JP7122255B2 - Pd-1/pd-l1およびcd80/pd-l1のタンパク質/タンパク質の相互作用の大環状阻害剤 - Google Patents
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Description
本願は、2016年4月5日付け出願の米国仮特許出願(出願番号62/318,417)の利益を主張する、2017年3月31日付け出願の米国非仮特許出願15/475,227の優先権を主張し、それらの内容はすべて、出典を明示することで本明細書に組み込まれるものとする。
本開示は、PD-1/PD-L1およびCD80/PD-L1のタンパク質/タンパク質の相互作用を阻害し、かくして、がんおよび感染疾患を含む、種々の疾患を改善するのに有用である、新規な大環状ペプチドを提供する。
Aは、結合手、
ここで:
zは0、1または2であり;
wは1または2であり;
nは0または1であり;
mは1または2であり;
m’は0または1であり;
pは0、1または2であり;
Rxは、水素、アミノ、ヒドロキシ、およびメチルより選択され;
R14およびR15は、水素およびメチルより独立して選択され;
Rzは、水素および-C(O)NHR16より選択され;ここでR16は水素、-CHR17C(O)NH2、-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NH2、および-CHR17C(O)NHCHR18C(O)NHCH2C(O)NH2より選択され;ここでR17は水素および-CH2OHより選択され、R18は水素およびメチルより選択され;
Rvは、水素または天然アミノ酸側鎖であり;
Rc、Rf、Rh、Ri、Rm、およびRnは、水素であり;
Ra、Re、Rj、およびRkは、水素およびメチルより、各々独立して、選択され;
R10はインドリルC1-C3アルキルであり、ここで該インドリル部は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニルC1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、シアノ、ハロC1-C3アルコキシ、ハロC1-C3アルキル、ヘテロアリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヘテロアリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3アルキル、およびテトラゾリルC1-C3アルキルより選択される1個の基で、またはC1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニルC1-C3アルキル、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、C3-C6シクロアルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ハロ、ハロC1-C3アルコキシ、ハロC1-C3アルキル、ヘテロアリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヘテロアリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3アルキル、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される2個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10はアザインドリルC1-C3アルキルであり、ここで該アザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニルC1-C3アルキル、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、C3-C6シクロアルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ハロ、ハロC1-C3アルコキシ、ハロC1-C3アルキル、ヘテロアリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヘテロアリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3アルキル、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより独立して選択される1または2個の別の基で置換され、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10は-(CH2)nQ’であり、ここでnは1-3であり、Q’は1、2、3または4個の窒素原子を含有する5,6員-縮合した飽和または不飽和の環系であり、該環系は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニルC1-C3アルキル、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、C3-C6シクロアルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ハロ、ハロC1-C3アルコキシ、ハロC1-C3アルキル、ヘテロアリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヘテロアリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3アルキル、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい:ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基であるか;または
R10は-(CH2)nZ’であり、ここでnは1-3であり、Z’は1、2、3または4個の窒素原子を含有する6,6員-縮合した飽和または不飽和の環系であり、該環系は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニルC1-C3アルキル、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、アリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、C3-C6シクロアルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ハロ、ハロC1-C3アルコキシ、ハロC1-C3アルキル、ヘテロアリールS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヘテロアリールC1-C3アルキルS(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NRpRq、(NRpRq)C1-C3アルキル、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2、または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよく;
RpおよびRqは、水素、およびC1-C6アルキルより独立して選択され;
R13は、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、および-(C(R17a)2)2-X-R30、-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’-X-R31、-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H、および-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2Hより選択され;
w’は2または3であり;
n’は1-6であり;
m’は0-5であり;
Xは1~172個の原子の鎖であり、該原子は炭素および酸素より選択され、ここで該鎖はその中に埋め込まれた-NHC(O)NH-、および-C(O)NH-より選択される1、2、3または4個の基を含有してもよく;該鎖は-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2、および-(CH2)CO2Hより独立して選択される1~6個の基で所望により置換されてもよく;
X’は1~172個の原子の鎖であり、該原子は炭素および酸素より選択され、ここで該鎖はその中に埋め込まれた-NHC(O)NH-、および-C(O)NH-より選択される1、2、3または4個の基を含有してもよく;該鎖は-CO2H、-C(O)NH2、および-CH2CO2Hより独立して選択される1~6個の基で所望により置換されてもよい:ただし、X’は置換されていないPEG以外の基であり;
R30は、-CO2H、-C(O)NRwRx、および-CH3より選択され、ここでRwおよびRxは、水素およびC1-C6アルキルより独立して選択される:ただし、Xのすべてが炭素である場合、R30は-CH3以外の基であり;
R31は-CO2H、-C(O)NRwRx、-CH3、アレクサ(alexa)-5-SDP、およびビオチン(biotin)であり;
R17aは、各々、水素、C1-C6アルキル、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2Hより独立して選択され;
R17は、各々、水素、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C≡CH、および-(CH2)z-トリアゾリル-X-R35より独立して選択され、ここでzは1-6であり、R35は、-CO2H、-C(O)NRwRx、CH3、ビオチン、-2-フルオロピリジン、-C(O)-(CH2)2-C(O)O-ビタミンE、-C(O)O-ビタミンE、および
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11、およびR12は、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖より独立して選択されるか、あるいは下記に示されるように対応する近接のR基と一緒になって環を形成し;
ReおよびRkは、各々、対応する近接のR基と、それらが結合する原子とが一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールより選択される、環を形成することができ;ここで各環は、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシより独立して選択される1~4個の基で所望により置換されてもよく;
Rbは、メチルであるか、またはRbとR2は、それらの結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールより選択される環を形成し;ここで各環はアミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシより独立して選択される1~4個の基で所望により置換されてもよく;
Rdは、水素またはメチルであるか、またはRdとR4は、それらの結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールより選択される環を形成し得;ここで各環は、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、ヒドロキシ、およびフェニルより独立して選択される1~4個の基で所望により置換されてもよく;
Rgは、水素またはメチルであるか、またはRgとR7は、それらの結合する原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、およびテトラヒドロチアゾールより選択される環を形成し得;ここで各環は、アミノ、ハロ基で所望により置換されてもよいベンジル、ベンジルオキシ、シアノ、シクロヘキシル、メチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ基で所望により置換されてもよいイソキノリニルオキシ、ハロ基で所望により置換されてもよいキノリニルオキシ、およびテトラゾリルより独立して選択される1~4個の基で所望により置換されてもよく;ならびに、ピロリジンおよびピペリジン環は、所望により、シクロヘキシル、フェニル、またはインドール基と縮合してもよく;および
RLはメチルであるか、またはRLとR12は、それらの結合する原子と一緒になって、アゼチジンおよびピロリジンより選択される環を形成し、ここで各環は、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、およびヒドロキシより独立して選択される1~4個の基で所望により置換されてもよい]
で示される化合物、またはその医薬的に許容される塩を提供する。
R13が、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;および
R10が、インドリルC1-C3アルキルであり、ここで該インドリル部は(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C1-C6アルコキシ、シアノ、およびテトラゾリルC1-C3アルキルより選択される1個の基で、またはC1-C6アルコキシ、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される2個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;または
R10がアザインドリルC1-C3アルキルであり、該アザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部がカルボキシC1-C3アルキルで置換され、所望によりC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1または2個の別の基で置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10が-(CH2)nQ’であり、ここでnは1-3であり、Q’は2、3または4個の窒素原子を含有する5,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよい;ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基であるか;または
R10が-(CH2)nZ’であり、ここでnは1-3であり、Z’は、1、2、3または4個の窒素原子を含有する6,6員-縮合した飽和または不飽和の環系であり、該環系は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2、または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい
化合物を提供する。
R13が天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R10がインドリルC1-C3アルキルであり、該インドリル部は(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C1-C6アルコキシ、シアノ、およびテトラゾリルC1-C3アルキルより選択される1個の基で、あるいはC1-C6アルコキシ、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される2個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10がアザインドリルC1-C3アルキルであり、該アザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部はカルボキシC1-C3アルキルで置換され、所望によりC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1または2個の別の基で置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10が-(CH2)nQ’であり、ここでnは1-3であり、Q’は2、3または4個の窒素原子を含有する5,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい:ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基であるか;または
R10が-(CH2)nZ’であり、ここでnは1-3であり、Z’は1、2、3または4個の窒素原子を含有する6,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよく;および
Aが
化合物を提供する。
R13が天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R10がインドリルC1-C3アルキルであり、該インドリル部は(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C1-C6アルコキシ、シアノ、およびテトラゾリルC1-C3アルキルより選択される1個の基で、またはC1-C6アルコキシ、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される2個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10がアザインドリルC1-C3アルキルであり、該アザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部はカルボキシC1-C3アルキルで置換され、所望によりC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1または2個の別の基で置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10が-(CH2)nQ’であり、ここでnは1-3であり、Q’は2、3または4個の窒素原子を含有する5,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよい:ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基であるか;または
R10が-(CH2)nZ’であり、ここでnは1-3であり、Z’は1、2、3または4個の窒素原子を含有する6,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよく;
Aが
wが1であり;
zが0であり;
Rzが-C(O)NHR16であり;
ここで、R16が水素および-CHR17C(O)NH2(ここでR17が水素である)より選択される、
化合物を提供する。
R13が天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R10がインドリルC1-C3アルキルであり、該インドリル部は(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C1-C6アルコキシ、シアノ、およびテトラゾリルC1-C3アルキルより選択される1個の基で、またはC1-C6アルコキシ、C1-C3アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される2個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10がアザインドリルC1-C3アルキルであり、該アザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部はカルボキシC1-C3アルキルで置換され、所望によりC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1または2個の別の基で置換されてもよく、ここで該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよいか;
R10が-(CH2)nQ’であり、ここでnは1-3であり、Q’は2、3または4個の窒素原子を含有する5,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよい:ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基であるか;または
R10が-(CH2)nZ’であり、ここでnは1-3であり、Z’は1、2、3または4個の窒素原子を含有する6,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、該環系はC1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1、2または3個の基で所望により置換されてもよく、ここで該フェニルC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよく;
Aが
wが1であり;
zが0であり;
Rzが-C(O)NHR16であり;
ここで、R16が水素および-CHR17C(O)NH2(ここでR17は水素である)より選択され;
RdおよびR4が、それらの結合する原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
RgおよびR7が、それらの結合する原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し、ここで該環は1個のヒドロキシ基で所望により置換されてもよく;および
Rkがメチルである、
化合物を提供する。
Aが
wが1であり;
zが0であり;
Rzが-C(O)NHR16であり;
ここで、R16が水素および-CHR17C(O)NH2(ここでR17は水素である)より選択され;
RdおよびR4が、それらの結合する原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
RgおよびR7が、それらの結合する原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し、ここで該環は1個のヒドロキシ基で所望により置換されてもよく;および
Rkがメチルであり;
Ra、Re、およびRjが水素であり;
RbおよびR2が、各々、メチルであるか、またはRbおよびR2が、それらの結合する原子と一緒になって、ピペリジン環を形成し;
RLがメチルであり;
Rnが水素であり;
R1がフェニルメチルであり、ここで該フェニルはC1-C6アルコキシ、ハロ、およびヒドロキシより選択される1個の基で所望により置換されてもよく;
R3が-CH2C(O)NH2、および-CH2CO2Hより選択され;
R5が-CH2(イミダゾリル)、-CH2NH2、および-CH2CH2CO2Hより選択され;
R6が-CH2CH(CH3)2、-(CH2)4NH2、および(CH2)2C(O)NH2より選択され;
R8が-CH2(インドリル)であり;
R9が-(CH2)2NH2、およびCH2OHより選択され;
R10が-CH2(インドリル)であり、ここでインドリル部は-CH2C(O)NHS(O)2CH3、シアノ、および-CH2(テトラゾリル)より選択される1個の基で、または-OCH3、-CO2H、および-CH2CO2Hより選択される2個の基で所望により置換されてもよいか;
R10が-CH2(アザインドリル)であり、ここでアザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部は-CH2CO2Hで置換されるか;
R10が-(CH2)nQ’であり、ここでnは1であり、Q’は2または3個の窒素原子を含有する5,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり、ここで該環系は-CH3、-CH2CO2H、およびオキソより選択される1または2個の基で所望により置換されてもよい;ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基であるか;または
R10が-(CH2)nZ’であり、ここでnは1であり、Z’が1個の窒素原子を含有する6,6員-縮合の飽和または不飽和環系であり;
R11およびR12が-(CH2)3CH3であり;および
R13がメチル、-CH2CH(CH3)2、および-(CH2)3NHC(NH)NH2より選択される、
化合物を提供する。
C2-C7アルケニル、C1-C3アルコキシC1-C3アルキル、C1-C6アルコキシカルボニルC1-C3アルキル、C1-C7アルキル、C1-C3アルキルスルファニルC1-C3アルキル、アミドC1-C3アルキル、アミノC1-C3アルキル、ベンゾチアゾリルC1-C3アルキル、ベンゾチエニルC1-C3アルキル、ベンジルオキシC1-C3アルキル、カルボキシC1-C3アルキル、C3-C14シクロアルキルC1-C3アルキル、C3-C6シクロアルキルC1-C3アルキル、ジフェニルメチル、フラニルC1-C3アルキル、イミダゾリルC1-C3アルキル、ナフチルC1-C3アルキル、ピリジニルC1-C3アルキル、チアゾリルC1-C3アルキル、チエニルC1-C3アルキル;
アザインドリルC1-C3アルキル(ここで、アザインドリルC1-C3アルキルのアザインドリル部は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより独立して選択される、1または2個の置換基で所望により置換されてもよく、該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される、1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい);
ビフェニルC1-C3アルキル(ここで、該ビフェニルはメチル基で所望により置換されてもよい);
-(CH2)nQ’(ここで、nは1~3であり、Q’は2、3または4個の窒素原子を含有する、5員、6員の縮合した飽和または不飽和環系であり、該環系は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、(C1-6アルキル)スルファミジルC1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される、1、2または3個の置換基で所望により置換されてもよく、該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される、1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい;ただし、Q’はアザインドリルまたはインドリル以外の基である);または
-(CH2)nZ’(ここで、nは1~3であり、Z’は1、2、3または4個の窒素原子を含有する、6員、6員の縮合した飽和または不飽和環系であり、該環系は、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルキル、(C1-C6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される、1、2または3個の置換基で所望により置換されてもよく、該フェニルは、C1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される、1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい);
ヘテロシクリル(C1-C4アルコキシ、C1-C4アルキル、C1-C3アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノC1-C3アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロC1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NC(NH2)2、ニトロ、および-OP(O)(OH)2より独立して選択される1、2、3、4または5個の基で所望により置換されてもよい);
インドリルC1-C3アルキル(ここで、該インドリル部は、(C1-6アルキル)S(O)2NHC(O)C1-C3アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C3アルキル、カルボキシ、カルボキシC1-C3アルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、テトラゾリル、テトラゾリルC1-C3アルキル、およびフェニルより選択される1または2個の基で所望により置換されてもよく、該フェニルはC1-C3アルコキシ、C1-C3アルキル、およびハロより独立して選択される1、2または3個の基で所望によりさらに置換されてもよい);
フェニル(C1-C4アルコキシ、C1-C4アルキル、C1-C3アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノC1-C3アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロC1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NC(NH2)2、ニトロ、および-OP(O)(OH)2より独立して選択される1、2、3、4または5個の基で所望により置換されてもよい);
NRaRb(C1-C7アルキル)(ここで、RaおよびRbは、水素、C2-C4アルケニルオキシカルボニル、C1-C3アルキル、C1-C3アルキルカルボニル、C3-C6シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニル、およびフェニルカルボニルより独立して選択される)(アルキルリンカーの炭素が1個より多い場合、さらなるNRaRb基が鎖上に存することができる);
NRcRdカルボニルC1-C3アルキル(ここで、RcおよびRdは、水素、C1-C3アルキル、およびトリフェニルメチルより独立して選択される);
フェニルC1-C3アルキル(ここで、該フェニル部分は、C1-C4アルコキシ、C1-C4アルキル、C1-C3アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノC1-C3アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロC1-C3アルキル、ヒドロキシ、-NC(NH2)2、ニトロ、および-OP(O)(OH)2より独立して選択される1、2、3、4、または5個の基で所望により置換されてもよい);および
フェノキシC1-C3アルキル(ここで、該フェニルは、C1-C3アルキル基で所望により置換されてもよい)。
本開示はまた、対照となる抗-PD-L1抗体(MDX-1105)の結合と、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、および少なくとも約100%の競合能を有する大環状ペプチドを対象とする。かかる大環状ペプチドは、本明細書に開示の1または複数の大環状ペプチド(変異体、保存的置換、機能的置換、および欠失形態を含む;ただし、該ペプチドはPD-L1と特異的に結合する)と構造的相同性を共有し得る。例えば、大環状ペプチドが、実質的に、PD-L1の、対照となる抗-PD-L1抗体と同じ領域に結合するならば、その大環状ペプチドは、抗-PD-L1モノクローナル抗体が結合するPD-L1エピトープと少なくとも重複する、PD-L1のエピトープと結合するはずである。その重複する領域は1個のアミノ酸残基から数百個のアミノ酸残基の範囲とすることができる。該大環状ペプチドは、次に、抗-PD-L1モノクローナル抗体と競合し、および/またはそのPD-L1との結合を遮断し、それにより抗-PD-L1モノクローナル抗体とPD-L1との結合は減少し、好ましくは競合アッセイにて少なくとも約50%は減少するはずである。
もう一つ別の態様において、本開示は、組成物、例えば、本開示の1の大環状ペプチドまたはその組み合わせを含有し、医薬的に許容される担体と一緒に処方した、医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の1または組み合わせた(例、2種またはそれ以上の異なる)大環状ペプチド、あるいは免疫抱合体または二重特異性分子を含んでもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、標的とする抗原にある異なるエピトープと結合するか、または補体活性を有する、大環状ペプチド(あるいは免疫抱合体または二重特異性体)の組み合わせを含み得る。
本開示の大環状ペプチド、組成物および方法は、例えば、PD-L1の検出、またはPD-L1の遮断による免疫応答の強化を含め、インビトロおよびインビボにて多数の有用性を有する。例えば、これらの分子は、インビトロまたはエクスビボにて培養細胞に、あるいは例えば、インビボにてヒト対象に投与され、種々の状態にある免疫性を強化することができる。従って、1の態様において、本開示は、対象における免疫応答を修飾する方法であって、該対象における免疫応答が修飾されるように、本開示の大環状ペプチドを該対象に投与することを含む方法を提供する。該応答が強化されるか、刺激されるか、アップレギュレートされるのが好ましい。他の点では、該大環状ペプチドは、抗イヌ、抗マウス、および/または抗ウッドチャック結合特性、および治療活性を有してもよい。
PD-1の、大環状ペプチドによる遮断は、患者におけるがん細胞への免疫応答を強化しうる。PD-1のリガンドである、PD-L1は、正常なヒト細胞では発現されないが、種々のヒトがんにて豊富に存在する(Dongら、Nat. Med., 8:787-789(2002))。PD-1とPD-L1とが相互に作用することで、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、T-細胞受容体介在性増殖の低下、がん細胞による免疫の回避がもたらされる(Dongら、J. Mol. Med., 81:281-287(2003);Blankら、Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314(2005); Konishiら、Clin. Cancer Res., 10:5094-5100(2004))。免疫抑制は、PD-1のPD-L1との局所的相互作用を阻害することにより、無効とされ、その上、PD-1のPD-L2との相互作用が遮断されると、その作用は相加的となり得る(Iwaiら、Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297(2002);Brownら、J. Immunol., 170:1257-1266(2003))。従来の研究によれば、T細胞の増殖が、PD-1のPD-L1との相互作用を阻害することによって、復元され得ることが示されたが、PD-1/PD-L1相互作用を遮断することによるインビボでのがん腫瘍の成長に対する直接的な効果について報告はなされていない。一の態様において、本開示はがん腫瘍の成長が抑制されるように大環状ペプチドを用いてインビボにて対象を治療することに関する。大環状ペプチドは単独で使用されてがん腫瘍の成長を阻害してもよい。あるいはまた、大環状ペプチドは他の免疫原性剤、標準的ながん治療剤、または下記に示される他の大環状ペプチドと共に使用されてもよい。
本開示の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝された患者を治療するのに使用される。従って、本開示のもう一つ別の態様は、対象における感染疾患を治療する方法であって、該対象が感染疾患について治療されるように、該対象に本開示の大環状ペプチドを投与することを含む、方法を提供する。
大環状ペプチドは自己免疫応答を誘発および増幅しうる。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを用いて抗腫瘍応答が誘発されることで、多くの抗腫瘍応答が、抗自己反応性(抗-CTLA-4+GM-CSF-修飾のB16黒色腫にて観察される脱色素(van Elsasら、前掲);Trp-2ワクチン接種したマウスにおける脱色素(Overwijk, W.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987(1999));TRAMP腫瘍細胞ワクチンにより惹起される自己免疫前立腺炎(Hurwitz, A.、supra(2000))、黒色腫ペプチド抗原ワクチン接種およびヒト臨床実験において観察される白斑(Rosenberg, S.A.ら、J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1):81-84(1996)))と関連していることが明らかにされた。
大環状ペプチドは、抗-PD-1大員環を関心のある抗原(例、ワクチン)と一緒に共投与することにより抗原特異的免疫応答を刺激するのに使用されてもよい。従って、もう一つ別の態様において、本開示は、対象での抗原に対する免疫応答を強化する方法であって、該対象に、(i)抗原;および(ii)対象にて抗原に対する免疫応答を強化するような抗-PD-1大員環、を投与することを含む、方法を提供する。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または病原体から由来の抗原とすることができる。限定されるものではないが、かかる抗原の例として、上記される腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)、または上記のウイルス、細菌または他の病原体から由来の抗原などの、上記のセクションにて記載される抗原が挙げられる。
本開示の大環状ペプチドと、もう一つ別のPD-L1アンタゴニストおよび/または他の免疫調節剤との組み合わせは、過剰増殖性疾患に対して免疫応答を強化するのに有用である。例えば、これらの分子は、インビトロまたはエクスビボにて、培養中の細胞に、あるいは、例えばインビボにて、ヒト対象に投与され、種々の状況での免疫性を強化することができる。従って、1の態様にて、該開示は、対象において免疫応答を修飾する方法であって、該対象における免疫応答が修飾されるように、該対象に本開示の大環状ペプチドを投与することを含む、方法を提供する。該応答は強化、刺激、またはアップレギュレートされるのが好ましい。もう一つ別の実施態様において、本開示は、過剰増殖性疾患の免疫刺激治療剤での治療に付随する有害事象を改変する方法であって、本開示の大環状ペプチドおよび治療用量以下のもう一つ別の免疫調節剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
式Iの適切なペプチド、より具体的には本明細書に記載の大環状ペプチドは、化合物として単独で、および/または許容される担体と混合して医薬製剤の形態にて、糖尿病、および他の関連する疾患を治療するために患者に投与され得る。糖尿病を治療する分野の当業者は、該化合物をかかる治療を必要とするヒトを含む哺乳動物に投与する量および経路を容易に決定し得る。投与経路は、限定されないが、経口、口内、経直腸、経皮、バッカル、経鼻、経肺、皮下、筋肉内、皮内、舌下、結腸内、眼内、静脈内、または腸内投与を包含しうる。該化合物は、許容される薬局実務を基礎とし、投与経路に従って、処方される(Finglら、in The Pharmacological Basis of Therapeutics、第1章、1頁(1075);Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Co.、Easton、PA(1990))。
標準的な2ピースのハードゼラチンカプセルに、100mgの粉末の活性成分、150mgのラクトース、50mgのセルロース、および6mgのステアリン酸マグネシウムを充填することによって、多数の単位カプセルが調製され得る。
活性成分の、大豆油、綿実油、またはオリーブ油などの可消化油中混合物を調製し、容積式ポンプを用いて、ゼラチン中に注入し、100mgの活性成分を含有するソフトゼラチンカプセルを形成することができる。該カプセルは洗浄かつ乾燥させる必要がある。
錠剤は、投与単位が、例えば、100mgの活性成分、0.2mgのコロイド状二酸化ケイ素、5mgのステアリン酸マグネシウム、275mgの微結晶セルロース、11mgの澱粉、および98.8mgのラクトースを含有するように、慣用的操作によって調製されてもよい。適切なコーティングを施し、口当たりを良くし、吸収を遅延させてもよい。
本明細書に記載のペプチドを含む組成物の注入可能な製剤は、賦形剤、例えば、取締機関により承認されている賦形剤の使用を必要とするし、また必要ともしない。これらの賦形剤は、限定されないが、溶媒および共溶媒、可溶化、乳化または増粘剤、キレート化剤、酸化防止剤、還元剤、抗菌性保存剤、緩衝およびpH調整剤、増量剤、防止剤、等張化調整剤、および特別な添加剤を包含する。注入可能な製剤は、滅菌状態の発熱物質フリーでなければならず、溶液の場合には、粒子材料が不含でなければならない。
経口および/または非経口投与用の水性懸濁液は、例えば、各5mLで、100mgの細分割された活性成分、20mgのナトリウムカルボキシメチルセルロース、5mgの安息香酸ナトリウム、1.0gのソルビトール溶液(U.S.P.)、および0.025mLのバニリンまたは他の口当たりのよいフレーバー剤が含まれるように、調製され得る。
注入による投与に適する徐放性非経口用組成物は、例えば、適切な生分解性ポリマーを溶媒に溶かし、そのポリマー溶液に配合される活性剤を添加し、溶媒をそのマトリックスから取り除き、それによって活性剤がマトリックス全体に分散されている、ポリマーマトリックスを形成することによって調製されてもよい。
本明細書における本開示の記載は、化学結合の法則および原理と一致するように解釈されるべきである。本開示により包含される化合物は医薬として用いるのに適当に安定しているものであると理解されるべきである。当業者であれば、化学結合および安定性の一般的原理に基づいて、どのような化合物が安定であるか、そうでないかを認識しているであろう。
質量分析:「ESI-MS(+)」は陽イオンモードで行われた電子噴射イオン化質量分析を意味し;「ESI-MS(-)」は陰イオンモードで行われた電子噴射イオン化質量分析を意味し;「ESI-HRMS(+)」は陽イオンモードで行われた高分解能電子噴射イオン化質量分析を意味し;「ESI-HRMS(-)」は陰イオンモードで行われた高分解能電子噴射イオン化質量分析を意味する。検出された質量を「m/z」単位記号の後に報告する。正確な質量が1000よりも大きい化合物は、しばしば、二重荷電イオンまたは三重荷電イオンとして検出された。
カラム:BEH C18、2.1x50 mm、1.7μm粒子;移動相A:水+0.05%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.05%TFA;温度:50℃;勾配:2分間にわたって2%Bから98%Bとし、次に98%Bで0.5分間保持する;流速:0.8mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:BEH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+0.05%TFA;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+0.05%TFA;温度:50℃;勾配:3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで0.75分間保持する;流速:1.11mL/分
カラム:BEH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:水+0.2%ギ酸および0.01%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.2%ギ酸および0.01%TFA;温度:50℃;勾配:2分間にわたって2%B~80%Bとし、0.1分間にわたって80%B~98%Bとし、次に98%Bで0.5分間保持する;流速:0.8mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:ウォーターズ・アクイティー(Waters Acquity)UPLC BEH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;温度:50℃;勾配:3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで0.75分間保持する;流速:1.11mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:ウォーターズ・アクイティーUPLC BEH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+0.1%トリフルオロ酢酸;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+0.1%トリフルオロ酢酸;温度:50℃;勾配:3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで0.75分間保持する;流速:1.11mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:ウォーターズ・エックスブリッジ(Waters Xbridge)C18、2.1x50mm;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;温度:35℃;勾配:4分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで1分間保持する;流速:4mL/分;検出:UV(220nm)
フィニガン(Finnigan)LTQマス・スペクトロメーター;カラム:フェノメネックス・ジュピター(Phenomenex Jupiter)C4、1x50mm;移動相A:1%ギ酸/水;移動相B:0.1%ギ酸/アセトニトリル;温度:30℃;勾配:1%Bで1分間保持し、3分間にわたって1-95%Bとし、次に95%Bで3分間保持する;流速:0.15mL/分
カラム:ウォーターズ(Waters)BEH C18、2.0x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;温度:50℃;勾配:3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで0.5分間保持する;流速:1.0mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:ウォーターズ BEH C18、2.0x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 メタノール:水+10mM酢酸アンモニウム;移動相B:95:5 メタノール:水+10mM酢酸アンモニウム;温度:50℃;勾配:3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで0.5分間保持する;流速:0.5mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:YMCパックODS(YMC Pack ODS)-AQ 3μm 150x4.6mm;移動相A:水+0.1%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.1%TFA;温度:60℃;勾配:25分間にわたって35%Bから80%Bとする;流速:1mL/分;検出:UV(217nm)
カラム:YMCパックODS-AQ 3μm 150x4.6mm;移動相A:水+0.1%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.1%TFA;温度:60℃;勾配:25分間にわたって25%Bから75%Bとする;流速:1mL/分;検出:UV(217nm)
カラム:YMCパックODS-AQ 3μm 150x4.6mm;移動相A:水+0.1%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.1%TFA;温度:60℃;勾配:25分間にわたって20%Bから70%Bとする;流速:1mL/分;検出:UV(217nm)
カラム:YMCパックODS-AQ 3μm 150x4.6mm;移動相A:水+0.1%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.1%TFA;温度:60℃;勾配:25分間にわたって15%Bから65%Bとする;流速:1mL/分;検出:UV(217nm)
カラム:YMCパックODS-AQ 3μm 150x4.6mm;移動相A:水+0.1%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.1%TFA;温度:60℃;勾配:20分間にわたって25%Bから60%Bとする;流速:1.25mL/分;検出:UV(217nm)
カラム:YMCパックODS-AQ 3μm 150x4.6mm;移動相A:水+0.1%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.1%TFA;温度:60℃;勾配:20分間にわたって25%Bから65%Bとする;流速:1.25mL/分;検出:UV(217nm)
カラム:サンファイア(Sunfire)C18 3.5μm、3.0x150mm;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+0.05%トリフルオロ酢酸;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+0.05%トリフルオロ酢酸;温度:50℃;勾配:12分間にわたって10-100%Bとし、次に100%Bで3分間保持する;流速:1mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:エックスブリッジ・フェニル(Xbridge Phenyl) 3.5x150μm、移動相A:5:95 アセトニトリル:水+0.05%トリフルオロ酢酸;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+0.05%トリフルオロ酢酸;温度:50℃;勾配:12分間にわたって10-100%Bとし、次に100%Bで3分間保持する;流速:1mL/分;検出:UV(220nm)
カラム:フェノメネックス・ルナ(Phenomenex Luna) 5μ C18(2)150x4.6mm;移動相A:水+0.1%トリフルオロ酢酸、移動相B:アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、勾配:20分間にわたって5-100%Bとし、次に100%Bで5分間保持する;流速:1mL/分、検出:UV(220)
カラム:フェノメネックス・ルナ 5μ C18(2)150x4.6mm;移動相A:水+0.1%トリフルオロ酢酸、移動相B:アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、勾配:20分間にわたって10-100%Bとし、次に100%Bで5分間保持する;流速:1mL/分、検出:UV(220)
プレリュード(Prelude)方法A:
すべての操作はプレリュード型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。特に断りのない限り、操作はすべて、底部フリットで取り付けられた10または45mLのポリプロピレン製の管において行われた。該管の底部と上部の両方を通して、該管をプレリュード型ペプチド合成装置に接続する。DMFおよびDCMは該管の上部から加えることができ、それにより該管の側面が等しく洗い流される。残りの試薬は該管の底部から加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが30秒毎に発生する。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。DMFはジメチルホルムアミドであり;DICはN,N’-ジイソプロピルカルボジイミドであり;HOAtは1-ヒドロキシ 7-アザベンゾトリアゾールであり;シーバー(Sieber)はFmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシであり、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型をいう。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を用いた、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールド(Merrifield)ポリマー(ポリスチレン)である。使用されるコモンアミノ酸(common amino acid)を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する。
40mLのポリプロピレン製固相反応容器に、メリフィールド:シーバー樹脂(140mg、0.100ミリモル)を添加した。その樹脂を以下のように3回洗浄した:反応容器にDMF(5.0mL)およびDCM(5.0mL)を添加し、その際に該混合物を該反応容器の底部からN2を吹き込むことにより周期的に10分間かき混ぜ、その後で溶媒を排出(drain)させた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸およびHOAcの溶液(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、ついでDIC(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を添加した。該混合物を周期的に60分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸およびHOAcの溶液(0.2M/DMF、5.0mL、5当量)を、ついでDIC(0.2M/DMF、5.0mL、5当量)を添加した。該混合物を300分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、DIPEA(4.0ミリモル、0.699mL、40当量)および塩化クロロアセチル(2.0ミリモル、0.160mL、20当量)のDMF中溶液(3.0mL)を添加した。混合物を12~18時間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液を排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液を排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DCM(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液を排出させた。
すべての操作はプレリュード型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。操作はすべて、底部フリットで取り付けられた10または45mLのポリプロピレン製の管において行われた。DMFおよびDCMは該管の上部から加えることができ、それにより該管の側面が等しく洗い流される。残りの試薬は該管の底部から加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが30秒毎に発生する。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。DMF=ジメチルホルムアミド;HCTU=2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;シーバー=Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシ、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型を記載する。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を有した、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールドポリマー(ポリスチレン)である。使用されるコモンアミノ酸を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する。
40mLのポリプロピレン製固相反応容器に、メリフィールド:シーバー樹脂(140mg、0.100ミリモル)を添加した。その樹脂を以下のように3回洗浄した(膨潤させた):反応容器にDMF(5.0mL)およびDCM(5.0mL)を添加し、その際に該混合物を該反応容器の底部からN2を吹き込むことにより周期的に10分間かき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、ついでHCTU(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、2.5mL、20当量)を添加した。該混合物を周期的に30分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、ついでHCTU(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、2.5mL、20当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を容器の上部を通してDMF(4.0mL)で連続して3回洗浄し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、ついでHCTU(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、2.5mL、20当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、10当量)を、ついでHCTU(0.2M/DMF、2.5mL、10当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.5mL、12当量)を添加した。該混合物を周期的に12時間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、DIPEA(4.0ミリモル、0.699mL、40当量)および塩化クロロアセチル(2.0ミリモル、0.160mL、20当量)のDMF中溶液(3.0mL)を添加した。混合物を12~18時間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液を排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、CH2Cl2(2.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、DMF(2.0mL)、クロロ酢酸(1.2ミリモル、113mg、12当量)およびN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(1.2ミリモル、0.187mL、12当量)を添加した。混合物を12~18時間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、CH2Cl2(2.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。
すべての操作はプレリュード型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。操作はすべて、特に限定されない限り、底部フリットで取り付けられた10または45mLのポリプロピレン製の管において行われた。該管を、その管の底部および上部の両方で、プレリュード型ペプチド合成装置に接続する。DMFおよびDCMは該管の上部から加えることができ、それにより該管の側面が等しく洗い流される。残りの試薬は該管の底部から加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが30秒毎に発生する。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。HATU溶液は調製から5日以内に使用された。DMF=ジメチルホルムアミド;HCTU=2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム;HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド・ヘキサフルオロリン酸塩;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;シーバー=Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシ、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型をいう。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を有した、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールドポリマー(ポリスチレン)である。使用されるコモンアミノ酸を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する。
40mLのポリプロピレン製固相反応容器に、メリフィールド:シーバー樹脂(140mg、0.100ミリモル)を添加した。その樹脂を以下のように3回洗浄した(膨潤させた):反応容器にDMF(5.0mL)およびDCM(5.0mL)を添加し、その際に該混合物を該反応容器の底部からN2を吹き込むことにより周期的に10分間かき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、5.0mL、10当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、2.5mL、20当量)を添加した。該混合物を周期的に60分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、1.5mL、12当量)を添加した。該混合物を300分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、1.5mL、12当量)を添加した。該混合物を300分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、0.5~2.5mL、1~5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、0.5~2.5mL、1~5当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、0.5~1.5mL、4~12当量)を添加した。該混合物を周期的に60分間~600分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
樹脂を次のように連続して2回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DCM(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
手動工程に注意のこと。上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を室温で5分間震盪させ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物をかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、DMF(2.0mL)、クロロ酢酸(1.2ミリモル、113mg、12当量)およびN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(1.2ミリモル、0.187mL、12当量)を添加した。混合物を室温で12~18時間震盪させ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、CH2Cl2(4.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。
すべての操作はプレリュード型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。操作はすべて、特に限定されない限り、底部フリットで取り付けられた10または45mLのポリプロピレン製の管において行われた。該管は、その管の底部および上部の両方で、プレリュード型ペプチド合成装置に接続される。DMFおよびDCMは該管の上部から加えることができ、それにより該管の側面が等しく洗い流される。残りの試薬は該管の底部から加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが30秒毎に発生する。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。HATU溶液は調製から5日以内に使用された。DMF=ジメチルホルムアミド;HCTU=2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム;HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド・ヘキサフルオロリン酸塩;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;シーバー=Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシ、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型をいう。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を有した、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールドポリマー(ポリスチレン)である。使用されるコモンアミノ酸を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する。
40mLのポリプロピレン製固相反応容器に、メリフィールド:シーバー樹脂(140mg、0.100ミリモル)を添加した。その樹脂を以下のように3回洗浄した(膨潤させた):反応容器にDMF(5.0mL)およびDCM(5.0mL)を添加し、その際に該混合物を該反応容器の底部からN2を吹き込むことにより周期的に10分間かき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、2.5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、2.5当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、0.75mL、5当量)を添加した。該混合物を周期的に30分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、2.5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、2.5当量)を、最後にDIPEA(0.8M/DMF、0.75mL、5当量)を添加した。該混合物を周期的に30分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂は次の工程にそのまま使用された。
樹脂を次のように連続して2回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DCM(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
手動工程に注意のこと。上記工程より由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を室温で5分間震盪させ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物をかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、DMF(2.0mL)、クロロ酢酸(1.2ミリモル、113mg、12当量)およびN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(1.2ミリモル、0.187mL、12当量)を添加した。混合物を室温で12~18時間震盪させ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、CH2Cl2(4.0mL)を容器の上部に添加し、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。
すべての操作はCEMリバティー型(CEM Liberty)マイクロ波ペプチド合成装置(CEM
Corporation)での自動化の下で行われた。操作はすべて、特に限定されない限り、底部フリットでCEMディスカバリー(CEM Discovery)マイクロ波ユニットに取り付けられた30または125mLのポリプロピレン製の管において行われた。該管は、その管の底部および上部の両方で、CEMリバティー型合成装置に接続される。DMFおよびDCMは該管の上部および底部から加えることができ、それにより該管の側面が等しく洗い流される。溶液はすべて、樹脂が上部から移動する間を除いて、該管の底部から取り出される。「周期的な泡立て」はN2ガスを短い泡立てで底部フリットに通すことをいう。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。HATU溶液は調製から5日以内に使用された。DMF=ジメチルホルムアミド;HCTU=2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム;HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド・ヘキサフルオロリン酸塩;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;シーバー(Sieber)=Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシ、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型を記載する。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を有した、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールドポリマー(ポリスチレン)である。リンク(Rink)、クロロトリチル(ChloroTrityl)などの他のコモン樹脂、または他の酸敏感リンカーを合成に利用することができ、特記されない限り、シーバーアミド樹脂を特定の実施例にて利用される。使用される通常のアミノ酸が、括弧内に側鎖保護基を示すことで、下記に列挙される:
50mLのポリプロピレン製円錐管に、メリフィールド:シーバー樹脂(140mg、0.100ミリモル)を添加した。次に、DMF(7mL)を、つづいてDCM(7mL)を該管に添加した。ついで該樹脂を容器の上部から反応容器に移した。操作をさらに2回繰り返した。DMF(7mL)を、つづいてDCM(7mL)を添加した。該樹脂をその反応容器の底部からN2を15分間通気することにより膨潤させ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)の溶液を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で容器の上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)を、HATU(0.5M/DMF、1.0mL、5当量)、およびDIPEA(2M/NMP、0.5mL、10当量)を添加した。その混合物を、50℃でカップリングさせるFmoc-Cys(Trt)-OHおよびFmoc-His(Trt)-OHを除く、すべてのアミノ酸について、75℃で5分間、N2を吹き込むことにより混合し、該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に65℃で2分間通気させ、次に溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)の溶液を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で容器の上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)を、HATU(0.5M/DMF、1.0mL、5当量)、およびDIPEA(2M/NMP、0.5mL、10当量)を添加した。その混合物を、50℃でカップリングさせるFmoc-Cys(Trt)-OHおよびFmoc-His(Trt)-OHを除く、すべてのアミノ酸について、75℃で5分間、N2を吹き込むことにより混合し、該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)、HATU(0.5M/DMF、1.0mL、5当量)、およびDIPEA(2M/NMP、0.5mL、10当量)を添加した。該混合物を、50℃でカップリングさせるFmoc-Cys(Trt)-OHおよびFmoc-His(Trt)-OHを除く、すべてのアミノ酸について、75℃で5分間、N2を吹き込むことにより混合し、該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に65℃で2分間通気させ、次に溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、5%ピペラジンおよび0.1M HOBt/DMF(7mL)の溶液を添加した。該混合物を周期的に75℃で3分間かき混ぜ、次に該溶液を排出させた。この操作をもう一度繰り返した。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、2.5mL、5当量)、HCTU(0.5M/DMF、1.0mL、5当量)、およびDIPEA(2M/NMP、0.5mL、10当量)を添加した。該混合物をすべてのアミノ酸について75℃で(Fmoc-Cys(Trt)-OHおよびFmoc-His(Trt)-OHについては50℃で)5分間、つづいて加熱することなく6時間、N2を吹き込むことにより混合した。排出させた後、該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。該反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に65℃で2分間通気させ、次に溶液を排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記工程から由来の樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMFの溶液(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、ピペリジン:DMFの溶液(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を3分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。該反応容器に、HATU(2.5当量~10当量)含有のアミノ酸溶液(1.25mL~5mL、2.5当量~10当量)を、最後にDIPEA(2M/NMP、0.5mL~1mL、20当量)を添加した。該混合物を、25℃~75℃で5分間~2時間、N2を通気することにより混合し、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。反応容器に、無水酢酸:DIEA:DMFの溶液(10:1:89 v/v/v、5.0mL)を添加した。該混合物を周期的に65℃で2分間通気させ、次に溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:DMF(7mL)で上部から洗浄し、つづいてDMF(7mL)で底部より洗浄し、最後にDMF(7mL)で上部より洗浄した。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
すべての操作はシンフォニー型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。特に断りのない限り、操作はすべて、底部フリットで取り付けられたシンフォニーポリプロピレン管において行われた。該管を、その管の底部と上部の両方を通して、シンフォニー型ペプチド合成装置に接続する。すべての溶媒、DMF、DCM、アミノ酸および試薬は該管の底部から加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが15秒毎に発生する。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。HATU溶液は調製から5日以内に使用された。DMF=ジメチルホルムアミド;HCTU=2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム;HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド・ヘキサフルオロリン酸塩;NMM=n-メチルモルホリン;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;シーバー=Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシであり、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型をいう。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を有した、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールド(Merrifield)ポリマー(ポリスチレン)である。リンク(Rink)または官能基を付与したクロロトリチル樹脂などの、他のコモン酸敏感樹脂も該合成において使用され得る。使用されるコモンアミノ酸を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する。
シンフォニー型ポリプロピレン製固相反応容器に、メリフィールド:シーバー樹脂(70mg、0.050ミリモル)を添加した。該樹脂を次のように3回洗浄した(膨潤させた):反応容器に、DMF(2.5mL)を添加し、その中の混合物を周期的に該反応容器の底部よりN2を通気することにより10分間にわたってかき混ぜ、その後でフリットを通して溶媒を排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を加えた。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)を容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂をDMF(6.25mL)で洗浄し、該容器の底部を介して添加し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、次にHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を加えた。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように3回洗浄した:該反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を周期的に該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたってかき混ぜ、その後でフリットを通して溶媒を排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。.
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を、その容器の底部を通して加えたDMF(6.25mL)で洗浄し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。該反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を加えた。該混合物を300分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を、その容器の底部を通して加えたDMF(6.25mL)で洗浄し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を加えた。該混合物を300分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。該反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器にカスタムアミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を手動で加えるために、シンフォニーソフトウェアによりその合成を一時停止させ、次に自動化を再び開始させ、HATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。混合物を300分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を、次のように、6回洗浄した;DMF(2.5mL)を容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)を添加し、該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
すべての操作はシンフォニー型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。特に断りのない限り、操作はすべて、底部フリットで取り付けられたシンフォニーポリプロピレン管において行われた。該管を、その管の底部と上部の両方を通して、シンフォニー型ペプチド合成装置に接続する。すべての溶媒、DMF、DCM、アミノ酸および試薬は該管の底部から加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが15秒毎に発生する。アミノ酸溶液は、一般に、調製から3週間を越えては使用されなかった。HATU溶液は調製から5日以内に使用された。DMF=ジメチルホルムアミド;HCTU=2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム;HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド・ヘキサフルオロリン酸塩;NMM=n-メチルモルホリン;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;シーバー=Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシであり、ここで「3-イルオキシ」はポリスチレン樹脂と結合する位置および型をいう。使用される樹脂は、シーバーリンカー(窒素にてFmoc-保護されている)を有した、100-200メッシュ、1%DVB、0.71ミリモル/g負荷のメリフィールドポリマー(ポリスチレン)である。リンク(Rink)または官能基を付与したクロロトリチル樹脂などの、他のコモン酸敏感樹脂も該合成において使用され得る。使用されるコモンアミノ酸を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する:
シンフォニー型ポリプロピレン製固相反応容器に、メリフィールド:シーバー樹脂(70mg、0.050ミリモル)を添加した。該樹脂を次のように3回洗浄した(膨潤させた):反応容器に、DMF(2.5mL)を添加し、その中の混合物を周期的に該反応容器の底部よりN2を通気することにより10分間にわたってかき混ぜ、その後でフリットを通して溶媒を排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を加えた。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)を容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を、該容器の底部を介して添加したDMF(6.25mL)で洗浄し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、次にHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を加えた。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように3回洗浄した:該反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を周期的に該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたってかき混ぜ、その後でフリットを通して溶媒を排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。.
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間にわたってかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように6回洗浄した:DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)を加え、該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。該反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を加えた。該混合物を15分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を、その容器の底部を通して加えたDMF(6.25mL)で洗浄し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、ついでHATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を加えた。該混合物を15分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)を添加し、該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。該反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器にカスタムアミノ酸(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を手動で加えるために、システムを一時停止させ、次に自動化を再び開始させ、HATU(0.2M/DMF、1.25mL、5当量)を、最後にNMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を反応ベシクルに添加した。混合物を15分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を、次のように、6回洗浄した:DMF(2.5mL)を容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)を添加し、該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を90秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
樹脂を次のように3回洗浄した:反応容器に、DMF(2.5mL)を加え、その中の混合物を該反応容器の底部よりN2を通気することにより30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で溶媒をフリットを通して排出させた。該反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.5mL)を添加した。該混合物を2.5分間にわたって周期的にかき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、NMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を、つづいて無水クロロギ酸(0.4M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。混合物を15分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂をその容器の底部を通して加えたDMF(6.25mL)で洗浄し、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、NMM(0.8M/DMF、1.25mL、10当量)を、つづいて無水クロロギ酸(0.4M/DMF、1.25mL、10当量)を添加した。該混合物を15分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように6回洗浄した:DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、Ac2O/DIPEA/DMF(v/v/v 1:1:3 2.5mL)を加え、該混合物を10分間にわたって周期的にかき混ぜ、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DCM(2.5mL)をその容器の底部を通して加え、得られた混合物を30秒間にわたって周期的にかき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。次に得られた樹脂を窒素流で10分間にわたって乾燥させた。
すべての操作は、特に断りのない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法A」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」はトリフルオロ酢酸:水:トリイソプロピルシラン:ジチオスレイトール(92.5:2.5:2.5:2.5 v:v:v:w)を用いて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、フリットを備えた25mLのシリンジに移した。該シリンジに、「脱保護溶液」(5.0mL)を添加した。該混合物を振盪器で85分間混合した。溶液を濾過し、濃縮してジエチルエーテル(30mL)で希釈した。沈殿した固体を3分間遠心分離に付した。上清溶液をデカントし、固体をジエチルエーテル(25mL)に再び懸濁させた。該懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカントし、残りの固体をジエチルエーテル(25mL)に懸濁させた。懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカンテーションに供し、残りの固体を高真空下で乾燥させた。粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特に断りのない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法B」の操作は、0.04ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.04ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」はトリフルオロ酢酸:トリイソプロピルシラン(96:4 v:v)を用いて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、フリットを備えた10mLのシリンジに移した。該シリンジに、「脱保護溶液」(2.0~3.0mL)を添加した。該混合物を振盪器で1時間または1.5時間混合した。溶液を濾過し、脱保護溶液(0.5mL)で洗浄し、濃縮してジエチルエーテル(30mL)で希釈した。沈殿した固体を3分間遠心分離に付した。上清溶液をデカントし、固体をジエチルエーテル(25mL)に再び懸濁させた。該懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカントし、残りの固体をジエチルエーテル(25mL)に懸濁させた。懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカンテーションに供し、残りの固体を高真空下で乾燥させた。粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法C」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」はトリフルオロ酢酸:トリイソプロピルシラン:ジチオスレイトール(95:2.5:2.5 v:v:w)を用いて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、Bio-Rad管に移した。該Bio-Rad管に、「脱保護溶液」(4.0mL)を添加した。該混合物を振盪器で60分間混合した。溶液を濾過し、ジエチルエーテル(30mL)で希釈した。沈殿した固体を3分間遠心分離に付した。上清溶液をデカントし、固体をジエチルエーテル(25mL)に再び懸濁させた。該懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカントし、残りの固体をジエチルエーテル(25mL)に懸濁させた。懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカンテーションに供し、残りの固体を高真空下で乾燥させた。粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特に断りのない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法D」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」はトリフルオロ酢酸:トリイソプロピルシラン:ジチオスレイトール(94:3:3 v:v:w)を用いて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、フリットを備えた25mLのシリンジに移した。該シリンジに、「脱保護溶液」(5.0mL)を添加した。該混合物を振盪器で5分間混合した。溶液を濾過し、ジエチルエーテル(30mL)で希釈した。沈殿した固体を3分間遠心分離に付した。上清溶液をデカントし、固体をジエチルエーテル(25mL)に再び懸濁させた。該懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカントし、残りの固体をジエチルエーテル(25mL)に懸濁させた。懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカンテーションに供し、残りの固体を高真空下で乾燥させた。粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法E」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と結合しているFmocGly-ClTrtリンカーの量で決定されるものとする。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」はトリフルオロ酢酸:トリイソプロピルシラン:ジチオスレイトール(95:2.5:2.5 v:v:w)を用いて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、Bio-Rad管に移した。該Bio-Rad管に、「脱保護溶液」(2.0mL)を添加した。該混合物を振盪器にて3分間混合した。溶液を濾過し、遠心管に集めた。該Bio-Rad管に「脱保護溶液」(2.0mL)を加えた。該混合物を振盪器にて3分間混合した。該溶液を濾過し、遠心管において集めた。そのBio-Rad管に、「脱保護溶液」(2.0mL)を添加した。該混合物を振盪器にて3分間混合した。溶液を濾過し、遠心管に集めた。その遠心管に入れた溶液を60分間放置させた。次に溶液を集め、ジエチルエーテル(30mL)で希釈し、沈殿物を形成させた。沈殿した固体を3分間遠心分離に付した。上清溶液をデカントし、固体をジエチルエーテル(25mL)に再び懸濁させた。該懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカントし、残りの固体をジエチルエーテル(25mL)に懸濁させた。懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカンテーションに供し、残りの固体を高真空下で乾燥させた。粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法F」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と結合しているリンク(Rink)リンカーの量で決定されるものとする。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」はトリフルオロ酢酸:トリイソプロピルシラン:ジチオスレイトール(95:2.5:2.5 v:v:w)を用いて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、6mlのBio-Rad管に移した。該Bio-Radに、「脱保護溶液」(4.0mL)を添加した。該混合物を振盪器にて90分間混合した。溶液を濾過し、ジエチルエーテル(30mL)で希釈した。沈殿した固体を3分間遠心分離に付した。上清溶液をデカントし、固体をジエチルエーテル(25mL)に再び懸濁させた。該懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカントし、残りの固体をジエチルエーテル(25mL)に懸濁させた。懸濁液を3分間遠心分離に付した。上清をデカンテーションに供し、残りの固体を高真空下で乾燥させた。粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特に断りのない限り、手動でなされた。「環化方法A」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは、ペプチドを生成するのに使用された樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。このスケールはその操作にて使用されるペプチドの量を直接測定することをベースとするものではない。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。粗ペプチドの固体をアセトニトリル:8M水性グアニジン/50mM TRIS(1:3)(pH8.6)(7mL:18mLまたは同じような割合)の溶液に溶かし、次に該溶液のpHを、必要ならば、NaOH水溶液(1.0M)を用いて8.5~9.0に調整した。ついで、該溶液を振盪器を用いて12~18時間混合した。反応溶液を濃縮し、次にその残渣をアセトニトリル:水に溶かした。この溶液を逆相HPLC精製に供し、所望の環状ペプチドを得た。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「環化方法C」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは、ペプチドを生成するのに使用された樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。このスケールはその操作にて使用されるペプチドの量を直接測定することをベースとするものではない。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。粗ペプチドの固体をアセトニトリル:0.1M炭酸水素アンモニウム水性緩衝液(11mL:24mLまたは同じような割合)の溶液に溶かし、次に該溶液のpHを、注意して、NaOH水溶液(1.0M)を用いて8.5~9.0に調整した。ついで、該溶液を振盪器を用いて12~18時間混合した。反応溶液を濃縮し、次にその残渣をアセトニトリル:水に溶かした。この溶液を逆相HPLC精製に供し、所望の環状ペプチドを得た。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「環化方法D」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは、ペプチドを生成するのに使用された樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。このスケールはその操作にて使用されるペプチドの量を直接測定することをベースとするものではない。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。粗ペプチドの固体をアセトニトリル:0.1M炭酸水素アンモニウム水性緩衝液(11mL:24mL)の溶液に溶かし、次に該溶液のpHを、注意して、NaOH水溶液(1.0M)を用いて8.5~9.0に調整した。ついで、該溶液を攪拌しながら12~18時間混合した。反応溶液を濃縮し、次にその残渣をアセトニトリル:水に溶かした。この溶液を逆相HPLC精製に供し、所望の環状ペプチドを得た。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「環化方法E」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは、ペプチドを生成するのに使用された樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。このスケールはその操作にて使用されるペプチドの量を直接測定することをベースとするものではない。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。粗ペプチドの固体を6MグアニジンHCl緩衝剤水溶液(15mL)に溶かし、ついで該溶液を攪拌しながら12~18時間混合した。反応溶液を濃縮し、15mLのDMSOを該残渣に加えてスラリーを得、それを濾過した。この濾過した溶液を逆相HPLC精製に供し、所望の環状ペプチドを得た。
上記の工程から由来の樹脂含有のBio-Rad反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、5.0mL)を添加した。その混合物を5分間にわたって周期的に震盪し、次に該溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して5回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を該容器の頂部から加え、得られた混合物を60秒間震盪し、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該反応容器に、アミノ酸(1.2-10当量)を、典型的には0.2M/DMF、2.5mL、5当量で、ついでHATU(1.2-10当量)を、典型的には0.2M/DMF、2.5mL、5当量で、最後にDIPEA(2.4-20当量)を、典型的には0.8M/DMF、1.25mL、10当量で添加した。該混合物を60分間ないし18時間振盪し、次に反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(4.0mL)を該容器の頂部から加え、得られた混合物を60秒間震盪し、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。
すべての操作は、特記されない限り、手動でなされた。「樹脂上でのN-メチル化方法A」の操作は、0.100ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは、ペプチドを生成するのに使用された樹脂と結合しているシーバーリンカーの量で決定されるものとする。このスケールはその操作にて使用されるペプチドの量を直接測定することをベースとするものではない。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。
少量の<10mgのサンプルの樹脂に、TIS(2滴)およびトリフルオロ酢酸(1mL)を添加し、室温で震盪させた。1時間後、少量のアリコートを取り出し、アセトニトリル(0.5mL)で希釈し、濾過し、LC-MSにより分析を行った。
「シンフォニー方法B:樹脂膨潤操作」;
Fmoc-グリシン-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-システイン(Trt)-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-アルギニン(Pfp)-OH:「シンフォニー方法B:第二アミンカップリング操作」;
Fmoc-N-メチルノルロイシン:「シンフォニー方法B:第二アミンカップリング操作」;
Fmoc-N-メチルノルロイシン:「シンフォニー方法B:第二アミンカップリング操作」;
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(イソキノリン-7-イル)プロパン酸:「手動カップリング操作A」;
Fmoc-セリン(OtBu)-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-トリプトファン(Boc)-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-トランス-ヒドロキシプロリン(tBu)-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-ロイシン-OH:「シンフォニー方法B:第二アミンカップリング操作」;
Fmoc-ヒスチジン-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-プロリン-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-アスパラギン-OH:「シンフォニー方法B:第二アミンカップリング操作」;
Fmoc-N-メチル-アラニン-OH:「シンフォニー方法B:標準カップリング操作」;
Fmoc-チロシン(OtBu)-OH:「シンフォニー方法B:第二アミンカップリング操作」;
「シンフォニー方法B:最終キャッピング操作」;
「環化方法D」
を用いて、1のリンク(Rink)アミド樹脂より調製された。
分析性LCMS条件D:保持時間=1.32分;ESI-MS(+)m/z 961.8(M+2H)
分析性LCMS条件E:保持時間=1.10分;ESI-MS(+)m/z 961.7(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:962.9380(M+2H);測定値:962.9370(M+2H)
カラム:ウォーターズ(Waters)BEH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:水+0.05%TFA;移動相B:アセトニトリル+0.05%TFA;温度:40℃;勾配:2分間にわたって2%B~98%Bとし、次に0.5分間、98%Bで保持する;流速:0.8mL/分;検出:UV(220 nm)
カラム:フェノメネックス・ルナ(Phenomenex Luna)C18 2.0x30mm 3μm粒子;移動相A:水+0.05%酢酸アンモニウム;移動相B:アセトニトリル+0.05%酢酸アンモニウム;温度:40℃;勾配:2分間にわたって0%B~100%Bとし、次に1分間100%Bで保持する;流速:1.0mL/分;検出:UV(220 nm)
カラム:ウォータズ BEH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+10mM酢酸アンモニウム;温度:70℃;勾配:0%B、3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで2.0分間保持する;流速:0.75mL/分;検出:UV(220 nm)
カラム:ウォータズ CSH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+トリフルオロ酢酸;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+トリフルオロ酢酸;温度:70℃;勾配:0%B、3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで2.0分間保持する;流速:0.75mL/分;検出:UV(220 nm)
カラム:ウォータズ CSH C18、2.1x50mm、1.7μm粒子;移動相A:5:95 アセトニトリル:水+0.05%トリフルオロ酢酸;移動相B:95:5 アセトニトリル:水+0.05%トリフルオロ酢酸;温度:70℃;勾配:3分間にわたって0-100%Bとし、次に100%Bで2.0分間保持する;流速:0.75mL/分;検出:UV(220 nm)
プレリュード(Prelude)方法A:
すべての操作はプレリュード型ペプチド合成装置(Protein Technologies)での自動化の下で行われた。特に断りのない限り、操作はすべて、底部フリットで取り付けられた10mLのポリプロピレン製の管において行われた。該管の底部と上部の両方を通して、該管をプレリュード型ペプチド合成装置に接続する。DMFおよびDCMは該管の上部を通して加えられ、それにより該管の側面が等しく洗い流される。残りの試薬は該管の底部を通して加えられ、下からフリットを通って樹脂と接触する。溶液はすべて該管の底部から取り出される。「周期的なかき混ぜ」はN2ガスを短いパルスで底部フリットに通すことをいい;パルスは約5秒間続き、それが30秒毎に発生する。アミノ酸溶液は調製から2週間を越えて使用されなかった。HATU溶液は調製して5日以内に使用された。DMFはジメチルホルムアミドであり;HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド・ヘキサフルオロリン酸塩;DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン;使用される樹脂は、リンク(Rink)リンカーで官能基化された、100-200メッシュ、1%DVB、0.53ミリモル/g負荷のメリフィールド(Merrifield)ポリマー(ポリスチレン)である。使用されるコモンアミノ酸(common amino acid)を、側鎖保護基を括弧内に示して、下記に列挙する。Fmoc-Asn(Trt)-OH;Fmoc-Asp(OtBu)-OH;Fmoc-Dab(Boc)-OH;Fmoc-Dap(Boc)-OH;Fmoc-Gln(Trt)-OH;Fmoc-Gly-OH;Fmoc-His(Trt)-OH;Fmoc-Hyp(tBu)-OH;Fmoc-Leu-OH;Fmoc-Lys(Boc)-OH;Fmoc-Nle-OH;Fmoc-[N-Me]Ala-OH;Fmoc-[N-Me]Nle-OH;Fmoc-Pro-OH;Fmoc-Trp(Boc)-OH;Fmoc-Tyr(tBu)-OH
3回繰り返した:樹脂含有の反応容器に、DMF(1.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に溶液をフリットを通して排出させた。
樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、1.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、1.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(DMF中0.2M、0.5mL、2当量)を、次にHATU(DMF中0.2M、0.5mL、2当量)を、最後にDIPEA(DMF中0.8M、0.3mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸のDMF中溶液(1M、0.8mL)を、つづいてDIPEA(0.8M、0.3mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程においてそのまま用いた。
この方法は、DIPEAを添加した後に、周期的に15分間かき混ぜる代わりに、混合物を周期的に30分間かき混ぜることを除き、「単一カップリング操作」と同じである。
上記工程から由来の樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、1.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、1.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(DMF中0.2M、0.5mL、2当量)を、次にHATU(DMF中0.2M、0.5mL、2当量)を、最後にDIPEA(DMF中0.8M、0.3mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(DMF中0.2M、0.5mL、2当量)を、次にHATU(DMF中0.2M、0.5mL、2当量)を、最後にDIPEA(DMF中0.8M、0.3mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように2回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸のDMF中溶液(1M、0.8mL)を、つづいてDIPEA(0.8M、0.3mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
上記の工程より由来の樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、1.0mL)を添加した。該混合物を周期的に3分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、1.0mL)を加えた。該混合物を周期的に3分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して6回洗浄した:各洗浄では、DMF(1.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、クロロ酢酸(0.2M、0.5mL)を、HATU(0.2M、0.5mL、2当量)を、ついでDIPEA(DMF中0.8M、0.3mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に30分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を容器の上部に加え、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、CH2Cl2(2.0mL)を容器の上部に加え、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を8分間N2流の下に置いた。
すべての操作については、プレリュードペプチド合成装置の代わりにシンフォニーXペプチド合成装置(Protein Technologies)を用い、試剤はすべて、反応容器の上部を通して添加された。シンフォニーXペプチド合成装置は反応を1.0ミリモル以上のスケールで行う。従って、以下の操作は合成を1.0ミリモルのスケールで記載する。
3回繰り返した:樹脂含有の反応容器に、DMF(2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に溶液をフリットを通して排出させた。
樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.0mL)を加えた。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(DMF中0.2M、1.0mL、2当量)を、次にHATU(DMF中0.2M、1.0mL、2当量)を、最後にDIPEA(DMF中0.4M、1.0mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸溶液(2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にそのまま用いた。
この方法は、DIPEAを添加した後に、周期的に15分間かき混ぜる代わりに、混合物を周期的に30分間かき混ぜることを除き、「単一カップリング操作」と同じである。
樹脂含有の反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(DMF中0.2M、1.0mL、2当量)を、ついでHATU(DMF中0.2M、1.0mL、2当量)を、最後にDIPEA(DMF中0.4M、1.0mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、次に該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して2回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、アミノ酸(DMF中0.2M、1.0mL、2当量)を、次にHATU(DMF中0.2M、1.0mL、2当量)を、最後にDIPEA(DMF中0.4M、1.0mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に15分間かき混ぜ、ついで該反応溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、無水酢酸溶液(2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に10分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂を次の工程にてそのまま用いる。
上記工程から由来の樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80 v/v、2.0mL)を添加した。該混合物を周期的に4分間かき混ぜ、次に該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を該容器の上部を通して添加し、得られた混合物を周期的に30秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。反応容器に、クロロギ酸(0.2M、1.0mL)、HATU(0.2M、1.0mL、2当量)を、ついでDIPEA(DMF中0.4M、1.0mL、4当量)を添加した。該混合物を周期的に30分間かき混ぜ、ついで該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して3回洗浄した:各洗浄では、DMF(2.0mL)を容器の上部に加え、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。該樹脂を次のように連続して4回洗浄した:各洗浄では、CH2Cl2(2.0mL)を容器の上部に加え、得られた混合物を周期的に90秒間かき混ぜ、その後で該溶液をフリットを通して排出させた。得られた樹脂をN2流の下に5分間置いた。
すべての操作は、特に断りのない限り、手動でなされた。「グローバル脱保護方法A」の操作は、0.050ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは樹脂と理論的に結合する最初の負荷アミノ酸のスケールで決定される。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.050ミリモルを越えてスケールアップすることができる。「脱保護溶液」は40mLのガラスバイアルにトリフルオロ酢酸(22mL)、水(1.25mL)、DTT(250mg)、およびトリイソプロピルシラン(0.5mL)を合わせて調製された。樹脂を反応容器から取り出し、4mLのガラスバイアルに移した。該バイアルに、樹脂を、つづいて「脱保護溶液」(1.0mL)を添加した。該混合物を振盪器で激しく混合した(約500RPMで40分間)。該混合物を0.2ミクロンのシリンジフィルターを通して濾過し、その固体をTFA(1.0mL)で抽出した。濾液を合わせ、充填した24mLの試験管に、Et2O(15mL)を添加した。混合物を激しく混合し、すると有意な量の白色固体が沈殿した。該混合物を5分間遠心分離に付し、次に溶液を固体からデカントさせ、廃棄した。固体をEt2O(20mL)に懸濁させ、5分間遠心分離に付し、溶液を固体からデカントさせ、廃棄して粗ペプチドを白色ないし灰白色の固体として得た。
すべての操作は、特に断りのない限り、手動でなされた。「環化方法A」の操作は、0.050ミリモルのスケールでなされる実験を記載し、そのスケールは、ペプチドを生成するのに使用された樹脂と理論的に結合して用いられる最初のアミノ酸の量で決定される。このスケールはその操作にて使用されるペプチドの量を直接測定することをベースとするものではない。操作は記載の容量をスケールの倍数で調整することにより0.100ミリモルを越えてスケールアップすることができる。粗ペプチドの固体をMeCN:0.2M水性炭酸水素アンモニウム(1:1)に総容量が18-22mLとなるように溶かした。標的とするpHは8.5~9.0である。ついで、該溶液を攪拌することなく12~18時間放置した。反応溶液を、加熱することなく、遠心分離による濃縮に付して濃縮し、次にその残渣をDMSO:MeOH(1mL:1mL)に溶かした。この溶液を逆相HPLC精製に供し、所望の環状ペプチドを得た。
「一般的合成シーケンスA」は、本明細書に記載の環状ペプチドを得るために使用された操作の一般的シーケンスを記載する。この一般的操作を行うことを目的として、「シンフォニー方法A」の操作は「プレリュード方法A」の操作と互換性がある。10mLのポリプロピレン製固相反応容器に、リンクアミド-メリフィールド樹脂(96mg)を加え、その反応容器をプレリュード型ペプチド合成装置に置いた。次に一連のアミノ酸カップリングを、仮に樹脂結合ペプチドのN-末端が第1アミンである場合には、プレリュード型の「プレリュード方法A:単一カップリング操作」に従って、樹脂結合ペプチドのN-末端が第2アミンである場合には、「プレリュード方法A:二重カップリング操作」に、あるいはカップリングされているAAがAA10位に組み込まれているならば、「単一カップリング操作-30分」に従って、連続的に実施された。「プレリュード方法A:クロロ酢酸カップリング操作」に従い;次に「グローバル脱保護方法A」に従い;ついで「環化方法A」に従った。
1H-インドール-3-カルバルデヒド(3g、20.53ミリモル)および炭酸セシウム(7.36g、22.58ミリモル)のDMF(82ml)中の0℃溶液に、2-ブロモ酢酸tert-ブチル(3.29ml、22.58ミリモル)を加え、氷浴を取り除くことで室温までの加温に付した。反応物を2時間攪拌した。反応物を水(500mL)中に注ぎ、Et2O(200mL)を添加した。生成物をEt2O層に抽出させた。層を分離し、水相をEt2O(100mL)で二度抽出した。Et2O層を合わせ、水で2x、ついでブラインで洗浄した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。その粗材料をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーに付し、0-30%EtOAc/ヘキサンの勾配を用いて精製した。生成物のフラクションを集め、溶媒を真空下で除去し、2-(3-ホルミル-1H-インドール-1-イル)酢酸tert-ブチル(5.23g(98%))を得た。ESI-MS(+)m/z 205.1(M+1-tBu);1H NMR(400MHz、クロロホルム-d) δ 10.28(s,1H)、8.35(d,J=8.1Hz,1H)、7.56 - 7.49 (m,1H)、7.45-7.36(m,2H)、5.18(s,2H)、1.48(s,9H)
(±)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-(ジメトキシホスフィニル)酢酸メチル(7.32g、22.10ミリモル)をCH2Cl2(50mL)に溶かし、窒素下で攪拌した。この溶液に、DBU(3.33mL、22.10ミリモル)を加え、該混合物を10分間攪拌し、つづいて2-(3-ホルミル-1H-インドール-1-イル)酢酸tert-ブチル(5.23g、20.09ミリモル)のCH2Cl2(50mL)中溶液を15-20分間にわたって滴下して加えた。攪拌を室温で16時間続けた。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をEtOAcで希釈し、5%クエン酸水溶液、ついでブラインで洗浄し、次に無水Na2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発させた。その粗材料をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーに付し、0-50%EtOAc/ヘキサンの勾配を用いて精製した。生成物のフラクションを集め、溶媒を真空下で除去し、(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)アクリル酸メチル(7.4g(79%))を得た。ESI-MS(+)m/z 466.0(M+1);1H NMR(400MHz、クロロホルム-d) δ 9.21(s,1H)、7.82(d,J=8.3Hz,1H)、7.52-7.23(m,8H)、6.90(s,1H)、5.23(s,2H)、5.08(s,2H)、3.86(s,3H)、1.44(s,9H)
(Z)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)アクリル酸メチル(7.4g、15.90ミリモル)を、Parrボトル中、MeOH(80mL)およびベンゼン(80mL)に溶かした。N2気体を該溶液に15分間にわたって通し、つづいて(+)-1,2-ビス((2S,5S)-2,5-ジエチルホスホラノ)ベンゼン(シクロオクタジエン)ロジウム(I)・トリフルオロメタンスルホン酸塩(0.115g、0.159ミリモル)を添加し、水素雰囲気(60psi)下に3日間置いた。反応物を珪藻土(セライト(Celite(登録商標)))を通して濾過し、真空下で濃縮した。その粗材料をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーに付し、0-50%EtOAc/ヘキサンの勾配を用いて精製した。生成物のフラクションを集め、溶媒を真空下で除去し、(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸メチル(7.43g、(100%))を得た。ESI-MS(+)m/z 468.0(M+1);1H NMR(400MHz、クロロホルム-d) δ 7.64(d,J=8.1Hz,1H)、7.44-7.26(m,7H)、7.15 (t,J=7.5Hz,1H)、5.87(d,J=7.8Hz,1H)、5.13(s,2H)、4.99(s,2H)、4.90-4.80(m,1H)、3.66(s,3H)、3.63-3.55(m,1H)、3.46 (dd,J=14.8、4.8Hz,1H)、1.42(s,9H)
水酸化リチウム(1.142g、47.7ミリモル)の水(39.7ml)中溶液を、(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸メチル(7.43g、15.89ミリモル)のTHF(39.7ml)中溶液に添加した。反応物を室温で30分間攪拌した。EtOAcを該反応物に添加し、1N HClを用いてpHを酸性にした。有機相を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィーに付し、0-10%MeOH/DCM w/0.1%AcOHを用いて精製した。生成物のフラクションを集め、溶媒を真空下で除去し、(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(3.9g(54%))を得た。ESI-MS(+)m/z 454.0(M+1);1H NMR(400MHz、DMSO-d6) δ 12.73 (br.s.,1H)、7.77(d,J=8.3Hz,1H)、7.56-7.50(m,2H)、7.40-7.24(m,5H)、7.14-7.08(m,1H)、5.15(s,2H)、5.00-4.89(m,2H)、4.42(td,J=8.6、5.1Hz,1H)、3.39-3.24(m,2H)、1.37(s,9H)
(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(3.88g、8.56ミリモル)をMeOH(80ml)/ベンゼン(20mL)に溶かし、N2雰囲気下に置いた。Pd-C(0.455g、0.428ミリモル)を激しく攪拌しながら該溶液に添加した。反応物をH2気体の雰囲気下に置き、16時間攪拌した。反応物を珪藻土(セライト(登録商標))を通して濾過し、真空下で濃縮して(S)-2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(2.74g(100%))を得、それを工程6にてそのまま用いた。ESI-MS(+)m/z 320.1(M+H);1H NMR(400MHz、DMSO-d6) δ 7.78(d,J=8.0Hz,1H)、7.54(d,J=8.5Hz,1H)、7.38(ddd,J=8.3、7.0、1.0Hz,1H)、7.13(t,J=7.2Hz,1H)、5.23-5.10(m,2H)、3.58(dd,J=9.0、4.0Hz,1H)、3.49(dd,J=15.6、4.0Hz,1H)、3.28(br.s.,2H)、3.17(dd,J=15.7、8.9Hz,1H)、1.41(s,9H)
(S)-2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(2.74g、8.58ミリモル)をTHF(34.3ml)に溶かし、つづいて水(34.3ml)を添加した。次に炭酸水素ナトリウム(1.442g、17.16ミリモル)を加え、つづいて(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(2.89g、8.58ミリモル)を添加した。反応物を2時間攪拌した。THFの大部分が真空下で除去され、次にEtOAcを添加した。混合物を1N HClでpH7の酸性にし、EtOAcで抽出した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮し、(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(4.9g、105%)を得、それをそのまま用いた。ESI-MS(+)m/z 542.1(M+H);1H NMR(400MHz、DMSO-d6) δ 7.87(d,J=7.5Hz,2H)、7.82(d,J=8.0Hz,1H)、7.70(d,J=8.3Hz,1H)、7.64(t,J=8.2Hz,2H)、7.52(d,J=8.3Hz,1H)、7.43-7.34(m,3H)、7.32-7.23(m,2H)、7.10(t,J=7.4Hz,1H)、5.15(s,2H)、4.42(td,J=8.8、5.0Hz,1H)、4.20-4.11(m,3H)、3.42-3.25(m,2H)、1.36(s,9H)
スキーム:
5-メトキシ-1H-インドール-3-カルバルデヒド(1.5g、8.56ミリモル)および炭酸セシウム(3.07g、9.42ミリモル)のDMF(34.2ml)中の0℃の溶液に、2-ブロモ酢酸tert-ブチル(1.373ml、9.42ミリモル)を添加し、氷浴を取り除くことで室温までの加温に付した。反応物を2時間攪拌した。反応物を水に注ぎ、Et2Oを添加した。生成物をEt2O層に抽出させた。その層を分離し、水相をEt2Oで二度抽出した。Et2O層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮し、2-(3-ホルミル-5-メトキシ-1H-インドール-1-イル)酢酸tert-ブチル(2.1g(85%))を得、それをそのまま次の工程に用いた。ESI-MS(+)m/z 290.1(M+H)
2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸ベンジル(1.55g、(3.8ミリモル)をDCM(11.52mL)に溶かし、窒素下で攪拌した。この溶液にDBU(0.573mL、3.80ミリモル)を加え、該混合物を10分間攪拌し、つづいて2-(3-ホルミル-5-メトキシ-1H-インドール-1-イル)酢酸tert-ブチル(1.0g、3.46ミリモル)のDCM(11.52mL)中溶液を15-20分間にわたって滴下して加えた。攪拌を室温で16時間続けた。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をEtOAcで希釈し、5%クエン酸水溶液で、次にブラインで洗浄し、ついで無水Na2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発させた。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィーに付し、20-70%EtOAc/ヘキサンの勾配を用いて精製した。生成物のフラクションを集め、溶媒を真空下で除去し、(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)アクリル酸ベンジル(1.6g、80%)を得た。ESI-MS(+)m/z 571.2(M+H)
(Z)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)アクリル酸ベンジル(700mg、1.227ミリモル)をMeOH(12ml)に溶かし、(+)-1,2-ビス((2S,5S)-2,5-ジエチルホスホラノ)ベンゼン(シクロオクタジエン)ロジウム(I)・トリフルオロメタンスルホン酸塩(8.86mg、0.012ミリモル)で処理し、水素雰囲気(60psi)下に3日間置いた。反応物を珪藻土(セライト(登録商標))を通して濾過し、真空下で濃縮して(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(702mg(100%))を得、それをそのまま次の工程に用いた。ESI-MS(+)m/z 573.2(M+H);1H NMR(400MHz、DMSO-d6) δ 7.87(d,J=7.8Hz,1H)、7.38-7.13(m,11H)、7.10-7.02(m,2H)、6.77(dd,J=8.8、2.3Hz,1H)、5.13-5.04(m,2H)、5.04-4.94(m,2H)、4.86(s,2H)、4.32(td,J=8.3、5.8Hz,1H)、3.72(s,3H)、1.39(s,9H)
(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(700mg、1.222ミリモル)をMeOH(12ml)に溶かし、N2雰囲気下に置いた。Pd-C(65.0mg、0.061ミリモル)を該溶液に激しく攪拌しながら添加した。該反応物をH2の雰囲気下に置き、16時間攪拌した。反応物を珪藻土(セライト(Celite(登録商標)))を通して濾過し、真空下で濃縮して(S)-2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(426mg(100%))を得、それを工程5にてそのまま用いた。ESI-MS(+)m/z 349.1(M+H)
(S)-2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(426mg、1.223ミリモル)をTHF(5ml)に溶かし、つづいて水(5.00ml)を添加した。次に炭酸水素ナトリウム(205mg、2.446ミリモル)を加え、つづいて(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(412mg、1.223ミリモル)を添加した。反応物を2時間攪拌した。THFの大部分を真空下で取り除き、次にEt2Oを添加した。有機層を捨て、水層を再びEt2Oで洗浄した。水相を集め、1N HClで酸性にし、EtOAcで抽出した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して粗生成物を得、それをさらに精製しなかった。LC/MSおよびNMRを用いて確認した。ESI-MS(+)m/z 571.1(M+H);1H NMR(400MHz、DMSO-d6) δ 12.71(br.s.,1H)、7.88(d,J=7.5Hz,2H)、7.72(d,J=8.3Hz,1H)、7.66(t,J=8.3Hz,2H)、7.40(td,J=7.1、4.1Hz,2H)、7.33-7.23(m,2H)、7.17(d,J=8.8Hz,1H)、7.13-7.08(m,2H)、6.76(dd,J=8.8、2.3Hz,1H)、4.85(s,2H)、4.24-4.14(m,3H)、3.76(s,3H)、3.14(dd,J=14.4、4.4Hz,1H)、2.99(dd,J=14.8、9.8Hz,1H)、1.38(s,9H)
スキーム:
1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-カルバルデヒド(1.5g、10.26ミリモル)および炭酸セシウム(3.68g、11.29ミリモル)のDMF(41.1ml)中の0℃での溶液に、2-ブロモ酢酸tert-ブチル(1.646ml、11.29ミリモル)を加え、氷浴を取り除くことで室温までの加温に付した。反応物を2時間攪拌した。該反応物を水に注ぎ、Et2Oを添加した。生成物をEt2O層に抽出させた。層を分離し、水相をEt2Oで二度抽出した。Et2O層を合わせ、水で2x、次にブラインで洗浄した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮し、2-(3-ホルミル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル)酢酸tert-ブチル(2.3g(86%))を得、それをそのまま次の工程に用いた。ESI-MS(+)m/z 205.1(M+1-tBu);1H NMR(400MHz、クロロホルム-d) δ 10.02(s,1H)、8.58(dd,J=7.8、1.5Hz,1H)、8.42(dd,J=4.8、1.5Hz,1H)、7.95(s,1H)、7.31-7.28(m,1H)、5.05(s,2H)、1.49(s,9H)
2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸ベンジル(2.348g、5.76ミリモル)をDCM(12mL)に溶かし、窒素下で攪拌した。この溶液に、DBU(0.637ml、4.23ミリモル)を加え、該混合物を10分間攪拌し、つづいて2-(3-ホルミル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル)酢酸tert-ブチル(1g、3.84ミリモル)のDCM(12mL)中溶液を滴下して加えた。攪拌を室温で16時間続けた。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をEtOAcで希釈し、5%クエン酸水溶液、およびブラインで洗浄し、次に無水Na2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発させた。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィーに付し、0-10%MeOH/DCMの勾配を用いて精製した。生成物のフラクションを集め、溶媒を真空下で除去し、(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル)アクリル酸ベンジル(1.54g(74%))を得た。
スキーム:
1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-3-カルバルデヒド(0.95g、6.50ミリモル)および炭酸セシウム(2.330g、7.15ミリモル)のDMF(26.0ml)中の0℃溶液に、2-ブロモ酢酸tert-ブチル(1.042ml、7.15ミリモル)を添加した。該混合物を氷浴を取り除くことで室温までの加温に付した。反応物を2時間攪拌した。該反応物を氷水(100mL)およびEtOAc(50mL)の混合物に注いだ。生成物をEtOAcに抽出させた。層を分離し、水相をEt2O(2x50mL)で二度抽出した。Et2O層を合わせ、ブラインで洗浄した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、2-(3-ホルミル-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-1-イル)酢酸tert-ブチル(1.24g(73%))をクリーンな生成物として得た。ESI-MS(-):MS m/z 259.1
(±)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-(ジメトキシホスフィニル)酢酸メチル(1.596g、4.82ミリモル)をDCM(15mL)に溶かし、窒素下にて0℃で5分間攪拌した。この溶液に、DBU(0.726ml、4.82ミリモル)を添加し、つづいて2-(3-ホルミル-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-1-イル)酢酸tert-ブチル(1.14g、4.38ミリモル)/DCM(15mL)溶液を10分間にわたって滴下して加えた。該混合物を室温で一夜攪拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、クエン酸5%水溶液で、ついでブラインで洗浄し、有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-3-イル)アクリル酸メチル(1.0g(49%))を生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 466.0
(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-3-イル)アクリル酸メチル(1.0g、2.15ミリモル)のメタノール(20mL)中溶液に、Pd/C(0.5g)を添加した。反応を55psiで2日間行った。Pd/Cを濾過し、メタノールおよびDCMで洗浄した。溶媒を濃縮し、2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-3-イル)プロパン酸メチル(0.54g(75%))を粗生成物として得、それを次の工程に直接用いた。ESI-MS(+):MS m/z 334.1
2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-3-イル)プロパン酸メチル(0.54g、1.62ミリモル)のTHF/H2O(1:1、10mL)中溶液に、LiOH(116mg、4.86ミリモル)を添加した。混合物を室温で9分間攪拌した。HClの1N溶液を添加することによって該混合物をpH=7に調整した。ついで炭酸水素ナトリウム(408mg、4.86ミリモル)およびFMOC-OSU(546mg、1.620ミリモル)を該混合物に加えた。得られた混合物を2時間攪拌した。5%クエン酸を加えてpHを7に調整し、水相を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-3-イル)プロパン酸(250mg(28.5%))を生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 542.2;1H NMR(メタノール-d4) δ 9.17(s,1H)、8.28(d,J=6.3Hz,1H)、7.82(t,J=6.8Hz,3H)、7.58(d,J=7.3Hz,1H)、7.62(d,J=7.3Hz,1H)、7.21-7.49(m,6H)、7.11-7.19(m,1H)、4.98-5.13(m,2H)、4.20-4.43(m,3H)、4.08-4.20(m,1H)、3.47-3.45(m,2H)、1.35-1.54(s,9H)
スキーム:
7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン(6g、50.4ミリモル)およびヘキサメチルアミンテトラミン(10.59g、76ミリモル)に、酢酸(20.00mL)および水(40mL)を窒素下で添加した。該反応混合物を加熱して還流させ、8時間攪拌した。該反応混合物を室温に冷却し、次に固体を濾過した。その固体をエーテルで3回洗浄した。該固体を乾燥させて7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-カルバルデヒド(5.6g(76%))を所望の生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 148.1;1H NMR(メタノール-d4) δ:10.00(s,1H)、9.43(s,1H)、8.91(s,1H)、8.40(s,1H)
7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-カルバルデヒド(5.41g、36.8ミリモル)および炭酸セシウム(13.18g、40.4ミリモル)のDMF(147ml)中の0℃溶液に、2-ブロモ酢酸tert-ブチル(5.90ml、40.4ミリモル)を添加した。該混合物を氷浴を取り除くことで室温までの加温に付した。反応物を2時間攪拌した。該反応混合物を水(500mL)およびEtOAc(300mL)の混合液に注いだ。該生成物をEtOAcに抽出させた。層を分離し、水相をEtOAc(2x150mL)で二度抽出した。EtOAc層を合わせ、ブラインで洗浄した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、2-(5-ホルミル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)酢酸tert-ブチル(6.60g(69%))をクリーンな生成物として得た。ESI-MS(-):MS m/z 262.0
(±)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-(ジメトキシホスフィニル)酢酸メチル(9.07g、27.4ミリモル)をDCM(70mL)に溶かし、窒素下にて0℃で5分間攪拌した。この溶液に、DBU(4.17ml、27.4ミリモル)を添加し、つづいて2-(5-ホルミル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)酢酸tert-ブチル(6.50g、24.88ミリモル)のDCM(50mL)中溶液を10分間にわたって滴下して加えた。該混合物を室温で一夜攪拌した。該反応混合物をEtOAcで希釈し、5%クエン酸水溶液/1N NaOH(pH=4)溶液で、ついでブラインで洗浄し、有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(7-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)アクリル酸メチル(11.55g(100%))を生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 467.0
(E)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(7-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)アクリル酸メチル(5.3g、11.36ミリモル)のメタノール(40mL)中溶液に、Pd/C(1.2g)を添加した。その反応を55psiで2日間実施させた。Pd/Cを濾過し、メタノールおよびDCMで洗浄した。溶媒を濃縮し、2-アミノ-3-(7-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)プロパン酸メチル(3.0g(79%))を生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 335.1
2-アミノ-3-(7-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)プロパン酸メチル(2.8g、8.37ミリモル)のTHF/H2O(1:1、40mL)中溶液に、LiOH(0.60g、25.1ミリモル)を添加した。混合物を室温で8分間攪拌した。1N HCl溶液を添加することで該混合物をpH=7に調整した。次に炭酸水素ナトリウム(2.11g、25.1ミリモル)およびFMOC-OSU(2.82g、8.37ミリモル)を該混合物に添加した。得られた混合物を2時間攪拌した。5%クエン酸を添加してpH=7に調整し、その水溶液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(7-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)プロパン酸(1.2g(26.4%))を生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 543.1;1H NMR(メタノール-d4) δ:8.75(s,1H)、7.79(d,J=7.5Hz,2H)、7.60(t,J=7.4Hz,1H)、7.20-7.45(m,7H)、4.95(s,2H)、4.57(d,J=8.3Hz,1H)、4.23-4.38(m,2H)、3.36-3.46(m,1H)、2.70(s,2H)、2.34(s,2H)、1.35-1.50(s,9H)
スキーム:
アザインドール(2.0g、16.93ミリモル)を、0℃のアルゴン雰囲気下で、塩化アルミニウム(11.29g、85ミリモル)/乾燥ジクロロメタン(85mL)に添加した。0℃で30分経過した後、該混合物を室温までの加温に供し、クロロオキソ酢酸エチル(11.56g、85ミリモル)を滴下して加えた。該反応混合物を激しく一夜攪拌し、次に氷を注意して添加した。4N NaOHで、ついで冷却したNaHCO3飽和溶液でpHを7に調整した。生成物をDCMで3回抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して2-オキソ-2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸エチルを黄色の油状残渣として得た。冷却した石油エーテルで洗浄した後、標記化合物を明黄色の粉末(280mg(7.6%))として得た。ESI-MS(-):MS m/z 217.1
TFA(2mL)およびトリエチルシラン(0.4mL)の混合物に、2-オキソ-2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸エチル(280mg、1.28ミリモル)を添加した。該混合物を55℃で16時間加熱した。室温に冷却した後、溶媒を除去し、飽和NaHCO3を、つづいてDCMを添加した。有機層を集め、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸エチルを粗生成物として得た。ESI-MS(-):MS m/z 203.1
工程2の粗材料の2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸エチルおよびLiOH(165mg、6.90ミリモル)をTHF/H2O(5mL、1:1)中にて室温で1時間攪拌した。1M HClを0℃で加え、pHを5に調整した。溶媒を除去し、残渣をメタノールで洗浄し、濾過し、有機層を乾燥させ、濃縮して2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸を粗生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 177.1
2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸(375mg、2.129ミリモル)のDCM(7.0mL)および酢酸tert-ブチル(3.0mL)中溶液に、過塩素酸(0.274mL、3.19ミリモル)を滴下して加えた。得られた溶液を室温で3時間攪拌した。明褐色の固体を濾過し、DCMで洗浄した。DCM層を濃縮した。次に水およびEtOAcを加えた。EtOAcを用いて生成物を2回抽出した。有機層を飽和NaHCO3で2回洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(100mg(20%))を生成物として得た。該材料を次の反応工程にそのまま用いた。ESI-MS(-):MS m/z 231.1
炭酸カリウム(357mg、2.58ミリモル)を2-(1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(100mg、0.431ミリモル)およびベンジル 2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパ-2-エノアート(162mg、0.431ミリモル)のアセトニトリル(5mL)中溶液に添加した。該反応混合物を50℃で一夜加熱した。反応物をEtOAcおよび水で希釈した。有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発させ、粗生成物を得た。該粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル}プロパン酸ベンジル(100mg、38%)を白色固体として得た。ESI-MS(+):MS m/z 610.3
工程5から由来の2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル}プロパン酸ベンジル(100mg、0.164ミリモル)およびPd-C(4.36mg、4.10マイクロモル)のMeOH(5mL)中溶液に、室温にてH2をゆっくりと6時間通気した。該反応混合物を珪藻土(セライト(登録商標))を通して濾過し、蒸発させて2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル}プロパン酸(80mg、94%)を得、それを精製することなく次の工程に用いた。ESI-MS(+):MS m/z 520.4
4M HCl/ジオキサン(2mL)を工程6より由来の2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル}プロパン酸に添加した。該混合物を30分間攪拌し、濃縮して2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル)プロパン酸を粗生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 320.1
炭酸水素ナトリウム(67.1mg、0.8ミリモル)およびFMOC-OSU(53.9mg、0.160ミリモル)を2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル)プロパン酸(51mg、0.16ミリモル)のTHF/水(4mL、1:1)中溶液に添加した。得られた混合物を2時間攪拌した。5%クエン酸を加えてpH=7に調整し、水溶液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させて真空下で濃縮させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して精製し、2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-ピロロ[3,2-b]ピリジン-1-イル)プロパン酸(10.7mg(12%))を生成物として得た。ESI-MS(+):MS m/z 542.2
2-(1H-インドール-3-イル)酢酸(500mg、2.85ミリモル)のDCM(25mL)およびTHF(2mL)中溶液に、2,2,2-トリクロロアセトイミド酸tert-ブチル(2.041mL、11.42ミリモル)を添加した。該反応物を室温で18時間攪拌した。反応揮発物を蒸発させ、粗材料をシリカゲル(40gカラム、5-50%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の2-(1H-インドール-3-イル)酢酸tert-ブチル(200mg、0.865ミリモル、収率30.3%)を黄色の油として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 7.55(dt,J=8.0、1.0Hz,1H)、7.36(dt,J=8.2、0.8Hz,1H)、7.15(s,1H)、7.12(td,J=7.6、1.1Hz,1H)、7.05-7.01(m,1H)、3.67(d,J=0.8Hz,2H)、1.46(s,9H)
2-(1H-インドール-3-イル)酢酸tert-ブチル(0.57g、2.5ミリモル)およびベンジル 2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパ-2-エノアート(0.85g、2.2ミリモル)のアセトニトリル(15mL)中溶液に、炭酸カリウム(1.9g、13ミリモル)を添加した。反応物を室温で18時間攪拌した。室温で攪拌した後、反応は起こらなかった。次に該反応を50℃で24時間加熱した。反応物を冷却し、EtOAcで希釈し、水で洗浄した。有機相をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させ、粗生成物を得た。その粗生成物をシリカゲル(40gカラム、5-40%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸ベンジル(830mg、1.4ミリモル、収率61%)を透明な油として得た。1H NMR(500MHz、クロロホルム-d) δ 7.59(d,J=7.9Hz,1H)、7.41-7.38(m,6H)、7.33-7.30(m,1H)、7.19(td,J=7.6、1.0Hz,1H)、7.13-7.08(m,1H)、7.05(s,1H)、5.28-5.19(m,3H)、4.87(dd,J=15.1、4.7Hz,1H)、3.68-3.55(m,2H)、1.47(s,9H)、1.43(s,9H)、1.28(s,9H);分析条件A:保持時間=1.69分;ESI-MS(+)m/z 631.3(M+Na)
H2を、2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸ベンジル(830mg、1.4ミリモル)およびPd-C(36mg、0.034ミリモル)のMeOH(10mL)中溶液にゆっくりと吹き込み、次にH2の陽圧下にて室温で2日間放置した。反応物をナイロン製フリットフィルターを通して濾過し、揮発物を蒸発させて2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(700mg、1.4ミリモル、収率100%)を透明な油として得た。分析条件A:保持時間=1.46分;ESI-MS(+)m/z 541.3(M+Na)
HClのジオキサン中0℃溶液(4M、5.0ml)に、2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(700mg、1.4ミリモル)をN2の陽圧下で添加した。氷浴を取り外し、反応物を室温で30分間攪拌した。反応揮発物を加熱することなく減圧下で蒸発させ、2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(480mg、1.4ミリモル、収率100%)を粘着性の油として得た。分析条件A:保持時間=0.91分;ESI-MS(+)m/z 262.95(M-t-ブチル)
2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸・HCl塩(480mg、1.4ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(570mg、6.8ミリモル)のアセトン(5.00mL)および水(10mL)中溶液に、(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(460mg、1.4ミリモル)を添加した。反応物を18時間攪拌した。該反応物をHCl水溶液(1.0M)を用い、激しく攪拌しながらゆっくりとpH5の酸性にした。反応溶液をDCMと分離させた。有機層を水で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。その粗材料をシリカゲルクロマトグラフィー(40gカラム、20-80%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物を白色固体として得た。その精製した材料をキラル分離を行うためにSFCに供した。SFCより最初に溶出したピークは(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(90mg、0.166ミリモル、収率12.28%)であった。2番目に溶出したピークは(R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(88mg、0.16ミリモル、収率12%)であった。分析条件A:保持時間=1.44分;ESI-MS(+)m/z 563.1(M+Na)
DCM(10mL)に溶かした(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(1.2g、2.2ミリモル)の溶液に、TFA(10mL)を添加した。反応物を室温で1時間攪拌した。反応揮発物を蒸発させ、高真空下に一夜置き、生成物の(S)-2-(3-(3-(ベンジルオキシ)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-オキソプロピル)-1H-インドール-1-イル)酢酸(1.0g、2.1ミリモル、収率93%)を得た。分析条件A:保持時間=1.25分;ESI-MS(+)m/z 509.2(M+Na)
乾燥DCM(20mL)に溶かした(S)-2-(3-(3-(ベンジルオキシ)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-オキソプロピル)-1H-インドール-1-イル)酢酸(1.01g、2.076ミリモル)に、メタンスルホンアミド(0.197g、2.076ミリモル)、EDC(0.438g、2.284ミリモル)およびDMAP(0.279g、2.284ミリモル)を添加した。反応物を室温で4日間攪拌した。該溶液をHCl水溶液(1M)で、つづいてブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して減圧下で蒸発させ、その粗材料の(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(メチルスルホンアミド)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(900mg、1.6ミリモル、収率77%)を得た。分析条件A:保持時間=1.79分;ESI-MS(+)m/z 586.1(M+Na)
H2を、(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(メチルスルホンアミド)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(896mg、1.590ミリモル)およびPd-C(169mg、0.159ミリモル)のMeOH(20mL)中溶液に、5分間にわたって吹き込んだ。次に、反応物をH2の陽圧下で2日間放置した。該反応物にN2を吹き込み、次にナイロン製フリットフィルターを通して濾過した。揮発物を減圧下で蒸発させ、生成物の(S)-2-アミノ-3-(1-(2-(メチルスルホンアミド)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(424mg、1.25ミリモル、収率79%)を粘着性の油として得た。分析条件A:保持時間=0.87分;ESI-MS(+)m/z 340(M+H)
(S)-2-アミノ-3-(1-(2-(メチルスルホンアミド)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(424mg、1.249ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(525mg、6.25ミリモル)のアセトン(8.00mL)および水(8mL)中溶液に、(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(421mg、1.249ミリモル)を添加した。反応物を18時間攪拌した。その反応物をHCl水溶液(1M)を用いて激しく攪拌しながらゆっくりとpH5の酸性にした。水層を25mlのEtOAcと分離させた。有機層を水で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、揮発物を減圧下で蒸発させた。その粗材料を逆相クロマトグラフィー(移動相A:5%アセトニトリル、95%水、10mM酢酸アンモニウム;移動相B:95%アセトニトリル、5%水、10mM酢酸アンモニウム;20カラム容量で10%B-50%Bとする)に付して精製し、生成物の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(メチルスルホンアミド)-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(330mg、0.59ミリモル、収率47%)をオフホワイトの固体として得た。分析条件B:保持時間=1.14分;ESI-MS(+)m/z 561.9(M+H)
(S)-2-(3-(3-(ベンジルオキシ)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-オキソプロピル)-1H-インドール-1-イル)酢酸(0.897g、1.844ミリモル)の溶液に、CDI(0.389g、2.397ミリモル)を加え、該反応物を3時間攪拌した。次に水酸化アンモニウム(0.287mL、7.37ミリモル)を添加し、反応物をさらに3時間攪拌した。該反応物をDCM(50mL)で希釈し、水性HCl(1M)で洗浄した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させ、粗生成物の(S)-3-(1-(2-アミノ-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸ベンジル(865mg、1.782ミリモル、収率97%)を得、それを次の反応工程にてそのまま用いた。分析条件A:保持時間=1.14分;ESI-MS(+)m/z 561.9(M+H)
(S)-3-(1-(2-アミノ-2-オキソエチル)-1H-インドール-3-イル)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸ベンジル(865mg、1.782ミリモル)のDMF(12mL)中溶液に、2,4,6-トリクロロ-1,3,5-トリアジン(164mg、0.891ミリモル)を室温で添加した。反応物を18時間攪拌した。さらに1当量のトリアジンを加え、2時間後、LCMSにおいて生成物まで完全に進行したことが見られた。反応物をEtOAcで希釈し、水で洗浄した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させた。粗生成物をシリカ(40gカラム、10-50%EtOAc:ヘキサン)で精製し、生成物の(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(シアノメチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(600mg、1.28ミリモル、収率72%)を明褐色の泡沫体として得た。分析条件A:保持時間=1.33分;ESI-MS(+)m/z 490.2(M+Na)
(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(シアノメチル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸ベンジル(300mg、0.642ミリモル)の水(2.0ml)および2-プロパノール(1.0ml)中溶液に、アジ化ナトリウム(83mg、1.283ミリモル)および臭化亜鉛(II)(72.3mg、0.321ミリモル)を添加し、90℃で加熱した。反応物を18時間加熱して攪拌した。反応物を冷却した後、水性HCl(1M、10mL)を、つづいてEtOAc(50mL)を添加した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させて、粗材料の(S)-3-(1-((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)-1H-インドール-3-イル)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸ベンジル(328mg、0.6ミリモル、収率100%)を得た。分析条件A:保持時間=1.23分;ESI-MS(+)m/z 533.3(M+Na)
H2を、(S)-3-(1-((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)-1H-インドール-3-イル)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸ベンジル(160mg、0.31ミリモル)およびPd-C(33mg、0.03ミリモル)のMeOH(5mL)中溶液に、5分間にわたって吹き込んだ。次に反応物をH2の陽圧下で攪拌しながら2日間放置した。反応物をナイロン製フリットフィルターを通して濾過し、減圧下で蒸発させた。生成物の(S)-3-(1-((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)-1H-インドール-3-イル)-2-アミノプロパン酸(89mg、0.311ミリモル、収率100%)を次の工程に直に適用させた。分析条件A:保持時間=0.7分;ESI-MS(+)m/z 287(M+H)
(S)-3-(1-((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)-1H-インドール-3-イル)-2-アミノプロパン酸(89mg、0.31ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(130mg、1.6ミリモル)のアセトン(2.0mL)および水(4.0mL)中溶液に、(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(110mg、0.31ミリモル)を添加した。反応物を18時間攪拌した。該反応物を水性HCl(1M)および激しい攪拌を用いてゆっくりとpH5の酸性にした。該反応物をDCMで分離させた。有機層を水で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、揮発物を減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。その粗材料を分取性HPLC(サンファイアー(SunFire)Prep C18 30x100 カラムサイズ;15分間にわたって0.1%TFA緩衝液と共に95:5 CH3CN:水で10-100%勾配とする)に付して精製し、生成物の(S)-3-(1-((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)-1H-インドール-3-イル)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸(104mg、0.205ミリモル、収率65.8%)を白色固体として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 7.77(d,J=7.4Hz,2H)、7.66-7.63(m,1H)、7.59(dd,J=7.4、3.2Hz,1H)、7.40-7.34(m,3H)、7.33(d,J=8.2Hz,2H)、7.29-7.21(m,3H)、7.20-7.15(m,2H)、7.11-7.06(m,1H)、5.70-5.62(m,2H)、4.57-4.51(m,1H)、4.36-4.19(m,2H)、4.17-4.10(m,1H)、3.37(dd,J=14.7、4.9Hz,1H)、3.23-3.10(m,1H);分析条件A:保持時間=1.14分;ESI-MS(+)m/z 509.1(M+H)
2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸メチル(10g、30ミリモル)のTHF(50mL)およびMeOH(50mL)中溶液に、水酸化リチウム・モノ水和物水溶液(18mL、2.0M)をゆっくりと滴下して加えた。反応物を室温で1時間攪拌した。該反応物をHCl水溶液(1.0M)で酸性にし、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させ、粗材料の2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸(8.0g、25ミリモル、収率84%)を得た。分析条件A:保持時間=1.06分;ESI-MS(+)m/z 339.8(M+Na)
2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸(8.0g、25ミリモル)およびDBU(3.8ml、25ミリモル)のアセトニトリル(17mL)中溶液に、(ブロモメチル)ベンゼン(3.15ml、26.5ミリモル)を添加した。反応物を室温で18時間攪拌した。反応物を水で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させて粗生成物を得た。その粗生成物をシリカゲル(80gカラム、0-100%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸ベンジル(4.5g、11ミリモル、収率44%)を白色固体として得た。1H NMR(500MHz、クロロホルム-d) δ 7.47-7.32(m,10H)、5.64(d,J=7.9Hz,1H)、5.33(d,J=12.1Hz,1H)、5.24(d,J=12.1Hz,1H)、5.21-5.11(m,2H)、5.04-4.94(m,1H)、3.79-3.67(m,6H);分析条件A:保持時間=1.39分;ESI-MS(+)m/z 430.0(M+Na)
2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸(3.44g、12.15ミリモル)のDCM(100mL)中溶液に、DMAP(0.148g、1.215ミリモル)を、つづいて2-(トリメチルシリル)エタノール(1.741mL、12.15ミリモル)およびN1-((エチルイミノ)メチレン)-N3,N3-ジメチルプロパン-1,3-ジアミン・HCl(2.79g、14.58ミリモル)を添加した。反応物を室温で2時間攪拌した。有機層をHCl(1M)で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて生成物の2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸2-(トリメチルシリル)エチル(4.4g、11.47ミリモル、収率94%)を透明な油として得た。1H NMR(500MHz、クロロホルム-d) δ 4.94-4.78(m,1H)、4.39-4.25(m,2H)、3.84(d,J=4.9Hz,3H)、3.86(d,J=5.0Hz,3H)、1.48(s,9H)、1.15-1.05(m,2H)、0.09-0.06(m,9H).
3-(tert-ブトキシ)-3-オキソプロパン酸(0.7mL、4.6ミリモル)、ピリジン-2-イルメタナミン(0.48mL、4.6ミリモル)、およびEDC(0.98g、5.1ミリモル)の溶液に、DMAP(0.62g、5.1ミリモル)を添加した。反応物を室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、次にEtOAcで希釈した。有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、ついでブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させ、粗生成物を得た。その粗生成物をシリカゲル(40gカラム、0-5%MeOH:DCM)に付して精製し、生成物の3-オキソ-3-((ピリジン-2-イルメチル)アミノ)プロパン酸tert-ブチル(830mg、3.3ミリモル、収率72%)を黄色の油として得た。分析条件A:保持時間=0.882分;ESI-MS(+)m/z 251.2(M+H)
3-オキソ-3-((ピリジン-2-イルメチル)アミノ)プロパン酸tert-ブチル(2g、8.0ミリモル)およびピリジン(3.9ml、48ミリモル)の0℃でのDCM(53ml)中溶液に、POCl3(0.90ml、9.6ミリモル)を添加し、室温までの加温に供した。反応物を1時間攪拌した。その反応材料を分離漏斗に移し、炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させ、粗生成物の2-(イミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(1.8g、7.8ミリモル、収率97%)を得た。分析条件A:保持時間=0.942分;ESI-MS(+)m/z 233.2(M+H)
DMF(0.40ml、5.2ミリモル)およびピリジン(2.1ml、26ミリモル)の0℃でのDCM(29ml)中溶液に、POCl3(0.50ml、5.2ミリモル)を加え、5分間攪拌した。ついで2-(イミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(1.0g、4.3ミリモル)をDCM(5.0mL)中溶液として添加し、室温までの加温に供した。反応物を18時間攪拌した。次に該反応物に、炭酸ナトリウム飽和水溶液を加え、10分間激しく攪拌した。次に二相混合物を分離し、有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて粗材料を得た。その粗材料をシリカゲル(80gカラム、20-80%EtOAc:ヘキサン)上で精製し、純水な生成物の2-(1-ホルミルイミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(876mg、3.37ミリモル、収率78%)を褐色のフレーク状の固体として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 9.97(s,1H)、8.41(d,J=7.1Hz,1H)、8.25(dt,J=9.1、1.1Hz,1H)、7.47(ddd,J=9.1、6.7、0.9Hz,1H)、7.13(td,J=6.9、1.1Hz,1H)、4.24(s,2H)、1.49-1.38(m,9H);分析条件A:保持時間=2.1分;ESI-MS(+)m/z 261(M+H)
2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸ベンジル(850mg、2.1ミリモル)のDCM(15mL)中溶液に、DBU(0.29mL、1.9ミリモル)をN2雰囲気下にてゆっくりと添加した。10分後、2-(1-ホルミルイミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(450mg、1.729ミリモル)(2mLのDCM中)を反応混合物にゆっくりと添加した。反応物を18時間攪拌した。反応物を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー(80gカラム、20-50%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の(Z)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)アクリル酸tert-ブチル(800mg、1.5ミリモル、収率85%)を透明な油として得た。分析条件A:保持時間=1.49分;ESI-MS(+)m/z 542.5(M+H)
N2を、(Z)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)アクリル酸ベンジル(400mg、0.739ミリモル)のMeOH(10mL)中溶液に、室温にて5分間にわたって吹き込んだ。次にPd-C(79mg、0.074ミリモル)を加え、ついで該反応混合物にH2を5分間吹き込み、その後でH2の陽圧下にて攪拌しながら2時間放置した。反応物をナイロン製フリットフィルターを通して濾過し、揮発物を蒸発させて生成物の2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)プロパン酸(239mg、0.739ミリモル、収率100%)を得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 3.96-3.82(m,2H)、3.82-3.69(m,1H)、2.94-2.83(m,1H)、2.82-2.63(m,2H)、2.02-1.92(m,2H)、1.87-1.79(m,2H)、1.51-1.45(m,9H);分析条件A:保持時間=0.747分;ESI-MS(+)m/z 324.2(M+H)
2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)プロパン酸(240mg、0.74ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(310mg、3.7ミリモル)のアセトン(5mL)および水(5mL)中溶液に、(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(250mg、0.740ミリモル)を添加した。該反応物を18時間攪拌した。該反応物を激しく攪拌しながら水性HCl(1.0M)を用いてゆっくりとpH5の酸性にした。反応物を25mlのEtOAcで分離させた。有機層を水で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。その粗材料を逆相クロマトグラフィー(55gカラム、10-100%CH3CN:水+0.1%TFA)に付して精製し、生成物の2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)プロパン酸(300mg、0.55ミリモル、収率74%)を白色の固体として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 7.86-7.77(m,2H)、7.71-7.61(m,2H)、7.45-7.37(m,2H)、7.37-7.29(m,2H)、4.40-4.17(m,5H)、4.00(t,J=6.0Hz,3H)、3.21-3.07(m,1H)、2.96(dd,J=15.0、8.4Hz,1H)、2.80-2.72(m,2H)、2.06-1.87(m,2H)、1.87-1.75(m,2H)、1.51-1.40(m,9H);分析条件A:保持時間=1.13分;ESI-MS(+)m/z 546.4(M+H)
2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸2-(トリメチルシリル)エチル(4.75g、12.4ミリモル)のDCM(25mL)中溶液に、DBU(1.9mL、12.3ミリモル)をN2雰囲気下でゆっくりと添加した。10分後に、2-(1-ホルミルイミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)酢酸tert-ブチル(1.00g、3.84ミリモル)/DCM(5mL)を該反応混合物にゆっくりと添加した。反応物を18時間攪拌した。反応揮発物を蒸発させ、その粗材料をシリカゲルクロマトグラフィー(80gカラム、20-50%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の(Z)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)アクリル酸2-(トリメチルシリル)エチル(1.39g、2.30ミリモル、収率70%)を透明な油として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 8.13(d,J=7.1Hz,1H)、7.74(dt,J=9.2、1.1Hz,1H)、7.06(s,1H)、7.02(ddd,J=9.3、6.5、0.8Hz,1H)、6.87-6.79(m,1H)、4.43-4.29(m,2H)、4.17(s,2H)、1.52-1.48(m,9H)、1.46(s,9H)、1.17-1.10(m,2H)、0.13-0.09(m,9H);分析条件F:保持時間=2.24分;ESI-MS(+)m/z 518.4(M+H)
(Z)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)アクリル酸2-(トリメチルシリル)エチル(1.40g、2.69ミリモル)のテトラヒドロフラン(30ml)中溶液を(+)-1,2-ビス((2s,5s)-2,5-ジエチルホスホラノ)ベンゼン(シクロオクタジエン)ロジウム(i)トリフルオロメタンスルホナート(0.06g、0.081ミリモル)で処理し、PARRボンベ中にて水素雰囲気(20バール)下に置いた。反応物を72時間攪拌した。反応揮発物を蒸発させ、その粗材料をシリカゲル(80gカラム、5-40%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の(S)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロパン酸2-(トリメチルシリル)エチル(380mg、0.729ミリモル、収率27%)を明橙色の泡沫体として得た。分析条件F:保持時間=1.64分;ESI-MS(+)m/z 520.5(M+H)
(S)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロパン酸2-(トリメチルシリル)エチル(240mg、0.462ミリモル)の室温でのTHF(4mL)中溶液に、フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム(0.460mL、0.462ミリモル)を添加し、1時間攪拌した。次に反応揮発物を蒸発させ、EtOAc(10mL)で希釈した。ついで有機層をMgSO4で乾燥させ、ナイロン製フリットフィルターを通して濾過し、揮発物を減圧下で蒸発させた。次に該残渣を高真空下に30分間置き、生成物の(S)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロパン酸(194mg、0.462ミリモル、収率100%)を暗橙色残渣として得た。分析条件A:保持時間=0.93分;ESI-MS(+)m/z 420.2(M+H)
N2の陽圧下にある(S)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロパン酸(194mg、0.462ミリモル)含有のバイアルに、HCl(1.2mL、ジオキサン中4M)を添加し、室温で1時間攪拌した。次に反応揮発物を減圧下の室温で蒸発させて生成物の(S)-2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)プロパン酸・HCl塩(165mg、0.464ミリモル、収率100%)を粘着性の泡沫体として得た。分析条件F:保持時間=0.96分;ESI-MS(+)m/z 320.1(M+H)
(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(203mg、0.603ミリモル)を、(S)-2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)プロパン酸・HCl(195mg、0.548ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(230mg、2.74ミリモル)のアセトン(3mL)および水(3mL)中溶液に添加し、室温で1時間攪拌した。反応物をHCl(1M)で中和し、pHを5-6とした。次のその中和した溶液をEtOAcおよび水で希釈した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させ粗材料を得た。その粗材料を分取性HPLC(サンファイアー(SunFire)Prep C18 30x100カラムサイズ;15分間にわたって0.1%TFA緩衝液と共に95:5 CH3CN:水で10-100%勾配とする)に付して精製し、純水な生成物の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-1-イル)プロパン酸(165mg、0.305ミリモル、収率55.6%)を褐色の泡沫体として得た。分析条件A:保持時間=1.09分;ESI-MS(+)m/z 542.3(M+H)
2-ブロモピリジン(2.50ml、25.3ミリモル)、アクリル酸tert-ブチル(18.4ml、127ミリモル)、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(0.114g、1.013ミリモル)、炭酸カリウム(3.50g、25.3ミリモル)、および臭化テトラブチルアンモニウム(8.16g、25.3ミリモル)の脱気処理に付したDMF(100ml)中溶液に、酢酸パラジウム(II)(0.114g、0.506ミリモル)を加え、圧力容器にて120℃に加熱し、14時間攪拌した。14時間後、反応物を冷却し、水(100ml)中に注ぎ、EtOAc(100ml)で抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて粗生成物を得た。該粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(120gカラム、5-25%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の(E)-3-(ピリジン-2-イル)アクリル酸tert-ブチル(1.5g、7.31ミリモル、収率28.9%)を褐色の油として得た。1H NMR(500MHz、クロロホルム-d) δ 8.69-8.59(m,1H)、7.76-7.68(m,1H)、7.65-7.55(m,1H)、7.47-7.40(m,1H)、7.27(ddd,J=7.6、4.8、1.1Hz,1H)、6.85(d,J=15.8Hz,1H)、1.60-1.50(m,9H);分析条件A:保持時間=1.02分;ESI-MS(+)m/z 206.1(M+H)
(E)-3-(ピリジン-2-イル)アクリル酸tert-ブチル(1.00g、4.87ミリモル)の1,4-ジオキサン(35mL)中溶液に、ヒドロキシルアミン(水中50%、3.22g、48.7ミリモル)を、つづいて硫酸テトラ-n-ブチルアンモニウム(水中50%、0.06g、0.049ミリモル)を添加した。反応物を4日間攪拌した。次に該反応物をEtOAcで希釈し、水で洗浄した。次に有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて生成物の3-(ヒドロキシアミノ)-3-(ピリジン-2-イル)プロパン酸tert-ブチル(1.10g、4.62ミリモル、収率95%)を得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 8.58-8.41(m,1H)、7.82(td,J=7.7、1.7Hz,1H)、7.52(d,J=7.9Hz,1H)、7.33(ddd,J=7.5、5.0、1.3Hz,1H)、4.43(t,J=7.1Hz,1H)、2.85-2.67(m,2H)、1.38(s,9H);分析条件A:保持時間=0.80分;ESI-MS(+)m/z 239.2(M+H)
3-(ヒドロキシアミノ)-3-(ピリジン-2-イル)プロパン酸tert-ブチル(500mg、2.10ミリモル)の0℃に冷却した酢酸(5mL)中溶液に、亜鉛(500mg、7.65ミリモル)を添加した。次に反応物を室温までの加温に供し、3時間攪拌した。反応スラリーをMeOH(5mL)で希釈し、ナイロン製フリットフィルターを通して濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させ、次にトルエン(20mLx3)との共沸蒸留(3回)に付し、粘着性の残渣を得た。その粘着性の残渣を高真空下に24時間置き、生成物の3-アミノ-3-(ピリジン-2-イル)プロパン酸tert-ブチル(466mg、2.096ミリモル、収率100%)を白色泡沫体として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 8.63(d,J=4.9Hz,1H)、8.11-8.05(m,1H)、7.65(d,J=8.0Hz,1H)、7.60-7.55(m,1H)、4.69(dd,J=7.7、4.7Hz,1H)、3.02-2.83(m,2H)、1.48-1.43(m,9H);分析条件A:保持時間=1.10分;ESI-MS(+)m/z 223.1(M+H)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(アリルオキシ)-4-オキソブタン酸(740mg、1.87ミリモル)のDCM(15mL)中溶液に、HATU(712mg、1.871ミリモル)を、つづいてヒューニッヒ塩基(1.634mL、9.36ミリモル)を添加し、しつおんで20分間攪拌した。次に3-アミノ-3-(ピリジン-2-イル)プロパン酸tert-ブチル(416mg、1.871ミリモル)を加え、室温で1時間攪拌した。ついで反応物を水およびDCMで希釈した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過して蒸発させて粗材料を得た。その粗材料をシリカゲル(40gカラム、10-70%EtOAc:ヘキサン)を介して精製し、生成物の(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-((3-(tert-ブトキシ)-3-オキソ-1-(ピリジン-2-イル)プロピル)アミノ)-4-オキソブタン酸アリル(263mg、0.439ミリモル、収率23.43%)を明褐色油として得た。分析条件A:保持時間=1.22分;ESI-MS(+)m/z 600.3(M+H)
1ドラムバイアル中の(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-((3-(tert-ブトキシ)-3-オキソ-1-(ピリジン-2-イル)プロピル)アミノ)-4-オキソブタン酸アリル(263mg、0.439ミリモル)およびピリジン(0.210mL、2.63ミリモル)の0℃でのDCM(3.00mL)中溶液に、POCl3(0.05mL、0.526ミリモル)を添加し、室温までの加温に供し、次に18時間攪拌した。18時間攪拌した後、反応物をDCMで希釈し、炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した。次に有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて粗生成物を得た。その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(40gカラム、10-60%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)プロパン酸アリル(136mg、0.234ミリモル、収率53.3%)を明褐色の泡沫体として得た。分析条件A:保持時間=1.20分;ESI-MS(+)m/z 582.3(M+H)
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)プロパン酸アリル(136mg、0.234ミリモル)の0℃でのTHF(5mL)中溶液に、N-メチルアニリン(0.130mL、1.17ミリモル)を、つづいてPd(Ph3P)4(27.0mg、0.023ミリモル)を添加した。次に反応物を室温までの加温に供し、1時間攪拌した。反応揮発物を蒸発させて粗材料を得た。その粗材料を分取性HPLC(サンファイアー(SunFire)Prep C18 30x100カラムサイズ;
15分間にわたって0.1%TFA緩衝液と共に95:5 CH3CN:水で10-100%勾配とする)に付して精製し、生成物の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)イミダゾ[1,5-a]ピリジン-3-イル)プロパン酸(105mg、0.194ミリモル、収率83%)を白色泡沫体として得た。
2-(5-ブロモ-1H-インドール-3-イル)酢酸tert-ブチル(500mg、1.6ミリモル)およびベンジル 2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパ-2-エノアート(640mg、1.7ミリモル)のアセトニトリル(10mL)中溶液に、炭酸カリウム(1.3g、9.6ミリモル)を添加した。反応物を室温で18時間攪拌した。該反応物をEtOAcで希釈し、水で洗浄した。有機層をブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物を逆相クロマトグラフィー(55gカラム、5-100%CH3CN:水+0.1%TFA)に付して精製し、2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(5-ブロモ-3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸ベンジル(1.12g、1.626ミリモル、収率101%)を白色固体として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 7.98-7.90(m,1H)、7.49(dd,J=8.9、1.8Hz,1H)、7.43-7.33(m,6H)、5.49(t,J=7.2Hz,1H)、5.26(d,J=2.7Hz,2H)、5.04(d,J=7.1Hz,2H)、3.93-3.82(m,2H)、1.48-1.45(m,9H)、1.31-1.27(m,18H);分析条件A:保持時間=1.84分;ESI-MS(+)m/z 712.2(M+Na)
H2を、2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(5-ブロモ-3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸ベンジル(1.0g、1.5ミリモル)およびPd-C(0.16g、0.15ミリモル)のMeOH(20mL)中溶液に5分間にわたって吹き込んだ。次に該反応物をH2の陽圧下で攪拌しながら2時間放置した。反応物にN2を吹き込み、次にスラリーをナイロン製フリットフィルターを通して濾過した。揮発物を減圧下で蒸発させ、2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(0.76g、1.5ミリモル、収率100%)を粘着性の油として得た。分析条件A:保持時間=1.63分;ESI-MS(+)m/z 542.2(M+Na)
HCl/ジオキサン(5.0ml、4.0M)を2-(ビス(((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-((2-メチル-2-プロパニル)オキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(781mg、1.503ミリモル)に加え、0℃で30分間攪拌し、次に室温までの加温に供し、30分間攪拌した。反応揮発物を減圧下で加熱することなく蒸発させ、2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸・HCl塩(540mg、1.5ミリモル、収率100%)を白色固体として得た。分析条件A:保持時間=1.18分;ESI-MS(+)m/z 320(M+H)
2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸・HCl塩(540mg、1.5ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(630mg、7.5ミリモル)のアセトン(10mL)および水(10mL)中溶液に、(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(510mg、1.5ミリモル)を添加した。反応物を室温で18時間攪拌した。該反応物を激しく攪拌しながら水性HCl(1.0M)を用いてゆっくりとpH5の酸性にした。水層を25mlのEtOAcで分離させた。有機層を水で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、揮発物を減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。その粗材料を分取性HPLC(10-100%CH3CN:水+0.1%TFA)に付して精製し、純粋な生成物の2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-1-イル)プロパン酸(131mg、0.242ミリモル、収率16.1%)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR(500MHz、メタノール-d4) δ 7.79(d,J=7.4Hz,2H)、7.71(d,J=8.2Hz,1H)、7.58-7.50(m,3H)、7.41-7.34(m,3H)、7.26(q,J=7.4Hz,2H)、7.13(t,J=7.5Hz,1H)、4.85-4.81(m,2H)、4.79-4.68(m,1H)、4.17(dd,J=7.3、1.7Hz,2H)、4.08(d,J=7.3Hz,1H)、3.92(s,2H)、1.46-1.39(m,9H);分析条件A:保持時間=1.75分;ESI-MS(+)m/z 542.1(M+H)
1H-インドール-2-カルボン酸(2.0g、12.4ミリモル)のDCM(50mL)中の0℃溶液に、2,2,2-トリクロロアセトイミド酸tert-ブチル(2.4mL、13.7ミリモル)を加え、0℃で30分間攪拌し、ついで室温までの加温に供した。反応物を18時間攪拌した。反応物を濾過し、揮発物を減圧下で蒸発させて粗材料を得、それをシリカゲル(40gカラム、5-40%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(2.2g、9.9ミリモル、収率80%)を透明な油として得た。1H NMR(500MHz、クロロホルム-d) δ 8.90(br.s.,1H)、7.70(dd,J=8.0、0.9Hz,1H)、7.44(dd,J=8.4、0.9Hz,1H)、7.33(ddd,J=8.2、7.1、1.1Hz,1H)、7.19-7.13(m,2H)、1.65(s,9H)
2-ブロモ酢酸tert-ブチル(0.85mL、5.8ミリモル)および1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(1.2g、5.3ミリモル)の溶液に、炭酸セシウム(1.9g、5.8ミリモル)を添加した。反応物を室温で18時間攪拌した。反応物を水で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層を水で、ついでブラインで洗浄し、集め、MgSO4で乾燥させ、濾過し、揮発物を蒸発させて粗生成物を得た。該粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(40gカラム、10-60%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(1.7g、5.2ミリモル、収率97%)を色の明るい油として得た。分析条件A:保持時間=1.54分;ESI-MS(+)m/z 332.0(M+H)
1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(1.7g、5.2ミリモル)のDCM(50mL)およびDMF(0.80mL、10ミリモル)中の攪拌溶液に、室温にてPOCl3(0.96mL、10ミリモル)を添加し、次に緩やかに1時間還流させた。ついで反応物を室温に冷却した。反応揮発物を蒸発させ、その粗材料をシリカゲル(40gカラム、5-40%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-3-ホルミル-1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(1.0g、2.8ミリモル、収率54%)を明黄色の固体として得た。1H NMR(500MHz、クロロホルム-d) δ 10.70(s,1H)、8.55(d,J=8.0Hz,1H)、7.47-7.42(m,1H)、7.40-7.37(m,1H)、7.37-7.33(m,1H)、5.23(s,2H)、1.68(s,9H)、1.51-1.44(m,9H);分析条件A:保持時間=1.43分;ESI-MS(+)m/z 248(M-2t-ブチル基)
2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-2-(ジメトキシホスホリル)酢酸ベンジル(1.2g、3.0ミリモル)のDCM(20mL)中溶液に、DBU(0.42mL、2.8ミリモル)をN2雰囲気下にてゆっくりと添加した。10分後、1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-3-ホルミル-1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(900mg、2.5ミリモル)のDCM(2mL)中溶液を該反応混合物にゆっくりと加えた。反応物を2日間攪拌した。次に反応揮発物を蒸発させ、その粗材料をシリカゲル(80gカラム、0-25%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、(Z)-3-(3-(ベンジルオキシ)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-オキソプロパ-1-エン-1-イル)-1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(680mg、1.1ミリモル、収率43%)を無色油として得た。分析条件A:保持時間=1.61分;ESI-MS(+)m/z 663.2(M+Na)
(Z)-3-(3-(ベンジルオキシ)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-オキソプロパ-1-エン-1-イル)-1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボン酸tert-ブチル(680mg、1.1ミリモル)およびPd-C(28mg、0.027ミリモル)のMeOH(10mL)中溶液に、H2をゆっくりと通気させ、室温で2日間攪拌した。その反応スラリーをナイロン製フリットフィルターを通して濾過し、揮発物を蒸発させ、粗生成物の2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(440mg、1.1ミリモル、収率99%)を得た。分析条件A:保持時間=1.04分;ESI-MS(+)m/z 419.3(M+H)
2-アミノ-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(440mg、1.1ミリモル)および炭酸水素ナトリウム(450mg、5.3ミリモル)のアセトン(5.00mL)および水(10mL)中溶液に、(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)炭酸(9H-フルオレン-9-イル)メチル(358mg、1.061ミリモル)を添加した。反応物を18時間攪拌した。該反応物を激しく攪拌しながら水性HCl(1.0M)を用いてゆっくりとpH5の酸性にした。次にその酸性にした溶液をDCMで分離させた。有機層を水で、つづいてブラインで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥させ、揮発物を減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。その粗材料をシリカゲル(40gカラム、20-80%EtOAc:ヘキサン)に付して精製し、生成物を白色泡沫体として得た。該材料をSFCキラル精製手段に付してさらに精製し、生成物の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(100mg、0.156ミリモル、収率14.71%)および(R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-1H-インドール-3-イル)プロパン酸(98mg、0.153ミリモル、収率14.42%)を白色泡沫体として得た。分析条件A:保持時間=1.53分;ESI-MS(+)m/z 663.2(M+Na)
攪拌棒を備えた40mLのバイアルに、(R)-2-アミノプロパン酸tert-ブチル・モノHCl塩(2.0g、11ミリモル)、1-フルオロ-2-ニトロベンゼン(1.553g、11.01ミリモル)、炭酸カリウム(3.04g、22.0ミリモル)およびDMF(30mL)を入れた。該バイアルを70℃の加熱ブロックに18時間置いた。反応混合物を500mLの分離漏斗に移し、水(100mL)で希釈した。該混合物をEtOAc(2x100mL)で抽出した。有機液を合わせ、水(100mL)で、次にブライン(75mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、ついで真空下で濃縮した。得られた残渣を最小量のアセトンに溶かし、次に真空下にて珪藻土(セライト(登録商標))上で濃縮した。得られた粉末をシリカゲルクロマトグラフィー(40gカラム、ヘキサン:EtOAc 100:0→90:10)に付し、(R)-2-((2-ニトロフェニル)アミノ)プロパン酸tert-ブチル(2.359g、80%)を橙色の油として得た。
攪拌棒を備え、(R)-2-((2-ニトロフェニル)アミノ)プロパン酸tert-ブチル(2.359g、8.86ミリモル)を入れた100mLの丸底フラスコに、MeOH(40mL)およびパラジウム/炭素(デグサ型(Degussa type)E101 NE/W、10%Pd乾燥ベース、約50重量%水、0.471g、0.221ミリモル)を加えた。該フラスコをラバーセプタムで密封し、該混合物にN2を注入することで15分間かき混ぜ、次に該混合物にH2を注入することで5分間かき混ぜた。該混合物をH2のバルーン圧の下で16時間攪拌した。該混合物を珪藻土(セライト(登録商標))を通して濾過し、濾過パッドをMeOHで抽出した。濾液を合わせ、真空下で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(25g Interchim 25ミクロンカラム、ヘキサン:EtOAc 100:0→50:50)に付し、(R)-2-((2-アミノフェニル)アミノ)プロパン酸tert-ブチル(1.100g、53%)を赤色の液体として得た。13C-NMR(100MHz、CDCl3) δ 173.86、135.61、134.82、119.89、119.25、116.36、113.07、80.95、52.65、27.59、18.73
攪拌棒を備え、(R)-2-((2-アミノフェニル)アミノ)プロパン酸tert-ブチル(1.100g、4.66ミリモル)を入れた50mLのフラスコに、THF(25mL)、DIPEA(3.00mL、17.5ミリモル)および1,1’-カルボニルジイミダゾール(2.83g、17.5ミリモル)を個々に添加した。該バイアルを密封し、溶液を室温で2時間攪拌した。反応溶液を250mLの分離漏斗に移し、Et2O(75mL)で希釈し、次に水性HCl(1M、50mL)で洗浄した。有機相を水(50mL)で、次にブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過して、ついで真空下、珪藻土(セライト(登録商標))上で濃縮した。得られた粉末をシリカゲルクロマトグラフィー(40gSiO2カラム、ヘキサン:EtOAc 90:10→50:50)に付し、(R)-2-(2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸tert-ブチル(828.1mg、68%)をオフホワイト色の固形泡沫体として得た。1H-NMR(500MHz、CDCl3) δ 9.09(br.s.,1H)、7.13-7.03(m,3H)、7.02-6.95(m,1H)、5.19(q,J=7.4Hz,1H)、1.70(d,J=7.4Hz,3H)、1.41(s,9H)
攪拌棒を備えた40mLのバイアルに、ベンジル 2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパ-2-エノアート(1.192g、3.16ミリモル)、(R)-2-(2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸tert-ブチル(828.1mg、3.16ミリモル)、およびMeCN(15mL)を添加した。該溶液に炭酸カリウム(2.618g、18.94ミリモル)を加えた。該バイアルに栓をし、60℃の加熱ブロックに攪拌しながら2時間置いた。その反応混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮した。得られた残渣をアセトンに溶かし、次に珪藻土(セライト(登録商標))上にて真空下で濃縮した。得られた粉末をSiO2クロマトグラフィー(80gシリカゲルカラム、ヘキサン:EtOAc 100:0→50:50)に供し、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[(2R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸ベンジル(ジアステレオマー比率 1:1、1.841g、91%)を無色の固形泡沫体として得た。
攪拌棒を備え、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[(2R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸ベンジル(920.3mg、1.439ミリモル)/MeOH(20mL)を入れた100mLの丸底フラスコに、パラジウム/炭素(デグサ型 E101 NE/W、10%Pd乾燥ベース、約50重量%水、153mg、0.072ミリモル)を加えた。該フラスコをラバーセプタムで密封した。溶液にN2を注入することで15分間かき混ぜ、次に該溶液にH2を注入することで5分間かき混ぜた。次にシステムをH2のバルーン圧の下に置き、一方で該混合物を1.5時間攪拌した。該溶液にN2を注入することで15分間かき混ぜ、次に珪藻土(セライト(登録商標))を通して濾過した。濾過ケーキをMeOHで抽出し、濾液を合わせ、真空下で濃縮し、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[(2R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸(ジアステレオマー比率 1:1、791mg、100%)を無色の固形泡沫体として得た。
2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[(2R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸(0.791g、1.44ミリモル)を入れ、0℃浴で冷却した、100mLの丸底フラスコに、HClのジオキサン中の0℃溶液(5mL、4M、20ミリモル)を加えた。該溶液を0℃で1時間攪拌し、次に真空下で濃縮し、分析に付して、一部が所望の生成物に変換したことが分かった。該溶液を0℃で1時間攪拌し、ついで真空下で濃縮し、分析に付して、一部が所望の生成物に変換したことが分かった。固体を含有する100mLの丸底フラスコを0℃浴に戻し、該フラスコにHClのジオキサン中0℃溶液(5mL、4M、20ミリモル)を加えた。該溶液を0℃で1.5時間攪拌し、ついで真空下で濃縮し、粗2-アミノ-3-(3-((R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル)-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸・HLC塩を白色の固体として得、それをそのまま次の工程に用いた。
2-アミノ-3-(3-((R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル)-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸(1.439ミリモル)の水(12mL)およびアセトン(6mL)中溶液に、炭酸水素ナトリウム(604mg、7.20ミリモル)を、ついで(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)炭酸(9H-フルオレン-9-イル)メチル(485mg、1.44ミリモル)を添加した。該溶液を一夜(18時間)攪拌した。反応混合物を珪藻土(セライト(登録商標))上の真空下で濃縮し、得られた粉末をC18クロマトグラフィー(カラム=55g Interchim Puriflash C18-HP30ミクロン;溶媒A=水中0.1%TFA;溶媒B=アセトニトリル中0.1%TFA;勾配=15カラム容量で15%Bから80%Bとする)に供した。生成物含有のフラクションをプールし、真空下で濃縮し、揮発物を除去して水溶液を得、それをEtOAcを入れた125mLの分離漏斗に移した。該混合物をブライン(10mL)でさらに希釈した。該混合物をEtOAc(2x50mL)で抽出した。有機液を合わせ、ブライン(25mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、次に真空下で濃縮して黄色の固形泡沫体の生成物をジアステレオマーの混合物(468.2mg)として得た。その材料の一部を次に示されるSFC精製:カラム=キラルパック(Chiralpak)AD-H分取性カラム、30x250mm、5μm;移動相=20%MeOH/CO2、150バール;温度=35℃;流速=70.0mL/分、19分間;UVを220nmでモニター観察;注入=約30mgを1mLのMeOH:CHCl3(2:1)に付き含む溶液を0.25ml(スタック注入により約246mgを精製)に供した。7.63分でのピークを集め、(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-((R)-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソプロパン-2-イル)-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸を得た。1H NMR(400MHz、CD3OD) δ 7.78(d,J=7.5Hz,2H)、7.57(d,J=7.5Hz,2H)、7.37(t,J=7.4Hz,2H)、7.32-7.22(m,3H)、7.13-7.03(m,3H)、5.09(q,J=7.3Hz,1H)、4.68(d,J=4.3Hz,1H)、4.47-4.38(m,1H)、4.27(dd,J=14.7、8.9Hz,1H)、4.17-4.11(m,2H)、4.10-4.03(m,1H)、1.59(d,J=7.3Hz,3H)、1.36(s,9H)
シュレンク(Schlenk)アダプターを備え、N2atm下に置かれた250mLの乾燥丸底フラスコに、DMF(60mL)、1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-オール(6.93g、51.7ミリモル)および2-ブロモ酢酸tert-ブチル(9.6g、49.2ミリモル)を添加した。該溶液を0℃に冷却した。その溶液に、水素化ナトリウム(油中60w/w%分散液、2.264g、56.6ミリモル)を加えた。混合物を0℃(t=0)で1時間攪拌した。該溶液にNaHCO3飽和水溶液(60mL)を添加した。その混合物は粘性が極めて大きくなり、攪拌ができなくなった。該混合物を室温までの加温に短期間にわたって供し、次に該混合物を水(250mL)を用いて1Lの分離漏斗に移した。混合物をEtOAc(400mL)で抽出し、有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、次に真空下で濃縮させた。残渣を最少量のアセトンに溶かし、ついで真空下にて珪藻土(セライト(登録商標))上で乾燥させた。この粉末をSiO2クロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc 100:0→0:100、生成物は溶出が2番目に大きなピークである)に供し、2-(2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)酢酸tert-ブチル(3.301g、27%)を淡黄色の固体として得た。1H-NMR(500MHz、CDCl3) δ 8.60(br.s.,1H)、7.12-7.04(m,3H)、6.92-6.86(m,1H)、4.53(s,2H)、1.47(s,9H)
攪拌棒を備えた、40mLのバイアルに、ベンジル 2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパ-2-エノアート(1.382g、3.66ミリモル)、2-(2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)酢酸tert-ブチル(1.00g、4.03ミリモル)およびMeCN(18mL)を添加した。その溶液に、炭酸カリウム(3.04g、22.0ミリモル)を加えた。バイアルに栓をし、それを攪拌しながら50℃の加熱ブロック中に2時間置いた。反応混合物を珪藻土(セライト(登録商標))を介して濾過し、濾過ケーキをMeCN(20mL)で抽出した。濾液を真空下で濃縮し、残渣を最少量のアセトンに溶かし、次に真空下にて珪藻土(セライト(登録商標))上で濃縮した。得られた粉末をSiO2クロマトグラフィー(80gシリカゲルカラム、ヘキサン:EtOAc 100:0→50:50)に供し、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸ベンジル(2.167g、収率95%)を黄色の油として得た。1H-NMR(500MHz、CDCl3) δ 7.38-7.29(m,5H)、7.06-7.01(m,2H)、7.00-6.95(m,1H)、6.85-6.80(m,1H)、5.47(dd,J=9.8、4.3Hz,1H)、5.22(s,2H)、4.66-4.49(m,3H)、4.40(d,J=17.7Hz,1H)、1.44(s,9H)、1.31(s,18H)
攪拌棒を備え、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸ベンジル(1.083g、1.731ミリモル)/メタノール(20mL)を入れた、100mLの丸底フラスコに、炭素パラジウム(デグサ型(Degussa type)E101 NE/W、10%Pd乾燥ベース、約50wt%水、0.184g、0.087ミリモル)を加えた。該フラスコをラバーセプタムで栓をした。該溶液をN2を15分間注入することでかき混ぜ、次に該溶液をH2を5分間注入することでかき混ぜた。次に該混合物を2時間攪拌しながら、システムをH2バルーン圧の下に置いた。該溶液をN2を15分間注入することでかき混ぜ、次に該溶液に、珪藻土(セライト(登録商標))を添加した。混合物を濾過し、濾過ケーキをメタノールで抽出した。濾液を真空下で濃縮し、2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸(917.7mg、99%)を得た。
2-{ビス[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{3-[2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-1-イル}プロパン酸(917.7mg、1.713ミリモル)を入れ、0℃浴で冷却した、100mLの丸底フラスコに、HClのジオキサン中0℃溶液(5mL、4M、20ミリモル)を添加した。該溶液を0℃で1時間攪拌し、次に真空下で濃縮させた。ジクロロメタン(50mL)との共蒸発を用いて、微量の溶媒を取り除き、2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸・HCl塩(710.8mg)を無色の固体として得た。この材料のすべてを工程6に用いた。
2-アミノ-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸・モノHCl塩(1.713ミリモル)の水(12mL)およびアセトン(6mL)中溶液に、炭酸水素ナトリウム(720mg、8.57ミリモル)を、次に(9H-フルオレン-9-イル)メチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボナート(578mg、1.71ミリモル)を添加した。該溶液を室温で18時間攪拌した。該反応溶液を真空下にて珪藻土(セライト(登録商標))上で濃縮させ、得られた固体をC18クロマトグラフィー(Interchim C18 55g 30ミクロンカラム、勾配=10CVにわたって水:MeCN 50:50~水:MeCN 0:100とし、5CVを100%MeCNで保持する)に供した。生成物のフラクションを合わせ、真空下で濃縮して水相を得、次にそれをEtOAc(2x100mL)で抽出した。有機相を合わせ、MgSO4で乾燥させ、濾過し、次に真空下で濃縮して2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)プロパン酸(483.2mg、2工程を通して22%)を白色固体として得た。1H-NMR(500MHz、アセトン-d6) δ 7.84(d,J=7.6Hz,2H)、7.71-7.61(m,2H)、7.40(t,J=7.4Hz,2H)、7.34-7.26(m,3H)、7.12-7.00(m,4H)、4.72(td,J=8.0、4.8Hz,1H)、4.63-4.54(m,2H)、4.47-4.36(m,2H)、4.25-4.21(m,2H)、4.20-4.14(m,1H)、1.43(s,9H)
分析条件C:保持時間=1.59分;ESI-MS(+)m/z 983.1(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.32分;ESI-MS(+)m/z 983.0(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:982.4750;測定値:982.4796.
分析条件C:保持時間=1.45分;ESI-MS(+)m/z 1003.2(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.17分;ESI-MS(+)m/z 1004.1(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:1003.5145;測定値:1003.5111
分析条件C:保持時間=1.76分;ESI-MS(+)m/z 1979.0(M+H)
分析条件D:保持時間=1.63分;ESI-MS(+)m/z 991.2(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:990.4633;測定値:990.4601
分析条件C:保持時間=1.33分;ESI-MS(+)m/z 996.6(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.62分;ESI-MS(+)m/z 996.5(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:996.4733;測定値:996.4698
分析条件C:保持時間=1.82分;ESI-MS(+)m/z 999.1(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.67分;ESI-MS(+)m/z 999.6(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:998.4486;測定値:998.4448
分析条件C:保持時間=1.72分;ESI-MS(+)m/z 1016.6(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.62分;ESI-MS(+)m/z 1015.9(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.58分;ESI-MS(+)m/z 1022.5(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.56分;ESI-MS(+)m/z 1022.3(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:1021.9788;測定値:1021.9747
分析条件C:保持時間=1.75分;ESI-MS(+)m/z 1024.8(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.98分;ESI-MS(+)m/z 1024.7(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:1023.9540;測定値:1023.9506
分析条件C:保持時間=1.58分;ESI-MS(+)m/z 947.1(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.44分;ESI-MS(+)m/z 946.4(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:946.4980;測定値:946.4946
分析条件C:保持時間=1.54分;ESI-MS(+)m/z 1015.6(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.52分;ESI-MS(+)m/z 989.7(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.43分;ESI-MS(+)m/z 1975.9(M-H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:989.4655;測定値:989.4619
分析条件C:保持時間=1.56分;ESI-MS(+)m/z 944.5(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.38分;ESI-MS(+)m/z 944.6(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.63分;ESI-MS(+)m/z 966.0(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.53分;ESI-MS(+)m/z 967.2(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:965.9796;測定値:965.9790
分析条件C:保持時間=1.59分;ESI-MS(+)m/z 960.6(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.39分;ESI-MS(+)m/z 959.2(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:959.4879;測定値:959.4848
分析条件C:保持時間=1.56分;ESI-MS(+)m/z 1901.9(M-H)
分析条件D:保持時間=1.31分;ESI-MS(+)m/z 952.3(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:952.4798;測定値:952.4758
分析条件C:保持時間=1.52分;ESI-MS(+)m/z 945.1(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.36分;ESI-MS(+)m/z 945.0(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.56分;ESI-MS(+)m/z 945.1(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.23分;ESI-MS(+)m/z 944.4(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:944.4824;測定値:944.4783
分析条件C:保持時間=1.54分;ESI-MS(+)m/z 925.0(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.38分;ESI-MS(+)m/z 925.2(M+2H)
ESI-HRMS(+)m/z:計算値:924.4611;測定値:924.4596
分析条件C:保持時間=1.46分;ESI-MS(+)m/z 687.3(M+3H)
分析条件D:保持時間=1.17分;ESI-MS(+)m/z 687.4(M+3H)
分析条件C:保持時間=1.56分;ESI-MS(+)m/z 956.2(M+2H)
分析条件D:保持時間=1.31分;ESI-MS(+)m/z 957.1(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.40分;ESI-MS(+)m/z 944.60(M+2H).
分析条件D:保持時間=1.12分;ESI-MS(+)m/z 944.80(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.44分;ESI-MS(+)m/z 945.30(M+2H).
分析条件D:保持時間=1.15分;ESI-MS(+)m/z 945.25(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.48分;ESI-MS(+)m/z 944.70(M+2H).
分析条件D:保持時間=1.26分;ESI-MS(+)m/z 944.45(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.66分;ESI-MS(+)m/z 944.3(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.40分;ESI-MS(+)m/z 944.2(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.70分;ESI-MS(+)m/z 916.0(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.37分;ESI-MS(+)m/z 916.0(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.30分;ESI-MS(+)m/z 916.2(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.16分;ESI-MS(+)m/z 916.1(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.61分;ESI-MS(+)m/z 930.1(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.37分;ESI-MS(+)m/z 930.1(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.57分;ESI-MS(+)m/z 916.0(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.32分;ESI-MS(+)m/z 915.9(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.53分;ESI-MS(+)m/z 944.1(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.29分;ESI-MS(+)m/z 944.4(M+2H)
分析条件C:保持時間=1.57分;ESI-MS(+)m/z 959.2(M+2H)
分析条件E:保持時間=1.35分;ESI-MS(+)m/z 959.3(M+2H)
本開示の大環状ペプチドのPD-L1との結合能を、PD-1/PD-L1の均一性時間分解蛍光測定(HTRF)結合アッセイを用いて測定した。
可溶性PD-1の可溶性PD-L1との結合の均一性時間分解蛍光測定(HTRF)アッセイ:可溶性PD-1および可溶性PD-L1は、膜貫通領域を除去し、異種配列と、具体的にはヒト免疫グロブリンG配列(Ig)のFc部またはヘキサヒスチジンエピトープタグ(His)と融合する、カルボキシル末端が切断されたタンパク質をいう。結合実験はすべて、0.1%(w/v)ウシ血清アルブミンおよび0.05%(v/v)ツィーン-20を補足したdPBSからなるHTRFアッセイ緩衝液中でなされた。PD-1-Ig/PD-L1-Hisの結合アッセイの場合、阻害剤を、アッセイ緩衝液(4μl)中、PD-L1-His(最終10nM)と一緒に15分間予めインキュベートし、つづいてアッセイ緩衝液(1μl)中のPD-1-Ig(最終20nM)を添加し、さらに15分間インキュベートした。ヒト、カニクイザル、マウスまたは他の種のいずれかより由来のPD-L1融合タンパク質を用いた。HTRF検出は、ユーロピウムクリプタート標識の抗モノクローナル抗体(最終1nM)およびアロフィコシアニン(APC)標識の抗Hisモノクローナル抗体(最終20nM)を用いて達成された。抗体をHTRF検出緩衝液で希釈し、5μlを結合反応の上部に分注した。反応を30分間にわたって平衡にさせ、シグナル(665nm/620nmの割合)をEn Vision蛍光光度計を用いて得た。さらなる結合アッセイが、PD-1-Ig/PD-L2-His(各々、20および5nM)、CD80-His/PD-L1-Ig(各々、100および10nM)およびCD80-His/CTLA4-Ig(各々、10および5nM)の間で達成された。ビオチニル化された化合物番号71と、ヒトPD-L1-Hisとの間の結合/競合実験が次のようになされた。大環状ペプチドの阻害剤を、アッセイ緩衝液(4μl)中、PD-L1-His(最終10nM)と一緒に60分間予めインキュベートし、つづいてアッセイ緩衝液(1μl)中のビオチニル化された化合物番号71(最終0.5nM)を添加した。結合を30分間にわたって平衡にさせ、つづいてユーロピウムクリプタート標識のストレプトアビジン(最終2.5pM)およびAPC標識の抗-His(最終20nM)/HTRF(5μl)緩衝液を添加した。反応を30分間にわたって平衡にさせ、シグナル(665nm/620nmの割合)をEn Vision蛍光光度計を用いて得た。
Claims (8)
- 免疫応答の強化、刺激および/または亢進のための、請求項1の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- がん細胞の成長、増殖または転移を阻害するための、請求項1の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- がんが、黒色腫、腎細胞がん、扁平非小細胞肺がん(NSCLC)、非扁平NSCLC、結腸直腸がん、去勢抵抗性前立腺がん、卵巣がん、胃がん、肝細胞がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、食道、消化器および乳房のがん腫、および血液悪性腫瘍より選択される、請求項3に記載の医薬組成物。
- 感染病を治療するための、請求項1の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- 感染病がウイルスにより引き起こされる、請求項5に記載の医薬組成物。
- 敗血性ショックを治療するための、請求項1の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- PD-L1とPD-1および/またはCD80との相互作用を遮断するための、請求項1の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む、医薬組成物。
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