JP2002538825A - クラミジア抗原および対応するdna断片ならびにその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
できる、システインの豊富なクラミジア(Chlamydia)60kDa膜タンパク質
および対応するDNA分子に関する。
られるタンパク質と構造的および機能的に類似するいくつかの膜タンパク質を含
む三層の外膜をはじめ、グラム陰性菌との形態的および構造的類似性を示す。そ
れらは、代謝上不活性であるが感染力のある細胞外段階と、複製はするが感染力
のない細胞内段階からなる独自の二相性生活環を有する偏性細胞内寄生体である
。生活環の複製段階は感染した宿主細胞の細胞質からこの細菌を隔離する膜に結
合した封入体内で起こる。
ミジア(Chlamydia psittaci)のTWAR株として記載されていたが、その後は新種で
あると認識されている。肺炎クラミジアは他のクラミジア種(トラコーマクラミ
ジア(C. trachomatis)、C.ペコラム(C. pecorum)およびオウム病クラミジアと
は抗原的、遺伝的および形態的に異なっている。それはトラコーマクラミジアま
たはオウム病クラミジアといずれかとDNA配列において10%以下の相同性し
か示さない。
菌(Streptococcus pneumoniae)および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoni
ae)よりもわずかに低い頻度である(Grayston et al. (1995) Journal of nfecti
ous Diseases 168:1231; Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmolo
gy and Visual Science 36:1477)。それはまた気管支炎および副鼻腔炎をはじめ
とする上気道症状および疾患を引き起こす(Grayston et al. (1990) Journal of
Infectious Diseases 168:1231; Grayston et al (1990) Journal of Infectio
us Diseases 161:618; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases, 18:501;
Wang et al (1986) Chlamydial infectious, Cambridge University Press, Ca
mbridge, p.329)。大部分の成人集団(60%を超える)は肺炎クラミジアに対
する抗体を持っており(Wang et al (1986) Chlamydial infection, Cambridge U
niversity Press, Cambridge, p.329)、これはまだ認識されていないか、または
無症候性である過去の感染を示している。
声、および発熱;聴診での異常な胸部音)として示される。ほとんどの患者では
咳が2〜6週間持続し、回復が遅い。このようなケースの約10%で、上気道感
染の後に気管支炎または肺炎が起こる。さらに肺炎クラミジア流行の際には、次
ぎにこれらの肺炎患者の約半数、特に虚弱者や高齢者で肺炎球菌の同時感染が認
めれた。上記で示されたように、肺炎クラミジア感染が呼吸器系感染以外の疾患
にも関連するさらに多くの証拠がある。
鳥類または動物の貯蔵庫は知られていない。伝染については明らかには定義され
ていない。それは分泌物との直接的な接触、媒介物、または風媒拡散によると考
えられる。長い潜伏期間があり、それは何ヶ月も持続する。流行の分析に基づけ
ば、感染者はその生物の効率の悪い媒介者であるので、肺炎クラミジアはある集
団にゆっくり拡散すると考えられる(患者から患者の間隔は平均30日)。肺炎
クラミジア罹病率は普遍的である。小児期に最初に感染した後、成人期に再感染
が起こる。肺炎クラミジアは、2〜3年持続する高い発病率(流行病)間隔を重
ね合わせると著しくは世界中の伝染病であると考えられる。トラコーマクラミジ
ア感染は肺炎クラミジアに対する交差免疫を付与しない。感染症は経口抗せ物質
テトラサイクリンまたはエリスロマイシン(2g/d、少なくとも10〜14日
間)で容易に治療される。最近開発された薬剤アジスロマイジンはクラミジア感
染症に対して単回投与として極めて有効である。
症の90%までは亜急性であるか、認識されない。工業国の小児の間では感染は
5才まではまれであると考えられていたが、最近の研究(E Normann et al, Chla
mydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections, Ac
ta Paediatrica, 1998, Vol 87, Iss 1, pp 23-27)では、この世代の子供の多く
は血清反応陰性であるにもかかわらず感染のPCR証拠を示し、2〜4才の17
〜19%有病率と見積もられることが報告されている。発展途上国では、幼児の
間の肺炎クラミジア抗体の血清有病率は上昇し、肺炎クラミジアは急性下気道疾
患、ならびに世界の熱帯地方の幼児よび小児の死亡率の重要な原因であり得ると
疑われる。
感染は通常、5才から20才の間で起こる。米国では例えば、肺炎クラミジアに
よって引き起こされる毎年の小児肺炎の30,000症例であると見積もられる
。感染は小児または若年(例えば、学生や徴兵)群の中で集団発生する。
(スェーデン、イタリア、フィンランドおよび米国から報告)。流行中、肺炎ク
ラミジアは感染は肺炎の症例の50〜60%にのぼると考えられる。このような
期間にはまた、さらに肺炎球菌による混合感染があることが報告されている。
の研究に基づけば、年齢とともに曝露が増す傾向にあり、これは特にヒトにおい
て明らかである。何人かの研究者が、持続性、無症候性の肺炎クラミジア感染状
態がよくあることであると推測している。
と進行する可能性がある。米国での研究は、60才より若い人において肺炎クラ
ミジアによって引き起こされた発病率は年間1,000人につき1症例であるが
、若年層では発病率は3倍に上昇していたことを明らかにした。肺炎クラミジア
感染は病床中にある患者を除いては入院につながることはまれである。
ある。従来の肺炎クラミジア感染と心臓発作、冠動脈疾患および頸動脈疾患との
関係を示すいくつかの疫学研究がある(Saikku et al. (1988) Lanet; ii:983; T
hom et al. (1992) JAMA 268:68; Linnanmaki et al. (1993), Circulation 87:
1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116:273; Melnick et
al (1993) American Journal of Medicine 95:499)。さらに、この微生物は冠動
脈、頸動脈、末梢動脈および大動脈のアテロームおよび脂肪索で検出されている
(Shor et al. (1992) South African. Medical Journal 82:158; Kuo et al. (1
993) Journal of Infectious Diseases 167:841; Kuo et al. (1993) Arteriosc
lerosis and Thrombosis 13:1500; Campbell et al (1995) Journal of Infecti
ous Diseases 172:585; Chiu et al. Circulation, 1997 (In Press))。種々の
肺炎クラミジアは冠動脈および頸動脈から回収されている(Ramirez et al (1996
) Annals of Internal Medicine 125:979; Jackson et al. Abst. K121, p272,
36th ICAAC, 15-18 Sept. 1996, New Orleans)。さらに肺炎クラミジアはウサ
ギモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の変化を誘導することが示されている
(Fong et al (1997) Journal of Clinical Microbiology 35:48)。考え併せると
これらの結果は、、クラミジア性のアテローム性動脈硬化症の疫学的重要性は依
然証明されてはいないが、肺炎クラミジアがヒトにおいてアテローム性動脈硬化
症を引き起こし得るという高い可能性があることを示している。
ている。感染は喘鳴性の喘息性気管支炎、成人発症喘息および成人における喘息
の急性再燃に結びつけられており、小規模研究では何人かで長期抗生物質治療が
効果的にゆっくりと疾病の重篤度を軽減することが示されている(Hahn DL, et a
l. Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asth
ma. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998 Jan; 80(1): 45-49; Hahn DL, et al.
Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptom
itic asthma. Epidemiol Infect. 1996 Dec; 117(3): 513-517; Bjornsson E, e
t al. Serology of chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperres
ponsiveness. Scand J Infect Dis. 1996; 28(1): 63-69; Hahn DL. Treatment
of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a befor-after trial.
J Fam Pract. 1995 Oct; 41(4): 345-351; Allegra L, et al. Acute exacerbat
ions of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection. Eur Re
spir J. 1994 Dec; 7(12): 2165-2168; Hahn DL, et al. Association of Chlam
ydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezng, asthmatic bronchit
is, and adult-onset asthma. JAMA. 1991 Jul 10; 266(2): 22 5-230)。
重要であると考えられる。いずれのヒトクラミジア感染にも有用なワクチンはま
だない。有効なワクチンは物理的または化学的に不活化したクラミジアを用いて
開発できると考えられる。しかしながらかかるワクチンは高い安全域がない。一
般に、安全なワクチンはその微生物の遺伝子操作のよって弱毒化するか、または
組換えによって作出される。従って、ヒトクラミジア感染に対する有効かつ安全
なワクチンを作出する主な障壁は、クラミジア、特に肺炎クラミジアに関する遺
伝情報が不十分であることであった。
する安全かつ有効なワクチンが達成可能な目標であることを示している。例えば
、トラコーマクラミジアの肺感染から回復したマウスはその後の膣攻撃によって
誘導される不妊症から保護される(Pal et al. (1996) Infection and Immunity.
64:5341)。同様に、不活化したオウム病クラミジアで免疫化したヒツジはその
後のクラミジア誘発性の流産および死産から保護された(Jones et al. (1995) V
accine 13:715)。クラミジア感染症からの保護はTh1免疫応答、特にINFg
(CD4+T細胞を産生する)の誘導と関連づけられている(Igietsemes et al.
(1993) Immunology 5:317)。CD4+細胞系統またはクローンの、ヌードマウ
スまたはSCIDマウスへの養子移入は攻撃または明らかな慢性疾患からの防御
を付与し(Igietseme et al (1993) Regional Immunology 5:317; Magee et al (
1993) Regional Immunology 5: 305)、またCD4+T細胞のin vivo涸渇は攻撃
後の疾病を悪化させた(Lander et al. (1991) Ynfection & Immunity 59:3774;
Magee et al (1995) Infection & Immunity 63:516)。しかしながら、粘膜表面
の十分高力価の中和抗体の存在も保護作用を発揮し得る(Cotter et al. (1995)
Infection and Immunity 63:4704)。
十分記載されていないが、バリエーションはトラコーマクラミジアに基づいて存
在しているものと予測される。トラコーマクラミジアの血清学的亜型は主要外膜
タンパク質(MOMP)における抗原バリエーションに基づいて定義されている
が、公表されている肺炎クラミジアMOMP遺伝子配列はこの微生物のいくつか
の異なる単離物の間ではバリエーションを示していない(Campbell et al (1990)
Infection and Immunity 58:93; McCafferty et al (1995) Infection and Imm
unity 63:2387-9; Knudsen et al (1996) Third Meeting of the European Soci
ety for Chlamydia Research, Vienna)。76kDaの抗原をコードする遺伝子
は肺炎クラミジアのただ1つの株からクローニングされたものである。オペロン
をコードする9kDaおよび60kDaのシステインが豊富な外膜タンパク質遺
伝子が記載されている(Watson et al., Nucleic Acids Res (1990) 18:5299; Wa
tson et al., Microbiology (1995) 141:2489)。肺炎クラミジアに対して血清を
免疫化することによって認められる多くの抗原は総てのクラミジアに保存されい
るが、98kDa、76kDaおよびその他のいくつかのタンパク質は肺炎クラ
ミジアに特異的であると考えられる(Perez Melgosa et al., Infect. Immun. 19
94 62:880; Melgosa et al., FEMS Microbiol Lett (1993) 112:199; Campbell
et al., J Clin Microbiol (1990) 28:1261; Iijima et al., J Clin Microbiol
(1994) 32:583)。肺炎クラミジア血清型の数および相対頻度の評価および抗原
の定義はまだ可能となっていない。肺炎クラミジア株CWL−029の全ゲノム
配列はすでに公知であり(http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)、さらな
る配列も入手できるようになっているので、抗原変異についてよりよい理解が得
られる。
ミジアにわたって保存されているが、98kDa、76kDaおよび54kDa
タンパク質は肺炎クラミジア特異的であると思われる(Campos et al. (1995) In
vestigation of Ophthalmology and Visual Science 36: 1477; Marrie (1993)
Clinical Infectious Diseases, 18:501; Wiedmann-Al-Ahmad M, et al. Reacti
ons of polyclonal and neutralizing anti-p54 monoclonal antibodies with a
n isolated, species-specific 54-kilodalton protein od Chlamydia pneumoni
ae, Clin Diagn Lab Immunil. 1997 Nov; 4(6): 700-704)。
ングパターンにバリエーションがあることを示し、血清型肺炎クラミジアが存在
し得ること示している(Grayston et al.(1995)Journal of Infectious Disease
s 168:1231;Ramirez et al(1996)Annals of Internal Medicine 125:979)。し
かしながらこの結果は、患者の血清の免疫ブロットプロフィールが感染後経時的
に変化するので、患者の感染状態によって混乱しているかもしれない。血清型の
数および相対頻度の評価、ならびに抗原の定義は依然として可能ではない。
のポリヌクレオチド配列を同定および単離する必要性がある。
ステインの豊富な60kDa膜タンパク質と呼ばれるクラミジアのポリペプチド
をコードする精製および単離されたポリヌクレオチド分子(配列番号1)を提供
する。本発明の1つの形態では、ポリヌクレオチド分子は配列番号2のポリペプ
チドをコードするDNAである。
供する。対応するコードポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号2に示されてい
る。
パク質をコードするポリヌクレオチド配列だけでなく、かかるポリペプチドに由
来する断片をコードするポリヌクレオチドも提供されることを容易に理解するで
あろう。さらに、本発明は、本明細書に記載の非必須アミノ酸の付加、欠失また
は置換によって生じる、かかるポリペプチドおよびそれらに由来する断片の変異
体および誘導体を提供するものと理解される。当業者ならば、本発明によりクラ
ミジアポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列だけでなく、かかるポリ
ペプチドと特異的に結合する単一特異性抗体がさらに提供されることを容易に理
解するであろう。
レオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む。従って、本発明
はさらに(i)組換え宿主系において本発明のポリペプチドを製造する方法、な
らびに関連の発現カセット、ベクター、および形質転換またはトランスフェクト
された細胞;(ii)本発明のポリヌクレオチドを含有するワクチン、またはポッ
クスウイルス、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)またはコレラ菌(Vible
rae cholerae)ベクターなどの生ワクチンベクター(かかるワクチンおよびワク
チンベクターは、希釈剤または担体と組み合わせて、例えばクラミジア感染を予
防および治療するのに有用である)、ならびに関連の医薬組成物および関連の治
療および/または予防方法;(iii)裸の形態もしくは送達ビヒクルと配合した
本発明のRNAまたはDNA分子、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド
の組合せ、または単一特異性抗体、ならびに関連の医薬組成物の治療的および/
または予防的使用;(iv)本発明のDNAまたはRNA分子、単一特異性抗体、
またはポリペプチドの使用を含み得る、生物学的サンプルにおけるクラミジアの
存在の診断方法;および(v)抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
による本発明のポリペプチドの精製方法を提供する。
ンリーディングフレーム(ORF)を肺炎クラミジアゲノムから同定した。この
タンパク質をコードする遺伝子を発現プラスミドに挿入したところ、クラミジア
感染に対する免疫防御が付与されることがわかった。従ってこのシステインの豊
富な60kDa膜タンパク質および関連ポリペプチドを用いてクラミジア感染を
予防および治療することができる。
ラミジアポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
り出されたポリヌクレオチドと定義される。例えば、生細菌のゲノム中、または
遺伝子バンクの一部として存在する天然DNA分子は単離されたとはいわないが
、例えばクローニング(増幅)の結果として細菌ゲノムの他の部分から分離され
る同分子は単離されたという。典型的には単離されたDNA分子は天然に存在す
るゲノムの5’または3’末端にすぐ隣接するDNA領域(例えばコード領域)
から遊離している。かかる単離ポリヌクレオチドはベクターまたは組成物の一部
であってよいが、かかるベクターまたは組成物がかかるポリヌクレオチドの自然
環境の一部ではないという点で「単離された」と定義される。
たは合成DNA)のいずれか、またはその改変体、変異体、相同体もしくは断片
である。DNAは二本鎖または一本鎖のいずれかであり、一本鎖であれば、コー
ド鎖または非コード(アンチセンス)鎖のいずれかである。配列番号1で示され
る、本発明のポリペプチドをコードする配列のいずれか1つが、(a)コード配
列、(b)(a)の転写により誘導されるリボヌクレオチド配列、または(c)
遺伝子コードの重複または縮重により同じポリペプチドをコードするコード配列
である。「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾(
例えばグリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、いずれのアミノ酸鎖をも意
味する。本願では両用語を相互に使用してもよい。
。本明細書において使用される「相同アミノ酸配列」とは、臨界融解温度(Tm
)を超えない25〜35℃において、配列番号1の核酸配列のいずれかの部分と
ハイブリダイズする核酸配列によって総てまたは一部がコードされるいずれかの
ポリペプチドである。相同アミノ酸配列は配列番号2で示されるアミノ酸配列と
1つ以上の保存的アミノ酸置換に関して異なるものである。またかかる配列は血
清型変異体(下記)ならびに免疫原性などのポリペプチド本来の特徴を維持する
、欠失または挿入を含む配列も包含する。かかる配列は配列番号2と好ましくは
少なくとも75%、さらに好ましくは80%、および最も好ましくは90%同一
である。
る。「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも90
%、好ましくは95%、さらに好ましくは97%、および最も好ましくは99%
同一であり、かつ好ましくは参照配列と大部分の保存的アミノ酸置換に関して異
なる配列を意味する。
例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンのよう
な非荷電極性側鎖を有するアミノ酸;リジン、アルギニン、およびヒスチジンの
ような塩基性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギン酸、およびグルタミン酸のよ
うな酸性側鎖を有するアミノ酸;およびグリシン、アラニン、バリン、ロイシン
、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
およびシステインのような非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。
Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis So
ftware Packageのような配列解析ソフトウェアを用いて求められる。アミノ酸配
列を同一性が最大となるように配列する。配列に人為的にギャップを挿入し適当
な配列を得てもよい。ひと度最適なアライメントが設定されれば、全位置数に対
し、両配列のアミノ酸が一致する位置を総て記録することにより相同性の程度が
確認される。
ド配列と好ましくは少なくとも45%、さらに好ましくは60%、および最も好
ましくは85%同一のものである。
には、天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに配列番号2のポリペプチド本
来の特徴を維持する変異体または天然には存在しないいずれの他の変異体も包含
される。
的機能を変更しない、1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有すること
を特徴とするポリペプチドのもう1つの形態である。「生物学的機能」とは、た
とえその機能が細胞の増殖または生存に必要でなくとも、それが天然に存在する
細胞におけるポリペプチドの機能を意味する。例えばポーリンの生物学的機能は
細胞外媒質に存在する化合物を細胞へ侵入させることである。生物学的機能は抗
原性特性とは性質が異なる。ポリペプチドは1以上の生物学的機能を有し得る。
どの細菌種は通常対立遺伝子の小さな変化に関し互いに異なる種々の株で表され
る。実際、異なる株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドはそれぞれ
の株で同一でないアミノ酸配列(およびポリヌクレオチド配列)を有していても
よい。この変動にかかわらず、一般に多くの対立遺伝子変異体に対して向けられ
た免疫応答が実証されている。クラミジアMOMP抗原の研究では、株間のMO
MPのアミノ酸配列の変化にかかわらず、雑種株抗体結合が起こるとともに感染
力の中和がなされ、免疫原として用いた際に、MOMPがアミノ酸変化を許容す
ることが示される。
常法により抽出されたゲノム細菌DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅
法によって回収される。これにはコードドメインの5’および3’末端の上流お
よび下流に適合する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用が含まれる。好適
なプライマーは配列番号1で提供されるヌクレオチド配列情報により設計される
。その工程は次の通りである:10〜40個、好ましくは15〜25個のヌクレ
オチドからなるプライマーを選択する。効率的なハイブリダイゼーションを確実
にするのに十分な比率でCおよびGを含有する、すなわちCおよびGヌクレオチ
ド量が全ヌクレオチド含量の少なくとも40%、好ましくは50%である、プラ
イマーを選択することが有利である。標準的なPCR反応は典型的には100μ
Lにつき0.5〜5単位のTaq DNAポリメラーゼ、20〜200μMの各
デオキシヌクレオチドを好ましくは同濃度で、デオキシヌクレオチドの総濃度を
超える0.5〜2.5mMマグネシウム、105〜106の標的分子、および約
20pmolの各プライマーを含む。約25〜50のPCRサイクルを行い、ア
ニーリング温度はプライマーの真のTmより15℃〜5℃低い温度とする。より
ストリンジェントなアニーリング温度では、誤ってアニーリングしたプライマー
に対する区別が向上し、プライマーの3’末端に誤ったヌクレオチドが組み込ま
れることが少なくなる。変性温度は95℃〜97℃が典型的であるが、G+C量
が豊富な標的の変性にはより高い温度が適当である場合がある。実施されるサイ
クル数は標的分子の出発濃度にもよるが、典型的には、非特異的バックグラウン
ド生成物が蓄積する傾向にあるので、40サイクルを超えるのは奨められない。
収する別法としては、DNAまたはRNAライブラリーのハイブリダイゼーショ
ンスクリーニングによるものがある。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野
では十分に知られており、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protoco
ls in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994), Silhavy et al. (
Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring harbor Labora
tory press, 1984)、およびDavis et al. (Davis et al. A Manual for Genetic
Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring harbor Laboratory
Press, 1980)に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を至適化する重
要なパラメーターは、その温度を超えると2本の相補DNA鎖が互いに分離する
臨界融解温度を得るのに用いる式で表される(Casey & Davidson, nucl. Acid Re
s. (1977)4:1539)。約600個以上のヌクレオチドでなるポリヌクレオチドの場
合、この式は次の通りである:Tm=81.5+0.41x(%G+C)+16
.6log(陽イオン濃度)−0.63x(%ホルムアミド)−600/塩基数
。好適なストリンジェント条件下では、ハイブリダイゼーション温度(Th)は
約20〜40℃、20〜25℃、または好ましくは計算値Tmを超えない30〜
40℃である。最適温度および塩条件が容易に求め得ることは当業者には明らか
であろう。
イズインキュベーションの双方について、(i)42℃で4〜16時間以内、6
×50%ホルムアミド含有SSCの条件、または(ii)65℃で4〜16時間以
内、6×SSC水溶液(1M NaCl、0.1Mクエン酸ナトリウム(pH7
.0))の条件により、ストリンジェント条件が達成される。典型的にはハイブ
リダイゼーション実験は60〜68℃、例えば65℃で行う。かかる温度においてスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件は6xSSC、好ましくは2xSS
Cまたは1xSSC、より好ましくは0.5xSSC、0.3xSSCまたは0
.1xSSC(ホルムアミド不存在下)で達成できる。1xSSCには0.15
M NaClおよび0.015Mクエン酸ナトリウムが含まれる。
/または欠失を許容すると思われる抗原の領域を同定する公知の方法を用いて設
計される。例として、異なる種由来の相同ポリペプチドを比較し、保存された配
列を同定することを挙げる。さらに分岐した配列が最も配列変化を許容すると考
えられる。配列間の相同性は、例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res.2
5:3389-3402(1997)のBLASTホモロジーサーチアルゴリズムを用いて解析し
てもよい。別法としては、可能性があるT−およびB−細胞エピトープのコンピ
ュータを用いた分析に基づいて、配列がTおよび/またはB細胞とより反応性を
有するようにそれらを改変する。さらにもう1つの別法ではin vitroにおいてポ
リペプチド内のある特定のアミノ酸残基または配列を変異させ、次いでのその変
異ポリペプチドを、以下に概略を記した方法によりクラミジア感染症を予防また
は治療する能力についてスクリーニングする。
2のある特定の相同体がクラミジア感染症の予防または治療に有用であるかを過
度な実験を行うことなく求められることが容易に理解されるであろう。
選択する 工程を含んでなる。
動物と比べた場合のクラミジア感染症のいずれかの影響の重篤度の軽減を意味す
る。
リペプチド配列の部分配列、内部欠失により全長ポリペプチドから誘導されたポ
リペプチド、および融合タンパク質であるポリペプチド誘導体が提供される。
10個のアミノ酸)免疫原性領域があれば十分であるため、ワクチンとしてタン
パク質免疫原の断片および変異体を使用することは免疫学の分野では一般に認ら
れた慣例である。クラミジア以外の病原体に関して、その表面に曝された抗原に
対応する種々の短い合成ペプチドがそれぞれの病原体に対する有効なワクチン抗
原であることが分かっており、例えば、ネズミ乳癌ウイルスの11残基ペプチド
(Casey & Davidson, Mucl. Acid Res.(1977)4:1539)、セムリキ森林ウイルスの
16残基ペプチド(Snijders et al., 1991. J. Gen.Virol. 72:557-565)、およ
びイヌパルボウイルス由来の15残基各々の2つの重複ペプチド(Langeveld et
al., Vaccine 12(15):1473-1480(1994))が挙げられる。
長配列固有のものであり、本発明により教示されることは当業者には容易に理解
されるであろう。かかるポリペプチド断片の長さは少なくとも12個のアミノ酸
であることが好ましい。それらの長さが少なくとも20個のアミノ酸、好ましく
は少なくとも50個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも75個のアミノ酸
、およびさらに好ましくは少なくとも100個のアミノ酸であることが有利であ
る。
ドからなるポリヌクレオチドは、以下に概略を記したパラメーターを用い、かつ
増幅される断片の5’および3’末端の上流および下流の配列に適合するプライ
マーを使用するPCR増幅法により回収される。かかる増幅物の鋳型ポリヌクレ
オチドは配列番号1と相同な全長ポリヌクレオチド、またはDNAまたはRNA
ライブラリーなどのポリヌクレオチド混合物に含まれるポリヌクレオチドのいず
れかである。部分配列を回収する別法としては、上記の条件下においてTmの計
算式を用いてスクリーニングハイブリダイゼーションを行う。30〜600個の
ヌクレオチドからなる断片を回収する場合、計算値Tmを減法(600/塩基対
のポリヌクレオチドサイズ)により補正し、ストリンジェント条件をTmを超え
ない5〜10℃であるハイブリダイゼーション温度で定義する。20〜30塩基
より短いオリゴヌクレオチドを得る場合、Tmの計算式は次の通りである:Tm
=4x(G+C)+2(A+T)。例えば、50%C+Gの18個のヌクレオチ
ド断片は約54℃のTmを有するであろう。配列番号2の断片またはその相同配
列である短いペプチドは化学合成(E. Gross and H. J. Meinhofer, 4 The Pepti
des: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesi
s, John Wiley & Sons (1981)、およびM. Bodanzki, Principles of Peptide Sy
nthesis, Springer-Verlag (1984))により直接得られる。
ューター支援解析を用いて設計する。これにより表面に曝された有望な抗原性領
域が同定されるであろう(Hughes et al., 1992. Infect.Immun.60(9):3497)。プ
ログラムSEQSEE(Wishart DS, et al., “SEQSEE:タンパク質配列
解析に適した総合プログラム” Comput Appl Biosci. 1994 Apr; 10 (2): 121-3
2)を使用する、産物の順応性および疎水性に基づく配列番号2中の6個のアミノ
酸配列の解析では、有用な免疫原性断片および変異体を選択する基準として使用
してもよい、可能性ある多数のBおよびT細胞エピトープを明らかにすることが
できる。この解析では抗体により認識されると考えられる外面特徴の適当な組合
せを使用する。HLA−A0201 MHCサブクラスの有望なT細胞エピトー
プは、NIHで開発されたアプローチとエミュレートするアルゴリズムにより明
らにしてもよい(Parker KC, et al. "Peptide binding to MHC class I molecul
es: implications for antigenic peptide prediction." Immunol Res 1995; 14
(1) 34-57)。
範囲全体に存在する。しかしながら、いくつかのエピトープはポリペプチドの2
次および3次構造によりマスクされる。かかるマスクされたエピトープを表面化
させるため、大きな内部欠失を引き起こし、それによってもとのタンパク質構造
の大部分を取り除いてマスクされたエピトープを露出させる。かかる内部欠失は
時に株間の高変異性の免疫優性領域を取り去るという付加的な利点をもたらす。
るおよびポリペプチドは、常法により構築する(Ausubel et al., Current Proto
cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994)。かかる方法とし
ては、標準PCR、逆PCR、クローニングしたDNA分子の制限酵素処理、ま
たはKunkel et al.(Kunkel et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA (1985)82:448)
の方法が挙げられる。これらの方法の成分およびその使用説明書はStratageneな
どの様々な販売元から容易に入手可能である。ひと度欠失変異体を構築すれば、
それらを上記のようにクラミジア感染症を予防または治療する能力について調べ
る。
プチドとNまたはC末端で融合した本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘
導体を含有するものである(以後ペプチドテールと記す)。かかる融合ペプチド
を得る簡便な方法はポリヌクレオチド配列のインフレーム融合物、すなわちハイ
ブリッド遺伝子の翻訳による。融合ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝
子を発現ベクターに挿入し、それを用いて宿主細胞を形質転換またはでトランス
フェクトする。そうでなければ、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体をコー
ドするポリヌクレオチド配列を、ペプチドテールをコードするポリヌクレオチド
が既に存在する発現ベクターに挿入する。かかるベクターおよびその使用説明書
は商業的に入手可能である、例えばペプチドテールがマルトース結合タンパク質
である、New England BiolabsのpMal−c2またはpMal−p2系、Pharm
aciaのグルタチオン−S−トランスフェラーゼ系、またはNovagenから入手可能
なHis−Tag系。これらおよび他の発現系により本発明のポリペプチドおよ
び誘導体のさらなる単離のための便宜な手段が提供される。
しくは断片と、コレラ毒素または大腸菌(E. coli)易熱性毒素のいずれかのサブ
ユニットBのようなアジュバント活性を有するポリペプチドとを融合したもので
ある。もう1つの有利な融合物はポリペプチド、相同体または断片と、強力なT
細胞エピトープまたはB細胞エピトープとを融合したものである。かかるエピト
ープは当技術分野で公知のもの(例えば、B型肝炎コア抗原、D. R. Millich et
al., "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepat
itis B virus primed by a single synthetic T cell site", Nature. 1987. 32
9: 547-549)、または可能性あるT−またはB−細胞エピトープのコンピュータ
を用いた分析に基づいて、本発明のもう1つのポリペプチドにおいて同定された
ものであってもよい。本発明のこの態様に従い、融合ポリペプチドは配列番号2
、またはその相同体もしくは断片由来のTまたはB細胞エピトープを含んでなる
(ここで、エピトープはそのポリペプチドまたは相同体もしくは断片の多様な変
異体から誘導され、各々のエピトープはそのエピトープのポリペプチド内の位置
および配列において他とは異なっている)。かかる融合物は全ポリペプチド、相
同体または断片に対するTまたはB細胞応答を最適にするため、それはクラミジ
ア感染症の予防および治療に有効である。
ポリペプチドのN、または好ましくはC末端、またはTもしくはB細胞エピトー
プとを融合する。そうでなければ、本発明のポリペプチド断片をアジュバント活
性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入する。またTまたはB細胞エピ
トープを本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入してもよい。
有する、本発明のポリペプチドへと成熟するハイブリッド前駆体ポリペプチドも
コードする。「異種シグナルペプチド」とは、本発明のポリペプチドの天然に存
在する前駆体には見られないシグナルペプチドを意味する。
オチド分子は様々な用途を有する。DNA分子は例えば(i)組換え宿主系にお
いてコードされたポリペプチドを生産するプロセスにおいて、(ii)クラミジア
感染症を予防および/または治療する方法および組成物においてさらに用いられ
る、ポックスウイルスなどのワクチンベクターの構築において、(iii)裸の形
態で、または送達ビヒクルと配合したワクチン薬剤として(RNA分子と同様)
、および(iv)本発明のポリヌクレオチドを過剰発現できる、またはそれを無毒
性、変異型で発現する弱毒クラミジア株の構築において用いられる。
に適当なプロモーターの制御下に置かれた本発明のDNA分子を含有する発現カ
セット;(ii)本発明の発現カセットを含有する発現ベクター;(iii)本発明
の発現カセットおよび/またはベクターで形質転換またはトランスフェクトした
原核生物または真核生物細胞、ならびに(iv)本発明のDNA分子の発現を可能
にする条件下において、本発明の発現カセットおよび/またはベクターで形質転
換またはトランスフェクトした原核生物または真核生物細胞を培養し、細胞培養
物からコードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含
む、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプ
チド誘導体を生産する方法を含む。
は、酵母細胞(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
またはピキア・パストリス(Pichia pastoris))、哺乳類細胞(例えばCOSI
、NIH3T3、またはJEG3細胞)、節足動物細胞(例えばスポドプテラ・
フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(SF9)細胞)、および植物細胞が挙
げられる。好ましい発現系としては大腸菌のような原核生物宿主がある。当業者
には細菌および真核生物細胞は商業的供給者をはじめいくつかの異なる供給者、
例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)から入
手可能である。組換えタンパク質発現に用いる細胞の商業的供給者は細胞の使用
説明書も提供する。
ば、特定の脂質化形態(lipidated form)または他のいずれかの形で本発明のポリ
ヌクレオチドを生産するのが有用であると考えられる。
を等しく十分に発現するとは考えられないことは当業者には容易に理解されるで
あろう。しかしながら、下記の指針により、過度な実験を行うことなく、かつ本
発明の範囲を逸脱することなく、ベクター、発現制御配列および宿主が選択でき
よう。
と適合する宿主を選択する必要がある。ベクターコピー数、コピー数を調節する
能力、抗生物質耐性などの他のタンパク質の発現が考慮される。発現制御配列を
選択する場合、いくつかの変数が考慮される。重要な変数には配列の相対強度(
例えば、種々の条件下において発現を駆動する能力)、配列の機能を調節する能
力、発現されるポリヌクレオチドと制御配列間の適合性(例えば二次構造は効率
的な転写を妨げるヘアピン構造を回避すると考えられる)がある。宿主を選択す
る場合、所望のコンホメーションで産物を発現でき、スケールアップが容易で、
さらにそれが最終産物の精製を容易にすることが望むならば、選択されたベクタ
ーと適合し、発現産物のいずれかの起こりうる有毒作用に耐性であり、発現産物
を効率的に分泌できる単細胞宿主を選択する。
される宿主系にもよっても異なる。典型的には発現カセットは選択された宿主系
において機能し得るものであり、かつ構成的または誘導性であり得るプロモータ
ー;リボソーム結合部位;要すれば開始コドン(ATG);シグナルペプチド、
例えば脂質化(lipidation)シグナルペプチドをコードする領域;本発明のDNA
分子;停止コドン;および所望により3’末端領域(翻訳および/または転写タ
ーミネーター)を含む。シグナルペプチドコード領域は本発明のポリヌクレオチ
ドに隣接し、適当なリーディングフレームに存在する。シグナルペプチドコード
領域は成熟ポリペプチドをコードするDNA分子と相同または異種であり、発現
に用いられる宿主の分泌機構と適合する。本発明のDNA分子により単独または
シグナルペプチドとともに構成されるリーディングフレームは転写および翻訳が
宿主系において起こるようにプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターお
よびシグナルペプチドコード領域は広く知られており、当業者ならば入手可能で
ある。例えばアラビノースにより誘導可能であり(プロモーターaraB)かつ
大腸菌などのグラム陰性菌において機能し得る、ネズミチフス菌(Salmonella ty
phimurium)(および誘導体)のプロモーター(米国特許第5,028,530号
およびCagnon et al., (Cagnon et al., Protein Engineering (1991)4(7):843
)に記載);T7ポリメラーゼを発現する数多くの大腸菌株において機能し得る
、RNAポリメラーゼをコードするバクテリオファージT7遺伝子のプロモータ
ー(米国特許第4,952,496号に記載);OspA脂質化シグナルペプチ
ド;およびRlpB脂質化シグナルペプチド(Takase et al., J. Bact.(1987)16
9:5692)挙げられる。
ベクターの一部である。発現ベクター(例えばプラスミドまたはウイルスベクタ
ー)は、例えばPouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985,
Supp. 1987)に記載されるものから選択することができる。好適な発現ベクター
は商業的供給者から購入することができる。
では十分に公知であり、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protocol
s in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994)に記載されるように
選択した宿主系によって異なる。
され細胞内コンパートメントに留まり、細胞外媒質または原形質膜空間に分泌/
放出されるか、または細胞膜に埋め込まれる。ポリペプチドは組換え細胞培養物
の遠心分離後の細胞抽出物からまたは上清から実質的に精製された形で回収され
る。典型的には組換えポリペプチドは抗体に基づくアフィニティー精製により、
またはポリペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドとアフィニ
ティー結合小ドメインとの融合などの当業者によって容易に適合できる十分に公
知な他の方法により精製する。本発明のポリペプチドを免疫アフィニティーによ
り精製するのに有用な抗体は下記のようにして得られる。
ヒクル(生ワクチンベクター)としてウイルスまたは細菌宿主を用いるか、また
は遺伝子を遊離型で、例えばプラスミドに挿入して投与するかの2つの主要な経
路がある。本発明のポリヌクレオチドの治療または予防効力は下記のようにして
評価される。
下に置かれた本発明のDNA分子を含有するポックスウイルスなどのワクチンベ
クター;(ii)本発明のワクチンベクターとともに希釈剤または担体を含んでな
る材料の組成物;とりわけ(iii)治療または予防上有効な量の本発明のワクチ
ンベクターを含有する医薬組成物;(iv)哺乳類に免疫原性上有効な量の本発明
のワクチンベクターを投与してクラミジアに対する感染防御または治療免疫応答
を誘導することを含む、哺乳類(例えばヒト)のクラミジアに対する免疫応答を
誘導する方法;またこの方法は動物(例えばネコまたは鳥)のクラミジア感染症
を治療または予防する獣医学的適用に用いることができる;さらに詳しくは(v
)感染した個体に予防または治療量の本発明のワクチンベクターを投与すること
を含む、クラミジア(例えばC.トラチョマチス(C. trachomatis)、C.プシタ
チ(C. psittaci)、肺炎クラミジア、C.ペコラム(C. pecorum))感染症を予防
および/または治療する方法が提供される。さらに本発明の第3の態様によれば
、クラミジア感染症を予防および/または治療する医薬の製造における本発明の
ワクチンベクターの使用が含まれる。
ペプチドまたは誘導体を発現する。ワクチンベクターはさらに免疫応答を増大す
る(アジュバント効果)、インターロイキン−2(IL−2)またはインターロ
イキン−12(IL−12)などのサイトカインを更に発現してもよい。発現さ
れる各成分が哺乳類細胞における発現に必要なエレメントの制御下に置かれてい
ることは明らかである。
は誘導体を発現し得るいくつかのワクチンベクターを含んでなる。組成物はまた
付加的なクラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もし
くは誘導体を、場合によってはIL−2もしくはIL−12などのサイトカイン
とともに発現し得るワクチンベクターを含んでいてもよい。
的な経路により、特に粘膜(例えば目、鼻腔内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣、
または尿管)表面にまたは非経口(例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または
腹膜内)経路により投与される本発明のワクチンベクターの使用を含んでなる。
好ましい経路はワクチンベクターの選択による。1回の投与で治療を果たしても
よいし、または間隔をおいて反復してもよい。好適な用量は当業者に理解されて
いる、ワクチンベクター自体、投与経路または予防接種する哺乳類の条件(重量
、年齢など)といった種々のパラメーターによって異なる。
クスウイルスなどのウイルスベクター、ならびに細菌ベクター(例えば赤痢菌属
(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、乳酸桿
菌(Lactobacillus)、カルメットーゲラン菌(Bacille bilie de Calmette-Guerin
)(BCG)、および連鎖球菌(Streptococcus))が挙げられる。
ノウイルスベクターの構築方法が米国特許第4,920,209号に記載されて
いる。ポックスウイルスベクターにはワクシニアおよびカナリヤポックスウイル
スがあり、それぞれ米国特許第4,722,848号および米国特許第5,36
4,773号に記載されている。例えばワクシニアウイルスベクターの記載はTa
rtaglia et al., Virology (1992) 188:217、カナリヤポックスの参照文献はTay
lor et al. Vaccine (1995) 13:539も参照。哺乳類細胞における発現に好適な条
件下で本発明のポリヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入するために、本発明の
ポリヌクレオチドを発現し得るポックスウイルスベクターをKieny et al., Natu
re (1984) 312:163に記載される相同組換えにより得る。一般に治療または予防
に使用するワクチンウイルスベクターの用量はキログラム当たりのプラーク形成
単位が、約1×104〜約1×1011、有利には約1×107〜約1×101 0 、好ましくは約1×107〜約1×109であってよい。好ましくは、ウイル
スベクターを、例えば4週間おきに3回で、非経口投与する。本発明のウイルス
ベクターを含有する組成物に化学アジュバントを加えることを避け、それによっ
てウイルスベクター自身に対する免疫応答を最小にすることが好ましい。
s et al., Nature (1983) 306:551および米国特許第4,882,278号では
、機能し得るコレラ毒素が生産されないように欠失させた、2つのctxA対立
遺伝子それぞれの実在する量のコード配列を有する株が記載されている。WO9
2/11354では、変異(この変異を単一株においてctxA変異と組み合わ
せてもよい)によりirgA遺伝子座を不活性化した株が記載されている。WO
94/01533では、機能し得るctxAおよびattRS1 DNA配列を
欠いた欠失変異体が記載されている。WO94/19482に記載されるように
、これらの変異株を遺伝子操作して非対応抗原を発現させる。本発明のDNA分
子によりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を発現し得るコレ
ラ菌株の有効なワクチン用量は、選択された投与経路に適した用量中の生存細菌
数、約1×105〜約1×109、好ましくは約1×106〜約1×108を含
有する。好ましい投与経路としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましく
はこれらのベクターは鼻腔内または経口投与される。
菌株、および経口ワクチンとしてのそれらの使用はNakayama et al. (Bio/Techn
ology (1988) 6:693)およびWO92/11361に記載されている。好ましい
投与経路としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましくはこれらのベクタ
ーは鼻腔内または経口投与される。
ー赤痢菌(Shigella flexneri)についてはHigh et al., EMBO (1992) 11:1991お
よびSizemore et al., Science (1995) 270:299に、ストレプトコッカス・ゴル
ドニー(Streptococcus gordonii)についてはMedaglini et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA (1995) 92:6868、およびカルメットーゲラン菌(Bacille Calmette
Guerin)についてはFlynn J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31
、WO88/06626、WO90/00594、WO91/13157、WO
92/01796、およびWO92/21376に記載されている。
は遊離状態でプラスミドの一部として残す。
有してもよい。いくつかのアジュバントが当業者に公知である。好ましいアジュ
バントは以下に挙げたリストから選択される。
もに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物;(ii)治療または予防上有効
な量の本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物;(iii)免疫原性上有
効な量の本発明のポリヌクレオチドを投与してクラミジアに対する感染防御免疫
応答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法
;さらに詳しくは(iv)感染した個体に予防または治療量の本発明のポリヌクレ
オチドを投与することにより、クラミジア(例えばC.トラチョマチス、C.プ
シタチ、肺炎クラミジア、またはC.ペコラム)感染症を予防および/または治
療する方法が提供される。さらに本発明の第4の態様によれば、クラミジア感染
症を予防および/または治療する医薬の製造における本発明のポリヌクレオチド
の使用が含まれる。好ましい使用には哺乳類細胞における、特に哺乳類細胞にお
いて複製できず、かつ哺乳類ゲノムに実質的に組み込むことのできないプラスミ
ドにおける発現の条件下に置かれたDNA分子の使用が挙げられる。
クチンとしての投与が挙げられる。かかるポリヌクレオチドは哺乳類細胞におい
て複製できず、かつ哺乳類ゲノムに組み込むことのできないプラスミドの一部と
してDNAの形で用いられる。典型的には、かかるDNA分子は哺乳類細胞の発
現に好適なプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは遍在して、または
組織特異的のいずれかで機能する。非組織特異的プロモーターの例としては、初
期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第4,168,06
2号に記載される)およびラウス肉腫ウイルスプロモーター(Norton & Coffin,
Molec. Cell Biol. (1985) 5:281に記載される)が挙げられる。組織特異的プ
ロモーターの例としては、筋肉細胞における発現を駆動するデスミンプロモータ
ー(Li et al., Gene (1989) 78:243、Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 26
6:6562およびLi & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403に記載される)で
ある。プロモーターの使用については当業者は十分に公知である。有用なベクタ
ーは多くの公報、特にWO94/21797およびMartikka et al., Human Gen
e Therapy (1996) 7: 1205で記載されている。
の前駆体または成熟型のいずれかをコードする。前駆体型ではシグナルペプチド
は相同または異種のいずれかである。後者の場合、組織型プラスミノゲン因子(
tPA)のリーダー配列などの真核生物リーダー配列が好ましい。
とともに所望によりウレアーゼサブユニットA、Bもしくはその両方などの別の
クラミジア抗原、またはその断片、誘導体、変異体もしくは類似体をコードする
少なくとも1つの付加的なポリヌクレオチドを含有する。また組成物は免疫応答
を増強するためにインターロイキン−2(IL−2)またはインターロイキン−
12(IL−12)などのサイトカインをコードする付加的なポリヌクレオチド
を含有してもよい。これらの付加的なポリヌクレオチドは発現に好適な制御下に
置かれている。同じ組成物に含まれる本発明のDNA分子および/または付加的
なDNA分子は同じプラスミドに存在することが有利である。
ドの調製および精製標準手法を用いる。ワクチンとして用いるための本発明のポ
リヌクレオチドは以下に概略を記した種々の方法により処方される。
で使用される。かかるポリヌクレオチドは単に滅菌生理食塩水または滅菌緩衝溶
液などの生理学上許容される溶液に、担体を用いてまたは用いずに希釈する。担
体が存在する場合には、担体が等張性、低張性、または弱高張性であることが好
ましく、スクロース溶液、例えば20%スクロース含有溶液により得られるよう
な比較的低いイオン強度を有する。
。かかる薬剤の例は(i)ブピバカインなどの細胞透過性を改変する化学物質(
例えばWO94/16737参照)、(ii)ポリヌクレオチドをカプセル封入す
るリポソーム、または(iii)それ自身がポリヌクレオチドと結合する陽イオン
脂質またはシリカ、金、もしくはタングステン微粒子である。
リポソーム作製方法の詳細な説明に関する、Liposomes: A Practical Approach,
Rpc New Ed, IRL press (1990)参照)、ポリヌクレオチドをはじめとする広範
囲の産物を送達するのに有用である。
る。かかる脂質には、DOTMA(N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プ
ロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド)としても知られるリ
ポフェクチン(商標)、DOTAP(1,2−ビス(オレイルオキシ)−3−(
トリメチルアンモニオ)プロパン)、DDAB(ジメチルジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド)、DOGS(ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン)お
よびDC−Chol(3β−(N−(N’、N’−ジメチルアミノメタン)−カ
ルバモイル)コレステロール)などのコレステロール誘導体が挙げられる。これ
らの陽イオン脂質の記載はEP187,702、WO90/11092、米国特
許第5,283,185号、WO91/15501、WO95/26356、お
よび米国特許第5,527,928号に見出すことができる。遺伝子送達用の陽
イオン脂質は、例えばWO90/11092に記載されるようにDOPE(ジオ
レイルホスファチジルエタノールアミン)のような中性脂質と結合させて用いる
ことが好ましい。
進化合物を含有してもよい。それらの多くはWO93/18759、WO93/
19768、WO94/25608、およびWO95/2397に記載されてい
る。それらには核膜を通るDNAの輸送を促進するのに有用なスペルミン誘導体
(例えばWO93/18759参照)およびGALA、グラミシジンS、ならび
に陽イオン胆汁酸塩などの膜透過性化合物(例えばWO93/19768参照)
が挙げられる。
よびTang et al. (Nature (1992) 356:152)に記載されるように遺伝子送達に用
いられる。米国特許第4,945,050号、米国特許第5,015,580号
、およびWO94/24263に記載されるもののように、微粒子で被覆したポ
リヌクレオチドを無針注入装置(「遺伝子銃」)を用いて皮内または表皮内経路
で注入する。
の強さ、発現遺伝子産物の免疫原性、投与をしようとする哺乳類の条件(例えば
哺乳類の体重、齢、および全身の健康状態)、投与様式、および剤型による。一
般に、治療または予防上有効な量、約1μg〜約1mg、好ましくは約10μg
〜約800μg、およびさらに好ましくは約25μg〜約250μgをヒト成人
に投与してもよい。1回の投与で投与を果たしてもよいし、または間隔をおいて
反復してもよい。
な指針として、本発明のポリヌクレオチドは粘膜表面、例えば目、鼻腔内、肺、
口腔、腸、直腸、膣、および尿管表面により;または非経口経路、例えば静脈内
、皮下、腹膜内、皮内、表皮内、または筋肉内経路により投与する。投与経路の
選択は選択される製剤による。ブピバカインと結合させて処方したポリヌクレオ
チドは筋肉投与が有利である。中性もしくは陰イオンリポソームまたはDOTM
AまたはDC−Cholなどの陽イオン脂質を用いる場合、製剤は静脈内、鼻腔
内(エアゾル化)、筋肉内、皮内、および皮下経路により注入することが有利で
あろう。裸の形態のポリヌクレオチドは筋肉内、皮内、または皮下経路により投
与することが有利であろう。
。もしそうであれば、アジュバント作用を示すために同時投与する必要のない浸
透性アジュバント、例えば米国特許第5,057,546号に記載されるQS2
1などが好ましい。
ーブおよびプライマーの設計が可能になる。従って、本発明の第5の態様によれ
ば、配列番号1に示される配列の遺伝子コードの縮重で見られる、または縮重に
より誘導された配列を有するヌクレオチドプローブまたはプライマーが提供され
る。
条件下で、配列番号1を有する核酸分子と、または配列番号1と相同な配列と、
またはその相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズするDNA(好まし
くは一本鎖)またはRNA分子(またはこれらの改変体もしくは組合せ)をいう
。一般に、プローブは全長配列よりかなり短い。かかるプローブは約5〜約10
0個、好ましくは約10〜約80個のヌクレオチドを含有する。特にプローブは
配列番号1の一部と少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、さらに好
ましくは95%相同である、またはかかる配列と相補的である配列を有する。プ
ローブはイノシン、メチル−5−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチ
ルアミノ−5−デオキシウリジン、またはジアミノ−2,6−プリンなどの改変
塩基を含有してもよい。糖またはリン酸残基も改変または置換してもよい。例え
ばデオキシリボース残基をポリアミドで置き換えてもよく(Nielsen et al., Sci
ence (1991) 254:1497)、リン酸残基をジホスフェート、アルキル、アリールホ
スホネートおよびホスホロチオエートエステルなどのエステル基で置き換えても
よい。さらにリボヌクレオチドの2’−ヒドロキシル基をアルキル基のような官
能基などで改変してもよい。
宜にはかかる捕捉プローブは共有結合手段によりまたは受動的吸着により固相支
持体に直接的または間接的に固定する。検出プローブは放射性同位元素、ペルオ
キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ならびに発色性、蛍光性、または発光
性基質を加水分解し得る酵素、発色性、蛍光性、または発光性化合物、ヌクレオ
チド塩基類似体、およびビオチンから選択される検出マーカーで標識する。
A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sp
ring Habor, New York)、サザンブロット法(Southern, J. Mol. Biol. (1975) 9
8:503)、ノーザンブロット法(RNAを標的として用いることを除いて、サザン
ブロットと同じ)、またはサンドイッチ手法(Dunn et al., Cell (1977) 12:23)
などのいずれの通常のハイブリダイゼーション手法にも用いてよい。後の手法で
は互いに少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有する特異的な捕捉プロ
ーブおよび/または特異的な検出プローブの使用が含まれる。
における酵素的DNA重合を開始するのに用いる、通常約10〜約40個のヌク
レオチドのプローブである。PCRをはじめとする診断法に用いるプライマーを
当技術分野で公知な方法で標識する。
てクラミジアの存在を検出および/または同定する本発明のプローブを含んでな
る試薬;(ii)(a)該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、(b)
該材料からDNAまたはRNAを抽出して変性させ、さらに(c)ストリンジェ
ントハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションが検出されるよ
うに本発明のプローブ、例えば捕捉、検出プローブもしくはその両方に曝す、生
物学的材料においてクラミジアの存在を検出および/または同定する方法;およ
び(iii)(a)該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、(b)そこ
からDNAを抽出し、(c)抽出したDNAに少なくとも1つ、および好ましく
は2つの本発明のプライマーを提供してポリメラーゼ鎖反応により増幅し、さら
に(d)増幅したDNA断片を生産する、生物学的材料においてクラミジアの存
在を検出および/または同定する方法も包含する。
の開示によりそれらの対応するアミノ酸配列が使用可能になることは明らかであ
る。従って本発明の第6の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドによりコー
ドされるアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリペプチドまたはポリペ
プチド誘導体が提供される。
然に存在する環境から選別されたポリヌクレオチド、および/またはそれが合成
される環境に存在する多数のポリヌクレオチドから遊離したポリペプチドと定義
される。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは細胞質ポリペプチドから遊
離したものである。本発明のポリペプチドが天然源、すなわちクラミジア株から
精製され得る、または組換え手段により生産され得ることは当業者には容易に理
解されよう。
に対する感染防御をすると考えられる標的動物において、その免疫原性を向上さ
せるために改変されたまたは処理されたポリペプチド、相同体または断片が提供
される。かかる改変または処理には:3−メチルヒスチジン、4−ヒドロキシプ
ロリン、5−ヒドロキシリジンなどのアミノ酸誘導体によるアミノ酸置換、アミ
ノ酸の遊離アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシル側基の改変などのポリペプ
チド、相同体または断片の調整後に行われる改変または欠失が挙げられる。
ペプチドまたはポリペプチド誘導体の同定は、配列番号1のアミノ酸配列を有す
る参照ポリペプチドに対して作製した抗血清との交差反応性によるスクリーニン
グにより達成される。この手順は次の通りである:単一特異性高度免疫抗血清を
、精製参照ポリペプチド、融合ポリペプチド(例えばMBP、GST、またはH
is−tag系の発現産物、pcDNA3.1/Myc−His(+)A,B,
およびC用の、およびXpress(登録商標)System Protein Purification用のイ
ンビトロジェン(Invitrogen)社の製品マニュアルに含まれているその使用のた
めの記述および指示書)、または抗原性であると推測される合成ペプチドに対し
て作製する。抗血清を融合ポリペプチドに対して作製する場合、2つの異なる融
合系を使用する。特異性抗原性は以下のようにウエスタンブロット法(Towbin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:4350)、ドットブロット法、およ
びELISA法などのいくつかの方法により求めることができる。
は大腸菌全抽出物のいずれかとして、Laemmli(Nature (1970) 227:680)により記
載されたSDS−PAGE電気泳動法に付す。ニトロセルロース膜に移した後、
この材料を約1:5〜約1:5000、好ましくは約1:100〜約1:500
の希釈範囲で、希釈した単一特異性高度免疫抗血清とともにさらにインキュベー
トする。その産物に対応する1つのバンドが上記の希釈範囲のいずれかで反応性
を呈すれば、特異的抗原性が示される。
ましい。全細胞抽出物を用いてもよいが、精製調製物が好ましい。要するに、約
10μgタンパク質/mlの調製物約100μlを96−ウェルポリカーボネー
トELISAプレートに分注する。このプレートを37℃で2時間、次いで4℃
で一晩インキュベートする。プレートを0.05%Tween20含有リン酸緩
衝生理食塩水(PBS)(PBS/Tweenバッファー)で洗浄する。ウェル
を1%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBS250μlで飽和させ、非特異
的抗体結合を妨げる。37℃で1時間インキュベーションした後、プレートをP
BS/Tweenバッファーで洗浄する。抗血清は0.5%BSA含有PBS/
Tweenバッファーで連続的に希釈する。各ウェルに希釈物100μlを加え
る。プレートを37℃で90分間インキュベートし、洗浄して標準法により評価
する。例えば、特異的抗体をウサギで生産した場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダ
ーゼ複合体をウェルに加える。インキュベーションを37℃で90分間で行い、
プレートを洗浄する。適当な基質により反応物を顕出させ、この反応物を比色定
量(分光光度計により測定された吸光度)により測定する。上記の試験条件下で
、O.D.値が非免疫対照血清より大きい場合に陽性反応を示す。
。要するに、約100μg/mlの産物の溶液を50mM Tris−HCl(
pH7.5)で連続的に2倍希釈する。各希釈物100μlを96−ウェルドッ
トブロット装置(Biorad)にセットしたニトロセルロース膜0.45μmに塗布す
る。系を減圧してバッファーを除去する。50mM Tris−HCl(pH7
.5)を加えてウェルを洗浄し、膜を風乾する。膜をブロッキングバッファー(
50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、10g/
L脱脂乳)で飽和させ、約1:50〜約1:5000、好ましくは約1:500
の抗血清希釈物とともにインキュベートする。反応物を標準手順により調べる。
例えば、ウサギ抗体を用いる場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合体をウェ
ルに加える。インキュベーションを37℃で90分間で行い、ブロットを洗浄す
る。適当な基質により反応物を顕出させて停止させる。この反応物を発色スポッ
トの様子から、例えば比色定量により視覚的に測定する。上記の試験条件下で、
発色スポットが少なくとも約1:5、好ましくは少なくとも約1:500の希釈
物と結合する場合に陽性反応を示す。
できる。本発明の第7の態様によれば、(i)本発明のポリペプチドとともに希
釈剤または担体を含んでなる材料の組成物;とりわけ(ii)治療または予防上有
効な量の本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物;(iii)免疫上有効な量
の本発明のポリペプチドを哺乳類に投与してクラミジアに対する感染防御免疫応
答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法;
さらに詳しくは(iv)感染した個体に予防または治療量の本発明のポリペプチド
を投与することにより、クラミジア(例えばC.トラチョマチス、C.プシタチ
、肺炎クラミジア、またはC.ペコラム)感染症を予防および/または治療する
方法が提供される。さらに本発明の第7の態様によれば、クラミジア感染症を予
防および/または治療する医薬の製造における本発明のポリペプチドの使用が含
まれる。
経路、特に粘膜(例えば目、鼻腔内、肺、口腔、胃、腸、直腸、膣、または尿管
)表面にまたは非経口(例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹膜内)経
路により投与する。投与経路の選択はポリペプチドと結合したアジュバントなど
のいくつかのパラメーターによる。粘膜アジュバントを用いる場合には鼻腔内ま
たは口腔経路が好ましい。脂質処方またはアルミニウム化合物を用いる場合には
非経口経路が好ましく、皮下または筋肉内経路が最も好ましい。この選択もまた
ワクチン薬剤の性質による。例えば、CTBまたはLTBと融合した本発明のポ
リペプチドは粘膜表面に投与することが最もよい。
チドまたは誘導体を含有する。所望により組成物は少なくとも1つの付加的なク
ラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もしくは誘導体
を含有してもよい。
ム、好ましくは中性または陰イオンリポソーム、ミクロスフェア、ISCOMS
、またはウイルス様粒子(VLP)中にまたはそれとともに処方して、送達を促
進および/または免疫応答を増強する。当業者はこれらの化合物を容易に入手で
きる;例えばLiposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press(1990)
参照。
アジュバントは抗原を局所デポジットに封鎖することにより、それを急速な分散
から守る、またはそれらは宿主を刺激して免疫系のマクロファージまたは他の成
分に対し化学走性である因子を分泌する物質を含有すると考えられる。一般的に
は当業者によって、例えば以下(本発明の第11の態様)に記載されるものから
適当な選択がなされるであろう。
たは必要に応じて間隔をおいて反復してもよい。例えば、開始用量の後、週単位
または1ヶ月単位の間隔をおいて3回の追加免疫抗原投与を続ける。好適な用量
は当業者には容易に決定できるが、受容者(例えば成人または小児)、個々のワ
クチン抗原、投与経路または頻度、アジュバントの有無またはタイプ、および所
望の効果(例えば感染防御および/または治療)を含む種々のパラメーターによ
って異なる。一般に、本発明のワクチン抗原を粘膜経路によって約10μg〜約
500mg、好ましくは約1mg〜約200mgの量を投与する。投与が非経口
経路の場合、通常用量は約1mg、好ましくは約100μgの限度を超えない。
ドを多段階免疫化プロセスの要素として連続的に用いてもよい。例えば、まず哺
乳類にポックスウイルスなどの本発明のワクチンベクターを、例えば非経口経路
によりに注入し、次いでワクチンベクターによりコードされるポリペプチドで2
回、例えば粘膜経路により追加免疫抗原を加える。また別の例では本発明のポリ
ペプチドまたは誘導体と結合したリポソームを開始に用い、粘膜アジュバント(
例えばLT)と組み合わせた本発明の可溶性ポリペプチドまたは誘導体を用いて
粘膜により追加免疫抗原刺激を行う。
液サンプルにおいて抗クラミジア抗体の存在を検出する診断試薬として用いられ
る。かかるポリペプチドの長さは約5〜約80個、好ましくは約10〜約50個
のアミノ酸である。診断方法により、それらを標識するまたは標識しないのいず
れかである。かかる試薬を含む診断方法を以下に記載する。
たはポリペプチド誘導体を生産し精製する。以下に記載されるように、ポリペプ
チドまたはポリペプチド誘導体は精製を促進する融合テールを有した融合タンパ
ク質として生産される。融合産物を用いて小型哺乳類、例えばマウスまたはウサ
ギを免疫化し、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に対する抗体(単一特異
性抗体)を作製する。よって本発明の第8の態様によれば、本発明のポリペプチ
ドまたはポリペプチド誘導体と結合する単一特異性抗体が提供される。
し得る抗体を意味する。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗
体のいずれかである。単一特異性抗体は組換え体、例えばキメラ(例えば、ヒト
不変部と結合したネズミ由来の可変部により構成された)、ヒト化型(動物、例
えばネズミ由来の超可変部とともにあるヒト免疫グロブリン不変主鎖)および/
または一本鎖であってよい。ポリクローナルおよび単一特異性抗体は双方とも免
疫グロブリン断片、例えばF(ab)’2またはFabフラグメントの形であっ
てもよい。本発明の抗体はいずれのイソ型のもの、例えばIgGまたはIgAで
あってよいが、ポリクローナル抗体は単一イソ型またはイソ型の混合物ある。
相同体または断片を含んでなる組成物による哺乳類の免疫化により産生される。
かかる抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体の産生方法は当技術分野では十分に公知である
。例えば、"Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Eds. E. Harlow and D. Lane (1988)、およびD. E. Yelton et al., 1981. A
nn. Rev. Biochem. 50: 657-680参照。モノクローナル抗体についてはKohl and
Milstein(1975)Nature256:495-497参照。
抗体を標準免疫学的アッセイ法、例えばウエスタンブロット解析法、ドットブロ
ットアッセイ法、またはELISA法(例えばColigan et al., Current Protoco
ls in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照)を用い
て作製して同定する。抗体は生物学的サンプルなどのサンプルにおいてクラミジ
ア抗原の存在を検出する診断法に用いられる。また抗体は本発明のポリペプチド
またはポリペプチド誘導体を精製するアフィニティークロマトグラフィーにも用
いられる。以下でさらに考察するように、かかる抗体を予防および治療的受動的
免疫化方法に用いてもよい。
たはポリペプチド誘導体を含有する生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在
を検出する試薬;および(ii)免疫複合体が形成されるように生物学的サンプル
と本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体とを接触させて、か
かる複合体を検出してサンプルまたはサンプルが誘導される生物体においてクラ
ミジアの存在を示すことにより、生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在を
検出する方法が提供される。
またはポリペプチド誘導体とで形成されること、および結合していない材料がい
ずれも複合体の検出前に除去されることは当業者には容易に理解されるであろう
。ポリペプチド試薬がサンプル、例えば血液サンプルにおいて抗クラミジア抗体
の存在を検出するのに有用であり、本発明の抗体が胃抽出物または生検などのサ
ンプルをクラミジアポリペプチドの存在についてスクリーニングするのに有用で
あることは明らかである。
チド誘導体)は遊離状態にあるか、またはチューブ、ビーズ、または当分野にお
いて用いられるいずれかの他の通常の支持体などの固相支持体に固定されている
かである。固定は直接的または間接的手段によりなし遂げられる。直接的手段と
しては受動的吸着(非共有結合)または支持体と試薬との共有結合が挙げられる
。「間接的手段」とは試薬と相互作用する抗試薬化合物が固相支持体に最初に付
着することを意味する。例えば、ポリペプチド試薬を用いる場合に、それが生物
学的サンプルにおいて抗体の認識に関係していないエピトープと結合するのであ
れば、それに結合する抗体が抗試薬として作用し得る。間接的手段にはまた、例
えばビタミンなどの分子がポリペプチド試薬に接合され、その対応する受容体が
固相に固定されるリガンド−受容体系も用いられる。これはビオチン−ストレプ
トアビジン系によって例示される。あるいは、ペプチドテールを化学的にまたは
遺伝子操作により試薬に加え、接合または融合された産物をペプチドテールの受
動的吸着または共有結合により固定する。
なる。この試薬はそれがその標的と結合した場合に試薬の検出がなされる検出手
段によって標識される。検出手段はフルオレセインイソシアネートまたはフルオ
レセインイソチオシアネートなどの蛍光剤、またはセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼもしくはルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素、ま
たは125Iまたは51Crなどの放射性元素であってよい。
一特異性抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、生
物学的サンプルから、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を精製す
る方法が提供される。
抗体のいずれか、および好ましくはIgG型である。精製IgGは常法により抗
血清から調製する(Coligan et al.,Current Protocols in Immunology (1994)Jo
hn Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。一般的なクロマトグラフィー支持体、
ならびに抗体を接合する標準方法については、例えばAntibodies: A Laboratory
Manual, D. Lane, E. Harlow, Eds. (1988)に記載されている。以下に概略を記
す。
学的サンプルを、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体(すなわち抗
原)をクロマトグラフィー材に吸着させるように、好ましくは生物学的サンプル
の希釈に用いるバッファーで平衡化した材料に適用する。本発明の抗体と結合し
たゲルまたは樹脂などのクロマトグラフィー材はバッチ型またはカラムのいずれ
かである。結合しない成分を洗い流し、次いで抗原をグリシンバッファー、また
はカオトロピック剤、例えばグアニジンHCl、もしくは高塩濃度(例えば、3
M MgCl2)を含有するバッファーなどの好適な溶出バッファーで溶出する
。溶出画分を回収し、例えば280nmにおける吸光度を測定することにより抗
原の存在を検出する。
剤または担体を含んでなる材料の組成物;(ii)治療または予防上有効な量の本
発明の単一特異性抗体を含んでなる医薬組成物;および(iii)感染した個体に
治療または予防量の本発明の単一特異性抗体を投与することにより、クラミジア
(例えばC.トラチョマチス、C.プシタチ、肺炎クラミジア、またはC.ペコ
ラム)感染症を治療または予防する方法が提供される。さらに本発明の第11の
態様によれば、クラミジア感染症を治療または予防する医薬の製造における本発
明の単一特異性抗体の使用が含まれる。
はIgAイソ型のもの(優勢)である。受動的免疫化では抗体を重炭酸バッファ
ーの存在下で哺乳類の粘膜表面、例えば胃粘膜に、例えば経口または胃内投与す
ることが有利である。また全身投与は重炭酸バッファーを用いずに行われる。本
発明の単一特異性抗体を単一有効成分として、または異なるクラミジアポリペプ
チドに対して特異的な少なくとも1つの単一特異性抗体との混合物として投与す
る。用いる抗体量および特定の管理方法は当業者により容易に決定される。大部
分の目的には、例えば抗体約100〜1,000mgを1週間毎日投与、または
抗体約100〜1,000mgを2または3日間1日当たり3回投与が有効な管
理法である。
または感染防御および/または治療的免疫の誘導を、例えば肺炎クラミジアマウ
スモデルを用いて測定することにより評価する。モデルの肺炎クラミジア株を別
のクラミジア株と置き換えてもよいことは当業者に容易に理解されるであろう。
例えば、肺炎クラミジア由来のDNA分子およびポリペプチドの効果は、好まし
くはマウスモデルにおいて肺炎クラミジア株を用いて評価する。感染防御はクラ
ミジア感染症の程度を対照群のものと比較して求める。感染症が対照群に比べて
軽減されている場合に感染防御を示す。本発明のポリヌクレオチド、ワクチンベ
クター、ポリペプチドおよびその誘導体、ならびに抗体に対してかかる評価がな
される。
ある。
およびヒドロキシリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物が挙げられる。
標準プロトコールに従い、抗原をアルミニウム化合物で沈降させる、またはそれ
に吸着させる。RIBI(ImmunoChem, Hamilton, MT)などの他のアジュバントも
非経口投与に用いられる。
毒(LT)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒Aお
よび百日咳毒(PT)、もしくはその組合せ、サブユニット、変性毒素、または
天然コレラ毒サブユニットB(CTB)の精製製剤などのその変異体が挙げられ
る。これらの毒素のいずれに対する断片、相同体、誘導体、および融合物もアジ
ュバント活性を保有している場合にはそれらもまた適当である。好ましくは弱毒
化した変異体を用いる。好適な変異体は、例えばWO95/17211(Arg
−7−Lys CT変異体)、WO96/06627(Arg−192−Gly
LT変異体)、およびWO95−34323(Arg−9−LysおよびGl
u−129−Gly PT変異体)に記載される。本発明の方法および組成物に
おいて用いられるさらなるLT変異体には、例えばSer−63−Lys、Al
a−69−Gly、Glu−110−Asp、およびGlu−112−Asp変
異体が挙げられる。例えば大腸菌、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesot
a)、ネズミチフス菌、またはシゲラ・フレクスネリ(Shigella Flexneri)の細菌
モノホスホリル脂質A(MPLA);サポニン、またはポリアクチドグリコリド
(PLGA)ミクロスフェアなどの他のアジュバントも粘膜投与に用いられる。
WO95/2415)、DC−chol(3b−(N−(N’,N’−ジメチル
アミノメタン)−カルバモイル)コレステロール;米国特許第5,283,18
5号およびWO96/14831)およびQS−21(WO88/09336)
が挙げられる。
を含有する本発明の医薬組成物は常法で製造される。特に医薬上許容される希釈
剤または担体、例えば水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水とともに
処方される。一般に希釈剤または担体は投与形ならびに経路、および医薬上の標
準法に基づき選択される。好適な医薬上の担体または希釈剤、ならびに医薬製剤
における使用に医薬上必要不可欠なものは、Remington's Pharmaceutical Scien
ces、当分野における標準的な参照文献およびUSP/NFに記載されている。
生物質、制酸剤、スクラルファート、またはその組合せとを併用した経口投与に
よりクラミジア感染症を治療する方法も含む。ワクチン抗原およびアジュバント
とともに投与し得るかかる化合物の例としては、例えばマクロライド、テトラサ
イクリン、およびその誘導体(用い得る抗生物質の特異例として、アジトロマイ
シンもしくはドキシサイクリンまたはサイトカインもしくはステロイド類などの
免疫調節剤が挙げられる)などの抗生物質がある。さらにともに結合した1種を
超える上記成分を含有する化合物を用いる。本発明はまたこれらの方法を行うた
めの組成物、すなわち医薬上許容される担体または希釈剤中に本発明のクラミジ
ア抗原(または抗体)、アジュバント、および1種以上の上記の化合物を含有す
る組成物も含む。
れているエピトープ、ネズミαミオシン重鎖エピトープM7A−αと交差反応す
る配列を含んでいることが示されている(Bachmaier et al., Science (1999) 28
3:1335)。この交差反応性は心血管疾患の発症の一因であることを示しているの
で、ワクチンとして使用される場合はそのタンパク質からこのエピトープおよび
ヒト抗原と交差反応するその他のエピトープのいずれもを除去するのが有効であ
り得る。従って、本発明のさらなる具体例は、例えばタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドからエピトープをコードするヌクレオチドを欠失させるまたは置
換して、ワクチンとしてのタンパク質の有効性と安全性を向上させることでコー
ド配列を改変することを含む。ヒト抗原との望ましくない相同性または交差反応
性を持つことがわかっているいずれの防御抗原に対しても同様のアプローチが適
当であり得る。
者ならば容易に求められる。治療/免疫化計画についても公知であり、当業者に
よって容易に計画される。例えば、非ワクチン成分を1〜14日目に投与して、
ワクチン抗原+アジュバントを7、14、21、および28日目に投与すること
が可能である。
具体的な実施例により得られる。これらの実施例は単に例示のために記載される
ものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況が提案され
または便宜となる限り、形態の変更および同等物との置換も考えられる。ここで
は特定の用語が用いられているが、かかる用語は説明を意図したものであって、
限定しようとするものではない。
ラスミドベクターpCACRMP60の調製を示すものである。 システインの豊富な60kDa膜タンパク質遺伝子は、肺炎クラミジア(Chla
mydia pneumoniae)のゲノムDNAから、以下の5’プライマーおよび3’プラ
イマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した:5’プライマ
ー:5'ATAAGAATGCGGCCGCCACC[ATGTCCAAACTCATCAGACGAGTAG]3'(配列番号3、括
弧内は太字);3’プライマー:5'GCGCCGGATCCG[ATACACGTGGGTATTTTCTGTG]3'(
配列番号4、括弧内は太字)。この5’プライマーは、NotI制限部位、リボ
ソーム結合部位、開始コドン、およびシステインの豊富な60kDa膜タンパク
質コード配列の5’末端配列を含有している。3’プライマーは、システインの
豊富な60kDa膜タンパク質のC末端配列をコードする配列、およびBamH
I制限部位を含有している。ヒスチジンタグとのインフレーム融合物を得るため
に、終止コドンを含まないようにし、さらに別のヌクレオチドを挿入した。
製し、NotIおよびBamHIで消化し、実施例2に記載のpCA/Myc−
His真核生物発現ベクター(ヒトCMVプロモーターの制御下で転写を起こす
)中にクローニングした(図3)。
ある。 プラスミドpcDNA3.1(−)Myc−His C(Invitrogen)はSpe
IおよびBamHIで制限処理してCMVプロモーターを取り出し、残りのベク
ター断片を単離した。プラスミドVR−1012(Vical)からCMVプロモータ
ーおよびイントロンAをSpeI/BamHI断片上に単離した。これらの断片
を連結してプラスミドpCA/Myc−Hisを作製した。NotI/BamH
Iで制限処理した、システインの豊富な60kDa膜タンパク質遺伝子を含むP
CR断片を、NotIおよびBamHIで制限処理したプラスミドpCA/My
c−Hisに連結してプラスミドpCACRMP60を作製した(図3)。
腸菌XL−1ブルー(Stratagene)に導入し、これを50μg/mlのカルベニシ
リンを含むLBブロス中で増殖させた。このプラスミドをEndo Free Plasmid Gi
ga KitTM(Qiagen)大規模DNA精製システムで単離した。DNA濃度は260n
mにおける吸光度によって測定し、プラスミドはゲル電気泳動および臭化エチジ
ウム染色、および分子量標準との比較により確認した。この遺伝子の5’および
3’末端は、LiCorモデル4000L DNAシーケンサーおよびIRD−
800標識プライマーを用いた配列決定によって確認した。
ウスの免疫化を示すものである。 マウスが肺炎クラミジアの種々の単離体によって鼻腔内感染しやすいことはす
でに実証されている(Yang et. al., 1993)。抗原投与感染モデルとしてAR−3
9株(Grayston, 1989)をBalb/cマウスに用い、裸のDNAとして送達され
るクラミジア遺伝子産物の、致死下肺炎クラミジア肺感染に対する防御応答を誘
導する能力を調べた。感染防御免疫とは、肺感染の加速されたクリアランスであ
ると定義される。 7〜9週齢雄Balb/cマウスの群(各群8〜10匹)を、実施例1および
2に示されるシステインの豊富な肺炎クラミジア60kDa膜タンパク質のコー
ド配列を含有するプラスミドDNAにより筋肉内(i.m.)および鼻腔内(i
.n.)感作させた。対照動物群には生理食塩水または挿入したクラミジア遺伝
子を欠いたプラスミドベクターを与えた。 筋肉内感作では左右四頭筋に交互に、PBS50μl中のDNA100μgを
0、3および6週目に3度注射した。鼻腔内感作では麻酔をかけたマウスにDN
A50μgを含有するPBS50μlを0、3および6週目に3度吸引させた。
8週目、免疫化したマウスにSPGバッファー100μl中の肺炎クラミジア、
AR39株5×105IFUを鼻腔内接種して致死下肺炎クラミジア抗原投与の
増殖制限能を調べた。
7.5%スクロース、5mMグルタミン酸塩、12.5mMリン酸塩 pH7.
5)でホモジネートした。このホモジネートはアッセイまで−70℃で凍結保存
した。ホモジネートの希釈物を単層の感受性細胞へ接種して感染性クラミジアの
存在についてアッセイした。接種物を3000rpmで1時間、細胞上へ遠心分
離し、次いでこの細胞をシクロヘキシミド1μg/mlの存在下、35℃で3日
間インキュベートした。インキュベーション後、単層をホルマリンおよびメタノ
ールで固定し、次いで肺炎クラミジアに感染したウサギ由来の回復期血清とペル
オキシダーゼ基質としての金属により増強されたDABを用いてクラミジア封入
体の存在を免疫ペルオキシダーゼ染色した。
スの肺のクラミジア力価は、5日目で4例中の4例で1400未満、9日目では
4例中の4例で400未満であったが、生理食塩水を感作させた模擬的な対照マ
ウスについての値の範囲は5日目で1200〜2100IFU/肺(平均168
0)であり、9日目では1100〜12400IFU/肺(平均4320)であ
ったことを示す。もう1つのプラスミドDNA構築体pCAI422は防御はで
きず、免疫化マウスの肺力価は生理食塩水を感作させた対照マウスで得られたも
のと同等であったので、DNAの免疫化自体は観察された防御作用に関わるもの
ではなかった。構築体pCAI422は、システインの豊富な60kDa膜タン
パク質をコードするヌクレオチド配列が、非防御性タンパク質をコードする肺炎
クラミジアヌクレオチド配列で置換されていること以外はpCACRMP60と
同じである。
番号1)およびシステインの豊富な肺炎クラミジア由来60kDa膜タンパク質
の推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。
解析を示す。
示す。
Claims (34)
- 【請求項1】 (a)配列番号2; (b)(a)のポリペプチド由来の少なくとも12個の連続するアミノ酸を含
んでなる免疫原性断片;および (c)その免疫原性を向上させるために改変された(a)または(b)のポリ
ペプチド(この改変ポリペプチドは対応する(a)または(b)のポリペプチド
とアミノ酸配列において少なくとも75%の同一性を有する) のいずれかから選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる核酸
分子。 - 【請求項2】 (a)配列番号1; (b)配列番号1によってコードされるポリペプチドをコードする配列; (c)(a)および(b)の核酸配列のいずれか1つに由来する少なくとも3
8個の連続するヌクレオチドを含んでなる配列; (d)配列番号1によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列において
少なくとも75%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列 のいずれかから選択される核酸配列を含んでなる核酸分子。 - 【請求項3】 請求項1に記載の核酸分子に対してアンチセンスである核酸配列を含んでなる
、核酸分子。 - 【請求項4】 請求項1に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと付加的なポリ
ペプチドとを含んでなる融合タンパクをコードする核酸配列を含んでなる核酸分
子。 - 【請求項5】 付加的なポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項4に記載の核酸
分子。 - 【請求項6】 付加的なポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項4に記載の核酸分
子。 - 【請求項7】 1以上の発現制御配列に作動可能に連結された、請求項1〜6のいずれか一項
に記載の核酸分子。 - 【請求項8】 請求項1、2、および4〜7のいずれか一項に記載の少なくとも1つの第1の
核酸とワクチンベクターとを含んでなり(ここで、各々の第1の核酸はポリペプ
チドとして発現する)、所望によりこの第1の核酸によって発現されるポリペプ
チドに対する免疫応答を増強する付加的なポリペプチドをコードする第2の核酸
を含んでなる、ワクチン。 - 【請求項9】 第2の核酸が付加的なクラミジアポリペプチドをコードしている、請求項8に
記載のワクチン。 - 【請求項10】 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸と医薬上許容される担体とを含んで
なる医薬組成物。 - 【請求項11】 請求項8または9に記載のワクチンと医薬上許容される担体とを含んでなる医
薬組成物。 - 【請求項12】 請求項7に記載の核酸分子で形質転換された単細胞宿主。
- 【請求項13】 ストリンジェント条件下で、配列番号1の核酸分子、またはその核酸分子の相
同体または相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする5〜100個の
ヌクレオチドからなる核酸プローブ。 - 【請求項14】 ストリンジェント条件下で、配列番号1の核酸分子、またはその核酸分子の相
同体または相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする10〜40個の
ヌクレオチドからなるプライマー。 - 【請求項15】 請求項1、2、および4〜7のいずれか一項に記載の核酸配列によってコード
されているポリペプチド。 - 【請求項16】 (a)配列番号2; (b)(a)のポリペプチド由来の少なくとも12個の連続するアミノ酸を含
んでなる免疫原性断片;および (c)その免疫原性を向上させるために改変された(a)または(b)のポリ
ペプチド(この改変ポリペプチドは対応する(a)または(b)のポリペプチド
とアミノ酸配列において少なくとも75%の同一性を有する) のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。 - 【請求項17】 請求項15または16のポリペプチドと付加的なポリペプチドとを含んでなる
融合ポリペプチド。 - 【請求項18】 付加的なポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項17に記載の融
合ポリペプチド。 - 【請求項19】 付加的なポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項17に記載の融合
ポリペプチド。 - 【請求項20】 請求項15または16のポリペプチドを生産する方法であって、請求項12に
記載の単細胞宿主を培養する工程を含んでなる、方法。 - 【請求項21】 請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドに対する抗体。
- 【請求項22】 請求項15〜19のいずれか一項に記載の少なくとも1つの第1のポリペプチ
ドと医薬上許容される担体とを含んでなり、所望によりこの第1のポリペプチド
に対する免疫応答を増強する第2のポリペプチドを含んでなる、ワクチン。 - 【請求項23】 第2のポリペプチドが付加的なクラミジアポリペプチドを含んでなる、請求項
22に記載のワクチン。 - 【請求項24】 請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬上許容される担
体とを含んでなる医薬組成物。 - 【請求項25】 請求項22または23に記載のワクチンと医薬上許容される担体とを含んでな
る医薬組成物。 - 【請求項26】 請求項21に記載の抗体と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
- 【請求項27】 (a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸; (b)請求項8、9、22および23のいずれか一項に記載のワクチン; (c)請求項10、11、24〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物; (d)請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド;または (e)請求項21に記載の抗体 を用いて、クラミジア感染症を予防または治療する方法。
- 【請求項28】 (a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸; (b)請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド;および (c)請求項21に記載の抗体 のいずれか1つから選択される成分を用いて、試験される哺乳類の体液をアッセ
イする工程を含んでなる、クラミジア感染症の検出方法。 - 【請求項29】 使用説明書と、 (a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸; (b)請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド;および (c)請求項21に記載の抗体 のいずれか1つから選択される成分とを含んでなる診断キット。
- 【請求項30】 予めポリペプチドで免疫化した哺乳類におけるクラミジア感染の重篤度の予防
または軽減に有効な免疫応答を誘導する、請求項15〜19に記載のポリペプチ
ドを同定する方法であって、 (a)マウスをポリペプチドで免疫化し;さらに (b)免疫化したマウスにクラミジアを接種し、 ここで、免疫化されていない対照マウスに比べて免疫化したマウスでクラミジア
感染の重篤度が予防されたまたは軽減したポリペプチドが同定される 工程を含んでなる、方法。 - 【請求項31】 発現プラスミドpCACRMP60。
- 【請求項32】 配列番号3または4の核酸分子。
- 【請求項33】 クラミジアに由来する、システインの豊富な60kDa膜タンパク質。
- 【請求項34】 肺炎クラミジアに由来する、システインの豊富な60kDa膜タンパク質。
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