CN1283108A - 衣原体蛋白、其基因序列及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了衣原体高分子量(“HMW”)蛋白,其氨基酸序列,特异性结合HMW蛋白的抗体及其编码核酸序列。还公开了包括疫苗的预防和治疗组合物,含有HMW蛋白,其片段,或特异性结合HMW蛋白或其部分的抗体,或编码HMW蛋白或其片段的核酸序列。

Description

衣原体蛋白、其基因序列及用途
1．发明领域
本发明一般涉及高分子量的(“HMW”)衣原体蛋白，其氨基酸序列，和特异性结合HMW蛋白的抗体，包括细胞毒抗体。本发明进一步包括预防和治疗组合物，该组合物含有HMW蛋白，其片段，或特异性结合HMW蛋白的抗体或其部分，或编码HMW蛋白的核苷酸序列或其片段，所述组合物包括疫苗。本发明还提供了预防，治疗或缓解哺乳动物和鸟类中衣原体感染相关疾病的方法和诱导针对衣原体的免疫应答的方法。本发明还提供了编码HMW蛋白的分离的核苷酸序列和简并序列，含有所述序列的载体和含有所述载体的宿主细胞。本发明还包括诊断方法和试剂盒。
2．发明背景
衣原体是广泛传播的人类病原体，其导致如性传播疾病，包括肺炎的呼吸系统疾病，新生儿结膜炎和失明等疾病。衣原体是专性细胞内细菌，它感染肺，结膜或生殖道的上皮层。最常见的衣原体种类包括砂眼衣原体，鹦鹉热衣原体，猫心衣原体和肺炎衣原体。最近，新命名的衣原体种类肺炎衣原体(以前被称为砂眼衣原体TWAR)被认为是人类流行性肺炎的主要原因，可能对动脉粥样硬化也起到一定作用。
目前，已认定了18种导致砂眼和一系列性传播疾病的砂眼衣原体血清变种：A，B和C血清变种常与砂眼相关，而D-K血清变种是生殖道感染最常见的病因。
在包括美国的很多发达国家，砂眼衣原体是性传播疾病的主要病因。而美国砂眼衣原体感染的准确发病率仍是未知的，最新的流行病学研究表明每年发生400万例以上的衣原体感染，这与所估计的每年200万例淋球菌感染形成对比。尽管衣原体感染会涉及所有种族，人种和社会经济群体，但其最常见于12至20岁的性活跃的年轻人中。大多数生殖泌尿器的衣原体感染在临床上无症状，男性和女性长期携带等居多。在被诊断为衣原体感染的患者中，多至25％的男性和75％的女性没有明显的感染体征。结果，这些无症状的个体构成了大的病原体库，可继续地在社会中传播病原体。
与这种良性携带相去甚远的是，这些感染也可导致严重的疾病，包括：尿道炎，性病淋巴肉芽肿(LGV)，宫颈炎和男性附睾炎。由宫颈管内膜逐步往上的感染通常会引起子宫内膜炎，盆腔炎性疾病(PID)和导致输卵管闭塞并最终导致不育的输卵管炎。
新生儿的砂眼衣原体感染是因围产期暴露于母体受感染的宫颈而引起的。将近70％从患有衣原体性宫颈炎的母体阴道分娩的新生儿在分娩的过程中被感染。眼睛，口咽部，泌尿生殖道和直肠的粘膜是感染的主要位点。衣原体性的结膜炎已成为新生儿眼炎的最常见形式。约20-30％暴露的新生儿在分娩14天内会患有包涵体结膜炎，甚至在接受了硝酸银或抗生素软膏预防之后也是如此。在美国，砂眼衣原体也是新生儿肺炎的病因。将近10-20％经感染的宫颈分娩的新生儿会患有衣原体肺炎并需要一些类型的医药干预。
在发展中国家，砂眼衣原体的眼感染导致砂眼，即一种慢性滤泡性结膜炎，其反复形成瘢痕，导致眼睑变形并最终失明。砂眼是可预防之失明的世界性病因。据世界卫生组织估计，目前世界上有超过5亿人，包括约1．5亿儿童患有活动性砂眼，超过600万人被此疾病致盲。
在发达国家，与治疗衣原体感染相关的花费是惊人的。1992年，美国治疗此病的年花费估计为25-30亿美元，到2000年为止，年花费预计会超过80亿美元。
对此健康危机的一个行之有效的解决办法是有效的衣原体疫苗。几种迹象表明开发有效的疫苗是简单易行的。
对人和灵长类动物的研究表明通过用整个衣原体免疫接种可产生针对砂眼衣原体的短期保护性免疫力。然而，保护作用的特征在于期限短，具有血清变种特异性，并由粘膜抗体产生。另外，在一些接种者中，当这些个体被不同于免疫所用的血清变种天然感染时，病情会加重。最终阐明这种有害反应是由迟发型超敏反应所引起的。因此，需要开发一种基于亚单位的衣原体疫苗，该疫苗能产生有效但非致敏的免疫应答。这种亚单位疫苗需要引发粘膜中和分泌型IgA抗体和／或细胞免疫应答才有效。
迄今为止，亚单位疫苗的开发几乎仅致力于主要外膜蛋白(MOMP)。MOMP是大小约为40KDa的膜内在蛋白质，其含有多达约60％的传染性原体(EB)膜蛋白(Caldwell，H．D．，J．Kromhout和L．Schachter，1981，Infect．Immun．，31：1161-1176)。MOMP赋予细胞外EB结构上的完整性，据认为，当生物在细胞内生长并且具有代谢活性时，MOMP作为膜孔蛋白样分子起作用。除了4个表面暴露的可变区(VDI-VDIV)外，MOMP在所有18个血清变种中是高度保守的。MOMP的免疫原性高，可引发局部的中和性抗衣原体抗体。然而，此方法也存在问题。
迄今为止，已被作图的大多数MOMP-特异性中和表位位于VD区，因此，仅产生血清变种特异性的抗体。将血清变种特异性的表位混合于不同的疫苗载体(如脊髓灰质炎病毒)以产生广泛交叉反应的中和性抗体的尝试勉强获得成功(Murdin，A．D．，H．Su，D．S．Manning，M．H．Klein，M．J．Parnell和H．D．Caldwell，1993，Infect．Immun．，61：4406-4414；Murdin，A．D．，H．Su，M．H．Klein，H．D．Caldwell．1995，Infect．Immun．，63：1116-1121)。
砂眼衣原体的两个其它主要外膜蛋白，即60KDa和12KDa的富含半胱氨酸的蛋白质以及暴露于表面的脂多糖是高度免疫原性的，但与MOMP不同的是，尚无证据表明它们可诱导中和性抗体(Cerrone等，1991，Infect．Immun．，59：79-90)。因此，仍需要新的基于亚单位的衣原体疫苗。
3．发明概述
本发明的目的是提供分离的和基本上纯化的高分子量衣原体蛋白(“HMW蛋白”)或其片段或类似物，其中经SDS-PAGE测定，HMW蛋白的表观分子量约为105-115KDa．优选HMW蛋白基本上具有SEQ ID NO：2，15和16中任一个所示的氨基酸序列。优选HMW蛋白的片段包括SEQ IDNO：3，17和25-37．本文所用的“基本上具有……序列”指的是序列与参照序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同。优选HMW蛋白是外膜蛋白，更优选外膜HMW蛋白位于表面。优选HMW蛋白具有肝素结合区域。优选HMW蛋白具有膜孔蛋白样区域。本发明欲包括所有的衣原体种类，但其中优选的种类包括砂眼衣原体，鹦鹉热衣原体，猫心衣原体和肺炎衣原体。基本上纯化的HMW蛋白至少为70wt％纯，优选至少约为90％wt纯，可以是其水溶液的形式。
本发明还包括重组形式的HMW蛋白或其片段或类似物，其包含在转化的大肠杆菌细胞中，经SDS-PAGE测定，被表达的重组形式的HMW蛋白的表观分子量约为105-115KDa。术语HMW-衍生的多肽包括HMW蛋白的片段；野生型HMW蛋白的变体或其片段，其含有一个或多个氨基酸缺失，插入或取代；嵌合蛋白，其含有与整个或部分HMW蛋白C-末端或N-末端或内部区段融合的异源多肽。
本文和权利要求书中所用的术语“HMW蛋白”指的是天然纯化的或重组纯化的高分子量衣原体蛋白，其表观分子量(经SDS-PAGE测定)约为105-115KDa。本文和权利要求书中所用的术语“rHMW蛋白”指的是重组的HMW蛋白。
本发明的另一目的是提供分离的基本上纯的编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸分子。优选所编码的HMW蛋白含有SEQ ID NO：2，15和16中任一个所示的氨基酸序列的核酸序列或其片段，尤其是SEQ IDNO：3，17和25-37。本发明还包括含有SEQ ID NO：1，23-24中任一个所示的DNA序列的分离核酸分子或其互补序列；具有SEQ ID NO：4-14，18-22中任一个所示的核酸序列的HMW DNA序列片段或其互补序列；和在严紧条件下与上述任一序列杂交的核酸序列。优选地，在严紧条件下杂交的核酸与上述任一序列具有约70％的序列同一性，更优选具有约90％的序列同一性。
HMW蛋白衍生物和类似物的生产和用途也在本发明的范围之内。在具体的实施方案中，衍生物或类似物具有功能活性，即能表现出一种或多种与全长野生型HMW蛋白相关的功能活性。例如，具有所需免疫原性或抗原性的衍生物或类似物可被用于免疫测定法中，也可用于免疫接种等等。具体的实施方案涉及可被抗-HMW抗体结合的HMW片段。通过本领域已知的方法可检测HMW衍生物或类似物是否具有所需的活性。
具体地说，通过提供功能上等同的分子的取代，增加或缺失改变HMW序列可制备HMW衍生物。由于核苷酸编码序列的简并性，编码与HMW基因所编码的序列基本上相同的氨基酸序列的其它DNA序列也可用于本发明的实践。它们包括但不限于含有全部或部分基因的核苷酸序列，所述基因的序列通过用编码功能等同的氨基酸残基的不同密码子取代而被改变，从而产生沉默突变。类似地，本发明的HMW衍生物包括但不限于含有HMW蛋白的全部或部分氨基酸序列作为一级氨基酸序列的衍生物，所述氨基酸序列包括经功能等同的氨基酸残基取代而导致沉默突变的经改变序列。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可被功能上等同的，具有类似极性的另一个氨基酸取代而产生沉默突变。序列中的氨基酸的取代物可从氨基酸所属类的其它成员中选择。例如，非极性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本发明的具体实施方案中，提供了由HMW蛋白的片段组成或含有此片段的蛋白质，所述片段由HMW蛋白中至少6个(连续的)氨基酸组成。在其它实施方案中，片段由HMW蛋白的至少7至50个氨基酸组成。在具体的实施方案中，该片段不大于35，100或200个氨基酸。HMW的衍生物或类似物包括但不限于含有与HMW或其片段基本上同源的区域，或其编码核酸能在严紧，中度严紧或非严紧的条件下与HMW编码序列杂交的那些分子(如在不同的实施方案中，与相同长度的氨基酸序列相比或与对比序列相比至少具有60％或70％或80％或90％或95％的同一性，序列对比通过本领域已知的计算机同源性程序进行)。
例如(但不限于此)，有用的计算机同源性程序包括下列：基本局部序列对比检索工具(BLAST)(WWW．ncbi．nlm．nih．gov)(Altschul等，1990，分子生物学杂志，215：403-410，BLAST算法；Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)，它是特制用于检索序列相似性的启发式检索算法，该算法使用Karlin和Altschul 1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87：2264-68；1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90：5873-77的统计方法确定显著性。5个特定的BLAST程序实施下列任务：
1)BLASTP程序将欲检索的氨基酸序列与蛋白质序列数据库相比较。
2)BLASTN程序将欲检索的核苷酸序列与核苷酸序列数据库相比较。
3)BLASTX程序将欲检索的核苷酸序列(两条链)的6-读码框概念翻译产物与蛋白质序列数据库相比较。
4)TBLASTN程序将欲检索的蛋白质序列与所有6个读码框中翻译的核苷酸序列数据库(两条链)相比较。
5)TBLASTX程序将欲检索的核苷酸序列的6-读码框翻译产物与核苷酸序列数据库的6-读码框翻译产物相比较。
Smith-Waterman(数据库：欧洲生物信息学学会wwwz．ebi．ac．uk／bic_sw／)(Smith-Waterman，1981，分子生物学杂志，147：195-197)是用于序列对比的数学上严密的算法。
FASTA(见Pearson等，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85：2444-2448)是与Smith-Waterman相似的启发式算法。关于BLAST，Smith-Waterman和FASTA算法之方法和优点的一般性讨论，可参见Nicholas等，1998，“有关检索序列数据库和序列评分方法的指导”(www．psc．edu)和其中所提及的参考文献。
本发明的HMW衍生物和类似物可通过本领域熟知的多种方法制备。导致其产生的操作可在基因或蛋白质水平上发生。例如，可通过本领域熟知的多种策略中的任一种来修饰克隆的HMW基因序列(Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。可用限制性核酸内切酶在适当的位点裂解序列，必要时进行进一步的酶促修饰，分离并进行体外连接。制备编码HMW衍生物或类似物的基因时，应注意确保编码所需HMW活性的基因区域中经修饰基因与HMW处于相同的翻译读码框中，而不会被翻译终止信号间断。
另外，可体外或体内突变编码HMW的核酸序列以产生和／或破坏翻译，起始和／或终止序列，或使编码区域产生变异和／或形成新的限制性内切核酸酶位点或破坏原先存在的位点以便于进一步地体外修饰。可使用本领域已知的任何诱变技术，包括但不限于化学诱变，体外定点诱变(Hutchinson，C等，1978，生物化学杂志，253：6551)，使用TAB接头(Pharmacia)等。
也可在蛋白质水平进行HMW序列的操作。本发明范围中包括HMW蛋白片段或其它衍生物或类似物，它们在翻译期间或之后通过例如已知的保护／封闭基团，蛋白酶裂解，与抗体分子或其它细胞配体的连接被糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，衍生化等，从而进行不同修饰。可通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，其包括但不限于通过溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化，甲酰化，氧化，还原；在衣霉素的存在下进行代谢合成等。
另外，也可化学合成HMW的类似物和衍生物。例如，可使用肽合成仪合成对应于HMW蛋白中含有所需区域或可在体外介导所需活性的部分的肽。另外，必要时，可在HMW序列中导入非典型氨基酸或氨基酸的化学类似物作为取代或添加的氨基酸。非-典型的氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，含氟-氨基酸，设计者氨基酸，如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。另外，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
本发明的另一目的是提供适用于转化宿主或将HMW蛋白传递给宿主的重组表达载体，其含有SEQ ID NO：1，23或24所述的核酸分子或其任何片段。优选重组表达载体适用于转化宿主并含有与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物。更优选表达载体中的表达元件包括以下核酸部分，其编码用于由宿主分泌HMW蛋白或其片段或类似物的前导序列，或编码偶联于蛋白或其片段或类似物N-或C-末端的亲和区。
本发明的另一方面包括含有上述表达载体的转化宿主细胞和可由转化的宿主细胞产生的重组HMW蛋白或其片段或类似物。
本发明的另一方面涉及可被抗体制品识别的HMW蛋白，所述抗体制品特异性结合氨基酸序列为SEQ ID NO：2，15-16的肽或其片段或其保守取代的类似物。
本发明的另一方面是抗原性和／或免疫原性组合物，其中组合物含有至少一种选自下列的成分：
a)HMW蛋白或其片段或类似物，所述蛋白经SDS-PAGE测定其分子量约为105-115KDa；
b)编码HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子；
c)具有SEQ ID NO：1，22，23或24的序列的分离核酸分子，其互补序列，或在严紧条件下能与其杂交的核酸序列，或其片段；
d)能由含有表达载体的转化宿主产生的分离的重组HMW蛋白或其片段或类似物，所述表达载体含有b)或c)所述的核酸分子和与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物；
e)含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸的重组载体；
f)含有e)之载体的转化细胞，
所述组合物还任选含有佐剂，和可药用载体或稀释剂，当施用于宿主时，所述组合物可产生免疫应答。
优选的佐剂包括霍乱全毒素或亚单位，大肠杆菌热不稳定全毒素，其亚单位和突变形式，明矾，QS21和MPL。特别优选明矾，LTR192G，mLT和QS21。
本发明还包括在哺乳动物或鸟类中产生免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的上述抗原性或免疫原性组合物。
本发明的另一方面涉及针对本发明的抗原性或免疫原性组合物产生的抗血清，和抗血清中存在的能特异性结合HMW蛋白或其片段或类似物的抗体。优选抗体结合具有SEQ ID NO：2，15-16的氨基酸序列的HMW蛋白或其片段或其保守取代的类似物。本发明还包括特异性结合HMW蛋白或其片段或类似物的单克隆抗体。
本发明的另一方面包括药物和疫苗组合物，其含有有效量的至少一种选自下列的成分：
a)HMW蛋白或其片段或类似物，经SDS-PAGE测定，其中分离的蛋白质的分子量约为105-115KDa；
b)编码HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子；
c)具有SEQ ID NO：1，22，23或24的序列的分离核酸分子，其互补序列，或在严紧条件下能与其杂交的核酸序列，或其片段；
d)能由含有表达载体的转化宿主产生的分离的重组HMW蛋白或其片段或类似物，所述表达载体含有b)或c)所述的核酸分子和与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述衣原体HMW蛋白或其片段或类似物；
e)含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸的重组载体；
f)含有e)之载体的转化细胞；
g)特异性结合a)，b)，c)，d)或e)之组分的抗体，
和可药用载体或稀释剂。优选疫苗组合物在粘膜水平上是有效的。
本发明还包括诊断试剂，其可以包括上述任何一种或多种组分，如天然HMW蛋白，重组HMW蛋白，核酸分子，免疫原性的组合物，抗原性的组合物，抗血清，抗体，含有核酸的载体和含有载体的转化细胞。
本发明还包括检测待测样品中的衣原体或抗衣原体抗体的方法和诊断试剂盒，其中所述方法包括下列步骤：
a)将所述样品与含有衣原体HMW蛋白或其片段或类似物的抗原性组合物或免疫原性组合物或其抗体接触以形成衣原体抗原：抗-衣原体抗体免疫复合物；
b)检测步骤a)中形成的所述免疫复合物的存在或测定其量以作为待测样品中存在所述衣原体或抗衣原体抗体的指征。
检测衣原体或其抗体的诊断试剂盒含有抗体，或含有衣原体HMW蛋白或其片段或类似物的抗原性或免疫原性组合物，用于使所述抗体或组合物与被怀疑含有抗衣原体抗体或衣原体的待测样品接触的容器，和用于检测或测定所述抗原性或免疫原性组合物或所述抗体与所述待测样品之间形成的衣原体抗原：抗衣原体抗体免疫复合物的试剂。
本发明的另一方面提供了测定待测样品中编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸的存在的方法，所述方法包括步骤：
a)使待测样品与本文提供的核酸分子接触以产生含有核酸分子和待测样品中编码HMW蛋白并能特异性地与以上核酸分子杂交的任何所述核酸分子的双链体；和
b)测定双链体的产生。
本发明还提供了用于测定样品中编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸的存在的诊断试剂盒及其所用的试剂，其含有：
a)本文提供的核酸分子；
b)使核酸与待测样品接触以产生双链体的容器，所述双链体含有核酸分子和待测样品中编码HMW蛋白并能特异性地与以上核酸分子杂交的任何所述核酸分子；和
c)测定双链体产生的试剂。
本发明还包括预防，治疗或缓解需要接受治疗的包括哺乳动物和鸟类的动物的衣原体相关疾病的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的药物或疫苗组合物。优选的疾病包括衣原体细菌感染，砂眼，结膜炎，尿道炎，性病淋巴肉芽肿(LGV)，宫颈炎，附睾炎或子宫内膜炎，盆腔炎性疾病，输卵管炎，输卵管闭塞，不育，宫颈癌和动脉硬化。优选的疫苗或药物组合物包括被配制供体内施用于宿主以提供对由衣原体所致疾病的保护作用或治疗所述疾病的制剂。也优选将组合物配制成微粒，胶囊，脂质体制剂或乳剂。
4．缩写
抗-HMW=HMW多肽抗体或抗血清
ATCC=美国典型培养物保藏中心
免疫-反应=能引发细胞或体液免疫应答
Kda=千道尔顿
OG=正辛基β-D-吡喃葡糖苷或辛基葡糖苷
OMP(s)=外膜蛋白
PBS=磷酸缓冲盐水
PAGE=聚丙烯酰胺凝胶电泳
多肽=任何长度的肽，优选具有10个或更长氨基酸残基的多肽
SDS=十二烷基硫酸钠
SDS-PAGE=十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
本文所述的核苷酸或核酸序列以下列单字母碱基符号表示：
A(腺嘌呤)
C(胞嘧啶)
G(鸟嘌呤)
T(胸腺嘧啶)
U(尿嘧啶)
M(A或C)
R(A或G)
W(A或T／U)
S(C或G)
Y(C或T／U)
K(G或T／U)
V(A或C或G；非T／U)
H(A或C或T／U；非G)
D(A或G或T／U；非C)
B(C或G或T／U；非A)
N(A或C或G或T／U)或(未知)
本文所述的肽和多肽序列以下列单字母氨基酸残基符号表示：
A(丙氨酸)
R(精氨酸)
N(天冬酰胺)
D(天冬氨酸)
C(半胱氨酸)
Q(谷氨酰胺)
E(谷氨酸)
G(甘氨酸)
H(组氨酸)
I(异亮氨酸)
L(亮氨酸)
K(赖氨酸)
M(甲硫氨酸)
F(苯丙氨酸)
P(脯氨酸)
S(丝氨酸)
T(苏氨酸)
W(色氨酸)
Y(酪氨酸)
V(缬氨酸)
X(未知)
参照下文的发明详述，本发明具体实施方案的非限制性实施例和附图可更完整地理解本发明。
5．附图简述
图1：砂眼衣原体L2原体(EB)的Western印迹分析。用含有2-巯基乙醇的标准Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液溶解梯度纯化的EB，煮沸约3分钟，上样于含SDS的4-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶上，以100V电泳。电泳之后立即于4℃，约50V下，将蛋白质电印迹至PVDF膜上。室温下，使用经1／5，000稀释的抗-rHMWP抗体(K196)将封闭的膜探测1．5小时。洗涤后，室温下用经1／5，000稀释的与HRP缀合的山羊抗兔IgG抗体将膜处理1小时。使用标准的TMB底物系统展开印迹。在EB和RB中检测到3条免疫反应的带。点表示约105-115KDa的HMW蛋白。
图2：编码砂眼衣原体LGV L2 HMW蛋白的开放阅读框的共有核酸序列。
图3：砂眼衣原体LGV L2 PCR开放阅读框的HMW蛋白推导的氨基酸序列。
图4：大肠杆菌中表达的砂眼衣原体LGV L2部分纯化的重组HMW蛋白的SDS-PAGE。复染和预先染色的SDS-PAGE标准被用作分子量标记。凝胶中分子量标记的位置标在图的左侧和右侧，以一些标记的分子量(KDa)标线表示。详见正文实施例10。泳道A：标记12宽范围的分子量标记(Novex)；肌球蛋白，200KDa；B-半乳糖苷酶，116．3KDa；磷酸化酶B，97．4KDa；牛血清白蛋白，66．3KDa．泳道B：砂眼衣原体L2重组HMWP。泳道C：SeeBlue预先染色的分子量标记(Novex)；肌球蛋白，250KDa；牛血清白蛋白，98KDa；谷氨酸脱氢酶，64Kda．
图5：质粒pAH306，pAH310，pAH312，pAH316和PCR开放阅读框的图谱。
图6：砂眼衣原体L2，B和F的HMW蛋白的推导氨基酸序列。砂眼衣原体L2序列在最上面一行给出，并以成熟蛋白质的第一个残基E开始。下划线的是潜在的真核N-糖基化序列。下划线并括在括号中的是侧翼于富含脯氨酸之区段，长度适于跨越脂质双层的疏水螺旋区域。在B和F血清变种中鉴定的氨基酸差异被标于L2HMWP蛋白序列的下方。
图7：使用抗-rHMWP’抗体对砂眼衣原体N11(血清变种为F)包涵体进行间接荧光抗体染色。
A组实验：兔K196的免疫后血清，衣原体包涵体被染成黄色。
B组实验：兔K196的免疫前血清。
6．发明详述
本文和权利要求书中所用的术语“抗原”及其相关术语“抗原性的”指的是与抗体或T细胞受体特异性结合的物质。优选所述抗原是免疫原性的。
本文和权利要求书中所用的术语“免疫原性”指的是在动物，优选哺乳动物或鸟类中诱导免疫应答，如抗体和／或细胞免疫应答的能力。
本文和权利要求书中所用的术语“宿主”指的是动物体内或体外哺乳动物细胞培养物。
应施用有效量的抗原性，免疫原性药物，包括但不限于本发明的疫苗，组合物，其中“有效量”被定义为足以在受试者体内产生所需的预防，治疗或缓解应答，包括但不限于免疫应答的量。所需的量随所用HMW蛋白，片段，核酸或衍生物的免疫原性，给药对象的种和体重的不同而不同，但使用标准技术可以确定。组合物在受试者体内引发免疫应答，其产生抗体，包括抗-HMW蛋白抗体和调理或杀菌的抗体。在本发明优选的非限制性的实施方案中，有效量的本发明组合物产生的抗体滴度比给药前的抗体滴度至少高3倍。在本发明优选的，具体的，非限制性的实施方案中，给宿主施用约0．01至2000μg，优选0．1至500μg．优选组合物另外含有佐剂。
免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物可被制成注射剂，液体溶液或乳剂。HMW蛋白可与一种或多种可药用与HMW蛋白相容的赋型剂混合，所述赋型剂包括水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇及其混合物。
免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物可进一步含有一种或多种辅剂，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂或增强其效力的佐剂。免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物可通过注射非肠道施用，也可经皮下或肌内施用。
或者，可以引发粘膜表面免疫应答的形式配制和传递根据本发明形成的免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物。因此，可通过例如鼻，口(胃内)，眼，鳃，阴道内或直肠内途径将免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物施用于粘膜表面。或者，也可使用其它给药方式，包括栓剂和口服制剂。对栓剂而言，结合剂和载体包括例如polyalkalene glycols或甘油三酯。口服制剂包括常用的赋型剂，例如药用级的甜味剂，纤维素和碳酸镁。这些组合物可采取溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，缓释制剂或粉末的形式，其含有约0．001至95％的HMW蛋白。以与剂量配制相容的方式施用免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物，施用的量应是治疗有效的，保护性的或免疫原性的。
另外，免疫原性的，抗原性的药物和疫苗组合物可与一种或多种靶向分子联合或结合使用以传递至免疫系统的特定细胞，如粘膜表面。一些例子包括但不限于维生素B12，细菌毒素或其片段，单克隆抗体和其它特定的靶向脂质，蛋白质，核酸或碳水化合物。
给药的量取决于所治疗的受试者，包括例如个体免疫系统合成抗体，必要时产生细胞介导的免疫应答的能力。给药所需活性成分的精确的量取决于实际操作者的判断。然而，本领域技术人员容易确定适当的剂量范围，其约为0．1至1000微克HMW蛋白，其片段或类似物。初次给药和加强剂量的适当制度也是可变的，但可包括初次给药及再次给药。剂量也可取决于给药途径，并根据宿主的大小而变化。
本发明的抗原性的，免疫原性的或药物组合物中HMW蛋白的浓度一般约为0．001至95％。仅含有一种病原体的抗原性物质的疫苗为单价疫苗。含有几种病原体的抗原性物质的疫苗为联合疫苗，它也属于本发明。这种联合疫苗含有例如得自多种病原体或相同病原体的不同株或多种病原体的联合的物质。
包括疫苗的抗原性的，免疫原性的或药物制品可含有核苷酸载体作为免疫刺激物，所述载体含有编码HMW蛋白的基因的至少一部分，或基因的至少一部分可直接用于免疫。
为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫力(CMI)，一般用佐剂乳化免疫原。如果免疫原与佐剂一起施用将会显著改善免疫原性。佐剂通过将免疫原局部保留在给药位点附近以产生便于将抗原缓释至免疫系统的细胞的储存效应而起作用。佐剂也可将免疫系统的细胞吸引至免疫原储存处并刺激这种细胞引发免疫应答。
很多佐剂是有毒的，可诱导肉芽肿，急性和慢性炎症(弗氏完全佐剂，FCA)，细胞溶解(皂苷和Pluronic聚合物)和热原性，关节炎和前色素层炎(LPS和MDP)。尽管FCA是出色的佐剂并广泛用于研究中，但因其毒性而未被准许用于人或兽用疫苗中。
理想佐剂的合乎需要的特征包括：
(1)无毒性；
(2)能刺激长期免疫应答；
(3)操作简单，且在长期储存中具有稳定性。
(4)必要时能引发针对通过多种途径给药的抗原的CMI或HIR或CMI和HIR；
(5)与其它佐剂能协同作用；
(6)能选择性地与抗原呈递细胞(APC)群体相互作用；
(7)能特异性引发适当的TH1或TH2细胞特异性免疫应答；和
(8)能选择性增加针对抗原的适当的抗体同种型水平(例如IgA)。
多年来，一直使用免疫刺激剂或佐剂以改善宿主针对例如疫苗的免疫应答。如脂多糖的内源性佐剂一般是用作疫苗的灭活或减毒细菌的组分。外源性佐剂是免疫调节剂，一般使其与抗原非共价连接，配制它是为了增强宿主的免疫应答。因此，增强针对非肠道传递的抗原的免疫应答的佐剂已被鉴定。氢氧化铝和磷酸铝(一般总称为明矾)被常规用作人和兽用疫苗的佐剂。明矾增加针对白喉和破伤风类毒素的抗体应答的效力已经确定，明矾被用作HBsAg疫苗的佐剂。
其它外源性佐剂可包括与膜蛋白抗原复合的皂苷(免疫刺激复合物)，含矿物油的pluronic聚合物，含矿物油的分支杆菌，弗氏完全佐剂，细菌产物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂质A和脂质体。
列入本文作为参考的国际专利申请PCT／US95／09005描述了肠毒性大肠杆菌的热不稳定毒素的突变形式(“mLT”)，列入本文作为参考的美国专利5，057，540描述了佐剂Qs21，列入本文作为参考的英国专利2，220，211中描述了皂苷经HPLC纯化的无毒组分3D-MPL，其中皂苷得自南美树种Quiliaja saponaria molina的树皮。
1989年8月8日授予Lockhoff等人的美国专利4，855，283(列入本文作为参考)教导了作为免疫调节剂或佐剂的糖脂类似物，包括N-糖基酰胺，N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，它们的糖基都被氨基酸所取代。Lockhoff报道了单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中的N-糖磷脂和糖基甘油脂能引发强的免疫应答。已由长链烷基胺和通过异头碳原子与糖直接相连的脂肪酸合成了一些糖脂以模拟天然脂质残基的功能。
授予Moloney的美国专利4，258，029(列入本文作为参考)教导了十八酪氨酸盐酸化物(OTH)当与破伤风类毒素和用福尔马林灭活的Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒疫苗复合时可用作佐剂。合成肽的脂化也被用于增加其免疫原性。
因此，根据本发明，含有HMW蛋白或其片段或其衍生物或HMW编码核酸或其片段或其表达载体的免疫原性的，抗原性的，药物，包括疫苗组合物可进一步含有佐剂，例如但不限于明矾，mLT，QS21和上文所列的所有其它佐剂。优选佐剂选自明矾，LT，3D-mPL或卡介苗(BCG)和上述物质的突变或修饰形式，尤其是mLT和LTR192G。本发明的组合物还可进一步含有适当的药物载体，包括但不限于盐水，碳酸氢盐，葡萄糖或其它水溶液。其它适当的药物载体描述于本领域的标准参考书Remington’s药物科学，Mack出版公司中(其全文列入本文作为参考)。
免疫原性的，抗原性的，药物，包括疫苗组合物可在适当的无毒性的药物载体中被施用，可被包含在微胶囊中，和／或包含在缓释的植入体中。
免疫原性的，抗原性的，药物，包括疫苗组合物可以几个间隔给药以保持抗体水平，和／或与其它杀菌或抑菌方法联合使用。
通过本领域技术人员熟知的任何常规方法可得到本文和权利要求书中所用的本发明“抗体”，所述方法例如但不限于“抗体，实验室手册”(E．Harlow，D．Lane，冷泉港实验室出版社，1989)中描述的方法(其全文列入本文作为参考)。术语“抗体”欲包括所有的抗体形式，例如但不限于多克隆，单克隆，纯化的IgG，IgM，IgA及其片段，包括但不限于如Fv，单链Fv(scFv)，F(ab’)2，Fab的片段(Harlow和Leon，1988，抗体，冷泉港)；单链抗体(美国专利4，946，778)，嵌合或人源化抗体(Morrison等人，1984，Proc．Natl Acad．Sci．USA81：6851；Neuberger等人，1984，自然81：6851)和互补决定区(CDR)(见Verhoeyen和Windust，分子免疫学，第2版，B．D．Hames和D．M．Glover，IRL出版社，牛津大学出版社，1996，p283-325)等。
一般说来，用不含或含佐剂或任何能增强免疫原效力之药剂的本发明HMW蛋白或其核酸序列或其致免疫的片段或其衍生物免疫动物(可使用多种脊椎动物，最常用的是小鼠，大鼠，豚鼠，牛，猪，仓鼠，绵羊，鸟和兔)并以规则的间隔加强免疫。通过任何常规的方法测定动物血清中所需抗体的存在。所述动物的血清或血液可用作多克隆抗体的来源。
按上文所述处理动物也可得到单克隆抗体。当检测到可接受的抗体滴度时，使动物安乐死，无菌取出脾脏以用于融合。将脾细胞与特别选择的无限增殖的骨髓瘤细胞系混合，将混合物暴露于可促进细胞融合的药剂，一般是聚乙二醇等中。在这些情况下，在随机选择中发生融合，融合的细胞混合物与未融合的各种细胞是所得的产物。利用选择培养基，如HAT：次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷特别选择用于融合的骨髓瘤细胞系以使融合混合物培养物中存在的唯一细胞是得自经免疫供体的细胞和骨髓瘤细胞之间的杂合体。融合之后，稀释细胞并在选择性培养基中培养细胞。筛选培养物中是否存在对选定抗原具有所需特异性的抗体。通过有限稀释克隆含有选定抗体的培养物直至认为细胞培养物为单细胞来源。
抗原，免疫原和免疫测定法
HMW蛋白或编码该蛋白的核酸，及其片段可用作抗原或免疫原以产生抗HMW蛋白的抗体或用作免疫测定法中的抗原，所述免疫测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射性免疫测定法(RIA)和其它非酶联抗体结合测定法或本领域已知的用于检测抗细菌，抗衣原体和抗HMW蛋白的抗体的方法。在ELISA测定法中，HMW蛋白被固定在选定的表面，例如能结合蛋白质的表面，如聚苯乙烯微滴板的孔。洗涤除去不完全吸附的HMW蛋白之后，已知对检测样品而言为抗原中性的非特异性蛋白溶液被结合于选定表面。这可封闭固定化表面上的非特异性吸附位点，从而降低抗血清非特异性地与表面结合所致的背景。
然后，以有助于免疫复合物(抗原／抗体)形成的方式使固定化的表面与样品，如待测的临床或生物学物质接触，它包括用稀释剂，如牛γ球蛋白(BGG)和／或磷酸缓冲盐水(PBS)／吐温溶液稀释样品。然后于约20至37℃的温度下将样品保温2至4小时。保温之后，洗涤与样品接触的表面以除去非免疫复合的物质。洗涤程序包括用如PBS／吐温或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。检测样品与结合的HMW蛋白之间形成特异性的免疫复合物之后，洗涤，通过使免疫复合物接触对第一抗体具有特异性的第二抗体可测定免疫复合物形成的出现，甚至是出现的量。如果检测样品来源于人，第二抗体是对人免疫球蛋白具有特异性的抗体，一般为IgG。
为了提供检测工具，第二抗体可具有联合活性，如通过与适当的生色底物保温可产生颜色的酶活性，通过检测颜色的产生即可完成检测，通过使用例如可见的分光光度计并与适当的标准进行比较可进行定量。本领域技术人员已知的其它任何检测方法也包括在本发明中。
另一个实施方案包括诊断试剂盒，其含有进行本发明所需免疫测定法必需的所有基本试剂。诊断试剂盒可以装有必需试剂的一个或多个容器组合的商业包装形式被提供。所述试剂盒可包括HMW蛋白或编码该蛋白的核酸或其片段，本发明的单克隆或多克隆抗体以及几种常规的试剂盒组分。常规的试剂盒组分对本领域技术人员而言是显而易见的，其公开于多种出版物中，包括“抗体，实验室手册”(E．Harlow，D．Lane，冷泉港实验室出版社，1989)中描述的方法(其全文列入本文作为参考)。常规的试剂盒组分可包括下列物质，例如微滴板，维持检测混合物之pH的缓冲液(例如但不限于Tris，HEPES等)，缀合的第二抗体，如与过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG(或针对从中得到第一抗体的动物的任何抗IgG)等，和其它标准试剂。
核酸及其用途
使用本领域已知的方法，如使用常规的化学方法或使用方便的寡核苷酸引物对进行的聚合酶链反应(PCR)扩增和使用一组连续的寡核苷酸进行的连接酶链反应可合成本发明的核苷酸序列，所述序列包括DNA和RNA并含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的序列。所述序列也可用于从任何衣原体中鉴定和克隆HMW蛋白基因，例如可用于筛选衣原体基因组文库或表达文库。
编码本发明HMW蛋白的核苷酸序列的用途在于它们能与其它蛋白质基因的一段互补序列选择性地形成双链体分子。根据应用的不同，可使用多种杂交条件得到不同的序列同一性。具体地说，提供的核酸含有与HMW蛋白基因的至少10，15，25，50，100，200或250个核苷酸互补的序列(图2)。在具体的实施方案中，提供的核酸可在低度，中度或高度严紧的退火条件下与HMW蛋白核酸(如具有序列SEQ IDNO：1，23或24)杂交。
为了得到高水平的选择性，可使用相对严紧的条件形成双链体，例如但不限于低盐和／或高温条件，如温度约为50℃至70℃下使用0．02M至0．15M NaCl。对于一些应用而言，需要较不严紧的杂交条件，例如但不限于在约20℃至55℃的温度范围内使用0．15M至0．9M的盐。通过加入增加量的甲酰胺可使杂交条件变得更加严紧以使杂合的双链体不稳定。因此，特定的杂交条件是易于操作的，一般是根据所需结果选择的方法。一般说来，例如但不限于，在50％甲酰胺存在下的方便的杂交温度是：对于与靶片段95至100％同源的探针为42℃，90至95％同源的为37℃，70至90％同源的为32℃。
低度，中度和高度严紧的条件是本领域技术人员众所周知的，并根据碱基组成和特定核酸序列的长度以及得到核酸序列的特定生物体的不同而能可推测地变化。有关这种条件的指导，可参见例如Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约，p9．47-9．57；和Ausubel等，1989，分子生物学最新方法，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，纽约(列入本文作为参考)。
在制备基因组文库时，产生了DNA片段，其中一些可编码部分或全部的衣原体HMW蛋白。可使用多种限制性酶在特定位点裂解DNA。或者，可在锰的存在下使用DNA酶以使DNA片段化，或通过例如超声处理物理剪切DNA。然后通过包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，柱层析和蔗糖梯度离心的标准技术根据大小分离DNA片段。然后将DNA片段插入适当载体中，包括但不限于质粒，粘粒，噬菌体λ或T4，杆粒和酵母人工染色体(YAC)(例见Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Glover，D．M．(编)，1985，DNA克隆：操作方法，MRL出版有限公司，英国牛津，Vol．Ⅰ，Ⅱ)。通过使核酸与经标记的探针杂交可筛选基因组文库(Benton和Davis，1977，科学196：180；Grunstein和Hogness，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．72：3961)。
使用本领域众所周知的最适方法，用经标记的对应于HMW蛋白任何肽的氨基酸序列的简并寡核苷酸探针筛选基因组文库。在特定的实施方案中，筛选探针是对应于SEQ ID NO：4的序列的简并寡核苷酸。在另一个实施方案中，筛选探针可以是对应于SEQ ID NO：5的序列的简并寡核苷酸。在另外的实施方案中，寡核苷酸SEQ ID NO：6-9，12-14和18-21中的任一个都可用作探针。在其它实施方案中，序列SEQ IDNO：1，10-11和22-24中的任一个或其任何片段，或其任何互补序列或其片段都可用作探针。优选使用的任何探针为15个核苷酸或更长。
文库中具有编码HMW蛋白或其片段的插入DNA的克隆会与一个或多个简并寡核苷酸探针杂交。使用本领域已知的方法可进行寡核苷酸探针与基因组文库的杂交。例如，与两个上述寡核苷酸探针的杂交可在50℃，2×SSC，1．0％SDS中进行，并使用相同条件洗涤。
另一方面，通过筛选衣原体表达文库也可得到编码部分或全部HMW蛋白或HMW衍生多肽的核苷酸序列的克隆。例如，分离衣原体DNA或由RNA产生的衣原体cDNA，制备随机片段并连接至表达载体(如噬菌体，质粒，噬粒或粘粒)中，将所述载体导入宿主细胞以使载体中的插入序列能被该细胞表达。可使用多种筛选试验选择表达的HMW蛋白或HMW衍生多肽。在一个实施方案中，可使用本领域已知的方法将本发明的多种抗-HMW抗体用于鉴定所需克隆，例见Harlow和Lane，1988，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，附录Ⅳ。将得自文库的克隆或噬斑与抗体接触以鉴定结合的克隆。
在一个实施方案中，根据Olsvick等，29th ICAAC，Houston，Tex．1989所述方法(列入本文作为参考)，使用DYNA珠检测含有编码HMW蛋白或HMW衍生多肽之DNA的克隆或噬斑。将抗-HMW抗体与甲苯磺酰化DYNA珠M280交联，然后使用这些含抗体的珠吸附表达HMW蛋白或HMW衍生多肽的克隆或噬斑。表达HMW蛋白或HMW衍生多肽的克隆或噬斑被鉴定为与珠结合的任何克隆或噬斑。
或者，可将抗HMW抗体非特异性地固定于适当的支持物，如硅石或(CeliteTM树脂上。然后使用该材料吸附上述表达HMW蛋白或HMW衍生多肽的细菌菌落。
另一方面，可使用PCR扩增由衣原体基因组DNA产生基本上纯的编码部分或全部HMW蛋白的DNA。可将对应于已知HMW蛋白序列的简并或非简并寡核苷酸引物用作引物。在特定的实施方案中，可将编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2，3或15-17之肽或其任一部分的简并或非简并寡核苷酸用作5’引物。至于片段的例子，5’引物可由SEQ ID NO：4-7，10，12，22-24中的任一核苷酸序列或其任何部分制成。为SEQID N0：11，13或14之反向互补物的简并或非简并核苷酸序列可用作3’引物。
使用例如Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(GeneAmpTM)可进行PCR。可以选择合成几个不同的简并引物以用于PCR反应。也可以改变引发PCR反应所用杂交条件的严紧性以使简并引物与衣原体DNA的相应序列之间的核苷酸序列相似水平更高或更低。成功扩增编码HMW蛋白的序列的区段之后，可对该区段进行分子克隆或测序，并将该区段用作探针以分离完整的基因组克隆。反过来，可以按上述文献所述测定基因完整的核苷酸序列，分析其表达，产生其蛋白质产物以进行功能分析。
在临床诊断实施方案中，本发明HMW蛋白基因的核苷酸序列可与适当指示物，如标记物联合使用以检测杂交情况。本领域已知多种适当的指示物，包括能提供可测信号的放射性标记，酶标记或其它配体，如亲和素／生物素和地高辛配基标记。在一些诊断实施方案中，可使用酶标记，如脲酶，碱性磷酸酶或过氧化物酶替代放射性标记。使用酶标记时，比色指示底物是已知的，使用它们能提供人眼或分光光度计可见的信号以鉴定与含HMW蛋白基因序列的样品的特异性杂交。
本发明HMW蛋白基因的核酸序列在溶液杂交和利用固相方法的实施方案中可用作杂交探针。在涉及固相方法的实施方案中，将得自样品的受试DNA(或RNA)吸附或要不然粘附于选定的基质或表面，所述样品如临床样品，包括溢泌物，体液(如血清，羊水，中耳渗出物，唾液，精液，尿液，眼泪，粘液，支气管肺泡灌洗液)或甚至是组织。然后在所需条件下使固定的单链核酸与选定探针进行特异性杂交，所述探针含有本发明编码HMW蛋白或其片段或类似物的基因的核酸序列。根据所需的特定规则，选定的条件取决于具体情况，例如，G+C含量，靶核酸的类型，核酸的来源，杂交探针的大小等。洗涤杂交表面以除去非特异性结合的探针分子之后，利用标记物检测或甚至定量检测特异性杂交。优先选择衣原体中保守的核酸序列部分。选定的探针至少为15bp，可以为约30至90bp。
表达HMW蛋白基因
可使用质粒载体在表达系统中表达编码HMW蛋白或其片段的基因，所述载体含有得自与宿主细胞相容之物种的复制子和控制序列。表达载体含有转录和翻译插入的蛋白质编码序列所需的所有必需元件。载体一般携有复制位点以及能在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，可使用含有氨苄青霉素和四环素抗性细胞之基因的pBR322转化大肠杆菌。也可使用其它商购的载体，包括但不限于pZERO，pTrc99A，pUC19，pUC18，pKK223-3，pEX1，pCAL，pET，pSPUTK，pTrxFus，pFastBac，pThioHis，pTrcHis，pTrcHis2和pLEx。噬粒或噬菌体必须也含有或经修饰含有启动子，宿主细胞可使用该启动子表达其自身的蛋白质。
另外，含有与宿主相容之复制子和控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主相关的转化载体。例如，可使用λGEMTM-11中的噬菌体制备用于转化宿主细胞，如大肠杆菌LE392的重组噬菌体载体。
常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统和其它的微生物启动子，如美国专利4，952，496中所述的T7启动子系统。启动子的核苷酸序列的有关细节是已知的，本领域技术人员可将它们与基因有效连接。一般根据所需结果选择所用的特定启动子。
根据本发明，优选通过重组方法制备HMW蛋白，尤其是当分离自衣原体培养物的天然HMW蛋白中含有痕量毒性物质或其它污染物时更是如此。使用在异源系统中重组产生的HMW蛋白可避免这一问题，所述蛋白可以分离物中污染物最少的方式分离自宿主。在此方面，特别合适的表达宿主包括不具有LPS因而不含内毒素的革兰氏阳性细菌。这种宿主包括芽孢杆菌，它们特别适用于产生非热原性的rHMW蛋白及其片段或类似物。
可使用多种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列，它们包括但不限于被病毒(如痘苗病毒，腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；被病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，如含有酵母载体的酵母，或被噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。适于表达HMW蛋白基因及其片段，类似物或变体的宿主包括大肠杆菌，芽孢杆菌，嗜血杆菌，真菌，酵母，如毕赤氏糖酵母，包特菌属，或者也可使用杆状病毒表达系统。优选宿主细胞是细菌，最优选细菌是大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或沙门氏菌。
载体表达元件的强度和特异性有所不同。根据所用的宿主-载体系统，可使用多种适当的转录和翻译元件中的任一种。在优选的实施方案中，表达了含有HMW蛋白或HMW衍生多肽序列和宿主细胞的pre和／或pro序列的嵌合蛋白。在其它优选的实施方案中，表达了含有与例如亲和纯化肽融合的HMW蛋白或HMW衍生多肽序列的嵌合蛋白。在其它优选的实施方案中，表达了含有HMW蛋白或HMW衍生多肽序列和有用的免疫原性肽或蛋白质的嵌合蛋白。在优选的实施方案中，所表达的HMW-衍生蛋白质含有形成天然HMW蛋白的外表面表位或受体结合域的序列。
可使用本领域已知的任何将DNA片段插入载体中的方法来构建含有嵌合基因的表达载体，所述基因由适当的转录／翻译控制信号和蛋白质编码序列组成。这些方法包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(基因重组)。可通过第二核酸序列调节编码HMW蛋白或HMW衍生多肽的核酸序列的表达以使插入序列能在被重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，插入序列的表达可由本领域已知的任何启动子／增强子元件来控制。可用于控制插入序列表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，自然，290：304-310)，Rous肉瘤病毒之3’长末端重复中所含的启动子(Yamamoto等，1980，细胞22：787-797)，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．78：1441-1445)，用于在动物细胞中表达的金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等，1982，自然296：39-42)；用于在细菌细胞中表达的β-内酰胺酶(Villa-Kamaroff等，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．75：3727-3731)，tac(DeBoer等，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．80：21-25)，PL或trc启动子(也见“重组细菌的有用蛋白质”，Scientific American，1980，242：74-94)；胭脂氨酸合成酶启动子区域或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，核酸研究，9：2871)和用于在植入细胞中表达的光合酶核酮糖二磷酸羧化酶启动子(Herrera-Estrella等，1984，自然310：115-120)；酵母或其它真菌的启动子元件，如Gal4启动子，ADC(醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子。
通过3种一般方法可鉴定含有HMW蛋白或HMW衍生多肽编码序列的表达载体：(a)核酸杂交，(b)“标记”基因功能的存在或缺乏和(c)插入序列的表达，如与抗HMW抗体的反应性。在第一种方法中，使用含有与插入的HMW蛋白或HMW衍生多肽编码序列同源的序列的探针，经核酸杂交可检测表达载体中所插入的外源基因的存在。在第二种方法中，根据因载体中插入外源基因所致的某些“标记”基因功能(如胸苷激酶活性，抗生素抗性，转化表型，杆状病毒中的包涵体形成等)的存在与否，可鉴定和选择重组载体／宿主系统。例如，如果HMW蛋白或HMW衍生多肽编码序列被插入载体的标记基因序列内，通过标记基因功能的丧失可鉴定含有插入物的重组体。在第三种方法中，通过检测由重组体表达的外源基因产物可鉴定重组表达载体。这种试验可基于例如HMW蛋白或HMW衍生多肽在体外检测系统中的物理或功能特性，如与HMW配体或受体的结合，或与本发明抗HMW抗体的结合，或宿主细胞凝血的能力或细胞提取物干扰衣原体凝血的能力。
一旦鉴定并分离出特定的重组DNA分子，可使用本领域已知的几种方法使之增殖。一旦确定了适当的宿主系统和生长条件，可大量增殖和制备重组表达载体。如上文所解释，可以使用的表达载体包括但不限于下列载体或其衍生物：人或动物病毒，如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒，如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(如λ)和噬粒和粘粒DNA载体，提到的只是一些代表而已。
另外，可选择能调节插入序列的表达，或以合乎需要的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。在某些诱导物的存在下，某些启动子可使表达水平升高；因此，可以控制经基因工程改造的HMW蛋白或HMW衍生多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特异性的翻译和翻译后加工和修饰蛋白质的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保能按需要修饰和加工所表达的外源蛋白质。
本发明的蛋白质，多肽，肽，抗体和核酸可用作临床或医学诊断衣原体感染的试剂，也可用作有关衣原体之致病性，毒力和感染性以及宿主防御机制的科学研究的试剂。例如，本发明的DNA和RNA可用作探针以通过杂交或PCR扩增鉴定生物样品中衣原体的存在，DNA和RNA也可用于鉴定可能编码与衣原体HMW蛋白相关之多肽的其它细菌。本发明的蛋白质可用于制备多克隆和单克隆抗体，通过亲和层析可将所述抗体用于进一步纯化含有本发明蛋白质的组合物。在标准的免疫测定法中也可使用蛋白质筛选样品中抗衣原体抗体的存在。
7．生物保藏
在提交本申请前，根据布达佩斯条约和37 CFR 1．808的规定将含有具有本文所述衣原体HMW蛋白编码基因之开放阅读框的基因部分的某些质粒保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该中心位于10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，美国。这些质粒中所存在基因的各个部分的鉴定示于下文。
以本美国专利申请为基础的专利被授权之后，公众即可得到保藏材料的样品。本文描述和要求权利的发明不受所保藏质粒的范围限制，因为保藏的方案仅以阐明本发明为目的。编码与本申请所述相似或功能等同的蛋白质或其片段或类似物的任何功能等同的或相似的质粒也包括在本发明的范围之内。
质粒     ATCC保藏号     保藏日
pAH342     ATCC 985538     1997年9月8日
8．实施例
上述内容一般性地描述了本发明，下文实施例提供了更具体的描述。实施例的描述仅是为了阐明本发明，而不会限制本发明的范围。当情况所需或更为便利时，形式的变化和等同物的替代也在考虑之列。尽管本文使用了特定的术语，但这些术语仅是为了描述而不是限制本发明。
描述部分和实施例中使用但未详细描述的分子遗传学，蛋白质生物化学和免疫学的方法在科学文献中已有详尽的报道，本领域技术人员能熟练掌握这些方法。
8．1．实施例1：分离和纯化成熟的衣原体蛋白
于37℃，5％CO2中，使用添加有10％无衣原体抗体的胎牛血清，葡萄糖和非必需氨基酸的DMEM培养基，在标准的225cm2组织培养瓶或Bellco旋动培养瓶(Cytodex microcarrier，Pharmacia)中培养McCoy细胞。砂眼衣原体L2原体(ATCC VR-902B)制备自感染的McCoy细胞的裂解物。基本地，超声处理被砂眼衣原体L2(LGV)感染的McCoy细胞，离心除去细胞碎片。然后离心含有衣原体原体(EB)的上清液，将含有EB的沉淀物重新悬浮于Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中。加入RNA酶／DNA酶溶液，37℃保温1小时，偶尔混合。将含有EB的溶液在Angiovist 370(3，5-双乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸melgumine和3，5-双乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸钠的混合物，BerlexLaboratories，Wayne，NJ)不连续的密度梯度(40％，44％和54％)上分层，超速离心以在梯度上分离EB。离心后，从44％和54％Angiovist 370层界面之间的梯度中收集EB。用磷酸缓冲盐水洗涤EB并重新悬浮于HBSS中。
用含0．1％OGP[高离子强度]的HBSS连续提取纯化的EB以除去外周表面蛋白，然后置于冰上。用含有0．1％OGP，10mM DTT，1mM PMSF，10mM EDTA的50mM Tris pH7．4缓冲液提取同一EB制品。透析(3500MWCO)提取物以除去去污剂和其它试剂，并通过冻干浓缩。用HBSS稀释含蛋白质的提取物，流经商购的肝素-琼脂糖凝胶柱(Hitrap Col．，Pharmacia)。将样品上样于肝素柱之后，通过用过量的HBSS洗涤以除去未粘附的蛋白质。用含有2M氯化钠的PBS分批洗脱结合的蛋白质。充分透析洗脱物以除去盐，然后冻干。通过SDS-PAGE对与肝素结合的蛋白质进行大小分级分离，通过银染进行观察或通过Western印迹进行分析。如图1所示，检测到以中等量存在的约105-115KDa的蛋白质。经测定，天然HMW蛋白的等电点约为5．95。
为了得到一个N末端氨基酸序列，将足够量的HMW蛋白(≥5μg)电印迹于PVDF膜(Applied Biosystems)上，用考马斯蓝染色。从膜上释放固定的HMW蛋白，用低水平的内肽酶Lys-C，内肽酶Arg-C和／或内肽酶Glu-C原位处理之以使天然蛋白质片段化。通过HPLC纯化所得肽片段，使用ABI 430蛋白质测序仪和标准的蛋白质测序方法测定其N末端的氨基酸序列，N-末端的氨基酸序列为：E-I-M-V-P-Q-G-I-Y-D-G-E-T-L-T-V-S-F-X-Y
此序列被表示为SEQ ID NO：3．
当使用精确匹配的参数，用HMW蛋白N末端序列(20个残基)检索复合数据库PDB+SwissProt+PIR+GenPept时，未发现精确的同源性，因此，HMW蛋白是新的衣原体蛋白。由于此蛋白质是在应仅释放外膜蛋白(如0mp2)的条件下分离的，这些数据表明HMW蛋白是表面相关蛋白。
8．2．实施例2：制备针对完整的衣原体EB的抗体
为了鉴定HMW蛋白，针对砂眼衣原体L2的完整EB产生超免疫兔抗血清。用约250微克衣原体EB对每只动物总共进行3次免疫，每次注射(开始用完全弗氏佐剂，接着用不完全弗氏佐剂)间隔约21天。每次免疫时，将约一半的EB肌内(i．m．)给药，另一半结内注射。第三次免疫后14天，肌内给药约100微克EB进行第四次加强免疫，7至10天后，给动物放血，经ELISA测定，得到的滴度为1∶100，000。
8．3．实施例3：测定翻译后修饰
最近，已证实几种砂眼衣原体膜相关蛋白在翻译后被修饰。18KDa和32KDa的富含半胱氨酸的EB蛋白为凝集素-结合蛋白，已证实它携有特异性的糖类组成成分(Swanson，A．F．和C．C．Kuo，1990，Infect．Immun．58：502-507)。放射性标记的棕榈酸的掺入被用于阐明约27KDa的砂眼衣原体Mip-样蛋白是脂质化的(Lundemose，A．G．，D．A．Rouch，C．W．Penn和J．H．Pearce，1993，细菌学杂志，175：3669-3671)。Swanson等发现L2血清变种的MOMP含有N-乙酰葡糖胺和／或N-乙酰半乳糖胺，这些糖类组成成分介导MOMP与Hela细胞膜的结合。
为了确定HMW蛋白是否为糖基化的，可在含氚半乳糖或葡糖胺的存在下，在McCoy细胞上培养EB，对EB进行肝素亲和层析，通过SDS-PAGE和放射自显影分析肝素结合蛋白。简单地说，在标准条件下(DMEM+10％FCS，每瓶35ml，10％CO2)，在T225瓶中培养McCoy细胞至约90％铺满，用足够量的EB接种以获得90％-100％的感染性。37℃感染3小时之后，加入环己酰亚胺(1μg／ml)以抑制宿主细胞合成蛋白质，再将培养物保温4至6小时。然后在每个瓶中加入约0．5mCi含氚半乳糖(D-[4，5-3H(N)]半乳糖，NEN)或葡糖胺(D-[1，6-3H(N)]葡糖胺，NEN)，再将培养物保温30至40小时。刮擦收集细胞，通过梯度离心纯化EB。通过亲和层析从1．0％OGP表面提取物中分离HMW蛋白，用NaCl洗脱，通过使用14C-标记的分子量标记(BRL)的SDS-PAGE，然后进行放射自显影分析HMW蛋白。于-70℃将干燥的凝胶暴露于KodakX-AR胶片达1至4周。
为了测定合成后的脂质修饰，根据标准方法在McCoy细胞单层上培养砂眼衣原体血清变种L2。感染后约24小时，除去常规培养基(DMEM+10％FCS)，用含有环己酰亚胺(1μg／ml)和[U-14C]棕榈酸(0．5mCi／T225瓶，NEN)的无血清培养基取代之，再保温16至24小时以使蛋白质脂质化。按上述制备表面EB提取物，分离肝素结合蛋白，并通过放射自显影进行分析。
通过用适当的糖苷酶处理完整的EB或OGP表面提取物以评估糖基化或脂质化组成成分的功能性。除去糖类之后，对提取物进行亲和层析和SDS-PAGE以测定HMW蛋白是否保留了结合硫酸肝素的能力。
8．4．实施例4：克隆HMW蛋白基因的N末端区段
根据HMW蛋白的N末端氨基酸序列设计简并的寡核苷酸并合成之。然后使用这些寡核苷酸产生基因特异性的PCR产物，该产物可用作杂交探针以筛选砂眼衣原体L2λZAPII DNA文库，从中分离HMW蛋白基因。
简单地说，通过计算机分析(MacVector，IBI)从N末端和内部氨基酸序列数据中鉴定出适当的低简并性的肽区段，使用该区段可指导设计低简并性序列-特异性的寡核苷酸PCR引物套。
使用N末端一级序列作为指导，设计出4个简并的寡核苷酸探针，所述探针与HMW肽的前6个残基E-I-M-V-P-Q(SEQ ID NO：3的残基1-6)互补并含有所有可能的核苷酸组合(总的简并性=192个独立序列)，将该探针用作正向扩增引物。
SEQ ID NO：4    5’-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3’
SEQ ID NO：5    5’-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3’
SEQ ID NO：6    5’-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3’
SEQ ID NO：7    5’-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3’
另外还设计了两个寡核苷酸探针，所述探针代表内部5个残基肽Y-D-G-E-T(SEQ ID NO：3的残基9-13)的反向互补DNA序列并含有所有可能的核苷酸组合(总的简并性=128个独立序列)，将该探针用作反向扩增引物。
SEQ ID NO：8   5’-NGT-YTC-NCC-RTC-ATA-3’
SEQ ID NO：9   5’-NGT-YTC-NCC-RTC-GTA-3’
在使用0．2μmol规格的柱(三苯甲基-on，自动裂解)和标准亚磷酰胺化学法的ABI 380B型DNA合成仪上合成寡核苷酸。在C-18针筒式柱(OP柱，ABI)上手工纯化粗提的寡核苷酸。用分光光度计(230／260／280比例)确定纯度和产量。
使用约0．2微克砂眼衣原体L2DNA(如果是单拷贝的话，约为3×107拷贝HMW蛋白基因)和约100pmol各种正向(N末端寡核苷酸)和反向(内部寡核苷酸)引物，按程序进行标准的PCR扩增反应(2mM Mg2+，200umol dNTP，0．75单位AmpliTaq，终体积为50μl)。至少在开始时应使用高于正常浓度(约20pmol／50μl)的引物进行扩增以补偿引物简并性。使用标准的30轮循环，3步热分布，即95℃ 30秒；60℃ 45秒，72℃ 1分钟获得靶序列的扩增。使用Idaho Technologies热循环仪在密封的50μl玻璃毛细管中进行扩增。为了证实扩增反应过程中产生的PCR产物特异于HMW蛋白编码序列而不是“引物-二聚体”或其它DNA扩增假象，使用硅胶自旋柱(QIAGEN)纯化扩增产物，将其克隆至PCR克隆载体pZERO(StrataGene)中，并直接进行DNA序列分析。
使用常规的双脱氧-终止剂测序化学和经修饰的T7 DNA聚合酶(Sequenase，USB)测定克隆的PCR产物的DNA序列。简单地说，通过用NaOH简单处理变性每个双链质粒模板。中和之后，使用每个变性的模板进行4个独立的测序反应。每个反应含有M13通用正向测序引物(21-聚体)，但ddNTP／dNTP终止混合物(即A，G，C或T)有所不同。通过在反应中包括[α-35S]dATP(约50μCi／反应，＞3000Ci／mmol，Amersham)以标记终止产物。使各个延伸产物变性(甲酰胺，约95℃)，对其进行高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(6％丙烯酰胺，8M尿素，TAE缓冲液，约500V，约90分钟)。然后将测序凝胶转移至滤纸(Whatmann 3MM)上，真空干燥，于-70℃进行放射自显影24至72小时。从每个凝胶上人工读出碱基序列梯并测定共有序列。
通过PCR产生适于文库筛选和／或Southern印迹的HMW蛋白-特异性扩增产物，在扩增过程中，在反应混合物中加入[α-35p]dNTP(每种dNTP约50μCi，＞5000Ci／mmol，Amersham)以均匀地放射性标记所述引物。按上述进行标记反应，不同的是使用Bellco热循环仪在0．5ml微量离心管中进行反应。使用离心大小排阻层析柱(BioSpin 6柱，BioRad)从反应混合物中除去未掺入的标记物和扩增引物。
通过将基因组DNA经EcoRⅠ部分消化而产生的经大小-分级分离的≥10kbp的片段克隆至λ克隆载体λZAPⅡ(Stratagene)中，构建出高度丰余的砂眼衣原体血清变种L2DNA文库(＞50，000原始克隆)。使用经放射性标记的HMW蛋白-特异性PCR产物筛选此文库以得到携有全部或部分HMW蛋白编码序列的重组克隆。这些实验使用了标准的重组DNA方法和方法学。通过连续进行铺板和杂交筛选将与这些探针杂交的所有噬菌体纯化至均质。一旦纯化出反应噬菌体，通过用适当的辅助噬菌体，如R408或VCSMl3(Stratagene)共感染宿主细胞从亲代噬菌体中切除-拯救含有插入物的噬粒(pBluescript SK-衍生物)。通过划线-铺板于含有氨苄青霉素(100微克／ml)的LB琼脂上并选择单菌落以进一步纯化各个噬粒。
为了证实纯化的噬粒衍生物携有HMW蛋白序列，制备质粒DNA，使用该DNA进行含有HMW蛋白特异性PGR引物套的扩增反应。通过适当大小的PCR产物的产生证实HMW蛋白特异性插入物的存在。
质粒pAH306是一个通过这些方法分离的含有HMW蛋白编码序列的衍生物。
pAH306物理图谱的绘制
绘制pAH306中插入物的物理图谱，使用适当的6-碱基限制性内切核酸酶(如EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ，PstⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ等)测定HMW蛋白基因的位置，通过利用放射性标记的N末端特异性PCR产物作为探针进行Southern杂交以定位HMW蛋白编码序列。通过使用由HMW蛋白特异性正向引物和与位于克隆载体中的T3或T7启动子序列互补的反向引物组成的引物套进行PCR分析以测定HMW蛋白特异性序列的方向和长度。
经测定，质粒pAH306含有单个约6．6kbp的EcoRⅠ片段，其来源于衣原体。对pAH306的定向PCR分析阐明该衍生物编码HMW蛋白基因约1．5kbp的N末端区域。
经由与不对称PCR循环测序方法学(ABI Prism Dye-TerminatorCycle Sequencing，Perkin-Elmer)联合使用的常规的“序列-步移”得到pAH306编码的HMW蛋白基因两条链的DNA序列。使用未经消化的质粒DNA(约0．5μg／rxn)作为模板以及适当的HMW蛋白特异性测序引物(约3．5pmol／rxn)进行测序反应。
除了模板和测序引物外，每个测序反应(约20μl)含有4种不同的dNTP(即A，G，C和T)和4种相应的ddNTP(即ddA，ddG，ddC和ddT)终止核苷酸；每种终止核苷酸与4种不同荧光染料中的一种缀合。通过掺入经染料标记的ddNTP终止核苷酸，在沿着模板的随机位置终止单链测序延伸产物。使用微量离心大小排阻层析柱(PrincetonGenetics)纯化经荧光染料标记的终止产物，真空干燥，悬浮于模板重悬浮缓冲液(Perkin-Elmer)中，95℃变性约5分钟，通过在ABI 310自动DNA测序仪(Perkin-Elmer)上进行高分辨率的毛细管电泳以进行分辨。
收集由各个反应产生的DNA序列数据，使用ABI序列分析软件(Perkin-Elmer)在PowerMAC计算机上自动分析相对的荧光峰强度。在使用AutoAssembler软件(Perkin-Elmer)合并成共有序列“行”之前，为了精确起见，可人工编辑各个经自动分析的DNA序列。对pAH306编码的HMW蛋白基因区段的两条链进行测序，将这些数据汇编在一起产生了HMW蛋白基因区段的复合序列。编码HMW蛋白区段的序列示为SEQ ID NO：10，由图2中的核苷酸382至1979表示。pAH306的图谱示于图5。
使用GeneRunner和Intelligentics软件进行HMW蛋白的DNA和推导的氨基酸序列的数据库分析(如一级氨基酸的同源性，亲水性分布图，N-／O-糖基化位点，功能／构象域分析)，证实HMW蛋白是新的。
8．5．实施例5：克隆HMW蛋白基因的C末端区段
使用染色体步移分离HMW蛋白基因的C末端部分。选择远离成熟HMW蛋白的N末端序列并靠近载体的T3启动子序列的约0．6kbpBamHⅠ-EcoRⅠ片段作为初次染色体步移的探针。简单地说，用BamHⅠ和EcoRⅠ完全消化pAH306，通过琼脂糖凝胶电泳(0．8％琼脂糖溶于TAE缓冲液中)对消化产物进行大小分级分离。从凝胶中切下所需的约0．6kbp BamHⅠ-EcoRⅠ(B／E)带，使用商购的硅胶微量离心层析柱和试剂(QIAGEN)纯化之。
经由利用商购试剂(Boehringer Mannheim)的随机-引物标记方法，用[α-dATP](＞3000Ci／mmol，Amersham)放射性标记经纯化的0．6kbp B／E片段，使用该片段探测已用HindⅢ完全消化的砂眼衣原体L2基因组DNA的Southern印迹。
得自pAH306的0．6kbp B／E探针与约1．4kbp的HindⅢ基因组片段杂交。根据pAH306编码的HMW蛋白基因区段中由实验得出的限制性图谱，此片段编码约0．2kbp C末端HMW蛋白序列。
随后，使用经放射性标记的0．6kbp B／E片段探测中等丰余(约5，000个原始克隆)的砂眼衣原体L2文库以鉴定含有约1．4kbpHindⅢ片段的克隆。简单地说，使用10倍过量的限制性内切核酸酶HindⅢ(每1微克基因组DNA约10个单位，37℃，18-24小时)完全消化砂眼衣原体L2基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳(0．8％琼脂糖溶于TAE缓冲液中)对消化产物进行大小分级分离。从凝胶中切下大小约为1．0kbp至2．0kbp的DNA片段，切下的琼脂糖条含有所需的DNA片段大小，将其溶解于增溶／结合溶液(QX1，QIAGEN)中并使用商购的硅胶自旋柱(QIAGEN)纯化之。然后将纯化的1．0-2．0kbp基因组HindⅢ片段克隆至pBlueScript SK-质粒中，所述质粒已预先被HindⅢ完全消化并经牛小肠磷酸酶处理以防止载体再连接。
于25℃，使用T4 DNA连接酶(约10个单位／反应)，以载体∶插入物摩尔比约为1∶10的比例，在约50μl的终反应体积(50mM Tris-HCl，pH7．00；10mM NaCl；1mM ATP；0．5mM DTT)中进行载体／插入物连接约达16至24小时。连接之后，使用等分试样(约50ng连接的DNA)电穿孔感受态的大肠杆菌宿主，如大肠杆菌TOP10。然后将经电穿孔的细胞铺于含约100μg／ml氨苄青霉素的LB琼脂上以选择携有质粒的克隆。通过毛细管作用将约1000个携有质粒的ApR转化子直接从LBAp100琼脂平板上转移至尼龙膜(HyBond N+，Amersham)上。
转移之后，于37℃再次保温平板以再生活菌落供进一步操作。裂解转移至膜的菌落，用变性的SDS／NaOH溶液处理菌落印迹以释放DNA。使用Tris缓冲的NaCl溶液中和和稳定裂解物。通过UV照射使释放的DNA固定于膜上。使用标准重组DNA方法和方法学探测含有经放射性标记的0．6kbp B／E片段的菌落印迹并鉴定携有所需的约1．4kbp HindⅢ片段的重组衍生物。
质粒pAH310是一个通过此方法分离的衍生物，HMW蛋白的编码区段由图2的核苷酸994-2401表示。
单独和联合使用HindⅢ和EcoRⅠ对纯化的质粒DNA进行限制性分析并对该DNA进行DNA序列分析，两者的结果证实pAH310编码预期的约1．4kbp HindⅢ片段。这些分析也证实了约1．4kbp的插入物由pAH306上存在的相同的约1．2kbp HindⅢ-EcoRⅠ片段和唯一的编码C末端HMW蛋白特异性DNA的约0．2kbp EcoRⅠ-HindⅢ片段组成。
选择约0．2kbp EcoRⅠ-HindⅢ(E／H)片段作为第二次染色体步移的探针。简单地说，用EcoRⅠ和HindⅢ完全消化pAH310，通过琼脂糖凝胶电泳(0．8％琼脂糖溶于TAE缓冲液中)对消化产物进行大小分级分离。从凝胶中切下所需的约0．2kbp(E／H)带，纯化，用[α-p32]dATP放射性标记，将其用作探针以鉴定原始的砂眼衣原体L2λZAPⅡ基因组文库中编码HMW蛋白基因C末端区段的克隆。
质粒pAH316是一个通过此方法分离的衍生物，对pAH316的限制性分析阐明此衍生物含有约4．5kbp的砂眼衣原体L2插入物，其由大小约为2．5kbp和2．0kbp的两个EcoRⅠ片段组成。使用约0．2kbp(E／H)片段作为探针进行Southern杂交分析，将此序列定位于pAH316的约2．5kbp EcoRⅠ片段中。利用纯化的pAH316质粒DNA作为模板和特异于约0．2kbp(E／H)片段和T3和T7载体序列的扩增引物套进行定向PCR分析，结果表明pAH316编码HMW蛋白基因C末端区段。HMW蛋白的编码区段由图2的核苷酸1974至3420表示，示于SEQ ID NO：11．
8．6．实施例6：产生截短的HMW重组蛋白
将HMW蛋白N末端的那一半作为约1．5kbp的片段PCR克隆至商购的大肠杆菌表达质粒pTrcHisB(Invitrogen)中。此反应中所用的正向引物被称为140FXHO(57-聚体)，示于SEQ ID NO：18，其含有与成熟HMW蛋白的前10个N末端残基互补的序列。除了HMW蛋白编码序列外，此正向引物也携有唯一的XhoⅠ限制性位点，该位点理想地位于成熟HMW蛋白第一个残基(Glu／E)的上游，从而能与载体质粒上编码的(His)6亲和纯化区域适当地融合，此正向引物中还携有5’末端6碱基G／C夹子(供有效扩增)和12碱基内部间隔序列(供有效的内切核酸酶识别和消化)。
SEQ ID NO：18  5’-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGC-TCG-AGA-GAA-ATT-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-GAT-3’
SEQ ID NO：19  5’-CGC-TCT-AGA-ACT-AGT-GGA-TC-3’
将商购的反向测序引物SK(20聚体，StrataGene)，SEQ ID NO：19用作此反应中的反向扩增引物，SK与pAH306中EcoRⅠ位点下游的噬粒序列互补。为了提高HMW蛋白ORF产物(约1．5kbp)的产量，使用由作为主要扩增聚合酶的T．thermophilus DNA聚合酶（AdvantagePolymerase)和少量可提供额外的5’-3’校正活性的第二高保真性热稳定的DNA聚合酶(CloneTech)组成的热稳定性DNA聚合酶混合物进行PCR扩增。在反应混合物中加入抗-Tth DNA聚合酶抗体以提供自动的“热-起始”条件，该条件可促使＞2kbp的扩增产物产生。使用商购的碱／SDS系统(QIAGEN)和硅胶自旋柱(QIAGEN)纯化质粒DNA，所述DNA被用于进行这些扩增反应(约0．2ng／反应)。
使用硅胶自旋柱从未掺入的引物中纯化约1．5kbp的扩增产物，使用过量的XhoⅠ和EcoRⅠ(约10单位／1微克DNA)完全消化该引物。然后将经纯化和消化的N末端截短的HMW蛋白ORF克隆至已用XhoⅠ和EcoRⅠ消化的商购表达质粒pTrcHisB中(5∶1，插入物∶载体比例)。然后使用连接反应的等分试样电转化适当的大肠杆菌宿主(如TOP10)。
制备随机挑选的氨苄青霉素-抗性转化子的少量DNA，用XhoⅠ，EcoRⅠ或XhoⅠ+EcoRⅠ完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳检查约1．5kbp的截短HMW蛋白ORF插入物的存在和方向。制备经测定携有约1．5kbpXhoⅠ／EcoRⅠ插入物的克隆的少量DNA，将其用于不对称PCR DNA测序反应以证实HMW蛋白片段和表达载体的(His)6亲和纯化区域之间形成的连接的保真性。质粒pJJ36-J是一个通过此方法分离的重组衍生物，由图2的核苷酸446至1977表示。HMW蛋白的截短片段的推导氨基酸序列由图3的氨基酸29至532表示，其示于SEQ ID NO：17。
8．7．实施例7：测定其它衣原体中的存在
进行聚合酶链反应分析以确定HMW基因是否存在于几个临床上认识的砂眼衣原体株以及其它衣原体，如肺炎衣原体中。砂眼衣原体株为得自ATCC(Rockville，MD)的冻干储存物，根据标准方法将其用于感染McCoy细胞次铺满的单层(约80％)。在Sorvall RT6000B离心机中离心感染的单层细胞(约1，300rpm，25℃，30分钟)和／或在感染时用葡聚糖硫酸酯(约50μg／ml)处理以增强低感染性生物变种(非-LGV)与宿主细胞最初的结合，从而增加最终的EB产量。大约48小时之后，刮擦收集感染的单层细胞，超声破碎宿主细胞以释放原体(EB)。使用Denamur等，微生物遗传学杂志，137：2525-2530(1991)(列入本文作为参考)所述的蛋白酶K／Nonidet P40法从各株纯化的EB(约107-108)中提取总DNA，并通过苯酚／氯仿提取和盐沉淀进一步纯化之。纯化的肺炎衣原体(AR-139)基因组DNA购自Advanced Biotechnologies公司。
为了测定这些衣原体株中HMW蛋白基因的存在，使用衣原体总DNA作为模板和下文所列的HMW蛋白区段特异性寡核苷酸引物(21聚体)套进行扩增反应：
SEQ ID NO：20   5’-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-3’
SEQ ID NO：21   5’-GGT-CCC-CCA-TCA-GCG-GGA-G-3’
简单地说，使用约15μl砂眼衣原体DNA粗提取物(约10μl商购的肺炎衣原体DNA)和各约20pmol SEQ ID NO：20和21所示的正向和反向HMW蛋白特异性扩增引物进行标准PCR扩增反应(2mM Mg2+，100μmol dNTP，0．75单位AmpliTaq聚合酶，终体积50μl)。使用32轮循环，3步热分布，即95℃ 30秒；60℃ 30秒，72℃ 1分钟获得小靶序列(≤2kbp)的扩增。除使用MAb-灭活的Tth／Vent DNA聚合酶组合(Advantage PCR，Clontech)，使用的72℃延伸时间为所需PCR产物大小加上2分钟(即所需PCR产物=6kbp，延伸时间=8分钟)外，以与上相同的方法使用粗DNA提取物进行ORF-克隆和测序所用的较长靶序列的扩增。
在ABI 2400热循环仪(Perkin-Elmer)中，使用0．2ml薄壁聚丙烯微量离心管进行常规的和长距离的PCR。热循环之后，分析反应的等分试样(约20μl)，通过标准的琼脂糖凝胶电泳(0．8％琼脂糖溶于TAE缓冲液)和溴化乙锭染色鉴定PCR产物。结果表明HMW蛋白在临床相关的血清变种中是高度保守的；HMW基因存在于所有受试衣原体样品株中，包括血清变种B，Ba，D，E，F，G，H，I，J，K，L1，L2和MoPn，也存在于肺炎衣原体中。
8．8．实施例8：测定序列变异
为了确定不同衣原体株中DNA和氨基酸序列变异的水平，从砂眼衣原体B血清变种(代表砂眼组生物)和砂眼衣原体F血清变种(代表低感染性的STD生物变种)中PCR克隆HMW蛋白基因，并与HMW蛋白共有的砂眼衣原体L2序列相比较。
简单地说，使用LD-PCR由含有成熟HMW蛋白完整编码序列的砂眼衣原体B和F基因组DNA产生约6kbp HMW蛋白特异性DNA片段。这些LD-PCR反应的扩增条件如实施例6所述。这些反应中所用的反向扩增引物(p316Kpn-RC，56聚体)示于SEQ ID NO：13，其与位于推定HMW蛋白终止密码子下游约3kbp处的序列互补。作为克隆所需的约6kbp扩增产物的辅助工具，衣原体序列5’端的单个KpnⅠ限制性内切核酸酶位点被设计到p316Kpn-RC引物中。这些反应中所用的正向扩增引物(p306Kpn-F，56聚体)示于SEQ ID NO：12，其含有与特异于成熟HMW蛋白前10个氨基酸残基(30个核苷酸)以及特异于KpnI位点的5’序列互补的序列。设计p306Kpn-F以使当约6kbp的扩增产物被插入大肠杆菌表达载体pTrcHisB(ClonTech)的KpnⅠ位点时，编码成熟HMW蛋白N末端的序列在框内与该载体高度有效的trc启动子下游所编码的六-His亲和区域连接。
SEQ ID NO：12 5’-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCG-AAA-TTA-TGG-TTC-CTC-AAG-GAA-TTT-ACG-AT-3’
SEQ ID NO：13 5’-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCC-TAA-GAA-GAA-GGC-ATG-CCG-TGC-TAG-CGG-AG-3’
使用硅胶自旋柱(QIAGEN)纯化约6kbp的HMW蛋白产物，使用10倍过量的KpnⅠ(每1微克纯化片段约10单位，37℃)对片段进行两轮8至10小时的KpnⅠ消化循环。第二次消化之后，使用QIAGEN自旋柱除去残留的限制性酶活性，将约6kbp KpnⅠ HMW蛋白片段克隆至预先经KpnⅠ完全消化并经牛小肠磷酸酶处理以防止载体再连接的pTrcHisB质粒中。
于25℃，使用T4 DNA连接酶(约10单位／反应)，以载体∶插入物摩尔比约为1∶5的比例，在约50μl终反应体积(50mM Tris-HCl，pH7．00；10mM NaCl；1mM ATP；0．5mM DTT)中进行载体／插入物连接约2小时。连接之后，使用等分试样(约50ng连接的DNA)电穿孔感受态的大肠杆菌宿主，如大肠杆菌TOP10。然后将经电转化的细胞铺于含约100μg／ml氨苄青霉素的LB琼脂上以选择携有质粒的转化子。37℃保温约18至24小时之后出现氨苄青霉素抗性(ApR)转化子，随机挑选这些转化子，将它们重新划线于相同的选择培养基上以进行纯化。
使用得自各个原始转化子的纯化的ApR单菌落接种约5ml LB肉汤，在37℃保温摇床中中度通气培养过夜(约200rpm)。离心收集肉汤培养物中的细胞，使用该细胞制备少量质粒DNA。提取质粒时使用商购试剂(QIAGEN Plasmid Mini试剂盒)。通过在琼脂糖凝胶(0．8％琼脂糖溶于TAE缓冲液)中电泳未经消化的质粒DNA并鉴定比载体质粒大的衍生物可以鉴定出携有插入物的质粒衍生物。含有插入物的衍生物被证实，单独或联合使用适当的限制性内切核酸酶(KpnⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ等)确定HMW蛋白插入物相对于载体序列的方向。
经由实施例4中所述的与不对称染料-终止剂PCR循环测序方法学(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing，Perkin-E1mer)联合使用的“序列-步移”得到砂眼衣原体B和F HMW蛋白基因两条链的DNA序列。用小量制备的质粒DNA和各个HMW蛋白序列特异性引物进行反应，所述引物曾用于测定L2型衣原体株的HMW蛋白基因序列。
使用ABI 310测序仪收集DNA序列数据，按实施例4所述在PowerMAC计算机上用适当的计算机软件自动分析这些数据。在使用AutoAssembler软件(Perkin-Elmer)合并成共有序列“行”之前，为了精确起见，可人工编辑各个经自动分析的DNA序列。对砂眼衣原体B和F血清变种的HMW蛋白基因的两条链进行测序，将这些数据汇编在一起产生了砂眼衣原体B和F HMW蛋白基因的复合共有序列。这些序列示为SEQ ID NO：14和15，L2，F和B衣原体株的序列比较示于图6。
8．9．实施例9：产生重组蛋白
为了产生足够量的重组HMW蛋白供免疫原性和动物保护研究，将HMW基因PCR克隆至适当的大肠杆菌和杆状病毒表达系统中。在基于大肠杆菌的系统中产生了大量rHMW蛋白，它们是含有N末端(His)6亲和纯化区域的嵌合融合蛋白。按实施例5所述，从砂眼衣原体L2基因组中以单个KpnⅠ片段的形式PCR克隆完整的HMW蛋白开放阅读框(ORF)，并以适当的方向在正确的阅读框内与高表达质粒载体pTrcHisB(CloneTech)上编码的(His)6亲和纯化区域融合。
(His)6亲和纯化区域是高表达基因座的一部分，所述基因座由高度有效的tac启动子(可被IPTG诱导)和紧接(His)6亲和纯化区域上游的共有的Shine和Delgarno核糖体结合位点(RBS)组成。砂眼衣原体LGV L2，砂眼衣原体B和砂眼衣原体F的HMW蛋白基因被PCR克隆成约3．0kbp的片段。这些反应中所用的正向引物(56聚体)被称为p306Kpn-F，其含有与成熟HMW蛋白前10个N末端氨基酸残基互补的序列，示于SEQ ID No：12。除了HMW蛋白编码序列外，该正向引物还携有唯一的KpnⅠ限制性位点，该位点理想地位于成熟HMW蛋白第一个残基(Glu)的上游，从而能与载体质粒上编码的(His)6亲和纯化区域适当地融合，此正向引物中还携有5’末端6碱基G／C夹子(供有效扩增)和12碱基内部间隔序列(供有效的内切核酸酶识别和消化)。反向PCR引物被称为p316Kpn-3RC，其含有与位于HMW蛋白终止密码子下游约0．2kbp处的砂眼衣原体序列反向互补的序列，示于SEQ ID NO：14。至于p306Kpn-F，反向引物还含有位于砂眼衣原体序列5’端的KpnⅠ限制性位点，6碱基的G／C夹子和12碱基的内部间隔序列。
为了提高HMW蛋白ORF产物(约3，500bp)的产量，使用由作为主要扩增聚合酶的T．thermophilus DNA聚合酶和少量可提供额外的5’-3’校正活性的第二高保真性热稳定的DNA聚合酶(AdvantagePolymerase，CloneTech)组成的热稳定性DNA聚合酶混合物进行PCR扩增。在反应混合物中加入抗-Tth DNA聚合酶抗体以提供自动的“热-起始”条件，该条件可促使＞2kbp的扩增产物产生。
按上文实施例所述，从EB中分离多种砂眼衣原体株的基因组DNA，并使用所述DNA进行这些反应。扩增之后，使用商购的硅胶自旋柱(QIAGEN)和试剂(QIAGEN)从过量引物中纯化所需反应产物，并用过量的KpnⅠ(约10单位／1微克DNA)完全消化该产物。然后将经纯化和消化的KpnⅠ HMW蛋白ORF克隆至已用KpnⅠ消化的表达质粒pTrcHisB中(5∶1，插入物∶载体比例)。然后使用连接反应的等分试样电转化适当的大肠杆菌宿主(如TOP10)。
制备随机挑选的氨苄青霉素-抗性转化子的少量DNA，用KpnⅠ，HindⅢ或KpnⅠ+HindⅢ完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检查约3．2kbp的HMW蛋白ORF插入物的存在和方向。按上文实施例所述，使用小量制备的DNA进行不对称PCR DNA测序反应以证实HMW蛋白片段和载体的(His)6亲和纯化区域之间形成的连接的保真性。质粒pAH342是一个通过此方法分离的衍生物，其含有砂眼衣原体L2的HMW蛋白基因ORF并由图2的核苷酸446至3421表示。
在含有100微克／ml Ap的2X-YT肉汤中将重组体培养至对数生长中期(约0．5 0．D．600)并用IPTG(终浓度为1mM)诱导4至5小时以激活载体trc启动子引发的转录。离心收集细胞，使用弗氏压碎器通过裂解制备粗细胞裂解物。
或者使用杆状病毒表达系统来表达rHMW蛋白。这里，按与pTrcHisB基本上相同的方式，将砂眼衣原体L2和砂眼衣原体F的HMW蛋白ORF作为约3kbp的PCR产物PCR-克隆至预先用KpnⅠ完全消化并用CIP处理以使载体再连接最小化的杆状病毒转移载体(如pFastBacHTb)中。然后通过使用商购的杆粒系统(Bac-to-Bac，Gibco)进行位点特异性转座将此次克隆反应中产生的HMW蛋白表达元件(即杆状病毒多角体启动子，N末端(His)6亲和纯化区域，HMW蛋白基因ORF)转移至杆状病毒基因组中。
简单地说，使用标准的转化和选择方法学，用HMW蛋白杆状病毒表达质粒转化含有杆粒(杂合的杆状病毒-质粒复制子)的感受态大肠杆菌DH10bac(Gibco)细胞(庆大霉素抗性)。使用标准的IPTG／X-Gal蓝-白选择鉴定出HMW蛋白表达元件已由表达质粒成功转座至位于杆粒复制子中的lacZ基因内适当受体位点的转化子。
随机挑选白色的GmR转化子并重新划线以进行纯化。通过Ish-Horowitz，N．A．R．9：2989-2993(1981)(列入本文作为参考)的方法由肉汤培养物制备杆粒DNA，使用该DNA转染草地夜蛾9细胞。噬斑纯化之后，使用重组HMW蛋白杆状病毒感染大量夜蛾悬浮培养物。使用酵母表达系统产生糖基化形式的HMW蛋白。
8．10．实施例10：纯化重组蛋白
使用标准的制备性固定化金属亲和层析(IMAC)法将重组HMW蛋白纯化至均质。简单地说，于37℃，在51发酵罐(New Brunswick)中的Luria肉汤中，中度通气培养携有含HMW蛋白基因的表达质粒的大肠杆菌菌株直至对数生长中期(约0．5 O．D．600)，并用IPTG(终浓度为1mM)诱导4至5小时。收集细胞团块，用PBS洗涤并储存于-20℃。通过机械振动将冻干细胞团块的等分试样(湿重约为9至10g)悬浮于约120ml D-PBS中，穿过弗氏压碎器(2×，14，000psi，4℃)以裂解细胞。然后通过高速离心(约10，000×g，4℃，30分钟)从rHMW蛋白包涵体中除去可溶性的蛋白质。
按上述通过混匀和离心将含有rHMW蛋白的不溶性沉淀物悬浮于约20ml冰冷的D-PBS中。通过悬浮于含有6M盐酸胍的磷酸钠缓冲液(0．1M，pH7．0)中以变性经洗涤的rHMW蛋白包涵体，并将包涵体上样于通过标准方法制备自Fast-Flow螯合Sepharose(Pharmacia)并因Ni2+或Zn2+离子而带电的Ni2+-亲和柱(1．5cm×25cm，床体积约为15ml)。通过用约5至10倍柱体积的含有8M尿素的磷酸钠缓冲液(0．1M，pH7．0)洗涤柱可除去未结合的物质。
使用pH4．0磷酸钠／8M尿素缓冲液(约20ml)洗脱利用N末端(His)6亲和纯化区域与亲和树脂结合的重组HMW蛋白。通过加入1．0MTris-HCl(约2．5ml，pH7．5)中和洗脱物，对含有SDS(0．5％)的TE缓冲液透析以除去尿素。使用Centricon-30离心浓缩器(Amicon，30，000 MWCO)浓缩透析物，与1／5体积含有1mM 2-巯基乙醇(Lammeli)的5×SDS凝胶样品缓冲液混合，100℃煮沸5分钟。
将样品上样于Tris／甘氨酸制备性丙烯酰胺凝胶(4％浓缩胶，12％分离胶，30∶0．8丙烯酰胺∶bis溶液，厚度3mm)。与rHMW蛋白样品一起平行电泳预染的分子量标准(SeeBlue，Novex)以在凝胶上鉴定大小组分。切下含有分子量约为50至70Kdal的蛋白质的凝胶带，按厂商说明，使用Elu-Trap装置和膜(S&S)电洗脱蛋白质。透析经电洗脱的蛋白质以除去SDS。使用Micro-BCA系统(Pierce)，以BSA为浓度标准测定样品的蛋白质浓度。如图4所示，使用常规的SDS-PAGE和商购的银染试剂(Silver Stain P1us，Novex)测定rHMW蛋白的纯度。
经SDS-PAGE测定，分离的成熟rHMW的表现分子量约为105至115Kda。
8．11．实施例11：制备HMW蛋白的抗体
通过用纯化的HMW蛋白或其片段免疫兔产生针对HMW蛋白的多价抗血清。用约250微克HMW蛋白或其片段对每只动物总共进行3次免疫，每次注射(开始用完全弗氏佐剂，接着用不完全弗氏佐剂)间隔约21天。每次免疫时，将约一半的药剂肌内(i．m．)给药，另一半结内注射。第三次免疫后14天，肌内给药约100微克HMW蛋白进行第四次加强免疫，7至10天后，给动物放血，使用纯化的HMW蛋白(1．0微克／孔)或砂眼衣原体L2EB(完整的粗蛋白提取物)作为捕获配体，经ELISA测定抗-HMW蛋白滴度。使用纯化的rHMW截短蛋白观察到免疫原特异性的IgG ELISA滴度为1／320，000，使用EB或RB观察到上述滴度为1／2500。
用PBS连续稀释抗血清，并通过ELISA检测双份稀释样品。在这些试验中，使用经1／1000稀释的山羊HRP-缀合的抗兔抗体作为第二报道抗体。滴度被表示为显示出阳性ELISA反应的最大稀释度，即O．D．450值＞高于平均阴性对照值2SD(预先采血的兔血清)。然后使用超免疫的抗血清探测粗EB或RB提取物以及1．0％ OGP EB提取物制品的Western印迹以测定其它砂眼衣原体血清变种和其它衣原体是否表达HMW蛋白。检测了砂眼衣原体血清变种B，Ba，D，F，G，I，J，K，L1，L2，L3，MoPn和肺炎衣原体，发现它们具有表现分子量为105至115Kda的蛋白质，该蛋白质可与针对HMW蛋白产生的抗血清反应。
8．12．实施例12：表面定位
通过间接荧光抗体(IFA)检查HMW蛋白在不同衣原体株和衍生物上的表面定位。使用超免疫的抗HMW蛋白作为第一抗体，通过本领域已知的方法进行IFA。通过下列方法，用砂眼衣原体血清变种L2，B和F，肺炎衣原体或鹦鹉热衣原体之一的完整EB感染Hak细胞。
在24孔组织培养板内的12mm平盖玻片上，于DMEM培养基中将McCoy或Hak细胞培养至铺满，然后用约5×104包涵体形成单位(IFU)的砂眼衣原体N11株(血清变种F)离心接种。保温24小时之后，除去培养基，用甲醇将感染细胞固定10分钟。然后用PBS(1×)洗涤固定的单层以除去固定剂，用＞300μl已用PBS 1／100稀释的抗-60Kdal截短的HMWP兔抗体洗去覆盖层。与第一抗体保温1小时之后，用PBS小心洗涤细胞，再与1／200稀释的与FITC缀合的小鼠抗兔IgG抗体保温约30分钟。使用含有0．0091％Evans Blue作为复染剂的PBS溶液稀释第二抗体以内眼观察单层。用PBS洗涤细胞2次以除去第二抗体，从培养板内取出盖玻片，使用荧光固定介质将其固定在显微镜载玻片上。
平行处理单独用预先采血的兔抗体或与FITC-缀合的第二抗体染色的相同细胞样品，将其用作抗体特异性(阴性)对照。用装配有plan-neoflur物镜的Zeiss Axioskop光学显微镜，以1000倍的放大倍数检查复染的样品。使用砂眼衣原体N11(血清变种为F)的结果示于图7。结果表明：与对照相比，被HMW蛋白抗体染色的样品的荧光增强证实了HMW蛋白位于表面。另外，被HMW蛋白抗体染色样品的荧光显示出与L2，B和MoPn血清变种或肺炎衣原体表面定位的HMW蛋白的结合。
9．实施例：体外中和模型
使用体外中和模型已证实保护性的抗血清抑制多种组织培养细胞系的衣原体感染(中和)。动物模型也是检测疫苗效力所必需的，小型动物(非灵长类)和灵长类模型是临床评价所必需的。已使用豚鼠研究由豚鼠包涵体结膜炎致病原(GPIC)鹦鹉热衣原体引起的实验性眼和生殖器感染。
小鼠提供了一致的、可再现的由人生殖道分离物引起的生殖道感染模型。此小鼠模型是普遍被接受的预临床试验，使用该模型将MOMP作为亚单位疫苗评价。另一个模型是砂眼感染的灵长类动物模型，其中分泌型IgA的诱导是保护作用的基本组成成分。使用上述普遍被接受的体外中和和动物模型系统可测定新亚单位抗原候选物生成疫苗的能力。
动物保护作用研究的初步试验是评价超免疫抗HMW抗体体外阻断多种砂眼衣原体血清变种(如L2，B，F)感染性的能力。尽管使用McCoy细胞增殖衣原体，这些细胞也允许经由Fc受体进行抗体-介导的摄取。因此，为了评价抗HMW抗体对感染性的抑制作用，将未显示出Fc受体的Hak细胞用于这些分析。
于37℃，5％CO2中，在24孔组织培养板内的盖玻片上培养细胞至次铺满单层(约90％铺满=1×105个细胞／ml)。用蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)缓冲液将抗-HMW-抗体稀释至100μg／ml(总蛋白质)，然后用SPG缓冲液进行连续稀释。用SPG缓冲液将预滴定衣原体的冻干等分试样稀释至约2×104IFU／ml。将EB与稀释的抗HMW抗体预混合至约10-20 IFU／μl，于30℃在摇动的平台上保温30分钟。
用HBSS洗涤制备的Hak细胞，然后与抗HMW抗体／衣原体EB混合物保温(每种抗体3份，EB为500 IFU／ml)。37℃下将培养板保温2小时，然后除去种子培养物，用HBSS将培养板洗涤3次。加入含有1μg／ml环己酰亚胺的组织培养基，于37℃，5％CO2中，将培养板保温约24至36小时以生成包涵体。保温之后，除去培养基，用PBS将细胞单层洗涤3次。用甲醇将培养板固定20分钟并重新用PBS洗涤。
通过与抗衣原体LPS抗体(约按1∶500稀释，ViroStat)保温来染色细胞以观察包涵体，用PBS将细胞洗涤3次，37℃与FITC-缀合的山羊第二抗体保温30分钟。洗涤盖玻片，风干，在玻璃盖玻片上用甘油固定之。在Zeiss荧光显微镜下，计数贯穿盖玻片中线的5个区域内的包涵体。结果被表示为与异源抗体对照(兔预先采血的血清)相比含包涵体细胞减少的百分比。
10．实施例：疫苗效力(输卵管炎和能育小鼠模型)
10．1．方法
10．1．1．免疫和攻击
使用Tuffrey鼠不育模型评价rHMWP保护动物免受砂眼衣原体诱导的输卵管炎和不孕症的效力。此评价中使用了3组，各为17只的雌性C3H HeOuJ小鼠(约6周龄，Jackson Labs)。在第0，2和3周，鼻内施用约20微升疫苗制剂以免疫17只动物的试验组，所述制剂含有约10至12微克经凝胶纯化的rHMWP和约5微克作为佐剂的mLT(SmithKline Beecham)。在免疫之前，使用由溶于68％无热原之PBS的16％Ketaject和16％Xylaject组成的麻醉剂混合物使小鼠镇静(每只动物腹膜内注射100微升)。使已服用镇静剂的小鼠背朝下，使用标准的实验室移液管施用疫苗制剂；每只鼻孔约滴10微升疫苗溶液，两次滴加之间等待5至10分钟。
类似地，用仅含有5微克mLT(即仅用佐剂，无抗原)的制剂免疫2组，各为17只的雌性小鼠。随后用砂眼衣原体攻击其中一组(假免疫，感染的)并用作阴性能育对照，而另一组未被攻击(假免疫，假感染)，将其用作阳性能育对照。
第4周，给所有动物施用单一腹膜内剂量的孕酮(2．5mg，溶于无热原的PBS，DepoPro-vera，Upjohn)以稳定子宫上皮细胞。第5周，通过两侧对称地在子宫内接种溶于100微升蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)缓冲液中的约5×105IFU(包涵体形成单位)的砂眼衣原体NI1(血清变种F)，以感染被rHMWP免疫的动物和阴性对照组中的动物。为了模拟其他两组经受的生殖道手术，阳性对照动物双侧接种100μl不含砂眼衣原体的McCoy细胞提取物。第7周，通过CO2窒息处死每组5-7只动物，取出完整的生殖道(上生殖道和下生殖道)用于组织病理学分析。第9周，各组中剩余的雌性动物与8-10周龄雄性C3H小鼠共同笼养2个月的繁殖期，以评价生殖力(每笼1只雄性动物2只雌性动物，组内雄性动物每周轮换，不同实验组动物不混杂)。通过触诊和定期称重确定每一组合内动物何时怀孕。用于估计各组生殖力的参数为：F，交配期内至少产仔一次的小鼠数除以该研究组内小鼠总数；M，新生小鼠数(出生时死亡或存活)除以交配期内该组所产幼仔数；N，新生小鼠数(出生时死亡或存活)除以该组小鼠总数。
10．1．2．组织病理学
生殖道在Bouin固定剂中处理不少于24小时，在50％、70％和100％甲醇中逐步脱水，在甲苯中浸泡，石蜡包埋或直接包埋于OCO化合物(Tissue-TEK，Miles)中，然后在液氮中速冻。组织切片(约6μm)用苏木精和依红染色(Bouin固定样品脱石蜡之后)。输卵管和卵巢中的炎症变化如下分级：0，没有明显炎症反应；1，少数单核细胞浸润输卵管卵周空间或粘膜下层；2，同1但程度更严重；3，同2但输卵管粘膜下层增厚，输卵管腔内有炎症细胞；4，同3但程度更严重。子宫颈／阴道内炎症根据观察到的上皮内浸润水平计分。
10．1．3．确定rHMWP特异性体液应答
免疫和攻击期间通过眶后采血定期收集血样，离心制备血清。用标准实验移液器向阴道内反复注射50μl无菌PBS并立即回收溶液收集阴道分泌物。进行2到3次注射／回收循环。
通过ELISA定量抗体(Ab)应答按照8．11节所述进行。确定抗体水平的微量ELISA板(Maxisorb，NUNC)在4℃每孔用大约0．5-1．0μg凝胶纯化的rHMWP包被过夜，rHMWP溶于10mM碳酸盐／碳酸氢盐缓冲液(pH9．6)，用含有0．1％Tween-20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤，用含有3％BSA的PBS溶液在37℃封闭大约1小时。为确定抗原特异性血清IgG水平，实验血清用含有0．5％BSA的洗涤缓冲液系列稀释，试样(100μl)在抗原包被的孔中37℃温育约2小时。然后洗涤微量板，用偶联有辣根过氧化酶的羊抗小鼠IgG第二抗体(Sigma)在37℃温育大约1小时。HRP偶联的羊抗小鼠IgA第二抗体用来检测阴道分泌物中存在的rHMWP特异性IgA。在与合适的第二抗体温育后，洗涤微量板，与TMB底物(Sigma)在室温下温育约20到30分钟。加入2M硫酸终止反应，在Molecular Devices SpectroMax微量板读数仪上于450纳米测定吸收值。滴度为450纳米时光密度为1的样品稀释度的倒数。
10．1．4．确定rHMWP特异性细胞应答
每组6只雌性C3H HeOuJ小鼠(Jackson Labs)的几组动物分别给予镇静剂，在0、2和3周如10．1．3．节所述通过鼻内给予rHMWP+mLT疫苗进行免疫接种。在第4周和第5周，分别于孕酮处理和尿道内攻击之前，取每组3只动物通过CO2窒息处死，无菌取出脾脏，使用常规方法制成单细胞悬液。分别分析来自免疫动物的脾细胞。阳性对照组(假免疫和假感染)和阴性对照组(假免疫、感染)脾细胞合并，测试再次刺激。
为测试脾细胞增殖，在5毫升RPMI 1640 Glutamax I中碾磨脾脏(5到10转)，上述溶液中添加有10％胎牛血清、25 mM HEPES、50U／ml青霉素、50μg／ml链霉素、1mm丙酮酸钠、非必需氨基酸和50μM 2-巯基乙醇(Gibco-BRL)。活细胞通过台盼蓝染色计数，在同一培养基中稀释至密度为1．0-2．0×106细胞／ml(Falocn 2063聚丙烯管)。在圆底96孔培养板(Nunclon，Nunc)上建立3组重复培养物，每孔是200μl中的大约5×105应答细胞。细胞用1．0 μg／ml rHMWP刺激(抗原特异性增殖)，或用4μg／ml伴刀豆球蛋白A(BoerhingerMannheim)刺激作为阳性刺激对照，未刺激细胞培养物作为细胞激活的阴性对照。在37℃5％ CO2中温育72-96小时后，每孔中细胞用1．0μCi 3H-胸苷(Amersham)脉冲标记大约18小时。脉冲处理过的细胞使用Tomtec细胞收获仪(MkⅢ)收获在玻璃纤维片上，在3道Wallac1450 Trilux液闪计数仪上计数β发射。样品(单独的或合并的)的刺激指数(SI)定义为3孔抗原或ConA刺激T细胞的胸苷吸收平均值除以3孔未刺激细胞的吸收平均值。确定抗原特异性(rHMWP特异性)和ConA特异性增殖的SI。
10．2．结果
10．2．1．异型攻击后对小鼠生殖力的影响
用rHMWP合并mLT进行粘膜免疫可以对由人衣原体临床分离株(NI1，血清变种F)引起的不育提供保护，证据如表1所示。用rHMWP免疫的动物的生殖率(70％，即组内可育雌性动物数／组内动物总数)较阴性对照组(30％，假免疫、感染)显著为高。类似地，与阴性对照组相比，rHMWP免疫组产出更多的后代，组生殖力更大(后代分别为51和24，生殖力得分为5．1±4．7和2．4±4．6)。从组间来看，用rHMWP疫苗免疫的动物与假感染阳性对照组动物(80％生殖率，后代总数为56，生殖力4．9±2．7)的生殖率、后代总数和生殖力得分相当。
本实验中对砂眼衣原体引起的不育的保护也证实了rHMWP对抗砂眼衣原体疾病提供跨生物变种和跨血清变种保护的用途。本实验中使用的重组HMWP抗原克隆自属于砂眼衣原体性病淋巴肉芽肿(LGV)组的菌株(菌株L2)，该菌株引起全身性以及更多见为眼和生殖道的局部粘膜感染。这些实验中使用的砂眼衣原体攻击生物NI1菌株是属于砂眼生物变种的F血清变种的生物，它们引起多种泌尿生殖道感染。
表1．大约2个繁殖周期后生殖力评估
组别 每组动物数 动物生殖力百分数 后代数 组生殖力1均值±SD
 rHMWP免疫组 10  70p=0．0892 51  5．10±4．68p=0．1053
假免疫假感染组(阳性对照) 10  80p=0．035 56  4．90±2．70p=0．078
假免疫感染组(阴性对照) 10  30 24  2．40±4．61
1．每组幼仔平均数
2．Fisher精确测定，单侧，95％置信区间
   p值相对阴性对照给出
3．Student t测定，不成对，Gausian分布，95％置信区间
   p值相对阴性对照给出
10．2．2．对细胞免疫应答的影响
rHMWP特异性细胞免疫系统激活使用常规脾细胞增殖实验证实。当脾细胞在第4周(孕酮处理之前)(表2)和第5周(激素处理后约7天，但在尿道内攻击之前)(表3)测试时，来自rHMWP免疫动物的所有样品形成强抗原特异性增殖免疫应答。rHMWP免疫动物孕酮处理前的抗原特异性刺激指数(SI)等于或大于用ConA进行促有丝分裂获得的SI(抗原和ConA刺激的平均值获自3只rHMWP免疫动物，分别为26．2和18．4)。获自假免疫动物或未免疫动物(即未接触过rHMWP抗原或mLT的动物)的脾细胞对rHMWP物质的体外再次刺激无应答，因此确立了免疫动物中观察到的增殖应答的特异性。孕酮处理不影响rHMWP免疫动物中观察到的抗原特异性增殖应答。激素处理后获得的脾细胞的抗原特异性SI大于促有丝分裂刺激获得的SI(抗原和ConA刺激的平均值获自3只rHMWP免疫动物，分别为92．4和37．8)。来自假免疫或未免疫动物的样品未显示任何抗原特异性增殖应答。
表2．激素处理前rHMWP特异性细胞增殖
    组别     细胞增殖(cpm)未处理／ConA／rHMWP     刺激指数(处理cpm／未处理cpm)ConA／rHMWP
 rHMWP免疫动物1     1557／20739／65741     13．3／42．2
 rHMWP免疫动物2     1508／26975／28361     17．9／18．8
 rHMWP免疫动物3     1238／29991／23453     24．0／18．9
假免疫动物(合并的)     1687／30546／1292     18／＜1．0
未免疫动物(合并的)     335／23886／838     71／2．5
表3．激素处理后rHMWP特异性细胞增殖
    组别     细胞增殖(cpm)未处理／ConA／rHMWP     刺激指数(处理cpm／未处理cpm)ConA／rHMWP
 rHMWP免疫动物1     767／15934／97458     20．8／127．0
 rHMWP免疫动物2     546／17212／28172     31．5／51．6
 rHMWP免疫动物3     297／18139／29300     61．1／98．6
假免疫动物(合并的)     273／18094／150     66．3／＜1．0
未免疫动物(合并的)     345／16740／1341     48．5／3．9
10．2．3．对体液免疫应答的影响
为了证实用全长rHMWP免疫产生体液免疫应答，在第5周攻击之前(即第3次免疫后大约2周)收集的血清的IgG滴度通过ELISA测定。如表4所示，用3剂大约10-12μg rHMWP免疫C3H小鼠在所有动物中产生可检测水平的抗rHMWP IgG。同时从这些动物收集阴道分泌物，测定抗rHMWP粘膜IgA。在3只动物中检测到了抗原特异性阴道IgA(表4)。
表4．rHMWP特异性体液应答
rHMWP免疫动物 抗rHMWP血清IgGELISA滴度 抗rHMWP阴道IgA存在与否
    4．4     5000
    4．5     6000
    4．6     12000     +
    4．7     130
    4．8     100
    4．9     54000     +
    4．10     670
    4．11     100
    4．12     570
    4．13     100000     +
    4．14     4500
    4．15     400
    4．16     1600
    4．17     2500
    4．18     700
    4．19     70000
    4．20     500
    4．21     2000
    4．22     18000
    4．23     3000
    均值±S．D．     18．5±29．6
11．实施例：PJJ701的构建
含有全长衣原体L2 HMWP基因的质粒通过选择性除去pAH306(见8．4节)中HMWP N末端上游的EcoRⅠ位点而构建。这通过用XhoⅠ完全消化pAH306，然后重新连接质粒形成pAH306-Xho△-1而完成。含有剩余的HMWP C末端、来自pAH316(8．5节)的大约2．5 Kbp EcoRⅠ片段从制备性凝胶中分离，凝胶中已加载有pAH316的EcoRⅠ完全消化产物。含有合适的约2．5Kbp片段的琼脂糖凝胶胶条切出，用NaⅠ缓冲液溶解，通过羟基磷灰石自旋柱层析(QiaGen)从剩余的琼脂糖纯化。纯化的C末端HMWP EcoRⅠ片段连接至pAH306-Xho△-1的单一EcoRⅠ位点，它位于HMWP N末端编码序列的3’末端，使用T4 DNA连接酶和标准分子生物学方法。大肠杆菌Top10细胞用pAH306-Xho△-1试样(EcoRⅠ消化和磷酸酶处理的载体)和2．5 Kbp EcoRⅠ C末端片段连接反应产物转化，重组子在含100μg／ml氨苄青霉素的2X-YT琼脂上选择。氨苄青霉素抗性转化子随机挑出。质粒DNA使用QiaGen小量制备质粒DNA分离系统从单个ApR转化子中分离，通过常规琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色筛选大于pAH306-Xho△-1的质粒。携带2．5Kbp HMWP片段的pAH306-Xho△-1衍生物定向合适就可以表达全长HMWP，使用EcoRⅠ和／或XhoⅠ限制性分析鉴定之。质粒pAH374是该试验中分离的一个衍生物。
基于PCR的定点诱变方法(Quik-Change定点诱变系统，Stratagene)用来实现所需DNA改变，即在pAH374的HMWP编码序列中除去NdeⅠ位点。诱变PCR引物140-Nde-FX和14-NdeRCX长度为41个碱基，互补于含有NdeⅠ位点的序列，将其设计成消除NdeⅠ识别位点但不改变相应蛋白编码序列。用来除去pAH374中NdeⅠ位点的两个PCR诱变引物序列如下。
140-Nde-FX (SEQ ID NO：38)
5’-GGG TTT GGG AAT CAG CAC ATG AAA ACC TCA TAT ACA TTT GC-3’
140-Nde-RCX (SEQ ID NO：39)
5’-GCA AAT GTA TAT GAG GTT TTC ATG TGC TGA TTC CCA AAC CC-3’
Pfu DNA聚合酶(Stratagene)诱变和DpnⅠ消化以切割任何未改变的pAH374亲本质粒之后，突变的质粒DNA转化进入大肠杆菌XL1-Blue。携带质粒的转化子在含100μg／ml氨苄青霉素的2X-YT琼脂上选择。抗生素抗性转化子随机挑出，筛选大小同pAH374的质粒。转化子中分离的质粒通过EcoRⅠ限制性内切酶消化确认。这些质粒中缺少NdeⅠ位点通过NdeⅠ消化确定。为了确证HMWP NdeⅠ位点的丢失并确保诱变过程中该区域中没有不希望的DNA序列改变，使用位于NdeⅠ位点上游的序列特异性测序引物对诱变质粒进行DNA序列分析。质粒pAH374-Nde△-1是从该试验中分离的一个质粒。
质粒pAH374-Nde△-1中缺少内部NdeⅠ位点、编码砂眼衣原体L2HMWP的DNA片段通过PCR扩增，使用质粒pAH374-Nde△-1(约50ng)和引物306-Nde-Met1和312H6Xba1。引物306NdeMet1被设计成包含中央NdeⅠ位点，以便定向克隆至pMG81。306NdeMet1中的NdeⅠ位点与HMWP信号序列的ATG起始密码子重叠，其5’侧翼是20个碱基的G／C夹子，3’侧翼是与HMWP信号序列的前15个残基互补的序列。引物312H6Xba1被设计成包含与HMWP C末端互补的序列，其后是限定6组氨酸亲和纯化结构域的(CAT)6基序。该引物也含有2个UAA终止密码子，1个XbaⅠ识别序列，在引物的3’末端是20个碱基的G／C夹子。306NdeMet1和312H6Xba1 PCR引物的序列如下。306NdeMet1 (SEQ ID NO：40)5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG ACA TAT GGA AAC GTC TTT CCA TAA GTTCTT TCT TTC A-3’312H6Xba1 (SEQ ID NO：41)5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGT CTA GAT TAT TAA TGA TGA TGA TGATGA TGG AAC CGG ACT CTA CTT CCT GCA CTC AAA CC-3’
8．4．节所述PCR扩增条件用来产生NdeⅠ-XbaⅠ HMWP基因盒。扩增后，PCR产物使用羟基磷灰石自旋柱(QiaGen)纯化，用大约10倍过量的NdeⅠ和XbaⅠ 37℃消化过夜，在片段末端产生所需的“突出端”。消化的片段使用自旋柱再次纯化，大约250纳克连接到大约50纳克pMG81质粒DNA上，该质粒DNA事先已用NdeⅠ和XbaⅠ完全消化，随后用CIP处理以防止载体再连接。一份连接反应产物试样用来转化大肠杆菌AR58菌株，该菌株已经通过Lederberg和Cohen法处理变成感受态。转化子在含有40μg／ml硫酸卡那霉素的2X-YT琼脂上选择。由于pMG81上温度可诱导的启动子，转化的细胞在30℃生长。卡那霉素抗性转化子随机挑出，筛选较pMG81大3．0Kbp的质粒。含有插入片段的pMG81衍生物通过使用NdeⅠ，XbaⅠ，EcoRⅠ和NcoⅠ限制性内切酶分析证实。质粒pJJ701是该操作中分离的一个质粒。
12．实施例16：从AR58(PJJ701)产生全长rHMWP
1毫升含有质粒pJJ701的大肠杆菌菌株AR58的冻存原种接种大约100毫升含有40μg／ml卡那霉素的2X-YT肉汤，30℃生长过夜，以制备发酵种子培养物。大约20毫升过夜种子培养物用来接种NewBrunswick Bioflow 3000发酵罐，发酵罐中装有大约2升含有40μg／ml卡那霉素的2X-YT肉汤。AR58(PJJ701)培养物在30℃充分通气生长，直至OD625值为0．5-0．6。通过提高发酵培养物温度至大约39到42℃诱导rHMWP表达。在较高温度下温育持续大约4-5个小时。
在诱导期末，某些细胞显示典型的重组蛋白包函体，使用HeraeusContifuge 28RS离心机通过连续流动离心收集大肠杆菌培养物。离心后，从离心管上刮下细胞沉淀，-70℃保存待用。
大约15gm AR58(pJJ701)冻存细胞沉淀在大约40毫升冰冷的10mM磷酸钠缓冲液(pH7．3)中涡旋搅拌并碾磨。悬浮后，加入溶菌酶(鸡蛋白，Sigma)和DnaseⅠ(牛胰腺，Sigma)至终浓度分别为1．0mg／ml和0．01mg／ml，混合物在冰上温育30到45分钟。细胞连续两次通过预冷的(大约4℃)SLM Aminco弗氏压力室(大约14Kpsi，1”内径)以破碎之。在Sprvall SS34转头中以大约20000×g离心45分钟分离含有rHMWP的不溶物质(沉淀)。该离心获得的上清液弃去，沉淀形式的不溶组分在-20℃下储存。
为选择性提取污染的蛋白并除去内毒素，含有rHMWP的不溶性沉淀在冰上融化，用10毫升含有2．0％Triton X-100的PBS缓冲液洗涤两次。在室温下洗涤，通过常规玻璃组织碾磨机涡旋搅拌和匀浆获得含有rHMWP的胶质沉淀悬液。通过在Sorvall SS34转头中大约10000×g离心20分钟(室温)洗涤获得含有rHMWP的不溶物质。不溶物质用10毫升含有2．0M氯化钠的4．0M尿素溶液洗涤2次(同样涡旋搅拌和匀浆)。洗涤过的rHMWP物质同上离心回收。不溶性rHMWP组分用含有1．0％Zwittergent 3-14(Sigma)的PBS溶液再洗2次。
最后一次洗涤后离心回收的rHMWP沉淀在含有4M尿素的标准Laemelli SDS-PAGE样品缓冲液中于室温溶解2小时。溶解的rHMWP通过电泳大小分离成大约110Kdal的单一蛋白带，使用标准14cm×20cm×3mm聚丙烯酰胺(36∶1，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)Tris／甘氨酸／SDS制备性凝胶。使用每孔大约500μl的5孔制备梳形成的4％聚丙烯酰胺浓缩胶在分离胶以上聚合。电泳在BioRad Protean单元中使用常规Tris／甘氨酸／SDS电泳缓冲液(BioRad)大约22℃进行约12小时(约80到85伏特，恒定电压)。预先染色的分子量标准物(SeeBlue，Novex)上样于平行泳道中，用来测量蛋白种类分离的程度和效果。电泳后，拆开凝胶夹层，从与分子量标准物相邻的rHMWP样品泳道中取出垂直的胶条，用考马斯兰R250染色显示rHMWP带。染色的区段在剩余的未染色制备性凝胶上重新定位，鉴定含有rHMWP的丙烯酰胺条带并切出。
使用Schleicher and Schuell EluTrap电洗脱仪自凝胶胶条中洗出rHMWP。电洗脱基本按照厂商说明进行，不同之处在于约1／4强度的SDS电泳缓冲液(Novex)用作洗脱缓冲液。洗脱在约40mA于室温中进行12到14小时。在洗脱期末细胞的极性倒转约2到3分钟，以除去吸附在BT1膜上的任何蛋白。含rHMWP的溶液从收集室中除去，4℃下储存在聚丙烯锥形管中。
过量的SDS去污剂使用SDS沉淀系统(SDS-OUT沉淀试剂盒，Pierce Chemical)除去。由凝胶洗脱的蛋白溶液中除去过量去污剂按照厂商说明完成。去污剂提取的rHMWP用无菌无内毒素的10mM磷酸钠缓冲液(pH7．4)稀释大约15倍，在Amicon搅拌离心室中使用YM30超离心膜超离心浓缩到大约1．0mg／ml。
残留的内毒素通过多粘菌素B Affi-Prep多粘菌素基质(BioRad)处理从浓缩的rHMWP溶液中除去。Affi-Prep处理在4℃下按照厂商说明以分批方式进行过夜。
浓缩的多粘菌素B处理的rHMWP的蛋白浓度使用Micro BCA法(Pierce Chem．)确定，BSA作为标准物。
纯化的rHMWP(约0．9-1．2mg／ml蛋白浓度)分别通过SDS-PAGE、Western印迹和比色内毒素测定法(BioWhittaker)估计纯度、同一性和残余内毒素负荷．凝胶纯化的rHMWP物质通过凝胶分析为具有预期分子量(约 110Kdal)的单一带，显示其纯度大于95％，在Western印迹中它与rHMWP特异性K196抗体强烈反应。经计算残余内毒素小于0．05EU／μg。
序列表&#60110&#62 ANTEXBIOLOGICS，INC．&#60120&#62 衣原体蛋白、其基因序列及用途&#60130&#62 7969-076&#60140&#62&#60141&#62&#60150&#62 08／942，596&#60151&#62 1997-10-02&#60160&#62 41&#60170&#62 PatentIn Ver．2．0&#60210&#62 1&#60211&#62 4435&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：
重组表达载体&#60400&#62 1gggcaaaact cttccccccg ggatttatat gggaaagggg aaactttggc ccgtattcaa 60gcgccacggg ttttggggcg gaatgaattt tttcgttccg gaaaaagtaa ttccccggga 120acgtagggta tcggtttcat aggctcgcca aatgggatat aggtggaaag gtaaaaaaaa 180ctgagccaag caaaggatag agaagtcttg taatcatcgc aggttaaagg ggggatgtta 240ttttagcctg caaatagtgt aattattgga tcctgtaaag agaaaaggac gaatgcgctg 300aagataagaa catttattga tattaaatta ttaatttttt atgaagcgga gtaattaatt 360ttatctctca gcttttgtgt gatgcaaacg tctttccata agttctttct ttcaatgatt 420ctagcttatt cttgctgctc tttaaatggg gggggatatg cagcagaaat catggttcct 480caaggaattt acgatgggga gacgttaact gtatcatttc cctatactgt tataggagat 540ccgagtggga ctactgtttt ttctgcagga gagttaacat taaaaaatct tgacaattct 600attgcagctt tgcctttaag ttgttttggg aacttattag ggagttttac tgttttaggg 660agaggacact cgttgacttt cgagaacata cggacttcta caaatggggc agctctaagt 720aatagcgctg ctgatggact gtttactatt gagggtttta aagaattatc cttttccaat 780tgcaattcat tacttgccgt actgcctgct gcaacgacta ataagggtag ccagactccg 840acgacaacat ctacaccgtc taatggtact atttattcta aaacagatct tttgttactc 900aataatgaga agttctcatt ctatagtaat ttagtctctg gagatggggg agctatagat 960gctaagagct taacggttca aggaattagc aagctttgtg tcttccaaga aaatactgct 1020caagctgatg ggggagcttg tcaagtagtc accagtttct ctgctatggc taacgaggct 1080cctattgcct ttgtagcgaa tgttgcagga gtaagagggg gagggattgc tgctgttcag 1140gatgggcagc agggagtgtc atcatctact tcaacagaag atccagtagt aagtttttcc 1200agaaatactg cggtagagtt tgatgggaac gtagcccgag taggaggagg gatttactcc 1260tacgggaacg ttgctttcct gaataatgga aaaaccttgt ttctcaacaa tgttgcttct 1320cctgtttaca ttgctgctaa gcaaccaaca agtggacagg cttctaatac gagtaataat 1380tacggagatg gaggagctat cttctgtaag aatggtgcgc aagcaggatc caataactct 1440ggatcagttt cctttgatgg agagggagta gttttcttta gtagcaatgt agctgctggg 1500aaagggggag ctatttatgc caaaaagctc tcggttgcta actgtggccc tgtacaattt 1560ttaaggaata tcgctaatga tggtggagcg atttatttag gagaatctgg agagctcagt 1620ttatctgctg attatggaga tattattttc gatgggaatc ttaaaagaac agccaaagag 1680aatgctgccg atgttaatgg cgtaactgtg tcctcacaag ccatttcgat gggatcggga 1740gggaaaataa cgacattaag agctaaagca gggcatcaga ttctctttaa tgatcccatc 1800gagatggcaa acggaaataa ccagccagcg cagtcttcca aacttctaaa aattaacgat 1860ggtgaaggat acacagggga tattgttttt gctaatggaa gcagtacttt gtaccaaaat 1920gttacgatag agcaaggaag gattgttctt cgtgaaaagg caaaattatc agtgaattct 1980ctaagtcaga caggtgggag tctgtatatg gaagctggga gtacatggga ttttgtaact 2040ccacaaccac cacaacagcc tcctgccgct aatcagttga tcacgctttc caatctgcat 2100ttgtctcttt cttctttgtt agcaaacaat gcagttacga atcctcctac caatcctcca 2160gcgcaagatt ctcatcctgc agtcattggt agcacaactg ctggttctgt tacaattagt 2220gggcctatct tttttgagga tttggatgat acagcttatg ataggtatga ttggctaggt 2280tctaatcaaa aaatcaatgt cctgaaatta cagttaggga ctaagccccc agctaatgcc 2340ccatcagatt tgactctagg gaatgagatg cctaagtatg gctatcaagg aagctggaag 2400cttgcgtggg atcctaatac agcaaataat ggtccttata ctctgaaagc tacatggact 2460aaaactgggt ataatcctgg gcctgagcga gtagcttctt tggttccaaa tagtttatgg 2520ggatccattt tagatatacg atctgcgcat tcagcaattc aagcaagtgt ggatgggcgc 2580tcttattgtc gaggattatg ggtttctgga gtttcgaatt tcttctatca tgaccgcgat 2640gctttaggtc agggatatcg gtatattagt gggggttatt ccttaggagc aaactcctac 2700tttggatcat cgatgtttgg tctagcattt accgaagtat ttggtagatc taaagattat 2760gtagtgtgtc gttccaatca tcatgcttgc ataggatccg tttatctatc tacccaacaa 2820gctttatgtg gatcctattt gttcggagat gcgtttatcc gtgctagcta cgggtttggg 2880aatcagcata tgaaaacctc atatacattt gcagaggaga gcgatgttcg ttgggataat 2940aactgtctgg ctggagagat tggagcggga ttaccgattg tgattactcc atctaagctc 3000tatttgaatg agttgcgtcc tttcgtgcaa gctgagtttt cttatgccga tcatgaatct 3060tttacagagg aaggcgatca agctcgggca ttcaagagcg gacatctcct aaatctatca 3120gttcctgttg gagtgaagtt tgatcgatgt tctagtacac atcctaataa atatagcttt 3180atggcggctt atatctgtga tgcttatcgc accatctctg gtactgagac aacgctccta 3240tcccatcaag agacatggac aacagatgcc tttcatttag caagacatgg agttgtggtt 3300agaggatcta tgtatgcttc tctaacaagt aatatagaag tatatggcca tggaagatat 3360gagtatcgag atgcttctcg aggctatggt ttgagtgcag gaagtagagt ccggttctaa 3420aaatattggt tagatagtta agtgttagcg atgccttttt ctttgagatc tacatcattt 3480tgttttttag cttgtttgtg ttcctattcg tatggattcg cgagctctcc tcaagtgtta 3540acgcctaatg taaccactcc ttttaaggga gacgatgttt acttgaatgg agactgcgct 3600tttgtcaatg tctatgcagg agctgaagaa ggttcgatta tctcagctaa tggcgacaat 3660ttaacgatta ccggacaaaa ccatacatta tcatttacag attctcaagg gccagttctt 3720caaaattatg ccttcatttc agcaggagag acacttactc tgagagattt ttcgagtctg 3780atgttctcga aaaatgtttc ttgcggagaa aagggaatga tctccgggaa aaccgtgagt 3840atttccggag caggcgaagt gattttctgg gataactccg tggggtattc tcctttatct 3900actgtgccaa cctaatcatc aactccgcct gctccaacag ttagtgatgc tcggaaaggg 3960tctatttttt ctgtagagac tagtttggag atctcaggcg tcaaaaaagg ggtcatgttc 4020gataataatg ccgggaattt cggaacagtt tttcgaggta agaataataa taatgctggt 4080ggtggaggca gtgggttccg ctacaccatc aagtacgact tttacagtta aaaactgtaa 4140agggaaagtt tctttcacag ataacgtagc ctcttgcgga ggcggagtgg tttataaagg 4200cattgtgctt ttcaaagaca atgaaggagg catattcttc cgagggaaca cagcatacga 4260tgatttaagg attcttgctg ctactaatca ggatcagaat acggagacag gaggcggtgg 4320aggagttatt tgctctccag atgattctgt aaagtttgaa ggcaataaag gttctattgt 4380ttttgattac aactttgcaa aaggcagagg cggaagcatc ctaacgaaag aattc      4435&#60210&#62 2&#60211&#62 1012&#60212&#62 PRT&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 2Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu Ser Met Ile Leu Ala Tyr1               5                  10                  15Ser Cys Cys Ser Leu Asn Gly Gly Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met Val20                  25                  30Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr35                  40                  45Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe Ser Ala Gly Glu50                  55                  60Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Leu Pro Leu Ser65                  70                  75                  80Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu Gly Arg Gly His85                  90                  95Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala Leu100                 105                 110Ser Asn Ser Ala Ala Asp Gly Leu Phe Thr Ile Glu Gly Phe Lys Glu115                 120                 125Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu Ala Val Leu Pro Ala Ala130                 135                 140Thr Thr Asn Lys Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Ser Thr Pro Ser145                 150                 155                 160Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu Leu Asn Asn Glu165                 170                 175Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Gly Asp Gly Gly Ala Ile180                 185                 190Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly Ile Ser Lys Leu Cys Val Phe195                 200                 205Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys Gln Val Val Thr210                 215                 220Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro Ile Ala Phe Val Ala Asn225                 230                 235                 240Val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Gln245                 250                 255Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro Val Val Ser Phe260                 265                 270Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val Ala Arg Val Gly275                 280                 285Gly Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu Asn Asn Gly Lys290                 295                 300Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro Val Tyr Ile Ala Ala Lys305                 310                 315                 320Gln Pro Thr Ser Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asn Asn Tyr Gly Asp325                 330                 335Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala Gly Ser Asn Asn340                 345                 350Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val Val Phe Phe Ser Ser355                 360                 365Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Lys Lys Leu Ser370                 375                 380Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Arg Asn Ile Ala Asn Asp385                 390                 395                 400Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser Ala405                 410                 415Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala Lys420                 425                 430Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Gln Ala Ile435                 440                 445Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala Gly450                 455                 460His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn Asn465                 470                 475                 480Gln Pro Ala Gln Ser Ser Lys Leu Leu Lys Ile Asn Asp Gly Glu Gly485                 490                 495Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Gln500                 505                 510Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala Lys515                 520                 525Leu Sar Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met Glu530                 535                 540Ala Gly Ser Thr Trp Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln Pro545                 550                 555                 560Pro Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser Leu565                 570                 575Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro Pro Thr Ash Pro580                 585                 590Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala Gly595                 600                 605Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp Thr610                 615                 620Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asn Val625                 630                 635                 640Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Lys Pro Pro Ala Asn Ala Pro Ser Asp645                 650                 655Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr Gly Tyr Gln Gly Ser Trp660                 665                 670Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly Pro Tyr Thr Leu675                 680                 685Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Glu Arg Val690                 695                 700Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile Leu Asp Ile Arg705                 710                 715                 720Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly Arg Ser Tyr Cys725                 730                 735Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Phe Tyr His Asp Arg740                 745                 750Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly Gly Tyr Ser Leu755                 760                 765Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly Leu Ala Phe Thr770                 775                 780Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val Val Cys Arg Ser Asn His785                 790                 795                 800His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Thr Gln Gln Ala Leu Cys805                 810                 815Gly Ser Tyr Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Ser Tyr Gly Phe820                 825                 830Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala Glu Glu Ser Asp835                 840                 845Val Arg Trp Asp Asn Asn Cys Leu Ala Gly Glu Ile Gly Ala Gly Leu850                 855                 860Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Pro865                 870                 875                 880Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu Ser Phe Thr Glu885                 890                 895Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Lys Ser Gly His Leu Leu Asn Leu900                 905                 910Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser Ser Thr His Pro915                 920                 925Asn Lys Tyr Ser Phe Met Ala Ala Tyr Ile Cys Asp Ala Tyr Arg Thr930                 935                 940Ile Ser Gly Thr Glu Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Glu Thr Trp Thr945                 950                 955                 960Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly Val Val Val Arg Gly Ser965                 970                 975Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu Val Tyr Gly His Gly Arg980                 985                 990Tyr Glu Tyr Arg Asp Ala Ser Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Ala Gly Ser995                1000                1005Arg Val Arg Phe1010&#60210&#62 3&#60211&#62 20&#60212&#62 PRT&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 3Glu Ile Met Val Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val1                 5                  10                  15Ser Phe Xaa Tyr20&#60210&#62 4&#60211&#62 l8&#60212&#62 DNA&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 4gaaathatgg tnccncaa                        18&#60210&#62 5&#60211&#62 18&#60212&#62 DNA&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 5gaaathatgg tnccncag                        18&#60210&#62 6&#60211&#62 18&#60212&#62 DNA&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 6gagathatgg tnccncaa                      18&#60210&#62 7&#60211&#62 18&#60212&#62 DNA&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 7gagathatgg tnccncag                      18&#60210&#62 8&#60211&#62 15&#60212&#62 DNA&#60213&#62 表原体&#60400&#62 8ngtytcnccr tcata                         15&#60210&#62 9&#60211&#62 15&#60212&#62 DNA&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 9ngtytcnccr tcgta                         15&#60210&#62 10&#60211&#62 1511&#60212&#62 DNA&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 10gaaatcatgg ttcctcaagg aatttacgat ggggagacgt taactgtatc atttccctat 60actgttatag gagatccgag tgggactact gttttttctg caggagagtt aacattaaaa 120aatcttgaca attctattgc agctttgcct ttaagttgtt ttgggaactt attagggagt 180tttactgttt tagggagagg acactcgttg actttcgaga acatacggac ttctacaaat 240ggggcagctc taagtaatag cgctgctgat ggactgttta ctattgaggg ttttaaagaa 300ttatcctttt ccaattgcaa ttcattactt gccgtactgc ctgctgcaac gactaataag 360ggtagccaga ctccgacgac aacatctaca ccgtctaatg gtactattta ttctaaaaca 420gatcttttgt tactcaataa tgagaagttc tcattctata gtaatttagt ctctggagat 480gggggagcta tagatgctaa gagcttaacg gttcaaggaa ttagcaagct ttgtgtcttc 540caagaaaata ctgctcaagc tgatggggga gcttgtcaag tagtcaccag tttctctgct 600atggctaacg aggctcctat tgcctttgta gcgaatgttg caggagtaag agggggaggg 660attgctgctg ttcaggatgg gcagcaggga gtgtcatcat ctacttcaac agaagatcca 720gtagtaagtt tttccagaaa tactgcggta gagtttgatg ggaacgtagc ccgagtagga 780ggagggattt actcctacgg gaacgttgct ttcctgaata atggaaaaac cttgtttctc 840aacaatgttg cttctcctgt ttacattgct gctaagcaac caacaagtgg acaggcttct 900aatacgagta ataattacgg agatggagga gctatcttct gtaagaatgg tgcgcaagca 960ggatccaata actctggatc agtttccttt gatggagagg gagtagtttt ctttagtagc 1020aatgtagctg ctgggaaagg gggagctatt tatgccaaaa agctctcggt tgctaactgt 1080ggccctgtac aatttttaag gaatatcgct aatgatggtg gagcgattta tttaggagaa 1140tctggagagc tcagtttatc tgctgattat ggagatatta ttttcgatgg gaatcttaaa 1200agaacagcca aagagaatgc tgccgatgtt aatggcgtaa ctgtgtcctc acaagccatt 1260tcgatgggat cgggagggaa aataacgaca ttaagagcta aagcagggca tcagattctc 1320tttaatgatc ccatcgagat ggcaaacgga aataaccagc cagcgcagtc ttccaaactt 1380ctaaaaatta acgatggtga aggatacaca ggggatattg tttttgctaa tggaagcagt 1440actttgtacc aaaatgttac gatagagcaa ggaaggattg ttcttcgtga aaaggcaaaa 1500ttatcagtga a                                                      1511&#60210&#62 11&#60211&#62 1444&#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          395                     400Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser405                 410                 415Ala Asp Tyr Gly Asp Met Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala420                 425                 430Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Gln Ala435                 440                 445Ile Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala450                 455                 460Gly His Gln Ile Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn465                 470                 475                 480Asn Gln Pro Ala Gln Ser Ser Glu Pro Leu Lys Ile Asn Asp Gly Glu485                 490                 495Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe Ala Asn Gly Asn Ser Thr Leu Tyr500                 505                 510Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala515                 520                 525Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met530                 535                 540Glu Ala Gly Ser Thr Leu Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln545                 550                 555                 560Pro Pro Ala Ala Asn Gln Ser Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser565                 570                 575Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro Pro Thr Asn580                 585                 590Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly Ser Thr Thr Ala595                 600                 605Gly Ser Val Thr Ile Ser Gly Pro Ile Phe Phe Glu Asp Leu Asp Asp610                 615                 620Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn Gln Lys Ile Asp625                 630                 635                 640Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Thr Gln Pro Pro Ala Asn Ala Pro Ser645                 650                 655Asp Leu Thr Leu Gly Asn Glu Met Pro Lys Tyr Gly Tyr Gln Gly Ser660                 665                 670Trp Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn Gly Pro Tyr Thr675                 680                 685Leu Lys Ala Thr Trp Thr Lys Thr Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Glu Arg690                 695                 700Val Ala Ser Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser I1e Leu Asp Ile705                 710                 715                 720Arg Ser Ala His Ser Ala Ile Gln Ala Ser Val Asp Gly Arg Ser Tyr725                 730                 735Cys Arg Gly Leu Trp Val Ser Gly Val Ser Asn Phe Phe Tyr His Asp740                 745                 750Arg Asp Ala Leu Gly Gln Gly Tyr Arg Tyr Ile Ser Gly Gly Tyr Ser755                 760                 765Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Phe Gly Ser Ser Met Phe Gly Leu Ala Phe770                 775                 780Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Lys Asp Tyr Val Val Cys Arg Ser Asn785                 790                 795                 800His His Ala Cys Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Thr Lys Gln Ala Leu805                 810                 815Cys Gly Ser Tyr Val Phe Gly Asp Ala Phe Ile Arg Ala Ser Tyr Gly820                 825                 830Phe Gly Asn Gln His Met Lys Thr Ser Tyr Thr Phe Ala Glu Glu Ser835                 840                 845Asp Val Cys Trp Asp Asn Asn Cys Leu Val Gly Glu Ile Gly Val Gly850                 855                 860Leu Pro Ile Val Ile Thr Pro Ser Lys Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Arg865                 870                 875                 880Pro Phe Val Gln Ala Glu Phe Ser Tyr Ala Asp His Glu Ser Phe Thr                885                 890                 895Glu Glu Gly Asp Gln Ala Arg Ala Phe Arg Ser Gly His Leu Met Asn900                 905                 910Leu Ser Val Pro Val Gly Val Lys Phe Asp Arg Cys Ser Ser Thr His915                 920                 925Pro Asn Lys Tyr Ser Phe Met Gly Ala Tyr Ile Cys Asp Ala Tyr Arg930                 935                 940Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Thr Leu Leu Ser His Gln Glu Thr Trp945                 950                 955                 960Thr Thr Asp Ala Phe His Leu Ala Arg His Gly Val Ile Val Arg Gly965                 970                 975Ser Met Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Asn Ile Glu Val Tyr Gly His Gly980                 985                 990Arg Tyr Glu Tyr Arg Asp Thr Ser Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Ala Gly995                 1000               1005Ser Lys Val Arg Phe1010&#60210&#62 16&#60211&#62 1013&#60212&#62 PRT&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 16Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu Ser Met Ile Leu Ala Tyr1               5                  10                  15Ser Cys Cys Ser Leu Thr Gly Gly Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met Val20                  25                  30Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr35                  40                  45Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe Ser Ala Gly Glu50                  55                  60Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Leu Pro Leu Ser65                  70                  75                  80Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu Gly Arg Gly His85                  90                  95Ser Leu Thr Phe G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重组表达载体&#60400&#62 23atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60ttaaatgggg gggggtatgc agaaatcatg gttcctcaag gaatttacga tggggagacg 120ttaactgtat catttcccta tactgttata ggagatccga gtgggactac tgttttttct 180gcaggagagt taacgttaaa aaatcttgac aattctattg cagctttgcc tttaagttgt 240tttgggaact tattagggag ttttactgtt ttagggagag gacactcgtt gactttcgag 300aacatacgga cttctacaaa tggagctgca ctaagtgaca gcgctaatag cgggttattt 360actattgagg gttttaaaga attatctttt tccaattgca acccattact tgccgtactg 420cctgctgcaa cgactaataa tggtagccag actccgtcga caacatctac accgtctaat 480ggtactattt attctaaaac agatcttttg ttactcaata atgagaagtt ctcattctat 540agtaattcag tctctggaga tgggggagct atagatgcta agagcttaac ggttcaagga 600attagcaagc tttgtgtctt ccaagaaaat actgctcaag ctgatggggg agcttgtcaa 660gtagtcacca gtttctctgc tatggctaac gaggctccta ttgcctttgt agcgaatgtt 720gcaggagtaa gagggggagg gattgctgct gttcaggatg ggcagcaggg agtgtcatca 780tctacttcaa cagaagatcc agtagtaagt ttttccagaa atactgcggt agagtttgat 840gggaacgtag cccgagtagg aggagggatt tactcctacg ggaacgttgc tttcctgaat 900aatggaaaaa ccttgtttct caacaatgtt gcttctcctg tttacattgc tgctgagcaa 960ccaacaaatg gacaggcttc taatacgagt gataattacg gagatggagg agctatcttc 1020tgtaagaatg gtgcgcaagc agcaggatcc aataactctg gatcagtttc ctttgatgga 1080gagggagtag ttttctttag tagcaatgta gctgctggga aagggggagc tatttatgcc 1140aaaaagctct cggttgctaa ctgtggccct gtacaactct tagggaatat cgctaatgat 1200ggtggagcga tttatttagg agaatctgga gagctcagtt tatctgctga ttatggagat 1260atgattttcg atgggaatct taaaagaaca gccaaagaga atgctgccga tgttaatggc 1320gtaactgtgt cctcacaagc catttcgatg ggatcgggag ggaaaataac gacattaaga 1380gctaaagcag ggcatcagat tctctttaat gatcccatcg agatggcaaa cggaaataac 1440cagccagcgc agtcttccga acctctaaaa attaacgatg gtgaaggata cacaggggat 1500attgtttttg ctaatggaaa cagtactttg taccaaaatg ttacgataga gcaaggaagg 1560attgttcttc gtgaaaaggc aaaattatca gtgaattctc taagtcagac aggtgggagt 1620ctgtatatgg aagctgggag tacattggat tttgtaactc cacaaccacc acaacagcct 1680cctgccgcta atcagtcgat cacgctttcc aatctgcatt tgtctctttc ttctttgtta 1740gcaaacaatg cagttacgaa tcctcctacc aatcctccag cgcaagattc tcatcctgca 1800gtcattggta gcacaactgc tggttctgtt acaattagtg ggcctatctt ttttgaggat 1860ttggatgata cagcttatga taggtatgat tggctaggtt ctaatcaaaa aatcgatgtc 1920ctgaaattac agttagggac tcagccccca gctaatgccc catcagattt gactctaggg 1980aatgagatgc ctaagtatgg ctatcaagga agctggaagc ttgcgtggga tcctaataca 2040gcaaataatg gtccttatac tctgaaagct acatggacta aaactgggta taatcctggg 2100cctgagcgag tagcttcttt ggttccaaat agtttatggg gatccatttt agatatacga 2160tctgcgcatt cagcaattca agcaagtgtg gatgggcgct cttattgtcg aggattatgg 2220gtttctggag tttcgaattt cttctatcat gaccgcgatg ctttaggtca gggatatcgg 2280tatattagtg ggggttattc cttaggagca aactcctact ttggatcatc gatgtttggt 2340ctagcattta ctgaagtatt tggtagatct aaagattatg tagtgtgtcg ttccaatcat 2400catgcttgca taggatccgt ttatctatct accaaacagg ctttatgtgg atcttatgtg 2460tttggagatg cgtttattcg tgctagctac gggtttggga atcagcatat gaaaacctca 2520tatacatttg cagaggagag cgatgtttgt tgggataata actgtctggt tggagagatt 2580ggagtgggat taccgattgt gattactcca tctaagctct atttgaatga gttgcgtcct 2640ttcgtgcaag ctgagttttc ttatgccgat catgaatctt ttacagagga aggcgaccaa 2700gctcgggcat tcaggagtgg acatctcatg aatctatcag ttcctgttgg agtaaaattt 2760gatcgatgtt ctagtacaca ccctaataaa tatagcttta tgggggctta tatctgtgat 2820gcttatcgca ccatctctgg gactcagaca acactcctat cccatcaaga gacatggaca 2880acagatgcct ttcatttggc aagacatgga gtcatagtta gagggtctat gtatgcttct 2940ctaacaagca atatagaagt atatggccat ggaagatatg agtatcgaga tacttctcga 3000ggttatggtt tgagtgcagg aagtaaagtc cggttctaaa aatattggtt agatagttaa 3060gtgttagcga tgcctttttc tttgagatct acatcatttt gttttttagc ttgtttgtgt 3120tcctattcgt atggattcgc gagctctcct caagtgttaa cacctaatgt aaccactcct 3180tttaaggggg acgatgttta cttgaatgga gactgcgctt ttgtcaatgt ctatgcaggg 3240gcagagaacg gctcaattat ctcagctaat ggcgacaatt taacgattac cggacaaaac 3300catacattat catttacaca ttctcaaggg ccagttcttc aaaattagcc ttca       3354&#60210&#62 24&#60211&#62 3324&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述：
重组表达载体&#60400&#62 24atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60ttaagtgggg gggggtatgc agcagaaatc atgattcctc aaggaattta cgatggggag 120acgttaactg tatcatttcc ctatactgtt ataggagatc cgagtgggac tactgttttt 180tctgcaggag agttaacgtt aaaaaatctt gacaattcta ttgcagcttt gcctttaagt 240tgttttggga acttattagg gagttttact gttttaggga gaggacactc gttgactttc 300gagaacatac ggacttctac aaatggagct gcactaagtg acagcgctaa tagcgggtta 360tttactattg agggttttaa agaattatct ttttccaatt gcaactaatt acttgccgta 420ctgcctgctg caacgactaa taatggtagc cagactccga cgacaacatc tacaccgtct 480aatggtacta tttattctaa aacagatctt ttgttactca ataatgagaa gttctcattc 540tatagtaatt tagtctctgg agatggggga actatagatg ctaagagctt aacggttcaa 600ggaattagca agctttgtgt cttccaagaa aatactgctc aagctgatgg gggagcttgt 660caagtagtca ccagtttctc tgctatggct aacgaggctc ctattgcctt tatagcgaat 720gttgcaggag taagaggggg agggattgct gctgttcagg atgggcagca gggagtgtca 780tcatctactt caacagaaga tccagtagta agtttttcca gaaatactgc ggtagagttt 840gatgggaacg tagcccgagt aggaggaggg atttactcct acgggaacgt tgctttcctg 900aataatggaa aaaccttgtt tctcaacaat gttgcttctc ctgtttacat tgctgctgag 960caaccaacaa atggacaggc ttctaatacg agtgataatt acggagatgg aggagctatc 1020ttctgtaaga atggtgcgca agcagcagga tccaataact ctggatcagt ttcctttgat 1080ggagagggag tagttttctt tagtagcaat gtagctgctg ggaaaggggg agctatttat 1140gccaaaaagc tctcggttgc taactgtggc cctgtacaat tcttagggaa tatcgctaat 1200gatggtggag cgatttattt aggagaatct ggagagctca gtttatctgc tgattatgga 1260gatattattt tcgatgggaa tcttaaaaga acagccaaag agaatgctgc cgatgttaat 1320ggcgtaactg tgtcctcaca agccatttcg atgggatcgg gagggaaaat aacgacatta 1380agagctaaag cagggcatca gattctcttt aatgatccca tcgagatggc aaacggaaat 1440aaccagccag cgcagtcttc cgaacctcta aaaattaacg atggtgaagg atacacaggg 1500gatattgttt ttgctaatgg aaacagtact ttgtaccaaa atgttacgat agagcaagga 1560aggattgttc ttcgtgaaaa ggcaaaatta tcagtgaatt ctctaagtca gacaggtggg 1620agtctgtata tggaagctgg gagtacattg gattttgtaa ctccacaacc accacaacag 1680cctcctgccg ctaatcagtt gatcacgctt tccaatctgc atttgtctct ttcttctttg 1740ttagcaaaca atgcagttac gaatcctcct accaatcctc cagcgcaaga ttctcatcct 1800gcagtcattg gtagcacaac tgctggtcct gtcacaatta gtgggccttt cttttttgag 1860gatttggatg atacagctta tgataggtat gattggctag gttctaatca aaaaatcgat 1920gtcctgaaat tacagttagg gactcagccc tcagctaatg ccccatcaga tttgactcta 1980gggaatgaga tgcctaagta tggctatcaa ggaagctgga agcttgcgtg ggatcctaat 2040acagcaaata atggtcctta tactctgaaa gctacatgga ctaaaactgg gtataatcct 2100gggcctgagc gagtagcttc tttggttcca aatagtttat ggggatccat tttagatata 2160cgatctgcgc attcagcaat tcaagcaagt gtggatgggc gctcttattg tcgaggatta 2220tgggtttctg gagtttcgaa tttctcctat catgaccgcg atgctttagg tcagggatat 2280cggtatatta gtgggggtta ttccttagga gcaaactcct actttggatc atcgatgttt 2340ggtctagcat ttaccgaagt atttggtaga tctaaagatt atgtagtgtg tcgttccaat 2400catcatgctt gcataggatc cgtttatcta tctaccaaac aagctttatg tggatcctat 2460ttgttcggag atgcgtttat ccgtgctagc tacgggtttg ggaaccagca tatgaaaacc 2520tcatacacat ttgcagagga gagcgatgtt cgttgggata ataactgtct ggttggagag 2580attggagtgg gattaccgat tgtgactact ccatctaagc tctatttgaa tgagttgcgt 2640cctttcgtgc aagctgagtt ttcttatgcc gatcatgaat cttttacaga ggaaggcgat 2700caagctcggg cattcaggag tggtcatctc atgaatctat cagttcctgt tggagtaaaa 2760tttgatcgat gttctagtac acaccctaat aaatatagct ttatgggggc ttatatctgt 2820gatgcttatc gcaccatctc tgggactcag acaacactcc tatcccatca agagacatgg 2880acaacagatg cctttcattt ggcaagacat ggagtcatag ttagagggtc tatgtatgct 2940tctctaacaa gcaatataga agtatatggc catggaagat atgagtatcg agatacttct 3000cgaggttatg gtttgagtgc aggaagtaaa gtccggttct aaaaatattg gttagatagt 3060taagtgttag cgatgccttt ttctttgaga tctacatcat tttgtttttt agcttgtttg 3120tgttcctatt cgtatggatt cgcgagctct cctcaagtgt taacacctaa tgtaaccact 3180ccttttaagg gggacgatgt ttacttgaat ggagactgcg ctttagtcaa tgtctatgca 3240ggggcagaga acggctcaat tatctcagct aatggcgaca atttaacgat taccggacaa 3300aaccatgcat tatcatttac agat                                        3324&#60210&#62 25&#60211&#62 65&#60212&#62 PRT&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 25Pro Tyr Thr Val Ile Gly Asp Pro Ser Gly Thr Thr Val Phe Ser Ala1               5                  10                  15Gly Glu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asp Asn Ser Ile Ala Ala Pro Leu20                  15                  30Ser Cys Phe Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Leu Gly Arg Gly35                  40                  45His Ser Leu Thr Phe Glu Asn Ile Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala50                  55                  60Leu65&#60210&#62 26&#60211&#62 24&#60212&#62 PRT&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 26Ala Ala Asn Gln Leu Ile Thr Leu Ser Asn Leu His Leu Ser Leu Ser1               5                  10                 15Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val20&#60210&#62 27&#60211&#62 8&#60212&#62 PRT&#60213&#62 衣原体&#60400&#62 27Gly Tyr Thr Gly Asp Ile Val Phe1               5&#60210&#62 28&#60211&#62 7&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Chlamydia&#60400&#62 28Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp1            5&#60210&#62 29&#60211&#62 63&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Chlamydera cerviniventris&#60400&#62 29Gly Tyr Al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Claims (41)

1．分离的衣原体HMW蛋白或其片段或类似物，其中通过SDS-PAGE测定的该蛋白的表观分子量为约105到115kDa。
2．权利要求1的蛋白，其为基本上纯化的。
3．权利要求1的蛋白，其中衣原体为砂眼衣原体、猫心衣原体、鹦鹉热衣原体或肺炎衣原体。
4．具有SEQ ID NO：2、15或16所示氨基酸序列的权利要求1的蛋白或其片段或保守取代的类似物。
5．权利要求4的片段，具有SEQ ID NO：3、17或25-37所示氨基酸序列。
6．权利要求1的蛋白或其片段或保守取代的类似物，其中所述蛋白可被特异性与具有SEQ ID NO：2、15或16氨基酸序列的肽结合的抗体制品识别。
7．编码权利要求1的HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子。
8．权利要求7的核酸分子，其中衣原体为砂眼衣原体、猫心衣原体、鹦鹉热衣原体或肺炎衣原体。
9．权利要求7的核酸分子或其片段或保守取代的类似物，其中其编码的蛋白具有SEQ ID NO：2、15或16的氨基酸序列。
10．分离核酸分子，具有选自以下的序列：
a)SEQ ID NO：1、23或24的DNA序列或其互补序列或片段；
b)编码具有SEQ ID NO 2、15或16的氨基酸序列的HMW蛋白的DNA序列或其片段；
c)编码SEQ ID NO：1、15或16的推导的氨基酸序列的DNA序列或其互补序列或简并序列或其片段；和
d)在严紧条件下与a)，b)或c)中限定的序列之一杂交的核酸序列。
11．适用于转化宿主的重组表达载体，含有权利要求7或10的核酸分子。
12．适用于转化宿主的重组表达载体，含有权利要求7或10的核酸分子，以及与该核酸分子可操作连接的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物。
13．权利要求12的表达载体，其中表达元件包括编码用于由宿主分泌HMW蛋白或其片段或类似物的前导序列的核酸部分。
14．含有权利要求12的表达载体的转化宿主细胞。
15．含有权利要求13的表达载体的转化宿主细胞。
16．可以通过权利要求14的转化宿主生产的分离重组蛋白或其片段或类似物。
17．可以通过权利要求15的转化宿主生产的分离重组蛋白或其片段或类似物。
18．用于将HMW蛋白或其片段或类似物传递给宿主的重组载体，含有权利要求7或10的核酸分子。
19．一种免疫原性组合物，含有至少一种选自以下的成分：
a)分离的HMW蛋白或其片段或类似物，所述蛋白经SDS-PAGE测定其分子量约为105-115KDa；
b)编码a)中HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子；
c)具有SEQ ID NO：1，23或24的序列的分离核酸分子，其互补序列，或在严紧条件下能与其杂交的核酸序列，或其片段；
d)能由含有表达载体的转化宿主产生的分离的重组蛋白或其片段或类似物，所述表达载体含有b)或c)所述的核酸分子和与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物；
e)含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的b)或c)所述核酸序列的重组载体；
f)含有e)之载体的转化细胞，
所述组合物还任选含有佐剂，和可药用载体或稀释剂，所述组合物在施用于宿主时可产生免疫应答。
20．一种抗原性组合物，含有至少一种选自以下的成分：
a)分离的HMW蛋白或其片段或类似物，所述蛋白经SDS-PAGE测定其分子量约为105-115KDa；
b)编码a)中HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子；
c)具有SEQ ID NO：1，22，23或24的序列的分离核酸分子，其互补序列或简并序列，或在严紧条件下能与其杂交的核酸序    列；
d)能由含有表达载体的转化宿主产生的分离的重组蛋白或其片段或类似物，所述表达载体含有b)或c)所述的核酸分子和与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物；
e)含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的b)或c)所述核酸序列的重组载体；
f)含有e)之载体的转化细胞，
所述组合物还任选含有佐剂，所述组合物在施用于宿主时可产生免疫应答。
21．在动物中产生免疫应答的方法，包括向动物施用有效量的权利要求20的抗原性组合物或权利要求19的免疫原性组合物。
22．权利要求21的方法，其中所述动物是哺乳动物或鸟类。
23．针对权利要求20的抗原性组合物或权利要求19的免疫原性组合物产生的抗血清。
24．权利要求23的抗血清中存在的抗体，其与HMW蛋白或其片段或类似物特异性结合。
25．选自以下的诊断试剂：权利要求1的蛋白，权利要求10的核酸分子，权利要求20的免疫原性组合物，权利要求19的抗原性组合物，权利要求23的抗血清，权利要求12的载体，权利要求14的转化细胞，权利要求24的抗体。
26．检测待测样品中抗衣原体抗体的方法，包括下列步骤：
a)将所述样品与权利要求1的HMW蛋白、权利要求20的抗原性组合物或权利要求19的免疫原性组合物接触，若存在所述抗体，就会形成衣原体抗原：抗衣原体抗体免疫复合物；并且
b)检测步骤a)中形成的所述免疫复合物的存在或测定其量以作为待测样品中存在所述抗衣原体抗体的指征。
27．检测抗衣原体抗体的诊断试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1的HMW蛋白，权利要求20的抗原性组合物或权利要求19的免疫原性组合物，使所述蛋白或组合物与怀疑含有所述抗体的试样接触的容器，以及检测或测定所述蛋白或组合物与所述抗体形成的衣原体抗原：抗衣原体抗体免疫复合物的试剂。
28．检测试样中衣原体的方法，包括以下步骤：
a)将试样与权利要求24的抗体接触足够时间，使所述抗体与试样可能中存在的衣原体结合并形成衣原体：抗衣原体抗体免疫复合物；并且
b)检测步骤a)中形成的所述免疫复合物的存在或测定其量以作为待测样品中存在衣原体的指征。
29．检测衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包括权利要求24的抗体，使所述抗体与怀疑含有所述衣原体的试样接触的容器，以及检测或测定所述抗体与衣原体形成的衣原体：抗衣原体抗体免疫复合物的试剂。
30．一种药物组合物，含有有效量的至少一种选自以下的成分：
a)HMW蛋白或其片段或类似物，所述蛋白经SDS-PAGE测定其分子量约为105-115KDa；
b)编码a)中HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子；
c)具有SEQ ID NO：1，23或24的序列的分离核酸分子，其互补序列或简并序列，或在严紧条件下能与其杂交的核酸序列；
d)能由含有表达载体的转化宿主产生的分离的重组蛋白或其片段或类似物，所述表达载体含有b)或c)所述的核酸分子和与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物；
e)含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的b)或c)所述核酸序列的重组载体；
f)含有e)之载体的转化细胞，
g)特异性结合a)，b)，c)，d)，e)或f)的成分的抗体，
所述组合物还可任选含有可药用载体或稀释剂。
31．一种疫苗，含有有效量的至少一种选自以下的成分：
a)HMW蛋白或其片段或类似物，所述蛋白经SDS-PAGE测定其分子量约为105-115KDa；
b)编码a)中HMW蛋白或其片段或类似物的分离核酸分子；
c)具有SEQ ID NO：1，23或24的序列的分离核酸分子，其互补序列或简并序列，或在严紧条件下能与其杂交的核酸序列；
d)能由含有表达载体的转化宿主产生的分离的重组HMW蛋白或    其片段或类似物，所述表达载体含有b)或c)所述的核酸分子和与核酸分子可操作相连的表达元件以通过宿主表达所述HMW蛋白或其片段或类似物；
e)含有编码HMW蛋白或其片段或类似物的b)或c)所述核酸序列的重组载体；
f)含有e)之载体的转化细胞，
g)特异性结合a)，b)，c)，d)，e)或f)的成分的抗体，
所述疫苗还可任选含有佐剂、可药用载体或稀释剂，其中所述疫苗在施用于宿主时会产生免疫应答。
32．在需要接受治疗的宿主中预防、治疗或缓解衣原体相关疾病的方法，包括向宿主给予有效量的权利要求30的药物组合物或权利要求31的疫苗组合物。
33．权利要求32的方法，其中所述疾病选自衣原体细菌感染，结膜炎，尿道炎，性病淋巴肉芽肿(LGV)，宫颈炎，附睾炎，子宫内膜炎，盆腔炎性疾病(PID)，输卵管炎，输卵管闭塞，不育，宫颈癌，动脉硬化和动脉粥样硬化。
34．权利要求33的方法，其中宿主为鸟类或哺乳动物。
35．权利要求19、20、30或31之一的组合物，被配制供体内施用于宿主以提供对由衣原体所致疾病的保护作用。
36．权利要求19、20、30或31之一的组合物，其中衣原体种选自砂眼衣原体、猫心衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体。
37．权利要求19、20、30或31之一的组合物，被配制成微粒，胶囊或脂质体制剂。
38．权利要求1、4、6、16和17之一的蛋白，其中蛋白与肝素或硫酸乙酰肝素结合。
39．权利要求1、4、6、16或17之一的蛋白，其中所述蛋白为外膜蛋白。
40．测定样品中编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸存在与否的方法，包括以下步骤：
a)使样品与权利要求7或10的核酸分子或其片段或互补物接触，以生成包括所述核酸分子和样品中编码HMW蛋白并可与所述核酸分子特异性杂交的任何核酸分子的双链体；以及
b)确定双链体的生成。
41．确定样品中编码HMW蛋白或其片段或类似物的核酸存在与否的诊断试剂盒，包括：
a)权利要求7或10的核酸分子或其任何片段或互补物；
b)使核酸与样品接触以生成包括所述核酸分子和样品中编码HMW蛋白并可与所述核酸分子特异性杂交的任何核酸分子的双链体；以及
c)确定双链体生成的工具。
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ZA (1) ZA989012B (zh)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6710033B1 (en) 1996-08-14 2004-03-23 Vanderbilt University Methods and treatment of multiple sclerosis
US5868735A (en) 1997-03-06 1999-02-09 Scimed Life Systems, Inc. Cryoplasty device and method
US6890526B2 (en) 1997-05-06 2005-05-10 Vanderbilt University Methods and reagents for the treatment of multiple sclerosis
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
WO2000034498A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-15 University Of Manitoba Two-step immunization procedure against chlamydia infection
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US20080213264A1 (en) * 1998-12-08 2008-09-04 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
GB9828000D0 (en) 1998-12-18 1999-02-10 Chiron Spa Antigens
DE60036698T2 (de) * 1999-05-03 2008-07-24 Sanofi Pasteur Ltd., Toronto Chlamydia-antigene und entsprechende dna-fragmente und deren verwendungen
DE60133190T2 (de) 2000-04-21 2009-04-02 CORIXA CORP., Wilmington Verbindungen und verfahren zur behandlung und diagnose von chlamydia-infektionen
US6919187B2 (en) * 2000-04-21 2005-07-19 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US7731980B2 (en) * 2000-10-02 2010-06-08 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia PMP proteins, gene sequences and uses thereof
US7537772B1 (en) 2000-10-02 2009-05-26 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, gene sequence and the uses thereof
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
ES2386386T3 (es) * 2001-12-12 2012-08-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunización contra Chlamydia trachomatis
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
ITTO20050905A1 (it) * 2005-12-23 2007-06-24 Univ Degli Studi Torino Leganti sintetici capaci di legare l'ocratossina e relativi usi
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
TR201807756T4 (tr) 2006-09-26 2018-06-21 Infectious Disease Res Inst Sentetik adjuvan içeren aşı bileşimi.
PT2086582E (pt) 2006-10-12 2013-01-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina compreendendo uma emulsão adjuvante óleo em água
SI2086582T1 (sl) 2006-10-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo, ki obsega emulzijo olja v vodi kot adjuvans
TW200908994A (en) 2007-04-20 2009-03-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2162460A4 (en) * 2007-06-14 2012-06-06 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc VACCINES AGAINST CHLAMYDIA INFECTIONS
US20090254588A1 (en) * 2007-06-19 2009-10-08 Zhong Li Multi-Dimensional Data Merge
WO2009158240A1 (en) * 2008-06-16 2009-12-30 Emergent Product Development Uk Limited Salmonella vectored vaccines against chlamydia and methods of use
WO2010005474A1 (en) * 2008-06-16 2010-01-14 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) expressing chlamydia polypeptide antigens
EP2413959A4 (en) 2009-01-29 2013-06-19 British Columbia Cancer Agency CHLAMYDIA-ANTIGENE COMPREHENSIVE COMPOSITIONS
EP2437753B1 (en) 2009-06-05 2016-08-31 Infectious Disease Research Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants and vaccine compositions containing them
ES2651005T3 (es) 2010-03-09 2018-01-23 Biomedical Research Models, Inc. Una nueva estrategia de vacunación mucosa para el virus del herpes simple tipo-2
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
CN104363892A (zh) 2012-02-07 2015-02-18 传染性疾病研究院 包含tlr4激动剂的改进佐剂制剂及其使用方法
RS57420B1 (sr) 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp Vakcine za hsv-2
AU2014203873A1 (en) 2013-01-07 2015-07-30 Biomedical Research Models, Inc. Therapeutic vaccines for treating herpes simplex virus type 2 infections
CA2909221A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Immune Design Corp. Gla monotherapy for use in cancer treatment
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
US11801223B2 (en) 2013-12-31 2023-10-31 Access To Advanced Health Institute Single vial vaccine formulations
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
CN109562057A (zh) 2016-05-16 2019-04-02 传染病研究所 聚乙二醇化脂质体和使用方法
IL314130A (en) 2016-05-16 2024-09-01 Access To Advanced Health Inst Formulation containing a TLR agonist and methods of use
BR112018074352B1 (pt) 2016-06-01 2021-11-30 Infectious Disease Research Institute Partículas de nanoalume contendo um agente de dimensionamento
KR102673794B1 (ko) 2017-06-15 2024-06-11 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 나노구조 지질 담체 및 안정적인 에멀션 그리고 이들의 용도
CN111315406A (zh) 2017-09-08 2020-06-19 传染病研究所 包括皂苷的脂质体调配物及其使用方法
CN114340665A (zh) 2019-05-25 2022-04-12 传染病研究所 用于对佐剂疫苗乳剂进行喷雾干燥的组合物和方法
AU2021337493A1 (en) 2020-09-04 2023-05-18 Access To Advanced Health Institute Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier
WO2024052882A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Access To Advanced Health Institute Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4258029A (en) 1979-04-23 1981-03-24 Connaught Laboratories Limited Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses
US4427782A (en) * 1981-03-03 1984-01-24 Caldwell Harlan D Isolation of principal outer membrane protein and antigen of Chlamydia trachomatis
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
DE3521994A1 (de) 1985-06-20 1987-01-02 Bayer Ag N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln
US4935352A (en) 1985-10-21 1990-06-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Expression vector for animal cell line and use thereof
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE69018926T2 (de) 1989-09-04 1995-08-24 Wellcome Found Vakzine gegen Bordetella.
US5071962A (en) 1990-05-31 1991-12-10 The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins
US5965141A (en) 1991-02-15 1999-10-12 Uab Research Foundation Epitopic regions of pneumococcal surface protein a
US5725863A (en) * 1991-09-06 1998-03-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Polypeptides useful in prevention of chlamydia infection
ES2143716T3 (es) * 1992-06-25 2000-05-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna que contiene adyuvantes.
GB9214857D0 (en) 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Human nucleic acid fragments and their use
IL107628A0 (en) 1992-11-18 1994-02-27 Calypte Inc Immunoassays for microorganisms associated with sexually transmitted diseases
WO1995007353A2 (en) 1993-09-10 1995-03-16 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Binding domains from plasmodium vivax and plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins
CN1134112A (zh) 1993-11-03 1996-10-23 辉瑞大药厂 衣原体感染的疫苗及治疗方法
US5565352A (en) 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
DE69510116T2 (de) 1994-02-23 1999-11-18 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, Okayama Nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym, dieses kodierende DNA, und deren Herstellungen und Verwendungen
US5629167A (en) * 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
US6019982A (en) * 1994-08-26 2000-02-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant
DE69628554T2 (de) 1995-03-28 2004-05-06 Hitachi Chemical Co., Ltd. Chlamydia-pneumoniae-antigen, verfahren zu seiner herstellung, verfahren zur testung von anti-chlamydia-pneumoniae-antikörper durch seine verwendung und reagenz zum testen von anti-chlamydia-pneumoniae-antikörper
GB9506863D0 (en) 1995-04-03 1995-05-24 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5807978A (en) * 1995-06-07 1998-09-15 Kokolus; William J. Immunogenic peptides of prostate specific antigen
JPH09184843A (ja) * 1995-12-28 1997-07-15 Meiji Milk Prod Co Ltd クラミジア・トラコマチス感染の診断方法
US6464979B1 (en) 1996-09-12 2002-10-15 Aventis Pasteur Limited Chlamydial vaccines and methods of preparation thereof
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
KR100769103B1 (ko) 1997-11-28 2007-10-23 세로노 제네틱스 인스티튜트 에스.에이. 클라미디아 트라코마티스 게놈 서열과 폴리펩티드, 이의단편 및 이의 용도, 특히, 감염의 진단, 예방 및 치료 용도
ES2330903T3 (es) 1997-12-17 2009-12-16 Serono Genetics Institute S.A. Adncs extendidos para proteinas secretadas.
US6077693A (en) * 1998-05-14 2000-06-20 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide encoding a promonocyte associated protein
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
KR20100132086A (ko) 1998-12-08 2010-12-16 코릭사 코포레이션 클라미디아 감염을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 진단 키트
US6565856B1 (en) 1998-12-08 2003-05-20 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US7731980B2 (en) 2000-10-02 2010-06-08 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia PMP proteins, gene sequences and uses thereof
GB0103169D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
EP2162460A4 (en) 2007-06-14 2012-06-06 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc VACCINES AGAINST CHLAMYDIA INFECTIONS
JP4743455B2 (ja) 2009-05-26 2011-08-10 トヨタ自動車株式会社 燃料電池システム

Also Published As

Publication number Publication date
CA2305709A1 (en) 1999-04-15
NZ503763A (en) 2003-01-31
US20040067524A1 (en) 2004-04-08
EP1019028A4 (en) 2002-11-20
EP1019028A1 (en) 2000-07-19
US7459524B1 (en) 2008-12-02
CO5050400A1 (es) 2001-06-27
HUP0004639A3 (en) 2004-10-28
US7419807B2 (en) 2008-09-02
KR100586569B1 (ko) 2006-06-02
EP1862472A3 (en) 2008-03-19
US7534445B2 (en) 2009-05-19
JP2001518489A (ja) 2001-10-16
AU752426B2 (en) 2002-09-19
AR018013A1 (es) 2001-10-31
US20050048557A1 (en) 2005-03-03
HUP0004639A2 (hu) 2001-04-28
HK1034187A1 (en) 2001-10-19
ZA989012B (en) 1999-04-12
BR9813841A (pt) 2000-10-03
CN1911960B (zh) 2012-11-07
SA99191283B1 (ar) 2006-04-18
US6642023B1 (en) 2003-11-04
KR20010030902A (ko) 2001-04-16
US7655246B2 (en) 2010-02-02
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