相關申請案之交叉參考 本申請案主張2016年4月5日申請的美國臨時專利申請案序號62/318,417的權益，該臨時專利申請案以全文引用的方式併入本文中。 根據本發明，吾等已發現肽特異性結合至PD-L1且能夠抑制PD-L1與PD-1及CD80之相互作用。此等巨環肽展現活體外免疫調節功效，因此使其成為用於治療包括癌症及感染性疾病之各種疾病的治療性候選物。 術語「特異性結合(specific binding或specifically bind)」係指蛋白質與結合分子(諸如化合物或配位體)之間的相互作用。相互作用取決於由結合分子識別之蛋白質的特別結構(亦即酶結合位點、抗原決定子或抗原決定基)的存在。舉例而言，若化合物特異性結合蛋白質結合位點「A」，則在含有包括結合位點A之蛋白質及特異性結合至蛋白質結合位點A之經標記肽的反應物中存在該化合物將減小結合至該蛋白質之經標記肽的量。相比之下，化合物對蛋白質之非特異性結合並不導致經標記肽自蛋白質之濃度依賴性置換。 本發明意欲包括存在於本發明化合物中之原子的所有同位素。同位素包括原子數相同、但質量數不同之彼等原子。作為一般實例但非限制性地，氫之同位素包括氘及氚。碳之同位素包括
13
C及
14
C。本發明之同位素標記化合物一般可藉由熟習此項技術者已知之習知技術或藉由類似於本文所述之方法，使用適當同位素標記試劑代替原來使用之未標記試劑來製備。此類化合物可具有多種潛在用途，例如在測定生物活性時用作標準物及試劑。在穩定同位素之情況下，此類化合物可具有有利地調節生物學、藥理學或藥物動力學特性之潛能。 本文所述之標的物的另一態樣為所揭示之肽作為放射性標記配位體用於配位體結合分析之顯影或用於監測活體內吸附、代謝、分佈、受體結合或佔有率或化合物處置之用途。舉例而言，本文所述之巨環肽可使用放射性同位素
125
I製備，且所得放射性標記肽可用於顯影結合分析或用於代謝研究。作為替代方案且出於相同目的，本文所述之巨環肽可藉由使用熟習此項技術者已知之方法的催化性氚化轉化成放射性標記形式。 本發明之巨環肽亦可藉由使用熟習此項技術者已知之方法添加放射性示蹤劑而用作PET成像劑。 較佳肽包括本文所提供之巨環肽中之至少一者且此等肽可包括於醫藥組合物及組合中。 除非在特定情形中另外限制，否則本文所提供之定義非限制性地適用於本說明書通篇所用的術語。 一般熟習胺基酸及肽化學之技術者瞭解胺基酸包括由以下通式結構表示之化合物：
其中R及R'如本文中所論述。 除非另外指明，否則如本文中單獨或作為另一基團之一部分使用之術語「胺基酸」包括(但不限於)連接至稱為「α」碳之同一碳的胺基及羧基，其中R及/或R'可為天然或非天然側鏈，包括氫。在「α」碳處之絕對「S」組態通常稱為「L」或「天然」組態。在「R」及「R'」(主要)取代基等於氫之情況下，胺基酸為甘胺酸且並非對掌性。 如本文所用，術語「天然胺基酸側鏈」及「天然存在之胺基酸側鏈」係指通常呈S-組態之任何天然存在之胺基酸(亦即L-胺基酸) (亦即丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、-組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸)側鏈。 如本文所用，術語「非天然胺基酸側鏈」及「非天然存在之胺基酸側鏈」係指通常呈R-組態之任何天然存在之胺基酸(亦即D-胺基酸)側鏈或除呈R-或S-組態之天然存在之胺基酸側鏈(亦即分別D-或L-胺基酸)以外之選自以下之基團： C
2
-C
7
烯基、C
1
-C
3
烷氧基C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
6
烷氧基羰基C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
7
烷基、C
1
-C
3
烷基硫基C
1
-C
3
烷基、醯胺基C
1
-C
3
烷基、胺基C
1
-C
3
烷基、苯并噻唑基C
1
-C
3
烷基、苯并噻吩基C
1
-C
3
烷基、苯甲氧基C
1
-C
3
烷基、羧基C
1
-C
3
烷基、C
3
-C
14
環烷基C
1
-C
3
烷基、C
3
-C
6
環烷基C
1
-C
3
烷基、二苯甲基、呋喃基C
1
-C
3
烷基、咪唑基C
1
-C
3
烷基、萘基C
1
-C
3
烷基、吡啶基C
1
-C
3
烷基、噻唑基C
1
-C
3
烷基、噻吩基C
1
-C
3
烷基； 氮雜吲哚基C
1
-C
3
烷基，其中該氮雜吲哚基C
1
-C
3
烷基之氮雜吲哚基部分視情況經一個或兩個獨立地選自以下之取代基取代：C
1
-C
6
烷氧基、C
1
-C
6
烷基、(C
1
-C
6
烷基)S(O)
2
NHC(O)C
1
-C
3
烷基、羧基、羧基C
1
-C
3
烷基、氰基、鹵基、羥基、四唑基、四唑基C
1
-C
3
烷基及苯基，其中該苯基另外視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C
1
-C
3
烷氧基、C
1
-C
3
烷基及鹵基之基團取代； 聯苯C
1
-C
3
烷基，其中該聯苯視情況經甲基取代； -(CH
2
)
n
Q'，其中n為1-3且Q'為含有兩個、三個或四個氮原子之五員、六員稠合飽和或不飽和環系統，其中該環系統視情況經一個、兩個或三個選自以下之基團取代：C
1
-C
6
烷氧基、C
1
-C
6
烷基、(C
1
-C
6
烷基)S(O)
2
NHC(O)C
1
-C
3
烷基、(C
1
-
6
烷基)磺醯胺基C
1
-C
3
烷基、羧基、羧基C
1
-C
3
烷基、氰基、鹵基、羥基、四唑基、四唑基C
1
-C
3
烷基及苯基，其中該苯基另外視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C
1
-C
3
烷氧基、C
1
-C
3
烷基及鹵基之基團取代；其限制條件為Q'不為氮雜吲哚基或吲哚基；或 -(CH
2
)
n
Z'，其中n為1-3且Z'為含有一個、兩個、三個或四個氮原子之六員、六員稠合飽和或不飽和環系統，其中該環系統視情況經一個、兩個或三個選自以下之基團取代：C
1
-C
6
烷氧基、C
1
-C
6
烷基、(C
1
-C
6
烷基)S(O)
2
NHC(O)C
1
-C
3
烷基、羧基、羧基C
1
-C
3
烷基、氰基、鹵基、羥基、四唑基、四唑基C
1
-C
3
烷基及苯基，其中該苯基另外視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C
1
-C
3
烷氧基、C
1
-C
3
烷基及鹵基之基團取代； 雜環基，其視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之基團取代：C
1
-C
4
烷氧基、C
1
-C
4
烷基、C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基、醯胺基、胺基、胺基C
1
-C
3
烷基、胺基磺醯基、羧基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷基、羥基、-NC(NH
2
)
2
、硝基及-OP(O)(OH)
2
； 吲哚基C
1
-C
3
烷基，其中該吲哚基部分視情況經一個或兩個選自以下之基團取代：(C
1
-
6
烷基)S(O)
2
NHC(O)C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
6
烷氧基、C
1
-C
3
烷基、羧基、羧基C
1
-C
3
烷基、氰基、鹵基、羥基、四唑基、四唑基C
1
-C
3
烷基及苯基，其中該苯基另外視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C
1
-C
3
烷氧基、C
1
-C
3
烷基及鹵基之基團取代； 苯基，其視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之基團取代：C
1
-C
4
烷氧基、C
1
-C
4
烷基、C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基、醯胺基、胺基、胺基C
1
-C
3
烷基、胺基磺醯基、羧基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷基、羥基、-NC(NH
2
)
2
、硝基及-OP(O)(OH)
2
； NR
a
R
b
(C
1
-C
7
烷基)，其中R
a
及R
b
獨立地選自氫、C
2
-C
4
烯氧基羰基、C
1
-C
3
烷基、C
1
-C
3
烷基羰基、C
3
-C
6
環烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。當烷基連接基團含有一個以上碳時，另一NR
a
R
b
基團可在鏈上。 NR
c
R
d
羰基C
1
-C
3
烷基，其中R
c
及R
d
獨立地選自氫、C
1
-C
3
烷基及三苯甲基； 苯基C
1
-C
3
烷基，其中該苯基部分視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之基團取代：C
1
-C
4
烷氧基、C
1
-C
4
烷基、C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基、醯胺基、胺基、胺基C
1
-C
3
烷基、胺基磺醯基、羧基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷基、羥基、-NC(NH
2
)
2
、硝基及-OP(O)(OH)
2
；及 苯氧基C
1
-C
3
烷基，其中該苯基視情況經C
1
-C
3
烷基取代。 如本文所用，術語「C
2
-C
4
烯基」係指具有二至四個碳原子、含有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈基團。 如本文所用，術語「C
2
-C
7
烯基」係指具有二至七個碳原子、含有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈基團。 如本文所用，術語「C
2
-C
4
烯氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
2
-C
4
烯基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
4
烷氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
1
-C
4
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之C
1
-C
6
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷氧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷氧基。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷氧基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
1
-C
6
烷氧基。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷氧基羰基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
1
-C
6
烷氧基羰基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基」係指衍生自含有一至三個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴之基團。 如本文所用，術語「C
1
-C
4
烷基」係指衍生自含有一至四個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴之基團。 如本文所用，術語「C
1
-C
6
烷基」係指衍生自含有一至六個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴之基團。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「(C
1
-C
6
烷基)S(O)
2
NHC(O)C
1
-C
3
烷基」係指：
； 其中R為C
1
-C
6
烷基，R*為C
1
-C
3
烷基，且
指示母分子部分之連接點。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基硫基」係指經由硫原子連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基硫基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基硫基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基磺醯基」係指經由磺醯基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「C
1
-C
3
烷基磺醯基胺基」係指經由胺基連接至母分子部分之C
1
-C
3
烷基磺醯基。 如本文所用，術語「醯胺基」係指-C(O)NH
2
。 如本文所用，術語「醯胺基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之醯胺基。 如本文所用，術語「胺基」係指-NH
2
。 如本文所用，術語「胺基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之胺基。 如本文所用，術語「胺基磺醯基」係指經由磺醯基連接至母分子部分之胺基。 如本文所用，術語「芳基」係指苯基或雙環稠合環系統，其中該等環中之一者或兩者為苯基。雙環稠合環系統由苯基與四至六員芳族或非芳族碳環稠合組成。本發明之芳基可經由基團中之任何可取代碳原子連接至母分子部分。芳基之代表性實例包括(但不限於)茚滿基、茚基、萘基、苯基及四氫萘基。本發明之芳基視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之取代基取代：C
1
-
3
烷氧基、C
1
-
3
烷基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷氧基、鹵基C
1
-C
3
烷基及羥基。 如本文所用，術語「芳基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之芳基。 如本文所用，術語「氮雜吲哚基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子之氮雜吲哚基。氮雜吲哚基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「苯并噻唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子之苯并噻唑基。苯并噻唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「苯并噻吩基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子之苯并噻吩基。苯并噻吩基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「苯甲氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之苯甲基。 如本文所用，術語「苯甲氧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之苯甲氧基。 如本文所用，術語「聯苯C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之聯苯基。聯苯基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「羰基」係指-C(O)-。 如本文所用，術語「羧基」係指-CO
2
H。 如本文所用，術語「羧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之羧基。 如本文所用，術語「氰基」係指-CN。 如本文所用，術語「C
3
-C
14
環烷基」係指具有三至十四個碳原子及零個雜原子之飽和單環、雙環或三環烴環系統。雙環及三環環可為稠合、螺環或橋連的。環烷基之代表性實例包括(但不限於)環丙基、環戊基、雙環[3.1.1]庚基及金剛烷基。 如本文所用，術語「C
3
-C
14
環烷基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
3
-C
14
環烷基。 如本文所用，術語「C
3
-C
14
環烷基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
3
-C
14
環烷基。 如本文所用，術語「C
3
-C
6
環烷基」係指具有三至六個碳原子及零個雜原子之飽和單環烴環系統。 如本文所用，術語「C
3
-C
6
環烷基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之C
3
-C
6
環烷基。 如本文所用，術語「C
3
-C
6
環烷基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之C
3
-C
6
環烷基。 如本文所用，術語「呋喃基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之呋喃基。呋喃基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「呋喃基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之呋喃基。 如本文所用，術語「鹵基」及「鹵素」係指F、Cl、Br或I。 如本文所用，術語「鹵基C
1
-C
3
烷氧基」係指經一個、兩個或三個鹵素原子取代之C
1
-C
3
烷氧基。 如本文所用，術語「鹵基C
1
-C
3
烷基」係指經一個、兩個或三個鹵素原子取代之C
1
-C
3
烷基。 如本文所用，術語「鹵甲基」係指經一個、兩個或三個鹵素原子取代之甲基。 如本文所用，術語「雜芳基」係指至少一個原子係選自N、O及S且其餘原子為碳之芳族五員或六員環。術語「雜芳基」亦包括雜芳基環與含有零個、一個或兩個選自N、O及S之額外雜原子的四員至六員芳族或非芳族環稠合的雙環系統。雜芳基經由基團中之任何可取代碳或氮原子連接至母分子部分。雜芳基之代表性實例包括(但不限於)苯并噁二唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、異噁唑基、異喹啉基、異噻唑基、㖠啶基、噁二唑基、噁唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、喹啉基、噻唑基、噻吩并吡啶基、噻吩基、三唑基、噻二唑基及三嗪基。本發明之雜芳基可視情況經一個、兩個、三個、四個或五個獨立地選自以下之取代基取代：C
1
-
3
烷氧基、C
1
-
3
烷基、氰基、鹵基、鹵基C
1
-C
3
烷氧基、鹵基C
1
-C
3
烷基及羥基。 如本文所用，術語「雜芳基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之雜芳基。 如本文所用，術語「雜環基」係指含有一個、兩個或三個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的五員、六員或七員環。五員環具有零至兩個雙鍵且六員及七員環具有零至三個雙鍵。術語「雜環基」亦包括雙環基團，其中雜環基環與四員至六員芳族或非芳族碳環或另一單環雜環基稠合。本發明之雜環基經由基團中之碳原子連接至母分子部分。雜環基之實例包括(但不限於)苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯啶基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基及硫代嗎啉基。 如本文所用，術語「羥基」係指-OH。 如本文所用，術語「咪唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之咪唑基。咪唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「吲哚基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之吲哚基。吲哚基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「萘基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之萘基。萘基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「硝基」係指-NO
2
。 如本文所用，術語「NR
a
R
b
」係指經由氮原子連接至母分子部分之兩個基團R
a
及R
b
。R
a
及R
b
獨立地選自氫、C
2
-C
4
烯氧基羰基、C
1
-C
3
烷基羰基、C
3
-C
6
環烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。 如本文所用，術語「NR
a
R
b
(C
1
-C
3
)烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之NR
a
R
b
基團。 如本文所用，術語「NR
c
R
d
」係指經由氮原子連接至母分子部分之兩個基團R
c
及R
d
。R
c
及R
d
獨立地選自氫、C
1
-C
3
烷基及三苯甲基。 如本文所用，術語「NR
c
R
d
羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之NR
c
R
d
基團。 如本文所用，術語「NR
c
R
d
羰基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之NR
c
R
d
羰基。 如本文所用，術語「苯氧基」係指經由氧原子連接至母分子部分之苯基。 如本文所用，術語「苯氧基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之苯氧基。 如本文所用，術語「苯基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之苯基。 如本文所用，術語「苯基羰基」係指經由羰基連接至母分子部分之苯基。 如本文所用，術語「吡啶基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之吡啶基。吡啶基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「硫基」係指-S-。 如本文所用，術語「磺醯基」係指-SO
2
-。 如本文所用，術語「四唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之四唑基。四唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「噻唑基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之噻唑基。噻唑基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 如本文所用，術語「噻吩基C
1
-C
3
烷基」係指經由C
1
-C
3
烷基連接至母分子部分之噻吩基。噻吩基可經由基團中之任何可取代原子連接至烷基部分。 術語「治療」係指：(i)預防可能易患疾病、病症及/或病狀、但尚未診斷出患病的患者出現該疾病、病症或病狀；(ii)抑制該疾病、病症或病狀，亦即遏制其發展；及(iii)緩解該疾病、病症或病狀，亦即使得該疾病病症及/或病狀及/或與該疾病、病症及/或病狀相關聯之症狀消退。 巨環肽與PD-L1之結合可例如藉由諸如均相時差式螢光(HTRF)、表面電漿子共振(SPR)、等溫滴定熱量測定(ITC)、核磁共振光譜(NMR)及其類似物之方法量測。另外，巨環肽與表現於細胞表面上之PD-L1的結合可如本文所述在細胞結合分析中量測。 投與本文所述之治療劑包括(但不限於)投與治療有效量之治療劑。如本文所用，術語「治療有效量」係指(但不限於)治療或預防藉由投與本文所述之PD-1/PD-L1結合抑制劑之組合物可治療之病狀的治療劑的量。該量為足以展現可偵測之治療性或預防性或改善性效應之量。效應可包括例如(但不限於)本文中所列舉之病狀的治療或預防。個體之精確有效量將取決於個體之體型及健康狀況、欲治療之病狀的性質及程度、治療醫師之建議及選擇用於投與之治療劑或治療劑組合。因此，事先規定精確有效量為不適用的。 在另一個態樣中，本發明係關於使用本發明之巨環肽抑制個體腫瘤細胞生長之方法。如本文所證實，本發明之巨環肽能夠結合至PD-L1、妨礙PD-L1與PD-1之間的相互作用、與PD-L1與已知阻斷與PD-1之相互作用的抗PD-1單株抗體之結合競爭、增強CMV特異性T細胞IFNγ分泌及增強HIV特異性T細胞IFNg分泌。因此，本發明之巨環肽適用於調節免疫反應、治療諸如癌症或感染性疾病之疾病、刺激保護性自體免疫反應或刺激抗原特異性免疫反應(例如藉由共投與PD-L1阻斷肽與所關注之抗原)。 為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。在整個實施方式中，闡述其他定義。 術語「漸進式死亡配位體1」、「漸進式細胞死亡配位體1」、「蛋白質PD-L1」、「PD-L1」、「PDL1」、「PDCDL1」、「hPD-L1」、「hPD-LI」、「CD274」及「B7-H1」可互換使用且包括人類PD-L1之變體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與PD-L1共同之抗原決定基的類似物。完整PD-L1序列可見於GENBANK®寄存編號NP_054862。 術語「漸進式死亡1」、「漸進式細胞死亡1」、「蛋白質PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-I」可互換使用且包括人類PD-1之變體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與PD-1共同之抗原決定基的類似物。完整PD-1序列可見於GENBANK®寄存編號U64863。 術語「細胞毒性T淋巴球相關抗原-4」、「CTLA-4」、「CTLA4」、「CTLA-4抗原」及「CD152」(參見例如Murata,
Am. J. Pathol.
, 155:453-460 (1999))可互換使用且包括人類CTLA-4之變體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與CTLA-4共同之抗原決定基的類似物(參見例如Balzano,
Int. J. Cancer Suppl.
, 7:28-32 (1992))。完整CTLA-4核酸序列可見於GENBANK®寄存編號L15006。 術語「免疫反應」係指例如淋巴球、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及由以上細胞或肝臟產生之可溶性大分子(包括巨環肽、細胞激素及補體)產生對侵入病原體、感染有病原體之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性炎症之情況下正常人類細胞或組織之選擇性損壞、破壞或自人體消除之作用。 如本文所用，「不良事件」(AE)為與醫藥治療之使用相關聯之任何不利且一般不希望、甚至不當跡象(包括異常實驗室研究結果)、症狀或疾病。舉例而言，不良事件可與響應於治療之免疫系統活化或免疫系統細胞(例如T細胞)擴增相關聯。醫藥治療可具有一或多個相關AE且各AE可具有相同或不同的嚴重程度。提及能夠「改變不良事件」之方法意指降低與不同治療方案之使用相關聯之一或多個AE的發生率及/或嚴重程度的治療方案。 如本文所用，「過度增生性疾病」係指細胞生長增加超過正常水準之病狀。舉例而言，過度增生性疾病或病症包括惡性疾病(例如食道癌、結腸癌、膽道癌)及非惡性疾病(例如動脈粥樣硬化、良性增生及良性前列腺肥大)。 如本文所用，「約」或「基本上包含」意指在如由一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受的誤差範圍內，其將部分取決於如何量測或測定該值，亦即量測系統之侷限性。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意指根據此項技術中之實踐在一個或一個以上標準差內。或者，「約」或「基本上包含」可意指至多20%之範圍。此外，尤其在生物系統或方法方面，該等術語可意指值之至多一個數量級或至多5倍。當在本申請案及申請專利範圍中提供特定值時，除非另外陳述，否則「約」或「基本上包含」之含義應假定為在該特定值之可接受的誤差範圍內。 如本文所述，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。 競爭分析 本發明亦關於能夠與參考抗PD-L1抗體(MDX-1105)競爭結合達至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%及至少約100%之巨環肽。此類巨環肽可與一或多種本文所揭示之巨環肽共有結構同源性，包括突變體、保守取代形式、功能取代形式及缺失形式，其限制條件為其特異性結合至PD-L1。舉例而言，若巨環肽與參考抗PD-L1抗體實質上結合至相同PD-L1區，則巨環肽應結合至與抗PD-L1單株抗體所結合之PD-L1抗原決定基至少重疊之PD-L1抗原決定基。重疊區可在一個胺基酸殘基至數百個胺基酸殘基之範圍內變化。巨環肽應接著在競爭分析中與抗PD-L1單株抗體與PD-L1之結合競爭及/或阻斷該結合，且從而減少抗PD-L1單株抗體與PD-L1之結合，較佳達至少約50%。 出於競爭分析目的可用作參考抗體之抗PD-L1抗體為此項技術中已知的。舉例而言，可使用以下代表性抗PD-L1抗體：MDX-1105 (BMS)；L01X-C (Serono)、L1X3 (Serono)、MSB-0010718C (Serono)及PD-L1 Probody (CytomX)及共同擁有的WO 2007/005874中所揭示之PD-L1抗體。 出於競爭分析目的可用作參考抗體之抗PD-1抗體為此項技術中已知的。舉例而言，可使用以下代表性抗PD-1抗體：尼沃單抗(nivolumab，BMS)；共同擁有的美國專利第8,008,449號中所分別揭示之17D8、2D3、4H1、4A11、7D3及5F4 (BMS)、MK-3475 (Merck，美國專利第8,168,757號中所揭示)及美國專利第7,488,802號中所揭示之抗體。 醫藥組合物 在另一個態樣中，本發明提供一種組合物(例如醫藥組合物)，含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配之一種本發明之巨環肽或本發明之巨環肽組合。此類組合物可包括一種本發明之巨環肽或免疫結合物或雙特異性分子或(例如兩種或兩種以上不同的)本發明之巨環肽或免疫結合物或雙特異性分子之組合。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含結合至靶抗原上之不同抗原決定基或具有互補活性的巨環肽(或免疫結合物或雙特異性物)之組合。 本發明之醫藥組合物亦可在組合療法中(亦即與其他藥劑組合)投與。舉例而言，組合療法可包括巨環肽與至少一種其他消炎劑或免疫抑制劑之組合。可用於組合療法之治療劑的實例更詳細地描述於下文關於本發明之巨環肽之用途的部分中。 如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。較佳地，載劑適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即巨環肽、免疫結合物或雙特異性分子)可包覆在材料中以保護該化合物免受酸作用及可使該化合物不活化之其他天然條件。 本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」或「治療學上可接受之鹽」係指保留母化合物之所需生物活性且未賦予任何不合需要的毒理學效應之鹽(參見例如Berge, S.M.等人,
J. Pharm. Sci.
, 66:1-19 (1977))。此類鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物)以及衍生自無毒有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物)之鹽。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及衍生自無毒有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物)之鹽。 本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及其類似物。 可用於本發明醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。 此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)而確保防止微生物存在。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。 醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。此類介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中已知的。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則考慮將其用於本發明之醫藥組合物中。組合物中亦可併入補充性活性化合物。 治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。 無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與一種上列成分或成分組合一起併入適當溶劑中，並視需要接著滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及所需上列其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，該等方法自其預先無菌過濾溶液產生活性成分粉末加任何額外所需成分。 可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量將視所治療之個體、特定投藥模式而變化。可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量一般為產生治療性效應之組合物的量。一般而言，在100%中，此量將介於約0.01%至約99%之活性成分、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%之活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合。 調節劑量方案以得到最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或可如治療情形之緊急程度所指示而按比例減少或增加劑量。就投藥簡便性及劑量均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上離散單位；各單位含有與所需醫藥載劑結合之經計算以產生所需治療性效應之預定量活性化合物。本發明之單位劑型之規格藉由以下情況指定且直接取決於以下情況：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療性效應，及(b)混配用於治療個體敏感性之此類活性化合物之技術中的固有限制。 關於巨環肽之投與，劑量範圍介於宿主體重之約0.0001至100 mg/kg且更通常0.01至5 mg/kg。舉例而言，劑量可為0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg範圍內。例示性治療方案需要每天一次、每天兩次、兩週一次、三週一次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、一月一次、每3個月一次或每3至6個月一次投與。本發明之巨環肽的較佳劑量方案包括經由靜脈內投與1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，同時使用以下給藥時程中之一者給與巨環：(i)每四週六次劑量，接著每三個月；(ii)每三週；(iii) 3 mg/kg體重一次，接著每三週1 mg/kg體重。 在一些方法中，同時投與具有不同結合特異性之兩種或兩種以上巨環肽，在此情況下，所投與之各化合物之劑量屬於所指示的範圍內。化合物通常在多個時刻投與。單次劑量之間的間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。間隔亦可為不規律的，藉由量測患者中針對靶抗原之巨環肽的血液含量所指示。在一些方法中，調節劑量以達到約1-1000 μg/ml之血漿濃度，且在一些方法中達到約25-300 μg/ml。 或者，巨環肽可以持續釋放調配物形式投與，在此情況下不需要頻繁投與。投與之劑量及頻率可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，在長時期內，以相對不頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短之間隔投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者展示疾病之症狀之部分或完全改善。此後，可向患者投與預防性方案。 可改變本發明之醫藥組合物中之活性成分的實際劑量，以便獲得在對患者無毒性之情況下有效達成特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應的量的活性成分。所選劑量將視多種藥物動力學因素而定，包括本發明所用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性；投藥途徑；投藥時間；所用特定化合物之排泄率；治療持續時間；與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫藥技術中熟知之類似因素。 「治療有效劑量」之本發明之巨環肽較佳使得疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀期之頻率或持續時間增加或預防疾病病痛所致之損傷或失能。舉例而言，關於腫瘤治療，「治療有效劑量」較佳相對於未經治療之個體抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且再更佳至少約80%。化合物抑制腫瘤生長及/或HIV之能力可在預測對人類腫瘤之功效或病毒功效之動物模型系統中評估。或者，組合物之此特性可藉由利用熟習此項技術者已知之分析檢查化合物之抑制能力(諸如活體外抑制)來評估。治療有效量之治療性化合物可在個體體內減小腫瘤尺寸、減少病毒負荷或以其他方式改善症狀。一般熟習此項技術者將能夠基於諸如個體體型、個體症狀之嚴重程度及所選特定組合物或投藥途徑之因素來確定該等量。 在另一個態樣中，本發明提供一種分裝部分之醫藥套組，其如本文所述包含巨環肽及另一種免疫調節劑。該套組亦可另外包含治療過度增生性疾病(諸如，如本文所述之癌症)及/或抗病毒疾病之使用說明書。 本發明之組合物可經由一或多種投藥途徑、使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。本發明之巨環肽的較佳投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意指除腸內及局部投與以外通常藉由注射進行之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。 或者，本發明之巨環肽可經由非非經腸途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。 活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼劑及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法已獲得專利或一般為熟習此項技術者已知。參見例如Robinson, J.R.編,
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems
, Marcel Dekker, Inc., New York (1978)。 治療性組合物可用此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一個較佳實施例中，本發明之治療性組合物可用無針皮下注射裝置投與，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。適用於本發明之熟知插入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示一種以受控速率施配藥物之可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示一種經由皮膚投與藥物之治療性裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示一種以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示一種用於連續藥物遞送之可變流動可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示一種具有多腔隔室之滲透藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示一種滲透藥物遞送系統。此等專利以引用的方式併入本文中。許多其他此類插入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者已知的。 在某些實施例中，本發明之巨環肽可經調配以確保恰當活體內分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除多種高度親水性化合物。為確保本發明之治療性化合物穿過BBB (必要時)，其可調配成例如脂質體。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包含選擇性輸送至特定細胞或器官中之一或多個部分，由此增強靶向藥物遞送(參見例如Ranade, V.V.,
J. Clin. Pharmacol.
, 29:685 (1989))。例示性靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖(Umezawa等人,
Biochem. Biophys. Res. Commun.
, 153:1038 (1988))；巨環肽(Bloeman, P.G.等人,
FEBS Lett.
, 357:140 (1995)；Owais, M.等人,
Antimicrob. Agents Chemother.
, 39:180 (1995))；界面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人,
Am. J. Physiol.
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J. Biol. Chem.
, 269:9090 (1994))；亦參見Keinanen, K.等人,
FEBS Lett.
, 346:123 (1994)；Killion, J.J.等人,
Immunomethods
4:273 (1994)。 本發明之用途及方法 本發明之巨環肽、組合物及方法具有許多活體外及活體內效用，涉及例如偵測PD-L1或藉由阻斷PD-L1增強免疫反應。舉例而言，此等分子可投與培養物中、活體外或離體之細胞或投與人類個體(例如活體內)以在多種情形中增強免疫力。因此，在一個態樣中，本發明提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與本發明之巨環肽以便調節該個體之免疫反應。較佳地，增強、刺激或上調反應。在其他方面中，巨環肽可具有抗獼猴、抗小鼠及/或抗土拔鼠結合及治療活性。 如本文所用，術語「個體」意欲包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊、犬、貓、牛、馬、雞、土拔鼠、兩棲動物及爬行動物，但哺乳動物為較佳，諸如非人類靈長類動物、羊、犬、貓、牛及馬。較佳個體包括需要增強免疫反應之人類患者。該等方法尤其適用於治療患有可藉由強化T細胞介導之免疫反應治療之病症的人類患者。在一個特定實施例中，該等方法尤其適用於活體內處理癌細胞。為實現抗原特異性免疫力增強，巨環肽可連同所關注之抗原一起投與。當針對PD-L1之巨環肽連同另一藥劑一起投與時，兩者可以任一次序或同時投與。 本發明另外提供用於偵測樣品中人類、土拔鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1抗原之存在或量測人類、土拔鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1抗原之量的方法，其包含使該樣品及對照樣品與特異性結合至人類、土拔鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1之參考巨環肽在允許在該巨環與人類、土拔鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1之間形成複合物的條件下接觸。接著偵測複合物之形成，其中樣品與對照樣品相比之差異複合物形成指示樣品中存在人類、土拔鼠、獼猴及/或小鼠PD-L1抗原。 鑒於本發明之巨環肽對於PD-L1與CD28、ICOS及CTLA-4相比之特異性結合，本發明之巨環肽可用於特異性偵測細胞表面上之PD-L1表現，且此外，可用於經由免疫親和力純化來純化PD-L1。 癌症 藉由巨環肽阻斷PD-1可增強患者針對癌細胞之免疫反應。PD-1之配位體PD-L1並不表現在正常人類細胞中，但大量存在於多種人類癌症中(Dong等人,
Nat. Med.
, 8:787-789 (2002))。PD-1與PD-L1之間的相互作用導致腫瘤浸潤性淋巴球減少、T細胞受體介導之增生減少及癌細胞免疫逃避(Dong等人,
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, 99:12293-12297 (2002)；Brown等人,
J. Immunol.
, 170:1257-1266 (2003))。雖然先前研究已展示T細胞增生可藉由抑制PD-1與PD-L1之相互作用而恢復，但尚未報導藉由阻斷PD-1/PD-L1相互作用對活體內癌症腫瘤生長之直接效應。在一個態樣中，本發明係關於使用巨環肽活體內治療個體，使得癌性腫瘤生長受到抑制。巨環肽可單獨用於抑制癌性腫瘤生長。或者，巨環肽可如下所述與其他免疫原性劑、標準癌症治療或其他巨環肽結合使用。 因此，在一個實施例中，本發明提供一種抑制個體之腫瘤細胞生長的方法，其包含向該個體投與治療有效量之巨環肽。 可使用本發明之巨環肽抑制生長之較佳癌症包括通常響應於免疫療法之癌症。治療之較佳癌症之非限制性實例包括黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎細胞癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺癌及去勢療法無效之前列腺癌)、乳癌、結腸直腸癌及肺癌(例如鱗狀及非鱗狀非小細胞肺癌)。另外，本發明包括可使用本發明之巨環肽抑制生長之難治性或復發性惡性病。 可使用本發明之方法治療之其他癌症的實例包括骨癌；胰臟癌；皮膚癌；頭頸癌；皮膚或眼內惡性黑素瘤；子宮癌；卵巢癌；結腸癌；直腸癌；肛門區癌；胃癌；睾丸癌；子宮癌；輸卵管癌；子宮內膜癌；子宮頸癌；陰道癌；外陰癌；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小腸癌；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；腎上腺癌；軟組織肉瘤；尿道癌；陰莖癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病；兒童實體腫瘤；淋巴球性淋巴瘤；膀胱癌；腎癌或輸尿管癌；腎盂癌；中樞神經系統(CNS)贅瘤；原發性CNS淋巴瘤；腫瘤血管生成；脊軸腫瘤；腦幹神經膠質瘤；垂體腺瘤；卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；表皮樣癌；鱗狀細胞癌；T細胞淋巴瘤；環境誘發癌，包括由石棉誘發之癌症；及該等癌症之組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症，尤其表現PD-L1之轉移性癌症(Iwai等人,
Int. Immunol.
, 17:133-144 (2005))。 視情況，針對PD-L1之巨環肽可與以下免疫原性劑組合，諸如癌細胞、經純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子)、細胞及轉染有編碼免疫刺激細胞激素之基因的細胞(He等人,
J. Immunol.
, 173:4919-4928 (2004))。可使用之腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞激素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。 在人類中，已展示一些腫瘤具有免疫原性，諸如黑素瘤。預期藉由利用PD-L1阻斷升高T細胞活化之臨限值，吾等可預計活化宿主中之腫瘤反應。 當與疫苗接種方案組合時，PD-L1阻斷可能最有效。已設計出針對腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000)；Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000)；Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000)；Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)；亦參見Restifo, N.等人, Cancer Vaccines, 第61章, 第3023-3043頁, DeVita, V.等人編,
Cancer: Principles and Practice of Oncology
, 第五版(1997))。在此等策略中之一者中，使用自體或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。已顯示此等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF為用於腫瘤疫苗接種之抗原呈現之強活化劑(Dranoff等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90: 3539-3543 (1993))。 各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg, S.A.,
Immunity
, 10:281-287 (1999))。在許多情況下，此等腫瘤特異性抗原為腫瘤中及出現腫瘤之細胞中表現的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，許多此等抗原可展示為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞的靶標。PD-L1阻斷可與表現於腫瘤中之重組蛋白質及/或肽之集合結合使用以產生針對此等蛋白質之免疫反應。此等蛋白質通常被免疫系統視為自體抗原且因此對其具耐受性。腫瘤抗原亦可包括蛋白質端粒酶，其為合成染色體之端粒所必需的且表現於超過85%之人類癌症中且僅表現於有限數目之體細胞組織中(Kim, N等人,
Science
, 266:2011-2013 (1994))。(可藉由各種方法保護此等體細胞組織免受免疫攻擊)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白質序列或在兩個無關序列之間形成融合蛋白(亦即費城染色體(Philadelphia chromosome)中之bcr-abl)之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新抗原」或B細胞腫瘤之個體基因型。 其他腫瘤疫苗可包括人類癌症中所牽涉之病毒的蛋白質，該等病毒諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可與PD-L1阻斷結合使用之腫瘤特異性抗原的另一形式為自腫瘤組織自身分離之經純化熱休克蛋白質(HSP)。此等熱休克蛋白質含有腫瘤細胞蛋白質之片段且此等HSP高效遞送至抗原呈現細胞以引發腫瘤免疫力(Suot, R.等人,
Science
, 269:1585-1588 (1995)；Tamura, Y.等人,
Science
, 278:117-120 (1997))。 樹突狀細胞(DC)為可用於引發抗原特異性反應之強抗原呈現細胞。DC可離體產生且負載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle, F.等人,
Nat. Med.
, 4:328-332 (1998))。DC亦可藉由基因方法轉導以亦表現此等腫瘤抗原。DC亦已出於免疫目的而直接與腫瘤細胞融合(Kugler, A.等人,
Nat. Med.
, 6:332-336 (2000))。作為疫苗接種之方法，DC免疫作用可與PD-L1阻斷有效組合以活化更強抗腫瘤反應。 PD-L1阻斷亦可與標準癌症治療組合。PD-L1阻斷可與化學治療方案有效組合。在此等情形中，有可能減小所投與之化學治療劑的劑量(Mokyr, M.等人,
Cancer Res.
, 58:5301-5304 (1998))。此類組合之一個實例為巨環肽與達卡巴嗪(decarbazine)組合用於治療黑素瘤。此類組合之另一個實例為巨環肽與介白素-2 (IL-2)組合用於治療黑素瘤。支持PD-L1阻斷與化學療法組合使用之科學基本原理在於作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應使得抗原呈現路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與PD-L1阻斷產生協同作用的其他組合療法為輻射、手術及激素去除。此等方案中之每一者產生宿主中之腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與PD-L1阻斷組合。抑制血管生成導致腫瘤細胞死亡，其可將腫瘤抗原饋至宿主抗原呈現路徑中。 PD-L1阻斷巨環肽亦可與使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性巨環肽組合使用(參見例如美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性巨環肽可用於靶向兩個單獨抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性巨環肽已用於使巨噬細胞靶向腫瘤位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。此等反應之T細胞臂藉由使用PD-L1阻斷來強化。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記之雙特異性巨環肽將抗原直接遞送至DC。 腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由使腫瘤所表現且具免疫抑制性之蛋白質不活化來克服。此等蛋白質尤其包括TGF-β (Kehrl, J.等人,
J. Exp. Med.
, 163:1037-1050 (1986))、IL-10 (Howard, M.等人,
Immunology Today
, 13:198-200 (1992))及Fas配位體(Hahne, M.等人,
Science
, 274:1363-1365 (1996))。針對此等實體中之每一者的巨環肽可與抗PD-L1組合使用，以抵消免疫抑制劑之效應且促進宿主的腫瘤免疫反應。 可用於活化宿主免疫反應之其他巨環肽可與抗PD-L1組合使用。此等巨環肽包括樹突狀細胞表面上之活化DC功能及抗原呈現的分子。抗CD40巨環肽能夠有效替代輔助T細胞活性(Ridge, J.等人,
Nature
, 393:474-478 (1998))且可與PD-1抗體結合使用(Ito, N.等人,
Immunobiology
, 201(5):527-540 (2000))。活化針對以下T細胞協同刺激分子之巨環肽亦可使得T細胞活化水準增加，諸如CTLA-4 (例如美國專利第5,811,097號)、OX-40 (Weinberg, A.等人,
Immunol.
, 164:2160-2169 (2000))、4-1BB (Melero, I.等人,
Nat. Med.
, 3:682-685 (1997)及ICOS (Hutloff, A.等人,
Nature
, 397:262-266 (1999))。 骨髓移植目前用於治療多種造血來源之腫瘤。雖然移植物抗宿主病為此治療之後果，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療效益。PD-L1阻斷可用於增加供體移植之腫瘤特異性T細胞的有效性。 亦存在涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受性轉移至受體中以便抗原特異性T細胞抗腫瘤之數個實驗性治療方案(Greenberg, R.等人,
Science
, 285:546-551 (1999))。此等方法亦可用於活化針對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在巨環肽存在下之離體活化可預期增加授受性轉移T細胞之頻率及活性。 感染性疾病 本發明之其他方法用於治療已暴露於特定毒素或病原體之患者。因此，本發明之另一個態樣提供一種治療個體之感染性疾病的方法，其包含向該個體投與本發明之巨環肽，以便治療該個體之感染性疾病。 與其如上文所論述之針對腫瘤之應用類似，PD-L1阻斷可單獨使用或作為佐劑與疫苗組合使用以刺激針對病原體、毒素及自體抗原之免疫反應。此治療方法可特別適用之病原體之實例包括當前無有效疫苗之病原體或習知疫苗不完全有效之病原體。此等病原體包括(但不限於)HIV、肝炎(A、B及C)、流感、疱疹、梨形鞭毛蟲屬(Giardia)、瘧疾(Butler, N.S.等人,
Nature Immunology 13
, 188-195 (2012)；Hafalla, J.C.R.等人,
PLOS Pathogens
; February 2, 2012))、利什曼原蟲屬(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas Aeruginosa)。PD-L1阻斷特別適用於抵抗由經感染過程呈現改變抗原之感染物(諸如HIV)所確立之感染。此等新穎抗原決定基在投與抗人類PD-L1時識別為外來的，因此經由PD-L1引起藉由陰性信號未抑制之強T細胞反應。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原菌的一些實例包括衣原體(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病(Lymes disease)細菌。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性真菌的一些實例包括念珠菌屬(Candida) (白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus) (煙麯黴(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴目(Mucorales)屬(毛黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizophus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。 引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba sp.)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲、微小巴倍蟲、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondi)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。 在所有以上方法中，PD-L1阻斷可與以下其他形式之免疫療法組合，從而提供增強的腫瘤抗原呈現，諸如細胞激素治療(例如干擾素、靶向VEGF活性或VEGF受體之藥劑、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法(參見例如Holliger,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90:6444-6448 (1993)；Poljak,
Structure
, 2:1121-1123 (1994))。 自體免疫反應 巨環肽可引起且放大自體免疫反應。實際上，使用腫瘤細胞及肽疫苗誘發抗腫瘤反應揭示許多抗腫瘤反應涉及抗自體反應性(在抗CTLA-4+GM-CSF調節之B 16黑素瘤中觀測到去色素(van Elsas等人, 見上文)；Trp-2疫苗接種小鼠中之去色素(Overwijk, W.等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 96:2982-2987 (1999))；由TRAMP腫瘤細胞疫苗引起之自體免疫前列腺炎(Hurwitz, A., 見上文(2000))、在人類臨床試驗中觀測到黑素瘤肽抗原疫苗接種及白斑病(Rosenberg, S.A.等人,
J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol.
, 19(1):81-84 (1996))。 因此，可能考慮抗PD-L1阻斷與各種自身蛋白質結合使用以便設計高效產生針對此等自身蛋白質之免疫反應用於疾病治療的疫苗接種方案。舉例而言，阿茲海默氏病涉及類澱粉沈積物之β肽在腦中之不當積聚；針對類澱粉之抗體反應能夠清除此等類澱粉沈積物(Schenk等人,
Nature
, 400:173-177 (1999))。 其他自身蛋白質亦可用作靶標，諸如用於過敏症及哮喘治療之IgE及用於類風濕性關節炎治療之TNFα。最後，針對各種激素之抗體反應可藉由使用本文所揭示之巨環化合物誘發。針對生殖激素之中和抗體反應可用於避孕。針對特定腫瘤生長所需之激素及其他可溶性因子的中和抗體反應亦可視為可能的疫苗接種靶標。 如上所述使用抗PD-L1巨環化合物之類似方法可用於誘發治療性自體免疫反應以治療具有其他自身抗原(諸如類澱粉沈積物，包括阿茲海默氏病中之β；細胞激素，諸如TNFα及IgE)不當積聚之患者。 疫苗 巨環肽可藉由抗PD-1巨環與所關注之抗原(例如疫苗)之共投與而用於刺激抗原特異性免疫反應。因此，在另一個態樣中，本發明提供一種增強個體體內針對抗原之免疫反應的方法，其包含向該個體投與：(i)該抗原；及(ii)抗PD-1巨環，使得個體體內針對該抗原之免疫反應得以增強。抗原可為例如腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。此類抗原之非限制性實例包括以上部分中所論述之抗原，諸如上文所論述之腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)、或來自上文所述之病毒、細菌或其他病原體的抗原。 活體內及活體外投與本發明組合物(例如巨環肽、多特異性及雙特異性分子及免疫結合物)之適合途徑為此項技術中所熟知，且可由一般技術者選擇。舉例而言，組合物可藉由注射(例如靜脈內或皮下)投與。所用分子之適合劑量將視個體之年齡及體重以及組合物之濃度及/或調配物而定。 如先前所述，本發明之巨環肽可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑)共投與。肽可連接至藥劑(以免疫複合物形式)或可與藥劑分開投與。在後一情況(分開投與)中，肽可在藥劑之前、之後或同時投與或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如輻射)共投與。此類治療劑尤其包括抗贅生性劑，諸如小紅莓(doxorubicin)(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑博萊黴素硫酸鹽(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、達卡巴嗪及環磷醯胺羥基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其本身僅在對患者具毒性或亞毒性之含量下有效。順鉑每四週以100 mg/m
2
劑量靜脈內投與一次，且阿德力黴素每21天以60-75 mg/ml劑量靜脈內投與一次。本發明之巨環肽與化學治療劑之共投與提供兩種經由不同機制操作之抗癌劑，其產生針對人類腫瘤細胞之細胞毒性效應。此類共投與可解決因耐藥性出現或腫瘤細胞之抗原性改變而將使其不與肽起反應所致的問題。 包含本發明組合物(例如巨環肽、雙特異性或多特異性分子或免疫結合物)及使用說明書之套組亦在本發明之範疇內。套組可另外含有至少一種額外試劑或一或多種本發明之額外巨環肽(例如具有結合至PD-L1抗原中與巨環不同之抗原決定基的互補活性的人類抗體)。套組通常包括指示套組內含物之預期用途的標籤。術語標籤包括在套組上或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組之任何書寫或記錄材料。 組合療法 本發明之巨環肽與另一PD-L1拮抗劑及/或其他免疫調節劑之組合適用於增強針對過度增生性疾病之免疫反應。舉例而言，此等分子可投與培養物中、活體外或離體之細胞或投與人類個體(例如活體內)以在多種情形中增強免疫力。因此，在一個態樣中，本發明提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與本發明之巨環肽以便調節該個體之免疫反應。較佳地，增強、刺激或上調反應。在另一個實施例中，本發明提供一種改變與用免疫刺激性治療劑治療過度增生性疾病相關聯之不良事件的方法，其包含向個體投與本發明之巨環肽及低於治療劑量之另一種免疫調節劑。 藉由巨環肽阻斷PD-L1可增強患者針對癌細胞之免疫反應。可使用本發明之巨環肽抑制生長之癌症包括通常響應於免疫療法之癌症。用本發明之組合療法治療之癌症的代表性實例包括黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎癌、前列腺癌、乳癌、結腸癌及肺癌。可使用本發明之方法治療之其他癌症的實例包括骨癌；胰臟癌；皮膚癌；頭頸癌；皮膚或眼內惡性黑素瘤；子宮癌；卵巢癌；直腸癌；肛門區癌；胃癌；睾丸癌；子宮癌；輸卵管癌；子宮內膜癌；子宮頸癌；陰道癌；外陰癌；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋巴瘤；食道癌；小腸癌；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；腎上腺癌；軟組織肉瘤；尿道癌；陰莖癌；慢性或急性白血病，包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病；兒童實體腫瘤；淋巴球性淋巴瘤；膀胱癌；腎癌或輸尿管癌；腎盂癌；中樞神經系統(CNS)贅瘤；原發性CNS淋巴瘤；腫瘤血管生成；脊軸腫瘤；腦幹神經膠質瘤；垂體腺瘤；卡堡氏肉瘤；表皮樣癌；鱗狀細胞癌；T細胞淋巴瘤；環境誘發癌，包括由石棉誘發之癌症；及該等癌症之組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症。 在某些實施例中，含有至少一種本文中論述之巨環肽的治療劑組合可以在醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物形式同時投與，或以各藥劑可依次投與之分開組合物形式同時投與。舉例而言，第二免疫調節劑及本發明之巨環肽可依次投與，諸如首先投與第二免疫調節劑且其次投與巨環肽，或首先投與巨環肽且其次投與第二免疫調節劑。此外，若依次投與一次以上劑量之組合療法，則依次投與之次序在每一投與時間點可顛倒或保持相同次序，依次投與可與同時投與組合或其任何組合。舉例而言，第二免疫調節劑及巨環肽之第一次投與可同時，第二次投與可依次，其中首先投與第二免疫調節劑且其次投與巨環肽，且第三次投與可依次，其中首先投與巨環肽且其次投與第二免疫調節劑等。另一代表性給藥方案可涉及首先依次投與，其中首先投與巨環肽且其次投與第二免疫調節劑，且後續投與可同時。 視情況，巨環肽及第二免疫調節劑之組合可另外與免以下疫原性劑組合，諸如癌細胞、經純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子)、細胞及轉染有編碼免疫刺激細胞激素之基因的細胞(He等人,
J. Immunol.
, 173:4919-4928 (2004))。可使用之腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞激素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。 經組合之PD-L1巨環肽及第二免疫調節劑可另外與疫苗接種方案組合。已設計出針對腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000)；Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000)；Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000)；Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000)；亦參見Restifo等人, Cancer Vaccines, 第61章, 第3023-3043頁, DeVita等人編,
Cancer: Principles and Practice of Oncology
, 第五版(1997))。在此等策略中之一者中，使用自體或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。已顯示此等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF為用於腫瘤疫苗接種之抗原呈現之強活化劑(Dranoff等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90:3539-3543 (1993))。 各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg,
Immunity
, 10:281-287 (1999))。在許多情況下，此等腫瘤特異性抗原為腫瘤中及出現腫瘤之細胞中表現的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，許多此等抗原可展示為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞的靶標。在某些實施例中，經組合之PD-L1巨環肽及第二免疫調節劑可與表現於腫瘤中之重組蛋白質及/或肽之集合結合使用以產生針對此等蛋白質之免疫反應。此等蛋白質通常被免疫系統視為自體抗原且因此對其具耐受性。腫瘤抗原亦可包括蛋白質端粒酶，其為合成染色體之端粒所必需的且表現於超過85%之人類癌症中且僅表現於有限數目之體細胞組織中(Kim等人,
Science
, 266:2011-2013 (1994))。(可藉由各種方法保護此等體細胞組織免受免疫攻擊)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白質序列或在兩個無關序列之間形成融合蛋白(亦即費城染色體中之bcr-abl)之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新抗原」或B細胞腫瘤之個體基因型。 其他腫瘤疫苗可包括人類癌症中所牽涉之病毒的蛋白質，該等病毒諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可與PD-L1巨環肽阻斷結合使用之腫瘤特異性抗原的另一形式為自腫瘤組織自身分離之經純化熱休克蛋白質(HSP)。此等熱休克蛋白質含有腫瘤細胞蛋白質之片段且此等HSP高效遞送至抗原呈現細胞以引發腫瘤免疫力(Suot等人,
Science
, 269:1585-1588 (1995)；Tamura等人,
Science
, 278:117-120 (1997))。 樹突狀細胞(DC)為可用於引發抗原特異性反應之強抗原呈現細胞。DC可離體產生且負載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle等人,
Nat. Med.
, 4:328-332 (1998))。DC亦可藉由基因方法轉導以亦表現此等腫瘤抗原。DC亦已出於免疫目的而直接與腫瘤細胞融合(Kugler等人,
Nat. Med.
, 6:332-336 (2000))。作為疫苗接種之方法，DC免疫作用可與經組合之抗PD-L1巨環肽及第二免疫調節劑進一步有效組合以活化更強抗腫瘤反應。 經組合之抗PD-L1巨環肽及額外免疫調節劑亦可與標準癌症治療進一步組合。舉例而言，巨環肽與第二免疫調節劑之組合可與化學治療方案有效組合。在此等情形中，如在巨環肽與第二免疫調節劑之組合下所觀測，有可能減小與本發明之組合一起投與之其他化學治療劑的劑量(Mokyr等人,
Cancer Res.
, 58:5301-5304 (1998))。此類組合之一個實例為巨環肽與第二免疫調節劑之組合與達卡巴嗪進一步組合用於治療黑素瘤。另一個實例為巨環肽與第二免疫調節劑之組合與介白素-2 (IL-2)進一步組合用於治療黑素瘤。支持PD-L1巨環肽及另一種免疫調節劑與化學療法組合使用之科學基本原理在於作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應使得抗原呈現路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與經組合之抗PD-L1巨環肽及額外免疫調節劑產生協同作用的其他組合療法包括輻射、手術及激素去除。此等方案中之每一者產生宿主中之腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與經組合之PD-L1及第二免疫調節劑組合。抑制血管生成導致腫瘤細胞死亡，其亦可為饋至宿主抗原呈現路徑中之腫瘤抗原之來源。 PD-L1與另一種免疫調節劑之組合亦可與使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性巨環肽組合使用(參見例如美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性巨環肽可用於靶向兩個單獨抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性巨環肽已用於使巨噬細胞靶向腫瘤位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。此等反應之T細胞臂藉由使用經組合之PD-L1及第二免疫調節劑來強化。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記之雙特異性巨環肽將抗原直接遞送至DC。 在另一個實例中，巨環肽與第二免疫調節劑之組合可與以下抗贅生性巨環劑結合使用，諸如RITUXAN® (利妥昔單抗(rituximab))、HERCEPTIN® (曲妥珠單抗(trastuzumab))、BEXXAR® (托西莫單抗(tositumomab))、ZEVALIN® (布突默單抗(ibritumomab))、CAMPATH® (阿侖單抗(alemtuzumab))、Lymphocide (依帕珠單抗(eprtuzumab))、AVASTIN® (貝伐單抗(bevacizumab))及TARCEVA® (埃羅替尼(erlotinib))及其類似物。舉例而言且不希望受理論束縛，用抗癌抗體或與毒素結合之抗癌抗體治療可導致癌細胞死亡(例如腫瘤細胞)，其將強化藉由第二免疫調節劑靶標或PD-L1介導之免疫反應。在一個示例性實施例中，過度增生性疾病(例如癌症腫瘤)之治療可包括抗癌抗體與同時或依次或其任何組合投與之巨環肽及第二免疫調節劑之組合，其可強化宿主之抗腫瘤免疫反應。 腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由使腫瘤所表現且具免疫抑制性之蛋白質不活化來克服。此等蛋白質尤其包括TGF-β (Kehrl, J.等人,
J. Exp. Med.
, 163:1037-1050 (1986))、IL-10 (Howard, M.等人,
Immunology Today
, 13:198-200 (1992))及Fas配位體(Hahne, M.等人,
Science
, 274:1363-1365 (1996))。在另一個實例中，針對此等實體中之每一者的抗體可與巨環肽及另一種免疫調節劑進一步組合，以抵消免疫抑制劑之效應且促進宿主的腫瘤免疫反應。 可用於活化宿主免疫反應性之其他藥劑可與本發明之巨環肽進一步組合使用。此等藥劑包括樹突狀細胞表面上之活化DC功能及抗原呈現的分子。抗CD40巨環肽能夠有效替代輔助T細胞活性(Ridge, J.等人,
Nature
, 393:474-478 (1998))且可與單獨或與抗CTLA-4組合組合之本發明之巨環肽結合使用(Ito, N.等人,
Immunobiology
, 201(5):527-540 (2000))。活化針對以下T細胞協同刺激分子之巨環肽亦可使得T細胞活化水準增加，諸如OX-40 (Weinberg, A.等人,
Immunol.
, 164:2160-2169 (2000))、4-1BB (Melero, I.等人,
Nat. Med.
, 3:682-685 (1997)及ICOS (Hutloff, A.等人,
Nature
, 397:262-266 (1999))。 骨髓移植目前用於治療多種造血來源之腫瘤。雖然移植物抗宿主病為此治療之後果，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療效益。單獨或與另一種免疫調節劑組合之本發明之巨環肽可用於增加供體移植之腫瘤特異性T細胞的有效性。 亦存在涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受性轉移至受體中以便抗原特異性T細胞抗腫瘤之數個實驗性治療方案(Greenberg, R.等人,
Science
, 285:546-551 (1999))。此等方法亦可用於活化針對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在單獨或與另一種免疫調節劑組合之本發明之巨環肽存在下之離體活化可預期增加授受性轉移T細胞之頻率及活性。 在某些實施例中，本發明提供一種改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關聯之不良事件的方法，其包含向個體投與本發明之巨環肽與低於治療劑量之另一種免疫調節劑之組合。舉例而言，本發明之方法提供一種藉由向患者投與不可吸收類固醇而降低免疫刺激性治療抗體誘發之結腸炎或腹瀉之發病率的方法。由於任何將接受免疫刺激性治療抗體之患者處於罹患由此類治療誘發之結腸炎或腹瀉的風險下，故此整個患者群體適合於根據本發明方法之療法。雖然已投與類固醇以治療發炎性腸病(IBD)及預防IBD惡化，但其尚未用於尚未診斷患有IBD之患者預防(降低發病率) IBD。與類固醇(甚至不可吸收類固醇)相關聯之顯著副作用已阻礙預防性使用。 在其他實施例中，單獨或與另一種免疫調節劑組合之本發明之巨環肽可與任何不可吸收類固醇之使用進一步組合。如本文所用，「不可吸收類固醇」為展現深入首次代謝的糖皮質激素，使得在肝臟中代謝後，類固醇之生物利用率低，亦即小於約20%。在本發明之一個實施例中，不可吸收類固醇為布地奈德(budesonide)。布地奈德為局部起效的糖皮類固醇，其在經口投與後主要藉由肝臟深入代謝。ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca)為經研發以使藥物遞送至迴腸及貫穿結腸最佳化之布地奈德的pH及時間依賴性經口調配物。ENTOCORT® EC在美國核准用於治療涉及迴腸及/或升結腸之輕度至中度克羅恩氏病(Crohn's disease)。用於治療克羅恩氏病之ENTOCORT® EC的常用口服劑量為6至9毫克/天。ENTOCORT® EC在腸中釋放，隨後吸收且保留在腸道黏膜中。一次其通過腸道黏膜目標組織，ENTOCORT® EC在肝臟中藉由細胞色素P450系統深入代謝成具有可忽略的糖皮質激素活性的代謝物。因此，生物利用率較低(約10%)。布地奈德之低生物利用率使得與具有較不深入之首次代謝的其他糖皮質激素相比的治療比率得以改善。布地奈德與全身起效的皮質類固醇相比產生較少不良作用，包括下丘腦-垂體抑制作用較小。然而，長期投與ENTOCORT® EC可導致全身性糖皮質激素效應，諸如腎上腺皮質機能亢進症及腎上腺抑制。參見
Physicians' Desk Reference Supplement
, 第58版, 608-610 (2004)。 在其他實施例中，PD-L1及另一種免疫調節劑與不可吸收類固醇結合之組合可與水楊酸進一步組合。水楊酸包括5-ASA劑，諸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine) (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn)；奧沙拉嗪(olsalazine) (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn)；巴柳氮(balsalazide) (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.)；及美沙拉嗪(mesalamine) (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA®, Shire US；CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA®, Solvay)。 劑量及調配物 式I之適合肽或更特定言之本文所述之巨環肽可作為單獨化合物及或與可接受之載劑混合以醫藥調配物形式投與患者以治療糖尿病及其他相關疾病。熟習治療糖尿病之技術者可易於確定向需要此類治療之哺乳動物(包括人類)投與化合物之劑量及途徑。投藥途徑可包括(但不限於)經口、口內、經直腸、經皮、經頰、鼻內、經肺、皮下、肌肉內、皮內、舌下、結腸內、眼內、靜脈內或腸道投與。根據投藥途徑，基於可接受之藥學實踐調配化合物(Fingl等人,
The Pharmacological Basis of Therapeutics
, 第1章, 第1頁 (1975)；
Remington's Pharmaceutical Sciences
, 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990))。 本文所述之醫藥學上可接受之肽組合物可以多種劑型投與，諸如錠劑、膠囊(其各包括持續釋放或定時釋放調配物)、丸劑、散劑、顆粒、酏劑、原位凝膠、微球體、晶體複合物、脂質體、微乳液、酊劑、懸浮液、糖漿、氣溶膠噴霧劑及乳液。本文所述之組合物亦可以經口、靜脈內(快速注射或輸注)、腹膜內、皮下、經皮或肌肉內形式投與，全部使用一般熟習醫藥技術者熟知的劑型。組合物可單獨投與，但一般將與基於所選投藥途徑及標準醫藥實踐選擇的醫藥載劑一起投與。 本文所述之組合物的給藥方案將當然視已知因素而變化，諸如特定藥劑之藥力學特徵及其投藥模式及途徑；接受者之物種、年齡、性別、健康狀況、醫學病狀及體重；症狀之性質及程度；同時發生的治療的種類；治療頻率；投藥途徑、患者之腎功能及肝功能以及所需效應。醫師或獸醫可確定預防、對抗或遏止疾病狀態之進程所需之有效量之藥物且開具該有效量之藥物的處方。 根據一般指導，活性成分在用於指定效應時之口服日劑量將介於每公斤體重約0.001至約1000 mg範圍內，較佳每天每公斤體重約0.01至約100 mg，且最佳每天每公斤約0.6至約20 mg。活性成分在用於指定效應時之靜脈內日劑量將在恆定速率輸注期間介於每公斤體重每分鐘0.001 ng至100.0 ng範圍內。此類恆定靜脈內輸注可較佳以每公斤體重每分鐘0.01 ng至50 ng且最佳每公斤體重每分鐘0.01 ng至10.0 mg之速率投與。本文所述之組合物可以單次日劑量投與，或每日總劑量可分成每日兩次、三次或四次分次給藥投與。本文所述之組合物亦可視需要藉由將允許經數天/週/月之時段持續釋放藥物之儲槽式調配物投與。 本文所述之組合物可經由局部使用適合之鼻內媒劑以鼻內形成或使用經皮皮膚貼片經由經皮途徑投與。當以經皮遞送系統形式投與時，劑量投與將當然在整個給藥方案中為連續而非間斷的。 組合物通常與根據預定投藥形式(亦即口服錠劑、膠囊、酏劑、在推進劑存在或不存在下生成之氣溶膠噴霧劑及糖漿)適當選擇且與習知醫藥實踐相符之適合醫藥稀釋劑、賦形劑或載劑(在本文中統稱為醫藥載劑)混合投與。 舉例而言，對於以錠劑或膠囊形式經口投與，活性藥物組分可與以下經口、無毒、醫藥學上可接受之惰性載劑組合，諸如(但不限於)乳糖、澱粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇及山梨醇；對於以液體形式經口投與，經口藥物組分可與以下任何經口、無毒、醫藥學上可接受之惰性載劑組合，諸如(但不限於)乙醇、丙三醇及水。此外，當需要或必要時，亦可將適合之黏合劑、潤滑劑、崩解劑及著色劑併入混合物中。適合之黏合劑包括(但不限於)澱粉；明膠；天然糖，諸如(但不限於)葡萄糖或β-乳糖；玉米甜味劑；天然及合成膠，諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉；羧基甲基纖維素；聚乙二醇及蠟。用於此等劑型之潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。崩解劑包括(但不限於)澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土及三仙膠。 本文所述之組合物亦可以混合微胞或脂質體遞送系統形式投與，諸如單層小微脂粒、單層大微脂粒及多層微脂粒。脂質體可由多種磷脂形成，諸如膽固醇、硬脂胺或磷脂醯膽鹼。可添加滲透增強劑以增強藥物吸收。 由於已知前藥增強許多所需醫藥品質(亦即溶解性、生物可用性、製造等)，故本文所述化合物可以前藥形式遞送。因此，本文所述之標的物意欲涵蓋本發明所主張之化合物的前藥、遞送其之方法及含有其之組合物。 本文所述之組合物亦可與作為靶向藥物載劑之可溶性聚合物偶合。此類聚合物可包括聚乙烯-吡咯啶酮、哌喃共聚物、聚羥丙基-甲基丙烯醯胺-苯酚、聚羥乙基天冬醯胺苯酚或經軟脂醯基殘基取代之聚氧化乙烯-聚離胺酸。此外，本文所述之組合物可與以下適用於實現藥物控制釋放之一類可生物降解聚合物組合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸之共聚物、聚ε己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫哌喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝膠之交聯或兩性嵌段共聚物。 適於投與之劑型(醫藥組合物)可含有每劑量單位約0.01毫克至約500毫克活性成分。在此等醫藥組合物中，活性成分將通常以按該組合物之總重量計約0.5-95重量%之量存在。 明膠膠囊可含有活性成分及粉末狀載劑，諸如乳糖、澱粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂及硬脂酸。類似稀釋劑可用於製造壓製錠劑。錠劑及膠囊可製造為持續釋放產物以提供藥物經數小時時段之連續釋放。壓製錠劑可經糖包覆或經膜包覆以掩蓋任何令人不愉快的味道且保護錠劑不受大氣影響，或經腸溶包衣包覆以便在胃腸道中選擇性崩解。 用於經口投與之液體劑型可含有著色劑及調味劑以增加患者接受性。 一般而言，水、適合之油、生理鹽水、右旋糖(葡萄糖)及相關糖水溶液及二醇(諸如丙二醇或聚乙二醇)為適用於非經腸溶液之載劑。用於非經腸投與之溶液較佳含有活性成分之水溶性鹽、適合之穩定劑及(若需要)緩衝物質。單獨或合併之抗氧化劑，諸如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸為適合之穩定劑。亦使用檸檬酸及其鹽及EDTA鈉。另外，非經腸溶液可含有防腐劑，諸如氯化苯甲烴銨、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯及氯丁醇。 適合之醫藥載劑描述於本領域之標準參考本文
Remington: The Science and Practice of Pharmacy
, 第十九版, Mack Publishing Company (1995)中。 適用於本文所述化合物投與之代表性醫藥劑型可說明如下： 膠囊 大多數單位膠囊可藉由用100毫克粉末狀活性成分、150毫克乳糖、50毫克纖維素及6毫克硬脂酸鎂填充標準分半硬明膠膠囊來製備。 軟明膠膠囊 可製備活性成分於可消化油(諸如大豆油、棉籽油或橄欖油)中之混合物且藉助於正排量泵注入明膠中以形成含有100毫克活性成分之軟明膠膠囊。膠囊應洗滌且乾燥。 錠劑 錠劑可藉由習知程序製備以使得劑量單位例如為100毫克活性成分、0.2毫克膠態二氧化矽、5毫克硬脂酸鎂、275毫克微晶纖維素、11毫克澱粉及98.8毫克乳糖。可施用適當包衣以增加可口性或延遲吸收。 可注射劑 本文所述之肽組合物的可注射調配物可或可不需要使用賦形劑，諸如已經監管機構核准之賦形劑。此等賦形劑包括(但不限於)溶劑及共溶劑、增溶劑、乳化劑或增稠劑、螯合劑、抗氧化劑及還原劑、抗微生物防腐劑、緩衝劑及pH調節劑、增積劑、保護劑及張力調節劑及專門添加劑。可注射調配物必須無菌、無熱原質且在溶液情況下，不含微粒物質。 適於藉由注射投與之非經腸組合物可藉由將例如1.5重量%活性成分攪拌於可或可不含有共溶劑或其他賦形劑之醫藥學上可接受之緩衝液中來製備。溶液應用氯化鈉等張且滅菌。 懸浮液 可製備用於經口及/或非經腸投與之水性懸浮液，以使得例如各5 mL含有100 mg細粉狀活性成分、20 mg羧甲基纖維素鈉、5 mg苯甲酸鈉、1.0 g山梨醇溶液U.S.P.及0.025 mL香草精或其他可口調味劑。 可生物降解微粒 適於藉由注射投與之持續釋放非經腸組合物可例如藉由將適合之可生物降解聚合物溶解於溶劑中，將欲併入之活性劑添加至聚合物溶液且自基質移除溶劑，由此形成活性劑分佈於整個基質中之聚合物基質來製備。 本申請案中所用(具體包括在以下說明性實例中)的縮寫為熟習此項技術者所熟知。一些所用縮寫如下：HOBt表示羥基苯并三唑；HOAt表示1-羥基-7-氮雜苯并三唑；DIC表示N,N'-二異丙基碳化二亞胺；BOP表示六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基參(二甲胺基)鏻；PyBOP表示六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻；HCTU表示六氟磷酸1H-苯并三唑鹽1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-5氯-,(1-),3-氧化物；HATU表示六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；TFA表示三氟乙酸；TIS表示三異丙基矽烷；DMSO表示二甲亞碸；MeCN或ACN或AcCN表示乙腈；DMF表示N,N-二甲基甲醯胺；DCM表示二氯甲烷；DIPEA或DIEA表示二異丙基乙胺；Et
2
O表示乙醚；MeOH表示甲醇；rt表示室溫；h表示小時；min表示分鐘；且iPr表示異丙基。 肽合成 本文中之本發明的描述應視為與化學鍵結之定律及原理一致。應理解，本發明涵蓋之化合物為適當穩定地用作藥劑之彼等化合物。基於化學鍵結及穩定性之一般原理，熟習此項技術者將知曉何等化合物將穩定及將不穩定。 本發明之巨環肽的化學合成可使用多種此項技術公認之方法進行，包括逐步固相合成、經由構形輔助之肽片段再接合的半合成、選殖或合成肽區段之酶促接合及化學接合。合成本文所述之巨環肽及其類似物之較佳方法為使用各種固相技術之化學合成，諸如描述於Chan, W.C.等人編,
Fmoc Solid Phase Synthesis
, Oxford University Press, Oxford (2000)；Barany, G.等人,
The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology
, 第2卷: 「Special Methods in Peptide Synthesis, Part A」, 第3-284頁, Gross, E.等人編, Academic Press, New York (1980)；及Stewart, J.M.等人,
Solid-Phase Peptide Synthesis
, 第2版, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)中之固相技術。較佳策略係基於用於臨時保護α-胺基之Fmoc (9-茀基甲基甲基-氧基羰基)基團與用於臨時保護胺基酸側鏈之第三丁基組合(參見例如Atherton, E.等人, 「The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group」,
The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology
, 第9卷: 「Special Methods in Peptide Synthesis, Part C」, 第1-38頁, Undenfriend, S.等人編, Academic Press, San Diego (1987)。 肽可以逐步方式在不溶性聚合物負載物(亦稱為「樹脂」)上自肽之C端開始合成。藉由將肽之C端胺基酸經由形成醯胺或酯鍵附接至樹脂開始合成。此使得所得肽最終分別以C端醯胺或羧酸形式釋放。 用於合成之C端胺基酸及所有其他胺基酸需要使其α-胺基及側鏈官能基(若存在)有差異地受保護，使得α-胺基保護基可在合成期間選擇性移除。胺基酸之偶合藉由將其羧基活化為活性酯且使其與附接至樹脂之N端胺基酸未封端之α-胺基反應來進行。重複α-胺基脫除保護基及偶合之順序，直至組裝整個肽序列為止。肽接著自樹脂釋放，同時伴隨側鏈官能基脫除保護基，通常在適當清除劑存在下進行以限制副反應。所得肽最終藉由逆相HPLC純化。 作為最終肽之前驅物所需之肽基-樹脂的合成利用市售交聯聚苯乙烯聚合物樹脂(Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA)。C端甲醯胺之較佳固體負載物為：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-胺基甲基)-苯氧基乙醯基-對甲基二苯甲胺樹脂(Rink醯胺MBHA樹脂)；9-Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber醯胺樹脂)；4-(9-Fmoc)胺基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊醯基-胺基甲基-Merrifield樹脂(PAL樹脂)。第一及後續胺基酸之偶合可使用HOBt、6-Cl-HOBt或分別由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP生產或由DIC/6-Cl-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU生產之HOAt活性酯實現。受保護之肽片段的較佳固體負載物為：2-氯三苯甲基氯樹脂及9-Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基-Merrifield樹脂(Sieber醯胺樹脂)。第一胺基酸裝載於2-氯三苯甲基氯樹脂上最佳藉由使受Fmoc保護之胺基酸與樹脂在二氯甲烷及DIEA中反應來實現。若需要，可添加少量DMF以促進胺基酸溶解。 本文所述之肽類似物的合成可藉由使用單通道或多通道肽合成器來進行，諸如CEM Liberty Microwave合成器或Protein Technologies, Inc. Prelude (6通道)或Symphony (12通道)合成器。 相應肽之肽基-樹脂前驅物可使用任何標準程序裂解且脫除保護基(參見例如King, D.S.等人,
Int. J. Peptide Protein Res.
, 36:255-266 (1990))。所需方法為在水及作為清除劑之TIS存在下使用TFA。通常，肽基-樹脂在室溫下於TFA/水/TIS (94:3:3，v:v:v；1 mL/100 mg肽基樹脂)中攪拌2-6小時。接著濾出已用樹脂且濃縮TFA溶液或在減壓下乾燥。所得粗物質肽沈澱且用Et
2
O洗滌或直接再溶解於DMSO或50%乙酸水溶液中以便藉由製備型HPLC純化。 具有所需純度之肽可藉由例如在Waters型號4000或Shimadzu型號LC-8A液體層析儀上使用製備型HPLC純化來獲得。將粗物質肽溶液注入YMC S5 ODS (20×100 mm)管柱中且用MeCN/水(均用0.1% TFA緩衝)之線性梯度使用14-20 mL/min之流動速率溶離，同時藉由在220 nm下之UV吸光度監測流出物。經純化肽之結構可藉由電噴霧MS分析確認。 以下分析方案及合成方法適合於實例1253至1288：
分析資料：
質譜分析：「ESI-MS(+)」表示在陽離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-MS(-)」表示在陰離子模式中進行之電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(+)」表示在陽離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析；「ESI-HRMS(-)」表示在陰離子模式中進行之高解析度電噴霧電離質譜分析。所偵測之質量在「
m/z
」單位名稱後報導。精確質量大於1000之化合物常常偵測為雙電荷或三電荷離子。
分析 LCMS 條件 A ：
管柱：BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：水 + 0.05% TFA；移動相B：乙腈 + 0.05% TFA；溫度：50℃；梯度：經2分鐘2% B至98% B，接著在98% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 B ：
管柱：BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05% TFA；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05% TFA；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.75分鐘；流速：1.11 mL/min。
分析 LCMS 條件 C ：
管柱：BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：水 + 0.2%甲酸及0.01% TFA；移動相B：乙腈 + 0.2%甲酸0.01% TFA；溫度：50℃；梯度：經2分鐘2% B至80% B，經0.1分鐘80% B至98% B，接著在98% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 D ：
管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.75分鐘；流速：1.11 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 E ：
管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.75分鐘；流速：1.11 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 F ：
管柱：Waters Xbridge C18, 2.1 × 50 mm；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：35℃；梯度：經4分鐘0-100% B，接著在100% B下保持1分鐘；流速：4 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 G ：
Finnigan LTQ質譜儀；管柱：Phenomenex Jupiter C4, 1 × 50 mm；移動相A：1%甲酸/水；移動相B：0.1%甲酸/乙腈；溫度：30℃；梯度：1% B，保持1分鐘；經3分鐘1-95% B，接著在95% B下保持3分鐘；流速：0.15 mL/min。
分析 LCMS 條件 H ：
管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：1.0 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 I ：
管柱：Waters BEH C18, 2.0 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：50℃；梯度：經3分鐘0-100% B，接著在100% B下保持0.5分鐘；流速：0.5 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 HPLC 條件 A ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘35% B至80% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 B ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘25% B至75% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 C ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘20% B至70% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 D ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經25分鐘15% B至65% B；流速：1 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 E ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經20分鐘25% B至60% B；流速：1.25 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 F ：
管柱：YMC Pack ODS-AQ 3um 150×4.6mm；移動相A：水 + 0.1% TFA；移動相B：乙腈 + 0.1% TFA；溫度：60℃；梯度：經20分鐘25% B至65% B；流速：1.25 mL/min；偵測：UV，217 nm。
分析 HPLC 條件 G
管柱：Sunfire C18 3.5um, 3.0×150mm；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；溫度：50℃；梯度：經12分鐘10-100% B，接著在100% B下保持3分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 HPLC 條件 H
管柱：Xbridge Phenyl 3.5×150um，移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；溫度：50℃；梯度：經12分鐘10-100% B，接著在100% B下保持3分鐘；流速：1 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 HPLC 條件 I ：
管柱：Phenomenex Luna 5u C18(2) 150 × 4.6 mm；移動相A：水 + 0.1%三氟乙酸，移動相B：乙腈 + 0.1%三氟乙酸，梯度：經20分鐘5-100% B，接著在100% B下保持5分鐘；流速：1 mL/min，偵測：UV，220
分析 HPLC 條件 J ：
管柱：Phenomenex Luna 5u C18(2) 150 × 4.6 mm；移動相A：水 + 0.1%三氟乙酸，移動相B：乙腈 + 0.1%三氟乙酸，梯度：經20分鐘10-100% B，接著在100% B下保持5分鐘；流速：1 mL/min，偵測：UV，220
通用程序 ： Prelude 方法 A ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。DMF = 二甲基甲醯胺；DIC = N,N'-二異丙基碳化二亞胺；HOAt = 1-羥基7-氮雜苯并三唑；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「Prelude方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。Fmoc-N-甲基胺基酸之偶合及偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。將氯乙醯基偶合至肽之N端藉由下文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」或「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸及HOAt之溶液(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加DIC (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)。週期性攪動混合物60分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸及HOAt之溶液(0.2M於DMF中，5.0 mL，5 eq)，接著添加DIC (0.2M於DMF中，5.0 mL，5 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙醯氯偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加3.0 mL DIPEA (4.0 mmol，0.699 mL，40 eq)及氯乙醯氯(2.0 mmol，0.160 mL，20 eq)於DMF中之溶液。週期性攪動混合物12至18小時，接著排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將DCM (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後排出溶液。
Prelude 方法 B ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「Prelude方法B」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。將氯乙醯基偶合至肽之N端藉由下文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」或「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
雙偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)經由容器頂部連續洗滌3次且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，10 eq)，接著添加HCTU (0.2M於DMF中，2.5 mL，10 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.5 mL，12 eq)。週期性攪動混合物12小時，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙醯氯偶合程序 A
： 向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加3.0 mL DIPEA (4.0 mmol，0.699 mL，40 eq)及氯乙醯氯(2.0 mmol，0.160 mL，20 eq)於DMF中之溶液。週期性攪動混合物12至18小時，接著經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
氯乙酸偶合程序 B
： 向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DMF (2.0 mL)、氯乙酸(1.2 mmol，113 mg，12 eq)及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(1.2 mmol，0.187 mL，12 eq)。週期性攪動混合物12至18小時，接著經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
Prelude 方法 C ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「Prelude方法C」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。樹脂之最終洗滌使用下文所述之「
最終洗滌程序
」
樹脂溶脹程序：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，5.0 mL，10 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，2.5 mL，20 eq)。週期性攪動混合物60分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，1.5 mL，12 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，1.5 mL，12 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，0.5至2.5 mL，1至5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，0.5至2.5 mL，1至5 eq)，且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.5至1.5 mL，4至12 eq)。週期性攪動混合物60分鐘至600分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
最終洗滌程序：
樹脂如下連續洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DCM (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙酸偶合程序：
注意手動步驟。向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。混合物在室溫下震盪5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且攪動所得混合物，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DMF (2.0 mL)、氯乙酸(1.2 mmol，113 mg，12 eq)及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(1.2 mmol，0.187 mL，12 eq)。混合物在室溫下震盪12至18小時，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
Prelude 方法 D ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10或45 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM可經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「Prelude方法D」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。樹脂之最終洗滌使用下文所述之「
最終洗滌程序
」
樹脂溶脹程序：
向40 mL聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (5.0 mL)及DCM (5.0 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
單偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.75 mL，5 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.75 mL，5 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，2.5 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.75 mL，5 eq)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。 最終洗滌程序： 樹脂如下連續洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DCM (4.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙酸偶合程序：
注意手動步驟。向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。混合物在室溫下震盪5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且攪動所得混合物，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加DMF (2.0 mL)、氯乙酸(1.2 mmol，113 mg，12 eq)及N,N'-二異丙基碳化二亞胺(1.2 mmol，0.187 mL，12 eq)。混合物在室溫下震盪12至18小時，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (4.0 mL)添加至容器頂部且攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(4.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
CEM 方法 A ：
所有操作在CEM Liberty微波肽合成器(CEM Corporation)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料至CEM Discovery微波單元之30或125 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至CEM Liberty合成器。DMF及DCM可經由管頂部及底部添加，其向下同等洗滌管側。除了自頂部轉移樹脂時，所有溶液經由管底部移出。「週期性鼓泡」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣鼓泡。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。可在合成中採用其他常見樹脂(諸如Rink、ChloroTrityl)或其他酸敏感性連接基團，除非另外指出，否則在特定實例中使用Seiber醯胺樹脂。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「CEM方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致140 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「樹脂溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「二級胺偶合程序」。將氯乙醯基偶合至肽之N端藉由上文詳述之「氯乙醯氯偶合程序」或「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序：
向50 mL聚丙烯錐形管中添加Merrifield:Sieber樹脂(140 mg，0.100 mmol)。隨後將DMF (7 mL)添加至管中，接著添加DCM (7 mL)。樹脂接著自容器頂部轉移至反應容器。再重複程序兩次。添加DMF (7 mL)，接著添加DCM (7 mL)。藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡使樹脂溶脹15分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。
標準偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HATU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH之外，所有胺基酸之混合物在75℃下藉由N2鼓泡5分鐘來混合，經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
雙偶合偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HATU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH之外，所有胺基酸之混合物在75℃下藉由N2鼓泡5分鐘來混合，經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HATU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。除了在50℃下偶合的Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH之外，所有胺基酸之混合物在75℃下藉由N2鼓泡5分鐘來混合，經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加5%哌嗪及0.1 M HOBt於DMF (7 mL)中之溶液。混合物在75℃下週期性攪動3分鐘且隨後排出溶液。再重複此程序一次。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)、HCTU (0.5M於DMF中，1.0 mL，5 eq)及DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL，10 eq)。所有胺基酸(對於Fmoc-Cys(Trt)-OH及Fmoc-His(Trt)-OH，50℃)之混合物在75℃下藉由N
2
鼓泡5分鐘來混合，接著在不加熱的情況下混合6小時。在排出後，樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF溶液(20:80 v/v，5.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加含有HATU (2.5 eq至10 eq)之胺基酸溶液(1.25 mL至5 mL，2.5 eq至10 eq)，且最後添加DIPEA (2M於NMP中，0.5 mL至1 mL，20 eq)。混合物在25℃至75℃下藉由N
2
鼓泡5分鐘至2小時來混合，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。向反應容器中添加乙酸酐:DIEA:DMF之溶液(10:1:89 v/v/v，5.0 mL)。混合物在65℃下週期性鼓泡2分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：DMF (7 mL)自頂部洗滌，接著DMF (7 mL)自底部洗滌且最後用DMF (7 mL)自頂部洗滌。所得樹脂直接用於下一步驟。
Symphony 方法 A ：
所有操作在Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之Symphony聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Symphony肽合成器。所有溶劑、DMF、DCM、胺基酸及試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔15秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；NMM = n-甲基嗎啉；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。其他常見酸敏感性樹脂亦可用於合成，諸如Rink或官能化氯三苯甲基樹脂。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「Symphony方法A」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致70 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.050 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「標準偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用「雙偶合」，常規胺基酸經由手動空白添加胺基酸，亦即下文所述之「空白偶合」來偶合。
溶脹程序 ：
向Symphony聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(70 mg，0.050 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。所得樹脂直接用於下一步驟。
標準偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。由Symphony軟體暫停合成以將常規胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)手動添加至反應容器中，隨後重啟自動化：以添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物300分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌六次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
Symphony 方法 B ：
所有操作在Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之Symphony聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Symphony肽合成器。所有溶劑、DMF、DCM、胺基酸及試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔15秒出現。一般不使用製備超過三週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HCTU = 2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
；HATU = 六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；NMM = n-甲基嗎啉；DIPEA = 二異丙基乙胺；Sieber = Fmoc-胺基-二苯并哌喃-3-基氧基，其中「3-基氧基」描述與聚苯乙烯樹脂連接之位置及類型。所用樹脂為具有Sieber連接基團(在氮處受Fmoc保護)之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.71 mmol/g裝載量。其他常見酸敏感性樹脂亦可用於合成，諸如Rink或官能化氯三苯甲基樹脂。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。 Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH 「Symphony方法B」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。此規模相當於大致70 mg上文所述之Sieber-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.050 mmol規模。在胺基酸偶合之前，所有肽合成順序始於樹脂溶脹程序，下文描述為「溶脹程序」。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「標準偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用「
二級胺偶合程序 B
」，常規胺基酸經由手動空白添加胺基酸，亦即下文所述之「
常規胺基酸偶合程序
」偶合，且氯乙醯酸酐使用下文所述之「最終封端程序」添加至序列之最終位置。
溶脹程序 ：
向Symphony聚丙烯固相反應容器中添加Merrifield:Sieber樹脂(70 mg，0.050 mmol)。樹脂如下洗滌(溶脹)三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。所得樹脂直接用於下一步驟。
標準偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌6次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
二級胺偶合程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)，接著添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
常規胺基酸偶合程序：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。由系統暫停系統以將常規胺基酸(0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)手動添加至反應容器中，隨後重啟自動化以向反應容器中添加HATU (0.2M於DMF中，1.25 mL，5 eq)且最後添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌6次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
最終封端程序 ：
樹脂如下洗滌三次：向反應容器中添加DMF (2.5 mL)，接著藉由自反應容器底部之N
2
鼓泡週期性攪動混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶劑。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.5 mL)。週期性攪動混合物2.5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下洗滌6次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)，接著添加氯乙酸酐(0.4M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂用經由容器底部添加之DMF (6.25 mL)洗滌且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加NMM (0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)，接著添加氯乙酸酐(0.4M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌6次：經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加Ac
2
O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL)，週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DMF (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器底部添加DCM (2.5 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂隨後用氮氣流乾燥10分鐘。
整體脫除保護基方法 A ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:水:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(92.5:2.5:2.5:2.5 v:v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至裝備有玻璃料的25 mL注射器中。向注射器中添加「脫除保護基溶液」(5.0 mL)。混合物在震盪器中混合85分鐘。將溶液過濾，濃縮且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗肽。
整體脫除保護基方法 B ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法B」之程序描述以0.04 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.04 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷(96:4; v:v)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至裝備有玻璃料的10 mL注射器中。向注射器中添加「脫除保護基溶液」(2.0-3.0 mL)。混合物在震盪器中混合1小時或1.5小時。將溶液過濾，用脫除保護基溶液(0.5 mL)洗滌，濃縮且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗肽。
整體脫除保護基方法 C ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法C」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(4.0 mL)。混合物在震盪器中混合60分鐘。將溶液過濾且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗肽。
整體脫除保護基方法 D ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法B」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Sieber連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(94:3:3 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至裝備有玻璃料的25 mL注射器中。向注射器中添加「脫除保護基溶液」(5.0 mL)。混合物在震盪器中混合5分鐘。將溶液過濾且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗肽。
整體脫除保護基方法 E ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法E」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Fmoc Gly-ClTrt連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至Bio-Rad管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中混合3分鐘。將溶液過濾且收集於離心管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中混合3分鐘。將溶液過濾且收集於離心管中。向Bio-Rad管中添加「脫除保護基溶液」(2.0 mL)。混合物在震盪器中混合3分鐘。將溶液過濾且收集於離心管中。使離心管中之溶液靜置60分鐘。隨後用乙醚(30 mL)稀釋所收集之溶液且形成沈澱物。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗肽。
整體脫除保護基方法 F ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「整體脫除保護基方法F」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至樹脂之Rink連接基團的量來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。使用三氟乙酸:三異丙基矽烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5 v:v:w)製備「脫除保護基溶液」。樹脂自反應容器移出且轉移至6 ml Bio-Rad管中。向Bio-Rad中添加「脫除保護基溶液」(4.0 mL)。混合物在震盪器中混合90分鐘。將溶液過濾且稀釋於乙醚(30 mL)中。將沈澱固體離心3分鐘。傾析清液層溶液且將固體再懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且將其餘固體懸浮於乙醚(25 mL)中。將懸浮液離心3分鐘。傾析清液層且其餘固體在高真空下乾燥。獲得呈白色至灰白色固體狀之粗肽。
環化方法 A
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成肽之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用肽之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗肽固體溶解於乙腈:8M胍/50mM TRIS水溶液(1:3) (pH 8.6) (7 mL:18 mL或類似比率)之溶液中，且隨後若需要，使用NaOH水溶液(1.0M)調節溶液至pH = 8.5-9.0。溶液接著使用震盪器混合12至18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於乙腈:水中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環肽。
環化方法 C ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法C」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成肽之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用肽之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗肽固體溶解於乙腈:0.1M碳酸氫銨水性緩衝液(11 mL:24 mL或類似比率)之溶液中，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 8.5-9.0。溶液接著使用震盪器混合12至18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於乙腈:水中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環肽。
環化方法 D ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法D」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成肽之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用肽之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗肽固體溶解於乙腈:0.1M碳酸氫銨水性緩衝液(11 mL:24 mL)之溶液中，且隨後使用NaOH水溶液(1.0M)將溶液小心地調節至pH = 8.5-9.0。溶液隨後在攪拌下混合12至18小時。濃縮反應溶液且隨後將殘餘物溶解於乙腈:水中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環肽。
環化方法 E ：
除非另外指出，否則手動進行所有操作。「環化方法E」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成肽之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用肽之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗肽固體溶解於6M胍HCl水性緩衝溶液(15 mL)中，溶液隨後在攪拌下混合12至18小時。濃縮反應溶液且將15 mL DMSO添加至殘餘物中，得到漿料，將其過濾。對此過濾溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環肽。
手動偶合程序 A ：
向先前步驟之含有樹脂的Bio-Rad反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。週期性震盪混合物5分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌五次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且震盪所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(1.2-10當量)典型(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，隨後添加HATU (1.210當量)典型(0.2M於DMF中，2.5 mL，5 eq)，且最後添加DIPEA (2.4-20當量)典型(0.8M於DMF中，1.25 mL，10 eq)。混合物震盪60分鐘至18小時，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (4.0 mL)且震盪所得混合物60秒，隨後經由玻璃料排出溶液。
樹脂上 N- 甲基化方法 A.
(Turner, R. A.; Hauksson, N. E.; Gipe, J. H.; Lokey, R. S.
Org. Lett. 2013
,
15
(19), 5012-5015)： 除非指出，否則手動進行所有操作。「樹脂上N-甲基化方法A」之程序描述以0.100 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由結合至用於生成肽之樹脂的Sieber連接基團的量來確定。此規模不基於程序中所用肽之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。 將樹脂轉移至25 mL燒結注射器中。向樹脂中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，5.0 mL)。震盪混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)洗滌3次。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，4.0 mL)。震盪混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。將樹脂懸浮於DMF (2.0 mL)及三氟乙酸乙酯(0.119 ml，1.00 mmol)、1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯(0.181 ml，1.20 mmol)中。將混合物置於震盪器上60分鐘。經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。 樹脂用無水THF (2.0 mL)洗滌三次以移除任何殘餘水。在烘箱乾燥之4.0 mL小瓶中添加THF (1.0 mL)及乾燥4 Å分子篩(20 mg)上之三苯基膦(131 mg，0.500 mmol)。將溶液轉移至樹脂且緩慢添加偶氮二甲酸二異丙酯(0.097 mL，0.5 mmol)。攪拌樹脂15分鐘。經由玻璃料排出溶液且用無水THF (2.0 mL)洗滌樹脂三次以移除任何殘餘水。在烘箱乾燥之4.0 mL小瓶中添加THF (1.0 mL)、乾燥4 Å分子篩(20 mg)上之三苯基膦(131 mg，0.500 mmol)。將溶液轉移至樹脂且緩慢添加偶氮二甲酸二異丙酯(0.097 mL，0.5 mmol)。攪拌樹脂15分鐘。經由玻璃料排出溶液。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。將樹脂懸浮於乙醇(1.0 mL)及THF (1.0 mL)中，且添加硼氫化鈉(37.8 mg，1.000 mmol)。將混合物攪拌30分鐘且排出。樹脂用DMF (4.0 mL)連續洗滌三次且用DCM (4.0 mL)洗滌三次。
微裂解 A ：
向＜10 mg之小樹脂樣品中添加2滴TIS及1 mL三氟乙酸，在室溫下震盪。在1小時之後，移出小等分試樣且用0.5 mL乙腈稀釋，過濾且藉由LC-MS獲得分析。
實例 0001 之製備 實例0001為使用下文所述之以下合成順序製備的一種Rink醯胺樹脂： 「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」， Fmoc-甘胺酸-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-胱胺酸(Trt)-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-精胺酸(Pfp)-OH：「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」， Fmoc-N-甲基正白胺酸：「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」， Fmoc-N-甲基正白胺酸：「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」， (S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(異喹啉-7-基)丙酸：「手動偶合程序A」， Fmoc-絲胺酸(OtBu)-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-色胺酸(Boc)-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-反式-羥脯胺酸(tBu)-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-白胺酸-OH：「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」， Fmoc-組胺酸-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-脯胺酸-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-天冬醯胺-OH：「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」， Fmoc-N-甲基-丙胺酸-OH：「Symphony方法B：
標準偶合程序
」， Fmoc-酪胺酸(OtBu)-OH：「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」， 「Symphony方法B：
最終封端程序
」， 「
整體脫除保護基方法 D
」 「
環化方法 D
」。 粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經25分鐘10-65% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘0-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為93%。
分析 LCMS 條件 D:
滯留時間 = 1.32 min; ESI-MS(+)
m/z
961.8 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E:
滯留時間 = 1.10 min; ESI-MS(+)
m/z
961.7 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z:
計算值：962.9380(M+2H)
;
實驗值：962.9370(M+2H)
實例 1254 之製備
實例1254係按照針對實例0001之製備所述由以下通用程序構成之通用合成順序來製備：「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」、「Symphony方法B：
標準偶合程序
」、「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」、「手動偶合程序A」、「Symphony方法B：
最終封端程序
」、「
整體脫除保護基方法 D
」及「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：Waters XBridge C18, 19 × 250 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經25分鐘0-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。
分析 LCMS 條件 D:
滯留時間 = 1.39 min; ESI-MS(+)
m/z
961.8 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 E:
滯留時間 = 1.13 min; ESI-MS(+)
m/z
962.5 (M+2H)。
實例 1271 之製備 實例1271係按照針對實例0001之製備所述由以下通用程序構成之通用合成順序來製備：「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」、「Symphony方法B：
標準偶合程序
」、「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」、「手動偶合程序A」、「Symphony方法B：
最終封端程序
」、「
整體脫除保護基方法 F
」及「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為14.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。
分析 LCMS 條件 H:
滯留時間 = 1.48 min.; ESI-MS(+)
m/z
926.9 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 I:
滯留時間 = 2.96 min.; ESI-MS(+)
m/z
926.9 (M+2H)。
ESI-HRMS(+) m/z:
計算值：926.4354(M+2H); 實驗值：926.4331(M+2H)。
實例 1284 之製備 實例1284係按照針對實例0001之製備所述由以下通用程序構成之通用合成順序來製備：「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」、「Symphony方法B：
標準偶合程序
」、「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」、「手動偶合程序A」、「Symphony方法B：
最終封端程序
」、「
整體脫除保護基方法 F
」及「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為0.9 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為90%。分析LCMS條件H: 滯留時間 = 1.53 min.; ESI-MS(+)
m/z
934.3 (M+2H)。分析LCMS條件I: 滯留時間 = 2.57 min.; ESI-MS(+)
m/z
933.7 (M+2H)。ESI-HRMS(+)
m/z:
計算值：932.9330(M+2H); 實驗值：932.9313 (M+2H)。
實例 1286 之製備 實例1286係按照針對實例0001之製備所述由以下通用程序構成之通用合成順序來製備：「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」、「Symphony方法B：
標準偶合程序
」、「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」、「手動偶合程序A」、「Symphony方法B：
最終封端程序
」、「
整體脫除保護基方法 F
」及「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘5-45% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。分析LCMS條件H: 滯留時間 = 1.45 min.; ESI-MS(+)
m/z
921.5 (M+2H)。分析LCMS條件I: 滯留時間= 2.59 min.; ESI-MS(+)
m/z
921.4 (M+2H)。ESI-HRMS(+)
m/z:
計算值：920.9330 (M+2H); 實驗值：920.9320 (M+2H)。
實例 1287 之製備 實例1287係按照針對實例0001之製備所述由以下通用程序構成之通用合成順序來製備：「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」、「Symphony方法B：
標準偶合程序
」、「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」、「手動偶合程序A」、「Symphony方法B：
最終封端程序
」、「
整體脫除保護基方法 F
」及「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為0.7 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為81%。分析LCMS條件H: 滯留時間 = 1.66 min.; ESI-MS(+)
m/z
942.7 (M+2H)。分析LCMS條件I: 滯留時間 = 2.80 min.; ESI-MS(+)
m/z
943.6 (M+2H)。
實例 1288 之製備 實例1288係按照針對實例0001之製備所述由以下通用程序構成之通用合成順序來製備：「Symphony方法B：
樹脂溶脹程序
」、「Symphony方法B：
標準偶合程序
」、「Symphony方法B：
二級胺偶合程序
」、「Symphony方法B：
常規胺基酸偶合程序
」、「Symphony方法B：
最終封端程序
」、「
整體脫除保護基方法 F
」及「
環化方法 D
」。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為14.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。
分析 LCMS 條件 H
: 滯留時間 = 1.45 min.; ESI-MS(+)
m/z
928.2 (M+2H)。
分析 LCMS 條件 I:
滯留時間 = 2.07 min.; ESI-MS(+)
m/z
928.2 (M+2H)。ESI-HRMS(+)
m/z:
計算值：927.9409(M+2H) 實驗值：927.9381 (M+2H)。 以下分析方案及合成方法適合於實例1001至10505。
分析 LCMS 條件 A ：
管柱：Waters BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：水 + 0.05% TFA；移動相B：乙腈 + 0.05% TFA；溫度：40℃；梯度：經2分鐘2% B至98% B，隨後在98% B下保持0.5分鐘；流速：0.8 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 B ：
管柱：Phenomenex Luna C18 2.0 × 30mm 3-μm粒子；移動相A：水 + 0.05%乙酸銨；移動相B：乙腈 + 0.05%乙酸銨；溫度：40℃；梯度：經2分鐘0% B至100% B，隨後在100% B下保持1分鐘；流速：1.0 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 C ：
管柱：Waters BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 D ：
管柱：Waters CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 三氟乙酸；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 E ：
管柱：Waters CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.05%三氟乙酸；溫度：70℃；梯度：經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。 通用程序：
Prelude 方法 A ：
所有操作在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自動進行。除非指出，否則所有程序在裝配有底部玻璃料之10 mL聚丙烯管中進行。該管經由該管之底部及頂部連接至Prelude肽合成器。DMF及DCM經由管頂部添加，其向下同等洗滌管側。其餘試劑經由管底部添加且向上穿過玻璃料以接觸樹脂。所有溶液經由管底部移除。「週期性攪動」描述經由底部玻璃料之短暫N
2
氣脈衝；脈衝持續約5秒且每隔30秒出現。不使用製備超過兩週之胺基酸溶液。HATU溶液在製備5天內使用。DMF = 二甲基甲醯胺；HATU = 六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物；DIPEA = 二異丙基乙胺；所用樹脂為用Rink連接基團官能化之Merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100-200目，1% DVB，0.53 mmol/g裝載量。常用胺基酸列於以下，在括弧內指示側鏈保護基。Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH 「Prelude方法A」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由初始樹脂裝載步驟中所用胺基酸之量來確定。此規模使用96 mg上文所述之Rink醯胺-Merrifield樹脂。所有程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.050 mmol規模。將胺基酸偶合至一級胺N端使用下文所述之「單偶合程序」。將胺基酸偶合至二級胺N端使用下文所述之「雙偶合程序」。將氯乙酸偶合至肽之N端藉由下文詳述之「氯乙酸偶合程序」描述。
樹脂溶脹程序：
重複三次：向含有樹脂之反應容器中添加DMF (1.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。
單偶合程序：
向含有樹脂之反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，1.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，1.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，0.5 mL，2 eq)，隨後添加HATU (0.2M於DMF中，0.5 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.3 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐於DMF中之溶液(1M，0.8 mL)，接著添加DIPEA (0.8M，0.3 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
單偶合程序 - 30 分鐘：
除在DIPEA添加之後週期性攪動混合物30分鐘而非15分鐘之外，此方法與「單偶合程序」相同。
雙偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，1.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，1.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，0.5 mL，2 eq)，隨後添加HATU (0.2M於DMF中，0.5 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.3 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2M於DMF中，0.5 mL，2 eq)，隨後添加HATU (0.2M於DMF中，0.5 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.3 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐於DMF中之溶液(1M，0.8 mL)，接著添加DIPEA (0.8M，0.3 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙酸偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，1.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，1.0 mL)。週期性攪動混合物3分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌六次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (1.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加氯乙酸(0.2M，0.5 mL)、HATU (0.2M，0.5 mL，2 eq.)，隨後添加DIPEA (0.8M於DMF中，0.3 mL，4 eq.)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。將所得樹脂置於N
2
流下8分鐘。 Symphony方法A： 對於所有程序，使用Symphony X肽合成器(Protein Technologies)代替Prelude肽合成器且所有試劑經由反應容器頂部添加。Symphony X合成儀以1.0 mmol規模或更大進行反應。因此，以下程序描述1.0 mmol規模之合成。
樹脂溶脹程序：
重複三次：向含有樹脂之反應容器中添加DMF (2.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。
單偶合程序：
向含有樹脂之反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2 M於DMF中，1.0 mL，2 eq)，接著添加HATU (0.2 M於DMF中，1.0 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.4 M於DMF中，1.0 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐溶液(2.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
單偶合程序 - 30 分鐘：
除在DIPEA添加之後週期性攪動混合物30分鐘而非15分鐘之外，此方法與「單偶合程序」相同。
雙偶合程序：
向含有樹脂之反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2 M於DMF中，1.0 mL，2 eq)，接著添加HATU (0.2 M於DMF中，1.0 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.4 M於DMF中，1.0 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌兩次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加胺基酸(0.2 M於DMF中，1.0 mL，2 eq)，接著添加HATU (0.2 M於DMF中，1.0 mL，2 eq)且最後添加DIPEA (0.4 M於DMF中，1.0 mL，4 eq)。週期性攪動混合物15分鐘，隨後經由玻璃料排出反應溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加乙酸酐溶液(2.0 mL)。週期性攪動混合物10分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。所得樹脂直接用於下一步驟。
氯乙醯氯偶合程序：
向先前步驟之含有樹脂的反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加哌啶:DMF (20:80 v/v，2.0 mL)。週期性攪動混合物4分鐘且隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，經由容器頂部添加DMF (2.0 mL)且週期性攪動所得混合物30秒，隨後經由玻璃料排出溶液。向反應容器中添加氯乙酸(0.2 M，1.0 mL)、HATU (0.2 M，1.0 mL，2 eq.)，隨後添加DIPEA (0.4 M於DMF中，1.0 mL，4 eq.)。週期性攪動混合物30分鐘，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌三次：對於每次洗滌，將DMF (2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。樹脂如下連續洗滌四次：對於每次洗滌，將CH
2
Cl
2
(2.0 mL)添加至容器頂部且週期性攪動所得混合物90秒，隨後經由玻璃料排出溶液。將所得樹脂置於N
2
流下5分鐘。 整體脫除保護基方法A： 除非指出，否則所有操作均手動進行。「整體脫除保護基方法A」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由理論上結合至樹脂之初始裝載胺基酸的規模來確定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.050 mmol規模。「脫除保護基溶液」係藉由將三氟乙酸(22 mL)、水(1.25 mL)、DTT (250 mg)及三異丙基矽烷(0.5 mL)合併於40 mL玻璃瓶中來製備。樹脂自反應容器移出且轉移至4 mL玻璃瓶。向該瓶中添加樹脂，接著添加「脫除保護基溶液」(1.0 mL)。混合物在震盪器中劇烈混合(大致500 RPM持續40分鐘)。經由0.2微米針筒過濾器過濾混合物且用TFA (1.0 mL)萃取固體。向裝有合併濾液之24 mL試管中添加Et
2
O (15 mL)。使混合物劇烈混合，接著沈澱大量白色固體。使混合物離心5分鐘，隨後傾析溶液與固體分離且棄去。將固體懸浮於Et
2
O (20 mL)中；隨後使混合物離心5分鐘；且傾析溶液與固體分離並棄去，得到呈白色至灰白色固體狀之粗肽。 環化方法A： 除非指出，否則所有操作均手動進行。「環化方法A」之程序描述以0.050 mmol規模進行之實驗，其中該規模藉由理論上結合至樹脂用於生成肽所用之初始胺基酸的量來確定。此規模不基於程序中所用肽之數量的直接測定。程序可藉由規模之倍量來調整所述體積，以便按比例放大超過0.100 mmol規模。將粗肽固體溶解於MeCN:0.2 M碳酸氫銨水溶液(1:1)中至18-22 mL的總體積。目標pH為8.5-9.0。隨後使溶液在不攪拌的情況下靜置12-18小時。反應溶液在不加熱的情況下經由離心濃縮而濃縮隔夜且隨後將殘餘物溶解於DMSO:MeOH (1 mL:1 mL)中。對此溶液進行逆相HPLC純化，得到所需環肽。 通用合成順序A： 「通用合成順序A」描述用於得到本文所述之環肽之程序的通用順序。出於此通用程序的目的，「Symphony方法A」之程序與「Prelude方法A」之程序可互換。向10 mL聚丙烯固相反應容器中添加Rink醯胺-Merrifield樹脂(96 mg)，且將反應容器置於Prelude肽合成器上。隨後在Prelude上依序進行一系列胺基酸偶合：若樹脂結合肽之N端為一級，則遵循「Prelude方法A：單偶合程序」；若樹脂結合肽之N端為二級胺，則遵循「Prelude方法A：雙偶合程序」；或若所偶合之AA併入在AA10位置處，則遵循「
單偶合程序 - 30 分鐘
」。遵循「Prelude方法A：氯乙酸偶合程序」；隨後遵循「整體脫除保護基方法A」；隨後遵循「環化方法A」。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吲唑 -3- 基 ) 丙酸之製備
流程：
步驟1： 向1H-吲唑-3-甲醛(3 g，20.53 mmol)及碳酸銫(7.36 g，22.58 mmol)於DMF (82 ml)中之0℃溶液中添加2-溴乙酸第三丁酯(3.29 ml，22.58 mmol)且藉由自冰浴移出而使其升溫至室溫。攪拌反應物2小時。將反應物傾倒於水(500 mL)上且添加Et
2
O (200 mL)。產物萃取於Et
2
O層中。分離各層且水相用Et
2
O (100 mL)萃取第二次。合併之Et
2
O層用水、隨後鹽水洗滌2次。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗物質藉由急驟矽膠層析使用0-30% EtOAc/己烷之梯度純化。收集產物溶離份且真空移除溶劑，得到2-(3-甲醯基-1H-吲唑-1-基)乙酸第三丁酯5.23 (98%)。ESI-MS(+)
m/z
205.1 (M+1-tBu)。
1
H NMR (400MHz, 氯仿-d) d 10.28 (s, 1H), 8.35 (d,
J
=8.1 Hz, 1H), 7.56 - 7.49 (m, 1H), 7.45 - 7.36 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 1.48 (s, 9H)。 步驟2： 將(±)-2-苯甲氧基羰基胺基-2-(二甲氧基氧膦基)乙酸甲酯(7.32 g，22.10 mmol)溶解於CH
2
Cl
2
(50 mL)中且在氮氣下攪拌。向此溶液中添加DBU (3.33 mL，22.10 mmol)且攪拌混合物10分鐘，接著經15-20分鐘逐滴添加2-(3-甲醯基-1H-吲唑-1-基)乙酸第三丁酯(5.23 g，20.09 mmol)於CH
2
Cl
2
(50 mL)中之溶液。在室溫下繼續攪拌16小時。真空濃縮反應混合物。殘餘物用EtOAc稀釋且用5%檸檬酸水溶液、隨後鹽水洗滌，接著經無水Na
2
SO
4
乾燥，過濾且蒸發。粗物質藉由急驟矽膠層析使用0-50% EtOAc/己烷之梯度純化。收集產物溶離份且真空移除溶劑，得到(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙烯酸甲酯7.4 g (79%)。ESI-MS(+)
m/z
466.0 (M+1)。
1
H NMR (400MHz, 氯仿-d) d 9.21 (s, 1H), 7.82 (d,
J
=8.3 Hz, 1H), 7.52 - 7.23 (m, 8H), 6.90 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 1.44 (s, 9H) 步驟3： 將(Z)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙烯酸甲酯(7.4 g，15.90 mmol)溶解於帕爾瓶(parr bottle)中之MeOH (80 mL)及苯(80 mL)中。N
2
氣鼓泡通過溶液15分鐘，接著添加(+)-1,2-雙((2S,5S)-2,5-二乙基磷㖦)苯(環辛二烯)銠(I)三氟甲烷磺酸鹽(0.115 g，0.159 mmol)，且置於氫氣氛圍(60 psi)下3天。反應物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾且真空濃縮。粗物質藉由急驟矽膠層析使用0-50% EtOAc/己烷之梯度純化。收集產物溶離份且真空移除溶劑，得到(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸甲酯7.43 g (100%)。ESI-MS(+)
m/z
468.0 (M+1)。
1
H NMR (400MHz, 氯仿-d) d 7.64 (d,
J
=8.1 Hz, 1H), 7.44 - 7.26 (m, 7H), 7.15 (t,
J
=7.5 Hz, 1H), 5.87 (d,
J
=7.8 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.99 (s, 2H), 4.90 - 4.80 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.63 - 3.55 (m, 1H), 3.46 (dd,
J
=14.8, 4.8 Hz, 1H), 1.42 (s, 9H)。 步驟4： 將氫氧化鋰(1.142 g，47.7 mmol)於水(39.7 ml)中之溶液添加至(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸甲酯(7.43 g，15.89 mmol)於THF (39.7 ml)中之溶液中。在室溫下攪拌反應物30分鐘。將EtOAc添加至反應物中且用1 N HCl使pH成酸性。收集有機相，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗物質藉由急驟層析使用0-10% MeOH/DCM + 0.1% AcOH純化。收集產物溶離份且真空移除溶劑，得到(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸3.9 g (54%)。ESI-MS(+)
m/z
454.0 (M+1)。
1
H NMR (400MHz, DMSO-d
6
) d 12.73 (br. s., 1H), 7.77 (d,
J
=8.3 Hz, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 2H), 7.40 - 7.24 (m, 5H), 7.14 - 7.08 (m, 1H), 5.15 (s, 2H), 5.00 - 4.89 (m, 2H), 4.42 (td,
J
=8.6, 5.1 Hz, 1H), 3.39 - 3.24 (m, 2H), 1.37 (s, 9H)。 步驟5： 將(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸(3.88 g，8.56 mmol)溶解於MeOH (80 ml)/苯(20 mL)中且置於N
2
氛圍下。在劇烈攪拌下，將Pd-C (0.455 g，0.428 mmol)添加至溶液中。將反應物置於H
2
氣氛圍下且攪拌16小時。反應物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾且真空濃縮，得到(S)-2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸2.74 g (100%)，其按原樣用於步驟6中。ESI-MS(+)
m/z
320.1 (M+H)。
1
H NMR (400MHz, DMSO-d
6
) d 7.78 (d,
J
=8.0 Hz, 1H), 7.54 (d,
J
=8.5 Hz, 1H), 7.38 (ddd,
J
=8.3, 7.0, 1.0 Hz, 1H), 7.13 (t,
J
=7.2 Hz, 1H), 5.23 - 5.10 (m, 2H), 3.58 (dd,
J
=9.0, 4.0 Hz, 1H), 3.49 (dd,
J
=15.6, 4.0 Hz, 1H), 3.28 (br. s., 2H), 3.17 (dd,
J
=15.7, 8.9 Hz, 1H), 1.41 (s, 9H)。 步驟6： 將(S)-2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸(2.74 g，8.58 mmol)溶解於THF (34.3 ml)中，接著添加水(34.3 ml)。隨後添加碳酸氫鈉(1.442 g，17.16 mmol)，接著添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(2.89 g，8.58 mmol)。攪拌反應物2小時。真空移除大部分THF，隨後添加EtOAc。混合物用1 N HCl酸化至pH 7，且用EtOAc萃取。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮，得到(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸(4.9 g，105%)，其按原樣使用。ESI-MS(+)
m/z
542.1 (M+H)。
1
H NMR (400MHz, DMSO-d
6
) d 7.87 (d,
J
=7.5 Hz, 2H), 7.82 (d,
J
=8.0 Hz, 1H), 7.70 (d,
J
=8.3 Hz, 1H), 7.64 (t,
J
=8.2 Hz, 2H), 7.52 (d,
J
=8.3 Hz, 1H), 7.43 - 7.34 (m, 3H), 7.32 - 7.23 (m, 2H), 7.10 (t,
J
=7.4 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.42 (td,
J
=8.8, 5.0 Hz, 1H), 4.20 - 4.11 (m, 3H), 3.42 - 3.25 (m, 2H), 1.36 (s, 9H)。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吡咯并 [3,2-b] 吡啶 -3- 基 ) 丙酸之製備 (S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)丙酸係藉由與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-3-基)丙酸相同之方法製備，但具有以下修改：在步驟1中使用1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲醛而非1H-吲唑-3-甲醛作為起始物質。步驟4中甲酯之水解在0℃下進行20分鐘，而非在室溫下進行30分鐘。ESI-MS(+)
m/z
542.2 (M+H)。
1
H NMR (400MHz, DMSO-d
6
) d 8.34 (dd,
J
=4.8, 1.3 Hz, 1H), 8.23 (d,
J
=7.5 Hz, 1H), 7.89 (d,
J
=7.5 Hz, 2H), 7.81 (dd,
J
=8.5, 1.3 Hz, 1H), 7.65 (t,
J
=8.4 Hz, 2H), 7.46 (s, 1H), 7.44 - 7.37 (m, 2H), 7.29 (dtd,
J
=10.9, 7.4, 0.9 Hz, 2H), 7.19 (dd,
J
=8.3, 4.5 Hz, 1H), 5.06 - 4.92 (m, 2H), 4.37 - 4.30 (m, 1H), 4.23 - 4.14 (m, 3H), 3.28 (dd,
J
=14.7, 4.1 Hz, 1H), 3.09 (dd,
J
=14.6, 9.0 Hz, 1H), 1.38 (s, 9H)。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-5- 甲氧基 -1H- 吲哚 -3- 基 ) 丙酸之製備
流程：
步驟1： 向5-甲氧基-1H-吲哚-3-甲醛(1.5 g，8.56 mmol)及碳酸銫(3.07 g，9.42 mmol)於DMF (34.2 ml)中之0℃溶液中添加2-溴乙酸第三丁酯(1.373 ml，9.42 mmol)且藉由自冰浴移出而使其升溫至室溫。攪拌反應物2小時。將反應物傾倒於水上且添加Et
2
O。產物萃取於Et
2
O層中。分離各層且水相用Et
2
O萃取第二次。合併之Et
2
O層用水、隨後鹽水洗滌兩次。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮，得到2-(3-甲醯基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸第三丁酯2.1 g (85%)，其按原樣用於下一步驟中。ESI-MS(+)
m/z
290.1 (M+H)。 步驟2： 將2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸苯甲酯(1.55 g，(3.8 mmol)溶解於DCM (11.52 mL)中且在氮氣下攪拌。向此溶液中添加DBU (0.573 mL，3.80 mmol)且攪拌混合物10分鐘，接著經15-20分鐘逐滴添加2-(3-甲醯基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸第三丁酯(1.0 g，3.46 mmol)於DCM (11.52 mL)中之溶液。在室溫下繼續攪拌16小時。真空濃縮反應混合物。殘餘物用EtOAc稀釋且用5%檸檬酸水溶液、隨後鹽水洗滌，接著經無水Na
2
SO
4
乾燥，過濾且蒸發。粗物質藉由急驟層析使用20-70% EtOAc/己烷之梯度純化。收集產物溶離份且真空移除溶劑，得到(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙烯酸苯甲酯1.6 g，80%。ESI-MS(+)
m/z
571.2 (M+H)。 步驟3： 將(Z)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙烯酸苯甲酯(700 mg，1.227 mmol)溶解於MeOH (12 ml)中，用(+)-1,2-雙((2S,5S)-2,5-二乙基磷㖦)苯(環辛二烯)銠(I)三氟甲烷磺酸鹽(8.86 mg，0.012 mmol)處理，且置於氫氣氛圍(60 psi)下3天。反應物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾，真空濃縮，得到(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯702 mg (100%)，其按原樣用於下一步驟中。ESI-MS(+)
m/z
573.2 (M+H)。
1
H NMR (400MHz, DMSO-d
6
) d 7.87 (d,
J
=7.8 Hz, 1H), 7.38 - 7.13 (m, 11H), 7.10 - 7.02 (m, 2H), 6.77 (dd,
J
=8.8, 2.3 Hz, 1H), 5.13 - 5.04 (m, 2H), 5.04 - 4.94 (m, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.32 (td,
J
=8.3, 5.8 Hz, 1H), 3.72 (s, 3H), 1.39 (s, 9H)。 步驟4： 將(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯(700 mg，1.222 mmol)溶解於MeOH (12 ml)中且置於N
2
氛圍下。在劇烈攪拌下，將Pd-C (65.0 mg，0.061 mmol)添加至溶液中。將反應物置於H
2
氛圍下且攪拌16小時。反應物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾且真空濃縮，得到(S)-2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸426 mg (100%)，其按原樣用於步驟5中。ESI-MS(+)
m/z
349.1 (M+H)。 步驟5： 將(S)-2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸(426 mg，1.223 mmol)溶解於THF (5 ml)中，接著添加水(5.00 ml)。隨後添加碳酸氫鈉(205 mg，2.446 mmol)，接著添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(412 mg，1.223 mmol)。攪拌反應物2小時。真空移除大部分THF，隨後添加Et
2
O。棄去有機層且再用Et
2
O洗滌水層。收集水相，用1 N HCl酸化且用EtOAc萃取。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮，得到粗產物，其未經進一步純化。獲得LC/MS及NMR證實。ESI-MS(+)
m/z
571.1 (M+H)。
1
H NMR (400MHz, DMSO-d
6
) d 12.71 (br. s., 1H), 7.88 (d,
J
=7.5 Hz, 2H), 7.72 (d,
J
=8.3 Hz, 1H), 7.66 (t,
J
=8.3 Hz, 2H), 7.40 (td,
J
=7.1, 4.1 Hz, 2H), 7.33 - 7.23 (m, 2H), 7.17 (d,
J
=8.8 Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 2H), 6.76 (dd,
J
=8.8, 2.3 Hz, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.24 - 4.14 (m, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.14 (dd,
J
=14.4, 4.4 Hz, 1H), 2.99 (dd,
J
=14.8, 9.8 Hz, 1H), 1.38 (s, 9H)。
2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吡咯并 [2,3-b] 吡啶 -3- 基 ) 丙酸之製備
流程：
步驟1： 向1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醛(1.5 g，10.26 mmol)及碳酸銫(3.68 g，11.29 mmol)於DMF (41.1 ml)中之0℃溶液中添加2-溴乙酸第三丁酯(1.646 ml，11.29 mmol)且藉由自冰浴移出而使其升溫至室溫。攪拌反應物2小時。將反應物傾倒於水上且添加Et
2
O。產物萃取於Et
2
O層中。分離各層且水相用Et
2
O萃取第二次。合併之Et
2
O層用水、隨後鹽水洗滌2次。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮，得到2-(3-甲醯基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)乙酸第三丁酯2.3 g (86%)，其按原樣用於下一步驟中。ESI-MS(+)
m/z
205.1 (M+1-tBu)。
1
H NMR (400MHz, 氯仿-d) d 10.02 (s, 1H), 8.58 (dd,
J
=7.8, 1.5 Hz, 1H), 8.42 (dd,
J
=4.8, 1.5 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.31 - 7.28 (m, 1H), 5.05 (s, 2H), 1.49 (s, 9H)。 步驟2： 將2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸苯甲酯(2.348 g，5.76 mmol)溶解於DCM (12 mL)中且在氮氣下攪拌。向此溶液中添加DBU (0.637 ml，4.23 mmol)且攪拌混合物10分鐘，接著逐滴添加2-(3-甲醯基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)乙酸第三丁酯(1 g，3.84 mmol)於DCM (12 mL)中之溶液。在室溫下繼續攪拌16小時。真空濃縮反應混合物。殘餘物用EtOAc稀釋且用5%檸檬酸水溶液及鹽水洗滌，接著經無水Na
2
SO
4
乾燥，過濾且蒸發。粗物質藉由急驟層析使用0-10%% MeOH/DCM之梯度純化。收集產物溶離份且真空移除溶劑，得到(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙烯酸苯甲酯1.54 g (74%)。
2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吡咯并 [3,2-c] 吡啶 -3- 基 ) 丙酸之製備
流程：
步驟1： 向1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-甲醛(0.95 g，6.50 mmol)及碳酸銫(2.330 g，7.15 mmol)於DMF (26.0 ml)中之0℃溶液中添加2-溴乙酸第三丁酯(1.042 ml，7.15 mmol)。藉由自冰浴移出而使混合物升溫至室溫。攪拌反應物2小時。將反應物傾倒於冰水(100 mL)及EtOAc (50 mL)混合物上。產物萃取於EtOAc中。分離各層且水相用EtOAc (2 × 50 mL)萃取第二次。合併之EtOAc層用鹽水洗滌。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到2-(3-甲醯基-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-1-基)乙酸第三丁酯1.24 g (73%)作為澄清產物。ESI-MS(-): MS
m/z
259.1。 步驟2： 將(±)-2-苯甲氧基羰基胺基-2-(二甲氧基氧膦基)乙酸甲酯(1.596 g，4.82 mmol)溶解於15 mL DCM中且在氮氣下在0℃下攪拌5分鐘。向此溶液中添加DBU (0.726 ml，4.82 mmol)，接著在10分鐘期間逐滴添加2-(3-甲醯基-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-1-基)乙酸第三丁酯(1.14 g，4.38 mmol)於DCM (15 mL)中之溶液。在室溫下攪拌混合物隔夜。反應混合物用EtOAc稀釋且用5%檸檬酸水溶液、隨後鹽水洗滌，收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-基)丙烯酸甲酯1.0 g (49%)作為產物。ESI-MS(+): MS
m/z
466.0。 步驟3： 向(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-基)丙烯酸甲酯(1.0 g，2.15 mmol)於甲醇(20 mL)中之溶液中添加Pd/C (0.5 g)。反應在55 psi下進行2天。過濾Pd/C且用甲醇及DCM洗滌。濃縮溶劑，得到2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-基)丙酸甲酯0.54 g (75%)作為粗產物，其直接用於下一步驟。ESI-MS(+): MS
m/z
334.1。 步驟4及5： 向2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-基)丙酸甲酯(0.54 g，1.62 mmol)於THF/H
2
O (1:1，10 mL)中之溶液中添加LiOH (116 mg，4.86 mmol)。在室溫下攪拌混合物9分鐘。藉由添加1 N HCl溶液將混合物調節至PH=7。隨後將碳酸氫鈉(408 mg，4.86 mmol)及FMOC-OSU (546 mg，1.620 mmol)添加至混合物中。攪拌所得混合物2小時。添加5%檸檬酸以調節PH=7且水相用乙酸乙酯萃取，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-基)丙酸250 mg (28.5%)作為產物。ESI-MS(+): MS
m/z
542.2。
1
H NMR (甲醇-d
4
) d 9.17 (s, 1H), 8.28 (d, J=6.3 Hz, 1H), 7.82 (t, J=6.8 Hz, 3H), 7.58 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.62 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.21-7.49 (m, 6H), 7.11-7.19 (m, 1H), 4.98-5.13 (m, 2H), 4.20-4.43 (m, 3H), 4.08-4.20 (m, 1H), 3.47-3.45 (m, 2H), 1.35-1.54 (s, 9H) 2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(7-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙酸
之製備
流程：
步驟1： 在氮氣下，向7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(6 g，50.4 mmol)及六甲胺四胺(10.59 g，76 mmol)中添加乙酸(20.00 mL)及水(40 mL)。將反應混合物加熱至回流且攪拌8小時。將反應混合物冷卻至室溫，隨後過濾固體。固體用醚洗滌3次。乾燥固體，得到7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醛5.6 g (76%)作為所需產物。ESI-MS(+): MS
m/z
148.1。
1
H NMR (甲醇-d
4
) d: 10.00 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.40 (s, 1H)。 步驟2： 向7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲醛(5.41 g，36.8 mmol)及碳酸銫(13.18 g，40.4 mmol)於DMF (147 ml)中之0℃溶液中添加2-溴乙酸第三丁酯(5.90 ml，40.4 mmol)。藉由自冰浴移出而使混合物升溫至室溫。攪拌反應物2小時。將反應物傾倒於冰水(500 mL)及EtOAc (300 mL)混合物上。產物萃取於EtOAc中。分離各層且水相用EtOAc (2 × 150 mL)萃取第二次。合併之EtOAc層用鹽水洗滌。收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到2-(5-甲醯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙酸第三丁酯6.60 g (69%)作為澄清產物。ESI-MS(-): MS
m/z
262.0。 步驟3： 將(±)-2-苯甲氧基羰基胺基-2-(二甲氧基氧膦基)乙酸甲酯(9.07 g，27.4 mmol)溶解於70 mL DCM中且在氮氣下在0℃下攪拌5分鐘。向此溶液中添加DBU (4.17 ml，27.4 mmol)，接著在10分鐘期間逐滴添加2-(5-甲醯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙酸第三丁酯(6.50 g，24.88 mmol)於DCM (50 mL)中之溶液。在室溫下攪拌混合物隔夜。反應混合物用EtOAc稀釋且用5%檸檬酸水溶液/1 N NaOH PH=4溶液、隨後鹽水洗滌，收集有機層，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(7-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙烯酸甲酯11.55 g (100%)作為產物。ESI-MS(+): MS
m/z
467.0。 步驟4： 向(E)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(7-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙烯酸甲酯(5.3 g，11.36 mmol)於甲醇(40 mL)中之溶液中添加Pd/C (1.2 g)。反應在55 psi下進行2天。過濾Pd/C且用甲醇及DCM洗滌。濃縮溶劑，得到3.0 g (79%) 2-胺基-3-(7-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙酸甲酯作為產物。ESI-MS(+): MS
m/z
335.1。 步驟5及6： 向2-胺基-3-(7-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙酸甲酯(2.8 g，8.37 mmol)於THF/H
2
O (1:1，40 mL)中之溶液中添加LiOH (0.60 g，25.1 mmol)。在室溫下攪拌混合物8分鐘。藉由添加1 N HCl溶液將混合物調節至PH=7。隨後將碳酸氫鈉(2.11 g，25.1 mmol)及FMOC-OSU (2.82 g，8.37 mmol)添加至混合物中。攪拌所得混合物2小時。添加5%檸檬酸以調節PH=7且水相用乙酸乙酯萃取，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(7-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙酸1.2 g (26.4%)作為產物。ESI-MS(+): MS
m/z
543.1。
1
H NMR (甲醇-d
4
) d: 8.75 (s, 1H), 7.79 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.60 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.20-7.45 (m, 7H), 4.95 (s, 2H), 4.57 (d, J=8.3 Hz, 1H), 4.23-4.38 (m, 2H), 3.36-3.46 (m, 1H), 2.70 (s, 2H), 2.34 (s, 2H), 1.35-1.50 (s, 9H)
2-{ 雙 [( 第三丁氧基 ) 羰基 ] 胺基 } 丙 -2- 烯酸苯甲酯之製備 在室溫下，向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-羥基丙酸苯甲酯(5.0 g，17 mmol)及二碳酸二第三丁酯(9.6 g，44 mmol)於乙腈(20 mL)中之溶液中添加DMAP (0.21 g，1.7 mmol)。攪拌溶液18小時且隨後減壓濃縮。將殘餘物溶解於乙醚中，依次用1 M硫酸氫鉀水溶液(2×)、飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，隨後經MgSO
4
乾燥，過濾且蒸發揮發物，得到呈白色固體狀之最終產物2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}丙-2-烯酸苯甲酯(6.0 g，16 mmol，94%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 7.41 - 7.37 (m, 4H), 7.35 - 7.31 (m, 1H), 6.45 - 6.34 (m, 1H), 5.70 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 1.43 (s, 18H)。
2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吡咯并 [3,2-b] 吡啶 -1- 基 ) 丙酸之製備
流程：
步驟1： 在0℃下在氬氣氛圍下，將氮雜吲哚(2.0 g，16.93 mmol)添加至含氯化鋁(11.29 g，85 mmol)之無水二氯甲烷(85 mL)中。在0℃下30分鐘之後，將混合物升溫至室溫且逐滴添加氯側氧基乙酸乙酯(11.56 g，85 mmol)。劇烈攪拌反應混合物隔夜，隨後小心地添加冰。用4 N NaOH、隨後冷的飽和NaHCO
3
溶液調節pH至7。產物用DCM萃取3次，經Na
2
SO
4
乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀殘餘物形式之2-側氧基-2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸乙酯。在用冷的石油醚洗滌之後，獲得呈淡黃色粉末形式之標題化合物280 mg (7.6%)。ESI-MS(-): MS
m/z
217.1。 步驟2： 向TFA (2 mL)及三乙基矽烷(0.4 mL)之混合物中添加2-側氧基-2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸乙酯(280 mg，1.28 mmol)。混合物在55℃下加熱16小時。在冷卻至室溫後，移除溶劑且添加飽和NaHCO
3
，接著添加DCM。收集有機層，經Na
2
SO
4
乾燥，過濾且濃縮，得到2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸乙酯作為粗產物。ESI-MS(-): MS
m/z
203.1。 步驟3： 步驟2粗物質2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸乙酯及LiOH (165 mg，6.90 mmol)在室溫下攪拌於THF/H
2
O (5 mL，1:1)中1小時。在0℃下添加1 M HCl以調節PH至5。移除溶劑且殘餘物用甲醇洗滌，過濾，乾燥有機層並濃縮，得到2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸作為粗產物。ESI-MS(+): MS
m/z
177.1。 步驟4： 向2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸(375 mg，2.129 mmol)於DCM (7.0 mL)及乙酸第三丁酯(3.0 mL)中之溶液中逐滴添加過氯酸(0.274 mL，3.19 mmol)。在室溫下攪拌所得溶液3小時。過濾淺棕色固體且用DCM洗滌。濃縮DCM層。隨後添加水及EtOAc。使用EtOAc萃取產物兩次。有機層用飽和NaHCO
3
洗滌2次，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮，得到2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯100 mg (20%)作為產物。該物質直接用於下一步驟反應。ESI-MS(-): MS
m/z
231.1。 步驟5： 將碳酸鉀(357 mg，2.58 mmol)添加至2-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯(100 mg，0.431 mmol)及2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}丙-2-烯酸苯甲酯(162 mg，0.431 mmol)於乙腈(5 mL)中之溶液中。將反應混合物加熱至50℃隔夜。反應物用EtOAc及水稀釋。有機層用鹽水洗滌，經Na
2
SO
4
乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物經由矽膠層析純化，得到呈白色固體狀之2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}丙酸苯甲酯(100 mg，38%)。ESI-MS(+): MS
m/z
610.3。 步驟6： 在室溫下，H
2
緩慢鼓泡通過來自步驟5之2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}丙酸苯甲酯(100 mg，0.164 mmol)及Pd-C (4.36 mg，4.10 µmol)於MeOH (5 mL)中之溶液6小時。反應混合物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾且蒸發，得到2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}丙酸 (80 mg，94%)，其未經純化即用於下一步驟。ESI-MS(+): MS
m/z
520.4。 步驟7： 將含4M HCl之二噁烷(2 mL)添加至來自步驟6之2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}丙酸中。攪拌混合物30分鐘，隨後濃縮，得到2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基)丙酸作為粗產物。ESI-MS(+): MS
m/z
320.1。 步驟8： 將碳酸氫鈉(67.1 mg，0.8 mmol)及FMOC-OSU (53.9 mg，0.160 mmol)添加至2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基)丙酸(51 mg，0.16 mmol)於THF/水(4 mL，1:1)中之溶液中。攪拌所得混合物2小時。添加5%檸檬酸以調節PH=7且水相用乙酸乙酯萃取，經硫酸鈉乾燥且真空濃縮。粗產物藉由矽膠層析純化，得到2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基)丙酸10.7 mg (12%)作為產物。ESI-MS(+): MS
m/z
542.2。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吲哚 -1- 基 ) 丙酸及 (R)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吲哚 -1- 基 ) 丙酸之製備
步驟1： 向2-(1H-吲哚-3-基)乙酸(500 mg，2.85 mmol)於DCM (25 mL)及THF (2 mL)中之溶液中添加2,2,2-三氯乙醯亞胺第三丁酯(2.041 mL，11.42 mmol)。在室溫下攪拌反應物18小時。蒸發反應揮發物且在矽膠上純化粗物質(40 g管柱，5-50% EtOAc:Hex)，得到呈黃色油狀之產物2-(1H-吲哚-3-基)乙酸第三丁酯(200 mg，0.865 mmol，30.3%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 7.55 (dt,
J
=8.0, 1.0 Hz, 1H), 7.36 (dt,
J
=8.2, 0.8 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.12 (td,
J
=7.6, 1.1 Hz, 1H), 7.05 - 7.01 (m, 1H), 3.67 (d,
J
=0.8 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H)。 步驟2： 向2-(1H-吲哚-3-基)乙酸第三丁酯(0.57 g，2.5 mmol)及2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}丙-2-烯酸苯甲酯(0.85 g，2.2 mmol)於乙腈(15 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(1.9 g，13 mmol)。在室溫下攪拌反應物18小時。在室溫下攪拌之後，尚未發生反應。反應物隨後加熱至50℃持續24小時。將反應物冷卻，用EtOAc稀釋且用水洗滌。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物經由矽膠純化(40 g管柱，5-40% EtOAc:Hex)，得到呈透明油狀之2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸苯甲酯(830 mg，1.4 mmol，61%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 7.59 (d,
J
=7.9 Hz, 1H), 7.41 - 7.38 (m, 6H), 7.33 - 7.30 (m, 1H), 7.19 (td,
J
=7.6, 1.0 Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 1H), 7.05 (s, 1H), 5.28 - 5.19 (m, 3H), 4.87 (dd,
J
=15.1, 4.7 Hz, 1H), 3.68 - 3.55 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.28 (s, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.69 min; ESI-MS(+)
m/z
631.3 (M+Na)。 步驟3： H
2
緩慢鼓泡通過2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸苯甲酯(830 mg，1.4 mmol)及Pd-C (36 mg，0.034 mmol)於MeOH (10 mL)中之溶液，且隨後在室溫下在H
2
正壓下靜置2天。反應物經由耐綸玻璃料過濾器過濾且蒸發揮發物，得到呈透明油狀之2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(700 mg，1.4 mmol，100%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.46 min; ESI-MS(+)
m/z
541.3 (M+Na)。 步驟4： 在N
2
正壓下，向HCl (4 M，5.0 ml)於二噁烷中之0℃溶液中添加2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(700 mg，1.4 mmol)。移除冰浴且在室溫下攪拌反應物30分鐘。在不加熱的情況下減壓蒸發反應揮發物，得到呈黏性油狀之HCl鹽形式的2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(480 mg，1.4 mmol，100%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 0.91 min; ESI-MS(+)
m/z
262.95 (M-第三丁基)。 步驟5： 向呈HCl鹽形式之2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(480 mg，1.4 mmol)及碳酸氫鈉(570 mg，6.8 mmol)於丙酮(5.00 mL)及水(10 mL)中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(460 mg，1.4 mmol)。攪拌反應物18小時。反應物用HCl水溶液(1.0 M)緩慢酸化至pH 5且劇烈攪拌。用DCM分離反應溶液。有機層用水、接著鹽水洗滌。收集有機層；經MgSO
4
乾燥且減壓濃縮，得到粗產物。在矽膠上純化粗物質(40 g管柱，20-80% EtOAc:Hex)，得到呈白色泡沫狀之產物。將純化的物質提交至SFC用於對掌性分離。來自SFC之第一溶離峰為(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(90 mg，0.166 mmol，12.28%產率)。第2溶離峰為(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(88 mg，0.16 mmol，12%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.44 min; ESI-MS(+)
m/z
563.1 (M+Na)。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 甲基磺醯胺基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吲哚 -3- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯(1.2 g，2.2 mmol)溶解於DCM (10 mL)中之溶液中添加TFA (10 mL)。在室溫下攪拌反應物1小時。蒸發反應揮發物且置放在高真空下隔夜，得到產物(S)-2-(3-(3-(苯甲氧基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基丙基)-1H-吲哚-1-基)乙酸(1.0 g，2.1 mmol，93%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.25 min; ESI-MS(+)
m/z
509.2 (M+Na)。 步驟2： 向(S)-2-(3-(3-(苯甲氧基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基丙基)-1H-吲哚-1-基)乙酸(1.01 g，2.076 mmol)溶解於無水DCM (20 mL)中之溶液中添加甲磺醯胺(0.197 g，2.076 mmol)、EDC (0.438 g，2.284 mmol)及DMAP (0.279 g，2.284 mmol)。在室溫下攪拌反應物4天。溶液用HCl水溶液(1 M)、接著鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥，過濾且減壓蒸發，得到粗物質(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(甲基磺醯胺基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯(900 mg，1.6 mmol，77%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.79 min; ESI-MS(+)
m/z
586.1 (M+Na)。 步驟3： H
2
鼓泡通過(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(甲基磺醯胺基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯(896 mg，1.590 mmol)及Pd-C (169 mg，0.159 mmol)於MeOH (20 mL)中之溶液5分鐘。反應物隨後靜置在H
2
正壓下2小時。反應物用N
2
鼓泡通過，且隨後經由耐綸玻璃料過濾器過濾。減壓蒸發揮發物，得到呈黏性油狀之產物(S)-2-胺基-3-(1-(2-(甲基磺醯胺基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(424 mg，1.25 mmol，79%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 0.87 min; ESI-MS(+)
m/z
340 (M+H)。 步驟4： 向(S)-2-胺基-3-(1-(2-(甲基磺醯胺基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(424 mg，1.249 mmol)及碳酸氫鈉(525 mg，6.25 mmol)於丙酮(8.00 mL)及水(8 mL)中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(421 mg，1.249 mmol)。攪拌反應物18小時。反應物在劇烈攪拌下用HCl水溶液(1 M)緩慢酸化至pH 5。水層用25 ml EtOAc分離。有機層用水、接著鹽水洗滌。收集有機層，經MgSO
4
乾燥且減壓蒸發揮發物。粗物質經由逆相層析(移動相A：5%乙腈、95%水、10 mM乙酸銨。移動相B：95%乙腈、5%水、10 mM乙酸銨。經20個管柱體積10% B-50% B)純化，得到呈灰白色固體狀之產物(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(甲基磺醯胺基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(330 mg，0.59 mmol，47%產率)。分析條件B: 滯留時間 = 1.14 min; ESI-MS(+)
m/z
561.9 (M+H)。
(S)-3-(1-((1H- 四唑 -5- 基 ) 甲基 )-1H- 吲哚 -3- 基 )-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 ) 丙酸之製備
步驟1： 向(S)-2-(3-(3-(苯甲氧基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基丙基)-1H-吲哚-1-基)乙酸(.897 g，1.844 mmol)之溶液中添加CDI (0.389 g，2.397 mmol)且攪拌反應物3小時。隨後添加氫氧化銨(0.287 mL，7.37 mmol)且再攪拌反應物3小時。反應物用DCM (50 mL)稀釋且用HCl水溶液(1 M)洗滌。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物(S)-3-(1-(2-胺基-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丙酸苯甲酯(865 mg，1.782 mmol，97%產率)，其按原樣用於下一反應步驟中。分析條件A: 滯留時間 = 1.14 min; ESI-MS(+)
m/z
561.9 (M+H)。 步驟2： 在室溫下，向(S)-3-(1-(2-胺基-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-3-基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丙酸苯甲酯(865 mg，1.782 mmol)於DMF (12 mL)中之溶液中添加2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪(164 mg，0.891 mmol)。攪拌反應物18小時。再添加1當量三嗪且在2小時後LCMS顯示完全進展成產物。反應物用EtOAc稀釋且用水洗滌。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥，過濾且蒸發。粗產物在矽膠上純化(40 g管柱10-50% EtOAc:Hex)，得到呈淺棕色泡沫狀之產物(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(氰基甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯(600 mg，1.28 mmol，72%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.33 min; ESI-MS(+)
m/z
490.2 (M+Na)。 步驟3： 向(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(氰基甲基)-1H-吲哚-3-基)丙酸苯甲酯(300 mg，0.642 mmol)於水(2.0 ml)及2-丙醇(1.0 ml)中之溶液中添加疊氮化鈉(83 mg，1.283 mmol)及溴化鋅(II) (72.3 mg，0.321 mmol)且加熱至90℃。加熱反應物且攪拌18小時。在反應物冷卻之後，添加HCl水溶液(1 M，10 mL)，接著添加EtOAc (50 mL)。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發，得到粗物質(S)-3-(1-((1H-四唑-5-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丙酸苯甲酯(328 mg，0.6 mmol，100%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.23 min; ESI-MS(+)
m/z
533.3 (M+Na)。 步驟4： H
2
鼓泡通過(S)-3-(1-((1H-四唑-5-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丙酸苯甲酯(160 mg，0.31 mmol)及Pd-C (33 mg，0.03 mmol)於MeOH (5 mL)中之溶液5分鐘。反應物隨後在攪拌下保持在H
2
正壓下2天。反應物經由耐綸玻璃料過濾器過濾且減壓蒸發。產物(S)-3-(1-((1H-四唑-5-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-2-胺基丙酸(89 mg，0.311 mmol，100%產率)直接用於下一步驟。分析條件A: 滯留時間 = 0.7 min; ESI-MS(+)
m/z
287 (M+H)。 步驟5： 向(S)-3-(1-((1H-四唑-5-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-2-胺基丙酸(89 mg，0.31 mmol)及碳酸氫鈉(130 mg，1.6 mmol)於丙酮(2.0 mL)及水(4.0 mL)中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(110 mg，0.31 mmol)。攪拌反應物18小時。反應物用HCl水溶液(1 M)緩慢酸化至pH 5且劇烈攪拌。反應物用DCM分離。有機層用水、接著鹽水洗滌。收集有機層；經MgSO
4
乾燥且減壓蒸發揮發物，得到粗產物。粗物質在製備型HPLC上純化(SunFire Prep C18 30×100管柱尺寸；經15分鐘梯度10-100% 95:5 CH
3
CN:水與0.1% TFA緩衝液)，得到呈白色固體狀之產物(S)-3-(1-((1H-四唑-5-基)甲基)-1H-吲哚-3-基)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙酸(104 mg，0.205 mmol，65.8%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 7.77 (d,
J
=7.4 Hz, 2H), 7.66 - 7.63 (m, 1H), 7.59 (dd,
J
=7.4, 3.2 Hz, 1H), 7.40 - 7.34 (m, 3H), 7.33 (d,
J
=8.2 Hz, 2H), 7.29 - 7.21 (m, 3H), 7.20 - 7.15 (m, 2H), 7.11 - 7.06 (m, 1H), 5.70 - 5.62 (m, 2H), 4.57 - 4.51 (m, 1H), 4.36 - 4.19 (m, 2H), 4.17 - 4.10 (m, 1H), 3.37 (dd,
J
=14.7, 4.9 Hz, 1H), 3.23 - 3.10 (m, 1H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.14 min; ESI-MS(+)
m/z
509.1 (M+H)。
2-((( 苯甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-2-( 二甲氧基磷醯基 ) 乙酸苯甲酯之製備 步驟1： 向2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸甲酯(10 g，30 mmol)於THF (50 mL)及MeOH (50 mL)中之溶液中緩慢逐滴添加氫氧化鋰單水合物水溶液(18 mL，2.0 M)。在室溫下攪拌反應物1小時。反應物用HCl水溶液(1.0 M)酸化且用EtOAc萃取。有機層用鹽水洗滌；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發，得到粗物質2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸(8.0 g，25 mmol，84%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.06 min; ESI-MS(+)
m/z
339.8 (M+Na)。 步驟2： 向2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸(8.0 g，25 mmol)及DBU (3.8 ml，25 mmol)於乙腈(17 mL)中之溶液中添加(溴甲基)苯(3.15 ml，26.5 mmol)。在室溫下攪拌反應物18小時。反應物用水稀釋且用EtOAc萃取。有機層用鹽水洗滌；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物在矽膠上純化(80 g管柱，0-100% EtOAc:Hex)，得到呈白色固體狀之產物2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸苯甲酯(4.5 g，11 mmol，44%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 7.47 - 7.32 (m, 10H), 5.64 (d,
J
=7.9 Hz, 1H), 5.33 (d,
J
=12.1 Hz, 1H), 5.24 (d,
J
=12.1 Hz, 1H), 5.21 - 5.11 (m, 2H), 5.04 - 4.94 (m, 1H), 3.79 - 3.67 (m, 6H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.39 min; ESI-MS(+)
m/z
430.0 (M+Na)。
2-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 )-2-( 二甲氧基磷醯基 ) 乙酸 2-( 三甲基矽烷基 ) 乙酯之製備 步驟1： 向2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸(3.44 g，12.15 mmol)懸浮於DCM (100 mL)中之溶液中添加DMAP (0.148 g，1.215 mmol)，接著添加2-(三甲基矽烷基)乙醇(1.741 mL，12.15 mmol)及N1-((乙基亞胺基)亞甲基)-N3,N3-二甲基丙烷-1,3-二胺, HCl (2.79 g，14.58 mmol)。在室溫下攪拌反應物2小時。有機層用HCl (1M)、接著鹽水洗滌。收集有機層，經MgSO
4
乾燥，過濾且蒸發揮發物，得到呈透明油狀之產物2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(4.4 g，11.47 mmol，94%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 4.94 - 4.78 (m, 1H), 4.39 - 4.25 (m, 2H), 3.84 (d,
J
=4.9 Hz, 3H), 3.86 (d,
J
=5.0 Hz, 3H), 1.48 (s, 9H), 1.15 - 1.05 (m, 2H), 0.09 - 0.06 (m, 9H)。
2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-5,6,7,8- 四氫咪唑并 [1,5-a] 吡啶 -1- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙酸(0.7 mL，4.6 mmol)、吡啶-2-基甲胺(0.48 mL，4.6 mmol)及EDC (0.98 g，5.1 mmol)之溶液中添加DMAP (0.62 g，5.1 mmol)。在室溫下攪拌反應物2小時。減壓蒸發溶劑且隨後用EtOAc稀釋。有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌且隨後用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物經由矽膠純化(40 g管柱，0-5% MeOH:DCM)，得到呈黃色油狀之產物3-側氧基-3-((吡啶-2-基甲基)胺基)丙酸第三丁酯(830 mg，3.3 mmol，72%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 0.882 min; ESI-MS(+)
m/z
251.2 (M+H)。 步驟2： 在0℃下向3-側氧基-3-((吡啶-2-基甲基)胺基)丙酸第三丁酯(2 g，8.0 mmol)及吡啶(3.9 ml，48 mmol)於DCM (53 ml)中之溶液中添加POCl
3
(0.90 ml，9.6 mmol)且使其升溫至室溫。攪拌反應物1小時。將反應物質轉移至分液漏斗且用飽和碳酸鈉水溶液洗滌。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發，得到粗產物2-(咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯(1.8 g，7.8 mmol，97%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 0.942 min; ESI-MS(+)
m/z
233.2 (M+H)。 步驟3： 在0℃下向DMF (0.40 ml，5.2 mmol)及吡啶(2.1 ml，26 mmol)於DCM (29 ml)中之溶液中添加POCl
3
(0.50 ml，5.2 mmol)且攪拌5分鐘。2-(咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯(1.0 g，4.3 mmol)隨後以於DCM (5.0 mL)中之溶液形式添加且使其升溫至室溫。攪拌反應物18小時。反應物隨後添加飽和碳酸鈉水溶液且劇烈攪拌10分鐘。隨後分離兩相混合物且有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到粗物質。粗物質在矽膠上純化(80 g管柱，20-80% EtOAc:Hex)，得到呈棕色片狀固體狀之純產物2-(1-甲醯基咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯(876 mg，3.37 mmol，78%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 9.97 (s, 1H), 8.41 (d,
J
=7.1 Hz, 1H), 8.25 (dt,
J
=9.1, 1.1 Hz, 1H), 7.47 (ddd,
J
=9.1, 6.7, 0.9 Hz, 1H), 7.13 (td,
J
=6.9, 1.1 Hz, 1H), 4.24 (s, 2H), 1.49 - 1.38 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 2.1 min; ESI-MS(+)
m/z
261 (M+H)。 步驟4： 在N
2
氛圍下，向2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸苯甲酯(850 mg，2.1 mmol)於DCM (15 mL)中之溶液中緩慢添加DBU (0.29 mL，1.9 mmol)。在10分鐘之後，將2-(1-甲醯基咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯(450 mg，1.729 mmol) (於2 mL DCM中)緩慢添加至反應混合物。攪拌反應物18小時。蒸發反應物且藉由矽膠層析純化(80 g管柱20-50% EtOAc:Hex)，得到呈透明油狀之產物(Z)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙烯酸苯甲酯(800 mg，1.5 mmol，85%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.49 min; ESI-MS(+)
m/z
542.5 (M+H)。 步驟5： 在室溫下N
2
鼓泡通過(Z)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙烯酸苯甲酯(400 mg，0.739 mmol)於MeOH (10 mL)中之溶液5分鐘。隨後添加Pd-C (79 mg，0.074 mmol)且接著用H
2
鼓泡反應溶液5分鐘，隨後在攪拌下保持在H
2
正壓下2小時。反應物經由耐綸玻璃料過濾器過濾且蒸發揮發物，得到產物2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5,6,7,8-四氫咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙酸(239 mg，0.739 mmol，100%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 3.96 - 3.82 (m, 2H), 3.82 - 3.69 (m, 1H), 2.94 - 2.83 (m, 1H), 2.82 - 2.63 (m, 2H), 2.02 - 1.92 (m, 2H), 1.87 - 1.79 (m, 2H), 1.51 - 1.45 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 0.747 min; ESI-MS(+)
m/z
324.2 (M+H)。 步驟6： 向2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5,6,7,8-四氫咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙酸(240 mg，0.74 mmol)及碳酸氫鈉(310 mg，3.7 mmol)於丙酮(5 mL)及水(5 mL)中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(250 mg，0.740 mmol)。攪拌反應物18小時。反應物在劇烈攪拌下用HCl水溶液(1.0 M)緩慢酸化至pH 5。反應物用25 ml EtOAc分離。有機層用水、接著鹽水洗滌。收集有機層；經MgSO
4
乾燥；過濾且減壓蒸發揮發物，得到粗產物。逆相層析純化粗物質(55 g管柱，10-100% CH
3
CN:水 + 0.1% TFA)，得到呈白色固體狀之產物2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-5,6,7,8-四氫咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙酸(300 mg，0.55 mmol，74%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 7.86 - 7.77 (m, 2H), 7.71 - 7.61 (m, 2H), 7.45 - 7.37 (m, 2H), 7.37 - 7.29 (m, 2H), 4.40 - 4.17 (m, 5H), 4.00 (t,
J
=6.0 Hz, 3H), 3.21 - 3.07 (m, 1H), 2.96 (dd,
J
=15.0, 8.4 Hz, 1H), 2.80 - 2.72 (m, 2H), 2.06 - 1.87 (m, 2H), 1.87 - 1.75 (m, 2H), 1.51 - 1.40 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.13 min; ESI-MS(+)
m/z
546.4 (M+H)。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 ) 咪唑并 [1,5-a] 吡啶 -1- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 在N
2
氛圍下，向2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(4.75 g，12.4 mmol)於DCM (25 mL)中之溶液中緩慢添加DBU (1.9 mL，12.3 mmol)。在10分鐘之後，將含2-(1-甲醯基咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)乙酸第三丁酯(1.00 g，3.84 mmol)之DCM (5 mL)緩慢添加至反應混合物中。攪拌反應物18小時。蒸發反應揮發物且藉由矽膠層析純化粗物質(80 g管柱20-50% EtOAc:Hex)，得到呈透明油狀之產物(Z)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙烯酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1.39 g，2.30 mmol，70%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 8.13 (d,
J
=7.1 Hz, 1H), 7.74 (dt,
J
=9.2, 1.1 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.02 (ddd,
J
=9.3, 6.5, 0.8 Hz, 1H), 6.87 - 6.79 (m, 1H), 4.43 - 4.29 (m, 2H), 4.17 (s, 2H), 1.52 - 1.48 (m, 9H), 1.46 (s, 9H), 1.17 - 1.10 (m, 2H), 0.13 - 0.09 (m, 9H)。分析條件F: 滯留時間 = 2.24 min; ESI-MS(+)
m/z
518.4 (M+H)。 步驟2： 向(Z)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙烯酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1.40 g，2.69 mmol)於四氫呋喃(30 mL)中之溶液中用(+)-1,2-雙((2s,5s)-2,5-二乙基磷㖦)苯(環辛二烯)銠(i)三氟甲烷磺酸鹽(0.06 g，0.081 mmol)處理，且置於氫氣氛圍(20巴)下的PARR高壓容器中。攪拌反應物72小時。蒸發反應揮發物且在矽膠上純化粗物質(80 g管柱，5-40% EtOAc:Hex)，得到呈淡橙色泡沫狀之產物(S)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(380 mg，0.729 mmol，27%產率)。分析條件F: 滯留時間 = 1.64 min; ESI-MS(+)
m/z
520.5 (M+H)。 步驟3： 在室溫下，向(S)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(240 mg，0.462 mmol)於THF (4 mL)中之溶液中添加氟化四正丁基銨(0.460 mL，0.462 mmol)且攪拌1小時。隨後蒸發反應揮發物且用EtOAc (10 mL)稀釋。有機層隨後經MgSO
4
乾燥，經由耐綸玻璃料過濾器過濾且減壓蒸發揮發物。殘餘物隨後置於高真空下30分鐘，得到呈深橙色殘餘物狀之產物(S)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸(194 mg，0.462 mmol，100%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 0.93 min; ESI-MS(+)
m/z
420.2 (M+H)。 步驟4： 在N
2
正壓下，向含有(S)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸(194 mg，0.462 mmol)之小瓶中添加HCl (1.2 mL，4M於二噁烷中)且在室溫下攪拌1小時。隨後在室溫下減壓蒸發反應揮發物，得到呈黏性泡沫狀之產物(S)-2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙酸HCl鹽(165 mg，0.464 mmol，100%產率)。分析條件F: 滯留時間 = 0.96 min; ESI-MS(+)
m/z
320.1 (M+H)。 步驟5： 將碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(203 mg，0.603 mmol)添加至(S)-2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙酸, HCl (195 mg，0.548 mmol)及碳酸氫鈉(230 mg，2.74 mmol)於丙酮(3 mL)及水(3 mL)中之溶液中且在室溫下攪拌1小時。反應物用HCl (1M)中和以達到pH 5-6。中和的溶液隨後用EtOAc及水稀釋。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到粗物質。粗物質在製備型HPLC上純化(SunFire Prep C18 30×100管柱尺寸；經15分鐘梯度10-100% 95:5 CH
3
CN:水與0.1% TFA緩衝液)，得到呈棕色泡沫狀之純產物(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-1-基)丙酸(165 mg，0.305 mmol，55.6%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.09 min; ESI-MS(+)
m/z
542.3 (M+H)。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 ) 咪唑并 [1,5-a] 吡啶 -3- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向2-溴吡啶(2.50 ml，25.3 mmol)、丙烯酸第三丁酯(18.4 ml，127 mmol)、1,4-二氮雜二環[2.2.2]辛烷(0.114 g，1.013 mmol)、碳酸鉀(3.50 g，25.3 mmol)及四丁基溴化銨(8.16 g，25.3 mmol)於脫氣DMF (100 ml)中之溶液中添加乙酸鈀(II) (0.114 g，0.506 mmol)且在壓力容器中加熱至120℃並攪拌14小時。在14小時之後，將反應物冷卻，倒入水(100ml)中且用EtOAc (100ml)萃取。有機層用水、鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到粗產物。粗產物經由矽膠層析純化(120 g管柱，5-25% EtOAc:Hex)，得到呈棕色油狀之產物(E)-3-(吡啶-2-基)丙烯酸第三丁酯(1.5 g，7.31 mmol，28.9%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 8.69 - 8.59 (m, 1H), 7.76 - 7.68 (m, 1H), 7.65 - 7.55 (m, 1H), 7.47 - 7.40 (m, 1H), 7.27 (ddd,
J
=7.6, 4.8, 1.1 Hz, 1H), 6.85 (d,
J
=15.8 Hz, 1H), 1.60 - 1.50 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.02 min; ESI-MS(+)
m/z
206.1 (M+H)。 步驟2： 向(E)-3-(吡啶-2-基)丙烯酸第三丁酯(1.00 g，4.87 mmol)於1,4-二噁烷(35 mL)中之溶液中添加羥胺(50%於水中，3.22 g，48.7 mmol)，接著添加硫酸四正丁基銨(50%於水中，0.06 g，0.049 mmol)。攪拌反應物4天。反應物隨後用EtOAc稀釋且用水洗滌。有機層隨後用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到產物3-(羥胺基)-3-(吡啶-2-基)丙酸第三丁酯(1.10 g，4.62 mmol，95%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 8.58 - 8.41 (m, 1H), 7.82 (td,
J
=7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.52 (d,
J
=7.9 Hz, 1H), 7.33 (ddd,
J
=7.5, 5.0, 1.3 Hz, 1H), 4.43 (t,
J
=7.1 Hz, 1H), 2.85 - 2.67 (m, 2H), 1.38 (s, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 0.80 min; ESI-MS(+)
m/z
239.2 (M+H)。 步驟3： 向冷卻至0℃之3-(羥胺基)-3-(吡啶-2-基)丙酸第三丁酯(500 mg，2.10 mmol)於乙酸(5 mL)中之溶液中添加鋅(500 mg，7.65 mmol)。反應物隨後升溫至室溫且攪拌3小時。反應漿液用MeOH (5 mL)稀釋且經由耐綸玻璃料過濾器過濾。減壓蒸發溶劑，隨後與甲苯(20 mL × 3)共沸(3次)，得到黏性殘餘物。黏性殘餘物置於高真空下24小時，得到呈白色泡沫狀之產物3-胺基-3-(吡啶-2-基)丙酸第三丁酯(466 mg，2.096 mmol，100%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 8.63 (d,
J
=4.9 Hz, 1H), 8.11 - 8.05 (m, 1H), 7.65 (d,
J
=8.0 Hz, 1H), 7.60 - 7.55 (m, 1H), 4.69 (dd,
J
=7.7, 4.7 Hz, 1H), 3.02 - 2.83 (m, 2H), 1.48 - 1.43 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.10 min; ESI-MS(+)
m/z
223.1 (M+H)。 步驟4： 向(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(烯丙氧基)-4-側氧基丁酸(740 mg，1.87 mmol)於DCM (15 mL)中之溶液中添加HATU (712 mg，1.871 mmol)，接著添加休尼格鹼(Hunig's Base) (1.634 mL，9.36 mmol)且在室溫下攪拌20分鐘。隨後添加3-胺基-3-(吡啶-2-基)丙酸第三丁酯(416 mg，1.871 mmol)且在室溫下攪拌1小時。反應物隨後用水及DCM稀釋。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發，得到粗物質。粗物質經由矽膠純化(40 g管柱，10-70% EtOAc:Hex)，得到呈淺棕色油狀之產物(2S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基-1-(吡啶-2-基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸烯丙酯(263 mg，0.439 mmol，23.43%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.22 min; ESI-MS(+)
m/z
600.3 (M+H)。 步驟5： 在0℃下，向1打蘭小瓶中之(2S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基-1-(吡啶-2-基)丙基)胺基)-4-側氧基丁酸烯丙酯(263 mg，0.439 mmol)及吡啶(0.210 mL，2.63 mmol)於DCM (3.00 mL)中之溶液中添加POCl
3
(0.05 mL，0.526 mmol)且使其升溫至室溫並隨後攪拌18小時。在攪拌18小時之後，反應物用DCM稀釋且用飽和碳酸鈉水溶液洗滌。有機層隨後用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到粗產物。粗產物經由矽膠層析純化(40 g管柱，10-60% EtOAc:Hex)，得到呈淺棕色泡沫狀之產物(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)丙酸烯丙酯(136 mg，0.234 mmol，53.3%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.20 min; ESI-MS(+)
m/z
582.3 (M+H)。 步驟6： 在0℃下，向(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)丙酸烯丙酯(136 mg，0.234 mmol)於THF (5 mL)中之溶液中添加N-甲基苯胺(0.130 mL，1.17 mmol)，接著添加Pd(Ph
3
P)
4
(27.0 mg，0.023 mmol)。隨後使反應物升溫至室溫且攪拌1小時。蒸發反應揮發物，得到粗物質。粗物質經由製備型HPLC純化(SunFire Prep C18 30×100管柱尺寸；經15分鐘梯度10-100% 95:5 CH
3
CN:水與0.1% TFA緩衝液)，得到呈白色泡沫狀之產物(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)咪唑并[1,5-a]吡啶-3-基)丙酸(105 mg，0.194 mmol，83%產率)。
2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1H- 吲唑 -1- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向2-(5-溴-1H-吲唑-3-基)乙酸第三丁酯(500 mg，1.6 mmol)及2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}丙-2-烯酸苯甲酯(640 mg，1.7 mmol)於乙腈(10 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(1.3 g，9.6 mmol)。在室溫下攪拌反應物18小時。反應物用EtOAc稀釋且用水洗滌。有機層用鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到粗產物。粗產物經由逆相層析純化(55 g管柱，5-100% CH
3
CN:水 + 01.% TFA)，得到呈白色固體狀之2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(5-溴-3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸苯甲酯(1.12 g，1.626 mmol，101%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 7.98 - 7.90 (m, 1H), 7.49 (dd,
J
=8.9, 1.8 Hz, 1H), 7.43 - 7.33 (m, 6H), 5.49 (t,
J
=7.2 Hz, 1H), 5.26 (d,
J
=2.7 Hz, 2H), 5.04 (d,
J
=7.1 Hz, 2H), 3.93 - 3.82 (m, 2H), 1.48 - 1.45 (m, 9H), 1.31 - 1.27 (m, 18H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.84 min; ESI-MS(+)
m/z
712.2 (M+Na)。 步驟2： H
2
鼓泡通過2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(5-溴-3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸苯甲酯(1.0 g，1.5 mmol)及Pd-C (0.16 g，0.15 mmol)於MeOH (20 mL)中之溶液5分鐘。反應物隨後在攪拌下保持在H
2
正壓下2小時。反應物用N
2
鼓泡通過，且隨後漿液經由耐綸玻璃料過濾器過濾。減壓蒸發揮發物，得到呈黏性油狀之2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸(0.76 g，1.5 mmol，100%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.63 min; ESI-MS(+)
m/z
542.2 (M+Na)。 步驟3： 將含HCl (5.0 ml，4.0 M)之二噁烷添加至2-(雙(((2-甲基-2-丙基)氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-((2-甲基-2-丙基)氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸(781 mg，1.503 mmol)中且在0℃下攪拌30分鐘，隨後升溫至室溫並攪拌30分鐘。在不加熱的情況下減壓蒸發反應揮發物，得到呈白色固體狀之2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸HCl鹽(540 mg，1.5 mmol，100%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.18 min; ESI-MS(+)
m/z
320 (M+H)。 步驟4： 向2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸HCl鹽(540 mg，1.5 mmol)及碳酸氫鈉(630 mg，7.5 mmol)於丙酮(10 mL)及水(10 mL)中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(510 mg，1.5 mmol)。在室溫下攪拌反應物18小時。反應物在劇烈攪拌下用HCl水溶液(1.0 M)緩慢酸化至pH 5。水層用25 ml EtOAc分離。有機層用水、接著鹽水洗滌。收集有機層；經MgSO
4
乾燥且減壓蒸發揮發物，得到粗產物。粗物質經由製備型HPLC純化(10-100% CH
3
CN:水 + 0.1% TFA)，得到呈灰白色固體狀之純產物2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲唑-1-基)丙酸(131 mg，0.242 mmol，16.1%產率)。
1
H NMR (500MHz, 甲醇-d
4
) d 7.79 (d,
J
=7.4 Hz, 2H), 7.71 (d,
J
=8.2 Hz, 1H), 7.58 - 7.50 (m, 3H), 7.41 - 7.34 (m, 3H), 7.26 (q,
J
=7.4 Hz, 2H), 7.13 (t,
J
=7.5 Hz, 1H), 4.85 - 4.81 (m, 2H), 4.79 - 4.68 (m, 1H), 4.17 (dd,
J
=7.3, 1.7 Hz, 2H), 4.08 (d,
J
=7.3 Hz, 1H), 3.92 (s, 2H), 1.46 - 1.39 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.75 min; ESI-MS(+)
m/z
542.1 (M+H)。
(S)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-2-( 第三丁氧基羰基 )-1H- 吲哚 -3- 基 ) 丙酸及 (R)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(1-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-2-( 第三丁氧基羰基 )-1H- 吲哚 -3- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向1H-吲哚-2-甲酸(2.0 g，12.4 mmol)於DCM (50 mL)中之0℃溶液中添加2,2,2-三氯乙醯亞胺第三丁酯(2.4 mL，13.7 mmol)且在0℃下攪拌30分鐘，隨後升溫至室溫。攪拌反應物18小時。過濾反應物且減壓蒸發揮發物，得到粗物質，其經由矽膠純化(40 g管柱，5-40% EtOAc:Hex)，得到呈透明油狀之1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(2.2 g，9.9 mmol，80%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 8.90 (br. s., 1H), 7.70 (dd,
J
=8.0, 0.9 Hz, 1H), 7.44 (dd,
J
=8.4, 0.9 Hz, 1H), 7.33 (ddd,
J
=8.2, 7.1, 1.1 Hz, 1H), 7.19 - 7.13 (m, 2H), 1.65 (s, 9H)。 步驟2： 向2-溴乙酸第三丁酯(0.85 mL，5.8 mmol)及1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(1.2 g，5.3 mmol)之溶液中添加碳酸銫(1.9 g，5.8 mmol)。在室溫下攪拌反應物18小時。反應物用水稀釋且用EtOAc萃取。有機層用水、隨後鹽水洗滌；收集；經MgSO
4
乾燥；過濾且蒸發揮發物，得到粗產物。矽膠層析純化粗產物(40 g管柱10-60% EtOAc:Hex)，得到呈淺色油狀之1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(1.7 g，5.2 mmol，97%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.54 min; ESI-MS(+)
m/z
332.0 (M+H)。 步驟3： 在室溫下，向1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(1.7 g，5.2 mmol)於DCM (50 mL)及DMF (0.80 mL，10 mmol)中之攪拌溶液中添加POCl
3
(0.96 mL，10 mmol)且隨後平緩地回流1小時。反應物隨後冷卻至室溫。蒸發反應揮發物且粗物質在矽膠上純化(40 g管柱，5-40% EtOAc:Hex)，得到呈淡黃色固體狀之1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-3-甲醯基-1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(1.0 g，2.8 mmol，54%產率)。
1
H NMR (500MHz, 氯仿-d) d 10.70 (s, 1H), 8.55 (d,
J
=8.0 Hz, 1H), 7.47 - 7.42 (m, 1H), 7.40 - 7.37 (m, 1H), 7.37 - 7.33 (m, 1H), 5.23 (s, 2H), 1.68 (s, 9H), 1.51 - 1.44 (m, 9H)。分析條件A: 滯留時間 = 1.43 min; ESI-MS(+)
m/z
248 (M-2個第三丁基)。 步驟4： 在N
2
氛圍下，向2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸苯甲酯(1.2 g，3.0 mmol)於DCM (20 mL)中之溶液中緩慢添加DBU (0.42 mL，2.8 mmol)。在10分鐘之後，將含1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-3-甲醯基-1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(900 mg，2.5 mmol)之DCM (2 mL)緩慢添加至反應混合物中。攪拌反應物2天。隨後蒸發反應揮發物且在矽膠上純化粗物質(80 g管柱0-25% EtOAc:Hex)，得到呈透明油狀之(Z)-3-(3-(苯甲氧基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)-1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(680 mg，1.1 mmol，43%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.61 min; ESI-MS(+)
m/z
663.2 (M+Na)。 步驟5： H
2
緩慢鼓泡通過(Z)-3-(3-(苯甲氧基)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)-1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-1H-吲哚-2-甲酸第三丁酯(680 mg，1.1 mmol)及Pd-C (28 mg，0.027 mmol)於MeOH (10 mL)中之溶液且在室溫下攪拌2天。反應漿液經由耐綸玻璃料過濾器過濾且蒸發揮發物，得到粗產物2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-(第三丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(440 mg，1.1 mmol，99%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.04 min; ESI-MS(+)
m/z
419.3 (M+H)。 步驟6： 向2-胺基-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-(第三丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(440 mg，1.1 mmol)及碳酸氫鈉(450 mg，5.3 mmol)於丙酮(5.00 mL)及水(10 mL)中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(358 mg，1.061 mmol)。攪拌反應物18小時。反應物在劇烈攪拌下用HCl水溶液(1.0 M)緩慢酸化至pH 5。酸化溶液隨後用DCM分離。有機層用水、接著鹽水洗滌。收集有機層；經MgSO
4
乾燥且減壓蒸發揮發物，得到粗產物。在矽膠上純化粗物質(40 g管柱，20-80% EtOAc:Hex)，得到呈白色泡沫狀之產物。該物質經由SFC對掌性純化組進一步純化，得到呈白色泡沫狀之產物(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-(第三丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(100 mg，0.156 mmol，14.71%產率)及(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-(第三丁氧基羰基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(98 mg，0.153 mmol，14.42%產率)。分析條件A: 滯留時間 = 1.53 min; ESI-MS(+)
m/z
663.2 (M+Na)。
(R)-2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-((R)-1-( 第三丁氧基 )-1- 側氧基丙 -2- 基 )-2- 側氧基 -2,3- 二氫 -1H- 苯并 [d] 咪唑 -1- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向裝備有攪拌棒之40 mL小瓶中裝入(R)-2-胺基丙酸第三丁酯單HCl鹽(2.0 g，11 mmol)、1-氟-2-硝基苯(1.553 g，11.01 mmol)、碳酸鉀(3.04 g，22.0 mmol)及DMF (30 mL)。將小瓶置於70℃加熱套中18小時。將反應混合物轉移至500 mL分液漏斗中且用水(100 mL)稀釋。用EtOAc (2 × 100 mL)萃取混合物。合併之有機物用水(100 mL)、隨後鹽水(75 mL)洗滌；經MgSO
4
乾燥；過濾；隨後真空濃縮。將所得殘餘物溶解於最少丙酮中且隨後真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上。對所得粉末進行矽膠層析(40 g管柱，己烷:EtOAc 100:0→90:10)，得到呈橙色油狀之(R)-2-((2-硝苯基)胺基)丙酸第三丁酯(2.359 g，80%)。 步驟2： 向裝備有攪拌棒且裝有(R)-2-((2-硝苯基)胺基)丙酸第三丁酯(2.359 g，8.86 mmol)之100 mL圓底燒瓶中添加MeOH (40 mL)及鈀/碳(Degussa型號E101 NE/W，10% Pd乾基，約50 wt%水，0.471 g，0.221 mmol)。燒瓶用橡膠隔膜密封且混合物用N
2
充氣15分鐘，隨後混合物用H
2
充氣5分鐘。在H
2
氣球壓力下攪拌混合物16小時。混合物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾且用MeOH萃取過濾墊。真空濃縮合併之濾液，且對所得殘餘物進行矽膠層析(25 g Interchim 25微米管柱，己烷:EtOAc 100:0 → 50:50)，得到呈紅色液體狀之(R)-2-((2-胺基苯基)胺基)丙酸第三丁酯(1.100 g，53%)。13C-NMR (100MHz, CDCl
3
) d 173.86, 135.61, 134.82, 119.89, 119.25, 116.36, 113.07, 80.95, 52.65, 27.59, 18.73。 步驟3： 向裝備有攪拌棒且裝有(R)-2-((2-胺基苯基)胺基)丙酸第三丁酯(1.100 g，4.66 mmol)之50 mL燒瓶中分別添加THF (25 mL)、DIPEA (3.00 mL，17.5 mmol)及1,1'-羰基二咪唑(2.83 g，17.5 mmol)。密封小瓶且在室溫下攪拌溶液2小時。將反應溶液轉移至250 mL分液漏斗且用Et
2
O (75 mL)稀釋，隨後用HCl水溶液(1M，50 mL)洗滌。有機相用水(50 mL)、隨後鹽水(50 mL)洗滌；經MgSO
4
乾燥；過濾；隨後真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上。對所得粉末進行矽膠層析(40 g SiO
2
管柱，己烷:EtOAc 90:10 → 50:50)，得到呈灰白色固體泡沫狀之(R)-2-(2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸第三丁酯(828.1 mg，68%)。1H-NMR (500MHz, CDCl
3
) d 9.09 (br. s., 1H), 7.13 - 7.03 (m, 3H), 7.02 - 6.95 (m, 1H), 5.19 (q, J=7.4 Hz, 1H), 1.70 (d, J=7.4 Hz, 3H), 1.41 (s, 9H) 步驟4： 向裝備有攪拌棒之40 mL小瓶中添加2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}丙-2-烯酸苯甲酯(1.192 g，3.16 mmol)、(R)-2-(2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸第三丁酯(828.1 mg，3.16 mmol)及MeCN (15 mL)。向溶液中添加碳酸鉀(2.618 g，18.94 mmol)。將小瓶封蓋且在攪拌下置於60℃加熱套中2小時。過濾反應混合物且真空濃縮濾液。將所得殘餘物溶解於丙酮中且隨後真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上。對所得粉末進行SiO
2
層析(80 g矽膠管柱，己烷:EtOAc 100:0 → 50:50)，得到呈無色固體泡沫狀之2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[(2R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸苯甲酯(1:1比率之非對映異構體，1.841 g，91%)。 步驟5： 向裝備有攪拌棒且裝有含2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[(2R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸苯甲酯(920.3 mg，1.439 mmol)之MeOH (20 mL)的100 mL圓底燒瓶中添加鈀/碳(Degussa型號E101 NE/W，10% Pd乾基，約50 wt%水，153 mg，0.072 mmol)。燒瓶用橡膠隔膜封蓋。溶液用N
2
充氣15分鐘，隨後溶液用H
2
充氣5分鐘。系統隨後置於H
2
氣球壓力下，同時攪拌混合物1.5小時。溶液用N
2
充氣15分鐘，隨後經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾。用MeOH萃取濾餅且真空濃縮合併之濾液，得到呈無色固體泡沫狀之2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[(2R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸(1:1比率之非對映異構體，791 mg，100%)。 步驟6： 向裝有2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[(2R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸(0.791 g，1.44 mmol)且用0℃浴冷卻之100 mL圓底燒瓶中添加HCl於二噁烷中之0℃溶液(5 mL，4 M，20 mmol)。在0℃下攪拌溶液1小時且隨後真空濃縮並分析發現部分轉化成所需產物。將含有固體之100 mL圓底燒瓶放回至0℃浴中且向燒瓶中添加HCl於二噁烷中之0℃溶液(5 mL，4 M，20 mmol)。在0℃下攪拌溶液1.5小時且隨後真空濃縮，得到呈白色固體狀之粗物質2-胺基-3-(3-((R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基)-2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸HLC鹽，其全部用於下一步驟中。 步驟7： 向2-胺基-3-(3-((R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基)-2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸(1.439 mmol)於水(12 mL)及丙酮(6 mL)中之溶液中添加碳酸氫鈉(604 mg，7.20 mmol)，隨後添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(485 mg，1.44 mmol)。攪拌溶液隔夜(18小時)。將反應混合物真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上且對所得粉末進行C18層析(管柱 = 55g Interchim Puriflash C18-HP 30微米；溶劑A = 0.1% TFA/水；溶劑B = 0.1% TFA/乙腈；梯度 = 經15個管柱體積15% B至80% B)。彙集含有產物之溶離份且真空濃縮以移除揮發物並得到水溶液，將其與EtOAc一起轉移至125 mL分液漏斗。用鹽水(10 mL)進一步稀釋混合物。用EtOAc (2 × 50 mL)萃取混合物。合併之有機物用鹽水(25 mL)洗滌；經MgSO
4
乾燥；過濾；隨後真空濃縮，得到呈非對映異構體之混合物形式之黃色固體泡沫產物468.2 mg。對一部分物質進行如下SFC純化：管柱 = Chiralpak AD-H製備型管柱, 30 × 250 mm, 5 μm；移動相 = 20% MeOH/CO2, 150巴；溫度 = 35℃；流動速率 = 70.0 mL/min. 持續19 min.；在220 nm下UV監測；注射 = 0.25 ml ~30 mg/mL於2:1 MeOH:CHCl
3
中之溶液(藉由堆疊注射純化~246 mg)。收集在7.63 min.處之峰，得到(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-((R)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基丙-2-基)-2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸。
1
H NMR (400MHz, CD
3
OD) d 7.78 (d,
J
=7.5 Hz, 2H), 7.57 (d,
J
=7.5 Hz, 2H), 7.37 (t,
J
=7.4 Hz, 2H), 7.32 - 7.22 (m, 3H), 7.13 - 7.03 (m, 3H), 5.09 (q,
J
=7.3 Hz, 1H), 4.68 (d,
J
=4.3 Hz, 1H), 4.47 - 4.38 (m, 1H), 4.27 (dd,
J
=14.7, 8.9 Hz, 1H), 4.17 - 4.11 (m, 2H), 4.10 - 4.03 (m, 1H), 1.59 (d,
J
=7.3 Hz, 3H), 1.36 (s, 9H)。
2-((((9H- 茀 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-3-(3-(2-( 第三丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-2- 側氧基 -2,3- 二氫 -1H- 苯并 [d] 咪唑 -1- 基 ) 丙酸之製備 步驟1： 向裝備有Schlenk接頭且置於N
2
atm下的乾燥250 mL圓底燒瓶中添加DMF (60 mL)、1H-苯并[d]咪唑-2-醇(6.93 g，51.7 mmol)及2-溴乙酸第三丁酯(9.6 g，49.2 mmol)。將溶液冷卻至0℃。向溶液中添加氫化鈉(60% w/w於油中之分散液，2.264 g，56.6 mmol)。在0℃(t=0)下攪拌混合物1小時。向溶液中添加飽和NaHCO
3
(60 mL)水溶液。混合物變得極稠且無法攪拌。將混合物短暫升溫至室溫，隨後使用水(250 mL)將混合物轉移至1 L分液漏斗。用EtOAc (400 mL)萃取混合物且有機相經MgSO
4
乾燥；過濾，隨後真空濃縮。將殘餘物溶解於最少丙酮中且隨後真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上。對此粉末進行SiO
2
層析(己烷:EtOAc 100:0 → 0:100，產物為第二溶離主峰)，得到呈淡黃色固體狀之2-(2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙酸第三丁酯(3.301 g，27%)。1H-NMR (500MHz, CDCl
3
) d 8.60 (br. s., 1H), 7.12 - 7.04 (m, 3H), 6.92 - 6.86 (m, 1H), 4.53 (s, 2H), 1.47 (s, 9H)。 步驟2： 向裝備有攪拌棒之40 mL小瓶中添加2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}丙-2-烯酸苯甲酯(1.382 g，3.66 mmol)、2-(2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙酸第三丁酯(1.00 g，4.03 mmol)及MeCN (18 mL)。向溶液中添加碳酸鉀(3.04 g，22.0 mmol)。將小瓶封蓋且在攪拌下置於50℃加熱套中2小時。反應混合物經由矽藻土(Celite
Ò
)過濾且用MeCN (20 mL)萃取濾餅。真空濃縮濾液且將殘餘物溶解於最少丙酮中並隨後真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上。對所得粉末進行SiO
2
層析(80 g矽膠管柱，己烷:EtOAc 100:0 → 50:50)，得到呈黃色油狀之2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸苯甲酯(2.167 g，95%產率)。1H-NMR (500MHz, CDCl
3
) d 7.38 - 7.29 (m, 5H), 7.06 - 7.01 (m, 2H), 7.00 - 6.95 (m, 1H), 6.85 - 6.80 (m, 1H), 5.47 (dd, J=9.8, 4.3 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.66 - 4.49 (m, 3H), 4.40 (d, J=17.7 Hz, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.31 (s, 18H)。 步驟3： 向裝備有攪拌棒且裝有含2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸苯甲酯(1.083 g，1.731 mmol)之甲醇(20 mL)的100 mL圓底燒瓶中添加鈀/碳(Degussa型號E101 NE/W，10% Pd乾基，約50 wt%水，0.184 g，0.087 mmol)。燒瓶用橡膠隔膜封蓋。溶液用N
2
充氣15分鐘，隨後溶液用H
2
充氣5分鐘。系統隨後置於H
2
氣球壓力下，同時攪拌混合物2小時。溶液用N
2
充氣15分鐘，隨後向溶液中添加矽藻土(Celite
Ò
)。過濾混合物且用甲醇萃取濾餅。真空濃縮濾液，得到2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸(917.7 mg，99%)。 步驟4： 向裝有2-{雙[(第三丁氧基)羰基]胺基}-3-{3-[2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基]-2-側氧基-2,3-二氫-1H-1,3-苯并二唑-1-基}丙酸(917.7 mg，1.713 mmol)且用0℃浴冷卻之100 mL圓底燒瓶中添加HCl於二噁烷中之0℃溶液(5 mL，4 M，20 mmol)。在0℃下攪拌溶液1小時且隨後真空濃縮。與二氯乙烷(50 mL)一起共蒸發用於移除痕量溶劑，得到呈無色固體狀之2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸HCl鹽(710.8 mg)。此物質全部用於步驟6中。 步驟5： 向2-胺基-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸單HCl鹽(1.713 mmol)於水(12 mL)及丙酮(6 mL)中之溶液中添加碳酸氫鈉(720 mg，8.57 mmol)，隨後添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(578 mg，1.71 mmol)。在室溫下攪拌溶液18小時。將反應溶液真空濃縮於矽藻土(Celite
Ò
)上且對所得固體進行C18層析(Interchim C18 55g 30微米管柱，梯度 = 水:MeCN 50:50至水:MeCN 0:100經10 CV，在100% MeCN下保持5 CV)。真空濃縮合併之產物溶離份，得到水相，其隨後用EtOAc (2 × 100 mL)萃取。合併之有機相經MgSO
4
乾燥；過濾；隨後真空濃縮，得到呈白色固體狀之2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)-2-側氧基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙酸(483.2 mg，經兩個步驟22%)。
1
H-NMR (500MHz, 丙酮-d6) 7.84 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.71 - 7.61 (m, 2H), 7.40 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.34 - 7.26 (m, 3H), 7.12 - 7.00 (m, 4H), 4.72 (td, J=8.0, 4.8 Hz, 1H), 4.63 - 4.54 (m, 2H), 4.47 - 4.36 (m, 2H), 4.25 - 4.21 (m, 2H), 4.20 - 4.14 (m, 1H), 1.43 (s, 9H)。
實例 1001 之製備 實例1001 遵循「通用合成順序A」製備實例1001。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為8.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 983.1 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 983.0 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z:計算值：982.4750實驗值：982.4796。
實例 1002 之製備 實例1002 遵循「通用合成順序A」製備實例1002。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘40-80% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持3分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為2.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.45 min; ESI-MS(+) m/z 1003.2 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.17 min; ESI-MS(+) m/z 1004.1 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z:計算值：1003.5145實驗值：1003.5111
實例 1003 之製備 實例1003 遵循「通用合成順序A」製備實例1003。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為7.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 1979.0 (M+H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 991.2 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：990.4633 實驗值：990.4601。
實例 1004 之製備 實例1004 遵循「通用合成順序A」製備實例1004。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘12-52% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為7.3 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.33 min; ESI-MS(+) m/z 996.6 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 996.5 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：996.4733 實驗值：996.4698。
實例 1005 之製備 實例1005 遵循「通用合成順序A」製備實例1005。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘12-52% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為7.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 999.1 (M+2H)。 分析條件D: 滯留時間 = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 999.6 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：998.4486 實驗值：998.4448。
實例 1006 之製備 實例1006 遵循「通用合成順序A」製備實例1006。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘12-52% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為4.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為99%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 1016.6 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 1015.9 (M+2H)
實例 1007 之製備 實例1007 遵循「通用合成順序A」製備實例1007。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：waters xbridge c-18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為6.6 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 1022.5 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 1022.3 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：1021.9788 實驗值：1021.9747。
實例 1008 之製備 實例1008 遵循「通用合成順序A」製備實例1008。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘12-52% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘12-52% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.75 min; ESI-MS(+) m/z 1024.8 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.98 min; ESI-MS(+) m/z 1024.7 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：1023.9540 實驗值：1023.9506。
實例 1009 之製備 實例1009 遵循「通用合成順序A」製備實例1009。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 947.1 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.44 min; ESI-MS(+) m/z 946.4 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：946.4980 實驗值：946.4946。
實例 1010 之製備 實例1010 遵循「通用合成順序A」製備實例1010。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經35分鐘5-45% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為2.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為93%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 1015.6 (M+2H)。
實例 1011 之製備 實例1011 遵循「通用合成順序A」製備實例1011。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-100% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為2.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為94%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 989.7 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.43 min; ESI-MS(+) m/z 1975.9 (M-H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：989.4655 實驗值：989.4619。
實例 1012 之製備 實例1012 遵循「通用合成順序A」製備實例1012。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘2-42% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為9.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 944.5 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 944.6 (M+2H)。
實例 1013 之製備 實例1013 遵循「通用合成順序A」製備實例1013。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘50-90% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為22.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 966.0 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 967.2 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：965.9796 實驗值：965.9790。
實例 1014 之製備 實例1014 遵循「通用合成順序A」製備實例1014。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持3分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.3 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 960.6 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.39 min; ESI-MS(+) m/z 959.2 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：959.4879 實驗值：959.4848。
實例 1015 之製備 實例1015 遵循「通用合成順序A」製備實例1015。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為43.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 1901.9 (M-H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 952.3 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：952.4798 實驗值：952.4758
實例 1016 之製備 實例1016 遵循「通用合成順序A」製備實例1016。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為10.3 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 945.1 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.36 min; ESI-MS(+) m/z 945.0 (M+2H)。
實例 1017 之製備 實例1017 遵循「通用合成順序A」製備實例1017。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為6.9 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。使用兩次分析型LC/MS注射測定最終純度。注射1條件：管柱：Waters BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-µm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：70℃；梯度：經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。注射2條件：管柱：Waters CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-µm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；溫度：70℃；梯度：經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。 分析條件C: 滯留時間 = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 945.1 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.23 min; ESI-MS(+) m/z 944.4 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：944.4824 實驗值：944.4783。
實例 1018 之製備 實例1018 遵循「通用合成順序A」製備實例1018。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為14.8 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.54 min; ESI-MS(+) m/z 925.0 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.38 min; ESI-MS(+) m/z 925.2 (M+2H) ESI-HRMS(+) m/z: 計算值：924.4611 實驗值：924.4596。
實例 1019 之製備 實例1019 遵循「通用合成順序A」製備實例1019。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘15-55% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為3.6 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.46 min; ESI-MS(+) m/z 687.3 (M+3H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.17 min; ESI-MS(+) m/z 687.4 (M+3H)。
實例 1020 之製備 實例1020 遵循「通用合成順序A」製備實例1020。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5甲醇:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘45-85% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為8.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 956.2 (M+2H) 分析條件D: 滯留時間 = 1.31 min; ESI-MS(+) m/z 957.1 (M+2H)。
實例 10001 之製備 實例10001 遵循「通用合成順序A」製備實例10001。實例10001之粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：
分析 LCMS 條件 C ：
管柱：Waters BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 D ：
管柱：Waters CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 三氟乙酸；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為26.9 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為93%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.40 min; ESI-MS(+)
m/z
944.60 (M+2H)。 分析條件D: 滯留時間 = 1.12 min; ESI-MS(+)
m/z
944.80 (M+2H)。
實例 10002 之製備 實例10002 遵循「通用合成順序A」製備實例10002。實例10002之粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：
分析 LCMS 條件 C ：
管柱：Waters BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 D ：
管柱：Waters CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 三氟乙酸；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為22.6 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為98%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.44 min; ESI-MS(+)
m/z
945.30 (M+2H)。 分析條件D: 滯留時間 = 1.15 min; ESI-MS(+)
m/z
945.25 (M+2H)。
實例 10003 之製備 實例10003 遵循「通用合成順序A」製備實例10003。實例10003之粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：
分析 LCMS 條件 C ：
管柱：Waters BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10 mM乙酸銨；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。
分析 LCMS 條件 D ：
管柱：Waters CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 三氟乙酸；溫度：70℃；梯度：0% B，經3分鐘0-100% B，隨後在100% B下保持2.0分鐘；流速：0.75 mL/min；偵測：UV，220 nm。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.2 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為94%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.48 min; ESI-MS(+)
m/z
944.70 (M+2H)。 分析條件D: 滯留時間 = 1.26 min; ESI-MS(+)
m/z
944.45 (M+2H)。
實例 10500 之製備 實例10500 遵循「通用合成順序A」製備實例10500。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經15分鐘10-70% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為20.0 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為91%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.66 min; ESI-MS(+) m/z 944.3 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.40 min; ESI-MS(+) m/z 944.2 (M+2H)。
實例 10501 之製備 實例10501 遵循「通用合成順序A」製備實例10501。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經15分鐘0-70% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為21.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為92%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.70 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H)。
實例 10502 之製備 實例10502 遵循「通用合成順序A」製備實例10502。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經15分鐘10-70% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為1.4 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為94%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.30 min; ESI-MS(+) m/z 916.2 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.16 min; ESI-MS(+) m/z 916.1 (M+2H。
實例 10503 之製備 實例10503 遵循「通用合成順序A」製備實例10503。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為23.1 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 930.1 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.37 min; ESI-MS(+) m/z 930.1 (M+2H)。
實例 10504 之製備 實例10504 遵循「通用合成順序A」製備實例10504。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經40分鐘2-42% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘5-45% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經10分鐘10-100% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為6.5 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為97%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 916.0 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.32 min; ESI-MS(+) m/z 915.9 (M+2H)。
實例 10505 之製備 實例10505 遵循「通用合成順序A」製備實例10505。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經40分鐘2-42% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘5-45% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經15分鐘10-100% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為7.4 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為96%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.53 min; ESI-MS(+) m/z 944.1 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.29 min; ESI-MS(+) m/z 944.4 (M+2H)。
實例 10506 之製備 實例10506 遵循「通用合成順序A」製備實例10506。粗物質經由製備型LC/MS以如下條件純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經30分鐘8-48% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘10-50% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：Waters CSH C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；移動相B：95:5乙腈:水 + 0.1%三氟乙酸；梯度：經30分鐘5-45% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。該物質經由製備型LC/MS以如下條件進一步純化：管柱：XBridge C18, 19 × 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；移動相B：95:5乙腈:水 + 10-mM乙酸銨；梯度：經10分鐘10-100% B，隨後在100% B下保持5分鐘；流速：20 mL/min。合併含有所需產物之溶離份且經由離心蒸發乾燥。產物產量為9.3 mg，且其藉由LCMS分析所估計之純度為100%。 分析條件C: 滯留時間 = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 959.2 (M+2H) 分析條件E: 滯留時間 = 1.35 min; ESI-MS(+) m/z 959.3 (M+2H)。 使用均相時差式螢光(HTRF)結合分析測試巨環肽與PD-1競爭結合至PD-L1之能力的方法 使用PD-1/PD-L1均相時差式螢光(HTRF)結合分析研究本發明之巨環肽結合至PD-L1之能力。
方法
可溶性PD-1與可溶性PD-L1結合之均相時差式螢光(HTRF)分析。可溶性PD-1及可溶性PD-L1係指移除跨膜區且融合至異源序列(特定言之，人類免疫球蛋白G序列(Ig)之Fc部分或六聚組胺酸抗原決定基標籤(His))之羧基端截短的蛋白質。所有結合研究均在由dPBS組成的補充有0.1% (w/v)牛血清白蛋白及0.05% (v/v) Tween-20之HTRF分析緩衝液中進行。對於PD-1-Ig/PD-L1-His結合分析，抑制劑與PD-L1-His (10 nM最終)一起在4 µl分析緩衝液中預培育15分鐘，接著添加含PD-1-Ig (20 nM最終)之1 µl分析緩衝液並另外培育15分鐘。使用來自人類、短尾獼猴、小鼠或其他物種之PD-L1融合蛋白。使用經銪穴狀配位體標記之抗Ig單株抗體(1 nM最終)及經別藻藍蛋白(APC)標記之抗His單株抗體(20 nM最終)實現HTRF偵測。將抗體稀釋於HTRF偵測緩衝液中且將5 µl施配在結合反應頂部。使反應平衡30分鐘且使用EnVision螢光計獲得信號(665 nm/620 nm比率)。建立PD-1-Ig/PD-L2-His (分別為20及5 nM)、CD80-His/PD-L1-Ig (分別為100及10 nM)及CD80-His/CTLA4-Ig (分別為10及5 nM)之間的額外結合分析。在生物素標記之第71號化合物與人類PD-L1-His之間的結合/競爭研究進行如下。巨環肽抑制劑與PD-L1-His (10 nM最終)一起在4 µl分析緩衝液中預培育60分鐘，接著添加含生物素標記之第71號化合物(0.5 nM最終)之1 µl分析緩衝液。使結合平衡30分鐘，接著添加含經銪穴狀配位體標記之抗生蛋白鏈菌素(2.5 pM最終)及經APC標記之抗His (20 nM最終)之5 µl HTRF緩衝液。使反應平衡30分鐘且使用EnVision螢光計獲得信號(665 nm/620 nm比率)。 重組蛋白質。在HEK293T細胞中表現具有C端人類Ig抗原決定基標籤[hPD-1 (25-167)-3S-IG]之羧基截短之人類PD-1 (胺基酸25-167)及具有C端His抗原決定基標籤[hPD-L1(19-239)-菸草葉脈斑點病毒蛋白酶裂解位點(TVMV)-His]之人類PD-L1 (胺基酸18-239)，且依次藉由重組蛋白質A親和層析及尺寸排阻層析純化。人類PD-L2-His (Sino Biologicals)、CD80-His (Sino Biologicals)、CTLA4-Ig (RnD Systems)均經由市售來源獲得。 重組人類PD-1-Ig之序列
重組人類PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)之序列
結果顯示於表1中。如所示，本發明之巨環肽證實有效抑制PD-1-Ig對PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His)之結合活性。範圍如下：A = ＞1 μM；B = 0.10 - 0.99 μM；C = 0.01 - 0.099 μM；D = 0.001 - 0.0099 μM。
表 1
熟習此項技術者應顯而易知本發明不限於前述說明性實例，且其可以其他不悖離本發明基本屬性之形式實施。因此，需要在所有方面將實例視為說明性而非限制性的，參考隨附申請專利範圍而非前述實例，且因此所有在申請專利範圍等效意義或範圍內的變化均意欲涵蓋於其中。