JP2001518489A - クラミジアタンパク質、その遺伝子配列および使用 - Google Patents
クラミジアタンパク質、その遺伝子配列および使用Info
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Abstract
Description
、そのアミノ酸配列、およびHMWタンパク質に特異的に結合する抗体(細胞毒性 抗体を含む)に関する。本発明はさらに、HMWタンパク質、その断片、またはHMW
タンパク質もしくはその一部に特異的に結合する抗体、またはHMWタンパク質も しくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含有する、ワクチンをはじめと
する予防用および治療用組成物を包含する。本発明はさらに、哺乳動物および鳥
類のクラミジア感染関連疾患を予防、治療または軽減する方法ならびにクラミジ
アに対する免疫応答を引き出す方法を提供する。本発明はさらに、HMWタンパク 質をコードする単離されたヌクレオチド配列および縮重配列、該配列を含むベク
ター、ならびに該ベクターを含む宿主細胞を提供する。また、診断法および診断
キットも含まれる。
った障害を引き起こす、広範囲に流行しているヒト病原体である。クラミジア菌
は真正の細胞内細菌であって、肺、結膜路または生殖路の上皮ライニングに感染
する。クラミジア属の最も一般的な種としては、Chlamydia trachomatis、Chlam
ydia psittaci、Chlamydia pecorum、Chlamydia pneumoniaeなどがある。最近、
新たに命名されたクラミジア属の種であるC. pneumoniae(以前は、C. trachoma
tis TWAR)は流行性のヒト肺炎の主因として関連づけられてきており、また、ア
テローム硬化症においてある役割を果たしている可能性がある。
isの血液型亜型は18種類が確認されており、A、BおよびC血液型亜型は主とし
てトラコーマに関係しており、一方D〜K血液型亜型は生殖感染症の最も一般的
な原因となる。
症の主な原因菌となっている。米国でのC. trachomatis感染症の正確な罹患率は
不明であるが、最近の疫学研究からは、淋菌性感染症がおよそ200万例であるの に対して、毎年400万例を超えるクラミジア感染症が発生していると報告されて いる。人種、民族、社会経済上のあらゆるグループが罹患するが、クラミジア感
染症の最大の流行は、12〜20才の性的に活発な若者の間で起こる。大部分の泌尿
生殖器クラミジア感染症は臨床的に無症候性である。男性でも女性でも長期保菌
が普通である。クラミジア感染症であると診断された男性の25%および女性の75%
もがはっきりとわかる感染の徴候をまったく呈していない。その結果、こうした
無症候性の人々が大きな貯蔵所を構成し、一般社会にこの病原菌を伝播させるこ
ととなる。
えば、尿道炎、性病性リンパ肉芽腫(LGV)、子宮頸炎、男性の副睾丸炎などであ る。子宮頸内膜からの上行性感染は通常、子宮内膜炎、骨盤炎症性疾患(PID)、 および卵管を閉塞させて最終的には不妊症に至らせることのある卵管炎を起こす
。
ることにより生じる。クラミジア子宮頸炎の母親の膣から生まれた新生児のほぼ
70%は産道通過中に感染してしまう。眼、中咽頭、泌尿器および直腸の粘膜が主 な感染部位である。クラミジアによる結膜炎は最も普通に見られる形の新生児眼
炎となってきている。暴露された乳児の約20〜30%は、硝酸銀または抗生物質軟 膏による予防処置を受けた後でさえ、出生後14日以内に封入体結膜炎を発生する
。C. trachomatisは米国での小児肺炎の主因でもある。感染した子宮頸部を通過
した新生児の約10〜20%がクラミジア肺炎を発症し、何らかの医療介入が必要だ ろう。
あるトラコーマを引き起し、この場合は瘢痕形成の繰り返しにより眼瞼のゆがみ
と視力の低下が結果的に起こる。トラコーマは世界中の予防可能な失明の主な原
因となっている。世界保健機関の推定によれば、世界中で50億人を超える人々(
約15億人の子供を含む)が現在も活動性のトラコーマを患っており、600万人を 超える人々がこの疾病によって失明している。
。米国では、かかる疾病の年間の治療コストが1992年には25〜30億ドルであると
概算されたが、2000年には80億ドルを上回ると見積もられている。
することである。幾つかの証拠が、有効なワクチンを開発することは実現可能で
あると提案している。
クラミジア(whole Chlamydia)を接種することで得られることが明らかになった 。しかし、この防御は短命で、血液型亜型に特異的であり、粘膜抗体によるもの
である点に特徴があった。その上、いくつかのワクチンでは、免疫感作に使用し
たものと異なる血液型亜型にもともと感染している場合に疾病が悪化した。この
有害な反応は結局、遅延型過敏症反応によるものであることが証明された。した
がって、ききめがあるが、非感作性の免疫応答を引き出す能力があるサブユニッ
トに基づくクラミジアワクチンを開発する必要がある。このようなサブユニット
ワクチンは、有効であるためには粘膜の中和分泌IgA抗体および/または細胞性 免疫応答の両方を引き出す必要がある。
(MOMP)に集中していた。MOMPは大きさが約40kDaの細胞膜内タンパク質であって 、感染性の基本小体(elementary body: EB)膜タンパク質の約60%までを構成して
いる(Caldwell, H.D., J. Kromhout & L. Schachter, 1981, Infect. Immun., 3
1:1161-1176)。MOMPは細胞外EBに構造的完全性を付与し、この微生物が細胞内で
増殖して代謝的に活動している場合はポーリン様分子として作用すると考えられ
る。4つの表面に露出した可変ドメイン(VDI〜VDIV)を除いて、MOMPは18全ての 血液型亜型において高度に保存されている。MOMPは非常に免疫原性があって、局
所の中和抗クラミジア抗体を誘導することができる。しかし、この方法には問題
がある。
内に位置しており、したがって血液型亜型に特異的な抗体のみをもたらす。各種
ワクチンベクター(例えば、ポリオウイルス)内で血液型亜型特異的エピトープ
を合体させて、広範に交差反応する中和抗体を生成する試みは最小限の成功を収
めたにすぎなかった(Murdin, A.D., H. Su, D.S. Manning, M.H. Klein, M.J. P
arnell, and H.D. Caldwell, 1993, Infect. Immun., 61:4406-4414; Murdin, A
.D., H. Su, M.H. Klein, and H.D. Caldwell, 1995, Infect. Immun., 63:1116
-1121)。
システインに富むタンパク質、ならびに表面に露出しているリポ多糖類は高度に
免疫原性であるが、MOMPと相違して、中和抗体を誘導しないことが示された(Cer
roneら, 1991, Infect. Immun., 59:79-90)。それゆえに、新規なサブユニット に基づくクラミジアワクチンの必要性が依然として存在する。
p.)の高分子量タンパク質(HMWタンパク質)またはその断片もしくは類似体を提供
することであり、このHMWタンパク質はSDS-PAGEで測定したときの見かけの分子 量が約105〜115kDaである。好ましくは、HMWタンパク質は実質的に配列番号2、
15および16のいずれかのアミノ酸配列を有する。HMWタンパク質の好ましい断片 には配列番号3、17および25〜37が含まれる。本明細書中で用いる場合、配列に
対して「実質的に」とは、その配列が基準配列に対して少なくとも80%、より好 ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%同一であることを意味す
るものである。好ましくは、HMWタンパク質は外膜タンパク質である。より好ま しくは、外膜HMWタンパク質は表面に局在しているものである。好ましくは、HMW
タンパク質はヘパリン結合ドメインを有する。好ましくは、HMWタンパク質はポ ーリン様ドメインを有する。本発明にはクラミジア属のあらゆる種が含まれるが
、好ましい種としては、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Chlamyd
ia pecorumおよびChlamydia pneumoniaeがある。実質的に精製されたHMWタンパ ク質は純度が70wt%以上、好ましくは約90wt%以上のものであり、その水溶液の形
態であり得る。
体は、SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaである。HMW由
来のペプチドとは、HMWタンパク質の断片; 1個以上のアミノ酸欠失、挿入また は置換を含む野生型HMWタンパク質またはその断片の変異体; およびHMWタンパク
質の全体または一部のC末端またはN末端または内部セグメントに融合された異
種ポリペプチドからなるキメラタンパク質を含むものである。
換え体のHMW タンパク質をさす。
HMWタンパク質が配列番号2、15および16のいずれかのアミノ酸配列、またはそ の断片(特に配列番号3、17、25〜37)からなる核酸配列が好ましいものである
。また、配列番号1、23〜24のいずれかのDNA配列またはその相補配列; 配列番 号4〜14、18〜22のいずれかの核酸配列を有するHMW DNA配列の断片またはその 相補配列; およびストリンジェント条件下で上記配列のいずれか1つにハイブリ
ダイズする核酸配列からなる、単離された核酸分子も含まれる。ストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズする核酸は、上記配列のいずれかと約70%の配列同一 性、より好ましくは約90%の配列同一性をもつことが好ましい。
わち、全長の野生型HMWタンパク質に関連した機能的活性を1以上示す能力があ る。一例として、所望の免疫原性または抗原性をもつこのような誘導体または類
似体は、例えばイムノアッセイや免疫感作のために使用することができる。特定
の実施形態は抗HMW抗体によって結合され得るHMW断片に関する。HMWの誘導体ま たは類似体はその所望の活性について当技術分野で公知の方法により試験するこ
とができる。
発明の実施において使用され得る。これらには、限定するものではないが、遺伝
子の全部または一部が配列内の機能的に等価のアミノ酸残基をコードする異なる
コドンの置換により改変されてサイレント変化をもたらすヌクレオチド配列が含
まれる。同様に、本発明のHMW誘導体には、限定するものではないが、一次アミ ノ酸配列として、配列内の残基が機能的に等価のアミノ酸残基で置換されてサイ
レント変化をもたらす改変配列を含むHMWタンパク質のアミノ酸配列の全部また は一部を含むものも含まれる。例えば、配列内の1個以上のアミノ酸残基が、機
能的等価物として作用してサイレント変化をもたらす類似の極性の他のアミノ酸
で置換され得る。配列内のアミノ酸の代替物はそのアミノ酸が属するクラスの他
のメンバーから選択される。例えば、無極性(疎水性)アミノ酸としては、アラ
ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ
トファンおよびメチオニンがある。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セ
リン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがあ
る。正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒス
チジンがある。負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸とグル
タミン酸がある。
00アミノ酸より大きくない。HMWの誘導体または類似体には、限定するものでは ないが、HMWまたはその断片と実質的に相同な領域を含む分子(例えば、各種の 実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列に対してまたは当技術分野で公知
のコンピュータ相同性プログラムによりアライメントされた配列と比較したとき
、60%以上または70%または80%または90%または95%の同一性)またはコードする 核酸がストリンジェント条件、中度のストリンジェント条件または非ストリンジ
ェント条件下でHMWコード配列にハイブリダイズすることができる分子が含まれ る。
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77に記載の統計学的方法を用いて有意差が
あるとみなす配列類似性の検索に適合するようにした発見的検索アルゴリズムで
ある、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Alt
schulら, 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, "The BLAST Algorithm"; A
ltschulら, 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402)。5つの特定のBLASTプログ ラムは次のタスクをおこなう。
スに対して比較するものである。 2)BLASTNプログラムは、疑わしいヌクレオチド配列をヌクレオチド配列デー
タベースに対して比較するものである。 3)BLASTXプログラムは、疑わしいヌクレオチド配列(両鎖)の6個のフレー
ムでの概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースに対して比較するもので
ある。 4)TBLASTNプログラムは、疑わしいタンパク質配列を6個すべてのリーディ ングフレームで翻訳されたヌクレオチド配列データベース(両鎖)に対して比較
するものである。 5)TBLASTXプログラムは、疑わしいヌクレオチド配列の6個のフレームでの 翻訳産物をヌクレオチド配列データベースの6個のフレームでの翻訳産物に対し
て比較するものである。
bi.ac.uk/bic sw/)(Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197)
は配列アライメントのための数学的に厳格なアルゴリズムである。
Smith-Watermanアルゴリズムに発見的に近似するものである。BLAST、Smith-Wat
ermanおよびFASTAアルゴリズムの手法および利点の一般的論議については、Nich
olasら, 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence S
coring Methods"(www.psc.edu)と本明細書中で引用した参考文献を参照されたい
。
起こりうる。例えば、クローン化されたHMW遺伝子配列を当技術分野で公知の多 数の戦略のいずれかにより修飾することができる(Sambrookら, 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, New York)。配列を適切な部位で制限エンドヌクレア ーゼにより切断し、続いてさらなる酵素的修飾をおこない、所望により単離し、
in vitroでライゲートする。HMWの誘導体または類似体をコードする遺伝子の生 産においては、修飾した遺伝子が確実にHMWと同じ翻訳リーディングフレーム内 に存在して、目的のHMW活性をコードする領域が翻訳停止シグナルで中断されな いように注意すべきである。
させて、翻訳配列、開始配列および/または終結配列を導入および/または破壊
したり、またはさらなるin vitro修飾を容易にするために、コード領域に改変を
導入し、かつ/または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成したりまたは既
存のものを破壊したりすることが可能である。当技術分野で公知の突然変異誘発
法のどれを使用してもよく、例えば、限定するものではないが、化学的突然変異
誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発(Hutchinson, C.ら, 1978, J. Biol. Ch
em 253:6551)、TAB(登録商標)リンカー(Pharmacia)の使用などがある。
片、または翻訳中もしくは翻訳後に、例えばグリコシル化、リピド化、アセチル
化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タン
パク質加水分解、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などにより、異な
って修飾された他の誘導体または類似体も本発明の範囲内に含まれる。化学的修
飾は公知の方法により行うことができ、例えば、限定するものではないが、臭化
シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4によ る特異的な化学的切断;アセチル化、ホルミル化、酸化、還元;ツニカマイシン
の存在下での代謝的合成などがある。
らに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換もしく
は付加によりHMW配列に導入してもよい。非古典的アミノ酸としては、通常のア ミノ酸のD異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ
-Abu、ε-Abx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピ オン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコ
シン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェ
ニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、デ
ザイナーアミノ酸(β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルア ミノ酸など)および一般的なアミノ酸類似体があるが、これらに限定されない。
さらに、アミノ酸はD(右旋性)またはL(左旋性)でありうる。
換え発現ベクターを提供することである。好ましくは、組換え発現ベクターは宿
主の形質転換に適しており、HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を宿 主により発現させるための前記核酸分子に機能的に連結された発現手段を含有す
る。より好ましいものは、発現手段が宿主から該タンパク質を分泌させるための
リーダー配列をコードする核酸部分、あるいは該タンパク質またはその断片もし
くは類似体のN末端とC末端のいずれかに結合されたアフィニティードメインを
含む発現ベクターである。
ならびに形質転換宿主細胞から産生される組換えHMWタンパク質またはその断片 もしくは類似体を含む。
チドまたはその断片もしくは保存的に置換された類似体に特異的に結合する抗体
調製物により認識されるHMWタンパク質に関する。
は次の成分: a)SDS-PAGEで測定したときの分子量が約105〜115kDaであるHMWタンパク質、
またはその断片もしくは類似体; b)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、単離された 核酸分子; c)配列番号1、22、23または24の配列、その相補配列、またはストリンジェ
ント条件下でそれにまたはその断片にハイブリダイズする核酸配列を有する、単
離された核酸分子; d)上記b)またはc)に規定する核酸分子と、HMWタンパク質またはその断 片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機能的に連結され
た発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される、
単離された組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体; e)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする核酸を含有す る組換えベクター;および f)上記e)のベクターを含む形質転換細胞; からなる群より選択される成分少なくとも1種と、場合によりアジュバントと、
そのための製薬上許容される担体もしくは希釈剤を含有し、宿主に投与したとき
免疫応答を生ずるものである。好ましいアジュバントとしては、コレラホロトキ
シンまたはサブユニット、E. coli熱不安定ホロトキシン、そのサブユニットお よび変異型、アルム、QS21、MPLなどがある。特に、アルム、LTR192G、mLTおよ びQS21が好ましい。
ることを含んでなる、哺乳動物またはトリにおいて免疫応答を引き出す方法も包
含される。
た抗血清、ならびにHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体に特異的に結 合する抗血清中に存在する抗体に関する。好ましくは、抗体は配列番号2、15〜
16のアミノ酸配列を有するHMWタンパク質またはその断片もしくは保存的に置換 された類似体に特異的に結合する。HMWタンパク質またはその断片もしくは類似 体に特異的に結合するモノクローナル抗体も含まれる。
の成分: a)SDS-PAGEで測定したときの分子量が約105〜115kDaであるHMWタンパク質、
またはその断片もしくは類似体; b)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、単離された 核酸分子; c)配列番号1、22、23または24の配列、その相補配列、またはストリンジェ
ント条件下でそれにまたはその断片にハイブリダイズする核酸配列を有する、単
離された核酸分子; d)上記b)またはc)に規定する核酸分子と、クラミジア種のHMWタンパク 質またはその断片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機
能的に連結された発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主におい
て産生される、単離された組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体 ; e)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする核酸を含有す る組換えベクター; f)上記e)のベクターを含む形質転換細胞; g)上記a)、b)、c)、d)またはe)の成分と特異的に結合する抗体;
からなる群より選択される成分少なくとも1種と、そのための製薬上許容される
担体もしくは希釈剤を含有する。好ましいものは粘膜レベルで有効なワクチン組
成物である。
然HMWタンパク質、組換えHMWタンパク質、核酸分子、免疫原性組成物、抗原性組
成物、抗血清、抗体、核酸を含むベクター、およびベクターを含む形質転換細胞
を含有する診断薬を包含する。
よび診断キットも包含され、前記方法は、 a)サンプルに、クラミジアのHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体 を含む抗原性もしくは免疫原性組成物またはそれに対する抗体を接触させて、ク
ラミジア抗原:抗クラミジア抗体免疫複合体を形成させ、そしてさらに、 b)被験サンプル中のクラミジアまたは抗クラミジア抗体の存在を示すものと
して、ステップa)で形成された免疫複合体の存在を検出するか、または免疫複
合体の量を測定する、 各ステップを含んでなる。クラミジアまたはそれに対する抗体を検出するための
診断キットは、抗体、またはクラミジアのHMWタンパク質またはその断片もしく は類似体を含む抗原性もしくは免疫原性組成物;該抗体または組成物に、抗クラ
ミジア抗体またはクラミジアを含む疑いのある被験サンプルを接触させるための
容器手段;および抗原性もしくは免疫原性組成物または抗体と被験サンプルの間
で形成されたクラミジア抗原:抗クラミジア抗体免疫複合体を検出または測定す
るための試薬手段を含有する。
分子と、HMWタンパク質をコードしかつ該核酸分子と特異的にハイブリダイズ可 能なサンプル中の該核酸とからなる二本鎖を生成させ、そして b)該二本鎖の生成を確認する、 各ステップを含んでなる。
し、前記キットおよび試薬は、 a)本明細書中で提供される核酸分子; b)該核酸分子と、HMWタンパク質をコードしかつ該核酸分子と特異的にハイ ブリダイズ可能なサンプル中の該核酸とからなる二本鎖を生成させるための、該
核酸分子を被験サンプルに接触させる手段;および c)該二本鎖の生成を確認する手段; を含有する。
与することを含んでなる、動物(哺乳動物と鳥類を含む)のクラミジア関連疾患
を予防、治療または軽減する方法も含まれる。好適な疾患としては、クラミジア
菌感染症、トラコーマ、結膜炎、尿道炎、性病性リンパ肉芽腫(LGV)、子宮頸炎 、副睾丸炎、子宮内膜炎、骨盤炎症性疾患(PID)、卵管炎、卵管閉塞、不妊症、 子宮頸癌、およびアテローム硬化症などがある。好ましいワクチンまたは医薬組
成物は、クラミジア種が原因となる疾患から宿主を保護または治療するためにin
vivo投与用に製剤化されたものである。微粒子、カプセル、リポソーム製剤ま たはエマルジョンとして製剤化された組成物も好ましい。
一文字表記で表される。 A (アデニン) C (シトシン) G (グアニン) T (チミン) U (ウラシル) M (AまたはC) R (AまたはG) W (AまたはT/U) S (CまたはG) Y (CまたはT/U) K (GまたはT/U) V (AまたはCまたはG; T/Uではない) H (AまたはCまたはT/U; Gではない) D (AまたはGまたはT/U; Cではない) B (CまたはGまたはT/U; Aではない) N (AまたはCまたはGまたはT/U)または(不明)
ミノ酸残基の一文字表記で表される。 A (アラニン) R (アルギニン) N (アスパラギン) D (アスパラギン酸) C (システイン) Q (グルタミン) E (グルタミン酸) G (グリシン) H (ヒスチジン) I (イソロイシン) L (ロイシン) K (リシン) M (メチオニン) F (フェニルアラニン) P (プロリン) S (セリン) T (トレオニン) W (トリプトファン) Y (チロシン) V (バリン) X (不明)
例および添付の図面を参照することで、さらに理解されよう。
エスタンブロット分析を示す。 2-メルカプトエタノールを含有する標準Laemmli SDS-PAGE サンプルバッファ
ー中に勾配精製したEB群を可溶化し、約3分間沸騰させ、SDSを含有する4-12% T
ris-グリシン勾配ゲル上にのせ、100Vで電気泳動した。電気泳動の直後に、4℃ で約2.5時間、約50Vでタンパク質をPVDF膜上にエレクトロブロットした。抗rHMW
P'抗体(K196)の1/5,000希釈物を使用して、ブロックした膜を室温で1.5時間 プローブした。洗浄後、膜をHRPと複合体化したヤギ抗ウサギIgG抗体の1/5,000
希釈物で室温で1時間処理した。標準TMB基質システムを使用して、ブロットを発
色させた。EBおよびRB中に3つの免疫反応性バンドが検出された。ドットは約105
-115kDaのHMWタンパク質を示す。
ームをコードする共通核酸配列を示す。
されるHMWタンパク質のアミノ酸配列を示す。
タンパク質のSDS-PAGEを示す。分子量マーカーとして、対比染色および前染色し
たSDS-PAGE標準を使用した。ゲル中の分子量マーカーの位置を、図の左側および
右側にいくつかのマーカーの分子量(kDa)に対する線によって示す。詳細につ いては本文の実施例10を参照されたい。 レーンA:Mark 12 Wide Range Molecular Weight Markers(Novex);ミオシン
、200 Kdal;B-ガラクトシダーゼ、116.3 Kdal;ホスホリラーゼ B、97.4 Kdal
;ウシ血清アルブミン、66.3 Kdal。 レーンB:C.trachomatis L2組換えHMWP。 レーンC:SeeBlue Prestained Molecular Weight Markers(Novex);ミオシン
、250 Kdal;ウシ血清アルブミン、98 Kdal;グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、6
4 Kdal。
ノ酸 配列を示す。 C.trachomatis L2配列を最上段に示し、成熟タンパク質の第1残基、Eで始ま る。真核 N-グリコシル化が可能な配列に下線をつけている。プロリンに富むセ グメントに隣接し、脂質二重層まで到達する好適な長さの疎水性ヘリックス領域
に下線をつけ、ブラケットで囲んである。BおよびF血清型(serovars)において
同定されたアミノ酸の差異をL2 HMWPタンパク質配列の下に記載している。
色する。 パネルB:ウサギ K196からの免疫化前の血清。 6.発明の詳細な説明 本明細書および請求の範囲中で使用する用語「抗原」およびこれに関連する用
語「抗原性」とは、抗体またはT細胞受容体に特異的に結合する物質に関して称
する。好ましくはこの抗原は免疫原性を有する。
くは哺乳類または鳥類において免疫応答、例えば抗体および/または細胞性免疫
応答を誘発する能力を称する。 本明細書および請求の範囲中で使用する用語「宿主」とは、動物中での in vi
voまたは哺乳類細胞培養物内での in vitroのいずれかを称する。
成物の有効量を投与すべきである。ここで「有効量」は、被験体中で、限定する
わけではないが免疫応答などの、所望の予防、治療または改善性応答を産生する
のに十分な量と定義される。必要とされる量は使用するHMWタンパク質、断片、 核酸若しくは誘導体の免疫原性、ならびに投与される被験体の種類および体重に
応じて変更されることになるが、標準的技術を使用して確定することができる。
組成物は、被験体中に抗HMWタンパク質抗体およびオプソニン作用性若しくは殺 菌性抗体を含む抗体を産生するような免疫応答を誘発する。本発明の限定するわ
けではない好ましい実施形態において、有効量の本発明の組成物は投与前の抗体
力価の少なくとも3倍までの抗体力価の上昇をもたらす。本発明の限定するわけ
ではない好ましい特定の実施形態において、宿主に対して約0.01-2000μgおよび
好ましくは0.1-500μgが投与される。その外にアジュバントを含有する組成物が
好ましい。
などの注射可能なものとして調製することができる。HMWタンパク質を1種以上
の製薬上許容される賦形剤でそのHMWタンパク質に適合するものと混合してもよ
い。こうした賦形剤として、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、
エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。
衝剤、またはそれらの有効性を強化するアジュバントなどの1種以上の補助剤を
さらに含ませることができる。免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物は
皮下若しくは筋肉内注射によって非経口投与することができる。
ン組成物を粘膜表面で免疫応答を喚起するような方法で製剤化して送達すること
ができる。例えば、免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物を粘膜表面に
、例えば鼻、口(胃内)、眼内、鰓内(branchiolar)、腟内または直腸内経由 によって投与することができる。あるいは、坐剤および経口製剤を含むその他の
投与形態も望ましい。坐剤のためには、結合剤および担体として、例えばポリア
ルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。経口製剤には例えば医薬
品グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用さ
れるインシピエント(incipient)を含ませることができる。これらの組成物は溶 液、懸濁液、錠剤、 ピル、カプセル、徐放剤または粉末の形態とすることがで き、そしてHMWタンパ ク質を約0.001-95%含有させることができる。免疫原性、
抗原性、医薬およびワクチン組成物を投与剤型に適合する様相で、かつ治療上有
効、予防的または免疫原性となる量で投与する。
疫システムの特定の細胞に送達するために1以上のターゲティング分子と組合せ
るかこれと複合体化して使用することができる。限定するわけではないが、いく
つかの例として、ビタミンB12、細菌毒素若しくはその断片、モノクローナル 抗体 およびその他の特異的ターゲティング脂質、タンパク質、核酸若しくは炭 水化物が含まれる。
応答を産生するための個体の免疫システムの能力を含む、治療すべき被験体に応
じて決まる。投与するために必要とされる活性成分の正確な量は実務者の判断に
応じて決まる。しかし、好適な投与量範囲は当業者によって容易に決定すること
ができるもので、HMWタンパク質、断片またはそれらの類似体の0.1-1000マ イク
ログラム程度が可能である。初発投与およびブースター投与の用量に関する好適
な方式もまた変更し得るが、初発投与に続くその後の投与が含まれる。投与量は
投与の経路(群)によっても決まり、宿主のサイズにしたがって変更される。
チンは1価ワクチンである。何種類かの病原体の抗原性物質を含有するワクチン
は複合ワクチンであるが、これも本発明に属する。こうした複合ワクチンは、例
えば各種の病原体からの、若しくは同一の病原体の各種の菌株からの物質、また
は各種の病原体の組合せからの物質を含有する。
てHMWタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチドベク ターを含んでもよく、またはこの遺伝子の少なくとも一部を免疫化のために直接
使用してもよい。
疫原は典型的にはアジュバント中に乳化される。免疫原をアジュバントとともに
投与すると、免疫原性は著しく改善される。アジュバントは、免疫原を投与部位
の近辺に局在させて保留することによって、免疫システムの細胞への抗原の緩慢
で持続的な放出を助長する貯蔵(depot)効果を産生するような作用をすること ができる。アジュバントは免疫システムの細胞を免疫原貯蔵所に誘引してこの細
胞を刺激して免疫応答を引き出すこともできる。
完全アジュバント、FCA)、細胞溶解(サポニンおよびプルロニックポリマー) ならび に発熱原性、関節炎および前ブドウ膜炎(LPSおよびMDP)を誘発する。F
CAは優 れたアジュバントであって研究においては広範に使用されるが、その毒 性のためにヒトまたは動物ワクチンでの使用は認可されていない。
またはその両方を誘発する能力; (5) 他のアジュバントとの相乗性; (6) 抗原提示細胞(APC)の集団と選択的に相互作用する能力; (7) 適切なTH1またはTH2細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力;ならび
に (8) 抗原に対する適切な抗体イソタイプレベル(例えばIgA)を選択的に増大
させる能力。
刺激剤またはアジュバントが使用されてきた。リポポリサッカライドなどの内因
性アジュバントは普通はワクチンとして使用する死滅または弱毒化細菌の成分で
ある。外因性アジュバントは典型的には抗原に非共有結合的に連結される免疫調
節剤で、宿主の免疫応答を増強するために製剤化される。このように、アジュバ
ントは非経口的に送達される抗原に対する免疫応答を増強するものとして同定さ
れてきた。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(普通、ミョウバンと
総称される)がヒトおよび動物ワクチンにおいてアジュバントとして通常使用さ
れる。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増大させるミョウ
バンの効力は十分確定されており、またHBsAgワクチンがミョウバンをアジュバ ントとしている。
ン(免疫刺激性複合体)、ミネラル油を含むプルロニックポリマー、ミネラル油
中の死滅マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド
(MDP)およびリポポリサッカライド(LPS)などの細菌産物、そしてリピドA、 およびリポソームが含まれる。
ンテロトキシン原性大腸菌の熱不安定性毒素の変異型(「mLT」)について記載 されている。参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,057,540号には、 アジュバント、Qs21が記載され、英国特許第2,220,211号には南アメリカの樹木 、Quiliaja saponaria molinaの樹皮からのサポニンのHPLC精製した非毒性画分
、3D-MPLが記載され、これを参照により本明細書に組み入れる。
国特許第4,855,283号には、免疫調節剤またはアジュバントとして、それぞれ糖 残基においてアミノ酸によって置換されている、N-グリコシルアミド、N-グリコ
シル尿素およびN-グリコシルカルバメートを含む、糖脂質類似体が教示されてい
る。LockhoffはN-グリコホスホリピドおよびグリコグリセロリピドが単純ヘルペ
スウイルスワクチンおよび偽性狂犬病ウイルスワクチンの両方において強力な免
疫応答を誘発することができることを報告した。天然のリピド残基の機能を模倣
するため、アノマー炭素原子を介して直接糖に結合している長鎖アルキルアミン
および脂肪酸から、いくつかの糖脂質が合成された。
号には、オクタデシルチロシン塩酸(OTH)が、破傷風トキソイドならびにホル マリン不活性化タイプI、IIおよびIIIポリオウイルスワクチンと複合体化させた
とき、アジュバントとして機能したことが教示されている。合成ペプチドのリピ
ド化もこれらの免疫原性を増大させるために使用された。
に、限定するわけではないが、ミョウバン、mLT、QS21および上に列記したすべ てのものなどのアジュバントを含ませることができる。好ましくは、アジュバン
トはミョウバン、LT、3D-mPL若しくはBacille Calmette-Guerine(BCG)ならび に上記のものの変異若しくは修飾型、特にmLTおよびLTR192Gから選択される。本
発明の組成物に、限定するわけではないが、生理食塩水、炭酸水素塩、デキスト
ロースまたはその他の水性溶液などの、好適な医薬用担体をさらに含ませてもよ
い。その他の好適な医薬用担体は、この分野における標準的参考書である、Remi ngton's Pharmaceutical Sciences ,Mack Publishing Company、に記載されてお り、その全文を参照により本明細書に組み入れる。
用担体中に入れて投与してもよく、マイクロカプセル中に含ませてもよく、及び
/または持続放出性埋め込み体中に含ませてもよい。 ワクチンなどの、免疫原性、抗原性および医薬組成物を、抗体レベルの持続の
ために、望ましくは時間をおいて複数回投与してもよく、及び/またはその他の
殺菌若しくは静菌方法と組合せて使用してもよい。
わけではないが、Antibodies A Laboratory Manual(E.Harlow,D.Lane,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1989)に記載された方法などの、当業者に知られ
た任意の通常の方法によって取得することができる。この全文を参照により本明
細書に組み入れる。用語「抗体」は限定するわけではないが、ポリクローナル、
モノクローナル、精製IgG、IgM、IgAおよび限定するわけではないが、Fv、単鎖F
v(scFv)、F(ab')2、Eab断片などを含むその断片(Harlow and Leon,1988,Anti
body,Cold Spring Harbor);単鎖抗体(米国特許第4,946,778号);キメラま たはヒト化抗体(Morrisonら、1984,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 81:6851);Neube
rgerら、1984,Nature 81:6851);および相補性決定領域(CDR)(Verhoeyen an
d Windust,Molecular Immunology 2ed.,B.D.Hames and D.M.Glover,IRL Press,Oxf
ord University Press,1996,pp.283-325を参照されたい)、その他などのすべて
の形態を含むことを意図している。
断片若しくは誘導体は、その免疫原の効力を増強するアジュバント若しくは任意
の薬剤の不在下または存在下で、動物(広範囲の脊椎動物種を使用することがで
きるが、最も普通にはマウス、ラット、モルモット、ウシ、ブタ、ハムスター、
ヒツジ、トリおよびウサギ)に免疫し、一定の間隔でブースター免疫する。任意
の通常の方法によって、所望の抗体の存在について、動物の血清をアッセイする
。その動物の血清または血液をポリクローナル抗体の原料として使用することが
できる。
体力価が検出されたとき、動物を安楽死させて、融合のために脾臓を無菌的に取
り出す。この脾臓細胞を特定して選択した永久増殖ミエローマ細胞系と混合し、
次に混合物を細胞の融合を促進する薬剤、典型的にはポリエチレングリコールな
ど、に曝露する。これらの状況下では、融合はランダム選択で発生し、その結果
生成するものは各タイプの非融合細胞と融合細胞との混合物である。融合のため
に使用するミエローマ細胞系は、HAT:ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン、などの選別用培地の使用によって、融合混合物から培養物中に残存す
る細胞が免疫したドナーに由来する細胞とミエローマ細胞とのハイブリッドのみ
になるように、特定して選択される。融合後、細胞を希釈して、選別用培地中で
培養する。選定した抗原に対して所望の特異性を有する抗体の存在について、こ
の培養培地をスクリーニングする。最良の抗体を含有する培養物を、培養物が単
一の細胞起源であることが確証されるまで限界希釈することによって、クローン
化する。
ンパク質抗体の作製のための抗原若しくは免疫原として、または抗細菌性、抗ク
ラミジアおよび抗HMWタンパク質抗体の検出のための、酵素結合イムノソルベン トアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および当分野で既知のその
他の非酵素結合抗体結合アッセイ若しくは操作法を含むイムノアッセイにおける
抗原として、有用である。ELISAアッセイにおいては、HMWタンパク質を選択した
表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどの、タンパク
質を結合させることが可能な表面上に固定化する。洗浄して不完全に吸着された
HMWタンパク質を除去した後、試験サンプルに関して抗原性としては中性である ことが知られている非特異的タンパク質溶液を、この選択した表面に結合させて
もよい。これによって、固定化表面上の非特異的吸着部位をブロックすることが
でき、したがって表面への抗血清の非特異的結合に起因するバックグラウンド値
を減少させることができる。
複合体(抗原/抗体)の形成を誘導するような様相で、接触させる。これには、
ウシガンマグロブリン(BGG)溶液および/またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
/Tweenなどの希釈剤でのサンプルの希釈が含まれる。次にサンプルを約20から3
7℃程度の温度で2-4時間インキュベートする。インキュベート後、サンプルと接
触させた表面を洗浄して、非免疫複合体化物質を除去する。洗浄操作には、PBS /Tweenまたはホウ酸塩バッファーなどの溶液での洗浄が含まれる。試験サンプ ルおよび結合したHMWタンパク質間での特異的免疫複合体の形成ならびにそれに 続く洗浄後、免疫複合体の形成の出現、およびさらにその量を、この第1の抗体
に対して特異性を有する第2の抗体に免疫複合体を反応させることによって、判
定することができる。試験サンプルがヒト起源の場合は、第2抗体はヒトイムノ
グロブリン、一般的にはIgGに特異性を有する抗体である。
ートした時に発色するような、酵素活性などの、関連する活性を有するものとす
ることができる。その後、発色を検出することによって、検出を達成することが
できる。次に、例えば可視分光光度計を使用して発色の程度を測定し、適切な標
準と比較することによって、定量を達成することができる。当業者に知られたそ
の他のあらゆる検出手段が含まれる。
要な基本的試薬のすべてを含む診断用キットが含まれる。この診断用キットは必
要な試薬を収納した1以上の容器の組合せとして市販用の包装体に入れて提供す
ることができる。こうしたキットには、HMWタンパク質若しくはこれをコードす る核酸またはそれらの断片、本発明のモノクローナル若しくはポリクローナル抗
体が数種の通常のキット成分と組み合わされて含まれることができる。通常のキ
ット成分は当業者にとって容易に明らかになるものであり、Antibodies A Labor atory Manual (E.Harlow,D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)
を含む多数の出版物に開示されている。この全文を参照により本明細書に組み入
れる。通常のキット成分として、例えばマイクロタイタープレート、アッセイ混
合物のpHを維持するためのバッファー(限定するわけではないがTris、HEPES、 その他など)、ペルオキシダーゼと複合体化した抗マウスIgG(または第1抗体 が由来する動物に対する任意の抗IgG)などの複合体化した第2抗体、およびそ の他の標準試薬、などの品目が含まれる。
の化学的アプローチ、もしくは都合の良いオリゴヌクレオチドプライマーのペア
を用いるポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)による増幅、および連続したオリゴヌク レオチドの一組を用いたリガーゼ連鎖反応法などの当業界では既知の方法を用い
て合成することができる。またその配列によって、クラミジアのどのような種か
らもHMWタンパク質の遺伝子の同定およびクローニングを、例えばクラミジアの ゲノムライブラリーもしくは発現ライブラリーのスクリーニングにその配列を用
いることにより行うことができる。
用である。応用方法の如何によって、様々な配列の同定を行いうるように種々の
ハイブリダイゼーション条件を用いることができる。特定の態様においては、HM
Wタンパク質の遺伝子の少なくとも10、15、25、50、100、200もしくは250個のヌ
クレオチドに対して相補的である配列を含む核酸が提供される(図2)。特定の実 施形態においては、核酸はHMWタンパク質核酸(例えば配列番号1,23もしくは24の
配列を有するもの)と低、中、もしくは高ストリンジェンシー条件のアニーリン グ条件下でハイブリダイズするものである。
例として示すもので限定するものではないが、0.02M〜0.15MのNaClで約50℃〜70
℃の間の温度などの低塩濃度および/または高温などの条件が二本鎖形成のため に用いられる。いくつかの応用においてはより低ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件、例えば、例として示すもので限定するものではないが、0.15
M〜0.9Mの塩、約20℃〜55℃の間の範囲の温度などの条件が必要とされる。ハイ ブリダイゼーション条件は、ハイブリッド二本鎖を不安定化させるために、ホル
ムアルデヒドの量を増量して添加することによってよりストリンジェントにさせ
ることもできる。このように特定のハイブリダイゼーション条件を容易に操作す
ることができ、所望の結果に応じて通常選ぶべき方法である。例として示すもの
で限定するものではないが、通常は、50%ホルムアルデヒド存在下のハイブリダ イゼーション温度として都合がよいのは:標的断片と95%〜100%相同のプローブ には42℃:90〜95%相同の場合には37℃、70〜90%相同の場合には32℃である。
り、特定の核酸配列の塩基組成および長さに依存して、およびその核酸配列が由
来する特定の生物体に依存して予見可能に変わる。そのような条件に関するガイ
ダンスとしては例えば次のものを参照のこと:Sambrookら, 1989, Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 米国ニュー ヨーク州, pp.9.47-9.57; Ausbelら, 1989, Current Protocols in Molecular B
iology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, 米国ニューヨ
ーク州。 これは本明細書中に参照により組み入れる。
種の制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。また別に、そのDNA を断片化するためにマンガンの存在下でデオキシリボヌクレアーゼ(Dnase)を用 いるか、もしくは例えば音波などでそのDNAを物理的にせん断することができる 。次いでそのDNA断片を、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、 カラムクロマトグラフィー、ならびにショ糖密度勾配遠心などの、それらには限
定されないが、標準的な方法によってその大きさに基づいて分離することができ
る。次いで、そのDNA断片をプラスミド、コスミド、バクテリオファージλもし くはT4、バクミド(bacmide)及び酵母人工染色体(YAC)などの、それらには限定さ
れないが、適切なベクター中に挿入することができる。(例えば、Sambrookら, 1
989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, 米国ニューヨーク州; Glover, D.M.(編
), 1985, DNA Cloning:A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, 英国
第I,II巻を参照のこと。) ゲノムライブラリーは標識されたプローブに対して
核酸ハイブリダイゼーションさせることによってスクリーニングすることができ
る(BentonとDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinとHogness, 1975, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961)。
レオチドプローブを用いてスクリーニングを行うことができる。特定の実施形態
においては、スクリーニングに用いるプローブは配列番号4の配列に対応する縮 重オリゴヌクレオチドである。別の実施形態においては、配列番号5の配列に対 応する縮重オリゴヌクレオチドをスクリーニング用プローブとすることができる
。またさらに別の実施形態においては、配列番号6-9, 12-14, および18-21のい ずれかのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることができる。さらに別の
実施形態においては、配列番号1, 10-11, 22-24のうちのいずれかの配列、もし くはそれらのいずれかの断片、またはそれらの配列もしくは断片の相補体をプロ
ーブとして用いることができる。用いるプローブは、ヌクレオチド15個もしくは
それより長いものが好ましい。
有するクローンは、1つ以上の縮重オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイ ズする。そのようなオリゴヌクレオチドプローブとゲノムライブラリーとのハイ
ブリダイゼーションは当業界で既知の方法を用いて行う。例えば、上記の2つの オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは2xSSC, 1.0% SDS中 で50℃で行い、同じ条件を用いて洗うことができる。
部もしくは全体をコードするヌクレオチド配列のクローンはクラミジア発現ライ
ブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。例えば、クラ
ミジアDNA、もしくはRNAから作製したクラミジアcDNAを単離しランダムな断片を
調製し、ベクター中に挿入された配列がその後にそのベクターが導入される宿主
細胞によって発現されうるように発現ベクター(例えばバクテリオファージ、プ ラスミド、ファージミド、もしくはコスミド)中に連結される。次いで発現され たHMWタンパク質もしくはHMW由来のポリペプチドを選択するために各種のスクリ
ーニングアッセイ法を用いることができる。1つの実施形態においては、本発明
の各種の抗HMW抗体を当業界では既知の方法を用いて所望のクローンを同定する ために用いることができる。例えば、HarlowとLane, 1988, Antibodies:A Labor
atory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 米国ニューヨーク州, 付録IVを参照もこと。ライブラリーから得たクローンもし
くはプラークを抗体と接触させて結合するクローンを同定する。
ドするDNAを含有するコロニーもしくはプラークはOlsvickら, 第29回ICAAC, Hou
ston, 米国テキサス州, 1989(これは本明細書に参照により組み入れる)に従っ
てDYNA Beadsを用いて検出しうる。抗HMW抗体はトシル化したDYNA Beads M280と
クロスリンクし、次いでこれらの抗体含有ビーズはHMWタンパク質もしくはHMW由
来ポリペプチドを発現しているコロニーもしくはプラークを吸着するために用い
られる。HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドを発現しているコロニーも
しくはプラークは、コロニーもしくはプラークのうちビーズと結合しているもの
として同定される。
で述べたHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドを発現している細菌性コロ
ニーに吸着させるために用いうる。
は全体をコードする実質的に純粋なDNAを産生するためにPCR増幅を用いることが
できる。既知のHMWタンパク質配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを 縮重したものもしくはそれ以外のもののいずれであっても、プライマーとして用
いることができる。特定の実施形態においては、配列番号2, 3, もしくは15-17 のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそれらの任意の部分をコードするオリゴ
ヌクレオチドは、縮重させたものもしくはそれ以外のもののいずれであっても、
5'プライマーとして用いることができる。断片の例として、5'プライマーを配列
番号4-7, 10, 12, 22-24もしくはそれらの部分のヌクレオチド配列のいずれか1 つから作製することができる。配列番号11, 13, もしくは14の逆方向相補体であ
るヌクレオチド配列は、縮重させたものもしくはそれ以外のもののいずれであっ
ても、3'プライマーとして用いることができる。
ene AmpTM)を用いて行うことができる。PCR反応に用いるために数種の異なる縮 重プライマーを合成することを選択することができる。PCR反応を開始する際に 用いるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えて縮重プライマ
ーと対応するクラミジアDNA中の配列との間のヌクレオチド配列の類似性の度合 いをより高くもしくはより低くさせることもできる。HMWタンパク質をコードす る配列のセグメントを首尾よく増幅した後、そのセグメントをクローン化し配列
を決定し、完全なゲノムクローンを単離するためのプローブとして用いることが
できる。このことが、その後、後述するとおりその遺伝子の完全なヌクレオチド
配列の決定、その発現の分析、および機能分析のためのその遺伝子のタンパク質
産物の産生を可能にするだろう。
わせて用いることができる。放射性、酵素、もしくはアビジン/ビオチンなどお よびジゴキシゲニン標識などのその他のリガンドなどの多種の検出可能なシグナ
ルを提供することのできる指示法が当業界で知られている。いくつかの診断用の
実施形態においては放射性タグの替わりにウレアーゼ、アルカリホスファターゼ
、もしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを用いることができる。酵素タグの
場合にはHMWタンパク質の遺伝子配列を含有するサンプルとの特異的なハイブリ ダイゼーションを同定するために、肉眼的にもしくは分光光学的に観測できる方
法を提供するものとして比色分析用指示剤基質が知られている。
て有用である。固相法を用いる実施形態においては、臨床的に得たサンプル、例
えば浸出液、体液(例えば血清、羊水、中耳浸出液、痰、精液、尿、涙液、粘液 、気管支肺胞洗浄液)もしくは組織などのサンプルから得た供試DNA(もしくはRNA
)を吸着させるかあるいは選択されたマトリクスもしくは表面へ付着させる。次 いで固定化された一重鎖核酸を、本発明のHMWタンパク質をコードする遺伝子も しくはその断片もしくはその類似体の核酸配列を含む選択されたプローブと所望
の条件下で特異的ハイブリダイゼーションさせる。条件の選択は、例えばG+C含 量、標的核酸のタイプ、核酸のソース、ハイブリダイゼーションプローブのサイ
ズなどの如何によって必要とされる特定の規準に基づく特定の状況に依拠する。
非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためにハイブリダイズさせた表
面を洗った後、標識を用いてその特異的ハイブリダイゼーションの検出もしくは
定量をも行われる。クラミジアの種の間で保存されている核酸配列部分を選択す
ることが好ましい。選択されたプローブは少なくとも15bp、約30から90bpの範囲
である。
プラスミドベクターを、発現系中でのHMWタンパク質もしくはその断片をコード する遺伝子の発現に用いることができる。発現ベクターは、タンパク質をコード
する挿入された配列の転写、翻訳のために必要な全てのエレメントを含有してい
る。ベクターは通常は複製部位、および形質転換細胞での表現型による選択が行
いうるようなマーキング配列を含んでいる。例えば、大腸菌(E.coli)は、アンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性細胞とするための遺伝子を含有しているpBR3
22を用いて形質転換することができる。その他の市販のベクターは有用であり、
それらとしては、pZERO, pTrc99A, pUC19, pUC18, pKK223-3, pEX1, pCAL, pET,
pSPUTK, pTrxFus, pFastBac, pThioHis, pTrcHis, pTrcHis2, およびpLExなど が挙げられるがそれらに限定されない。プラスミドもしくはファージも、宿主細
胞がそれ自体のタンパク質の発現のために用いることのできるプロモーターを含
有しているかあるいは含有するように改変されていなければならない。
ベクターは、これらの宿主との関連において形質転換ベクターとして用いること
ができる。例えば、λGEMTM-11ファージを、大腸菌LE392などの宿主細胞を形質 転換するために用いうる組換えファージベクターを作成するために利用すること
ができる。
記載のT7プロモーター系などのその他の微生物プロモーターがある。プロモータ
ーのヌクレオチド配列の詳細については既知であり、熟練した技術者であればそ
れらのプロモーターを機能を有する形で遺伝子に連結させることができる。用い
られる特定のプロモーターは、通常は所望する結果如何によって選択することが
できる。
な天然のHMWタンパク質が痕跡量の毒性物質もしくはその他の夾雑物を含んでい る可能性のある場合には、組換え法によってHMWタンパク質を作ることが好まし い。この問題は異種の系で組換え法で産生させたHMWタンパク質では宿主から単 離された物質中の夾雑物が最小となるようなやり方で単離しうるため、このよう
なHMWタンパク質を用いることによって避けることができる。この観点から見て 特に望ましい発現用宿主としては、LPSを有さず従ってエンドトキシンのないグ ラム陽性細菌が挙げられる。そのような宿主としてはバチラス(Bacillus)属に属
する種のものが挙げられ、パイロジェンを含まないrHMWタンパク質、その断片も
しくは類似体の産生に特に有用であろう。
ロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;酵母ベクターを含んでいる酵母などの微 生物もしくはバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで 形質転換された細菌が挙げられるがそれらに限定されない。HMWタンパク質遺伝 子、その断片、類似体もしくは変異体の発現に適切な宿主としては、大腸菌(E.c
oli)、バチラス属の種、ヘモフィルス(Haemophilus)属、真菌、サッカロマイセ ス・ピチア(Saccharomyces pichia)などの酵母、ボルデテーラ(Bordetella)
もしくはバキュロウイルス発現系などを用いることができる。好ましくは宿主細
胞は細菌であり、最も好ましくはその細菌は大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.Subtili
s)もしくはサルモネラである。
1つを用いることができる。好ましい実施形態においてはHMWタンパク質もしく はHMW由来ポリペプチド配列ならびに宿主細胞のプレおよび/もしくはプロ配列を
含むキメラタンパク質を発現させる。別の好ましい実施形態においてはHMWタン パク質もしくはHMW由来のポリペプチド配列を、例えばアフィニティー精製した タンパク質と融合させたものからなるキメラタンパク質を発現させる。さらに好
ましい実施形態においてはHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチド配列と有
用な免疫原性を有するペプチドもしくはタンパク質とを含むキメラタンパク質を
発現させる。好ましい実施形態においては、発現されたHMW由来タンパク質は天 然のHMWタンパク質の外表面のエピトープもしくは受容体結合ドメインのいずれ かを形成する配列を含んでいる。
の方法としてはin vitro組換えDNAおよび合成法およびin vivo組換え体(遺伝子 組換え)を挙げることができる。HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドを コードする核酸配列の発現は第2の核酸配列によって、組換えDNA分子で形質転換
された宿主中で挿入された配列が発現されるように調節することができる。例え
ば、挿入された配列の発現を当業界で既知の何らかのプロモーター/エンハンサ ーエレメントによって調節することができる。挿入された配列の発現を調節する
ために用いることのできるプロモーターとしては、動物細胞中での発現用として
は、SV40初期プロモーター領域(BernoistとChambon, 1981, Nature 290:304-310
)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamoto
ら, 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner ら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン 遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42);細菌細胞中での発現
用としてはβ-ラクタマーゼ(Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 75:3727-3731)、tac(DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:21-25)、PL、もしくはtrc("Useful proteins from recombinant bacteria",
Scientific American, 1980, 242:74-94も参照);植え込まれた細胞での発現用
としては、ノパリン合成酵素プロモーター領域もしくはカリフラワーモザイクウ
イルスの35S RNAプロモーター(Gardnerら, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、 および光合成酵素であるリブロースビリン酸カルボキシラーゼのプロモーター(H
errera-Estrellaら, 1984, Nature 310:115-120); Gal4プロモーターなどのそ の他の真菌もしくは酵母のプロモーターエレメント、ADC(アルコール脱水素酵素
)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホス
ファターゼのプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。
ターの同定は次の3種類の一般的なアプローチによって行うことができる:(a)核
酸ハイブリダイゼーション、(b)"マーカー"遺伝子機能の存在もしくは不在、(c)
抗HMW抗体との反応性などの挿入された配列の発現。第1のアプローチにおいては
、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたHMWタンパク質 もしくはHMW由来ポリペプチドをコードする配列に対して相同な配列を含むプロ ーブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第2 のアプローチでは、組換えベクター/宿主系は、ベクター中に挿入された外来遺 伝子によって生ずる特定の"マーカー"遺伝子機能(例えばチミジンキナーゼ活性 、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の閉鎖体(occlusion bod
y)形成など)の存在もしくは不在に基づいて同定され選択することができる。例 えば、HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドをコードする配列がベクター
のマーカー遺伝子配列中に挿入される場合には、そのインサートを含む組換え体
はマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。第3のアプローチ においては、組換え発現ベクターはその組換え体によって発現される外来遺伝子
産物をアッセイすることによって同定することができる。そのようなアッセイは
in vitroアッセイ系においてHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドの例え
ばHMWリガンドもしくは受容体との結合、または宿主細胞の赤血球凝集能力もし くは細胞抽出物のクラミジアによる赤血球凝集反応を阻害する活性などの物理的
もしくは機能的特性に基づいて行うことができる。
系および増殖条件が確立された後は組換え発現ベクターを増殖させ、多量に調製
することができる。上記説明のとおり、用いることのできる発現ベクターは次の
ベクターもしくはその誘導体が挙げられるが、それらに限定されない:ワクシニ
アウイルスもしくはアデノウイルスなどのヒトもしくは動物ウイルス;バキュロ
ウイルスなどの昆虫ウイルス;酵母ベクター;バクテリオファージベクター(例 えばλ)、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクターなどを少数であるが挙
げることができる。
な様式で遺伝子産物を改変しプロセスするものが選択される。特定のプロモータ
ーからの発現は特定のインデューサーの存在で増大し、従って遺伝子的に操作さ
れたHMWタンパク質もしくはHMW由来HMWの発現が制御される。さらに異なる宿主 細胞はタンパク質の翻訳及び翻訳後のプロセシングと改変のための特徴的で特異
的なメカニズムを有している。発現した外来遺伝子の所望の改変とプロセシング
を確保するために適切な細胞系もしくは宿主系を選択することができる。
ア感染の臨床的もしくは医学的診断のため、およびクラミジアの病原性の特性、
毒性(virulence)、および感染性、ならびに宿主防御システムの科学的研究のた めの試薬として有用である。例えば、生物学的被検体中のクラミジアの存在をハ
イブリダイゼーションもしくはPCR増幅によって同定するためのプローブとして 本発明のDNAおよびRNAを用いることができる。このDNAとRNAはまた、クラミジア
HMWタンパク質関連のポリペプチドをコードしている可能性のある他の細菌を同 定するためにも用いることができる。本発明のタンパク質は、アフィニティーク
ロマトグラフィーで本発明のタンパク質を含有する組成物をさらに精製するため
に用いられるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製するために用いる
ことができる。このタンパク質はまた、サンプル中のクラミジアに対する抗体の
存在をスクリーニングするための標準的なイムノアッセイ法に用いることもでき
る。
スミドを、American Type Culture Collection(ATCC) (10801 University boule
vard, Manassas, 米国バージニア州20110-2209)に、ブダペスト条約に従い、ま た37 CFR 1.808に従って、本特許出願の出願前に寄託した。これらのプラスミド
中に存在する遺伝子の関連部分の受託番号は下記に示す。
託の実施形態は本発明の説明としてのみ意図されたものであるので寄託されたプ
ラスミドの範囲に限定されるべきではない。本明細書で述べたものと類似もしく
は等価のタンパク質もしくはその断片もしくは類似体をコードする等価もしくは
類似のいかなるプラスミドも本発明の範囲に包含される。
実施例において提供する。これらの実施例は説明の目的のみのために記述したも
のであり本発明の範囲を限定することは意図していない。形態の変更および等価
なものへの置換は、状況からみて好都合であると示唆されるかもしくは好都合で
あるとされるものを意図している。ここでは特別の用語を用いてはいるがそのよ
うな用語は記述のために用いているのであり、限定するために用いているもので
はない。
遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は科学文献中に豊富に記載され
ており、それらは当業者であれば十分理解可能なものである。
B)を調製した。基本的にはC. trachomatis L2(LGV)を感染させたマッコイ細胞を
、超音波処理し、細胞の破砕残査を遠心で除去した。次いでクラミジアの基本小
体を含有している上清を遠心し、基本小体を含有するペレットをハンクス平衡塩
溶液(HBSS)中に再懸濁した。リボヌクレアーゼ/デオキシリボヌクレアーゼ溶液 を添加し時々攪拌しながら37℃で1時間インキュベートした。基本小体を含有す る溶液を、Angiovist 370(ジアトリゾエートメルグミンおよびナトリウムジアト
リゾエートの混合物, Berlex Laboratories, Wayne, 米国ニュージャージー州) の不連続密度勾配(40%, 44%および54%)上に重層し、基本小体を密度勾配へ分離 させるために超遠心した。遠心後、基本小体を密度勾配の44%および55%のAngiov
ist 370層の間の界面から回収した。基本小体をリン酸緩衝食塩水中で洗いHBSS 中に再懸濁した。
いで同じ基本小体調製品を1.0%のOGP、10mM DTT、1mM PMSF、10mM EDTAを50mMの
Tris 緩衝液pH7.4中に含むもので抽出した。界面活性剤およびその他の試薬を除
去するために抽出物を透析し(3500 MWCO)、凍結乾燥で濃縮した。タンパク質を 含有する抽出物をHBSSで希釈し市販のヘパリン-セファロースカラム(HiTrap Col
., Pharmacia)に通した。サンプルをヘパリンカラムにアプライした後、未吸着 のタンパク質は過剰のHBSSで洗って除去した。結合したタンパク質はバッチ式で
2M 塩化ナトリウム含有のPBSで溶出した。溶出物の塩を除去するために十分に透
析し、次いで凍結乾燥した。ヘパリンに結合したタンパク質はSDS-PAGEで大きさ
による分画を行い、銀染色による可視化、もしくはウエスタンブロッティング分
析を行った。図1に示すとおり、中程度の量存在する約105-115 kDaのタンパク質
が検出された。天然のHMWタンパク質の等電点は約5.95と測定されている。
膜(Applied Biosystems)上にエレクトロブロットし、クーマシーブルーで染色し
た。固定化HMWタンパク質を膜から放出させ、その場(in situ)で低レベルのエ
ンドペプチダーゼLys-C、エンドペプチダーゼArg-C、および/またはエンドペプ チダーゼGlu-Cを用いて天然タンパク質を断片化するために処理した。この結果 できたペプチド断片をHPLCで精製し、N末端のアミノ酸配列をABI 430 Protein
Sequenatorおよび標準的なタンパク質配列決定法を用いて決定した。そのN末端
アミノ酸配列は: E-I-M-V-P-Q-G-I-Y-D-G-E-T-L-T-V-S-F-X-Y であり、配列番号3とした。
タベース(>145 K ユニーク配列)で厳格にパラメーターをマッチさせて検索する と、正確に相同なものは発見できなかった。従ってこのHMWタンパク質は新規の クラミジアタンパク質である。このタンパク質は周辺膜タンパク質(例えばOmp2)
のみを放出するような条件下で単離されたものなので、これらのデータはHMWタ ンパク質が表面関連タンパク質であることを示している。
小体に対して高度免疫ウサギ抗血清を作製した。各ウサギに1回の注射あたり約2
50μgのクラミジア基本小体(フロイントの完全アジュバントで開始し、その後フ
ロイントの不完全アジュバントを使用)を約21日間隔で計3回免疫した。各免疫で
は、約半量を筋肉内投与(i.m.)し、半量を結節内(intranodally)注射した。第3 回目のワクチン接種の14日後に第4のブースターとして約100μgの基本小体を筋 肉内投与し、ウサギをその7-10日後に放血した。ELISAで測定したところ、1:100
,000のタイターが得られた。
ることが示された。18 kDaおよび32 kDaのシステインに富む基本小体タンパク質
は、レクチン結合タンパク質であるが、このタンパク質は特異的炭水化物部分を
有することが示された(Swanson, A.F. およびC.C.Kuo, 1990, Infect. Immun. 5
8:502-507)。放射性標識パルミチン酸の取り込みは、約27kDaのC. trachomatis
Mip様タンパク質が脂質付加されていることを示すために用いられてきた(Lundem
ose, A.G., C.W.Rouch, C.W. Penn, およびJ.H. Pearce, 1993 J.Bacteriol. 17
5:3669-3671)。Swansonらは、L2 血清型からのMOMPがN-アセチルグルコサミンお
よび/またはN-アセチルガラクトサミンを含有していること、およびこれらの炭 水化物部分がMOMPのHela細胞膜への結合をメディエートすることを見出した。 HMWタンパク質が糖鎖付加されているか確認するために、基本小体をマッコイ 細胞上でトリチウム標識ガラクトースもしくはグルコサミンの存在下で増殖させ
、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにかけ、SDS-PAGEおよびオートラ
ジオグラフィーでヘパリン結合タンパク質を分析する。簡潔に述べれば、標準的
な条件(DMEM+10% FCS, フラスコあたり35ml, 10% CO2)下でマッコイ細胞をT225 フラスコ中で約90%のコンフルエンシーとなるまで増殖し十分な量の基本小体を 接種して約90-100%の感染性となるようにする。37℃3時間の感染期間をおいた後
、シクロヘキシミドを添加(1μg/ml)して宿主細胞のタンパク質合成を阻害し、 培養物をさらに4-6時間再インキュベーションする。次いで約0.5mCiのトリチウ ム標識ガラクトース(D-[4,5-3H(N)]ガラクトース, NEN)もしくはグルコサミン(D
-[1,6-3H(N)グルコサミン, NEN]を各フラスコに添加し、培養物はさらに30-40時
間インキュベートする。細胞を掻きとって集め、基本小体を勾配遠心で精製する
。HMWタンパク質は1.0% OGP表面抽出物からアフィニティークロマトグラフィー で単離し、塩化ナトリウムで溶出し、14C標識分子量マーカー(BRL)を用いてSDS-
PAGEで分析し、オートラジオグラフィーにかける。乾燥させたゲルをKodak X-AR
フィルムに対して−70℃で1-4週間露出させる。
胞の単層上で標準的な方法に従って培養する。感染の約24時間後、従来の培地(D
MEM+10% FCS)を除去し、シクロヘキシミド(1μg/ml)および[U-14C]パルミチン酸
(0.5mCi/T225フラスコ, NEN)を含有する無血清培地と置換し、さらに16-24時間 インキュベートしてタンパク質への脂質付加(lipidation)が起こるようにする。
表面基本小体抽出物を調製し、ヘパリン結合タンパク質を単離し、上述のとおり
オートラジオグラフィーで分析する。
去した後、抽出物をアフィニティークロマトグラフィーおよびSDS-PAGEにかけ、
HMWタンパク質が硫酸ヘパリンとの結合能を保持しているか測定する。
イゼーションプローブとして用いる遺伝子特異的PCR産物を生成し、C. trachoma
tis L2λZAPII DNAライブラリーをスクリーニングしてHMWタンパク質の遺伝子を
単離した。
列のデータからコンピュータ解析によって同定し(MacVector, IBI)、これに基づ
いて低縮重性配列に特異的なオリゴヌクレオチドPCRプライマーのセットを設計 した。
(配列番号3の残基1〜6)に相補的であって、かつ可能なヌクレオチドの組み合
わせの全て(総縮重度=192配列)を含んでなる4個の縮重オリゴヌクレオチドプ ローブを設計しておき、順方向増幅プライマーとして使用した。 配列番号4 5'-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3' 配列番号5 5'-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3' 配列番号6 5'-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3' 配列番号7 5'-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3' 5残基の内部ペプチドY-D-G-E-T(配列番号3の残基9〜13)の逆相補DNA配列に相
当し、かつ可能なヌクレオチドの組み合わせの全て(総縮重度=128配列)を含ん でなる2個のオリゴヌクレオチドプローブをさらに設計しておき、逆方向増幅プ
ライマーとして使用した。 配列番号8 5'-NGT-YTC-NCC-RTC-ATA-3' 配列番号9 5'-NGT-YTC-NCC-RTC-GTA-3'
、自己開裂)と標準的なホスホルアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドを 合成した。粗オリゴヌクレオチドをC-18シリンジカラム(OPカラム、ABI)にかけ て手動で精製した。純度および収率を分光測光法にて確認した(230/260/280比) 。
3×107コピーのHMWタンパク質遺伝子)および約100pmolの各順方向(N末端オリ ゴ)および逆方向(内部オリゴ)プライマーを用いて計画した。プライマーの縮重 度を補償するため、通常の濃度よりも高いプライマー濃度(約20pmol/50μl)を少
なくとも増幅の最初に使用した。標的配列の増幅は、標準的な30サイクルの3段
階温度プロフィール(即ち、95℃で30秒、60℃で45秒、72℃で1分)を使用して行
った。密封した50μlガラス製キャピラリーチューブ中、Idaho Technologies製 サーマルサイクラーを使用して増幅を行った。これらの増幅反応時に生成したPC
R産物がHMWタンパク質コード配列に特異的であり、かつ「プライマー二量体」ま
たは他のDNA増幅アーティファクトではないことを確認するため、シリカゲルス ピンカラム(QIAGEN)を使用してアンプリマー(amplimer)を精製し、PCRクローニ ングベクターpZERO(StrataGene)へクローニングし、直接DNA配列分析にかけた。
列決定化学および改質T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase, USB)を用いて決定した。
簡単には、各二本鎖プラスミド鋳型を、NaOHを用いる簡単な処理で変性した。中
和した後、各変性鋳型を使用して4つの異なる配列決定反応を計画した。各反応
ではM13普遍的順方向配列決定プライマー(21量体)を使用したが、ddNTP/dNTPタ ーミネーション混合物(即ち、A、G、CまたはT)は異なる。[α-35S]dATPを反応に
添加してターミネーション産物を標識した(約50μCi/反応、>3000Ci/mmol、A
mersham)。個々の伸長産物を変性し(ホルムアミド、約95℃)、高分解能の変性ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた(6%アクリルアミド、8M尿素、TAEバ
ッファー、約500V、約90分)。次いで配列決定ゲルを濾紙(Whatmann 3MM)へ転写 し、減圧下で乾燥させ、次いで-70℃で24〜72時間オートラジオグラフィーを行 った。塩基ラダーを各ゲルから手動で読み取り、コンセンサス配列を決定した。
HMWタンパク質特異的アンプリマーをPCRで生成し、増幅工程中に[α-32P]dNTP( 約50μCiの各dNTP、Amersham、>5000Ci/mmol)を反応混合物へ添加して均一に放
射性標識した。標識反応は上述の通りに行った。但し、反応を0.5mlの微量遠心 チューブ中にてBellco製サーマルサイクラーを用いて行った。組込まれなかった
標識と増幅プライマーを、遠心サイズ排除クロマトグラフィーカラム(BioSpin6
カラム、BioRad)を用いて反応混合物から除去した。
サイズ分画断片をλクローニングベクターλZAPII(Stratagene)へクローニング して構築しておいた。放射性標識HMWタンパク質に特異的なPCR産物を使用して、
HMWタンパク質コード配列の全部または一部を保有する組換えクローンについて このライブラリーをスクリーニングした。標準的な組換えDNAの手法と方法論を これらの実験に利用した。これらのプローブとハイブリダイズする全てのファー
ジを、平板培養とハイブリダイゼーションスクリーニングを連続的に繰り返して
均一になるまで精製した。反応性のファージを精製したら、インサートを含有す
るファージミド(pBluescript SK-誘導体)を、適切なヘルパーファージ(例えば、
R408またはVCSM13;Stratagene)と共に宿主細胞に同時感染させて親ファージか ら切出した。アンピシリン(100μg/ml)を含有するLB寒天上に線条接種して個々 のコロニーを選択することにより、個々のファージミドをさらに精製した。
tI、SmaI、KpnI等)を使用して決定し、放射性標識N末端特異的PCR産物をプロー
ブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによってHMWタンパク質コード配 列の位置を決定した。HMWタンパク質特異的配列の方向および領域はPCR分析によ
って判定し、この分析には、クローニングベクター中に位置するT3もしくはT7プ
ロモーター配列のいずれかに相補的なHMWタンパク質特異的順方向プライマーと 逆方向プライマーとからなるプライマーセットを用いた。
むと判定された。pAH306のディレクショナル(directional)PCR分析によって、こ
の誘導体がHMWタンパク質遺伝子の約1.5KbpのN末端領域をコードすることが判 明した。
PCRサイクル配列決定法と組み合わせた従来の「配列歩行」によって得られた(AB
I Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer)。配列決定反応は、
未消化のプラスミドDNA(約0.5μg/rxn)を鋳型とし、適切なHMWタンパク質特異的
配列決定プライマー(約3.5pmol/rxn)を用いて計画した。
ddCおよびddT)ターミネーターヌクレオチドが含まれ、各ターミネーターを4種 の異なる蛍光染料のうちの一つに結合させた。1本鎖の配列決定伸長産物を、染
料標識ddNTPターミネーターを組込むことで鋳型に沿って任意の位置で終結させ た。蛍光染料標識ターミネーション産物を微量遠心サイズ排除クロマトグラフィ
ーカラム(Princeton Genetics)を用いて精製し、減圧下で乾燥させ、Template R
esuspension Buffer (Perkin-Elmer)に懸濁し、95℃で約5分間変性し、ABI 310
Automated DNA Sequenator (Perkin-Elmer)上で高分解能キャピラリー電気泳動
を行って分析した。
erMACコンピュータでABI Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer)を用いて
自動解析した。個別に自動解析したDNA配列の精度を手動で編集した後、AutoAss
emblerソフトウエア(Perkin-Elmer)を用いてコンセンサス配列「ストリング」に
マージした。pAH306によってコードされるHMWタンパク質遺伝子セグメントの両 鎖を配列決定し、これらのデータをコンパイルしてHMWタンパク質遺伝子セグメ ントの複合配列を作製した。HMWタンパク質のセグメントをコードする配列を配 列番号10として示す。この配列は図2のヌクレオチド382〜1979に相当する。pAH
306の地図を図5に示す。
タンパク質のN末端配列から遠く、かつベクターのT3プロモーター配列に隣接す
る約0.6KbpのBamHI-EcoRI断片を、初期染色体歩行用のプローブとして選択した 。簡単には、pAH306をBamHIおよびEcoRIで完全に消化し、アガロースゲル電気泳
動(0.8%アガロース、TAEバッファー中)によって消化産物をサイズ分画した。所
望の約0.6KbpのBamHI/EcoRI(B/E)バンドをゲルから切り出し、市販のシリカゲル
微量遠心クロマトグラフィーカラムおよび試薬(QIAGEN)を用いて精製した。
nger Mannheim)を用いて[α-dATP](>3000Ci/mmol, Amersham)で放射性標識し、
HindIIIで完全に消化しておいたC. trachomatis L2ゲノムDNAのサザンブロット を釣り上げるのに使用した。
ダイズした。pAH306上にコードされるHMWタンパク質遺伝子セグメントの実験的 に誘導した制限地図によれば、この断片は約0.2KpbのC末端HMWタンパク質配列 をコードする。
0個の一次クローン)のC. trachomatis L2ライブラリーを釣り上げて約1.4KbpのH
indIII断片を含むクローンを同定した。簡単には、C. trachomatis L2ゲノムDNA
を、約10倍過剰の制限エンドヌクレアーゼHindIII(ゲノムDNA1μg当たり約10単
位、37℃、18〜24時間)を使用して完全に消化した。消化産物をアガロースゲル 電気泳動(0.8%アガロース、TAE)によってサイズ分画し、サイズが約1.0Kbp〜2.
0KbpのDNA断片をゲルから切り出した。切り出したアガロースのストリップには 所望のDNA断片サイズが含まれており、可溶化/結合溶液(QX1、QIAGEN)に溶解し
、市販のシリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を使用して精製した。次いで、予めHi
ndIIIで完全に消化し、かつベクターの再ライゲーションを防ぐためウシ小腸ホ スファターゼで処理しておいたpBlueScript SK-プラスミドへ、1.0〜2.0Kbpの精
製ゲノムHindIII断片をクローニングした。
HCl、pH7.00、10mM NaCl、1mM ATP、0.5mM DTT)で25℃にて約16〜24時間、T4 D
NAリガーゼ(約10単位/反応)を用いて行った。ベクター:インサートのモル比は
約1:10とした。ライゲーションの後、アリコート(約50ngのライゲートしたDNA
)を使用してコンピテントな大腸菌宿主(例えば、大腸菌TOP10)にエレクトロポレ
ーションした。次いで、エレクトロポレーションを行った細胞を、約100μg/ml のアンピシリンを含有するLB寒天上に接種し、プラスミドを保有するクローンを
選択した。約1,000個のプラスミドを保有するApR形質転換体をLB Ap100寒天プレ
ートからナイロン膜(HyBond N+、Amersham)へ毛管作用によって直接転写した。
らなる操作のために再び生成させた。膜に転写したコロニーを溶解し、コロニー
のブロットを変性SDS/NaOH溶液で処理してDNAを遊離させた。Tris緩衝NaCl溶液 を使用して溶解物質を中和して安定化させた。遊離したDNAをUV照射によって膜 に固定化した。標準的な組換えDNAの手法および方法論を使用して、0.6Kbpの放 射性標識B/E断片を含むコロニーのブロットを釣り上げ、所望の約1.4KbpのHindI
II断片を保有する組換え誘導体を同定した。
HMWタンパク質のコードセグメントは図2のヌクレオチド994〜2401に相当する。
と個別におよび組み合わせて用いたところ、pAH310が推定約1.4KbpのHindIII断 片をコードすることを確認した。これらの分析からは、約1.4Kbpのインサートが
、pAH306に存在する約1.2Kbpの同じHindIII-EcoRI断片と、C末端HMWタンパク質
特異的DNAをコードする約0.2KbpのユニークなEcoRI-HindIII断片とからなること
も判明した。
選択した。簡単には、pAH310をEcoRIおよびHindIIIで完全に消化し、消化産物を
アガロースゲル電気泳動(0.8%アガロース、TAEバッファー中)でサイズ分画した
。所望の約0.2Kbp(E/H)バンドをゲルから切り出して精製し、[α-P32]dATPで放 射性標識し、これをプローブとして使用して、元のC. trachomatis L2λZAPIIゲ
ノムライブラリーに含まれるHMWタンパク質遺伝子のC末端セグメントをコード するクローンを同定した。
pAH316の制限分析より、この誘導体が、約2.5Kbpと約2.0Kbpのサイズの2個のEc
oRI断片からなる約4.5KbpのC. trachomatis L2インサートを含むことが判明した
。約0.2KbpのE/H断片をプローブとして使用するサザンハイブリダイゼーション 分析では、この配列はpAH316の約2.5KbpのEcoRI断片に位置した。精製pAH316プ ラスミドDNAを鋳型として使用し、約0.2KbpのE/H断片並びにT3およびT7ベクター
配列に特異的な増幅プライマーのセットを使用するディレクショナルPCR分析か らは、pAH316がHMWタンパク質遺伝子のC末端セグメントをコードすることが判 明した。HMWタンパク質のコードセグメントは図2のヌクレオチド1974〜3420に 相当し、配列番号11として示す。
タンパク質の最初の10個のN末端残基に相補的な配列を含む。HMWタンパク質コ ード配列の他にも、この順方向プライマーは、ベクタープラスミド上にコードさ
れた(His)6アフィニティー精製ドメインへ適切に融合するための成熟HMWタンパ ク質(Glu/E)の最初の残基の上流に最適に位置するユニークなXhoI制限部位と、 効率的な増幅のための5'末端の6塩基G/Cクランプおよびエンドヌクレアーゼに よる効率的な認識と消化のための12塩基内部スペーサーを保有する。 配列番号18 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGC-TCG-AGA-GAA-ATT-ATG-GTT-CCT
-CAA-GGA-ATT-TAC-GAT-3' 配列番号19 5'-CGC-TCT-AGA-ACT-AGT-GGA-TC-3' pAH306のEcoRI部位の下流にあるファージミド配列に相補的な市販の逆配列決定 プライマーSK(20量体、StrataGene;配列番号19)を、これらの反応に逆方向増幅
プライマーとして使用した。HMWタンパク質ORF産物(約1.5Kbp)の許容できる収 率を得るために、一次増幅ポリメラーゼとしてのT. thermophilus DNAポリメラ ーゼ(Advantage Polymerase)と、さらに5'-3'プルーフリーディング活性をもた らす微量の忠実度の高い第2の熱安定性DNAポリメラーゼ(CloneTech)とからなる
熱安定性DNAポリメラーゼの混合物を用いてPCR増幅を行った。抗Tth DNAポリメ ラーゼ抗体を反応混合物に添加して、2Kbpを越えるアンプリマーの生成を促進す
る自動「ホットスタート(hot-start)」条件を与えた。市販のアルカリ/SDS系(Q
IAGEN)およびシリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を用いて精製したpAH306プラスミ
ドDNAを使用してこれらの増幅反応を計画した(約0.2ng/反応)。
のアンプリマーを精製し、過剰のXhoIおよびEcoRI(DNA1μg当たり約10単位)を 使用して完全に消化した。次いで、精製かつ消化したN末端切断HMWタンパク質O
RFを、XhoIおよびEcoRIの両方で予め消化しておいた市販の発現プラスミドpTrcH
isBへクローニングした(5:1のインサート:ベクター比)。次いで、ライゲーショ
ン反応からのアリコートを使用して、適切な大腸菌宿主(例えば、TOP10)を電気 的に形質転換した。
i-prep DNA)を調製し、XhoI、EcoRIまたは両者の組み合わせで完全に消化し、約
1.5Kbpの末端切断HMWタンパク質ORFインサートの有無および方向についてアガロ
ースゲル電気泳動にて試験した。約1.5KbpのXhoI/EcoRIインサートを保有すると
判定されたクローン由来のミニプレップDNAを調製し、これを使用して非対称PCR
DNA配列決定反応を計画し、HMWタンパク質断片と発現ベクターの(His)6アフィ ニティー精製ドメインとの間に形成される結合の忠実度を確認した。プラスミド
pJJ36-Jは、これらの手法で単離された組換え誘導体の一つであり、図2のヌク レオチド446〜1977に相当する。HMWタンパク質の末端切断断片の推定アミノ酸配
列は、図3のアミノ酸29〜532に相当し、配列番号17として示す。
matis株と他のクラミジア種(例えば、C. pneumoniae)にHMW遺伝子が存在するか を確認した。凍結ストックとしてATCC(Rockville, MD)から入手したChlamydia t
rachomatis株を使用して、McCoy細胞のコンフルエントに達していない(subconfl
uent)単層(約80%)に標準的な手法に従って感染させた。感染させた単層をSorva
ll RT6000B遠心分離機で遠心分離し(約1,300rpm、25℃、30分)、および/または
硫酸デキストラン(約50μg/ml)で感染時に処理して感染力の低い次亜種(biovar)
(non-LGV)の宿主細胞への初期結合を強化させ、最終的なEB収率を増加させた。 約48時間後に、感染単層を掻き取って回収し、宿主細胞を超音波処理で破壊して
基本小体(EB)を遊離させた。全DNAを各株の精製EB(約107〜108)からプロテイナ ーゼK/Nonidet P40法(Denamurら, J. Gen. Microbiol. 137:2525-2530, 1991 に記載、本文献は引用により本明細書に含まれるものとする)を使用して抽出し 、フェノール/クロロホルム抽出と塩析沈殿でさらに精製した。精製Chlamydia
penumoniae(AR-139)のゲノムDNAはAdvanced Biotechonologies Inc.より購入し た。
ドプライマー(21量体)のセットを使用する増幅反応を計画した。 配列番号20 5'-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-G-3' 配列番号21 5'-GGT-CCC-CCA-TCA-GCG-GGA-G-3'
iTaqポリメラーゼ、最終容量50μl)を、約15μlの粗C. trachomatis DNA抽出物(
約10μlの市販のC. pneumoniae DNA)と約20pmolの順方向および逆方向の各HMWタ
ンパク質特異的増幅プライマー(配列番号20および21)を使用して計画した。短い
標的配列(2Kbp以下)の増幅は、32サイクルの3段階温度プロフィール(即ち、95
℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分)を用いて行った。ORF-クローニングおよび 配列決定用の長い標的配列の増幅は、粗DNA抽出物を同様に用いて行った。但し 、MAbで不活化したTth/Vent DNAポリメラーゼ酵素の組み合わせを使用し(Advant
age PCR, Clontech)、72℃での伸長時間は、所望のPCR産物のサイズに2分間を 足した時間を使用した(即ち、所望のPCR産物=6Kbpの場合、伸長時間=8分)。
の薄壁ポリプロピレン遠心分離チューブを使用してABI 2400サーマルサイクラー
(Perkin-Elmer)中で行った。温度サイクルを行った後、反応のアリコート(約20 μl)を分析し、PCR産物を標準的なアガロースゲル電気泳動(0.8%アガロース、T
AEバッファー中)と臭化エチジウム染色で同定した。その結果、HMWタンパク質が
、臨床上関連のある血液型亜型中に高度に保存されていることが判明し、HMW遺 伝子は試験を行った全てのクラミジアサンプル株(血液型亜型B、Ba、D、E、F、G
、H、I、J、K、L1、L2およびMoPn並びにC. pneumoniae)中に存在した。
相当)および C. trachomatis F血液型亜型(感染力の低いSTD次亜種に相当)の双 方からPCRクローニングし、HMWタンパク質コンセンサスC. trachomatis L2配列 と比較した。
bpのHMWタンパク質特異的DNA断片をC. trachomatis BおよびFゲノムDNAから生成
した。これらのLD-PCR操作の増幅条件は、実施例6に記載の通りとした。これら
の反応に使用した逆方向増幅プライマー(p316Kpn-RC、56量体、配列番号13とし て記載)は、推定HMWタンパク質終結コドンの約3Kbp下流に位置する配列に相補 的なものである。所望の約6Kbpのアンプリマーをクローニングするため、クラ ミジア配列の5'側の1個のKpnI制限エンドヌクレアーゼ部位を遺伝子操作によっ
てp316Kpn-RCプライマーへ組込んだ。これらの反応に使用した順方向増幅プライ
マー(p306Kpn-F、56量体、配列番号12として記載)には、成熟HMWタンパク質を特
定する最初の10アミノ酸残基(30ヌクレオチド)とKpnI部位を特定する5'配列に相
補的な配列が含まれる。約6Kbpアンプリマーを大腸菌発現ベクターpTrcHisB(Cl
onTech)のKpnI部位へ挿入した場合に、成熟HMWタンパク質のN末端をコードする
配列が、このベクター上の高効率trcプロモーターの下流にコードされている6H
isアフィニティードメインにインフレームで連結し得るようにP306Kpn-Fを設計 した。 配列番号12 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCG-AAA-TTA-TGG-TTC-CTC
-AAG-GAA-TTT-ACG-AT-3' 配列番号13 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCC-TAA-GAA-GAA-GGC-ATG
-CCG-TGC-TAG-CGG-AG-3' 約6KbpのHMWタンパク質産物をシリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を用いて精製し
、10倍過剰のKpnI(精製断片1μg当たり約10単位、37℃)を用いるKpnI消化の8 〜10時間サイクルに断片を2回かけた。2回目の消化の後、残留する制限酵素活
性をQIAGENスピンカラムを用いて除去し、予めKpnIで完全に消化し、かつベクタ
ーの再ライゲーションを防ぐためウシ小腸ホスファターゼで処理しておいたpTrc
HisBプラスミドへ約6KbpのKpnI HMWタンパク質断片をクローニングした。
HCl、pH7.00、10mM NaCl、1mM ATP、0.5mM DTT)で25℃にて約2時間、T4 DNAリ
ガーゼ(約10単位/反応)を用いて行った。ベクター:インサートのモル比は約1
:5とした。ライゲーションの後、アリコート(約50ngのライゲートしたDNA)を 使用してコンピテントな大腸菌宿主(例えば、大腸菌TOP10)にエレクトロポレー ションした。電気的に形質転換した細胞を約100μg/mlのアンピシリンを含有す るLB寒天上に接種して、プラスミドを保有する形質転換体を選択した。37℃で約
18〜24時間インキュベートした後に現れるアンピシリン耐性(ApR)形質転換体を ランダムに採取し、精製のため、同様の選択培地上へ再び線条接種した。
て適度に通気しながら増殖させた。ブロス培養から得られた細胞を遠心分離で回
収し、これを使用して少量のプラスミドDNAを調製した。市販の試薬(QIAGEN Pla
smid Mini Kits)をこれらのプラスミド抽出に使用した。消化されなかったプラ スミドDNAをアガロースゲル(0.8%アガロース、TAEバッファー中)で電気泳動し てベクタープラスミドよりもサイズの大きい誘導体を同定することにより、イン
サートを保有するプラスミド誘導体を推定で同定した。インサートを含有する誘
導体を確認し、ベクター配列に対するHMWタンパク質インサートの方向を適切な 制限エンドヌクレアーゼ(KpnI、EcoRI、HindIII、BamHI等)を個別にまたは様々 に組み合わせて用いて決定した。
Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer)、実施例4に記載)を用いてC
. trachomatis BおよびFのHMWタンパク質遺伝子のDNA配列を両鎖とも得た。プラ
スミドのミニプレップDNAと、L2型株由来のHMWタンパク質遺伝子の配列決定に使
用する個々のHMWタンパク質配列特異的プライマーを用いて反応を計画した。
た。個別に自動解析したDNA配列の精度を手動で編集した後、AutoAssemblerソフ
トウエア(Perkin-Elmer)を用いてコンセンサス配列「ストリング」にマージした
。C. trachomatis BおよびF血液型亜型に由来するHMWタンパク質遺伝子の両鎖を
配列決定し、これらのデータをコンパイルしてC. trachomatis BおよびF HMWタ ンパク質遺伝子の両方について複合コンセンサス配列を作製した。これらの配列
を配列番号14および15として示す。L2、FおよびB株の配列比較を図6に示す。
を産生させた。完全HMWタンパク質オープンリーディングフレーム(ORF)をC.trac
homatis L2ゲノムから1個の(single)KpnI断片としてPCRクローニングし、実施 例5に記載したとおりに、高発現プラスミドベクターpTrcHisB(CloneTech)にコ ードされた(His)6アフィニティ精製ドメインに適正な方向および正確な読み枠に
なるように融合した。
イン・ダルガノリボソーム結合部位(RBS)からなる高発現遺伝子座の一部である 。C.trachomatis LGV L2、C.trachomatis BおよびC.trachomatis F由来のHMWタ ンパク質遺伝子を〜3.0Kbp断片としてPCRクローニングした。これらの反応に用 いられる順方向プライマー(56マー)をp306Kpn-Fと命名した。このプライマー は、配列番号12に列挙した成熟HMWタンパク質の最初の10個のN末端アミノ酸残基
に相補的な配列を含む。この順方向プライマーは、HMWタンパク質コード配列の 他に、ベクタープラスミドにコードされている(His)6アフィニティ精製ドメイン
への適正な融合のための成熟HMWタンパク質の最初の残基(Glu)の上流に任意に位
置するユニーク(unique)KpnI制限部位、効率的な増幅のための5'末端6塩基G/Cク
ランプ(clamp)および効率的なエンドヌクレアーゼ認識/消化のための12塩基内 部スペーサーも有する。p316Kpn-3RCと称される逆方向PCRプライマーは、配列番
号14に示したHMWタンパク質終結コドンから〜0.2Kbp下流に位置するC.trachomat
is配列に対する逆方向相補配列を含む。p306Kpn-Fの場合と同様に、逆方向プラ イマーもC.trachomatis配列の5'側にKpnI制限部位を含み、さらに6塩基G/Cクラ ンプおよび12塩基内部スペーサーを含む。
幅ポリメラーゼとしてT.thermophilus DNAポリメラーゼからなる耐熱性DNAポリ メラーゼと、さらなる5'-3'プルーフリーディング活性を得るための少量の第二 の高忠実度(fedelity)耐熱性DNAポリメラーゼ(Advantage Polymerase, CloneTec
h)との混合物を用いてPCR増幅を行った。抗-Tth DNAポリメラーゼ抗体を反応混 合物に加えて大型(2Kbpより大)のアンプライマー(amplimer)の製造を促進する
自動「ホットスタート(hot-start)」条件を得た。
ら単離し、これらの反応のプログラムするのに用いた。増幅後、市販のシリカゲ
ルスピンカラムおよび試薬(QIAGEN)を用いて所望の反応産物を過剰のプライマー
から精製し、過剰のKpnI(DNA 1μg当たり〜10単位)を用いて完全に消化した。
次いで、精製し、消化したKpnI HMWタンパク質ORFをKpnI予備消化pTrcHisB発現 プラスミド(5:1、挿入断片:ベクター比)にクローニングした。その後、ライゲ
ーション反応から得たアリコートを用いて適当なE.coli宿主(例えばTOP10)を電 気形質転換した。
し、KpnI、HindIII、またはその両方の組合せを用いて完全に消化し、そしてア ガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により〜3.2KbpのHMWタンパク 質ORF挿入断片の存在および方向について試験した。上記の実施例に記載したよ うにmini-prep DNAを用いて非対称PCR DNA配列決定反応をプログラムし、ベクタ
ーのHMWタンパク質断片と(His)6アフィニティ精製ドメインとの間に形成された 結合部(junction)の忠実度を確認した。プラスミドpAH342はこれらの操作により
単離された誘導体の一つであり、C.tarchomatis L2由来のHMWタンパク質遺伝子O
RFを含み、図2においてヌクレオチド446〜3421に示されている。
加圧セル(French pressure cell)を用いて溶解することにより粗細胞溶解物を調
製した。
てもよい。ここで、C.trachomatis L2およびC.trachomatis F由来のHMWタンパク
質ORFを、pTrcHisBについて記載した手法と本質的に同じ手法で予めKpnIで完全 に消化し、CIPで処理することによりベクター再結合を最小にしたバキュロウイ ルストランスファー(transfer)ベクター(例えばpFastBacHTb)に〜3Kbp PCR産 物としてPCR-クローニングした。次いで、このクローニングエクササイズにおい
て作製されたHMWタンパク質発現カートリッジ(すなわちバキュロウイルス多面 体プロモーター、N末端(His)6アフィニティ精製ドメイン、HMWタンパク質遺伝子
ORF)を、市販のbacmid系(Bac-to-Bac, Gibco)を用いた部位特異的転位によりバ
キュロウイルスゲノムに転移させた。
ラスミドレプリコン)を含むコンピテントE.coli DH10bac(Gibco)細胞を標準的 な形質転換および選別方法により形質転換した。HMWタンパク質発現カートリッ ジが発現プラスミドからbacmidレプリコン上に位置するlacZ遺伝子内の適切な受
容体部位にうまく転位された形質転換体を、標準的なIPTG/X-galブルー-ホワイ ト選択を用いて同定した。
-Horowitz, N.A.R.9:2989-2993(1981)(参照により本明細書に含まれる)の方法
によりブロス培養物からbacmid DNAを調製し、これを用いてSpodoptera frugipe
rda 9細胞をトランスフェクトする。プラーク精製後、組換えHMWタンパク質バキ
ュロウイルスを用いて大量のSpodoptera懸濁培養物に感染させる。酵母発現系を
用いることによりグリコシル化型のHMWタンパク質を産生させる。
質遺伝子を含有する発現プラスミドを有するE.coli株を、5Lの発酵槽(New Bruns
wick)においてルリアブロス中で37℃にて適度に通気しながら対数増殖中期(〜0.
5O.D.600)になるまで増殖させ、4〜5時間IPTG(最終1mM)を用いて誘導した 。細胞ペーストを集めて、PBS中で洗浄し、-20℃で保存した。凍結した細胞ペー
ストのアリコート(湿潤重量で〜9〜10g)を機械的撹拌により〜120mlのD-PBS
に懸濁し、フレンチ加圧セル(2×、14,000psi、4℃)を通過させて溶解した。次 いで、可溶性タンパク質を高速遠心分離(〜10,000×g、4℃、30分)によりrHMW
タンパク質封入体から除去した。
ク質封入体を6M塩酸グアニジンを含むリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.0)に 懸濁することにより変性し、Fast-Flow Chelating Sepharose(Pharmacia)から調
製したNi2+アフィニティカラム(1.5cm×25cm、カラム床体積〜15ml)に加えて標
準的な手順でNi2+またはZn2+イオンを充填した。カラムを8M尿素を含むリン酸ナ
トリウム緩衝液(0.1M、pH7.0)〜5〜10カラム容量で洗浄することにより非結合 材料を除去した。
を用いて溶出した。溶出した材料を1.0Mのトリス-HCl(〜2.5ml、pH7.5)を加え
ることにより中和し、SDS(0.5%)を含むTE緩衝液に対して透析することにより尿
素を除去した。透析した材料をCentricon-30遠心濃縮器(Amicon、30,000MWCO)を
用いて濃縮し、1mMの2-メルカプトエタノール(Lammeli)を含む5×SDSゲル試料 緩衝液1/5容量と混合して100℃にて5分間煮沸した。
ゲル(resolving gel)、30:0.8のアクリルアミド:ビス溶液、厚さ3mm)に加えた
。予備染色した分子量標準(SeeBlue, Novex)をrHMWタンパク質試料と平行に流し
てゲル上のサイズ分画を同定した。分子量〜50〜70Kdalのタンパク質を含有する
ゲルの領域を切り出して、製造業者が指定したようにElu-Trap装置および膜(S&S
)を用いてタンパク質を電気溶出させた。電気溶出したタンパク質を透析してSDS
を除去した。試料のタンパク質濃度をMicro-BCAシステム(Pierce)を用い、濃度 標準としてBSAを用いて測定した。図4に示したようにrHMWタンパク質の純度を 通常のSDS-PAGEおよび市販の銀染色試薬(Silver Stain Plus, Novex)を用いて測
定した。
kDaである。
タンパク質に対して誘導される多価抗血清を作製した。1回当たり約250μgのHMW
タンパク質またはその断片を注射することにより約21日間隔で合計3回各動物を 免疫感作した(完全フロイントアジュバントで開始し、不完全フロイントアジュ
バントがそれに続く)。各免疫感作において、約半分の材料を筋内(i.m.)投与し
、半分を結節間注射した。3回目のワクチン接種の14日後、約100μgのHMWタンパ
ク質をi.m.投与することにより4回目の追加免疫を行い、7〜10日後に動物から 瀉血した。捕獲リガンドとして精製HMWタンパク質(1.0μg/ウェル)またはC.trac
homatis L2 EB(全および粗タンパク質抽出物)を用いるELISAによって抗HMWタ ンパク質力価を測定した。精製rHMW先端切断タンパク質を用いた場合、免疫原特
異的IgG ELISA力価1/320,000が観察され、EBまたはRBを用いた場合、1/2500が観
察された。
釈したヤギHRP-結合抗ウサギ抗体を、これらのアッセイの第2のレポーター抗体
として用いた。力価は、陽性ELISA反応(すなわちO.D.450値が平均陰性対照値(
予備出血(prebleed)ウサギ血清)よりも2SD以上高い)を示す最大希釈度として 示される。次いで高度免疫抗血清を用いて粗EBまたはRB抽出物ならびに1.0%OGP
EB抽出調製物のウェスタンブロットを調べることにより、その他のC.trachomat
is血液型亜型およびクラミジア種がHMWタンパク質を発現するか否かを確認した 。C.trachomatis血液型亜型B、Ba、D、F、G、I、J、K、L1、L2、L3、MoPnおよび
Chlamydia pneumoniaeを試験したところ、HMWタンパク質に対して作製した抗血 清と反応する見かけの分子量105〜115KDaのタンパク質を有することが分かった 。
技術分野で一般的に公知の方法によってIFAを行った。C.trachomatis血液型亜型
L2、B、およびFの一つ、C.pneumoniaeまたはC.psittaci由来の全EBに感染したHa
k細胞は下記の方法により得られる。
ラス上にてD-MEM培地中で集密になるまで増殖させ、次いで〜5×104封入体形成
単位(IFU)のC.trachomatis株N11(血液型亜型F)を遠心的に接種した。〜24時間 インキュベートした後、培地を除去し、感染細胞を10分間メタノール中に固定し
た。次いで固定化された単層をPBS(1×)で洗浄して固定液を除去し、PBS中で〜1
/100に希釈した>300μlの抗60Kdal先端切断HMWPウサギ抗体を重ね合わせた。一
次抗体とともに1時間インキュベートした後、細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次い
でFITCと結合したマウス抗ウサギIgG抗体の1/200希釈物とともに〜30分間インキ
ュベートした。対比染色として0.0091%エバンスブルーを含むPBSを用いて第2の
抗体を希釈することにより単層を視覚化した。細胞をPBSで2回洗浄して二次抗体
を除去し、培養皿からカバーガラスを取り除いて蛍光封入剤を用いて顕微鏡スラ
イド上に固定した。
並行して処理し、抗体特異性(陰性)対照として用いた。対比染色した試料をpl
an-neoflur対物レンズを備えたZeiss Axioskop顕微鏡写真機を用いて倍率1000×
で調べた。C.trachomatis NI1(F血液型亜型)を用いた結果を図7に示す。この 結果は、HMWタンパク質抗体で染色した試料の蛍光発光性が対照と比べて増大し ているということはHMWタンパク質が表面に位置していることを裏付けるもので あることを示すものである。さらに、HMWタンパク質抗体で染色された試料の蛍 光発光は、L2、BおよびMoPn血液型亜型およびC.pneuomoniae由来の表面局在化HM
Wタンパク質への結合を示すものである。
のクラミジア感染を抑制(中和)したことが示されている。動物モデルは、前臨
床評価に必要な小動物(非霊長類)および霊長類モデルの両方についてのワクチ
ン有効性試験にも必須である。モルモットをモルモット封入体性結膜炎物質(GPI
C)、C.psittaciによる実験的な眼および性器感染の試験に用いた。
ルを提供する。このマウスモデルは一般的に許容された前臨床検定であり、サブ
ユニットワクチンとしてのMOMPを評価するために用いた。別のモデルは、分泌型
IgAの誘導が防御の主要な構成要素であることが示されているトラコーマ感染の 霊長類モデルとして公知である。上記の一般的に許容されたin vitro中和および
動物モデル系を用いて新規サブユニット抗原候補物質のワクチン原能力を測定す
る。
.trachomatis血液型亜型(例えばL2、B、F)のin vitroの感染性をブロックするそ
の能力について評価した。McCoy細胞を用いてクラミジアを伝播させたが、これ らの細胞はFc受容体による抗体介在取り込みも可能にする。したがって、感染性
の抗HMW抗体阻害を評価するために、Fc受容体を表示しないHak細胞をこれらの分
析に用いた。
%=1×105細胞/ml)になるまで5%CO2中で37℃にて増殖させた。抗HMW抗体を スクロース-リン酸-グルタミン酸(SPG)緩衝液中で約100μg/ml(総タンパク質)
まで希釈し、次いでSPG緩衝液中で連続的に希釈した。予め力価測定したクラミ ジアの凍結アリコートをSPG緩衝液中で約2×104IFU/mlになるまで希釈した。EB
を希釈した抗HMW抗体と約10〜20IFU/μlになるまで予備混合し、振動プラットフ
ォーム(rocking platform)上で37℃にて30分間インキュベートした。
500IFU/mlにて各抗体につき3個一組でインキュベートした。プレートを37℃で2 時間インキュベートし、次いで接種材料を除去し、プレートをHBSSで3回洗浄し た。1μg/mlのシクロヘキサミドを含む組織培養培地を加え、プレートを5%CO2 中で37℃にて約24〜36時間インキュベートすることにより封入体を生じさせた。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞単層をPBS中で3回洗浄した。プレー
トをメタノール中に20分間固定してPBS中で再洗浄した。
C結合ヤギ二次抗体と37℃にて30分間インキュベートした。カバーガラスを洗浄 し、空気乾燥し、カバーガラス上のグリセロール中に固定した。Zeiss蛍光顕微 鏡写真機にてカバーガラスの中央線を通る5つの領域内の封入体を計数した。結
果を、異種抗体対照(ウサギ予備出血血清)に対する封入体含有細胞の減少割合
として報告する。
a trachomati誘発型卵管炎および不妊症に対して動物を防御する効力を評価した
。17匹の雌C3H HeOuJマウス(〜6週齢、Jackson Lab)からなる群(3群)をこの評
価に用いた。約10〜12μgのゲル精製rHMWPとアジュバントとして〜5μgのmLT(Sm
ithKline Beecham)とを含有するワクチン製剤〜20μlを鼻腔内投与することによ
り0週目、2週目および3週目に17匹のマウスからなる試験群を免疫感作した。16 %のKetajectおよび16%のXylajectを加えた68%の発熱性物質無しのPBSからな る麻酔カクテル(100μl i.p./動物)を用いて免疫感作前にマウスを鎮静させた
。鎮静マウスを仰向けに寝かせて標準的な実験用ピペットを用いてワクチン製剤
を投与した。投与は鼻孔当たり〜10μlのワクチン溶液を5分間隔で注入すること
により行った。
作した。続いて、これらの群の中の一つにC.trachomatisを抗原投与して(偽免 疫感作、感染)陰性妊性対照として用い、その他の群は抗原投与せずに(偽免疫
感作、偽感染)陽性妊性対照として用いた。
S中2.5mg、Depo-Provera、Upjohn)を投与して子宮上皮を安定化させた。5週目 に、rHMWで免疫感作した動物および陰性対照群の動物に、子宮内左右接種(bilat
eral intrauterine inoculation)により、100μlのスクロースリン酸グルタミン
酸緩衝液(SPG)に加えた〜5×105封入体形成単位(IFU)のC.trachomatis NI1(血
液型亜型F)を感染させた。その他の2群が経験した生殖管に対する処理を模擬す るために、陽性対照の動物にC.trachomatisを含まない100μlのMcCoy細胞抽出物
を左右接種した。7週目に、各群の5〜7匹のマウスをCO2窒息により屠殺し、完
全生殖管(上部、下部生殖管の両方)を組織病理学的分析のために取り出した。
9週目に、各群の残りの雌を8〜10週齢雄C3Hマウスとともに2ヶ月間ケージに入 れて飼育し、妊性を評価した(1ゲージ当たり2匹の雌を入れ、1匹の雄を入れる
。各群の雄は週1回入れ替えをする。異なる実験群のマウスは混合しなかった) 。触診と定期的な体重測定によって各ペアのマウスが妊娠した時期を確認した。
群の妊性の評価に用いたパラメーターは下記のとおりである:F、交配期間中に 少なくとも1回出産したマウスの数をその試験群のマウスの総数で割ったもの;M
、新生児マウス(死産(born dead)または生存(alive))の数を交配期間中にその
群で生まれた同腹子の数で割ったもの;ならびにN、新生児マウス(死産または 生存)の数をその群のマウスの総数で割ったもの。
にパラフィン包埋または直接包埋し、その後液体窒素中で急激に (snap)凍結し た。組織切片(〜6μm)をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した(ブワン 固定化試料の脱パラフィン後に染色)。卵管および卵巣内の炎症性の変化を下記
のようにして等級付けした:0、識別できる炎症性反応なし;1、2〜3個の単
核細胞が卵巣傍腔(periovarial space)または卵管の粘膜下組織に浸潤している ;2、1と同じであるが、より程度が大きい;3、2と同じであるが、卵管粘膜
下組織が厚くなり、卵管管腔に炎症細胞が存在する;4、3と同じであるがより
程度が大きい。観察された上皮内浸潤のレベルに基づいて子宮頸部/膣の炎症の
スコアを付けた。
よって定期的に回収し、血清を遠心分離によって調製した。50μlの滅菌PBSを標
準的な実験用ピペットを用いて膣に繰り返し注入し、ただちに溶液を回収するこ
とにより膣分泌物を回収した。注入/回収サイクルを2〜3回行った。
一晩かけてウェル当たり10mM炭酸塩/重炭酸塩緩衝液(pH9.6)に加えた〜0.5〜1.
0μgのゲル精製rHMWPで被覆し、0.1%Tween-20を含むPBS(洗浄用緩衝液)で洗 浄し、3%BSAを含むPBS溶液で37℃にて〜1時間ブロックした。抗原特異的血清Ig
Gレベルの測定のために、試験血清を0.5%BSAを含む洗浄用緩衝液で連続的に希 釈し、アリコート(100μl)を抗原被覆ウェル中で37℃にて〜2時間インキュベー
トした。次いで、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤ ギ抗マウスIgG第2抗体(Sigma)とともに37℃にて〜1時間インキュベートした。HR
P結合ヤギ抗マウスIgA二次抗体を用いて膣分泌物中のrHMWP特異的IgAの存在を検
出した。適当な二次Abとともにインキュベートした後、プレートを洗浄し、室温
にてTMB基質(Sigma)とともに〜20〜30分間インキュベートした。2MのH2SO4を加 えることにより反応を停止させ、Molecular Devices SpectroMax マイクロプレ ートリーダーを用いて450nmにおける吸光度を測定した。力価を450nmにおける光
学濃度1.0に対応する試料希釈倍数(dilution)の逆数として測定した。
よび3週目に免疫感作した。4週目および5週目の、それぞれプロゲステロン処
置および子宮内抗原投与直前に、各群の3匹のマウスをCO2窒息により屠殺し、 脾臓を無菌的に取り出し、単一細胞懸濁物を通常の方法を用いて調製した。免疫
感作したマウスから得た脾臓細胞を別個に分析した。陽性対照群(偽免疫感作、
偽感染)と陰性対照群(偽免疫感作、感染)の両方について、脾臓細胞をプール
して再刺激に関して試験した。
mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、1mm ピルビン酸ナトリウム、非必
須アミノ酸、および50μM 2-メルカプトエタノール(Gibco-BRL)を補給した5ml のRPMI 1640 Glutamax I中で細かく砕いた(5〜10回転)。生細胞をトリパンブ
ルー染色により計数し、1.0〜2.0×106細胞/mlの密度になるまで同培地中で希釈
した(Falcon 2063 ポリプロピレンチューブ)。培養物を3個一組で、丸底96ウ ェル培養プレート(Nunclon, Nunc)中に加えた。200μl中、ウェル当たり〜5×
105レスポンダー細胞で添加した。細胞を、1.0μg/mlのrHMWP(抗原特異的増殖 )または陽性刺激対照として4μg/mlコンカナバリンA(Boerhinger Mannheim)の
いずれかを用いて刺激し;非再刺激細胞培養物を細胞活性化の陰性対照として用
いた。5%CO2中で37℃にて72〜96時間インキュベートした後、細胞をウェル当 たり1.0μCiの3H-チミジン(Amersham)で18時間かけてパルス標識した(pulsed la
belled)。パルス細胞をTomtec Cell Harvester(Mk III)を用いてガラスファイバ
ーシート上に採取し、3チャンネルWallac 1450 Trilux 液体シンチレーション カウンターにてβ放射を計数した。試料の刺激指数(SI)(個別のものまたはプー
ルしたもの)は、3個一組のウェルについての抗原またはConA-刺激T細胞の3H-チ
ミジンの取り込みの平均を、3個一組のウェルについての非刺激取り込みの平均 で割り算したものと定義した。抗原特異的(rHMWP-特異的)およびConA特異的増 殖の両方についてのSIを測定した。
亜型F)のヒト臨床単離菌によって引き起こされた不妊症に対する防御を付与し得
るという証拠を表1に示す。rHMWPで免疫感作した動物は、陰性対照群の動物(3
0%、偽免疫感作、感染)よりも有意に高い受精率(70%、すなわち群内の妊性 雌の数/その群内の動物の総数)を示した。同様に、rHMWP免疫感作群はより多 くの子を産み、陰性対照群において観察されたよりも大きな群生殖力を示した(
それぞれ、子51対24、生殖力スコア5.1±4.7対2.4±4.6)。rHMWPワクチンで免 疫感作された動物の群は、偽感染陽性対照群で観察されたものと同等の受精率、
子の総数、および生殖力スコアを示した(受精率80%、子の総数56匹、生殖力4.
9±2.7)。
.trachomatis疾患に対する交差次亜種(cross-biovar)および交差血液型亜型(cro
ss-serovar)防御を付与するというrHMWPの効用も示すものである。本実験で用い
られた組換えHMWP抗原は、眼および生殖管の全身性ならびにより局在化した粘膜
感染を引き起こすC.trachomatis性病性リンパ肉芽腫(LGV)群(L2株)に属する株 からクローニングされた。これらの実験で用いられたC.trachomatis抗原投与生 物、NI1株は、多数の尿生殖管感染を引き起こすトラコーマ次亜種に属するF血液
型亜型生物である。
等もしくはそれよりも大きかった(3匹のrHMWP免疫動物から得られた抗原および
ConA刺激の平均値は、それぞれ26.2対18.4であった)。偽免疫された動物または 純粋な動物(つまり、rHMWP抗原またはmLTのいずれにも暴露されなかった動物)か
ら得られた脾臓細胞はいずれも、rHMWP物質でのin vitro再刺激に対して応答し なかったので、免疫化動物で観察される増殖応答の特異性を確立した。黄体ホル
モン処置は、rHMWP免疫された動物で観察される抗原特異的増殖応答に影響を及 ぼさなかった。ホルモン処置後の脾臓細胞を用いて得られる抗原特異的SIは、マ
イトジェン刺激を介して得られたものよりも大きかった(3匹のrHMWP免疫動物か
ら得られた抗原およびConA刺激の平均値は、それぞれ92.4対37.8であった)。偽 免疫した動物または純粋な動物から回収したサンプルは、やはり抗原特異的増殖
応答を全く示さなかった。
るELISAによってIgG力価を測定した。表4に示すように、3回の約10〜12μgのr
HMWP投与でのC3Hマウスの免疫化により、全ての動物において検出可能なレベル の抗rHMWP IgGが生成された。これらの動物から、同時点で膣分泌物も回収し、 抗-rHMWP粘膜IgAの存在について検査した。3匹の動物で抗原特異的膣IgAが検出
された(表4)。
することによってC.trachomatis L2 HMWP遺伝子全体を含むプラスミドを構築し た。これは、pAH306をXhoIで完全に消化し、プラスミドを再度ライゲートしてpA
H306-Xho△-1を作製することによって達成した。残りのHMWP C-末端を含むpAH3
16由来の約2.5KbpのEcoRI断片(第8.5節に記載)を、pAH316の完全なEcoRI消化物 を充填された分離用アガロースゲルから単離した。適切な約2.5Kbp断片を含むア
ガロースゲル薄片を切り出し、NaI緩衝液で溶解し、ヒドロキシアパタイトスピ ンカラムクロマトグラフィー(QiaGen)で残ったアガロースから精製した。次いで
、精製したC-末端HMWP EcoRI断片を、HMWP N-末端コード配列の3'末端に位置
する、pAH306-Xho△-1の単一のEcoRI部位に、T4 DNAリガーゼおよび標準的な分 子生物学的プロトコールを使用してライゲートした。大腸菌Top10細胞を、pAH30
6-Xho△-1(EcoRIで消化し、ホスファターゼで処理したベクター)のアリコートお
よび2.5KbpのEcoRIC-末端断片ライゲーション反応で形質転換し、そして100μg
/mlアンピシリンを含有する2X-YT寒天上で組換え体を選択した。アンピシリン耐
性形質転換体をランダムに取った。プラスミドDNAを、QiaGen Mini-Prepプラス ミドDNA単離システムを用いて個体ApR形質転換体から単離し、従来のアガロース
ゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によってpAH306-Xho△-1よりも大き
さが大きいプラスミドの存在についてスクリーニングした。全長HMWPの発現が可
能な正しい配向で2.5Kbp HMWP断片を担持するpAH306-Xho△-1の誘導体を、EcoRI
および/またはXhoIを用いた制限分析で同定した。プラスミドpAH374は、この実 験で単離された誘導体の1つである。
System, Stratagene)を用いて、所望のDNA変化をもたらした(すなわち、pAH374 のHMWPコード配列内のNdeI部位を除去する)。変異用PCRプライマー(41塩基の長 さで、NdeI部位を含む配列と相補的で、140-Nde-FXおよび140-NdeRCXと命名した
)を設計し、対応タンパク質のコード配列を変えることなくNdeI認識部位を無く した。pAH374中のNdeI部位を除去するために用いた2つのPCR変異用プライマー の配列を以下に示す。 140-Nde-FX(配列番号38) 5'-GGG TTT GGG AAT CAG CAC ATG AAA ACC TCA TAT ACA TTT GC-3' 140-Nde-RCX(配列番号39) 5'-GCA AAT GTA TAT GAG GTT TTC ATG TGC TGA TTC CCA AAC CC-3'
ミドを切断するためのDpnI消化の後に、突然変異プラスミドDNAを大腸菌XL1-Blu
e中に形質転換した。プラスミドを有する形質転換体を、100μg/mlアンピシリン
を含む2X-YT寒天上で選択した。抗生物質耐性形質転換体を無作為に取り出し、p
AH374と同じサイズのプラスミドについてスクリーニングした。形質転換体から 単離したプラスミドの同定を、EcoRIを用いた制限酵素消化により行った。これ らのプラスミド中のNdeI部位の不在を、NdeIを用いた消化により確認した。HMWP
NdeI部位の欠失を実証するため、および突然変異誘発過程においてこの領域中 に不本意なDNA配列変化が起きていないことを確かめるために、突然変異誘発さ せたプラスミドをさらに、NdeI部位の上流に位置する配列特異的配列決定プライ
マーを用いてDNA配列分析にかけた。プラスミドpAH374-NdeΔ-1は、この実験か ら単離した1つのプラスミドであった。
ラスミドpAH374-NdeΔ-1を、プラスミドpAH374-NdeΔ-1(約50ng)ならびにプラ
イマー306-Nde-Met1および312H6Xba1を用いてプログラミングされた反応によ りPCR増幅した。pMG81へのダイレクトクローニングのために中央にNdeI部位
を含むように、プライマー306NdeMet1を設計した。306NdeMet1中のNdeI部位は、
HMWPシグナル配列のためのATG開始コドンに重複し、5'側で20塩基G/Cクランプに
、および3'側でHMWPシグナル配列の最初の15塩基に相補的な配列に、隣接してい
た。HMWPのC末端に相補的な配列とそれに続く6-ヒスチジン親和性精製ドメイン
を特定する(CAT)6モチーフを含むように、プライマー312H6Xba1を設計した。こ のプライマーも、2つのUAA終結コドン、XbaI認識配列、および該プライマーの3
'末端に20塩基G/Cクランプを含んでいた。306NdeMet1および312H6Xba1 PCRプラ イマーを以下に記載する。
TC A-3' 312H6Xba1(配列番号41) 5'- AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGT CTA GAT TAT TAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG
AAC CGG ACT CTA CTT CCT GCA CTC AAA CC−3'
成した。増幅後、ヒドロキシアパタイトスピンカラム(QiaGen)を用いてPCR産 物を精製し、約10倍過剰のNdeIおよびXbaIを用いて37℃にて一晩消化し、必要な
「突出部(overhang)」を該断片の両端に生成した。スピンカラムを用いて該消
化断片を再び精製し、その約250ngを、予めNdeIおよびXbaIで完全消化してからC
IPで処理してベクターの再連結を防止しておいた約50ngのpMG81プラスミドDNAに
連結した。連結反応物のアリコートを用いて、LederbergおよびCohenの方法によ
りコンピテントとした大腸菌AR58株を形質転換した。形質転換体を、40μg/ml硫
酸カナマイシンを含む2X-YT寒天上で選択した。pMG81上の温度誘導性プロモータ
ーにより、該形質転換細胞は30℃にて増殖した。カナマイシン耐性形質転換体を
無作為に取り出し、pMG81よりも約3.0Kbp大きいプラスミドの存在についてスク リーニングした。インサートを含むpMG81の誘導体は、NdeI、XbaI、EcoRIおよび
NcoIを用いた制限酵素分析により確認した。プラスミドpJJ701は、この実験から
単離した1つのプラスミドであった。
カナマイシンを含む約100mlの2X-YTブロスに接種し、30℃にて一晩増殖させて、
発酵槽種培養物を調製した。つぎに一晩種培養物(約20ml)を用いて、40μg/ml
のカナマイシンを含む約2.0lの2X-YTブロスを載せたNew Brunswick Bioflow 300
0発酵槽に接種した。このAR58(pJJ701)培養物を勢い良く曝気しながら、O.D.625 値が0.5〜0.6になるまで30℃にて培養した。発酵槽の培養物の温度を約39℃〜42
℃に上げて、rHMWPの発現を誘導した。この高い温度でのインキュベーションを 約4〜5時間続けた。
細胞を含む)を、Heraeus Contifuge 28RS遠心分離器を用いて連続フロー遠心分
離により収集した。遠心分離のあと、細胞の塊を遠心分離ボールから掻き出し、
処理するまで-70℃で保存した。
ム緩衝液(pH7.3)(約40ml)中でボルテックスしすり潰すことにより、再懸濁 した。懸濁したら、リゾチーム(鶏卵白、Sigma)およびDNアーゼI(ウシ膵臓、
Sigma)を加えてそれぞれ最終濃度1.0mg/mlおよび0.01mg/mlとし、該混合物を氷
上で30〜45分間インキュベートした。予め冷却しておいた(約4℃)SLM Aminco
French Pressure Cell (約14 Kpsi, 1"径穴)に2回連続通して細胞を破壊した。
次に、該細胞溶解物を、Sorvall SS34ローターの中で約500Xg(4℃)にて5分間遠 心分離して、破壊されていない細胞を除去した。rHMWPを含む不溶性物質を、Sor
vall SS34ローターで約20,000Xg(4℃)にて45分間遠心分離して単離(ペレットに
)した。この遠心分離物から上清を捨て、不溶性画分をペレット状で-20℃にて 保存した。
rHMWP含有不溶性ペレットを氷上で解凍し、2.0%Triton X-100を含む10mlのPBS 緩衝液で2回洗浄した。洗浄は室温にて行い、ゲル状のrHMWP含有ペレットを、 従来のガラス組織粉砕器でのボルテックスおよびホモジナイズにより懸濁した。
該rHMWPを含む不溶性物質を、Sorvall SS34ローターで約10,000Xgで20分間(室 温)の遠心分離により洗浄したあとに回収した。つぎに、不溶性物質を、2.0M
NaClを含む4.0M尿素溶液(10ml)で2回(ふたたびボルテックスおよびホモジナ
イズにより)洗浄した。洗浄したrHMWP物質を上記のように遠心分離により回収 した。1.0% Zwittergent 3-14(Sigma)を含むPBS溶液(10ml)で、該不溶性rHMWP
画分を更に2回洗浄した。
した。可溶化したrHMWPを、標準的な約14cm×約20cm×約3mmの10%ポリアクリル
アミド(36:1、アクリルアミド:ビス-アクリルアミド)Tris/グリシン/SDS分 取ゲルによる電気泳動により、約110Kdalの1つのタンパク質バンドにサイズ分 画された。5-ウェルの約500μl/ウェル分取コーム(comb)を用いて作成した4%
ポリアクリルアミド・スタッキングゲルを、分離ゲルの上でポリマー化した。従
来のTris/グリシン/SDS泳動緩衝液(BioRad)を用いて、BioRad タンパク質ユニ
ット上で約22℃(約80〜85V、定電圧)にて約12時間、電気泳動を行った。予め 染色した分子量標準物(See Blue, Novex)を並行なレーンに載せ、タンパク質 種の分離度および分離効率を測定するために使用した。電気泳動のあと、ゲル・
サンドイッチを解体して垂直スライスを分子量マーカーの隣のrHMWPサンプルレ ーンから取り出し、クーマシーブルーR250で染色してrHMWPバンドを可視化した 。次にこの染色した部分を、残った未染色分取ゲルに再びのせ、該rHMWPを含む アクリルアミドのストリップを同定し、切り出した。
12〜14時間、室温にて行った。溶出時間の最後に、細胞の極性を約2〜3分間逆
にして、BT1膜に吸着されたタンパク質を除去した。該rHMWP含有溶液を収集チャ
ンバーから取り出し、ポリプロピレンの円錐形チューブ中で4℃にて保存した。
DS界面活性剤を除去した。ゲル溶出したタンパク質溶液からの過剰SDS界面活性 剤の除去は、この製造社のプロトコールに従って行った。界面活性剤抽出rHMWP を、エンドトキシンを含まない滅菌した10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) で約15倍に希釈し、さらにYM30限外濾過膜を用いてAmicon攪拌濃縮細胞での限外
濾過により、約1.0mg/mlに濃縮した。
ce Chem.)を用い、BSAを標準物として測定した。
、および残留エンドトキシン負荷量を、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、および
比色エンドトキシンアッセイ(BioWhittaker)によりそれぞれ評価した。このゲ
ル精製したrHMWP物質は、ゲル分析により推定分子サイズ(約110Kdal)の単一の
バンドとして95%を超える純度を示し、ウェスタンブロットにおいてrHMWP特異 的K196抗体と活発に反応した。残留エンドトキシンを計算すると、<0.05EU/μg
であった。
ンブロット分析。 2-メルカプトエタノールを含有する標準Laemmli SDS-PAGE サンプルバッファ
ー中に勾配精製したEB群を可溶化し、約3分間沸騰させ、SDSを含有する4-12% T
ris-グリシン勾配ゲル上にのせ、100Vで電気泳動した。電気泳動の直後に、4℃ で約2.5時間、約50Vでタンパク質をPVDF膜上にエレクトロブロットした。抗rHMW
P'抗体(K196)の1/5,000希釈物を使用して、ブロックした膜を室温で1.5時間 プローブした。洗浄後、膜をHRPと複合体化したヤギ抗ウサギIgG抗体の1/5,000
希釈物で室温で1時間処理した。標準TMB基質システムを使用して、ブロットを発
色させた。EBおよびRB中に3つの免疫反応性バンドが検出された。ドットは約105
-115kDaのHMWタンパク質を示す。
標準を使用した。ゲル中の分子量マーカーの位置を、図の左側および右側にいく
つかのマーカーの分子量(kDa)に対する線によって示す。詳細については本文 の実施例10を参照されたい。 レーンA:Mark 12 Wide Range Molecular Weight Markers(Novex);ミオシン
、200 Kdal;B-ガラクトシダーゼ、116.3 Kdal;ホスホリラーゼ B、97.4 Kdal
;ウシ血清アルブミン、66.3 Kdal。 レーンB:C.trachomatis L2組換えHMWP。 レーンC:SeeBlue Prestained Molecular Weight Markers(Novex);ミオシン
、250 Kdal;ウシ血清アルブミン、98 Kdal;グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、6
4 Kdal。
フレームのマップ。
配列。 C.trachomatis L2配列を最上段に示し、成熟タンパク質の第1残基、Eで始ま る。真核 N-グリコシル化が可能な配列に下線をつけている。プロリンに富むセ グメントに隣接し、脂質二重層まで到達する好適な長さの疎水性ヘリックス領域
に下線をつけ、ブラケットで囲んである。BおよびF血清型(serovars)において
同定されたアミノ酸の差異をL2 HMWPタンパク質配列の下に記載している。
染色。 パネルA:ウサギ K196からの免疫化後の血清。クラミジア封入体は黄色に染
色する。 パネルB:ウサギ K196からの免疫化前の血清。
Claims (41)
- 【請求項1】 SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDa である、単離されたクラミジア(Chlamydia)種HMWタンパク質、またはその断片も
しくは類似体。 - 【請求項2】 実質的に精製されたものである、請求項1記載のタンパク質
。 - 【請求項3】 クラミジア種がChlamydia trachomatis、Chlamydia pecorum
、Chlamydia psittaciまたはChlamydia pneumoniaeである、請求項1記載のタン
パク質。 - 【請求項4】 配列番号2、15または16に示されるアミノ酸配列を有する請 求項1記載のタンパク質、またはその断片もしくは保存的に置換された類似体。
- 【請求項5】 配列番号3、17または25〜37に示されるアミノ酸配列を有す る、請求項4記載の断片。
- 【請求項6】 配列番号2、15または16のアミノ酸配列を有するペプチドと 特異的に結合する抗体調製物により認識される、請求項1記載のタンパク質また
はその断片もしくは保存的に置換された類似体。 - 【請求項7】 請求項1記載のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似 体をコードする、単離された核酸分子。
- 【請求項8】 クラミジア種がChlamydia trachomatis、Chlamydia pecorum
、Chlamydia psittaciまたはChlamydia pneumoniaeである、請求項7記載の核酸
分子。 - 【請求項9】 コードされるタンパク質が配列番号2、15または16のアミノ 酸配列またはその断片もしくは保存的に置換された類似体を有する、請求項7記
載の核酸分子。 - 【請求項10】 a)配列番号1、23または24のDNA配列またはその相補配列もしくは断片; b)配列番号2、15または16のアミノ酸配列を有するHMWタンパク質をコードす
るDNA配列またはその断片; c)配列番号2、15または16の推定上のアミノ酸配列をコードするDNA配列また
はその相補配列、縮重配列もしくは断片;および d)ストリンジェント条件下で上記a)、b)またはc)に規定する配列のい
ずれか1つにハイブリダイズする核酸配列; からなる群より選択される配列を有する、単離された核酸分子。 - 【請求項11】 請求項7または10記載の核酸分子を含有する、宿主の形
質転換に適している組換え発現ベクター。 - 【請求項12】 HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を宿主によ り発現させるための、請求項7または10記載の核酸分子および該核酸分子に機
能的に連結された発現手段を含有する、宿主の形質転換に適している組換え発現
ベクター。 - 【請求項13】 前記発現手段が、HMWタンパク質またはその断片もしくは 類似体を宿主から分泌させるためのリーダー配列をコードする核酸部分を含む、
請求項12記載の発現ベクター。 - 【請求項14】 請求項12記載の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
- 【請求項15】 請求項13記載の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
- 【請求項16】 請求項14記載の形質転換宿主により産生される、単離さ
れた組換えタンパク質またはその断片もしくは類似体。 - 【請求項17】 請求項15記載の形質転換宿主により産生される、単離さ
れた組換えタンパク質またはその断片もしくは類似体。 - 【請求項18】 請求項7または10記載の核酸分子を含有する、宿主にHM
Wタンパク質またはその断片もしくは類似体を送達するための組換えベクター。 - 【請求項19】 次の成分: a)SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaである、単離 されたHMWタンパク質、またはその断片もしくは保存的に置換された類似体; b)上記a)のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、 単離された核酸分子; c)配列番号1、23または24の配列、その相補配列またはストリンジェント条 件下でそれにハイブリダイズする核酸配列もしくはその断片を有する、単離され
た核酸分子; d)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を宿主により発現させるた めの、上記b)またはc)に規定する核酸分子および該核酸分子に機能的に連結
された発現手段を含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される
、単離された組換えタンパク質またはその断片もしくは類似体; e)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする上記b)また はc)に規定する核酸配列を含有する組換えベクター;および f)上記e)のベクターを含む形質転換細胞; からなる群より選択される成分少なくとも1種と、場合によりアジュバントと、
そのための製薬上許容される担体もしくは希釈剤を含有する、宿主に投与したと
きに免疫応答を生じる免疫原性組成物。 - 【請求項20】 次の成分: a)SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaである、単離 されたHMWタンパク質、またはその断片もしくは類似体; b)上記a)のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、 単離された核酸分子; c)配列番号1、22、23または24の配列、その相補配列もしくは縮重配列、ま
たはストリンジェント条件下でそれにハイブリダイズする核酸配列を有する、単
離された核酸分子; d)上記b)またはc)に規定する核酸分子と、HMWタンパク質またはその断 片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機能的に連結され
た発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される、
単離された組換えタンパク質またはその断片もしくは類似体; e)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする上記b)また はc)に規定する核酸分子を含有する組換えベクター;および f)上記e)のベクターを含む形質転換細胞; からなる群より選択される成分少なくとも1種および場合によりアジュバントを
含有する、宿主に投与したときに免疫応答を生じる抗原性組成物。 - 【請求項21】 動物に有効量の請求項20記載の抗原性組成物または請求
項19記載の免疫原性組成物を投与することを含んでなる、動物において免疫応
答を引き出す方法。 - 【請求項22】 動物が哺乳動物またはトリである、請求項21記載の方法
。 - 【請求項23】 請求項20記載の抗原性組成物または請求項19記載の免
疫原性組成物に対して誘導された抗血清。 - 【請求項24】 HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体と特異的に 結合する、請求項23記載の抗血清中に存在する抗体。
- 【請求項25】 請求項1記載のタンパク質、請求項10記載の核酸分子、
請求項20記載の抗原性組成物、請求項19記載の免疫原性組成物、請求項23
記載の抗血清、請求項12記載のベクター、請求項14記載の形質転換細胞、お
よび請求項24記載の抗体、からなる群より選択される診断薬。 - 【請求項26】 被験サンプル中の抗クラミジア抗体を検出する方法であっ
て、 a)サンプルに請求項1記載のHMWタンパク質、請求項20記載の抗原性組成 物または請求項19記載の免疫原性組成物を接触させて、前記抗体の存在下で、
クラミジア抗原:抗クラミジア抗体免疫複合体を形成させ、そしてさらに、 b)被験サンプル中の抗クラミジア抗体の存在を示すものとして、ステップa
)で形成された免疫複合体の存在を検出するか、または免疫複合体の量を測定す
る、 各ステップを含んでなる上記方法。 - 【請求項27】 クラミジアに対する抗体を検出するための診断キットであ
って、請求項1記載のHMWタンパク質、請求項20記載の抗原性組成物または請 求項19記載の免疫原性組成物、該タンパク質または組成物を該抗体を含む疑い
のある被験サンプルと接触させるための容器手段、および該タンパク質または組
成物と該抗体とから形成されたクラミジア抗原:抗クラミジア抗体免疫複合体を
検出または測定するための試薬手段を含んでなる上記キット。 - 【請求項28】 被験サンプル中のクラミジアの存在を検出する方法であっ
て、 a)被験サンプルと請求項24記載の抗体とを、クラミジアが、存在する場合
は、該抗体と結合してクラミジア:抗クラミジア抗体免疫複合体を形成するのに
十分な時間接触させ、そしてさらに、 b)被験サンプル中のクラミジアの存在を示すものとして、ステップa)で形
成された免疫複合体の存在を検出するか、または免疫複合体の量を測定する、 各ステップを含んでなる上記方法。 - 【請求項29】 クラミジアの存在を検出するための診断キットであって、
請求項24記載の抗体、該抗体をクラミジアを含む疑いのある被験サンプルと接
触させるための容器手段、および該抗体とクラミジアとから形成されたクラミジ
ア:抗クラミジア抗体免疫複合体を検出または測定するための試薬手段を含んで
なる上記キット。 - 【請求項30】 有効量の次の成分: a)SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaであるHMWタン
パク質、またはその断片もしくは類似体; b)上記a)のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、 単離された核酸分子; c)配列番号1、23または24の配列、その相補配列もしくは縮重配列、または
ストリンジェント条件下でそれにハイブリダイズする核酸配列を有する、単離さ
れた核酸分子; d)上記b)またはc)に規定する核酸分子と、HMWタンパク質またはその断 片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機能的に連結され
た発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される、
単離された組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体; e)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする上記b)また はc)に規定する核酸分子を含有する組換えベクター; f)上記e)のベクターを含む形質転換細胞;および g)上記a)、b)、c)、d)、e)またはf)の成分と特異的に結合する
抗体; からなる群より選択される成分少なくとも1種、および場合により、そのための
製薬上許容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物。 - 【請求項31】 有効量の次の成分: a)SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaであるHMWタン
パク質、またはその断片もしくは類似体; b)上記a)のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、 単離された核酸分子; c)配列番号1、23または24の配列、その相補配列もしくは縮重配列、または
ストリンジェント条件下でそれにハイブリダイズする核酸配列を有する、単離さ
れた核酸分子; d)上記b)またはc)に規定する核酸分子と、HMWタンパク質またはその断 片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機能的に連結され
た発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される、
単離された組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体; e)HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする上記b)また はc)に規定する核酸分子を含有する組換えベクター; f)上記e)のベクターを含む形質転換細胞;および g)上記a)、b)、c)、d)、e)またはf)の成分と特異的に結合する
抗体; からなる群より選択される成分少なくとも1種と、場合によりアジュバントと、
そのための製薬上許容される担体または希釈剤とを含有する、宿主に投与したと
き免疫応答を生じるワクチン組成物。 - 【請求項32】 クラミジア関連疾患をかかる治療を必要とする宿主におい
て予防、治療または軽減する方法であって、宿主に、有効量の請求項30記載の
医薬組成物または請求項31記載のワクチン組成物を投与することを含んでなる
上記方法。 - 【請求項33】 前記疾患がクラミジア菌感染症、結膜炎、尿道炎、性病性
リンパ肉芽腫(LGV)、子宮頸炎、副睾丸炎、子宮内膜炎、骨盤炎症性疾患(PID)、
卵管炎、卵管閉塞、不妊症、子宮頸癌、動脈硬化症およびアテローム硬化症から
なる群より選択される、請求項32記載の方法。 - 【請求項34】 宿主がトリまたは哺乳動物である、請求項33記載の方法
。 - 【請求項35】 クラミジア種が原因となる疾患から宿主を保護すべくin v
ivo投与用に製剤化された、請求項19、20、30または31のいずれか1項 記載の組成物。 - 【請求項36】 クラミジア種がChlamydia trachomatis、Chlamydia pecor
um、Chlamydia psittaciおよびChlamydia pneumoniaeからなる群より選択される
、請求項19、20、30または31のいずれか1項記載の組成物。 - 【請求項37】 微粒子、カプセルまたはリポソーム製剤として製剤化され
た、請求項19、20、30または31のいずれか1項記載の組成物。 - 【請求項38】 前記タンパク質がヘパリンまたは硫酸ヘパランと結合して
いる、請求項1、4、6、16および17のいずれか1項記載のタンパク質。 - 【請求項39】 前記タンパク質が外膜タンパク質である、請求項1、4、
6、16および17のいずれか1項記載のタンパク質。 - 【請求項40】 サンプル中のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似 体をコードする核酸の存在を確認する方法であって、 a)サンプルを、請求項7または10記載の核酸分子またはその断片もしくは
相補体と接触させて、該核酸分子と、HMWタンパク質をコードしかつ該核酸分子 と特異的にハイブリダイズ可能なサンプル中の該核酸とからなる二本鎖を生成さ
せ、そして b)該二本鎖の生成を確認する、 各ステップを含んでなる上記方法。 - 【請求項41】 サンプル中のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似 体をコードする核酸の存在を確認するための診断キットであって、 a)請求項7または10記載の核酸分子またはその断片もしくは相補体; b)該核酸分子と、HMWタンパク質をコードしかつ該核酸分子と特異的にハイ ブリダイズ可能なサンプル中の該核酸とからなる二本鎖を生成させるための、該
核酸分子をサンプルに接触させる手段;および c)該二本鎖の生成を確認する手段; を含んでなる上記キット。
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