RS59760B1 - Makrociklični inhibitori pd-1/pd-l1 i cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interakcija - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetna objava obezbeđuje nove makrociklične peptide koji inhibiraju PD-1/PD-L1 i CD80/PD-L1 protein/protein interakcije, i prema tome su korisni za ublažavanje različitih bolesti, uključujući kancer i infektivne bolesti.

[0002] Protein 1 programirane smrti (PD-1 - Protein Programmed Death) je inhibitorni član CD28 familije receptora, koja takođe uključuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. PD-1 je eksprimiran na aktiviranim B ćelijama, T ćelijama, i mijeloidnim ćelijama (Agata et al., supra; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett et al., J. Immunol., 170:711-718 (2003)).

[0003] PD-1 protein je transmembranski protein tipa I od 55 kDa koji je deo superfamilije Ig gena (Agata et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)). PD-1 sadrži membranski proksimalni imunoreceptorski tirozinski inhibitorni motiv (ITIM) i membranski distalni tirozin-bazirani prekidački (ITSM) (Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181:1953-1956 (1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997)). Iako je strukturno sličan CTLA-4, PD-1 nedostaje MYPPY motiv koji je kritičan za CD80 CD86 (B7-2) vezivanje. Dva liganda za PD-1 su identifikovana, PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (b7-DC). Aktivacija T ćelija koje eksprimiraju PD-1 je pokazala da je negativno regulisana nakon interakcije sa ćelijama koje eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002)). I PD-L1 i PD-L2 su članovi familije B7 proteina koji se vezuju za PD-1, ali se ne vezuju za druge članove CD28 familije. PD-L1 ligand obiluje raznim humanim kancerima (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). Interakcija između PD-1 i PD-L1 rezultuje smanjenjem tumor infiltrirajućih limfocita, smanjenjem proliferacije posredovane T-ćelijskim receptorima, i imunološkom evazijom od strane kanceroznih ćelija (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Kancer Res., 10:5094-5100 (2004)). Imuna supresija može se preokrenuti inhibiranjem lokalne interakcije PD-1 sa PD-L1, a efekat je aditivan kada je interakcija PD-1 sa PD-L2 takođe blokirana (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)).

[0004] PD-L1 je takođe pokazao da intereaguje sa CD80 (Butte, M.J. et al., Imunitet, 27:111-122 (2007)). Interakcija PD-L1/CD80 na eksprimirajućim imunim ćelijama je pokazala da je inhibitorna. Pokazano je da blokada ove interakcije ukida ovu inhibitornu interakciju (Paterson, A.M. et al., J. Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang, J. et al., J. Immunol., 187(3):1113-1119 (Aug 12011)).

[0005] Kada PD-1 eksprimirajuće T ćelije kontaktiraju ćelije koje eksprimiraju njegove ligande, funkcionalne aktivnosti kao odgovor na stimulanse antigena, uključujući proliferaciju, sekreciju citokina i citotoksičnost, su smanjene. PD-1/PD-L1 ili PD-L2 interakcije negativno regulišu imune odgovore tokom rezolucije infekcije ili tumora, ili tokom razvoja samo tolerancije (Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26:Epub (2008)). Hronična stimulacija antigena, poput one koja se javlja tokom tumorske bolesti ili hroničnih infekcija, rezultuje T ćelijama koje eksprimiraju povišene nive PD-1 i disfunkcionalne su u odnosu na aktivnosti prema hroničnom antigenu (revidirano u Kim et al., Curr. Opin. Imm. (2010)). To se naziva "iscrpljivanje T ćelija". B ćelije takođe pokazuju supresiju PD-1 / PD-liganda i "iscrpljivanje".

[0006] Blokada PD-1/PD-L1 ligacije korišćenjem antitela na PD-L1 pokazala je da obnavlja i povećava aktivaciju T ćelija u mnogim sistemima. Pacijenti sa naprednim kancerom imaju koristi od terapije monoklonskim antitelom za PD-L1 (Brahmer et al., New Engl. J. Med. (2012)). Predklinički životinjski modeli tumora i hronične infekcije su pokazali da blokada PD-1/PD-L1 puta od strane monoklonskih antitela može da poboljša imuni odgovor i rezultuje odbacivanjem tumora ili kontrolom infekcije. Antitumorska imunoterapija putem PD-1/PD-L1 blokade može da poveća terapijski imuni odgovor brojnim histološki različitim tumorima (Dong, H. et al., "B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity", J. Mol. Med., 81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., "Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", Nat. Med., 8(8):793-800 (2002)).

[0007] Interferencija u PD-1/PD-L1 interakciji izaziva poboljšanu T ćelijsku aktivnost u sistemima sa hroničnim infekcijama. Blokada PD-L1 izaziva unapređen virusni klirens i obnovljen imunitet kod miševa sa hromoičnom limfocitnom infekcijom virusom horio meningitisa (Barber, D.L. et al., "Restoprsten function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection", Nature, 439(7077):682-687 (2006)). Humanizovani miševi inficirani sa HIV-1 pokazali su poboljšanu zaštitu od viremije i virusne deplecije CD4+ T ćelija (Palmer et al., J. Immunol. (2013)). Blokada PD-1/PD-L1 putem monoklonskih antitela na PD-L1 može da povrati in vitro antigen-specifičnu funkcionalnost T ćelija kod HIV pacijenata (Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza, J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, Nature Imm. (2007); Kasu, J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011)), HCV pacijenata (Golden-Mason, J. Virol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto, PLoS Path. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008)) i HBV pacijenata (Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012); Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep. (2012); Raziorrough, Hepatology (2009); Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (2008)).

[0008] Blokada PD-L1/CD80 interakcija je pokazala da stimuliše imunitet (Yang, J. et al., J. Immunol., 187(3):1113-1119 (Aug 1 2011)). Pokazano je da se imuno stimulacija koja je rezultat blokade PD-L1/CD80 interakcija pojačava putem kombinacije sa blokadom daljih PD-1/PD-L1 ili PD-1/PD-L2 interakcija.

[0009] Promene u fenotipovima imunih ćelija se hipotezirane kao važan faktor septičkog šoka (Hotchkiss et al., Nat. Rev. Immunol. (2013)). Ovo uključuje povećane nivoe PD-1 i PD-L1 (Guignant, et al., Crit. Care (2011)), Ćelije pacijenata sa septičnim šokom sa povišenim nivoima PD-1 i PD-L1 ispoljavaju povišen nivo aptoze T ćelije. Antitela usmerena na PD-L1, mogu da smanje nivo atoze imune ćelije (Zhang et al., Crit. Care (2011)). Osim toga, miševi kojima nedostaje PD-1 ekspresija su otporniji na simptome septičkog šoka od miševa divljih vrsta. Yang, J. et al., J. Immunol., 187(3):1113-1119 (01. avgust 2011)). Studije su otkrile da blokada interakcija PD-L1 korišćenjem antitela može suzbiti neprikladne imune odgovore i ublažiti znakove bolesti.

[0010] Pored poboljšanja imunoloških odgovora na hronične antigene, blokada PD-1/PD-L1 puta je takođe pokazala da poboljšava odgovore na vakcinaciju, uključujući terapijsku vakcinaciju u kontekstu hronične infekcije (Ha, S.J. et al., "Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection", J. Exp. Med., 205(3):543-555 (2008); Finnefrock, A.C. et al., ""PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronic infection and prophylactic vaccination", J. Immunol., 182(2):980-987 (2009); Song, M.-Y. et al., "Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ t-cell responses by soluble PD-1", J. Immunother., 34(3):297-306 (2011)).

[0011] Molekuli opisani ovde demonstriraju sposobnost da blokiraju interakciju PD-L1 sa PD-1, i u biohemijskim i ćelijski-zasnovanim eksperimentalnim sistemima. Ovi rezultati su konzistentni sa potencijalom terapijske administracije za poboljšanje imuniteta kod kancera ili hronične infekcije, uključujući terapijsku vakcinu.

[0012] Makrociklični peptidi opisani ovde su sposobni da inhibiraju interakciju PD-L1 sa PD-1 i sa CD80. Ova jedinjenja su demonstrirala visoku efikasnost vezivanja za PD-L1, blokadu interakcija PD-L1 sa ili PD-1 ili CD80, i sposobna su da promovišu poboljšanu funkcionalnu aktivnost T ćelija, čineći ih tako kandidatima za parenteralne, oralne, plućne, nazalne, bukalne i sa produženim oslobađanjem formulacije.

[0013] U jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak je usmeren na jedinjenja za koja se traži zaštita. Predmetna objava stavlja na uvid javnosti jedinjenje formule (I)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde:

A je odabrano od veze,

gde:

označava tačku vezivanja za karbonilnu grupu a označava tačku vezivanja za atom azota;

n je 0 ili 1;

R<14>i R<15>su nezavisno odabrani od vodonika i metila; i

R<16>je odabrano od

vodonika, -CHR<17>C(O)NH2, -CHR<17>C(O)NHCHR<18>C(O)NHz,

i -CHR<17>C(O)NHCHR<18>C(O)NHCH2C(O)NH2; gde R<17>je odabrano od vodonika

i -CH2OH i gde R<18>je odabrano od vodonika i metila;

R<c>, R<f>, R<h>, R<i>, R<m>, i R<n>su vodonik;

R<a>, R<e>, R<j>, i R<k>, su nezavisno odabrani od vodonika i metila;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, R<10>, R<11>, R<12>, i R<13>su nezavisno odabrani od bočnog lanca prirodne aminokiseline i bočnog lanca neprirodne aminokiseline ili formiraju prsten sa odgovarajućom vicinalnom R grupom kao što je opisano ispod;

R<e>i R<k>mogu svaki da formiraju prsten sa odgovarajućom vicinalnom R grupom i atomima na koje su vezani odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, i hidroksi;

R<b>je metil ili, R<b>i R<2>, zajedno sa atomima za koje su vezani, formiraju prsten odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, i hidroksi;

R<d>je vodonik ili metil, ili, R<d>i R<4>, zajedno sa atomima za koje su vezani, mogu da formiraju prsten odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, hidroksi, i fenil;

R<g>je vodonik ili metil ili R<g>i R<7>, zajedno sa atomima za koje su vezani, mogu da formiraju prsten odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, benzil po izboru supstituisanom sa halo grupom, benziloksi, cijano, cikloheksil, metil, halo, hidroksi, izohinoliniloksi po izboru supstituisanom sa metoksi grupom, hinoliniloksi po izboru supstituisanom sa halo grupom, i tetrazolil; i gde pirolidin i piperidin prsten su po izboru spojeni za cikloheksil, fenil, ili indol grupu; i

R<1>je metil ili, R<1>i R<12>, zajedno sa atomima za koji su vezani, formiraju prsten odabran od azetidina i pirolidina, gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, i hidroksi.

[0014] Predmetna objava dalje stavlja na uvid javnosti jedinjenje formule (II)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde:

A je odabrano od veze,

gde:

označava tačku vezivanja za karbonilnu grupu a označava tačku vezivanja za atom azota;

n je 0 ili 1;

R<14>i R<15>su nezavisno odabrani od vodonika i metila; i

R<16>je odabrano od

vodonika, -CHR<17>C(O)NH2, -CHR<17>C(O)NHCHR<18>C(O)NH2,

i -CHR<17>C(O)NHCHR<18>C(O)NHCH2C(O)NH2;

gde R<17>je odabrano od vodonika i -CH2OH i gde R<18>je odabrano od vodonika i metila;

R<a>, R<f>, R<j>, R<k>, R<l>, i R<m>su vodonik;

R<b>i R<c>su metil;

R<g>je odabrano od vodonika i metil;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, R<10>, R<11>, i R<12>su nezavisno odabrani od bočnog lanca prirodne aminokiseline i bočnog lanca neprirodne aminokiseline ili formiraju prsten sa odgovarajućom vicinalnom R grupom kao što je opisano ispod;

R<d>je odabrano od vodonika i metila, ili, R<d>i R<4>, zajedno sa atomima za koje su vezani, formiraju prsten odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, halometil, i hidroksi;

R<e>je odabrano od vodonika i metila, ili, R<e>i R<5>, zajedno sa atomima za koje su vezani, formiraju prsten odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, halometil, i hidroksi;

R<h>je odabrano od vodonika i metila, ili, R<h>i R<8>, zajedno sa atomima za koje su vezani, formiraju prsten odabran od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, halometil, i hidroksi; i

R<1>je odabrano od vodonika i metila, ili, R<i>i R<9>, zajedno sa atomima za koje su vezani odabranim od azetidina, pirolidina, morfolina, piperidina, piperazina, i tetrahidrotiazola; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabranom od amino, cijano, metil, halo, halometil, i hidroksi.

[0015] U drugom tehničkom rešenju predmetna objava obezbeđuje najmanje jedan makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom za primenu u poboljšanju, stimulisanju, i/ili povećanju imunog odgovora u subjektu kome je to potrebno. U drugom tehničkom rešenju dodatni agens može biti administriran pre, posle, ili istovremeno sa makrocikličnim peptidom ili peptidima pronalaska. U drugom tehničkom rešenju dodatni agens je antimikrobijalnii agens, antiviralni agens, citotoksični agens, i/ili modifikator imunog odgovora.

[0016] U drugom tehničkom rešenju predmetna objava obezbeđuje jedan ili više makrocikličnih peptida u skladu sa pronalaskom za primenu u inhibiranju rasta, proliferacije, ili metastaza ćelija kancera kod subjekta kome je to potrebno. U drugom tehničkom rešenju kancer je odabrano od melanoma, karcinoma bubrežnih ćelija, skvamoznog nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC - squamous non-small cell lung cancer), neskvamoznog NSCLC, kolorektalnog kancera, kancera prostate rezistentanog na kastraciju, kancera ovarijuma, kancera želuca, hepatocelularnoog karcinoma, karcinoma pankreasa, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, karcinoma jednjaka, gastrointestinalnog trakta i dojke, i hematološkog maligniteta.

[0017] U drugom tehničkom rešenju predmetna objava obezbeđuje najmanje jedan makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom za primenu u lečenju infektivnih bolesti kod subjekta kome je to potrebno. U drugom tehničkom rešenju infektivna bolest je izazvana virusom. U drugom tehničkom rešenju virus je odabrano od HIV-a, Hepatitisa A, Hepatitisa B, Hepatitisa C, herpes virusa, i influenze.

[0018] U drugom tehničkom rešenju predmetna objava obezbeđuje jedan ili više makrocikličnih peptida u skladu sa pronalaskom za primenu u lečenju septičnog šoka kod subjekta kome je to potrebno.

[0019] U drugom tehničkom rešenju predmetna objava obezbeđuje najmanje jedan makrociklični peptidi u skladu sa pronalaskom za primenu u blokiranju interakcija PD-L1 sa PD-1 i/ili CD80 kod subjekta.

[0020] Predmetna objava stavlja na uvid javnosti metode primene makrocikličnih peptida predmetne objave za ublažavanje i/ili lečenje hiperproliferativnih poremećaja i/ili virusnih poremećaja.

[0021] Predmetna objava stavlja na uvid javnosti metodu modulisanja imunog odgovora kod subjekta koja obuhvata administriranje subjektu jednog ili više makrocikličnih peptida koji sadrže sekvencu odabranu od peptida opisanih ovde.

[0022] Predmetna objava stavlja na uvid javnosti metodu poboljšanja, stimulisanja, ili povećanja imunog odgovora kod subjekta koja obuhvata administriranje subjektu jedanog ili više makrocikličnih peptida koji sadrže sekvencu odabranu od onih opisanih ovde.

[0023] Predmetna objava stavlja na uvid javnosti metodu za promociju inhibicije imunog sistema rasta tumorskih ćelija koja subjekta, koja obuhvata administriranje subjektu terapijski efikasne količine jednog ili više makrocikličnih peptida koji sadrže sekvencu odabranu od onih peptida opisanih ovde.

[0024] Predmetna objava stavlja na uvid javnosti metodu lečenja infektivane bolesti u subjektu, koja obuhvata administriranje subjektu terapijski efikasne količine jednog ili više makrocikličnih peptida koji sadrži sekvencu odabranu od onih peptida opisanih ovde.

[0025] Predmetna objava je takođe usmerena na kombinacije koje sadrže sekvencu odabranu

1

od makrocikličnih peptida opisanih ovde, sa drugim agensima, kao što je antimikrobna terapija, antivirusna terapija, dodatna imunomodulatorna terapija, vakcina, ili hemoterapijski agens protiv raka.

KRATAK OPIS SLIKA

[0026]

Slika 1 - Obezbeđuje shematski prikaz PD-1/PD-L1 biohemijskog eseja vezivanja formatiranog kao homogeni vremenski-razložen fluorescentni format (HTRF - homogeneous time-resolved fluorescence format) esej korišćen za merenje sposobnosti makrocikličnih peptida da se vežu sa PD-L1.

Slika 2 - Obezbeđuje PD-1/PD-L1 doza-odgovor krive kontrolnih antitela za HTRF korišćene da se izmeri sposobnost makrocikličnih peptida da se vežu sa PD-L1.

Slika 3 - Obezbeđuje PD-1/PD-L1 HTRF doza-odgovor krive za reprezentativne makrociklične peptide predmetne objave.

Slika 4 - HTRF panel selektivnosti. Kao što je prikazano, podaci pokazuju da se makrociklični peptidi vezuju za PD-L1 jer oni interferiraju sa PD-L1 vezivanjem na PD-1 i CD80, ali njihovo vezivanje je selektivno jer peptidi ne blokiraju PD-1/PD-L2 ili CD80/CTLA4 interakcije. Slika 5 – Esej vezivanja ćelija odabranih makrocikličnih peptida predmetne objave. Kao što je prikazano, makrociklični peptidi predmetne objave blokiraju vezivanje rekombinantnog PD-L1-Ig za Jurkat-PD-1 ćelije, i takođe blokiraju vezivanje rekombinantnog PD-1-Ig za ili L2987 (ćelijska linija adenokarcinoma sa endogenom PD-L1 ekspresijom) ili LK35.2-hPD-L1 (mišja B ćelijska linija koja prekomerno eksprimira hPD-L1. Anti-PD-Ll antitelo je interno antitelo koje je razvila Bristol-Myers Squibb kompanija).

Slika 6 – Esej ćelijskog vezivanja kontrolnog antitela. Kao što je prikazano, kontrolna antitela (anti-PD-1 i anti-PD-Ll) blokiraju vezivanje rekombinantnog PD-1-Ig (fikoeritrin, PE -phycoerythrin, obeležen) za LK35.2-hPD-L1 ćelije.

Slike 7 - Esej ćelijskog vezivanja odabranih makrocikličnih peptida predmetne objave. Kao što je prikazano, makrociklični peptidi blokiraju vezivanje rekombinantnog PD-1-Ig (PE obeležen) za LK35.2-hPD-L1 ćelije.

Slika 8 - Esej vezivanja biotinilovanog jedinjenja br. 71 / PD-L1. Kao što je prikazano, makrociklični peptidi jedinjenja Br. 99, 2, i 1 su sposobni da blokiraju vezivanje peptida biotinilovanog jedinjenja Br.71 za PD-L1 korišćenjem HTRF eseja. Ovi rezultati sugerišu da se ovi peptidi vezuju za ista mesta vezivanja.

Slika 9 - Esej vezivanja biotinilovanog jedinjenja br.71 / PD-L1 - Anti-PD-Ll Antitelo. Kao što je prikazano, anti-PD-Ll monoklonsko antitelo je sposobno da blokira biotinilovano jedinjenje br. 71 za PD-L1 korišćenjem HTRF eseja. Ovi rezultati sugerišu da se ovi peptidi vezuju za ista mesta vezivanja kao anti-PD-Ll monoklonsko antitelo.

Slike 10A-C - Anti-PD-Ll antitelo i peptidi oba promovišu IFNy sekreciju sa CMV-specifičnim T ćelijama na dozno-zavisan način. Najviše robusan odgovor generisan je antitelom usmerenim na PD-L1 (MDX-1105) (Anti-PD-1 Ab#1, ECso 0.6nM; SLIKA 10A) zatim sa jedinjenjem Br.

71 (ECso 300nM; SLIKA 10B), Jedinjenjem br. 1 (EC50400nM), Jedinjenjem br. 2 (ECso 400nM), i Jedinjenjem br. 99 (ECso >10,000nM). Numerički EC50rezultati za MDX-1105 i Jedinjenje Br.71, Jedinjenje Br.1, Jedinjenje Br.2, i Jedinjenje Br.99 su obezbeđeni na slici 10C. Ovi rezultati sugerišu da PD-L1 vezivanje inhibitora makrocikličnih peptida predmetne objave može da poboljša IFNy oslobađanje u memorijskoj T ćelijskoj populaciji nastalo prethodnom izloženošću perzistentnom antigenu.

Slika 11 - Anti-PD-Ll antitelo makrociklični peptidi oba promovišu IFNy sekreciju sa HIV-specifičnim T ćelijama na dozno-zavisan način. Srednja vrednost IFNy ćelija koje formiraju mrlju (SFC - spot forming cells) po bunariću je izračunata iz bunarića u duplikatu i bilo koja pozadina prisutna u nestimulisanim bunarićima (< 25 SFC) je oduzeta. Podaci su takođe predstavljeni kao faktor povećanja u odnosu na DMSO kontrolni tretman. Anti-PD-Ll antitelo i peptid oba poboljšavaju IFNy sekreciju pomoću HIV-specifičnih T ćelija koje reaguju na najmanje 1 od 6 HIV-Gag antigen pulova. Ovi rezultati pokazuju da PD-L1 vezivanje sa peptidnim inhibitorom može poboljšati IFNy oslobađanje iz T ćelijske populacije koja reguje na tekuću hroničnu virusnu infekciju, sličnu anti-PD-Ll antitelu.

[0027] U skladu sa predmetnom objavom, otkrili smo peptide koji se specifično vezuju za PD-L1 i sposobni su da inhibiraju interakciju PD-L1 sa PD-1 i CD80. Ovi makrociklični peptidi pokazuju in vitro imunomodulatornu efikasnost tako čineći ih terapijskim kandidatim za lečenje raznih bolest uključujući kancer i infektivnu bolest.

[0028] Termini "specifično vezivanje" ili "specifično vezuju" odnose se na interakciju između proteina i vezujućeg molekula, kao što je jedinjenje ili ligand. Interakcija je zavisna od prisustva određene strukture (tj., mesta vezivanja enzima, antigenske determinante ili epitopa) proteina koji je prepoznat vezujućim molekulom. Na primer, ako jedinjenje ima specifično vezivanje za mesto "A" vezivanja proteina, prisustvo jedinjenja u reakciji koja sadrži protein uključujući mesto A vezivanja, i obeležen peptid koji se specifično vezuje za mesto A vezivanja proteina će smanjiti količine obeleženog peptida vezanog za protein. U suprotnosti, nespecifično vezivanje jedinjenja za protein ne rezultuje koncentracijom-zavisnom premeštanju obeleženih peptida iz proteina.

[0029] Drugo tehničko rešenje je farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan od makrocikličnih peptida pronalaska.

[0030] Drugo tehničko rešenje je usmereno na farmaceutsku kombinaciju koja sadrži makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom, i najmanje jedan terapijski agens odabran iz grupe koja se sastoji od antimikrobijalnog, antiviralnog, anti-kancerskog, agensa antidijabetskog agensa, agensa protiv gojaznosti, anti-hipertenzivnog agensa, anti-aterosklerotskog agensa i agensa za snižavanje lipida.

[0031] Drugo tehničko rešenje je usmereno na farmaceutsku kombinaciju makrocikličnog peptida u skladu sa pronalaskom, sa drugim agensom ovde stavljenim na uvid javnosti.

[0032] Drugo tehničko rešenje je usmereno na makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom za primenu u lečenju ili odlaganju progresije ili početka kancera i/ili poremećaja virologije.

[0033] Predmetna objava podrazumeva se da uključuje sve izotope atoma koji se javljaju u predmetnom jedinjenu. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj ali različite masene brojeve. Kao opšti primer i bez ograničavanja, izotopi vodonika uključuju deuterijum i tricijum. Izotopi ugljenika uključuju<13>C i<14>C. Izotopno-obeležena jedinjenja pronalaska mogu generalno biti pripremljena konvencionalnim tehnikama poznatim prosečnim poznavaocima oblasti ili procesima analognim onima opisanim ovde, korišćenjem odgovarajućih izotopno-obeleženih reagenasa umesto neobeleženih reagenasa koji se inače koriste. Takva jedinjenja mogu imati razne potencijalne primene, na primer kao standardi i

1

reagensi u određivanju bioloških aktivnosti. U slučaju stabilnih izotopa, takva jedinjenja mogu imati potencijal da povoljno modifikuju biološka, farmakološka, ili farmakokinetička svojstva.

[0034] Dodatni aspekt predmeta zaštite opisanog ovde je primena peptida stavljenih na uvid javnosti kao radioobeleženih liganada za razvoj eseja vezivanja liganda ili za monitornig in vivo adsorpcije, metabolizma, distribucije, vezivanja ili popunjenosti receptora, ili dispozicije jedinjenja. Na primer, makrociklični peptid opisan ovde može biti pripremljen korišćenjem radioaktivnog izotopa<125>I a rezultujući radioobeležen peptid može se koristiti za razvoj eseja vezivanja ili za studije metabolizma. Alternativno, i u istu svrhu, makrociklični peptid opisan ovde može biti konvertovan u radioobeležen oblik katalitičkom izmenom vodonika sa tricijumom (tritiation) korišćenjem metode poznate prosečnim poznavaocima u oblasti.

[0035] Makrociklični peptidi predmetne objave mogu se takođe koristiti kao agensi za PET imidžing dodavanjem radioaktivnog tragača korišćenjem metoda poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti.

[0036] Poželjno peptidi uključuju najmanje jedan od makrocikličnih peptida obezbeženih ovde i ovi peptidi mogu biti uključeni u farmaceutske kompozicije i kombinacije.

[0037] Definicije date ovde primjenjuju se, bez ograničenja, na termine koji se koriste u ovoj specifikaciji, osim ako je drugačije ograničeno u određenim slučajevima.

[0038] Oni koji imaju uobičajene veštine u oblasti hemije aminokiselina i peptida su svesni da aminokiselina uključuje jedinjenje predstavljeno opštom strukturom:

gde R i R' su kao što je objašnjeno ovde.

[0039] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "aminokiselina" kako se ovde koristi, samostalno ili kao deo druge grupe, uključuje, bez ograničavanja, amino grupu i karboksil grupu povezanu sa istim ugljenikom, označenim kao "α" ugljenik, gde R i/ili R' mogu biti prirodni ili ne-prirodni bočni lanci, uključujući vodonik. Apsolutna "S" konfiguracija na "α" ugljeniku se uobičajeno naziva "L" ili "prirodna" konfiguracija. U slučaju gde i "R" i "R'"(prim) supstituenti su jednaki vodoniku, aminokiselina je glicin i nije hiralna.

[0040] Termin "bočni lanac aminokiseline koja se javlja u prirodi ", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na bočni lanac bilo koje od aminokiselina koje se javljaju u prirodi (tj., alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin) obično u S-konfiguraciji (tj., L-aminokiselina).

[0041] Termin "bočni lanac aminokiseline koja se ne javlja u prirodi ", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na bočni lanac bilo koje od aminokiselina koje se javljaju u prirodi obično u R-konfiguraciji (tj., D-aminokiselina) ili na grupu drugu nego bočni lanac aminokiseline koja se javlja u prirodi u R- ili S-konfiguraciji (tj., D- ili L-aminokiselina, redom) odabran od: C2-C7alkenil, C1-C3alkoksiC1-C3alkil, C1-C6alkoksikarbonilC1-C3alkil, C1-C7alkil, C1-C3alkilsulfanilC1-C3alkil, amidoC1-C3alkil, aminoC1-C3alkil, azaindolilC1-C3alkil, benzotiazolilC1-C3alkil, benzotienilC1-C3alkil, benziloksiC1-C3alkil, karboksiC1-C3alkil, C3-C6cikloalkilC1-C3alkil, difenilmetil, furanilC1-C3alkil, imidazolilC1-C3alkil, naftilC1-C3alkil, piridinilC1-C3alkil, tiazolilC1-C3alkil, tienilC1-C3alkil;

bifenilC1-C3alkil gde bifenil je po izboru supstituisan sa metil grupom;

indolilC1-C3alkil, gde indolil deo je po izboru supstituisan sa jednom grupom odabranom od C1-C3alkil, karboksiC1-C3alkil, halo, hidroksi, i fenil, gde fenil je dalje po izboru supstituisan sa jednom, dve ili tri grupe nezavisno odabranim od C1-C3alkoksi, C1-C3alkil, i halo;

NR<a>R<b>(C1-C7alkil), gde R<a>i R<b>su nezavisno odabrani od vodonika, C2-C4alkeniloksikarbonil, C1-C3alkila, C1-C3alkilkarbonil, C3-C6cikloalkilkarbonil, furanilkarbonil, i fenilkarbonil. Kada alkil veznik sadrži više od jednog ugljenika dodatna NR<a>R<b>grupa može biti na lancu.

NR<c>R<d>karbonilC1-C3alkil, gde R<c>i R<d>su nezavisno odabrani od vodonika, C1-C3alkila, i trifenilmetila;

fenilC1-C3alkil gde fenil deo je po izboru supstituisan sa jednom, dve, tri, četiri ili pet grupa nezavisno odabranih od C1-C4alkoksi, C1-C4alkil, C1-C3alkilsulfonilamino, amido, amino,

1

aminoC1-C3alkil, aminosulfonil, karboksi, cijano, halo, haloC1-C3alkil, hidroksi, -NC(NH2)2, nitro, i -OP(O)(OH)2; i

fenoksiC1-C3alkil gde fenil je po izboru supstituisan sa C1-C3alkil grupom.

[0042] Termin "C2-C4alkenil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu sa ravnim ili razgranatim lancem od dva do četiri atoma ugljenika koja sadrži najmanje jednu ugljenikugljenik dvostruka vezu.

[0043] Termin "C2-C7alkenil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu sa ravnim ili razgranatim lancem od dva do sedam atoma ugljenika koja sadrži najmanje jednu ugljenikugljenik dvostruku vezu.

[0044] Termin "C2-C4alkeniloksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C2-C4alkenil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma kiseonika.

[0045] Termin "C1-C3alkoksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma kiseonika.

[0046] Termin "C1-C4alkoksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C4alkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma kiseonika.

[0047] Termin "C1-C6alkoksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C6alkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma kiseonika.

[0048] Termin "C1-C3alkoksiC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkoksi grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0049] Termin "C1-C6alkoksikarbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C6alkoksi grupu vezanu za matični molekulski segment preko karbonil grupe.

[0050] Termin "C1-C6alkoksikarbonilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C6alkoksikarbonil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

1

[0051] Termin "C1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu izvedenu iz ravnog ili razgranatog lanca zasićenog ugljovodonika koji sadrži od jednog do tri atoma ugljenika.

[0052] Termin "C1-C4alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu izvedenu iz ravnog ili razgranatog lanca zasićenog ugljovodonika koji sadrži od jednog do četiti atoma ugljenika.

[0053] Termin "C1-C6alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu izvedenu iz ravnog ili razgranatog lanca zasićenog ugljovodonika koji sadrži od jednog do šest atoma ugljenika.

[0054] Termin "C1-C3alkilkarbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko karbonil grupe.

[0055] Termin "C1-C3alkilsulfanil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma sumpora.

[0056] Termin "C1-C3alkilsulfanilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkilsulfanil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0057] Termin "C1-C3alkilsulfonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko sulfonil grupe.

[0058] Termin "C1-C3alkilsulfonilamino", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkilsulfonil grupi vezanu za matični molekulski segment preko amino grupe.

[0059] Termin "amido", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -C(O)NH2.

[0060] Termin "amidoC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na amido grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0061] Termin "amino", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -NH2.

1

[0062] Termin "aminoC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na amino grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0063] Termin "aminosulfonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na amino grupu vezanu za matični molekulski segment preko sulfonil grupe.

[0064] Termin "azaindolilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na azaindolil grupu vezanu za matični molekulski preko C1-C3alkil grupe. Azaindolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0065] Termin "benzotiazolilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benzotiazolil grupu vezanu za matični molekulski preko C1-C3alkil grupe. Benzotiazolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0066] Termin "benzotienilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benzotienil grupu vezanu za matični molekulski preko C1-C3alkil grupe. Benzotienil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0067] Termin "benziloksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benzil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma kiseonika.

[0068] Termin "benziloksiC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benziloksi grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0069] Termin "bifenilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na bifenil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Bifenil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0070] Termin "karbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -C(O)-.

[0071] Termin "karboksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -CO2H.

1

[0072] Termin "karboksiC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na karboksi grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupa.

[0073] Termin "cijano", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -CN.

[0074] Termin "C3-C6cikloalkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na zasićeni monociklični, ugljovodonični prstenast sistem koji ima tri do šest atoma ugljenika i nula heteroatoma.

[0075] Termin "C3-C6cikloalkilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C3-C6cikloalkil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0076] Termin "C3-C6cikloalkilkarbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C3-C6cikloalkil grupa vezanu za matični molekulski segment preko karbonil grupe.

[0077] Termin "furanilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na furanil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Furanil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0078] Termin "furanilkarbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na furanil grupu vezanu za matični molekulski segment preko karbonil grupe.

[0079] Termini "halo" i "halogen", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na F, Cl, Br, ili I.

[0080] Termin "haloC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu supstituisanu sa jednim, dva, ili tri halogena atoma.

[0081] Termin "halometil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na metil grupu supstituisanu sa jednim, dva ili tri halogena atoma.

[0082] Termin "hidroksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -OH.

1

[0083] Termin "imidazolilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na imidazolil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Imidazolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0084] Termin "indolilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na indolil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Indolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0085] Termin "naftilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na naftil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Naftil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0086] Termin "nitro", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -NO2.

[0087] Termin "NR<a>R<b>", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na dve grupe, R<a>i R<b>, koje su vezane za matični molekulski segment preko atoma azota. R<a>i R<b>su nezavisno odabrane od vodonika, C2-C4alkeniloksikarbonil, C1-C3alkilkarbonil, C3-C6cikloalkilkarbonil, furanilkarbonil, i fenilkarbonil.

[0088] Termin "NR<a>R<b>(C1-C3)alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na NR<a>R<b>grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0089] Termin "NR<c>R<d>", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na dve grupe, R<c>i R<d>, koje su vezane za matični molekulski segment preko atoma azota. R<c>i R<d>su nezavisno odabrane od vodonika, C1-C3alkila, i trifenilmetila.

[0090] Termin "NR<c>R<d>karbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na NR<c>R<d>grupa vezanu za matični molekulski segment preko karbonil grupe.

[0091] Termin "NR<c>R<d>karbonilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na NR<c>R<d>karbonil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

2

[0092] Termin "fenoksi", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenil grupu vezanu za matični molekulski segment preko atoma kiseonika.

[0093] Termin "fenoksiC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenoksi grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0094] Termin "fenilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe.

[0095] Termin "fenilkarbonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenil grupu vezanu za matični molekulski segment preko karbonil grupe.

[0096] Termin "piridinilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na piridinil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Piridinil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0097] Termin "sulfanil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -S-.

[0098] Termin "sulfonil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -SO2-.

[0099] Termin "tiazolilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na tiazolil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Tiazolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0100] Termin "tienilC1-C3alkil", kao što je korišćeno ovde, odnosi se na tienil grupu vezanu za matični molekulski segment preko C1-C3alkil grupe. Tienil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog pogodnog atoma u grupi.

[0101] Termin "lečenje" odnosi se na: (i) sprečavanje bolesti, poremećaja, ili stanja da se pojavi kod pacijenta koji može biti predisponiran za bolest, poremećaj, i/ili stanje ali za koje još nije dijagnostikovano da ga ima; (ii) inhibiranje bolesti, poremećaja, ili stanja, tj., zaustavljanje njenog razvoja; i (iii) ublažavanje bolesti, poremećaja, ili stanja, tj. izazivanja regresije bolesti, poremećaja, i/ili stanja i/ili simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.

[0102] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "alkil" kao što je upotrebljen ovde samostalno ili kao deo druge grupe uključuje, bez ograničavanja, ugljovodonike i sa ravnim i razgranatim lancem, koji sadrže 1 do 40 ugljenika, poželjno 1 do 20 ugljenika, poželjnije 1 do 8 ugljenika, u uobičajenom lancu, kao što su metil, etil, propil, izopropil, butil, t-butil, izobutil, pentil, heksil, izoheksil, heptil, 4,4-dimetilpentil, oktil, 2,2,4-trimetilpentil, nonil, decil, undecil, dodecil, njihovi različiti izomeri razgranatog lanca, i slično. Dalje, alkil grupe, kao što je definisano ovde, mogu po izboru biti supstituisane na bilo kom dostupnom atomu ugljenika sa jednom ili više funkcionalnih grupa obično vezanih za takve lance, kao što su, ali nije ograničeno na alkil, aril, alkenil, alkinil, hidroksi, arilalkil, cikloalkil, cikloalkilalkil, alkoksi, arilalkiloksi, heteroariloksi, heteroarilalkiloksi, alkanoil, halo, hidroksil, tio, nitro, cijano, karboksil, karbonil

karboksamido, amino, alkilamino, dialkilamino, amido, alkilamino, arilamido, heteroarilamido, azido, gvanidino, amidino, fosfonska, fosfinska, sulfonska, sulfonamido, haloaril, CF3, OCF2, OCF3, ariloksi, heteroaril, cikloalkilalkoksialkil, cikloheteroalkil i slično da formiraju alkil grupe kao što su trifluoro metil, 3-hidroksiheksil, 2-karboksipropil, 2-fluoroetil, karboksimetil, cijanobutil i slično.

[0103] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "cikloalkil" kao što je upotrebljen ovde samostalno ili kao deo druge grupe uključuje, bez ograničavanja, zasićene ili delimično nezasićene (koje sadrže 1 ili 2 dvostruke veze) ciklične ugljovodonične grupe koje sadrže 1 do 3 prstena, dodana ili fuzionisana, uključujući monociklični alkil, biciklični alkil i triciklični alkil, koji sadrže ukupno 3 do 20 ugljenika koji formiraju prstenove, poželjno 4 do 7 ugljenika, koji formiraju svaki prsten; koje mogu biti fuzionisane za 1 aromatični prsten kao što je opisano za aril, koje uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklodecil, ciklododecil, cikloheksenil,

bilo koja od ovih grupa može biti po izboru supstituisana preko bilo kog dostupnog atoma ugljenika sa 1 ili više grupa odabrano od vodonika, halo, haloalkila, alkila, haloalkila, alkoksi, haloalkoksi, alkenila, trifluorometila, trifluorometoksi, alkinila, cikloalkilalkila, fluorenila, heterocikloalkila, heterocikloalkilalkila, arila, heteroarila, arilalkila, ariloksi, ariloksialkila, arilalkoksi, ariltio, arilazo, heteroarilalkila, heteroarilalkenila, heteroarilheteroarila, heteroariloksi, hidroksi, nitro, okso, cijano, karboksil, karbonil

karboksamido, amino, supstituisan amino gde amino uključuje 1 ili 2 supstituenta (koji su alkil, aril ili bilo koji od drugih jedinjenja pomenutih u definicijama), amido, azido, gvanidino, amidino, fosfonska, fosfinska, sulfonska, sulfonamido, tiol, alkiltio, ariltio, heteroariltio, ariltioalkil, alkoksiariltio, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkilaminokarbonil, arilaminokarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, arilsulfinil, arilsulfinilalkil, arilsulfonilamino ili arilsulfonaminokarbonil, ili bilo kojih alkil supstituenata kako je gore navedeno.

[0104] Termin "aril" kao što je upotrebljen ovde samostalno ili kao deo druge grupe odnosi se, bez ograničavanja, na monociklične i biciklične aromatične grupe koje sadrže 6 do 10 ugljenika u delu prstena (kao što je fenil ili naftil) i mogu po izboru da uključuju jedan do tri dodatna prstena fuzionisana za "aril" (kao što su aril, cikloalkil, heteroaril ili heterocikloalkil prstenovi) i mogu po izboru biti supstituisane preko bilo kog dostupnog atoma ugljenika sa 1 ili više grupa odabranih od vodonika, alkila, halo, haloalkila, alkoksi, haloalkoksi, alkenila, trifluorometila, trifluorometoksi, alkinila, cikloalkilalkila, fluorenila, heterocikloalkila, heterocikloalkilalkila, arila, heteroarila, arilalkila, ariloksia, ariloksialkila, arilalkoksi, ariltio, arilazo, heteroarilalkila, heteroarilalkenila, heteroariloksi, heteroarilalkiloksi, heteroarilalkiloksialkila, hidroksi, nitro, okso, cijano, amino, supstituisan amino gde amino uključuje 1 ili 2 supstituenta (koji su alkil, cikloalkil, heterocikloalkil, heteroaril, ili aril ili bilo koji od drugih aril jedinjenja pomenutih u definicijama), tiol, alkiltio, ariltio, heteroariltio, ariltioalkila, alkoksiariltio, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkilaminokarbonil, cikloalkilaminokarbonil, arilaminokarbonil, heteroarilaminokarbonil, heteroarilalkilaminokarbonil alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, arilsulfinil, arilsulfinilalkil, arilsulfonilamino ili arilsulfonaminokarbonil, ili bilo kojih alkil supstituenata kako je gore navedeno.

2

[0105] Termin "arilalkil" kao što je korišćeno ovde samostalno ili kao deo druge grupe odnosi se, bez ograničavanja, na alkil grupe kao što je definisano iznad koje imaju aril, kao što je benzil, fenetil ili naftilpropil, gde navedene aril i/ili alkil grupe mogu po izboru biti supstituisane kao što je definisano iznad.

[0106] Termin "alkoksi", "ariloksi", "heteroariloksi", "arilalkiloksi", ili "heteroarilalkiloksi" kao što je upotrebljen ovde samostalno ili kao deo druge grupe uključuje, bez ograničavanja, alkil ili aril grupu kao što je definisano iznad povezano preko atoma kiseonika.

[0107] Termin "heterociklo", "heterocikl", "heterociklil" ili "heterociklični", kao što je korišćeno ovde, predsravlja, bez ograničavanja, nesupstituisan ili supstituisan stabilan 4-, 5-, 6-, ili 7-člani monociklični prstenast sistem koji može biti zasićen ili nezasićen, i koji se sastoji od atoma ugljenika i od jednog do četiri heteroatoma odabranih od azota, sumpora, kiseonika i/ili SO ili SO2grupe, gde heteroatomi azot i sumpor mogu po izboru biti oksidovani, a azot heteroatom može po izboru biti kvaternizovan. Heterociklični prsten može biti vezan na bilo kom heteroatomu ili atomu ugljenika što rezultuje u kreiranju stabilne strukture. Primeri takvih heterocikličnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofenil pirolidinil, piperidinil, piperazinil, oksopirolidinil, oksopiperazinil, oksopiperidinil i oksadiazolil. Po izboru heterociklo grupa može biti supstituisana sa jednom ili više funkcionalnih grupa, kao što su one opisane za "alkil" ili "aril".

[0108] Termin "heterocikloalkil" kao što je korišćeno ovde samostalno ili kao deo druge grupe odnosi se, bez ograničavanja, na alkil grupe kao što je definisano iznad koje imaju heterocikloalkil supstituent, gde navedene "heterociklo" i/ili alkil grupe mogu po izboru biti supstituisane kao što je definisano iznad.

[0109] Termin "heteroaril" kao što je korišćeno ovde odnosi se, bez ograničavanja, na 5-, 6- ili 7-člani aromatični heterociklični prsten koji sadrži jedan ili više heteroatoma odabranih od azota, sumpora, kiseonika i/ili SO ili SO2grupe. Takvi prstenovi mogu biti fuzionisani za drugi aril ili heteroaril prsten i uključuju moguće N-okside; primeri takvih heteroaril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, furan, pirol, tiofen, piridin, pirimidin, pirazin, piridazin, izoksazol, oksazol, imidazol i slično. Po izboru heteroaril grupa može biti supstituisana sa jednom ili više funkcionalnih grupa obično vezanih za takve lance, kao što su one opisane za "alkil" ili "aril".

[0110] Termin "heteroarilalkil" kao što je korišćeno ovde samostalno ili kao deo druge grupe odnosi se, bez ograničavanja, na alkil grupe kao što je definisano iznad koje imaju heteroaril supstituent, gde navedene heteroaril i/ili alkil grupe mogu po izboru biti supstituisane kao što je definisano iznad.

[0111] "Inhibitorna koncentracija" PD-1/PD-L1 inhibitora nameravano je da označava koncentraciju pri kojoj jedinjenje prikazano u eseju objave inhibira merljiv procenat interakcije PD-1 sa PD-L1. Primeri vrednosti "inhibitorne koncentracije" su u opsegu od IC50do IC90, i poželjno su, IC50, IC60, IC70, IC80, ili IC90, što predstavlja 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% smanjenje PD-1/PD-L1 aktivnosti vezivanja, redom. Poželjnije, "inhibitorna koncentracija" je merena kao IC50vrednost. Razume se da je druga oznaka za IC50e polumaksimalna inhibitorna koncentracija.

[0112] Vezivanje makrocikličnih peptida za PD-L1 može se meriti, na primer, metodama kao što su homogena vremenski razložena fluorescencija (HTRF - homogeneous time-resolved fluorescence), rezonancija površinskog plazmona (SPR - Surface Plasmon Resonance), izotermalna titraciona kalorimetrija (ITC - isothermal titration calorimetry), nuklearno magnetna rezonantna spektroskopija (NMR), i slično. Dalje, vezivanje makrocikličnih peptida za PD-L1 eksprimiranih na površini ćelija može se meriti kao što je opisano ovde u esejima ćelijskog vezivanja.

[0113] Administracija terapijskog agensa opisanog ovde uključuje, bez ograničavanja, administraciju terapijski efikasne količine terapijskog agensa. Termin "terapijski efikasna količina" kao što je korišćeno ovde odnosi se, bez ograničavanja, na količinu terapijskog agensa za lečenje ili sprečavanje stanje koje se može lečiti administriranjem kompozicije PD-1/PD-L1 vezujućih inhibitora opisanih ovde. Ta količina je količina dovoljna da se ispolji detektabilni terapijski ili preventivni ili poboljšani efekat. Efekat može da uključuje, na primer i bez ograničavanja, lečenje ili prevenciju stanja navedenih ovde. Precizna efikasna količina za subjekat će zavisiti od veličine i zdravlja subjekta, prirode i stepena stanja koje se leči,

2

preporuka lekara, i terapija kombinacija terapija odabranih za administraciju. Stoga, nije korisno precizirati tačne efikasne količine unapred.

[0114] Makrociklični peptidi predmetne objave pokazuju potentnu aktivnost vezivanja za PD-L1, oba u HTRF esejima, kao i esejima ćelijskog vezivanja. Pored toga, makrociklični peptidi takođe demonstriraju biološku aktivnost u opozivu CMV-a i HIV Elispot esejima koji demonstriraju njihovu korisnost u ublažavanju i/ili lečenju hiperproliferativnih poremećaja, kao što su kancer, i indikacije virologije, uključujući HIV.

[0115] U drugom aspektu, objava pripada makrocikličnim peptidima predmetnog pronalaska za primenu u inhibiranje rasta ćelija tumora kod subjekta. Kao što je ovde pokazano, makrociklični peptidi predmetne objave su sposobni da se vezuju za PD-L1, ometajući interakciju između PD-L1 i PD-1, kompetirajući sa vezivanjem PD-L1 sa anti-PD-1 monoklonskim antitelima koja su poznata da blokiraju interakciju sa PD-1, poboljšavajući CMV-specifičnu T ćelijsku IFNy sekreciju, i poboljšanje HIV- specifične T ćelijske IFNg sekrecije. Kao rezultat, makrociklični peptidi predmetne objave su korisni za modifikovanje imunog odgovora, lečenje bolesti kao što je kancer ili infektivna bolest, stimulisanje zaštitnog autoimunog odgovora ili da stimulišu antigen-specifične imune odgovore (npr., koadministracijom PD-L1 blokirajućih peptida sa antigenom od interesa).

[0116] Da bi se predmetna objava mogla lakše razumeti, prvo se definišu određeni termini. Dodatne definicije su izložene u detaljnom opisu.

[0117] Termini "ligand 1 programirane smrti", "ligand 1 programirane ćelijske smrti", "Protein PD-L1", "PD-L1", "PDL1", "PDCDL1", "hPD-L1", "hPD-LI", "CD274" i "B7-H1" su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, vrste homologa humanog PD-L1, i analoga koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa PD-L1. Potpuna PD-L1 sekvenca može se pronaći pod GENBANK® pristupnim Br. NP_054862.

[0118] Termini "programirana smrt 1", " programirana ćelijska smrt 1", "Protein PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" i "hPD-I" su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, vrste homologa humanog PD-1, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički

2

epitop sa PD-1. Potpuna sekvenca PD-1 može se pronaći pod GENBANK® pristupnim Br. U64863.

[0119] Termini "citotoksični antigen-4 povezan sa T limfocitima", "CTLA-4", "CTLA4", "CTLA-4 antigen" i "CD152" (videti, npr., Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999)) su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, vrste homologa humanog CTLA-4, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa CTLA-4 (videti, npr., Balzano, Int. J. Kancer Suppl., 7:28-32 (1992)). Potpuna sekvenca nukleinske kiseline CTLA-4 može se pronaći pod GENBANK® pristupnim Br. L15006.

[0120] Termin "imuni odgovor" odnosi se na delovanje, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita, i rastvorljivih makromolekula proizvedenih od ćelija navedenih iznad ili jetre (uključujući makrociklične peptide, citokine, i komplement) što rezultuje selektivnim oštećenjem, uništavanjem, ili eliminacijom iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva zaraženih patogenima, kanceroznim ćelijama, ili, u slučajevima autoimunosti ili patoloških inflamacija, normalnim humanim ćelijama ili tkivima.

[0121] "Put signalne transdukcije" odnosi se na biohemijsku vezu između razne signalne transdukcione molekule koji imaju ulogu u transmisiji signala od jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Kao što je korišćeno ovde, izraz "receptor površine ćelije" uključuje, na primer, molekule i komplekse molekula sposobne da prime signal i prenesu takav signal kroz plazma membranu ćelije. Primer "receptora površine ćelije" predmetne objave je PD-1 receptor.

[0122] Termin "derivati makrocikličnih peptida" odnosi se na bilo koji modifikovan oblik makrocikličnih peptida ovde stavljenih na uvid javnosti, npr., mutacije, izoforme, peptide sa izmenjenim kosturom veznika, konjugate sa antitelom i/ili drugim agensom, itd..

[0123] Kao što je korišćeno ovde, makrociklični peptid predmetne objave koji "specifično se veže za humani PD-L1" nameravano je da se odnosi na makrociklični peptid koji se vezuje za humani PD-L1 sa IC50od manje od oko 200 nM, manje od oko 150 nM, manje od oko 100 nM, manje od oko 80 nM, manje od oko 60 nM, manje od oko 40 nM, manje od oko 20 nM, manje od oko 15 nM, manje od oko 10 nM, manje od oko 5 nM, manje od oko 1 nM, ili manje. U

2

ovom kontekstu, termin "oko" će se tumačiti tako da znači bilo gde između ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 nM manje ili više od citirane količine.

[0124] Termin "lečenje" ili "terapija" odnosi se na administriranje aktivnih agensa u svrhu izlečenja, zaceljenja, ublažavanja, olakšavanja, izmene, popravljanja, poboljšanja, unapređenja ili uticaja na stanje (npr. bolest), simptome stanja, ili sprečavanja ili odlaganja početka simptoma, komplikacija, biohemijske indikacije bolesti, ili na drugi način zaustave ili inhibiraju dalji razvoj bolesti, stanja ili poremećaja na statistički značajan način.

[0125] "Neželjeni događaj" (AE – adverse event) kao što je korišćeno ovde je svaki nepovoljni i uglavnom nenamerni, čak i nepoželjni, znak (uključujući abnormalan laboratorijski nalaz), simptom ili bolest povezana sa primenom medicinskog lečenja. Na primer, neželjeni događaj može biti povezan sa aktivacijom imunog sistema ili ekspanzijom ćelija imunog sistema (npr., T ćelija) kao odgovor na tretman. Medicinsko lečenje može imati jedan ili više povezanih AE i svaki AE može imati isti ili različit nivo ozbiljnosti. Upućivanje na metode koje mogu "izmeniti neželjene događaje" znači režim lečenja koji smanjuje učestalost i/ili ozbiljnost jednog ili više AE povezanih sa primenom različitog režima lečenja.

[0126] Kao što je korišćeno ovde, "hiperproliferativna bolest" odnosi se na stanja u kojima je ćelijski rast povećava preko normalnih nivoa. Na primer, hiperproliferativna bolest ili poremećaji uključuju malignu bolest (npr., ezofagealni kancer, kancer kolona, kancer bilijarnog trakta) i nemalignu bolest (npr., ateroskleroza, benigna hiperplazija, i benigna hipertrofija prostate).

[0127] Kao što je korišćeno ovde, "oko" ili "koja se sastoji u osnovi od' označava unutar prihvatljivog opsega greške za određenu vrednost kao što je određeno od prosečnog poznavaoca u oblasti, što će delom zavisiti od toga kako je vrednost merena ili određena, tj., ograničenjima sistema za merenje. Na primer, "oko" ili " koja se sastoji u osnovi od' može da označava vrednost unutar jednog ili više od jednog standardnog odstupanja po praksi u oblasti. Alternativno, "oko" ili "koja se sastoji u osnovi od' može da označava opseg od do 20%. Osim toga, naročito u odnosu na biloške sisteme ili procese, termini mogu da označavaju do reda veličine ili do 5 puta veće vrednosti. Kada su određene vrednosti obezbeđene u prijavi i

2

patentnim zahtevima, ukoliko nije drugačije navedeno, značenje "oko" ili "koja se sastoji u osnovi od' bi trebalo pretpostaviti da je unutar prihvatljivog opsega greške za tu određenu vrednost.

[0128] Kao što je opisan ovde, bilo koji opseg koncentracije, procentualni opseg, opseg odnosa ili opseg celog broja treba podrazumevati da uključuje vrednost bilo kojeg celog broja unutar navedenog raspona i, kada je prikladno, njegove frakcije (kao što je jedna desetina i jedna stotina celog broja), osim ako nije drugačije naznačeno.

Kompetetivni eseji

[0129] Predmetna objava je takođe usmerena na makrociklične peptide koji su sposobni da kompetiraju sa vezivanjem referentnog anti-PD-L1 antitela (MDX-1105) sa najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, i najmanje oko 100%. Takvi makrociklični peptidi mogu da dele strukturnu homologiju sa jednim ili više makrocikličnih peptida ovde stavljenih na uvid javnosti, uključujući mutantnu, konzervativnu supstituciju, funkcionalnu supstituciju, i delecione oblike, pod uslovom da se specifično vežu za PD-L1. Na primer, ako se makrociklični peptid veže za isti region od PD-L1 kao referentno anti-PD-L1 antitelo, makrociklični peptid treba da se veže za epitop od PD-L1 koji se najmanje preklapa sa PD-L1 epitopom za koje se anti-PD-L1 monoklonsko antitelo veže. Preklapajući region može da bude u opsegu od jednog aminokiselinskog ostatka do nekoliko stotina aminokiselinskih ostataka. Makrociklični peptid treba tada da kompetira sa i/ili blokira vezivanje anti-PD-L1 monoklonskog antitela za PD-L1 i time smanji vezivanje anti-PD-L1 monoklonskog antitela za PD-L1, poželjno najmanje oko 50% u kompetetivnom eseju. (Videti Slika 9).

[0130] Anti-PD-L1 antitela koja se mogu koristiti kao referentna antitela u svrhe kompetetivnog eseja su poznata u oblasti. Na primer, sledeća reprezentativna anti-PD-L1 antitela mogu se koristiti: MDX-1105 (BMS); L01X-C (Serono), L1X3 (Serono), MSB-0010718C (Serono), i PD-L1 Probody (CytomX), i PD-L1 antitela stavljena na uvid u suvlasničkoj WO 2007/005874.

[0131] Anti-PD-1 antitela koja se mogu koristiti kao referentna antitela u svrhe kompetetivnog

2

eseja su poznata u oblasti. Na primer, sledeća reprezentativna anti-PD-1 antitela mogu se koristiti: nivolumab (BMS); 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 i 5F4 svaki stavljen na uvid javnosti u suvlasničkom U.S. patentu br.8,008,449 (BMS), MK-3475 (Merck, stavljen na uvid javnosti u U.S. patentu br.8,168,757), i antitela stavljena na uvid javnosti u U.S. patentu br.7,488,802.

Farmaceutske kompozicije

[0132] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje kompoziciju, npr., farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedan ili kombinaciju makrocikličnih peptida, ili antigen-vezujći(e) deo(delove) istih, predmetne objave, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jedan ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) makrocikličnih peptida, ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula objave. Na primer, farmaceutska kompozicija objave može da sadrži kombinaciju makrocikličnih peptida (ili imunokonjugata ili bispecifičnih) koji se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koja imaju komplementarne aktivnosti.

[0133] Farmaceutska kompozicije objave takođe mogu biti administrirane u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovanoj sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje makrociklični peptid kombinovan sa najmanje jednim drugim antiinflamatornim ili imunosupresantskim agensom. Primeri terapijskih agenasa koji se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji su opisani detaljnije ispod u odeljku o primenama makrocikličnih peptida objave.

[0134] Kao što je korišćeno ovde, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifugalne agense, izotonične i za odlaganje apsorpcije agense, i slično koji su fizioločki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu administraciju(npr., injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta administracije, aktivno jedinjenje, tj., makrociklični peptid, imunokonjugat, ili bispecifični molekul, može biti obložen materijalom da zaštiti jedinjeje od delovanja kiselina ili drugih prirodnih stanja koja mogu da inaktivišu jedinjenje.

[0135] Farmaceutska jedinjenja objave mogu da uključuju jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one izvedene od netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, hidrobromna, hidrojodna, fosforasta i slično, kao i od netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanoične kiseline, hidroksi alkanoične kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i od netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0136] Farmaceutska kompozicija objave takođe može da uključuje farmaceutski prihvatljiv anti-oksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidansa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiseloina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovan hidroksianizol (BHA), butilovan hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) metal helirajuće agense, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0137] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu upotrebiti u farmaceutskim kompozicijama objave uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektibilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može se održavati, na primer, primenom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzija, i primenom surfaktanata.

[0138] Ove kompozicije mogu takože da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, agensi za kvašenje, emulgatori i disperzoioni agensi. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se

1

osigurati i procedurama sterilizacije, supra, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Može takože biti poželjno da se uključe isotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično u kompozicije. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koja odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0139] Farmaceutski prihvatljiv nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne prahove za, neposredno pre, pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzije. Primena takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti. Osim ako je bilo koji uobičajeni medijum ili agens nespojiv sa aktivnim jedinjenjem, njegova primena u farmaceutskim kompozicijama objave se razmatra. Dopunska aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u kompozicije.

[0140] Terapijska kompozicije tipično mora buiti sterilna i stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili bilo koja naručena struktura pogodna visokim konventracijama leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može biti održavana, na primer, primenom sredstva za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i primenom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju agenasa koja odlažu apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatin.

[0141] Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporacijom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednom ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, praćeno sterilizacijonom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporacijom aktivnog jedinjenja u sterilni transporter koji sadrži bazni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, poželjne metode pripremanja su

2

vakuum sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno-filtriranog rastvora istog.

[0142] Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača da se proizvede pojedinačni dozni oblik će varirati u zavisnosti od subjekta koji se leči, posebnog načina administracije. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača da se proizvede pojedinačni dozni oblik će generalno biti ta količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenta do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70 procenta, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenta aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0143] Dozni režimi su prilagođeni da obezbede optimalan željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, jedan bolus može biti administriran, nekoliko podeljenih doza može biti administrirano tokom vremena ili doza može biti srazmerno smanjena ili povećana što ukazuje na potrebe terapijske situacije. Naročito je pogodno formulisati parentalnu kompoziciju u obliku dozne jedinice za lakšu administraciju i ujednačenost doze. Oblik dozne jedinice kao što je korišćeno ovde odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao unitarne doze za subjekte koji će se lečiti; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat povezan sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za oblike dozne jedinice objave su diktirane i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapijskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja svojstvena oblasti tehnike sjedinjavanja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.

[0144] Za administraciju makrocikličnog peptida, doza je u opsegu od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg, telesne mase domaćina. Na primer doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne mase, 1 mg/kg telesne mase, 3 mg/kg telesne mase, 5 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili unutar opsega od 1-10 mg/kg. Režim lečenja uzet kao primer podrazumeva administraciju jednom dnevno, dvonedeljno, tronedeljno, nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u 3 meseca ili jednom u tri do 6 meseci. Poželjni dozni režimi za makrociklični peptid objave uključuju 1 mg/kg telesne mase ili 3 mg/kg telesne mase putem intravenske administracije, sa antitelom koje je dato korišćenjem jednog od sledećih doznih rasporeda: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne mase jednom a zatim 1 mg/kg telesne mase svake tri nedelje.

[0145] U nekim metodama, dva ili više makrocikličnih peptida sa različitim specifičnostima vezivanja su administrirana istovremeno, u tom slučaju doza svakog administriranog jedinjenja je unutar naznačenih opsega. Jedinjenja su obično administrirana u više navrata. Intervali između pojedinačne doze mogu biti, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca ili godišnje. Intervali takođe mogu biti neredovni što se pokazuje merenjem nivoa makrocikličkog peptida u krvi kod ciljnog antigena kod pacijenta. U nekim metodama, doziranje se prilagođava tako da se postigne koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 .mu.g/ml i u nekim metodama oko 25-300.mu.g/ml.

[0146] Alternativno, makrociklični peptid može biti administriran kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u tom slučaju potrebna je ređa administracija. Doza i učestalost varira u zavisnosti od polu-života makrocikličnog peptida u pacijentu. Doza i učestalost administriranja mogu da variraju u zavisnosti da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza je administrirana u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju lečenje tokom ostatka svog života. U terapijskim primenama, relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna dok progresija bolesti ne bude smanjena ili prekinuta, a poželjno dok pacijent ne pokaže delimičnu ili potpunu amelioraciju simptoma bolesti. Posle toga, pacijentu se može administrirati profilaktički režim.

[0147] Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetne objave mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompozicije, i način administracije, a da nisu toksični za pacijenta. Odabrani nivo doziranja će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog pronalaska, ili njegovog estra, soli ili amida, puta administracije, vremena administracije, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova,

4

jedinjenja i/ili materijala korišćenih u kombinaciji sa određenim upotrijebljenim kompozicijama, starosti, pola, mase, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicini.

[0148] "Terapijski efikasna doza" makrocikličnog peptida objave poželjno rezultuje smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, dovećanjem učestalosti i trajanja perida bez simptoma bolesti, ili sprečavanjem oštećenja ili invaliditeta zbog patnje od bolesti. Na primer, za lečenje tumora, "terapijski efekasna doza" poželjno inhibira ćelijski rast ili rast tumora najmanje oko 20%, poželjnije najmanje oko 40%, čak poželjnije najmanje oko 60%, i još poželjnije najmanje oko 80% u odnosu na subjekte koji nisu lečeni. Sposobnost jedinjenje da inhibira rast tumora i/ili HIV može se proceniti u sistemu životinjskog modela predskazujući efikasnost u humanim tumorima ili viralnoj efikasnosti. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije može se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da ispolji, takvu inhibiciju in vitro esejima poznatim prosečnim praktičarima. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora, smanji viralno opterećenje, ili drugačije poboljša simptome kod subjekta. Prosečan poznavalac u oblasti tehnike bi bio u mogućnosti da odredi takve količine na osnovu takvih faktora kao što su veličina subjekta, ozbiljnost simptoma kod subjekta, i određene odabrane kompozicije ili put administracije.

[0149] U drugom aspektu, trenutna objava obezbeđuje farmaceutski kit delova koji sadrži makrociklični peptid i anti-CTLA-4 antitelo, kao što je opisano ovde. Kit može takođe dalje da sadrži uputstva za primenu u lečenju hiperproliferativne bolesti (kao što je kancer kao što je opisano ovde) i/ili anti-viralne bolesti.

[0150] Kompozicija predmetne objava može biti administrirana preko jednog ili više puteva administracija korišćenjem jedne ili više raznih metoda poznatih u oblasti tehnike. Kao što će ceniti stručan poznavalac, put i/ili način administracije će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi administracije za makrociklične peptide objave uključuju intravensku, intramuskularnu, intradermalnu, intraperitonealnu, subkutanu, spinalnu ili druge parenteralne puteve administracija, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna administracija" kao što je korišćeno ovde označava načine administracija druge od enteralne i topikalne administracije, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničavanja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0151] Alternativno, makrociklični peptid objave može biti administriran preko neparenteralnog puta, kao što je topikalnim, epidermalnim ili mukozalnim putem administracije, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

[0152] Aktivna jedinjenja mogu biti pripremljena sa nosačima koja će zaštiti jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Biodegradabilni, biokompatibilni polimeri mogu biti korišćeni, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktična kiselina. Mnoge metode za pripremanje takvih formulacija su patentirane ili generalno poznate prosečnim poznavaocima u oblasti. Videti, npr., Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Njujork (1978).

[0153] Terapijske kompozicije mogu biti administrirane sa medicinskim uređajima poznatim u oblasti. Na primer, u poželjnom tehničkom rešenju, terapijska kompozicija objave može biti administrirana sa hipodermičkim injekcionim uređajem bez igle, kao što su uređaji stavljeni na uvid javnosti u U.S. patentima br. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanta i modula korisnih u predmetnoj objavi uključuju: U.S. patent br.4,487,603, koji stavlja na uvid javnosti implantabilnu mikroinfuzijsku pumpu za izdavanje lekova kontrolisanom brzinom; U.S. patent br. 4,486,194, koji stavlja na uvid javnosti terapijski uređaj za administriranje lekova preko kože; U.S. patent br.

4,447,233, koji stavlja na uvid javnosti pumpu za infuziju lekova za isporuku leka sa preciznom brzinom infuzije; U.S. patent br.4,447,224, koji stavlja na uvid javnosti implatibilan infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za kontinuiranu isporuku leka; U.S. patent br.4,439,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporuku leka koji ima kompartmente sa više komora; i U.S. patent br.4,475,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporuku leka. Mnogi drugi takvi implanti, sistemi za isporuku, i moduli su dobro poznati prosečnim poznavaocima u oblasti.

[0154] U određenim tehničkim rešenjima, makrociklični peptidi objave mogu biti formulisani da osiguraju pravilnu distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB - bloodbrain barrier) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Da se osigura da terapijska jedinjenja objave pređu BBB (ako je poželjno), ona mogu biti formulisani, na primer, u lipozomima. Za metode proizvodnje lipozoma, videti, npr., U.S. patente br.

4,522,811, 5,374,548, i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više segmenata koji se selektivno prenose u specifične ćelije ili organe, time poboljšavajući ciljne isporuke leka (videti, npr., Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29:685 (1989)). Ciljni segmenti uzeti kao primer uključuju folat ili biotin (videti, npr., U.S. patent br.5,416,016 od Low et al.); manozide (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153:1038 (1988)); makrociklične peptide (Bloeman, P.G. et al., FEBS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al., Antimicrob. Agenss Chemother., 39:180 (1995)); receptor surfaktant proteina A (Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233:134 (1995)); p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem., 269:9090 (1994)); videti takođe Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994); Killion, J.J. et al., Immunometode 4:273 (1994).

Primene i metode objave

[0155] Makrociklični peptidi, kompozicije i metode predmetne objave imaju brojne in vitro i in vivo koristi koje uključuju, na primer, detekciju PD-L1 ili poboljšanje imunog odgovora blokadom PD-L1. Na primer, ovi molekuli mogu biti administrirani ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr., in vivo, da poboljšaju imunitet u raznim situacijama. Shodno tome, u jednom aspektu, objava stavlja na uvid javnosti metodu modifikovanja imunog odgovora u subjektu koja obuhvata administriranje antitela subjektu, ili antigen-vezujućeg dela istog, objave tako da je imuni odgovor u subjektu modifikovan. Poželjno, odgovor je poboljšan, stimulisan ili pozitivno regulisan. U drugim pogledima, makrociklični peptid može da ima anti-cino, anti-mišje i/ili anti-mrmotsko vezivanje i terapijsku aktivnost.

[0156] Kao što je korišćeno ovde, termin "subjekat" je nameravano da uključuje humane i nehumane životinje. Nehumane životinje uključuju sve kičmenjake, npr., sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, pilići, mrmot, vodozemci, i reptili, iako su sisari poželjni, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave i konji. Poželjni subjekti uključuju humane pacijenti kojima je potrebno poboljšanje imunog odgovora. Metode su naročito pogodne za lečenje humanih pacijenata koji imaju poremećaj koji se može lečiti povećanjem T-ćelijski posredovanog imunog odgovora. U određenom tehničkom rešenju, metode naročito pogodne za lečenje ćelija kancera in vivo. Da se postigne antigen-specifično poboljšanje imuniteta, makrociklični peptidi mogu biti administriran zajedno sa antigenom od interesa. Kada su makrociklični peptidi za PD-L1 administrirani zajedno sa drugim agensima, dva mogu biti administrirana bilo redosledom ili istovremeno.

[0157] Objava dalje stavlja na uvid javnosti metode detektovanja prisustva humanog, mrmotovog, cino, i/ili mišjeg PD-L1 antigena u uzorku, ili merenja količine humanog, mrmotovog, cino, i/ili mišjeg PD-L1 antigena, koja obuhvata kontaktiranje uzorka, i kontrolnog uzorka, sa referentnim monoklonskim antitelom, ili antigen-vezujućim delom istog, koji se specifično vezuje za humani, mrmotov, cino, i/ili mišji PD-L1, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i humanog, mrmotovog, cino, i/ili mišjeg PD-L1. Formiranje kompleksa se zatim detektuje, gde pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom je indikacija prisustva humanog, mrmotovog, cino i/ili mišjeg PD-L1 antigena u uzorku.

[0158] S obzirom na specifično vezivanje makrocikličnih peptida objave za PD-L1, u poređenju sa CD28, ICOS i CTLA-4, makrociklični peptidi objave mogu se primeniti da specifično detektuju PD-L1 eksprimiranje na površini ćelije i, štaviše, mogu se koristiti da prečiste PD-L1 imunoafinitetnim prečišćavanjem.

Kancer

[0159] Blokada PD-1 pomoću makrocikličnih peptida može da poboljša imuni odgovor na kancerozne ćelije u pacijentu. Ligand za PD-1, PD-L1, nije eksprimiran u normalnim humanim ćelijama, ali obiluje raznim humanim kancerima (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). Interakcija između PD-1 i PD-L1 rezultuje smanjenjem tumor infiltrirajućih limfocita, smanjenjem smanjenje proliferacije posredovane receptorima T-ćelija, i imune evazija kanceroznim ćelijama (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). Imuna supresija može se preokrenuti inhibiranjem lokalne interakcije PD-1 sa PD-L1 i efekat je aditivan kada je interakcija PD-1 na PD-L2 blokirana takođe (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)). Dok su prethodne studije pokazale da T-ćelijska proliferacija može se povratiti inhibiranjem interakcije PD-1 sa PD-L1, nije bilo izveštaja o direktnom uticaju na rast tumora kancera in vivo blokiranjem PD-1/PD-L1 interakcije. U jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na lečenje subjekta in vivo korišćenjem makrocikličnog peptida tako da je rast kanceroznih tumora inhibiran. Makrociklični peptid može biti korišćen samostalno da inhibira rast kanceroznih tumora. Alternativno, makrociklični peptid može se koristiti zajedno sa drugim imunogeničnim agensima, standardnim tretmanima kancera, ili drugim makrocikličnim peptidima, kao što je opisano ispod.

[0160] Shodno tome, u jednom tehničkom rešenju, objava obezbeđuje makrociklični peptid pronalaska za primenu u inhibiranju rasta ćelija tumora u subjktu.

[0161] Poželjni kanceri čiji rast može biti inhibiran korišćenjem makrocikličnih peptida objave uključuju kancere tipično responsivne na imunoterapiju. Neograničavajući primeri poželjnih kancera za lečenje uključuju melanom (npr., metastatski maligni melanom), karcinom renalnih ćelija (npr., karcinom bistre ćelije), kancer prostate (npr., hormonski refraktorni adenokarcinom prostate i kancer prostate rezistentan na kastraciju), kancer dojke, kolorektalni kancer i kancer pluća (npr., skvamozni i ne-skvamozni sitnoćelijski kancer pluća). Pored toga, objava uključuje refraktorne ili rekurentne malignitete čiji rast može biti inhibiran korišćenjem makrocikličnih peptida objave.

[0162] Primeri drugih kancera koji se mogu lečiti primenom metoda objave uključuju kancer kostiju, pankreasni kancer, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intgraokularni maligni melanom, kancer materice, kancer ovarijuma, kancer kolona, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer stomaka/želuca, testikularni kancer, kancer materice, karcinom falopijevih tuba, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinova bolest, ne-Hodžkinov limfom, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, hronične ili akutne leukemije uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, solidne tumore detinjstva, llimfocitni limfom, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom renalnog pelvisa, neoplazma centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS, tumor angiogeneze, tumor kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, Kapošijev sarkom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, T-ćelijski limfom, kanceri izazvani okruženjem uključujući one izazvane azbestom, i kombinacije pomenutih kancera. Predmetna objava je obično korisna za lečenje metastatskih kancera, posebno metastatskih kancera koji eksprimiraju PD-L1 (Iwai et al., Int. Immunol., 17:133-144 (2005)).

[0163] Po izboru, makrociklični peptidi za PD-L1 mogu biti kombinovani sa imunogeničnim agensom, kao što su kancerozne ćelije, prečišćenim tumorskim antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i molekule ugljovodonika), ćelijama, i ćelijama transfektovanim genima koji kodiraju imuno stimulirajuće citokine (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Neograničavajući primeri tumorskih vakcina koje se mogu koristiti uključuju peptide antigena melanoma, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigeni, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaze, ili tumorske ćelije transfektovane da eksprimiraju citokine GM-CSF (razmotreno u nastavku).

[0164] Kod ljudi, pokazalo se da su neki tumori imunogenični, kao što su melanomi. Očekuje se da podizanjem praga aktiviranja T ćelija PD-L1 blokadom, možemo očekivati aktiviranje odgovora tumora kod domaćina.

[0165] PD-L1 blokada je verovatno najefikasnija kada je kombinovana sa protokolom vakcinacije. Mnoge eksperimentalne strategije za vakcinaciju protiv tumora su osmišljene (videti Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); videti takođe Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, poglavlje 61, str.3023-3043, u DeVita, V. et al., izd., Cancer: Principles and Practice of Oncology, peto izdanje (1997)). U jednoj od ovih strategija, vakcina je pripremljena korišćenjem autolognih ili alogenih ćelija tumora. Pokazalo se da su ove ćelijske vakcine najefikasnije kada su ćelije tumora

4

transduktovane da eksprimiraju GM-CSF. GM-CSF je pokazao da je potentan aktivator prikazivanja antigena za vakcinaciju protiv tumora (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)).

[0166] Istraživanje eksprimiranja gena i obrasci eksprimiranja gena velikog obima kod različitih tumora doveli su do definicije takozvanih tumor specifičnih antigena (Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287 (1999)). U mnogim slučajevima, ovi tumor specifični antigeni su diferencijacijski antigeni eksprimirani u tumorima i u ćeliji iz koje je tumor nastao, na primer melanocitni antigeni gp100, MAGE antigeni, i Trp-2. Još važnije, može se pokazati da mnogi od ovih antigena mogu biti ciljevi T ćelija specifičnih za tumor pronađenih u domaćinu. PD-L1 blokada može se koristiti zajedno sa kolekcijom rekombinantnih proteina i/ili peptida eksprimiranih u tumoru da bi se stvorio imuni odgovor na ove proteine. Na ove proteine imuni sistem normalno gleda kao na sopstvene antigene pa su prema tome tolerantni na njih. Tumorski antigen može takođe da obuhvata protein telomerazu, koja je potrebna za sintezu telomera hromozoma i koja se eksprimira u više od 85% humanog kancera i u samo ograničenom broju somatskih tkiva (Kim, N. et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Ova somatska tkiva mogu biti zaštićena od imunog napada raznim sredstvima). Tumorski antigen može takođe biti „neo-antigeni“ eksprimirani u ćelijama kancera zbog somatskih mutacija koje menjaju sekvencu proteina ili stvaraju fuzione proteine između dve nepovezane sekvence (tj., bcr-abl u Filadelfija hromozomu), ili idiotip iz B ćelijskih tumora.

[0167] Ostale tumorske vakcine mogu da uključuju proteine iz virusa umešanih u humane kancere kao što su humani papiloma virusi (HPV), virusi hepatitisa (HBV i HCV) i Kapošijev herpes sarkoma virus (KHSV). Drugi oblik tumor specifičnog antigena koji se može koristiti zajedno sa PD-L1 blokadom je prečišćeni protein toplotnog šoka (HSP - heat shock proteins) izolovan iz samog tumorskog tkiva. Ovi proteini toplotnog šoka sadrže fragmente proteina iz ćelija tumora i ovi HSP su visoko efikasni pri isporuci u antigen prezentujuće ćelije za izazivanje imuniteta protiv tumora (Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y. et al., Science, 278:117-120 (1997)).

[0168] Dendritske ćelije (DC - dendritic cells) su potentne antigen prezentujuće ćelije koje se mogu koristiti za primarne antigen-specifične odgovore. DC se mogu proizvesti ex vivo i napuniti sa različitim proteinima i peptidnim antigenima kao i ekstraktima tumorskih ćelija (Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). DC mogu takođe biti transduktovane benetskim sredstvima da eksprimiraju tumorske antigene takođe. DC su takođe bile fuzionisane direktno za tumorske ćelije u svrhu imunizacije (Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Kao metoda vakcinacije, DC imunizacija može biti efikasno kombinovana sa PD-L1 blokadom da aktivira potentnije anti-tumorske odgovore.

[0169] PD-L1 blokada može takođe biti kombinovana sa standardnim tretmanima kancera. PD-L1 blokada može biti efikasno kombinovana sa hemoterapijskim režimima. U ovim slučajevima, može biti moguće da se smanji doza administriranih hemoterapijskih reagenasa (Mokyr, M. et al., Kancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Primer takve kombinacije je makrociklični peptid u kombinaciji sa dekarbazinom za lečenje melanoma. Drugi primer takve kombinacije je makrociklični peptid u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno obrazloženje iza kombinovane primene PD-L1 blokade i hemoterapije je da ćelijska smrt, što je posledica citotoksičnog delovanja većine hemoterapijskih jedinjenja trebalo bi da rezultira povećanim nivoima tumorskih antigena na antigen prezentujućem putu. Ostale kombinovane terapije koje mogu rezultovati sinergijom sa PD-L1 blokadom kroz ćelijsku smrt su zračenje, hirurgija, i deprivacija hormona. Svaki od ovih protokola stvara izvor tumorskih antigena u domaćinu. Inhibitori angiogeneze se takođe mogu kombinovati sa PD-L1 blokadom. Inhibicija angiogeneze dovodi do smrti tumorskih ćelija što može uvesti tumorski antigen u puteve prezentacije antigena domaćina.

[0170] PD-L1 blokirajući makrociklični peptidi mogu takođe biti korišćeni u kombinaciji sa bispecifičnim makrocikličnim peptidima koji ciljaju Fc alfa ili Fc gama receptoreksprimirajuće efektorske ćelije na tumorskim ćelijama (videti, npr., U.S. patente br.

5,922,845 i 5,837,243). Bispecifični makrociklični peptidi mogu biti korišćeni da ciljaju dva odvojena antigena. Na primer anti-Fc receptor/anti tumorski antigen (npr., Her-2/neu) bispecifični makrociklični peptidi su korišćeni da ciljaju makrofage na mesta tumora. Ovo ciljanje može efikasnije aktivirati odgovore specifične za tumor. T ćelijska grana ovih odgovora bi se povećala primenom PD-L1 blokade. Alternativno, antigen se može isporučiti direktno DC ćelijama primenom bispecifičnih makrocikličnih peptida koji se vezuju za tumorski antigen i marker površine ćelije specifičan za dendritsku ćeliju.

[0171] Tumori izbegavaju imuni nadzor domaćina velikim brojem mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama se mogu prevazići inaktivacijom proteina koji su eksprimirani tumorima i koji su imunosupresivni. Oni između ostalih uključuju TGF-beta (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), i Fas ligand (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). Makrociklični peptidi za svaki od ovih entiteta mogu se koristiti u kombinaciji sa anti-PD-Ll za suzbijanje efekata imunosupresivnog agensa i pogodovanje imunih odgovora tumora od strane domaćina

[0172] Drugi makrociklični peptidi koji se mogu koristiti da aktiviraju imuni odziv domaćina mogu se koristiti u kombinaciji sa anti-PD-Ll. Ovi uključuju molekule na površini dendritskih ćelija koje aktiviraju DC funkciju i prezentaciju antigena. Anti-CD40 makrociklični peptidi su u mogućnosti da efikasno zamene aktivnost pomoćnih T ćelija (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) i mogu se koristiti zajedno sa PD-1 antitelima (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Aktiviranje makrocikličnih peptida za T ćelijske kostimulativne molekule kao što su CTLA-4 (npr., U.S. patent br. 5,811,097), OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), i ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) može takođe obezbediti povećane nivoe T ćelijske aktivacije.

[0173] Transplantacija koštane srži trenutno se koristi za lečenje različitih tumora hematopoetskog porekla. Iako je bolest kalem protiv domaćina posledica ovog lečenja, terapijska korist može se dobiti od odgovora kalem protiv tumora. PD-L1 blokada može se koristiti za povećanje efikasnosti

donorskih transplantiranih tumorskih specifičnih T ćelija.

[0174] Postoji takođe nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja koji uključuju ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen specifičnih T ćelija i adoptivni transfer ovih ćelija u recipijente u cilju antigen specifičnih T ćelija protiv tumora (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Ove metode mogu se takođe koristiti da aktiviraju T ćelijske odgovore na infektivne agense kao što su CMV. Može se očekivati da ex vivo aktivacija u prisustvu makrocikličnih peptida poveća učestalost i aktivnost adoptivno transferovanih T ćelija.

4

Infektivna bolest

[0175] Ostale metode objave koriste se za lečenje pacijenata koji su bili izloženi određenim toksinima ili patogenima. Shodno tome, drugi aspekt objave obezbeđuje makrociklični peptid prema pronalasku za primenu u lečenju infektivne bolesti kod subjekta. Poželjno, antitelo je humani anti-humani PD-L1 makrociklični peptid (kao što je bilo koji od makrocikličnih peptida opisanih ovde). Dodatno ili alternativno, antitelo može biti himerno ili humanizovano antitelo.

[0176] Slično svojoj primeni na tumorima kao što je gore razmatrano, antitelom posredovana PD-L1 blokada može se koristiti zasebno, ili kao ađuvant, u kombinaciji sa vakcinama, za stimulisanje imunog odgovora na patogene, toksine i sopstvene antigene. Primeri patogena za koje ovaj terapijski pristup može biti posebno koristan, uključuju patogene za koje trenutno ne postoji efikasna vakcina, ili patogene za koje su konvencionalne vakcine manje nego potpuno efikasne. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na HIV, hepatitis (A, B i C), influencu, herpes, giardiju, malariju

(Butler, N.S. et al., Nature Immunology, 13:188-195 (2012); Hafalla, J.C.R., et al., PLOS Pathogens (2. februar, 2012)), Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. PD-L1 blokada je posebno korisna protiv utvrđenih infekcija od strane agenasa kao što je HIV koji predstavlja izmenjene antigene tokom promene infekcije. Ovi novi epitopi su prepoznati kao strani u vreme administracije anti-humanog PD-L1, tako izazivajući jak T ćelijski odgovor koji nije prigušen negativnim signalima putem PD-L1.

[0177] Neki primeri patogenih virusa koji izazivaju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju HIV, hepatitis (A, B, ili C), herpes virus (npr., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, i CMV, Epštajn Barov virus), adenovirus, influenca virus, flavivirusi, ehovirus, rinovirus, koksaki virus, kornovirus, respiratorni sinicijelni virus, virus zauški, rotavirus, virus malih boginja, virus rubeole, parvovirus, vakcinia virus, HTLV virus, denga virus, papilomavirus, moluskum virus, poliovirus, virus besnila, JC virus i virus arboviralnog encefalitisa.

[0178] Neki primeri patogenih bakterija koje izazivaju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju hlamidiju, rikecijalne bakterije, mikobakterije, stafilokoke, streptokoke, pneumonokoke, meningokoke i konokoke, klebsijelu, proteus, seraciju, pseudomonas, legionelu, difteriju, salmonelu, bacile, koleru, tetanus, botulizam, antraks, kugu, leptospirozu, i bakteriju Lajmske bolesti.

[0179] Neki primeri patogenih gljiva koje izazivaju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, itd.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, itd.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis i Histoplasma capsulatum.

[0180] Neki primeri patogenih parazita koji izazivaju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, i Nippostrongylus brasiliensis.

[0181] U svim gore navedenim metodama, PD-L1 blokada može biti kombinovana sa drugim oblicima imunoterapije kao što je tretman citokinima (npr. interferoni, agensi koji ciljaju VEGF aktivnost ili VEGF-receptore, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ili terapija bispecifičnim antitelom, koja obezbeđuje poboljšanu prezentaciju tumorskih antigena (videti, npr., Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Autoimune reakcije

[0182] Makrociklični peptidi mogu izazivati i amplifikovati autoimune odgovore. Zaista, indukcija anti-tumorskih odgovora korišćenjem ćelije tumora i peptidnih vakcina otkriva da mnogi anti-tumorski odgovori uključuju anti-sopstvene reaktivnosti (depigmentacija uočena u anti-CTLA-4+GM-CSF-modifikovanim B16 melanomu u van Elsas et al., supra; depigmentacija u Trp-2 vakcinisanim miševima (Overwijk, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987 (1999)); autoimuni prostatitis izazvan TRAMP vakcinama sa tumorskim ćelijama (Hurwitz, A., supra (2000)), vakcinacija peptidnim antigenom melanoma i vitiligo uočen u humanim kliničkim probama (Rosenberg, S.A. et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1):81-84 (1996)).

4

[0183] Prema tome, moguće je razmatrati korišćenje anti-PD-L1 blokade zajedno sa različitim sopstvenim proteinima kako bi se izveli protokoli vakcinacije da se efikasno generišu imuni odgovori na ove sopstvene proteine za lečenje bolesti. Na primer, Alchajmerova bolest uključuje neodgovarajuću akumulaciju A.beta. peptida u amiloidnim naslagama u mozgu; odgovori antitela na amiloid su sposobni da uklone ove amiloidne naslage (Schenk et al., Nature, 400:173-177 (1999)).

[0184] Drugi sopstveni proteini mogu takođe biti korišćeni kao ciljevi kao što je IgE za lečenje alergije i astme, i TNF.alfa za reumatoidni artritis. Konačno, odgovori antitela na različite hormone mogu biti indukovani primenom makrocikla ovde stavljenih na uvid javnosti. Neutrališući odgovori antitela na reproduktivne hormone mogu se primeniti za kontracepciju. Neutrališući odgovori antitela na hormone i druge rastvorljive faktore koji su potrebni za rast određenih tumora mogu se takođe smatrati kao mogući ciljevi vakcinacije.

[0185] Analogne metode kao što je opisano gore za primenu anti-PD-Ll makrocikla mogu biti korišćene za indukciju terapijskih autoimunih odgovora da se leče pacijenati koji imaju neodgovarajuću akumulaciju drugih sopstvenih antigena, kao što su amiloidne naslage, uključujući A.beta. u Alchajmerovoj bolesti , citokine kao što su TNF.alfa., i IgE.

Vakcine

[0186] Makrociklični peptidi mogu se koristiti da stimulišu antigen-specifične imune odgovore koadministracijom anti-PD-1 makrocikla sa antigenom od interesa (npr., vakcina). Shodno tome, (i) antigen; i (ii) anti-PD-1 makrocikl, ili njegov antigen-vezujući deo, prema tome mogu se administrirati u subjektu tako da je imuni odgovor na antigen kod subjekta poboljšan. Antigen može biti, na primer, tumorski antigen, viralni antigen, bakterijski antigen ili antigen od patogena. Neograničavajući primeri takvih antigena uključuju one razmotrene u odeljcima iznad, kao što su tumorski antigeni (ili tumorske vakcine) prethodno razmatrani, ili antigeni iz virusa, bakterija ili drugih patogena opisanih iznad.

[0187] Pogodni putevi administriranje kompozicija (npr., makrociklični peptidi, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) objave in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti i mogu biti odabrani od strane prosečnih poznavaoca. Na primer, kompozicije

4

mogu biti administrirane injekcijom (npr., intravenski ili subkutano). Pogodne doze korišćenih molekula će zavisiti od godina i mase subjekta i koncentracije i/ili formulacije kompozicije.

[0188] Kao što je prethodno opisano makrociklični peptidi objave mogu biti koadministrirani sa jednim ili više drugih terapijskih agensa, npr., citotoksički agens, radiotoksični agens ili imunosupresivni agens. Peptid može biti povezan za agens (kao imunokompleks) ili može biti administriran odvojeno od agensa. U potonjem slučaju (odvojena administracija), peptid može biti administriran pre, posle ili zajedno sa agensom ili može biti koadministriran sa drugim poznatim terapijama, npr., anti-kancerska terapija, npr., zračenje. Takvi terapijski agensi uključuju, između ostalih, anti-neoplastične agense kao što je doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil, dekarbazin i ciklofosfamid hidroksiurea koji, sami, su samo efikasni pri nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se intravenski administrira kao 100 mg/dozi jednom svake četiri nedelje i adriamicin se intravenski administrira kao 60-75 mg/ml doza jednom svakog 21 dana. Koadministracija makrocikličnih peptida, ili antigen vezujućih fragmenata istih, predmetne objava sa hemoterapijskim agensima obezbeđuje dva anti-kancerska agensa koji deluju preko različitih mehanizama koji daju citotoksični humanim tumorskim ćelijama. Takva koadministracija može rešiti probleme usled razvoja otpornosti na lekove ili promene u antigeničnosti tumorskih ćelija koje bi ih učinile nereaktivnim sa peptidima.

[0189] Takođe u obimu predmetne objave su kitovi koji sadrže kompozicije objave (npr., makrociklične peptide, bispecifične ili multispecifične molekule, ili imunokonjugate) i uputstva za primenu. Kit može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedan ili više dodatnih makrocikličnih peptida objave (npr., human antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop u PD-L1 antigenu koji je različit od makrocikla). Kitovi tipično uključuju oznaku koja označava nameravanu upotrebu sadržaja kita. Termin oznaka uključuje bilo koji pisani, ili snimljeni materijala koji se nalazi na ili sa kitom, ili koji na drugačiji način prati kit.

Kombinovana terapija

4

[0190] Kombinacija makrocikličnih peptida predmetne objave sa drugim PD-L1 antagonistom i/ili CTLA-4 antagonistom je korisna za poboljšanje imunog odgovora na hiperproliferativnu bolest blokadom PD-L1 i CTLA-4. Na primer, ovi molekuli mogu biti administrirani ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr., in vivo, da poboljšaju imunitet u raznim situacijama. Prema tome, kombinacija antitela, ili kombinacija antigen-vezujućih delova istog, objave može biti administrirana subjektu tako da se imuni odgovor kod subjekta modifikuje. Poželjno, odgovor je poboljšan, stimulisan ili pozitivno regulisan. U drugom tehničkom rešenju, trenutna objava obezbeđuje makrociklični peptid predmetne objave i subterapijsku dozu anti-CTLA-4 antitela za subjekta za primenu u menjanju neželjenih događaja povezanih sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim terapijskim agensom.

[0191] Blokada PD-L1 i CTLA-4 pomoću makrocikličnih peptida može poboljšati imuni odgovor na kancerozne ćelije kod pacijenta. Kanceri čiji rast može biti inhibiran korišćenjem makrocikličnih peptida trenutne objave uključuju kancere tipično responsivne na imunoterapiju. Reprezentativni primeri kancera za lečenje kombinovanom terapijom trenutne objave uključuju melanom (npr., metastatski maligni melanom), renalni kancer, kancer prostate, kancer dojke, kancer kolona i kancer pluća. Primeri drugih kancera koji se mogu lečiti korišćenjem metoda trenutne objave uključuju kancer kostiju, pankreasni kancer, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intgraokularni maligni melanom, kancer materice, kancer ovarijuma, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer stomaka, testikularni kancer, kancer materice, karcinom falopijevih tuba, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinova bolest, ne-Hodžkinov limfom, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, hronične ili akutne leukemije uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, solidne tumore detinjstva, limfocitni limfom, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom renalnog pelvisa, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS, tumor angiogeneze, tumor kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, Kapošijev sarkom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, T-ćelijski limfom, kanceri izazvani

4

okruženjem uključujući one izazvane azbestom, i kombinacije pomenutih kancera. Predmetna objava je takođe korisna za lečenje metastatskih kancera.

[0192] U određenim tehničkim rešenjima, kombinacija terapijskih agenasa koja sadrži najmanje jedan makrociklični peptid razmatran ovde može biti administrirana istovremeno kao pojedinačna kompozicija u farmaceutski prihvatljivom nosaču, ili istovremeno kao odvojena kompozicije gde svaki agens može biti administriran sekvencijalno. Na primer, anti-CTLA-4 antitelo i makrociklični peptid predmetne objave može biti administriran sekvencijalno, poput anti-CTLA-4 koje se administrira prvi a makrociklični peptid drugi, ili makrociklični peptid koji se administrira prvi i anti-CTLA-4 drugi. Osim toga, ukoliko se više od jedne doze kombinovane terapije administrira sekvencijalno, redosled sekvencijalne administracije može da se obrne ili zadrži istim redosledom u svakoj tački administracije, sekvencijalne administracije mogu se kombinovati sa istovremenim administracijama, ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Na primer, prva administracija kombinacije anti-CTLA-4 antitelo i makrociklični peptid može biti istovremena, druga administracija može biti sekvencijalna sa anti-CTLA-4 prvim i makrocikličnim peptidom drugim, i treća administracija može biti sekvencijalna sa makrocikličnim peptidom prvim i anti-CTLA-4 drugim, itd. Druga reprezentativna shema doziranja može uključivati prvu administraciju koja je sekvencijalna sa makrociklični peptid prvim i anti-CTLA-4 drugim, a naredna administracije može biti istovremena.

[0193] Po izboru, kombinacija makrocikličnog peptida i anti-CTLA-4 agensa može dalje biti kombinovana sa imunogeničnim agensom, kao što su kancerozne ćelije, prečišćeni tumorski antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i ugljovodonični molekuli), ćelije, i ćelije transfektovane genima koji kodiraju imuno stimulišuće citokine (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Neograničavajući primeri tumorskih vakcina koje se mogu koristiti uključuju peptide antigena melanoma, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigena, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaza, ili tumorske ćelije transfektovane da eksprimiraju citokin GM-CSF (razmatrano u nastavku).

[0194] Kombinovan PD-L1 makrociklični peptid i CTLA-4 blokada mogu dalje biti kombinovani sa protokolom vakcinacije. Mnoge eksperimentalne strategije vakcinacije protiv

4

tumora su osmišljene (videti Rosenberg, S., Development of cancer Vaccinas, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); videti takođe Restifo et al., Cancer Vaccinas, poglavlje 61, str.3023-3043 u DeVita et al., izd.,Cancer: Principles and Practice of Oncology, peto izdanje (1997)). U jednoj od ovih strategija, vakcina je pripremljena korišćenjem autolognih ili alogenih ćelija tumora. Ove ćelijske vakcine su pokazale da su najefikasnije kada su tumorske ćelije transduktovane da eksprimiraju GM-CSF. GM-CSF je pokazao da je potentan aktivator prezentacije antigena za vakcinaciju protiv tumora (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3539-3543 (1993)).

[0195] Studija ekspresije gena i obrasci ekspresije gena velikog obima kod različitih tumora doveli su do definicije takozvanih tumor specifičnih antigena (Rosenberg, Imunnity, 10:281-287 (1999)). U mnogim slučajevima, ovi tumor specifični antigeni su antigeni diferencijacije eksprimirani u tumorima i u ćeliji iz koje je tumor nastao, na primer melanocitni antigeni gp100, MAGE antigeni, i Trp-2. Što je još važnije, mnogi od ovih antigena su pokazali da su ciljevi tumor specifičnih T ćelija pronađenih u domaćinu. U određenim tehničkim rešenjima, kombinovani PD-L1 makrociklični peptid i CTLA-4 blokada korišćenjem kompozicije antitela opisane ovde može biti korišćena sa kolekcijom rekombinantnih proteina i/ili peptida eksprimiranih u tumoru kako bi se generisao imuni odgovor na ove proteine. Imuni sistem ove proteine obično posmatra kao sopstvene-antigene i, prema tome, podnosi toleranciju na njih. Tumorski antigen može takođe da uključuje protein telomerazu, koja je potrebna za sintezu telomeraza hromozoma i koja je eksprimirana u više od 85% humanih kancera i samo u ograničenom broju somatskih tkiva (Kim et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Ova somatska tkiva mogu se zaštititi od imunog napada raznim sredstvima). Tumorski antigen može takođe biti "neo-antigeni" eksprimiran u ćelijama kancera zbog somatskih mutacija koje menjaju sekvencu proteina ili stvaraju fuzione proteine između dve nepovezane sekvence (tj., bcr-abl u Filadelfija hromozomu), ili idiotip iz B ćelijskih tumora.

[0196] Druge tumorske vakcine mogu da uključuju proteine iz virusa sadržanih u humanim kancerima kao što su Humani Papiloma Virusi (HPV), virusi hepatitisa (HBV i HCV) i Kapošijev herpes sarkoma virus (KHSV). Drugi oblik tumor specifičnog antigena koji se može koristiti zajedno sa PD-L1 blokadom makrocikličnog peptida su prečišćeni proteini toplotnog šoka (HSP) izolovani od samog tumorskog tkiva. Ovi proteini toplotnog šoka sadrže fragmente proteina iz ćelija tumora i ovi HSP su visoko efikasni pri isporuci u antigen prezentujuće ćelije za izazivanje imuniteta na tumor (Suot et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura et al., Science, 278:117-120 (1997)).

[0197] Dendritske ćelije (DC) su potente antigen prezentujuće ćelije koje se mogu koristiti za praćenje antigen-specifičnog odgovora. DC ćelije se mogu proizvesti ex vivo i dopuniti raznim proteinima i peptidnim antigenima kao i ekstraktima tumorskih ćelija (Nestle et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). DC ćelije mogu takođe biti transduktovane genetičkim sredstvima da eksprimiraju ove tumorske antigene. DC ćelije su takođe fuzionisane direktno sa tumorskim ćelijama u svrhu imunizacije ((Kugler et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Kao metoda vakcinacije, DC imunizacija može biti efikasno kombinovana sa anti-PD-L1 makrocikličnim peptidom i CTLA-4 blokadom da aktivira potentnije anti-tumorske odgovore.

[0198] Kombinovani anti-PD-L1 makrociklični peptid i CTLA-4 blokada mogu takođe biti dalje kombinovani standardnim tretmanima kancera. Na primer, kombinovani makrociklični peptid i CTLA-4 blokada mogu biti efikasno kombinovani sa hemoterapijskim režimima. U ovim slučajevima, kao što je primećeno sa kombinacijom makrocikličnog peptida i anti-CTLA-4 agensa, može biti moguće da se smanji doza drugog hemoterapijskog reagensa administriranog sa kombinacijom trenutne objave (Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Primer takve kombinacije je kombinacija makrocikličnog peptida i anti-CTLA-4 agensa dalje u kombinaciji sa dekarbazinom za lečenje melanoma. Drugi primer je kombinacija makrocikličnog peptida i anti-CTLA-4 agensa dalje u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučni smisao u osnovi kombinovane primene PD-L1 makrocikličnog peptida i CTLA-4 blokade sa hemoterapijom je da smrt ćelije, koja je posledica citotoksične aktivnosti većine hemoterapijskih jedinjenja, treba da rezultuje povećanim nivoima tumorskih antigena u putu prikazivanja. Druge kombinovane terapije koje mogu rezultovati u sinergiji sa kombinovanim anti-PD-L1 makrocikličnim peptidom i CTLA-4 blokadom preko ćelijske smrti uključuju zračenje, hirurški zahvat i hormonsku deprivacija. Svaki od ovih protokola stvara izvor tumorskih antigena u domaćinu. Inhibitori angiogeneze se takođe mogu kombinovati sa kombinovanim PD-L1 i CTLA-4 blokadom. Inhibicija angiogeneze dovodi do smrti ćelije

1

tumora, koja može takođe biti izvor tumorskih antigena kojim se snabdevaju antigen prikazujući putevi domaćina.

[0199] Kombinacija PD-L1 i CTLA-4 blokirajućih agenasa može takođe biti korišćena u kombinaciji sa bispecifičnim makrocikličnim peptidima koji ciljaju Fc.alfa. ili Fc.gama. receptor-eksprimirajuće efekatorske ćelije na tumorske ćelije (videti, npr., U.S. patente br.

5,922,845 i 5,837,243). Bispecifični makrociklični peptidi mogu se koristit da ciljaju dva odvojena antigena. Na primer anti-Fc receptor/anti tumorski antigen (npr., Her-2/neu) bispecifični makrociklični peptidi su korišćeni da ciljaju makrofage na mesta tumora. Ovo ciljanje može efikasnije aktivirati tumor specifične odgovore. T ćelijski krak ovih odgovora bi se povećao primenom kombinovane PD-1 i CTLA-4 blokade. Alternativno, antigen se može isporučiti direktno DC ćelijama primenom bispecifičnih makrocikličnih peptida koji se vezuju za tumorski antigen i marker površine ćelije specifičan za dendritsku ćeliju.

[0200] U drugom primeru, kombinacija makrocikličnog peptida i anti-CTLA-4 agensa može biti korišćena zajedno sa anti-neoplastičnim makrocikličnim agensima, kao što je RITUXAN® (rituksimab), HERCEPTIN® (trastuzumab), BEXXAR® (tozitumomab), ZEVALIN® (ibritumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), Lymphocide (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab), i TARCEVA® (erlotinib), i slično. Pomoću primera i ne želeći da se vežemo za teoriju, lečenje anti-kancer antitelom ili anti-kancer antitelom konjugovanim sa toksinom može dovesti do smrti ćelije kancera (npr., ćelije tumora) što bi moglo da potencira imuni odgovor posredovan sa CTLA-4 ili PD-L1. U tehničkom rešenju datom kao primer, lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., tumora kancera) može da uključuje anti-kancer antitelo u kombinacija sa makrocikličnim peptidom i anti-CTLA-4 agensima, istovremeno ili sekvencijalno ili bilo koju njihovu kombinacija, koja može da potencira anti-tumorske imune odgovore od strane domaćina.

[0201] Tumori izbegavaju imuni nadzor domaćina velikim izborom mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama mogu se prevazići inaktivacijom proteina, koji su eksprimirani tumorima i koji su imunosipresivni. Ovi uključuju, između ostalih, TGF-.beta. (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), i Fas ligand (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). U sledećem primeru, antitela na svakom od ovih entiteta mogu se dalje kombinovati sa makrocikličnim peptidom i

2

kombinacijom anti-CTLA-4 radi suzbijanja efekata imunosupresivnih agenasa i favorizovanja anti-tumorskih imunih odgovora od strane domaćina.

[0202] Drugi agensi koji mogu biti korišćeni da aktiviraju imune reakcije domaćina mogu se dalje koristiti u kombinacija sa makrocikličnim peptidima predmetne objave. Ovi uključuju molekule na površini dendritske ćelije koji aktiviraju DC funkciju i prezentaciju antigena. Anti-CD40 makrociklični peptidi su u mogućnosti da zamene aktivnost pomoćne (helper) T ćelije (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) i mogu biti korišćeni zajedno sa makrocikličnim peptidima predmetne objave, bilo samostalno ili u kombinacija sa anti-CTLA-4 kombinacijom (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Aktiviranje makrocikličnih peptida na kostimulatorne molekule T ćelije, kao što su OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), i ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) može takođe da obezbedi povećane nivoe aktivacije T ćelija.

[0203] Transplatacija koštane srži se trenutno koristi za lečenje raznih tumora hematopoetskog porekla. Dok je bolest kalem protiv domaćina posledica ovog lečenja, terapijska korist može se dobiti od odgovora kalem protiv tumora. Makrociklični peptid predmetne objave, bilo samostalno ili u kombinacija sa CTLA-4 blokadom, može biti korišćen da poveća efikasnost donorski transplantiranih tumor specifičnih T ćelija.

[0204] Postoji takođe nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja koji uključuju ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen specifičnih T ćelija i adoptivni transfer ovih ćelija u recipijente u cilju antigen-specifičnih T ćelija protiv tumora (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Ove metode se takođe mogu koristiti da aktiviraju T ćelijske odgovore na infektivne agense kao što je CMV. Može se očekivati da ex vivo aktivacija u prisustvu makrocikličnih peptida predmetne objave, bilo samostalno ili u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antagonistom, poveća učestalost i aktivnost adopivno transferovanih T ćelija.

[0205] U određenim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje makrociklični peptid predmetne objave za primenu u menjanju neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim agensom u kombinacija sa subterapijskom dozom anti-CTLA-4 antitela kod subjekta. Na primer, učestalost kolitisa ili dijareje izazvane imunostimulirajućim terapijskim antitelom može se smanjiti administriranjem steroida koji se ne apsorbuje pacijentu. Pošto je bilo koji pacijent koji će primiti imunostimulirajuće terapijsko antitelo u riziku od razvoja kolitisa ili dijareje izazvane takvim lečenjem, ova cela populacija pacijenata je pogodna za terapiju u skladu sa metodama predmetne objave. Iako su steroidi administrirani za lečenje inflamatorne bolesti creva (IBD - inflammatory bowel disease) i sprečavaju pogoršanja IBD, nisu korišćeni da spreče (smanje incidenciju) IBD kod pacijenta kome nije dijagnostikovan IBD. Značajni sporedni efekti povezani sa steroidima, čak steroidima koji se ne apsorbuju, obeshrabrili su profilaktičku primenu.

[0206] U daljim tehničkim rešenjima, makrociklični peptid predmetne objave, bilo samostalno ili u kombinaciji sa CTLA-4 blokadom, može dalje biti kombinovan sa primenom bilo kod steroida koji se ne apsorbuje. Kao što je korišćeno ovde, "steroid koji se ne apsorbuje" je glukokortikoid koji pokazuje metabolizam prvog prolaza tako da, nakon metabolizma u jetri, bioraspoloživost steroida je, tj., manja od oko 20%. U jednom tehničkom rešenju objave, steroid koji se ne apsorbuje je budesonid. Budesonid je lokalno delujući glukokortikosteroid, koji se ekstenzivno metabolizuje, primarno u jetri, nakon oralne administracije. ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca) je pH- i vremenski-zavisna oralna formulacija budesonida razvijena da optimizuje isporuku leka do ileuma i celog kolona. ENTOCORT® EC je odobren u Americi za lečenje blage do umerene Kronove bolesti koja uključuje ileum i/ili uzlazni kolon. Uobičajena oralna doza ENTOCORT® EC za lečenje kronove bolesti je 6 do 9 mg/danu. ENTOCORT® EC se oslobađa u crevima pre nego što se apsorbuje i zadržava u crevnoj mukozi. Jednom kada prođe kroz ciljno tkivo crevne mukoze, ENTOCORT® EC se ekstenzivno metabolizuje citohromnim P450 sistemom u jetri do metabolita sa zanemarljivom glukokortikoidnom aktivnošću. Prema tome, biraspoloživost je niska (oko 10%). Niska bioraspoloživost budesonida rezultuje poboljšanim terapijskim odnosom u poređenju sa drugim glukokortikoidima sa manje obimnim metabolizmom prvog prolaza. Budesonid rezultuje manje štetnim efekatima, uključujući manju supresiju hipotalamo-hipofize, nego sistemski delujući kortikosteroidi. Međutim, hronična administracija ENTOCORT® EC može da rezultuje sistemskim efektima glukokortikoida, kao što su hiperkorticizam i adrenalna. Videti Physicians' Desk Reference Supplement, 58. izdanje, 608-610 (2004).

[0207] U još daljim tehničkim rešenjima, kombinacija PD-L1 i CTLA-4 blokade (tj.,

4

imunostimulirajućih terapijskih makrocikličnih peptida anti-PD-L1 i anti-CTLA-4) zajedno sa steroidom koji se ne apsorbuje može dalje biti kombinovana sa salicilatom. Salicilati uključuju 5-ASA agense kao što su, na primer: sulfasalazin (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazin (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazid (COLAZAL®, Salix Farmaceutskas, Inc.); i mesalamin (ASACOL®, Procter & Gamble Farmaceutskas; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

Doza i Formulacija

[0208] Pogodni makrociklični peptid opisan ovde, može biti administriran pacijentima za lečenje dijabetesa i drugih povezanih bolesti kao jedinjenje samostalno ili u smeši sa prihvatljivim nosačem u obliku farmaceutskih formulacija. Prosečni poznavaoci u oblasti lečenja dijabetesa mogu lako odrediti dozu i put administracije jedinjenja sisarima, uključujući ljude, kojima je takvo lečenje potrebno. Put administracije može da uključuje ali nije ograničen na oralnu, intraoralnu, rektalnu, transdermalnu, bukalnu, intranazalnu, pulmonarnu, subkutanu, intramuskularnu, intradermalnu, sublingvalnu, intrakolonsku, intraokularnu, intravensku, ili intestinalnu administraciju. Jedinjenje je formulisano u skladu sa putem administracije zasnovanom na prihvatljivoj farmaceutskoj praksi (Fingl et al., u The Pharmacological Basis of Therapeutics, poglavlje 1, str.1 (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Mack Publishing Co., Iston, PA (1990)).

[0209] Farmaceutski prihvatljive peptidne kompozicije opisane ovde mogu biti administrirane u višestrukim doznim oblicima kao što su tablete, kapsule (od kojih svaka uključuje formulacije sa produženim ili vremenskim oslobađanjem), pilule, prahovi, granule, eliksiri, in situ gelovi, mikrosfere, kristalni kompleksi, lipozomi, mikro-emulzije, tinkture, suspenzije, sirupi, aerosolni sprejevi i emulzije. Ovde opisane kompozicije takođe se mogu administrirati u oralnom, intravenskom (bolus ili infuzija), intraperitonealnom, subkutanom, transdermalnom ili intramuskularnom obliku, svi koristeći dozne oblike dobro poznata onima koji imaju prosečne veštine u farmaceutskim oblastima. Kompozicije se mogu administrirati same, ali generalno će se administrirati sa farmaceutskim nosačem odabranim na osnovu odabranog puta administracije i standardne farmaceutske prakse.

[0210] Dozni režim za kompozicije opisane ovde će, naravno, varirati u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamičke karakteristike određenih agenasa i njihovog načina i puta administracije; vrsta, godina, pola, medicinskog stanja i mase recipijenta; prirode i obim simptoma; vrsta istovremenog lečenja; učestalosti lečenja; puta administracije, renalne i hepatične funkcije pacijenta i željenog efekta. Lekar ili veterinar može da odredi i propiše efikasnu količinu leka potrebnog za sprečavanje, suzbijanje, ili zaustavljanje napretka bolesnog stanja.

[0211] Prema opštem uputstvu, dnevna oralna doza aktivnog sastojka, kada se koristi za naznačene efekte, će biti u opsegu između oko 0.001 do 1000 mg/kg telesne mase, poželjno između oko 0.01 do 100 mg/kg telesne mase po danu, i najpoželjnije između oko 0.6 do 20 mg/kg/danu. Intravenski, dnevna doza aktivnog sastojka kada se koristi za naznačene efekte će biti u opsegu između 0.001ng do 100.0 ng po min/po kg telesne mase tokom infuzije sa konstantnom brzinom. Takva infuzije sa konstantnom brzinom može poželjno biti administrirana pri brzini od 0.01 ng do 50 ng po min po kg telesne mase i najpoželjnije pri 0.01 ng do 10.0 mg po min po kg telesne mase. Kompozicije opisane ovde mogu biti administrirane u pojedinačnoj dnevnoj dozi, ili ukupna dnevna doza može biti u podeljenim dozama od dva, tri, ili četiri puta dnevno. Kompozicije opisane ovde mogu takođe biti administrirane depo formulacijom koja će omogućiti produženo oslobađanje leka tokom perioda dana/nedelja/meseci po želji.

[0212] Kompozicije opisane ovde mogu biti administrirane u intranazalnom obliku preko topikalne primene pogodnih intranazalnih transportera, ili transdermalnih putevima, korišćenjem transdermalnih flastera za kožu. Kada je administrirana u obliku transdermalnog sistema za isporuku, administracija doze će, naravno, biti kontinuirana a ne naizmenična tokom celog režima doziranja.

[0213] Kompozicije se obično administriraju u smeši sa pogodnim farmaceutskim razblaživačima, ekscipijensima, ili nosačima (koji se ovde zajednički nazivaju farmaceutski nosači) pogodno odabranim u odnosu na planirani oblik administracije, odnosno oralne tablete, kapsule, eliksire, aerosolne sprejeve proizvedene sa ili bez propelanta i sirupe, u skladu sa uobičajenim farmaceutskim praksama.

[0214] Na primer, za oralnu administraciju u obliku tablete ili kapsule, aktivna komponenta leka može se kombinovati sa oralnim, netoksičnim, farmaceutski prihvatljivim, inertnim nosačem kao što je ali nije ograničeno na, laktoza, skrob, saharoza, glukoza, metil celuloza, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, manitol i sorbitol; za oralnu administraciju u tečnom obliku, oralne komponente leka mogu se kombinovati sa bilo kojim oralnim, netoksičnim, farmaceutski prihvatljivim inertnim nosačem kao što je ali nije ograničeno na, etanol, glicerol, i voda. Štaviše, kada je to poželjno ili potrebno, odgovarajuća vezivna sredstva, lubrikanti, dezintegransi, i sredstva za bojenje se mogu ugraditi u smešu. Pogodna vezivna sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, skrob, želatin, prirodne šećere kao što su, ali ne ograničavajući se na, glukoza ili beta-laktoza, zaslađivači iz kukuruza, prirodne i sintetičke gume kao što su akacija, tragakant, ili natrijum alginat, karboksimetilceluloza, polietilen glikol, i voskovi. Lubrikanti korišćeni u ovim doznim oblicima uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, i natrijum hlorid. Dezintegransi uključuju, ali nisu ograničeni na, skrob, metil celulozu, agar, bentonit, i ksantan gumu.

[0215] Kompozicije opisane ovde takođe se mogu administrirati u obliku smeše micelarnih ili lipozomskih sistema za isporuku, kao što su male unilamelarne vezikule, velike unilamelarne vezikule, i multilamelarne vezikule. Lipozomi se mogu formirati iz različitih fosfolipida, kao što su holesterol, stearilamin, ili fosfatidilholini. Pojačivači permeacije se mogu dodati da bi se poboljšala apsorpcija leka.

[0216] Pošto je poznato da prolekovi poboljšavaju brojne poželjne kvalitete farmaceutskih preparata (tj., rastvorljivost, bioraspoloživost, proizvodnju, itd.), jedinjenja opisana ovde mogu se isporučiti u obliku proleka. Dakle, predmet zaštite opisan ovde je nameravan da obuhvati prolekove jedinjenja za koje je trenutno tražena zaštita, metode isporuke istih, i kompozicije koje sadrže iste.

[0217] Kompozicije opisane ovde mogu takođe biti povezane sa rastvorljivim polimerima kao nosači lekova koji se mogu ciljati. Takvi polimeri mogu da uključuju polivinil-pirolidon, piran kopolimer, polihidroksipropil-metakrilamid-fenol, poli-hidroksietilaspartamidfenol, ili polietilenoksid-polilizin supstituisan ostacima palmitoila. Pored toga, kompozicije ovde opisane mogu se kombinovati sa klasom biorazgradivih polimera korisnih za postizanje kontrolisanog oslobađanja leka, na primer, polilaktičnom kiselinom, poliglikolnom kiselinom, kopolimerima polilaktične i poliglikolne kiseline, poliepsilon kaprolaktonom, polihidroksi buternom kiselinom, poliortoesterima, poliacetalima, polidihidropiranima, policijanoacilatima, i umreženin ili amfipatskim blok kopolimerima hidrogelova.

[0218] Dozni oblici (farmaceutske kompozicije) pogodni za administraciju mogu da sadrže od oko 0.01 miligrama do oko 500 miligrama aktivnog sastojka po doznoj jedinici. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni sastojaka će obično biti prisutan u količini od oko 0.5-95% po masi zasnovano na ukupnoj masi kompozicije.

[0219] Želatinske kapsule mogu da sadrže aktivni sastojak i nosače u prahu, kao što su laktoza, skrob, derivat celuloze, magnezijum stearat, i stearinska kiselina. Slični razblaživači se mogu koristiti za pravljenje komprimovanih tableta. I tablete i kapsule mogu se proizvesti kao proizvodi sa produženim oslobađanjem da bi se obezbedilo kontinuirano oslobađanje leka tokom perioda vremena. Komprimirane tablete mogu biti obložene šećerom ili obložene filmom da bi prikrile bilo koji neugodan ukus i zaštitile tabletu od atmosfere, ili enterički obložene za selektivnu razgradnju u gastrointestinalnom traktu.

[0220] Tečni dozni oblici za oralnu administraciju mogu da sadrže boje i arome kako bi se povećalo prihvatanje od strane pacijenta.

[0221] Uopšteno, voda, pogodno ulje, rastvor soli, vodena dekstroza (glukoza), i srodni rastvori šećera i glikoli kao što su propilen glikol ili polietilen glikoli su pogodni nosači za parenteralne rastvore. Rastvor za parenteralnu administraciju poželjno sadrži so rastvorljivu u vodi aktivnog sastojka, pogodni agens za stabilizaciju i, ako je potrebno, puferske supstance. Antioksidantna sredstva kao što je natrijum bisulfit, natrijum sulfit, ili askorbinska kiselina, bilo samostalno ili u kombinaciji, su pogodni agensi za stabilizaciju. Takođe se koriste limunska kiselina i njene soli i natrijum EDTA. Pored toga, parenteralni rastvori mogu da sadrže konzervanse, kao što su benzalkonijum hlorid, metil- ili propil-paraben, i hlorobutanol.

[0222] Pogodni farmaceutski nosači su opisani u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, devetnaesto izdanje, Mack Publishing Company (1995), standardni referentni tekst u ovoj oblasti.

[0223] Reprezentativni korisni farmaceutski dozni oblici za administraciju jedinjenja opisanih ovde mogu se prikazati kao što sledi:

Kapsule

[0224] Veliki broj jediničnih kapsula može se pripremiti punjenjem standardnih dvodelnih tvrdih želatinskih kapsula sa 100 miligrama praškastog aktivnog sastojka, 150 miligrama laktoze, 50 miligrama celuloze, i 6 miligrama magnezijum stearata.

Meke želatinske kapsule

[0225] Smeša aktivnog sastojka u digestabilnom ulju kao što je sojino ulje, pamukovo ulje ili maslinovo ulje može se pripremiti i ubrizgati pomoću pumpe pozitivnog dejstva u želatin da se formiraju meke želatinske kapsule koje sadrže 100 miligrama aktivnog sastojka. Kapsule treba oprati i osušiti.

Tablete

[0226] Tablete se mogu pripremiti konvencionalnim procedurama tako da dozna jedinica, na primer je 100 miligrama aktivnog sastojka, 0.2 miligrama koloidnog silicijum dioksida, 5 miligrama magnezijum stearata, 275 miligrama kristalne celuloze, 11 miligrama skroba i 98.8 miligrama laktoze. Odgovarajući premazi mogu se naneti da bi se povećala palatabilnost ili odložila apsorpcija.

Injektibilno

[0227] Injektabilna formulacija peptidne kompozicije opisane ovde može ili ne mora zahtevati upotrebu ekscipijenasa kao što su oni koje su odobrila regulatorna tela. Ovi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvarače i korastvarače, agense za razblaživanje, emulgovanje ili zgušnjavanje, helirajuće agense, antioksidante i redukciona sredstva, antimikrobne konzervanse, pufere i agense za podešavanje pH, punioci, zaštitna sredstva i sredstva za podešavanje toničnosti i specijalne aditive. Injektabilna formulacija mora biti sterilna, bez pirogena i, u slučaju rastvora, bez čestica.

[0228] Parenteralna kompozicija pogodna za administracija injekcijom može biti pripremljena mešanjem na primer, 1.5% po masi aktivnog sastojka u farmaceutski prihvatljivom puferu koji može ili ne mora da sadrži korastvarač ili drugi ekscipijens. Rastvor treba da bude napravljen izotoničan sa natrijum hloridom i sterilisan.

Suspenzija

[0229] Vodena suspenzija se može pripremiti za oralnu i/ili parenteralnu administraciju tako da, na primer, svaki 5 ml sadrži 100 mg fino podeljenog aktivnog sastojka, 20 mg natrijum karboksimetil celuloze, 5 mg natrijum benzoata, 1.0 g rastvora sorbitola, U.S.P., i 0.025 mL vanilina ili drugog palatabilnog ukusa.

Biodegradabilne mikročestice

[0230] Parenteralna kompozicija sa produženim oslobađanjem pogodna za administraciju injekcijom može se pripremiti, na primer, rastvaranjem pogodnog biorazgradivog polimera u rastvaraču, dodavanjem u rastvor polimera aktivnog sredstva koje treba da se inkorporira, i uklanjanjem rastvarača iz matrice čime se formira matrica polimera sa aktivnim agensom raspoređenim po matrici.

Sinteza peptida

[0231] Makrociklični peptidi predmetne objave mogu se proizvesti metodama poznatim u oblasti tehnike, kao što su oni mogu biti hemijski sintetisani, rekombinantno u sistemu bez ćelija, rekombinantno unutar ćelije ili mogu biti izolovani iz biološkog izvora. Hemijska sinteza makrocikličkog peptida predmetne objave može se izvesti korišćenjem različitih metoda prepoznatih u oblasti tehnike, uključujući postupnu sintezu u čvrstoj fazi, polu-sintezu putem konformaciono-potpomognute ponovne-ligacije fragmenata peptida, enzimske ligacije kloniranog ili sintetičkog peptidnog segmenta, i hemijske ligacije. Poželjna metoda za sintezu makrocikličnih peptida i njihovih analoga opisanih ovde je hemijska sinteza korišćenjem različitih tehnika u čvrstoj fazi kao što su one opisane u Chan, W.C. et al., izd., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oksford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom. 2: "Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", str. 3-284, Gross, E. et al., izd., Academic Press, Njujork (1980); i u Stewart, J.M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2. izdanje, Pierce Chemical Co., Rokford, IL (1984). Poželjna strategija je zasnovana na Fmoc (9-Fluorenilmetil metil- oksikarbonil) grupi za privremenu zaštitu α-amino grupe, u kombinaciji sa terc-butil grupom za privremenu zaštitu bočnih lanaca aminokiselina (videti na primer Atherton, E. et al., "The Fluorenylmethokxycarbonyl Amino Protecting Group", u The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom. 9: "Special Methoda in Peptide Synthesis, Part C", str.1-38, Undenfriend, S. et al., izd., Academic Press, San Dijego (1987).

[0232] Peptidi se mogu sintetisati postupno na nerastvorljivom polimernom nosaču (koji se takođe naziva "smola") počevši od C-terminusa peptida. Sinteza započinje dodavanjem C-terminalne aminokiseline peptida na smolu stvaranjem amidnog ili estrskog povezivanja. Ovo omogućava eventualno oslobađanje rezultujućeg peptida kao C-terminalnog amida ili karboksilne kiseline, redom.

[0233] C-terminalna aminokiselina i sve druge aminokiseline korišćene u sintezi moraju imati svoje α-amino grupe i funkcionalnosti bočnog lanca (ako su prisutne) različito zaštićene tako da se α-amino zaštitna grupa može selektivno ukloniti tokom sinteze. Kuplovanje aminokiseline se vrši aktiviranjem njene karboksilne grupe kao aktivnog estra i njegova reakcija sa deblokiranom α-amino grupom N-terminalne aminokiseline pridružene smoli. Niz uklanjanja zaštite i kuplovanja α amino grupe se ponavlja dok se ne sastavi cela peptidna sekvenca. Peptid se zatim oslobađa iz smole uz istovremeno uklanjanje zaštite funkcionalnosti

1

bočnih lanaca, obično u prisustvu odgovarajućih skavendžera da se ograniče sporedne reakcije. Dobijeni peptid se konačno prečisti pomoću HPLC reverzne faze.

[0234] Sinteza peptidil-smola koja je potrebna kao prekursora finalnih peptida koristi komercijalno dostupne umrežene polistirenske polimerne smole (Novabiochem, San Dijego, CA; Applied Biosystems, Foster Siti, CA). Poželjni čvrsti nosači su: 4-(2',4'-dimetoksifenil-Fmoc-aminometil)-fenoksiacetil-p-metil benzhidrilamin smola (Rink amidna MBHA smola); 9-Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi-Merrifield smola (Sieber amidna smola); 4-(9-Fmoc)aminometil-3,5-dimetoksifenoksi)valeril-aminometil-Merrifield smola (PAL smola), za C-terminalne karboksamide. Kuplovanje prve i narednih aminokiselina može se postići korišćenjem HOBt, 6-Cl-HOBt ili HOAt aktivnih estara proizvedenih iz DIC/HOBt, HBTU/HOBt, BOP, PyBOP, ili iz DIC/6-Cl-HOBt, HCTU, DIC/HOAt ili HATU, redom. Poželjni čvrsti nosači su: 2-hlorotritil hloridna smola i 9-Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi-Merrifield smola (Sieber amidna smola) za zaštićene peptidne fragmente. Punjenje prve aminokiseline na 2-hlorotritil hloridnu smolu najbolje je postići reakcijom Fmoc-zaštićene aminokiseline sa smolu u dihlorometanu i DIEA. Ako je potrebno, može se dodati mala količina DMF da se olakša rastvaranje aminokiseline.

[0235] Sinteze peptidnih analoga opisane ovde mogu se izvesti korišćenjem jednog ili višekanalnog peptidnog sintetizatora, kao što je CEM Liberty mikrotalasni sintetizator, ili Protein Technologies, Inc. Prelude (6 kanala) ili Symphony (12 kanala) sintetizator.

[0236] Korisni Fmoc aminokiselinski derivati su prikazani ispod.

Primeri ortogonalno zaštićenih aminokiselina koje se koriste u sintezi u čvrstoj fazi

[0237]

2

[0238] Prekursori peptidil-smole za njihove respektivne peptide mogu se cepati i sa njih se može ukloniti zaštita korišćenjem bilo koje standardne procedure (videti, na primer, King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990)). Željena metoda je upotreba TFA u prisustvu vode i TIS kao sredstava za uklanjanje. Obično, peptidil-smola se meša u TFA/voda/ (94:3:3, v:v:v; 1 mL/100 mg peptidil smole) tokom 2-6 sati na sobnoj temperaturi. Potrošena smola se zatim filtrira i rastvor TFA koncentriše ili suši pod sniženim pritiskom. Dobijeni sirovi peptid je ili istaložen i ispran sa Et2O ili se ponovo rastvara direktno u DMSO ili 50% vodenoj sirćetnoj kiselini radi prečišćavanja preparativnom HPLC.

[0239] Peptidi željene čistoće mogu se dobiti prečišćavanjem upotrebom preparativne HPLC, na Water-ovom Modelu 4000 ili Shimadzu Modelu LC-8A tečnog hromatografa. Rastvor sirovog peptida ubrizgava se u YMC S5 ODS (20 x 100 mm) kolonu i eluira linearnim gradijentom MeCN u vodi, oba puferovana sa 0.1% TFA, korišćenjem protoka od 14-20 mL/min uz nadgledanje efluenta UV apsorbancom na 220 nm. Strukture prečišćenih peptida mogu se potvrditi elektro-raspršivačkom MS analizom.

[0240] Lista aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi ovde je obezbeđena ispod.

4

[0241] Sledeće skraćenice se koriste u Primerima i drugde ovde:

Ph = fenil

Bn = benzil

i-Bu = izo-butil

i-Pr = izo-propil

Me = metil

Et = etil

Pr = n-propil

Bu = n-butil

t-Bu = terc-butil

Trt = tritil

TMS = trimetilsilil

TIS =triizopropilsilan

Et2O = dietil etar

HOAc ili AcOH = sirćetna kiselina

MeCN ili AcCN = acetonitril

DMF = N,N-dimetilformamid

EtOAc = etil acetat

THF = tetrahidrofuran

TFA = trifluorosirćetna kiselina

TFE = α,α,α-trifluoroetanol

Et2NH = dietilamin

NMM = N-metilmorfolin

NMP = N-metilpirolidon

DCM = dihlorometan

TEA = trietilamin

min. = minut(e)

h ili hr = sat(i)

L = litar

mL ili ml = mililitar

µL = mikrolitar

g = gram(i)

mg = miligram(i)

mol = mol(ovi)

mmol = milimol(ovi)

meq = miliekvivalent

rt or RT = sobna temperatura

sat ili sat'd = zasićen

aq. = vodeni

mp = tačka topljenja

BOP reagens = benzotriazol-1-iloksi-tris-dimetilamino-fosfonijum heksafluorofosfat (Kastrov reagens)

PyBOP reagens = benzotriazol-1-iloksi-tripirolidino fosfonijum heksafluorofosfat HBTU = 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronjim heksafluorofosfat

HATU = O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijm heksafluorofosfat

HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat T3P = 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosforinan-2,4,6-triokside DMAP = 4-(dimetilamino)piridin

DIEA = diizopropiletilamin

Fmoc ili FMOC = fluorenilmetiloksikarbonil

Boc ili BOC = terc-butiloksikarbonil

HOBT ili HOBT●H2O = 1-hidroksibenzotriazole hidrat

Cl-HOBt = 6-Hloro-benzotriazol

HOAT = 1-hidroksi-7-azabenzotriazol

HPLC = tečna hromatografija visokih performansi

LC/MS = tečna hromatografija visokih performansi/masena spektrometrija

MS ili Mass Spec = masena spektrometrija

NMR = nuklearna magnetna rezonanca

Sc ili SC = sub-kutano

IP ili ip = intra-peritonealno

PRIMERI

PRIMER 1 - SINTEZA PEPTIDA U ČVRSTOJ FAZI I CIKLIZACIJA PEPTIDA

[0242] Procedure opisane u ovom primeru, bilo u celosti ili u delu gde je notirano, korišćene su za sintezu makrocikličnih peptida prikazanih u Tabelama 1, 2, 3, 4 i 5 (nisu prema

pronalasku).

�

[0243] Generalni protokol peptidnu sintezu u čvrstoj fazi i makrociklizaciju. Na Symphony peptidnom sintetizatoru (Protein Technology Inc. Tuson, AZ), Prelude peptidnom sintetizatoru

2

(Protein Technology Inc. Tuson, AZ), ili Liberty (CEM Matthews, NC), Sieber Amidna smola (0.71 mmol/g, 0.100 mmol, 141 mg) je bubrena sa DMF (7 mL x 4 min) i pomešana sa blagom strujom N2svakih 30 sekundi. Rastvarač je dreniran i sledeća metoda je korišćena da kupluje prvu aminokiselinu: Fmoc grupa je uklonjena iz smolom podržanog gradivnog bloka ispiranjem smole dvaput sa rastvorom 20% piperidina u DMF (5 mL i 2.5 minuta po ispiranju) i mešanjem sa blagom strujom N2svakih 30 sekundi. Smola je isprana tri puta sa DMF (5-8 mL i 1.5 min po ispiranju). 2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)sirćetna kiselina (0.2 M rastvor u DMF, 0.5 mmol) je zatim dodat, a potom aktivator kuplovanja (tj., HATU (Chem-Impex Int'1, 0.4M rastvor u DMF, 1.25 mL, 0.5 mmol)) i baza (tj., N-metil morfolin (Aldrich, 0.8 M u DMF, 1.25 mL, 1 mmol)). Reakciona smeša je agitovana blagom strujom azota tokom 1 h. Reagensi su drenirani iz reakcione posude, i smola je isprana tri puta sa DMF (5 mL x 1.5 min). Treba napomenuti da su tipični reagensi za Liberty CEM sledeći: HCTU (0.45 M u DMF) kao aktivator kuplovanja, DIEA (2 M u NMP) kao baza, i 5% piperazin u DMF sa 0.1 M HOBt kao rastvor za uklanjanje zaštite.

[0244] Rezultujućem smolom-podržanom Fmoc-zaštićenom dipeptidu je zatim uzastopno uklonjena zaštita i kuplovan je sa trećom aminokiselinom i tako dalje na iterativni način da bi se dobio željeni smolom-podržani proizvod.

[0245] LCMS analiza je izvedena na alikvotu peptida, koji je ocepljen od smole (analitička količina je tretirana sa TFA/TIS (96:4) rastvorom (0.2 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon potvrde željene linearne sekvence, Fmoc grupa je uklonjena iz N-terminusa nakon ispiranja smole dvaput sa rastvorom 20% piperidina u DMF (5 mL i 2.5 minuta po ispiranju) i vorteksovanja guste mase. Smola je isprana sa DMF (2 x 5 mL). U peptid-smolu je dodat u nizu 2-hlorosirćetna kiselina (0.6 mmol, 57 mg), DMF (5.26 mL), i DIC (0.6 mmol, 93 µL). Nova gusta masa je vorteksovana tokom 1-2 dana u kom trenutku je peptid-smola isprana sa DMF (1 x 5 mL x 1 min) i DCM (3 x DCM x 1 min).

[0246] Sa peptida je uklonjena zaštita i ocepljen je iz smole nakon tretmana sa TFA/TIS (96:4) rastvorom (10 mL) tokom 1 h. Smola je uklonjena filtracijom, isprana sa koktelom za cepanje (2 x 1 mL), kombinovani filtrati su dodati u Et2O (10-15 mL) i rastvor je ohlađen na 0 °C da bi se uticalo da se peptid taloži iz rastvora. Gusta masa je centrifugirana da se peletiraju čvrste materije i supernatant je dekantovan. Svež Et2O (25 mL) je dodat i proces je ponavljan tri puta radi ispiranja čvrstih materija. Vlažnim čvrstim materijama je dodat rastvor 0.1 M NH4HCO3/acetonitril (od 1/1 do 3/1 (v/v), pH = 8.6) ili 6 M gvanidin HCl u 100 mM NaH2PO4(pH = 8.4). Rastvor je mešan tokom 1-2 dana i nadgledan pomoću LCMS. Reakcioni rastvor je prečišćen preparativnom HPLC da bi se dobio željeni proizvod.

OPŠTI ANALITIČKI PROTOKOLI I SINTETSKE METODE<±>

[0247]<±>Sledeći protokoli analize i sintetske metode korišćeni su u Primeri 1 do 4000.

Analitički podaci:

[0248] Masena spektometrija: "ESI-MS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom koja se izvodi u režimu pozitivnog jona; "ESI-MS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom koja se izvodi u režimu negativnog jona; "ESI-HRMS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije koja se izvodi u režimu pozitivnog jona; "ESI-HRMS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije koja se izvodi u režimu negativnog jona. O detektovanim masama se izveštava nakon "m/z" oznake jedinice. Jedinjenja sa tačnom masom većom od 1000 često su detektovana kao dvostruko naelektrisani ili trostruko naelektrisani joni.

Analiza LCMS uslov A:

[0249] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B:Acetonitril sa 0.05% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 2% B do 98% B tokom 2 minuta, zatim 0.5 minuta zadržavanje pri 98% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS uslov B:

4

[0250] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.75-minutno zadržavanje pri 100% B; Protok: 1.11 mL/min.

Analiza LCMS uslov C:

[0251] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.2% mravljom kiselinom i 0.01% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.2% mravljoim kiselinom 0.01% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 2% B do 80% B tokom 2 minuta, 80% B do 98% B tokom 0.1 minuta zatim 0.5 minuta zadržavanje pri 98% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS uslov D:

[0252] Kolona: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetata; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetata; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.75-minuta zadržavanje pri 100% B; Protok: 1.11 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS uslov E:

[0253] Kolona: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.75-minuta zadržavanje pri 100% B; Protok: 1.11 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS uslov F:

[0254] Kolona: Waters XBridge C18, 2.1 x 50 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 35 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 4 minuta, zatim 1-minutno zadržavanje pri 100% B; Protok: 4 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS uslov G:

[0255] Finnigan LTQ Maseni spektrometar; kolona: PHENOMENEX® Jupiter C4, 1 x 50 mm; Mobilna faza A: 1% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu; Temperatura: 30 °C; Gradijent: 1% B, 1 min. zadržavanje; 1-95% B tokom 3 min., zatim 3-min. zadržavanje pri 95% B; Protok: 0.15 mL/min.

Analiza HPLC uslov A:

[0256] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 35% B do 80% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV pri 217 nm.

Analiza HPLC uslov B:

[0257] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 25% B do 75% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC uslov C:

[0258] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 20% B do 70% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC uslov D:

[0259] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 15% B do 65% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC uslov E:

[0260] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 25% B do 60% B tokom 20 min.; Protok: 1.25 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC uslov F:

[0261] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 25% B do 65% B tom 20 min.; Protok: 1.25 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC uslov G:

[0262] Kolona: SunFire C18 3.5µm, 3.0x150mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 10-100% B tokom 12 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje pri 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza HPLC uslov H:

[0263] Kolona: XBridge Fenil 3.5x150µm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 10-100% B tokom 12 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje pri 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza HPLC uslov I:

[0264] Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 150 x 4.6 mm; mobilna faza A: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, mobilna faza B: acetonitril sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, Gradijent 5-100% B tokom 20min, zatim 5 minutno zadržavanje pri 100% B; Protok 1mL/min, Detekcija: UV na 220.

Analiza HPLC uslov J:

[0265] Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 150 x 4.6 mm; mobilna faza A: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, mobilna faza B: acetonitril sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, Gradijent 10-100% B tokom 20min, zatim 5 minutno zadržavanje pri 100% B; Protok 1mL/min, Detekcija: UV na 220.

Opšte procedure:

Prelude Metoda A:

[0266] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure ukoliko nije drugačije naglašeno su izvedene u 10 ili 45 mL polipropilenskoj epruveti opremljenoj sa fritom na donjem delu. Epruveta se povezuje sa Prelude peptidnim sintetizatorom i kroz dno i vrh epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da bi kontaktirali smolu. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. DMF = dimetilformamid; DIC = N,N'-diizopropilkarbodiimid; HOAt = 1-hidroksi 7-azabenzotriazol; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[NMe]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[0267] Procedura iz "Prelude Metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje Fmoc-N-metil aminokiselina i kuplovanje za sekundarni aminski N-terminus koristio je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja sa hloroacetil hloridom" ili "Procedure kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom" opisanih ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0268] U 40 mL polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0269] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor aminokiseline i HOAt (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim DIC (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 60 min, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor ispran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0270] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor aminokiseline i HOAt (0.2M u DMF, 5.0 mL, 5 ekv), zatim DIC (0.2M u DMF, 5.0 mL, 5 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 min, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedure kuplovanja sa hloroacetil hloridom:

[0271] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat 3.0 mL rastvor DIPEA (4.0 mmol, 0.699 mL, 40 ekv), i hloroacetil hlorid (2.0 mmol, 0.160 mL, 20 ekv) u DMF. Smeša je periodično agitovana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (4.0 mL) je dodat vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran.

Prelude Metoda B:

[0272] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedures su izvedene u 10 ili 45 mL polipropilenskoj epruveti opremljenoj sa fritom na donjem delu. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da bi kontaktirali smolu. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu p); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

1

[0273] Procedure iz "Prelude Metode B" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja hloroacetil hloridom" ili "Procedure kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom" opisanih ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0274] U 40 mL polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (bubrena) tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0275] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor aminokiseline i HOAt (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim DIC (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom

2

30 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[0276] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno 3 puta sa DMF (4.0 mL) kroz vrh posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0277] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 2.5 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF, 2.5 mL, 10 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 12 sati, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura A kuplovanja hloroacetil hloridom:

[0278] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodato 3.0 mL rastvora DIPEA (4.0 mmol, 0.699 mL, 40 ekv), i hloroacetil hlorid (2.0 mmol, 0.160 mL, 20 ekv) u DMF. Smeša je periodično agitovana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom:

4

[0279] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 12 do18 sati, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

Prelude Metoda C:

[0280] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom u donjem delu. Epruveta se povezuje sa Prelude peptidnim sintetizatorom i kroz dno i kroz vrh epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu u donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino) metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-aminoksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[0281] Procedura iz "Prelude Metode C" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Finalno ispiranje smole koristilo je "Proceduru finalnog ispiranja" opisanu ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0282] U 40 mL polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (bubrena) tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0283] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 60 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je astvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0284] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je dvaput isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana dvaput kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja:

[0285] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 0.5 do 2.5 mL, 1 do 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 0.5 do 2.5 mL, 1 do 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.5 do 1.5 mL, 4 do 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 60 minuta do 600 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je dvaput isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura finalnog ispiranja:

[0286] Smola je isprana sukcesivno dvaput kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom:

[0287] Napomena Manualni korak. U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je agitovana pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-Diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturu tokom 12 do 18 sati, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(4.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

Prelude Metoda D:

[0288] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom u donjem delu. Epruveta se povezuje sa Prelude peptidnim sintetizatorom i kroz dno i kroz vrh epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da bi kontaktirali smolu. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu u donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinium 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-aminoksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[0289] Procedura iz "Prelude Metoda D" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Finalno ispiranje smole koristilo je "Proceduru finalnog ispiranja" opisanu ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0290] U 40 mL polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (bubrena) tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0291] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 2.5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 2.5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.75 mL, 5 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 30 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0292] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 2.5 ekv),

1

zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 2.5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.75 mL, 5 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 30 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je dvaput isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata amino (0.2M u DMF, 1.25 mL, 2.5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 2.5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.75 mL, 5 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 30 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je dvaput isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je dvaput isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura finalnog ispiranja:

[0293] Smola je isprana sukcesivno dvaput kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom:

2

[0294] Napomena Manualni korak. U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je agitovana pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-Diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 12 do 18 sati, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(4.0 mL) je dodat na vrh posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

CEM Metoda A:

[0295] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na CEM Liberty mikrotalasnom peptidnom sintetizatoru (CEM Corporation). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 30 ili 125mL opremljenoj sa fritom u donjem delu za CEM Discovery mikrotalasnu jedinicu. Epruveta se povezuje sa CEM Liberty sintetizatorom i kroz dno i kroz vrh epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati sa vrha i sa dna epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Svi rastvori u uklonjeni kroz dno epruvete prenosa smole sa vrha. "Periodično barbotiranje" opisuje kratko barbotiranje N2gasa kroz fritu sa donje strane. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u roku od 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Druge uobičajene smole kao što su Rink, Hloro Tritil, ili drugi veznici osetljivi na kiselinu mogu se koristiti u sintezi, Seiber amidna smola je korišćena ukoliko nije naznačeno u specifičnim primerima. Uobičajene korišćene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Orn(Boc)-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[0296] Procedura iz "CEM Metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja hloroacetil hloridom" ili "Procedure kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom" opisanih ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0297] U 50 mL polipropilensku koničnu epruvetu je dodat Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Zatim DMF (7 mL) je dodat u epruvetu a zatim DCM (7 mL). Smola je zatim prenesena u reakcionu posudu sa vrha posude. Procedura je ponovljena dodatno dva puta. DMF (7 mL) je dodat a zatim DCM (7 mL). Smola je ostavljena da nabubri sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 15 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Standardna procedura kuplovanja:

4

[0298] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana N2barbotiranjem tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje su kuplovane na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranje sa vrha. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 minuta na 65 °C, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom:

[0299] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana N2barbotiranjem tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje su kuplovane na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana N2barbotiranjem tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje su kuplovane na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 minuta na 65 °C, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0300] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor 5% piperazina i 0.1 M HOBt u DMF (7 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta na 75 °C a zatim rastvor je isušen. Ova procedura je ponovljena još jednom. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HCTU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana N2barbotiranjem tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline (50 °C za Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH), zatim 6 sati bez zagrevanja. Nakon dreniranja, smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 minuta na 65 °C, zatim je rastvor dreniran. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja:

[0301] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodat aminokiselinski rastvor (1.25 mL do 5 mL, 2.5 ekv do 10 ekv) koji sadrži HATU (2.5 ekv do 10 ekv), i konačno DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL do 1 mL, 20 ekv). Smeša je mešana N2barbotiranjem tokom 5 minuta do 2 sata na 25 °C do 75 °C, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 minuta na 65 °C, zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, zatim DMF (7 mL) ispiranje sa dna i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Symphony Metoda A:

[0302] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Symphony peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u Symphony polipropilenskoj epruveti opremljenoj sa fritom u donjem delu. Epruveta se povezuje za Symphony peptidni sintetizator i kroz dno i vrh epruvete. Svi rastvarači, DMF, DCM, aminokiseline i reagensi su dodati kroz dno epruvete i prolaze preko frite da dođu u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlaj se svakih 15 sekundi. Aminokiselini rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremnaja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; NMM= n-Metil morfolin; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Druge uobičajene smole osetljive na kiselinu mogu takođe biti korišćene u sintezi kao što je Rink ili funkcionalizovana Hloro tritil smola. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[0303] Procedura iz "Symphony Metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.050 mmol skali, gde je smola određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 70 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.050 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru standardnog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru dvostrukog kuplovanja" opisanu ispod, prilagođene aminokiseline su kuplovane preko manualnog dodovanja slepe probe (Blank) aminokiselinskog "Kuplovanja sa slepom probom" opisanog ispod.

Procedura bubrenja:

[0304] U Symphony polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Sieber smola (70 mg, 0.050 mmol). Smola je isprana (bubrena) tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sa DMF (6.25 mL) dodatim kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Standardna procedura kuplovanja:

[0305] Smola je isprana tri puta kao što sledi: U reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično mešana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sa DMF (6.25 mL) dodatim kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0306] Smola je isprana tri puta kao što sledi: U reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sa DMF (6.25 mL) dodatim kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja:

[0307] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Sinteza je pauzirana Symphony softverom da se u reakcionu posudu doda manualno prilagođena aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim se ponovno pokrene automatizacija: da se doda HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL,

1

5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana šest puta kao što sledi sa DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL) smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Symphony Metoda B:

[0308] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Symphony peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u Symphony polipropilenskoj epruveti opremljenoj sa fritom u donjem delu. Epruveta je povezana sa Symphony peptidnim sintetizatorom i kroz dno i vrh epruvete. Svi rastvarači, DMF, DCM, aminokiseline i reagensi su dodati kroz dno epruvete i prolaze preko frite da dođu u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlaj se svakih 15 sekundi. Aminokiselini rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremnaja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; NMM= n-Metil morfolin; DIEA ili DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Druge uobičajene smole osetljive na kiselinu mogu takođe biti korišćene u sintezi kao što je Rink ili funkcionalizovana Hloro tritil smola. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH;

1 1

Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[0309] Procedura iz "Symphony Metoda B" opisuje eksperiment izveden na 0.050 mmol skali, gde je smola određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 70 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.050 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru B sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod, Prilagođene aminokiseline su kuplovane preko manualnog dodovanja slepe probe (Blank) aminokiselinske "Prilagođene procedure aminokiselinskog kuplovanja" opisane ispod, i hloroacetil anhidrid je dodat finalnoj poziciji sekvence korišćenjem "Procedure finalnog kaptiranja (capping)" opisanoj ispod.

Procedura bubrenja:

[0310] U Symphony polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Sieber smola (70 mg, 0.050 mmol). Smola je isprana (bubrena) tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sa DMF (6.25 mL) dodatim kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično

1 2

agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Standardna procedura kuplovanja::

[0311] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL) smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[0312] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom

1

30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sa DMF (6.25 mL) dodatim kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL) smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat kroz dno posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja:

[0313] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem preko dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minutes a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 times kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Sistem je pauziran sistemom za manualno dodavanje prilagođene aminokiseline u reakcionu posudu (0.2M u DMF, 1.25 mL, 5 ekv), zatim je automatizacija ponovo pokrenuta da se u reakcioni mehur doda HATU (0.2M u DMF,

1 4

1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: DMF (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32.5 mL) smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u narednom koraku.

Procedura finalnog kaptiranja:

[0314] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcionu posudu je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcione posude tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 2.5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv) praćeno dodavanjem anhidrida hlorosirćetne kiseline (0.4M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sa DMF (6.25 mL) dodatim preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat NMM (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv) praćeno dodavanjem anhidrida hlorosirćetne kiseline (0.4M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: DMF (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL) smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran

1

preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (2.5 mL) je dodat preko dna posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je zatim osušena strujom azota tokom 10 minuta.

Metoda A globalnog uklanjanje zaštite:

[0315] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Metode A globalnog uklanjanje zaštite " opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:voda:triizopropilsilan:ditiotreitol (92.5:2.5:2.5:2.5 v:v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prenesena u špric od 25mL opremljen fritom. U špric je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (5.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 85 min. Rastvor je filtriran kroz, koncentrovan i razblažen u dietil etru (30 mL). Istaložena čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je resuspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je suspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirov peptid je dobijen kao bela do gotovo bela čvrsta supstanca.

Metoda B globalnog uklanjanje zaštite:

[0316] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Metode B globalnog uklanjanje zaštite" opisuje eksperiment izveden na 0.04 mmol skali, pri čemu je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.04 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan (96:4; v:v). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prenesena u 10 mL špric opremljen sa fritom. U špric je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0-3.0 mL).

1

Smeša je mešana u šejkeru tokom 1 h ili 1.5 h. Rastvor je filtriran kroz, ispran sa rastvorom za uklanjanje zaštite (0.5 mL), koncentrovan i razblažen u dietil etru (30 mL). Istaložena čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je resuspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je suspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirov peptid je dobijen kao bela do gotovo bela čvrsta supstanca.

Metoda C globalnog uklanjanje zaštite:

[0317] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Metode C globalnog uklanjanje zaštite" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (95:2.5:2.5 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prenesena u Bio-rad epruvetu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (4.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 60 minuta. Rastvor je filtriran kroz i razblažen u dietil etru (30 mL). Istaložena čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je resuspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je suspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirov peptid je dobijen kao bela do gotovo bela čvrsta supstanca.

Metoda D globalnog uklanjanje zaštite:

[0318] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Metoda B globalnog uklanjanje zaštite " opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale.

1

"Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (94:3:3 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prenesena u špric od 25mL opremljen sa fritom. U špric je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (5.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 5 minuta. Rastvor je filtriran kroz i razblažen u dietil etru (30 mL). Istaložena čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je resuspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je suspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirov peptid je dobijen kao bela do gotovo bela čvrsta supstanca.

Metoda E globalnog uklanjanje zaštite:

[0319] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Metoda E globalnog uklanjanje zaštite " opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena količinom Fmoc Gly-ClTrt veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (95:2.5:2.5 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prenesena u Bio-Rad epruvetu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 3 minuta. Rastvor je filtriran, i sakupljen u epruveti za centrifugu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 3 minuta. Rastvor je filtriran, i sakupljen u epruveti za centrifugu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 3 minuta. Rastvor je filtriran, i sakupljen u epruveti za centrifugu. Rastvor u epruveti za centrifugu je ostavljen da stoji tokom 60 minuta. Sakupljeni rastvor je zatim razblažen sa dietil etrom (30 mL), i formiran je talog. Istaložena čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je resuspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je suspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je

1

osušena pod visokim vakuumom. Sirov peptid je dobijen kao bela do gotovo bela čvrsta supstanca.

Metoda F globalnog uklanjanje zaštite:

[0320] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Metode F globalnog uklanjanje zaštite " opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (95:2.5:2.5 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prenesena u Bio-Rad epruvetu od 6 ml. U Bio-Rad je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (4.0 mL). Smeša je mešana u šejkeru tokom 90 minuta. Rastvor je filtriran kroz i razblažen u dietil etru (30 mL). Istalpožena čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovamn i čvrsta supstanca je resuspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je suspendovani dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirov peptid je dobijen kao bela do gotovo bela čvrsta supstanca.

Ciklizaciona metoda A

[0321] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Ciklizacione metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu korišćenog da se stvori peptid. Ova skala nije zasnovana na direktnom određivanju količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 8M Gvanidin/50mM TRIS (1:3) (pH 8.6) (7 mL:18 mL ili slični odnos), i rastvor je zatim podešen na pH = 8.5-9.0 korišćenjem aq NaOH (1.0M), ako je potrebno. Rastvor je zatim mešan korišćenjem

1

šejkera tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Ovaj rastvor je podvrgnut prečišćavanju reverzno-faznom HPLC da bi se dobio željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda C:

[0322] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Ciklizacione metode C" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu korišćenog da se stvori peptid. Ova skala nije zasnovana na direktnom određivanju količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 0.1M amonijum bikarbonatnom puferu (11 mL:24 mL ili slični odnos), i rastvor je zatim pažljivo podešen na pH = 8.5-9.0 korišćenjem aq NaOH (1.0M). Rastvor je zatim mešan korišćenjem šejkera tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Ovaj rastvor je podvrgnut prečišćavanju reverznofaznom HPLC da bi se dobio željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda D:

[0323] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Ciklizacione metode D" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu korišćenog da se stvori peptid. Ova skala nije zasnovana na direktnom određivanju količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 0.1M amonijum bikarbonatnom puferu (11 mL:24 mL), i rastvor je zatim pažljivo podešen na pH = 8.5-9.0 korišćenjem aq NaOH (1.0M). Rastvor je zatim mešan korišćenjem šejkera tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Ovaj rastvor je podvrgnut prečišćavanju reverzno-faznom HPLC da bi se dobio željeni ciklični peptid.

11

Ciklizaciona metoda E:

[0324] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno drugačije. Procedura "Ciklizacione metode E" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu korišćenog da se stvori peptid. Ova skala nije zasnovana na direktnom određivanju količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru vodenog 6M gvanidin HCl pufera (15 mL), i rastvor je zatim mešan uz mešanje tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i 15 mL DMSO je dodato ostatku dajući gustu masu koja je filtrirana. Ovaj filtrirani rastvor je podvrgnut prečišćavanju reverzno-faznom HPLC da bi se dobio željeni ciklični peptid.

Manualna procedura A kuplovanja:

[0325] U Bio-Rad reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično mućkana tokom 5 minuta a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je mućkana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (1.2-10 ekvivalenata) obično (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (1.210 ekvivalenata) obično (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (2.4- 20 ekvivalenata)obično (0.8M u DMF, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je mućkana tokom 60 minuta do 18 sati, zatim je reakcioni rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je mućkana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

Metoda A N-metilacije na-smoli. (Turner, R.A. et al., Org. Lett., 15(19):5012-5015 (2013)):

[0326] Sve manipulacije su izvedene manualno ukoliko nije navedeno. Procedura " Metode A N-metilacije na-smoli" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, pri čemu je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen da se stvori peptid. Ova skala nije zasnovana na direktnom određivanju količine peptida korišćenog u proceduri.

Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale.

[0327] Smola je prenesena u špric od 25mL sa fritom. U smola je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana tokom 3 min. a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana 3 puta sa DMF (4.0 mL). U reakcionu posudu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 4.0 mL). Smeša je mućkana tokom 3 min. a zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL). Smola je suspendovana u DMF (2.0 mL) i etil trifluoroacetatu (0.119 ml, 1.00 mmol), 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-enu (0.181 ml, 1.20 mmol). Smeša je stavljena na šejker tokom 60 min.. Rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL).

[0328] Smola je isprana tri puta sa suvim THF (2.0 mL) da se ukloni zaostala voda. U peći osušenoj bočici od 4.0 mL je dodat THF (1.0 mL) i trifenilfosfin (131 mg, 0.500 mmol) na 4 Å molekulskim sitima (20 mg). Rastvor je prenesen na smolu i diizopropil azodikarboksilat (0.097 mL, 0.5 mmol) je dodat polako. Smola je mešana tokom 15 min. Rastvor je dreniran preko frite i smola je isprana tri puta sa suvim THF (2.0 mL) da se ukloni zaostala voda. U peći osušenoj bočici od 4.0 mL je dodat THF (1.0 mL), trifenilfosfin (131 mg, 0.500 mmol) na suvim 4 Å molekulskim sitima (20 mg). Rastvor je prenesen na smolu i diizopropil azodikarboksilat (0.097 mL, 0.5 mmol) je dodat polako. Smola je mešana tokom 15 min.. Rastvor je dreniran preko frite. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL). Smola je suspendovana u etanolu (1.0 mL) i THF (1.0 mL), i natrijum borohidrid (37.8 mg, 1.000 mmol) je dodat. Smeša je mešana tokom 30 min. i drenirana. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL).

Mikrocepanje A:

[0329] U mali < 10 mg uzorak smole je dodato 2 kapi TIS i 1 mL trifluorosirćetne kiseline, mešanje na rt. Nakon 1 h, ukloniti mali alikvot i razblažiti sa 0.5 mL acetonitrilom, filtrirati, i dobiti analizu pomoću LC-MS.

[0330] Sintetski protokoli za specifične peptide stavljene ovde na uvid javnosti su obezbeđeni u sledećim Primerima.

[0331] Primeri 2 do 71 obezbeđuju sheme sinteze za Formulu I(a) do I(d) makrocikličnih peptida (nije u skladu sa pronalskom).

[0332] Primeri 72 do 88 obezbeđuju sheme sinteze za Formulu II(a) do II(c) makrocikličnih peptida (nije u skladu sa pronalskom).

[0333] Primeri 100 do 116 obezbeđuju sheme sinteze za Formulu III(a) do III(c) makrocikličnih peptida (nije u skladu sa pronalskom).

[0334] Primeri 116 do 119 obezbeđuju sheme sinteze za C-terminalne PEGilovane makrociklične peptide Formula I i II (nije u skladu sa pronalskom).

PRIMER 2 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 1

[0335]

11

[0336] U 40 mL polipropilensku posudu za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i reakciona posuda je stavljena na Prelude peptidni sintetizator. Sledeće procedure su zatim izvedene uzastopno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je usledila;

"CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Gly-OH;

"CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Arg(Pbf)-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Trp(Boc)-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Ser(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Trp(Boc)-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-[N-Me]Gly-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Leu-OH;

"CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-His(Trt) -OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Pro-OH;

"CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Asn(Trt) -OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-[N-Me]Ala-OH; "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" je usledila sa Fmoc-Phe-OH;

"Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom" je usledila;

"Metoda A globalnog uklanjanje zaštite" je usledila;

"Ciklizaciona metoda A" je usledila.

[0337] Sirov materijal je prečišćen pomoću preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 20-70% B tokom 50 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 16 mg, i njegova procenjena čistoća sa HPLC analizom je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.30 min.; ESI-MS(+) m/z 926.7 (M+2H). Analiza HPLC Uslov A: vreme zadržavanja = 11.16 min.

PRIMER 3 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 2

[0338]

[0339] Primer 3 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0340] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 20-75% B tokom 55 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 18 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 93 Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.19 min.; ESI-MS(+) m/z 959.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov B: vreme zadržavanja = 14.49 min.

11

PRIMER 4 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 3

[0341]

[0342] Primer 4 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0343] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 8.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.21 min.; ESI-MS(+) m/z 970.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov B: vreme zadržavanja = 19.91 min.

11

PRIMER 5 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 4

[0344]

[0345] Primer 5 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0346] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 2.1 mg, i njegova procenjena, čistoća pomoću HPLC analize bila je 99%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.28 min.; ESI-MS(+) m/z 948.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov C: vreme zadržavanja = 19.03 min.

11

PRIMER 6 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 5

[0347]

[0348] U polipropilenski sud od 40 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena;

"Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina" je praćena za kuplovanja Fmoc-Metil aminokiseline i za kuplovanja za N-terminus sekundarnog amina; "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom” je praćena; "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” je praćena;

"Ciklizaciona metoda C" je praćena.

[0349] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 20-65% B tokom

11

25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.412 min; ESI-MS(+) m/z 888.75 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.539 min; ESI-MS(+) m/z 888.50 (M+2H).

PRIMER 7 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 6

[0350]

[0351] Primer 7 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A:

11

Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0352] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 24 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.20 min.; ESI-MS(+) m/z 920.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov C: vreme zadržavanja = 15.66 min.

PRIMER 8 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 7

[0353]

12

[0354] Primer 8 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0355] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 11.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.24 min.; ESI-MS(+) m/z 920.2 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov C: vreme zadržavanja = 16.39 min.

PRIMER 9 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 8

[0356]

[0357] Primer 9 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0358] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 12 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.27 min.; ESI-MS(+) m/z 905.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov C: vreme zadržavanja = 17.18 min.

PRIMER 10 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 9

[0360] Primer 10 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0361] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 16 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.26 min.; ESI-MS(+) m/z 914.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov C: vreme zadržavanja = 16.98 min.

12

PRIMER 11 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 10

[0362]

[0363] Primer 11 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0364] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC AQ-ODS, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 10-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 3.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.45 min.; ESI-MS(+) m/z 894.2 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov D: vreme zadržavanja = 23.00 min.

PRIMER 12 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 11

[0365]

[0366] Primer 12 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0367] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-75% B tokom 45 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i

12

osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 3.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov G: ESI-MS(+) m/z 905.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 14.68 min.

PRIMER 13 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 12

[0368]

[0369] Primer 13 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0370] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova:

12

Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-70% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 4.06 min.; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 13.71 min.

PRIMER 14 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 13

[0371]

[0372] Primer 14 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A:

12

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i "Ciklizaciona metoda C".

[0373] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.683 min; ESI-MS(+) m/z 933.70 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.750min; ESI-MS(+) m/z 933.95 (M+2H).

PRIMER 15 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 14

[0374]

12

[0375] Primer 15 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0376] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.566 min; ESI-MS(+) m/z 933.95 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.630 min; ESI-MS(+) m/z 934.00 (M+2H).

12

PRIMER 16 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 15

[0377]

[0378] Primer 16 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja za N-Metil aminokiselinu", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0379] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-60% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 7.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 93%.

1

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.15 min.; ESI-MS(+) m/z 869.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 10.49 min.

PRIMER 17 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 16

[0380]

[0381] Primer 17 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja za N-Metil aminokiselinu", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0382] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova:

1 1

Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-60% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.76 min.; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 14.69 min.

PRIMER 18 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 17

[0383]

[0384] Primer 18 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja za N-

1 2

Metil aminokiselinu", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[0385] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-65% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 10.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.60 min.; ESI-MS(+) m/z 869.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 11.75 min.

PRIMER 19 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 18

[0386]

1

[0387] U polipropilenski sud od 40 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"Prelude Metoda B: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"Prelude Metoda B: Procedura dvostrukog kuplovanja" je praćena za kuplovanja za N-terminus primarnog amina;

"Prelude Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina" je praćena za kuplovanja za N-terminus sekundarnog amina;

"Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom” je praćena; “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” je praćena;

"Ciklizaciona metoda C" je praćena.

[0388] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-75% B tokom 45 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 15 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.53 min.; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 15.29 min.

PRIMER 20 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 19

[0389]

1 4

[0390] Primer 20 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0391] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.434 min; ESI-MS(+) m/z 906.30 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.483min; ESI-MS(+) m/z 905.70 (M+2H).

1

PRIMER 21 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 20

[0392]

[0393] Primer 21 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 19, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda B: Procedura dvostrukog kuplovanja" za kuplovanja za N-terminus primarnog amina; "Prelude Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina" za kuplovanja za N-terminus sekundarnog amina; "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0394] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-65% B tokom 45 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 21.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 91%.

1

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.84 min.; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 16.82 min.

PRIMER 22 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 21

[0395]

[0396] Primer 22 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 19, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda B: Procedura dvostrukog kuplovanja" za kuplovanja za N-terminus primarnog amina; "Prelude Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina" za kuplovanja za N-terminus sekundarnog amina; "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

1

[0397] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-50% B tokom 45 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 7.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.89 min.; ESI-MS(+) m/z 905.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 13.23 min.

PRIMER 23 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 22

[0398]

[0399] Primer 23 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 19, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda B: Procedura dvostrukog kuplovanja" za kuplovanja za N-terminus primarnog amina; "Prelude Metoda B: Procedura kuplovanja

1

sekundarnog amina" za kuplovanja za N-terminus sekundarnog amina; "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0400] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 25-70% B tokom 45 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 25 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.91 min.; ESI-MS(+) m/z 884.5 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 13.23 min.

PRIMER 24 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 23

[0401]

1

[0402] Primer 24 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0403] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.505 min; ESI-MS(+) m/z 926.70 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.537 min; ESI-MS(+) m/z 926.80 (M+2H).

PRIMER 25 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 24

[0404]

14

[0405] Primer 25 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0406] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.676 min; ESI-MS(+) m/z 898.20 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.749 min; ESI-MS(+) m/z 898.45 (M+2H).

PRIMER 26 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 25

[0407]

[0408] Primer 26 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-Trp(Boc)-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0409] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 946.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 946.4 (M+2H).

PRIMER 27 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 26

[0410]

[0411] Primer 27 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-2-Nal-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0412] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B;

14

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 951.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

PRIMER 28 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 27

[0413]

[0414] Primer 28 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-1-Nal-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0415] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.8%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.83 min; ESI-MS(+) m/z 1903.7 (M+H), 952.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.9 min.

PRIMER 29 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 28

[0416]

14

[0417] Primer 29 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-Bip-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0418] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 964.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 964.9 (M+2H).

PRIMER 30 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 29

[0419]

14

[0420] Primer 30 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-1-Tiq-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0421] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.81 min; ESI-MS(+) m/z 933.2 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.85 min.'

PRIMER 31 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 30

14

[0423] Primer 31 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-Tyr(tBu)-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0424] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 934.8 (M+2H).

14

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 934.8 (M+2H).

PRIMER 32 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 31

[0425]

[0426] Primer 32 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-metoksi-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0427] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

14

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.6%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.78 min; ESI-MS(+) m/z 942.0 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.27 min.

PRIMER 33 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 32

[0428]

[0429] Primer 33 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-Flouro-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0430] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

1

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.85 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.8%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.78 min; ESI-MS(+) m/z 936.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.58 min.

PRIMER 34 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 33

[0431]

[0432] Primer 34 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-Hloro-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0433] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-

1 1

mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 943.6 (M+2H).

PRIMER 35 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 34

[0434]

[0435] Primer 35 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom

1 2

kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-Bromo-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0436] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.7%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.83 min; ESI-MS(+) m/z 966.3 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.99 min.

PRIMER 36 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 35

[0437]

1

[0438] Primer 36 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-triflourometil-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0439] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.824 min; ESI-MS(+) m/z 960.90 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 960.4 (M+2H).

PRIMER 37 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 36

[0440]

1 4

[0441] Primer 37 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-metil-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0442] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.847 min; ESI-MS(+) m/z 933.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.742 min; ESI-MS(+) m/z 933.9 (M+2H).

1

PRIMER 38 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 37

[0443]

[0444] Primer 38 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-t-Butil-Phe-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0445] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 35-75% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 2.003 min; ESI-MS(+) m/z 954.6 (M+2H).

1

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.786 min; ESI-MS(+) m/z 954.6 (M+2H).

PRIMER 39 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 38

[0446]

[0447] Primer 39 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-3-Pir-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0448] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim

1

uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 927.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.13 min; ESI-MS(+) m/z 927.4 (M+2H).

PRIMER 40 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 39

[0449]

[0450] Primer 40 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom

1

kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-4-Pir-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0451] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.448 min; ESI-MS(+) m/z 927.55 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.121 min; ESI-MS(+) m/z 927.65 (M+2H).

PRIMER 41 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 40

[0452]

1

[0453] Primer 41 je pripremljen, počevši sa Intermedijernom Smolom I, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-3-tienil Alanin-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0454] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.649 min; ESI-MS(+) m/z 1858.8 (M+1), 929.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.589 min; ESI-MS(+) m/z 929.9 (M+2H).

1

PRIMER 42 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 41

[0455]

[0456] Primer 42 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0457] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.79 min; ESI-MS(+) m/z 941.2 (M+2H).

1 1

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.45 min.

PRIMER 43 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 42

[0458]

[0459] Primer 43 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0460] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

1 2

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.553 min; ESI-MS(+) m/z 926.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.356 min; ESI-MS(+) m/z 926.7 (M+2H).

PRIMER 44 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 43

[0461]

[0462] Primer 44 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0463] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1%

1

trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.2%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.76 min; ESI-MS(+) m/z 898.6 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 12.91 min.

PRIMER 45 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 44

[0464]

[0465] Primer 45 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A:

1 4

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0466] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.547 min; ESI-MS(+) m/z 934.65 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.732 min; ESI-MS(+) m/z 933.95 (M+2H).

PRIMER 46 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 45

[0467]

1

[0468] Primer 46 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0469] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.710 min; ESI-MS(+) m/z 954.20 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.966 min; ESI-MS(+) m/z 954.20 (M+2H).

PRIMER 47 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 46

[0470]

1

[0471] Primer 47 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0472] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.851 min; ESI-MS(+) m/z 964.95 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.957 min; ESI-MS(+) m/z 964.75 (M+2H).

1

PRIMER 48 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 47

[0473]

[0474] Primer 48 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0475] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.486 min; ESI-MS(+) m/z 934.95 (M+2H).

1

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.636 min; ESI-MS(+) m/z 935.00 (M+2H).

PRIMER 49 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 48

[0476]

[0477] Primer 49 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0478] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 20-65% B tokom

1

25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.290 min; ESI-MS(+) m/z 934.45 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.567 min; ESI-MS(+) m/z 934.55 (M+2H).

PRIMER 50 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 49

[0479]

[0480] Primer 50 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A:

1

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0481] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.623 min; ESI-MS(+) m/z 933.95 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.841 min; ESI-MS(+) m/z 933.95 (M+2H).

PRIMER 51 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 50

[0482]

1 1

[0483] Primer 51 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda C".

[0484] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97% pomoću “Analiza HPLC Uslovi B i D".

Analiza LCMS Uslov B: Vreme zadržavanja = 1.476 min; ESI-MS(+) m/z 920.00 (M+2H).

1 2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.670 min; ESI-MS(+) m/z 919.95 (M+2H).

PRIMER 52 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 51

[0485]

[0486] Primer 52 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0487] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno

1

zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.5%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.80 min; ESI-MS(+) m/z 928.0 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.38 min.

PRIMER 53 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 52

[0488]

[0489] Primer 53 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

1 4

[0490] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.390 min; ESI-MS(+) m/z 941.35 (M+2H), 1881.85 (M+H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.355 min; ESI-MS(+) m/z 941.50 (M+2H).

PRIMER 54 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 53

[0491]

1

[0492] Primer 54 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0493] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.682 min; ESI-MS(+) m/z 959.85 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.607 min; ESI-MS(+) m/z 959.85 (M+2H).

PRIMER 55 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 54

[0494]

1

[0495] Primer 55 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0496] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.398 min; ESI-MS(+) m/z 969.45 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.360 min; ESI-MS(+) m/z 969.75 (M+2H).

1

PRIMER 56 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 55

[0497]

[0498] Primer 56 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0499] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

1

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 940.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 940.2 (M+2H).

PRIMER 57 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 56

[0500]

[0501] Primer 57 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0502] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1%

1

trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.714 min; ESI-MS(+) m/z 1882.85 (M+1), 941.90 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.532 min; ESI-MS(+) m/z 941.90 (M+2).

PRIMER 58 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 57

[0503]

[0504] Primer 58 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja",

1

"Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0505] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.68 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.714 min; ESI-MS(+) m/z 1868.85 (M+1), 934.85 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.526 min; ESI-MS(+) m/z 934.65 (M+2).

PRIMER 59 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 58

[0506]

1 1

[0507] Primer 59 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0508] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.45 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.454 min; ESI-MS(+) m/z 1879.90 (M+1), 940.55 (M+2).

PRIMER 60 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 59

1 2

[0510] Primer 60 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0511] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94.4%.

1

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.452 min; ESI-MS(+) m/z 947.60 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.257 min; ESI-MS(+) m/z 947.65 (M+2).

PRIMER 61 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 60

[0512]

[0513] Primer 61 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0514] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-

1 4

mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92.5%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.800 min; ESI-MS(+) m/z 1751.85 (M+1), 876.35 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.620 min; ESI-MS(+) m/z 876.35 (M+2).

PRIMER 62 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 61

[0515]

[0516] Primer 62 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B

1

kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0517] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.616 min; ESI-MS(+) m/z 899.40 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.558 min; ESI-MS(+) m/z 899.35 (M+2H).

PRIMER 63 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 62

[0518]

1

[0519] Primer 63 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0520] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.575 min; ESI-MS(+) m/z 1779.90 (M+1), 890.30 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 889.9 (M+2H).

PRIMER 64 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 63

[0521]

1

[0522] Primer 64 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0523] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 890.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 890.3 (M+2H).

1

PRIMER 65 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 64

[0524]

[0525] Primer 65 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0526] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.4%.

1

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.847 min; ESI-MS(+) m/z 935.70 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.658 min; ESI-MS(+) m/z 935.60 (M+2).

PRIMER 66 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 65

[0527]

[0528] Primer 66 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0529] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-

1

mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.44 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.605 min; ESI-MS(+) m/z 926.95 (M+2).

PRIMER 67 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 66

[0530]

[0531] Primer 67 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena

1 1

procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0532] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.41 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.3%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.388 min; ESI-MS(+) m/z 914.35 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.228 min; ESI-MS(+) m/z 914.30 (M+2).

PRIMER 68 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 67

[0533]

1 2

[0534] Primer 68 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0535] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja=1.659 min; ESI-MS(+) m/z 1886.80 (M+1), 943.90 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja=1.449 min; ESI-MS(+) m/z 943.90 (M+2).

1

PRIMER 69 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 68

[0536]

[0537] Primer 69 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0538] Materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-50% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

1 4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja= 1.402 min; ESI-MS(+) m/z 1812.80 (M+1), 906.80 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja=1.216 min; ESI-MS(+) m/z 906.80 (M+2).

PRIMER 70 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 69

[0539]

[0540] Primer 70 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0541] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

1

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja=1.590 min; ESI-MS(+) m/z 1872.85 (M+1), 936.90 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja=1.377 min; ESI-MS(+) m/z 936.65 (M+2).

PRIMER 71 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 70

[0542]

[0543] Primer 71 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0544] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

1

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.9%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.80 min; ESI-MS(+) m/z 920.1 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.01 min.

1

� PRIMER 72 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 71

[0545]

[0546] U polipropilenski sud od 40 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Leu-OH; "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Tyr(tBu)-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Sar-OH; "Prelude Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Tyr(tBu)-OH korišćenjem 10ekv tokom 10h;

1

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-[N-Me]Phe-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Val-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Asp(OtBu)-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Sar-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Phe-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Phe-OH;

"Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom” je praćena; “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” je praćena;

"Ciklizaciona metoda C" je praćena.

[0547] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-95% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 28.6 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 98% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% B u A tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.451 min; ESI-MS(+) m/z 899.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 898.4313 (M+2H); Nađeno: 898.4294.

PRIMER 73 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 72

[0548]

2

[0549] Primer 73 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0550] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.85 min; ESI-MS(+) m/z 860.96 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.696 min.

PRIMER 74 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 73

2 1

[0552] Primer 74 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0553] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.87 min; ESI-MS(+) m/z 861.1 (M+2). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.82 min.

PRIMER 75 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 74

2 2

[0555] Primer 75 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0556] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.98 min; ESI-MS(+) m/z 1783.2 (M+1).

2

PRIMER 76 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 7

[0557]

[0558] Primer 76 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0559] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.6%.

2 4

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.83 min; ESI-MS(+) m/z 1754.7 (M+H), 878.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.44 min.

PRIMER 77 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 76

[0560]

[0561] Primer 77 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0562] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

2

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.610 min; ESI-MS(+) m/z 1782.75 (M+1), 891.60 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.775 min; ESI-MS(+) m/z 892.10 (M+2).

PRIMER 78 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 77

[0563]

[0564] Primer 78 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E". Fmoc-N-Me-Ala-OH je korišćen u jedanaestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

2

[0565] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.7%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.94 min; ESI-MS(+) m/z 1811.1 (M+H), 906.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 16.38 min.

PRIMER 79 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 78

[0566]

[0567] Primer 79 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

2

[0568] Materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja=1.591 min; ESI-MS(+) m/z 1782.80 (M+1), 891.85 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja=1.634 min; ESI-MS(+) m/z 891.60 (M+2).

PRIMER 80 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 79

[0569]

[0570] Primer 80 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0571] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10 1000% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.7%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.94 min; ESI-MS(+) m/z 1753.8 (M+H), 877.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 16.19 min.

PRIMER 81 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 80

[0572]

2

[0573] Primer 81 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0574] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-1000% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.86 min; ESI-MS(+) m/z 1769.0 (M+H), 884.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.89 min.

PRIMER 82 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 81

21

[0576] Primer 82 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0577] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: 4 x 2 mL ubrizgavanja na 30 x 100 C18 koloni sa gradijentom od 10 do 100% Acetonitril u vodi, 0.1% TFA kao modifikator tokom 20 minuta. Prinos proizvoda je bio 4.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.85 min; ESI-MS(+) m/z 861.0 (M+2). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.249 min.

PRIMER 83 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 82

[0578]

[0579] Primer 83 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0580] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.587 min; ESI-MS(+) m/z 1782.75 (M+1), 891.65 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.750 min; ESI-MS(+) m/z 891.70 (M+2).

PRIMER 84 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 83

[0581]

[0582] Primer 84 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0583] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: 4 x 2 mL ubrizgavanja na 30 x 100 C18 koloni sa gradijentom od 10 do 100% Acetonitril u vodi, 0.1% TFA kao modifikator tokom 20 minuta. Prinos proizvoda je bio 1.04 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.91min; ESI-MS(+) m/z 852.8 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 16.012 min.

21

PRIMER 85 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 84

[0584]

[0585] Primer 85 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0586] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: 4 x 2 mL ubrizgavanja na 30 x 100 C18 koloni sa gradijentom od 10 do 100% Acetonitril u vodi, 0.1% TFA kao modifikator tokom 20 minuta. Prinos proizvoda je bio 1.01 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.93 min; ESI-MS(+) m/z 906.3 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 16.484 min.

PRIMER 86 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 85

[0587]

[0588] Primer 86 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0589] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

21

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.611 min; ESI-MS(+) m/z 1782.70 (M+1), 891.80 (M+2).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.783 min; ESI-MS(+) m/z 891.95 (M+2).

PRIMER 87 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 86

[0590]

[0591] Primer 87 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0592] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: 4 x 2 mL ubrizgavanja na 30 x 100 C18 koloni sa gradijentom od 10 do 100% Acetonitril u vodi, 0.1% TFA kao modifikator tokom 20 minuta. Prinos proizvoda je bio 1.53 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 97%.

21

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.92min; ESI-MS(+) m/z 852.3 (M+2). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 16.044 min.

PRIMER 88 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 87

[0593]

[0594] Primer 88 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda E".

[0595] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: 4 x 2 mL ubrizgavanja na 30 x 100 C18 koloni sa gradijentom od 10 do 100% Acetonitril u vodi, 0.1% TFA kao modifikator tokom 20 minuta. Prinos proizvoda je bio 1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja =0.88 min; ESI-MS(+) m/z 877.1 (M+2H).

21

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 15.511 min.

21

PRIMER 89 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 88 SULFOKSID DIASTEREOMERNA SMEŠA JEDINJENJA BR. 1

[0596]

21

[0597] Primer 89 [Jedinjenje br. 88] je pripremljen oksidacijom makrocikličnog peptida Primera 2 korišćenjem sledeće procedure: u rastvor makrocikličnog peptida Primera 2 (1.6 mg) u 1 mL 50 mM NH4HCO4/Acetonitril (1:1) je dodat 1 mg/mL rastvor m-hlorobenzoeve kiseline (0.9 ekv) u acetonitrilu. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h.

[0598] Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 20-75% B u A tokom 55 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 0.91 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.16 min; ESI-MS(+) m/z 935.4 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov A: Vremena zadržavanja = 9.19 min i 9.41 min za delimično razdvojene diastereomere.

PRIMER 90. SINTEZA JEDINJENJA SA BROJEVIMA 89 I 90

[SULFOKSIDI jedinjenja br. 71]

22

[0600] Sinteza jedinjenja Primera 90 (Jedinjenje sa brojevima 89 i 90) je izvedena oksidacijom makrocikličnog peptida Primera 71 korišćenjem sledeće procedure: u rastvor peptida Primera 71 (1.4 mg) u 1 mL od 50 mM NH4HCO4/Acetonitril (1:1) je dodat 1 mg/mL rastvor u Acetonitrilu m-hlorobenzoeve kiseline (m-CPBA) (0.9 ekv). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h.

[0601] Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u AcCN; gradijent: 20-75% B tokom 55 min.; Protok: 15 mL/min. Dva izomerna proizvoda su razdvojena, Izomer A (Jedinjenje br.89) i Izomer B (Jedinjenje br.90). Frakcije koje su ih sadržale su kombinovane i osušene liofilizacijom.

[0602] Prinos brže eluirajućeg Izomera A (Jedinjenje br. 89) je bio 0.49 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 907.4 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov G: Vreme zadržavanja = 12.72 min.

[0603] Prinos sporije eluirajućeg Izomera B (Jedinjenje br. 90) je bio 0.49 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 907.4 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov G: Vreme zadržavanja = 13.61 min.

PRIMER 92 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 91

[0604]

[0605] Primer 92 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina". Fmoc-Asp(O-2-PhiPr)-OH je korišćen kao ortogonalna zaštita Asp<14>ostatka. Nakon poslednjeg Fmoc uklanjanja, peptidilsmola je iscepana iz čvrstog oslonca tretiranjem toga četiri puta sa DCM/TIS/TFA (96:3:1; v:v:v) (4 mL) tokom 5 min. Ovaj korak je takođe uklonio 2-fenilizopropil estar iz Asp<14>ostatka.

Zaštićeni peptid (70.4 mg) je ciklizovan korišćenjem 1 ekv. T3P (50% EtOAc) i 2 ekv. od DIEA u (1:1) Acetonitril/DCM (20 mL). Reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 18 h. Rastvarači su uklonjeni pod smanjenim pritiskom rezultujuća čvrsta supstanca je tretirana sa (50:46:4) TFA/DCM/TIS (4 mL) tokom 1.5 h na st. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu. Dodavanje etra (20 mL) i hlađenje do 0 °C tokom 15 min, proizvelo je čvrstu supstancu, koja je oprana sa etrom i osušena, da se dobije 27 mg sirovog proizvoda. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 20-60% B tokom 60 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 1.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.97 min.; ESI-MS(+) m/z 904.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 10.11 min.

PRIMER 93 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 92

[0606]

22

[0607] Primer 93 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 92, osim što Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH je korišćen na poziciji 14. Nakon oslobađanja zaštićenog peptida sa čvrstog oslonca, T3P-posredovana ciklizacija rezultujućeg zaštićenog peptida i TFA-posredovano uklanjanje zaštite bočnog lanca dalo je sirov proizvod (28 mg), koji je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 25-75% B tokom 75 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 97.5%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 3.88 min.; ESI-MS(+) m/z 911.08 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov H: vreme zadržavanja = 12.04 min.

PRIMER 94 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 93

[0608]

[0609] Primer 94 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 92, osim što je dodatni Fmoc-Gly-OH kuplovan na N-terminusu. Nakon oslobađanja sa čvrstog oslonca, T3P-posredovana ciklizacija rezultujućeg zaštićenog peptida i TFA-posredovano uklanjanje zaštite bočnog lanca, sirov proizvod (25 mg) je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 20-60% B tokom 60 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 1.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.00 min.; ESI-MS(+) m/z 932.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 11.07 min.

PRIMER 95 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 94

[0610]

22

[0611] Primer 95 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 93, osim što je dodatni Fmoc-Gly-OH kuplovan na N-terminusu. Nakon oslobađanja sa čvrstog oslonca, T3P-posredovana ciklizacija rezultujućeg zaštićenog peptida i TFA-posredovano uklanjanje zaštite bočnog lanca, sirov proizvod (25 mg) je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 20-60% B tokom 60 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov G: vreme zadržavanja = 4.27 min.; ESI-MS(+) m/z 939.5 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 13.76 min.

PRIMER 96 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 95

[0612]

22

[0613] Primer 96 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina". Fmoc-Asp(O-2-PhiPr)-OH je korišćen kao ortogonalna zaštita Asp<13>ostatka. Nakon poslednjeg Fmoc uklanjanja, peptidilsmola je iscepana iz čvrstog oslonca tretiranjem toga pet puta sa DCM/TIS/TFA (96:3:1; v:v:v) (5 mL) tokom 1 min. Ovaj korak je takođe uklonio 2-fenilizopropil estar sa Asp<13>ostatka. Filtrati su sakupljeni u sudu koji sadrži 1.5 mL piridina. Filtrati su zatim ekstrahovani sa vodom (3 x 5mL). Organska faza je osušena da se dobije ulje, koje je zatim liofilizovano iz MeCN/voda (1:2) da se dobije čvrst proizvod (100 mg). deo proizvoda (34 mg, 0.017 mmol) je ciklizovan korišćenjem 1 ekv. HATU i 2 ekv. Od DIEA u (1:9) DMF/DCM (17 mL). Reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 18 h. Rastvarači su uklonjeni pod smanjenim pritiskom rezultujuća čvrsta supstanca je tretirana sa (95:5) TFA/TIS (6 mL) tokom 5 min. na st. Dodavanje etra (20 mL) proizvelo je čvrstu supstancu, koja je oprana sa etrom i osušena. Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 30-95% B tokom 50 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije.

22

Prinos proizvoda je bio 1.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.40 min.; ESI-MS(+) m/z 904.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov G: vreme zadržavanja = 13.54 min.

PRIMER 97 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 96

[0614]

[0615] Primer 97 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja". Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH je korišćen kao ortogonalna zaštita za Glu<13>ostatak. Nakon poslednjeg Fmoc uklanjanja, peptidil-smola je iscepana iz čvrstog oslonca tretiranjem toga pet puta sa DCM/TIS/TFA (96:3:1; v:v:v) (5 mL) tokom 1 min. Ovaj korak je takođe uklonio 2-fenilizopropil estar iz Glu<13>ostatka. Filtrati su sakupljeni u sudu koji sadrži1.5 mL piridin i zatim su ektrahovani sa vodom (3 x 5mL). Organska faza je uparena da se dobije ulje, koje je zatim liofilizovano iz MeCN/voda (1:2) da

22

se dobije čvrst proizvod (36 mg). Peptidu je uklonjena zaštita korišćenjem TFA/TIS/voda (96:2:2:) tokom 5 minuta i zatim je precipitiran u etru, opran sa etrom i osušen. Zaštićeni peptid (32 mg, 0.015 mmol) mg) je ciklizovan korišćenjem 1 ekv. od HATU i 2 ekv. od DIEA u DMF (30 mL). Reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 18 h. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostatak je precipitiran sa vodom, opran i osušen. Rezultujuća čvrsta supstanca je tretirana sa (48:48:4) TFA/DCM/TIS (3 mL) tokom 5 min. na sobnoj temperaturi. Dodavanje etra (20 mL) proizvelo je čvrstu supstancu, koja je oprana sa etrom i osušena, da se dobije čvrst proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice, zagrejano do 60 °C; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 20-60% B tokom 60 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 0.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov C: vreme zadržavanja = 1.63 min.; ESI-MS(+) m/z 911.9 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov I: vreme zadržavanja = 12.50 min.

PRIMER 98 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 97

[0616]

22

[0617] Primer 98 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina". Fmoc-Asp(O-2-PhiPr)-OH je korišćen kao ortogonalna zaštita Asp<13>ostatka. Nakon poslednjeg Fmoc uklanjanja, peptidilsmola je iscepana iz čvrstog oslonca tretiranjem toga pet puta sa DCM/TIS/TFA (96:3:1; v:v:v) (5 mL) tokom 1 min. Ovaj korak je takođe uklonio 2-fenilizopropil estar iz Asp<13>ostatka. Filtrati su sakupljeni u sudu koji sadrži1.5 mL piridina. Filtrati su zatim ekstrahovani sa vodom (3 x 5 mL). Organska faza je osušena da se dobije ulje, koje je zatim liofilizovano iz MeN/voda (1:2) da se dobije čvrst proizvod (97 mg). Deo proizvoda (35 mg, 0.017 mmol) je ciklizovan korišćenjem 1 ekv. HATU i 2 ekv. DIEA u (1:9) DMF/Acetonitril (17 mL). Reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 18 h. Rastvarači su uklonjeni pod smanjenim pritiskom ostatak je ponovo rastvoren u Acetonitrilu (1 mL) i zatim precipitiran sa vodom (2 mL). Sakupljen peptid je ponovo rastvoren u DCM i ektrahovan sa vodom (2 x 5mL). Organski sloj je zatim osušen preko natrijum sulfata, filtriran i osušen da se dobije 97 mg zaštićenog peptida. Ovo je tretirano sa (95:5) TFA/TIS (6 mL) tokom 5 min na st. Dodavanje etra (20 mL) proizvelo je čvrstu supstancu, koja je oprana sa etrom i osušena. Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 30-95% B tokom 50 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže

2

željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 1.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 82%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.42 min.; ESI-MS(+) m/z 876.2 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov G: vreme zadržavanja = 14.01 min.

PRIMER 99 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 98

[0618]

[0619] Primer 99 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 6, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sekundarnog amina". Sinteza je započela od H-Gly-2-Cl-tritil smola (Novabiochem, 0.6 mmol/g). Nakon poslednjeg Fmoc uklanjanja, peptidilsmola je iscepana iz čvrstog oslonca tretiranjem toga pet puta sa DCM/TIS/TFA (96:3:1; v:v:v) (5 mL) tokom 1 min. Filtrati su sakupljeni u sudu koji sadrži 1.5 mL piridina. Filtrati su zatim ekstrahovani sa vodom (3 x 5mL). Organska faza je uparena da se dobije ulje, koje je zatim liofilizovano iz MeCN/voda (1:2) da se dobije čvrst proizvod (221 mg). Deo proizvoda (10 mg,

2 1

0.005 mmol) je ciklizovan korišćenjem 1 ekv. od HATU i 2 ekv. DIEA u (1:9) DMF/DCM (17 mL). Reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 18 h. Rastvarači su uklonjeni pod smanjenim pritiskom ostatak je ponovo rastvoren u Acetonitrilu (1 mL) i zatim precipitiran sa vodom (2 mL). Sakupljen peptid je ponovo rastvoren u DCM i ektrahovan sa vodom (2 x 5mL). Organski sloj je zatim osušen preko natrijum sulfata, filtriran i osušen da se dobije 17 mg zaštićenog peptida. Ovo je tretirano sa (95:5) TFA/TIS (6 mL) tokom 5 min. na sobnoj temperaturi. Dodavanje etra (20 mL), i hlađenje do 0 °C tokom 10 min. proizvelo je čvrstu supstancu, koja je oprana sa etrom i osušena. Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne LC/MS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® C18 Luna, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 30-95% B tokom 50 minuta; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko liofilizacije. Prinos proizvoda je bio 0.81 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.55 min.; ESI-MS(+) m/z 819.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov G: vreme zadržavanja = 16.15 min.

TABELA 4 - FORMULA III PEPTIDNA SERIJA<±>

2 2

PRIMER 100 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 99

[0620]

2

[0621] Primer 100 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 19, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda B: Procedura dvostrukog kuplovanja" za kuplovanja za N-terminus primarnog amina; "Prelude Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina" za kuplovanja za N-terminus sekundarnog amina; "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda A".

[0622] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.90 min.; ESI-MS(+) m/z 817.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 9.21 min.

PRIMER 101 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 100

2 4

[0624] Primer 101 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0625] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 15-55% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.82 min.; ESI-MS(+) m/z 839.1 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov E: vreme zadržavanja = 10.22 min.

PRIMER 102 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 101

2

[0627] Primer 102 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0628] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.93 min.; ESI-MS(+) m/z 834.8 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 9.57 min.

PRIMER 103 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 102

2

[0630] Primer 103 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0631] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.05 min.; ESI-MS(+) m/z 834.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 12.03 min.

PRIMER 104 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 103

2

[0633] Primer 104 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0634] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.94 min.; ESI-MS(+) m/z 817.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 9.61 min.

PRIMER 105 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 104

[0635]

2

[0636] Primer 105 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0637] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.96 min.; ESI-MS(+) m/z 834.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 10.20 min.

PRIMER 106 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 105

[0638]

2

[0639] Primer 106 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0640] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 7.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.93 min.; ESI-MS(+) m/z 849.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 9.43 min.

PRIMER 107 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 106

[0641]

24

[0642] Primer 107 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0643] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.00 min.; ESI-MS(+) m/z 841.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 10.80 min.

PRIMER 108 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 107

[0644]

[0645] Primer 108 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0646] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 8.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.90 min.; ESI-MS(+) m/z 810.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 8.70 min.

PRIMER 109 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 108

[0647]

[0648] Primer 109 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0649] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.89 min.; ESI-MS(+) m/z 808.1 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 8.65 min.

PRIMER 110 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 109

[0650]

24

[0651] Primer 110 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0652] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 30-80% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.18 min.; ESI-MS(+) m/z 796.3 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: vreme zadržavanja = 9.00 min.

PRIMER 111 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 110

[0653]

[0654] Primer 111 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0655] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 3.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.96 min.; ESI-MS(+) m/z 824.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 9.98 min.

PRIMER 112 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 111

[0656]

24

[0657] Primer 112 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0658] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 13 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.98 min.; ESI-MS(+) m/z 841.5 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 10.49 min.

PRIMER 113 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 112

[0659]

24

[0660] Primer 113 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0661] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 5.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 0.95 min.; ESI-MS(+) m/z 849.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 9.72 min.

PRIMER 114 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 113

[0662]

24

[0663] Primer 114 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0664] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov A: vreme zadržavanja = 1.02 min.; ESI-MS(+) m/z 821.1 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: vreme zadržavanja = 11.30 min.

PRIMER 115 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 114

[0665]

24

[0666] Primer 115 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0667] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 12.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.06 min; ESI-MS(+) m/z 788.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: Vreme zadržavanja = 11.88 min.

PRIMER 116 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 115

24

[0669] Primer 116 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[0670] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-60% B tokom 40 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.95 min; ESI-MS(+) m/z 834.5 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov F: Vreme zadržavanja = 10.01 min.

2

PRIMER 117 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 116

21

[0672] Primer 117 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda globalnog uklanjanja zaštite E", i "Ciklizaciona metoda C". Početna smola je bila Fmoc-PEG12-Sieber amid smola (0.05 mmol), koja je pripremljena manuelno kuplovanjem O-(N-Fmoc-2-aminoetil)-O'-(2-karboksietil)-undekaetilenglikola u Sieber Amid smolu u skladu sa sledećom procedurom: Seiber Amid Smola (0.60 mmol, 0.846 g, 0.71 mmol/g) je oprana sa DCM (8 mL) tokom 5 min. i DMF (8 mL) tokom 5 min. Smola je tretirana dva puta sa 5% piperazinom u DMF (8 mL) tokom 5 min i zatim oprana jednom sa metanolom (8 mL) i šest puta sa DMF (8 mL). U rastvor O-(N-Fmoc-2-aminoetil)-O'-(2-karboksietil)-undekaetilenglikol (0.715 g, 0.851 mmol) u DMF (4 mL) je dodat 0.45 M HCTU u DMF (1.8 ml, 0.810 mmol) i 2 M DIEA u NMP (0.85 ml, 1.70 mmol). Rezultujući rastvor je mešan i dodat u smolu. Reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 18 h. Smola je oprana tri puta sa DMF (8 mL) i tri puta sa DCM ispiranjima (8 mL). Fmoc determinacija na alikvotu suve smole obezbedila je supstituciju od 0.26 mmol/g. Ovo je korišćeno da se utvrdi količina početne smole ekvivalentne sa 0.05 ili 0.1 mmol, uzavisnosti od skale koja je potrebna.

2 2

[0673] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-80% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 6.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.31 min.; ESI-MS(+) m/z 1226.6 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov B: Vreme zadržavanja = 16.08 min.

PRIMER 118 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 117

[0674]

[0675] Primer 118 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, "Metoda globalnog uklanjanja zaštite E", i "Ciklizaciona metoda C". Početna smola je bila Fmoc-PEG12-Sieber amid smola (0.05 mmol), pripremljena kao što je opisano u Primer 117.

2

[0676] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 25-50% B tokom 50 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 3.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 91.4%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.22 min; ESI-MS(+) m/z 1260.1 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov B: Vreme zadržavanja = 14.75 min.

PRIMER 119 - SINTEZA JEDINJENJA BR. 118

[0677]

[0678] Primer 119 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 2, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "CEM Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". Početna smola je bila Fmoc-PEG12-Sieber amid smola (0.05 mmol), pripremljen kao što je opisano u Primer 117.

2 4

[0679] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC ODS-AQ, 20 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u MeCN; gradijent: 20-90% B tokom 60 min.; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene liofilizacijom. Prinos proizvoda je bio 5.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 1198.7 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov K: Vreme zadržavanja = 14.22 min.

Prilagođene aminokiseline

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(ciklobutankarboksamido) propionska kiselina

[0680]

[0681] Ciklobutankarbonil hlorid (72.7 mg, 0.613 mmol) i NaOH (0.735 mL, 0.735 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-aminopropionske kiseline (200mg, 0.613 mmol) u THF (1.5mL) i Nod aOH (IN, 0.8mL) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x1). Sirov je prečišćen preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (156 mg, 61%).

2

[0682] Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.94 min; ESI-MS(+) m/z 409.1 (M+H).

[0683]<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.80 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.67 (br s, 2H), 7.44 - 7.35 (m, 2H), 7.35 - 7.27 (m, 2H), 4.37 - 4.31 (m, 2H), 4.23 (s, 1H), 3.55 - 3.48 (m, 1H), 3.14 (s, 2H), 2.31 - 2.08 (m, 7H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(ciklopentankarboksamido) propionska kiselina

[0684]

[0685] Ciklopentankarbonil hlorid (81 mg, 0.613 mmol) i NaOH (0.735 mL, 0.735 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-aminopropionske kiseline (200mg, 0.613 mmol) u THF(1.5 mL) i od NaOH (IN, 0.8 mL) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1). Sirov je prečišćen preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (142 mg, 54%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja= 0.99 min; ESI-MS(+) m/z 423.1 (M+H).

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.80 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.67 (t, J=6.4 Hz, 2H), 7.44 - 7.37 (m, 2H), 7.35 - 7.27 (m, 2H), 4.38 - 4.31 (m, 2H), 4.27 - 4.19 (m, 1H), 3.69 -3.47 (m, 2H), 2.61 (s, 1H), 1.88 - 1.53 (m, 9H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-benzamidopropionska kiselina

2

[0687] Benzoil hlorid (86 mg, 0.613 mmol) i NaOH (0.735 mL, 0.735 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-aminopropionske kiseline (200 mg, 0.613 mmol) u THF (1.5 mL) i od NaOH (IN, 0.8 mL) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1). Sirov je prečišćen preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (149 mg, 52%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.96 min; ESI-MS(+) m/z 431.0 (M+H).

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.84 - 7.75 (m, 4H), 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.52 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.48 - 7.41 (m, 2H), 7.37 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 2H), 4.54 - 4.47 (m, 1H), 4.33 (dd, J=7.0, 3.3 Hz, 2H), 4.24 - 4.17 (m, 1H), 3.89 - 3.73 (m, 2H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(ciklobutankarboksamido) buterna kiselina

[0688]

[0689] Ciklobutankarbonil hlorid (69.7 mg, 0.588 mmol) i NaOH (0.705 mL, 0.705 mmol) su

2

spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-aminobuterne kiseline (200 mg, 0.588 mmol) u THF(1.5 mL) i od NaOH (1N, 0.7 mL) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1). Sirov je prečišćen preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (92.6 mg, 37%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja= 0.94 min; ESI-MS(+) m/z 423.1 (M+H).

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.80 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.72 - 7.65 (m, 2H), 7.43 -7.36 (m, 2H), 7.35 - 7.28 (m, 2H), 4.41 - 4.32 (m, 2H), 4.28 - 4.15 (m, 2H), 3.20 (d, J=7.0 Hz, 1H), 3.08 (s, 1H), 2.31 - 2.04 (m, 6H), 1.97 (d, J=9.9 Hz, 1H), 1.84 (d, J=7.3 Hz, 2H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(ciklopentankarboksamido) buterna kiselina

[0690]

[0691] Ciklopentankarbonil hlorid (78 mg, 0.588 mmol) i NaOH (0.705 mL, 0.705 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-aminobuterne kiseline (200 mg, 0.588 mmol) u THF(1.5 mL) i od NaOH (IN, 0.7 mL) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1).

2

Sirovi materijali su prečišćeni preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (84.1mg, 33%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja= 0.98 min; ESI-MS(+) m/z 437.1 (M+H).

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.79 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.72 - 7.64 (m, 2H), 7.42 -7.35 (m, 2H), 7.34 - 7.26 (m, 2H), 4.41 - 4.30 (m, 2H), 4.26 - 4.14 (m, 2H), 3.24 - 3.13 (m, 1H), 2.59 (t, J=7.8 Hz, 1H), 2.05 (s, 1H), 1.91 - 1.62 (m, 8H), 1.64 - 1.50 (m, 2H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(cikloheksankarboksamido) buterna kiselina

[0692]

[0693] Cikloheksankarbonil hlorid (86 mg, 0.588 mmol) i NaOH (0.705 mL, 0.705 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-aminobuterne kiseline (200 mg, 0.588 mmol) u THF(1.5 mL) i od NaOH (1N, 0.7 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1). Sirovi materijali su prečišćeni preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (201 mg, 70%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.01 min; ESI-MS(+) m/z 451.2 (M+H).

2

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4): δ 7.79 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.73 - 7.65 (m, 2H), 7.43 -7.35 (m, 2H), 7.34 - 7.26 (m, 2H), 4.42 - 4.30 (m, 2H), 4.27 - 4.15 (m, 2H), 3.18 (d, J=7.3 Hz, 1H), 2.15 (s, 1H), 2.10 - 2.01 (m, 1H), 1.89 - 1.72 (m, 5H), 1.68 (d, J=10.3 Hz, 1H), 1.49 - 1.17 (m, 6H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-benzamidobuterna kiselina

[0694]

[0695] Benzoil hlorid (83 mg, 0.588 mmol) i NaOH (0.705 mL, 0.705 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-aminobuterna kiselina (200 mg, 0.588 mmol) u THF (1.5 mL) i od NaOH (IN, 0.7 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1). Sirov je prečišćen preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (160 mg, 57%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.97 min; ESI-MS(+) m/z 445.1 (M+H).

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.82 (t, J=8.6 Hz, 4H), 7.74 - 7.67 (m, 2H), 7.56 -7.50 (m, 1H), 7.49 - 7.42 (m, 2H), 7.42 - 7.36 (m, 2H), 7.35 - 7.26 (m, 2H), 4.39 (dd, J=7.0, 2.0 Hz, 2H), 4.32 - 4.21 (m, 2H), 3.62 - 3.52 (m, 1H), 3.45 - 3.35 (m, 1H), 2.20 (d, J=5.1 Hz, 1H), 1.99 (d, J=8.1 Hz, 1H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(furan-2-karboksamido)buterna kiselina

2

[0697] Furan-2-karbonil hlorid (77 mg, 0.588 mmol) i NaOH (0.705 mL, 0.705 mmol) su spušteni u isto vreme u mešani rastvor (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-aminobuterne kiseline (200 mg, 0.588 mmol) u THF (1.5 mL) i od NaOH (1N, 0.7 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h u koje vreme LC-MS je pokazala željeni pik proizvoda. Reakcioni rastvor je zakiseljen sa IN HCl i ektrahovan sa EtOAc (60 mL x 1). Sirov je prečišćen preko fleš hromatografije (ISCO, silika gel, 12 g kolona; stopa protoka 30 mL/min, 100% DCM do 20% MeOH/DCM). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije da se dobije jedinjenje iz naslova (107 mg, 41%).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.92 min; ESI-MS(+) m/z 435.0 (M+H).

<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.80 (d, J=7.7 Hz, 2H), 7.73 - 7.66 (m, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.44 - 7.35 (m, 2H), 7.34 - 7.26 (m, 2H), 7.09 (d, J=3.3 Hz, 1H), 6.56 (dd, J=3.4, 1.7 Hz, 1H), 4.41 - 4.35 (m, 2H), 4.28 - 4.19 (m, 2H), 3.51 (dd, J=13.8, 7.4 Hz, 1H), 3.43 - 3.34 (m, 1H), 2.24 - 2.12 (m, 1H), 1.94 (d, J=7.3 Hz, 1H).

Intermedijerne smole za Primere 1001-3000

Pripremanje Intermedijerne smole A.

[0698]

2 1

[0699] U reaktor od 125 mL dodata Sieber smola (1410 mg, 1 mmol) i posuda je postavljen na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Arg(PBF)-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Trp-OH korišćenjem 2.5 ekv. tokom 30 minuta;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Ser(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp-OH.

[0700] Rezultujuća smola je prebačena u polipropilensku epruvetu od 100 mL i oprana DCM (40 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu.

[0701] Mikrocepanje A je praćeno.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.89 min, ESI-MS(+) m/z 1271.2 (M+H).

2 2

Pripremanje Intermedijerne smole B.

[0702]

[0703] U reaktor od 125 mL je dodata Sieber smola (1410 mg, 1 mmol), i posuda je postavljen on CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Arg(PBF)-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Ser(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Sar-OH;

2

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Leu-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-His(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Pro-OH; "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Asn(tBu)-OH.

[0704] Rezultujuća smola je prebačena u polipropilensku epruvetu od 100 mL opremljenu sa fritom i opranu sa DCM (40 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu.

[0705] Mikrocepanje A je praćeno.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.0 min, ESI-MS(+) m/z 966.6 (M+2H 1CO2).

Pripremanje Intermedijerne smole C.

[0706]

[0707] U reaktor od 125 mL je dodata Rink Amid smola (1640 mg, 1 mmol), i posuda je

2 4

postavljen na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Dap(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Bzt-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Trp-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Dab(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Hyp(tBu)-OH;

[0708] Rezultujuća smola je prebačena u polipropilensku epruvetu od 100 mL opremljenu sa fritom i opranu sa DCM (40 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu.

[0709] Mikrocepanje A je praćeno.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.81 min, ESI-MS(+) m/z 672.2 (M+2H).

Pripremanje Intermedijerne smole D.

[0710]

2

[0711] U reaktor od 125 mL je dodata Rink smola (1640 mg, 1 mmol), i posuda je postavljen na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Orn(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Bzt-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Dab(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Hyp(tBu)-OH.

2

[0712] Rezultujuća smola je prebačena u polipropilensku epruvetu od 100 mL opremljenu sa fritom i opranu sa DCM (40 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu.

[0713] Mikrocepanje A je praćeno.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.77 min, ESI-MS(+) m/z 708.2 (M+2H 1CO2).

Pripremanje Intermedijerne smole E.

[0714]

[0715] U polipropilensku posudu od 45 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH;

2

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Orn(Boc)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-NMeNle-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-MeNleOH;

"Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Ser(tBu)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Hyp(tBu)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Leu-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-His(Boc)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Pro-OH; "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Asn(tBu)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja" je praćena

[0716] Rezultujuća smola je prebačena u Bio-Rad epruvetu od 6 mL opremljenu sa fritom i opranu sa DCM (4 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu. Sirov materijal je korišćen kao intermedijer za sintezu bez analize.

Pripremanje Intermedijerne smole F.

[0717]

2

[0718] U reaktor od 125 mL je dodata Rink smola (1640 mg, 1 mmol), i posuda je postavljen na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Arg(PBF)-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Bzt-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Ser(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Pro-OH; "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Leu-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-His(Trt)-OH;

2

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Pro-OH; "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Asn(tBu)-OH.

[0719] Rezultujuća smola je prebačena u polipropilensku epruvetu od 100 mL opremljenu sa fritom i opranu sa DCM (40 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu.

[0720] Mikrocepanje A je praćeno.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.83 min, ESI-MS(+) m/z 945.7 (M+2H).

Pripremanje Intermedijerne smole G.

[0721]

[0722] U polipropilensku posudu od 45 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-Orn(Boc)-OH;

2

"Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja” je praćena sa Fmoc-NMeNle-OH;

"Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja" je praćena sa Fmoc-MeNleOH;

"Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja" je praćena.

[0723] Rezultujuća smola je prebačena u Bio-Rad epruvetu opremljenu sa fritom i opranu DCM (4 mL x 3).

[0724] Mikrocepanje A je izvedena.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.91 min, ESI-MS(+) m/z 810.5 (M+H).

Pripremanje Intermedijerne smole H.

[0725]

[0726] U reaktor od 125 mL je dodata Rink smola (1640 mg, 1 mmol), i posuda je postavljen na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH;

2 1

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Orn(Alloc)-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom" je praćena sa Fmoc-Bzt-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Dab(Alloc)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Hyp(tBu)-OH.

[0727] Rezultujuća smola je prebačena u polipropilensku epruvetu od 100 mL opremljenu sa fritom i opranu sa DCM (40 mL x 3). Konačno, smola je osušena pod vakuumom i korišćena kao intermedijer za sintezu.

Pripremanje Primera 1001 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0728]

2 2

[0729] Primer 1001 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0730] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

2

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 841.20 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 841.20 (M+2H).

Pripremanje Primera 1002 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0731]

[0732] Primer 1002 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0733] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

2 4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 89%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 932.50 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 932.60 (M+2H).

Pripremanje Primera 1003 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0734]

[0735] Primer 1003 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B

2

kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0736] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja =1.59 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja =1.54 min; ESI-MS(+) m/z 944.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1004 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0737]

[0738] Primer 1004 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0739] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 902.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.20 min; ESI-MS(+) m/z 902.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1005 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0740]

2

[0741] Primer 1005 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0742] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 911.85 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 911.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1006 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0743]

2

[0744] Primer 1006 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0745] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64min; ESI-MS(+) m/z 943.90 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.54min; ESI-MS(+) m/z 944.25 (M+2H).

Pripremanje Primera 1007 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0746]

2

[0747] Primer 1007 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0748] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.83min; ESI-MS(+) m/z 946.10 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74min; ESI-MS(+) m/z 945.15 (M+2H).

Pripremanje Primera 1009 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[0750] Primer 1009 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0751] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja =1.77 min; ESI-MS(+) m/z 932.40 (M+2H).

2 1

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja =1.68 min; ESI-MS(+) m/z 932.20 (M+2H).

Pripremanje Primera 1010 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0752]

[0753] Primer 1010 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0754] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim

2 2

uslovima: Kolona: XBridge C18 300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 911.25 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 910.60 (M+2H).

Pripremanje Primera 1011 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0755]

[0756] Primer 1011 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-

2

Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(ciklobutankarboksamido)propionska kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0757] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45min; ESI-MS(+) m/z 947.65 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.39min; ESI-MS(+) m/z 947.35 (M+2H).

Pripremanje Primera 1012 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0758]

[0759] Primer 1012 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 11, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda

2 4

A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(ciklopentankarboksamido)propionska kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0760] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50min; ESI-MS(+) m/z 954.30 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43min; ESI-MS(+) m/z 954.20 (M+2H).

Pripremanje Primera 1013 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0761]

2

[0762] Primer 1013 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-benzamidopropionska kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0763] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-80% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 958.75 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 958.35 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 1014

[0764]

[0765] Primer 1014 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0766] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-50% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 956.30 (M+2H).

2

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja= 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 956.30 (M+2H).

Pripremanje Primera 1015 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0767]

[0768] Primer 1015 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0769] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 70% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

2

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 948.45 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 948.40 (M+2H).

Pripremanje Primera 1016 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0770]

[0771] Primer 1016 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0772] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1%

2

trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 948.20 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 948.15 (M+2H).

Pripremanje Primera 1017 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0773]

[0774] Primer 1017 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(cikloheksankarboksamido)propionska kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0775] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja =1.45 min; ESI-MS(+) m/z 961.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 961.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1018 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0776]

2 1

[0777] Primer 1018 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0778] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 941.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 942.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1019 (ne u skladu sa pronalaskom)

2 2

[0780] Primer 1019 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(ciklobutankarboksamido)buterna kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0781] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 982.50 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 982.25 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 1020 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0782]

[0783] Primer 1020 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(ciklopentankarboksamido)buterna kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0784] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B;

2 4

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 89%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 989.30 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 989.45 (M+2H).

Pripremanje Primera 1021 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0785]

[0786] Primer 1021 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-

2

Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(cikloheksankarboksamido)buterna kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0787] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 996.75 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 996.75 (M+2H).

Pripremanje Primera 1022 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0788]

[0789] Primer 1022 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja",

2

"Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-benzamidobuterna kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0790] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja =1.82 min; ESI-MS(+) m/z 993.35 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja =1.71 min; ESI-MS(+) m/z 993.45 (M+2H).

Pripremanje Primera 1023 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0791]

2

[0792] Primer 1023 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(furan-2-karboksamido)buterna kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0793] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja =1.76 min; ESI-MS(+) m/z 988.75 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja =1.68 min; ESI-MS(+) m/z 988.75 (M+2H).

Pripremanje Primera 1024 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0794]

2

[0795] Primer 1024 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0796] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja =1.87 min; ESI-MS(+) m/z 961.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja =1.78 min; ESI-MS(+) m/z 961.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1025 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[0798] Primer 1025 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0799] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1026 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0801] Primer 1026 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0802] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 944.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 944.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1028 (ne u skladu sa pronalaskom)

1

[0804] Primer 1028 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0805] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 945.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 945.6 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 1029 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0806]

[0807] Primer 1029 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0808] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 946.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 946.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1030 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0809]

[0810] Primer 1030 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0811] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 953.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 952.9 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1031 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0812]

[0813] Primer 1031 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0814] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-50% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 934.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1032 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0815]

[0816] Primer 1032 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0817] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 953.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 954.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1033 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0818]

[0819] Primer 1033 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(ciklobutankarboksamido)propionska kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0820] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 50% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 926.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.29 min; ESI-MS(+) m/z 926.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1034 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0821]

[0822] Primer 1034 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-4-(ciklobutankarboksamido)buterna kiselina je korišćena u “Prilagođenoj proceduri aminokiselinskog kuplovanja".

[0823] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 933.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.30 min; ESI-MS(+) m/z 933.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1035

[0824]

[0825] Primer 1035 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0826] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 965.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 964.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1036 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0827]

1

[0828] Primer 1036 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskogkuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0829] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 974.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 974.8 (M+2H).

11

Pripremanje Primera 1037

[0830]

[0831] Primer 1037 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0832] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

12

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 964.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1038 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0833]

[0834] Primer 1038 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0835] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B;

1

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47min; ESI-MS(+) m/z 927.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.32min; ESI-MS(+) m/z 927.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1039 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0836]

[0837] Primer 1039 je pratio generalni sintetički niz opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0838] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa

14

10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 936.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 935.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1040 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0839]

[0840] Primer 1040 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

1

[0841] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 913.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 912.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1041

[0842]

[0843] Primer 1041 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C:

1

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0844] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 942.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 942.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1042

[0845]

1

[0846] Primer 1042 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0847] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

1

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57min; ESI-MS(+) m/z 935.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.57min; ESI-MS(+) m/z 935.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1043 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0848]

[0849] Primer 1043 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0850] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna Axia C18, 30 x 250; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1%TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% TFA; Gradijent: 10-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99%.

1

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.9 min; ESI-MS(+) m/z 953.1 (M+2H). Analiza HPLC Uslov I: Vreme zadržavanja = 14.98 min.

Pripremanje Primera 1044 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0851]

[0852] Primer 1044 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0853] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno

2

zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 973.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 973.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1045 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0854]

[0855] Primer 1045 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0856] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

21

Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 964.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 964.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1046 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0857]

[0858] Primer 1046 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B

22

kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0859] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 964.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 963.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1047 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0860]

2

[0861] Primer 1047 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0862] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna Axia C18, 30 x 250; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.94 min; ESI-MS(+) m/z 967.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov I: Vreme zadržavanja = 15.58 min.

Pripremanje Primera 1048

[0863]

24

[0864] Primer 1048 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0865] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 974.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 974.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1049 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[0867] Primer 1049 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0868] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 914.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 913.8 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 1050 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0869]

[0870] Primer 1050 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0871] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

2

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 952.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1051

[0872]

[0873] Primer 1051 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0874] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

2

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 943.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1052 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0875]

[0876] Primer 1052 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

2

[0877] Sirov materijal je prečišćen preko 2 ubrizgavanja preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 30 x 100; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 0-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A Vreme zadržavanja = 0.8 min, ESI-MS(+) m/z 956.9 (M+H). Analiza HPLC Uslov G: Vreme zadržavanja = 7.8 min.

Analiza HPLC Uslov H: Vreme zadržavanja = 9.35 min.

Pripremanje Primera 1053 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0878]

[0879] Primer 1053 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0880] Sirov materijal je prečišćen preko 2 ubrizgavanja preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 30 x 100; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 0-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 0.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.78 min; ESI-MS(+) m/z 899.0 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 12.74 min.

Pripremanje Primera 1054 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0881]

[0882] Primer 1054 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C:

1

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0883] Sirov materijal je prečišćen preko 2 ubrizgavanja preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 30 x 100; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 0-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.81 min; ESI-MS(+) m/z 935.4 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.48 min.

Pripremanje Primera 1055 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0884]

2

[0885] Primer 1055 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0886] Sirov materijal je prečišćen preko 2 ubrizgavanja preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 30 x 100; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 0-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 1.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.81 min; ESI-MS(+) m/z 906.2 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.54 min.

Pripremanje Primera 1056 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0888] Primer 1056 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0889] Sirov materijal je prečišćen preko 2 ubrizgavanja preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 30 x 100; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 0-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 3.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99.2%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.78 min; ESI-MS(+) m/z 963.1 (M+2H).

4

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 12.33 min.

Pripremanje Primera 1057 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0890]

[0891] Primer 1057 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0892] Sirov materijal je prečišćen preko 2 ubrizgavanja preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 30 x 100; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 0-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 8.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99.5%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.71 min; ESI-MS(+) m/z 899.1 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 11.76 min.

Pripremanje Primera 1058 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0893]

[0894] Primer 1058 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0895] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 981.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 981.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1059 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0896]

[0897] Primer 1059 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0898] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 915.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 915.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1060 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0899]

[0900] Primer 1060 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0901] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 901.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 901.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1061 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0902]

[0903] Primer 1061 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0904] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 919.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 919.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1062 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0905]

4

[0906] Primer 1062 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0907] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µmčestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%trifluorosirćetna kiselina; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 908.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 908.8 (M+2H).

41

Pripremanje Primera 1063 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0908]

[0909] Primer 1063 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0910] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µmčestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

42

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 915.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 915.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1064 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0911]

[0912] Primer 1064 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0913] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno

4

zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 916.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 916.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1065 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0914]

[0915] Primer 1065 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

44

[0916] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 927.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 927.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1066 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0917]

[0918] Primer 1066 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B

4

kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0919] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-100% B tokom 30 minuta, Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC Analize je 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.78 min; ESI-MS(+) m/z 890.5 (M+2H).

Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.4 min.

Pripremanje Primera 1067 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0920]

4

[0921] Primer 1067 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0922] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-100% B tokom 30 minuta, Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC Analize je 95%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.93 min; ESI-MS(+) m/z 935.7 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.92 min.

Pripremanje Primera 1068 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0923]

4

[0924] Primer 1068 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0925] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona; PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-1000% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min, 22 ml ubrizgavanja. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100% korišćenjem Analiza Uslov J.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.79 min; ESI-MS(+) m/z 952.4 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 12.99 min.

Pripremanje Primera 1069 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0926]

4

[0927] Primer 1069 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0928] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona; PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 1000 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min, 22 ml ubrizgavanja. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 95.5% korišćenjem 3 metode LC analize Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.81 min; ESI-MS(+) m/z 947.5 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.13 min.

Analiza HPLC Uslov G: Vreme zadržavanja = 9.14 min.

Analiza HPLC Uslov H: Vreme zadržavanja = 10.76 min.

Pripremanje Primera 1070 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0929]

4

[0930] Primer 1070 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0931] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Kolona; PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min, 22 ml ubrizgavanja. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.82 min; ESI-MS(+) m/z 940.7 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.0 min.

Pripremanje Primera 1071 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0932]

[0933] Primer 1071 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0934] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima : Kolona PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm, 5-µm čestice; 0 do 100% Acetonitril u vodi sa 0.1% TFA kao modifikator, tokom 30 minuta. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.88 min; ESI-MS(+) m/z 905.7 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 14.83 min.

Pripremanje Primera 1072 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0935]

1

[0936] Primer 1072 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0937] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Column PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm, 5-µm čestice; 0 do 100% Acetonitril u vodi sa 0.1% TFA kao modifikator, tokom 30 minuta. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.7 min; ESI-MS(+) m/z 922.9 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 11.36 min.

Pripremanje Primera 1073 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0938]

2

[0939] Primer 1073 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0940] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Column PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm, 5-µm čestice; 0 do 100% Acetonitril u vodi sa 0.1% TFA kao modifikator, tokom 30 minuta. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.71 min; ESI-MS(+) m/z 902.7 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 11.15 min.

Pripremanje Primera 1074 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0941]

[0942] Primer 1074 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0943] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Column PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm, 5-µm čestice; 0 do 100% Acetonitril u vodi sa 0.1% TFA kao modifikator, tokom 30 minuta. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.84 min; ESI-MS(+) m/z 955.8 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.34 min.

Pripremanje Primera 1075 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0944]

4

[0945] Primer 1075 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0946] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC sa sledećim uslovima: Column PHENOMENEX® Luna C18, 30 x 100 mm, 5-µm čestice; 0 do 100% Acetonitril u vodi sa 0.1% TFA kao modifikator, tokom 30 minuta. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LC 100%.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 0.8 min; ESI-MS(+) m/z 948.9 (M+2H). Analiza HPLC Uslov J: Vreme zadržavanja = 13.34 min.

Pripremanje Primera 1076 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0947]

[0948] Primer 1076 je pripremljen na Fmoc-Gly-O-cltritil smoli, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0949] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 927.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 927.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1077 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0951] Primer 1077 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0952] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 922.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 922.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1078 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0954] Primer 1078 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0955] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 89%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 933.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 933.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1080 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0956]

[0957] Primer 1080 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3,4-dimetoksifenil)propionska kiselina je korišćena osmi korak aminokiselinskog kuplovanja.

[0958] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18 300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 937.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 937.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1081 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0959]

[0960] Primer 1081 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0961] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18 300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mMamonijum acetate; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1082 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0962]

1

[0963] Primer 1082 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0964] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 926.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 926.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1083 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[0966] Primer 1083 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (R)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metil-3-(tritilthio)buterna kiselina je korišćena drugi korak aminokiselinskog kuplovanja.

[0967] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 20- 70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.91 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 941.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 940.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1084

[0968]

[0969] Primer 1084 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0970] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 930.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 930.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1085 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0971]

[0972] Primer 1085 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-metoksifenil)propionska kiselina je korišćena u osmom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0973] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 922.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 922.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1086 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0974]

[0975] Primer 1086 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-metilfenil)propionska kiselina je korišćena u osmom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0976] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 914.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1087 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0977]

[0978] Primer 1087 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0979] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 948.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 947.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1088 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0980]

[0981] Primer 1088 je pripremljen od Intermedijerne Smole A, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0982] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 902.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 902.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1089 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0983]

[0984] Primer 1089 je pripremljen od Intermedijerne Smole A, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0985] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 934.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1090 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0986]

[0987] Primer 1090 je pripremljen od Intermedijerne Smole A, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0988] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 956.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 955.9 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 1091 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0989]

[0990] Primer 1091 je pripremljen od Intermedijerne Smole A, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0991] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

2

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 930.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 930.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1092 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0992]

[0993] Primer 1092 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[0994] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 927.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 927.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1093 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0995]

[0996] Primer 1093 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-

4

Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(4-sulfamoilfenil)propionska kiselina, je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[0997] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µmčestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 966.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 966.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1094 (ne u skladu sa pronalaskom)

[0998]

[0999] Primer 1094 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-4-il)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1000] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 946.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 946.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1095 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1001]

[1002] Primer 1095 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(4-(terc-butoksikarbonil)fenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1003] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 949.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1096 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1004]

[1005] Primer 1096 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9HFluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(tiazol-4-il)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1006] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 930.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 930.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1097 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1007]

[1008] Primer 1097 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(m-tolil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1009] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 934.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 934.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1098 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1010]

[1011] Primer 1098 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3-metoksifenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1012] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 942.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 942.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1099 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1013]

[1014] Primer 1099 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(furan-2-il)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1015] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 922.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 922.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1100 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1016]

1

[1017] Primer 1100 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(4-(metilsulfonamido)fenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1018] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 973.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 973.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1101 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1019]

2

[1020] Primer 1101 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(2-hlorofenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1021] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 945.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 944.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1102 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1023] Primer 1102 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3-hlorofenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1024] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 944.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 944.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1103 (ne u skladu sa pronalaskom)

4

[1026] Primer 1103 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3,4-dihlorofenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1027] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 961.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 961.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1104 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1029] Primer 1104 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3,4-difluorofenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1030] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 945.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 945.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1105 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1031]

[1032] Primer 1105 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3,4-dimetoksifenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1033] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 956.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 956.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1106 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1034]

[1035] Primer 1106 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(o-tolil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1036] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 934.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1107 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1037]

[1038] Primer 1107 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom B, korišćenjem “Procedura A manuelnog kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3-(trifluorometil)fenil)propionska kiselina je korišćena u koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1039] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 961.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 961.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1108 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1040]

[1041] Primer 1108 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-N-Me-Ala-OH je korišćen u četvrtom koraku aminokiselinskog kuplovanja, i (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-5-fenilpentanoic acid je korišćena u petom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1042] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 930.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 930.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1110 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1043]

1

[1044] Primer 1110 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom A, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". 2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-2-metilpropionska kiselina je korišćena u prvom koraku kuplovanja za Intermedijernu Smolu A.

[1045] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 933.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1112 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1046]

2

[1047] Primer 1112 je pripremljen počevši sa Intermedijernom Smolom A, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-1-(((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4,4-difluoropirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena u četvrtom koraku kuplovanja.

[1048] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 944.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 944.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1113

[1049]

[1050] Primer 1113 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1051] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 922.4(M+2H).

Pripremanje Primera 1114 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1052]

[1053] Primer 1114 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1054] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 930.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 930.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1115

[1055]

[1056] Primer 1115 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1057] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 964.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 964.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1116 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1058]

[1059] Primer 1116 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1060] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 926.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 926.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1117 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1061]

[1062] Primer 1117 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1063] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.86 min; ESI-MS(+) m/z 957.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 956.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1118

[1064]

[1065] Primer 1118 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1066] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 939.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 938.7 (M+2H).

4

[1067] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 938.4553 (M+2H); Nađeno: 938.4529 (M+2H).

Pripremanje Primera 1119

[1068]

[1069] Primer 1119 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1070] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum

4 1

acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 955.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 955.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1120

[1071]

[1072] Primer 1120 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena

4 2

procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1073] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 967.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 968.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1121 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1074]

4

[1075] Primer 1121 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1076] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 906.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 906.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1122

[1077]

4 4

[1078] Primer 1122 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1079] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 948.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 948.8 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1123

[1080]

[1081] Primer 1123 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1082] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

4

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 935.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 935.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1124 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1083]

[1084] Primer 1124 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

4

[1085] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 2.03 min; ESI-MS(+) m/z 966.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.99 min; ESI-MS(+) m/z 965.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1125 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1086]

4

[1087] Primer 1125 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1088] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 974.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 973.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1126 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1089]

4

[1090] Primer 1126 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1091] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 965.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 966.3 (M+2H).

41

Pripremanje Primera 1127 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1092]

[1093] Primer 1127 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1094] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 939.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.6 min; ESI-MS(+) m/z 938.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1128 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1095]

[1096] Primer 1128 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1097] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 947.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 947.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1129 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1098]

[1099] Primer 1129 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A:

41

Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1100] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 956.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1130 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1101]

[1102] Primer 1130 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-(D/L)-Trp(Me)-OH je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[1103] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 955.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 955.4 (M+2H).

41

Pripremanje Primera 1131

[1104]

[1105] Primer 1131 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1106] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

41

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 928.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 928.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1132

[1107]

[1108] Primer 1132 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1109] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

41

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1133

[1110]

[1111] Primer 1133 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

41

[1112] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 969.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 969.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1134

[1113]

[1114] Primer 1134 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A:

41

Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1115] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 962.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 962.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1135

[1116]

42

[1117] Primer 1135 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1118] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 955.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 955.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1136 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1119]

[1120] Primer 1136 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1121] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 954.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 953.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1137 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1122]

[1123] Primer 1137 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B

42

kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1124] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 954.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 953.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1138 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1125]

[1126] Primer 1138 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1127] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 888.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 888.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1139

[1128]

42

[1129] Primer 1139 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1130] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 917.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 917.8 (M+2H).

42

Pripremanje Primera 1140

[1131]

[1132] Primer 1140 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1133] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 30.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

42

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 914.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1141

[1134]

[1135] Primer 1141 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1136] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum

42

acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 939.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 940.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1142 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1137]

[1138] Primer 1142 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C:

42

Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1139] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 7-minutno zadržavanje 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 923.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 923.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1143 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1140]

4

[1141] Primer 1143 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1142] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 10-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 908.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 909.3 (M+2H).

4 1

Pripremanje Primera 1144 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1143]

[1144] Primer 1144 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole G praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, počevši od sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskogkuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(7-metil-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u prvom kuplovanju za Intermedijernu Smolu G.

[1145] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B;

4 2

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 955.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 955.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1145 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1146]

[1147] Primer 1145 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1148] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 909.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.4 min; ESI-MS(+) m/z 909.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1146 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1149]

[1150] Primer 1146 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C:

4 4

Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1151] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge shield rp18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1147 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1152]

4

[1153] Primer 1147 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1154] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 931.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 931.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1148 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1155]

4

[1156] Primer 1148 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1157] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 962.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 961.8 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1149 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1158]

[1159] Primer 1149 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1160] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 55.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 915.8 (M+2H).

4

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1150

[1161]

[1162] Primer 1150 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1163] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 47.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 901.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 900.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1151 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1164]

[1165] Primer 1151 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1166] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM

44

amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 53.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 908.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.30 min; ESI-MS(+) m/z 908.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1152 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1167]

[1168] Primer 1152 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1169] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 28.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 894.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 894.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1153 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1170]

[1171] Primer 1153 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, počevši sa Fmoc-Gly-O-hlorotritil Smola, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskogkuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda globalnog uklanjanja zaštite E", i "Ciklizaciona metoda D".

[1172] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.9 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 923.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1154 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1173]

44

[1174] Primer 1154 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, počevši sa Fmoc-Gly-O-hlorotritil Smola, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskogkuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda globalnog uklanjanja zaštite E", i "Ciklizaciona metoda D".

[1175] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

[1176] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 913.9560 (M+2H); Nađeno: 913.9529 (M+2H).

Pripremanje Primera 1155 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1177]

[1178] Primer 1155 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

44

[1179] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.4 min; ESI-MS(+) m/z 923.8 (M+2H). Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 923.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1156 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1180]

44

[1181] Primer 1156 je pripremljen tretiranjem Primera 1140 (29 mg, 0.016 mmol) sa prethodno napravljenim rastvorom HATU (7.24 mg, 0.019 mmol) u DMF (2 mL), i DIEA (6.93 µl, 0.040 mmol). Mešati na ST preko noći.

[1182] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 935.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 935.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1157

44

[1184] Primer 1157 je pripremljen, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1185] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 941.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 941.4 (M+2H).

44

Pripremanje Primera 1158 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1186]

[1187] Primer 1158 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1188] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

44

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 895.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 895.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1159 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1189]

[1190] Primer 1159 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1191] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

4

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 964.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 964.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1160 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1192]

4 1

[1193] Primer 1160 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1194] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 938.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 938.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1161

[1195]

4 2

[1196] Primer 1161 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1197] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 903.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 904.0 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1162

[1198]

[1199] Primer 1162 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1200] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

4 4

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 912.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 911.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1163

[1201]

[1202] Primer 1163 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1203] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 904.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 904.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1164 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1204]

[1205] Primer 1164 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog

4

kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1206] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 912.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 912.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1165 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1207]

4

[1208] Primer 1165 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1209] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge Shield RP18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 913.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 913.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1166

[1210]

[1211] Primer 1166 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1212] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B;

4

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge Shield RP18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 956.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 956.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1167 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1213]

[1214] Primer 1167 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude

4

Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1215] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.4 min; ESI-MS(+) m/z 955.3 (M+2H). Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 955.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 1168

[1216]

4 1

[1217] Primer 1168 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1218] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 921.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1169 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1219]

4 2

[1220] Primer 1169 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1221] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge Shield RP18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

4

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 921.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 921.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1170 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1222]

[1223] Primer 1170 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1224] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

4 4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 889.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 888.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1171 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1225]

4

[1226] Primer 1171 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1227] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 895.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 895.7 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1172 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1228]

[1229] Primer 1172 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1230] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod

4

su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 867.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 867.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1173

[1231]

[1232] Primer 1173 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1233] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 40.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 940.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 941.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1174

[1234]

[1235] Primer 1174 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude

4

Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1236] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 958.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 959.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1175 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1237]

[1238] Primer 1175 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura:

4

"Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1239] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 963.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 963.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1176 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1240]

4 1

[1241] Primer 1176 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1242] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 934.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 933.9 (M+2H).

4 2

[1243] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 933.4614 (M+2H); Nađeno: 933.4596 (M+2H).

Pripremanje Primera 1177

[1244]

[1245] Primer 1177 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1246] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

4

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 948.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 947.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1178 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1247]

[1248] Primer 1178 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

4 4

[1249] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 921.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 921.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1179 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1250]

4

[1251] Primer 1179 je pripremljen, korišćenjem Rink Smole, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda D: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda D: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda D: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda D: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1252] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-61% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 921.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 921.6 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1180 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1253]

[1254] Primer 1180 je pripremljen iz Intermedijerne Smole C, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1255] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

4

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 910.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 910.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1181 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1256]

[1257] Primer 1181 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

4

[1258] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 30.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 931.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.28 min; ESI-MS(+) m/z 932.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 931.4236 (M+2H); Nađeno: 931.4212 (M+2H).

Pripremanje Primera 1182

[1259]

4

[1260] Primer 1182 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1261] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 932.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 932.5 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 931.9395 (M+2H); Nađeno: 931.9369 (M+2H).

Pripremanje Primera 1183

[1262]

4

[1263] Primer 1183 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1264] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 932.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 932.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 932.4315 (M+2H); Nađeno: 932.4284 (M+2H).

4 1

Pripremanje Primera 1184

[1265]

[1266] Primer 1184 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1267] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

4 2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 926.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 926.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 925.4236 (M+2H); Nađeno: 925.4208 (M+2H).

Pripremanje Primera 1185

[1268]

[1269] Primer 1185 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1270] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 932.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 932.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 931.9395 (M+2H); Nađeno: 931.9371 (M+2H).

Pripremanje Primera 1186

[1271]

[1272] Primer 1186 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih

4 4

procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1273] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 925.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 925.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 924.9316 (M+2H); Nađeno: 924.9286 (M+2H).

Pripremanje Primera 1187

[1274]

4

[1275] Primer 1187 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1276] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 5-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.27 min; ESI-MS(+) m/z 937.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.29 min; ESI-MS(+) m/z 938.0 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1188 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1277]

[1278] Primer 1188 je pripremljen iz Intermedijerne Smole E, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (2S,4S)-1-(((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((terc-butoksikarbonil)amino) pirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja na Intermedijernu Smolu E.

[1279] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

4

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 27.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.21 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.18 min; ESI-MS(+) m/z 948.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 947.9747 (M+2H); Nađeno: 947.9706 (M+2H).

Pripremanje Primera 1189 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1280]

[1281] Primer 1189 je pripremljen iz Intermedijerne Smole B, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-N-Me-Glu(tBu)-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja na Intermedijernu Smolu B.

4

[1282] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 963.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 963.6 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.4776 (M+2H); Nađeno: 963.4749 (M+2H).

Pripremanje Primera 1190 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1283]

4

[1284] Primer 1190 je pripremljen iz Intermedijerne Smole F, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-N-Me-Asp(tBu)-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja na Intermedijernu Smolu F.

[1285] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 978.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 978.8 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 977.9582 (M+2H); Nađeno: 977.9561 (M+2H).

Pripremanje Primera 1191 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1286]

4

[1287] Primer 1191 je pripremljen iz Intermedijerne Smole F, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". Fmoc-N-Me-Glu(tBu)-OH je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja na Intermedijernu Smolu F.

[1288] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 985.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 985.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 984.9660 (M+2H); Nađeno: 984.9631(M+2H).

4 1

Pripremanje Primera 1192

[1289]

[1290] Primer 1192 je pripremljen iz Intermedijerne Smole E, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D". (2S,4R)-1-(((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((terc-butoksikarbonil)amino) pirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena u prvom koraku aminokiselinskog kuplovanja na Intermedijernu Smolu E.

[1291] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

4 2

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.14 min; ESI-MS(+) m/z 948.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.19 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 947.9747 (M+2H); Nađeno: 947.9710 (M+2H).

Pripremanje Primera 1193

[1292]

[1293] Primer 1193 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog

4

aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1294] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 938.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.28 min; ESI-MS(+) m/z 938.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 938.4315 (M+2H); Nađeno: 938.4283 (M+2H).

Pripremanje Primera 1194

[1295]

4 4

[1296] Primer 1194 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1297] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 924.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 924.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 923.9602 (M+2H); Nađeno: 923.9567 (M+2H).

Pripremanje Primera 1195

[1298]

[1299] Primer 1195 je pripremljen iz Intermedijerne Smole D, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

4

[1300] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 932.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 931.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 931.4475 (M+2H); Nađeno: 931.4443 (M+2H).

Pripremanje Primera 1196 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1301]

4

[1302] Primer 1196 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1303] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 22-72% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 947.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 947.3 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1197 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1304]

[1305] Primer 1197 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda C: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda C: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda C: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda C: Procedura finalnog pranja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1306] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 22-72% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 957.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 958.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1198

[1307]

[1308] Primer 1198 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1309] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 913.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 913.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1199 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1310]

[1311] Primer 1199 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

1

[1312] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 887.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 887.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1200 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1313]

[1314] Primer 1200 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1315] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 914.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 914.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1201

[1316]

[1317] Primer 1201 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1318] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 984.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.30 min; ESI-MS(+) m/z 983.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1202 (ne u skladu sa pronalaskom)

4

[1320] Primer 1202 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1321] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 921.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 921.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1203 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1322]

[1323] Primer 1203 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1324] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 992.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 991.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1204 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1325]

[1326] Primer 1204 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda A: Procedura B sekundarnog aminskog-kuplovanja”, "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura B kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, "Metoda C globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1327] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 897.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 896.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1205 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1328]

[1329] Primer 1205 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1330] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 920.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 920.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1206 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1331]

[1332] Primer 1206 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1333] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

1

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 905.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 905.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1207 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1334]

[1335] Primer 1207 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1336] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

11

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 913.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 913.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1208 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1337]

[1338] Primer 1208 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

12

[1339] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 900.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 900.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 1209 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1340]

1

[1341] Primer 1209 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1342] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 900.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 900.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1210 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1343]

14

[1344] Primer 1210 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1345] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno

1

zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 893.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 893.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1211 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1346]

[1347] Primer 1211 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B:

1

Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1348] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 899.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 899.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1212 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1349]

1

[1350] Primer 1212 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1351] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 5-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 901.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.25 min; ESI-MS(+) m/z 901.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 1213 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1352]

1

[1353] Primer 1213 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1354] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

1

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 907.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.23 min; ESI-MS(+) m/z 907.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 1214 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1355]

[1356] Primer 1214 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

2

[1357] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 922.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.22 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1215 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1358]

21

[1359] Primer 1215 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1360] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod

22

su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 926.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 926.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1216 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1361]

[1362] Primer 1216 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B:

2

Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1363] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.23 min; ESI-MS(+) m/z 948.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1217 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1364]

24

[1365] Primer 1217 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1366] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 977.6 (M+2H).

2

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 976.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1218

[1367]

[1368] Primer 1218 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1369] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

2

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-55% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 969.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 969.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1219 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1370]

2

[1371] Primer 1219 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1372] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

2

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 956.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 956.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1220 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1373]

[1374] Primer 1220 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

2

[1375] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 5-50% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 948.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.21 min; ESI-MS(+) m/z 948.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 1221 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1376]

[1377] Primer 1221 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1378] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 0-50% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 0-45% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

1

kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 0.94 min; ESI-MS(+) m/z 922.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 0.97 min; ESI-MS(+) m/z 921.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 1222 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1379]

[1380] Primer 1222 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole C praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

2

[1381] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 917.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 918.0 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 917.4080 (M+2H); Nađeno: 917.4042 (M+2H).

Pripremanje Primera 1223

[1382]

[1383] Primer 1223 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole C, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1384] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 918.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 918.7 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 917.9238 (M+2H); Nađeno: 917.9207 (M+2H).

Pripremanje Primera 1224

[1385]

4

[1386] Primer 1224 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole C, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1387] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 911.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 911.5 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 911.4080 (M+2H); Nađeno: 911.4052 (M+2H).

Pripremanje Primera 1225 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1388]

[1389] Primer 1225 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole C, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1390] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 917.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 917.9 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 917.4318 (M+2H); Nađeno: 917.4290 (M+2H).

Pripremanje Primera 1226 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1391]

[1392] Primer 1226 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole C, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1393] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 911.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 911.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 910.9160 (M+2H); Nađeno: 910.9128 (M+2H).

Pripremanje Primera 1227 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1394]

[1395] Primer 1227 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole F, praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1396] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 970.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 970.2 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 969.9607 (M+2H); Nađeno: 969.9592 (M+2H).

Pripremanje Primera 1228 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1397]

[1398] Primer 1228 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole C praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1399] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa

4

0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 924.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 924.6 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 923.9238 (M+2H); Nađeno: 923.9242 (M+2H).

Pripremanje Primera 1229 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1400]

41

[1401] Primer 1229 je pripremljen na Fmoc-Gly-Hlortritil Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", "Metoda globalnog uklanjanja zaštite E", i "Ciklizaciona metoda D".

[1402] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 907.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 907.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1230 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1403]

42

[1404] Primer 1230 je pripremljen počevši od Intermedijerne Smole H praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1405] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 1041.4 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 1231

[1406]

[1407] Primer 1231 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1408] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 886.4 (M+2H).

44

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 886.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1232 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1409]

[1410] Primer 1232 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1411] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko

4

centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 914.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 1233

[1412]

[1413] Primer 1233 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

4

[1414] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 944.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1234

[1415]

4

[1416] Primer 1234 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1417] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-100% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 956.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 956.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1235

[1418]

[1419] Primer 1235 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1420] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

4

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 923.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 923.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 1236 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1421]

[1422] Primer 1236 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1423] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 82%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 943.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 1237

[1424]

1

[1425] Primer 1237 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1426] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 977.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 977.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 1238 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1427]

[1428] Primer 1238 je pripremljen na Gly-Hlortritil Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskogkuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", "Metoda globalnog uklanjanja zaštite E", i "Ciklizaciona metoda D".

[1429] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 88%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 921.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 921.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 920.9638 (M+2H); Nađeno: 920.9628 (M+2H).

Pripremanje Primera 1239 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1430]

4

[1431] Primer 1239 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja (capping)", “Metoda F globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda D".

[1432] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 1.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 885.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 885.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 885.4270 (M+2H); Nađeno: 885.4269 (M+2H).

Analitički podaci:

[1433] Masena spektrometrija: "ESI-MS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-MS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom izvedenu u negativnom jonskom modu; "ESI-HRMS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-HRMS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije izvedenu u negativnom jonskom modu. Detektovane mase su prijavljene praćenjem "m/z" jedinične oznake. Jedinjenja sa tačnim masama većim od 1000 su često detektovana kao dvostruko-naelektrisani ili trostruko-naelektrisani joni.

Analiza LCMS Uslov A:

[1434] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B:Acetonitril sa 0.05% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 2% B do 98% B tokom 2 min., zatim 0.5 min. zadržavanje na 98% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov C:

[1435] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.2% mravljom kiselinom i 0.01% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.2% mravljom kiselinom 0.01% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 2% B do 80% B tokom 2 min., 80% B do 98% B tokom 0.1 minuta ‚ zatim 0.5 min. zadržavanje na 98% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov D:

[1436] Kolona: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 min., zatim 0.75-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1.11 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov E:

[1437] Kolona: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 min., zatim 0.75-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1.11 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov F:

[1438] Kolona: Waters XBridge C18, 2.1 x 50 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Temperatura: 35 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 4 min., zatim 1-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 4 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza HPLC Uslov B:

[1439] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3µm 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 40 °C; Gradijent: od 10% B do 100% B tokom 10 do 40min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Generalne procedure:

Prelude Metoda A:

[1440] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom u donjem delu. Epruveta se povezuje sa Prelude peptidnim sintetizatorom i kroz dno i kroz vrh epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da bi kontaktirali smolu. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu u donjem delu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino) metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-aminoksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[1441] Procedure iz "Prelude Metode A" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena pomoću količine Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja sa hloroacetil hloridom" ili "Procedure kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom" opisanih ispod.

Procedura bubrenja smole:

[1442] U polipropilenski sud od 40 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodat Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je oprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana sa N2barbotiranjem sa dna reakcionog suda tokom 10 min. pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[1443] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno pet puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor je dreniran preko frite.

U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 60 min., zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 min., zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja:

[1444] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno pet puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 300 min., zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana dva puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 min., zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja:

[1445] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. u reakcioni sud je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno pet puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. u reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 0.5 do 2.5 mL, 1 do 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 0.5 do 2.5 mL, 1 do 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.5 do 1.5 mL, 4 do 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 60 min. do 600 min., zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana dva puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 min., zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom:

[1446] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno pet puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodato 3.0 mL rastvora DIPEA (4.0 mmol, 0.699 mL, 40 ekv), i hloroacetil hlorid (2.0 mmol, 0.160 mL, 20 ekv) u DMF. Smeša je periodično agitovana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom:

[1447] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno pet puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-Diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite.

CEM Metoda A:

[1448] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na CEM Liberty mikrotalasnom peptidnom sintetizatoru (CEM Corporation, Matthews, NC). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 30 ili 125 mL opremljenoj sa fritom u donjem delu za CEM Discovery mikrotalasnu jedinicu. Epruveta se povezuje sa CEM Liberty sintetizatorom kroz donji deo i vrh epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Svi rastvori su uklonjeni preko donjeg dela epruvete osim dok se prenosi smola sa vrha. "Periodično ispuštanje mehurića" opisuje kratko ispuštanje mehurića N2gasa preko frite u donjem delu. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-

1

ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[1449] Procedure iz "CEM Metoda A" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru sekundarnog aminskog-kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću “Procedure kuplovanja sa hloroacetil hloridom” ili "Procedure kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom" opisanih iznad.

Procedura bubrenja smole:

[1450] U polipropilensku konusnu epruvetu od 50 mL je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Zatim DMF (7 mL) je dodat u epruvetu praćeno sa DCM (7 mL). Smola je zatim prebačena u reakcionu posudu sa vrha posude. Procedura je ponovljena dodatno dva puta. DMF (7 mL) je dodat praćeno sa DCM (7 mL). Smola je ostavljena da bubri sa N2barbotiranjem sa dna reakcionog suda tokom 15 min. pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

2

Standardna procedura kuplovanja:

[1451] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. u reakcioni sud je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M in NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je izmešana pomoću N2barbotiranja tokom 5 min. na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH, koje su kuplovane na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 min. na 65 °C, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom:

[1452] u reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je izmešana pomoću N2barbotiranja tokom 5 min. na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje su kuplovane na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je izmešana pomoću N2barbotiranja tokom 5 min. na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje su kuplovane na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 min. na65 °C, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja:

[1453] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. U reakcioni sud je dodat aminokiselinski rastvor (1.25 mL do 5 mL, 2.5 ekv do 10 ekv) koji sadrži HATU (2.5 ekv do 10 ekv), i konačno DIPEA (2M in NMP, 0.5 mL do 1 mL, 10 do 20 ekv). Smeša je izmešana pomoću N2bubbling tokom 5 min. do 2 sata na 25 °C do 75 °C, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. u reakcioni sud je dodat a rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično barbotirana tokom 2 min. na 65 °C, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: DMF (7 mL) ispiranje sa vrha, i konačno praćeno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa donjeg dela i konačno sa DMF (7 mL) ispiranjem sa vrha. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

4

Metoda A N-metilacije na-smoli (Turner, R.A. et al., Org. Lett., 15(19):5012-5015 (2013)):

[1454] Sve manipulacije su izvedene manuelno osim ukoliko nije naznačeno. Procedura iz " Metode A N-metilacije na-smola" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen da se generiše peptid. Ova skala nije bazirana na direktnoj determinaciji količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale.

[1455] Smola je prebačena u fritovan špric od 25 mL. U smolu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana 3 puta sa DMF (4.0 mL). U reakcioni sud je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 4.0 mL). Smeša je mućkana tokom 3 min. i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL). Smola je suspendovana u DMF (2.0 mL) i etil trifluoroacetat (0.119 ml, 1.00 mmol), 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (0.181 ml, 1.20 mmol). Smeša je postavljena na šejker tokom 60 min.. Rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL).

[1456] Smola je oprana tri puta sa suvim THF (2.0 mL) kako bi se uklonila bilo kakva preostala voda. U bočici od 4. mL osušenoj u rerni je dodat THF (1.0 mL) i trifenilfosfin (131 mg, 0.500 mmol) na suvim 4 Å molekularnim sitima (20 mg). Rastvor je prebačen u smolu i diizopropil azodikarboksilat (0.097 mL, 0.5 mmol) je dodat polako. Smola je mešana tokom 15 min. Rastvor je dreniran preko frite i smola je oprana tri puta sa suvim THF (2.0 mL) kako bi se uklonila bilo kakva preostala voda. U bočici od 4. mL osušenoj u rerni je dodat THF (1.0 mL), trifenilfosfin (131 mg, 0.500 mmol) na suvim 4 Å molekularnim sitima (20 mg). Rastvor je prebačen u smolu i diizopropil azodikarboksilat (0.097 mL, 0.5 mmol) je dodat polako. Smola je mešana tokom 15 min.. Rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL). Smola je suspendovana u etanolu (1.0 mL) i THF (1.0 mL), i natrijum borohydride (37.8 mg, 1.000 mmol) je dodat. Smeša je mešana tokom 30 min. i dreniran. Smola je oprana uzastopno tri puta sa DMF (4.0 mL) i tri puta sa DCM (4.0 mL).

Metoda globalnog uklanjanja zaštite B:

[1457] Sve manipulacije su izvedene manuelno osim ukoliko nije naznačeno. Procedura iz “Metode B globalnog uklanjanja zaštite” opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (94:3:3 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prebačena u fritovan špric od 25 mL u koji je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (5.0 mL). Smeša je mešana tokom 5 min.. Rastvor je filtriran i filtrat je ispušten u dietil etar (30 mL). Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugiran tokom 3 min.. Rastvor supernatanta je dekantiran i čvrsta supstanca je resuspendovana u dietil etru (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 min.. Procedura je ponovljena još jednom i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumomda se dobije bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Ciklizaciona metoda C:

[1458] Sve manipulacije su izvedene manuelno osim ukoliko nije naznačeno. Procedura iz "Ciklizacione metode C" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen da se generiše peptid. Ova skala nije bazirana na direktnoj determinaciji količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 0.1M amonijum bikarbonatni pufer (11 mL:24 mL ili sličan odnos), i rastvor je zatim pažljivo podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim mešan tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovana i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Ovaj rastvor je podvrgnut reverzno-faznom HPLC prečišćavanju kako bi se dobio željeni ciklični peptid.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(naftalen-1-il)propionska kiselina

[1459] (Freidinger, R.M. et al., J. Org. Chem., 48(1):77-81 (1983))

Korak 1:

[1460] U suspenziju (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(naftalen-1-il)propionska kiselina (1.00 g, 2.286 mmol) u toluenu (50 ml) je dodat paraformaldehid (0.500 g, 16.65 mmol) i monohidrat p-toluensulfonske kiseline (0.435 g, 2.286 mmol). Reakciona smeša je zagrejana do refluksa tokom 16 sati sa uklanjanjem azeotropne vode korišćenjem Dean-Stark aparata ("Dean-Stark trap“). Reakcija je ohlađena do sobne temperature i razblažena sa 20 mL EtOAc. Organska faza je oprana sa 2 x 50 mL vodenog rastvora zasićenog NaHCO3i zatim osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracija bezbojno ulje je dobijeno. Prečišćavanje kolonskom hromatografijomon silika gel korišćenjem 30% EtOAc/Heksani vodi do željenog proizvoda kao bezbojnog ulja. (S)-(9H-fluoren-9-il)metil 4-(naftalen-1-ilmetil)-5-oksooksazolidin-3-karboksilat 0.750 g (73%)<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (d, J=7.5 Hz, 3H), 7.82 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.68 - 7.51 (m, 2H), 7.49 - 7.21 (m, 8H), 5.18 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.40 (br. s., 4H), 3.31 (br. s., 4H).

Korak 2:

[1461] U rastvor (S)-(9H-fluoren-9-il)metil 4-(naftalen-1-ilmetil)-5-oksooksazolidin-3-karboksilat (0.750 g, 1.669 mmol) u DCM (8.0 ml) je dodata trifluorosirćetna kiselina (8.0 mL, 104 mmol) praćeno sa trietilsilanom (0.799 ml, 5.01 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Reakciona smeša je osušena na rotovap-u. Sirovo ulje je rastvoreno u 15.0 mL DCM i uparen na rotovap-u dva puta. Sirov proizvod je dobijen kao prljavo bela guma i je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem dihlormetana i metanola kao eluanta. Željeni proizvod, (S)-2-((((9H-fluoren-9il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(naftalen-1-il)propionska kiselina, je dobijen kao bezbojna guma (0.692 g, 46%).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil) propionska kiselina

[1462] (Ross, A.J. et al., J. Org. Chem., 75:245-248 (2010))

Korak 1:

[1463] U bočicu od 8 mL osušenu u rerni sa teflonskim poklopcem pročišćenu sa N2je dodata Cinkova prašina (298 mg, 4.56 mmol), DMF (1.5 mL), i jod (57.8 mg, 0.228 mmol). U tu smešu je dodat (R)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-jodopropanoat (500 mg, 1.519 mmol), odmah praćeno sa jodom (57.8 mg, 0.228 mmol). Pd2(dba)3(69.6 mg, 0.076 mmol), 2-dicikloheksilfosfino-2'6-dimetoksibifenil (62.4 mg, 0.152 mmol) i 4-bromo-2-hloro-1-fluorobenzen (477 mg, 2.279 mmol) su zatim dodati i reakciona smeša je ostavljena da se meša na 50 °C tokom 3 sata. Sirova smeša je razblažen u 30 mL EtOAc i DMF je uklonjen sa 4 vodena ispiranja. Organska faza je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvor je filtrirani koncentrovan, i sirov proizvod je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksani do 30% EtOAc/Heksani. Željeni proizvod je dobijen kao bledo žuto ulje, (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil)propanoat (0.174 g, 35%).<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 7.27 (s, 1H), 7.17 (dd, J=6.9, 1.4 Hz, 1H), 7.11 - 6.93 (m, 1H), 5.03 (d, J=6.8 Hz, 1H), 4.55 (d, J=6.4 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.19 - 3.04 (m, 1H), 2.98 (dd, J=13.9, 5.9 Hz, 1H), 1.49 - 1.37 (m, 10H).

Korak 2:

[1464] U rastvor (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil)propanoata (174 mg, 0.524 mmol) u THF (1967 µl)/H2O (656 µl) je dodat LiOH (37.7 mg, 1.573 mmol) i reakcija je ostavljena da se meša tokom 2 h. THF je uklonjen pomoću rotovap-a pre nego što je rastvor razblažen u EtOAc (10 mL) i vodena faza je zakiseljena do pH 3 korišćenjem IN vodenog HCl rastvora. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organske frakcije su kombinovane i osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracije, sirov proizvod, (S)-2-((terc-butoksikarbonil) amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil)propionska kiselina, je dobijen kao žuta guma (0.183 mg, 99%).

Korak 3:

[1465] (S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil)propionska kiselina (183.0 mg, 0.576 mmol) je suspendovana u 4M rastvoru hlorovodonične kiseline (1440 µl, 5.76 mmol) u dioksanu na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Nakon evaporacije rastvora, sirov proizvod je ohlađen do 0 °C korišćenjem ledenog kupatila pre nego što je rastvoren u MeCN (288 µl) i 2.0M vodeni rastvor Na2CO3(288 µl, 0.576 mmol). (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioksopirolidin-1-il) karbonat (194 mg, 0.576 mmol) je dodat u rastvor i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 30 min.. Smeša je razblažena u 5.0 mL EtOAc i vodena faza je neutralisana sa nekoliko kapi vodenog IN HCl rastvora. Organski rastvarači su upareni i sirov proizvod je zatim podeljen između zasićenog vodenog NH4Cl rastvora i EtOAc. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organske frakcije su kombinovane i osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracije, a žuta kristalna čvrsta supstanca je dobijena. Prečišćavanje silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 30% EtOAc/Heksani dalo je željeni proizvod kao bela kristalna čvrsta supstanca. Drugo prečišćavanje na silika gelu je izvedena korišćenjem 100% DCM do 20% MeOH/DCM kao eluanta. Željeni proizvod, (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil)propionska kiselina, je dobijen kao prljavo bela čvrsta supstanca (0.111 g, 44%).<1>H NMR (400MHz, metanol-d4) δ 7.79 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.60 (t, J=6.8 Hz, 2H), 7.47 - 7.23 (m, 5H), 7.25 - 7.14 (m, 1H), 7.13 (d, J=9.0 Hz, 1H), 4.52 - 4.11 (m, 4H), 3.19 (dd, J=14.3, 4.6 Hz, 1H), 2.92 (dd, J=13.9, 9.7 Hz, 1H).

(R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanska kiselina

[1466] (Ley, S.V. et al., Tetrahedron, 48(6):1145-1174 (1992))

Korak 1:

[1467] (R)-2-Amino-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanska kiselina (1.00 g, 4.92 mmol) je suspendovana u THF (18.45 ml) / Voda (6.15 ml) i ohlađena do 0 °C korišćenjem ledenog kupatila. U hladnu gustu masu je polako dodat benzil hloroformat (0.773 mL, 5.41 mmol) i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 2.5 h. Gusta masa je razblažen sa 50 mL EtOAc pre nego što je zakiseljena do pH 3 korišćenjem vodenog IN HCl rastvora. Sirov proizvod je ektrahovan tri puta sa EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirane i koncentrovane. Sirov proizvod je dobijen kao bistro ulje i podvrgnuto je silika gel hromatografiji korišćenjem 100% Heksana do 100% etil acetata kao eluanta. Proizvod, (R)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanska kiselina, je dobijen kao bezbojno ulje (1.41 g, 71%).<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 7.44 - 7.29 (m, 5H), 5.53 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.41 (d, J=5.1 Hz, 1H), 2.56 - 2.30 (m, 2H), 2.21 (dd, J=13.5, 6.5 Hz, 1H), 2.06 - 1.88 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).

Korak 2:

[1468] U rastvor (R)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanska kiselina (1.41 g, 4.18 mmol) i MeI (2.091 mL, 33.4 mmol) u THF (12.66 ml) na 0 °C je polako dodat NaH (0.501 g, 12.54 mmol) i suspenzija je ostavljena da se meša dok se zagreva do sobne temperature tokom 24 sata. Reakciona smeša je ohlađena do 0 °C pre nego što 10 mL EtOAc je dodato zajedno sa 5 mL vode da se kvenčuje višak NaH. Sirov proizvod je podeljen između zasićenog NaHCO3vodenog rastvora i Et2O. Dve faze su razdvojene i organska faza je oprana sa zasićenim NaHCO3rastvorom i oba vodena ekstrakta su kombinovana. Vodeni rastvor je doveden do pH 3 korišćenjem 6N HCl vodenog rastvora. Vodena faza je ektrahovana sa EtOAc, organski ekstrakti su kombinovani i osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracije, (R)-2-(((benziloksi) karbonil)(metil)amino)-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanska kiselina je dobijena kao žuto ulje, 1.4 g (78%). LCMS pokazala je m/z željenog proizvoda, (M+Na)<+>374.

Korak 3:

[1469] U rastvor (R)-2-(((benziloksi)karbonil)(metil)amino)-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanske kiseline (1.40 g, 3.98 mmol) u MeOH (18.79 ml) je dodat 10% Pd/C (0.424 g, 0.398 mmol) i reakciona smeša je postavljena u atmosferi vodonika korišćenjem. Reakcija je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Katalizator je uklonjen filtracijom CELITE® i filtrat je koncentrovana pod smanjenim pritiskom kako bi se dobila bela čvrsta supstanca. Sirov materijal je rastvoren u Acetonitrilu (9.40 ml), Vodi (9.40 ml) i TEA (1.111 mL, 7.97 mmol). Rastvor je ohlađen do 0 °C korišćenjem i ledenog kupatila i FMOC-OSU (1.344 g, 3.98 mmol) je dodat. Reakciona smeša je ostavljena da se meša dok se zagreva do sobne temperature tokom 18 sati. Sirov proizvod je razblažen u 200 mL EtOAc i opran sa IN HCl vodenog rastvora i slanog rastvora. Organska faza je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracije bistro ulje je dobijeno, koje je prečišćeno silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 100% EtOAc. (R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-5-(terc-butoksi)-5-oksopentanska kiselina je dobijena kao bezbojno ulje (0.481 g, 28%).<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 7.81 - 7.68 (m, 2H), 7.63 -7.49 (m, 2H), 7.43 - 7.21 (m, 4H), 5.95 (br. s., 3H), 4.76 (dd, J=10.7, 4.5 Hz, 1H), 4.60 - 4.48 (m, 1H), 4.47 - 4.32 (m, 2H), 4.29 - 4.10 (m, 1H), 2.87 (s, 3H), 2.43 - 1.82 (m, 4H), 1.51 - 1.36 (m, 9H).

Korak 1:

[1470] Rastvor L-fenilalanin benzil estar hidrohlorida (2 g, 6.85 mmol), Z-Phe-OH (2.257 g, 7.54 mmol), DIPEA (2.99 mL, 17.14 mmol) i DCM (100 mL) je tretiran sa 1-hidroksi-7-azabenzotriazolom (1.120 g, 8.23 mmol) i EDC (1.577 g, 8.23 mmol) i mešan na st tokom 15 h. Smeša je opran sa zasićenim NaHCO3(2 x 100 mL), 1 M HCl (2 x 50 mL) i slanim rastvorom (50 mL), osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod smanjenim pritiskom da se dobije

1

(S)-benzil 2-((S)-2-(((benziloksi)karbonil) amino)-3-fenilpropanamido)-3-fenilpropanoat (3.2 g, 5.96 mmol, 87% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.42 -7.11 (m, 21H), 4.96 (d, J=2.0 Hz, 4H), 4.63 - 4.45 (m, 1H), 4.06 - 3.91 (m, 2H), 3.34 - 2.96 (m, 3H), 2.85 (br. s., 4H).

Korak 2 (Schroeder, G.M. et al., Tetrahedron Lett., 51:1404-1406 (2010)):

[1471] Bočica pod pritiskom je napunjena sa (S)-benzil 2-((S)-2-(((benziloksi)karbonil) amino)-3-fenilpropanamido)-3-fenilpropanoat (1.0 g, 1.864 mmol) i difenil-2-piridilfosfin (3.17 g, 7.45 mmol) u THF (9.32 mL) under N2. Rastvor je pročišćen sa N2pre nego što je DIAD (1.449 mL, 7.45 mmol) dodat u kapima. Reakcija je ostavljena da se meša tokom 5 min. difenilfosforil azid (1.606 mL, 7.45 mmol) je zatim dodat u kapima tokom 30 min. Nakon što je dodavanje završeno i niej bilo više formiranja azota, zaptivena epruveta je zatvorena i reakcija je ostavljena da se meša na 55 °C tokom 4 h.

[1472] Reakcija je ohlađena do st i sipana u etil acetat (200 ml), isprana sa hladnom IN HCl (100 mL), Zas. NaHCO3(100 mL) i slanim rastvorom (100 mL). Organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan da se dobije narandžasto ulje. Prečišćavanje silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 60% Etil acetata u heksanima kao eluenta dalo je 660 mg (S)-benzil 2-(5-((S)-1-(((benziloksi) karbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoata sa niskom čistoćom. Drugo prečišćavanje preparativnom HPLC korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 100A 250x21.2mm Axia packed (10-100mg) #520551-2. Mobilna faza A: 0.1 TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 50-80% B tokom 20 min., zatim 10-minutni gradijent 95% B; Protok: 15 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. (S)-benzil 2-(5-((S)-1-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoat je dobijen kao bež higroskopna čvrsta supstanca u 60.0 mg prinosa u 70% čistoći pomoću LC/MS Analize.

[1473] Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 562.5 (M+H).

Korak 3:

2

[1474] Rastvor (S)-benzil 2-(5-((S)-1-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropanoata (60 mg, 0.107 mmol) u MeOH (534 µl) je hidrogenizovan preko10% Pd/C (22.74 mg, 0.021 mmol) korišćenjem vodonika iz balona od lateksa tokom 2 h.

[1475] Katalizator je uklonjen filtracijom i filtrat je koncentrovana pod smanjenim pritiskom da se dobije bela gumasta čvrsta supstanca. Proizvod je rastvoreno u MeCN (2 mL) i voda (2 mL) i Et3N (100 µL) i tretiran sa FMOC-OSU (36.0 mg, 0.107 mmol). Smeša je mešana na st tokom 15 h.

[1476] Reakciona smeša je razblažen sa EtOAc (50 mL), oprana sa 1 M HCl (2 x 20 mL) i slanim rastvorom (20 mL), osušena (Natrijum sulfat) i koncentrovana pod smanjenim pritiskom da se dobije (S)-2-(5-((S)-1-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-2-feniletil)-1H-tetrazol-1-il)-3-fenilpropionska kiselina (42 mg, 0.075 mmol, 70.3% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. Proizvod je 64% čist pomoću LC/MS Analiza. Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 560.5 (M+H).

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3,5-dihlorofenil)propionska kiselina

[1477] (Ross, A.J. et al., J. Org. Chem., 75:245-248 (2010))

Korak 1:

[1478] U bočicu od 8 mL osušenu u rerni sa teflonskim poklopcem pročišćenu sa N2je dodata Cinkova prašina (298 mg, 4.56 mmol), DMF (1.5 mL), i jod (57.8 mg, 0.228 mmol). U tu smešu je dodat (R)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-jodopropanoat (500 mg, 1.519 mmol), odmah praćeno sa jodom (57.8 mg, 0.228 mmol). Pd2(dba)3 (69.6 mg, 0.076 mmol), 2-dicikloheksilfosfino-2',6'-dimetoksibifenil (62.4 mg, 0.152 mmol), 1,3-dihloro-5jodobenzen (622 mg, 2.279 mmol) i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 16 h. Sirova smeša je razblažena u EtOAc (30 mL) i DMF je uklonjen sa četiri vodena ispiranja. Organska faza je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvor je filtriran i koncentrovan, i sirov je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 30% EtOAc/Heksani. Željeni proizvod je dobijen kao bledo žuto ulje, (S)-metil 2-((tercbutoksikarbonil)amino)-3-(3,5-dihlorofenil)propanoat, 0.160 g prinos u 77% čistoće pomoću LCMS Analize. Analiza LCMS Uslov F: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 348.1 (M+H).

Korak 2:

[1479] U rastvor (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3,5-dihlorofenil)propanoata (160 mg, 0.459 mmol) u THF (2 mL)/H2O (0.667 mL) je dodat LiOH (33.0 mg, 1.378 mmol) i reakcija je ostavljena da se meša tokom 2 h. THF je uparen pre nego što je rastvor razblažen u EtOAc (10 mL) i vodena faza je zakiseljena do pH 3 korišćenjem IN vodenog HCl rastvora. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organske frakcije su kombinovane i osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracije, sirov proizvod je dobijen kao žuta guma. Čvrsta supstanca je uzeta direktno za Korak 3.

Korak 3:

[1480] U čvrste supstance iz prethodnog koraka je dodat 4M HCl u dioksanu (1.149 mL, 4.59 mmol) i rastvor je ostavljen da se meša tokom 2h. Nakon evaporacije rastvora, sirov proizvod je ohlađen do 0 °C i rastvoren u 5% vodenom Na2CO3/AcCN (2:1) (30 mL). (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioksopirolidin-1-il) karbonat (170 mg, 0.505 mmol) je dodat i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 16 h. Smeša je razblažena u 15.0 mL EtOAc i vodena faza je neutralisana sa nekoliko kapi vodenog IN HCl rastvora. Organski rastvarači su upareni i sirov proizvod je zatim podeljen između zasićenog vodenog NH4Cl rastvora i EtOAc. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organski ekstrakti su kombinovani, osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom LCMS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250, 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 35-100% B tokom 50 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)

4

amino)-3-(3,5-dihlorofenil)propionske kiseline je 50 mg; čistoća, 87% pomoću Analize LCMS Uslov A: rt = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 478.0 (M+Na)<+>.

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-hloro-4,5-difluorofenil)propionska kiselina

[1481] (Ross, A.J. et al., J. Org. Chem., 75:245-248 (2010))

Korak 1:

[1482] U bočicu od 8 mL osušenu u rerni sa teflonskim poklopcem pročišćena sa N2je dodata Cinkova prašina (298 mg, 4.56 mmol), DMF (1.5 mL), i jod (57.8 mg, 0.228 mmol). U tu smešu je dodat (R)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-jodopropanoat (500 mg, 1.519 mmol), odmah praćeno sa jod (57.8 mg, 0.228 mmol). Pd2(dba)3 (69.6 mg, 0.076 mmol), 2-dicikloheksilfosfino-2',6'-dimetoksibifenil (62.4 mg, 0.152 mmol), 5-bomo-1hloro-2,3-diflurobenzen (518 mg, 2.279 mmol) i reakciona smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Sirova smeša je razblažen u 30 mL EtOAc i DMF je uklonjen sa četiri vodena ispiranja. Organska faza je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvor je filtriran i koncentrovan i sirov je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 30% EtOAc/Heksani. Željeni proizvod je dobijen kao bledo žuto ulje, (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hloro-4,5-difluorofenil)propanoat, 0.165 g, koji je uzet direktno za sledeći korak.

Korak 2:

[1483] U rastvor (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hloro-4,5-difluorofenil)propanoat (165 mg, 0.472 mmol) u THF (2ml)/H2O (0.667 ml) is dodat LiOH (33.9 mg, 1.415 mmol) i reakcija je ostavljena da se meša tokom 2 h. THF je uklonjen pre nego što je rastvor razblažen u EtOAc (10 mL). Vodena faza je zakiseljena do pH 3 korišćenjem 1N vodenog HCl rastvora. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organske frakcije su kombinovane i osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracije, sirov proizvod je dobijen kao žuta guma, koji je uzet direktno za Korak 3.

Korak 3:

[1484] U čvrste supstance je dodata 4M HCl u dioksanu (1.179 mL, 4.72 mmol) i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 2 h. Nakon evaporacije rastvora, sirov proizvod je ohlađen do 0 °C i rastvoren u 5% vodeni Na2CO3/ACN (2:1) (30 mL). (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioksopirolidin-1-il) karbonat (175 mg, 0.519 mmol) je dodat u rastvor i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 16 h. Smeša je razblažena u 15.0 mL EtOAc i vodena faza je neutralisana sa nekoliko kapi vodene 1N HCl. Organski rastvarači su upareni i sirov proizvod je podeljen između zasićenog vodenog NH4Cl rastvora i EtOAc. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organski ekstrakti su kombinovani, osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovani. Rezultujući proizvod je zatim prečišćen preparativnom LCMS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250, 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 35-100% B tokom 50 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene da se dobije 62 mg (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-hloro-4,5-difluorofenil)propionske kiseline.

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3,5-dihloro-4-fluorofenil)propionska kiselina

[1485] (Ross, A.J. et al., J. Org. Chem., 75:245-248 (2010))

Korak 1:

[1486] U bočicu od 8 mL osušenu u rerni sa teflonskim poklopcem pročišćenu sa N2je dodata Cinkova prašina (298 mg, 4.56 mmol), DMF (1.5 mL), i jod (57.8 mg, 0.228 mmol). U tu smešu je dodat (R)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-jodopropanoat (500 mg, 1.519 mmol), odmah praćeno sa jodom (57.8 mg, 0.228 mmol). Pd2(dba)3(69.6 mg, 0.076 mmol), 2-dicikloheksilfosfino-2',6'-dimetoksibifenil (62.4 mg, 0.152 mmol), 5-bromo-1,3-dihloro-2-fluorobenzen (556 mg, 2.279 mmol) i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 16 h. Sirova smeša je razblažena u 30 mL EtOAc i DMF je uklonjen korišćenjem četiri vodena ispiranja. Organska faza je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvor je filtriran i koncentrovan i sirov proizvod je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 30% EtOAc/Heksani. Željeni proizvod je dobijen kao bledo žuto ulje, (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3,5-dihloro-4-fluorofenil)propanoat, 0.102 g koji je uzet za sledeći korak direktno.

Korak 2:

[1487] U rastvor (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3,5-dihloro-4-fluorofenil)propanoat a(102 mg, 0.279 mmol) u THF (2ml)/H2O (0.667 ml) je dodat LiOH (20.01 mg, 0.836 mmol) i reakcija je mešana tokom 2 h. THF je uklonjen i rastvor je razblažen u EtOAc (10 mL). Vodena faza je zakiseljena do pH 3 korišćenjem IN vodene HCl. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organski ekstrakti su kombinovani i osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentraciji sirov proizvod je dobijen kao žuta guma, i uzet je direktno za Korak 3.

Korak 3:

[1488] U proizvod iz Koraka 2 je dodata 4M HCl u dioksanu (0.696 mL, 2.79 mmol) i reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 2 h. Nakon evaporacije rastvora, sirov proizvod je ohlađen do 0 °C i rastvoren u 5% vodenom Na2CO3/MeCN (2:1) (30 mL). (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioksopirolidin-1-il) karbonat (103 mg, 0.306 mmol) je dodat u rastvor i reakciona smeša je mešana tokom 16h. Smeša je razblažena u 15.0 mL EtOAc i vodena faza je neutralisana sa nekoliko kapi vodene IN HCl. Organski rastvarači su upareni i sirov proizvod jezatim podeljen između zasićenog vodenog NH4Cl rastvora i EtOAc. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organski ekstrakti su kombinovani, osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, koncentrovani i zatim prečišćeni preparativnom LCMS korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 35-100% B tokom 50 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene da se dobije 36 mg (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3,5-dihloro-4-fluorofenil)propionske kiseline.

(S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-hloro-3-fluorofenil)propionska kiselina

[1489] (Ross, A.J. et al., J. Org. Chem., 75:245-248 (2010))

Korak 1:

[1490] U bočicu od 8 mL osušenu u rerni sa teflonskim poklopcem pročišćenu sa N2je dodata Cinkova prašina (298 mg, 4.56 mmol), DMF (1.5 mL), i jod (57.8 mg, 0.228 mmol). U tu smešu je dodat (R)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-jodopropanoat (500 mg, 1.519 mmol), odmah praćeno sa jodom (57.8 mg, 0.228 mmol). Pd2(dba)3(69.6 mg, 0.076 mmol), 2-dicikloheksilfosfino-2',6'-dimetoksibifenil (62.4 mg, 0.152 mmol), 1-hloro-2-fluoro-4-jodobenzen (584 mg, 2.279 mmol), i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Sirova smeša je razblažen u 30 mL EtOAc i DMF je uklonjen korišćenjem četiri vodena ispiranja. Organska faza je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirana, koncentrovana i sirov proizvod je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem 100% heksana do 30% EtOAc/Heksani. Željeni proizvod je dobijen kao bledo žuto ulje, (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(4-hloro-3-fluorofenil)propanoat, 0.220g; čistoća, 93% pomoću LCMS Analize. Analiza LCMS Uslov F: rt = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 332.2 (M+H).

Korak 2:

[1491] U rastvor (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(4-hloro-3-fluorofenil)propanoat (220mg, 0.663 mmol) u THF (2 mL)/Voda (0.667 mL) je dodat LiOH (47.6 mg, 1.989 mmol) i reakcija je ostavljena da se meša tokom 2 sata. THF je uklonjen i rastvor je razblažen u EtOAc (10 mL). Vodena faza je zakiseljena do pH 3 korišćenjem IN vodene HCl. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organski ekstrakti su kombinovani i osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon filtracije i koncentracija sirov proizvod je dobijen kao žuta guma i uzet direktno za Korak 3.

Korak 3:

[1492] U čvrstu supstancu iz Koraka 2 je dodat 4M HCl u dioksanu (1.658 mL, 6.63 mmol) i smeša je mešana tokom 2h. Nakon evaporacije rastvora, sirov proizvod je ohlađen do 0 °C i rastvoren u 5% vodeni Na2CO3/AcCN (2:1) (30 mL). (9H-fluoren-9-il)metil (2,5-dioksopirolidin-1-il) karbonat (246 mg, 0.729 mmol) je dodat u rastvor i reakciona smeša je mešana tokom 16h. Smeša je razblažen u 15.0 mL EtOAc i vodena faza je neutralisana sa nekoliko kapi vodene IN HCl. Organski rastvarači su upareni i sirov proizvod je zatim podeljen između zasićenog vodenog NH4Cl rastvora i EtOAc. Sirov proizvod je ektrahovan sa EtOAc. Organski ekstrakti su kombinovani, osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, koncentrovani i zatim prečišćeni preparativnom LCMS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250, 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 35-100% B tokom 50 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene da se dobije 30 mg (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-hloro-3-fluorofenil)propionske kiseline. Analiza LCMS Uslov A: rt = 1.65 min, 85% čistoća; ESI-MS(+) m/z 462.0 (M+Na).

Pripremanje Primera 3052 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1493]

[1494] Primer 3052 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1495] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250, 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-95% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 825.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3053 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1496]

[1497] Primer 3053 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1498] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-95% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 15 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 92% pomoću "Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B u A tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 818.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3054 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1499]

1

[1500] Primer 3054 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1501] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-95% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 21 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B u A tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 842.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3055 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1502]

2

[1503] Primer 3055 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1504] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-95% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 19 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 92% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B u A tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 760.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3056 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1505]

[1506] Primer 3056 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1507] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 25-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomera (izomer 3056-A i izomer 3056-B) su dobijeni. Prinos proizvoda izomer 3056-A i izomer 3056-B su 3.6 mg i 5.7 mg, redom, i njihova procenjena čistoća pomoću “Analize Uslov B" korišćenjem gradijenta od 20% do 85% pufer B u A tokom 30 min. na 60° C su 83% i 96%, redom.

Analiza LCMS Uslov A: izomer 3056-A, Vreme zadržavanja = 1.21 min; ESI-MS(+) m/z 894.2 (M+2H); izomer 3056-B, 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 894.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3057 (ne u skladu sa pronalaskom)

4

[1509] Primer 3057 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1510] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250, 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 20-85% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.3 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 91% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 20% do 85% pufer B u A na 60° C tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.23 min; ESI-MS(+) m/z 894.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3058 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1512] Primer 3058 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1513] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x250, 5µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 20-85% B u A tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomera (izomer 3058-A i izomer 3058-B) su dobijena. Prinos proizvoda izomer 3058-A i izomer 3058-B je 4.3 mg i 7.6 mg redom, i njihove procenjene čistoće pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 20% do 85% pufer B u A tokom 30 min. na 60° C su 93% i 92%, redom.

Analiza LCMS Uslov A: izomer 3058-A, vreme zadržavanja = 0.99 min; ESI-MS(+) m/z 889.1 (M+2H); izomer 3058-B, 1.10 min; ESI-MS(+) m/z 889.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3059 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1514]

[1515] Primer 3059 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1516] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B u A tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene da se dobije 9.2 mg proizvoda pri 96% čistoće.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.573 min; ESI-MS(+) m/z 1811.80 (M+H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.711 min; ESI-MS(+) m/z 906.80 (M+2H), 1811.80 (M+H).

Pripremanje Primera 3060 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1517]

[1518] Primer 3060 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1519] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B u A tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomera (izomer 3060-A i izomer 3060-B) su dobijena. Prinosi proizvoda izomer 3060-A i izomer 3060-B su 5.5 mg i 1.7 mg redom, i njihove procenjene čistoće pomoću “Analize Uslovi D i E" su 95% i 86%, redom.

Analiza Uslov D: izomer 3060-A: Vreme zadržavanja = 1.455 min; ESI-MS(+) m/z 923.65 (M+2H).

Analiza Uslov D: izomer 3060-B: Vreme zadržavanja = 1.570 min; ESI-MS(+) m/z 923.60 (M+2H).

Analiza Uslov E: izomer 3060-A: Vreme zadržavanja = 1.549 min; ESI-MS(+) m/z 923.45 (M+2H).

Analiza Uslov E: izomer 3060-B: Vreme zadržavanja = 1.666 min; ESI-MS(+) m/z 923.70 (M+2H).

Pripremanje Primera 3061 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1520]

[1521] Primer 3061 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1522] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene da se dobije 3.2mg pri 98% čistoće.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.573 min; ESI-MS(+) m/z 1811.80 (M+H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.711 min; ESI-MS(+) m/z 906.80 (M+2H), 1811.80 (M+H).

Pripremanje Primera 3062 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1523]

[1524] Primer 3062 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1525] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene kako bi se dobilo 5.7mg pri 95% čistoće.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.698 min; ESI-MS(+) m/z 1813.70 (M+H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.853 min; ESI-MS(+) m/z 1813.65 (M+H).

Pripremanje Primera 3063 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1526]

[1527] Primer 3063 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”,

1

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1528] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18 300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.439 min; ESI-MS(+) m/z 1825.90 (M+H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.490 min; ESI-MS(+) m/z 1825.85 (M+H).

Pripremanje Primera 3064 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1529]

2

[1530] Primer 3064 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1531] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18 300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.31 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.468 min; ESI-MS(+) m/z 1777.95 (M+H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.671 min; ESI-MS(+) m/z 1778.80 (M+H).

Pripremanje Primera 3065 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1532]

[1533] Primer 3065 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1534] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-80% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 80% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću

4

HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 75% pufer B tokom 30 min dajući 96% čistoće.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 907.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3066 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1535]

[1536] Primer 3066 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1537] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-70% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 70% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.5 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 91% pomoću HPLC "Analiza HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 70% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 947.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3067 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1538]

[1539] Primer 3067 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1540] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-70% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 70% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC je 99% "Analiza HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 916.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3068 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1541]

[1542] Primer 3068 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1543] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.8 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 912.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3069 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1544]

[1545] Primer 3069 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1546] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.1 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 98% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 912.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3070 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1547]

[1548] Primer 3070 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1549] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.9 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 98% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 925.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3071 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1550]

[1551] Primer 3071 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1552] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 899.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3072 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1553]

[1554] Primer 3072 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1555] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.5 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

1

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 870.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3073 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1556]

[1557] Primer 3073 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1558] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .35-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.9 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 98% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 943.9 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 3074 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1559]

[1560] Primer 3074 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1561] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.8 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću “Analize HPLC Uslov B" korišćenjem gradijenta od 30% do 90% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 915.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3075 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1562]

[1563] Primer 3075 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1564] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .30-90% B tokom 60 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 30% do 85% pufer B tokom 30 min. dajući 97% čistoću.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 926.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3076 (ne u skladu sa pronalaskom)

4

[1566] Primer 3076 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1567] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .35-95% B tokom 60 min, zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min dajući 99% čistoće.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 900.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3077 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1568]

[1569] Primer 3077 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1570] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .35-95% B tokom 60 min, zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 12.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min dajući 99% čistoća.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 900.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3078 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1571]

[1572] U polipropilensku epruvetu od 50 mL je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i epruveta je postavljena na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Leu-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Tyr(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Sar-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Tyr(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Phe-OH;

"CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Val-OH korišćenjem 10 ekv tokom 2 sati na 75 °C;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Asp(OtBu)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Sar-OH; "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH korišćenjem 5ekv tokom 10 min;

"CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Phe-OH korišćenjem 5 ekv tokom10 min;

"CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Phe(penta-F)-OH korišćenjem 5 ekv tokom 10 min;

"Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom” je praćena; “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” je praćena;

"Ciklizaciona metoda C" je praćena.

[1573] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Gradijent: 30- 70% B tokom 25 min, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 944.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.98 min; ESI-MS(+) m/z 944.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3079 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1574]

[1575] Primer 3079 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1576] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 35-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 936.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.09 min; ESI-MS(+) m/z 935.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3080 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1577]

[1578] Primer 3080 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1579] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.71 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 935.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.11 min; ESI-MS(+) m/z 936.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3081 (ne u skladu sa pronalaskom)

1

[1581] Primer 3081 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1582] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 min, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 938.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 938.9 (M+2H).

11

Pripremanje Primera 3082 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1583]

[1584] Primer 3082 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1585] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 906.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 906.2 (M+2H).

12

Pripremanje Primera 3083 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1586]

[1587] Primer 3083 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1588] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 882.0 (M+2H).

1

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 881.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3086 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1589]

[1590] Primer 3086 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1591] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

14

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 916.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 916.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3087 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1592]

[1593] Primer 3087 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1594] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: YMC AQ-ODS 250 x 20mm kolona; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 30-90% B tokom 55 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Peptid nije bio vrlo čist i stoga još jedna preparativna HPLC sa sledećim uslovima je izvedena:

1

Kolona: YMC AQ-ODS 250 x 20mm kolona; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 40-80% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 80% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.5 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 97% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 85% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 913.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3088 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1595]

[1596] Primer 3088 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1597] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: YMC AQ-ODS 250 x 20mm kolona; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B:

1

Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 30-90% B tokom 55 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 90% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Peptid nije bio vrlo čist i stoga još jedna preparativna HPLC sa sledećim uslovima je izvedena: Kolona: YMC AQ-ODS 250 x 20mm kolona; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 40-80% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 80% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomera (izomer 3088-A i izomer 3088-B) su dobijeni. Prinos proizvoda izomer 3088-A i izomer 3088-B je 1.1 mg i 0.81 mg redom, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 85% pufer B tokom 30 min. dajući 99% i 93% čistoće za izomer 3088-A i izomer 3088-B, redom. LC/MS je potvrdila proizvod korišćenjem LCMS "Analiza Uslov A".

Izomer 3088-A: Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 918.7 (M+2H).

Izomer 3088-B: Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 918.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3089 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1598]

1

[1599] Primer 3089 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1600] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 914.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3090 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1601]

1

[1602] Primer 3090 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1603] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.11 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 918.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 918.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3091 (ne u skladu sa pronalaskom)

1

[1605] Primer 3091 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1606] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 894.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 893.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3092 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[1608] Primer 3092 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1609] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 902.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 902.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3093 (ne u skladu sa pronalaskom)

21

[1611] Primer 3093 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1612] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 60% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 933.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 933.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3094 (ne u skladu sa pronalaskom)

22

[1614] Primer 3094 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1615] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 906.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 906.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3095 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[1617] Primer 3095 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1618] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 914.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 914.1 (M+2H).

24

Pripremanje Primera 3096 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1619]

[1620] Primer 3096 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1621] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 919.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 919.0 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 3097 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1622]

[1623] Primer 3097 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1624] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

2

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 898.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3098 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1625]

[1626] Primer 3098 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1627] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 932.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3099 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1628]

[1629] Primer 3099 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1630] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

2

kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 908.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.03 min; ESI-MS(+) m/z 908. 0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3100 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1631]

[1632] Primer 3100 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1633] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

2

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 925.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.09 min; ESI-MS(+) m/z 925.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3101 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1634]

[1635] Primer 3101 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1636] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 893.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 893.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3102 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1637]

[1638] Primer 3102 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

1

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1639] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 928.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 928.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3103 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1640]

[1641] Primer 3103 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1642] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 918.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 918.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3104 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1643]

[1644] Primer 3104 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1645] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3105 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1646]

4

[1647] Primer 3105 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1648] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 906.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 905.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3106 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1649]

[1650] Primer 3106 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1651] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 933.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 932.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3107(ne u skladu sa pronalaskom)

[1652]

[1653] Primer 3107 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1654] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3109 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1655]

[1656] Primer 3109 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1657] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 927.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.03 min; ESI-MS(+) m/z 927.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3110 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1658]

[1659] Primer 3110 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1660] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 35-80% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 910.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 910.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3111 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1661]

[1662] Primer 3111 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1663] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B;

4

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 88%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 962.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 962.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3112 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1664]

[1665] Primer 3112 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1666] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B;

41

Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 35-80% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 977.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 978.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3113 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1667]

[1668] Primer 3113 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

42

[1669] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 977.9 (M+2H). Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 977.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3114 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1670]

4

[1671] Primer 3114 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1672] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 924.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.99 min; ESI-MS(+) m/z 925.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3115 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1673]

44

[1674] Primer 3115 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1675] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 924.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.02 min; ESI-MS(+) m/z 924.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3116 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1676]

[1677] Primer 3116 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A:

4

Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1678] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 916.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 916.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3117 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1679]

[1680] Primer 3117 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A:

4

Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1681] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 916.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 916.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3118 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1682]

[1683] Primer 3118 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A:

4

Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1684] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 931.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 931.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3119 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1685]

[1686] Primer 3119 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A:

4

Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1687] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 931.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 931.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3120 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1688]

[1689] Primer 3120 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za

4

pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1690] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 923.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 923.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3121 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1691]

[1692] Primer 3121 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1693] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 923.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3122 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1694]

1

[1695] Primer 3122 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1696] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 922.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 922.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3123 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1697]

2

[1698] Primer 3123 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1699] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 914.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3124 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1700]

[1701] Primer 3124 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1702] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 914.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 914.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3125 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1703]

4

[1704] Primer 3125 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1705] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 908.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 907.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3130 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1706]

[1707] Primer 3130 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1708] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 917.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.86 min; ESI-MS(+) m/z 916.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3131 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1709]

[1710] Primer 3131 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1711] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 908.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 909.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3132 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1712]

[1713] Primer 3132 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1714] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 65% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 909.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 909.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3133 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1716] Primer 3133 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1717] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3134 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1718]

[1719] Primer 3134 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1720] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3135 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1721]

[1722] Primer 3135 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1723] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 55% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 898.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3136 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1724]

1

[1725] Primer 3136 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1726] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 898.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1. 78 min; ESI-MS(+) m/z 899.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3138 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[1728] Primer 3138 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1729] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 924.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.03 min; ESI-MS(+) m/z 924.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3139 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1731] Primer 3139 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1732] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 14.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 898.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 898.3 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 3140 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1733]

[1734] Primer 3140 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1735] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 14.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 898.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 898.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3141 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1736]

[1737] Primer 3141 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1738] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 914.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 913.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3142 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1739]

[1740] Primer 3142 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1741] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 87%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 899.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 899.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3143 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1742]

[1743] Primer 3143 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1744] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .25-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.3 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 96% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 916.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3144 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1745]

[1746] Primer 3144 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1747] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .25-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 95% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 95% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 925.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3145 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1748]

[1749] Primer 3145 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1750] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 18.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 909.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 908.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3146 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1751]

[1752] Primer 3146 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1753] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa

1

0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 883.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 883.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3147 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1754]

[1755] Primer 3147 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1756] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

2

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 906.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 907.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3148 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1757]

[1758] Primer 3148 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1759] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 918. 7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 918.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3149 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1760]

[1761] Primer 3149 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

4

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1762] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 905.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 905.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3150 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1763]

[1764] Primer 3150 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1765] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 12.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 913.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 913.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3151 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1766]

[1767] Primer 3151 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1768] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge Fenil, 19 x 150 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-55% B tokom 20 min., zatim 10-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 927.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 927.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3152 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1769]

[1770] Primer 3152 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1771] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93% čistoća.

[1772] Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 884.3 (M+2H).

[1773] Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 884.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3153 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1774]

[1775] Primer 3153 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1776] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95% čistoća.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 891.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 891.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3154 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1777]

[1778] Primer 3154 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1779] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94% čistoća.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H). Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 923.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3155 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1780]

[1781] Primer 3155 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1782] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 15.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98% čistoća.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 900.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 899.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3156 (ne u skladu sa pronalaskom)

1

[1784] Primer 3156 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1785] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-60% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25

2

min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99% čistoća.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 893.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 892.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3157 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1786]

[1787] Primer 3157 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1788] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94% čistoća.

[1789] Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 906.9 (M+2H).

[1790] Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 907.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3158 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1791]

[1792] Primer 3158 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1793] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa

4

0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93% čistoća.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 919.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 919.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3159 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1794]

[1795] Primer 3159 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1796] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 13.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97% čistoća.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 926.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.09 min; ESI-MS(+) m/z 926.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3160 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1797]

[1798] Primer 3160 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja” i “Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja".

[1799] Gornja peptidil-smola (0.033mmol) je pročišćena sa N2i stavljena u konusnu bočicu od 15mL (opremljenu sa mešalicom) za mikrotalasni reaktor. Zatim 0.033mmol Hoveyda-Grubb katalizator 2. generacije rastvoren u 5mL 1,2-Dihloretana je dodat. Smeša je zatim zagrejana u mikrotalasnoj na 120°C tokom 1h. Nakon što je reakcija završena, smola je filtrirana i oprana sa DMF 2x5mL praćeno sa DCM 3x5mL u špricu opremljenom sa filterom. Procedura za globalno uklanjanje zaštite i ciklizaciju je ponovljena kao što je izvedeno u Primeru 3078 “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1800] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .35-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.77 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 86% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 85% pufer B tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 888.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3161 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1801]

[1802] Primer 3161 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1803] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 885.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 885.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3162 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1805] Primer 3162 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1806] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 892. 7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 892.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3163 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1807]

[1808] Primer 3163 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1809] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 899.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 899.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3164 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1810]

[1811] Primer 3164 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1812] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 906.8 (M+2H).

1

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 906.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3165 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1813]

[1814] Primer 3165 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1815] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 910.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 910.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3166 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1816]

[1817] Primer 3166 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1818] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 18.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 901.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.03 min; ESI-MS(+) m/z 900.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3167 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1819]

[1820] Primer 3167 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1821] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

4

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 900.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.14 min; ESI-MS(+) m/z 900.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3168 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1822]

[1823] Primer 3168 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1824] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 17.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 907.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 907.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3171 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1825]

[1826] Primer 3171 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1827] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 881.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 881.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3172 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1828]

[1829] Primer 3172 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1830] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 891.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 891.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3173 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1831]

[1832] Primer 3173 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1833] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 35-80% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 2.26 min; ESI-MS(+) m/z 903.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.25 min; ESI-MS(+) m/z 903.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3174 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1834]

[1835] Primer 3174 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1836] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 911.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 911.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3175 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1837]

[1838] Primer 3175 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1839] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 910.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 910.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3176 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1840]

1

[1841] Primer 3176 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1842] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 879.1 (M+2H).

2

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 878.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3177 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1843]

[1844] Primer 3177 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1845] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 887.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 886.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3178 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1846]

[1847] Primer 3178 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1848] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa

4

0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 887.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 886.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3179 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1849]

[1850] Primer 3179 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil) amino)-3-(3,5-dihlorofenil)propionska kiselina je korišćena.

[1851] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 933.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 933.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3180 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1852]

[1853] Primer 3180 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-hloro-3-fluorofenil)propionska kiselina je korišćena.

[1854] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 924.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 925.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3181 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1855]

[1856] Primer 3181 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1857] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 925.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 925.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3182 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1858]

[1859] Primer 3182 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1860] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 982.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 982.8 (M+2H).

[1861] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 982.4330 (M+2H); Nađeno: 982.4307 (M+2H).

Pripremanje Primera 3183 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1862]

[1863] Primer 3183 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1864] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19

1

x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 960.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 960.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3184 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1865]

[1866] Primer 3184 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

11

[1867] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 21.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 925.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 926.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3185 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1868]

[1869] Primer 3185 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”,

12

"Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3,5-dihloro-4-fluorofenil)propionska kiselina je korišćena.

[1870] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 6-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 942.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.96 min; ESI-MS(+) m/z 942.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3186 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1871]

1

[1872] Primer 3186 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-hloro-4,5-difluorofenil)propionska kiselina je korišćena.

[1873] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: .35-85% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća je bila 99% pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 30% do 85% pufer B tokom 20 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 933.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3187 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1874]

14

[1875] Primer 3187 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1876] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.4 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 907.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 907.5 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 3188 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1877]

[1878] Primer 3188 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1879] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

1

kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 900.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 900.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3189 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1880]

[1881] Primer 3189 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

1

[1882] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.6 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 893.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 893.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3190 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1883]

[1884] Primer 3190 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A:

1

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1885] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.8 mg i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 914.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 914.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3191 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1886]

1

[1887] Primer 3191 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1888] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene.

2

Prinos proizvoda je bio 5.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 893.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 893.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3192 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1889]

[1890] Primer 3192 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1891] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum

21

acetatom; Gradijent: 20-75% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 943.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 943.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3193 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1892]

[1893] Primer 3193 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1894] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa

22

10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-75% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 950.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 950.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3194 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1895]

[1896] Primer 3194 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1897] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona:

2

Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.99 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3195 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1898]

[1899] Primer 3195 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

24

[1900] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 951.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 951.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3196 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1901]

[1902] Primer 3196 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

2

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1903] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.86 min; ESI-MS(+) m/z 965.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 965.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3197 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1904]

[1905] Primer 3197 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1906] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 981.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 981.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3198 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1907]

2

[1908] Primer 3198 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1909] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 965.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 965.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3199 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1910]

2

[1911] Primer 3199 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1912] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-75% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 951.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3200 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1913]

2

[1914] Primer 3200 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1915] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 944. 7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 944.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3201 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1917] Primer 3201 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1918] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 958.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 958.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3202 (ne u skladu sa pronalaskom)

1

[1920] Primer 3202 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1921] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 966.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 966.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3203 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1922]

[1923] Primer 3203 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1924] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 959.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 959.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3204 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1925]

[1926] Primer 3204 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

4

[1927] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 918.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 918.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3205 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1928]

[1929] Primer 3205 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1930] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 918.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 918.5 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 917.9173 (M+2H); Nađeno: 917.9147 (M+2H).

Pripremanje Primera 3206 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1931]

[1932] Primer 3206 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". Osmo kuplovanje Fmoc-N-Me-Phe(3-F)-OH je izvedena korišćenjem procedure "Metode A N-Metilacije na-smoli".

[1933] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 907.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 908.0 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 907.4266 (M+2H); Nađeno: 907.4237 (M+2H).

Pripremanje Primera 3207 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1934]

[1935] Primer 3207 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1936] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 16.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 867.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 867.2 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 866.4394 (M+2H); Nađeno: 866.4367 (M+2H).

Pripremanje Primera 3208 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1937]

[1938] Primer 3208 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1939] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 40-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomera (izomer 3208-A i izomer 3208-B) su dobijeni. Prinos proizvoda izomer 3208-A i izomer 3208-B je 1.68 mg i 1.47 mg redom, i njihove procenjene čistoće su bile 97% i 99%, redom, pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 85% pufer B preko25 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 954.7 (M+2H) za izomer 3208-A i 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 954.3 (M+2H) za izomer 3208-B.

ESI-HRMS(+) m/z za izomer 3208-A: Izračunato: 953.9473 (M+2H); Nađeno: 953.9456 (M+2H).

Pripremanje Primera 3209 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1940]

[1941] Primer 3209 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3078, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Procedura standardnog kuplovanja", "Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1942] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 20x2505µ čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna

4

faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Gradijent: 40-95% B tokom 50 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomera (izomer 3209-A i izomer 3209-B) su dobijeni. Prinos proizvoda izomer 3209-A i izomer 3209-B je 2.35 mg i 3.2 mg redom, i njihove procenjene čistoće su bile 96% i 99%, redom, pomoću HPLC "Analiza Uslov B" korišćenjem gradijenta od 35% do 85% pufer B tokom 25 min.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 981.7 (M+2H) za izomer 3209-A i 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 981.4 (M+2H) za izomer 3209-B.

ESI-HRMS(+) m/z za izomer 3209-A: Izračunato: 980.9332 (M+2H); Nađeno: 980.9318 (M+2H).

Pripremanje Primera 3500 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1943]

[1944] Primer 3500 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

41

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1945] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-55% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 23.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 100% korišćenjem generalne "Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 1855.5 (M+H).

Pripremanje Primera 3501 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1946]

42

[1947] Primer 3501 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1948] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-55% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 22.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 97.6% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 1838.7 (M+H).

Pripremanje Primera 3502 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1949]

4

[1950] Primer 3502 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1951] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-55% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 33.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96.6% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 1811.7 (M+H).

Pripremanje Primera 3503 (ne u skladu sa pronalaskom)

44

[1953] Primer 3503 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1954] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-55% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 19.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96.6% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 1861.9 (M+H).

4

Pripremanje Primera 3504 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1955]

[1956] Primer 3504 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1957] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-55% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni

4

proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 13.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98.9% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18300A 150x4.6mm (575289-17); Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 30-95% B tokom 30 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 1798.6 (M+H).

Pripremanje Primera 3505 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1958]

[1959] Primer 3505 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

4

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1960] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-55% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 18.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 97.2% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 1748.0 (M+H).

Pripremanje Primera 3506 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1961]

4

[1962] Primer 3506 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1963] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 3.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99.6% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 1790.9 (M+H).

Pripremanje Primera 3507 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1964]

4

[1965] Primer 3507 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1966] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 45 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 14.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 100% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 1764.0 (M+H).

Pripremanje Primera 3508 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1968] Primer 3508 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1969] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 8.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 93% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

1

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 1841.1 (M+H).

Pripremanje Primera 3509 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1970]

[1971] Primer 3509 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1972] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 45 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni

2

proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 98.6% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 1813.8 (M+H).

Pripremanje Primera 3510 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1973]

[1974] Primer 3510 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1975] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99.6% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.29 min; ESI-MS(+) m/z 941.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3511 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1976]

[1977] Primer 3511 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A:

4

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1978] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 5.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 83% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 952.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3512 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1979]

[1980] Primer 3512 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1981] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 45 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 29.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99.2% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-80% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 1869.9 (M+H).

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 935.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3513 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1982]

[1983] Primer 3513 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1984] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 7.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 87% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-80% tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.27 min; ESI-MS(+) m/z 894.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3514 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1986] Primer 3514 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1987] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 5.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 90% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-80% tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 905.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3515 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1988]

[1989] Primer 3515 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1990] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 5.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 99% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 904.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3516 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1991]

[1992] Primer 3516 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1993] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 1.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 89% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.025% Amonijum Acetat u 5% metanol/voda; Mobilna faza B: Acetonitril/voda (4:1); Gradijent: 30-95% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 1812.1 (M+H).

Pripremanje Primera 3517 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1994]

[1995] Primer 3517 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

1

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C". Prethodno naneta Fmoc-Gly-Tritil Smola je korišćena umesto Seiber smole.

[1996] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 5.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 95% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 30-80% tokom 30 min.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 899.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3518 (ne u skladu sa pronalaskom)

[1997]

2

[1998] Primer 3518 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[1999] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 2.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 82% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 1772.7 (M+H).

Pripremanje Primera 3519 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2000]

[2001] Primer 3519 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2002] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 15.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96% korišćenjem generalne “Analize Uslovi B" 35-95% tokom 30 min.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 1847.4 (M+H).

4

Pripremanje Primera 3520 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2003]

[2004] Primer 3520 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2005] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 907.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3522 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2006]

[2007] Primer 3522 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2008] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 13.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.5%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 937.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3523 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2009]

[2010] Primer 3523 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2011] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 14.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.5%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 906.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3524 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2012]

[2013] Primer 3524 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2014] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 12.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 905.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3525 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2015]

[2016] Primer 3525 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2017] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.4%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 899.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3526 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2018]

[2019] Primer 3526 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog ispod.

[2020] U polipropilensku epruvetu od 50 mL je dodata Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol), i epruveta je postavljena na CEM Liberty mikrotalasni peptidni sintetizator. Procedure koje slede su izvedene sekvencijalno:

"CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Gly-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Cys(Trt)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Leu-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Tyr(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc- Tyr(tBu)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Sar-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Tyr(tBu)-OH; "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Phe-OH;

"CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Val-OH korišćenjem 10 ekv tokom 2 sati na 75 °C;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Asp(OtBu)-OH;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Sar-OH; "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Nle-OH korišćenjem 5 ekv tokom 10 min;

"CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja" je praćena sa Fmoc-[N-Me]Phe-OH korišćenjem 5 ekv tokom 10 min;

"CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja" je praćena sa Fmoc-Phe-OH korišćenjem 5 ekv tokom 10 min;

"Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom” je praćena, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite” je praćena i "Ciklizaciona metoda C" je praćena.

1

[2021] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 12.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.8%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 887.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3527 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2022]

[2023] Primer 3527 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

2

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2024] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 928.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 928.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3528 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2025]

[2026] Primer 3528 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2027] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 906.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 906.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3529 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2028]

4

[2029] Primer 3529 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2030] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 906.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.96 min; ESI-MS(+) m/z 906.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3531 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2031]

[2032] Primer 3531 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2033] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 911.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 911.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3532 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2034]

[2035] Primer 3532 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2036] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 921.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 920.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3533 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2037]

[2038] Primer 3533 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2039] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.41 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 920.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 920.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3534 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2040]

[2041] Primer 3534 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2042] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.72 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 890.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.94 min; ESI-MS(+) m/z 890.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3535 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2043]

[2044] Primer 3535 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2045] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.81 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.3%.

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.03 min; ESI-MS(+) m/z 916.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3536 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2046]

1

[2047] Primer 3536 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2048] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.61 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 930.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 930.2 (M+2H).

2

Pripremanje Primera 3537 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2049]

[2050] Primer 3537 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2051] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.81 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.1%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 915.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 915.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3538 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2052]

[2053] Primer 3538 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2054] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.91 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.8%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.05 min; ESI-MS(+) m/z 915.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3539 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2055]

[2056] Primer 3539 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2057] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.52 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 910.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 910.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3540 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2058]

[2059] Primer 3540 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2060] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.52 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 890.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 890.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3541 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2061]

[2062] Primer 3541 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2063] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.41 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3542 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2064]

[2065] Primer 3542 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2066] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 903.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 903.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3543 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2067]

[2068] Primer 3543 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2069] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.71 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 923.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 923.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3544 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2070]

[2071] Primer 3544 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2072] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 2.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.9%.

1

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 896.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 896.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3545 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2073]

[2074] Primer 3545 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2075] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1%

2

trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.5%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 917.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.01 min; ESI-MS(+) m/z 917.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3546 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2076]

[2077] Primer 3546 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2078] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 12.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 896.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 897.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3547 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2079]

4

[2080] Primer 3547 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2081] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 12.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.5%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 928.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.12 min; ESI-MS(+) m/z 928.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3548 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2082]

[2083] Primer 3548 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2084] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.1%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 894.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 894.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3549 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2085]

[2086] Primer 3549 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2087] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 8.41 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 913.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.99 min; ESI-MS(+) m/z 913.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3550 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2088]

[2089] Primer 3550 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2090] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 13.72 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.6%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1. 72 min; ESI-MS(+) m/z 913.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 913.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3551 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2091]

[2092] Primer 3551 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2093] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.82 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 905.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 905.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3552 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2094]

[2095] Primer 3552 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2096] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.61 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 920.7 (M+2H).

1

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 920.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3553 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2097]

[2098] Primer 3553 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2099] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

2

kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.22 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 906.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 905.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3555 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2100]

[2101] Primer 3555 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2102] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.82 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 892.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 892.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3556 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2103]

[2104] Primer 3556 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A:

4

Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2105] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.02 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 892.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 892.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 3557 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2106]

[2107] Primer 3557 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2108] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 5.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 83% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.025% Amonijum Acetat u 5% metanol/voda; Mobilna faza B: Acetonitril/voda (4:1); Gradijent: 25-75% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 907.9 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 1815.0 (M+H).

Pripremanje Primera 3558 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2109]

[2110] Primer 3558 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2111] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 1.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC analize je bila 96% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.025% Amonijum Acetat u 5% metanol/voda; Mobilna faza B: Acetonitril/voda (4:1); Gradijent: 25-75% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 919.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 1837.1 (M+H).

Pripremanje Primera 3559 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2112]

[2113] Primer 3559 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Procedura kuplovanja sa dvostrukim parom", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2114] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 3.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 89% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 25-55% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza LCMS Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 919.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 1837.1 (M+H).

Pripremanje Primera 3560 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2115]

[2116] Primer 3560 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2117] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 20.72 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 912.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.01 min; ESI-MS(+) m/z 912.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3561 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2118]

[2119] Primer 3561 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A:

1

Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2120] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 16.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 890.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 890. 7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3562 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2121]

11

[2122] Primer 3562 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2123] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94.9%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 911.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 912.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3563 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2124]

12

[2125] Primer 3563 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2126] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 11.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.9%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 899.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 3564 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2127]

[2128] Primer 3564 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2129] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 18.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 898.9 (M+2H).

14

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 898.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3565 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2130]

[2131] Primer 3565 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2132] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su

1

kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.8%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 890.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 891.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3566 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2133]

[2134] Primer 3566 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2135] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1%

1

trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.56 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 906.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 906.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3567 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2136]

[2137] Primer 3567 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

1

(S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(3-hloro-4-fluorofenil)propionska kiselina je korišćena.

[2138] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 40-85% B tokom 35 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 9.82 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 98.8% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 25-55% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 1849.9 (M+H).

Pripremanje Primera 3568 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2139]

1

[2140] Primer 3568 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2141] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 40-85% B tokom 35 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 8.08 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 98.8% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 25-55% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 1815.0 (M+H).

Pripremanje Primera 3569 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2142]

1

[2143] Primer 3569 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2144] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 16.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 916.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.86 min; ESI-MS(+) m/z 917.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3570 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2145]

2

[2146] Primer 3570 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2147] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 27.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 900.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 900.8 (M+2H).

21

Pripremanje Primera 3571 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2148]

[2149] Primer 3571 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2150] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 25.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

22

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 900.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 900.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3572 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2151]

[2152] Primer 3572 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2153] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

2

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 16.01 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90.8%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 919.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 918.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3573 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2154]

[2155] Primer 3573 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

24

[2156] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 9.71 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 919.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.96 min; ESI-MS(+) m/z 919.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3574 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2157]

[2158] Primer 3574 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A:

2

Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2159] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 16.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 94.1% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.025% Amonijum Acetat u 5% metanol/voda; Mobilna faza B: Acetonitril/voda (4:1); Gradijent: 25-55% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 925.0 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 1848.5 (M+H).

Pripremanje Primera 3575 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2160]

2

[2161] Primer 3575 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2162] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Rastvorene u minimumu acetonitrila i vode, zamrznute i liofilizovane da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 19.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 94.1% korišćenjem "Analiza Uslov B"; Gradijent: 30-75% B tokom 30 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 920.0 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 1839.3 (M+H).

2

Pripremanje Primera 3576 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2163]

[2164] Primer 3576 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2165] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.70 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.0%.

2

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3577 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2166]

[2167] Primer 3577 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2168] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1%

2

trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.92 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.3%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 905.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 904.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3578 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2169]

[2170] Primer 3578 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2171] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.21 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 919.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 919.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 3579 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2172]

1

[2173] Primer 3579 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2174] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.52 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99.1%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 906.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 907.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3580 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2175]

2

[2176] Primer 3580 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2177] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.81 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.1%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z 919.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 2.06 min; ESI-MS(+) m/z 919.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 3581 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2179] Primer 3581 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2180] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 28.22 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 901.2 (M+2H).

4

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.85 min; ESI-MS(+) m/z 901.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 3582 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2181]

[2182] Primer 3582 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2183] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 26.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.8%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 904.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 904.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3583 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2184]

[2185] Primer 3583 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2186] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 14.60 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.8%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 3584 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2187]

[2188] Primer 3584 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2189] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 50 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 3.06 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 95.4% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Kinetex 2.6µ C18(2) 2.1 x 50mm Ser. #515561-57; Mobilna faza A: 0.025% Amonijum Acetat u 5% metanol/voda; Mobilna faza B: Acetonitril/voda (4:1); Gradijent: 25-55% B tokom 20 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 60 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 919.0 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 1837.1 (M+H).

Pripremanje Primera 3585 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2190]

[2191] Primer 3585 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2192] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Dva izomerna proizvoda su izolovana: Izomer A i B.

[2193] Prinos izomera A je 1.70 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 100.0% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18150 x 4.6mm 300A.; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u acetonitrilu: 30-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 923.0 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 1845.1 (M+H).

[2194] Prinos izomera B je 2.18 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 92.8% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18150 x 4.6mm 300A.; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u acetonitrilu: 35-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 923.9 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 1847.9 (M+H).

Pripremanje Primera 3586 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2195]

4

[2196] Primer 3586 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hloroacetil hloridom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2197] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 4.79 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 96.6% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18150 x 4.6mm 300A.; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u acetonitrilu: 35-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 916.9 (M+2H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 1832.9 (M+H).

Pripremanje Primera 3588 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2198]

41

[2199] Primer 3588 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2200] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 95% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 3.19 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 91.9% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18 150 x 4.6mm 300A.; Mobilna faza A: 0.025% Amonijum Acetat u 5% metanol/voda; Mobilna faza B: Acetonitril/voda (4:1): 30-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 920.0 (M+2H).

42

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 1838.3 (M+H).

Pripremanje Primera 3589 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2201]

[2202] Primer 3589 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2203] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno

4

zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.31 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.3%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 974.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 973.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3590 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2204]

[2205] Primer 3590 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

44

[2206] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.60 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 967.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 966.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 35901 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2207]

4

[2208] Primer 3591 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2209] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 10.21 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 973.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 973.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3592 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2210]

4

[2211] Primer 3592 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2212] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.40 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 966.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 966.9 (M+2H).

4

Pripremanje Primera 3593 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2213]

[2214] Primer 3593 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2215] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 7.80 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 962.2 (M+2H).

4

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 962.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3594 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2216]

[2217] Primer 3594 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2218] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode,

4

zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 2.08 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 89.3% korišćenjem “Analiza Uslovi B"; 30-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.29 min; ESI-MS(+) m/z 1925.6 (M+H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 1924.4 (M+H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.4605 (M+2H); Nađeno: 962.45821 (M+2H).

Pripremanje Primera 3595 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2219]

[2220] Primer 3595 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2221] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 3.39 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 100% korišćenjem “Analiza Uslovi B"; 35-75% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM, Rerna: 40 °C.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 1925.4 (M(-Trt)+H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 1927.6 (M(-Trt)+H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1083.5153 (M+2H); Nađeno: 1083.51169 (M+2H).

Pripremanje Primera 3596 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2222]

1

[2223] Primer 3596 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2224] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne HPLC sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 2.52 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 90.6% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18150 x 4.6mm 300A.; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitril : 35-60% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 1978.3 (M+H). Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 1979.4 (M+H).

Pripremanje Primera 3597 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2225]

2

[2226] Primer 3597 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2227] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Dva izomerna proizvoda su izolovana.

[2228] Prinos izomera A je 3.40 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.9%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 920.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 920.4 (M+2H).

[2229] Prinos izomera B je 4.50 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 920.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 920.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3598 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2230]

[2231] Primer 3598 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM

4

Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2232] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.45 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 944.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3599 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2233]

[2234] Primer 3599 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2235] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.01 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92.7%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 3600 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2236]

[2237] Primer 3600 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2238] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.40 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.4%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 920.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 3601 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2239]

[2240] Primer 3601 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2241] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 5.30 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 920.8 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 920.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 3602 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2242]

[2243] Primer 3602 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2244] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 35 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 0.99 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 96% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3 µm 150 x; Mobilna faza A: 0.025 Amonijum Acetat/Acetonitril (8:2); Mobilna faza B: 0.025% Amonijum Acetat/Acetonitril (2:8): 30-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM. Oven 40 °C.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 1783.0 (M+H).

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.27 min; ESI-MS(+) m/z 1783.8 (M+H).

Pripremanje Primera 3603 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2245]

[2246] Primer 3603 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", “Procedura N-Metilacije nasmoli” za N-metilaciju Fmoc-2-Nal-OH, "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2247] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 0.89 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 100% korišćenjem “Analiza Uslovi C": 30-60% B tokom 15 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM. Oven 40 °C.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 1845.8 (M+H).

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 1847.5 (M+H).

Pripremanje Primera 3604 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2248]

1

[2249] Primer 3604 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2250] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: PHENOMENEX® Luna 5µ C18(2) 250 x 21.2 Axia, 100A Ser. #520221-1; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitrilu; Gradijent: 35-75% B tokom 40 min., zatim 5-minutni gradijent do 85% B; Protok: 15 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Proizvod je rastvoren u minimumu acetonitrila i vode, zamrznut i liofilizovan da bi se dobila bela amorfna čvrsta supstanca. Prinos proizvoda je bio 1.10 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću HPLC Analize je 96% korišćenjem sledećih uslova: Kolona: PHENOMENEX® Jupiter 5µ C18150 x 4.6mm 300A.; Mobilna faza A: 0.1% TFA u vodi; Mobilna faza B: 0.1% TFA u Acetonitril : 35-60% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min. Detekcija UV: 217 nM. Oven 40 °C.

Analiza LCMS Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 1839.9 (M+H).

Pripremanje Primera 3605 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2251]

2

[2252] Primer 3605 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2253] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 6.50 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93.8%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 950.5 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 950.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3606 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2254]

[2255] Primer 3606 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2256] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.07 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92.5%.

4

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 967.4 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 967.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 3607 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2257]

[2258] Primer 3607 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2259] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 3.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.2%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 943.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 3608 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2260]

[2261] Primer 3608 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2262] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 1.49 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.1%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 950.6 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 950.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 950.4230 (M+2H); Nađeno: 950.4200 (M+2H).

Pripremanje Primera 3609 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2263]

[2264] Primer 3609 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2265] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 0.39 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.5%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 934.1 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.86 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 933.4146 (M+2H); Nađeno: 933.4126 (M+2H).

Pripremanje Primera 3610 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2266]

[2267] Primer 3610 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2268] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 14.79 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 892.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 892.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 891.9267 (M+2H); Nađeno: 891.9229 (M+2H).

Pripremanje Primera 3611 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2269]

[2270] Primer 3611 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 3026, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "CEM Metoda A: Procedura bubrenja smole", "CEM Metoda A: Standardna procedura kuplovanja", "CEM Metoda A: Prilagođena procedura aminokiselinskog kuplovanja", "Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2271] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 25.53 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100.0%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 929.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 929.7 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 929.4447 (M+2H); Nađeno: 929.4428 (M+2H).

Pripremanje Primera 3613 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2272]

[2273] Primer 3613 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 72, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura sekundarnog aminskog-kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura A kuplovanja sa hlorosirćetnom kiselinom”, “Metoda B globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda C".

[2274] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18300, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 30-70% B tokom 25 min., zatim 5-minutno

1

zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene. Prinos proizvoda je bio 4.93 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.5%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 966.9 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 966.8 (M+2H).

Analitički podaci:

[2275] Masena spektrometrija: "ESI-MS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-MS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom izvedenu u negativnom jonskom modu; "ESI-HRMS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-HRMS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije izvedenu u negativnom jonskom modu. Detektovane mase su prijavljene praćenjem "m/z" jedinične oznake. Jedinjenja sa tačnim masama većim od 1000 su često detektovana kao dvostruko-naelektrisani ili trostruko-naelektrisani joni.

Analiza Uslov A:

[2276] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5 minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza Uslov B:

[2277] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol:voda sa 10mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 10mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5 minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 0.5 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza Uslov C:

2

[2278] Kolona: Waters AQUITY® BEH C182.1 x 50 mm 1.7 µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.05% TFA; Temperatura: 40 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 1.5 minuta, zatim 0.5 minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Generalne Procedure:

Prelude Metoda A:

[2279] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 mL opremljenoj sa fritom u donjem delu; gde skala reakcije prelazi 0.100 mmol, polipropilenska epruveta od 40 mL opremljena sa fritom na dnu je korišćena. Epruveta se vezuje za Prelude peptidni sintetizator i preko donjeg dela i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati preko donjeg dela epruvete i propušteni preko frite kako bi kontaktirali smolu. Svi rastvori su uklonjeni preko donjeg dela epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa preko frite u donjem delu; puls traje pribiližno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Hloroacetil hloridni rastvori u DMF su korišćeni u okviru 24h od pripremanja. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvori su korišćeni u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Rink = (2,4-dimetoksifenil)(4-alkoksifenil)metanamin, gde "4-alkoksi" opisuje opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Rink veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.56 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[2280] Procedure iz "Prelude Metoda A" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 178 mg Rink-Merrifield smole opisane ovde. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja” opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru dvostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetilhlorida za N-terminus peptida je opisano pomoću “Procedure kuplovanja sa hloroacetil hloridom” opisane ispod.

Procedura bubrenja smole:

[2281] U polipropilensku posudu od 10 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Rink smola (178 mg, 0.100 mmol). Smola je oprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[2282] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno šest puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.5 mL, 4 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat anhidrid sirćetne kiseline (2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno

4

četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[2283] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno šest puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.5 mL, 4 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana dva puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF, 0.5 mL, 4 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana dva puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat anhidrid sirćetne kiseline (2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom:

[2284] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. u reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno šest puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat preko vrha posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat DIPEA (0.8M u DMF, 3.0 mL, 24 ekv), zatim hloroacetil hlorid (0.8M u DMF, 1.65 mL, 13.2 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 30 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrhu posude i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je postavljena pod N2struju tokom 15 minuta.

Symphony Metoda A:

[2285] Ova grupa procedura je identična onoj iz "Prelude Metoda A" osim kad je napomenuto. Za sve procedure Symphony X peptidni sintetizator (Protein Technologies) je korišćen umesto Prelude peptidnog sintetizatora i svi reagensi su dodati preko vrha reakcione posude.

Procedura bubrenja smole:

[2286] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole".

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[2287] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” osim što je koncentracija DIPEA rastvora bila 0.4M i 1.0 mL ovog rastvora je isporučeno u reakciju.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[2288] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja" osim što je koncentracija DIPEA rastvora bila 0.4M i 1.0 mL ovog rastvora je isporučeno u reakciju.

Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom:

[2289] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom".

Metoda globalnog uklanjanja zaštite A:

[2290] Sve manipulacije su izvedene manuelno osim ukoliko nije naznačeno. Procedura iz “Metode A globalnog uklanjanja zaštite” opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen kombinovanjem u staklenoj bočici od 40 mL trifluorosirćetne kiseline (22 mL), fenoal (1.325 g), vode (1.25 mL) i triizopropilsilana (0.5 mL). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prebačena u staklenu bočicu od 4 mL. U bočicu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0 mL). Smeša je snažno mešana u šejkeru (1000 RPM tokom 1 minuta, zatim 500 RPM tokom 1-2h). Smeša je filtrirana kroz filter za špric od 0.2 µ i čvrste supstance su ektrahovane sa "rastvorom za uklanjanje zaštite" (1.0 mL) ili TFA (1.0 mL). U test epruvetu od 24 mL napunjenu sa kombinovanim filtratima je dodat Et2O (15 mL). Smeša je snažno mešana nakon čega je značajna količina bele čvrste supstance precipitirala. Smeša je centrifugiran tokom 5 minuta, zatim rastvor je dekantiran iz čvrstih supstanci i odbačen. Čvrste supstance su suspendovane u Et2O (20 mL); zatim smeša je centrifugiran tokom 5 minuta; i rastvor je dekantiran away iz čvrstih supstanci i odbačen. Poslednji put, čvrste supstance su suspendovane u Et2O (20 mL); smeša je centrifugirana tokom 5 minuta; i rastvor je dekantiran iz čvrstih supstanci i odbačen kako bi se dobio sirov peptid kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Ciklizaciona metoda A:

[2291] Sve manipulacije su izvedene manuelno osim ukoliko nije naznačeno. Procedura iz "Ciklizacione metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu koji je korišćen da se generiše peptid. Ova skala nije bazirana na direktnoj determinaciji količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u MeCN:vod. 0.1M NH4OAc (30mL:30mL), i rastvor je zatim pažljivo podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim ostavljen da odstoji bez mešanja tokom 12-18h. Reakcioni rastvor je koncentrovana i ostatak je zatim rastvoren u DMSO:MeOH. Ovaj rastvor je podvrgnut reverzno-faznom HPLC prečišćavanju kako bi se dobio željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda B:

[2292] Sve manipulacije su izvedene manuelno osim ukoliko nije naznačeno. Procedura iz "Ciklizacione metoda B" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu koji je korišćen da se generiše peptid. Ova skala nije bazirana na direktnoj determinaciji količine peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana preko 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih zapremina pomoću sadržaoca skale. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvoreni u MeCN:vod. 0.1M NH4OAc (1:1) do ukupne zapremine od 18-22 mL, i rastvor je pažljivo zatim podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim ostavljen da odstoji bez mešanja tokom 12-18h. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u DMSO:MeOH. Ovaj rastvor je podvrgnut reverzno-faznom HPLC prečišćavanju kako bi se dobio željeni ciklični peptid.

Generalni sintetički niz A:

[2293] "Generalni sintetički niz A" opisuje generalni sintetički niz procedura koje su korišćene kako bi se dobili ciklični peptidi opisani ovde. Za svrhe ove generalne procedure, procedure iz "Symphony Metode A" su zamenljive sa onim iz "Prelude Metode A". U polipropilensku posudu od 10 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Rink-Merrifield smola (178 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude peptidni sintetizator. "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena. Zatim serija aminokiselinskih kuplovanja je sekvencijalno izvedena na Prelude nakon "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” ako N-terminus peptoda vezanog za smolu je primarni amin ili "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja" ako je N-terminus peptida vezanog za smolu sekundarni amin. "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom" je praćena; zatim “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite” je praćena; zatim "Ciklizaciona metoda A" je praćena.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)([<13>C]metil)amino) heksanska kiselina

[2294]

Korak 1:

[2295] Smeša koja sadrži paraformaldehid(<13>C obeležen) (500 mg, 16.65 mmol), (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)heksansku kiselinu (4527 mg, 12.81 mmol), i ptoluensulfonsku kiselinu (221 mg, 1.281 mmol) je refluksovana u toluenu (100 mL) tokom 2 h. Reakcija je zatim ohlađena do ST, oprana sa zas. natrijum bikarbonatnim rastvorom, praćeno slanim rastvorom, osušena sa MgSO4, filtrirana i uparena kako bi se dobio proizvod iz Koraka 1 (4.694 g, 12.81 mmol) kao žuto ulje. Prinos se pretpostavlja da je 100%. ESI-MS(+) m/z = 389.2 (M+Na).

Korak 2:

[2296] Kompletan proizvod iz Koraka 1 (4.694 g, 12.83 mmol) je rastvoreno u CHCl3(40 mL) i u rastvor je dodat trietilsilan (10.24 mL, 64.1 mmol) praćeno sa TFA (10 mL, 130 mmol). Rastvor je mešan na ST pod pozitivnim pritiskom N2tokom 18 h. Isparljive supstance su uklonjene u vakuumu kako bi se dobilo lepljivo ulje. Ulje je rastvoreno u EtOAc i zatim ektrahovano sa zas. natrijum bikarbonatom (2 x 100 mL). Čvrste supstance na mestu dodira faza su sakupljene sa vodenom fazom. Vodena faza je podešena sa vod. HCl do pH 4-5. Bela čvrsta supstanca je precipitirala blizu krajnje tačke podešavanja pH. Smeša je ektrahovana sa EtOAc (200 mL) i organska faza oprana sa slanim rastvorom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana kako bi se dobio čist proizvod (S)-2-((((9H-fluoren-9il)metoksi)karbonil)(([<13>C]metil)amino)heksanska kiselina (3 g, 8.14 mmol, 63.5% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, CDCl3) d 7.78 (d, J=7.1 Hz, 2H), 7.66 - 7.52 (m, 2H), 7.41 (d, J=6.8 Hz, 2H), 7.33 (d, J=6.1 Hz, 2H), 4.84 - 4.59 (m, 1H), 4.55 - 4.40 (m, 2H), 4.34 - 4.17 (m, 1H), 3.16 - 2.98 (m, 1H), 2.71 (br. s., 1H), 1.77 (br. s., 1H), 1.44 - 1.14 (m, 5H), 0.91 (d, J=7.3 Hz, 3H). ESI-MS(+) m/z = 369.4 (M+H).

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)([<13>C]metil)amino) propionska kiselina

[2297]

Korak 1:

[2298] Smeša koja sadrži paraformaldehid(C13 obeležen) (250 mg, 8.33 mmol), (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)propionska kiselina (1994 mg, 6.40 mmol), i p-toluene sulfonic acid (110 mg, 0.640 mmol) je refluksovana u toluenu (50 mL) tokom 2 h. Reakcija je zatim ohlađena do ST, oprana sa zas. natrijum bikarbonat rastvor, praćeno sa slanim rastvorom, osušen sa MgSO4, filtriran and uparen kako bi se dobio proizvod iz Koraka 1 (2.08 g, 6.41 mmol) kao žuto ulje. Pretpostavlja se da je prinos 100%. ESI-MS(+) m/z = 348.1 (M+Na).

Korak 2:

[2299] Kompletan proizvod iz Koraka 1 (2.08 g, 6.41 mmol) je rastvoreno u CHCl3(20 mL) i u rastvor je dodat trietilsilan (5.12 mL, 32.1 mmol) praćeno sa TFA (4.94 mL, 64.1 mmol). Rastvor je mešan na ST pod pozitivnim pritiskom od N2tokom 18 h. Isparljive supstance su uklonjene kako bi se dobilo lepljivo ulje. Ulje je rastvoreno u EtOAc i zatim ektrahovano sa zas. natrijum bikarbonatom (2 x 100 mL). Čvrste supstance na mestu dodira faza su sakupljene sa vodenom fazom. Vodena faza je podešena do pH 4-5 korišćenjem vod. HCl. Bela čvrsta supstanca je precipitirala blizu krajnje tačke pH podešavanja. Smeša je ektrahovana sa EtOAc (200 mL) i organska faza oprana sa slanim rastvorom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana kako bi se dobio čist proizvod (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)([<13>C]metil)amino)propionska kiselina (1 g, 3.06 mmol, 47.8% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) d 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2H), 7.62 (br. s., 2H), 7.43 (t, J=7.2 Hz, 2H), 7.34 (t, J=7.3 Hz, 2H), 4.88 (br. s., 1H), 4.52 - 4.37 (m, 2H), 4.29 (d, J=6.1 Hz, 1H), 3.11 (s, 1H), 2.76 (s, 2H), 1.49 (d, J=6.8 Hz, 2H), 1.39 (br. s., 1H). ESI-MS(+) m/z = 349.2 (M+H).

Pripremanje (2S,5S)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-5-hidroksipiperidin-2-karboksilne kiseline

[2300]

Korak 1:

[2301] TFA (5 mL, 64.9 mmol) je dodat u rastvor (2S,5S)-di-terc-butil 5-hidroksipiperidin-1,2-dikarboksilata (1 g, 3.32 mmol) u DCM (5 mL) na ST, i rastvor je mešan tokom 1 h nakon čega je LCMS Analiza pokazala kompletnu konverziju (uklanjanje Boc). Rastvor je koncentrovan u vakuumu i ostatak je zatim tretiran sa 3 mL vod. konc. HCl. Rastvor je mešan tokom 5 min nakon čega je LCMS Analiza pokazala kompletnu konverziju (uklanjanje tBu). Rastvor je koncentrovan u vakuumu kako bi se dobila (2S,5S)-5-hidroksipiperidin-2-

1

karboksilna kiselina, HCl (0.6 g) kao ulje. Prinos se pretpostavlja da je 100%. ESI-MS(+) m/z = 146.2 (M+H).

Korak 2:

[2302] U rastvor (2S,5S)-5-hidroksipiperidin-2-karboksilne kiseline, HCl (.603 g, 3.32 mmol) u 1,4-dioksanu (4 mL) i vode (16 mL) je dodat kalijum karbonat (1.835 g, 13.28 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridatom (0.859 g, 3.32 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h i zatim tretirana sa vodom (10ml). Rezultujuća smeša je ektrahovana sa dietil etrom (2x15 ml). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod (2S,5S)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-5-hidroksipiperidin-2-karboksilna kiselina(800 mg, 65.6% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500MHz, metanol-d4) d 7.86 - 7.78 (m, 2H), 7.69 - 7.57 (m, 2H), 7.48 - 7.37 (m, 2H), 7.37 - 7.20 (m, 2H), 4.81 - 4.77 (m, 1H), 4.59 - 4.36 (m, 2H), 4.32 - 4.20 (m, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 1H), 3.75 -3.64 (m, 2H), 3.58 - 3.43 (m, 1H), 2.01 - 1.89 (m, 1H), 1.81 - 1.57 (m, 1H), 1.30 - 1.17 (m, 1H). ESI-MS(+) m/z = 368.2 (M+Na).

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)oksi)-3-bromofenil)propionska kiselina

[2303]

Korak 1:

[2304] U sud okruglog dna (r.b.) od 250 mL opremljen sa štapom sa mešanjem je dodata sirćetna kiselina (50 mL) i bromovodonična kiselina u AcOH (27 mL, 149 mmol), zatim (S)-2-amino-3-(4-hidroksifenil)propionska kiselina (13.47 g, 74.3 mmol). U mešan rastvor je dodat

2

u kapima preko3 h preko levka za dodavanje brom (4.14 mL, 80 mmol) u AcOH (20 mL). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi. Posle 9 dana, mešanje je stopirano i smeša je filtrirana (vreme reakcije nije optimizovano). Materijal zadržan na filteru je opran sa AcOH (100 mL) i zatim Et2O (150 mL). Izolovane prljavo bele čvrste supstance su osušene pod vakuumom kako bi se dobio proizvod (S)-2-amino-3-(3-bromo-4-hidroksifenil)propionska kiselina, hidrobromid (23.9 g, 85% prinos) kao bledo žuti čvrsti prah.<1>H NMR (500MHz, metanol-d4) d 7.47 - 7.41 (m, 1H), 7.12 (dd, J=8.2, 2.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.22 (dd, J=7.6, 5.4 Hz, 1H), 3.23 (dd, J=14.8, 5.4 Hz, 1H), 3.08 (dd, J=14.7, 7.7 Hz, 1H).

Korak 2:

[2305] U rastvor (S)-2-amino-3-(3-bromo-4-hidroksifenil)propionske kiseline, hidrobromid (3 g, 8.80 mmol) u 1,4-dioksanu (12 mL) i vode (48 mL) je dodat kalijum karbonat (4.86 g, 35.2 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridatom (2.276 g, 8.80 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h and zatim tretirana sa vodom (50 mL). Rezultujuća smeša je ektrahovan sa dietil etrom (2x15 ml). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko silika gel hromatografije (120 g kolona, 30-90% EtOAc:Heksani, 20 kolonskih zapremina) da se dobije proizvod (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)oksi)-3-bromofenil)propionska kiselina(3.42g, 55.2% prinos) kao svetlo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) d 7.80 (t, J=7.9 Hz, 4H), 7.68 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.3 Hz, 2H), 7.49 - 7.32 (m, 9H), 7.16 (br. s., 2H), 5.32 (s, 1H), 4.73 (br. s., 1H), 4.58 (d, J=7.3 Hz, 2H), 4.54 - 4.34 (m, 2H), 4.24 (t, J=6.6 Hz, 1H), 3.31 - 3.03 (m, 2H). ESI-MS(+) m/z = 721 (M+H2O).

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2306]

Korak 1:

[2307] U rastvor na 0 °C od (S)-metil 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propanoaat (4 g, 12.56 mmol) i cezijum karbonat (4.50 g, 13.82 mmol) u DMF (40 mL) je dodat terc-butil 2-bromoacetat (2.015 mL, 13.82 mmol) i ostavljen je da se zagreje do ST uklanjanjem iz ledenog kupatila i mešano tokom 18 h. Reakcija je sipana u 1:1 ledena voda:1N HCl i ektrahovana sa EtOAc. Organski sloj je opran sa slanim rastvorom, sakupljen, osušen preko MgSO4, filtriran i uparen da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko silika gel hromatografije (80g kolona, 0-50% EtOAc:Heksani preko 20 CV) kako bi se dobio proizvod (S)-metil 3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)propanoat (4.69 g, 86% prinos).<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) d 7.56 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.26 - 7.18 (m, 2H), 7.17 - 7.12 (m, 1H), 6.92 (s, 1H), 5.09 (d, J=7.6 Hz, 1H), 4.71 (s, 2H), 3.73 - 3.59 (m, 3H), 3.30 (d, J=5.1 Hz, 2H), 1.45 (s, 18H). ESI-MS(+) m/z = 433 (M+H).

Korak 2:

[2308] Litijum hidroksid monohidrat (0.455 g, 10.84 mmol) je dodat u rastvor (S)-metil 3 -(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)-2-((terc-butoksikarbonil) amino)propanoat (4.69 g, 10.84 mmol) u dioksanu (50 mL) i voda (16.67 mL) i mešan na st tokom 1 h. Reakcija je neutralisana sa 1M HCl i ektrahovana sa EtOAc. Organski sloj oprana sa slanim rastvorom, sakupljen, osušen preko MgSO4, filtriran i uparen da se dobije sirov materijal. Sirov materijal

4

je prečišćen preko silika gel hromatografije (120 g kolona, 0-50% EtOAc:Heks preko 20 CV) kako bi se dobio proizvod (S)-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)propionska kiselina (3.54g, 78% prinos).<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) d 7.62 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.26 - 7.21 (m, 2H), 7.15 (ddd, J=7.9, 5.6, 2.3 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 5.08 (d, J=7.8 Hz, 1H), 4.71 (s, 2H), 4.65 (br. s., 1H), 3.42 - 3.31 (m, 2H), 1.46 (s, 18H). ESI-MS(+) m/z = 441 (M+Na).

Korak 3:

[2309] HCl (4M u dioksanu, 10 ml, 40.0 mmol) je ohlađen u ledenom kupatilu pod N2atm. (S)-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)-2-((terc-butoksikarbonil)amino) propionska kiselina (1 g, 2.390 mmol) je dodata u HCl rastvor. Ledeno kupatilo je uklonjeno i reakcija je mešana tokom 30 minuta. Rastvor je koncentrovana (temp kupatila = ST) kako bi se dobio proizvod (S)-2-amino-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina, HCl (848 mg, 100% prinos) kao lepljivo ulje. ESI-MS(+) m/z = 319.2 (M+Na).

Korak 4:

[2310] U rastvor (S)-2-amino-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline, HCl (848 mg, 2.390 mmol) u 1,4-dioksanu (5 mL) i vode (20 mL) je dodat kalijum karbonat (1321 mg, 9.56 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridatom (618 mg, 2.390 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h i tretirana sa vodom (10ml). Rezultujuća smeša je ektrahovan sa dietil etrom (2x15 ml). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko prep HPLC(10-100% CH3CN:Voda sa 0.1% TFA pufer) kako bi se dobio proizvod (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina (405 mg, 0.749 mmol, 31.3% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500MHz, metanol-d4) d 7.80 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.67 - 7.60 (m, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.32 - 7.22 (m, 3H), 7.18 (td, J=7.6, 0.9 Hz, 1H), 7.08 (td, J=7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 4.54 (dd, J=8.4, 4.9 Hz, 1H), 4.36 - 4.23 (m, 2H), 4.23 - 4.14 (m, 1H), 3.43 - 3.35 (m, 2H), 3.25 - 3.09 (m, 1H), 1.55 - 1.38 (m, 9H). ESI-MS(+) m/z = 541.3 (M+H).

Pripremanje (2S, 4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((6-metoksiizohinolin-1-il)oksi)pirolidin-2-karboksilne kiseline

[2311]

Korak 1:

[2312] U rastvor (2S,4R)-4-((6-metoksiizohinolin-1-il)oksi)pirolidin-2-karboksilne kiseline, HCl (750 mg, 2.309 mmol) u 1,4-dioksanu (5 mL) i vode (20 mL) je dodat kalijum karbonat (1277 mg, 9.24 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridat (597 mg, 2.309 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h and tretirana sa vodom (10ml). Rezultujuća smeša je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko silika gel hromatografije (40 g kolona, MeOH u DCM 0-10% preko 20 CV) kako bi se dobio proizvod (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((6-metoksiizohinolin-1-il)oksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) d 8.09 (d, J=9.3 Hz, 1H), 8.00 - 7.88 (m, 1H), 7.80 - 7.65 (m, 2H), 7.65 - 7.47 (m, 2H), 7.37 (t, J=7.2 Hz, 2H), 7.34 - 7.29 (m, 2H), 7.25 - 7.12 (m, 2H), 7.09 - 7.04 (m, 1H), 5.83 (br. s., 1H), 4.76 (t, J=7.9 Hz, 1H), 4.61 - 4.39 (m, 3H), 4.30 - 4.19 (m, 2H), 4.06 - 3.94 (m, 3H), 2.70 (dd, J=7.9, 3.3 Hz, 2H). ESI-MS(+) m/z = 511 (M+H).

Pripremanje (2S, 4R)-1-(((9-il)metoksi)karbonil)-4-((3-bromohinolin-2-il)oksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina

Korak 1:

[2314] TFA (5.0 ml, 65 mmol) je dodat u rastvor (2S,4R)-4-((3-bromohinolin-2-il)oksi)-1-(terc-butoksikarbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina (300 mg, 0.686 mmol) u DCM (5 mL) i mešan na ST dok LCMS Analiza nije pokazala kompletnu konverziju. Rastvor je koncentrovana kako bi se dobio proizvod (2S,4R)-4-((3-bromohinolin-2-il)oksi) pirolidin-2-karboksilna kiselina, TFA (310 mg) kao lepljivo ulje. Prinos se pretpostavlja da je 100%. ESI-MS(+) m/z = 337 (M+H).

Korak 2:

[2315] U rastvor (2S,4R)-4-((3-bromohinolin-2-il)oksi)pirolidin-2-karboksilne kiseline, TFA (310 mg, 0.687 mmol) u 1,4-dioksanu (3 mL) i vode (12 mL) je dodat kalijum karbonat (380 mg, 2.75 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridatom (178 mg, 0.687 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h i tretirana sa vodom (10ml). Rezultujuća smeša je ektrahovana sa dietil etrom (2x15 ml). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko prep HPLC (10-100% CH3CN:Voda, 0.1% TFA pufer) kako bi se dobio proizvod (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((3-bromohinolin-2-il)oksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina (250 mg, 65% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500MHz, metanol-d4) d 7.90 - 7.75 (m, 2H), 7.73 - 7.63 (m, 2H), 7.58 - 7.49 (m, 2H), 7.49 - 7.39 (m, 2H), 7.37 - 7.31 (m, 1H), 7.26 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.20 - 7.14 (m, 1H), 7.12 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.04 (td, J=7.4, 1.0 Hz, 1H), 4.68 - 4.56 (m, 2H), 4.51 (t, J=8.3 Hz, 1H), 4.44 - 4.33 (m, 2H), 4.27 - 4.16 (m, 2H), 3.99 - 3.92 (m, 1H), 3.81 - 3.73 (m, 1H), 3.73 - 3.64 (m, 1H). ESI-MS(+) m/z = 337 (M+ H).

Pripremanje (2S, 4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-(benziloksi) pirolidin-2-karboksilna kiselina

[2316]

Korak 1:

[2317] TFA (5 ml, 64.9 mmol) je dodata u rastvor (2S,4R)-4-(benziloksi)-1-(tercbutoksikarbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina (500 mg, 1.556 mmol) u DCM (5 mL) i mešan na ST dok LCMS Analiza nije pokazala kompletnu konverziju. Rastvor je koncentrovan kako bi se dobio proizvod. Prinos se pretpostavlja da je 100%. ESI-MS(+) m/z = 222 (M+H).

Korak 2:

[2318] U rastvor (2S,4R)-4-(benziloksi)pirolidin-2-karboksilne kiseline, TFA (522 mg, 1.557 mmol) u 1,4-dioksanu (4 mL) and voda (16 mL) je dodat kalijum karbonat (861 mg, 6.23 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridatom (403 mg, 1.557 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h and tretirana sa vodom (10ml). Rezultujuća smeša je ektrahovan sa dietil etrom (2x15 ml). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko prep HPLC (10-100%CH3CN:Voda 0.1%TFA pufer) kako bi se dobio čist proizvod (2S,4R)-1-(((9H-fluoren9-il)metoksi)karbonil)-4-(benziloksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina(430mg, 62.3% prinos)kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500MHz, metanol-d4) d 7.86 - 7.76 (m, 2H), 7.71 - 7.57 (m, 2H), 7.44 - 7.27 (m, 9H), 4.58 - 4.50 (m, 2H), 4.49 - 4.33 (m, 3H), 4.29 - 4.19 (m, 2H), 3.72 - 3.49 (m, 2H), 2.49 (br. s., 1H), 2.10 (ddd, J=13.4, 8.2, 4.8 Hz, 1H). ESI-MS(+) m/z = 444 (M+H).

Pripremanje (S)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-(terc-butoksikarbonil) piperazin-2-karboksilna kiselina

[2319]

Korak 1:

[2320] U rastvor (S)-4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-2-karboksilne kiseline (500 mg, 2.171 mmol) u 1,4-dioksanu (5 mL) i vode (20 mL) je dodat kalijum karbonat (1200 mg, 8.69 mmol) praćeno sa (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridatom (562 mg, 2.171 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na st tokom 18 h and zatim tretirana sa vodom (10ml). Rezultujuća smeša je ektrahovana sa dietil etrom (2x15 ml). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i ektrahovana sa DCM (3x20ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i koncentrovani da se dobije sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preko prep HPLC (10-100% CH3CN:Voda sa 0.1%TFA puferom) kako bi se dobio proizvod (S)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-2-karboksilna kiselina (294mg, 30% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500MHz, metanol-d4) d 7.83 (t, J=6.6 Hz, 2H), 7.68 - 7.58 (m, 2H), 7.45 - 7.38 (m, 2H), 7.38 - 7.30 (m, 2H), 4.65 (br. s., 1H), 4.58 (d, J=13.7 Hz, 1H), 4.55 - 4.39 (m, 3H), 4.33 - 4.18 (m, 1H), 2.91 - 2.85 (m, 4H), 1.47 (s, 9H). ESI-MS(+) m/z = 475 (M+Na).

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(mtoliloksi)propionske kiseline

[2321]

Korak 1:

[2322] U sud sa okruglim dnom opremljen sa štapom za mešanje je dodat (S)-metil 3-hidroksi-2-(tritilamino)propanoat (10.0 g, 27.7 mmol), trifenilfosfin (7.98 g, 30.4 mmol) i toluen (100 mL). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 30 min., zatim u rastvor je dodat m-krezol (3.78 mL, 36.0 mmol) and diizopropilazodikarboksilat ("DIAD", 5.92 mL, 30.4 mmol). Rastvor je zagrejan na 80 °C sa mešanjem tokom 18 h. Rastvor je ohlađen do sobne temperature i koncentrovan i rezultujući ostatak je podvrgnut silika gel hromatografiji(heksani:EtOAc) kako bi se dobio (S)-metil 3-(m-toliloksi)-2-(tritilamino)propanoat, 8.28 g (66%).<1>H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.53 (d, J=7.6 Hz, 6H), 7.29 - 7.23 (m, 5H), 7.21 - 7.11 (m, 4H), 6.77 (d, J=7.3 Hz, 1H), 6.73 - 6.64 (m, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.25 (dd, J=9.3, 4.9 Hz, 1H), 4.01 (dd, J=9.2, 6.7 Hz, 1H), 3.76 - 3.68 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.88 (d, J=10.5 Hz, 1H), 2.32 (s, 3H).

Korak 2:

[2323] U sud sa okruglim dnom opremljen sa štapom za mešanje i napunjen sa (S)-metil 3-(mtoliloksi)-2-(tritilamino)propanoatom (8.28 g, 18.34 mmol) u MeOH (30 mL) i THF (30 mL) je dodat litijum hidroksid u vodi (55.0 mmol, 27.5 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1h. Reakciona smeša je neutralisana sa vod. 2N HCl. Smeša je razblažena sa EtOAc i organska faza je izolovana i oprana sa slanim rastvorom; osušena preko MgSO4; filtrirana; zatim koncentrovana u vakuumu. Rezultujući ostatak je prečišćen preko silika gel hromatografije kako bi se dobila (S)-3-(m-toliloksi)-2-(tritilamino) propionska kiselina, 1.47 g (18%).<1>H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.44 (d, J=7.1 Hz, 6H), 7.35 - 7.24 (m, 8H), 7.09 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.76 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.46 (d, J=8.1 Hz, 1H), 4.07 (dd, J=9.2, 2.3 Hz, 1H), 3.71 (t, J=3.2 Hz, 1H), 2.79 (dd, J=9.2, 4.0 Hz, 1H), 2.28 (s, 3H).

Korak 3:

[2324] U sud sa okruglim dnom opremljen sa štapom za mešanje i napunjen sa (S)-3-(mtoliloksi)-2-(tritilamino)propionskom kiselinom (1.47 g, 3.36 mmol) ohlađenom do 0 °C je dodata trifluorosirćetna kiselina (6.0 ml, 78 mmol). Rastvor je mešan tokom 1 h. Isparljive supstance su uklonjene u vakuumu i ostatak je zatim rastvoren u MeOH (5 mL) i ponovo koncentrovan u vakuumu. Rezultujuća sirova TFA so (S)-2-amino-3-(m-toliloksi)propionske kiseline je prenešena direktno u Korak 4.

Korak 4:

[2325] U sud sa okruglim dnom opremljen sa štapom za mešanje i napunjen sa komletnom TFA soli (S)-2-amino-3-(m-toliloksi)propionske kiseline dobijenom u Koraku 3 (pretpostavljeno 3.36 mmol) je dodat 1,4-Dioksan (4 mL) i voda (16 mL), zatim K2CO3(1.17 g, 8.49 mmol). Smeša je ohlađena do 0 °C, zatim u smešu je dodat (9H-fluoren-9-il)metil karbonohloridat (549 mg, 2.12 mmol). Smeša je ostavljena da se meša do sobne temperature sa mešanjem tokom 18 h. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL) i zatim oprana sa dietil etrom

1

(2 x 15 mL). Vodena faza je zakiseljena sa vod. HCl (1M) do pH 2-3, i zatim je ektrahovana sa CH2Cl2(3 x 20ml). Kombinovani CH2Cl2rastvori su osušeni preko MgSO4; filtrirani; zatim koncentrovani u vakuumu kako bi se dobila (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(m-toliloksi)propionska kiselina kao bela čvrsta supstanca, 430 mg (31% udva koraka).

Korak 5:

[2326] Korišćenjem Dean-Stark postavke, smeša koja sadrži paraformaldehid (340 mg, 11.34 mmol), (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(m-toliloksi)propionsku kiselinu (789 mg, 1.890 mmol), i p-toluensulfonsku kiselinu (32.5 mg, 0.189 mmol) je refluksovana u toluenu (15 mL) tokom 2 h. Reakcija je zatim ohlađena do ST, oprana sa zas. natrijum bikarbonatnim rastvorom, praćeno sa slanim rastvorom, osušena sa MgSO4, filtrirana i koncentrovana kako bi se dobio proizvod (S)-(9H-fluoren-9-il)metil 5-okso-4-((m-toliloksi) metil)oksazolidin-3-karboksilat (812 mg, 1.891 mmol, 100% prinos) kao žuto ulje. ESI-MS(+) m/z = 430 (M+H).

Korak 6:

[2327] (S)-(9H-Fluoren-9-il)metil 5-okso-4-((m-toliloksi)metil)oksazolidin-3-karboksilat (825 mg, 1.921 mmol) je rastvoren u CHCl3(10 mL) i dodat trietilsilan (1.534 ml, 9.60 mmol) praćeno sa TFA (10 ml, 130 mmol) i mešano je na ST pod pozitivnim pritiskom od N2tokom 18 h. Reakcija je zatim uparen na rotovap-u dok lepljivo ulje nije ostalo iza. Ulje je rastvoreno u EtOAc i zatim ektrahovano sa zas. natrijum bikarbonatom (10ml x2). Tamo je bio srednji sloj između vodenog sloja i organskog sloja koji se činio da je deprotonovani proizvod. Vodeni sloj i srednji sloj su razdvojeni i sakupljeni i zatim zakiseljeni do pH 4-5. Rastvor je formirao precipitat jednom kiseo. EtOAc (200ml) je korišćena kako bi se ektrahovao precipitat. Organski sloj je opran sa slanim rastvorom, sakupljen, osušen preko MgSO4, filtriran i uparen kako bi se dobio čist proizvod (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(mtoliloksi)propionska kiselina (506 mg, 1.173 mmol, 61.0% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ESI-MS(+) m/z = 454 (M+Na).

Pripremanje Primera 5001 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[2329] Primer 5001 je pripremljen praćenjem "Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 933.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.93 min; ESI-MS(+) m/z 933.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5002 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2330]

[2331] Primer 5002 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 4-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 926.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 617.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 5003 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2332]

4

[2333] Primer 5003 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" supstituisanjem "Ciklizacione metode B" za "Ciklizacionu metodu A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 942.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 942.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 5004

[2334]

[2335] Primer 5004 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 40.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 940.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 941.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 940.9398 (M+2H); Nađeno: 940.9378 (M+2H).

Pripremanje Primera 5005 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2336]

[2337] Primer 5005 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(m-toliloksi)propionska kiselina je korišćena u četvrtom koraku aminokiselinskog kuplovanja. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.94 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5006 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2338]

[2339] Primer 5006 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 42.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 898.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z 898.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5007 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2340]

[2341] Primer 5007 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 44.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 892.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.02 min; ESI-MS(+) m/z 892.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5008 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2342]

[2343] Primer 5008 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 70-100% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 30.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 933.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.00 min; ESI-MS(+) m/z 933.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 5009 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2344]

[2345] Primer 5009 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 911.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.69 min; ESI-MS(+) m/z 911.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5010 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2346]

1

[2347] Primer 5010 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 920.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 919.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5011

[2348]

2

[2349] Primer 5011 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 911.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.45 min; ESI-MS(+) m/z 911.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 5012 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2350]

[2351] Primer 5012 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 935.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5013 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2352]

4

[2353] Primer 5013 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.79 min; ESI-MS(+) m/z 916.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.94 min; ESI-MS(+) m/z 917.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5014 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2354]

[2355] Primer 5014 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5015 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2356]

[2357] Primer 5015 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z 876.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.99 min; ESI-MS(+) m/z 877.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5016 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2358]

[2359] Primer 5016 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.91 min; ESI-MS(+) m/z 898.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.98 min; ESI-MS(+) m/z 898.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5017 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2360]

[2361] Primer 5017 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 905.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.01 min; ESI-MS(+) m/z 905.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 5018 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2362]

[2363] Primer 5018 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 904.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.00 min; ESI-MS(+) m/z 905.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5019 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2364]

1

[2365] Primer 5019 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 912.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.92 min; ESI-MS(+) m/z 913.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5020 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2366]

11

[2367] Primer 5020 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.88 min; ESI-MS(+) m/z 919.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(+) m/z 920.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5021 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2368]

12

[2369] Primer 5021 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.14 min; ESI-MS(+) m/z 899.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.93 min; ESI-MS(+) m/z 899.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5022

[2370]

1

[2371] Primer 5022 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 950.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5023 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2372]

14

[2373] Primer 5023 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 957.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 957.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5024

[2374]

1

[2375] Primer 5024 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 27.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.07 min; ESI-MS(+) m/z 963.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 963.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 5025

[2376]

1

[2377] Primer 5025 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 957.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5026

[2378]

1

[2379] Primer 5026 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 20-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 896.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 895.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5027 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2380]

1

[2381] Primer 5027 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 898.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(+) m/z 898.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5028

[2382]

1

[2383] Primer 5028 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 941.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.52 min; ESI-MS(+) m/z 941.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5029

[2384]

2

[2385] Primer 5029 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 935.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.54 min; ESI-MS(+) m/z 935.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5030 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2386]

21

[2387] Primer 5030 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.89 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5031

[2388]

22

[2389] Primer 5031 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 935.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(+) m/z 935.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5032

[2390]

2

[2391] Primer 5032 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 27.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(-) m/z 932.0 (M-2H).

Pripremanje Primera 5033 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2392]

24

[2393] Primer 5033 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 948.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z 949.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 5034

[2394]

2

[2395] Primer 5034 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 943.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.50 min; ESI-MS(+) m/z 943.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 5035

[2396]

2

[2397] Primer 5035 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 919.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 919.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5036

[2398]

2

[2399] Primer 5036 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 927.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 927.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 5037

[2400]

2

[2401] Primer 5037 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 928.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 927.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5038

[2402]

2

[2403] Primer 5038 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 927.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 927.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5039

[2404]

[2405] Primer 5039 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 928.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 928.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 5040

[2406]

1

[2407] Primer 5040 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 901.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 901.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 5041

[2408]

2

[2409] Primer 5041 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-50% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 935.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 935.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5042

[2410]

[2411] Primer 5042 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 910.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 910.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 5043

[2412]

4

[2413] Primer 5043 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-50% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 942.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.50 min; ESI-MS(+) m/z 942.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 5044

[2414]

[2415] Primer 5044 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 916.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.52 min; ESI-MS(+) m/z 916.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 5045

[2416]

[2417] Primer 5045 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 936.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 936.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 5046

[2418]

[2419] Primer 5046 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-50% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 942.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.50 min; ESI-MS(+) m/z 942.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5047 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2420]

[2421] Primer 5047 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-50% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 921.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 921.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 5048 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2422]

[2423] Primer 5048 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 895.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 895.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 5049

[2424]

4

[2425] Primer 5049 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 895.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 896.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5050

[2426]

41

[2427] Primer 5050 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-50% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 10-50% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 921.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 921.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5051 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2428]

42

[2429] Primer 5051 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto "Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.93 min; ESI-MS(+) m/z 957.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5052 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2430]

4

[2431] Primer 5052 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 978.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(-) m/z 977.3 (M-2H).

Pripremanje Primera 5053 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2432]

44

[2433] Primer 5053 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 936.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.73 min; ESI-MS(+) m/z 936.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 5054 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2434]

4

[2435] Primer 5054 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 944.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.72 min; ESI-MS(+) m/z 944.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 5055 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2436]

4

[2437] Primer 5055 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 950.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.69 min; ESI-MS(-) m/z 949.2 (M-2H).

Pripremanje Primera 5056 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2438]

4

[2439] Primer 5056 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 950.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 950.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5057 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2440]

4

[2441] Primer 5057 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 944.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 944.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5058 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2442]

4

[2443] Primer 5058 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 5059

[2444]

[2445] Primer 5059 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 902.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 902.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 5060

[2446]

1

[2447] Primer 5060 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 910.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 910.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5061 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2448]

2

[2449] Primer 5061 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 903.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(-) m/z 901.6 (M-2H).

Pripremanje Primera 5062

[2450]

[2451] Primer 5062 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 929.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(-) m/z 926.8 (M-2H).

Pripremanje Primera 5063

[2452]

4

[2453] Primer 5063 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 895.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(-) m/z 893.8 (M-2H).

Pripremanje Primera 5064

[2454]

[2455] Primer 5064 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 935.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(-) m/z 933.2 (M-2H).

Pripremanje Primera 5065

[2456]

[2457] Primer 5065 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 5066

[2458]

[2459] Primer 5066 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 949.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.72 min; ESI-MS(+) m/z 949.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5067

[2460]

[2461] Primer 5067 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 923.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z 923.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 5068

[2462]

[2463] Primer 5068 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali sa sledećom modifikacijom: "Ciklizaciona metoda B" je korišćena umesto “Ciklizacione metode A", skala je bila 0.600 mmol i sve porcije reagenasa su prilagođene odgovarajuće, i smola je bila 2-hlorotritil smola sa Fmoc-Gly prethodno naneta na smolu. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 956.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 956.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5069

[2464]

[2465] Primer 5069 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A" i izveden na 0.300 mmol skali i sve porcije reagenasa su prilagođene odgovarajuće. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 112.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H).

1

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 971.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 970.4798 (M+2H); Nađeno: 970.4764 (M+2H).

Pripremanje Primera 5070

[2466]

[2467] Primer 5070 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 909.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 909.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 5071

2

[2469] Primer 5071 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 917.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.72 min; ESI-MS(+) m/z 917.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5072

[2470]

[2471] Primer 5072 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 915.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.72 min; ESI-MS(+) m/z 915.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 5073

[2472]

4

[2473] Primer 5073 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 915.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.73 min; ESI-MS(+) m/z 915.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 5074

[2474]

[2475] Primer 5074 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 924.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.76 min; ESI-MS(+) m/z 923.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 5075

[2476]

[2477] Primer 5075 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z 941.8 (M+2H); ESI-MS(-) m/z 940.3 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 941.4589 (M+2H); Nađeno: 941.4568 (M+2H).

Pripremanje Primera 5076 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2478]

[2479] Primer 5076 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 949.1 (M+2H); ESI-MS(-) m/z 947.7 (M-2H).

Pripremanje Primera 5077(ne u skladu sa pronalaskom)

[2480]

[2481] Primer 5077 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.76 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(-) m/z 960.3 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 961.4745 (M+2H); Nađeno: 961.4715 (M+2H).

Pripremanje Primera 5078

[2482]

[2483] Primer 5078 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 927.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 927.4432 (M+2H); Nađeno: 927.4402 (M+2H).

Pripremanje Primera 5079

[2484]

[2485] Primer 5079 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min.

Analiza Uslov C: Vreme zadržavanja = 1.024 min; ESI-MS(+) m/z 935.35 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 933.4614 (M+2H); Nađeno: 933.4583 (M+2H).

Pripremanje Primera 5080 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2486]

1

[2487] Primer 5080 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 941.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 940.4692 (M+2H); Nađeno: 940.4675 (M+2H).

Pripremanje Primera 5081 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2488]

2

[2489] Primer 5081 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.71 min.

Analiza Uslov C: Vreme zadržavanja = 0.997 min; ESI-MS(+) m/z 941.5 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 940.4511 (M+2H); Nađeno: 940.4484 (M+2H).

Pripremanje Primera 5082

[2490]

[2491] Primer 5082 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.71 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 928.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.4818 (M+2H); Nađeno: 928.4794 (M+2H).

Pripremanje Primera 5083

4

[2493] Primer 5083 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 915.4740 (M+2H) Nađeno: 915.4709 (M+2H).

Pripremanje Primera 5084 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2494]

[2495] Primer 5084 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A".

[2496] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.71 min; ESI-MS(-) m/z 1855.3 (M-H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.4511 (M+2H); Nađeno: 928.4483 (M+2H).

Pripremanje Primera 5085 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2497]

[2498] Primer 5085 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 30.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 939.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 939.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 938.4585 (M+2H); Nađeno: 938.4562 (M+2H).

Pripremanje Primera 5086 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2499]

[2500] Primer 5086 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 44.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 963.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(-) m/z 961.8 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.9856 (M+2H); Nađeno: 962.9827 (M+2H).

Pripremanje Primera 5087 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2501]

[2502] Primer 5087 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 28.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 914.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(-) m/z 912.7 (M-2H).

[2503] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 913.9378 (M+2H); Nađeno: 913.9353 (M+2H).

Pripremanje Primera 5088 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2505] Primer 5088 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 30.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 939.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 939.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 938.4585 (M+2H); Nađeno: 938.4562 (M+2H).

Pripremanje Primera 5089

[2506]

[2507] Primer 5089 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 962.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z 962.7 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.0085 (M+2H); Nađeno: 962.0052 (M+2H).

Pripremanje Primera 5090 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2508]

1

[2509] Primer 5090 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 942.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.80 min; ESI-MS(+) m/z 942.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 941.4771 (M+2H); Nađeno: 941.4739 (M+2H).

Pripremanje Primera 5091 (ne u skladu sa pronalaskom)

2

[2511] Primer 5091 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 934.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.4692 (M+2H); Nađeno: 934.4662 (M+2H).

Pripremanje Primera 5092 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2512]

[2513] Primer 5092 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 28.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 957.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 956.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 955.9778 (M+2H); Nađeno: 955.9749 (M+2H).

Pripremanje Primera 5093 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2514]

4

[2515] Primer 5093 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 929.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 929.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.9494 (M+2H); Nađeno: 928.4476 (M+2H).

Pripremanje Primera 5094 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2516]

[2517] Primer 5094 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 948.4905 (M+2H); Nađeno: 948.4872 (M+2H).

Pripremanje Primera 5095

[2518]

[2519] Primer 5095 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 963.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.73 min; ESI-MS(+) m/z 963.4 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.5005 (M+2H); Nađeno: 962.4969 (M+2H).

Pripremanje Primera 5096

[2520]

[2521] Primer 5096 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 48.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(+) m/z 964.4 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.4720 (M+2H); Nađeno: 963.4685 (M+2H).

Pripremanje Primera 5097 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2522]

[2523] Primer 5097 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 928.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z 928.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 927.9534 (M+2H); Nađeno: 927.9498 (M+2H).

Pripremanje Primera 5098

[2524]

[2525] Primer 5098 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 950.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 950.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 949.9483 (M+2H); Nađeno: 949.9460 (M+2H).

Pripremanje Primera 5099

[2526]

[2527] Primer 5099 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.424 min; ESI-MS(+) m/z 971.00 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 970.4616 (M+2H); Nađeno: 970.4595 (M+2H).

Pripremanje Primera 5100

1

[2529] Primer 5100 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B:

2

95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(+) m/z 971.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 969.9878 (M+2H); Nađeno: 969.9850 (M+2H).

Pripremanje Primera 5101

[2530]

[2531] Primer 5101 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 929.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(+) m/z 929.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.4329 (M+2H); Nađeno: 928.4301 (M+2H).

Pripremanje Primera 5102 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2532]

[2533] Primer 5102 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod

4

su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 964.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.4776 (M+2H); Nađeno: 963.4740 (M+2H).

Pripremanje Primera 5103 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2534]

[2535] Primer 5103 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 942.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(+) m/z 943.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5104

[2536]

[2537] Primer 5104 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 935.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 935.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.9669 (M+2H); Nađeno: 934.9637 (M+2H).

Pripremanje Primera 5105

[2538]

[2539] Primer 5105 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 956.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 957.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 956.4698 (M+2H); Nađeno: 956.4670 (M+2H).

Pripremanje Primera 5106

[2540]

[2541] Primer 5106 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 970.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.99 min; ESI-MS(+) m/z 970.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 969.9696 (M+2H); Nađeno: 969.9662 (M+2H).

Pripremanje Primera 5107 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2542]

[2543] Primer 5107 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 941.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.86 min; ESI-MS(+) m/z 941.4 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 940.9794 (M+2H); Nađeno: 940.9762 (M+2H).

Pripremanje Primera 5108 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2544]

[2545] Primer 5108 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 922.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 921.9352 (M+2H); Nađeno: 921.9318 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 5109

[2546]

[2547] Primer 5109 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 927.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.80 min; ESI-MS(+) m/z 927.0 (M+2H).

1 1

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 926.4536 (M+2H); Nađeno: 926.4504 (M+2H).

Pripremanje Primera 5110

[2548]

[2549] Primer 5110 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod

1 2

su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 984.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 984.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 984.0091 (M+2H); Nađeno: 984.0061 (M+2H).

Pripremanje Primera 5111 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2550]

[2551] Primer 5111 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.28 min; ESI-MS(+) m/z 943.8 (M+2H).

1

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.49 min; ESI-MS(+) m/z 943.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 942.9405 (M+2H); Nađeno: 942.9380 (M+2H).

Pripremanje Primera 5112

[2552]

[2553] Primer 5112 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 964.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.4720 (M+2H); Nađeno: 963.4688 (M+2H).

1 4

Pripremanje Primera 5113

[2554]

[2555] Primer 5113 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.4476 (M+2H); Nađeno: 963.4742 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 5114

[2556]

[2557] Primer 5114 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 942.4461 (M+2H); Nađeno: 942.4485 (M+2H).

Pripremanje Primera 5115

1

[2559] Primer 5115 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-95% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 916.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 917.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 916.4454 (M+2H); Nađeno: 916.4431 (M+2H).

Pripremanje Primera 5116 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2560]

1

[2561] Primer 5116 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 881.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(-) m/z 880.5 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 882.4267 (M+2H); Nađeno: 882.4241 (M+2H).

Pripremanje Primera 5117 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2562]

1

[2563] Primer 5117 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 883.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(-) m/z 881.8 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 883.3982 (M+2H); Nađeno: 883.3956 (M+2H).

Pripremanje Primera 5118 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2564]

1

[2565] Primer 5118 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 896.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(-) m/z 894.2 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 895.9322 (M+2H); Nađeno: 895.9297 (M+2H).

Pripremanje Primera 5119 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2566]

1 1

[2567] Primer 5119 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 897.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 897.6 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 896.9193 (M+2H); Nađeno: 896.9218 (M+2H).

Pripremanje Primera 5120

[2568]

1 11

[2569] Primer 5120 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 949.4563 (M+2H); Nađeno: 949.4537 (M+2H).

Pripremanje Primera 5121 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2570]

1 12

[2571] Primer 5121 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 929.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.72 min; ESI-MS(+) m/z 928.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.4329 (M+2H); Nađeno: 928.4301 (M+2H).

Pripremanje Primera 5122 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2572]

1 1

[2573] Primer 5122 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 906.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.85 min; ESI-MS(+) m/z 906.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 905.9403 (M+2H); Nađeno: 905.9375 (M+2H).

Pripremanje Primera 5123 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2574]

1 14

[2575] Primer 5123 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 950.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 949.4620 (M+2H); Nađeno: 949.4589 (M+2H).

Pripremanje Primera 5124 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2576]

1 1

[2577] Primer 5124 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 970.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 970.4854 (M+2H); Nađeno: 970.4820 (M+2H).

Pripremanje Primera 5125 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2578]

1 1

[2579] Primer 5125 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 40.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 914.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.69 min; ESI-MS(+) m/z 914.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 913.4276 (M+2H); Nađeno: 913.4242 (M+2H).

Pripremanje Primera 5126 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2580]

1 1

[2581] Primer 5126 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 949.4381 (M+2H); Nađeno: 949.4355 (M+2H).

Pripremanje Primera 5127 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2582]

1 1

[2583] Primer 5127 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 902.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 902.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 901.4402 (M+2H); Nađeno: 901.4375 (M+2H).

Pripremanje Primera 5128 (ne u skladu sa pronalaskom)

1 1

[2585] Primer 5128 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 904.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.73 min; ESI-MS(+) m/z 904.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 903.4194 (M+2H); Nađeno: 903.4167 (M+2H).

Pripremanje Primera 5129 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2586]

1 2

[2587] Primer 5129 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 917.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 917.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 916.4511 (M+2H); Nađeno: 916.4482 (M+2H).

Pripremanje Primera 5130 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2588]

1 21

[2589] Primer 5130 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 932.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 932.2 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 931.4563 (M+2H); Nađeno: 931.4534 (M+2H).

Pripremanje Primera 5131 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2590]

1 22

[2591] Primer 5131 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 931.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(+) m/z 931.6 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 930.9643 (M+2H); Nađeno: 930.9617 (M+2H).

Pripremanje Primera 5132 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2592]

1 2

[2593] Primer 5132 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 44.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.52 min; ESI-MS(+) m/z 950.4 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 949.4620 (M+2H); Nađeno: 949.4587 (M+2H).

Pripremanje Primera 5133

[2594]

1 24

[2595] Primer 5133 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 922.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 921.9352 (M+2H); Nađeno: 921.9318 (M+2H).

Pripremanje Primera 5134 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2596]

1 2

[2597] Primer 5134 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 943.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.54 min; ESI-MS(+) m/z 943.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 942.4541 (M+2H); Nađeno: 942.4513 (M+2H).

Pripremanje Primera 5135 (ne u skladu sa pronalaskom)

1 2

[2599] Primer 5135 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 869.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 870.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 869.4007 (M+2H); Nađeno: 869.3986 (M+2H).

1 2

Pripremanje Primera 5137

[2600]

[2601] Primer 5137 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A", i je pripremljen na 0.300 mmol skali gde su količine reagenasa skalirane odgovarajuće. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 102.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 964.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.4720 (M+2H); Nađeno: 963.4687 (M+2H).

Pripremanje Primera 5138 (ne u skladu sa pronalaskom)

1 2

[2603] Primer 5138 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A", i je pripremljen na 0.300 mmol skali gde su količine reagenasa skalirane odgovarajuće. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 57.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 971.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 5139

[2604]

1 2

[2605] Primer 5139 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A", i je pripremljen na 0.300 mmol skali gde su količine reagenasa skalirane prema tome. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 27.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 950.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 950.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 949.4563 (M+2H); Nađeno: 949.4541 (M+2H).

Pripremanje Primera 5140 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2606]

1

[2607] Primer 5140 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 901.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.51 min; ESI-MS(+) m/z 902.1 (M+2H).

[2608] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 901.4822 (M+2H); Nađeno: 901.4800 (M+2H).

Pripremanje Primera 5141

[2609]

1 1

[2610] Primer 5141 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 935.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 935.5 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.9487 (M+2H); Nađeno: 934.9471 (M+2H).

Pripremanje Primera 5142 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2611]

1 2

[2612] Primer 5142 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 935.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.49 min; ESI-MS(+) m/z 935.6 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.9487 (M+2H); Nađeno: 934.9467 (M+2H).

Pripremanje Primera 5143 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2613]

1

[2614] Primer 5143 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 935.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(+) m/z 935.4 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.9487 (M+2H); Nađeno: 934.9464 (M+2H).

Pripremanje Primera 5144

[2615]

1 4

[2616] Primer 5144 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 952.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(+) m/z 952.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 951.9409 (M+2H); Nađeno: 951.9385 (M+2H).

Pripremanje Primera 5145 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2617]

1

[2618] Primer 5145 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 935.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(-) m/z 934.2 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 935.4407 (M+2H); Nađeno: 935.4385 (M+2H).

Pripremanje Primera 5146 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2619]

1

[2620] Primer 5146 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 0.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 935.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(-) m/z 933.2 (M-2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.9487 (M+2H); Nađeno: 934.9464 (M+2H).

Pripremanje Primera 5147 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2621]

1

[2622] Primer 5147 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 952.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 952.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 951.9409 (M+2H); Nađeno: 951.9377 (M+2H).

Pripremanje Primera 6001 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2623]

1

[2624] Primer 6001 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 5.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.778 min; ESI-MS(+) m/z 955.25 (M+2H).

Pripremanje Primera 6002 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2625]

1

[2626] Primer 6002 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 978.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 977.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 6003 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2627]

1 4

[2628] Primer 6003 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 6004 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2629]

1 41

[2630] Primer 6004 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 934.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 6005 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2631]

1 42

[2632] Primer 6005 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 920.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 920.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 6006 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2633]

1 4

[2634] Primer 6006 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 934.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 6007 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2635]

1 44

[2636] Primer 6007 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 919.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.76 min; ESI-MS(+) m/z 919.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6008 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2637]

1 4

[2638] Primer 6008 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z 938.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.99 min; ESI-MS(+) m/z 938.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 6009 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2639]

1 4

[2640] Primer 6009 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 963.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z 963.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 6010 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2641]

1 4

[2642] Primer 6010 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 913.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 913.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6011 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2643]

1 4

[2644] Primer 6011 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 926.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.87 min; ESI-MS(+) m/z 926.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 6012 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2645]

1 4

[2646] Primer 6012 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 937.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(+) m/z 937.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6013 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2647]

1

[2648] Primer 6013 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.96 min; ESI-MS(+) m/z 258.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.08 min; ESI-MS(-) m/z 956.5 (M-2H).

Pripremanje Primera 6014 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2649]

1 1

[2650] Primer 6014 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z 951.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.85 min; ESI-MS(+) m/z 951.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6015 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2651]

1 2

[2652] Primer 6015 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 937.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z 937.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 6016 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2653]

1

[2654] Primer 6016 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 958.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.03 min; ESI-MS(+) m/z 958.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6017

[2655]

1 4

[2656] Primer 6017 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 984.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(-) m/z 983.1 (M-2H).

Pripremanje Primera 6018

[2657]

1

[2658] Primer 6018 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 976.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 976.7 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 6019

[2659]

[2660] Primer 6019 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 60-100% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 990.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 991.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 6020 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2661]

1

[2662] Primer 6020 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 1004.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 1004.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 6021

[2663]

1

[2664] Primer 6021 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-50% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 28.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 929.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 930.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6022

[2665]

1

[2666] Primer 6022 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 960.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 960.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 6023

[2667]

1

[2668] Primer 6023 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 946.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 6024

[2669]

1 1

[2670] Primer 6024 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 913.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(-) m/z 911.9 (M-2H).

Pripremanje Primera 6025

[2671]

1 2

[2672] Primer 6025 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 934.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 934.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6026

[2673]

1

[2674] Primer 6026 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(-) m/z 940.9 (M-2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(-) m/z 940.7 (M-2H).

Pripremanje Primera 6027

[2675]

1 4

[2676] Primer 6027 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 941.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.72 min; ESI-MS(+) m/z 941.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 6028 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2677]

1

[2678] Primer 6028 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 939.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.73 min; ESI-MS(-) m/z 937.8 (M-2H).

Pripremanje Primera 6029

[2679]

1

[2680] Primer 6029 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(m-toliloksi) propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 947.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 947.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 6030 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2681]

1

[2682] Primer 6030 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(m-toliloksi) propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 942.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 942.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 6031 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2683]

1

[2684] Primer 6031 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(metil)amino)-3-(m-toliloksi) propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 942.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z 943.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 6032 (ne u skladu sa pronalaskom)

1

[2686] Primer 6032 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 937.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(+) m/z 936.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 6033

[2687]

1

[2688] Primer 6033 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(+) m/z 944.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6034 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2689]

1 1

[2690] Primer 6034 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 943.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(-) m/z 941.8 (M-2H).

Pripremanje Primera 6035

[2691]

1 2

[2692] Primer 6035 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiseline (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)([<13>C]metil)amino)propionska kiselina i (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(([<13>C]metil)amino)heksanske kiseline su korišćene. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 958.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(-) m/z 955.7 (M-2H).

Pripremanje Primera 6036 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2693]

1

[2694] Primer 6036 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)oksi)-3-bromofenil)propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 974.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 973.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 6037 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2695]

1 4

[2696] Primer 6037 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(([<13>C]metil)amino)heksanska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 957.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6038 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2697]

1

[2698] Primer 6038 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)(([<13>C]metil)amino)heksanska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 957.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 6039 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2699]

1

[2700] Primer 6039 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)([<13>C]metil)amino)propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 6040

[2701]

1

[2702] Primer 6040 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min.

Pripremanje Primera 6041 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2703]

1

[2704] Primer 6041 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.96 min; ESI-MS(+) m/z 922.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 6042 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2705]

1

[2706] Primer 6042 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (2S,5S)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-5-hidroksipiperidin-2-karboksilna kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 6043 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2707]

1

[2708] Primer 6043 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)oksi)-3-bromofenil)propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 953.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.71 min; ESI-MS(-) m/z 950.6 (M-2H).

Pripremanje Primera 6044 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2709]

1 1

[2710] Primer 6044 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)oksi)-3-bromofenil)propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 958.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.50 min; ESI-MS(-) m/z 957.7 (M-2H).

Pripremanje Primera 6045 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2711]

1 2

[2712] Primer 6045 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(4-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)oksi)-3-bromofenil)propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 0-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 938.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.50 min; ESI-MS(-) m/z 935.5 (M-2H).

Pripremanje Primera 6046

[2713]

1

[2714] Primer 6046 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 944.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 944.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 6047

1 4

[2716] Primer 6047 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-(benziloksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z 960.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.94 min; ESI-MS(+) m/z 960.3 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 6048 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2717]

[2718] Primer 6048 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((6-metoksiizohinolin-1-il)oksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z 993.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.98 min; ESI-MS(+) m/z 994.2 (M+2H).

1

Pripremanje Primera 6049 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2719]

[2720] Primer 6049 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-((3-bromohinolin-2-il)oksi)pirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-70% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i

1

osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.96 min; ESI-MS(+) m/z 1018.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.07 min; ESI-MS(+) m/z 1018.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 6050 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2721]

[2722] Primer 6050 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Aminokiselina (S)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-2-karboksilna kiselina je korišćena. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-95% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 914.8 (M+2H).

1

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 915.0 (M+2H).

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-fenil-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2723]

[2724] U smešu (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino )-3-(1H-indol-3-il)propionske kiseline (500 mg, 1.172 mmol) and srebro(I) tetrafluoroborate (456 mg, 2.345 mmol) u zaptivenom sudu sa okruglim dnom od 150 mL koji se može ponovo upotrebiti na s.t. pod N2je dodata smeša jodobenzena (478 mg, 2.345 mmol) u DMF (3 mL), praćeno sa smešom trifluorosirćetne kiseline (0.090 mL, 1.172 mmol) u DMF (3 mL) i zatim smešom diacetoksipaladijuma (13.16 mg, 0.059 mmol) u DMF (4 mL). Sud je čvrsto poklopljen i mešan na 95 °C u uljanom kupatilu tokom 17 h. Smeša je razblažen sa EtOAc (150 mL), i filtriran. Filtrat je uparen, i ostatak je rastvoren u MeOH i prečišćen pomoću Shimadzu-VP preparativne HPLC na reverznoj fazi korišćenjem metode za seperaciju: Rastvarač A = 10% MeOH-90% H2O-0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH-10% H2O-0.1% TFA, Početni %B = 50, Finalni %B = 100, Vreme gradijenta = 10 min, Vreme zaustavljanja = 12 min, Stopa protoka = 30 mL/min, Kolona: SunFire Prep C1819 x 1005µm, (UV detekcija na 220 nm). Kombinovane željene frakcije pri vremenu zadržavanja = 8.513 min su uparene da se dobije prljavo bela čvrsta supstanca proizvoda (247 mg).

[2725]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.70 (br s, 1H), 11.23 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.3, 2H),

1

7.80 (d, J = 8.1, 1H), 7.73 (d, J = 7.8, 1H), 7.70 - 7.62 (m, 4H), 7.49 (t, J = 7.6, 2H), 7.43 - 7.34 (m, 4H), 7.30 (m, 1H), 7.25 (m, 1H), 7.10 (t, J = 7.5, 1H), 7.00 (m, 1H), 4.35 - 4.30 (m, 1H), 4.16 - 4.09 (m, 3H), 3.41 (m, 1H), 3.20 (dd, J = 14.4, 8.6, 1H). Položaj fenil prstena na C2 indola je pokazan opažanjem korelacije dugog dometa C-H između protona fenila H11/H15 i ugljenika indola C2. Optička rotacija [a]<20>D-9.83° (1.75 mg/mL, MeOH). LCMS (ES+) m/z = 503.1 (M+H), vreme zadržavanja = 2.250 min. LCMS su izvedene korišćenjem Shimadzu-VP instrumenta sa UV detekcijom na 220 nm i Waters MICROMASS®. HPLC metoda: Rastvarač A = 10% MeOH90% H2O0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH10%H2O0.1% TFA, Početni %B = 0, Finalni %B = 100, Vreme gradijenta = 2 min, Vreme zaustavljanja na 3 min, Stopa protoka = 1 ml/min, Kolona: PHENOMENEX®-Luna, 2.0 x 30mm, 3µm.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-fluorofenil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2726]

[2727] U smešu (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propionske kiseline (1 g, 2.345 mmol) i srebro(I) tetrafluoroborata (0.913 g, 4.69 mmol) u zaptivenom sudu sa okruglim dnom od 150 mL koji se može ponovo upotrebiti na s.t. pod N2je dodata smeša 1-fluoro-4-jodobenzena (1.041 g, 4.69 mmol) u DMF (5 mL), praćeno sa smešom trifluorosirćetne kiseline (0.181 mL, 2.345 mmol) u DMF (5 mL) i zatim smešom diacetoksipaladijuma (0.026 g, 0.117 mmol) u DMF (5 mL). Drugih 5 mL DMF je dodato u reakcionu smešu. Sud je čvrsto poklopljen i reakciona smeša mešana na 95 °C u uljanom kupatilu tokom 18 h. Smeša je razblažena sa 300 mL EtOAc, filtrirana, i filtrat opran sa slanim rastvorom (2 x 100 mL). Organski rastvor je uparen. Ostatak je rastvoren u MeOH i prečišćen

1

pomoću Shimadzu-VP preparativne HPLC na reverznoj fazi korišćenjem metode za separaciju: Rastvarač A = 10% MeOH-90% H2O-0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH-10% H2O-0.1% TFA, Početni %B = 50, Finalni %B = 100, Vreme gradijenta = 10 min, Vreme zaustavljanja = 12 min, Stopa protoka = 30 mL/min, Kolona: SunFire Prep C1819 x 1005µm, (UV detekcija na 220 nm). Kombinovane željene frakcije pri vremenu zadržavanja = 8.679 min su uparene da se dobije prljavo bela čvrsta supstanca proizvoda (586.8mg).

[2728]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.68 (br s, 1H), 11.24 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.6, 2H), 7.79 (d, J = 8.3, 1H), 7.72 - 7.63 (m, 5H), 7.43 - 7.38 (m, 2H), 7.35 - 7.23 (m, 5H), 7.10 (t, J = 7.6, 1H), 7.00 (m, 1H), 4.33 - 4.28 (m, 1H), 4.15 - 4.09 (m, 3H), 3.36 (m, 1H), 3.18 (dd, J = 14.4, 8.8, 1H). [a]<20>D-10.07° (1.35 mg/mL, rastvarač). LCMS (ES+) m/z = 521.0 (M+H), vreme zadržavanja = 2.262 min. LCMS su izvedene korišćenjem Shimadzu-VP instrumenta sa UV detekcijom na 220 nm i Waters MICROMASS®. HPLC metoda: Rastvarač A = 10% MeOH90% H2O0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH10%H2O0.1% TFA, Početni %B = 0, Finalni %B = 100, Vreme gradijenta = 2 min, Vreme zaustavljanja na 3 min, Stopa protoka = 1 ml/min, Kolona: PHENOMENEX®-Luna, 2.0 x 30mm, 3µm.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(3-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2729]

[2730] U zaptiven sud sa okruglim dnom od 150 mL su dodati (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propionska kiselina (1 g, 2.345 mmol), srebro(I) tetrafluoroborat (0.913 g, 4.69 mmol), DMF (20mL), 3-jodoanizol (1.098 g, 4.69 mmol), 2,2,2-

1 1

trifluorosirćetna kiselina (0.181 mL, 2.345 mmol) i diacetoksipaladijum (0.026 g, 0.117 mmol). Smeša je isprana/degasirana sa azotom tokom 5min. Sud je čvrsto poklopljen i smeša mešana na 95 °C tokom 18 h. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc(300mL), filtriran, i filtrat oprana sa slanim rastvorom (2x100mL). Organski rastvor je uparen. Ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom (BIOTAGE® silika gel kolona 25m, EtOAc/Heksan = 0 do 100%) da se dobije proizvod (560mg, 42%) kao svetlo braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 8.19 (s, 1H), 7.81 - 7.68 (m, 3H), 7.53 - 7.04 (m, 13H), 6.92 (dd, J=8.3, 2.0 Hz, 1H), 5.20 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.72 - 4.62 (m, 1H), 4.26 - 4.19 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.65 - 3.45 (m, 2H); [a]<20>D-10.35° (2.88 mg/mL, MeOH). LCMS vreme zadržavanja = 1.862 min., m/z = 533 (M+H), 95.0% čistoća. LCMS podaci su dobijeni na Shimadzu analitičkoj LC/MICROMASS® Platformi LC (ESI+) na 220nm korišćenjem sledećeg seta uslova: PHENOMENEX® Luna 3µm C18, 2 x 50 mm kolona, sa gradijentom od 0-100%B (B = 90% HPLC grade Acetonitril/ 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade voda), (A = 90% HPLC grade voda / 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade acetonitril), u 2 minuta sa 1 minutnim zadržavanjem pri stopi protoka od 1 mL/minuti.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2731]

[2732] (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina (1.12g, 85%) je dobijen from (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propionska kiselina i 1-jodo-4-metoksibenzen korišćenjem procedure opisane za (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(3-

1 2

metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.89 -12.48 (m, 1H), 11.14 (s, 1H), 7.93 - 7.77 (m, 2H), 7.72 - 7.58 (m, 5H), 7.46 - 7.22 (m, 6H), 7.11 - 6.94 (m, 4H), 4.30 (dd, J=8.5, 6.0 Hz, 1H), 4.18 - 4.07 (m, 3H), 3.84 - 3.77 (s, 3H), 3.35 (m, 1H), 3.23 - 3.14 (m, 1H); [α]<20>D-9.44° (3.05 mg/mL, MeOH). LCMS vreme zadržavanja = 1.810 min., m/z = 533 (M+H), 97.3% čistoća. LCMS podaci su dobijeni na Shimadzu analitičkoj LC/MICROMASS® Platformi LC (ESI+) na 220nm korišćenjem sledećeg seta uslova: PHENOMENEX® Luna 3µm C18, 2 x 50 mm kolona, sa gradijentom od 0-100%B (B = 90% HPLC grade Acetonitril/ 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade voda), (A = 90% HPLC grade voda / 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade acetonitril), u 2 minuta sa 1 minutnim zadržavanjem pri stopi protoka od 1 mL/minuti.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-etoksifenil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2733]

[2734] (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-etoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina (1.11 g, 66%) je dobijena od (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propionske kiseline i 1-jodo-4-etoksibenzena korišćenjem procedure opisane za (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi) karbonil)amino)-3-(2-(3-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 8.12 (s, 1H), 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.69 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.54 - 7.34 (m, 8H), 7.33 - 7.12 (m, 4H), 6.97 - 6.90 (m, 2H), 5.16 (d, J=7.8 Hz, 1H), 4.64 (d, J=6.3 Hz, 1H), 4.28 - 4.06 (m, 4H), 3.62 - 3.42 (m, 2H), 1.44 - 1.36 (t, J=8.0Hz, 3H); [a]<20>D-10.68° (4.01 mg/mL, MeOH). LCMS

1

vreme zadržavanja = 1.898 min., m/z 547 = (M+H), 98.2% čistoća. LSMC podaci su dobijeni na Shimadzu analitičkoj LC/MICROMASS® Platform LC (ESI+) na 220nm korišćenjem sledećeg seta uslova: PHENOMENEX® Luna 3µm C18, 2 x 50 mm kolona, sa gradijentom od 0-100%B (B = 90% HPLC grade Acetonitril/ 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade voda), (A = 90% HPLC grade voda / 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade acetonitril), u 2 minuta sa 1 minutnim zadražavanjem pri stopi protoka od 1 mL/minuti.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-propoksifenil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

2735]

Korak 1: 1-jodo-4-propoksibenzen

[2736] Suspenzija 4-jodofenola (3 g, 13.64 mmol), 1-bromopropana (1.845 g, 15.00 mmol), i natrijum karbonata (7.54 g, 54.5 mmol) u DMF (30 mL) je mešana na 80°C tokom 4h. Reakciona smeša je razblažena sa vodom (250mL) i ektrahovana sa EtOAc (3x75mL). Kombinovani organski ekstrakti su oprani sa 0.5M NaOH (2x50mL), i vodom (2X50mL), i zatim osušeni preko MgSO4. Rastvarač je uklonjen. Sirov proizvod (3.11g) je dobijen, koji je direktno korišćen za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400MHz, hloroformd) δ 7.61 - 7.53 (m, 2H), 6.74 - 6.67 (m, 2H), 3.90 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.88 - 1.76 (m, 2H), 1.05 (t, J=7.4 Hz, 3H).

1 4

Korak 2:

[2737] (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-propoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina (830mg, 57%) je dobijena od (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propionske kiseline i 1-jodo-4-propoksibenzena korišćenjem procedure opisane za (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi) karbonil)amino)-3-(2-(3-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionsku kiselinu.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 8.14 (s, 1H), 7.83 - 7.59 (m, 3H), 7.54 - 7.12 (m, 11H), 6.93 (d, J=8.5 Hz, 2H), 5.43 - 5.12 (m, 1H), 4.71 - 4.53 (m, 1H), 4.29 - 4.05 (m, 3H), 3.88 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.63 - 3.41 (m, 2H), 1.79 (sxt, J=7.0 Hz, 2H), 1.09 - 0.98 (m, 3H); [α]<20>D- 7.54° (3.05 mg/mL, MeOH). LCMS vreme zadržavanja = 1.952 min., m/z = 561 (M+H), 99.1% čistoća. LSMC podaci su dobijeni na Shimadzu analitičkoj LC/MICROMASS® Platformi LC (ESI+) na 220nm korišćenjem sledećeg seta uslova: PHENOMENEX® Luna 3µm C18, 2 x 50 mm kolona, sa gradijentom od 0-100%B (B = 90% HPLC grade Acetonitril/ 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade voda), (A = 90% HPLC grade voda / 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade acetonitril), u 2 minuta sa 1 minutnim zadražavanjem pri stopi protoka od 1 mL/minuti.

Pripremanje (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(3-propoksifenil)-1H-indol-3-il)propionske kiseline

[2738]

Korak 1:

[2739] Iodo-3-propoksibenzen (3.53g, 98%) je dobijen od 3-jodofenola i 1-bromopropana korišćenjem procedure opisane za 1-jodo-4-propoksibenzen.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 7.33 - 7.25 (m, 2H), 7.05 - 6.97 (m, 1H), 6.92 - 6.85 (m, 1H), 3.91 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.82 (sxt, J=7.0 Hz, 2H), 1.05 (t, J=7.4 Hz, 3H).

1

Korak 2:

[2740] (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(3-propoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina (1.25g, 83%) je dobijena od (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1H-indol-3-il)propionske kiseline i 1-jodo-3-propoksibenzena korišćenjem procedure opisane za (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi) karbonil)amino)-3-(2-(3-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina.<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) δ 8.28 (s, 1H), 7.80 - 7.70 (m, 3H), 7.53 - 7.09 (m, 13H), 6.94 - 6.87 (m, 1H), 5.23 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.68 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.22 - 4.15 (m, 2H), 3.93 (t, J=6.7 Hz, 2H), 3.60 (d, J=5.3 Hz, 1H), 3.52 (d, J=7.0 Hz, 1H), 1.85 - 1.72 (m, 2H), 1.01 (t, J=7.4 Hz, 3H); [a]<20>D-11.34° (4.25 mg/mL, MeOH). LCMS vreme zadržavanja = 1.972 min., m/z = 561 (M+H), 99.0% čistoća. LSMC podaci su dobijeni na Shimadzu analitičkoj LC/MICROMASS® Platform LC (ESI+) na 220nm korišćenjem sledećeg seta uslova: PHENOMENEX® Luna 3µm C18, 2 x 50 mm kolona, sa gradijentom od 0-100%B (B = 90% HPLC grade Acetonitril/ 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade voda), (A = 90% HPLC grade voda / 0.1% trifluorosirćetna kiselina/ 10% HPLC grade acetonitril), u 2 minuta sa 1 minutnim zadržavanjem pri stopi od 1 mL/minuti.

Pripremanje Primera 7001 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2741]

[2742] Primer 7001 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za

1

pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-fenil-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2743] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z = 986.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z = 986.4 (M+2H).

[2744] ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1969.9894, Nađeno: 1969.9865 (M+H); Izračunato: 985.4983, Nađeno: 985.4964 (M+2H); Izračunato: 657.3347, Nađeno: 657.3327 (M+3H).

Pripremanje Primera 7002

[2745]

1

[2746] Primer 7002 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-fluorofenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2747] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije.

[2748] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne

1

evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z = 977.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z = 977.9 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 976.9856, Nađeno: 976.9838 (M+2H).

Pripremanje Primera 7003 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2749]

[2750] Primer 7003 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(3-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2751] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom;

1

Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije.

[2752] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z = 983.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z = 983.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 982.9956, Nađeno: 982.9936 (M+2H).

Pripremanje Primera 7004 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2753]

[2754] Primer 7004 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za

11

pripremanje Primera 7001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(3-propoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2755] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije.

[2756] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.1mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z = 996.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z = 997.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 997.0113, Nađeno: 997.0088 (M+2H).

Pripremanje Primera 7005

[2757]

11 1

[2758] Primer 7005 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-propoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2759] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z = 996.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z = 997.5 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 997.0113, Nađeno: 997.0086 (M+2H).

Pripremanje Primera 7006

11 2

[2761] Primer 7006 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2762] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z = 983.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z = 983.6 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 982.9956, Nađeno: 982.9930 (M+2H).

11

Pripremanje Primera 7007 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2763]

[2764] Primer 7007 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2765] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije.

[2766] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20

11 4

mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.7mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 990.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.69 min; ESI-MS(+) m/z 990.6 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 990.0035, Nađeno: 990.0008 (M+2H).

Pripremanje Primera 7008

[2767]

[2768] Primer 7008 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-metoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2769] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM

11

amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.5mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z = 975.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z = 975.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 974.9982, Nađeno: 974.9949 (M+2H).

Pripremanje Primera 7009

[2770]

[2771] Primer 7009 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-etoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

11

[2772] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.9mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 990.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 990.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 990.0035, Nađeno: 990.0014 (M+2H).

Pripremanje Primera 7010 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2773]

[2774] Primer 7010 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona

11

metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-etoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2775] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.9mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z = 997.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z = 997.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 7011 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2776]

[2777] Primer 7011 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura

11

kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A". (S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(2-(4-etoksifenil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja.

[2778] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 982.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 982.6 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 982.0060, Nađeno: 982.0035 (M+2H).

Pripremanje Primera 7012 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2779]

[2780] Primer 7012 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja". A "Prelude Metoda A: Procedura

11

jednostrukog kuplovanja” je korišćena da kaptira amino terminus od Tyrl sa akrilnom kiselinom kao poslednji korak aminokiselinskog kuplovanja. Peptid vezan za smolu dobijen je zatim podvrgnut "reakciji zatvaranja prstena sa metatezom olefina (RCM)" kao što je opisano ispod i zatim praćena sa “Metodom A globalnog uklanjanja zaštite”.

[2781] Reakcija zatvaranja prstena sa metatezom olefina (RCM): Peptid vezan za smolu (0.044mmol) je dodat u konusnu bočicu za mikrotalasni reaktor. Hoveyda-Grubb-ov katalizator 2. generacije ((1,3-Bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden) dihloro(oizopropoksifenilmetilen)rutenijum) (27.5mg, 0.033mmol) i 1,2,-dihloretan(10mL) su dodait. Smeša je degasirana, i zagrejana u mikrotalasnom reaktoru na 120° tokom 1h. Nakon što je reakcija izvedena, smola je filtrirana, i oprana sa DMF (2X5mL), praćeno sa DCM (3X5mL) i zatim osušena. Sirovom materijalu je uklonjena zaštita korišćenjem “Metode A globalnog uklanjanja zaštite”.

[2782] Sirov proizvod je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.9mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52min; ESI-MS(+) m/z = 938.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z = 938.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 7013 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2783]

111

[2784] Primer 7013 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja". A "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja” je korišćena kako bi se kaptirao amino terminus Tyrl sa akrilnom kiselinom kao poslednji korak aminokiselinskog kuplovanja. Peptid vezan za smolu dobijen je zatim podvrgnut "reakcija zatvaranja prstena sa metatezom olefina (RCM)" kao što je opisano ispod i zatim praćeno sa “Metodom A globalnog uklanjanja zaštite”.

[2785] Reakcija zatvaranja prstena metatezom olefina (RCM): Peptid vezan za smolu (0.262mmol) je podeljen u šest gomila. Prva gomila (0.044mmol) je dodata u konusnu bočicu od 20 mL za mikrotalasni reaktor. Hoveyda-Grubb-ov katalizator 2. generacije (27.5mg, 0.033mmol) i 1,2,-dihloretan(10mL) su dodati. Smeša je degasiran, i zagrejana u mikrotalasnom reaktoru na 120° tokom 1hr. Nakon što je reakcija izvedena, smola je filtrirana, i oprana sa DMF (2X5mL), praćeno sa DCM (3X5mL) i zatim osušena. Šest gomila je kombinovano i sirovom materijalu je uklonjena zaštita korišćenjem “Metode A globalnog uklanjanja zaštite”.

[2786] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije.

[2787] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.1mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z = 920.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z = 920.9 (M+2H).

[2788] Primeri 7014 to 7064 su pripremljeni praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom". “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite” i “Ciklizaciona metoda A" korišćene za pripremanje Primera 7014 do 7064 su modifikovane kao štoje opisano u nastavku. Metoda globalnog uklanjanja zaštite A: Procedura “Metode A globalnog uklanjanja zaštite” opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen kombinovanjem u staklenoj tegli od 40 mL trifluorosirćetnae kiseline (22 mL), fenola (1.325 g), vode (1.25 mL) i triizopropilsilana (0.5 mL). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prebačena u staklenu bočicu od 4 mL. U bočicu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0 mL). Smeša je izmešana na orbitalnom šejkeru (175RPM tokom 2h). Smeša je filtrirana kroz levak, čvrste supstance su oprane sa dodatnim "rastvorom za uklanjanje zaštite" (1.0 mL) i sakupljene u bočici sa vijčanim zatvaračem od 40 mL. U filtrate je dodat Et2O (15 mL). Smeša je snažno mešana nakon čega je značajna količina bele čvrste supstance precipitirala. Smeša je centrifugirana tokom 3 minuta na 2000 RPM, rastvor dekantiran iz čvrstih supstanci i odbačen. Proces je ponovljen x3, čvrste supstance su zatim ostavljene da odstoje na stolu i suše se na vazduhu tokom 1-2 sata pre nego što daju sirov peptid kao prljavo belu čvrstu susptancu. Ciklizaciona metoda A: Procedura "Ciklizacione metoda A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u MeCN:vod. 0.1M NH4OAc (15mL:15mL), i rastvor je zatim pažljivo podešen do pH = 9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Bočisu su poklopljene i rastvor je zatim izmešan na 175RPM na orbitalnom šejkeru preko noći (∼18h). Reakcioni rastvor je koncentrovana i ostatak je zatim rastvoren u MeOH. Ovaj rastvor je podvrgnut reverzno-faznom HPLC prečišćavanju kako bi se dobilo željeni ciklični peptid.

Pripremanje Primera 7014 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2789]

[2790] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.87 min; ESI-MS(+) m/z = 923.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z = 923.7 (M+2H).

111

Pripremanje Primera 7015 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2791]

[2792] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 40.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z = 955.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.06 min; ESI-MS(+) m/z = 954.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 7016 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2793]

[2794] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 42.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z = 949.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.96 min; ESI-MS(+) m/z = 949.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 7017 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2795]

111

[2796] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 39.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z = 955.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.94 min; ESI-MS(+) m/z = 955.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 7018 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2797]

111

[2798] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z = 954.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.94 min; ESI-MS(+) m/z = 954.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 7019 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2799]

111

[2800] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2801] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.6%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z = 931.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z = 931.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7020

[2802]

111

[2803] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z = 910.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z = 910.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7021 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2804]

111

[2805] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 44.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z = 910.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z = 910.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7022 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2806]

112

[2807] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2808] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z = 898.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z = 898.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 7023 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2809]

[2810] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2811] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 80%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z = 916.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.92 min; ESI-MS(+) m/z = 916.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7024 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2812]

[2813] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z = 948.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z = 948.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 7025 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2814]

112

[2815] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95.4%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z = 948.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z = 948.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 7026 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2816]

[2817] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2818] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z = 961.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z = 961.7 (M+2H), 972.6 (M+H+Na).

Pripremanje Primera 7027 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2819]

112

[2820] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z = 961.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z = 961.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 7028 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2821]

112

[2822] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2823] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z = 961.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z = 961.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7029 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2824]

112

[2825] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2826] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 53.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.7%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z = 948.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z = 948.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7030 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2827]

112

[2828] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97.8%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.05 min; ESI-MS(+) m/z = 956.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.11 min; ESI-MS(+) m/z = 956.8 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 955.9709, Nađeno: 955.9667 (M+2H).

Pripremanje Primera 7031

[2829]

112

[2830] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91.4%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z = 952.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z = 952.1 (M+2H), 971.7 (M+MeCN+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 951.4614, Nađeno: 951.4591 (M+2H).

Pripremanje Primera 7032 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2831]

11

[2832] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2833] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.8%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z = 951.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z = 951.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 951.4614, Nađeno: 951.4587 (M+2H).

Pripremanje Primera 7033 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2834]

11 1

[2835] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2836] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98.5%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.05 min; ESI-MS(+) m/z = 952.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.11 min; ESI-MS(+) m/z = 951.5 (M+2H), 972.0 (M+MeCN+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 951.4614, Nađeno: 951.4590 (M+2H).

Pripremanje Primera 7034 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2837]

11 2

[2838] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 38.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z = 955.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.02 min; ESI-MS(+) m/z = 955.7 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 955.9709, Nađeno: 955.9679 (M+2H).

Pripremanje Primera 7035

[2839]

11

[2840] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 37.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.02 min; ESI-MS(+) m/z = 928.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.04 min; ESI-MS(+) m/z = 928.7 (M+2H), 940.6 (M+H+Na).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.9851, Nađeno: 928.9822 (M+2H).

Pripremanje Primera 7036 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2841]

11 4

[2842] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.21 min; ESI-MS(+) m/z = 950.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.17 min; ESI-MS(+) m/z = 950.5 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 950.0085, Nađeno: 950.0054 (M+2H).

Pripremanje Primera 7037 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2843]

11

[2844] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z = 934.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.76 min; ESI-MS(+) m/z = 935.2 (M+2H), 945.7 (M+H Na).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.4749, Nađeno: 934.4719 (M+2H).

Pripremanje Primera 7038 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2845]

11

[2846] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 40.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z = 934.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.76 min; ESI-MS(+) m/z = 934.8 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 934.4749, Nađeno: 934.4719 (M+2H).

Pripremanje Primera 7039

[2847]

11

[2848] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z = 937.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.93 min; ESI-MS(+) m/z = 937.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 936.9825, Nađeno: 936.9799 (M+2H).

Pripremanje Primera 7040 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2849]

11

[2850] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z = 951.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z = 951.7 (M+2H), 963.8 (M+H+Na).

Pripremanje Primera 7041 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2851]

11

[2852] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z = 944.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.45 min; ESI-MS(+) m/z = 944.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 7042 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2853]

114

[2854] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2855] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-40% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z = 937.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z = 937.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 7043 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2857] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 60-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z = 940.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.01 min; ESI-MS(+) m/z = 940.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7044 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2858]

[2859] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.08. min; ESI-MS(+) m/z = 939.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.08 min; ESI-MS(+) m/z = 939.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 7045 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2860]

114

[2861] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.18 min; ESI-MS(+) m/z = 976.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.13 min; ESI-MS(+) m/z = 976.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7046

[2862]

[2863] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.80 min; ESI-MS(+) m/z = 960.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z = 960.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 7047 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2864]

114

[2865] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.84 min; ESI-MS(+) m/z = 957.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.54 min; ESI-MS(+) m/z = 957.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 7048 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2866]

114

[2867] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 55.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z = 931.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2. min; ESI-MS(+) m/z = 931.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 7049 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2868]

114

[2869] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2870] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z = 976.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.40 min; ESI-MS(+) m/z = 976.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 7050

[2871]

114

[2872] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z = 969.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.44 min; ESI-MS(+) m/z = 969.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 7051

[2873]

114

[2874] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z = 966.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.00 min; ESI-MS(+) m/z = 966.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 7052 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2875]

11

[2876] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z = 982.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.13 min; ESI-MS(+) m/z = 982.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 7053 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2877]

11 1

[2878] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2879] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z = 962.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.43 min; ESI-MS(+) m/z = 962.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 7054

[2880]

11 2

[2881] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 2.04 min; ESI-MS(+) m/z = 965.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.04 min; ESI-MS(+) m/z = 965.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 7055 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2882]

11

[2883] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z = 930.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z = 930.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 7056 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2884]

11 4

[2885] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.93 min; ESI-MS(+) m/z = 982.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.07 min; ESI-MS(+) m/z = 982.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 7057 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2886]

11

[2887] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z = 955.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.90 min; ESI-MS(+) m/z = 955.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 7058 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2888]

11

[2889] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1. min; ESI-MS(+) m/z = 960.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z = 960.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 7059 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2890]

11

[2891] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z = 955.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z = 955.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 7060

[2892]

11

[2893] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2894] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z = 963.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z = 963.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 7061 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2895]

11

[2896] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.83 min; ESI-MS(+) m/z = 966.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.04 min; ESI-MS(+) m/z = 966.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 7062 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2897]

11

[2898] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.89 min; ESI-MS(+) m/z = 983.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.11 min; ESI-MS(+) m/z = 982.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 7063 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2899]

11 1

[2900] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z = 957.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.15 min; ESI-MS(+) m/z = 957.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 7064 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2901]

11 2

[2902] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2903] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 30-70% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

[2904] Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 5µm, 19 x 200 mm, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 0-40% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije.

[2905] Prinos proizvoda je bio 7.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z = 951.0 (M+2H).

11

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.40 min; ESI-MS(+) m/z = 951.2 (M+2H), 634.5 (M+3H).

Serija 9000

[2906] Svi primeri serije 9000 koji služe ispod kao primer su pripremljeni praćenjem gorepomenutog "Generalnog sintetičkog niza A"

Pripremanje Primera 9001 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2907]

[2908] Sirov materijal Primera 9001 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

11 4

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 964.8(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 964.8(M+2H).

Pripremanje Primera 9002 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2909]

[2910] Sirov materijal Primera 9002 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.92 min; ESI-MS(+) m/z 956.6(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.91 min; ESI-MS(+) m/z 956.6(M+2H).

Pripremanje Primera 9003 (ne u skladu sa pronalaskom)

11

[2912] Sirov materijal Primera 9003 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 957.5(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.40 min; ESI-MS(+) m/z 957.6(M+2H).

Pripremanje Primera 9004 (ne u skladu sa pronalaskom)

11

[2914] Sirov materijal Primera 9004 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 957.5(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.38 min; ESI-MS(+) m/z 957.5(M+2H).

Pripremanje Primera 9005 (ne u skladu sa pronalaskom)

11

[2916] Sirov materijal Primera 9005 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 950.1(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.45 min; ESI-MS(+) m/z 949.9(M+2H).

Pripremanje Primera 9006

[2917]

11

[2918] Sirov materijal Primera 9006 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 964.9(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.40 min; ESI-MS(+) m/z 965.1(M+2H).

Pripremanje Primera 9007 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2919]

11

[2920] Sirov materijal Primera 9007 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 965.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.40 min; ESI-MS(+) m/z 965.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 9008 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2921]

11

[2922] Sirov materijal Primera 9008 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(+) m/z 957.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9009 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2923]

11 1

[2924] Sirov materijal Primera 9009 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 957.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 957.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 9010 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2925]

11 2

[2926] Sirov materijal Primera 9010 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.46 min; ESI-MS(+) m/z 950.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9011 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2927]

11

[2928] Sirov materijal Primera 9011 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 956.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.53 min; ESI-MS(+) m/z 956.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9012 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2929]

11 4

[2930] Sirov materijal Primera 9012 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 972.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z 972.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9013 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2931]

11

[2932] Sirov materijal Primera 9013 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 964.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.49 min; ESI-MS(+) m/z 964.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9014

[2933]

11

[2934] Sirov materijal Primera 9014 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 955.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 955.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9015 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2935]

11

[2936] Sirov materijal Primera 9015 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 963.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 963.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9016 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2937]

11

[2938] Sirov materijal Primera 9016 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 963.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.86 min; ESI-MS(+) m/z 963.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9017 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2939]

11

[2940] Sirov materijal Primera 9017 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 955.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 954.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9018 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2941]

11

[2942] Sirov materijal Primera je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 963.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 963.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9019 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2943]

11 1

[2944] Sirov materijal Primera 9019 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 954.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 955.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9020 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2945]

11 2

[2946] Sirov materijal Primera 9020 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 154. min; ESI-MS(+) m/z 969.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z 970.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9021 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2947]

11

[2948] Sirov materijal Primera 9021 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 963.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9022

[2949]

11 4

[2950] Sirov materijal Primera 9022 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 965.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 965.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9023

[2951]

11

[2952] Sirov materijal Primera 9023 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 973.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.73 min; ESI-MS(+) m/z 973.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9024

[2953]

11

[2954] Sirov materijal Primera 9024 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 965.0 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.52 min; ESI-MS(+) m/z 965.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9025 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2955]

11

[2956] Sirov materijal Primera 9025 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 973.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 973.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9026 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2957]

11

[2958] Sirov materijal Primera 9026 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 965.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.47 min; ESI-MS(+) m/z 965.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9027 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2959]

11

[2960] Sirov materijal Primera 9027 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 922.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.92 min; ESI-MS(+) m/z 922.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9028

[2961]

11

[2962] Sirov materijal Primera 9028 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 930.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(+) m/z 930.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9029

[2963]

11 1

[2964] Sirov materijal Primera 9029 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 921.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 921.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9030

[2965]

11 2

[2966] Sirov materijal Primera 9030 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 957.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 957.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9031 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2967]

11

[2968] Sirov materijal Primera 9031 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 971.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 971.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9032 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2969]

11 4

[2970] Sirov materijal Primera 9032 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.27 min; ESI-MS(+) m/z 935.0 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.32 min; ESI-MS(+) m/z 934.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9033 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2971]

11

[2972] Sirov materijal Primera 9033 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 952.1(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.48 min; ESI-MS(+) m/z 952.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9034 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2973]

11

[2974] Sirov materijal Primera 9034 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.23 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.24 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9035 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2975]

11

[2976] Sirov materijal Primera 9035 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 965.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 964.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9036 (ne u skladu sa pronalaskom)

11

[2978] Sirov materijal Primera 9036 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39. min; ESI-MS(+) m/z 964.1 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.52 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9037 (ne u skladu sa pronalaskom)

11

[2980] Sirov materijal Primera 9037 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 963.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 963.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9038 (ne u skladu sa pronalaskom)

12

[2982] Sirov materijal Primera 9038 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 956.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 956.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9039 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2983]

12 1

[2984] Sirov materijal Primera 9039 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 973.0 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.71 min; ESI-MS(+) m/z 973.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9040 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2985]

12 2

[2986] Sirov materijal Primera 9040 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 957.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z 957.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9041 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2987]

12

[2988] Sirov materijal Primera 9041 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 949.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.54 min; ESI-MS(+) m/z 949.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9042

[2989]

12 4

[2990] Sirov materijal Primera 9042 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 965.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.76 min; ESI-MS(+) m/z 965.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9043 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2991]

12

[2992] Sirov materijal Primera 9043 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 958.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.51 min; ESI-MS(+) m/z 958.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9044 (ne u skladu sa pronalaskom)

[2993]

12

[2994] Sirov materijal Primera 9044 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 943.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 943.5 (M+2H).

12

Pripremanje Primera 9045

[2995]

[2996] Sirov materijal Primera 9045 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 965.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.71 min; ESI-MS(+) m/z 965.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9046

[2997]

12

[2998] Sirov materijal Primera 9046 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 17.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 957.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.49 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9047

[2999]

12

[3000] Sirov materijal Primera 9047 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 955.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 955.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9048

[3001]

121

[3002] Sirov materijal Primera 9048 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 55-95% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 971.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.81 min; ESI-MS(+) m/z 971.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9049

[3003]

[3004] Sirov materijal Primera 9049 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 963.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 963.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9050

[3005]

[3006] Sirov materijal Primera 9050 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 958.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 958.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9051

[3007]

121

[3008] Sirov materijal Primera 9051 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 950.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 950.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9052

[3009]

[3010] Sirov materijal Primera 9052 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 963.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 963.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9053

[3011]

121

[3012] Sirov materijal Primera 9053 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.1% trifluorosirćetna kiselina; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 935.6 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.63 min; ESI-MS(+) m/z 935.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9054 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3013]

121

[3014] Sirov materijal Primera 9054 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 927.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.39 min; ESI-MS(+) m/z 927.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9055 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3015]

121

[3016] Sirov materijal Primera 9055 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.34 min; ESI-MS(+) m/z 934.9(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.36 min; ESI-MS(+) m/z 934.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9056 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3017]

121

[3018] Sirov materijal Primera 9056 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 943.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9057 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3019]

121

[3020] Sirov materijal Primera 9057 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.30 min; ESI-MS(+) m/z 934.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.33 min; ESI-MS(+) m/z 934.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9058

[3021]

122

[3022] Sirov materijal Primera 9058 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 943.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9059 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3023]

[3024] Sirov materijal Primera 9059 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 36.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 936.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.54 min; ESI-MS(+) m/z 936.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9060

[3026] Sirov materijal Primera 906 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 944.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.91 min; ESI-MS(+) m/z 944.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9061

[3027]

122

[3028] Sirov materijal Primera 9061 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 944.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.65 min; ESI-MS(+) m/z 944.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9062 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3029]

[3030] Sirov materijal Primera 9062 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 20-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 20-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 9.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 953.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.88 min; ESI-MS(+) m/z 952.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9063 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3031]

122

[3032] Sirov materijal Primera 9063 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 948.5(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 948.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9064 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3033]

122

[3034] Sirov materijal Primera 9064 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 956.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.81 min; ESI-MS(+) m/z 957.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9065 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3035]

122

[3036] Sirov materijal Primera 9065 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 956.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 956.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9066

[3037]

122

[3038] Sirov materijal Primera 9066 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 964.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z 965.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9067 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3039]

122

[3040] Sirov materijal Primera 9067 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 934.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.57 min; ESI-MS(+) m/z 934.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9068 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3041]

12

[3042] Sirov materijal Primera 9068 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9069

[3043]

12 1

[3044] Sirov materijal Primera 9069 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 943.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 943.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9070 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3045]

12 2

[3046] Sirov materijal Primera 9070 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.85 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9071

[3047]

12

[3048] Sirov materijal Primera 9071 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-100% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.91 min; ESI-MS(+) m/z 939.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9072 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3049]

12 4

[3050] Sirov materijal Primera 9072 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 405-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 931.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.93 min; ESI-MS(+) m/z 931.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9073 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3051]

12

[3052] Sirov materijal Primera 9073 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 922.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z 922.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9074

[3053]

12

[3054] Sirov materijal Primera 9074 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 931.0 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.98 min; ESI-MS(+) m/z 930.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9075 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3055]

12

[3056] Sirov materijal Primera 9075 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 954.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.18 min; ESI-MS(+) m/z 954.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 9076 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3057]

12

[3058] Sirov materijal Primera 9076 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 44.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 958.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.11 min; ESI-MS(+) m/z 958.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 9077 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3059]

12

[3060] Sirov materijal Primera 9077 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 30.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 950.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.92 min; ESI-MS(+) m/z 950.0(M+2H).

Pripremanje Primera 9078

[3061]

124

[3062] Sirov materijal Primera 9078 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 39.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 966.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.09 min; ESI-MS(+) m/z 966.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9079

[3063]

[3064] Sirov materijal Primera 9079 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 957.9(M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.89 min; ESI-MS(+) m/z 958.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9080

[3065]

[3066] Sirov materijal Primera 9080 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 945.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z 945.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9081 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3067]

124

[3068] Sirov materijal Primera 9081 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 931.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.60 min; ESI-MS(+) m/z 931.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9082 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3069]

[3070] Sirov materijal Primera 9082 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 939.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 939.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9083

[3071]

124

[3072] Sirov materijal Primera 9083 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 939.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 939.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9084

[3073]

124

[3074] Sirov materijal Primera 9084 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 9085 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3075]

124

[3076] Sirov materijal Primera 9085 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 90%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.55 min; ESI-MS(+) m/z 889.1 (M+2H)<+>.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z 889.1 (M+2H)<+>.

Pripremanje Primera 9086

[3077]

124

[3078] Sirov materijal Primera 9086 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 897.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(+) m/z 897.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9087 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3079]

124

[3080] Sirov materijal Primera 9087 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 897.0 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 897.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9088

[3081]

12

[3082] Sirov materijal Primera 9088 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 905.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.88 min; ESI-MS(+) m/z 905.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9089 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3083]

12 1

[3084] Sirov materijal Primera 9089 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 92%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 931.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 931.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9090 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3085]

12 2

[3086] Sirov materijal Primera 9090 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 28.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 940.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z 940.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9091

[3087]

12

[3088] Sirov materijal Primera 9091 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 939.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.51 min; ESI-MS(+) m/z 939.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 9092 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3089]

12 4

[3090] Sirov materijal Primera 9092 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 948.1 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.69 min; ESI-MS(+) m/z 948.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9093 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3091]

12

[3092] Sirov materijal Primera 9093 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 22.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 889.4 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 889.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 9094 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3093]

12

[3094] Sirov materijal Primera 9094 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 897.5 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 897.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9095 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3095]

12

[3096] Sirov materijal Primera 9095 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 19.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 896.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 896.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9096 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3097]

12

[3098] Sirov materijal Primera 9096 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 27.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 905.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 905.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 9097 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3099]

12

[3100] Sirov materijal Primera 9097 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 931.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 931.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9098

[3101]

12

[3102] Sirov materijal Primera 9098 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 940.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 940.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9099 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3103]

12 1

[3104] Sirov materijal Primera 9099 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 11.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1. min; ESI-MS(+) m/z 940.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2. min; ESI-MS(+) m/z 940.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9100 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3105]

12 2

[3106] Sirov materijal Primera 9100 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 940.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 940.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9105

[3107]

12

[3108] Sirov materijal Primera 9105 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 16.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 944.0 (M+2H)<+>.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.50 min; ESI-MS(+) m/z 944.2 (M+2H)<+>.

Pripremanje Primera 9106

[3109]

12 4

[3110] Sirov materijal Primera 9106 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 952.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.70 min; ESI-MS(+) m/z 952.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9107

[3111]

12

[3112] Sirov materijal Primera 9107 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 4.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.41 min; ESI-MS(+) m/z 952.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.49 min; ESI-MS(+) m/z 952.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9108 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3113]

12

[3114] Sirov materijal Primera 9108 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 960.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 960.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9109 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3115]

12

[3116] Sirov materijal Primera 9109 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 12.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 943.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.44 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 9110 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3117]

12

[3118] Sirov materijal Primera 9110 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 35 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 7.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 902.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.46 min; ESI-MS(+) m/z 902.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 9111 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3119]

12

[3120] Sirov materijal Primera 9111 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 8.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 910.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 910.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9112 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3121]

12

[3122] Sirov materijal Primera 9112 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 952.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 952.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 9113 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3123]

12 1

[3124] Sirov materijal Primera 9113 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 93%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 951.7 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.39 min; ESI-MS(+) m/z 952.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 9114 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3125]

12 2

[3126] Sirov materijal Primera 9114 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge Shield RP18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 35-75% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 960.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.56 min; ESI-MS(+) m/z 960.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 10001 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3127]

12

[3128] Primer 10001 je pripremljen praćenjem generalnog sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 5001, sastavljenog od sledećih generalnih procedura: "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole", "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja”, "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja", "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom", “Metoda A globalnog uklanjanja zaštite”, i "Ciklizaciona metoda A".

[3129] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 20 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 15 minuta, zatim 4-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 892.6 (M+2H).

12 4

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 3.01 min; ESI-MS(+) m/z 892.6 (M+2H).

Pripremanje (2S,3S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(tercbutoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina

[3130]

Korak 1:

[3131] (E)-3-(1H-Indol-3-il)akrilna kiselina (4.2 g, 22.44 mmol), (Boc)2O (10.42 ml, 44.9 mmol), i Et3N (7.82 ml, 56.1 mmol) su mešani u THF (112 ml) praćeno sa dodatkom DMAP (0.137 g, 1.122 mmol). Reakcija je mešana tokom 16 h. Reakcija je kvenčovana sa zasićenim natrijum bikarbonatom i mešana snažno tokom 10 min. Smeša je razblažena sa EtOAc i zakiseljena sa 1 N HCl. Organski sloj je sakupljen, osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod vakuumom da se dobije (E)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)akrilna kiselina koja je direktno preneta u Korak 2.

12

Korak 2:

[3132] U rastvor (E)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)akrilne kiseline (7.14 g, 24.85 mmol) u THF (400 mL) na -78 °C su dodati Et3N (10.39 ml, 74.6 mmol) i pivaloil hlorida (6.12 ml, 49.7 mmol). Smeša je mešana tokom 15 min na -78 °C zatim zagrejana do 0 °C tokom 1.5 h. Smeša je ohlađena do -78 °C, u koju je dodat n-Butillitijum (1.6 M u heksanima) (14 mL, 22.4 mmol), zatim dodata je litijum so (R)-4-fenil-2-oksazolidinona [pripremljeno dodavanjem n-Butillitijum (1.6 M u heksanima)(31 ml, 49.7 mmol), u rastvor (R)-4-feniloksazolidin-2-ona (8.11 g, 49.7 mmol)] u THF (200 mL) na -78°C) preko kanile. Reakcija je mešana na -78 °C tokom 2 h zatim na st tokom 16 h. Reakcija je kvenčovana sa zasićenim NH4Cl vodenim rastvorom. Organske supstance su uklonjene pod vakuumom i vodeni je ektrahovan sa EtOAc. Organski sloj je sakupljen, opran sa slanim rastvorom, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Sirov proizvod je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem gradijenta od 10-20% EtOAc/Heksani. Frakcije proizvoda su sakupljene i rastvarač uklonjen pod vakuumom da se dobije ((R,E)-terc-butil 3-(3-okso-3-(2-okso-4-feniloksazolidin-3-il)prop-1-en-1-il)-1H-indol-1-karboksilat, 7.12 g (66%). ESI-MS(+) m/z 433.4 (M+1).

Korak 3:

[3133] U smešu Bakar (I) bromid metilsulfid kompleksa (5.08 g, 24.70 mmol) i dimetilsulfida (15 mL) u THF (30 mL) na -4 °C je dodat metilmagnezijum bromid (3 M u dietiletru) (5.49 ml, 16.46 mmol). Nakon mešanja tokom 10 min, (R,E)-terc-butil 3-(3-okso-3-(2-okso-4-feniloksazolidin-3-il)prop-1-en-1-il)-1H-indol-1-karboksilat (7.12 g, 16.46 mmol) u THF (70 mL) je dodat. Smeša je mešana na -4 °C tokom 1 h i na st tokom 2 h. Smeša je ohlađena do -78 °C i NBS (5.86 g, 32.9 mmol) u THF (120 mL) je dodat preko kanile u reakciju. Reakcija je mešana tokom 1 h na -78 °C tokom 1 h zatim st tokom 2 h. Reakcija je kvenčovana sa 0.5 N NaHSO4: slani rastvor (1:1, 200 mL). Organski sloj je izvodjen i opran sa 0.5 N Na2S2O3(2 x 100 mL). Organska faza je oprana sa NH4Cl zatim slanim rastvorom. Organski sloj je sakupljen, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Sirov proizvod je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem 10-20% EtOAc/Heksani. Frakcije proizvoda su sakupljene i rastvarač je uklonjen pod vakuumom do terc-butil 3-((2S,3R)-3-bromo-4-okso-4-((R)-2-okso-4-feniloksazolidin-3-il)butan-2-il)-1H-indol-1-karboksilata, 4.0 g, (46%). ESI-

12

MS(+) m/z 549.2 (M+Na).<1>H NMR (500MHz, hloroform-d) d 8.16 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.64 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.43 - 7.22 (m, 7H), 6.18 (d, J=10.9 Hz, 1H), 5.16 (dd, J=8.8, 4.3 Hz, 1H), 4.45 (t, J=8.9 Hz, 1H), 4.16 (dd, J=8.9, 4.3 Hz, 1H), 3.75 (dq, J=10.8, 7.0 Hz, 1H), 1.69 (s, 9H), 1.60 (d, J=7.1 Hz, 3H).

Korak 4:

[3134] terc-Butil 3-((2S,3R)-3-bromo-4-okso-4-((R)-2-okso-4-feniloksazolidin-3-il)butan-2-il)-1H-indol-1-karboksilat (4 g, 7.58 mmol) je rastvoreno u DMSO (50.6 ml) praćeno sa dodavanjem NaN3(1.972 g, 30.3 mmol). Reakcija je mešana tokom 2 h. Reakcija je razblažena sa EtOAc i vodom. Organski sloj je sakupljen, opran sa vodom, zatim slanim rastvorom, osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirov proizvod koji je prečišćen silika gel hromatografijom korišćenjem gradijenta od 15-20% EtOAc/Heksani. Frakcije proizvoda su sakupljene i rastvarač je uklonjen pod vakuumom do terc-butil 3-((2S,3S)-3-azido-4-okso-4-((R)-2-okso-4-feniloksazolidin-3-il)butan-2-il)-1H-indol-1-karboksilata, 3.4 g (91%).<1>H NMR (400MHz, hloroform-d) d 8.16 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.37 - 7.20 (m, 7H), 5.55 (d, J=8.8 Hz, 1H), 5.51 (dd, J=8.8, 4.4 Hz, 1H), 4.79 (t, J=8.9 Hz, 1H), 4.38 (dd, J=8.9, 4.3 Hz, 1H), 3.68 - 3.57 (m, 1H), 1.69 -1.66 (m, 9H), 1.27 (d, J=6.8 Hz, 3H).

Korak 5:

[3135] U smešu terc-butil 3-((2S,3S)-3-azido-4-okso-4-((R)-2-okso-4-feniloksazolidin-3-il)butan-2-il)-1H-indol-1-karboksilat (3.38 g, 6.90 mmol) u vodi (29 mL) i THF (86 mL) na 0°C je dodat vodonik peroksid (4.67 ml, 45.7 mmol), zatim litijum hidroksid (0.331 g, 13.81 mmol). Reakcija je mešana tokom 2 h. Reakcija je kvenčovana sa Na2SO3(7 g) u 40 mL vode. Reakcija je mešana tokom 30 min na st. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom i zatim reakcija je razblažen sa EtOAc i vodom. pH je podešen do 2. Organska faza je sakupljena, oprana sa slanim rastvorom, osušena preko natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da se dobije ostatak koji je triturisan u Et2O da se dobije čvrsta supstanca koja je sakupljena filtracijom i osušen da se dobije (2S,3S)-2-azido-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina, 2.38 g (100%). ESI-MS(-) m/z 343.3 (M-H).<1>H NMR (500MHz, hloroform-d) d 8.15 (d, J=5.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.58 - 7.55 (m, 1H), 7.33 (td, J=7.7, 1.1 Hz, 1H),

12

7.27 - 7.23 (m, 1H), 4.29 (d, J=6.5 Hz, 1H), 3.68 (quin, J=6.9 Hz, 1H), 1.70 (s, 9H), 1.51 (d, J=7.1 Hz, 3H).

Korak 6:

[3136] 10% Pd na ugljeniku (1.19 g, 1.118 mmol) je postavljen u sud pod pokrivač od N2(g). Katalizator je navlažen sa MeOH (5 mL). U sud je dodata (2S,3S)-2-azido-3-(1-(tercbutoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina (2.38 g, 6.91 mmol) kao rastvor u MeOH (69.1 ml). Sud je ispražnjen zatim napunjen sa H2(g). Reakcija je mešana tokom 2 h. Sud je ispražnjen i pročišćen sa N2(g) 2X. Reakcija je filtrirant kroz CELITE® i materijal zadržan na filteru je opran sa MeOH. Organske supstance su koncentrovane pod vakuumom da se dobije (2S,3S)-2-amino-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina koja je korišćena u Koraku 7 kao takva. ESI-MS(+) m/z 319.4 (M+H).

Korak 7:

[3137] (2S,3S)-2-Amino-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina (2197 mg, 6.9 mmol) je rastvorena u smeši vode (35 mL) i THF (100 mL). Natrijum bikarbonat (2174 mg, 25.9 mmol) and (9H-fluoren-9-il)metil 2,5-dioksopirolidin-1-karboksilat (4434 mg, 13.80 mmol) su dodati u rastvor i reakcija je mešana tokom 16 h. Zasićen amonijum hlorid rastvor (200 mL) je dodat u reakciju i rastvarač je zatim uklonjen pod vakuumom. Preostali vodeni sloj je ektrahovan sa EtOAc. Organski sloj je zatim sakupljen, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Sirov materijal je prečišćen pomoću rev. fazne BIOTAGE® C-18 kolone korišćenjem gradijenta od 20-80% ACN/voda sa 0.1% TFA modifikatorom tokom 20 min. Frakcije proizvoda su sakupljene, razblažene sa vodom i ektrahovane sa EtOAc. Organski sloj je opran sa vodom, zatim slanim rastvorom, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom da se dobije (2S,3S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina, 500 mg (13%). ESI-MS(+) m/z 541.5 (M+H).<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) d 12.79 (br. s., 1H), 8.03 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.90 - 7.85 (m, 2H), 7.73 (dd, J=8.1, 4.7 Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.39 (td, J=7.4, 4.0 Hz, 2H), 7.35 - 7.30 (m, 1H), 7.28 - 7.18 (m, 3H), 4.45 (t, J=8.2 Hz, 1H), 4.30 - 4.25 (m, 1H), 4.21 - 4.15 (m, 1H), 4.15 -4.09 (m, 1H), 3.48 (quin, J=7.2 Hz, 1H), 1.57 (s, 9H), 1.34 (d, J=7.3 Hz, 3H).

12

Pripremanje Primera 10501 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3138]

[3139] Primer 10501 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 950.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 950.5 (M+2H).

Pripremanje Primera 10502 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3140]

12

[3141] Primer 10502 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 944.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 944.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 10503 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3142]

12

[3143] Primer 10503 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 44.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.47 min; ESI-MS(+) m/z 937.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.61 min; ESI-MS(+) m/z 937.0 (M+2H).

Pripremanje Primera 10504 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3144]

12 1

[3145] Primer 10504 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 49.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 930.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 930.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 10505 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3146]

12 2

[3147] Primer 10505 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 951.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.64 min; ESI-MS(+) m/z 951.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 10506 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3148]

12

[3149] Primer 10506 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 930.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 930.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 10507 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3150]

12 4

[3151] Primer 10507 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 13.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.50 min; ESI-MS(+) m/z 944.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H).

Pripremanje Primera 10508 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3152]

12

[3153] Primer 10508 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 2.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 79%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 937.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.68 min; ESI-MS(+) m/z 937.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 10509 (ne u skladu sa pronalaskom)

12

[3155] Primer 10509 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 929.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.82 min; ESI-MS(+) m/z 929.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 10510 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3156]

12

[3157] Primer 10510 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 922.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.83 min; ESI-MS(+) m/z 922.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 10511 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3158]

12

[3159] Primer 10511 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 915.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 915.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 10512 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3160]

12

[3161] Primer 10512 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A". Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B tokom 40 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 25.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 908.4 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.81 min; ESI-MS(+) m/z 908.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 10513 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3162]

12

[3163] Primer 10513 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". (2S,3S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 10.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 954.4950 (M+2H); Nađeno: 954.4874 (M+2H).

Pripremanje Primera 10514

[3164]

12 1

[3165] Primer 10514 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". (2S,3S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina je korišćena u šestom koraku aminokiselinskog kuplovanja. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 14.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 962.9 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.58 min; ESI-MS(+) m/z 962.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.4880 (M+2H); Nađeno: 962.4851 (M+2H).

Pripremanje Primera 10515 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3166]

12 2

[3167] Primer 10515 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". (2S,3S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-(1-(terc-butoksikarbonil)-1H-indol-3-il)buterna kiselina je korišćena u eighth amino acid coupling step. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 15.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 963.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.4880 (M+2H); Nađeno: 962.4844 (M+2H).

Pripremanje Primera 10516 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3168]

12

[3169] Primer 10516 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 976.2 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 976.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 10517 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3170]

12 4

[3171] Primer 10517 je pripremljen praćenjem “Generalnog sintetičkog niza A" ali korišćenjem “Ciklizacione metode B" umesto “Ciklizacione metode A". Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 983.8 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.77 min; ESI-MS(+) m/z 983.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 983.0012 (M+2H); Nađeno: 982.9986 (M+2H).

Analitički podaci:

[3172] Masena spektrometrija: "ESI-MS(+)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-MS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom izvedenu u negativnom jonskom modu; "ESI-HRMS(+)" označava masene spektrometrije sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije

12

izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-HRMS(-)" označava masenu spektrometriju sa elektrosprej jonizacijom visoke rezolucije zvedenu u negativnom jonskom modu. Detektovane mase su prijavljene praćenjem "m/z" jedinične oznake. Jedinjenja sa tačnim masama većim od 1000 su često detektovana kao dvostruko-naelektrisani ili trostruko-naelektrisani joni.

Analiza Uslov A:

[3173] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5 minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza Uslov B:

[3174] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol:voda sa 10mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 10mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5 minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 0.5 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Generalne procedure za Primere 13001-14008:

[3175] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Symphony-X peptidni sintetizator (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 mL opremljenoj sa fritom u donjem delu. Epruveta se vezuje za Prelude peptidni sintetizator i preko donjeg dela i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati preko vrha epruvete, što spira na dole strane epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati preko donjeg dela epruvete i propušteni preko frite kako bi kontaktirali smolu. Svi rastvori su uklonjeni preko donjeg dela epruvete. "Periodična agitacija" opisuje kratak puls N2gasa preko frite u donjem delu; puls traje pribiližno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Hloroacetil hloridni rastvori u DMF su korišćeni u okviru 24h od pripremanja. Aminokiselinski rastvori nisu generalno korišćeni preko tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor je korišćen u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Rink = (2,4-dimetoksifenil)(4-alkoksifenil)metanamin, gde "4-

12

alkoksi" opisuje opisuje poziciju i tip povezanosti za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Rink veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 mesh, 1% DVB, 0.56 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline su navedene ispod sa grupama koje štite bočne lance naznačenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

[3176] Procedure opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 178 mg Rink-Merrifield smole opisane ovde. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi peptidne sinteze počinju sa procedurom bubrenja smole, opisanom ispod kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja” opisan ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru dvostrukog kuplovanja" opisan ispod. Kuplovanje hloroacetilhlorida za N-terminus peptida je opisano pomoću “Procedure kuplovanja sa hloroacetil hloridom” opisane ispod.

Procedura bubrenja smole:

[3177] U polipropilensku posudu od 10 mL za reakciju u čvrstoj fazi je dodata Merrifield:Rink smola (178 mg, 0.100 mmol). Smola je oprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.0 mL), nakon čega je smeša periodično agitovana tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran preko frite.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[3178] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno

12

šest puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.4M u DMF, 1.0 mL, 4 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat anhidrid sirćetne kiseline (2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[3179] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodat piperdin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 3 minuta i zatim je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno šest puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.4M u DMF, 1.0 mL, 4 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana dva puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.4M u DMF, 1.0 mL, 4 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana dva puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. U

12

reakcioni sud je dodat anhidrid sirćetne kiseline (2.0 mL). Smeša je periodično agitovana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sa hloroacetil hloridom:

[3180] U reakcioni sud je dodat DIPEA (0.4M u DMF, 3.0 mL, 24 ekv), zatim hloroacetil hlorid (0.8M u DMF, 1.5 mL, 13.2 ekv). Smeša je periodično agitovana tokom 30 minuta, zatim rastvor je dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno tri puta kao što sledi: za svako pranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Smola je oprana uzastopno četiri puta kao što sledi: za svako pranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrhu posude (ne preko frite u donjem delu) i rezultujuća smeša je periodično agitovana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran preko frite. Rezultujuća smola je postavljen pod N2strujom tokom 15 minuta nakon čega je smola postala rigidna i laka za rukovanje.

Globalna procedura uklanjanja zaštite:

[3181] "Rastvor za uklanjanje zaštite" je pripremljen kombinovanjem u staklenoj bočici od 40 mL trifluorosirćetne kiseline (22 mL), fenola (1.325 g), vode (1.25 mL) i triizopropilsilana (0.5 mL). Smola je uklonjena iz reakcione posude i prebačena u staklenu bočicu od 4 mL. U bočicu je dodat "rastvor za uklanjanje zaštite" (2.0 mL). Smeša je snažno mešana u šejkeru (1000 RPM tokom 1 minuta, zatim 500 RPM tokom 1.5h). Smeša je filtrirana kroz filter za špric od 0.2 µ u 18X150 mm test epruvetu, i čvrste supstance su ektrahovane sa drugim delom "rastvora za uklanjanje zaštite" (1.0 mL). Kombinovani filtrati, u 18X150 mm test epruveti, su razblaženi sa Et2O (15 mL) nakon čega je značajna količina bele čvrste supstance precipitirala. Smeša je centrifugirana tokom 2 minuta, zatim rastvor je dekantiran. Čvrste supstance su suspendovane u Et2O (20 mL); smeša je centrifugirana tokom 5 minuta; i rastvor je dekantiran. Poslednji put, čvrste supstance su suspendovane u Et2O (20 mL); smeša je centrifugirana tokom 5 minuta; i rastvor je dekantiran.

Procedura ciklizacije:

12

[3182] Čvrste supstance su rastvorene u 20 mL MeCN:vod. 0.1M NH4OAc (1:1), i rastvor je pažljivo podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim ostavljen da odstoji (mešanje nije neophodno) preko noći (otpr.18h). 1 mL DMSO je dodat, i reakcioni rastvor je koncentrovan u SPEEDVAC® uparivaču sa centrifugom preko noći sa blagim zagrevanjem. Približno 1 mL MeOH je dodato u ostatak, i rezultujući rastvor je prečišćen pomoću metode opisane u pojedinačnim primerima.

Pripremanje (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-fenilpirolidin-2-karboksilne kiseline

[3183]

Korak 1:

[3184] U rastvor (2S,4R)-1-(terc-butoksikarbonil)-4-fenilpirolidin-2-karboksilne kiseline (1.20 g, 4.12 mmol) u CH2Cl2(20.59 ml) je dodata TFA (4.13 ml, 53.5 mmol). Rezultujući rastvor je mešan na st. Kada je analiza pomoću LC/MS pokazala da je reakcija kompletna, isparljive supstance su uklonjene u vakuumu, toluen (10 mL) je dodat, i isparljive supstance ponovo uklonjene.

Korak 2:

[3185] Ostatak iz Koraka 1 je prebačen u 1 M vod Na2CO3(24.71 ml, 24.71 mmol) sa ∼5 mL THF dodatog za solubilnost. FMOC-OSU (1.667 g, 4.94 mmol) je zatim dodat, i smeša mešana preko noći na st. Reakciona smeša je ektrahovana dva puta sa etrom (odbačena). pH je podešen do ∼2 sa dodavanjem 1 M HCl, i rezultujuća suspenzija ektrahovana tri puta u EtOAc. Kombinovani EtOAc ekstrakti su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani u

1

vakuumu. Sirova (2S,4R)-1-(((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-4-fenilpirolidin-2-karboksilna kiselina je korišćena kao takva za dalju hemiju.

Pripremanje Primera 13001

[3186]

[3187] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3188] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne

1 1

evaporacije. Prinos proizvoda je bio 32.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.42 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.62 min; ESI-MS(+) m/z 943.7 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 942.9543 (M+2H); Nađeno: 942.9517 (M+2H).

Pripremanje Primera 13002

[3189]

[3190] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3191] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

1 2

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 26.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 929.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 929.8 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 928.9331 (M+2H); Nađeno: 928.9306 (M+2H).

Pripremanje Primera 13003

[3192]

[3193] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

1

[3194] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 39.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 910.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.59 min; ESI-MS(+) m/z 910.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 909.9616 (M+2H); Nađeno: 909.9587 (M+2H).

Pripremanje Primera 13004 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3195]

1 4

[3196] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3197] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 3.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 968.2 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.55 min; ESI-MS(+) m/z 968.3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 967.9652 (M+2H); Nađeno: 967.9616 (M+2H).

Pripremanje Primera 13005 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3198]

1

[3199] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3200] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 939.6 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z 939.6 (M+2H), najobilniji jon.

1

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 938.9820 (M+2H); Nađeno: 938.9804 (M+2H).

Pripremanje Primera 13006 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3201]

[3202] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3203] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-45% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne

1

evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 28.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 1001.1 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(+) m/z 1001.1 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1000.4980 (M+2H); Nađeno: 1000.4955 (M+2H).

Pripremanje Primera 13007

[3204]

1

[3205] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3206] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 34.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 979.3 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.86 min; ESI-MS(+) m/z 979.7 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 978.9825 (M+2H); Nađeno: 978.9810 (M+2H).

Pripremanje Primera 13008

[3207]

1

[3208] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3209] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 31.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 965.3 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(+) m/z 965.7 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 964.9613 (M+2H); Nađeno: 964.9582 (M+2H).

1 1

Pripremanje Primera 13009 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3210]

[3211] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3212] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 946.5 (M+2H).

1 11

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z 946.5 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 945.9898 (M+2H); Nađeno: 945.9875 (M+2H).

Pripremanje Primera 13010

[3213]

[3214] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

[3215] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min.

1 12

Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 33.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 1008.3 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.75 min; ESI-MS(+) m/z 1008.3 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1007.5058 (M+2H); Nađeno: 1007.5027 (M+2H).

Pripremanje Primera 13011 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3216]

[3217] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

1 1

[3218] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 41.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 988.6 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 988.7 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 987.9778 (M+2H); Nađeno: 987.9758 (M+2H).

Pripremanje Primera 13012 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3219]

1 14

[3220] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.68 min; ESI-MS(+) m/z 974.8 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.90 min; ESI-MS(+) m/z 974.4 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 973.9565 (M+2H); Nađeno: 973.9538 (M+2H).

Pripremanje Primera 13013 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3221]

1 1

[3222] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu -[trans 4-(4-fluorobenzil)-L-prolin]-Trp-Ser-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Orn-Cys-Gly

[3223] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.69 min; ESI-MS(+) m/z 955.5 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.78 min; ESI-MS(+) m/z 955.8 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 954.9851 (M+2H); Nađeno: 954.9819 (M+2H).

1 1

Pripremanje Primera 13014 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3224]

[3225] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asp-Pro-His-Lys-[trans 4-(4-fluorobenzil)-L-prolin]- Trp-Lys-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Glu-Cys-Gly

[3226] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 18.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

1 1

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 1017.3 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.76 min; ESI-MS(+) m/z 1016.9 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1016.5011 (M+2H); Nađeno: 1016.4991 (M+2H).

Pripremanje Primera 14001 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3227]

Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu -[trans 4-fenil-L-prolin]-Trp-Ser-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Orn-Cys-Gly

[3228] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-

1 1

85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 940.2 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 939.6 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 938.9820 (M+2H); Nađeno: 938.9799 (M+2H).

Pripremanje Primera 14002 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3229]

[3230] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asp-Pro-His-Lys -[trans 4-fenil-L-prolin]- Trp-Lys-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Glu-Cys-Gly

1 1

[3231] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 51.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 1000.8 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.71 min; ESI-MS(+) m/z 1001.2 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1000.4980 (M+2H); Nađeno: 1000.4958 (M+2H).

Pripremanje Primera 14003 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3232]

1 2

[3233] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu-[trans 4-benziloksi-L-prolin]-Trp-Ser-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Orn-Cys-Gly

[3234] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 23.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 954.6 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.79 min; ESI-MS(+) m/z 954.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 14004

[3235]

1 21

[3236] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asp-Pro-His-Lys -[trans 4-benziloksi-L-prolin]-Trp-Lys-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Glu-Cys-Gly

[3237] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 35.6 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 1015.7 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 1016.2 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1015.5033 (M+2H); Nađeno: 1015.5008 (M+2H).

1 22

Pripremanje Primera 14005

[3238]

[3239] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-His-Glu-[trans-4-cikloheksil-L-prolin]-Trp-Dab-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Dab-Cys-Gly

[3240] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 24.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

1 2

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 975.0 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.87 min; ESI-MS(+) m/z 975.1 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 974.9982 (M+2H); Nađeno: 974.9954 (M+2H).

Pripremanje Primera 14006

[3241]

[3242] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asp-Pro-His-Glu-[trans-4-cikloheksil-L-prolin]-Trp-Dab-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Ala-Cys-Gly

[3243] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-

1 24

60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 29.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 961.3 (M+2H). Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.99 min; ESI-MS(+) m/z 961.4 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 960.9769 (M+2H); Nađeno: 960.9749 (M+2H).

Pripremanje Primera 14007 (ne u skladu sa pronalaskom)

[3244]

[3245] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu-[trans-4-cikloheksil-L-prolin]-Trp-Ser-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Orn-Cys-Gly

[3246] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

1 2

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 20.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.77 min; ESI-MS(+) m/z 942.8 (M+2H), najobilniji jon.

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.91 min; ESI-MS(+) m/z 942.8 (M+2H), najobilniji jon.

Pripremanje Primera 14008

[3247]

[3248] Peptid koji sledi je sintetisan u skladu procedurama iznad. Podvučeni koraci su koristili proceduru dvostrukog kuplovanja.

ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asp-Pro-His-Lys-[trans-4-cikloheksil-L-prolin]-Trp-Lys-Trp-[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Glu-Cys-Gly

1 2

[3249] Nakon uklanjanja zaštite i ciklizacije u skladu sa procedurama iznad, jedinjenje je prečišćeno kao što sledi:

Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B tokom 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je bio 21.7 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Analiza Uslov A: Vreme zadržavanja = 1.74 min; ESI-MS(+) m/z 1003.9 (M+2H).

Analiza Uslov B: Vreme zadržavanja = 2.74 min; ESI-MS(+) m/z 1004.2 (M+2H), najobilniji jon.

ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 1003.5215 (M+2H); Nađeno: 1003.5189 (M+2H).

PRIMER 120 – METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA DA KOMPETIRAJU ZA VEZIVANJE PD-1 ZA PD-L1 KORIŠĆENJEM ESEJA VEZIVANJA SA HOMOGENOM VREMENSKI-RAZLOŽENOM FLUORESCENCOM (HOMOGENOUS TIME-RESOLVED FLUORESCENCE -HTRF)

[3250] Sposobnost makrocikličnih peptida iz predmetne objave da se veže za PD-L1 je ispitan korišćenjem eseja vezivanja PD-1/PD-L1 sa homogenom vremenski-razloženom fluorescencom (HTRF). Shematski prikaz ovog eseja je obezbeđen na Slici 1.

Metode

[3251] Eseji vezivanja sa homogenom vremenski-razloženom fluorescencom (HTRF) solubilnog PD-1 za solubilni PD-L1. Solubilni PD-1 i solubilni PD-L1 odnosi se na proteine sa skraćenjima karboksil-kraja koji uklanjaju transmembranske-prelazeće regione i koji su fuzionisani za heterologne sekvence, specifično Fc deo humane immunoglobulinske G sekvence (Ig) ili heksahistidinske epitopske oznake (His). Sve studije vezivanja su izvedene u

1 2

puferu za HTRF esej koji se sastoji od dPBS obogaćenog sa 0.1% (m/v) goveđim serum albuminom i 0.05% (v/v) Tween-20. Za esej vezivanja PD-1-Ig/PD-L1-His, inhibitori su prethodno inkubirani sa PD-L1-His (10 nM finalno) tokom 15m u 4 µl pufera za esej, praćeno dodavanjem PD-1-Ig (20 nM finalno) u 1 µl pufera ze esej i daljom inkubacijom tokom 15m. PD-L1 fuzioni proteini iz ili čoveka, cinomolgus makaka, ili miša su korišćeni. HTRF detekcija je postignuta korišćenjem europijum kripat-obeleženog anti-Ig monoklonsko antitela (1 nM finalno) i alofikocijanin (APC) obeleženog anti-His monoklonskog antitela (20 nM finalno). Antitela su razblažena u puferu za detekciju HTRF i 5 µl je raspodeljeno na vrhu reakcije vezivanja. Reakcija je ostavljena da ekvilibriše tokom 30 minuta i signal (665nm/620nm odnos) je dobijen korišćenjem EnVision fluorometera. Dodatni eseji vezivanja su uspostavljeni između PD-1-Ig/PD-L2-His (20 i 5 nM, redom), CD80-His/PD-L1-Ig (100 and 10 nM, redom) i CD80-His/CTLA4-Ig (10 i 5 nM, redom). Studije kompeticije između biotinilovanog Jedinjenja br. 71 i humanog PD-L1-His su izvedene kao što sledi. Inhibitori makrocikličnih peptida su prethodno inkubirani sa PD-L1-His (10 nM finalno) tokom 60 minuta u 4 µl pufera ze esej praćeno dodavanjem biotinilovanog Jedinjenja br.71 (0.5 nM finalno) u 1 µl pufera za esej. Vezivanje je dozvoljeno da ekvilibriše tokom 30 minuta praćeno dodavanjem europijum kripatom obeleženog Streptavidina (2.5 pM finalno) i APC-obeleženog anti-His (20 nM finalno) u 5 µl HTRF pufera. Reakcija je ostavljena da ekvilibriše tokom 30m i signal (665nm/620nm odnos) je dobijen korišćenjem EnVision fluorometra.

[3252] Rekombinantni Proteini. Karboksil-skraćeni humani PD-1 (Aminokiseline 25-167) sa C-terminalnom humanom Ig epitopskom oznakom [hPD-1 (25-167)-3S-IG] i humani PD-L1 (Aminokiseline 18-239) sa C-terminalnom His epitopskom oznakom [hPD-L1(19-239)-mesto proteaznog cepanja virusa šarenila nerava duvana (TVMV)-His] su eksprimirani u HEK293T ćelijama i prečišćeni sekvencijalno pomoću rProteinA afinitetne hromatografije i ekskluzione hromatografije po veličini. Humani PD-L2-His (Sino Biologicals), CD80-His (Sino Biologicals), CTLA4-Ig (RnD Systems) su svi dobijeni preko komercijalnih izvora.

Sekvenca rekombinantnog humanog PD-1-Ig

1 2

Sekvenca rekombinantnog humanog PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)

[3255] Rezultati su prikazani u Tabeli 6. Kao što je prikazano, makrociklični peptidi iz predmetne objave su pokazali potentnu inhibiciju aktivnosti vezivanja PD-1-Ig za PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His).

Tabela 6

1 2

PRIMER 121 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI VARIJANTNIH MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA JEDINJENJA BR. 99 DA SE VEŽU ZA PD-L1 KORIŠĆENJEM ESEJA VEZIVANJA SA HOMOGENOM VREMENSKI-RAZLOŽENOM FLUORESCENCOM (HTRF)

[3256] Sposobnost varijantnih makrocikličnih peptida za peptid Jedinjenja br.99 iz predmetne objave da inhibiraju vezivanje PD-1-Ig vezivanja za PD-L1-His je ispitana u cilju da se uspostave odnosi struktura aktivnost.

[3257] HTRF Eksperimenti su izvedeni u suštini kao što je opisano supra. Varijantni makrociklični peptidi su kreirani kao što je opisano ovde.

[3258] Rezultati su prikazani u Tabeli 7. Rezultati za svaki parentalni makrociklični peptid iz drugih tabela su uključeni u ovu tabelu za svrhe poređenja. Kao što je prikazano, varijantni makrociklični peptidi iz predmetne objave pokazali su potentnu inhibiciju PD-1-Ig vezivanja za PD-L1 i regioni u kojima je aktivnost osetljiva i otporna na varijaciju su identifikovani.

Tabela 7 - Varijantni makrociklični peptidi Jedinjenja br.99

1

PRIMER 122 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI VARIJANTNIH MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA JEDINJENJA BR. 1 DA INHIBIRAJU VEZIVANJE PD-1 ZA PD-L1 KORIŠĆENJEM ESEJA VEZIVANJA SA HOMOGENOM VREMENSKI-RAZLOŽENOM FLUORESCENCOM (HTRF)

[3259] Sposobnost varijantnih makrocikličnih peptida Jedinjenja br.1 iz predmetne objave da inhibiraju vezivanje PD-1 za PD-L1 je ispitana kako bi se uspostavili odnosi struktura aktivnost.

[3260] HTRF Eksperimenti su izvedeni u suštini kao što je opisano supra. Varijantni makrociklični peptidi su kreirani kao što je opisano ovde.

1 1

[3261] Rezultati su prikazani u Tabeli 8. Rezultati za svaki parentalni makrociklični peptid iz drugih tabela su uključeni u ovoj tabeli za svrhe poređenja. Kao što je prikazano, varijantni makrociklični peptidi iz predmetne objave pokazali su potentnu inhibiciju PD-1 vezivanja za PD-L1 i regioni osetljivi i otporni na varijaciju su identifikovani.

Tabela 8 - Varijantni makrociklični peptidi Jedinjenja br.1

1 2

1

1 4

PRIMER 123 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI VARIJANTNIH MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA JEDINJENJA BR. 71 DA INHIBIRAJU VEZIVANJE PD-1 ZA PD-L1 KORIŠĆENJEM ESEJA VEZIVANJA SA HOMOGENOM VREMENSKI-RAZLOŽENOM FLUORESCENCOM (HTRF)

[3262] Sposobnost varijantnih makrocikličnih peptida Jedinjenja br. 71 iz predmetne objave da inhibiraju vezivanje PD-1 za PD-L1 je ispitano kako bi se uspostavili odnosi struktura aktivnost.

[3263] HTRF eksperimenti su izvedeni u suštini kao što je opisano supra. Varijantni makrociklični peptidi su kreirani kao što je opisano ovde.

[3264] Rezultati su prikazani u Tabeli 9. Rezultati za svaki parentalni makrociklični peptid iz drugih tabela su uključeni u ovu tabelu za svrhe poređenja. Kao što je prikazano, varijantni makrociklični peptidi iz predmetne objave pokazali su potentnu inhibiciju PD-1 vezivanja za PD-L1 i regioni osetljivi i otporni na varijaciju su identifikovani.

Tabela 9

1

PRIMER 124 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI VARIJANTNIH MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA JEDINJENJA BR. 116 DA SE VEŽU ZA PD-L1 KORIŠĆENJEM ESEJA VEZIVANJA SA HOMOGENOM VREMENSKI-RAZLOŽENOM FLUORESCENCOM (HTRF)

[3265] Sposobnost varijantnih makrocikličnih peptida Jedinjenja br.116 iz predmetne objave da se vežu za PD-L1 je ispitano kako bi se uspostavili odnosi struktura aktivnost.

1

[3266] HTRF Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano supra. Varijantni makrociklični peptidi su kreirani kao što je opisano ovde.

[3267] Rezultati su prikazani u Tabeli 10. Rezultati za svaki parentalni makrociklični peptid iz drugih tabela su uključeni u ovu tabelu za svrhe poređenja. Kao što je prikazano, varijantni makrociklični peptidi iz predmetne objave pokazali su potentnu aktivnost vezivanja za PD-L1 i regioni osetljivi i otporni na varijaciju su identifikovani.

Tabela 10 - Varijantni makrociklični peptidi Jedinjenja br.116

PRIMER 125 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA DA POSPEŠE SEKRECIJU INTERFERONA GAMA (IFNγ) □ U TESTU ZA FUNKCIJU T ĆELIJA SPECIFIČNIH ZA CITOMEGALOVIRUS (CMV)

[3268] Sposobnost makrocikličnih peptida iz predmetne objave da promovišu sekreciju IFNγ □ od strane CMV-specifičnih T ćelija na dozno-zavistan način je ispitana.

Metode

[3269] Test funkcije CMV-specifičnih T ćelija. Mononuklearne ćelije periferne krvi iz donora koji je seropozitivan za CMV (PBMC, Astarte Biologics, Redmond, Vašington) su kultivisane u 2.5 x 10<5>ćelija/bunariću u pločama sa 96 bunarića sa ravnim dnom koje su tretirane tkivnim kulturama (TC), u prisustvu 0.5µg/mL CMV+ ćelijski lizat (Microbix Biosystems, Misisoga, Ontario) sa ili bez povećavanja koncentracije anti-PD-L1 antitela ili naznačenih makrocikličnih peptida. AIM-V medijum (Life Technologies, Grand Island, Njujork) obogaćen sa 10% toplotom-inaktivisanim fetalnim goveđim serumom (FBS, Sigma, St Luis, Misuri) je korišćen

1

pri ukupnoj zapremini od 200µL/bunariću u triplikatu. Ćelije su kultivisane tokom 4 dana na 37 °C, 5% CO2u koje vreme supernatant kulture je pokupljen za određivanje sekretovanog IFNγ pomoću ELISA (OptEIA hIFNγ ELISA Kit, BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija).

[3270] Kao što je prikazano na slikama 10A-C, anti-PD-Ll antitelo i peptidi su oboje pokazani da pospešuju IFNy sekreciju od strane CMV-specifičnih T ćelija na dozno-zavistan način. Najsnažniji odgovor je generisan od strane antitela usmerenog na PD-L1 (MDX-1105, EC500.6nM) praćeno sa Jedinjenjem br. 71 (EC50300nM), Jedinjenjem br. 1 (EC50400nM), Jedinjenjem br. 2 (EC50400nM), i Jedinjenjem br. 99 (EC50>10,000 nM). Ovi rezultati pokazuju da PD-L1 vezivanje za inhibitore makrocikličnih peptida mogu da poboljšaju oslobađanje IFNy u populaciji memorijskih T ćelija generisanoj iz prethodnog izlaganja upornom antigenu.

PRIMER 126 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA DA POSPEŠE SEKRECIJU IFNγ U ESEJU ZA FUNKCIJU HIV-SPECIFIČNIH T ĆELIJA

[3271] Sposobnost makrocikličnih peptida iz predmetne objave da pospeše sekreciju IFNy od strane HIV-specifičnih T ćelija na dozno-zavistan način je ispitana.

Metode

[3272] Esej funkcije HIV-specifičnih T ćelija. Humane PBMC (Bioreclamation LLC, Vestberi, Njujork) izvedene iz viremičnih HIV+ donora u hroničnoj fazi infekcije su kultivisane u 2.0 x 10<6>ćelija/bunariću u TC-tretiranim pločana sa 48 bunarića. Ćelije su stimulisane sa HIV-Gag (kapsid, Gag = antigen specifičan za grupu) peptidnom bibliotekom (ProImmune, Sarasota, Florida) koja se sastoji od 6 pulova od 20 preklapajućih peptida (15-meri koji se preklapaju za 11 ostataka) svaki. Finalna koncentracija u kulturi je bila 2µg/mL po peptidu. HIV-Gag antigenska stimulacija je izvedena /- anti-PD-Ll antitelo(0.1µM finalno) ili peptid Jedinjenje br. 71 (7.5µM finalno). RPMI medijum (Life Technologies, Grand Island, Njujork) obogaćen sa 10% toplotom-inaktivisanim FBS (Sigma, Sent Luis, Misuri) i 10 U/ml rIL-2 (Peprotech, Roki Hil, Njujork) je korišćen pri ukupnoj zapremini od 1mL/bunariću. Ćelije su kultivisane tokom 6 dana na 37 °C, 5% CO2u koje vreme su kulture oprane i ponovo stimulisane u anti-IFNγ□ obloženim ELISpot pločama (hIFNγ□ELISpot PRO Kit, Mabtech, Mariemont, Ohajo)

1

tokom 18 sati na 37 °C, 5% CO2. Za re-stimulaciju, in vitro raširene ćelije su kultivisane u 2.0 x 10<5>ćelija/bunariću u RPMI medijumu lišenom rIL-2 pri ukupnoj zapremini od 100µL/bunariću. Finalne koncentracije HIV-Gag antigena i anti-PD-Ll inhibitora su iste kao što je navedeno iznad. ELISpot ploče su osušene na vazduhu tokom 5 dana i pročitane korišćenjem ImmunoSpot S6 Fluorospot analizatora (C.T.L., Šejker Hajts, Ohajo).

[3273] Kao što je prikazano na Slici 2, anti-PD-Ll antitelo i peptidi su i jedno i drugo prikazani da pospešuju IFNγ □ sekreciju od strane HIV-specifičnih ćelija na dozno-zavistan način. Srednja vrednost IFNy ćelija koje formiraju mrlju (SFC) po bunariću je izračunata iz bunarića u duplikatu i bilo koja pozadina prisutna u nestimulisanim bunarićima (< 25 SFC) je oduzeta. Podaci su prikazani kao faktor povećanja u odnosu na DMSO kontrolni tretman. Anti-PD-Ll antitelo i peptid oboje pojačavaju IFNγ sekreciju od strane HIV-specifičnih T ćelija koje odgovaraju na najmanje 1 od 6 HIV-Gag antigenskih pulova. Ovi rezultati pokazuju da PD-L1 vezivanje sa peptidnim inhibitorom mogu da pojačaju IFNγ oslobađanje iz T ćelijske populacije koja odgovara na tekuću hroničnu viralnu infekciju, slično anti-PD-Ll antitelu.

PRIMER 127 - METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA DA SE VEŽU ZA PD-L1 U ESEJIMA ĆELIJSKOG VEZIVANJA

[3274] Sposobnost makrocikličnih peptida iz predmetne objave da se vežu za Jurkat, mišju B ćelijsku liniju (LK35.2), i humanu ćelijsku liniju adenokarcinoma pluća (L2987) je ispitana.

Metode

[3275] Esej vezivanja Jurkat-PD-1 ćelija. Fikoeritrin (PE) je kovaletno vezan za Ig epitopsku oznaku humanog PD-L1-Ig i fluorescentno-obeležen PD-L1-Ig je korišćen za studije vezivanja sa Jurkat ćelijskom linijom humanog koja prekomerno eksprimira humani PD-1 (Jurkat-PD-1). Ukratko, rekombinantni PD-L1-Ig (10 nM finalno) je prethodno inkubiran sa inhibitorima tokom 15m u zapremini od 30 µl RPMI obogaćenog sa 2% fetalnim telećim serumom. 1x105 Jurkat-PD-1 ćelija je raspoređeno na vrhu PD-L1-Ig i inhibitora u 20 µl RPMI obogaćenog sa 2% fetalnim telećim serumom i vezivanje je dopušteno da se odigra tokom 1h na sobnoj temperaturi. Ćelije su oprane 3x u dPBS. Ćelije su ponovo suspendovane u 200 µl dPBS i vezivanje je izmereno pomoću protočne citometrije.

1

[3276] Esej vezivanja LK35.2-hPD-L1 ćelija. Fikoeritrin (PE) je kovalentno vezan za Ig eptitopsku oznaku humanog PD-1-Ig i fluorescentno-obeležen PD-1-Ig je korišćen za studije vezivanja sa mišjom B ćelijskom linijom (LK35.2) koja stabilno eksprimira humani PD-L1 (LK35.2-hPD-L1). Ukratko, 1x105 LK35.2-hPD-L1 ćelija je prethodno inkubirano sa inhibitorom tokom 15m u zapremini od 30 µl RPMI obogaćenog sa 2% fetalnim telećim serumom. 20 µl PE-obeleženi PD-1-Ig (2 nM finalno) , razblažen u RPMI obogaćen sa 2% fetalnim telećim serumom, je raspoređen na vrhu ćelija i inhibitora i vezivanje je dopušteno da se odigra tokom 1h na sobnoj temperaturi. Ćelije su oprane 3x u dPBS. Ćelije su ponovo suspendovane u 200 µl dPBS i vezivanje je izmereno pomoću protočne citometrije.

[3277] L2987 Cellomics esej ćelijskog vezivanja. Fikoeritrin (PE) je kovalentno vezan za Ig epitopsku oznaku humanog PD-1-Ig i fluorescentno-obeležen PD-1-Ig je korišćen za studije vezivanja sa humanom ćelijskom linijom adenokarcinoma pluća (L2987) koja prirodno eksprimira PD-L1. Ukratko, 12,000 L2987 ćelija je zasađeno u prozirne ploče sa 96 bunarića sa prozirnim dnom u 50 µl DMEM obogaćenog sa 5% fetalnim telećim serumom. Sledeći dan, inhibitori su razblaženi u DMEM bez seruma i 25 µl je rapoređeno na vrhu ćelija. Nakon 15m inkubacije, sPD-1-Ig (30 nM finalno) je raspoređeno na vrhu ćelija i inhibitora u 25 µl DMEM bez seruma. Uzorci su inkubirani tokom 1h na 37 °C praćeno sa 2 ispiranja u dPBS i fiksacijom tokom 30m sa 4% paraformaldehidom. Uzorci su dalje isprani 2x u dPBS. Hoechst (final 1 µg/ml) je dodat u finalno ispiranje kako bi se obojili nukleusi. Ploče su obrađene korišćenjem Cellomics ARRAYSCAN®.

[3278] Rezultati su prikazani na Slikama 2 do 9. Kao što je prikazano, reprezentativni makrociklični peptidi iz predmetne objave su sposobni da za svaku od Jurkat, mišje B ćelijske linije (LK35.2), i humane ćelijske linije adenokarcinoma pluća (L2987) koje su testirane. Pored toga, PD-L1 makrociklični peptidi su izgledali da se vezuju za isto vezujuće mesto od PD-L1 kao međusobno kao i interno razvijeno anti-PD-Ll monoklonsko antitelo.

[3279] Dodatni rezultati eseja ćelijskog vezivanja za seriju peptida Jedinjenja br.99, Jedinjenja br. 1, i Jedinjenja br.71 su prikazani u Tabelama 11 do 13, redom.

Tabela 11 – Podaci za ćelijsko vezivanje za seriju peptida Jedinjenja br.99

1 4

Tabela 12 - Podaci za ćelijsko vezivanje za seriju peptida Jedinjenja br.1

1 41

142

Tabela 13 - Podaci za ćelijsko vezivanje za seriju peptida Jedinjenja br.71

1 4

PRIMER 128

Metode

[3280] Skrining esej vezivanja LK35.2-hPD-L1 ćelija sa visokim sadržajem. Fikoeritrin (PE) je kovalentno vezan za Ig epitopsku oznaku humanog PD-1-Ig i fluorescentno-obeležen PD-1-Ig je korišćen za studije vezivanja sa mišjom B ćelijskom linijom (LK35.2) koja stabilno eksprimira humani PD-L1 (LK35.2-hPD-L1). Ukratko, 3x10<3>LK35.2-hPD-L1 ćelija je zasađeno u ploče sa 384 bunarića u 20 µl RPMI obogaćenog sa 10% fetalnim telećim serumom i kultivisano preko noći. 125 nl jedinjenja je dodato u ćelije, praćeno sa 5 µl PE-obeleženog PD-1-Ig (1 nM finalno), razblaženog u RPMI obogaćenog sa 10% fetalnim telećim serumom, praćeno sa inkubacijom na 37°C tokom 1h. Ćelije su oprane 3x u 100 µl dPBS praćeno sa fiksacijom sa 30 µl 4% paraformaldehida u dPBS koji sadrži 10 µg/ml Hoechst 33342 tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su oprane 3x u 100 µl dPBS praćeno sa finalnim dodavanjem 15 µl dPBS. Podaci su sakupljeni i obrađeni korišćenjem skenera visokog sadržaja Cell Insight NXT High Content Imager and i povezanog softvera.

[3281] Skrining esej vezivanja 293T-hPD-L1 ćelija visokog sadržaja. Fikoeritrin (PE) je kovalentno vezan za Ig epitopsku oznaku humanog PD-1-Ig and fluorescentno-obeležen PD-1-Ig je korišćena za studije vezivanja sa humanom embrionskom ćelijskom linijom bubrega (293T) koja stabilno eksprimira humani PD-L1 (293T-hPD-L1). Ukratko, 2x10<3>293T-hPD-L1 ćelija je zasađeno u ploče sa 384 bunarića u 20 µl DMEM obogaćenog sa 10% fetalnim telećim serumom i kultivisano preko noći.125 nl jedinjenja je dodato u ćelije praćeno sa 5 µl PE-obeleženog PD-1-Ig (0.5 nM finalno), razblaženog u DMEM obogaćenog sa 10% fetalnim telećim serumom, praćeno sa inkubacijom na 37°C tokom 1h. Ćelije su oprane 3x u 100 µl

1 44

dPBS praćeno sa fiksacijom sa 30 µl 4% paraformaldehida u dPBS koji sadrži 10 µg/ml Hoechst 33342 tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su oprane 3x u 100 µl dPBS praćeno sa finalnim dodavanjem 15 µl dPBS. Podaci su sakupljeni i obrađeni korišćenjem skenera visokog sadržaja Cell Insight NXT High Content Imager i povezanog softvera.

Tabela 14

1 4

14

14

14

14

1

1 1

1 2

1

1 4

1

1

1

1

1

1

1 1

1 2

1

1 4

1

1

1

1

1

1

1 1

1 2

1

1 4

1

1

1

1

1

1

1 1

1 2

1

1 4

1

1

1

1

1

1

1 1

1 2

1

1 4

1

1

1

1

1

14

141

142

14

144

14

14

[3282] Brojne modifikacije i varijacije predmeta koji je opisan i za koji se traži zaštita ovde su moguće u svetlu gorenavedenih učenja. Stoga se razume da unutar obima priloženih patentnih zahteva, predmet koji je naveden u patentnim zahtevima se može praktikovati drugačije nego što je ovde posebno opisano.

14

14

��

141

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje odabrano od:

   141

   141

   141

   141

   141

   ı42

   ı42

   ı42

   ı42

   ı42

   ı42

   ��

   141

   ı42

   ��

   ı44

   ��

   ��

   ��

   ��

   ��

   ı44

   ı44

   ı44

   ı44

   ı44

   ı44

   ı44

   ��

   141

   ı42

   ��

   ı44

   ��

   ��

   ��

   ��

   ��

   ��

   141

   ı42

   ��

   ı44

   ��

   ��

   ��

   ��

   ��

   ��

   141

   ı42

   ��

   ı44

   ��

   ��

   i 14

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih u skladu sa patentnim zahtevom 1 za primenu u poboljšavanju, stimulisanju, i/ili povećavanju imunog odgovora kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
3. 3. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 2 sa dodatnim agensom pre, nakon, ili simultano sa makrocikličnim peptidom ili peptidima opisanim ovde.
4. 4. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 3 gde dodatni agens je antimikrobni agens, antivirusni agens, citotoksični agens, i/ili modifikator imunog odgovora.
5. 5. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih u skladu sa bilo kojim od patentnog zahteva 1 za primenu u inhibiranju rasta, proliferacije, ili metastaze kancerskih ćelija kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
6. 6. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 5 gde kancer je odabran od melanoma, karcinoma bubrežnih ćelija, skvamoznog nesitnoćelijskog kancera pluća (squamous non-small cell lung cancer - NSCLC), neskvamoznog NSCLC, kolorektalnog kancera, kancera prostate rezistentnog na kastraciju, 14 kancera ovarijuma, kancera želuca, hepatocelularnog karcinoma, pankreasnog karcinoma, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, karcinoma jednjaka, gastrointestinalnog trakta i dojke, i hematološkog maligniteta.
7. 7. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih u skladu sa patentnim zahtevom 1 za primenu u lečenju infektivne bolesti kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
8. 8. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 7 gde infektivna bolest je uzrokovana virusom.
9. 9. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 8 gde virus je odabran od HIV-a, Hepatitisa A, Hepatitisa B, Hepatitisa C, herpes virusa, i influence.
10. 10. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih u skladu sa patentnim zahtevom 1 za primenu u lečenju septičkog šoka kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
11. 11. Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljiva so istih u skladu sa patentnim zahtevom 1 za primenu u blokiranju interakcije PD-L1 sa PD-1 i/ili CD80 kod subjekta. 14