيا. تذكر البراءة الأمريكية رقم 4258029 المودعة باسم ‎Moloney‏ والمدرجة في السياق بالإشارة إليها أن هيدروكلوريد تيروسين أوكتاديسيل ‎octadecyl tyrosine hydrochloride (OTH)‏ يقوم بوظيفة مادة مساعدة عند دمجه مع سماني التيتانوس ‎tetanus‏ ولقاح فيروس شلل الأطفال غي المنشط بالفورمالين ‎formalin‏ من ‎ITs Ip sil‏ و]11. وقد تم أيضا استخدام طريقة إدخال الدهمون ‎ve‏ على الببتيدات ‎peptides‏ المخلقة لزيادة قدرتها على التوليد المناعي. لذلك؛ وفقا للاختراع» يمكن أن تشتمل أيضا التركيبات المولدة للمناعة والمكونة لمولد الضدء والصيدلانية؛ بما فيها اللقاح» والمشتملة على بروتين 10077؛ أو قطعة منه؛ أو شكل مناظر له أو ناقل يعبر عن نفس التركيبات؛ على مادة مساعدة مثل؛ ولكن ليس على سبيل الحصر؛ شبة؛ ‎«mL T‏ و021 وجميعها مدرجة أعلاه. ويفضل؛ أن يتم انتقاء ‎sald)‏ المساعدة ن شسبة؛ أو ‎SLT‏ ‎3D-mPL +٠‏ أو ‎(BCG) Bacille Calmette-Guerine‏ وأشكال مطفرة أو معدلة من المذكورة أعلاه؛

‎YY -‏ -— ولاسيما ‎LTR192G 5 «mLT‏ يمكن أيضا أن تشتمل التركيبات من الاختراع الحالي على ناقل صيد لاني مناسب»؛ ‎lay‏ في ‎«alld‏ ولكن ليس على سبيل الحصر ‘ محلول ملحي ‘ أو بيكربونات ‎bicarbonate‏ » أو دكستروز ‎dextrose‏ أو محاليل مائية أخرى. يتم وصف النواقل الصيدلانية الأخرى المناسبة في ‎Mack Publishing Cmpany«Remington's Pharmaceutical Sciences‏ « وهو © يعد نص مرجعي قياسي في هذا المجال؛ والذي يتم دمجه بالكامل في السياق بالإشارة. يمكن إعطاء التركيبات المولدة للمناعة؛ أو المكونة لمولد الضد والصيدلانية بما في ذلك اللقاح؛ في ناقل صيدلاني مناسب غير سام؛ ويمكن إدراجه في كبسولات دقيقة؛ و/ أو يمكن دمجه في رقعة نسيجية لإطلاق مستديم الأثر . يمكن بشكل محبذ إعطاء التركيبات المولدة للمناعة أو المكونة لمولد الضد والصيدلانية بما في ‎٠‏ ذلك اللقاح على فواصل زمنية عديدة لكي نحافظ على استمرارية مستويات الجسم ‎lad)‏ ؛ و/أو يمكن استخدامها بالاشتراك مع طرق أخرى قاتلة للبكتيريا أو تابتة للبكتيريا. وفقا لاستخدامه في السياق وفي عناصر الحماية؛ يمكن الحصول على "أجسام مضادة” من الاختراع بواسطة أي من الطرق التقليدية المعروفة للمتمرسين في الفن؛ مثل؛ ولكن ليس على سبيل الحصر ‘ الطرق الموصوفة في : ‎Antibodies A Laboratory Manual (E.

Harlow« D.

Lane« Cold Spring Harbor Vo‏ ‎Laboratory Press« 45 1989)‏ والتي يتم دمجها بالكامل في السياق بالإشارة. يقصد من مصطلح "الجسم المضاد" أن يتضمن جميع الأشكال ‎٠‏ مثلء ولكن ليس على سبيل الحصر ‘ الأجسام ‎IgAy IgM JgG‏ المنقاة عديدة النسيلة ووحيدة النسيلة وقطع منها مثل :

_ ع 7 _ ‎Fv‏ ؛ وسلسلة ‎Fv‏ المفردة ‎(scFv)‏ وقطع ‎٠:‏ ‎Fab (Harlow and Leon: 1988: Antibody« Cold Spring Harbor)‏ 26 ط1)2 وأجسام مضادة مفردة السلسلة (البراءة الأمريكية رقم946:)4؛ )778( والأجسام المضادة الخيميرية والبشرية : ‎Proc.

Nat'l Acad.

Sci.

USA 81:6851) Neuberger °‏ 1984¢ له ‎antibodies (Morrison el‏ ‎et al.« 1984. Nature 81:6851)‏ ومناطق التحديد المتممة ‎(CDR)‏ انظر : ‎Verhoeyen and Wihdust¢ in Molecular Immunology 260.6 by 8. D.

Hames and © M.‏ ‎IRL Press: Oxoford University Pressc 1996¢ at pp. 283-325)¢ etc..‏ 10766 \ بصفة عامة يثم التحصين المناعي لحيوان (يمكن استخدام مجموعة واسعة من أنواع الفقاريات؛ وأشهرها الفئران؛ والجرذان؛ والخنزير الغيني؛ ‎El‏ والخنزيرء؛ والهمستر؛ ‎ch alg‏ والطيونء والأرانب) ‎lag‏ باستخدام بروتين ‎HMW‏ أو تسلسل حمض أميني ‎amino acid‏ أو قطعة مولدة للمناعة منه أو مشتق منه من الاختراع الحالي في عدم وجود أو في وجود مادة مساعدة أو أي عامل يعزز من فعالية التوليد المناعي ويتم تعزيزه على فترات زمنية منفصلة. يتم ‎١‏ تجربة المصل الحيواني للتأكد من وجود الجسم المضاد المطلوب بواسطة أي طريقة تقليدية. يمكن استخدام مصل أو دم الحيوان المذكور كمصدر للأجسام المضادة عديد النسيلة. بالنسبة للأجسام المضاد وحيدة النسيلة؛ يتم معالجة الحيوانات وفقا لما بيناه أعلاه. عند كشسف معيار مقبول لجسم مضادء يتم قتل الحيوان ويتم فصل الطحال بشكل لا يفسده لدمجه. يتم مز ‎z‏

دوس - خلايا الطحال بسلالة خلايا ورم نخاعي حي منتقى بشكل خاص؛ ويتم بعد ذلك تعريض الخليط لعامل؛ يكون نمطيا بولي إثيلين جلايكول ‎polyethylene glycol‏ أو ما شابه ذلك؛ والذي يعزز من اندماج الخلايا. في ظل هذه الظروف يحدث الاندماج في اختيار عشوائي ويكون خليط الخلية المدمجة مع الخلايا غير المدمجة لكل نوع هو المنتج النائج. يتم اختيار سلالات خلايا الورم م النخاعي المستخدمة للإندماج بشكل خاص بطريقة معينة حيث يتم استخدام وسط الانتقاء؛ ‎de‏ ‎:HAT‏ وهيبوكسانتثاين ‎hypoxanthine‏ « وأمينوبترين ‎aminopterin‏ « وتيميدين ‎thymidine‏ ¢ وتكون الخلايا التي تستمر في المزرعة من خليط الاندماج هي تلك الخلايا التي تكون مهجنة بين الخلايا المشتقة من المائح المحصن وخلايا الورم النخاعي. بعد الاندماج؛ يتم تخفيف الخلايا واستنباتها في الوسط الانتقائي. يتم فحص وسط مزرعة الاستنبات للتأكد من وجود جسم مضاد ‎٠‏ يحتوي على خاصية التحديد المطلوبة نحو مولد الضد المختار. يتم استنساخ تلك المزارع التي تحتوي على جسم مضاد حسب الاختيار بواسطة تحديد التخفيف حتى يمكن استنتاج أن مزرعة الخلية عبارة عن خلية مفردة في الأصل. مولدات ‎call‏ ومولدات المناعة وتجارب المناعة يكون بروتين 1184777 أو الحمض النووي الذي يرمزه وقطع منه مفيدة كمولد ضد أو مولد مناعة ‎١‏ _ لتوليد أجسام مضادة لبروتين ‎HMW‏ أو كمولد ضد في التجارب المناعية بما في ذلك تجارب امتصاص المناعة المرتبطة بالإنزيم ‎(ELISA)‏ أو تجارب المناعة الإشضعاعية ‎Lad (RIA)‏ الارتباط الأخرى للجسم المضاد غير المرتبط بإنزيم أو إجراءات معروفة في الفن لكشف أجسام مضادة للبكتيريا؛ والكلاميديا ‎«chlamydia‏ وبروتين ‎.HMW‏ في تجارب ‎ELISA‏ يتم تثبيت بروتين ‎HMW‏ على سطح منتقى؛ على سبيل ‎(JO)‏ سطح يكون قادر على ربط البروتينات ‎die‏ ‏© عيون طبق معيار دقيق به بولي إسترين ‎polystyrene‏ . بعد الغسل لإزالة بروتين ‎HMW‏ غير

اسم - الممتص تماماء يمكن ربط محلول البروتين غير المحدد والذي يعرف بأنه محايد من ناحية تكوين مولد الضد فيما يتعلق بعينة الاختبار بالسطح المنتفى. مما يسمح بإعاقة مواضع الامتصاص غير المحددة على السطح المثبت وبالتالي يقلل من الخلفية التي تحدثها ‎ol Jala py‏ غير المحددة بأمصال الضد على السطح.

0 بعد ذلك يتم تلامس السطح المثبت مع عينة؛ مثل مواد إكلينيكية أو بيولوجية؛ مطلوب اختبارما بطريقة موصلة لتكوين المعقد المناعي (مولد ضد/جسم مضاد). ‎(Says‏ أن يتضمن هذا تخقيف العينة بمحاليل مخففة؛ ‎Jie‏ محاليل جلوبولين ‎Lela‏ البقري ‎gamma globulin (BGG)‏ و/أو محلول ملحي منظم بفوسفات ‎aes.

Tween (PBS) phosphata‏ ذلك تترك العينة لتحضن لمدة تتراوح من إلى ؛ ساعات؛ عند درجات حرارة مثل حوالي ‎٠١‏ درجة إلى ‎١7‏ درجة مثوية. عقب

‎٠‏ الحضن؛ يتم غسل السطح الملامس للعينة لإزالة المادة غير المعقدة مناعيا. يمكن أن يشتمل إجراء الغسل على الغسل بمحلول» ‎Tween/PBS Jie‏ أو محلول منظم بورات: عقب تكوين معقدات مناعية محددة بين عينة الاختبار وبروتين ‎HMW‏ المرتبط؛ والغسيل ‎«Bad‏ يمكن تحديد توفر وكمية تكوين المعقد المناعي بتعريض المعقد المناعي إلى جسم مضاد ثان يتصف بخاصية تحديد للجسم المضاد الأول. إذا كانت ‎die‏ الاختبار ذات أصل بشري؛ يكون الجسم المضاد الثاني

‎IgG ‏عبارة عن جسم مضاد يتصف بخاصية تحديد الجلوبولينات المناعية البشرية وبصفة عامة‎ ٠ ‏نشاط إنزيمي من‎ Jie ‏لتوفير وسيلة كشف؛ يمكن أن يتصف الجسم المضاد الثاني بنشاط مرتبط به‎ ‏شأنه؛ على سبيل المثال؛ أن يحدث تطوير اللون عند الحضن مع ركيزة تفاعل مناسبة مكونة‎ ‏للون. يمكن تحقيق الكشف بعد ذلك بكشف تكوين اللون. يمكن حينئذ تحديد الكمية بقياس درجة‎ ‏تكون اللون؛ على سبيل المثال؛ باستخدام مقياس طيفي مرئي ومقارنته بمقياس مناسب. يتضمن‎

‏ذلك استخدام أي طريقة كشف معروفة للمتمرسين في الفن.

الاسم يتضمن نموذج آخر أطقم كشفية تشتمل على جميع الكواشف الضرورية المطلوبة لإجراء تجربة مناعية مطلوبة وفقا للاختراع الحالي. يمكن تقديم طقم التشخيص في شكل ‎Gee‏ تجاريا على هيئة توليفة من واحدة أو أكثر من الحاويات التي تحتوي على الكواشف الضرورية. يمكن أن يشتمل هذا الطقم على بروتين ‎HMW‏ أو حمض نووي ‎nucleic acid‏ يرمزه أو قطعة منه؛ أو جسم ‎٠‏ مضاد وحيد النسيلة أو متعدد النسيلة من الاختراع الحالي في توليفة من مكونات أطقم تقليدية عديدة. ستكون مكونات الأطقم التقليدية واضحة بسهولة للمتمرسين في الفن ويتم الكشف عنها في العديد من المطبوعات؛ بما في ذلك ؛ ‎Antibodies A Laboratory Manual (E.

Harlow« D.

Lane« Cold Spring Harbor‏ ‎Laboratory Press, 1989)‏ ‎٠‏ والتي يتم دمجها بالإشارة إليها بالكامل في السياق. يمكن أن تتضمن مكونات الأطقم التقليدية مواد ‎(J‏ أطباق عيار دقيق؛ ومحاليل منظمة للمحافظة على الرقم الهيدروجيني ‎pH‏ لخليط التجربة ‎Je)‏ سبيل ‎«JE‏ وليس على سبيل الحصر؛ ‎(HEPES (Tris‏ الخ)؛ وأجسام مضادة ثانية مقترنة؛ ‎Jie‏ جسم ‎IgG‏ المضاد الفأري المقترن بإنزيم فوق أكسيد (أو أي جسم ‎IgG‏ مضاد للجسم المضاد الحيواني الذي تم اشتقاق الجسم المضاد الأول منه) وما شابه ذلك؛والكواشف القياسية الأخرى. ‎٠‏ الأحماض الأمينية واستخداماتها يمكن تخليق تسلسلات الحمض النووي من الاختراع الحالي؛ ‎Lay‏ في ذلك حمض ‎DNA‏ وحمض ‎RNA‏ المشتملين على تسلسل ترمز بروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه أو شكل مناظر له؛ بامستخدام طرق معروفة في ‎(ill‏ مثل استخدام أساليب كيميائية تقليدية أو تضخيم بتفاعل سلسلة إنزيم بوليمري ‎(PCR) polymerase‏ باستخدام أزواج متلائمة من بواديء قليل النوويد ‎nucleotides‏ ‏ض ‎٠‏ وتفاعل سلسلة إنزيم رابط باستخدام بطارية قليل النوويد ‎nucleotides‏ المتجاور. ا :

رم - التسلسلات كذلك بتمييز واستنساخ جين بروتين ‎HMW‏ من أي نوع من بروتين كلاميديا ‎protein‏ ‎chlamydia‏ على سبيل ‎(Jd‏ لفحص مجموعات جينومية كلاميدية ‎chlamydial genomic‏ أو مجموعات التعبير. تكون تسلسلات ‎Jif‏ النوويد ‎nucleotides‏ التي ترمز بروتين ‎HMW‏ من الاختراع الحالي مفيدة ‎٠‏ لقدرتها على تكوين جزيئات مزدوجة ‎WE‏ بامتدادات جينات بروتينات أخرى. تبعا للاستخدام المطلوب؛ يمكن استخدام مجموعة متنوعة من ظروف التهجين لتحقيق هويات تسلسلات متنوعة. في جوانب محددة؛ يتم توفير أحماض أمينية ‎amino acids‏ وتشتمل على تسلسل متممة ل ١٠؛‏ د ‎(Yo‏ دى ‎٠0 (Va‏ أو ‎Juli Yoo‏ نوويد ‎nucleotides‏ على الأقل من جين بروتين ‎HMW‏ (الشكل ‎.)١‏ في نماذج محددة؛ تتهجن الأحماض النووية مع حمض نووي ‎nucleic acid‏ ‎٠‏ البروتين ‎Oe) HMW‏ تحتوي على تسلسلات أرقام: ‎YY)‏ أو ‎(YE‏ تحت تأثير ظروف تعديل لظروف تضييق منخفضة؛ أو معتدلة أو عالية. بالنسبة لدرجة الانتقائية العالية؛ يتم استخدام ظروف ضيقة نسبيا لتكوين المزدوجات ‎Sha‏ على سبيل المثال وليس الحصر؛ ظروف ملح منخفض و/ أو درجة حرارة عالية؛ ‎Jie‏ التي يتم توفيرها بدرجة تتراوح من ‎١507‏ مولار إلى ‎١19‏ مولار من ‎NaCl‏ عند درجات حرارة تتراوح بين ‎ve‏ حوالي ‎٠٠‏ درجة مثوية إلى ‎Ve‏ درجة ‎Age‏ بالنسبة لبعض التطبيقات؛ يتطلب الأمر ظروف تهجين أقل تضييقا؛ على سبيل ‎(JB)‏ وليس الحصر؛ مثل ملح بنسبة ‎v0‏ مولار إلى ‎٠,1‏ ‏مولار؛ وعند درجات حرارة تتراوح من بين حوالي ‎٠١0‏ إلى 00 درجة مئوية. يمكن أيضا تحويل ظروف التهجين إلى تضييق أكثر بإضافة كميات متزايدة من الفورماميد ‎formamide‏ « ولمنع استقرار مزدوج التهجين. وبالتالي» يمكن محاولة استخدام ظروف تهجين خاصة بسهيولة؛ © وستكون بصفة عامة طريقة اختيار متوقف على النتائج المطلوبة. على سيل ‎JU‏ وليس

دوس ‎(pan)‏ بصفة عامة؛ تكون درجات حرارة التهجين الملائمة في ‎٠ pag‏ 5/ فورماميد ‎formamide‏ هي: ‎£Y‏ درجة مئوية لمسبار يكون ‎Slade‏ مع القطعة المستهدفة بنسبة تتراوح بين 8 إلى ‎٠٠١‏ وعند ‎TV‏ درجة مئوية بالنسبة لنسبة التماثل التي تتراوح من 0 إلى 58 7 وعند ‎TY‏ درجة مئوية بالنسبة لنسبة التماثل التي تتراوح بين ‎7١‏ إلى ‎SA‏ ‏م تكون ظروف التضييق المنخفضة والمعتدلة والعالية معروفة جيدا في الفن؛ وستتفاوت على نحو متوقع تبعا للتركيبة القاعدية وطول تسلسل الحمض النووي الخاص ووققا للكائن المحدد الذي تشتق منه تسلسل الحمض النووي. لمزيد من الإرشادات حول مثل هذه الظروف؛ انظر على سبيل المثال: ‎Sambrook et al.« 1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual« Second‏ ‎Edition Cold Spring Harbor Press¢ N.Y .« pp. 9.47-9.57; and Ausubel et al.

Ve‏ ‎Current Protocols in Molecular Biology« Green Publishing Associates and‏ 1989¢ ‎Wiley Interscience: N.Y.‏ والتي يتم دمجها في السياق بالإشارة. في تحضير مجموعات جينومية ‎genomic‏ يتم توليد ‎ahi‏ حمض ‎DNA‏ والتي يرمسز ‎vo‏ بعض منها أجزاء من ‎of‏ جميع بروتين ‎HMW‏ كلاميديا ‎chlamydia‏ يمكن تقسيم حمسض ‎DNA‏ عند مواضع محددة باستخدام إنزيمات تقييد متنوعة. على نحو بديل؛ يمكن استخدام إنزيم ‎Dnase‏ في وجود منجنيز ‎manganese‏ لتشظي حمض ‎(DNA‏ أو يمكن تقطيع حمض ‎«Lala DNA‏ على سبيل المثال؛ بواسطة الرنين الصوتي. يمكن بعد ذلك فصل قطع حمض ‎DNA‏ بحسب الحجم بواسطة أساليب قياسية؛ على سبيل المثال وليس الحصر؛ء؛ © - الاستشراد بهلام أجاروز ‎agarose‏ و بولي أكريلاميد ‎polyacrylamide‏ واستشراب عمودي

- $. - وطرد مركزي متدرج بسكروز ‎csucrose‏ يمكن حينئذ إدخال قطع الحمض ‎DNA‏ في نواقل مناسبة؛ بما في ذلك وليس على سبيل الحصرء بلادزميدات 5 وكوزميدات ‎cosmids‏ ؛ وخلايا ملتهمة بكتيرية لامدا أو ‎«T4‏ وبازميدات ‎bacmids‏ وكروموزوم ‎chromosome‏ صناعي للخميرة(7/8.0) (انظر على سبيل المثال: ‎2d Ed.« Cold °‏ القنصدكة ‎A Laboratory‏ اعيتدم0 ‎Sambrook et al.« 1989« Molecular‏ ‎Spring Harbor Laboratory Press< Cold Spring Harbor N.Y; Glover« D. M. (ed.)«‏ ‎DNA Cloning: A Practical Approach MRL Press« Ltd.« Oxford« UK. Vol.‏ 19856 ‎IID)‏ ‏يمكن فحص المجموعة المتعلقة بمجموعة العوامل الوراثية بواسطة تهجين الحمض النووي وفقا ‎. ‏لمسبار مميز‎ ٠٠١ (Benton and Davis¢ 1977) Science 196:180( Grunstein and ‏قمعضعه11‎ 1975¢ Proc.

Natl. Acad. Sci. US A 72:3961). ‏يمكن فحص المجموعات المتعلقة بمجموعة العوامل الوراثية بواسطة مسبارات مميزة بقليل‎ peptide ‏لأي ببتيد‎ amino acid ‏المتحلل المناظر لتسلسل الحمض الأميني‎ nucleotides ‏النوويد‎ ‏معروفة جيدا في الفن. في نماذج محددة؛ يكون مسبار‎ Ale ‏باستخدام أساليب‎ HMW ‏.من بروتين‎ ٠ amino ‏متحلل يتوافق مع تسلسل الحمض الأميني‎ nucleotides ‏الفحص عبارة عن قليل نوويد‎ ‏متحلل‎ nucleotides ‏يمكن أن يكون مسبار الفحص قليل نوويد‎ «A ‏في نموذج‎ Eid acid ‏رقم: 5. في نموذج إضافي؛ يمكن اسستخدام أي‎ amino acid ‏يتوافق مع تسلسل الحمض الأميني‎ ‏77-؟1أو أي قطع منهاء أو أي متمم للتسلسل أو‎ 11-٠١ ٠ ‏واحدة من تسلسلات أرقام:‎

‎gy =‏ - قطع منها كمسبار. يفضل أن يكون أي مسار مستخدم محتوي على ‎V0‏ نيوكليوتيد ‎nucleotide‏ ‏أكثر. ‏ستقوم النسائل الموجودة في مجموعات ذات حمض ‎DNA‏ مدخل يرمز بروتين ‎HMW‏ أو قطع منه بالتهجين وفقا لواحد أو أكثر من مسبارات قليل نوويد ‎nucleotides‏ متحلل. يتم إجراء © تهجين مسبارات قليل التوويد ‎nucleotides‏ هذه وفقا لمجموعات متعلقة بمجموعة العوامل الوراثية باستخدام طرق معروفة في الفن. على سبيل المثال؛ يمكن إجراء التهجين بمسباري قليل النوويد ‎nucleotides‏ المذكورين أعلاه في ‎SSC XY‏ و1,0 58057 عند ‎٠١‏ درجة مئوية. ويتم غسلها باستخدام نفس الظروف. في جانب ‎al‏ يمكن أيضا الحصول على نسائل تسلسلات قليل النوويد ‎nucleotides‏ التي ترمز ‎٠‏ جزءا من أو كامل بروتين ‎HMW‏ أو قليل الببتيدات ‎peptides‏ المشتق من بروتين ‎HMW‏ بنحص مجموعات التعبير عن الكلاميديا ‎chlamydia‏ على سبيل المثال؛ يتم عزل حمض ‎DNA‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏ أو حمض ‎cDNA‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏ المولد من حمض ‎RNA‏ ويتم تحضير قطع عشوائية ويتم ربطها في نواقل التعبير ‎Dia)‏ خلية ملتهمة للبكتيرياء أو بلازميد ‎plasmid‏ + أو فاجميد ‎«phagemid‏ أو كوزميد ‎(cosmid‏ بحيث يمكن التعبير عن التسلسل المدخلة في الناقل ‎١‏ بواسطة الخلية العائلة التي يتم تقديم الناقل فيها حينئذ. يمكن بعد ذلك استخدام العديد من تجارب الفحص لانتقاء بروتين ‎HMW‏ المعبر عنه أو عديد الببتيدات ‎polypeptide‏ المشتق من ‎HMW‏ ‏في أحد النماذج؛ يمكن استخدام العديد من الأجسام المضادة لبروتين ‎HMW‏ من الاختراع لتمييز النسائل المطلوبة باستخدام طرف معروفة في الفن. انظر على سبيل المثال: ‎Harlow and Lane« 1988¢ Antibodies: Al.aboratory Manual¢ Cold Spring Harbor‏ ‎Laboratory Press Cold Spring Harbor¢ N.Y Appendix IV.

Yoo‏

- +

يتم تلامس النسائل والبقع من المجموعة مع الأجسام المضادة لتمييز تلك النسائل التي تتحد.

في أحد النماذج يمكن كشف المستعمرات أو البقع التي تحتوي على حمض ‎DNA‏ الذي يرمز

بروتين ‎HMW‏ عديد الببتيدات ‎polypeptide‏ المشتق من بروتين ‎HMW‏ وذلك باستخدام خرزات

‎DYNA‏ رقا للد ‎Tex. 1999 Houston: 29th ICAAC:Olvsvick et‏ ؛ المدمج هنا بالإشارة. يتم م ربط الأجسام المضادة لبروتين ‎HMW‏ تبادليا وفقا ل ‎DYNA Beads M280‏ مضطربة؛ وتستخدم

‏بعد ذلك هذه الخرزات التي تحتوي على أجسام مضادة لامتزاز المستعمرات أو البقع التي تعبر

‏عن بروتين ‎HMW‏ أو عديد الببتيدات ‎polypeptide‏ المشتق من ‎HMw‏ يتم تمييز المستعمرات أو

‏البقع التي تعبر عن بروتين ‎HMW‏ أو عديد الببتيدات ‎polypeptide‏ المشتق من ‎HMW‏ على هيئة

‏أي من تلك التي تربط الخرزات.

‎las sole ‏بشكل غير محدد في‎ HMW ‏يمكن تثبيت الأجسام المضادة لبروتين‎ cay ‏على نحو‎ ٠ ‏ستستخدم هذه المادة بعد ذلك في امتزاز‎ . Celite TM ‏أو راتينج‎ silica ‏مناسبة؛ مثل السيليكا‎ ‏المشتق من‎ polypeptide ‏أو عديد الببتيدات‎ HMW ‏المستعمرات البكتيرية المعبرة عن بروتين‎ ‏وفقا لما تم بيانه في الفقرة السابقة.‎ HMW ‏بروتين‎ ‏لإنتاج حمض 2118 نقي إلى حد كبير يرمز جزءا‎ PCR ‏يمكن استخدام تضخيم‎ AT ‏في جانب‎

‎Vo‏ .من أو كل بروتين ‎HMW‏ من حمض ‎DNA‏ الجينومي ‎genomic‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏ يمكن استخدام بواديء قليل النوويد ‎«nucleotides‏ المتحلل أو المكون بخلاف ذلك؛ المناظر لتسلسلات بروتين ‎HMW‏ معروفة كبواديء. في نماذج خاصة؛ يمكن استخدام قليل النوويد ‎nucleotides‏ ‏المتحلل أو المتكون بخلاف ذلك؛ والذي يرمز الببتيد ‎peptide‏ الذي يحتوي على تسلسلات حمض أميني ‎amino acid‏ أرقام: ؟؛ © أو ‎١7-١١‏ أو أي ‎Ja‏ منه باعتباره الرئيسي *" . بالنسبة

‎amino acid ‏الأمثلة القطع ؛ يمكن تكوين الرئيسي 10 من أي واحدة من تسلسلات الحمض الأميني‎ vy.

اسع ‎VY ٠١ v= nl]‏ - 77-؟ ؟ أو أي جزء منه. يمكن استخدام تسلسلات قليل النوويد ‎«nucleotides‏ المتحلل أو المتكون بخلاف ذلك؛ والتي تكون متممات عكسية للتسلسلات أرقام: ‎١١‏ أو ‎١“‏ أو ‎١4‏ باعتبارها الباديء 7 .

يمكن إجراء ‎(PCR‏ مثلاء باستخدام وسيلة تدوير حراري من ‎Perkin-Elmer Cetus‏ وإنزيم ‎٠‏ بوليمراز ‎(Gene Amp TM) Taq‏ يمكن أن نختار تخليق العديد من البواديء المتحللة المختلفة؛ وذلك لاستخدامها في تفاعلات ‎PCR‏ كما أنه من الممكن تنويع تضييق ظروف التهجين المستخدمة في بدء تفاعلات ‎PCR‏ للسماح بوجود درجات أكبر أو أقل من تشابه تسلسلات النوويد ‎nucleotide‏ بين البواديء المتحللة والتسلسلات المناظرة في حمض ‎DNA‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏ بعد التضخيم الناجح لجزء من التسلسل التي ترمز بروتين ‎HMW‏ يمكن استتسساخ ‎٠‏ ذلك الجزء وعمل تسلسل له جزيئيا؛ ويمكن استخدامه كمسبار لفصل نسيلة جنومية ‎genomic‏ ‏كاملة. وهذا بدوره سيسمح بتحديد تسلسل النوويد ‎nucleotide‏ التامة للجين؛ وتحليل التعبير عنهاء

وإنتاج جزء منتج منها للتحليل الوظيفي؛ وفقا لما ‎oli‏ مسبقا. في نموذج تشخيصي إكلينيكي؛ يمكن استخدام تسلسلات الحمض النووي من جينات بروتين 77 من الاختراع الحالي في توليفة مع وسيلة مبينة مناسبة؛ ‎ie‏ بطاقة تمييز» لتحديد التهجين. هناك مجموعة متنوعة واسعة من الوسائل المبينة المعروفة في الفن؛ بما فيها وسيلة إشعاعية؛ أو رابطة إنزيمية أو رابطة أخرىء مثل أفيدين 810:0 / فيتامين ه والتمييز بداي جوكسيجينين ‎digoxigenin‏ ؛ وهي قادرة على توفير إشارة يمكن كشفها. في بعض النماذج ‎Apa dll‏ يمكن استخدام بطاقة إنزيمية مثل إنزيم اليورين ‎urease‏ « أو إنزيم فوسفاتاز ‎«alkaline phosphatase‏ أو إنزيم فوق ‎peroxidase laws!‏ ؛ بدلا من بطاقة إشعاعية في حالة بطاقات ‎am iY)‏ تعرف > الركائز الأساسية لمبين مقياس السعرات الحرارية والتي يمكن استخدامها لتوفير وسيلة مرئية

- ss ‏للعين البشرية أو بطريقة المقياس الطيفي؛ لتحديد تهجين محدد بعينات تحتوي على تسلسلات‎

HMW ‏جين بروتين‎ ‏من الاختراع الحالي مفيدة كمسبار‎ HMW ‏تكون تسلسلات الحمض النووي لجينات بروتين‎ ‏للتهجين في عمليات التهجين المحلول وفي النماذج التي تستخدم إجراءات الطور الصلب. في‎ ‏للاختبار (أو‎ DNA ‏النماذج التي تشتمل على إجراءات الطور الصلب؛ يتم امتصساص حمض‎ ٠ ‏مصل؛‎ lis ( ‏العينات الإكلينيكية؛ بما في ذلك النضحات؛ وموائع الجسم‎ Jie ‏من العينات؛‎ (RNA ‏والنخط؛ وانسكاب الأذن الوسطىء والبلغم؛ والمني؛ والبول؛ والدموع؛ والمخاط» ومائع غسل‎ ‏الحويصلات الهوائية) أو حتى الأنسجة؛ يتم تثبيتها بخلاف ذلك على مجموعة أو سطح منتقى.بعد‎ ‏ذلك يتم تعريض الحمض النووي مفرد السلالة إلى تهجين محدد بمسبارات منتقاة تشسستمل على‎ ‏التي ترمز جينات أو قطع منه أو أشكال مناظرة له‎ HMW ‏تسلسلات الحمض النووي لبروتين‎ ٠ ‏من الاختراع الحالي تحت تأثير الظروف المطلوبة. تعتمد الظروف المنتفاة على ظطروف معية‎ ‏ونوع الحمض النووي‎ (GHC ‏مبينة على معايير خاصة مطلوبة تبعاء على سبيل المثال؛ لمحتويات‎ ‏المستهدف؛ ومصدر الحمض النووي؛ وحجم مسار التهجين الخ. عقب غسل سطح التهجين لإزالة‎ ‏جزيئات مسبار مرتبطة على نحو غير محدد؛ يتم كشف التهجين المحدد؛ أو حتى تحديد حجمه‎ ‏بواسطة البطاقة المميزة. يفضل ان يتم انتقاء أجزاء تسلسلات الحمض النووي التي يتم حفظها‎ Vo ‏على الأقل‎ Vo ‏أن يكون المسبار المنتقى بزوج قاعدة‎ Sa chlamydia ‏بين أنواع كلاميديا‎ ‏زوج قاعدة.‎ te ‏إلى‎ "٠ ‏ويمكن أن يتراوح من حوالي‎

HMW ‏التعبير عن جين بروتين‎ ‏التي تحتوي على تسلسلات ناسخة و تحكم والتي يتم‎ plasmid ‏يمكن استخدام نواقل البلازميد‎ ‏أو قطع‎ HMW ds pn ‏اشتقاقها من أنواع متوائمة مع الخلية العائلة للتغبير عن الجينات التي ترمز‎ vy.

هم - منه في أنظمة التعبير. تحتوي نواقل التعبير على جميع العناصر الضرورية للنسخ والترجمة الوراثية لتسلسل ترميز الجين التي تم إدخالها. عادة ما يحمل الناقل موضع تكرار نسخ؛ وكذلك تسلسلات ترقيم والتي تكون قادرة على توفير انتقاء نمط ظاهري في الخلايا المتحولة. على سبيل المثال يمكن تحويل إشرشيا كولاي ‎E.coli‏ باستخدام ‎pBR322‏ التي تحتوي على جينات م لخلايا مقاومة للأمبيسيلين ‎ampicillin‏ والتتراسيلين ‎tetracycline‏ تكون النواقل الاخرى المتوفرة تجاريا مفيدة؛ ‎Lay‏ فيها ولين على ييل الحصر ‎pTrc99A 5 (pZERO‏ 017018017019

3 كلتم ارط ‎p¢ pThioHis¢ pFastBaccpTrxFus « pSPUTK: pET« pCAL«‏ ‎Trellis‏ 011152: 1م ‎٠‏ و ‎.pLEX‏ يجب أن تحتوي البلازميدات ‎plasmids‏ أو الخلايا الملتهمة؛ أو يجب تعديلها لتحتوي على معززات يمكن استخدامها بواسطة الخلية العائلة proteins ‏ا للتعبير عن بروتيناتها‎ ٠ aul ‏علاوة على ما سبق يمكن استخدام النواقل الملتهمة التي تحتوي على تسلسلات‎ ‏وضابطة والتي تكون متوائمة مع الخلية العائلة وذلك كناقل تحويلي فيما يتعلق بهذه‎ ‏الخلايا العائلة. على سبيل المثال؛ يمكن استخدام الخلية الملتهمة الموجودة في لامدا‎ .8 coli LE392 ‏إشرشيا كو لاي‎ Jia ‏لتحويل الخلايا العائلة.‎ GEWTM-11 ‏ناتج عودة الارتباط‎ DNA ‏تشتمل المعززات شائعة الاستخدام في تركيب حمض‎ oe lactose ‏وأنظمة معزز اللاكتوز‎ (penicillinase ‏الاكتاماز -8 (إنزيم بنسيلين‎ recombinant ‏الموصوف في البراءة الأمريكية رقم‎ TT ‏ومعززات ميكروبية أخرى؛ مثل نظام معزز‎ ‏للمعززات‎ nucleotides ‏6.ر. تكون التفاصيل المتعلقة بتسلسلات قليل النوويد‎ ‏معروفة؛ مما يمكن العامل المتمرس من ربطها وظيفيا مع الجينات. سيكون المعزز‎ ‏مسألة اختيار تبعا للنتائج المطلوبة.‎ Le; ‏الخاص المستخدم بصفة عامة‎ - ©

-

وفقاً للاختراع؛ يفضل عمل بروتين ‎HMW‏ بواسطة طرق عودة الارتباط ‎"Lali » recombinant‏ عندما يشتمل بروتين ‎HMW‏ المتكون بطريقة طبيعية عن طريق فصله من مستنبت أنواع كلاميديا ‎chlamydia‏ على أثار كمية من مواد سامة أو مواد ناتجة عن عودة ارتباط أخر. يمكن تجنب هذه المشكلة عن طريق استخدام بروتين ‎HMW‏ ناتج عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ في ‎١‏ نظم غير متجانسة؛ التي يمكن فصلها من الخلية العائلة بطريقة تقلل من وجود الملوثات في المادة المستخلصة. وبالتحديدء تشتمل الخلايا العائلة المرغوبة للتعبير ورائياً هنا على البكتيريا الإيجابية لجرام التي لا تمتلك ‎LPS‏ وتكون بالتالي خالية من السموم الداخلية. تشتمل هذه الخلية العائلة على أنواع من العصيات ويمكن أن تكون على وجه التحديد مفيدة في إنتاج بروتين 11177 غير

المسبب للحمى أو قطعة منه أو أشباه له.

‎٠‏ ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من نظم ناقل ‎ile‏ للتعبير وراثياً عن تسلسل ترميز البروتين. تشتمل هذه على نظم خلايا ثديية مصابة بفيروس (على سبيل المثال؛ فيروس الوقس وفيروسات الغدد. الخ)؛ نظم ‎LIA‏ الحشرات المصابة بفيروس (الفيروسات العصوية) والميكروبات ‎Jie‏ ‏الخمائر التي تحتوي على الناقل الخيميرية أو البكتريا المتحولة مع حمض ‎DNA‏ لملتهمة البكتيرياء أو حمض ‎DNA‏ بلازميد ‎plasmid‏ أو حمض ‎DNA‏ كوزميد؛ ولكن لا تقتصر على ذلك.

‎ve‏ ويمكن أن تشتمل الخلايا العائلة الملائمة للتعبير وراثياً عن جينات بروتين 12287 أو أشباه له أو شظيات أو صورة مختلفة منه على ‎Coli‏ .5 أو أنواع العصيات أو الجراثيم المستديمة أو الفطريات أو الخمائر ‎Bordetella<Saccharomyces pichia Jie‏ أو تستخدم نظم تعبير وراتية للفيروسات العصوية. ويفضل أن تكون الخلية العائلة عبارة عن جرثومة؛ ويفضل أكثر أن تكون الجرثومة عبارة عن 3 ‎E. coli,‏ أو العصوية الرقيقة أو السلمونيلا ‎.Salmonella‏

‏ا

- وتختلف عناصر التعبير الوراثي للناقلات من ناحية مقوماتهم ونوعياتهم. واعتماداً على استخدام ‎(Jil JL‏ يمكن استخدام واحداً من مجموعة عناصر الانتساخ والترجمة الوراثية المناسبة. في نموذج مفضل؛ يتم التعبير وراثياً عن بروتين خيميري يشتمل على بروتين 100377 أو تسلسل بولي ببتايد مشتقة منه وتسلسل قبلية و/أو بعدية للخلية العائلة . في نموذج أخر ‎cumin‏ يتم التعبير ‎Woy o‏ عن بروتين خيمري يشتمل على بروتين ‎HMW‏ أو تسلسل بولي ببتيد ‎polypeptide‏ مشتقة منه تندمج مع ببتيد ‎Judd) peptide‏ إلى التنقية على سبيل المثال. وفي نموذج مفضل أخر؛ يتم التعبير وراثياً عن بروتين خيميري يشتمل على بروتين ‎HMW‏ أو تسلسل بولي ببتيد ‎polypeptide‏ ‏مشتقة منه وببتيد ‎peptide‏ أو بروتين مفيد مولد للمناعة. وفي نموذج مفضل؛ يحتوي البروتين المشتق من ‎HMW‏ على تسلسل تشكل قمة لاصقة للسطح الخارجي أو نطاق الربط للمستقبل من > بروتين 118137 الذاتي. يمكن استخدام أي طريقة معروفة في هذا المجال لإدخال شظيات من حمض ‎DNA‏ داخل ‎(JI‏ ‏وذلك لإنشاء ناقل تعبير وراثي يحتوي على جينات خيميرية متكونة من إشارات تحكم نسخية/ترجمية وراثية ملائمة وتسلسل ترميز البروتين. يمكن أن تشتمل هذه الطرق على ‎aaa‏ ‎DNA‏ ناتج عن عودة الارتباط في المختبر وتقنيات تخليقيه بالإضافة إلى مواد ناتجة عن عودة ‎ve‏ الارتباط ‎Jala‏ الكائن الحي (عودة الارتباط). ويمكن تنظيم التعبير الورائي لتسلسل الحمض النووي التي ترمز بروتين ‎HMW‏ أو البولي ببتيد ‎polypeptide‏ المشتق منه عن طريق تسلسل حمض نووي ‎nucleic acid‏ ثانية؛ حتى يتم التعبير ورائياً عن التسلسل المدخلة في خلية عائلة متحولة مع جزئ حمض ‎DNA‏ الناتج عن عودة الارتباط. على سبيل المثال؛ يمكن التحكم في التعبير الوراثي للتسلسل المدخلة بواسطة أي عنصر محفز/معزز معروف في هذا المجال. ‎vs‏ وتشتمل المحفزات التي يمكن استخدامها للتحكم في التعبير الوراثي للتسلسل المدخلة؛ دون ض الاقتصار على ذلك؛ على منطقة المحفز ض

- ‏م‎ - : ‏؛ والمحفز الموجود‎ Nature 290:304-310) « 1981¢(Bernoist and Chambon SV40 Carly «(Yamamoto et al. ‏المكرر الطرف الطويل‎ Rous sarcoma virus ‏في فيروس ساركوما روس‎ herpes thymidine ‏ومحفز إنزيم هربس ثتيميدين‎ Cell 22:787-0 ‏؛ والتسلسل‎ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441—1445)c 1981«(Wagner et al. « metallothionein gene ‏المنتظمة لجين الميتالوثيونين‎ © ‏_للتعبير الوراثي داخل الخلايا الحيوانية؛‎ Nature 296:39-42)¢ 1982¢(Brinster et al. « lactamase ‏ومحفزات إنزيم م-اللاكتاماز‎ (Villa-Kamaroff et al « 1978: Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA. 75:3727—373 1)¢ tac (DeBoer et al « 1983: Proc. Natl. Acad Sci. U.SA. 80:21-25)¢ P, : ‏أو ©» للتعبير وراثياً عن خلايا بكتيرية (انظر أيضاً‎ Ve " "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American 1980 242-74- 94) 355 RNA ‏أو محفز الفيروس الخزفي للأذن القنبيطية‎ nopaline ‏ومنطقة محفز إنزيم النوبالين‎ ‏ومحفز إنزيم البناء الضوئي كربوكسيلاز‎ Nucl Acids 765 1981 (Gardner et al. 9:2871)

Nature 310:115-120)¢1984 ribulose biphosphate carboxylase ‏باي فوسفات ريبولوز‎ ١ ‏والعناصر المحفزة من الخميرة‎ de ual ‏1166:2-250©112)»_للتعبير الوراتي للخلايا‎ et al. ‏(إنزيم الديهيدروجيناز الكحولي‎ ADC ‏محفز 6814 ومحفز‎ Jt ‏والفطريات الأخرى‎ (phosphoglycerol kinase ‏(إنزيم فوفسو جليسرزول‎ PGK ‏ومحفز‎ (alcohol dehydrogenase alkaline phosphatase ‏ومحفز إنزيم فوسفات الألكلين‎ 7

- ge ‏أو البولي‎ HMW ‏ويمكن تحديد ناقلات التعبير الوراثي المحتوية على تسلسلات ترميز بروتين‎ ‏المشتق منه بواسطة ثلاث مداخل: (أ) تهيجين الحمض النووي؛ (ب) وجود أو‎ polypeptide ‏ببتيد‎ ‏تفاعل الأجسام المضادة‎ Jie ‏غياب وظائف الجين المرقم و(ج) التعبير الوراثي للتسلسل المدخلة‎ ‏لبروتين 110877. في المدخل الأول؛ يمكن الكشف عن وجود جين غريب مدخل في ناقل التعبير‎ ‏_الوراثي بواسطة تهجين الحمض النووي باستخدام مسبارات تشتمل على تسلسل متوافقة مع‎ ٠ ‏المشتق منه. في المدخل الثاني يمكن‎ polypeptide ‏أو البولي ببتيد‎ HMW ‏تسلسل ترميز بروتين‎ ‏على وجود أو غياب وظائف‎ bolded ‏تحديد واختيار نظام الناقل/العائل الناتج عن عودة الارتباط‎ ‏ومقاومة الأجسام المضادة والتحول المظهري‎ thymidine ‏جين مرقم معين (نشاط إنزيم التيميدين‎ ‏وتشكيل جسم انسدادي في الفيروسات العصوية الخ) الذي يسببها إدخال جينات غريبة في الناقل.‎ ‏المشتق‎ polypeptide ‏على سبيل المثال؛ إذا تم إدخال تسلسل ترميز بروتين 11817 أو البولي ببتيد‎ ٠ ‏يمكن تحديد المواد الناتجة عن عودة الارتباط المشتملة على‎ (JI ‏منه داخل تسلسل الجين المرقم‎ ‏المكونات المدخلة بواسطة غياب وظيفة الجين المرقم . في المدخل الثالث؛ يمكن تحديد ناقلات‎ ‏التعبير الوراثي الناتجة عن عودة الارتباط عن طريق تحليل منتج الجين الغريب المعبر عنه‎ ‏بنتاج عودة الارتباط. تعتمد هذه التحاليل على الخواص الوظيفية والطبيعية بروتين‎ Us ‏في نظم التحليل المختبرية» على سبيل المثال‎ ase ‏المشتق‎ polypeptide ‏البولي ببتيد‎ JHMW ٠ sy HMW ‏أو الارتباط مع أجسام مضادة لبروتين‎ FIMW ‏الربط باستخدام جزئ ربط أو مستقبل‎ ‏للاختراع أو قدرة الخلايا العائلة على التلزن أو قدرة عصارة الخلية على التدخل في عملية التلزن‎ .chlamydia ‏بالكلاميديا‎ ‏الناتج عن عودة الارتباط ؛ يمكن استخدام العديد من‎ DNA ‏وبمجرد تحديد وفصل جزئ حمض‎ ‏الطرق المعروفة في هذا المجال لإنتاجه. وبمجرد إنشاء نظام عائل وظروف نمو مناسبة؛ يمكن‎ © 0 ‏إنتاج وتحضير ناقلات التعبير الوراثي الناتجة عن عودة الارتباط بكميات. وكما تم التوضيع‎ en ‏أعلاه؛ تشتمل ناقلات التعبير الوراثي التي يمكن استخدامها على الناقلات التالية أو مشتقاتها دون‎ ‏الاقتصار على ذلك: فيروسات تصيب الإنسان والحيوان مثل فيروس الوقس أو فيروسات الغدد‎ ‏وفيروسات الحشرات مثل الفيروسات العصوية والناقلات الخيميرية وناقلات ملتهمة البكتيريا‎ ‏والكوزميد؛ ولا يمكن التحديد إلا القليل منها.‎ plasmid ‏البلازميد‎ DNA ‏(لامبدا) وناقلات حمض‎ ‏خلية عائلة التي تعدل التعبير الوراثي للتسلسل المدخلة أو‎ ADL ‏م بالإضافة لذلك؛ يمكن اختيار‎ ‏تعدل وتعالج منتج الجين في شكل محدد ومرغوب. يمكن تحسين التعبير الوراثي لمحفزات معينة‎

HMW ‏معينة وبالتالي يمكن التحكم في التعبير الوراشي لبروتين 122417 أو‎ lina ‏في وجود‎ ‏المشتق منه والمعدل ورائياً. علاوة على ذلك؛ تمتلك الخلايا العائلة المختلفة خصائص وآليات‎ ‏معينة للمعالجة والتعديل الترجمي وبعد الترجمي للبروتينات. ويمكن اختيار خطوط خلايا ونظم‎ ‏وراثيا.‎ die ‏للتأكد من التعديل والمعالجة المرغوبين للبروتين الغريب المعبر‎ LDL ‏عائلة‎ ‏والأجسام المضادة والأحماض‎ peptides ‏والببتيدات‎ polypeptide ‏وتعد البروتينات والبولي ببتيدات‎ ‏التووية وفقاً للاختراع مفيدة كعوامل كاشفة للتشخيص العيادي والطبي لعدوي الكلاميديا‎ chlamydia ‏وللبحث العلمي في الخواص الاعتلالية والسمية وحالة العدوي للكلاميديا‎ chlamydia

DNA ‏يمكن استخدام أحماض‎ (Jl) ‏بالإضافة إلى آليات الدفاع للخلية العائلة . على سبيل‎ ‏في عينات بيولوجية بواسطة‎ chlamydia ‏وفقاً للإختراع كمسبارات لتحديد وجود الكلاميديا‎ RNAS ve ‏لتحديد أنواع أخرى من البكتيريا‎ RNAS DNA ‏ويمكن استخدام أحماض‎ PCR ‏التهجين أو تكبير‎ ‏المتعلق ببروتين 110407 للكلاميديا‎ polypeptide ‏التي يمكن أن تقوم بترميز البولمي ببتيد‎ ‏ل. ويمكن استخدام البروتينات وفقاً للاختراع في تحضير أجسام مضادة أحادية أو‎ 8 ‏متعددة الاستنساخ التي يمكن استخدامها أيضاً في تنقية تركيبات تحتوي على بروتينات وفقا‎ ‏ا للاختراع عن طريق الاستشراب بالألفة. كما يمكن استخدام البروتينات أيضاً في اختبارات مناعية‎ ٠ ‏في العينة.‎ chlamydia ‏عيارية للكشف عن وجود الأجسام المضادة للكلاميديا‎

‎١ __‏ م - مواد بيولوجيه مودعة وقد تم إيداع بلازميدات معينة تحتوي على أجزاء من الجين ذات إطار قراءة مفتوح للجين الذي يقوم بترميز بروتين ‎HMW‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏ الموصوف والمشار إليه في هذه الوثيقة في ‎the‏ ‎American Type Culture Collection (ATCC)‏ الواقعة في ‎University Blvd‏ 10801 ‎U.S A « Va 20110-2209<Manassas ٠‏ طبقا لاتفاقية ‎CFR 1.808 5 Budapest‏ 37 وقبل إيداع هذا الطلب. ويلي توضيح مطابقة الأجزاء المتناظرة من الجين الموجود في هذه البلازميدات ‎-plasmids‏ ‏وسوف تتاح عينات من المواد المودعة للعامة فور الموافقة على البراءة بناء على طلب البراءة الأمريكي هذا. ولا يحدد الاختراع الذي ثم وصفه وحمايته وفقا لعناصر الحماية المذكورة = هذه ‎٠‏ - الوثيقة داخل نطاق ‎plasmids awe SUN‏ المودعة؛ حيث يقصد بالنموذج المودع توضيح الاختراع فقط. وتعتبر أي بلازميدات ‎plasmids‏ مكافئة أو مشابهه التي تقوم بترميز بروتينات مكافئة أو مشابهه أو شظيات منها أو أشباه لها داخلة في نطاق الاختراع. رقم التسجيل في 8760 .| ...تاريخ الإبداع 2م 3121 ‎A ATCC 985538 E.

Coli‏ سبتمبر ‎VARY‏ ‎٠ ATCC PTA-3719 E.

Coli TOP 10 (JJ 36-‏ سبتمبر ‎٠٠١١‏

‎Y _‏ 5 ا أمثلة : ويصف الكشف السابق الاختراع الحالي بشكل عام. ويلي تقديم وصف أكثر تحديدا في الأمتلة الآتية. ويتم وصف الأمثلة فرادى بغرض التوضيح ولا يقصد بها تقييد نطاق الاختراع. ويهدف الاختراع إلى إحداث تغييرات في الشكل وتقديم بدائل كلما أتاحت الظروف أو قدمت الوسائل. هه وعلى الرغم من استخدام مصطلحات محددة في هذه الوثيقة؛ يقصد بهذه المصطلحات الوصف

‏وليس التحديد. وتم وصف طرق الوراثة الجزيئية والكيمياء الحيوية للبروتينات وعلم المناعة المستخدم ولكن لم يتم وصفها بصورة مباشرة في الكشف والأمثلة في المواد العلمية وتتدخل في نطاق قدرة ذوي المهارة في هذا المجال.

‎( ١ ) ‏المقثال‎ ٠ ‏الناضج‎ chlamydia ‏فصل وتنقية بروتين الكلاميديا‎ ‏الدوارة‎ Bellco ‏في قنينة استنبات عيارية لنسيج 770 سما أو في قنينة‎ McCoy WDA ‏تم استنبات‎ ‏.م في 70 من ثاني أكسيد‎ TV ‏عند درجة حرارة‎ (Pharmacia ‏الدقيقة؛‎ Cytodex ‏(حاملات‎ ‏من مصل بقري جنيني خالي من الأجسام‎ 7 ٠١ ‏يكمله‎ DMEM ‏باستخدام مستنبت‎ CO, ‏الكربون‎

‎١٠‏ المضادة للكلاميديا ‎chlamydia‏ و الجلوكوز ‎glucose‏ و الأحماض الأمينية ‎amino acids‏ غير الضرورية. تحضر | لأجسام الأولية من الكلاميديا :

‎chlamydia trachomatis L, (ATCC VR-902B) ‏المصابة بالكلاميديا‎ McCoy ‏بشكل أساسي؛ يتم تعريض خلايا‎ .MeCoy ‏من ناتج ذوبان خلايا‎

- ov —

‎chlamydia‏ مآ ‎Cla gall (LGV) rrachomatis‏ فوق الصوتية ويتم إزالة الفضلات ‎Ag all‏ عن طريق الطرد المركزي. ثم تطرد الأجسام الطافية المشتملة على الأجسام الأولية ‎ba OSU‏ ‎(Ebs) chlamydia‏ ويعاد تعليق الحبيبة المحتوية على ‎Bbs‏ في محلول ‎Hanks‏ الملحي المتسوازن (محلول ‎HBSS‏ ). وتضاف محاليل ‎Rnase/Dnase‏ وتحضن عند درجة حرارة 7١م‏ لمدة ساعة ‎٠‏ مع التقليب من حين لأخر. وتوضع ‎EB‏ المشتملة على محلول في طبقات على مكون ذو كثافة متقطعة (750و7414و194) من ‎Angiovist‏ ( خليط من الداي أتريزوات ميلجومين ‎diatrizoate melgumine‏ والداي أتريزوات ‎diatrizoate sodium a 323 gall‏ ‎N.J.« WaynecBerlex Laboratories‏ ( ويحدث ‎3S ja 3 yh‏ 5( فائق ‎EBs Jail de ) ull‏ الموجودة على المدروج. بعد الطرد المركزي؛ يتم قطف ‎EBs‏ من المدروج بين الأسطح البينية ‎٠‏ 7440و 4ه 7 لطبقات ‎(YY +) Angiovist‏ ثم تغسل ‎EBs‏ في ملح فوسفات1105018:6م المدرئ

‏ويعاد تعليقها في محلول 10355 . ويتم استخلاص ‎EBs‏ التي تم تنقيتها بواسطة 7001 ‎OGP‏ (مقاومة أيونية عالية) في محلول لإزالة بروتينات سطحية محيطية وتحفظ في الثلج. ثم يستخلص نفس مستحضر ‎EB‏ بواسطة 71,0 ‎OGP‏ و١٠‏ ملي مولار من ‎DTT‏ و١‏ ملي مولار من 73457 و١٠‏ ملي ‎Vo‏ مولار من 20718 في محلول منظم ‎TRIS‏ تركيزه ‎١‏ © ملي مولار له رقم هيدروجيني ‎PH‏ ‏؟؛,. ويتم فصل المستخلص البروتيني ‎(3500MWCO)‏ لإزالة المادة المنظفة والمواد المنظفة الأخرى؛ ثم يركز بالتجفيف. وتخفف البروتينات المحتوية على خلاصة البروتين في محلول 98 ويمرر على أعمدة هيبارين-سيفاروز ‎heparin-sepharose‏ المتاحة تجاريا ‎(HiTrap Col., Pharmacia)‏ وبعد وضع العينات في أعمدة الهيبارين ‎heparin‏ » يتم إزالة

‏: © البروتينات غير الملتصقة بغسلها في محلول ‎HBSS‏ فائق. ويتم تصنيف البروتينات ‎CA pall‏

عه -

حسب النوعية باستخدام ‎PBS‏ المحتوي على كلوريد الصوديوم ‎sodium chloride‏ تركيزه ؟

مولار. وتفصل مواد الفصل التتابعي بتوسع لإزالة الملح ثم تجفف. ويتم تجزثة البروتينات

الرابطة للهيبارين ‎heparin‏ من ‎Cua‏ الحجم باستخدام ‎SDSPAGE‏ ثم يجعل مرئيا لعن طريق

صبغه بالفضة أو يحلل باستخدام طريقة بقعة ‎Western‏ وتم الكشف عن ما يقرب من ‎٠١#‏ - م ‎١١#‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ من البروتينات متواجدة في كميات متوسطة كما تم توضيحها في ‎JS‏

0,90 ‏وتم تحديد نقطة التعادل للبروتين 12117 الذاتي بحوالي‎ .)١(

وللحصول على تسلسل حمض أميني ‎ld amino acid‏ طرف ‎ON‏ تم تلطيخ كميات كافية أكبر من

أو تساوي © ميكروجرام من بروتين ‎HMW‏ كهربيا على غشاء ‎PVDF‏ (نظم حيوية تطبيقية)

وتصبغ باستخدام الكوماسي الأزرق. وتم إطلاق بروتين ‎HMW‏ المجمد من الغشاء ويعامل في ‎No‏ موضعه الأصلي بمستويات منخفضة من إنزيم ببتيداز داخلي ‎endopeptidase Lys-C‏ و إنزيم

ببتيداز داخلي ‎endopeptidase Arg-C‏ و/أو إنزيم ببتيداز داخلي ‎endopeptidase Glu-C‏ إلى

قطعة من البروتين الذاتي ‎٠‏ ويتم تنقية شظيات الببتيد ‎peptide‏ الناتج باستخدام ‎HPLC‏ وتسلسلات

الحمض الأميني ‎amino acid‏ ذوات الطرف ‎N‏ المحدد باستخدام مسلسل بروتين 430 ‎ABI‏

ومنهجيات عيارية لسلسلة البروتين. وتسلسل الحمض الأميني ‎amino acid‏ ذات الطرف ‎N‏ هي: ‎E-I-M-V-P-Q-G-I-Y-D-G-E-T-L-T-V-S-F-X-Y Vo‏

ويشار إليها كتسلسل رقم ‎٠‏

وعند البحث في قاعدة بيانات مركب ‎PDB+SwissProt+PIR+GenPept‏ (أكبر من ‎Vo‏ كيلو

من تسلسلات فريدة) باستخدام تسلسل البروتين 11477 ذات الطرف ‎YON‏ وحدة بنائية)

بواسطة بارامتر مطابقة دقيق جداء لم يتم العثور على نظائر دقيقة. وبالتالي»؛ يعد بروتين 118117 ‎Gig ©‏ كلاميدي جديد. وحيث أنه تم فصل هذا البروتين تحت ظروف تقوم بإطلاق بروتينات

غشائية محيطية فقط ‎leo)‏ سبيل المثال ‎((Omp2‏ تشير هذه البيانات إلى أن بروتين ‎HMW‏ عبارة عن بروتين متصل سطحيا. المثال ‎(Y)‏ ‏تحضير أجسام مضادة لأجسام الكلاميديا ‎chlamydia‏ الابتدائية ‎oo‏ للمساعدة في تحديد خصائص بروتين ‎HMW‏ تم عمل أمصال للأرانب فائقة المناعة ضد ‎EBs‏ ‏من الكلاميديا ‎.Trachomatis L, chlamydia‏ وقد أعطي كل حيوان عدد ‎MS‏ من ثلاث جرعات تحصين مناعي تقدر بحوالي ‎Yoo‏ ميكروجرام من الأجسام الابتدائية للكلاميديا ‎chlamydia‏ في كل حقنة (بداية بمساعد ‎Fruend‏ التامة ثم يليه مساعد ‎Fruend‏ غير التام) عند فاصل زمني ١د‏ يوما تقريبا . في كل جرعة تحصين» يعطى نصف كل مادة تقريبا في العضل بينما يحقن النتصف - الأخر في العقدة. وبعد أربعة عشر يوما من التحصين ‎Cll‏ تعطى جرعة منشطة رابعة تقدر بحوالي ‎١‏ أ ميكروجرام من ‎Ebs‏ ثم يستتنزرف الحيوانات من ‎Ui Yo = VY‏ فيما بعد. وتم الحصول على عيار قدره :كما ثم تحديده بواسطة اختبار ‎ELISA‏ ‏: المثال (3) تحديد تعديلات ما بعد الترجمة الوراثية ‎١‏ اتضح حديثا أن العديد من البروتينات الكلاميديا ‎Trachomatis chlamydia‏ المتحدة عن طريق الغشاء كبروتينات معدلة بعد ترجمتها ‎Lil‏ . وقد اتضح أن البروتينات ‎EB‏ الغنية بحوالى ‎١ A‏ كيلو دالتون ‎YY 5 kDa‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ من السيستين ‎cysteine‏ والتي تعد بروتينات رابطة للاكتين تقوم بحمل أشطار كربوهيدراتية محددة :

‎T —_‏ 0 _ ‎(Swanson, A.

F. and ©. © Kuo. 1990. Infect.

Immun. 58: 502-507)‏ وقد استخدم اندماج حمض البلميتيك ‎palmitic acid‏ الموسم إشعاعيا لإثبات أن ‎١١‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ من بروتين الكلاميديا ‎trachomatis chlamydia‏ على شكل ‎Mip‏ الذي تم معالجته بالدهون : ‎D.

A.

Rouch¢ A.

G.<(Lundemose °‏ المصمعط ‎and J H Pearce. 1993. J.

Bacterial.« C.

W.‏ )175:3669-3671 وقد أكتشف ‎Swanson‏ وأخرون أن ‎MOMP‏ من نمط ‎Ly (sae‏ يحتوي على ‎N-acetylglucosamine‏ و/أو ‎N-acetylgalactosamine‏ وهذه ‎Ja EVV‏ الكربوهيدراتيسة ‎carbohydrate‏ الوسيطة التي تقوم بربط ‎MOMP‏ بأغشية ‎Hela WA‏ ‎٠‏ وللتأكد من إضافة ‎de sane‏ الجليكوسيلات ‎glycosylated‏ إلى بروتين ‎(HMW‏ يتم إنماء ‎EBs‏ ‏داخل خلايا ‎McCoy‏ في وجود الجلاكتوز ‎galactose‏ المعالج بالتريتيوم ‎tritiated‏ الجلوكوز أمين ‎glucosamine‏ وتعرض لاستشراب الميل للهيبارين ‎heparin‏ والبروتينات الرابطة للهيبارين ‎heparin‏ التي ثم تحليلها بواسطة ‎SDS-PAGE‏ وتصوير ا لإشعاع الذاتي . باختصار ¢ يسم إنماء خلايا ‎McCoy‏ داخل قنيئة 5 تحت ظروف عيارية ) ‎7٠١ DMEM+‏ 705 و ‎Yo‏ ملي/ قنينة ‎١‏ و١٠٠7‏ من ثاني أكسيد الكربون ,00 ) إلى حوالي 90 / نقاء وتلقح بكمية كافية من ‎EBs‏ لتحقيق ‎Yoo — 7 4.‏ 7 عدوي. ويلي عدوي مدتها ¥ ساعات عند درجة حرارة ‎‘a vv‏ إضافة كلاميديا سيكلو أوكسي أميد ‎cycloheximide‏ )1 ميكروجرام/ملي) ليثبط الخلايا العائلة لتخليق البروتين ويتم تحضين المستنبتات لمدة ؛ - 6 ساعات إضافية. يتم ‎Ala)‏ 55 ملي كوري تقريبا من الجلاكتوز ‎galactose‏ المعالج بالتريتيوم ‎[(N) *H—¢,0]-D) tritiated‏ جلاكتوز ‎galactose‏ « ‎(NEN ve‏ أو الجلوكوز أمين ‎[(N) 311 ”-١,ة[-ط( glucosamine‏ جلوكوز أمين؛ ‎(NEN‏ لكل قنينة

‎ov —‏ - ويسمح بتحضين المستنبتات لمدة ‎٠‏ *-50؛ ساعة أضافية. ويتم التقاط الخلايا بالكشط؛ بينما تتقي بواسطة الطرد المركزي للمدروج. وينفصل بروتين ‎HMW‏ من ‎0606070٠00‏ من المستخلصات البروتينية السطحية بواسطة الاستشراب بالألفة؛ ثم يفصل تتابعيا باستخدام كلوريد الصوديوم ‎sodium chloride‏ _ويتم تحليله بواسطة ‎SDS-PAGE‏ باستخدام مرقم الوزن الجزيئي ‎(BRL) MC-Labelled ٠‏ ثم يعرض للتصوير الإشعاعي الذاتي. ويعرض السهلام المجفف لفيلم ‎KODAK X-AR‏ لمدة من ١-؟‏ أسابيع عند درجة ‎Yams‏ م. ولتحديد تعديل الشحم بعد التخليق؛ يتم استنبات كلاميديا ‎chlamydiatra-chomalis‏ ذات تنمط مصلي ‎Lp‏ على طبقة واحدة من خلايا ‎McCoy‏ وفقا لإجراءات عيارية. وبعد ما يقرب من ‎YE‏ ‏ساعة من العدوى؛ يتم إزالة المستنبت التقليدي ‎(DMEM 10% FCS)‏ واستبداله بوسيط خالي من ‎٠‏ الأمصال يحتوي على سيكلو هيكسي أميد ‎١( cycloheximide‏ ميكروجرام/ملي) وحمض البمليتيك ‎T225/ mCi +,©) [U-"C] palmitic acid‏ قنينة؛ ‎(NEN‏ ويتم تحضينها لمدة ‎1-١١‏ ؟ ساعة إضافية ليسمح بمعالجة البروتين بالدهون. وبعد تحضير المستخلصات البروتينية ‎Agata)‏ من ‎(EB‏ يتم فصل البروتينات الرابطة للهيبارين ‎heparin-binding‏ وتحليلها بالتصوير الإشعاعي الذاتي كما تم وصفه أعلاه. ‎vo‏ ويتم تقييم وظيفية الأشطار المعالجة بالدهون أو مجموعات الجليكوسيلات ‎glycosylated‏ بواسطة معالجة المستخلصات البروتينية ‎funda ul)‏ من ‎OGP 5 EBs‏ باستخدام إنزيم جليكوسيداز 985 ملائم. وبعد إزالة الكربوهيدارت؛ يتم تعريض المستخلصات البروتينية لاستشراب بالألفة 5 ‎aa) SDS-PAGE‏ إذا كان بروتين ‎HMW‏ استرجع قدرته على ربط سلفات الهيبارين ‎-heparin sulfate‏

— ‏م‎ A —_

المثال )£(

استنساخ جزء ذي طرف ‎N‏ من جين بروتين ‎HMW‏

تم تصميم وتخليق مركبات قليلة النكليوتيد ‎oligonucleotides‏ المتحللة بناءا على تسلسل ‎ya asl)‏

الأميني ‎amino acid‏ ذات الطرف ‎N‏ لبروتين ‎HMW‏ ثم استخدمت المركبات قليلة النكليوتيد ‎oligonucleotides ©‏ هذه لإنتاج منتجات تحتوي على جينات محددة ‎(PCR)‏ تم استخدامها كمسبارات

تهجين للكشف عن مكتبة حمض ‎trachomalis Ly 721] DNA‏ © لفصل جين بروتين ‎HMW‏

باختصار؛ تم تحديد أجزا ء ببتيد ‎peptide‏ ذو تحلل منخفض ملائم من بيانات تسلسل الحمض

الأميني ‎amino acid‏ ذات الطرف ‎N‏ بواسطة تحليل الحاسب :131(»048278010 وثم استخدم

لتوجيه تصميم مجموعات بادئ ‎(PCR)‏ لمجموعة ‎ALY‏ النكليو ‎oligonucleotides‏ لها تسلسل

‎٠‏ محددة ذات تحلل منخفض.

‏باستخدام التسلسل الأولية ذات الطرف 17 كموجه؛ تم تصميم أربع مسبارات لمجموعة قليلة

‏النكليوتيد المتحللة المتممة لمجموعات النكليوتيد ‎oligonucleotide‏ التي تقوم بترميز الوحدات

‏البنائية الست الأولى لببتيد ‎E-I-M-V-P-Q HMW peptide‏ (تسلسل رقم ؟؛ المطابقة لوحدات

‏بنائية ‎١‏ - + لتسلسل رقم 7)؛ والمشتملة على جميع توليفات النكليوتيد ‎nucleotide‏ الممكنة

‎vo‏ (إجمالي تحلل = ‎VAY‏ تسلسل فردية) تم تصميمها واستخدامها كبادئات أمامية مكبرة.

‏التسلسل رقم ؛: ‎5'-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3".‏

‏التسلسل رقم : ‎5'-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3'‏

‎5-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3' 1.8 ‏التسلسل‎

-_ 0 5 pa

5'-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3' : Vd) ‏التسلسل‎

من خمس ببتيدات ‎peptides‏ داخلية ‎Y-D-G-E-T‏ للوحدة البنائية (وحدات بنائية 4 - ‎VF‏ لتسلسل

رقم ؟) والمشتملة على جميع توليفات النكليوتيد ‎nucleotide‏ الممكنة (إجمالي تحلل = ‎YYA‏

© تسلسل فردية) تم تصميمها واستخدامها كبادئات عكسية مكبرة.

التسلسل رقم ‎:A‏ اد 0-41 5-1061-710-1100-21

التسلسل رقم 1: ‎5'-NGT-YTC-NCC-RTC-GTA-3'‏

وتم تخليق مركبات قليلة النكليوتيد ‎oligonucleotides‏ على ‎Glia‏ حمض ‎ABI DNA‏ طراز

8 باستخدام عمود قياس ‎١,7‏ ميكرو مول (تريتايلون * * وتشطرزر ‎trityl-on, auto- Ll‏ ‎(cleavage \-‏ وكيمياء ‎de gana‏ الفوسفور أميد العيارية ‎.standard phosphoramidite chemistry‏ ويتم

تنقية مجموعات قليلة النكليوتيد ‎oligonucleotides‏ الخام يدويا على أعمدة حاقفة ‎C-18‏ (أعمدة spectrophotometrically ‏يتم التأكد من النقاوة والحصيلة باستخدام الفوتومتر الطيفي‎ (ABI «OP

(YAY YY ‏(نسب‎

يتم برمجة التفاعلات المكبرة العيارية ‎(PCR)‏ ) ملي مولار من ‎Yoo Mg"‏ ميكرومول من ‎«Yo 3 0211089 he‏ وحدات ‎AmpliTag‏ 5 00 ميكرولتر من الحجم التهائي) باستخدام حوالي ‎٠,7‏

ميكروجرام من حمض ‎DNA‏ للكلاميديا ‎trachomatis I; chlamydia‏ (حوالي ‎iy oxy‏ نسخ من

جين بروتين 11497 في ‎Als‏ النسخة الواحدة) وحوالي ‎٠٠١‏ بيكو مول ‎pmol‏ من كل (مجموعة

قليلة ذات طرف ‎(N‏ أمامية وبادئ (مجموعة قليلة داخلية) عكسي. تم استخدام تركيزات أعلى من

التركيز الطبيعي للبادئات ‎YT)‏ بيكو مول ‎١/ pmol‏ © ميكرولتر) للتكبير على الأقل ابتدائيا .

ا لتعويض تحلل البادئ. وتم الحصول على صورة مكبرة من تسلسلات مستهدفة باستخدام قطاع جانبي حراري عياري ثلاثي الخطوة و له ‎Ye‏ لفة؛ على سبيل ‎(JU‏ 60 مو #اثء و١‏ م £0 ول .م و ‎١‏ د. ويتم تنفيذ التكبير أنبوب ‎ond‏ زجاجي ‎٠٠‏ ميكرولتر محكم باستخدام جهاز تدوير حراري لتقنيات ‎Idaho‏ وللتأكد أن منتجات ‎(PCR)‏ التي تم إنتاجها أثناء تفاعلات ‎٠‏ التكبير كانت محددة بتسلسل ترميز بروتين ‎HMW‏ ولم تكن "بادئ مكون من جزأين"' أو أي مبادلات تكبير حمض ‎DNA‏ الصناعية؛ تم تنقية أمبليمر باستخدام أعمدة تدوير هلام السيليكا ‎(QIAGEN) silica-gel‏ المستنسخ داخل ناقل استتساخ ‎(StrataGene) pZERO (PCR)‏ ثم تعرضت لتحليل تسلسل حمض ‎DNA‏ مباشر. وتم تحديد تسلسل حمض ‎DNA‏ لمنتجات ‎(PCR)‏ ‏المستنسخة باستخدام كيمياء تسلسل داي دي أوكسي ‎dideoxy‏ الطرفي التقليدي. وإنزيم بوليمر ‎polymerase ٠‏ حمض ‎DNA‏ 17 المعدل (إنزيم سيكويناز» ‎(USB‏ باختصارء يتم إزالة الصفات الطبيعية لكل نموذج بلازميد ‎plasmid‏ عياري مزدوج عن طريق معالجة مختصرة باستخدام 3 . وبعد المعادلة؛ يتم استخدام كل نموذج تم إزالة صفاته الطبيعية لبرمجة ؛ تفاعلات تسلسل منفصلة. يحتوي كل تفاعل على ‎١“‏ مول من بادئ التسلسل الأمامي العام ‎(sas 7١(‏ وخليط نهائي ‎dANTP/ANTP‏ مختلف ‎Je)‏ سبيل المثال ‎(or 1.6 CA‏ وأطلق على المنتجات ‎٠‏ _ النهائية اسم يشتمل على ‎SIATP‏ -8] في التفاعل ( 50 ميكرو كوري / للتفاعل ‎Yous‏ ‏كوري/ملي مول؛ ‎(Amersham‏ وتم إزالة الصفات الطبيعية للمنتجات الفردية ‎Aina)‏ (فورم ‎formamide al‏ 157 م) وتعريضها لتحليل كهربي بهلام البولي أكريل أميد ‎polyacrylamide gel‏ المزيل للصفات الطبيعية بالانحلال العالي ‎(٠‏ أكريل أميد ‎acrylamide‏ و ‎A‏ مول من اليوريا ‎urea‏ ومحلول ‎TAE‏ المنظم و 8060© فولت و 50 د). تم تحويل هلامات ‎yy‏ التتابع إلى ورقة ترشيح ‎(Whatmann 3MM)‏ ويجفف بالخلاء ثم يصور بالإشعاع ‎SI‏ عند -

- +١ ‏ويتم‎ gel ‏ساعة. ويتم قراءة السلالم القاعدية بصورة يدوية من كل هلام‎ VY - 74 ‏ام لمدة‎ Vo ‏تحديد تسلسل متفق عليها.‎ ia.) ge Southern ‏مناسب للكشف المكتبي و/أو تم إنتاج بقعة‎ HMW ‏وتم إنتاج أمبليمر بروتين‎ ٠0 sa) ]2-770[04175 ‏وتم توسيمه إشعاعيا أثناء عملية التكبير عن طريق إضافة‎ (PCR) ‏كوري -/ملي مول) لكل خليط تفاعل. وتم إجراء‎ 9٠٠١ < Amersham «NTP ‏ملي كوري بكل‎ © ‏مللتر‎ v0 ‏تفاعلات التوسيم كما سبق إلا أن التفاعلات تجرى في أنبوب طرد مركزي دقيقة‎ ‏باستخدام جهاز تدوير 36160 الحراري ويتم إزالة بادئات التوسيم والتكبير غير المندمجة من‎ ‏خليط التفاعل باستخدام أعمدة استشراب الطاردة التي تستبعد وفقا للحجم‎ . (BioSpin 6 columns, BioRad) trachomatis chlamydia ‏نسخة ابتدائية) للكلاميديا‎ ve <) DNA ‏وتم إنشاء مكتبة حمض‎ ٠ ‏المزيدة ذات نمط مصلي .1 بواسطة استنساخ شظيات متجزئة أكبر من أو تساوي ١٠كيلو زوج‎ ‏داخل ناقل الاستتساخ‎ genomic ‏جينومي‎ DNA ‏من حمض‎ EcoRI ‏قاعدة تم إنتاجه من عصارة‎ ‏التي تم وسمها‎ HMW ‏محددة لبروتين‎ (PCR) ‏وتستخدم منتجات‎ (Stratagene) 1 ‏لامبدا‎ ‏بالإشعاع لكشف هذه المكتبة لنسخ ناتجة عن عودة الارتباط التي تحمل كل أو جزء من تسلسسل‎ ‏الناتج عن عودة الارتباط‎ DNA ‏ويتم استخدام إجراءات ومنهجيات حمض‎ HMW ‏ترميز بروتين‎ Ve ‏العيارية في هذه التجارب. وتم تنقية كل الملتهمات المهجنة باستخدام هذه المسبارات لكي تتجلنس‎ ‏بواسطة دورات متتالية من الطلاء والتهجين. وبمجرد تنقية الملتهمة المتفاعلة؛ تم إنقاذ الفاجميد‎ ‏مسن‎ (pBluescript SK-derivatives) ‏المحتوي على المكون المدخل بالاستخلاص‎ 41 ‏ملتهمة والدية بواسطة إجراء عدوى مرافقة للخلايا العائلة مع ملتهمة مساعدة ملائمة؛ على سبيل‎ ‏الفردية أيضا عن طريق‎ phagemid ‏تم تنقية الفاجميد‎ R408 or 705113 (Stratagene) ‏المثال‎ ٠

الفحص ‎da Wa‏ صفيحة خزفية على أجار ‎LB‏ يحتوي على أمبسيلين ‎ampicillin‏ ‎You )‏ ميكروجرام / ملي ‎(A‏ واختيار مستعمرات فردية. ولتأكيد مشتقات الفاجميد ‎phagemid‏ المنقى الذي يحمل تسلسلات بروتين ‎HMW‏ تم تحضير ‎DNA‏ بلازميد 0 واستخدم في برمجة تفاعل التكبير المحتوى على مجموعات بادئة ‎(PCR)‏ ‏م المحددة لبروتين ‎HMW‏ ويتم تأكيد وجود المكونات المدخلة المحددة لبروتين ‎HMW‏ بواسطة إنتاج منتج ‎PCR‏ محدد الحجم ملائم. وتعد البلازميدة ‎pAH306 plasmid‏ واحدة من المشتقات المحتوية على بروتين ‎HMW‏ الذي تم فصلها باستخدام هذه المنهجيات. التخطيط الطبيعي للبلازميدة ‎pAH306 plasmid‏ ‎٠‏ تم تخطيط المكونات المدخلة من 011306 طبيعيا وموقع جين بروتين ‎HMW‏ المحدد بامستخدام إنزيمات نوكلياز داخلية ‎Je) endonucleases‏ سبيل المثال: لدمكتلمودي ‎Bamlll « Pst‏ 201 ) وتسلسل ترميز بروتين ‎HMW‏ الموجودة بالتهجين ‎Southern‏ الذي يستخدم 3 منتجات ‎(PCR)‏ محددة ثم وسمها إشعاعيا لها طرف ‎N‏ كمسبارات . ‎as‏ تحديد اتجاءه ونطاق تسلسلات محددة لبروتين ‎HMW‏ بواسطة تحليل ‎PCR‏ باستخدام مجموعات بادئة تشتمل على ‎ve‏ بادئات أمامية محددة لبروتين ‎HMW‏ وبادئات عكسية متممة لتسلسلات المحفز 13 أو ‎T7‏ ‏الموجودة في ناقل الاستنساخ. يتم تحديد البلازميدة 0811306 لتحتوي على 06 كيلو زوج قاعدة ‎EcoRI‏ من قطعة فردية من أصل الكلاميديا ‎chlamydia‏ ويقوم تحليل ‎PCR‏ الاتجاهي للبلازميدة ‎pAH306 plasmid‏ الذي

داس - يوضح هذا المشتق بترميز 1,0 كيلو زوج قاعدة من منطقة ذات الطصرف 8 لجين بروتين ‎-HMW‏ ‏تم الحصول على تسلسل حمض ‎DNA‏ لجين بروتين ‎HMW‏ الذي تم ترميزه على البلازميدة ‎pAH306 plasmid‏ للسلسلتين عن طريق "تحرك متوالية' تقليدي مقترن بمنهجيات تسلسل دائري © 208 تناظري ‎Perkin-Elmer)«(ABI Prism Dye-Terminator cycle sequencing‏ . تم برمجة التفاعلات المتتالية بحمض ‎DNA‏ بلازميد ‎plasmid‏ غير مهضم )°7 ,+ ميكروجدام/ ‎(xn‏ ‏كنموذج وبادئات تسلسل محددة لبروتين ‎HMW‏ ( 7,5 بيكومول ‎(xn / pmol‏ بالإضافة إلى النموذج وأداة التسلسل؛ كل ‎dels‏ (- ١٠ميكرولتر)‏ يحتوي على أربع ‎dNTPs‏ ‎٠‏ مختلفة (على سبيل المثال؛ .+206 ‎(and‏ وأربعة متشابهه 002775 (على سبيل المثال؛ ‎ddA‏ ؛ ‎(and 101: 20006‏ من النكليوتيد ‎nucleotides‏ النهائي؛ بحيث تقترن كل نكليوتيد ‎nucleotides‏ ض نهائي بصبغة واحدة أو أربع صبغات متألقة مختلفة. وتنتهي المنتجات ذات سلسلة فردية ممتدة عند أوضاع عشوائية على طول النموذج بواسطة اندماج المواد النهائية ‎dANTPs‏ التي تم وسمها بالصبغة. وتم تنقية المنتجات النهائية المتألقة التي تم وسمها بالصبغة باستخدام أعمدة استشراب طاردة التي تستبعد وفقا للحجم ‎(Princeton Genetics)‏ وتجفف بالخلاء وتعلق في عامل تنظيم نموذج ‎sale]‏ تعليق ‎(Perkin-Elmer)‏ ويتم إزالة خصائصيا الطبيعية عند درجة حرارة 55 ‎a‏ لمدة 5د وتحلل بواسطة التحليل الكهربائي الشعري بالانحلال العالي في ‎ABI 310 Automated DNA Sequenator (Perkin-Elmer).‏ تم جمع بيانات تسلسل حمض ‎DNA‏ الذي تم إنتاجه من تفاعلات فردية وقيم شدة التألق ‎x,‏ القصوى النسبية المحللة آليا بواسطة حاسب ‎PowerMAC‏ باستخدام برنامج تحليل تسلسل ‎(Perkin-Elmer) ABI‏ وتم تعديل تسلسل حمض ‎DNA‏ المحللة آليا بصورة فردية ‎bya‏ وذلك

)+ - للدقة قبل دمجها في سلسلة التسلسل التي تم الاتفاق عليها باستخدام برنامج تجميع آلسي ‎(Perkin-Elmer)‏ ويتم عمل تسلسل لسلسلتي قطعة جين بروتين ‎HMW‏ التي تم ترميزها بواسطة بالزميدة ‎plasmid‏ 011306 وتم تجميع البيانات لعمل تسلسل لتركيبة قطعة جين بروتين 7. وتوضع التسلسل التي ترمز قطعة البروتين ‎HMW‏ في قائمة كتسلسل رقم ‎٠١‏ وتمقل 0 بواسطة نكيولتيدات 7 إلى ‎١99756‏ في الشكل ‎٠ (Y)‏ وتم توضيح خريطة للبلازميدة ‎plasmid‏ ‏6 في الشكل )0( تم إجراء تحليل قاعدة البيانات ‎Je)‏ سبيل المثال. حمض أميني ‎amino acid‏ أولي متمائل. وأشكال المعالجة المائية ومواقع 17-0 لإضافة الجليكوسيلات ‎glycosylated‏ ؛ وتحليلات وظيفية ومطابقة) لحمض 0118 وتسلسلات الحمض الأميني ‎amino acid‏ المتوقعة لبروتين 11717 ‎٠‏ باستخدام برامج ‎GeneRunner and Intelligences‏ والتي تشير إلى كون بروتين ‎HMW‏ جديد. ‎de‏ (*) استنساخ القطعة ذات الطرف ‎C‏ من جين بروتين ‎HMW‏ ‏يتم استخدام تحرك الكروموسوم لفصل الجزء الطرفي © من جين بروتين ‎HMW‏ يتم اختيار قطعة ‎١.56‏ كيلو زوج قاعدة ‎BamHI-EcoRI‏ بعيدة عن ‎lull‏ ذات الطرف ‎N‏ لبروتين ‎HMW ٠‏ الناضج وقريبة من تسلسل المحفز 13 للناقل؛ كمسبارات لتحرك الكروموسوم ‎chromosome‏ الابتدائي. باختصارء يتم هضم البلازميدة ‎pAH306 plasmid‏ للتكامل مع ‎BamHI‏ ‎EcoRI‏ ويتم تجزئة ناتج الهضم بواسطة تحليل كهربي باستخدام هلام أجاروز ‎agarose gel‏ 7 8 7 أجاروز 6 في محلول ‎TAE‏ المنظم). ويتم استخلاص ‎day pd‏ + كيلو زوج قاعدة ‎(B/E) EcoRI-BamHI‏ من الهلام وتم تنقيته باستخدام أعمدة استشراب طاردة تعمل بجبل ‎٠ |‏ السيليكا ‎silica gel‏ المتاحة تجاريا 5 ‎Jal ge‏ كاشفة ‎(QIAGEN)‏

و - ويتم توسيم القطعة ‎١,6‏ كيلو زوج قاعدة من ‎BE‏ إشضماعيا باستخدام ‎[a-dATP]‏ (> © كوري/ملي مول ‎(Amersham‏ عن طريق ترميز بادئة تستخدم كواشف متوفرة تجاريا ‎(Boehringer Mannheim)‏ وتستخدم لسبر لطخ ‎Southern‏ الخاصة بحمض ‎DNA‏ المتعلق بالعوامل الوراثية ليآ ‎C. trachomatis‏ التي تم اهتضامها بالكامل باستخدام ‎HindIII‏ ‏© تم تهجين مسبار ‎١ B/E‏ كيلو زوج قاعدة من ‎pAH306‏ وفقا ‎genomic die gia dahil‏ 34 كيلو زوج قاعدة ‎(HindIII‏ بناء على خريطة التقييد المشتقة تجريبيا لقسم جين بروتين ‎HMW‏ المرمز على ‎(pAH306‏ ترمز هذه القطعة + كيلو زوج قاعدة من تسلسل بروتين ‎HMW‏ بطرفية -0. تم استخدام قطعة 8 ‎١,١‏ كيلو زوج قاعدة لاحقا لسبر مجموعة ‎C.Trachomatis L2‏ ‎٠‏ المتوفرة باعتدال )0,000 نسيلة رئيسية) لتمييز النسائل التي تحتوي على قطعة ‎٠,‏ ‏كيلو زوج قاعدة 71. باختصار؛ تم اهتضام حمض ‎DNA‏ الجينومي ‎genomic‏ لل ‎C.

Trachomatis [2‏ تماما باستخدام زيادة ‎٠١‏ أضعاف من إنزيم نووي خارجي للتقييد ‎٠ ) HindIII‏ وحدات لكل عروة من حمض ‎(DNA‏ عند ‎VV‏ درجة مئوية؛ لمدة 8١-؛؟‏ ساعة) . تمت تجزئة منتجات الاهتضام حسب الحجم بواسطة استشراد بهلام أجاروز ‎٠ A) agarose gel Vo‏ أجاروز ‎(TAE « agarose‏ وقطع حمض ‎DNA‏ تتراوح في الحجم من ‎١‏ كيلو زوج قاعدة إلى ؟ كيلو زوج قاعدة وتم استخراجها من الهلام ‎ helgel‏ ‏تحتوي أشرطة الهلام المستخرج على أحجام ‎aad‏ حمض ‎DNA‏ المطلوبة وتم إذابتها في محلول إذابة/ ارتباط ‎(QTAGENQX1)‏ وتمت تنقيته باستخدام أعمدة تدوير هلام سيليكا ‎silica gel‏ متوفر تجاريا ‎(QIAGEN)‏ . تم بعد ذلك استنساخ قطع ]1110011 الجينومية ‎7-١ sll genomic ٠‏ كيلو زوج قاعدة في بلازميد ‎pBlueScript SK- plasmid‏ والتي تم

١ل‏ - اهتضامها مسبقا للاكتمال ب1110011]1 وتمت معالجتها بإنزيم فوسفاتاز ‎phosphatase‏ من أمعاء عجل بقري لمنع إعادة ارتباط الناقل. تم إجراء ارتباطات ناقل/مادة مدخلة في حجم تفاعل نهائي ‎5٠0‏ ميكرو لتر ‎on)‏ مللي مولار من ‎(Tris-HCl‏ رقم هيدروجيني ‎pH‏ 7؛ و١٠‏ مللي مولار ‎١ NaCl‏ مللي مولار © من ©81؛ 05+ مللي مولار من ‎(DTT‏ عند ‎YO‏ درجة مئوية. لمدة تتراوح من ١“١-؟‏ ؟ ‎dela‏ باستخدام إنزيم رابط ‎T4 DNA‏ (حوالي ‎٠١‏ وحدات/ تفاعل) ونسبة مولارية لمادة مدخلة: ناقل ‎٠١ :١‏ تقريبا. عقب الربط؛ تم استخدام أجزاء متساوية ( حوالي ‎5٠‏ نانو جرام مرتبطة بحمض ‎(DNA‏ وذلك لإجراء استشراد على خلية عائلة منافسة إشرشيا كولاي ‎«Ble «coli‏ إشرشيا كولاي ‎E coli‏ 101710. بعد ذلك تم وضع الخلايا ‎٠‏ المستشردة في طبق على ‎IB lal‏ تحتوي على حوالي ‎٠٠١‏ ميكرو جرام/ مل من الإمبيسيلين ‎ampicillin‏ لاختيار نسائل استقرار البلازميد ‎plasmid‏ تم نقل حوالي ‎٠٠٠١‏ ‏من المتحولات ‎Ap‏ المستقرة للبلازميد ‎plasmid‏ مباشرة من أطباق ‎LB Ap" [lal‏ على أغشية نايلون ‎Amersham«HyBond N+) nylon‏ ) بواسطة الخاصية ‎oe aM‏ ‎-capillary action‏ ‎١‏ عقب النقل. تمث ‎sale)‏ حضن الأطباق عند ‎PV‏ درجة مئوية لإعادة تكوين نسائل مرئية لمزيد من التجارب. تم تحليل المستعمرات المنقولة إلى الأغشية وتم تحرير حمض ‎DNA‏ ‏بمعالجة لطخ المستعمرات بمحلول ‎NaOH/SDS‏ المزيل للخواص الطبيعية. تم اسستخدام محلول ‎NaCl‏ منظم ‎Tris—‏ لمعادلة وتثبيت مادة التحليل. تم تثبيت حمض ‎DNA‏ المطلق على أغشية بواسطة إشعاع فوق بنفسجي. تم استخدام إجراءات ‎Goby‏ حمض ‎DNA‏ ناتج ‎Yn‏ عودة ارتباط قياسي لسبر لطخ المستعمرة باستخدام قطعة 18/8 0,1 كيلو زوج قاعدة

- —

المرمز إشعاعيا وتمييز مشتقات ناتج عودة ارتباط تحمل قطعة ‎HindIII‏ المطلوبة حوالي

‎٠4‏ كيلو زوج قاعدة.

‏كان البلازميد ‎plasmid‏ 811310 أحد المشتقات المعزولة بواسطة هذه الإجراءات وتم

‏تمثيل الجزء المرمز من بروتين ‎HMW‏ بواسطة قليل النوويد ‎nucleotides‏ 994-2410

‏م في الشكل ؟.

‏أكد تحليل التقييد باستخدام ‎(HindIII and EcoRI‏ كل على حدة وفي توليفة؛ إلى جانب

‏تحليل تسلسل حمض ‎DNA‏ لحمض ‎DNA‏ للبلازميد ‎plasmid‏ المنقى أن 0811310 يرمز

‏قطعة ‎٠,4 HindIII‏ كيلو زوج قاعدة المتوقع. وقد أظهرت هذه التحليلات أيضا أن

‏المادة المدخلة § ,1 كيلو زوج قاعدة تتكون من نفس قطعة ‎HindIII-EcORI‏ حوالي ‎٠١١‏ ‎٠‏ كيلو زوج قاعدة الموجودة في ‎pAH306‏ وقطعة 20081-11100111 ‎١7‏ كيلو زوج قاعدة

‏الفريدة التي ترمز حمض ‎DNA‏ المحدد لبروتين ‎HMW‏ لطرفية -0.

‏تم اختيار قطعة 5/8 20081-13100111 ‎١,7‏ كيلو زوج قاعدة باعتبارها مسبار لحركة

‏الكروموزوم ‎chromosome‏ الثاني. باختصار؛ تم اهتضام ‎pAH310‏ تماما باستخدام ‎EcoRI‏

‎and HindIII‏ وتمت تجزئة حجم منتجات الاهتضام بواسطة استشراد هلام أجاروز م ‎7١ A) agarose gel‏ أجاروز ‎agarose‏ في محلول منظم ‎(TAE‏ وتم استخلاص النطاق

‎١7)2/1(‏ كيلو زوج قاعدة المطلوب من الهلام» وتمست تنقيته»؛ وترميزه إشعاعيا

‏باستخدام ©77م2-2*2[0]؛ واستخدامه كمسبار لتمييز النسائل في المجموعة الجينومية

‎genomic‏ الأصلية 1 124 ‎(SWC Trachomatis‏ ترمز الجزء الذي له الطرف

‎HMW ‏من جين بروتين‎ C-

م1 - يعتبر بلازميد ‎plasmid‏ 0811316 أحد المشتقات المعزولة بواسطة هذه الإجراءات. وقد أوضح تحليل التقييد ل ‎pAH316‏ أن المشتق يحتوي على المادة المدخلة من ‎C.Trachomatis L,‏ حوالي £0 كيلو زوج قاعدة والتي تتكون من شظيتين ‎EcoRI‏ بحوالي ‎Yo‏ كيلو زوج م قاعدة وحوالي ‎٠,٠‏ كيلو زوج قاعدة في الحجم. وقد حدد تحليل التهجين ‎Southern‏ ‏باستخدام قطعة 8/11 ‎١7‏ كيلو زوج قاعدة كمسبار مكان هذه التسلسل بالنسبة لقطعة ‎Y,0 EcoRI‏ كيلو زوج قاعدة ل8813316. وتحدد تحاليل ‎PCR‏ الاتجاهية باستخدام بلازميد ‎plasmid‏ 0811316 لحمض ‎DNA‏ كقالب وباديء تضخيم قطعة ‎E/H‏ 0,7 كيلو زوج ‎sacs‏ وتسلسلات ‎Jib‏ 13 و27 التي أظهرت أن 8811316 يرمز الجزء الذي له ‎٠‏ طرفية -© من جين بروتين ‎J HMW‏ يتم تمثيل الجزء الذي يرمز بروتين ‎HMW‏ بواسطة قليل النوويد ‎nucleotides‏ 1977 إلى 3420 في الشكل ‎Yo‏ ويتم إدراجه في التسلسل رقم: ‎١‏ ‏مثال > إنتاج بروتين ‎HMW‏ مبتور ناتج عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ ‎١‏ .تم استنساخ اشق الذي له الطضرف ‎N‏ من بروتين ‎PCR 45; ,bHMW‏ في صورة قطعة 0 كيلو زوج قاعدة في بلإزميد ‎plasmid‏ تعبير إشرشيا كولاي ‎E.coli‏ متوفر تجاريا 38 (إنفتر وجين ‎(Invitrogen‏ تم تعيين الباديء المتقدم المستخدم في هذه التفاعلات ‎0V) 140FXHO—S‏ وحدة بنائية)؛ مدرجة كتسلسل رقم:8٠؛‏ ويحتوي على تسلسلات متممة للوحدات البنائية العشر الأولى ذات الطرف 1 لبروتين ‎HMW‏ الناضج. علاوة ‎Jo x. |‏ تسلسلات ترميز بروتين ‎HMW‏ يحمل هذا الباديء المتقدم أيضا موضع تقييد

1 فريد موجود بشكل مثالي بعد الوحدة البنائيةالأولى من بروتين ‎HMW‏ الناضج ‎(Glu/E)‏ للدمج الصحيح في مجال تنقية ‎(His)s zal!‏ المرمز على بلازميد ‎plasmid‏ الناقل 1 ورابط 6/0 لقاعدة6 للطرف 5 للتضخيم الفعال ومباعدة داخلية للقاعدة ‎١١‏ لتمييز واهتضام إنزيم نووي خارجي .تسلسل رقم ‎YA‏ ‎-AAG-GGC-CCA-AIT-ACG-CAG-AGC-TCG-AGA-GAA-ATT-ATG-GTT-CCT- °‏ 5 ‎CAA-GGA-ATT-TAC-GAT-3'‏ ‏تسلسل رقم ‎١٠:‏ ‎5'-CGC-TCT-AGA-ACT-AGT-GGA-TC-3'‏ ‏تم استخدام باديء توالي عكسي متوفر تجاريا ‎Y +) SK‏ وحدة بنائية ‎«(StrataGene‏ ‎Yoo‏ لتسلسل رقم نل والتي تعتبر متمم للتسلسلات الملتهمة وتقع يعد موضع ‎EcoRI‏ في 6 وذلك في صورة باديء التضخيم العكسي في هذه التفاعلات. للحصسول على ناتج مقبول من منتج ‎ORF‏ لبروتين ‎HMW‏ )1,0 كيلو زوج قاعدة)ء تم إجراء تضخيم ‎PCR‏ باستخدام خليط من إنزيمات بوليمرية ‎polymerase‏ لحمض ‎DNA‏ ثابت الحرارة تتكون من إنزيم بوليمراز لحمض ‎T-thermophilus DNA‏ ( إنزيم بوليمراز متميز)؛ على ‎١‏ هيئة إنزيم بوليمراز للتضخيم الرئيسي وكمية ضئيلة من إنزيم بوليمراز لحمض ‎DNA‏ ‏الثابت الحرارة الثاني عالي الجودة لتوفير نشاط تدقيق '3-5 ‎-(CloneTech)‏ تمت ‎ial)‏ ‏جسم مضاد لإنزيم بوليمراز مضاد ‎Tth DNA‏ إلى خليط التفاعل لتوفير ظروف بدء ساخنة تلقائية والتي تعزز إنتاج أمبليمرز 8 > ؟ كيلو زوج قاعدة. بلازميد ‎DNA Pah306 plasmid‏ المنقى باستخدام نظام ألكالين ‎SDS/ alkaline‏ المتوفر تجاريا

.ل

‎(QIAGEN)‏ وأعمدة تدوير هلام سيليكا ‎(QIAGEN) silica gel‏ لبرمجة هذه التفاعلات

‏الخاصة بالتضخيم ‎١,7(‏ نانو جرام/تفاعل).

‏تمت تنقية أمبليمر ‎٠,69‏ كيلو زوج قاعدةمن البواديء غير المدرجة باستخدام أعمدة تدوير

‏هلام سيليكا ‎silica gel‏ ويهتضم تماما باستخدام كمية زائدة من ‎٠١( EcoRI Xhol‏ ‎٠‏ وحدات لكل ميكرو جرام ‎(DNA‏ بعد ذلك تم استنساخ ‎ORF‏ لبروتين ‎HMW‏ المقطوع

‏القمة الذي له الطرف ل المنقى والمهتضم في بلازميد ‎pTreHisB plasmid‏ للتعبير

‏والمتوفر تجاريا والذي تم اهتضامه مسبقا ‎Xhol—‏ و0181 )10 )¢ نسبة مادة مدخلة:

‏ناقل). بعد ذلك تم استخدام أجزاء متساوية من تفاعل الربط للتحويل الكهربائي لخلية

‏إشرشيا كولاي ‎coli‏ .2 العائلة المناسبة ‎(TOP10 Dis)‏

‎ampicillin ‏من متحولات مقاومة للأمبيسسيلين‎ DNA ‏تم تحضير مستحضرات صغيرة من‎ ٠ ‏و0011؛ أو توليفة منهما وتم فحصها للتأكد‎ Xhol ‏منتقاة عشوائيا وتم اهتضامها تماماب‎ ‏كيلو زوج‎ ٠,5 ‏مقطوع القمة‎ HMW ‏لبروتين‎ ORF ‏من وجود وتوجيه مادة مدخلة من‎ ‏من‎ DNA ‏قاعدة بواسطة استشراد بهلام أجاروز. تم تحضير مستحضرات صغيرة من‎ ‏نسائل تحدد أنها تحمل 1,0 كيلو زوج قاعدة من مادة مدخلة 70001/20011 واستخدمت‎

‎vo‏ لبرمجة تفاعلات التوالي ‎PCR DNA‏ غير المتناظرة لتأكيد تضمين ارتباط مكون بين ‎Azad‏ بروتين ‎HMW‏ و مجال تضخيم الميل ل,(1119) لناقل التعبير. وكان بلازميد ‎plasmid‏ [-1136م أحد مشتقات ناتج عودة الارتباط المعزول بهذه الإجراءات ويتم تمثيله بقليل النوويد ‎nucleotides‏ 466 إلى 1980 في الشكل ؟. يتم تمثيل تسلسل الحمض الأميني ‎amino acid‏ المستنتج من قطعة بروتين ‎HMW‏ مقطوع القمة وذلك بواسطة

‎vy -‏ - الأحماض الأمينية ‎amino acids‏ 74 إلى 577 في ‎YSN‏ ويتم إدراجها في التسلسل رقم:7١١.‏ مثال ‎١7‏ ‏تحديد وجود البروتين في أنواع أخرى م تقرر من خلال تحاليل تفاعل سلسلة إنزيم بوليمراز وجود جين 118417 في العديد من سلاسل ‎trachomatis‏ .6 المعروفة إكلينيكيا وكذلك تم استخدام أنواع الكلاميديا ‎chlamydia‏ الأخرى؛ ‎Mia‏ سلالات ‎«C.pneumaniae‏ و ‎Chlamydia trachomatis‏ على هيئة مكونات خام مجمدة من ‎MD)ATCC (Rockville‏ لعدوى طبقات أحادية متجمعة فرعيا (حوالي ‎A‏ 7) من خلايا ‎Way McCoy‏ للإجراءات القياسية. وكانت الخلايا المعدية ‎La)‏ ‎٠‏ معرضة بالطرد المركزي في الطرد المركزي ‎٠,٠٠١( Sorvall RT6000B‏ دورة في الدقيقة؛ عند ‎YO‏ درجة مئوية؛ لمدة ‎Vo‏ دقيقة) 5[ أو تمت معالجتها بسولفات دكستران(حوالي 00 ميكرو جرام/ مل) في وقت العدوى لتعزيز التثبيت الأولي للأنواع المختلفة حيويا ذات العدوى المنخفضة (غير ‎(LGV‏ لإعالة الخلايا وبالتالي تزيد من الناتج النهائي من ‎(EB‏ بعد ‎£A‏ ساعة تقريباء تم تجميع الطبقات الأحادية المعداة بالكشط ‎ve‏ وتفكيك الخلايا العائلة بالرنين الصوتي لإطلاق الأجسام العنصرية ‎(EBs)‏ تم استخلاص إجمالي حمض ‎DNA‏ من ‎Ebs‏ المنقاة ‎٠١-"' ٠١(‏ *) لكل سلالة باستخدام إنزيم بروتيناز طريقة ‎K/Noidet P40‏ التي ‎J.

Gen.

Microbiol. 137:2525-6 et al.«Denamur lisa y‏ )1991( 2530 والمدرجة في السياق بالإشارة؛ وتمت تنقيتها بشكل إضافي باستخلاص فينول ‎phenol‏ /كلوروفورم ‎chloroform‏ وترسيب الملح. وتم شراء حمض ‎DNA‏ الجينومي + ال(139حقم) ‎Chlamydia pneumoniae‏ من ‎Advanced Biotechnologies Inc.‏ لتحديد

وجود جين بروتين ‎HMW‏ في هذه ‎YO‏ تمت برمجة تفاعلات التضخيم بامسستخدام ‎DNA‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏ في صورة قالب وباديء قليل النوويد ‎nucleotides‏ المحدد لقسم من بروتين ‎7١( HMW‏ وحدة بنائية) المذكور أدناه. تسلسل ‎Yad)‏ ‎5'-ATG-GIT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-‏ 63 هت تسلسل ‎XY ad)‏ ‎5'-GGT-CCC-CCA-TCA-GCG-GGA-G-3'‏ ‏باختصارء تمت برمجة تفاعلات تضخيم ‎PCR‏ القياسية ) مللي مولار ع و١٠٠ميكرو‏ مول من ‎(dNTPs‏ 75 وحدة من إنزيم بوليمراز ‎AmpliTaq‏ 50 ميكرو لتر حجم نهائي) باستخدام ‎٠‏ ميكرو لتر تقريبا من مستخلصات ‎C trachomatis DNA‏ ‎٠‏ اخام ‎٠١(‏ ميكرو لتر من ‎C pneumoniae DNA‏ المتوفر تجاريا) و١٠‏ جزء مول من كل باد ‎S$‏ ع تضخيم أمامي وعكسي محدد لبروتين ‎HMW‏ لمتو اليقرقم ‎7٠‏ و ‎١‏ . تم تحقيق تضخيم للتسلسلات الصغيرة المستهدفة (> ‎Y‏ كيلو زوج قاعدة) باستخدام دورة ‎VY‏ ‏وخاصية حرارية ثلاثية ‎cd shall‏ أي 0 ‎(da ya‏ لمدة ‎٠‏ ؟ ثانية؛ و .4 درجة لمدة ‎٠‏ ‏ثانية؛ و77 درجة لمدة دقيقة واحدة. تم ‎of jal‏ تضخيم لتسلسلات مستهدفة أطول ‎١‏ للاستنساخ وتكوين التسلسلات - ‎ORF‏ باستخدام مستخلصات ‎DNA‏ خام بطريقة متطابقة ما عدا أنه تم استخدام توليفة من إنزيم بوليمراز ‎Tth/Vent DNA‏ غير المنشط- قفا ‎ClontechiAdvantagePCR)‏ ) ولا درجة وتم استخدام زمن تمديد مطابق لحجم منتج ‎PVR‏ المطلوب زائد 7 دقيقة (أي منتج ‎PCR‏ المطلوب- ‎١+‏ كيلو زوج قاعدة؛ زمن تمديد ‎A=‏ دقيقة).

- سجنلا تم إجراء كلا ‎PCRs‏ التقليدي وطويل المسافة باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيق رقيقة الجدار ‎١7‏ مل بها بولي بروبلين في مدور حراري 2400 ‎(Perkin-Elmer ( ABI‏ عقب التدوير الحراري؛ تم تحليل أجزاء متساوية من ‎Yo)‏ ميكرو لتر) التفاعلات وتم تمييز منتجات ‎PCR‏ بالاستشراد بهلام أجاروز ‎agarose gel‏ قياسية(8 ‎٠‏ 7 أجاروز ‎agarose‏ ‏5 في محلول منظم ‎(TAE‏ ولطخ بإيثيديوم بروميد ‎ethidium bromide‏ . وقد أظهرت النتائج أن بروتين ‎HMW‏ محفوظا بدرجة عالية في أنماط مصلية وثيقة الصلة إكلينيكيا؛ وكان جين بروتين ‎HMW‏ موجودا في جميع سلالات عينات كلاميديا 018007018 بما فيها الأنماط المصلية ‎Ba B‏ هي ‎«J <I ¢H «G «F‏ كل انآ و12» ‎MoPns‏ وفي ‎.C.pnumoniae‏ ‎٠‏ مثال + تحديد نمط تسلسل _مختذلف لتحديد درجة النمط المختلف من تسلسل الحمض ‎DNA‏ والحمض الأمينسي ‎amino acid‏ بين سلالات الكلاميديا 48 المختلفة؛ تم استنساخ جين بروتين ‎HMW‏ بطريقة ‎PCR‏ من كل من نمط مصلي ‎C.trchomatis‏ و3 (يمثل مجموعة التراكوما ‎trachomatis‏ ‎yo‏ للكائنات الحية) ومن النمط المصلي 7 ‎Jia) Ctrchomatis‏ الانماط المصلية ‎STD‏ ‏للعدوى) ومقارنته بتسلسل ‎C.trchomatis Ly‏ لإحصاء بروتين ‎HMW‏ . باختصار؛ تم استخدام 10-7018 لتوليد قطع ‎DNA‏ محددة لبروتين ‎HMW‏ 6 كيلو زوج قاعدة من ‎DNA 5 C.trchomatis B‏ الجينومي ‎genomic‏ ل7 والذي يحتوي على تسلسل الترميز الكامل لبروتين ‎HMW‏ الناضج. وكانت ظروف التضخيم لهذه التمارين ‎LD-PCR‏ ‏© وفقا لما تم وصفها في المثال رقم 7. ويكون باديء التضخيم العكسي المستخدم في هذه

التفاعلات (0316100-80؛ © وحدة بنائية)؛ والمدرج على هيئة تسلسل رقم:٠؛‏ متمما للتسلسل الموجودة ب 7 كيلو زوج قاعدة بعد كودون نهاية بروتين ‎HMW‏ المتوقع. كمساعدة لاستنساخ أمبليمر ‎١ amplimer‏ كيلو زوج قاعدة المطلوب؛ ثم إجراء هندسة وراثية لموضع '5 لإنزيم إندونيوكلاز ‎endonuclease‏ للتقييد ‎Kpnl‏ لتسلسل الكلاميديا ‎chlamydia ٠‏ باديء ‎.p31Kpn-RC‏ يحتوي باديء التضخيم الأمامي المستخدم لهذه التفاعلات ‎«p306Kpn-F)‏ 1 وحدةبنائية)؛ والمدرجة كتسلسل رقم: ‎YY‏ على التسلسل المتممة للوحدات البنائية العشر الأولى للحمض ‎١‏ لأميني ‎Yo) amino acid‏ قليل النوويد ‎nucleotides‏ ( التي تحدد بروتين ‎HMW‏ الناضج وكذلك تسلسل 5 التي تحدد موضع ‎ad -Kpnl‏ تصميم ‎p306Kpn-F‏ بحيث يمكن ربط التسلسل التي ترمز الطرف ‎N‏ لبروتين ‎HMW ٠‏ الناضج داخليا مع نطاق ميل ‎hexa-liis‏ المرمز بعد معزز ‎tre‏ الفعال درجة عاليةٍ على ‎Jil‏ تعبير إشرشيا كو لاي ‎(ClonTech) pTreHisB E. coli‏ عندما تم إدخال أمبليمر 4 كيلو زوج قاعدةٌ في موضع ‎Kpnl‏ من هذا الناقل . تسلسل رقم ‎5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG- ١١‏ ‎AGG-GTA-CCG-AAA-TTA-TGG-TTC-CTC-AAG-GAA-‏ ‏م ‎TTT-ACG-AT-3'‏ ‏تسلسل رقم ‎VY‏ ‎:-ATG-GIT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC- 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG- G-‏ ‎3'AGG-GTA-CCC-TAA-GAA-GAA-GGC-ATG-CCG-TGC-TAG-CGG-AG-3'‏

‎Vo —‏ - تمت تنقية منتجات بروتين ‎HMW‏ > كيلو زوج قاعدة باستخدام أعمدة تدوير هلام -سيليكا ‎(QIAGEN) silica gel‏ وتم تعريض القطع إلى دورتين لمدة من ‎٠١-‏ ساعة من اهتضام ‎Kpnl—‏ باستخدام زيادة ‎٠١‏ أضعاف من ‎٠ ) KpnI‏ وحدات لكل ميكرو جرام من القطعة ‎lid)‏ عند ‎TY‏ درجة). عقب الاهتضام الثاني؛ تمت إزالة ‎BLAS‏ الإنزيم تقييد ‎o‏ المتبقي باستخدام أعمدة تدوير ‎Qiagen‏ و١‏ كيلو زوج قاعدة من قطع بروتين ‎HMW‏ ‎Kpnl‏ المستنسخة في بلازميد ‎pTrcHisB plasmid‏ الذي تم اهتضامه من قبل تماما ‎Kpnl—‏ وتمت معالجته بإنزيم فوسفاتاز من أمعاء ‎dae‏ بقري لمنع ‎sale)‏ ارتباط الناقل. تم إجراء عمليات ربط ناقل/مادة مدخلة في حجم تفاعل نهائي ‎5٠‏ ميكرو لتر )© مللي مولارء من ‎«Tris-HCl‏ رقم ‎Ph (ang yaaa‏ 7؛ و١٠‏ مللي مولار من ‎VENaCl‏ ملي مولار ‎٠‏ من ‎ATP‏ 05+ ملي مولار من ‎(DTT‏ عند درجة حرارة ‎Yo‏ .م لمدة ساعتان باستخدام إنزيم ربط 14 لحمض ‎٠١( DNA‏ وحدات/تفاعل) ونسبة تركيز ناقل: مدخل تقرب من ‎:١‏ ©. وبعد الربط» يتم استخدام القاسمات التامة ( ‎5٠0‏ ع« من حمض ‎DNA‏ المرتبط) لتحول عائل ‎E.Coli‏ ‏مؤهل كهربيا؛ على سبيل المثال 10010 ‎E.Coli‏ تم اختيار محولات حاملة للهيبارين ‎heparin‏ ‏بواسطة طلي ‎DA‏ محولة كهربيا على أجار ‎LB‏ يشتمل على ‎٠٠١‏ ميكرو/مللتر من الأمبسيلين ‎ampicillin Ve‏ وتم التقاط المحولات المقاومة للأمبسيلين ‎(APY) ampicillin‏ التي تظهر بعد مدة تحضين من ‎YE -١ AN‏ ساعة عند درجة حرارة ‎VV‏ 0 عشوائيا ويعاد تخطيطه في نفس المستنبت المختار للتنقية. ويتم استخدام مستعمرة "مخ نقية فردية من كل محول ابتدائي لتلقيح ‎٠‏ مللتر من 13 زرعي وينمى لليلة ‎ALS‏ عند درجة حرارة ‎(da VV‏ حاضن هزاز مع تعرض معتدل للهواء ‎٠٠١(‏ ‏ا لفة/د). ويتم تجميع الخلايا من المنبتات الزرعية بواسطة الطرد المركزي وتستخدم في تحضير

- )ل كميات صغيرة من ‎DNA‏ بلازميد. وتم استخدام المواد الكاشفة المتاحة تجاريا ‎QIAGEN)‏ ‏بلازميدة ‎(Mini Kits plasmid‏ لاستخلاص هذه البلازميدة ‎plasmid‏ وتم تحديد المكونات المدخلة الحاملة لمشتقات البلازميدات بشكل ترجيحي بواسطة تحليل ‎DNA‏ بلازميد ‎plasmid‏ غير المهضم كهربيا في هلام أجاروز ‎+A) agarose gel‏ 7 من الأجاروز 68 في عامل ‎TAE‏ المنظم) ‎٠‏ وتحديد مشتقات أكبر حجما من ناقل البلازميدة ‎plasmid‏ ويتم تأكيد المشتقات المحتوية على مكون مدخل وتم تحديد اتجاه المكونات المدخلة لبروتين ‎HMW‏ بالنسبة لتسلسلات الناقل باستخدام إنزيمات نوكلياز الداخلية ‎endonucleases‏ الملائمة للاحتجاز (على سبيل المثال: ‎Kpnl‏ ‎(EcoRI Hindlll «Bamlll طونل «Smal:‏ إما منفصلة أو معا في توليفات مختلفة. تم الحصول على تسلسل حمض ‎DNA‏ لجين بروتين ‎HMW‏ للكلاميديا ‎trachomatis chlamydia‏ ‎٠‏ 3و2 للسلسلتين عن طريق "تحرك متوالية' تقليدي مقترن بمنهجيات تسلسل دائري ‎PCR‏ ‏تناظري ‎Perkin-Elmer)« (ABI Prism Dye-Terminator cycle sequencing‏ الموصوف في ‎JU‏ 54 . وتم برمجة تفاعلات حمض ‎mini-prep DNA‏ بلازميد ‎plasmid‏ وبادئات تسلسل محددة فردية لبروتين ‎HMW‏ الذي تم استخدامه في تسلسل جين بروتين ‎HMW‏ من سلسلة من النوع مآ. تم جمع بيانات تسلسل حمض ‎DNA‏ الذي تم إنتاجه من تفاعلات فردية وقيم شدة التألق ‎١‏ القصوى النسبية الذي تم تحليله آليا بواسطة حاسب ‎PowerMAC‏ باستخدام برنامج حاسب ملائم كما تم وصفه في المثال ؛. وتم تعديل تسلسل حمض ‎DNA‏ المحللة آليا بصسورة فردية يدوياء وذلك للدقة قبل دمجها في سلسلة التسلسل التي تم الاتفاق عليها باستخدام برنامج تجميع آلي ‎(Perkin-Elmer)‏ كما تم عمل تسلسل لسلسلتي جين بروتين 1124177 من أنماط مصلية للكلاميديا ‎Fy B trachomatis chlamydia‏ لجينات بروتين ‎HMW‏ للكلاميديا ‎chlamydia‏

‎VY -‏ - ‎.F 3 B trachomatis‏ وتوضع تسلسل الحمض الأميني ‎amino acid‏ التي تم ترميزها في قاتمة كتسلسل رقم 15 0 ‎A‏ ويعرض الشكل + مقارنات لتسلسل سلاسل ‎Ly‏ و7 ‎By‏ ‏المثال )4( إنتاج بروتين من عودة الارتباط ‎Production of Recombinant Protein‏ ‎٠‏ الإنتاج كميات كافية من بروتين ‎HMW‏ الناتج عن عودة الارتباط لدراسة المناعة وتحصين الحيوانات؛ تم استنساخ جين ‎HMW‏ باستخدام ‎PCR‏ داخل ‎E.Coli‏ ونظم تعبير وراتي مناسبة للفيروسات العصوية. يتم إنتاج كميات ضخمة من بروتين 11747577 في نظام مبني على ‎E.Coli‏ ‏كبروتين اندماج خيمري يشتمل على مجال الميل للتنقية ‎(Hise‏ له طرف 2. وتم استتساخ بروتين 7 مكتمل ذو إطار قراءة مفتوح ‎(ORF)‏ باستخدام ‎(PCR)‏ من جينوم كلاميديا ‎chlamydia‏ ‎٠‏ | 27040707001655 ,1 كقطعة فردية ‎Kpnl‏ تندمج في اتجاه وإطار القراءة الصحيح إلى نطاق الميسل للتنقية ‎(His)s‏ الذي تم ترميزه في ناقل تعبير وراتي عالي للبلازميد ‎pTrcHisB plasmid‏ ‎(CloneTech)‏ كما تم وصفه في المثال )©( ويعد نطاق الميل للتتقية ‎(Highs‏ جزءا من موضع تعبير وراثي مرتفع يشتمل على محفز ‎tac‏ عالي الجودة ‎(IPTG-inducible)‏ وموقع رابط للريبوسوم ‎Shine and Delgarno (RBS) ribosome‏ تسم ‎٠‏ الاتفاق عليه والموجود قبل نطاق الميل للتتقية ‎(His)‏ مباشرة. تم استنساخ جينات بروتين ‎HMW‏ ‏من كادميديا ‎chlamydia‏ مآ ‎C.trachomatiss C. trachomatis Bs C. trachomatis LGV‏ ‎PCR Laud oF‏ كشظيات 7 ‎٠‏ ,؟ كيلو زوج قاعدة. ويتم تعيين البادئ الأمامي ‎p306Kpn-F‏ ‏ويحتوي على تسلسلات متممة للوحدات البنائية العشر الأولي من الحمض الأميني ‎amino acid‏ ذو الطرف ‎N‏ لبروتين ‎HMW‏ الناضج ويوضع في قائمة كتسلسل رقم ‎.١١‏ بالإضافة إلى تسلسل > ترميز 0 ‎(HMWOS5‏ يحمل هذا البادئ الأمامي موقع تقييد ‎Kpnl‏ فريد موضوع قبل الوحدة

‎VA -‏ - البنائية الأولي لبروتين ‎(Glu) HMW‏ لاندماج ملائم لنطاق الميل للتنقية ‎(His)s‏ الذي تم ترميزه في ناقل البلازميدات ‎plasmids‏ و*' طرف + قاعدة 6/6 تشابك للتكبير الفعالو ‎١‏ مباعد داخلي قاعدي لتعرف/هضم فعال لإنزيم نوكلياز الداخلي ‎endonuclease‏ - ويحتوي بادئ ‎PCR‏ العكسي؛ المعين في ‎p316Kpn-3RC‏ على تسلسل متممة عكسية مع تسلسل كلاميديا ‎chlamydia‏ ‎eo‏ 720008025 الموجودة ‎١.7 Jd‏ كيلو زوج قاعدة بعد نهاية رامزة بروتين ‎HMW‏ المصنفة في متولية رقم ‎VE‏ مع 30616200-7م ؛ يحتوي البادئ العكسي أيضا على موقع تقييد ‎Kpnl‏ © مع تسلسلات كلاميديا ‎trachomatis chlamydia‏ وقاعدة 76 متشابكة وأداة فصل داخلية قاعدية ‎AY‏ ‏وللحصول على ‎gl‏ مقبول من منتج ‎ORF‏ لبروتين ‎HMW‏ (حوالي ‎1,90٠‏ كيلو زوج قاعدة)؛ يتم عمل تكبير ‎PCR‏ باستخدام خليط من إنزيم بوليمري ‎polymerases‏ لحمض ‎DNA‏ صامد ‎٠‏ ا للحرارة المشتمل على إنزيم بوليمري 6ل لحمض ‎T.thermophilus DNA‏ كإنزيم بوليمري ‎polymerase‏ ابتدائي يستخدم في التكبير وكمية صغيرة من إنزيم بوليمري ‎polymerase‏ ‏لحمض ‎DNA‏ صامد للحرارة لتوفير نشاط مراجعة من ‎Fo‏ إضافي (إنزيم بوليمري 6 مفيد 06100861©1). ويتم إضافة أجسام مضادة لإنزيم بوليمري ‎ass] polymerase‏ ‎DNA‏ إلى خليط التفاعل لتوفير ظروف بداية حرارية آلية تشجع إنتاج أمبليمر ضخم (> ؟ كيلو ‎No‏ زوج قاعدة). يتم فصل ‎DNA‏ الجينومي ‎genomic‏ من سلاسل متنوعة من الكلاميديا ‎trachomatis chlamydia‏ من ‎EBs‏ كما تم وصفها في المثال أعلاه وتستخدم في برمجة هذه التفاعلات. بعد التكبير» يتم تنقية منتجات التفاعل المرغوبة من البادئات الفائقة باستخدام عمود دوار يعمل بجل السيليكا ‎silica gel‏ المتاح تجاريا وعوامل كاشفة ‎(QIAGEN)‏ وتهضم لتتكامل مع كمية فائقة من ‎Kpnl‏ ‎Ve) ٠‏ وحدات لكل ‎١‏ ميكروجرام من ‎-(DNA‏ ويستنسخ ‎ORF‏ من ‎Kpnl‏ _لبروتين ‎HMW‏ المنتقى

- va -

والمهضم داخل ‎Kpnl‏ قبل الهضم لبلازميدة ‎plasmid‏ تعبير وراتي ‎pTreHisB‏ (نسبة ناقل: مدخل

تكون ‎:١‏ ©#). وتم يتم استخدام القاسمات التامة الناتجة عن تفاعل الربط لتحول عائل ‎E Coli‏

(TOP10 ‏سبيل المثال‎ Je) clu jes Jase

وتم تحضير حمض ‎Mini-prep DNA‏ المصنوع من محولات مقاومة لأمبسيلين ‎ampicillin‏ التي

‎٠‏ .تم التقاطها عشوائيا وتهضم لتتكامل مع ‎HindfIILy Knl‏ أو توليفة من ذلك وتفحص للبحث عن

‏وجود واتجاه المكون المدخل ‎ORF‏ لبروتين ‎YY HMW‏ كيلو زوج قاعدة بواسطة تحليل

‏كهربي يستخدم هلام أجاروز ‎agarose gel‏ وملاط إيثيديوم بروميد ‎-ethidium bromide‏ وتم

‏استخدام حمض ‎Mini-prep DNA‏ لبرمجة تفاعل تسلسل حمض ‎PCR DNA‏ تناظري كما تم

‏وصفه في الأمثلة السابقة لتأكيد دقة الوصلة المتشكلة بين قطعة بروتين ‎HMW‏ ونطاق الميل ‎٠‏ لللتنقية ‎(His)‏ للناقل. وتعد البلازميدة ‎plasmid‏ 011306 واحدة من المشتقات التي تم فصلها

‏بواسطة هذه الإجراءات التي تحتوي على جين بروتين ‎ORF HMW‏ من الكلاميديا ‎chlamydia‏

‎VEY) ‏إلى‎ 5676 nucleotides ‏والتي تمثل بواسطة مجموعات النكليوتيدات‎ Ly trachomatis

‏الموضحة في الشكل ‎AY)‏

‏وتم إنماء المواد الناتجة عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ في مزرعة 272-771 تشتمل على ‎٠٠١‏ ‎vo‏ ميكروجرام /مللترمم مع مرحلة ولوج متوسطة )0+ ‎gg‏ .0.3 ) وتحفز باستخدام ‎١( IPTG‏

‏ملي مولار نهائي) لمدة 0-4 ساعات إضافية لتنشيط الاستنساخ من محفزات الناقلات 106. ويتسم

‏التقاط الخلايا بواسطة الطرد المركزي ويحضر ناتج ذوبان الخلايا الخام بواسطة التحلل باستخدام

‏خلايا ضغط ‎French‏

لي - وبشكل بديل؛ يمكن الحصول على التعبير الوراثي لبروتين ‎tHMW‏ باستخدام نظم التعبير الوراثي للفيروسات العصوية. وتم استنساخ بروتين ‎HMW‏ باستخدام ‎ORF‏ من كلاميديا ‎chlamydia‏ ‎trachomatis‏ وآ والكلاميديا ‎F chlamydia‏ 70270710715 كمنتجات ‎٠ PCR‏ كيلو زوج قاعدة داخل ناقل محول للفيروسات العصوية (على سبيل المثال؛ ‎(pFastBacHTb‏ التي تم هضمها سابقا ‎٠‏ لتتكامل مع ‎Kpnl‏ وتعالج باستخدام ‎CIP‏ لتقليل إعادة ربط الناقل بنفس الطريقة الموصوفة من ناحية ‎pTroHisB‏ ثم تحول خرطوشة التعبير الوراثي لبروتين ‎HMW‏ المنتج في هذا الاستتساخ (على سيبل المثال؛ محفز البولي هيدرون ‎polyhedron‏ للفيروسات العصوية؛ ونطاق_ الميل ‎Ral)‏ ‎(His)s‏ ذو الطرف ‎N‏ و0107 لجين بروتين ‎(HMW‏ يتم تحويلهم إلى جينوم ‎genome‏ لفيروسات عصوية بوساطة النقل إلى موقع محدد باستخدام نظام باكميد المتاحة تجاريا ‎(Bac-to-Bac, Gibco) ٠‏ . باختصار؛ تم استخدام بلازميدة ‎plasmid‏ التعبير الوراثي لبروتين ‎HMW‏ في الفيروسات العصوية لتحويل ‎E.Coli DH10bac (Gibco) Wa‏ المؤهلة المشتملة على باكميد ‎bacmid‏ (ريبليكون ‎replicon‏ لبلازميد ‎plasmid‏ الفيروسات العصوية مهجنة) إلى مقاومة للجنتاميسين ‎gentamicin‏ ‏باستخدام منهجيات تحويل وانتقاء عيارية. يتم تحديد المحولات حيث تم نقل خرطوشة التعبير ‎١٠‏ _ الوراثي لبروتين ‎HMW‏ بنجاح من بلازميدة ‎plasmid‏ التعبير الوراثي إلى موقع المستقبل الملائم داخل الجين ‎LacZ‏ الموجود على ريبليكون باكميد ‎bacmid replicon‏ بامستخدام طريقة انتقاء ‎IPTG/X-gal blue-white‏ العيارية. ويتم التقاط المحولات ‎Gm®‏ البيضاء عشوائيا ويعاد تخطيطها للتنقية. تم تحضير بأكميد ‎bacmid‏ ‏حمض ‎DNA‏ من مستنبت بواسطة طريقة ‎(1981)<Esh-Horowitz‏ 9:2989-2993 .4.7 17 المدمجة © في هذه الوثيقة بالإشارة والمستخدمة لإصابة 1 خلايا بالعدوى ‎Spodoptera frugiperda‏ وبعد

‎AY -‏ - تنقية الأطباق؛ يتم استخدام بروتين ‎HMW‏ الناتج عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ للفيروسات العصوية لعدوى نطاق كبير من مستنبتات معلقات ‎Spodoptera‏ ويتم استخدام تعبير وراتقي خيميري لإنتاج صورة معالجة بمجموعات الجليكوسيلات ‎glycosylated‏ .من بروتين ‎HMW‏ ‏مثال ‎)٠١(‏ ‏© تنقية البروتين الناتج عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ ‏يتم تنقية بروتين ‎HMW‏ الناتج عن عودة الارتباط للتجانس باستخدام إجراءات الاستشراب بالألفة المعدني المثبت الإعدادي العياري ‎(IMAC)‏ باختصار؛ يتم إنماء سلالة ‎E.Coli‏ الحاملة لبلازميدة ‎judd) plasmid‏ الوراثي المشتملة على جين بروتين 118177 في مزرعة ‎Luria‏ في ‎©١‏ مادة تخمر ‎(New Brunswick)‏ عند درجة حرارة ‎a TV‏ مع تعريضها للهواء باعتدال حتى ‎hay‏ إلى منتصف ‎٠‏ طور النمو اللوغارتمي ( ©,0» ‎(OD.‏ وتحفز باستخدام ‎١( IPTC‏ ملي مولار نهائي) لمدة من ؛ - © ساعات. ويتم جمع عجينة الخلية وتغسل في ‎PBS‏ وتخزن عند درجة حرارة - ‎٠١‏ م. ويتم تعليق القاسمات التامة لعجينة الخلية المتجمدة )87 ‎Vom‏ جم من الوزن قبل التخلص من الرطوبة) في ‎١١7‏ مللتر من ‎DPBS‏ بواسطة توتر ميكانيكي وتحلل عن طريق المرور خلال خلية ضغط ‎١,00 XY) French‏ باسكال ‎psi‏ عند 4 ‎(a‏ ثم يزال البروتين المذاب من الأجسام ‎١‏ المشتملة على بروتين 11477 بواسطة عزل عالي السرعة ( ‎#٠٠٠١‏ جرام عند 46 م لمدة ‎Yo‏ دقيقة) . ويتم تعليق الحبيبية المذابة المشتملة على بروتين ‎THMW‏ في ‎Yo‏ مللتر من ‎D-PBS‏ مبرد بالثلج بواسطة التجنيس وتعزل كما سبق. ثم يتم إزالة الصفات الطبيعية للأجسام المشتملة على بروتين 7 المغسول بواسطة تعليقه في عامل فوسفات الصوديوم المنظم )7 ‎١1‏ مولارء؛ رقم ‎٠‏ - هيدروجيني ‎(v, ٠‏ يحتوي على “7 مولار جوانيدين هيدروكلوريد ‎guanidine hydrochloride‏

‎AY -‏ - ويحمل في عمود ميل- 117 )1,0 سم» ‎YO‏ سم وحجم الطبقة ‎Vo - A‏ مللتر) ثم إعداده من ‎Fast-Flow Chelating Sepharose (Pharmacia)‏ وتشحن بأيونات ‎ions‏ 1117 أو “70 بواسطة أجراءات عيارية. ويتم إزالة المواد غير المرتبطة بواسطة غسل العمود باستخدام أحجام عمود ‏ ‎٠١-٠‏ من معامل فوسفات الصوديوم ‎sodium phosphate‏ المنظم )7 ‎١9‏ مولار ورقم © هيدروحيني ‎)7.١ pH‏ الذي يحتوي على ‎A‏ مولار من اليوريا ‎curea‏ وتم فصل البروتين 7 تابعيا الناتج عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ المرتبط بصمغ الميل بواسطة نطاق الميل للتنقية ‎(His)‏ ذو الطرف ‎N‏ باستخدام فوسفات الصوديوم ‎sodium phosphate‏ لها رقم هيدروجيني ‎A JE, pH‏ مولار من عامل اليوريا ‎urea‏ المنظم (© ‎٠‏ 7 ممليلتر). ويتم معادلة المواد المعزولة بإضافة 7 ‎٠.١‏ مولار من ‎Tri-HCT‏ )7 0,¥ مللتر ورقم هيدروجيني ‎(V.0 pH‏ ويحلل مقابل عامل 218 المنظم المشتمل على ‎SDS‏ )7 21,0( لإزالة اليوريا ‎urea‏ ويتم تركيز المواد المتحللة باستخدام أداة تركيز عازلة ‎(Amicon ٠٠٠٠١ MWCO) Centricon ٠١‏ ويخلط بحجم 1/5 من عينة هلام © ‎SDS x‏ من العامل المنظم المشتمل على ‎١‏ ملي مولار ‎Jil sil pe‏ -2 ‎(Lammeli) mercaptoethanol‏ ويغلى عند ١٠٠-م‏ لمدة خمس دقائق. ويتم تحميل العينات على هلامات الأكريل أميد ‎acrylamide gels‏ الإعدادية ‎Tris/glycine‏ (5 من ‎١‏ هلام تكديس ‎7٠١ «stacking gel‏ من جل إحلال ‎8:7٠ resolving gel‏ في محلول أكريل أميد ‎acrylamide‏ بيس ‎this‏ كثافة © مللتر). ويتم إجبراء وزن جزيئثي تم صبغه مسبقا ‎50b Novex)«(SeeBlue‏ 5 مع عينات بروتين ‎(HMW‏ لتحديد كسور الحجم على الهلام. وتم استخلاص منطقة من الجل ‎gel‏ تحتوي على بروتينات لها ‎JES‏ جزيئية من © ‎Kdal 70-8٠‏ وتم فصل البروتينات كهربيا باستخدام أداة ‎Elu-Trap‏ وأغشية ‎(S&S)‏ كما تم تحديدها من قبل ‎Y.‏ المصنع.

ويتم تحليل البروتينات التي تم فصلها كهربيا لإزالة 505. يتم تحديد تركيز البروتين في العينة باستخدام نظام ‎BSA 5 (Pierce) Micro-BCA‏ كعيار للتركيز. يتم تحديد نقاوة بروتين 117157 باستخدام ‎SDS-PAGE‏ تقليدية وعوامل كشافة لصبغة الفضة المتاحة تجاريا ‎«(Silver Stain Plus‏ ‎Novex)‏ كما تم توضيحه في الشكل (2). ‎٠‏ ويتراوح الوزن الجزيئي الظاهر لبروتين 112417 الناضج الذي تم فصله بين ‎١١١9 - ٠١١‏ كيلو دالتون ‎kDa‏ كما تم تحديده بواسطة ‎SDS-PAGE‏ . ‎(VV) Jed‏ تحضير أجسام مضادة لبروتين ‎HMW‏ ‏تم إنتاج أمصال مضادة عديدة المكافئ لبروتين ‎BMW‏ بواسطة حقن الأرانب ببروتين ‎HMW‏ ‏حوالي ‎You‏ ميكروجرام من بروتين ‎HMW‏ أو قطعة منه في كل ‎Ais‏ (بدية ‎Fruend sel way‏ التام ويليه مساعد ‎Fruend‏ غير التام) عند ما يقرب من فاصل زمن ١؟‏ يوما. في كلمرة تحصين مناعي؛ تعطى نصف المادة تقريبا في العضل بينما يحقن النصف الأخر العقدة. بعد ‎VE‏ ‏يوما من التطعيم؛ تعطى ‎ic a‏ منشطة حوالي ‎١‏ ميكروجرام من بروتين ‎HMW‏ ويستزف

ELISA ‏باختبار‎ HMW ‏أيام بعد ذلك. ثم تقاس عيارات من مضادات بروتين‎ ٠١ - ناويحلا‎ _ ١

C. trachomatis L, EBs ‏ميكروجرام/|(عين) أن‎ ٠٠١ 7) ‏النقي‎ HMW ‏باستخدام بروتين‎ ‏ربط احتجاز. وقد لوحظ أن عيارات‎ ald jal ‏(المستخلصات البروتينية الخام والكلي)‎

EBs ‏أو‎ BBs ‏مولدات مناعة محددة اختبار 15021158 باتخدام‎ (FY 000) 7

عي - تم عمل تخفيفات متتالية للأمصال المضادة في ‎DBS‏ وتم أختيارها بواسطة اختبار ‎ELISA‏ في زوج. واستخدم جسم مضاد ‎HPP‏ مستنزف من عنزة ومخفف من ‎٠٠٠١/١‏ كجسم مضاد مقرر ثاني في هذه التجارب. ويعبر عن هذه العيارات كأكبر مادة محللة توضح تفاعل ‎ELISA‏ إيجلبي. على سبيل المثال قيمة .0.0 > 25 دالتون ‎kDa‏ أعلى من قيمة التحكم السلب (أمصال الأرنب م قبل النزف). ثم تستخدم أمصال مضادة فائقة المناعة لسبر بقع ‎Western‏ لمستخلصات ‎RB‏ أو ‎EB‏ ‏الخام. بالإضافة إلى ‎٠١‏ 96 من مستحضرات مستخلص ‎OGPEB‏ لتحديد ما إذا كانت الأناط المصلية للكلاميديا ‎chlamydia‏ 720705 والأنواع الأخرى من الكلاميديا ‎chlamydia‏ تعبر وراثيا عن بروتين ‎HMW‏ تم اختبار الأنماط المصلية للكلاميديا ‎B chlamydia‏ 27706/07104775 17 1/1000 والكلاميديا ‎pneumoniae chlamydia‏ ووجد أن لها بروتين له وزن جزيئي ظاهر ‎٠‏ من ‎١١5 - ٠١#‏ كيلو دالتون 108 يتفاعل مع الأمصال المضادة المنتجة لمضادات بروتين ب ‎(VY) Jes‏ ثم فحص التحضير الموضعي السطحي لبروتين ‎MHW‏ على سلالات الكلاميديا ‎chlamydia‏ ‏ومشتقات مختلفة باستخدام أجسام مضادة متألقة غير مباشرة ‎(IFA)‏ تم إجراء ‎TFA‏ باستخدام ‎٠‏ الإجراءات المعروف بشكل عام في هذا المجال باستخدام بروتثين 7 المضاد فائق المناعة كجسم مضاد ابتدائي. يتم الحصول علي خلايا ‎Hak‏ المصابة بالأجسام المضادة الابتدائية الكلية من إحدى الأنماط المصلية للكلاميديا ‎Lye Farackomatis 8 chlamydia‏ أو الكلاميديا ‎pneumoniae chlamydia‏ أو الكلاميديا ‎psittaci chlamydia‏ باستخدام الطريقة التالية: تم إنماء خلايا ‎McCoy‏ أو ‎Hak‏ لتتجمع في مستنبت ‎D-MEM‏ في ‎mmm ١١‏ من شرائط تغطية ‎٠3٠‏ مسطحة ‎(Yt) Jab‏ عين من أطباق مستنبت نسيجي ثم تلفح بالعزل مع ‎١ xe”‏ وحدات تشكيل

‎Ae —‏ - ‎(IFU)‏ من الكلاميديا ‎trackomatis chlamydia‏ من سلالة ‎N11‏ (نمط ‎(Fas‏ بعد تحضين لمدة ‎YE‏ ساعة؛ يتم إزالة المستنبت وتثبت الخلايا المصابة في الميتانول ‎methanol‏ لمدة ‎٠١‏ ‏دقائق. ‏يتم ‎Jue‏ الخلايا المثبتة أحادية الطبقة باستخدام ‎١( PBS‏ مرة) لإزالة المادة المثبتة وتغطى في > ‎Pon 6‏ ميكرولتر من أجسام مضادة مستخلصة من الأرانب لبروتين ‎HMWP‏ المبتور مضاد ‎Tem‏ ‎Kdal‏ الذي تم تخفيفه في ‎٠ /١‏ من ‎PBS‏ بعد التحضين لمدة ساحة واحدة مع الجسم المضاد الأولي؛ تم ‎LAY due‏ باعتدال باستخدام ‎PBS‏ وبعد ذلك يتم تحضينها لمدة ‎١7‏ د بمادة مخففة ‎٠0١‏ من الجسم المضاد 186 المستخلص من فأر ومضاد للأجسام المضادة في الأرانب مستنزف بواسطة ‎FITC‏ وتم تخفيف الجسم المضاد الآخر باستخدام محلول ‎PBS‏ المشتمل على ‎٠‏ 10قح:,ء7ر ‎Evans Blue‏ بقعة عكسية لجعل الطبقة الأحادية مرئية. وتم غسل ‎Y LIAN‏ مرة في لإزالة الأجسام المضادة الثانوية وشرائح التغطية المزالة من أطباق المستنبت وتركب على شريحة مجهر تصويري باستخدام وسيط تركيب متألق. ويتم معالجة عينات الخلية المطابقة لمصطبغة لجسم مضاد من الأرانب مستخلص قبل النزف أو جسم مضاد ‎FITC‏ ثان مستنزف وده بالتوازي وتعامل كوحدات تحكم (سلبية) في نوعية الجسم ‎١‏ المضاد. وتم فحص في عينات المصطبغة بالعداد عند تكبير ‎٠٠٠١‏ مرة بواسطة مجهر تصويري ‎Axioskop‏ 5 مزود بعدسة شيئية. ويوضح الشكل ‎(V)‏ النتائج باستخدام نمط مصلي ‎F‏ ‏للكلاميديا ‎N11 trackomatis chlamydia‏ وتوضح النتائج أن التألق المعزز ‎Glial]‏ المصطبغة بالجسم المضاد لبروتين ‎HMW‏ بالمقارنة بوحدات التحكم تؤكد الموقع السطحي للبروتين ‎HMW‏ ‏وعلاوة على ذلك؛ يظهر تألق العينات المصطبغة بأجسام مضادة لبروتين 114157 ارتباط ببروتين

MoPn¢ ‏امآ‎ FB chlamydia ‏معين سطحيا وبروتين من الأنماط المصلية للكلاميديا‎ HMW pneumoniae chlamydia ‏والكلاميديا‎

‎J‏ لاستخدام

‏تم استخدام نموذج المعادلة المختبري لتوضيح أن المصل المضاد المناعي الذي يثبط عدوى م الكلاميديا ‎chlamydia‏ (معادلة) من خطوط خلية مستنبت نسيجي مختلفة. وتعد النماذج الحيوانية

‏ضرورية أيضا لاختبار كفاءة التطعيم مع كل من الحيوانات الصغيرة (لا رئيسيات ‎non-‏

‎(primate‏ ونماذج ‎primates Hl‏ الضرورية للتقييم قبل العيادي. وتم استخدام الخنزير الهندي

‏لدراسة العدوى التناسلية والعينية التجريبية باستخدام خنزير يحتوي على عامل التهاب الملتحمة

‎psittaci chlamydia ‏وكلدميديا‎ (GPIC)

‎٠‏ ويقدم ‎JW‏ نموذج متناسق ومنتج لعدوى القناة التناسلية باستخدام معزلات القناة التناسلية البشرية. ويعد النموذج المشتمل على ‎JU‏ هذا تجربة قبل عيادية مقبولة بشكل عام واستخدمت لتقييم 0 كوحدة تطعيم فرعية. ويعرف نموذج أخر كنموذج الرئيسيات لعدوي التراكوما ‎dus trachomatis‏ تم توضيح تأثير ‎IgA‏ الأفرازي كمكون رئيسي للمناعة. ويتم تحديد القدرة التحصينة لوحدة فرعية جديدة من مولد المضادات باستخدام المعادلة المذكورة سابقا والمقبولة

‏م مختبريا ونظم النماذج الحيوانية. المثال ‎(Vv)‏ ‏نموذج معادلة مختبري وكتدريب أولي لدراسات التحصين الحيواني؛ تم تقييم جسم مضاد لمضادات بروتين ‎HMW‏ فائق المناعة لقدرته على مقاومة حالة العدوى من الأنماط المصلية المختلفة للكلاميديا ‎chlamydia‏

— لام - ‎(Loc BoB) trachomatis‏ في المختبر. على الرغم م استخدام خلايا ‎Hela‏ لإنتاج كلاميديا ‎cchlamydia‏ إلا أنها تسمح أيضا بإدراك الأجسام المضادة الوسيطة عن طريق مستقبلات ‎Fo‏ ‏وبالتالي؛ تقييم قدرة الأجسام المضادة لبروتين ‎HMW‏ على منع العدوى وتم استخدام خلديا ‎Hak‏ ‏التي تقوم بعرض مستقبلات ‎Fo‏ في هذه التحليلات. ‎٠‏ تم إنماء الخلايا على شرائط تغطية في أطباق )£ 7)- عينا إلى مادة أحادية الطبقة متمادية (حوالي ‎٠١ x ١<يدامت ٠‏ ” خلايا/مللتر) عند درجة حرارة ‎TV‏ .م في 5 ثاني أكسيد الكربون 007. وتم تخفيف أجسام مضادة لبروتين ‎HMW‏ إلى حوالي ‎٠٠١‏ ميكروجرام/مللتر (البروتين الكلي) في عامل سكروز فوسفات الجلاتيمات ‎sucrose-phosphate-glutamate‏ المنظم ‎(SPG)‏ ثم يخقف تسلسليا في عامل ‎(SPG)‏ المنظم. كما تم تخفيف القاسمات التامة المتجمدة للكلاميديا ‎chlamydia‏ ‎٠‏ ”قبل معايرتها في عامل منظم ‎(SPG)‏ إلى حوالي ‎٠١ x Y‏ 1717/مللتر. وتم خلط و23 قبل استخدامها مع أجسام مضادة لبروتين 11077 إلى حوالي ‎٠١-٠١‏ ل11/ميكرولتر وتحضن لمدة ‎٠‏ د عند درجة حرارة ‎١7‏ .م في ‎dale‏ هزازة. وتم غسل خلايا ‎Hak‏ المحضرة في محلول ‎HBSS‏ ثم تحضينها مع خليط أجسام مضادة لبروتين 0 كلاميديا ‎EB chlamydia‏ ثلاثة لكل جسم مضاد باستخدام ‎٠ ٠‏ © [171/مللتر. يتم تحضين ‎١‏ الأطباق لمدة ساعتان عند درجة حرارة ‎a TV‏ تزال اللقيحة وتغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام محلول ‎HBSS‏ . ويتم إضافة مستنبت نسيجي يشتمل على ‎١‏ ميكروجرام/مللتر من السيكلو هيكسي أميد ‎cyclohexamide‏ وتم تضحين الأطباق لمدة تتراوح من ‎YE‏ - 776 ساعة عند درجة حرارة ‎"١‏ م في ‎٠‏ من ثاني أكسيد الكربون ‎CO,‏ ليسمح بتطور للمشتملات. بعد التحضين؛ يتم إزالة المستنبت وتغسل المواد الخلوية أحادية الطبقة * مرات في ‎PBS‏ يتم تثبيت © الأطباق في ميثانول ‎methanol‏ لمدة ‎٠١‏ دقيقة ويعاد غسلها في ‎PBS‏

م/م - ويتم طلاء الخلايا لتصبح المشتملات مرئية بواسطة التحضين مع الأجسام المضادة للكلاميديا ‎LPS chlamydia‏ (المخففة بحوالي ‎:١‏ + +0« 1717058)؛ تغسل الخلايا ثلاث مرات في ‎PBS‏ ثم يتبعه التحضين مع أجسام مضادة ثانيوة مستنزفة من عنزة ‎FITC-conjugated goat secondary‏ لمدة ‎Fe‏ د عند درجة حرارة ‎TV‏ .م. يتم غسل شرائط التغطية وتجفف بالهواء وتثبت في ‎٠‏ جليسرول على شريط تغطية زجاجي. تحسب المشتملات في خمس مجالات خلال الخط ‎Coal i)‏

لشريط التغطية على مجهر تصويري ‎Ziess‏ متألق. وتقدم النتائج على شكل كسر نسبي للمشتملات المحتوية على خلايا فيما يتعلق بالتحكم في الأجسام المضادة الغريبة (مصل أرنب أخذ قبل النزف). ‎)١6( Je‏

‎٠‏ نموذج عدوى تناسلية في الفأر تم تقييم بروتين ‎HMW‏ كمولد مناعي ومولد طعمي باستخدام نموذج عدوى تناسلية من الكلاميديا ‎trachomatis chlamydia‏ مقبول بشكل عام أجري على فأر ‎٠‏ تم تقييم بروتين ‎HMW‏ كمولد مناعي ولقدرته على حماية 8/113/مستنبت فئران ضد تحدي من أنماط مصلية مختلفة من الكلاميديا ‎Ly) trachomatis chlamydia‏ و17 و8). يعطى بروتين ‎HMW‏ لمجموعات من حيوانات

‎٠‏ خالية من الكلاميديا ‎chlamydia‏ بواسطة ثلاث طرق ‎de jal‏ التحصين المناعي: عن طريق الفم أو الأنف أو تحت الجلد. بالنسبة لكل طريق؛ يتم تحديد المناعة التحصينية لبرويتن ‎HMW‏ للبروتين فقط وبالاتحاد مع المساعد (أو المساعدات) الملائم. بعد الجرعة الأولي من التحصين المناعي؛ يتم التضحية بالحيوان بصورة دورية وتحدد مستويات المصسل 18660 و ‎sigh‏ المخاطية باستخدام منهجيات معروفة.

‎Ad —‏ - تحصين الفئران: تعطى فأرة أنثى خالية من أمراض محددة؛ يتراوح عمرها ‎Ge‏ - 4 أسابيع (ناضجة جنسيا) بروتين ‎HMW‏ كما سيتم وصفه لاحقا. وللإعطاء عن طريق الحقن؛ الذي يعد الطريق التقليدي لإطلاق وحدات فرعية ناتجة عن عودة الارتباط ‎recombinant‏ وسموم للإنسان؛ تعطى وحدة فرعية من بروتين ‎HMW‏ تحت الجلد ‎٠‏ لفتران لم يتم تخديرها. وبالنسبة للتحصين المناعي عن طريق ‎ill‏ يمنع الحيوانات من المخصص الغذائي لهم لمدة ؛ ساعات قبل إعطاء الجرعة. يعطى بروتين ‎HMW‏ عن طريق المعدة لفئران لم يتم تخديرها. وتعاد الفثران المطعمة عن طريق المعدة إلى مخصص صلب تقريبا ‎EF‏ ‏ساعات بعد التحصين المناعي . بينما تعطى الفئران التي تحصن عن طريق الأنف مهدئ ‎CGS‏ ‏يوضع على ظهورهم ثم تعطى بروتين ‎HMW‏ ‎٠‏ تحديد مستويات الجسم المضاد في المصل والغشاء المخاطي: عند البدء بعد التحصين المناعي الأول مباشرة والاستمرار على فواصل زمنية لمدة 7 أيام بعد ذلك؛ تم تخدير الحيوانات من كل مجموعة تلقيح؛ وتم فتح التجويف البطني وتم استنزاف الحيوان بالبذل القلبي . بعد ذلك مباشرة؛ تمت إزالة القناة التناسلية السفلية (عنق الرحم والمهبل) والأمعاء الدقيقة جراحيا. تم تجميع الإفرازات المخاطية من الأمعاء 0 وعنق الرحم/ والمهبل بكشط الأعضاء المغسولة من قبل والمشرحة برفق وذلك بمبضسع جراحي معقم. تم تزين الإفرازات المصلية والمخاطية في ‎PBS‏ عند ‎١7 ١-‏ درجة منشوي حتى نهاية التجربة وتم تحليلها كمجموعة. تم تحديد مستويات جسم ‎IgG‏ الكلاميدي ‎IgA‏ الإفرازي في المصل والإفرازات المخاطية بواسطة تجربة ‎(ELISA‏ تم تحديد المعيارات لكل من نواتج ذوبان الخلايا ‎EB‏ ‏2 بالكامل و بروتين ‎HMW‏ باختصار؛ تم تخفيف ‎Ly EBs‏ 7427:071075.) المنقى أو بروتين

- 4.0

77 في محلول منظم ‎١06‏ مولار من كربونات صوديوم واستخدمت لتغطية أطباق

معيار دقيق بها 97 ‎Immulon-3 (DynaTech)liae‏ . بعد اعاقة التفاعل ب-١/7 ‎BSA/PBS‏

(Tween-20 70320 5/035 ‏والغسيل الشديد(“مرات؛‎ Tween-20 0,6

تمت إضافة عينات إفراز مصلي أو مخاطي؛ وتم تخفيفها بشكل متسلسل في ‎PBS‏ وتم

© حضن الطبق عند ‎YY‏ درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم اختبار جميع العينات من ‎Cie‏

متطابقتين. تمت إزالة المواد غير المرتبطة بالغسل. تم اقتران ‎HRP‏ المنقاة للميل إما إلى

جسم ‎IgA‏ (سلسلة ألفا) من ماعز ومضاد للفئران أو جسم ‎IgG‏ من ماعز ومضاد للفئران

‎(Vector Labs)‏ بعد ذلك تمت إضافة ‎caidas vv 5/١‏ في ‎PBS‏ وتمت ‎sole)‏ حضانة

‏الطبق عند ‎TY‏ درجة مئوية. تمت إزالة الأجسام المضادة الثانوية؛ وتم ‎Jue‏ الطبق مرة ‎٠‏ أخرى وتمت إضافة ركيزة تفاعل(1348).

‏تم قياس تغيير اللون بمقياس طيف للطبق الدقيق عند ‎fo‏ نانو متر بعد ‎Ve‏ دقيقة

‏حضانة عند درجة حرارة الغرفة وتم غمره ب112504. تم تمييز قراءات ‎2SD<‏ من ‎٠١‏

‏لمتوسط القيمة المقارنة السالبة (أمصال مجمعة قبل النزيف؛ وإفرازات مخاطية مجمعة

‏من حيوانات غير محصنة بلقاح) كقيمة موجبة. تمت مراقبة خاصية تحديد التفاعل ‎ve‏ بواسطة الامتصاص المسبق للجسم المضاد الرئيسي بمولد الضد (إعاقة بجسم مضاد)

‏والجسم المضاد الثانوي بجسم فأري 180/188 منقى (إعاقة بالاقتران). يتم تقديم عيارات

‏جسم مضاد لكل نقطة بيانات )0 حيوانات/نقطة)على هيئة المتوسط الهندسي .5+ لآخر

‏محلول تخفيف موجب.

‏اختبار 0.72700707075_ بعد أسبوعين من التحصين المناعي الثالث تم اختبار الحيوانات © عن طريق المهبل؛ بينما كانت تحت تأثير معتدل من المخدر؛ بجرعة واحدة من ‎0١‏ مل

‏.0منقاة؛‎ Trachomatis EBs ‏من‎ 108IFU ‏خالي من السماني الخارجي يحتوي على‎ 5 ‏(حوالي ؟ مجم لكل جرعة في‎ Progesterone ‏ومعايرة مسبقا.تم إعطاء بروجيستيرون‎ ‏العضل) قبل زمن الاختبار بأسبوع لإعاقة تكون الإسترات وضمان عدوى خلايا ظهارية‎ ‏بشرية. تم تقييم وجود واستمرارية‎ C Trachomatis ‏لعنق رحم فأر بسلالات‎ : ‏القناة التناسلية السفلى للحيوانات الملقحة باستخدام كل من‎ $C Trachomatis ٠

‎Chlamydia-specific ELISA (Chlamydiazyme, Abbott Diagnostics) |‏ التجساري وبواسطة مزرعة في المعمل. بعد مضي ‎OVE oY‏ و١؟‏ يوما عقب الاختبار» يتم ذبح الحيوانات وفقا لما ذكر عاليه وتمت إزالة القنوات التناسلية السفلية (عنق الرحم/المهبل) والأمعاء

‏الدقيقة جراحيا وفقا لما ذكر عاليه.

‎٠‏ تم تحضير الأشكال المتماثلة من الأنسجة بواسطة تقطيع وتحديد اجزاء متماثلة ومتطابقة من النسيج في ‎١‏ مل من محلول منظم ‎.SPG‏ تم تخفيف عينات توضيحية بشكل متسلسل واختبارها للتأكد من وجود مولد ضد محدد للكلاميديا ‎chlamydia‏ باستخدام تجربة ‎ELISA‏ التجارية وتم استخدامها لعدوى خلايا ‎McCoy‏ المستنبتة في حوالي 790 لزوجة في أطباق مستنبت أنسجة به ‎YE‏ عينا. تمت تجربة كل محلول تخفيف من عينتين

‎Yo‏ متطابقتين. بعد فترة زراعة ؛ ؟ ساعة تم تثبيت الطبقات الوحيدة المصابة بميثانول ‎methanol‏ وأجسام مدرجة مرئية بواسطة لطخ الأجسام المضادة بالتألق الوميضي المباشر باستخدام جسم مضاد ‎LPS‏ مضاد للكلاميديا 011807018. تم عد أجسام مدرجة في التألق الوميضي بتكبير ‎5٠‏ مرة وتم التعبير عن المعيار الناتج كعدد متوسط من الإدراجات لكل ‎Yo‏ مجال. تم أيضا تحديد مستويات أجسام 1:66 5 ‎STgA‏ للكلاميديا

‎chlamydia.‏ في المصل والأمعاء لهذه الحيوانات وفقا لما تم تفصيله أعلاه.تم تعريف

الحماية بانها القدرة على تخفيف أو تقليل مستوى ‎C.Trachomatis‏ في القناة التناسلية

السفلى.

لتحديد ما ذا كان التلقيح 9 ‎HMW CRI‏ يحمي الفثر ان من اختبار من نو 2 غير

متجانس + كم تحصين مجموعات متكافئة من الفئران ببروتين ‎HMW‏ وتم اختبارهم لاحقا ° بأي من النمطين المصليين ‎Esl B C.Trachomatis‏

يمكن تحديد متكافئات أخرى من الاختراع الحالي بسهولة من قبل المتمرسين في الفن

ويقصد بمثل هذه المتكافئات أن يتم إدراجها في هذا الاختراع. يشتمل الكشف السابق على

جميع المعلومات التي ‎axl‏ جوهرية لتمكين المتمرس في الفن لممارسة الاختراع وفقا

لعناصر الحماية بدون تجارب غير ضرورية. نظرا لأن البراءات أو المطبوعات المنوه ‎٠١‏ عنها يمكن أن توفر المزيد من المعلومات ‎J‏ لإضافية المفيدة يتم بموجب هذا دمج جميع

المواد المنوه عنها بالإشارة إليها في السياق بكاملها.

<210>تسلسل رقم 1

<211>طول 4435:

<212>النوع ملا : ‎yo‏ <213>تسلسل صناعية :ميكروبات

: Saudi? 20>

<223>معلومات ‎AT‏ 5( :وصف التسلسل الصناعية :عودة الارتباط ‎recombinant‏ نتاج

- ay —- <221> NAME/KEY: CDS <222> LOCATION: (382). (3417) ‏ناقل التعبير الوراثي <220>السمات<223>‎ : ‏معلومات أخرى‎ : 1 ‏<400>التسلسل‎ ‎gggcaaaact cttccccccg ggatttatat gggaaagggg aaactttggc ccgtattcaa 60 ° gcgccacggg ttttggggeg gaatgaattt tttcgttceg gaaaaagtaa ttcecececggga 120 acgtagggta tcggtttcat aggctcgcca aatgggatat aggtggaaag gtaaaaaaaa 180 ctgagccaag caaaggatag agaagtcttyg taatcatcgc aggttaaagg ggggatgtta 240 ‏ولعو‎ caaatagtgt aattattgga tcctgtaaag agaaaaggac gaatgcgetg 300 aagataagaa catttattga tattaaatta ttaatttttt atgaagcgga gtaattaatt 360 ٠٠ ttatctctca gettttgtgt ‏وعد و‎ caa acg ‏اع‎ tte cat aag ttc ttt ctt 411

Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu 1 5 10 tca atg att cta get tat ‏وو عع‎ tgc tect tta aat ggg ggg gga tat 459

Ser Met Ile Leu Ala Tyr Ser Cys Cys Ser Leu Asn Gly Gly Gly Tyr \o gca gca gaa atc atg gtt cct caa gga att tac gat ggg gag acg tta 507

Ala Ala Glu Ile Met Val Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu act gta tca ttt ccc tat act gtt ata gga gat ccg agt ggg act act 555 A

Thr Val Ser Phe Pro Tyr Thr val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr gtt ttt tct gca gga gag tta aca tta aaa aat ctt gac aat tct att 603

Val Phe Ser Ala Gly Glu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile 60 65 70 Yo gca gct ttg cct tta agt tgt ttt ggg aac tta tta ggg agt ttt act 651

Ala Ala Leu Pro Leu Ser Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr 75 80 85 90 gtt tta ggg aga gga cac tcg ttg act ttc gag aac ata cgg act ‏ع‎ 699

Val Leu Gly Arg Gly His Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser ° 95 100 105 aca aat ggg gca gct cta agt aat agc gct gct gat gga ctg ttt act 747

Thr Asn Gly Ala Ala Leu Ser Asn Ser Ala Ala Asp Gly Leu Phe Thr 110 115 120 att gag ggt ttt aaa gaa tta tcc ttt tcc aat tgc aat tca tta ctt 795 \

Ile Glu Gly Phe Lys Glu Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu 125 130 135 gcc gta ctg cect get ‏يهو‎ acg act aat aag ggt age cag act ccg acg 843

Ala Val Leu Pro Ala Ala Thr Thr Asn Lys Gly Ser Gln Thr Pro Thr 140 145 150 \o aca aca tct aca ‏وى‎ tct aat ggt act att tat tct aaa aca gat ctt 891

Thr Thr Ser Thr Pro Ser Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu 155 160 165 170 ‏وا‎ tta ctc aat aat gag aag ttc tca ttc tat agt aat tta gtc tct 939

Leu Leu Leu Asn Asn Glu Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Yo 175 180 185 gga gat ggg gga get ata gat gct aag age tta acg gtt caa gga att 987

Gly Asp Gly Gly Ala Ile Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile 190 195 200 agc aag ctt tgt gtc ttc caa gaa aat act gct caa gct gat ggg gga 1035 Yeo

Ser Lys Leu Cys Val Phe Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly

- 4° — 205 210 215 gct tgt caa gta ‏عاو‎ acc agt ttc tect get atg got aac gag ‏عو‎ cect 1083

Ala Cys Gln Val Val Thr Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro 220 225 230 att gcc ttt gta gcg aat gtt gca gga gta aga ggg gga ggg att get 1131 °

Ile Ala Phe Val Ala Asn Val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly Ile Ala 235 240 245 250 gct gtt cag gat ggg cag cag gga gtg ‏دع‎ tca tct act tca aca gaa 1179

Ala Val Gln Asp Gly Gln Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu 255 260 265 ٠٠١ gat cca gta gta agt ttt tcc aga aat act ‏ومو‎ gta gag ttt gat ggg 1227

Asp Pro Val Val Ser Phe Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly 270 275 280 aac gta gcc cga gta gga gga ggg att tac tcc tac ggg aac gtt gct 1275

Asn Val Ala Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Vo 285 290 295 ttc ctg aat aat gga aaa acc ttg ttt ctc aac aat gtt get tect cect 1323

Phe Leu Asn Asn Gly Lys Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro 300 305 310 gtt tac att gct get aag caa cca aca agt gga cag gct tct aat acg 1371 AK

Val Tyr Tle Ala Ala Lys Gln Pro Thr Ser Gly Gln Ala Ser Asn Thr 315 320 325 330 agt aat aat tac gga gat gga gga gct atc ttc tgt aag aat ggt ‏ووو‎ 1419

Ser Asn Asn Tyr Gly Asp Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala 335 340 345 Yo caa gca gga tcc aat aac tct gga tca gtt tee ttt gat 998 gag gga 1467

Gln Ala Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly 350 355 360 gta gtt ttc ttt agt agc aat gta gct get ggg aaa ggg gga gct att 1515

Val Val Phe Phe Ser Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile 365 370 375 ° tat gcc aaa aag ctc tcg gtt get aac tgt ggc cct gta caa ttt tta 1563

Tyr Ala Lys Lys Leu Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu 380 385 390 agg aat atc get aat gat ggt gga gcg att tat tta gga gaa tct gga 1611

Arg Asn Ile Ala Asn Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Ve 395 400 405 410 gag ctc agt tta tct gct gat tat gga gat att att ttc gat ggg aat 1659

Glu Leu Ser Leu Ser Ala Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn 415 420 425

Ctt aaa aga aca gcc aaa gag aat gct gcc gat gtt aat ‏ووو‎ gta act 1707 Vo

Leu Lys Arg Thr Ala Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr 430 435 440 gtg tcc tea caa gcc att ‏وم‎ atg gga ‏و‎ gga ggg aaa ata acg aca 1755

Val Ser Ser Gln Ala Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr 445 450 455 Ye. tta aga gct aaa ‏دعو‎ ggg cat cag att ctc ttt aat gat ccc atc gag 1803

Leu Arg Ala Lys Ala Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu 460 465 470 atg gca aac gga aat aac cag cca gcg cag tect tcc aaa ctt cta aaa 1851

Met Ala Asn Gly Asn Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu Leu Lys Yo 475 480 485 490

- vy - att aac gat ggt gaa gga tac aca ggg gat att gtt ttt gct aat gga 1899

Ile Asn Asp Gly Glu Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly 495 500 505 agc agt act ttg tac caa aat gtt acg ata gag caa gga agg att gtt 1947

Ser Ser Thr Leu Tyr Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile 1 ° 510 515 520

Ctt cgt gaa ‏وعد‎ gca aaa tta tca ‏واو‎ aat tct cta agt cag aca ggt 1995

Leu Arg Glu Lys Ala Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly 525 530 535 999 agt ctg tat atg gaa gct ‏ووو‎ agt aca tgg gat ttt gta act cca 2043 \

Gly Ser Leu Tyr Met Glu Ala Gly Ser Thr Trp Asp Phe Val Thr Pro 540 545 550

Caa cca cca caa cag cct cct gee get aat cag ‏و‎ atc acg ctt tec 2091

Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser 555 60 565 570 \o aat ctg cat ttg tct ctt tect tect ttg tta gca aac aat gca gtt acg 2135

Asn Leu His Leu Ser Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala val Thr 575 580 585 aat cct cct acc aat cct cca ‏وعو‎ caa gat tect cat cot gca gtc att 2187

Asn Pro Pro Thr Asn Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Tle Yo 590 595 600 ggt agc aca act gct ggt tct gtt aca att agt ggg cct atc ttt ttt 2235

Gly Ser Thr Thr Ala Gly Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile Phe Phe 605 610 615 gag gat ttg gat gat aca gct tat gat agg tat gat tgg cta ggt tct 2283 Yo

Glu Asp Leu Asp Asp Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser

- ‏ممق‎ ‎620 625 60 aat caa aaa atc aat gtc ctg aaa tta cag tta ggg act aag ccc cca 2331

Asn Gln Lys Ile Asn Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Lys Pro Pro 635 640 645 650 gct aat gcc cca tca gat ttg act cta ggg aat gag atg cct aag tat 2379 5

Ala Asn Ala Pro Ser Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr 655 660 665 ggce tat caa gga agc tgg aag ctt ‏ومو‎ tgg gat cct aat aca gca aat 2427

Gly Tyr Gln Gly Ser Trp Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn 670 675 680 Vo aat ggt cct tat act ctg aaa get aca tgg act aaa act ggg tat aat 2475

Asn Gly Pro Tyr Thr Leu Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn 685 6390 695

Ccct ggg cct gag ‏دوه‎ gta gct tect ttg gtt cca aat agt tta tgg gga 2523

Pro Gly Pro Glu Arg Val Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Yo 700 705 710 tcc att tta gat ata cga tct ‏وجو‎ cat tea gca att caa gca agt ‏وو‎ 2571

Ser Ile Leu Asp Ile Arg Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser val 715 720 725 730 gat ggg cgc tct tat tgt cga gga tta tgg gtt tct gga gtt tcg aat 2619 AK

Asp Gly Arg Ser Tyr Cys Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn 735 740 745 ttc ttc tat cat gac cgc gat gct tta ggt cag gga tat cgg tat att 2667

Phe Phe Tyr His Asp Arg Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile 750 755 760 Yo agt 999 99 tat tcc tta gga ‏دقو‎ aac tcc tac ttt gga tca tcg atg 2715

Ser Gly Gly Tyr Ser Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met 765 770 775 ttt ggt cta gca ttt acc gaa gta ttt ggt aga tct aaa gat tat gta 2763

Phe Gly Leu Ala Phe Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val 780 785 790 ٠ gtg tgt cgt tcc aat cat cat gct tgc ata gga tcc gtt tat cta tet 2811

Val Cys Arg Ser Asn His His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser 795 800 805 810 acc caa caa gct tta tgt gga tcc tat ttg ttc gga gat gcocg ttt atc 2859

Thr Gln Gln Ala Leu Cys Gly Ser Tyr Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ile ٠١ 815 820 825

Cgt gct age tac ggg ttt ggg aat cag cat atg aaa acc tca tat aca 2907

Arg Ala ser Tyr Gly Phe Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr 830 835 840 ttt gca gag gag agc gat gtt cgt tgg gat aat aac ‏او‎ ctg gct gga 2955 Vo

Phe Ala Glu Glu Ser Asp Val Arg Trp Asp Asn Asn Cys Leu Ala Gly 845 850 855 gag att gga gcg gga ‏ف‎ ccg att ‏واو‎ att act cca tct aag ‏وا‎ tat 3003

Glu Ile Gly Ala Gly Leu Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr 860 865 870 Y. ttg aat gag ttg ‏عو‎ cct ttc ‏واو‎ caa gct gag ttt tect tat gcc gat 3051

Leu Asn Glu Leu Arg Pro Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp 875 880 885 890 cat gaa tect ttt aca gag gaa ggc gat caa gct cgg ‏دعو‎ ttc aag agc 3099

His Glu Ser Phe Thr Glu Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Lys Ser Yo 895 300 905

- Vee — gga cat ctc cta aat cta tca gtt cct gtt gga ‏وو‎ aag ttt gat cga 3147

Gly His Leu Leu Asn Leu Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg 910 915 920 tgt tct agt aca cat cct aat aaa tat agc ttt atg gcg gct tat atc 3195

Cys Ser Ser Thr His Pro Asn Lys Tyr Ser Phe Met Ala Ala Tyr Ile © 925 930 935 tgt gat gct tat ‏عو‎ acc atc tct ggt act gag aca acg ctc cta tcc 3243

Cys Asp Ala Tyr Arg Thr Ile Ser Gly Thr Glu Thr Thr Leu Leu Ser 940 945 950 cat caa gag aca tgg aca aca gat gcc ttt cat tta gca aga cat gga 3291 ٠١

His Gln Glu Thr Trp Thr Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly 955 960 965 970 gtt ‏وو‎ gtt aga gga tct atg tat get tct cta aca agt aat ata gaa 3339

Val Val Val Arg Gly Ser Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu 975 980 985 \o gta tat ggc cat gga aga tat gag tat cga gat gct tct cga ggc tat 3387

Val Tyr Gly His Gly Arg Tyr Glu Tyr Arg Asp Ala Ser Arg Gly Tyr 990 995 1000 ggt ttg agt gca gga agt aga gtc ‏ووه‎ ttc taaaaatatt ggttagatag 3437

Gly Leu Ser Ala Gly Ser Arg Val Arg Phe Y. 1005 1010 ttaagtgtta gcgatgectt tttectttgag atctacatca ttttgttttt tagcttgttt 3497 gtgttcctat tcgtatggat tcgcgagetc tcctcaagtyg ttaacgecta atgtaaccac 3557 tccttttaag ggagacgatg tttacttgaa tggagactgc gcttttgtca atgtctatgce 3617 aggagctgaa gaaggttcga ttatctcagce taatggcgac aatttaacga ttaccggaca 3677 Yo aaaccataca ttatcattta cagattctca agggccagtt cttcaaaatt atgccttcat 3737

- ١٠١.١ = ttcagcagga gagacactta ctctgagaga tttttcgagt ctgatgttct cgaaaaatgt 3797 ‏دوو وه‎ gaaaagggaa tgatctccogg gaaaaccgtg agtatttccg gagcaggcga 3857 agtgattttc tgggataact ccgtggggta ttctecttta tctactgtgec caacctcatc 3917 atcaactceg cctgetccaa cagttagtga tgctcggaaa gggtctattt tttctgtaga 3977 gactagtttyg gagatctcag gcgtcaaaaa aggggtcatg ttcgataata atgccgggaa 4037 ° tttcggaaca gtttttcgag gtaagaataa taataatgct ggtggtggag gcagtgggtt 4097 ctgctacacc atcaagtacg acttttacag ttaaaaactg taaagggaaa gtttctttca 4157 cagataacgt agcctcttge ggaggcggag tggtttataa aggcattgtg cttttcaaag 4217 acaatgaagg aggcatattc ttcecgaggga acacagcata cgatgattta aggattcttyg 4277 ctgctactaa tcaggatcag aatacggaga caggaggcgg tggaggagrt atttgctctc 4337 Vo cagatgattc tgtaaagttt gaaggcaata aaggttctat tgtttttgat tacaactttg 4397 caaaaggcag aggcggaagc atcctaacga aagaattc 4435 <210> SEQ ID NO 2 <211> LENGTH: 1012 <212> TYPE: PRT Vo <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 2

Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu Ser Met Ile Leu Ala Tyr 1 5 10 15

Ser Cys Cys Ser Leu Asn Gly Gly Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met Val Y.

Pro Gln Giy Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr

Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr val Phe Ser Ala Gly Glu 60 Yo

Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Leu Pro Leu Ser

- ١ ‏سالا‎ ‎65 70 75 80

Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu Gly Arg Gly His 85 90 95 ٠

Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala Leu 100 105 110

Ser Asn Ser Ala Ala Asp Gly Leu Phe Thr Ile Glu Gly Phe Lys Glu 115 120 125

Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu Ala Val Leu Pro Ala Ala \ 130 135 140

Thr Thr Asn Lys Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Ser Thr Pro Ser 145 150 155 160

Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu Leu Asn Asn Glu 165 170 175 \o

Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Gly Asp Gly Gly Ala Ile 180 185 190

Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile Ser Lys Leu Cys Val Phe 195 200 205

Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys Gln Val Val Thr ص9١‎ 210 215 220

Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro Ile Ala Phe Val Ala Asn 225 230 235 240 val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Gln 245 250 255 Yo

Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro Val Val Ser Phe 260 265 270

- ١

Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val Ala Arg Val Gly 275 280 285

Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu Asn Asn Gly Lys 290 295 300

Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro val Tyr Ile Ala Ala Lys 2 305 310 315 320

Gln Pro Thr Ser Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asn Asn Tyr Gly Asp 325 330 335

Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala Gly Ser Asn Asn 340 345 350 ٠

Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val Val Phe Phe Ser Ser 355 360 365

Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Lys Lys Leu Ser 370 375 380

Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Arg Asn Ile Ala Asn Asp Vo 385 390 395 400

Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser Ala 405 410 415

Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala Lys 420 425 430 Yo

Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr val Ser Ser Gln Ala Ile 435 440 445

Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala Gly 450 455 460

His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn Asn Yo 465 470 475 480

- VV. =

Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu Leu Lys Ile Asn Asp Gly Glu Gly 485 490 495

Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Gln 500 505 510

Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala Lys © 515 520 525

Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met Glu 530 535 540

Ala Gly Ser Thr Trp Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln Pro 545 550 555 560 \

Pro Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser Leu 565 570 575

Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro Pro Thr Asn Pro 580 585 590

Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala Gly \o 595 600 605

Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp Thr 610 615 620

Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asn 1 625 630 635 640 XY.

Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Lys Pro Pro Ala Asn Ala Pro Ser Asp 645 650 655

Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr Gly Tyr Gln Gly Ser Trp 660 665 670

Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly Pro Tyr Thr Leu Yo 675 680 © 685

- Vio —

Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Glu Arg val 690 635 700

Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile Leu Asp Ile Arg 705 710 715 720

Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly Arg Ser Tyr Cys ° 725 730 735

Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Phe Tyr His Asp Arg 740 745 750

Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly Gly Tyr Ser Leu 755 760 765 \

Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly Leu Ala Phe Thr 770 775 780

Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val Val Cys Arg Ser Asn His 785 790 795 800

His Ala Cys Ile Gly Ser 1 Tyr Leu Ser Thr Gln Gln Ala Leu Cys \o 805 810 815

Gly Ser Tyr Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Ser Tyr Gly Phe 820 825 830

Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala Glu Glu Ser Asp 835 840 845 Y.

Val Arg Trp Asp Asn Asn Cys Leu Ala Gly Glu Ile Gly Ala Gly Leu 850 855 860

Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Pro 865 870 875 880

Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu Ser Phe Thr Glu Yo 885 890 895

- ١.1 - “lu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Lys Ser Gly His Leu Leu Asn Leu 900 905 910

Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser Ser Thr His Pro 915 920 925

Asn Lys Tyr Ser Phe Met Ala Ala Tyr Ile Cys Asp Ala Tyr Arg Thr e 930 935 940

Ile Ser Gly Thr Glu Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Glu Thr Trp Thr 945 950 855 960

Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly val val val Arg Gly Ser 965 970 975 ys.

Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu Val Tyr Gly His Gly Arg 980 985 990

Tyr Glu Tyr Arg Asp Ala Ser Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Ala Gly Ser 995 1000 1005

Arg Val Arg Phe \o 1010 <210> SEQ ID NO 3 <211> LENGTH: 20 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. ‏9ص‎ ‎<220> FEATURE: <221> NAME/KEY: SITE <222> LOCATION: 19 <223> OTHER INFORMATION: Xaa=unknown amino acid <400> SEQUENCE: 3 Yo

Glu Ile Met Val Pro Gin Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr val

- VY = 1 5 10 15

Ser Phe Xaa Tyr <210> SEQ ID NO 4 <211> LENGTH: 18 ° <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <220> FEATURE: <221> NAME/KEY: modified base <222> LOCATION: 12, 15 ٠.١ <223> OTHER INFORMATION: n = a, t, ‏,و96‎ or ¢ <400> SEQUENCE: 4 gaaathatgg tnccncaa 18 >210< SEQ ID NO 5 <211> LENGTH: 18 Yo <212> TY?2E: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <220> FEATURE: <221> NAME/KEY: modified base <222> LOCATION: 12, 15 Yo <223> OTHER INFORMATION: n = a, t, g, or c <400> SEQUENCE: 5 gaaathatgg tnccncag 18 <210> SEQ ID NO 6 <211> LENGTH: 18 Yo <212> TYPE: DNA

-— \ ٠ A _

<213> ORGANISM: Chlamydia sp.

<220> FEATURE:

<221> NAME/KEY: modified base

<222> LOCATION: 12, 15

<223> OTHER INFORMATION: n = a, t, g, cr c ‏هه‎ ‎<400> SEQUENCE: 6 gagathatgg tnccncaa 18

<210> SEQ ID NO 7

<211> LENGTH: 18

<212> TYPE: DNA \ <213> ORGANISM: Chlamydia sp.

<220> FEATURE:

<221> NAME/KEY: modified base

<222> LOCATION: 12, 5

<223> OTHER INFORMATION: n = a, t, g, or c Vo <400> SEQUENCE: 7 gagathatgg tnccncag 18

<210> SEQ ID NO 8

<211> LENGTH: 15

<212> TYPE: DNA Yo. <213> ORGANISM: Chlamydia sp.

<220> FEATURE:

<221> NAME/KEY: modified base <222> LOCATION: 1, 7 <223> OTHER INFORMATION: n = a, t, g, or c Yo <400> SEQUENCE: 8

- ١٠.8 -

ngtytcnccr tcata 15 <210> SEQ ID NO 9 <211> LENGTH: 15 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. 0° <220> FEATURE: <221> NAME/KEY: modified base <222> LOCATION: 1, 7 <223> OTHER INFORMATION: n = a, t, g, or c <400> SEQUENCE: 9 Ve ngtytcnccr tcgta 15 <210> SEQ ID NO 10 <211> LENGTH: 1511 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. \o <400> SEQUENCE: 10 gaaatcatgg ttcctcaagg aatttacgat ggggagacgt taactgtatc atttccctat 60 actgttatag gagatccgag tgggactact gttttttctg caggagagtt aacattaaaa 120 aatcttgaca attctattge agctttgect ttaagttgtt ttgggaactt attagggagt 180 tttactgttt tagggagagg acactcgttg actttcgaga acatacggac ttctacaaat 240 Yo ggggcagctc taagtaatag cgctgctgat ggactgttta ctattgaggg ttttaaagaa 300 ttatcctttt ccaattgcaa ttcattactt gccgtactge ctgctgcaac gactaataag 360 ggtagccaga ctccgacgac aacatctaca ccgtctaatg gtactattta ttctaaaaca 420 gatcttttgt tactcaataa tgagaagttc tcattctata gtaatttagt ctctggagat 480 gggggagcta tagatgctaa gagcttaacg gttcaaggaa ttagcaagct ttgtgtcttce 540 Yo caagaaaata ctgctcaagc tgatggggga gcttgtcaag tagtcaccag tttctctget 600

- ١١. - atggctaacg aggctcctat tgcctttgta gcgaatgttg caggagrtaag 29 660 attgctgctg ttcaggatgg gcagcaggga gtgtcatcat ctacttcaac agaagatcca 720 gtagtaagtt tttccagaaa tactgcggta gagtttgatg ggaacgtagc ccgagtagga 780 ggagggattt actcctacgg gaacgttgct ttcctgaata atggaaaaac cttgtttctce 840 aacaatgttg cttctcctgt ttacattgct gctaagcaac caacaagtgg acaggcttct S00 o aatacgagta ataattacygg agatggagga gctatcttct gtaagaatgg tgcgcaagca 960 ggatccaata actctggatc agttteccttt gatggagagg gagtagtttt ctttagtagc 1020 aatgtagctg ctgggaaagg gggagctatt tatgccaaaa agctctcggt tgctaactgt 1080 ggccctgtac aatttttaag gaatatcgct aatgatggtyg gagcgattta tttaggagaa 1140 tctggagagc tcagtttatc tgctgattat ggagatatta ttttcgatgg gaatcttaaa 1200 \ agaacagcca aagagaatgc tgccgatgtt aatggcgtaa ctgtgtcctec acaagccatt 1260 tcgatgggat cgggagggaa aataacgaca ttaagagcta aagcagggca tcagattctc 1320 tttaatgatc ccatcgagat ggcaaacgga aataaccagc cagcgcagtc ttccaaactt 1380

Ctaaaaatta acgatggtga aggatacaca ggggatattg tttttgctaa tggaagcagt 1440 actttgtacc aaaatgttac gatagagcaa ggaaggattg ttcttcegtga aaaggcaaaa 1500 \o ttatcagtga a 1511 <210> SEQ ID NO 11 <211> LENGTH: 1444 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. Yo <400> SEQUENCE: 11 ttctctaagt cagacaggtg ggagtctgta tatggaagct gggagtacat gggattttgt 60 aactccacaa ccaccacaac agcctcctgce cgctaatcag ttgatcacge tttccaatct 120 gcatttgtct ctttcttctt tgttagcaaa caatgcagtt acgaatcctce ctaccaatcce 180 tccagegecaa gattctcatc ctgcagtcat tggtagcaca actgctggtt ctgttacaat 240 Yo tagtgggcct atcttttttyg aggatttgga tgatacagct tatgataggt atgattgget 300

- 1١1١ = aggttctaat caaaaaatca atgtcctgaa attacagtta gggactaage ccccagcectaa 360 tgccccatca gatttgactc tagggaatga gatgcctaag tatggctatc aaggaagctg 420 gaagcttgcg tgggatccta atacagcaaa taatggtcct tatactctga aagctacatyg 480 gactaaaact gggtataatc ctgggcctga gcgagtagct tcectttggttc caaatagttt 540 atggggatcc attttagata tacgatctgc gcattcagca attcaagcaa gtgtggatgg 600 e gcgetcecttat tgtcgaggat tatgggtttce tggagtttcg aatttcttct atcatgaccg 660 cgatgcttta ggtcagggat atcggtatat tagtgggggt tattccttag gagcaaactc 720 ctactttgga tcatcgatgt ttggtctagc atttaccgaa gtatttggta gatctaaaga 780 ttatgtagtg tgtcgttcca atcatcatgc ttgcatagga tccgtttatc tatctaccca 840 acaagcttta tgtggatcct atttgttcgg agatgcgttt atccgtgcta gctacgggtt 900 ٠١ tgggaatcag catatgaaaa cctcatatac atttgcagag gagagcgatg ttcgttggga 360 taataactgt ctggctggag agattggagc gggattaccg attgtgatta ctccatctaa 1020 gctctatttg aatgagttgc gtcctttcgt gcaagctgag ttttcttatg ccgatcatga 1080 atcttttaca gaggaaggcg atcaagctcg ggcattcaag agcggacatc tcctaaatct 1140 atcagttcct gttggagtga agtttgatcg atgttctagt acacatccta ataaatatag 1200 \o ctttatggcg gcttatatct gtgatgctta tcgcaccatc tctggtactg agacaacget 1260 cctatcccat caagagacat ggacaacaga tgcctttcat ttagcaagac atggagttgt 1320 ggttagagga tctatgtatg cttctctaac aagtaatata gaagtatatg gccatggaag 1380 atatgagtat cgagatgctt ctcgaggcta tggtttgagt gcaggaagta gagtccggtt 1440 ctaa 1444 Ye. <210> SEQ ID NO 12 <211> LENGTH: 56 <212> TYPE: DNA Yo <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 12 aagggcccaa ttacgcagag ggtaccgaaa ttatggttcce tcaaggaatt tacgat 56 <210> SEQ ID NO 3 <211> LENGTH: 56 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. 0 <400> SEQUENCE: 3 aagggcccaa ttacgcagag ggtaccctaa gaagaaggca tgccgtgceta gcggag 56 <210> SEQ ID NO 14 <211> LENGTH: 57 <212> TYPE: DNA ٠١ <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 14 aagggcccaa ttacgcagag ggtaccggag agctcgcgaa tccatacgaa taggaac 57 <210> SEQ ID NO 15 <211> LENGTH: 1013 Vo <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 15

Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu Ser Met Ile Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Yo

Ser Cys Cys Ser Leu Asn Gly Gly Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met val

Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr

Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe Ser Ala Gly Glu Yo 60

= ١١7 -

Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Leu Pro Leu Ser 65 70 75 80

Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr val Leu Gly Arg Gly His 85 90 95

Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala Leu ° 100 105 110

Ser Asp Ser Ala Asn Ser Gly Leu Phe Thr Ile Glu Gly Phe Lys Glu 115 120 125

Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Pro Leu Leu Ala Val Leu Pro Ala Ala 130 135 140 yo.

Thr Thr Asn Asn Gly Ser Gln Thr Pro Ser Thr Thr Ser Thr Pro Ser 145 150 155 160

Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu Leu Asn Asn Glu 165 170 175

Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Ser val Ser Gly Asp Gly Gly Ala Ile \o 180 185 190

Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile ser Lys Leu Cys Val Phe 195 200 205

Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys Gln Val val Thr 210 215 220 Yo

Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro Ile Ala Phe Val Ala Asn 225 230 235 240

Val Ala Gly val Arg Gly Gly Gly Ile Ala Ala val Gln Asp Gly Gln 245 250 255

Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro Val Val Ser Phe Yo 260 265 270

- ل ‎Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val Ala Arg Val Gly‏ 285 280 275 ‎Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu Asn Asn Gly Lys‏ 300 295 290 ‎Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro Val Tyr Ile Ala Ala Glu o‏ 320 315 310 305 ‎Gln Pro Thr Asn Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asp Asn Tyr Gly Asp‏ 335 330 325 ‎Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala Ala Gly Ser Asn‏ ‎Vo‏ 350 345 340 ‎Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val Val Phe Phe Ser‏ 365 360 355 ‎Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Lys Lys Leu‏ 380 375 370 ‎Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Leu Leu Gly Asn Ile Ala Asn \o‏ 400 395 390 385 ‎Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser‏ 415 410 405 ‎Ala Asp Tyr Gly Asp Met Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala‏ ‎Yo‏ 430 425 420 ‎Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Gln Ala‏ 445 440 435 ‎Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala‏ 460 455 450 ‎Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn Yo‏ 480 475 470 465

- ١١و‎ —

Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Glu Pro Leu Lys Ile Asn Asp Gly Glu 485 490 495

Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Asn Ser Thr Leu Tyr 500 505 510

Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala ° 515 520 525

Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met 530 535 540

Glu Ala Gly Ser Thr Leu Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln 545 550 555 560 \

Pro Pro Ala Ala Asn Gln Ser Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser 565 570 575

Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro Pro Thr Asn 580 585 590

Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala Vo 595 600 605

Gly Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp 610 615 620

Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asp 625 630 635 640 Ve

Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Gln Pro Pro Ala Asn Ala Pro Ser 645 650 655

Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr Gly Tyr Gln Gly Ser 660 665 670

Trp Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly Pro Tyr Thr Yo 675 680 685

- ١١1 -

Leu Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Glu Arg 690 695 700

Val Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile Leu Asp Ile 705 710 715 720

Arg Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly Arg Ser Tyr e 725 730 735

Cys Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Phe Tyr His Asp 740 745 750

Arg Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly Gly Tyr Ser 755 760 765 ١

Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly Leu Ala Phe 770 775 780

Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val Val Cys Arg Ser Asn 785 790 795 800

His His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Thr Lys Gln Ala Leu Vo 805 810 815

Cys Gly Ser Tyr Val Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Ser Tyr Gly 820 825 830

Phe Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala Glu Glu Ser 835 840 845 Yo

Asp Val Cys Trp Asp Asn Asn Cys Leu Val Gly Glu Ile Gly Val Gly 850 855 860

Leu Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Arg 865 870 875 880

Pro Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu Ser Phe Thr Yo 885 890 895

- ١١97 -

Glu Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Arg Ser Gly His Leu Met Asn 900 305 910

Leu Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser Ser Thr His 915 920 925

Pro Asn Lys Tyr Ser Phe Met Gly Ala Tyr Ile Cys Asp Ala Tyr Arg © 930 935 940

Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Glu Thr Trp 945 950 955 960

Thr Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly Val Ile Val Arg Gly 965 970 975 ١

Ser Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu Val Tyr Gly His Gly 980 985 990

Arg Tyr Glu Tyr Arg Asp Thr Ser Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Ala Gly 995 1000 1005

Ser Lys Val Arg Phe \o 1010 <210> SEQ ID NO 16 <211> LENGTH: 1013 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. Ye <400> SEQUENCE: 16

Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu Ser Met Ile Leu Ala Tyr 1 5 10 15

Ser Cys Cys Ser Leu Thr Gly Gly Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met Val

Yo

Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr

- YYA -

Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe Ser Ala Gly Glu 60

Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Leu Pro Leu Ser 65 70 75 80 °

Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu Gly Arg Gly His 85 90 95

Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala Leu 100 105 110

Ser Asp Ser Ala Asn Ser Gly Leu Phe Thr Ile Glu Gly Phe Lys Glu yo 115 120 125

Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu Ala Val Leu Pro Ala Ala 130 135 140

Thr Thr Asn Asn Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Ser Thr Pro Ser 145 150 155 160 \o

Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu Leu Asn Asn Glu 165 170 175

Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Gly Asp Gly Gly Thr Ile 180 185 190

Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile Ser Lys Leu Cys Val Phe Yo 195 200 205

Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys Gln Val Val Thr 210 215 220

Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro Ile Ala Phe Ile Ala Asn 225 230 235 240 Yo

Val Ala Gly Val Arg Giy Gly Gly Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Gln

- ١١8ق-‎ 250 255

Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro Val Val Ser Phe 260 265 270

Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val Ala Arg Val Gly 275 280 285 °

Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu Asn Asn Gly Lys 290 295 300

Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro Val Tyr Ile Ala Ala Glu 305 310 315 320

Gln Pro Thr Asn Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asp Asn Tyr Gly Asp \ 325 330 335

Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala Ala Gly Ser Asn 340 345 350

Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val Val Phe Phe Ser 355 360 365 \o

Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Lys Lys Leu 370 375 380

Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Gly Asn Ile Ala Asn 385 390 395 400

Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser ‏بن‎ ‎405 410 415

Ala Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala 420 425 430

Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Gln Ala 435 440 445 Yo

Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala

_ \ Y . — 450 455 460

Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn 465 470 475 480

Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Glu Pro Leu Lys Ile Asn Asp Gly Glu 485 490 495 5

Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Asn Ser Thr Leu Tyr 500 505 510

Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala 515 520 525

Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met \ 530 535 540

Glu Ala Gly Ser Thr Leu Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln 545 550 555 560

Pro Pro Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser 565 570 575 Vo . Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro Pro Thr Asn 580 585 590

Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala 595 600 605

Gly Pro Val Thr Ile Ser Gly Pro Phe Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp A 610 615 620

Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asp 625 630 635 640

Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Gln Pro Ser Ala Asn Ala Pro Ser 645 650 655 Yo

Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr Gly Tyr Gln Gly Ser

660 665 670

Trp Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly Pro Tyr Thr 675 680 685

Leu Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Glu Arg 690 695 700 ٠ val Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile Leu Asp Ile 705 710 715 720

Arg Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly Arg Ser Tyr 725 730 735

Cys Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Ser Tyr His Asp \ 740 745 750

Arg Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly Gly Tyr Ser 755 760 765

Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly Leu Ala Phe 770 775 780 Vo

Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val Val Cys Arg Ser Asn 785 790 795 800

His His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Thr Lys Gln Ala Leu

Ya 805 810 815

Cys Gly Ser Tyr Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Ser Tyr Gly 820 825 830

Phe Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala Glu Glu Ser 835 840 845 Yo

Asp Val Arg Trp Asp Asn Asn Cys Leu Val Gly Glu Ile Gly Val Gly 850 855 860

- ١77 -

Leu Pro Ile Val Thr Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Arg 865 870 875 880

Pro Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu Ser Phe Thr 885 80 895

Glu Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Arg Ser Gly His Leu Met Asn 0 900 905 910

Leu Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser Ser Thr His 915 920 925

Pro Asn Lys Tyr Ser Phe Met Gly Ala Tyr Ile Cys Asp Ala Tyr Arg 930 935 940 ٠

Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Glu Thr Trp 945 950 955 960

Thr Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly Val Ile Val Arg Gly 965 970 975

Ser Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu 1 Tyr Gly His Gly \o 980 985 990

Arg Tyr Glu Tyr Arg Asp Thr Ser Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Ala Gly 995 1000 1005

Ser Lys Val Arg Phe 1010 7 <210> SEQ ID NO 17 <211> LENGTH: 505 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 17 Yo

Glu Ile Met Val Pro Gln Gly Tle Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val

- YY - 1 5 10 15

Ser Phe Pro Tyr Thr val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr val Phe

Ser Ala Gly Glu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala °

Leu Pro Leu Ser Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu 60

Gly Arg Gly His Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn 65 70 75 80

Gly Ala Ala Leu Ser Asn Ser Ala Ala Asp Gly Leu Phe Thr Ile Glu Ve 85 90 95

Gly Phe Lys Glu Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu Ala val 100 105 110

Leu Pro Ala Ala Thr Thr Asn Lys Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr 115 120 125 Yo

Ser Thr Pro Ser Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu 130 135 140

Leu Asn Asn Glu Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Gly Asp 145 150 155 160

Gly Gly Ala Ile Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile Ser Lys Yo 165 170 175

Leu Cys Val Phe Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys 180 185 190

Gln Val val Thr Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro Ile Ala 195 200 205 Yo

Phe Val Ala Asn Val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly Ile Ala Ala 1

- ١74 - 210 215 220

Gln Asp Gly Gln Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro 225 230 235 240 val Val Ser Phe Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val 245 250 255 °

Ala Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu 260 265 270

Asn Asn Gly Lys Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro Val Tyr 275 280 285

Ile Ala Ala Lys Gln Pro Thr Ser Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asn \ 290 295 300

Asn Tyr Gly Asp Gly Gly Ala Ile Pre Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala 305 310 315 320

Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val val 325 330 335 \o

Phe Phe Ser Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Ala 340 345 350

Lys Lys Leu Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Arg Asn 355 360 365

Ile Ala Asn Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Yo 370 375 380

Ser Leu Ser Ala Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys 385 390 395 400

Arg Thr Ala Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr Val Ser 405 410 415 Yo

Ser Gln Ala Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg

- \Yo - 420 425 430

Ala Lys Ala Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala 435 440 445

Asn Gly Asn Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu Leu Lys Ile Asn 450 455 460 0

Asp Gly Glu Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Ser Ser 465 470 475 480

Thr Leu Tyr Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg 485 490 495

Glu Lys Ala Lys Leu Ser Val Asn Ser \ 500 505 <210> SEQ ID NO 18 <211> LENGTH: 57 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. \o <400> SEQUENCE: 18 aagggcccaa ttacgcagag ctcgagagaa attatggttc ctcaaggaat ttacgat 57 <210> SEQ ID NO 9 <211> LENGTH: 20 <212> TYPE: DNA Ve <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 19 cgctctagaa ctagtggatc 20 <210> SEQ ID NO 20 <211> LENGTH: 22 Yo <212> TYPE: DNA

- Yl -

<213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 20 atggttcctc aaggaattta cg 22 <210> SEQ ID NO 21 <211> LENGTH: 19 ° <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 21 ggtcccccat cagcgggag 19 <210> SEQ ID NO 22 ٠٠١ <211> LENGTH: 1515 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 22 gaaatcatgg ttcctcaagg aatttacgat ggggagacgt taactgtatc atttccctat 60 \o actgttatag gagatccgag tgggactact gttttttctg caggagagtt aacattaaaa 120 aatcttgaca attctattgc agctttgcecct ttaagttgtt ttgggaactt attagggagt 180 tttactgttt tagggagagg acactcgttg actttcgaga acatacggac ttctacaaat 240 ggggcagctc taagtaatag cgctgctgat ggactgttta ctattgaggg ttttaaagaa 300 ttatcctttt ccaattgcaa ttcattactt gcoccgtactgc ctgctgcaac gactaataag 360 Yo ggtagccaga ctccgacgac aacatctaca ccgtctaatg gtactattta ttctaaaaca 420 gatcttttgt tactcaataa tgagaagttc tcattctata gtaatttagt ctctggagat 480 gggggagcta tagatgctaa gagcttaacg gttcaaggaa ttagcaagct ttgtgtctte 540 caagaaaata ctgctcaagc tgatggggga gcttgtcaag tagtcaccag tttctctget 600 atggctaacg aggctcctat tgcctttgta gcgaatgttg caggagtaag agggggaggg 660 Yo attgctgctg ttcaggatgg gcagcaggga gtgtcatcat ctacttcaac agaagatcca 720

- ١7ال-‎ gtagtaagtt tttccagaaa tactgcggta gagtttgatg ggaacgtagc ccgagtagga 780 ggagggattt actcctacgg gaacgttgct ttcctgaata atggaaaaac cttgtttctc 840 aacaatgttg cttctcctgt ttacattgct gctaagcaac caacaagtgg acaggcttct 900 aatacgagta ataattacgg agatggagga gctatcttct gtaagaatgg tgcgcaagca 960 ggatccaata actctggatc agtttccttt gatggagagg gagtagtttt ctttagtagce 1020 ° aatgtagctg ctgggaaagg gggagctatt tatgccaaaa agctctcggt tgctaactgt 1080 ggccctgtac aatttttaag gaatatcgcect aatgatggtg gagcgattta tttaggagaa 11490 tctggagagc tcagtttatc tgctgattat ggagatatta ttttcgatgg gaatcttaaa 1200 agaacagcca aagagaatgc tgccgatgtt aatggcgtaa ctgtgtcctc acaagccatt 1260 tcgatgggat cgggagggaa aataacgaca ttaagagcta aagcagggca tcagattctc 1320 Ye tttaatgatc ccatcgagat ggcaaacgga aataaccagc cagcgcagtc ttccaaactt 1380 ctaaaaatta acgatggtga aggatacaca ggggatattg tttttgctaa tggaagcagt 1440 actttgtacc aaaatgttac gatagagcaa ggaaggattg ttcttcgtga aaaggcaaaa 1500 ttatcagtga attct 1515 <210> SEQ ID NO 23 \o <211> LENGTH: 3354 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Description of Artificial Sequence: Yo

Recombinant

Expression Vector <400> SEQUENCE: 23 atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60 ttaaatgggg gggggtatgc agaaatcatg gttcctcaag gaatttacga tggggagacg 120 Yo ttaactgtat catttcccta tactgttata ggagatccga gtgggactac tgttttttet 180

- ١٠١ - gcaggagagt taacgttaaa aaatcttgac aattctattg cagctttgec tttaagttgt 240 tttgggaact tattagggag ttttactgtt ttagggagag gacactcgtt gactttcgag 300 aacatacgga cttctacaaa tggagctgca ctaagtgaca gcgctaatag cgggttattt 360 actattgagg gttttaaaga attatctttt tccaattgca acccattact tgccgtactg 4290 cctgctgcaa cgactaataa tggtagccag actccgtcga caacatctac accgtctaat 480 ° ggtactattt attctaaaac agatcttttg ttactcaata atgagaagtt ctcattctat 540 agtaattcag tctctggaga tgggggagct atagatgcta agagcttaac ggttcaagga 600 attagcaagc tttgtgtctt ccaagaaaat actgctcaag ctgatggggg agcttgtcaa 660 gtagtcacca gtttctctgc tatggctaac gaggctccta ttgecctttgt agcgaatgtt 720 gcaggagtaa gagggggagg gattgctgct gttcaggatg ggcagcaggg agtgtcatca 780 \ tctacttcaa cagaagatcc agtagtaagt ttttccagaa atactgcggt agagtttgat 840 gggaacgtag cccgagtagg aggagggatt tactcctacg ggaacgttgc tttcctgaat 900 aatggaaaaa ccttgtttct caacaatgtt gcttctcctg tttacattgc tgctgagcaa 960 ccaacaaatg gacaggcttc taatacgagt gataattacg gagatggagg agctatcttc 1020 tgtaagaatg gtgcgcaagc agcaggatcc aataactctg gatcagtttc ctttgatgga 1080 Vo gagggagtag ttttctttag tagcaatgta gctgctggga aagggggagc tatttatgee 1140 aaaaagctct cggttgctaa ctgtggccct gtacaactct tagggaatat cgctaatgat 1200 ggtggagcga tttatttagg agaatctgga gagctcagtt tatctgctga ttatggagat 1260 atgattttcg atgggaatct taaaagaaca gccaaagaga atgctgccga tgttaatggce 1320 gtaactgtgt cctcacaagc catttcgatyg ggatcgggag ggaaaataac gacattaaga 1380 9 gctaaagcag ggcatcagat tctctttaat gatcccatcg agatggcaaa cggaaataac 1440 cagccagcgc agtcttccga acctctaaaa attaacgatg gtgaaggata cacaggggat 1500 attgtttttyg ctaatggaaa cagtactttg taccaaaatg ttacgataga gcaaggaagg 1560 attgttcttc gtgaaaaggc aaaattatca gtgaattctc taagtcagac aggtgggagt 1626 ctgtatatgg aagctgggag tacattggat tttgtaactc cacaaccacc acaacagcct 1680 Yo cctgecgeta atcagtcgat cacgcectttcecc aatctgcatt tgtctecttte ttctttgtta 1740

- \va- gcaaacaatg cagttacgaa 026024-06 aatcctccag cgcaagatzc tcatcctgca 1800 gtcattggta gcacaactgc tggttctgtt acaattagtg ggcctatctt ttttgaggat 1860 ttggatgata cagcttatga taggtatgat tggctaggtt ctaatcaaaa aatcgatgtc 1920 ctgaaattac agttagggac tcagccccca gctaatgccce catcagattt gactctaggg 1980 aatgagatgc ctaagtatgg ctatcaagga agctyggaagc ttgcgtggga tcctaataca 2040 ° gcaaataatg gtccttatac tctgaaagct acatggacta aaactgggta taatcctggg 2100 cctgagcgag tagcttcttt ggttccaaat agtttatggg gatccatttt agatatacga 2160 tctgcgecatt cagcaattca agcaagtgtg gatgggcgct cttattgtcg aggattatgg 2220 gtttctggag tttcgaattt cttctatcat gaccgcgatg ctttaggtca gggatatcgg 2280 tatattagtg ggggttattc cttaggagca aactcctact ttggatcatc gatgtttggt 2340 \ oe ctagcattta ctgaagtatt tggtagatct aaagattatg tagtgtgtcg ttccaatcat 2400 catgcttgca taggatccgt ttatctatct accaaacagg ctttatgtgg atcttatgtyg 2460 tttggagatg cgtttattcyg tgctagctac gggtttggga atcagcatat gaaaacctca 2520 tatacatttg cagaggagag cgatgtttgt tgggataata actgtctggt tggagagatt 2580 ggagtgggat taccgattgt gattactcca tctaagctct atttgaatga gttgcgtcect 2640 \o ttcgtgcaag ctgagttttc ttatgccgat catgaatctt ttacagagga aggcgatcaa 2700 gctcgggeat tcaggagtgg acatctcatg aatctatcag ttcctgttgg agtaaaattt 2760 gatcgatgtt ctagtacaca ccctaataaa tatagcttta tgggggctta tatctgtgat 2820 gcttatcgeca ccatctctgg gactcagaca acactcctat cccatcaaga gacatggaca 2880 acagatgcct ttcatttggce aagacatgga gtcatagtta gagggtctat gtatgettct 2940 Y. ctaacaagca atatagaagt atatggccat ggaagatatg agtatcgaga tacttctcga 3000 ggttatggtt tgagtgcagg aagtaaagtc cggttctaaa aatattggtt agatagttaa 3060 gtgttagcga tgccttttte tttgagatct acatcatttt gttttttage ttgtttgtgt 3120 tcctattcgt atggattcge gagctctecct caagtgttaa cacctaatgt aaccactcect 3180 tttaaggggg acgatgttta cttgaatgga gactgcgctt ttgtcaatgt ctatgcaggg 3240 Yo gcagagaacg gctcaattat ctcagctaat ggcgacaatt taacgattac cggacaaaac 3300

- AY. - catacattat catttacaca ttctcaaggg ccagttcttc aaaattagcec ttca 3354 <210> SEQ ID NO 24 <211> LENGTH: 3324 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence ° <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Description of Artificial Sequence:

Recombinant

Expression Vector <400> SEQUENCE: 24 \ atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60 ttaagtgggg gggggtatgc agcagaaatc atgattcctc aaggaattta cgatggggag 120 acgttaactg tatcatttcc ctatactgtt ataggagatc cgagtgggac tactgttrte 180 tctgcaggag agttaacgtt aaaaaatctt gacaattcta ttgcagcttt gcctttaagt 240 tgttttggga acttattagg gagttttact gttttaggga gaggacactc gttgactttce 300 \o gagaacatac ggacttctac aaatggagct gcactaagtg acagcgctaa tagcgggtta 360 tttactattg agggttttaa agaattatct ttttccaatt gcaactcatt acttgccgta 420 ctgcctgctg caacgactaa taatggtagce cagactccga cgacaacatc tacaccgtct 480 aatggtacta tttattctaa aacagatctt ttgttactca ataatgagaa gttctcattc 540 tatagtaatt tagtctctgg agatggggga actatagatg ctaagagett aacggttcaa 600 9 ggaattagca agctttgtgt cttccaagaa aatactgctc aagctgatgg gggagcttgt 660 caagtagtca ccagtttctc tgctatgget aacgaggcte ctattgcctt tatagcgaat 720 gttgcaggag taagaggggg agggattgct gctgttcagg atgggcagea gggagtgtca 780 tcatctactt caacagaaga tccagtagta agtttttcca gaaatactgc ggtagagttt 840 gatgggaacg tagceccgagt aggaggaggyg atttactcct acgggaacgt ‏ومو‎ 900 Yo aataatggaa aaaccttgtt tctcaacaat gttgettctc ctgtttacat tgctgctgag 960

- ١7١ - caaccaacaa atggacaggc ttctaatacg agtgataatt acggagatgg aggagctatc 1020 ttctgtaaga atggtgcgca agcagcagga tccaataact ctggatcagt ttcctttgat 1080 ggagagggag tagttttctt tagtagcaat gtagctgctg ggaaaggggg agctatttat 1140 gccaaaaagc tctcggttge taactgtggce cctgtacaat tcttagggaa tatcgctaat 1200 gatggtggag cgatttattt aggagaatct ggagagctca gtttatctgc tgattatgga 1260 ° gatattattt tcgatgggaa tcttaaaaga acagccaaag agaatgctgc cgatgttaat 1320 ggcgtaactg tgtcctcaca agccatttcg atgggatcgg gagggaaaat aacgacatta 1380 agagctaaag cagggcatca gattctcttt aatgatccca tcgagatggc aaacggaaat 1440 aaccagccag cgcagtcttc cgaacctcta aaaattaacg atggtgaagg atacacaggg 1500 gatattgttt ttgctaatgg aaacagtact ttgtaccaaa atgttacgat agagcaagga 1560 ٠١ aggattgttc ttcgtgaaaa ggcaaaatta tcagtgaatt ctctaagtca gacaggtggg 1620 agtctgtata tggaagctgg gagtacattg gattttgtaa ctccacaacc accacaacag 1680 cctcctgeecg ctaatcagtt gatcacgcectt tccaatctge atttgtctet ttcttcectttg 17490 ttagcaaaca atgcagttac gaatcctcct accaatcctc cagcgcaaga ttctcatcct 1800 \o gcagtcattg gtagcacaac tgctggtcct gtcacaatta gtgggecttt cttttttgag 1860 gatttggatyg atacagctta tgataggtat gattggctag gttctaatca aaaaatcgat 1920 gtcctgaaat tacagttagg gactcagccc tcagctaatg ccccatcaga tttgactcta 1280 gggaatgaga tgcctaagta tggctatcaa ggaagctgga agcttgcgtg ggatcctaat 2040 ‏.ص‎ ‎acagcaaata atggtcctta tactctgaaa gctacatgga ctaaaactgg gtataatcct 2100 gggcctgagc gagtagcttc tttggttcca aatagtttat ggggatccat tttagatata 2160 cgatctgcge attcagcaat tcaagcaagt gtggatgggce gctcttattg tcgaggatta 2220 tgggtttctg gagtttcgaa tttctcctat catgaccgceg atgctttagg tcagggatat 2280 cggtatatta gtgggggtta ttccttagga gcaaactecct actttggatc atcgatgttt 2340 Yo ggtctagcat ttaccgaagt atttggtaga tctaaagatt atgtagtgtg tcgttccaat 2400 catcatgctt gcataggatc cgtttatcta tctaccaaac aagctttatg tggatcctat 2460 ttgttcggag atgcgtttat ccgtgctagc tacgggtttyg ggaaccagca tatgaaaacc 2520 tcatacacat ttgcagagga gagcgatgtt cgttgggata ataactgtct ggttggagag 2580 attggagtgg gattaccgat tgtgactact ccatctaagce tctatttgaa tgagttgcgt 2640 cctttecgtge aagctgagtt ttcttatgecc gatcatgaat cttttacaga ggaaggcgat 2700 caagctcggg cattcaggag tggtcatctc atgaatctat cagttcctgt tggagtaaaa 2760 ° tttgatcgat gttctagtac acaccctaat aaatatagct ttatgggggc ttatatctgt 2820 gatgcttatc gcaccatctc tgggactcag acaacactcc tatcccatca agagacatgg 2880 acaacagatg cctttcattt ggcaagacat ggagtcatag ttagagggtc tatgtatgcet 2940 tctctaacaa gcaatataga agtatatggc catggaagat atgagtatcg agatacttct 3000 cgaggttatg gtttgagtgc aggaagtaaa gtccggttct aaaaatattg gttagatagt 3060 \ taagtgttag cgatgccttt ttctttgaga tctacatcat tttgtttttt agcttgtttg 3120 tgttcctatt cgtatggatt cgcgagctct cctcaagtgt taacacctaa tgtaaccact 3180 ccttttaagyg gggacgatgt ttacttgaat ggagactgcg ctttagtcaa tgtctatgca 3240 ggggcagaga acggctcaat tatctcagct aatggcgaca atttaacgat taccggacaa 3300 aaccatgcat tatcatttac agat 3324 \o <210> SEQ ID NO 25 <211> LENGTH: 65 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 25 Yo.

Pro Tyr Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe Ser Ala 1 5 10 15

Gly Glu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Pro Leu

Ser Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu Gly Arg Gly Yo

His Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala 50 55 60

Leu 65 <210> SEQ ID NO 26 0 <211> LENGTH: 24 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 26

Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser Leu Ser \ 1 5 10 15

Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val <210> SEQ ID NO 27 <211> LENGTH: 8 Yo <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 27

Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe 1 5 Yo. <210> SEQ ID NO 28 <211> LENGTH: 7 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 28 Yo

Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp

- ١١7 - 1 5 >210< SEQ ID NO 9 <211> LENGTH: 63 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. ° <400> SEQUENCE: 29

Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met Val Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu 1 5 10 15

Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly yo

Thr Thr Val Phe Ser Ala Gly Glu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn

Ser Ile Ala Ala Leu Pro Leu Ser Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly 60 <210> SEQ ID NO 30 \o <211> LENGTH: 22 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 30

Met Ala Asn Gly Asn Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu Leu Lys Yo. 1 5 10 15

Ile Asn Asp Gly Glu Gly 20 <210> SEQ ID NO 31 <211> LENGTH: 14 Yo <212> TYPE: PRT

~- \Ye - <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 31

Ala Asn Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Gln Asn val Thr Ile Glu 1 5 10 <210> SEQ ID NO 32 0 <211> LENGTH: 10 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp- <400> SEQUENCE: 32

Lys Leu Ser Val Asn ser Leu Ser Gln Thr ١ 1 5 10 >21 0< SEQ ID NO 33 <211> LENGTH: 45 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. Vo <400> SEQUENCE: 33 val Ile Gly Ser Thr Thr Ala Gly Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile 1 5 10 15

Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu

Yo

Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asn Val Leu Lys Leu Gln Leu <210> SEQ ID NO 34 <211> LENGTH: 4 <212> TYPE: PRT Yo . <213> ORGANISM: Chlamydia sp.

- yr - <400> SEQUENCE: 4

Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala Gly Ser val Thr Ile Ser Gly Pro Ile 1 5 10 15

Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu °

Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asn Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Lys

Pro Pro Ala Asn Ala Pro Ser Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro 60 <210> SEQ ID NO 35 ٠ <211> LENGTH: 10 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 35

Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly Pro Tyr \o 1 5 10 <210> SEQ ID NO 36 <211> LENGTH: 458 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. Yo <400> SEQUENCE: 36

Gly Gly Ala Cys Gln Val Val Thr Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu 1 5 10 15

Ala Pro Ile Ala Phe Val Ala Asn Val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly 20 25 30 Yo

Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Gln Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser

- YY -

Thr Glu Asp Pro Val val Ser Phe Ser Arg Asn Thr Ala 1 Glu Phe 60

Asp Gly Asn Val Ala Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn 65 70 75 80 5

Val Ala Phe Leu Asn Asn Gly Lys Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala 85 90 95

Ser Pro Val Tyr Ile Ala Ala Lys Gln Pro Thr Ser Gly Gln Ala Ser 100 105 110

Asn Thr Ser Asn Asn Tyr Gly Asp Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn ٠١ 115 1250 125

Gly Ala Gln Ala Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly 130 135 140

Glu Gly val Val Phe Phe Ser Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly 145 150 155 160 Vo

Ala Ile Tyr Ala Lys Lys Leu Ser 731 Ala Asn Cys Gly Pro val Gln 165 170 175

Phe Leu Arg Asn Ile Ala Asn Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu 180 185 190

Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser Ala Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp 9 195 200 205

Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly 210 215 220

Val Thr Val Ser Ser Gln Ala Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile 225 230 235 240 Yo

Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro

= ١7م0‎ 250 255

Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu 260 265 270

Leu Lys Ile Asn Asp Gly Glu Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala 275 280 285 °

Asn Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg 290 295 300

Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln 305 310 315 320

Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met Glu Ala Gly Ser Thr Trp Asp Phe Val \ 325 330 335

Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr 340 345 350

Leu Ser Asn Leu His Leu Ser Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala 355 360 365 \o

Val Thr Asn Pro Pro Thr Asn Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala 370 375 380

Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala Gly Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile 385 390 395 400

Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Yo 405 410 415

Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asn Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Lys 420 425 430

Pro Pro Ala Asn Ala Pro Ser Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro 435 440 445 Yo

Lys Tyr Gly Tyr Gln Gly Ser Trp Lys Leu

- Avs - 450 455 >210< SEQ ID NO 7 <211> LENGTH: 325 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. 0 <400> SEQUENCE: 7

Leu Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Glu Arg 1 5 10 15 val Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile Leu Asp Ile ٠١

Arg Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly Arg Ser Tyr

Cys Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Phe Tyr His Asp | 55 60

Arg Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly Gly Tyr Ser \o 65 70 75 80

Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly Leu Ala Phe 85 90 95

Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val val Cys Arg Ser Asn 100 105 110 Yo

His His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Thr Gln Gln Ala Leu 115 120 125

Cys Gly Ser Tyr Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Ser Tyr Gly 130 135 140

Phe Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala Glu Glu Ser Yo 145 150 155 160

- ١م.‎

Asp Val Arg Trp Asp Asn Asn Cys Leu Ala Gly Glu Ile Gly Ala Gly 165 170 175

Leu Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Arg 180 185 190

Pro Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu Ser Phe Thr ٠ 195 200 205

Glu Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Lys Ser Gly His Leu Leu Asn 210 215 220

Leu Ser val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser Ser Thr His 225 230 235 240 ٠١

Pro Asn Lys Tyr Ser Phe Met Ala Ala Tyr Ile Cys Asp Ala Tyr Arg 245 250 255

Thr Ile Ser Gly Thr Glu Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Glu Thr Trp 260 265 270

Thr Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly Val Val Val Arg Gly \o 275 280 285

Ser Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu Val Tyr Gly His Gly 290 295 300

Arg Tyr Glu Tyr Arg Asp Ala Ser Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Ala Gly 305 310 315 320 Yo

Ser Arg Val Arg Phe 325 <210> SEQ ID NO 38

SEQUENCE: 38 000 3 Yo <210> SEQ ID NO 39

- VEY - <211> LENGTH: <212> TYPE: <213> ORGANISM: <400> SEQUENCE: 39 000 © <210> SEQ ID NO 40 <211> LENGTH: <212> TYPE: <213> ORGANISM: <400> SEQUENCE: 40 ٠١ 000 <210> SEQ ID NO 41 <211> LENGTH: Vo <212> TYPE: <213> ORGANISM: <400> SEQUENCE: 41 000 <210> SEQ ID NO 42 ‏ص‎ ‎<211> LENGTH: 6 <212> TYPE: PRT <213>0RGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 42

Glu Ile Met Val Pro Gln Yo 1 5 ٍ <210> SEQ ID NO 3

- ١47 - >211< LENGTH: 4 <212> TYPE: PRT <213> ORGANISM: Chlamydia sp. <400> SEQUENCE: 43

Glu Ile Met Val Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr val ° 1 5 10 15

Ser Phe Pro Tyr Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe

Ser Ala Gly Glu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala \

Leu Pro Leu Ser Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu 60

Gly Arg Gly His Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn 65 70 75 80

Gly Ala Ala Leu Ser Asn Ser Ala Ala Asp Gly Leu Phe Thr Ile Glu yo 85 90 95

Gly Phe Lys Glu Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu Ala Val 100 105 110

Leu Pro Ala Ala Thr Thr Asn Lys Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr 115 120 125 Yo

Ser Thr Pro Ser Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu 130 135 140

Leu Asn Asn Glu Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Gly Asp 145 150 155 160

Gly Gly Ala Ile Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile Ser Lys Yo 165 170 175

- ١27 -

Leu Cys Val Phe Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys 180 185 190

Gln Val Val Thr Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro Ile Ala 195 200 205

Phe Val Ala Asn Val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly Ile Ala Ala Val > 210 215 220

Gln Asp Gly Gln Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro 225 230 235 240

Val Val Ser Phe Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val 245 250 255 Vo

Ala Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu 260 265 270

Asn Asn Gly Lys Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro Val Tyr 275 280 285

Ile Ala Ala Lys Gln Pro Thr Ser Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asn \o 290 295 300

Asn Tyr Gly Asp Gly Gly Ala Tle Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala 305 310 315 320

Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val 1 325 330 335 Yo

Phe Phe Ser Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Ala 340 345 350

Lys Lys Leu Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Arg Asn 355 360 365

Ile Ala Asn Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Yo 370 375 380

- Vie =

Ser Leu Ser Ala Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys 385 390 395 400

Arg Thr Ala Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr val Ser 405 410 415

Ser Gln Ala Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg 0° 420 425 430

Ala Lys Ala Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala 435 440 445

Asn Gly Asn Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu Leu Lys Ile Asn 450 455 460 ٠٠١

Asp Gly Glu Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Ser Ser 465 470 475 480

Thr Leu Tyr Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg 485 490 495

Glu Lys Ala Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Yo 500 505 510

Leu Tyr Met Glu Ala Gly Ser Thr Trp Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro 515 520 525

Pro Gln Gln Pro Pro Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser Asn Leu 530 535 540 Ya

His Leu Ser Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro 545 550 555 560

Pro Thr Asn Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly Ser 565 570 575

Thr Thr Ala Gly Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile Phe Phe Glu Asp Yo 580 585 590

- Vie —

Leu Asp Asp Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn Gln 5385 600 605

Lys Ile Asn Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Lys Pro Pro Ala Asn 610 615 620

Ala Pro Ser Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr Gly Tyr ° 625 630 635 640

Gln Gly Ser Trp Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly 645 650 655

Pro Tyr Thr Leu Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly 660 665 670 ٠١

Pro Glu Arg Val Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile 675 680 685

Leu Asp Ile Arg Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly 690 695 700

Arg Ser Tyr Cys Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Phe Vo 705 710 715 720

Tyr His Asp Arg Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly 725 730 735

Gly Tyr Ser Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly 740 745 750 Ye

Leu Ala Phe Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val 1 Cys 755 760 765

Arg Ser Asn His His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Thr Gln 770 775 780

Gln Ala Leu Cys Gly Ser Tyr Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Yo 785 790 795 800

- ١27 -

Ser Tyr Gly Phe Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala 805 810 815

Glu Glu Ser Asp Val Arg Trp Asp Asn Asn Cys Leu Ala Gly Glu Ile 820 825 830

Gly Ala Gly Leu Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn ° 835 840 845

Glu Leu Arg Pro Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu 850 855 86Q

Ser Phe Thr Glu Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Lys Ser Gly His 865 870 875 880 ٠

Leu Leu Asn Leu Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser 885 890 895

Ser Thr His Pro Asn Lys Tyr Ser Phe Met Ala Ala Tyr Ile Cys Asp 900 905 910

Ala Tyr Arg Thr Ile Ser Gly Thr Glu Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Vo 915 920 925

Glu Thr Trp Thr Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly Val Val 930 935 940

Val Arg Gly Ser Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu Val Tyr 945 950 955 960 ‏أ‎ ‎Gly His Gly Arg Tyr Glu Tyr Arg Asp Ala Ser Arg Gly Tyr Gly Leu 965 970 975

Ser Ala Gly Ser Arg Val Arg Phe 980

Claims (1)

1. ‎١9 -‏ - عناصر الحماية

   ‎(HMW) ‏يقوم بترميز بروتين‎ alias ‏تم‎ nucleic acid ‏جزئ حمض نووي‎ -١ ١ (HMW) ‏يشتمل بروتين‎ (Se ‏ذات وزن جزيثي‎ chlamydia ‏الكلاميديا‎ Y ‏لتسلنلسل‎ Ls amino acid sequence ‏و المذكور على تسلسل الحمض الأميني‎ .١ ‏رقم‎ 1

   ‎١‏ 7- جزئ الحمض النووي ‎Gig nucleic acid‏ لعنصر الحماية (١)؛‏ حيث تكون ‎Y‏ أنواع الكلاميديا ‎chlamydia‏ هي: ‎Chlamydia trachomatis‏ أو ‎Chlamydia‏ ‎pecorum 7‏ أو ‎Chlamydia psittaci‏ أو ‎-Chlamydia pneumoniae‏

   ‎١‏ *- جزئ الحمض النووي ‎nucleic acid‏ وفقاً لعنصر الحماية (١)؛‏ حيث يشتمل على تسلسل حمض ‎lily DNA‏ لتسلسل رقم ‎١‏ أو متممة الجزئ المذكور.

   ‎١‏ ؛- جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ ثم فصله يشتمل على:

   ‏7 تسلسل حمض نووي ‎nucleic acid‏ التي تهجن تحت ظطروف تشتمل ‎Cr‏ / فورم »- أميد و 77 أم إلى تسلسل حمض ‎DNA‏ المتممة لتسلسل رقم ‎١‏ والتي تقوم بترميز 4 بروتين يتم التعرف عليه بواسطة الأجسام المضادة التي ترتبط بالتحديد ببروتين ‎dane‏ على:

   ‏4 تسلسل الحمض الأميني ‎amino acid‏ وفقاً لتسلسل رقم ؟.

   - ١ -

   ‎Ji —o ١‏ تعبير وراثي مأشوب ‎recombinant eXPression vector‏ مهياً لتحول ‎Y‏ خلية عائلة يشتمل على جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ وفقا لعنصري ‎Y‏ الحماية ‎١‏ أو 4.

   ‎١‏ 1 ناقل تعبير ‎oy‏ مأشوب ‎recombinant expression vector‏ مهياً لتحول ‎LAY‏ عائلة يشتمل على جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ وفقا لعناصر الحماية ‎١‏ ‏» - - ؛ حيث تقترن وسائل التعبير الوراثي عمليا بجزئ الحمض النووي ‎nucleic‏ ‏¢ 0 للتعبير .

   ‎-١ ١‏ ناقل تعبير وراثي مأشوب ‎recombinant expression vector‏ وفقا لعنصر ‎Y‏ الحماية ) 1( حيث تشتمل وسائل التعبير ‎sl‏ على جزء من حمض نووي ‎nucleic acid ¥‏ يقوم بترميز تسلسل أساسية للإفرازات.

   ‎Hos ‏التعبير‎ BU ‏تشتمل على‎ transformed host cell ‏خلية عائلة متحولة‎ —A ١ (1) ‏لعنصر الحماية‎ lay,

   ‎١‏ - خلية عائلة متحولة ‎transformed host cell‏ تشتمل على ناقل التعبير الوراثي ‎vy‏ وفقاً لعنصر الحماية ‎AV)‏

   ‎١‏ - جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ تم فصله يشتمل على وحدات بنائية من ‎Y‏ النكليوتيد ‎"7١ - £17 nucleotide‏ وفقا لتسلسل رقم ‎Cun)‏ يمكن الحصول 7 على الحمض النووي ‎nucleic acid‏ المذكور من :

   ع١‏ -

   ‎E.coli 3121 (pAH342) assigned ATCC accession number 985538. :‏ ‎-١١ ١‏ ناقل ‎mad‏ وراثي مأشوب ‎recombinant expression vector‏ يشتمل على ‎Y‏ بلازميدة ‎plasmid‏ 0411342 الذي يمكن الحصول عليه من :

   ‎E.coli BL21 (pAH342) having ATCC accession number 8 v‏ ‎-٠ ١‏ جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ ثم فصله يشتمل على مجموعات نكليوتيد ‎Y‏ على الأقل وفقا للتسلسل رقم ‎١‏ ويقوم بترميز قطع من بروتين ‎(HMW)‏ لكلاميديا ‎chlamydia 3‏ وزن جزيئي عالي؛ حيث يتم التعرف على القطع المذكورة عن ؛ - طريق الأجسام المضادة التي ترتبط تحديداً ببروتين يشتمل على تسلسل الحمض ° الأميني ‎amino acid‏ وفقاً لتسلسل رقم 7. ‎JIL -١“ ١‏ تعبير وراثي مأشوب ‎recombinant expression vector‏ مهيا لتحول ‎Y‏ خلية ‎alle‏ يشتمل على جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ وفقاً لعنصر الحماية ‎(VY) ¥‏ ‎-٠4 ١‏ ناقل تعبير وراتي مأشوب ‎recombinant expression vector‏ مهيا لتحول ‎Ale La‏ يشتمل على جزئ حمض نووي ‎nucleic acid‏ وفقاً لعنصر الحماية ‎(VY) YF‏ حيث تقترن وسائل التعبير الوراثي عمليا بجزئ الحمض النووي للتعبير ¢ الوراثي عن قطعة_ من بروتين ‎(HMW)‏ ‎-١ ١ :‏ ناقل تعبير وراثي مأشوب ‎recombinant expression vector‏ 884 لعنصر

   — وج \ _ الحماية 7 ‎١‏ ( حيث تشتمل وسائل التعبير ‎BY‏ = على جزء من حمص نووي ‎ae ose nucleic acid ¥‏ تسلسل أساسية لإفرازات قطعة من بروتين (/01041. ‎١‏ - خلية عائلة متحو )4 ‎transformed host cell‏ تشتمل على ناقل التعبير الوراثي " > وفقاً لعنصر الحماية ‎OF)‏ ‎-١١7 ١‏ خلية عائلة متحولة ‎transformed host cell‏ تشتمل على ناقل التعبير الوراتي ‎Y‏ وفقاً لعنصر الحماية )08( ‎A ١‏ )= جزئ حمض نووي ‎a nucleic acid‏ فصله يشتمل على وحدات بنائية من ‎Y‏ النكليوتيد ‎nucleotide‏ 4717 الى ‎١‏ وفقا لتسلسل رقم 6 ‎Cua‏ يمكن الحصول 3 على الحمض النووي ‎nucleic acid‏ المذكور من :

   ‎E. coli TOP10 having ATCC accession number PTA-3719. ¢ ‏يشتمل على‎ recombinant expression vector ‏ناقل تعبير وراتي مأشوب‎ -8 ١ : ‏[-1136م الذي يمكن الحصول عليه من‎ plasmid ‏بلازميدة‎ Y

   ‎E.coli TOP10 pJJ 36-J having ATCC accession number PTA-3719. v