RS49819B - Inhibitorski peptidi hepatitisa c - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovaj se pronalazak odnosi na jedinjenja, kompozicije i postupke za lečenje infekcija izazvanih hepatitis C virusom (HCV). Posebno, ovaj pronalazak daje nove peptide, analoge, njihove analoge i intermedijere, farmaceutske kompozicije koje sadrže takve peptide i postupke za upotrebu tih peptida u lečenju HCV infekcije.

OSNOVNI PODACI U VEZI SA PRONALASKOM

Širom sveta, virus hepatitisa C (HCV) je najznačajniji enološki uzročnik, ne-A i ne-B hepatitisa, dobijenog posle transfuzije. Smatra se da je preko 150 miliona ljudi širom sveta inficirano tim virusom. Veliki procenat nosilaca postaje hronično inficiran a kod mnogih dolazi do hroničnog oboljenja jetre, takozvanog hroničnog hepatitisa C. Ta grupa je u velikoj opasnosti od ozbiljnih oboljenja jetre, kao što su ciroza jetre, hepatoćelijski karcinomi a završno oboljenje jetre dovodi do smrti.

Mehanizam pomoću koga HCV ostvaruje virusnu istrajnost i izaziva veliku broj hroničnih oboljenja jetre nije podrobno istražen. Nije poznato kako HCV i imunski sistem domaćina utiču jedan na drugi i kako ga HCV izbegava. Osim toga, uloge ćelijskog i humoralnog imunskih odgovora u zaštiti od HCV infekcije i oboljenja treba još da se odrede. Pominjani su imunoglobulini za profilaksu od virusnog hepatitisa vezanog za transfuziju. Međutim, Centar za kontrolu oboljenja još nije preporučio tretman imunoglobulinima za tu svrhu.

Nedostatak efikasnog zaštitnog imunskog odgovora ometa razvoj vakcine ili odgovarajućih profilaksnih mera posle izlaganja, tako da su u bliskoj budućnosti nade čvrsto usmerene na antivirusne intervencije.

Različite kliničke studije su obavljene sa ciljem da se identifikuju farmaceutska sredstva koja su u stanju da efikasno leče HCV infekciju kod pacijenata koji imaju problem sa hroničnim hepatitisom C. Te studije su obuhvatile upotrebu interferona alfa, samog ili u kombinaciji sa drugim antivirusnim sredstvima. Takve studije su pokazale da znatan broj lica ne odgovara na te terapije, a kod velikog broja onih koji povoljno reaguju bolest se vraća posle završetka tretmana.

Do nedavno, interferon (IFN) je predstavljao jedinu dostupnu terapiju sa pokazan-im povoljnim efektima koja je odobrena za kliničko lečenje pacijenata sa hroničnim hepatitisom C. Međutim, stopa uspešnosti terapije je i dalje niska, a takođe, lečenje inerferonom izaziva ozbiljne neželjene efekte (na primer retinopatiju, tiroiditis, akutni pankreatilis, depresiju) koji umanjuju kvalitet života tretiranih pacijenata. U poslednje vreme odobreno je korišćenje inerferona u kombinaciji sa ribavirinom kod pacijenata koji ne reaguju na sam IFN. Ipak, neželjeni efekti izazvani sa IFN se ne umanjuju ovom kombinovanom terapijom.

Zbog toga, postoji potreba za razvojem efikasnog antivirusnog agensa za tretman HCV infekcija, koji bi bio u stanju da prebrodi ograničenja postojećih farmaceutskih terapija.

HCV pripada familiji Flaviviridae, a čini ga upakovani pozitivni lanac RNK-a virusa. Jednolančani RNK genom HCV-a ima dužinu od oko 9500 nukleotida i ima jedan otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira jedan veliki poliprotein od oko 3000 amino kiselina. U inficiranim ćelijama, ovaj protein seku na mnogo mesta ćelijske i virusne proteaze i proizvode se strukturni i nestrukturnu (NS) proteini. U slučaju HCV-a stvaranje zrelih nestrukturnih proteina (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, i NS5B) vrši se pomoću dve virusne proteaze. Prva, još uvek slabo okarakterisana, seče na NS2-NS3 vezi; druga je serinska proteaza koja je sadržana u okviru N-terminalnog regiona NS3 (nadalje označena kao NS3 proteaza) i posreduje u svakom narednom sečenju nizvodno od NS3, u oba, ucis,na NS3-NS4A mestu sečenja, i utrans,za ostala mesta NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Izgleda da protein NS4A ima više funkcija, delujući kao kofaktor za NS3 proteazu i verovatno učestvujući u membranskoj lokalizaciji NS3 i ostalih virusnih komponenata za replikaciju. Kompleksna formacija NS3 proteina sa NS4A je izgleda neophodna za obradu, pojačavajući efikasnost proteolize na svim mestima. NS3 protein takođe pokazuje aktivnost nukleozid trifosfataze i RNKhelikaze. NS5B je RNK polimeraza zavisna od RNK, koja je uključena u replikacuju HCV-a.

Opšta strategija pri razvoju antivirusnih sredstava je da se inaktivišu enzimi kodirani u virusnom genomu koji su neophodni za replikaciju virusa. U tom smislu, patentna prijava WO 97/06804 opisuje (-) enantiomer nukleozidnog analoga citozin-l,3-oksatiolana (takođe poznatog kao 3TC) kao aktivnog protiv HCV-a. Ovo jedinjenje, iako prikazano kao bezbedno u prethodnim kliničkim ispitivanjima protiv HIV i HBV, tek treba da bude odobreno za kliničku primenu protiv HCV-a i njegov mehanizam đelovanja protiv virusa tek treba da bude prikazan.

Intezivni napori u cilju otkrića jedinjenja koja inhibiraju NS3 proteazu ili RNK helikazu HCV-a, dovela su do sledićih zaključaka: US patent 5,633,388 opisuje heterociklično supstituisane karboksamide i analoge, kao aktivne protiv HCV-a. Ova jedinjenja su uperena protiv helikazne aktivnosti virusnog NS3 proteina, ali klinički testovi još uvek nisu prikazani. Fenantrenehinon su prikazali Chu i saradniđ u (Tet. Lett, (1996), 7229-7232) daje aktivan protiv NS3 proteaze HCV-ain vitro.Nikakav dalji razvoj ovog jedinjenja nije prikazan.

U radu objavljenom u Ninth International Conference on Antiviral Research, Urabandai, Fukvshima, Japan (1996) ( Antiviral Research, (1996), 30, 1, A23 (apstrakt 19)) se navode tiazolidin derivati kao inhibitori HCV proteaze.

Nekoliko studija je prikazalo jedinjenja koja su inhibitori drugih serinskih proteaza, kao što je humana leukocitna elastaza. Jedna familija ovih jedinjenja je prikazana u WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Peptidi obuhvaćeni tom prijavom su morfolinilkarbonil-benzoil-peptidni analozi koji se strukturno razlikuju od peptida prema ovom pronalasku.

WO 98/17679 iz Vertex Pharmaceuticals Inc. obelodanjuje inhibitore serinskih proteaza, posebno NS3 proteaze hepatitis C virusa. Ti inhibitori su peptidni analozi zasnovani na prirodnom supstratu za NS5A/5B. Svi od tih peptida sadrže C-termin-alnu aktiviranu karbonil funkciju kao osnovnu karakteristiku. Ovi peptidi su takođe prikazani kao aktivni protiv drugih serinskih proteaza, što znači da nisu specifični za NS3 proteazu HCV-a.

Hofiman LaRoche je takođe prikazao heksapeptide koji su inhibitori proteinaze, korisni kao antivirusna sredstva za tretman HCV infekcija. Ovi peptidi sadrže aldehid ili bornu kiselinu na Cterminusu.

Steinkuhleretal. iIngallinellaetal.su prikazali inhibiciji produkta cepanjem N-terminalnog (Biochemistrv (1998), 37, 8899-8905 i 8906-8914). Ipak, peptidi i peptidni analozi opisani u tom radu ne uključuju niti dovode do dizajniranja peptida na osnovu ovog pronalaska.

WO 98/46597 sa Emory univerziteta prikazuje inhibotore serinske proteaze, naročito proteaze hepatitis C virusa. Sva obelodanjena jedinjenja imaju strukturu različitu

od peptida prema ovom pronalasku.

WO 98/46630 iz Peptide Therapeutcs Ltd, prikazuje inhibitore NS3 proteaze hepa-tisa C. Međutim, nijedan od obelodanjenih peptida ne odnosi se na peptide prema pronalasku.

JP 10298151 od Japan Energv Corp. prikazije N-(2,3-dihidroksibenzoil) supstituisane derivate serina kao inhibitore serinske proteaze, naročito kao inhibitore virusne proteaze hepatitisa C. Ova jedinjenja ne sadrže bilo kakvu strukturnu sličnost sa analozima peptida prema ovom pronalasku.

Jedna od prednosti ovog pronalaska je da daje peptide koji su inhibitori NS3 proteaze hepatitis C virusa.

Dalja prednost jednog od aspekata ovog pronalaska leži u činjenici da ovi peptidi specifično inhibiraju NS3 proteazu i ne pokazuju značajnu inhibitorsku aktivnost pri koncentracijama do 300 uM u odnosu na ostale serinske proteaze kao što su leukocitna elastaza čoveka (HLE), elastaza pankreasa svinje (PPE), ili riimotripsin pankreasa govečeta, ili cisteinske proteaze kao što je katepsin B jetre čoveka (CatB).

IZVOD PRONALASKA

Predmetom ovog pronalaska obuhvaćeni su racemati, dijastereoizomeri i optički izomeri jedinjenja formule (I):

u kojoj

a jeste 0 ili 1; b jeste 0 ili 1; Y jeste H iliCh6alkil grupa;

B je H, acil derivat formule R7-C(0)- ili sulfonil, formule R7-S02gde

R7jeste grupa (i) Cnoalkil eventualno supstituisana sa grupom karboksil, Cw alkanoiloksi ili Cls alkoksi;

(ii) C3.7cikloalkil eventualno supstituisana sa grupom karboksil,

(Ci.6alkoksi)karbonil ili fenilmetoksikarbonil; (iii) C6ili Cioarilm C7-i6aralkil eventualno supstituisane sa grupom Ci.g alkil, hidroksi, ili amino eventualno supstituisanom sa Ci.g alkilom; ili (iv) Het eventualno supstituisana sa grupom Ci.6alkil, hidroksi, amino eventualno supstituisanom sa Cx.g alkilom, ili amido eventualno supstituisanom sa Q.g alkilom;

R6, kada je prisutan, jeste C^g alkil supstituisan sa karboksilom;

R5, kada je prisutan, jeste Q.g alkil eventualno supstituisan sa karboksilom;

R4je Čuo alkil, C3.7cikloalkil ili C4.10(alkilcikloalkil);

R3je Cno alkil, C3.7cikloalkil ili C4.10(alkilcikloalkil);

R2je CH2-R20*NH-R2o, O-R20ili S-R20, gde R2ojeste zasićen ili nezasićen C3.7cikloalkil ili C440(alkil cikloalkil) eventualno mono-, di- ili tri-supsittuisani sa R21,

ili R2oje Cg ili C10aril ili C7.16aralkil eventualno mono-, di ili trisupstituisani sa R2iili R2oje Het ili (niži alkil)-Het eventualno mono-, di- ili tri-supstituisani sa R2i,

gde svaki R2ijeste nezavisno grupa Cw alkil; Ci_g alkoksi; amino eventualno mono- ili di-supstituisana sa Ci^alkilom; sulfonil; N02; OH; SH; halogeno;

halogenoalkil; amido eventualno mono supstituisana sa grupom Ci^alkil, C6ili Cio aril, C7_i6aralkil, Het ili (niži alkil)-Het; karboksil; karboksi(niži alkil); Cg ili Ci0aril, C745 aralkil ili Het, a pomenute aril, aralkil ili Het eventualno su supstituisane sa R22;

gde R22jeste C^g alkil; Ci^alkoksi; amino eventualno mono- ili di-supstituisana sa Q.g alkilom; sulfonil; NO2; OH; SH; halogeno;

halogeno-alkil; karboksil; amid; ili (niži alkil) amid;

Rije Ci-g alkil ili C2.g alkenil eventualno supstituisane sa halogenom; a W je hidroksi ili N-supstituisana amino grupa;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar.

Predmetom ovog pronalaska obuhvaćen je farmaceutski preparat koji sadrži virusno efikasnu količinu anti-hepatis C jedinjenja formule I, ili terapeutski prihvatljivu njegovu so ili estar, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosećim medijumom i pomoćnim sredstvom.

Značajan aspekt pronalaska obuhvata postupak za lečenje virusne infekcije hepatitisa C, kod sisara, davanjem sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove terapeutski prihvatljive soli ili estra, ili kompozicije kao što je gore opisana.

Dalji značajan aspekt obuhvata postupak za inhibiranje replikacije virusa hetapitisa C, izlaganjem virusa količini jedinjenja formule I koja inhibira virusnu NS3 proteazu hepatitisa C, ili njegovoj terapeutski prihvatljivoj soli ili estru ili kompoziciji kao što je gore opisano.

Još jedan dalji aspekt obuhvata postupak za lečenje virusne infekcije hepatitisa C kod sisara, davanjem anti-hepatitis C virusno efikasne količine kombinacije jedinjenja formule I, ili njegove terapeutski prihvatljive soli ili estra i nekog interferona. Farmaceutska kompozicija koja sadrži kombinaciju, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosećim medijumom ili pomoćnim sredstvom, takođe je predmet ovog pronalaska.

PODROBNI OPIS PRONALASKA

Definicije

Kako su ovde upotrebljene, sledeće definicije, ukoliko nije drugo rečeno, označavaju: U vezi sa slučajevima gde su upotrebljeni( R)ili( S)radi označavanja konfiguracije radikala, npr. R4jedinjenja formule I, značenje je dato u kontekstu jedinjenja a ne u kontekstu samog radikala.

Prirodne amino kiseline, sa izusetkom glicina, sadrže hiralni atom ugljenika. Ukoliko ništa drugo posebno nije naznačeno, prednost imaju jedinjenja koja sadrže prirodne amino kiseline sa L-konfiguracijom. Međutim, prijavioci imaju u vidu da kada je specificirano, neke amino kiseline formule I mogu biti ili D- ili L- konfiguracije, ili mogu biti smeše D- i L- izomera, uključujući racemske smeše.

Oznaka "Pl, P2 i P3 itd.", kako je ovde upotrebljena, odnosi se na položaj ostataka amino kiseline polazeći od kraja završnog (terminalnog) C atoma peptidnih analoga pa pružajući se ka završnom (terminatnom) N atomu [ti. Pl odnosi se na položaj 1 od završnog C atoma, P2: drugi položaj od završnog C atoma, itd.) (vidi Berger A & Schechter I., Transactions of the Royal Societv London series, B257. 249-264(1970)).

Skraćenice za a-amino kiseline korišćene u ovoj prijavi prikazane su u tabeli A.

Kako je ovde koriscen, izraz "1-aminociklopropil-karboksilna kiselina" (Acca) odgovara jedinjenju formule:

Kako je ovde korišcen, izraz" terc-buitlglicin"(Tbg) odgovara jedinjenju formule:

Izraz "ostatak" kada se odnosi na amino kiselinu ili na derivat amino kiseline predstavlja radikal koji potiče od odgovarajuće a-amino kiseline posle eliminisanja hidroksila karboksi grupe i jednog vodonika iz a-amino grupe. Na primer, oznake Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar i Tyr predstavljaju odgovarajuće "ostatke", L-glutarnina, L-alanina, glicina, L-izoleucina, L-arginina, L-asparaginske kiseline, L-fenilalanina, L-serina, L-leucina, L- cisteina, L-aspa-ragina, sarkozina i L-tirozina.

Izraz "bočni lanac", kada se odnosi na amino kiselinu ili na ostatak amino kiseline, predstavlja grupu vezanu za atom a-ugljenika a-amino kiseline. Na primer, bočni lanac R-grupe, za glicin je vodonik, za alanin je metil, za valin izopropil grupa. Za specifične R-grupe ili bočne lance a-amino kiselina referencu daje A. L. Lehnin-ger's text on Biochemistrv (vidi glava 4).

Izraz "halogeno", kako je ovde korišcen označava halogeni radikal odabran između bromo, hloro, fluoro ili jodo naziva.

Izraz "Ci.6alkil" ili "(niži) alkil", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava alkil radikale, sa pravim ili razgranatim nizom (lancem) koji sadrže do šest atoma ugljenika, a obuhvataju na primer, metil, etil, propil, butil, heksil, 1-metiletil, 1-metilpropil, 2-metilpropil, 1,1-dimetiletil (npr.terc-

-butil).

Izraz "C3.7cikloalkil", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava cikloalkil radikal koji sadrži od tri do sedam atoma ugljenika, a uključuje ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i cikloheptil grupe.

Izraz "nezasićeni cikloalkil" obuhvata, na primer, cikloheksenil:

Izraz "C4.10(alkilcikloalkil)", kako je ovde korišćen, označava cikloalkil radikal koji sadrži od tri do sedam atoma ugljenika, povezanih u alkil radikal, a vezani radikali sadrže do deset atoma ugljenika: na primer, ciklopropilmetil, ciklopentiletil, cikloheksilmetil, cikloheksiletil ili cikloheptiletil.

Izraz "C240 alkenil", kako je ovde korišcen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava alkil radikal kao što je gore definisano, koji sadrži od 2 do 10 atoma ugljenika, a sadrži još i bar jednu duplu vezu. Na primer, alkenil uključuje alil i vinil.

Izraz "C^ alkanoil", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava prave ili razgranate 1-oksoalkil radikale koji sadrže jedan do šest atoma ugljenika i obuhvata formil, acetil, 1-oksopropil (propionil), 2-metil-l-oksopropil, 1-oksoheksil i slično.

Izraz "C^ alkoksi", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava radikal - 0( Ch6 alkil), gde alkil kao što je gore definisano sadrži do 6 atoma ugljenika. Alkoksi obuhvata metoksi, etoksi, propoksi, 1-metiletoksi, butoksi i 1,1-dimetiletoksi. Poslednji radikal je obično poznat kao ferc-butoksi.

Izraz "€3.7cikloalkoksi", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava C3.7cikloalkil grupu vezanu za atom kiseonika, kao što je na primer:

Izraz "C6ili C10aril", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava ili aromatsku monocikličnu grupu koja sadrši 6 atoma ugljenika ili aromatsku bicikličnu grupu koja sadrži 10 atoma ugljenika. Na primer, aril uključuje fenil, 1-naftil ili 2-naftil.

Izraz "C7.16aralkil ", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava Cg ili Cioaril, kao što je gore definisano, vezan za alkil grupu, gde alkil definisan kao gore sadrži od 1 do 6 atoma ugljenika. C7.i6aralkil obuhvata na primer, benzil, butilfenil i 1-naftilmetil.

Izraz "amino aralkil", kako je ovde korišcen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava amino grupu supstituisanu sa C^g aralkil grupom, kao na primer, amino aralkil:

Izraz "karboksi (niži) alkil", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava karboksil grupu (COOH) vezanu preko (niži) alkil grupe, kao što je gore definisano a obuhvata na primer buternu kiselinu.

Izraz "heterocikl" ili "Het", kako je ovde korišcen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava monovalentan radikal dobijen uklanjanjem vodonika iz peto-, šesto- ili sedmo-članog zasićenog ili nezasićenog (uključujući aromatičan) heterocikla koji sadrži od jedan do četiri hetero-atoma odabranih od azota, kiseonika i sumpora. Dalje, "Het", kako je ovde korišceno, označava heterociklično jedinjenje kao što je definisano gore, "stopljeno" u jedan ili više drugih prstenova, bili oni hetero-prstenovi ili drugi prstenovi. Primeri pogodnih heterocikla obuhvataju: pirolidin, tetrahidrofuran, tiazolidin, pirol, tiofen, diazepin, lH-imidazol, izoksazol, tiazol, tetrazol, piperidin, 1,4-dioksan, 4-morfolin, piridin, pirimidin, tiazolo[4,5-b]piridin, hinolin ili indol, ili sledeće heterocikle:

Izraz "(niži alkil)-Het", kako je ovde korišcen, označava heterocikličan radikal kao što je gore definisano vezan preko prave ili razgranate alkil grupe, pri čemu alkil, definisan kao gore, sadrži do 1 do 6 atoma ugljenika. Primeri (niži alkil)-Het obuhvataju:

Izraz "farmaceutski prihvatljiv estar", kako je ovde korišćen, bilo sam ili u kombinaciji sa drugi radikalom, označava estre jedinjenja formule I, u kojoj su karboksilne funkcije molekula, a prvenstveno karboksi zavšetak, zamenjeni alkoksikarbonil funkcijom:

u kojoj je deo R, estra, odabran od alkila (npr. metil, etil,/2-propil, r-butil, z?-butil); alkoksialkila (npr. metoksimetil); alkoksiacila (npr. acetoksimetil); aralkila (npr. benzil); ariloksialkila (npr. fenoksimetil); arila (npr. fenil), eventualno supstituisan sa halogenom, Ci_4alkil ili Ci_4alkoksi grupom. Drugi pogodni prolek estri mogu se naći u Design of prodrugs, Bundgaard, H. Ed. Elsevier (1985), uključenim ovim kao referenca. Takvi farmaceutski prihvatljivi estri obično hidrolizujuin vivokada se injektuju u sisara i transformišu se u oblik kiseline jedinjenja formule I.

Sto se tiče gore opisanih estara, ukoliko nije drukčije specificirano, svaki prisutan alkil deo prvenstveno sadrži 1 do 16 atoma ugljenika, naročito 1 do 6 atoma ugljenika. Svaki aril deo u takvim estrima prvenstveno sadrži fenil grupu. Naročito, estri mogu biti CM6 alkil estar, neki nesupstituisani benzil estar ili benzil estar supstituisan sa bar jednom halogenom, Cj.6alkil, Ci.g alkoksi, nitro ili trifluormetil grupom.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva so", kako je ovde korišcen, obuhvata one izvedene od farmaceutski prihvatljivih baza. Primeri pogodnih baza obuhvataju holin, etanolamin i etilendiamin. Na<+>, K<+>i Ca<++>soli takođe dolaze u obzir kao predmet pronalaska (vidi takođe Pharmaceutical salts, Birge, S.M. et al., J. Pharm. Sci.,

(1977) , 66, 1-19,uključeno ovde kao referenca).

Rešenja koja imaju prednost

Predmet ovog pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj

B jeste prvenstveno R7-SO2gde R7prvenstveno jeste Cg ili Cioaril, C7-I6aralkil ili Het svi eventualno supstituisani sa Q.g alkilom.

Alternativno, B je prvenstveno H ili acil derivat formule R7-C(0)- gde je R7prvenstveno Ci_6alkil; C^alkoksi; C3.7cikloalkil eventualno supstituisan hidroksilom; amido eventualno supstituisana sa grupom C\. q alkil ili Het; C6ili Cioaril, C7_i6aralkil ili Het svi eventualno supstituisani sa grupom Ci^ alkil ili hidroksi. Povoljnije je da B jeste H ili R7C(0)-, gde je povoljnije da R7jeste Ci.g alkil ili neki od heterocikla kao što su: Najpovoljnije je da B jeste H; acetil;

Ipak, najpovoljnije je da B jeste acetil.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj Rg, kada je prisutan, prvenstveno jeste bočni lanac u Asp ili Glu. Povoljnije je, da R6, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp. Alternativno, prvenstveno, a je 0 a tada R6nije prisutan. Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac neke amino kiseline odabrane iz grupe koju sačinjava-ju: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-butilglicin (Tbg), i L-Tbg. Povoljnije je da, R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Asp, D-Val ili D-Glu. Najpovoljnije je da, R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Glu. Alternativno, prvenstveno, a je 0 i b je 0, a tada oba, Rg i R5nisu prisutni.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, R4jeste bočni lanac neke amino kiseline odabrane iz grupe koju sačinjavaju: Val, cikloheksilglicin (Chg), Tbg, Ile ili Leu. Povoljnije je da R4jeste bočni lanac u Chg ili Ile. Najpovoljnije je da R4jeste bočni lanac u Chg.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, Y jeste H, ili Me. Najpovoljnije je da Y jeste H.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, R3jeste bočni lanac neke amino kiseline odabrane iz grupe koju sačinjavaju: Ile, Chg, Val ili Tbg. Povoljnije je da R3jeste bočni lanac u Val, Chg ili Tbg. Najpovoljnije je da R3jeste bočni lanac u Val ili Tbg.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, R2jeste S-R20ili O-R20. gde R20jeste prvenstveno Cg ili Cioaril, C7_i6aralkil, Het ili -CH2-Het, svi eventualno mono-, di- ili tri-supstituisani sa R21.

Prvenstveno, R21jeste C14 alkil; C^alkoksi; amino; mono- ili di(niži alkil) amino; amido eventualno mono-supstituisan sa grupom Ci^ alkil, Cg ili Cioaril, C7.i6aralkil, Het ili (niži alkil)-Het; N02; OH; halogeno; trifluorometil; karboksil; C6ili Cioaril, C7-I6aralkil, ili Het, a pomenuti aril, aralkil ili Het eventualno su supstitisani sa R22. Povoljnije je da R2ijeste Cwalkil; Ci-g alkoksi; amino; di(niži alkil) amino; (niži alkil) amid; Cg ili Ci0aril, ili Het a pomenuti aril ili Het eventualno su supstituisani sa R22.

Prvenstveno, R22 jeste Ci_g alkil; C^ alkoksi; amino; mono- ili di(niži alkil) amino; (niži alkil) amid; N02; OH; halogeno; trifluorometil; ili karboksil. Povoljnije je da R22 jeste Ci? alkoksi; amino; di(niži alkil) amino;

(niži alkil) amid; halogeno; ili trifluorometil.

Povoljnije je da R2jeste 1-naftilmetoksi; 2-naftilmetoksi; benziloksi;

1-naftiloksi; 2-naftiloksi; ili hinolinoksi nesupstituisan, mono- ili di-supstituisan sa R2i kao što je definisano gore. Najpovoljnije je da R2jeste 1-naftilmetoksi; ili hinolinoksi nesupstituisan, mono- ili di-supstituisan sa R2ikao što je definisano gore.

Još je najpovoljnije da R2jeste:

Povoljnije je da R2ia jeste amido grupa eventualno mono-supstituisana sa grupom Ci_6alkil, C6ili C10aril, C7.16aralkil ili Het; ili C6ili C10aril ili Het eventualno supstituisani sa R22. Najpovoljnije je da R22jeste amino; di(niži alkil) amino; ili (niži alkil) amid. Ipak je najpovoljnije da R22jeste amino; dimetilamino; ili acetamido.

Ipak, najpovoljnij je da R2i a jeste Cg ili Cioaril ili Het, svi nesupstituisani.

Prvenstveno, R2ibjeste C^ alkil; Ci.6alkoksi; amino; di(niži alkil) amino; (niži alkil) amid; N02; OH; halogeno; trifluorometil; ili karboksil. Povoljnije je da R2ibjeste Ci.g alkoksi; ili di(niži alkil)amino. Najpovoljnije je da R2ibjeste metoksi.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, Ri jeste metil, etil, propil, vinil, svi eventualno supstituisani sa halogenom. Povoljnije je da Rijeste etil, vinil ili bromovinil. Najpovoljnije je da Rijeste vinil.

Predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I u kojoj, prvenstveno, W je hidroksi grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar; ili (niži alkil) amino, di(niži alkil) amino ili amino aralkil. Povoljnije je da W jeste hidroksi, iliN(Ri3a)R13bgde Ri3ai R13I) jesu nezavisno H, aril ili C^ alkil eventualno supstituisani sa hidroksilom ili fenilom; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Najpovoljnije je da W jeste -OH, -NH-benzil ili -NH-CH(Me)Ph. Još je povoljnije da W jeste -OH ili -NH--fS;CH (Me)-fenil.

Kada je W estar, takav estar je prvenstveno odabran između Ci_g alkoksi, fenoksi, ili aril (C i.g alkoksi) grupa. Povoljnije je da je takav estra metoksi, etoksi, fenoksi, benziloksi, ili PhCH(Me)-0-.

Kao što je prethodno opisano Pl segment jedinjenja formule I jeste

ciklopropilni prstenasti sistem formule:

gde svaki od Cii C2predstavlja asimetričan atom ugljenika u položajima 1 i 2, ciklopropil prstena. Uprkos drugim mogućim asimetričnim centrima na drugim segmentima jedinjenja formule I, prisustvo ova dva asimetrična centra znači da jedinjenja formule I mogu da postoje kao racemske smeše dijastereoizomera. Kao što je prikazano na daljim primerima, racemske smeše mogu biti pripremljene a zatim razdvojene u pojedinačne optičke izomere, ili ti optički izomeri mogu biti pripremljeni putem hiralne sinteze.

Otuda, jedinjenje formule I može da postoji kao racemska smeša dijastereoizomera kada je Rju položaju 2 orijentisansynu odnosu na karbonil u položaju 1, što je prikazano pomoću radikala: ili jedinjenje formule I može da postoji kao racemska smeša dijastereoizomera kada je Riu položaju 2 orijentisanantiu odnosu na karbonil u položaju 1, što je prikazano pomoću radikala:

Sa druge strane, racemska smeša može da bude razdvojena u pojedinačne optičke izomere.

Najinteresantnije otkriće ovog pronalaska odnosi se na prostornu orijentaciju Pl segmenta. Otkriće se odnosi na konfiguraciju asimetričnog ugljenika u položaju 1. Povoljnije rešenje je ono kada asimetrični ugljenik u položaju 1 imaRkonfiguraciju.

Određenije, kada ugljenik 1 ima i? konfiguraciju, inhibicija NS3 proteaze HCV-a je dalje pojačana položajem supstituenta Ri(npr. alkil ili alkilen) na ugljeniku 2 ciklopropil prstena. Najpogodnije jedinjenje je optički izomer koji sadrži Ri supstituent, a karbonil usynorijentaciji sa sledećom apsolutnom konfiguracijom:

U slučaju kada Rijeste etil, na primer, asimetrični atomi ugljenika u položajima 1 i 2 imaju i?,7?konifguraciju.

Radi ilustrovanja uloge koju ima apsolutna konfiguracija supstituenata na nivo potence jedinjenja, jedinjenje 112 (tabela 1) koje ima apsolutnu konfiguracijulR, 2R\ mzIC50°đ 1>6 uM dok odgovarajućilS, 2Sizomer(jedinjenje 113) ima IC50od 27,5 uM. Zbog toga je1R, 2Rizomer 25-struko potentniji nego odgovarajući

1ST2S izomer.

Dalje, predmet pronalaska obuhvata jedinjenja formule I, u kojoj B jeste H, niži alkil-C(O)- ili Het-C(0)-;

R6, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp ili Glu;

R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D- ili L-: Asp, Glu, Val ili Tbg;

Y je H ili metil;

R4 je bočni lanac u Val, Chg, Tbg, Ile ili Leu;

R3 je bočni lanac u Ile, Chg, Val ili Tbg;

R2je 1-naffilmetoksi, 2-nafilmetoksi, ili O-Bn,

a R22je amino; di(niži alkil) amino; (niži alkil) amid; N02; OH; halogeno; CF3; ili karboksi;

Pl je ciklopropilni prstenasti sistem formule

u kojoj Rijeste etil, vinil ili bromovinil; a

W je hidroksi ili N(Ri3a)R13b<g>de Ri3a i R13bnezavisno jesu H, aril ili ChB alkil eventualno supstituisani sa grupom hidroksi ili fenil; ili njihova farmaceutski prihvatljiva so ili estar.

Dalja grupa jedinjenja koja imaju prednost, prikazana je formulom I, gde B jeste H, acetil ili Het-C(O)-; Rg, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp; R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Asp, D-Glu ili D-Val; Y je H; R4je bočni lanac u Chg ili Ile; R3je bočni lanac u Val, Chg ili Tbg; R2je 1-naftilmetoksi, benziloksi, 4-hinolinoksi, ili

Pl je ciklopropilni prstenski sistem formule

u kojoj Rijeste Et ili -CH=CH2ili -CH-CHBr; a

W je hidroksi ili -NH- ( S) CH( Me)Ph,

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so ili estar.

Još jedna druga grupa jedinjanja koja ima prednost, prikazana je formulom I, u kojoj je B acetil; R6, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp; R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Glu; Y je H; R4je bočni lanac u Chg; R3je bočni lanac u Val ili Tbg; R2 je;

Pl je:

W je hidroksi grupa, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so ili estar.

Na kraju, predmetom ovog pronalaska obuhvaćeno je svako jedinjenje formule I kao što je prikazano u tabelama 1 do 5.

Prema jednom alternativnom rešenju, farmaceutske kompozicije na osnovu ovog pronalaska mogu dodatno da sadrže i drugo anti-HCV sredstvo. Primeri anti-HCV sredstava obuhvataju, a- ili p-interferon, ribavirin i amantidin.

Prema drugom alternativnom rešenju, farmaceutske kompozicije na osnovu ovog pronalaska mogu dodatno da sadrže i druge inhibitore HCV proteaze.

Prema još jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutske kompozicije na osnovu ovog pronalaska mogu dodatno da sadrže i inhibitore drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, uključujući ali ne uz ograničavanje, helikazu, polimerazu, metaloproteazu ili interno mesto ulaženja ribozoma (IRES).

Farmaceutske kompozicije na osnovu ovog pronalaska mogu da se daju oralno, parenteralno ili preko implantiranog rezervoara. Prednost ima oralno davanje ili davanje putem injekcije. Farmaceutske kompozicije na osnovu ovog pronalaska mogu da sadrže bilo koje uobičajene netoksične, farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke (adjuvense) ili prenosioce. U nekim slučajevima, pH formulacije može da se podešava sa farmeceutski prihvatljivim kiselinama, bazama ili puferima, da bi se povećala stabilnost jedinjenja u formulaciji ili oblik u kome se daje. Izraz parenter-alan, kako je ovde korišćen, obuhvata supkutanu, intrakutanu, intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu i intralezijsku injekciju ili infuzione tehnike.

Farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku sterilnog preparata koji se može injektovati, na primer, kao sterilna injekciona vodena ili uljna suspenzija. Takva suspenzija može biti formulisana prema tehnikama poznatim na osnovu stanja tehnike, uz upotrebu pogodnih sredstava za dispergovanje ili kvašenje (takvog kao na primer Tween<®>80) i sredstava za suspendovanje.

Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku oralno mogu da se daju u bilo kom obliku prihvatljivom za oralno davanje, uključujući, ali ne uz ograničavanje, kapsule, tablete i vodene suspenzije i rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se obično koriste uključuju laktozu i kukuruzni škrob. Sredstva koja olakšavaju presovanje tableta, kao magnezijum-stearat, takođe se tipično dodaju. Za oralno davanje u obliku kapsule, upotrebljivi razblaživači uključuju laktozu i suvi kukuruzni škrob. Kada se vodene suspenzije daju oralno aktivni sastojak se kombinuje sa sredstvima za emulgovanje i suspendovanje. Po želji, mogu se dodati određena sredstva za zaslađivanje i/ili aromu i/ili bojenje.

Drugi pogodni prenosioci ili nosači za gore navedene formulacije i kompozicije mogu se naći u standardnim farmaceutskim knjigama, npr. "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacv, 19* Ed. Mack Publishing Companv, Easton, Penn., (1995).

Nivoi doziranja, između oko 0,01 i oko 100 mg/kg telesne mase na dan, prvenstveno između oko 0,5 do oko 75 mg/kg telesne mase na dan, jedinjenja inhibitora proteaze opisanih ovde, korisni su u monoterapiji za prevenciju i lečenje oboljenja izazvanih HCV-om. Tipično je da se farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku daju od oko 1 do oko 5 puta dnevno, ili alternativno kao kontinualna infuzija. Takvo davanje može da se primeni kao hronična ili akutna terapija. Količina aktivnog sastojka, koja može da se kombinuje sa nosećim materijalima za pripremanje pojedinačnog oblika doziranja, menjaće se u zavisnosti od domaćina koji se tretira a naročito od načina davanja. Tipičan preparat sadrži od oko 5% do oko 95% aktivnog jedinjenja (mas./mas.). Prvenstveno, takvi preparati sadrže od oko 20% do oko 80% aktivnog jedinjenja.

Kao što će stručnjak da proceni, niže ili više doze, od onih gorenavedenih mogu biti neophodne. Specifično doziranje i režimi tretmana za svakog posebnog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost primenjenog specifičnog jedinjenja, godine, telesnu masu, opšte zdravstveno stanje, pol, ishranu, vreme davanja, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, ozbiljnost i tok infekcije, predispoziciju pacijenata prema infekciji i procenu lekara koji obavlja lečenje. U principu, lečenje se započinje sa malim dozama znatno manjim od optimalne doze peptida. Posle toga, doza se po malo povećava dok se ne postigne optimalni efekt pod tim okolnostima. Obično, najpoželjnije je da se jedinjenje daje sa nivoom koncentracije koji će uopšte dati efikasne antivirusne rezultate bez izazivanja štetnih ili škodljivih pratećih efekata.

Kada kompozicije prema ovom pronalasku sadrže kombinaciju jedinjenja formule I i jedno ili više dodatnih terapeutskih ili profilaksnih sredstava, i jedinjenje i adiciono sredstvo treba da su uneti na nivoima doze od između oko 10 do 100%, pogodnije je između oko 10 i 80% doze koja se normalno daje u režimima monoterapije.

Kada su ova jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli formulisani zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, dobijena kompozicija može da se dajein vivosisarima, kao što je čovek, da bi se inhibirala NS3 proteaza HCV-a ili za lečenje ili prevenciju HCV infekcije. Takav tretman može takođe da se postigne upotrebom jedinjenja prema ovom pronalasku u kombinaciji sa sredstvima koja sadrže, ali bez ograničavanja samo na njih: imunomodulatorska sredstva, kao što su a-, P- ili y -interferoni; druga antivirusna sredstva kao što su ribavirin, amantadin; druge inhibitore NS3 proteaze HCV-a; inhibitore drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, koji uključiju, ali ne uz ograničavanja, helikazu, polimerazu, metaloproteazu, ili interno mesto ulaska ribozoma (IRES); ili njihove kombinacije. Dodatna sredstva mogu da se kombinuju sa jedinjenjima prema ovom pronalasku radi stvaranja jedinstvenog oblika doziranja. Alternativno, ova dodatna sredstva mogu da se daju odvojeno sisarima kao deo višestrukog doziranja oblika.

Prema tome, drugo rešenje prema ovom pronalasku pruža postupke za inhibiranje aktivnosti NS3 proteaze HCV-a kod sisara, davanjem jedinjenja formule I, čiji su supstituenti definisani kao što je prethodno izneto.

Prema rešenju koje ima prednost, ti postupci su korisni za smanjenje, kod sisara, aktivnosti NS3 proteaze HCV-a. Ako farmaceutska kompozicija sadrži samo komponentu prema ovom pronalasku, kao aktivnu komponentu, takvi postupci mogu dodatno da sadrže i stupanj davanja pomenutom sisani nekog sredstva odabranog između imunomodulatorskog sredstva, antivirusnog sredstva, inhibitora HCV proteaze, ili inhibitora drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, kao što su helikaza, polimeraza, ili metaloproteaza, ili IRES. Takvo dodatno sredstvo može da se da sisani, pre, jednovremeno sa, ili posle davanja jedinjenja, prema ovom pronalasku.

Prema alternativnom rešenju koje ima prednost, ovi postupci su korisni za inhibiranje virusne replikacije kod sisara. Takvi postupci su korisni za lečenje i prevenciju HCV oboljenja. Ako farmaceutska kompozicija, kao aktivnu komponentu, sadrži samo jedinjenje prema ovom pronalasku takvi postupci mogu dodatno da sadrže i stupanj davanja pomenutom sisani nekog sredstva odabranog među imunomodulacionim sredstvima, neko antivirusno sredstvo, neki inhibitor HCV proteaze, ili inhibitor drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV. Takvo dodatno sredstvo može da se daje sisani, pre, jednovremeno sa, ili posle davanja kompozicije prema ovom pronalasku.

Jedinjenja koja su ovde prikazana mogu takođe da se koriste kao laboratorijski reagensi. Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu takođe da se koriste za tretiranje ili prevenciju virusne kontaminacije materijala pa time da smanje rizik od virusne infekcije laboratorijskog ili medicinskog osoblja ili pacijenata koji dolaze u dodir sa takvim materijalima (npr. krv, tkivo, hirurški instrumenti i opreme, laboratorijski instrumenti i opreme, i aparati i materijali za čuvanje krvi).

Jedinjenja prikazana ovde mogu takođe da se upotrebe kao reagensi u istraživanju. Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu takođe da se upotrebe kao pozitivna kontrola valjanosti surogat testova baziranih na ćelijama, ili uin vitroiliin vivoeksperimentima replikacija.

POSTUPAK

Jedinjenja prema ovom pronalasku sintetizuju se prema opštem postupku kao što je prikazano na shemi I (gde CPG jeste karboksilna zaštitna grupa a APG je amino zaštitna grupa):

Ukratko, Pl, P2, P3, P4, a eventualno P5 i P6 mogu se povezati prema dobro poznatim tehnikama kuplovanja peptida. Pl, P2, P3, P4, i P5 i P6 grupe mogu biti povezane jedna za drugu bilo kojim redom dokle god finalno jedinjenje odgovara peptidima formule 1. Na primer, P6 može biti vezan za P5 dajući P5-P6 koji se vezuje za P4-P3-P2-P1; ili P6 može biti vezan za P5-P4-P3-P2 pa onda vezani za Pl sa odgovarajuće zaštićenim C-terminalnim.

Uglavno, peptidi se produžavuju putem deprotektovanja (uklanjanja zaštitne grupe) a-amino grupe N-terminalnog ostatka i kuplovanja neprotektovane (nezaštićene) karboksil grupe sledeće pogodono N-protektovane amino kiseline preko peptidne veze korišćenjem opisanih postupaka. Taj postupak deprotektovanja i kuplovanja ponavlja se sve dok se ne dobije željena sekvenca. Kuplovanje može da se izvede sa konstitucionim amino kiselinama, stupnjevito, kao što pokazuje shema I, ili kondenzovanjem fragmenata (dve ili više amino kiselina), ili kombinovanjem oba postupka, ili sintezom peptida u čvrstoj fazi, prema postupku koji je originalno opisao Merrifield, u J. Am. Chem. Soc, (1963), 85_, 2149 - 2154, čije se otkriće ovim uključuje kao referenca.

Kuplovanje između dveju amino kiselina, amino kiseline i peptida, ili dva peptidna fragmenta, može se izvesti upotrebom standardnih postupaka za kuplovanje, kao što je azidni postupak, postupak mešanja anhidrida karbonske-karboksilne kiseli-ne (izobutii hloroformijat), karbodiimidni (dicikloheksilkarbodiimid, diizopropil-karbodiimid, ili vodo-rastvorni karbodiimid) postupak, postupak aktivnog estra (p-nitrofenil estar, N-hidrosukcinik imido estra), K-postupak sa Woodward-ovim reagensom, karbonildiimidazolni postupak, postupci sa fosfornim reagensima ili oksidaciono-redukcioni. Neki od tih postupaka (naročito karbodiimidni postupak) mogu biti poboljšani dodavanjem 1-hidroksibenzotriazola. Ove reakcije kuplovanja mogu da se izvode ili u rastvoru (tečna faza) ili u čvrstoj fazi.

Određenije, stupanj kuplovanja obuhvata dehidrativno kuplovanje slobodnog karboksila jednog reaktanta sa slobodnom amino grupom drugog reaktanta, u prisustvu sredstva za kuplovanje, radi stvaranja vezujuće amidne veze. Opisi takvih sredstava za kuplovanje nalaze se u opštim udžbenicima peptidne hernije, na primer, M. Bodanszkv, "Peptide Chemistry", 2<nd>rev. ed., Springer-Verlag, Berlin, Nemačka (1993). Primeri pogodnih sredstava za kuplovanje jesu A^T<V->dicikloheksilkarbodiimid, 1-hidroksibenzotriazol u prisustvu A^dicikloheksilkarbo-diimida ili A<c>etil-A</->[(3-dimetilamino)-propil]karbodimida. Veoma praktično i obič-no koriščeno sredstvo za kuplovanje je komercijalno dostupni (benzotriazol-l-il-oksi)tris-(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat bilo sam ili u prisustvu 1-hidroksibenzotriazola. Drugo veoma praktično i korisno sredstvo za kuplovanje je komercijalno dostupan 2-(lH-benzotriazol-l-il)-A'; A^A<f>'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat. Još jedno veoma praktično i korisno sredstvo za kuplovanje je komercijalno dostupan 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)- N, N, N',A^'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat

Reakcija kuplovanja se izvodi u inertnom rastvaraču, npr. dihlormetanu, acetonitrilu ili dimetilformamidu. Višak tercijarnog amina, npr. diizopropiletilamin, Af-metil-morfolin iliN -metilpirolidin,dodaje se da bi se reakciona smeša održavala na pH oko 8. Temperatura reakcije obično se kreće između 0 °C i 50 °C, a reakcija traje obično između 15 min i 24 h.

Kada se koristi sintezni postupak u čvrstoj fazi, C -terminalno karboksilne kiseline se vezuje za nerastvoran nosač (obično polistiren). Takvi nerastvorni nosači sadrže grupu koja će da reaguje sa karboksilnom grupom stvarajući vezu koja je stabilna pod uslovima elongacije, ali se kasnije lako čepa. Primeri za to su: hloro- ili bromometil smola, hidroksimetil smola i aminometil smola. Mnoge od tih smola su komercijalno dostupne uvek sa ugrađenom željenom C-terminalnom amino kiselinom. Alternativno, amino kiselina može da bude ugrađena na čvrst nosač na osnovu poznatih postupaka Wang, S.-S., J. Am. Chem. Soc, (1973), 95, 1328; Atherton, E., Shepard, R.C. "Solid-phase peptide svnthesis; a practical approach" IRL Press: Oxford (1989); 131 -148. Pored prethodnih, drugi postupci sinteza peptida su opisani kod Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Svnthesis", 2<nd>ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meinhofer, Udenfriend, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1, 2, 3, 5 i 9, Academic Press, New-York, (1980-1987); Bodansky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New-York (1984), čiji se objavljeni podaci ovim unose kao referenca.

Funkcionalne grupe konstitucionih amino kiselina obično moraju biti zaštićene za vreme reakcija kuplovanja kako bi se izbegla stvaranja neželjenih veza. Zaštitne grupe koje mogu biti upotrebljene navedene su u Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) i "The Peptides: Analvsis, Svnthesis, Biologv", Vol. 3, Academic Press, New York (1981), čiji se objavljeni podaci ovim unose kao referenca.

a-karboksil grupa C-terminalnog ostatka obično se štiti kao estar (CPG) koji može biti razložen dajući karboksilnu kiselinu. Zaštitne grupe koje mogu biti upotrebljene uključuju: 1) alkilestre, kao što je metil, trimetilsililetil i r-butil; 2) aralkil estre, kao što je benzil i supstituisani benzil, ili 3) estre koji mogu biti razloženi putem blago baznog tretmana ili blagim redukcionim sredstvima, kao što su trihloroetil i fenacil estri.

a-amino grupa svake amino kiseline koja treba da se kupluje u peptidni lanac koji se produžava mora biti zaštićena (APG). Svaka zaštitna grupa poznata na osnovu stanja tehnike može da se upotrebi. Primeri takvih grupa obuhvataju: 1) acil grupe, kao formil, trifluoroaceul, ftalil, ijP-toluensulfonil; 2) aromatske karbamatne grupe kao benziloksikarbonil (Cbz ili Z) i supstituisane benziloksikarbonile, i 9-fluoren-ilmetiloksikarbonil (Fmoc); 3) alifatske karbamatne grupe, kaoterc -butiloksikar-bonil (Boe), etoksikarbonil, diizopropilmetoksikarbonil i aliloksikarbonil; 4) cik-lične alkil karbamatne grupe, kao ciklopentiloksikarbonil i adamantiloksikarbonil;

5) alkil grupe, kao trifenilmetil i benzil; 6) trialkilsilil, kao trimetilsilil; i 7) grupe koje sadrže tiol, kao feniltiokarbonil i ditiasukcinoil. Prvenstveno, a-amino zaštitne grupe jesu ili Boe ili Fmoc. Mnogi derivati amino kiselina, pogodno zaštićeni za sinteze peptida, komercijalno su dostupni.

a-amino zaštitna grupa novododatog ostatka amino kiseline, odcepljuje se pre kuplovanja sledeće amino kiseline. Kad se koristi Boe grupa, u obzir dolaze postupci sa trifluorosirćetnom kiselinom, čistom ili u dihlormetanu, ili sa HC1 u dioksanu ili u etilacetatu. Amonijumova so koja nastaje, zatim se neutrališe, ili pre kuplovanja iliin situ,sa baznim rastvorima kao što su vodeni rastvori pufera, ili tercijarni amini u dihlormetanu ili acetonitrilu ili dimetilformamidu. Kada se koristi grupa Fmoc, kao reagensi se odabiraju piperidin ili supstituisani piperidin u dimetilformamidu, ali može da se upotrebi i svaki sekundarni amin. Depro-tektovanje se izvodi na temperaturi između 0 °C i sobne temperature (RT), obično na 20-22°C.

Svaka od amino kiselina koja poseduje funkcionalnosti u bočnom lancu mora biti zaštićena za vreme pripremanja peptida korišćenjem goreopisanih grupa. Oni koji su stručnjaci u ovome znaju da izbor i upotreba odgovarajućih zaštitnih grupa za ove funkcionalnosti u bočnom lancu zavisi od amino kiseline i prisustva drugih zaš-titnih grupa u peptidu. Izbor takvih zaštitnih grupa je značajan po tome što zaštitna grupa mora biti uklonjena za vreme deprotektovanja i kuplovanja a-amino grupe.

Na primer, kada se Boe koristi kao a-amino zaštitna grupa, sledeće pogodne zaštitne grupe bočnog lanca jesu:p -toluensulfonil(tozil) delovi mogu biti uzeti za zaštitu amino bočnog lanca amino kiselina kao Lys i Arg; acetamidometil, benzil (Bn), ilit -butilsulfonildelovi mogu biti upotrebljeni za zaštitu sulfida koji sadrži bočni lanac cisteina; benzil (Bn) etri mogu biti upotrebljeni za zaštitu bočnih lanaca koji sadrše hidroksi grupe, serina, treonina ili hidroksiprolina; a benzil estri mogu biti upotrebljeni za zaštitu bočnih lanaca koji sadrše karboksi grupe, asparaginske kiseline i glutaminske kiseline.

Kada se Fmoc izabere za a-amin zaštitu, obično su prihvatljive zažtitne grupe na baziterc -butila.Na primer, Boe može da bude upotrebljen za lizin i arginin,terc--butil etar za serin, treonin i hidroksiprolin, aterc-butil estar za asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Trifenilmetil CTritil) deo može da se upotrebi za zaštitu bočnog lanca koji sadrži sulfid, cisteina.

Kada W jeste amid (w), Pl se kupluje sa pogodnim aminom pre kuplovanja

sa P2. Takvu reakciju aminacije stručnjaci lako mogu da prepoznaju.

Kada je jednom produžavanje (elongacija) peptida završeno sve zaštitne grupe se uklanjaju. Kada se sinteza radi u tečnoj fazi, zaštitne grupe se uklanjaju na bilo koji način koji je određen izborom zaštitnih grupa. Ti postupci su stručnjacima dobro poznati.

Kada se sinteza izvodi sa čvrstom fazom, peptid se uklanja sa smole jednovremeno sa uklanjanjem zaštitnih grupa. Kada je u sintezi upotrebljen zaštitni Boe postupak, postupak koji ima prednost za odvajanje peptida sa smole je tretman sa anhidrovanom HF koja sadrži aditive kao što su dimetilsulfid, anizol, tioanizol, ilip-krezol, na 0 °C. Odvajanje peptida može da se izvede takođe pomoću drugih kiselih reagenasa kao što su smeše trifluorometansulfonske kiseline/triflu-orosirćetne kiseline. Ako se koristi Fmoc zaštitni postupak, N-terminalna grupa Fmoc-a se odvaja sa reagensima prethodno opisanim. Druge zaštitne grupe i peptidi se odvajaju sa smole upotrebom rastvora trifluorosirćetne kiseline i različitih aditiva, kao anizol itd.

Sinteza čeone (završne) Grupe B i delova P6, P5, P4 i P3

Za zaštitu P4, P5 ili P6 ili bilo kog peptidnog segmenta sa pogodnim acil hloridom ili sulfonil hloridom, koji je ili komercijalno dostupan ili za koji je sinteza dobro poznata na osnovu stanja tehnike, uvode se različite čeone grupe B.

Različiti P6 do P3 delovi komercijalno su dostupni ili je sinteza dobro poznata na osnovu stanja tehnike.

1. Sinteza P2 delova.

1. 1 Sinteza prekurzora:

A) Sinteza derivata halogenoarilmetana:

Pripremanje halogenometil-8-hinolina Ud izvedeno je prema postupku KN. Campbell et al., J. Amer. Chem. Soc, (1946), 68,1844.

Ukratko, 8-hinolin karboksilna kiselina Ha prevedena je u odgovarajući alkohol IIc putem redukovanja odgovarajućeg acilhalogenida Ilb sa redukcionim sredstvom kao Utijum-aluminijum-hidrid. Tretiranje alkohola Ilb sa pogodnom hidrohalogeno kiselinom daje željeni halogeni derivat Ud. Specifičan način izvođenja tog postupka prikazan je u primeru 1A

B) Sinteza derivata aril alkohola:

Derivati 2-fenil-4-hidroksihinolina IIIc pripremljeni su prema Giardina et al., Q. Med. Chem., (1997), 40,1794-1807).

R22& R2ib= alkil, OH, SH, halogeno, NH2, N02.

Benzoilacetamid (Hla) kondenzovan je sa pogodnim anilinom (IHb) pa je dobijeni imin ciklizovan sa polifosfornom kiselinom dajući odgovarajući 2-fenil-4-hidroksihi-nolin (IIIc). Specifičan način izvođenja tog postupka prikazanje u primeru 1B i 1C.

1. 2 Sinteza P2:

A) Sinteza 4-supstituisanog prolina (gde je R<2>vezan za prsten preko atoma ugljenika) (sa stereohemijom kao što je pokazano): izvedena je kao što prikazuje shema IV na osnovu postupka opisanog od strane J. Ezquerra et al., (Tetrahedron, (1993), 38,8665 - 8678) i C. Peđregal et al. fTetrahedon Lett (1994), 35,2053 - 2056).

Ukratko, Boc-piroglutaminska kiselina je zaštićena kao benzil estar. Tretman sa jakom bazom, kao litijum-diizopropilamid, pa posle toga adicija sredstva za alkilovanje (Br-R<20>ili I-R<20>) daje željena jedinjenja IVe posle redukcije amida i deprotektovanja estra.

B) Sinteza 0-aralkilovanog-4-(2?)-hidroksiprolina:

Kada R<20>jeste aril, Het, aralkil, ili (niži alkil)-Het, postupak može da se izvede prema postupku koju su opisali E.M. Smith et al. 0. Med. Chem. (1988), 31, 875 - 885). Ukratko, komercijalno dostupan Boc-4-#^-hidroksiprolin tretiranje sa bazom kao što je natrijum-hidrid ili K-ć-BuO pa je dobijeni alkoksid reagovao sa halogeno-R20 (Br-R<20>, I-R20 , itd.) dajući željena jedinjenja. Specifični načini izvođenja tog postupka prikazani su u primerima 2,3 i 4B.

C) Alternativno, kada R<20>jeste aril ili Het, jedinjenja mogu takođe da se pripreme putem Mitsunobu-ove reakcije (Mitsunobu (1981), Svnthesis, januar. 1 - 28; Ranoetal.,(1995), Tet Lett 36( 22). 3779 - 3792; Krchnaketal.,(1995), Tet Lett 36( 5), 6193 - 6196; Richteretal.,(1994), Tet. Lett. 35( 27). 4705 - 4706). Ukratko, komercijalno dostupan Boc-4- fS>hidroksiprolin metilestar tretiran je sa pogodnim aril alkoholom ili tiolom, u prisustvu trifenilfosfina i dietilazodikarboksilata (DEAD) pa je dobijeni estar hidrolizovan u kiselinu. Specifičan način izvođenja tog postupka prikazan je u primer 4A.

Alternativno, Mitsunobu reakcija može da se izvede na čvrstoj fazi (shema V). U ploču sa 96 udubljenja, sintesajzer Model 396 (Advanced ChemTech), uneti su alikvoti jedinjenja (Va) vezanog za smolu, pa su dodati različiti aril alkoholi ili tioli i odgovarajući reagensi. Posle inkubacije, svaki proizvod (Vb) vezan za smolu je opran, osušen i odvojen od smole.

Suzuki reakcija (Mivauraetal.,(1981), Synth. Comm. U, 513; Satoetal.,

(1989), Chem. Lett., 1405; VVatanabeetal.,(1992), Svnlett, 207;Takayuki

etal.,(1993), J. Org. Chem. 58,2201; Frenetteetal,(1994),Tet. Lett. 35( 49). 9177 - 9180; Guilesetal.,(1996), J. Org. Chem. 61,5169 -5171) može takođe da se primeni za dalje funkcionalizovanje aril supstituenta.

2. Sinteza Pl delova (2-supstituisane 1-aminociklopropil-karboksilne kiseline)

Sinteza je izvedena prema shemi VI.

a) Ukratko, di-protektovan malonat Via i 1,2-dihalogenoalkan VIb ili ciklični sulfat Vic (sintetizovano prema K. Burgess i Chun-Yen KE (Svnthesis, (1996), 1463 -

1467), reagovali su pod baznim uslovima dajući diestar Vid.

b) Regioselektivnom hidrolizom manje zaklonjenog estra dobijena je kiselina Vle. c) Ta kiselina Vic je podvrgnuta pregrupisavanju po Curtius-u dajući racemsku

smešu derivata 1-aminociklopropil-karboksilne kiseline Vlf sa R<1>usynpoložaju u

odnosu na karboksilnu grupu. Specifičan način izvođenja te sinteze prikazan je u primeru 5.

d, e) Alternativno, selektivno stvaranje estra od kiselline Vle, sa pogodnim

halogenidom (P<*>C1) ili alkoholom (P<*>OH), daje diestar Vlg u kome je P'estar kom-patibilan sa selektivnom hidrolizom P estra. Hidroliza P estra daje kiselinu VIh.

f) Pregrupisavanje VIh, po Curtius-u, daje racemsku smešu derivata 1-aminociklopropil-karboksilne kiseline Vli sa R<1>grupom uantipoložaju u odnosu na

karboksilnu grupu. Specifičan način izvođenja te sinteze prikazan je u primeru 10.

Alternativna sinteza za pripremanje derivata VHf (kada R<i>jeste vinil, a nalazi se usynpoložaju prema karboksil grupi) opisana je u narednom tekstu.

Tretman komercijalno dostupnih imina Vila sa 1,4-dihalogenobutenom VHb u prisustvu baze, posle hidrolize dobijenog imina VIIc, daje VHd sa alil supstitu-entom usynpoložaju u odnosu na karboksilnu grupu. Ovaj postupak prikazan je u primeru 11.

Razdvajanje svih gornjih enantiomernih smeša ugljenika 1 (Vle i VHd) može da se izvede putem: 1) enzimskog razdvajanja (primeri 9 i 13);

2) kristalizacije sa hiralnom kiselinom (primer 14); ili

3) pripremanja hemijskog derivata (primer 6).

Posle razdvajanja, određivanje apsolutne stereohemijske strukture može da se izvede kao što je prikazano u primeru 7.

Razdvajanje enantiomera i određivanje stereohemijske strukture može da se izvede na isti način sa enantiomernim smešama ugljenika 1 kada je supstituent na C2 uanti položajuu odnosu na karboksilnu grupu (Vli).

Prema tome, pronalazak dalje obuhvata postupak za pripremanje

peptidnog analoga formule (I) u kojoj Pl jeste ostatak supstituisane aminociklopropil-karboksilne kiseline koji se sastoji od stupnja: kuplovanja peptida odabranog iz grupe koju čine: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4--P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; i APG-P2;

sa Pl intermedijerom formule:

u kojoj Rijeste Ci.6alkil ili Cz-g alkenil eventualno supstituisani sa halogenom, CPG je zaštitna grupa karboksila, APG je zaštitna grupa amino radikala, a P6 do P2 su definisani kao gore.

Na kraju, pronalazak takođe obuhvata upotrebu intermedijera formule:

u kojoj Ri jeste Ci^alkil ili C2.6alkenil eventualno supstituisani sa halogenom, za pripremanje jedinjenja formule I, kao što je gore definisano.

PRIMERI

Ovaj pronalazak je ilustrovan podrobnije sledećim primerima kojima se pronalazak ne ograničava.

Temperature su date u stepenima po Celzijusu. Procentni rastvori daju odnos mase prema zapremini, a odnosi rastvora izražavaju odnos zapremine prema zapremini, ukoliko nije drukčije dato. Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) snimani su na spektrometru Bruker 400 MHz; hemijska pomeranja (8) data su u delovima na 1 milion. Fleš hromatografija je rađena na silikagelu (Si02) prema postupku Still fleš hromatografske tehnike (W.C. Still at al., J. Org. Chem., (1978), 43,2923).

Skraćenice upotrebljene u primerima obuhvataju: Bn: benzil; Boe:terc-butiloksi-karbonil

{Me3COC(0)}; BSA: goveđi serumski albumin; CHAPS: 3-[(3-holamido-propil)-dimetilamonio]-l-propaiisulfonat; DBU: l,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-en; CH2C12= DCM: metilenhiorid; DEAD: dietilazodikarboksilat; DIAD: diizopropil-azodikarboksilat; DIPEA: dizipropiletilamin; DMAP: dimetilaminopiridin; DCC: 1,3--dicikloheksilkarbodiimid; DME: 1,2-dimetiloksietan; DMF: dimetilformamid; DMSO: dimetilsulfoksid; DTT: ditiotreitol ili treo-l,4-dimerkapto-2,3-butandiol; DPPA: difenilfosforil azid; EDTA: etilendiamintetrasirćetna kiselina; Et etil; EtOH: etanol; EtOAc: etilacetat; Et20: dietiletar; HATU: [0-7-azabenzotriazol-l-il)-l,l,3,3--tetrametiluronijum heksafluorofosfat]; HPLC: tečna hromatografija pod visokim pritiskom; MS: masena spektrometrija (MALDI-TOF: Matrbc Assisted Laser Disorption Ionization-Time od Flight, FAB: bombardovanje brzim atomima); LAH: litijum-aluminjum-hidrid; Me: metil; MeOH: metanol; MES: (2-{N-morfolino}etan-sulfonska kiselina); NaHMDS: natrijum bis(trimetilsilil)-amid; NMM: N-metil-morfolin; NMP: N-metilpirolidin; Pr: propil: Suce: 3-karboksipropanoil; PNA: 4-nit-rofenilamino ili p-nitroanilin; TBAF: tetra-n-butilamonijum-fluorid; TBTU: 2(1H--benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborat; TCEP: tris(2-karbok-sietil)fosfin hidrohlorid; TFA: trifluorosirćetna kiselina; THF: tetrahidrofuran; TIS: triizopropilsilan; TLC: tankoslojna hromatografija; TMSE: trimetilsililetil; Tris/HCl: tris(hidroksimetil) aminometan hidrohlorid.

P2 BLOKOVI ZA IZGRADNJU

PRIMER 1A

Sinteza bromometil-8-hinolina (1A):

U komercijalno dostupnu 8-hinolin-karboksilnu kiselinu (2,5 g, 14,4 mmol) dodat je čist tionilhlorid (10 ml, 144 mmol). Ova smeša je zagrevana 1 h na 80 °C, pre nego što je pod smanjenim pritiskom oddestilisan višak tionilhlorida. U dobijenu braonkastu čvrstu supstancu dodat je apsolutni EtOH (15 ml) pa je pre koncentrovanjain vacuo1 h zagrevano na 80 °C. Ostatak je razdeljen između EtOAc i za-sićenog vodenog rastvora NaHCOs, pa je organska faza osušena

(MgS04), profiltrirana i uparena dajući braonkasto ulje (2,8 g). Taj raeterijal (ca. 14,4 mmol) je 35 min dokapavan u suspenziju LAH (0,76 g, 20,2 mmol)/Et20, ohlađenu na -60 °C. Reakciona smeša je polako, tokom 1,5 h, zagrevana na -35 °C sve dok reakcija nije bila završena. Reakcija je polako, tokom 30 min, prekidana sa MgSO4.10H2O a zatim sa vlažnim THF. Smeša je razdeljena između Et20 i 10% vodenog rastvora NaHC03. Organska faza je osušena (MgS04), profiltrirana i koncentrovana dajući žućkastu čvrstu supstancu (2,31 g, 80% u 2 stupnja), odgo-varajućeg alkohola. Alkohol (2,3 g, 11,41 mmol) je rastvoren u AcOH/HBr (20 ml, 30% Aldrich-ov rastvor) pa je zagrevano 2,5 h na 70 °C. Smeša je do suva koncentrovanain vacuo,razdeljena između EtOAc (100 ml) i zasićenog vodenog rastvora NaHCOs, pre sušenja (MgS04), profiltrirana je dajući željeno jedinjenje (1A) kao braonkastu čvrstu supstancu (2,54 g, 100%).

PRIMER 1B

Sinteza 2-fenil-4-hidroksihinolina (1B):

Komercijalno dostupan etil benzoilacetat (6,00 g, 31,2 mmol) zagrevan je 2 h, na 85 °C (zatopljena epruveta) u 75 ml 30% NH4OH. Čvrsta supstanca, nastala posle hlađenja, proceđena je pa je 2 sata refluksovana u vodi. Rastvor je triput ekstrahovan sa CH2C12. Organski slojevi su sjedinjeni, osušeni preko MgS04, profiltrirani i upareni. Žuti ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silikagelu, eluiranjem sa EtOAc : heksan (3:7), pa je dobijen odgovarajući amid kao čvrsta bela supstanca, 1,60 g, prinos 31%.

Ovaj amid (250 mg, 1,53 mmol) je 16 h refluksovan u aparaturi po Dean-Stark-u, sa anilinom (143 mg, 1,53 mmol) i anilin-HCl (10 mg, 0,08 mmol) u toluenu (10 ml). Rastvor je uparen dajući braon ulje koje je pomešano sa polifosfornom kiselinom (2 g) pa je 20 min zagrevano na 135 °C. Reakciona smeša je izlivena u vodu i sa 5M NaOH podešeno je pH 8. Vodena suspenzija je dvaput ekstrahovana sa etilacetatom. Organski slojevi su sjedinjeni, oprano je sa rastvorom soli, osušeno preko MgS04, profiltrirano i upareno. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silikagelu, eluiranjem sa 3% MeOH u etilacetatu, pa je dobijen

2-fenil-4-hidroksihinolin (1B), 67 mg, prinos 20%.

<*>H NMR (DMSO-dg) 6 8,11 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7,86 - 7,83 (m, 2 H), 7,77 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,68 (dd, J = 8,7 Hz, IH), 7,61 - 7,58 (m, 3 H), 7,35 (dd, J = 8, 7 Hz, 1 H), 6,34 (s, IH).

PRIMER 1C

Sinteza 4-hidroksi-2-fenil-7-metoksihinolina (1C)

4-hidroksi-2-fenil-7-metoksihinolin (e):

Rastvor etilbenzoilacetata (b) (100,0 g, 0,52 mol), m-anizidina (a) (128,1 g, 1,04 mol) i 4M HCl/dioksan (5,2 ml) u toluenu (1,0 lit) refluksovan je6,25 hu aparaturi po Dean-Stark-u. Ohlađen toluenski rastvor je, jedno za drugim, pran sa 10% vodenim rastvorom HC1 (2 x 300 ml), IM NaOH (2 x 300 ml), H20 (300 ml) i rastvorom soli (150 ml). Toluenska faza je osušena (MgSO^, profiltrirana pa koncentrovana pod smanjenim pritiskom, dajući 1,2 :1,0 smešu estra c i amida d (144,6 g, sirov prinos 45%/38%) kao tamno braon ulja. Sirovo ulje je zagrevano 80 min na 280 °C dok je destilisao stvoreni EtOH. Hlađenjem, dobijena tamna čvrsta supstanca je rastrljana sa CH2CI2(200 ml). Suspenzija je profiltrirana a dobijena čvrsta supstanca je oprana sa CH2Cl2dajući e (22,6 g, 17% od a) kao čvrstu supstancu bež boje:<*>H NMR (DMSO-dg) 5 8,00 (d, J = 9,0 Hz, IH), 7,81 - 7,82 (m, 2H), 7,57 - 7,59 (m, 3H), 7,20 (d, J = 2,2 Hz, IH), 6,94 (dd, J = 9,0, 2,2 Hz, IH), 6,26 (s, IH), 3,87 (s, 3H).

4-hloro-2-fenil-7-metoksihinolin (1C):

Suspenzija supstance e (8,31 g, 33,1 mmol) u POCl3(90 ml) zagrevana je 2 h uz refluks (posle zagrevanja dobijen je bistar rastvor). Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Ostatak je razdeljen između IM NaOH (egzotermno, 10 M NaOH dodavan radi održavanja velikog pH) i EtAOc (500 ml). Organski sloj je opran sa H20 (100 ml) i rastvorom soli (100 ml) pa je osušen (MgS04), profiltriran i koncentrovan pod smanjenim pritiskom dajući 1C (8,60 g, 96%), kao bledožutu čvrstu supstancu:<1>H NMR (DMSO-de) 6 8,28 - 8,30 (m, 2H), 8,20 (s, IH), 8,10 (d, J = 9,1 Hz, IH), 7,54 - 7,58 (m, 3H), 7,52 (d, J = 2,5 Hz, IH), 7,38 (dd, J = 9,1, 2,5 Hz, IH), 3,98 (s, 3H). Reakcija je ponovljena triput i uvek je dobijan prinos 96 - 98%, što je znatno više od prinosa od 68% koji je dat u J. Med. Chem. 1997,40,1794.

PRIMER 2

Sinteza Boc-4-(3?>(naftalen-l-ilmetoksi) prolina (2):

Komercijalno dostupan Boc-4 ^-hidroksiprolin (5,00 g, 21,6 mmol) rastvoren je u THF (100 ml) i ohlađen na 0 °C. Natrijum-hidrid (60% disperzija u ulju, 1,85 g, 45,4 mmol) dodavan je u porcijama tokom 10 minuta pa je suspenzija mešana 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat l-(bromomeitl)naftalen (8,00 g, 36,2 mmol)

(pripremljen kao što su opisali E A Dixon et al., Can. J. Chem., (1981), 59, 2629 - 2641) pa je smeša grejana 18 h uz refluks. Smeša je izlivena u vodu (300 ml) i oprana heksanom. Vodeni sloj je zakiseljen sa 10% vodenim rastvorom HC1 pa je dvaput ekstrahovan etilacetatom. Organski slojevi su sjedinjeni, oprano je sa rastvorom soli, osušeno (MgS04), profiltrirano i koncentrovano. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (49 : 49 : 2, heksan : etilacetat: sirćetna kiselina), dajući jedinjenje navedeno u naslovu kao bezbojno ulje (4,51 g, prinos 56%).<!>H NMR (DMSO-de) ukazuje na prisustvo dva rotamera: 5 8,05 (m, IH), 7,94 (m, IH), 7,29 (d, J = 14 Hz, IH), 7,55 - 7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (br. s, IH), 4,12 (dd, J = 8 Hz, IH), 3,54 - 3,42 (m, 2H), 2,45 - 2,34 (m, IH), 2,07 - 1,98 (m, IH), 1,36 (s, (3/9) 9H),1,34 (s, (6/9) 9H).

PRIMER 3

Sinteza Boc-4- #?>(8-hinolin-metoksi) prolina (3):

U suspenziju NaH (1,4 g, 60% u ulju, 34 mmol) u THF (100 ml), dodat je Boc-4<??> -hidroksiprolin (1,96 g, 8,5 mmol) u anhidrovanom THF (20 ml). Smeša je mešana 30 min pre nego što je dodat bromometil-8-hinolin, iz primera 1A (2,54 g, 11,44 mmol), u THF (30 ml). Reakciona smeša je grejana na 70 °C (5 h) pre nego što je višak NaH pažljivo razložen sa vlažnim THF. Reakciona smeša je koncentrovanain vacuoa dobijeni materijal je rastvoren u EtOAc i H2O. Bazna vodena faza je odvojena i zakiseljena sa 10% vodenim rastvorom HC1 do pH~5, pre ekstrahovanja sa EtAOc (150 ml). Organska faza je osušena (MgS04), profiltrirana i koncentrovana dajući braon ulje. Prečišćavanjem pomoću fleš hromatografije (eluent: 10% MeOH/CHCl3) dobijeno je željeno jedinjenje kao bledožuta čvrsta supstanca (2,73 g, 86%). HPLC (97,5%);<*>H-NMR (DMSO-de) pokazuje dve rotamerske grupacije u odnosu 6 : 4, 5 12 -11,4 (bs, IH), 8,92 (2 x d, J = 4,14 i 4,14 Hz, IH), 8,38 (2 x d, J = 8,27 i 8,27 Hz, IH), 7,91 (d, J = 7,94 Hz, IH), 7,77 (d, J = 7,0 Hz, IH), 7,63 - 7,54 (m, 2H), 5,14 (2 x s, 2H), 4,32 - 4,29 (m, IH), 4,14 - 4,07 (m, IH), 3,52 - 3,44 (m, 2H), 2,43- 2,27 (m, IH), 2,13 - 2,04 (m, IH), 1,36i 1,34 (2xs, 9H).

PRIMER 4A

Pripremanje Boc-4- <^>(7-hlorohinolin-4-okso) prolina (4A):

Komercijalno dostupan metilestar Boc-4 (S>hidroksiprolina (500 mg, 2,04 mmol) i 7-hloro-4-hidroksihinolin (440 mg, 2,45 mmol) uneti su u suvi THF (10 ml), na 0 °C. Dodat je trifenilfosfin (641 mg, 2,95 mmol) a zatim polako DIAD (426 mg, 2,45 mmol). Smeša je mešana 20 h na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša koncentrovana, prebačena u etilacetat pa je triput ekstrahovana sa IM HC1. Vodena faza je zaalkalisana sa Na2C03pa je dvaput ekstrahovana etilacetatom. Organski slojevi su sjedinjeni, osušeni preko MgS04, profiltrirano je, pa koncentrovano i dobijeno je žuto ulje. Ulje je prečišćeno fleš hromatografijom i dobijeno je jedinjenje 4A, metilestar, kao čvrsta bela supstanca, 498 mg, prinos 58%.

Metilestar (400 mg, 0,986 mmol) je hidrolizovan sa IM vodenim rastvorom natrijum-hidroksida (1,7 ml, 1,7 mmol) u metanolu (4 ml), 3 h na 0 °C. Rastvor je koncentrovan radi uklanjanja metanola pa je neutralisan sa IM vodenim rastvorom HC1. Suspenzija je uparena do suva i prebačena u metanol (20 ml), soli su odfiltrirane a filtrat je uparen dajući željeno jedinjenje 4A, kao čvrstu belu supstancu, 387 mg, prinos kvantitativan.

<*>H NMR (DMSO-d6) (smeša rotamera ca. 1:1) 8 8,74 (d, J = 5 Hz, IH), 8,13 - 8,09 (m, IH), 7,99 i 7,98 (s, IH), 7,58 (d, J - 9 Hz, IH), 7,02 (d, J = 5 Hz, IH), 5,26 - 5,20 (m, IH), 4,10- 4,01 (m, IH), 3,81 - 3,72 (m, IH), 3,59 (dd, J = 12,10 Hz, IH), 2,41 - 2,31 (m,2H),l,34il,31 (s, 9H).

PRIMER 4B

Sinteza Boc-4 (2?>(2-fenil-7-metoksihinolin-4-okso)prolina (4B):

l-[(1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4(R)-[(7-metoksi-2-fenil-4-hinolin)oksi]-L-prolin (4B): Tokom 15 min, u malim porcijama je dodavan kalijum-terc-butoksid (8,16 g, 72,7 mmol) u rastvor komercijalno dostupnog 4- (S>hidroksiprolina (6,73 g, 29,1 mmol)

u DMSO (83 ml), održavan na 25 °C. Na 25 °C smeša je mešana 1,5 h. Hloro-2-fenil--7-metoksihinolin 1C (8,61 g, 32,0 mmol) dodavan je, u reakcionu smešu, u 4 porcije tokom 15 min. Reakciona smeša je mešana 19 h na 25 °C. Dobijena suspenzija je izlivena u H2O (650 ml) pa je smeša oprana sa Et20 (3 x 150 ml) radi uklanjanja viška hlorohinolina (kasnije je utvrđeno daje EtOAc mnogo efikasniji). Vodeni sloj je zakiseljen sa IM HC1 (38 ml od izračunato potrebnog 1,5 ekviva-lenta, 43,6 ml) do pH 4 - 5. Čvrsta bela supstanca koja se taloži sakupljena je filtriranjem. Vlažna čvrsta supstanca osušena je pod smanjenim pritiskom preko P205pa je dobijen derivat prolina 4B (12,6 g, 91%, sadrži 2,3% (mas./mas.) DMSO) kao čvrste bež supstance:<l>H NMR (DMSO-dg) 5 (smeša rotamera 2 : 1) 8,27 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 8,00, 7,98 (2d, J = 9,2, -9,2 Hz, IH), 7,48 - 7,56 (m, 3H), 7,45, 7,43 (2s, IH), 7,39 (d, J = 2,5 Hz, IH), 7,17 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, IH), 5,53 - 5,59 (m, IH), 4,34 - 4,41 (m, IH), 3,93 (s, 3H), 3,76 (širok s, 2H), 2,63 - 2,73 (m, IH), 2,32 -2,43 (m, IH), 1,36,1,33 (2s, 9H).

P1 GRADIVNI BLOKOVI

PRIMER 5

Sinteza smeše( 1R, 2R)/( 1S, 2R)1 -amino-2-etilciklopropil-karboksilne kiseli-ne

a) U suspenziju benziltrietilaminijum-hlorida (21,0 g, 92,19 mmol) u 50% vođenom rastvoru NaOH (92,4 g u 185 ml H20), jedno za drugim, dodati su di-fe/r-butil--malonat (20,0 g, 92,47 mmol) i 1,2-dibrombutan (30,0 g, 138,93 mmol). Reakciona smeša je snažno mešana tokom noći na sobnoj temperaturi, pa je dodata smeša leda i vode. Sirovi proizvod je ekstrahovan sa CH2C12(3x), pa jedno za drugim, opran je vodom (3x) i rastvorom soli. Organski sloj je osušen (MgS04), profiltriran pa koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (7 cm, 2 do 4% Et20 u heksanu), dajući željeni derivat ciklopropana 5c (19,1 g, 70,7 mmol, prinos 76%).<*>H NMR (CDCI3) 5 1,78 - 1,70 (m, IH), 1,47 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,44 -1,39 (m, IH), 1,26 -1,64 (m, 3H), 1,02 (t, 3H, J = 7,6 Hz).

b) U suspenziju kalijum-te/r-butoksida (6,71 g, 59,79 mmol, 4,4 ekv.) u suvom etru (100 ml), na 0 °C dodata je H20 (270 ul, 15,00 mmol, 1,1 ekv.). Posle 5 min, u

suspenziju je dodat diestar 5c (3,675 g, 13,59 mmol) u etru (10 ml). Reakciona smeša je tokom noći mešana na sobnoj temperaturi, zatim je izlivena u smešu leda i vode pa je oprana etrom (3x). Vodeni sloj je zakiseljen sa 10% aq. rastvorom limunske kiseline, na 0 °C pa je ekstrahovan sa AcOEt (3x). Sjedinjeni organski slojevi su, jedno za drugim, oprani vodom (2x) i vodenim rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (Na2S04, filtriranje, koncentrovanje), željena kiselina 5d je izolovana kao bledožuto ulje (1,86 g, 8,68 mmol, prinos 64%).<*>H NMR (CDC13) 5 2,09 - 2,01 (m, IH), 1,98 (dd, J = 3,8, 9,2 Hz, IH), 1,81 -1,70 (m, IH), 1,66 (dd, J = 3,0, J = 8,2 Hz, IH), 1,63 -1,56 (m, IH), 1,51 (s, 9H), 1,0 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

c) U kiselinu 5d (2,017 g, 9,414 mmol) u suvom benzenu (32 ml), jedno za drugim, su dodati Et3N (1,50 ml, 10,76 mmol, 1,14 ekv.) i DPPA (2,20 ml, 10,21 mmol, 1,08

ekv.). Reakciona smeša je refluksovana 3,5 h pa je dodat 2-trimetilsililetanol (2,70 ml, 18,84 mmol, 2,0 ekv.). Refluks je održavan tokom noći, zatim je reakciona smeša razblažena sa Et20 pa je, jedno za drugim, prana sa 10% vod. rastvorom limunske kiseline, vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, vodom (2x) i vodenim rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgS04, filtriranje, koncentrovanje) ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (5 cm, 10% AcOEt - heksan) dajući željeni karbamat 5e (2,60 g, 7,88 mmol, prinos 84%) kao bledožuto ulje. MS (FAB) 330 (MH<+>);<*>H NMR (CDC13) 5 5,1 (bs, IH), 4,18 - 4,13 (m, 2H), 1,68-1,38 (m, 4H) 1,45 (s, 9H), 1,24-1,18 (m, IH), 1,00-0,96 (m, 5H), 0,03 (s, 9H).

d) U karbamat 5e (258 mg, 0,783 mmol) dodat je 1,0M rastvor TBAF u THF (940 pl, 0,94 mmol, 1,2 ekv.). Posle 4,5 h dodata je dodatna količina 1,0M rastvora

TBAF (626 p.1, 0,63 mmol, 0,8 ekv.). Reakciona smeša je mešan tokom noći na sobnoj temperaturi, refluksovano je 30 min, pa je razblaženo sa AcOEt Rastvor je, jedno za drugim, opran vodom (2x) i rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgS04, filtriranje i koncentrovanje) izolovan je željeni amin 5f (84 mg, 0,453 mmol, prinos 58%), kao bledožuta točnost<*>H NMR (CDCI3) 5 1,96 (bs, 2H), 1,60 - 1,40 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 1,31 -1,20 (m, IH), 1,14 (dd, J = 4,1, 7,3 Hz, IH), 1,02 (dd, J = 4,1, 9,2 Hz, IH), 0,94 (t,J = 7,3 Hz, 3H).

PRIMER 6

Hemijsko razdvajanje £butil- ( 1R,2R)/( 1S, 2R)l-ammo-2-etilciklopropil--karboksilata (iz primera 5):

Jedinjenje 5e, iz primera 5 (8,50 g, 25,86 mmol) tretirano je sa IM TBAF/THF (26 ml), uz refluks 45 min. Ohlađena reakciona smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa vođom (3x) i rastvorom soli (lx), zatim osušena (MgSO^, profiltrirana i uparena dajući slobodni amin, kao svetložuto ulje. Slobodni amin je rastvoren u anhidrovanom CH2CI2(120 ml), pa su, jedno za drugim, dodati NMM (8,5 ml, 77,57 mmol), jedinjenje 2 (primer 2) (10,08 g, 27,15 mmol) i HATU (11,79 g, 31,03 mmol). Reakciona smeša je tokom noći mešana na sobnoj temperaturi, pa je dalja obrada izvedena kao što je prethodno opisano. Sirova dijastereomerna smeša je razdvojena pomoću fleš hromatografije (eluent - heksan : Et20; 25 : 75), dajući dipeptid 6a (manje polaran eluirani deo) kao belu penu (4,42 g; 64 teor.%) i 6b (polarniji eluirani deo) kao penu boje slonovače (4,5 g, 57 teor.%). U tom trenutku su oba izomera bila razdvojena ali apsolutna stereohemijska struktura još nije bila poznata.

PRIMER 7

Određivanje apsolutne stereohemijske strukture jedinjenja 6a i 6b, putem korelacije sa poznatim t-butil (lR-amino-2R-etilciklopropil-karboksilatom

Prof. A. Charette, sa Univerziteta u Montrealu, dobio je jedinjenje 7a sa apsolutnom stereohemijskom strukturom kao što je prikazano, koja je određena pomoću rendgenske kristalografijeQ.Am. Chem. Soc., 1995, 117, 12721). Jedinjenje 7a (13,2 mg, 0,046 mmol) rastvoreno je u IM HCl/EtOAc (240 pl) pa je mešano približno 48 sati. Smeša je uparena do suva dajući jedinjenje 7b, kao svetložutu pastu, pa je ono kuplovano sa jedinjenjem 2 (18 mg, 0,049 mmol) kao što je opisano u primeru 6, upotrebom NMM (20,3 pl, 0,185 mmol) i HATU (21,1 mg, 0,056 mmol) u CH2Cl2- Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom (eluent - heksan : Et20; 50 : 50) dajući dipeptid 7c, kao ulje (7,7 mg; 31%). Upoređivanjem pomoću TLC, HPLC i NMR, nađeno je da je dipeptid 7c identičan sa manje polarnim jedinjenjem 6a, dobijenim u primeru 6, identifikujući tako apsolutnu stereohemijsku strukturu jedinjenja 6a kao( 1R, 2R).

PRIMER 8

Pripremanje( lRt 2R)/( 1S,^)-l-Boc-amino-2-etilciklopropil-karboksilne kiseline (8a):

Karbamat 5e iz primera 5 (2,6 g, 7,88 mmol) mešan je 40 rnin u TFA, na 0 °C. Smeša je zatim koncentrovana pa razblažena sa THF (10 ml). Dodat je vodeni rastvor NaOH (700 mg, 17,5 mmol u 8,8 ml H20) pa zatim rastvor (Boc)20 (2,06 g, 9,44 mmol, 1,2 ekv.) u THF (13 ml). Reakciona smeša je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi (pH je održavan na 8 dodavanjem 10% vodenog rastvora NaOH, kada je bilo potrebno), onda je razblaženo sa H20, oprano sa Et20 (3x) pa je na 0 °C zakiseljeno sa 10% aq. rastvorom limunske kiseline. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc (3x) pa je, jedno za drugim, pran sa H20 (2x) i vodenim rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgSO,*, filtriranja i koncentrovanja), izolovana je željena amino kiselina zaštićena sa Boe (8a) (788 mg, 3,44 mmol, prinos 44%).<*>H NMR (CDC13) 6 5,18 (bs, IH), 1,64 - 1,58 (m, 2H), 1,55 - 1,42 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,32 -1,25 (m, IH), 0,99 (t, 3H, J = 7,3 Hz).

Pripremanje metilestra( 1R, 2R)/( 1S,^-l-Boc-arnino-2-etilciklopropil-karboksilne kiseline (8b):

Boe derivat 8a (0,30 g, 1,31 mmol) rastvoren je u Et20 (10 ml) pa je tretiran sa sveže pripremljenim diazometanom u Et20, na 0 °C, sve dok je bilo žute boje od neznatnog viška diazometana. Posle mešanja 20 min na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je uparena do suva dajući 8b kao bistro bezbojno ulje (0,32 g, 100%).<*>H NMR (CDC13) 5 5,1 (bs, IH), 3,71 (s, 3H), 1,62 - 1,57 (m, 2H), 1,55 (s, 9H), 1,53 -1,43 (m, IH), 1,28 -1,21 (m, 2H), 0,95 (t, J - 7,3 Hz, 3H).

PRIMER 9

Enzimsko razdvajanje metil( 1R, 2R)/( 1S, 2R)Boc-l-amino-2-etilciklopropil--karboksilata:

a) Enantiomerna smeša metilestra( lSr 2R)/( lRf 2R)l-Boc-amino-2-etilkarboksil-ne kiseline iz primera 8 (0,31 g, 1,27 mmol) rastvorena je u acetonu (3 ml) pa je

onda uz brzo mešanje razblaženo vodom (7 ml). Sa 0,05M vodenim rastvorom NaOH podešeno je pH rastvora na 7,5 pre nego što je dodata Alcalase<®>[2,4L ekstrakt od Novo Nordisk Industrials] (300 mg). Za vreme inkubacije pH je stabilizo-vano pomoću NaOH a pH-metar je priključen da prati dodavanje rastvora NaOH. Posle 40 h smeša je razblažena sa EtOAc i H20 (sa 5 ml zas. NaHC03) pa su faze razdvojene. Vodena faza je zakiseljena sa 10% vođenim rastvorom HC1 pa je ekstrahovana sa EtOAc, osušeno je (MgSO^, profiltrirano i koncentrovano, dajući kiselinu 9a (48,5 mg). Apsolutna stereohemijska struktura određena je upotrebom korelacije opisane u primerima 6 i 7.

b) Tretmanom alikvota kiseline 9a sa diazometanom u Et20, radi dobijanja metil estra, a zatim HPLC analizom uz upotrebu hiralne kolone [Chiralcel<®>OD-H, 2,5%

izopropanol/heksan, izokratna], dobijen je odnos 51:1( 1S, 2R) izomera.

a') Organska faza je osušena (MgSO^, profiltrirana i koncentrovana dajući nehid-rolizovane estre (0,248 g). Ovaj materijal je ponovo podvrgnut gornjem enzimskom protokolu sve dok pH nije ostalo stabilno (98 h). Posle ekstrahovanja kao prethodno, dobijeno je 0,146 mg (100%) nehidrolizovanog estra. Analiza pomoću HPLC uz upotrebu hiralne kolone dala je odnos >50 :1 u korist( 1R, 2R)izomera.

b') Vodena faza je zakiseljena sa 10% vodenim rastvorom HC1 pa je ekstrahovana sa EtOAc, osušena (MgS04), profiltrirana i koncentrovana dajući analognu kiselinu (82 mg). Deo tog materijala je tretiran sa diazometanom pa je zatim analiziran po-moću HPLC uz upotrebu hiralne kolone, kao prethodno, dajući odnos 65:1( 1S, 2R)derivata.

PRIMER 10

Sinteza( 1R, 2S)/( 1S, 2S)l-amino-2-etilciklopropil-karboksilne kiseline:

Polazeći od kiseline 5d opisane u primeru 5:

c) U 5d (1,023 g, 4,77 mmol) u CH3CN (25 ml), jedno za drugim su dodati DBU (860 pl, 5,75 mmol, 1,2 ekv.) i alilbromid (620 ul, 7,16 mmol, 1,5 ekv.). Reakciona smeša je mešana 4 h na sobnoj temperaturi pa je koncentrovana. Ostatak je razblažen sa Et20 pa je, jedno za drugim, prano sa 10% aq. rastvorom limunske kiseline (2x), H2O, zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, H20 (2x) i rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgS04, filtracija i koncentrovanje) izolovan je željeni estar 10a (1,106 g, 3,35 mmol, prinos 91%), kao bezbojno ulje. MS (FAB) 255 (MH<+>);<l>UNMR (CDCI3) 5 5,96 - 5,86 (m, IH), 5,37 - 5,22 (m, 2H), 4,70 - 4,65 (m, IH), 4,57 - 4,52 (m, IH), 1,87 - 1,79 (m, IH), 1,47 (s, 9H), 1,45 - 1,40 (m, IH), 1,33 - 1,24 (m, 3H), 1,03 (t, J = 7,3 Hz, 3H). d) U estar 10a (1,106 g, 4,349 mmol) u suvom CH2CI2(5 ml), na sobnoj temperaturi je dodat TFA (5 ml). Reakciona smeša je mešana 1,5 h pa je koncentrovana dajući 10b (854 mg, 4,308 mmol, prinos 99%). MS (FAB) 199 (MH<+>);<*>H NMR (CDCI3) 5 5,99 - 5,79 (m, IH), 5,40- 5,30 (m, 2H), 4,71 -4,62 (m, 2H), 2,22-2,00 (m, 2H), 1,95-1,88 (m, IH), 1,84-1,57 (m, 2H), 0,98 (t J = 7,3 Hz, 3H). e) U kiselinu 10b (853 mg, 4,30 mmol) u suvom benzenu (14,8 ml), jedno za drugim, dodati su Et3N (684 ul, 4,91 mmol, 1,14 ekv.) i DPPA (992 ul, 4,60 mmol,

1,07 ekv.).

Reakciona smeša je 4,5 h refluksovana pa je onda dodat 2-trimetilsililetanol (1,23 ml, 8,58 mmol, 2,0 ekv.). Refluks je održavan tokom noći a onda je reakciona smeša razblažena sa Et20, pa je, jedno za drugim, prana sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline, vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaHCOs, vodom (2x) i rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgS04, filtriranje, koncentrovanje), ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (5 cm, 10 do 15% AcOEt - heksan) dajući karbamat 10c (1,212 g, 3,866 mmol, prinos 90%), kao bledožuto ulje. MS (FAB) 314 (MH<+>);<I>H NMR (CDCI3) 5 5,93 - 5,84 (m, IH), 5,32 - 5,20 (m, 2H), 5,05 (bs, IH), 4,60 - 4,56 (m, 2H), 4,20 - 4,11 (m, 2H), 1,71 -1,60 (m, 3H), 1,39 -1,22 (m, IH), 1,03 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 0,96 - 0,86 (m, IH), 0,04 (s, 9H).

f) U karbamat 10c (267 mg, 0,810 mmol) dodat je 1,0M rastvor TBAF u THF (1,62 ml, 1,62 mmol, 2,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana tokom noći na sobnoj

temperaturi, refluksovana je 30 min pa je onda razblažena sa AcOEt. Rastvor je, jedno za drugim, pran vodom (2x) i rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgS04, filtriranje, koncentrovanje), izolovan je željeni amin lOd (122 mg, 0,721 mmol, prinos 89%), kao bledožuta tečnost.<*>H NMR (CDCI3) 5 5,94 - 5,86 (m, IH), 5,31 - 5,22 (m, 2H), 4,58 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 1,75 (bs, 2H), 1,61 -1,53 (m, 2H), 1,51 - 1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,70 - 0,62 (m, IH).

PRIMERU

Sintezaetil- ( 1R, 2S)/( 1S, 2S)-l-amino-2-vinilciklopropil-karboksilata:

a) U rastvor kafijum-fe/r-butoksida (4,62 g, 41,17 mmol, 1,1 ekv.) u THF (180 ml), na -78 °C je dodat komercijalno dostupni imin 11a (10,0 g, 34,41 mmol) u THF (45

ml). Reakciona smeša je zagrejana do 0 °C pa je na toj temperaturi mešana 40 min. Smeša je onda opet rashlađena do -78 °C da bi se dodao

1,4-dibromobuten 11b (8,0 g, 37,40 mmol), mešana je 1 h na 0 °C, pa je ponovo rashlađena na -78 °C radi dodavanja kalijum- terc -butoksida (4,62 g, 41,17 mmol, 1,1 ekv.). Na kraju je reakciona smeša mešana još jedan sat na 0 °C, pa je posle koncentrovanja dobijeno jedinjenje 11c.

b, c, d) U Et20 (265 ml) uneto je jedinjenje 11c pa je tretirano sa IM aq. rastvorom HC1 (106 ml). Posle 3,5 h na sobnoj temperaturi, slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je opran sa Et20 (2x) pa je zaalkalisan sa zasićenim aq. rastvorom NaHCG"3. Željeni amin je ekstrahovan sa Et20 (3x) a sjedinjeni organski ekstrakti su oprani sa rastvorom soli. Posle uobičajenog tretmana (MgS04, filtriranje i koncentrovanje) ostatak je tretiran sa 4M rastvorom HC1 u dioksanu (187 ml, 748 mmol). Posle koncentrovanja, hidrohloridna so lld je izolovana kao braon čvrsta supstanca (2,467 g, 12,87 mmol, prinos 34%).<*>H NMR (CDC13) 5 9,17 (bs, 3H), 5,75 - 5,66 (m, IH), 5,39 (d, J = 17,2 Hz, IH), 5,21 (d, J = 10,2 Hz, IH), 4,35 - 4,21 (m, 2H), 2,77 - 2,70 (m, IH), 2,05 (dd, J = 6,4,10,2 Hz, IH), 1,75 (dd, J = 6,4,8,3 Hz IH), 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 3H).

PRIMER 12

Pripremanje etilestra( 1R, 2S)/( 1S,^5>l-Boc-ammo-2-vinilciklopropil-karboksilne kiseline:

Hidrohloridna so lld (1,0 g, 5,2 mmol) i (Boc)20 (1,2 g, 5,7 mmol) ratsvoreni su u THF (30 ml) i tretirani sa DMAP (0,13 g, 1,04 mmol, 0,2 ekv.) i diizopropiletilami-nom (2,8 ml, 15,6 mmol). Reakciona smeša je mešana 24 h pre nego što je razblažena sa EtOAc (40 ml) pa je, jedno za drugim, prana sa zasićenim NaHC03(aq.), 5% vodenim rastvorom HC1 i zasićenim rastvorom soli. Organska faza je osušena (MgS04), profiltrirana i koncentrovana dajući 12a (0,29 g, 23%), posle prečišćavanja fleš hromatografijom (15% EtOAc/heksan).<*>H NMR (CDC13) 5 5,80 - 5,72 (m, IH), 5,29 - 5,25 (dd, J « 17,2,17,2 Hz, IH), 5,24 - 5,1 (bs, IH), 5,10 (dd, J = 9,2 9,2 Hz, IH), 4,22 - 4,13 (m, 2H), 2,15 - 2,04 (m, IH), 1,85 - 1,73 (bs, IH), 1,55 - 1,5 (m, IH), 1,49 (s, 9H), 1,26 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

PRIMER 13

Enzimsko razdvajanje etil( 1R, 2S)/( 1S, 2S)l-amino-2-vinilciklopropil-karboksilata:

<*>Analiza sa HPLC upotrebom Chiralcel<®>OD-H kolone

a) Racemski derivat 12a (0,29 g, 1,14 mmol) rastvoren je u acetonu (5 ml) i raz-blažen sa H20 (10 ml). Sa 0,2M vodenim rastvorom NaOH podešeno je pH na 7,2

pre nego što je dodata Alcalase<®>(300 mg). Da bi se za vreme inkubacije pH održa-valo konstantnim, dodavan je rastvor NaOH pomoću titracionog uređaja dirigova-nog pH-metrom, tokom 9 dana sve dok teorijska količina baze nije bila dodata. Zatim je vršena ekstrakcija kiselinom/bazom, kao što je opisano u primeru 9, pa su izolovani nehidrolizovan estra (0,15 g, 100%) i hidrolizovan materijal (0,139 g, 95%). Analiza nehidrolizovanog estra pomoću HPLC, upotrebom hiralne kolone, ut-vrđen je odnos 43 : 1 željenog jedinjenja 13c. Jedinjenje 206 (gde Rijeste vinil, tabela 2) hidrogenovano je (10,8 mg, 0,015 mmol u 1 ml EtOH sa oko 1 ml 20% Pd(OH)2pod pritskom vodonika od 1 bar, tokom 45 min) dajući jedinjenje 214 (gde Rjjeste etil, tabela 2). Jedinjenju 214 pripisana je( 1R, 2R)stereohemijska struktura na osnovu hemijske korelacije opisane u primerima 6 i 7 koja ukazuje da jedinjenje 206 (Rt= vinil) ima istu apsolutnu konfiguraciju kao što je prikazana za 13c (i pored toga što je1R, 2S,zbog Rj= vinil).

Uslovi za HPLC analizu: Chiralcel<®>OD-H (4,6 mm x 25 cm), izokratni uslovi uz upotrebu mobilne faze sa 2,5% izopropanol/heksana.

PRIMER 14

Razdvajanje( 1R, 2S)/( 1S, 2S)l-amino-2-vinilciklopropil-karboksilata putem kristalizacije sa dibenzoil-D-vinskom kiselinom

U rastvor sirovog racemata (1S, 25 i1R,25) etil l-amino-2-vinilciklopropil-karbok-silata [dobijen od etilestra N-(difenilmeitlen)glicina (25,0 g, 93,5 mol) kao što je opisano u primeru 13] u EtOAc (800 ml) dodata je dibenzoil-D-vinska kiselina (33,5 g, 93,5 mol). Smeša je zagrevana do refluksa, ostavljena 15 min na sobnoj temperaturi a zatim ohlađena na 0 °C. Posle 30 min dobijena je bela čvrsta supstanca. Čvrsta faza je odvojena filtriranjem, oprana je sa EtOAc (100 ml) pa je osušeno na vazduhu. Čvrsta faza je suspendovana u acetonu (70 ml), sonifikovana, pa profiltrirana (3x), a zatim je dvaput prekristalisana iz vrelog acetona (deo A). Matični lugovi su koncentrovani pa je ostatak prekristalisan triput iz vrelog acetona (deo B). Oba dela amorfne čvrste supstance, soli dibenzoil-D-vinske kiseline su sjedinjena (5,53 g) i suspendovana u smeši Et20 (250 ml) i zasićenog rastvora NaHC03(150 ml). Organski sloj je opran sa rastvorom soli, osušen (MgS04) i profiltriran. Filtrat je razblažen sa IM HCl/Et20 (100 ml) pa je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Uljasti ostatak je otparen sa CC14, dajući hidrohlorid etil-1-- (2?>amino-2-(S>vinil-ciklopropan-karboksilata (940 mg, prinos 11%), kao belu čvrstu higroskopnu supstancu čija je apsolutna stereohemijska struktura određena na osnovu korelacije sa jedinjenjem 13c iz primera 13.

[a]<25>D= +39,5° (c = 1,14 MeOH); [a]<25>365= +88,5° (c = 1,14 MeOH);<*>H NMR (DMSO-d6) 5 9,07 (bs, 2H), 5,64 (ddd, J = 17,2,10,4, 8,7 Hz, IH), 5,36 (dd, J = 17,2, 1,6 Hz, IH), 5,19 (dd, J = 10,4, 1,6 Hz, IH), 4,24 - 4,16 (m, 2H), 2,51 - 2,45 (m, pikove ometa DMSO, IH), 1,84 (dd, J = 10,0, 6,0 Hz, IH), 1,64 (dd, J = 8,3, 6,0 Hz, IH), 1,23 (t, J = 7,1 Hz, 3H); MS (ESI) m/z 156 (MH)<+>; pomoću HPLC analize (CHIRALPAK AS<®>kolona,heks.: /-PrOH)utvrđeno je da je enantiomerna čistoća Boe derivata 91% ee (primer 13).

P4-P2 BLOKOVI ZA IZGRADNJU

PRIMER 15

Sinteza segmenta: Ac-Chg-Chg-Pro (4(i?)-naftalen-l-ilmetoksi)-OH (15g)

Jedinjenjel5a (isto kao jedinjenje 2 iz primera 2) (4,45 g, 11,98 mmol) rastvoreno je u anhidrovanom CH3CN (60 ml), DBU (2,2 ml, 14,38 mmol) pa je alil bromid (1,1 ml, 13,18 mmol) dodavan postepeno a reakciona smeša je mešana 24 h na sobnoj temperaturi. Smeša je koncentrovana, dobijeno ulje je razblaženo sa EtOAc i vodom pa je, jedno za drugim, oprano vodom (2x) i rastvorom soli (lx). Sloj EtOAc je osušen (MgS04), profiltriran i uparen do suva. Žuto ulje je prečišćeno fleš hromatografijom (eluent: heksan : EtOAc; 90 :10 do 85 :15) dajući proizvod 15b kao žuto ulje (2,4,17 g; prinos 85%). MS (FAB) 412 MH<+>

'H NMR (CDCfe), smeša rotamera ca.1:2 , 5 <d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (d, J= 8Hz, 1H),

7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.55-7.41 (m, 4H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.34-5.21 (m, 2H), 5.03-4.88 (m, 2H), 4.70-4.56 (m, 2H), 4.48 & 4.39 (t, J= 8,15Hz, 1H), 4.28-4.23 (m, 1H), 3.81-3.55 (m, 2H), 2.46-2.36 (m, 1H), 2.13-2.05 (m, 1H), 1.44 &1.41 (s, 9H).

Jedinjenje 15b (2,08 g, 5,05 mmol) tretirano je 30 min na sobnoj temperaturi sa 4M HCl/dioksan. Uparavanjem do suva dobijen je odgovarajući amin-HCl, kao ulje. Amin-HCl 15c je rastvoren u anhidrovanom DCM (25 ml) i NMM (2,2 ml, 20,22 mmol), pa su, jedno za drugim, dodati Boe -Chg-OH • H20 (1,53 g, 5,56 mmol) i TBTU (1,95 g, 6,07 mmol). Reakciona smeša je tokom noći mešana na sobnoj temperaturi, zatim je razblaženo sa EtOAc pa je, jedno za drugim, prano sa 10% vodenog rastvora limunske kiseline (2x), zasićenim vodenim rastvorom NaHC03(2x), vodom (2x), rastvorom soli (lx). Sloj EtOAc je osušen (MgS04), profiltriran i uparen do suva dajući sirovi proizvod 15d, kao žućkasto-belu penu (ca. 2,78 g, prinos 100%).

MS (FAB) 551.4 MH*. 1H NMR

(CDCI3) 8 8.03(d, J=8Hz, 1H), 7.86 (b d, J= 8.5Hz, 1H), 7.84 (d, J= 8Hz, 1H), 7.56-7.40 (m, 4H), 5.92-5.85 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.22 (dd, J= 1,10Hz, 1H), 5.17 (d, J=9Hz, 1H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.91 (d, J= 12Hz. 1H), 4.67-4.60

(m, 3H), 4.31-4.27 (m, 2H), 4.16 (b d, J= 11Hz, 1H), 3.71 {dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2.47-2.41 (m, 1H), 2.08-1.99 (m,1 H), 1.85-1.63 (m, 5H), 1.44-1.40 (m, 1H), 1.36 (S, 9H), 1.28- 1.00 (m, 5H).

Sirovi dipeptid 15d (ca. 5,05 mmol) tretiran je sa 4M HCl/dioksanom (25 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15c. Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boe -Chg-OH • H20 (1,53 g, 5,55 mmol) sa NMM (2,22 ml, 20,22 mmol) i TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) u DCM (25 ml), kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15d, dajući sirovi tripeptid 15e, kao žuto-uljastu penu. Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom (eluent heksan : EtOAc; 80 : 20 do 75 : 25), dajući tripeptid 15e kao belu penu (2,75 g; prinos, posle 2 stupnja, 79%).

MS (FAB) 690.5 MH<*.>'H NMR (CDCI3), uglavnom jedan rotamer, 5 8.06 (d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 8.5Hz. 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.57-7.40 (m, 4H), 6.41 (d, J= 8.5Hz. 1H), 5.92-5.84 (m, 1H). 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.23 (dd, J= 1, 10.5Hz, 1H), 5.04

(d, J= 12Hz, 1H), 4.98 (b d, J= 7Hz, 1H). 4.93 (d, J=12Hz, 1H), 4.63-4.58 (m, 4H), 4.29- 4.25 (m, 1H). 4.10-4.07 (m, 1H), 3.90-3.84 (m, 1H), 3.72 (dd, J=4, 11 Hz, 1H). 2.48-2.40 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 1H), 1.83-1.55 (m, 12H), 1.43 (s, 9H), 1.23-0.89 (m, 10H).

Tripeptid 15e (2,75 g, 3,99 mmol) tretiranje sa 4M HCl/dioksanom (20 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15c. Sirova hidrohloridna so je rastvorena u anhidrovanom DCM (20 ml). Jedno za drugim, dodati su NMM (1,75 ml, 15,94 mmol) i anhidrid sirćetne kiseline (752 pl, 7,97 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom noći, na sobnoj temperaturi, pa je razblažena sa EtOAc. Organski sloj je opran, jedno za drugim, sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline (2x), zasićenim vodenim rastvorom NaHC03(2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen do suva, dajući sirovi tripeptid 15f kao belu penu (2,48 g, prinos 98%).

MS (FAB) 632.4 MH+I.<1>H NMR (CDCI3), uglavnom jedan rotamer, 5 8.06(b d, J= 8Hz,

1H), 7.87 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.83 (d, J= 8Hz, IH), 7.58-7.40 (m, 4H), 6.36 (d, J= 9Hz,1H), 6.01 (d, J= 9Hz, 1H), 5.94-5.83 (m, 1H), 5.34-5.28 (m, 1H), 5.25-5.21 (m, 1H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12Hz, 1H), 4.64-4.57 (m, 4H), 4.30-4.23 (m, 2H), 4.12-4.08 (rn, 1H), 3.73 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.49-2.42 (m, 1H), 2.08-2.01 (m, 1H), 1.99 (s. 3H), 1.85-1.53 (m, 11H), 1.25-0.88 (m, 11H).

Sirovi tripeptid 15f (2,48 g, 3,93 mmol) rastvoren je u anhidrovanoj smeši CH3CN: DCM (20 ml). Jedno za drugim, dodati su trifenilfosfin (53,5 mg, 0,200 mmol) i katalizator tetrakis(trifenilfosfin)-paladijum(O) (117,9 mg, 0,102 mmol), pa zatim pirolidin (353,9 pl, 4,24 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi, 18 h. Posle toga, rastvarač je otparen. Ostatak je rastvoren u EtOAc i 10% vodenom rastvoru limunske kiseline, pa je zatim opran još dvaput sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline, vodom (2x), pa rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen (MgS04), profiltriran pa uparen. Sirovi proizvod je rastrljan sa Et20 : DCM (85 : 15), dajući, posle filtriranja, tripeptid 15g kao čvrstu belu supstancu (2,09 g, prinos 90%).

MS (FAB) 592.4 MH<*>614.3 (M+Na)+. 1H NMR (CDCI3),

uglavnom jedan rotamer, s 8.08 (d, J= 8Hz, 1H), 7.93 (b d, J- 9Hz, 1H), 7.88 (b d, J=

8Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.57-7.41 (m, 4H), 6.47 (d, J= 8.5Hz, 1H), 5.05 (d, J= 12.5Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12.5Hz, 1H), 4.73 (t, J= 9.5,19Hz, 1H), 4.44-4.35 (m, 2H), 4.26 (b s, 1H), 4.19 (d, J= 11.5Hz. 1H), 3.75 (dd, J=4,11 Hz, 1H), 2.47 (b dd, J=7.5, 13.5Hz, 1H), 2.20-2.11 (m, 1H),2.04 (s, 3H), 1.88-1.41 (m, 11H), 1.30-0.80 (11H).

PRIMER 16

Sinteza segmenta Ac-Chg-Val -Pro(4(#-naftolen-l-ilmetoksi)-OH (16e)

Jedinjenje 16a (2,89 g, 7,02 mmol) tretirano je sa 4M HCl/dioksanom (30 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15c Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boe -Val-OH (1,53 g, 7,73 mmol) sa NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) i TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) u DCM (35 ml) tokom 3,5 h, kao što je opisano za sinetzu jedinjenja 15d, dajući sirovi dipeptid 16c, kao uljastu penu, boje slonovače (ca. 3,60 g, prinos 100%).

MS (FAB) 509.3 MH" 511.3 MH<+>533.2 (M+Na)<+>.<1>H NMR (CDCI3) 8

8.04 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 7Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.56-7.40 (m,

4H), 5.93-5.85 (m, 1H), 5.34-5.28 (m, 1H). 5.24-5.19 (m, 2H), 5.04 (d, J= 12Hz, 1H), 4.92 (d, J= 12Hz, 1H), 4.67-4.60 (m, 3H), 4.31-4.26 (m, 2H), 4.11-4.09 (m, 1H), 3.72 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 1H), 1.44-1.36 (m, 1H), 1.37

(s. 9H), 1.01 (đ, J= 7Hz, 3H), 0.93 (d, J= 7Hz, 3H).

Sirovi dipeptid 16b (ca. 7,02 mmol) tretiran je sa 4M HCl/dioksanom (30 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15c. Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boe -Chg-OH • H20 (2,13 g, 7,73 mmol) sa NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) i TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) u CH2C12(35 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15d, dajući sirovi tripeptid 16c, kao penu boje slonovače (ca. 4,6 g, prinos 100%).

MS (FAB) 648.5MH"672.4 (M+Na)<+.>'H NMR (CDCI3) 8 8.06 (b d, J=8Hz,

1H), 7.87 (b d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.82 (b d , J= 8Hz, 1H), 7.57-7.40 (m, 4H), 6.46 (b d,

J= 8.5Hz, 1H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.23 (dd, J= 1,10.5Hz, 1H), 5.03 (d, J= 12Hz, 1H), 5.00^.97 (m, 1H), 4.93 (d, J=, 12Hz, 1H), 4.63-4.59 (m, 4H), 4.29-4.27 (m, 1H), 4.10-4.07 (m, 1H), 3.92-3.86 (m, 1H), 3.72 (dd, J= 5, 11 Hz, 1H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.10-1.99 (m, 1H). 1.76-1.57 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 1.20-0.92 (m, 6H), 1.00 (d, J= 7Hz, 3H), 0.93 (d, J= 7Hz, 3H).

Sirovi tripeptid 16c (ca. 7,02 mmol) tretiranje sa 4M HCl/dioksanom (30 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15c. Sirova hidrohloridna so je zatim tretirana sa anhidriđom sirćetne kiseline (1,33 g, 14,05 mmol) i sa NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) u CH2C12(35 ml) kao što je opisano za sintezu jedinjenja 15d. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom (eluent: heksan: EtOAc; 30 :70) dajući aci-lovano zaštićeni tripeptid 16d, kao belu penu (3,39 g, prinos, kroz 3 stupnja, 81%). MS (FAB) 590.3 MH" 592.4 MH<+>614.4 (M+Na)<+>

<1>H NMR (CDCI3), uglavnom jed. rotamer , 8 8.06 (d, J= 8Hz, 1H), 7.88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.83 (d, J= 8Hz. 1H), 7.58-7.41 (m, 4H), 6.37 (d, J= 9Hz. 1H), 5.97 (d, J= 8.5 Hz,

1H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1,17Hz, 1H), 5.24 (dd, J= 1,10.5 Hz, 1H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12Hz, 1H), 4.66-4.57 (m, 4H), 4.31-4.22 (m, 2H), 4.11-4.05 (m, 1H), 3.73 (dd, J= 4.5,11 Hz, 1H), 2.50-2.43 (m, 1H), 2.09-2.01 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 1.68-1.55 (m, 5H), 1.15-0.89 (m, 6H), 0.99 (d, J= 7Hz, 3H), 0.91 (d, J= 7Hz, 3H).

Acilovani tripeptid 16d (3,39 g, 5,73 mmol) deprotektovan je pomoću katalizatora tetrakis(trifenilfosfin)-paladijum(0)-a (172,1 mg, 0,149 mmol) sa trifenilfosfinom (78,1 mg, 0,298 mmol) i pirolidinom (516 pl, 6,19 mmol) u smeši 1:1, anhidrova-nog CH3CN : DCM (30 ml), kao što je opisano u sintezi jedinjenja 15g. Sirovi, bledožut penasti proizvod, rastrljan je u Et20 : DCM (85 :15), dajući posle filtriranja tripeptid 16e kao prljavo-belu čvrstu supstancu (3,0 g; prinos 95%).

MS (FAB) 550.3 MH"

<1>H NMR (CDCI3) 5 8.08 (d, J= 8H2, 1H), 8.04 (b d. J= 9Hz, 1H), 7.88 (b d, J= 7.5Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.58-7.37 (m, 5H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12Hz, 1H), 4.61 (t, J= 9.5, 19.5Hz, 1H), 4.46-4.37 (m, 2H), 4.27 (b s, 1H), 4.17 (d, J= 11Hz, 1H), 3.74 (dd, J=4,11 Hz, 1H), 2.49 (bdd, J=7.5,13Hz, 1H), 2.17-2.09 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.79 (b d, J= 12.5Hz, 1H), 1.62-1.43 (m, 5H), 1.08-0.85 (m, 5H), 1.00 (d, J= 7Hz, 3H), 0.90 (d, J= 7Hz, 3H).

JEDINJENJA IZ TABELA 1 DO 4

PRIMER 17

Sinteza jedinjenja 104 iz tabele 1

Jedinjenje 17a (4,27 g, 7,93 mmol, opisano kao jedinjenje 6a u primeru 6) tretirano je sa 4M HCl/dioksanom (40 ml), 5 h kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je rastvorena u THF (10 ml) pa je dodat rastvor NaOH (348,7 mg, 8,72 mmol) u H20 (5 ml), a zatim je dokapan (Boc)20 (1,73 g, 7,93 mmol) rastvoren u THF (13 ml). Dodavanjem, prema potrebi, 10% vodenog rastvora NaOH, održavano je pH 8. Reakciona smeša je snažno mešana, zatim je razblažena sa Et20 i H20, pa je još jednom ekstrahovana sa Et20. Vodeni sloj je zakiseljen do pH 3 sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3x). Sjedinjeni EtOAc ekstrakti su oprani sa H20 (2x), rastvorom soli (lx), osušeni (MgS04), profiltrirani i upareni do suva, dajući sirovo jedinjenje 17b kao penu boje slonovače (ca. 7,93 mmol).

MS (FAB) 481.3 MH" 'H NMR

(CDCI3), ca.t:1 smeša rotamera, 5 8.04 (bd, J= 7.5Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 7.5Hz,

1H). 7.82 (d, J= 7.5Hz, 1H), 7.56-7.40 (m, 5H), 4.96 (bs, 2H), 4.33 (t, J= 7.5,

14.5Hz,1H), 4.21-4.09 (m, 0.5H), 3.99-3.84 (m, 0.5H), 3.78-3.75 (m, 0.5H), 3.68-

3.62 (m, 0.5H), 3.61-3.42 (m, 1H), 2.55-2.41 (m, 1H), 2.22-2.11 (m, 1H), 1.61-1.52

(m, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.40-1.31 (m, 1H), 1.25-1.19 (m. 1H), 0.99 (t, J=7.5,14.5Hz, 3H).

Jedinjenje 17b (ca. 7,93 mmol) tretirano je sa DBU (1,18 ml, 93 mmol) i alilbromidom (4,12 ml, 47,61 mmol) u anhidrovanom CH3CN (40 ml), 48 h, kao što je opisano za jedinjenje 15b, dajući alilovani dipeptid 17c, kao penu boje slonovače (3,54 g; prinos, kroz 2 stupnja, 86%).

MS (FAB) 521.3 MH"545.2 (M+Na)<*>. 1H NMR

(CDCI3), ca.1:1 smeša rotamera, 5 8.05 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.86 (b d, J= 7.5Hz,

1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.55-7.40 (m, 5H), 5.88-5.79 (m, 1H), 5.27 (b d, J=

17.5Hz, 1H), 5.18 (b d, J= 10Hz, 1H), 5.03-4.89 (m, 2H), 4.63-4.50 (m, 2H), 4.44-

4.19 (m, 2H), 4.00-3.40 (m, 2H), 2.70-2.02 (m, 2H), 1.66-1.35 (m, 5H), 1.44 (s, 9H), 0.95 (t, J= 7.5,14.5Hz, 3H).

Sirovi dipeptid 17c (1,18 g, 2,26 mmol) tretiran je sa 4M HCl/dioksanom (35 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boc--Chg-OH • H20 (684 mg, 2,48 mmol) sa NMM (993 pl, 9,03 mmol) i TBTU (870 mg, 2,71 mmol) u DCM (11 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15d, dajući sirovi tripeptid 17d, kao penu boje slonovače (1,41 g; 95%). MS (FAB) 660.4 MH" 662.3 MH<*.><1>H NMR (CDCI3), uglavnom jedan rotamer, 5 8.03 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.85 (b d, J=

8Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8H2,1H), 7.56-7.39 (m, 5H), 5.88-5.77 (m, 1H), 5.26 (dd, J=

1.5, 17Hz, 1H), 5.15 (dd, J= 1.5,10.5Hz, 1H), 5.12 (s, 1H), 5.02-4.92 (m, 2H), 4.72-4.59 (m, 1H), 4.57-4.46 (m, 1H). 4.42-4.35 (m, 1H), 4.33-4.20 (m, 1H), 4.02-3.90 (m, 1H), 3.78-3.70 (m, 1H), 3.67-3.51 (m, 1H), 2.71-2.61 (m, 1H), 2.12-2.02 (m, 1H), 1.79-1.48 (m, 10H), 1.45-1.39 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.25-1.01 (m, 5H), 0.94 (t, J=7.5, 14Hz, 3H).

Sirovi tripeptid 17d (265 mg, 0,400 mmol) tretiran je sa 4M HCl/dioksanom (3 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boe - Chg-OH • H20 (143,3 mg, 0,521 mmol) sa NMM (176 pl, 1,60 mmol) i TBTU (154,3 mg, 0,481 mmol) u DCM (3 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15d, dajući sirovi tetrapeptid 17e, kao penu boje slonovače (ca. 0,400 mmol; 100%). MS (FAB) 799.5 MH- 801.5 MH<*>823 (M+Na)*. :H NMR (CDCI3), ca. 1 :1 smeša

rotamera 5 8.05 (b d, J= 8.5Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 7.5Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.5Hz,

1H), 7.55-7.40 (m, 4H), 7.37 (s, 1H), 6.58-6.41 (m, 1H), 5.89-5.78 (m, 1H), 5.26 (b dd, J= 1.5, 17Hz, 1H), 5.16 (b dd, J= 1.5,10.5Hz, 1H), 5.20-4.92 (m, 3H), 4.68-4.58

(m, 2H), 4.57-4.47 (m, 1H), 4.43-4.26 (m, 1H), 3.99-3.81 (m, 2H), 3.78-3.60 (m, 2H), 2.67-2.60 (m, 1H), 2.11-2.02 (m, 1H),1.78-1.42 (m. 14H), 1.44 &1.43 (s, 9H), 1.25-0.91 (m, 13H), 0.95 (t, J=7.5, 15Hz, 3H).

Sirovi tetrapeptid 17e (ca. 0,400 mmol) tretiran je sa 4M HCl/dioksanom (3 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je dalje tretirana sa anhidridom sirćetne kiseline (83 pl, 0,884 mmol) i NMM (194 pl, 1,77 mmol) u DCM (3 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15f, dajući sirovi acetilovani tetrapeptid 17f, kao penu boje slonovače (ca. 0,400mmol).

MS (FAB) 741.5 MH" 743.4 MH<*>765.4 (M+Na)*.

'H NMR (CDCI3) 8 8.05 (b d, J= 8.5Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 7.5Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8.5Hz, 1H), 7.55-7.41 (m, 4H), 7.39 (s, 1H), 6.63-6.48 (m, 1H), 6.01 (d, J= 8.5Hz,

1H), 5.90-5.79 (m, 1H), 5.27 (b dd, J= 1.5,17Hz, 1H), 5.16 (b dd, J= 1.5,10.5Hz,

1H), 5.01 <d, J= 12Hz, 1H), 4.96 (d, J= 12Hz, 1H), 4.69-4.48 (m, 3H), 4.44-4.37 <m, 1H), 4.36-4.22 (m, 1H), 3.96 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 3.78-3.60 (m, 2H), 2.67-2.59 (m, 1H), 2.10-2.00 (m, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.78-1.48 (m, 13H), 1.45-1.35 (m, 1H), 1.26-0.89 (m, 13H), 0.95 (t, J= 7.5,15Hz, 3H).

Acetilovani tetrapeptid 17f (ca. 0,400 mmol) đeprotektovan je pomoću katalizatora tetrakis (trifenilfosfin) -paladijum(O) -a (11,3 mg, 0,010 mmol) sa trifenilfosfinom (5,12 mg, 0,020 mmol) i pirolidinom (34<p>l, 0,406 mmol) u smeši 1:1, anhiđrova-nog CH3CN : DCM (2 ml), kao što je opisano u sintezi jedinjenja 15g. Sirovi, proizvod je prečišćen fleš hromatografijom (eluent - V" EtOAc, zatim 2^, 1,92% HOAc, 3,85% MeOH u DCM) dajući, posle liofiliziranja, tetrapeptidno jedinjenje 104 iz tabele 1, kao prljavo-belu amorfnu čvrstu supstancu (193,1 mg; prinos, posle 5 stupnjeva, 73%).

MS (FAB) 701.4 MH- 703.4 MH<+>725.4 (M+Na)<4>.

<1>H NMR (DMSO), ca.1 : 5 smeša rotamera, 6 8.57 & 8.32 (s, 1H), 8.04 (d, J= 7.5Hz, 1H), 7.94 (b d, J= 7.5Hz, 1H), 7.88 (d, J= 8Hz, 1H), 7.83-7.78 (m, 2H), 7.58-7.30 (m, 4H), 4.99 (d, J= 12Hz, 1H), 4.90 (d, J= 12Hz, 1H), 4.44-4.29 (m, 2H), 4.29-4.05 (m, 3H), 3.87-3.73 (m, 1H), 2.23-2.13 (m, 1H), 2.05-1.95 (m, 1H), 1.91 & 1.84 (s, 3H), 1.75-1.40 (m, 15H), 1.29-0.84 (m, 12H), 0.91 (t, J= 7.5, 14.5Hz, 3H).

PRIMER 18

Sinteza jedinjenja 105 iz tabele 1

Jedinjenjel8b, ti. odgovarajuće jedinjenju 5f iz primera 5, kuplovano je za prethodno obrazovani tripeptid 18a, opisan prethodno u primeru 15. Specifičnije jedinjenje 18b (ca. 0,521 mmol) pomešano je sa jedinjenjem 18a (323,6 mg, 0,547 mmol) u DCM (3 ml) i NMM (172 pl, 1,562 mmol), a zatim je adirano HATU (237,6 mg, 0,625 mmol). Reakciona smeša je mešana 18 h na sobnoj temperaturi, posle čega je dalje rađeno kao što je opisano za jedinjenje 15d, pa je dobijen sirovi tetrapeptid kao racemska smeša na Pl. Oba izomera su delimično razdvojena fleš hromatografijom (eluent - toluen : EtOAc; 40 : 60). Sjedinjavanjem prvih eluiranih frakcija dobijena je smeša 9 :1 u kojoj je sličanterc -butilestar jedinjenja 17f bio većinska komponenta (58 mg). Srednje frakcije su sadržavale različite odnose odgovarajućihterc -butilestara jedinjenja 17f i r-butilestar jedinjenja 105 (163 mg). Krajnje eluacione frakcije dale su odgovarajućiterc -butilestar jedinjenja 105 kao većinski izomer (75,8 mg).

Poslednji estar (74 mg, 0,0975 mmol) rastvoren je u 4M HCl/dioksanu (2 ml), mešan je na sobnoj temperaturi 5,5 h, zatim je uparen do suva, dajući uljasti proizvod. Prečišćavanjem pomoću fleš hromatografije (eluent -1™ EtOAc, zatim 2^ 1,92% HOAc, 3,85% MeOH, u DCM) dobijeno je, posle liofiliziranja, jedinjenje 105, kao prljavo-bela čvrsta supstanca (38,7 mg, prinos 56%). HPLC analiza pokazala je odnos 3 : 1, jedinjenja 105 i jedinjenja 104. MS i NMR podaci za jedinjenje 105: MS (FAB) 701.5 MH" 703.5 MH<*>

725.6 (M+Na)*. nH NMR (DMSO), ca.1 :2.5 smeša rotamera, 5 8.76 & 8.34 (s,

1H), 8.05(b d, J= 7.5Hz, 1H), 7.94 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.88 (d, J=8.5Hz, 1H), 7.85-

7.78 (m, 2H), 7.59-7.43 (m, 4H), 4.99 (d, J= 12Hz, 1H), 4.89 (d, J= 12Hz, 1H), 4.41-4.05 (m, 5H), 3.82-3.66 (m, 1H), 2.25-2.11 (m, 1H), 2.11-1.98 (m, 1H), 1.90 & 1.84

(s, 3H), 1.78-1.40 (m, 15H), 1.39-0.82 (m, 12H), 0.90 (t, J= 7, 14Hz, 3H).

PRIMER 19

Sinteza jedinjenja 103 iz tabele 1

Prema postupku opisanom za sintezu jedinjenja 104 iz primera 17, smeša 1( R), 2( R)\\ ( R), 2 ( S)izomera intermedijernog jedinjenja lOd, pripremljenog u primeru 10, kuplovana je sa jedinjenjem 2, dajući smešu izomernih intermedijernih jedinjenja 19a i 19b.

Na osnovu postupka iz primera 18, izomerna jedinjenja 19a i 19b razdvojena su i transformisana u svoje odgovarajuće jedinjenje formule 1; radi izolovanja odgovarajućeg jedinjenja 103 iz tabele 1.

Spektralni podaci:

Jedinjenje 103: Zastupljenost rotamera, na osnovu NMR, ca. (1:8,7):

MS (FAB) m/z: 703 (MH+); 1H-NMR (DMSO-d6) 68.21-8.09 (bs, 1H), 8.05 (bd, J = 7.63 Hz, 1H), 7.94 (bd, J = 7.0 Hz, 1H), 7.91-7.83 (m, 2H), 7.83-7.76 (m, 1H), 7.59-7.5 (m, 3H), 7.5-7.43 <m, 1H), 4.99 (d, J = 11.8 Hz. 1H), 4.89 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.43-4.30 (m, 3H), 4.23-4.16 (m, 1H), 4.13 (bd, J = 10.8 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 11.1, 4 Hz, 1H), 2.2-2.02 (m, 2H), 1.87 and 1.84 (2 x s, 3H), 1.81-1.71 (m, 2H), 1.70-1.40 (m, 12H), 1.26-1.06 (m, 4H), 1.04-0.83 (m, 11H), 0.59 (m, 1H).

PRIMER 20

Sinteza jedinjenja 108 iz tabele 1

Sirovi tetrapeptid 17e iz primera 17 (ca. 0,963 mmol) tretiran je sa 4M rastvorom HCl/dioksanom (5 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boe -(D)Glu(0-alil)-OH (331,9 mg, 1,155 mmol) sa NMM (423 pl, 3,850 mmol) i TBTU (370,8 mg, 1,155 mmol) u DCM (5 ml), 3 h na sobnoj temperaturi, kao što je opisano za jedinjenje 15d. Dobijen je sirovi pentapeptid 20d, kao pena boje slonovače (ca. 933,9 mg, 0,963 mmol).

MS (FAB) 968.6 MH' 970.6 MH<*>992.5 (M+Na).

<1>H NMR (CDC!3), ca.1 : 4 smeša rotamera, 5 8.05 (d, J= 8.5Hz, 1H), 7.87 (b d, J=

7.5Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.5Hz, 1H), 7.58-7.34 (m, 5H), 6.77-6.25 (m, 2H), 5.98-5.77

(m, 2H), 5.38-5.21 (m, 4H), 5.16 (dd, J= 1.5, 10.5Hz, 1H), 5.06-4.89 (m, 2H), 4.68-4.13 (m, 7H), 3.96-3.52 (m, 4H), 2.69-2.38 (m, 3H), 2.23-1.87 (m, 2H), 1.78-1.37 (m, 17H), 1.46 & 1.44 (s, 9H), 1.22-0.87 (m, 11H), 0.95 (t, J= 7, 14.5Hz, 3H).

Sirovi pentapeptid 20b (ca. 0,963 mmol) tretiran je sa 4M rastvorom HCl/dioksanom (5 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je kuplovana za Boe -Asp(0-alil)-OH (315,6 mg, 1,155 mmol) sa NMM (423 pl, 3,85 mmol) i TBTU (370,8 mg, 1,155 mmol) u DCM (5 ml), kao što je opisano za jedinjenje 15d. Dobijen je sirovi heksapeptid 20c, kao pena boje slonovače (ca. 1,083 mg, 0,963 mmol).

MS (FAB) 1147.6 (M+Na)<*>. 1H NMR (CDCl3), ca.1:1

smeša rotamera, 5 8.06 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.86 (d, J= 8Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8Hz,

1H), 7.59-7.39 (m, 5H), 7.39-6.34 (m, 4H), 5.98-5.76 (m, 3H), 5.38-5.10 (m, 6H), 5.10-4.89 (m, 2H), 4.66-4.05 (m, 10H), 3.87-3.58 (m, 4H), 3.30-2.65 (m, 2H), 2.65-1.89 (m3H), 1.79-1.33 (m, 19H), 1.47 & 1.45 (s, 9H), 1.33-0.86 (m, 14H).

Sirovi heksapeptid 20c (ca. 0,963 mmol) tretiran je sa 4M HCl/dioksanom (5 ml) kao što je opisano za jedinjenje 15c. Sirova hidrohloridna so je acetilovana sa anhiđridom sirćetne kiseline (182 pl, 1,193 mmol) i NMM (423,5 pl, 3,850 mmol) u DCM (5 ml), kao što je opisano za jedinjenje 15f, dajući sirovi acetilovani tetrapeptid. Penasti ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (elunet: I", heksan : EtOAc 20 : 80 do 10 : 90, a 2<«>\ čist EtOAc) dajući acetilovani heksapeptid 20d kao penu boje slonovače (528 mg, prinos, posle 4 stupnja, 51%). MS (FAB) 1067,6 (MH+) 1089,6 (M+Na).

Acetilovani heksapeptid 20d (528 mg, 0,495 mmol) rastvoren je u DCM (3 ml) pa je tretiran sa prethodno pomešanim, 15 min mešanim, rastvorom katalizatora tetrakis(trifenilfosfin)-paladijum(0)-a (90 mg, 0,078 mmol) i pirolidina (134 pl, 1,603 mmol) u DCM (3 ml). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 48 h, posle čega je rastvarač otparen. Sirovi proizvod je prečišćen delimično trljanjem u Et20 : DCM (85 : 15), zatim prečišćavanjem u dve šarže preparativnom HPLC. Polovina delimično prečišćenog materijala je rastvorena u glacijalnoj sirćetnoj kise-lini (HOAc, 5 ml), profiltrirana je kroz Millipore®: Millex®- HV 0,45 pm filter pa je injektovana u ekvilibrisanu kolonu Cl 8, sa reverznom fazom, Whatman Partisil® 10-ODS-3 (2,2 x 50 cm). Program prečišćavanja: linearni gradijent sa 15 ml/min, 230 pm, injektovan sa 5% A; kada je sva HOAc izeluirala program je počet - sa 5% A tokom 10 min, 5 - 58% A za 70 min; A: 0,06% TFA/CH3CN; B: 0,06% TFA/H20. Frakcije su analizirane pomoću analitičke HPLC, odgovarajuće frakcije iz oba HPLC prečišćavanja su sjedinjene i liofilizirane, dajući željeno heksapeptid jedinjenje 108, kao belu čvrstu amorfnu supstancu (218,3 mg, prinos 47%).

MS (FAB) 945.5 MH- 947.4 MH+ 969.5 (M+Na)+ 985.4 (M+K)+. 'H NMR (DMSO), ca.1:9 smeša rotamera, 5 8.55 & 8.31 (s, 1H), 8.16 (d, J= 7.5Hz, 1H), 8.11 (d, J= 8Hz, 1H), 8.05 (d, J= 8.5Hz, 1H), 7.97-7.85 (m, 2H), 7.88 (d, J= 8.5Hz, 1H), 7.75 (d, J= 9Hz, 1H), 7.59-7.39 (m, 4H), 4.99 (d, J= 12Hz, 1H), 4.89 (d, J= 12Hz, 1H), 4.53 (dd, J= 7,14Hz. 1H), 4.08-4.45 (m, 6H), 3.77 (b dd, J=4,11 Hz. 1H), 2.64 (dd, J= 6.5,16.5Hz, 1H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.25-2.12 (m, 3H), 2.07 & 1.82 (s, 3H), 2.04-1.86 (m, 2H), 1.80-1.35 (m, 14H), 1.32-0.80 (m, 14H), 0.91 (t, J= 7.5, 14.5Hz, 3H).

PRIMER 21

Sinteza jedinjenja 301 iz tabele 3

Rastvor Utijum-hidroksid monohidrata (23 mg, 0,56 mmol) u H20 (4 ml) dodat je u rastvor estra jedinjenja 21a (45 mg, 0,185 mmol, prethodno opisan kao( R, R)izomer 9c) u MeOH (3,5 ml) i THF (3,5 ml). Dobijeni rastvor je snažno mešan 16 h pa je onda razdeljen između EtOAc (60 ml) i 10% vodenog rastvora HC1 (20 ml). Organska faza je odvojena, osušena (MgSO^, profiltrirana i koncentrovana dajući odgovarajuću kiselinu sa kvantitativnim prinosom.

Taj materijal (ca. 0,185 mmol) je pomešan sa (S)-(-)-a-meitlbenzilaminom (27 mg, 0,22 mol), HATU (77 mg, 0,20 mmol) i DIPEA (0,11 ml, 0,65 mmol) u DMF (5 ml). Posle 20 h reakcioni sistem je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u EtOAc pa je rastvor, jedno za drugim, opran sa zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, 10% vodenim rastvorom HC1, pa rastvorom soli, pre nego što je osušen (MgS04), profiltriran i koncentrovanin vacuo.Prečišćavanje pomoću fleš hromatografije (eluent: 35% EtOAc/heksan) dalo je 11 mg (28%) kuplovanog proizvoda 21b. Taj materijal (11 mg, 0,033 mmol) je tretiran sa 4M HCl/dioksanom, tokom 35 min. Posle toga reakciona smeša je koncentrovana do suva dajući hidrohloridnu so odgovarajućeg amina. Poslednji proizvod je kuplovan sa:

(33 mg, 0,036 mmol, pripremljen prema postupcima analognim onima iz primera 15 i 20), HATU (14 mg, 0,036 mmol) i DIPEA (0,116 ml, 0,02 mmol) u DMF (4 ml). Pošto je reakciona smeša mešana 16 h, smeša je koncentrovana. Ostatak je rastvoren u EtOAc. Rastvor je opran, jedno za drugim, sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCOs, 10% vodenim rastvorom HC1 i rastvorom soli, osušen je (MgS04), profiltriran i koncentrovanin vacuodajući belu čvrstu supstancu. Taj materijal (ca. 0,033) je rastvoren u EtOH (6 ml) pa je tretiran sa amonijum-acetatom (7 mg, 0,09 mmol) i 10% Pd/C (10 mg) pod atmosferom gasovitog vodonika. Posle 3 h, reakciona smeša je profiltrirana kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat je koncentrovan do suva. Ostatak je rastvoren u DMSO pa je prečišćen preparativnom HPLC dajući, posle liofiliziranja, čvrstu belu supstancu (17,6 mg, prinos, posle dva stupnja, 57%).

Spcktrsliii pođcici*

MS (FAB) ES" 932.6 (M-H)\ 954.5 (M-Na)"; HRMS izračunato za

C48H67N7012(MH<*>) 934.49261, nadjeno: 934.49010; 'H-NMR (DMSO.de) 8 8.90 (S, 1H), 8.24 (d, J = 7.95 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 7.63 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.26 Hz, 1H), 7.79

(d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 6.26 Hz, 1H), 7.42-7.17 (m, 10 H), 5.00 (quintet, J = 7.63 Hz, 1H), 4.7 (m, 1H), 4.52 (d, J = 11.76 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.33-4.2 (m, 6H), 3.70 (dd, J = 11.4 and 11.1 Hz, 2H), 2.63 (dd, J = 5.7 and 5.7 Hz, 1H), 2.45 (dd, J = 7.95 and 7.95 Hz, 1H), 2.21-2.11 (m, 3H), 2.07-1.97 (m, 1H), 1.93-1.83 (m, 2H), 1.81 (s, 3H), 1.78-1.63 (m, 2H), 1.54-1.41 (m, 2H), 1.39 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.29 (dd, J ~ 7.94 and 7.63 Hz, 1H), 1.15 (quintet, J = 7.0 Hz, 1H), 1.05 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.36 Hz, 6H), 0.88-0.83 (m, 1H), 0.71 (m, 9H).

PRIMER 22

Jedinjenje 107 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 17.

Zastupljenost rotamera na osnovu NMR (1: 7,6):

MS (FAB) m/z: 675 (MH+); 1H-NMR (DMSO-d6) 5 8.35-8.19 (bs, 1H), 8.04 (d, J = 7.63 Hz, 1H), 7.93 (bd, J = 7.31 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.27 Hz, 1H), 7.86-7.79 (m,

2H), 7.59-7.49 (m, 3H), 7.46 (dd, J = 7.95, 7.95 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.40-4.34 (m, 1H), 4.32 (bs, 1H), 4.29-4.24 (m, 1H), 4.22-4.15 (m, 1H), 4.09 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.74 (dd, J = 11.1, 4 Hz. 1H), 2.20-2.12 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 2H), 1.84 (s, 3H), 1.72-1.42 (m, 7H), 1.20-1.13 (m, 1H), 1.08-0.87 (m, 13H), 0.85 (d, J = 6.68 Hz, 6H).

PRIMER 23

Jedinjenje 114 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 17.

Zastupljenost rotamera na osnovu NMR (1:7,5):

MS (FAB) m/z: 747 (M+Na<*>); 'H-NMR (DMSO-d6) 6 8.40-8.24 (bs, 1H), 8.07-8.01

(m, 1H), 7.96-7.91 (m, 1H), 7.87 (d J = 8.26 Hz, 1H), 7.85-7.78 (m, 2H), 7.58-7.49

(m, 3H), 7.46 (dd, J = 7.95, 7.95 Hz, 1H), 7.30-7.21 (m, 4H), 7.20-7.14 (m, 1H), 4.98 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.40-4.34 (m, 1H), 4.34-4.29 (m, 1H), 4.29-4.25 (m, 1H), 4.22-4.15 (m,1H), 4.09 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.74 (dd, J = 11.1, 4 Hz, 1H), 2.95-2.79 (m, 2H), 2.21-2.11 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 2H), 1.89-1.83 (2 xs, 3H), 1.63-1.41 (m, 7H), 1.38-1.30 (m, 1H), 1.27-1.22 (m, 1H), 1.12-0.94 (m, 5H),

0.89 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 6.4 Hz, 3H).

PRIMER 24

Jedinjenje 118 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 17.

Zastupljenost rotamera na osnovu NMR ca. (1:6,3):

MS (FAB) m/z: 677.4 (MH<*>); 1 H-NMR (DMSO-d6) 5 8.58 i 8.38 (2 x bs. 1H), 8.04 (d, J = 7.63 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.63 Hz, 1H), 7.91-7.81 (m, 3H), 7.59-7.49 (m, 3H), 7.49-7.43 (m, 1H), 4.98 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.41-4.29 (m, 2H), 4.29-4.14 (m, 2H), 4.1 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.74 (bd, J = 7.63 Hz, 1H), 2.21-

2.12 (m, 1H), 2.04-1.92 (m,2H), 1.90 i 1.84 (2xs,3H), 1.63-1.41 (m, 9H), 1.39-1.26 (m, 3H), 1.21-1.15 (m, 1H), 1.06-0.92 (m, 5H), 0.92-0.80 (m, 9H).

PRIMER 25

Jedinjenje 116 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 17.

<n>H NMR (DMSO-ds) 5 8.36 (s, 1 H), 8.14 (đ, J s= 8 Hz, 1 H), 8.04 (d, J = 8 Hz, 1 H),7.99 (d, J = 9 HZ, 1 H), 7.79 (d, J * 9 Hz, 1 H), 7.33-7.26 (m, 5 H), 4.54-4.42 (m, 3 H), 4.30-4.21 (m, 5 H), 4.06 (d, J = 11 Hz, 1 H), 3.69 (dd, J = Hz, 1 H), 2.62 (dd, J = 16,10 Hz, 1 H), 2.47-2.42 (m, 1 H). 2.18-2.14 (m, 3 H), 2.02-1.87 (m, 2 H), 1.82 (s, 3 H). 1.74-1.66 (m, 2 H), 1.54-1.47 (m, 2H), 1.38-1.27 (m, 2 H), 1.21-1.18 (m, 1 H), 0.97-0.85 (m, 11 H), 0.80-0.70 (m, 7 H).

PRIMER 26

Jedinjenje 121 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 17.

<1>H NMR (DMSO-d6) 5 9.12 (d, J = 6 Hz, 1 H), 8.64 (s, 1 H), 8.30 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.12 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8.05 (dd, J = 8,7 Hz, 1 H), 7.97 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.80 (dd, J=8, 7 Hz, 1 H), 7.66 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.54 (d, J = 6 Hz, 1 H), 5.70-5.61 (m, 2 H), 5.26 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.07 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.52 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.39 (dd, J = 9, 8 Hz, 1 H), 4.23-4.12 (m, 2 H), 4.03-3.99 (m, 1 H), 2.66-2.54 (m, 1 H), 2.35-2.28 (m, 1 H), 2.08 (dd, J = 9,17 Hz, 1 H), 2.01-1.93 (m, 1 H), 1.83 (s, 3 H), 1.65-1.46 (m, 5 H), 1.41-1.38 (m, 1 H), 1.24-1.20 (dd, J = 9, 5 Hz, 1 H), 01.05-0.78 (m, 12 H).

PRIMER 27

Jedinjenje 205 iz tabele 2 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 17.

<1>H NMR (DMSO-de) 5 9.14 (d. J = 6 Hz, 1 H), 8.60 (s, 1 H), 8.32 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.14-8.06 (m, 2 H), 7.98 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.82 (dd, J = 8, 7 Hz, 1 H), 7.66 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.55 (d, J = 8 Hz, 1 H), 5.75-5.66 (m, 2 H), 5.22 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5.07 (d, J = 10 Hz, 1 H), 4.50 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.39 (dd, J = 9, 9 Hz, 1 H), 4.23-4.08 (m, 3 H), 2.56-2.50 (m. 1 H), 2.36-2.28 (m, 1 H), 2.04-1.97 (m, 1 H), 1.82 (s, 3 H), 1.62-1.41 (m, 7 H), 1.24 (dd, J = 5, 4 Hz, 1 H), 0.94-0.75 (m, 12 H).

PRIMER 28

Jedinjenje 117 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 20.

'H NMR (DMSO-d6) 6 8.36 (s, 1 H), 8.17 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.09 (d, J = 8 Hz, 1 H),

8.04 (d, J = 8 HZ, 1 H), 7.96-7.92 (m, 2 H), 7.87 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.77 (d, J = 9 Hz,

1 H), 7.56-7.45 (m, 4 H), 4.99 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.89 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.52 (dd, J = 14, 7 Hz, 1 H), 4.37-4.12 (m, 6 H), 3.78-3.73 (m, 1 H), 2.63 (dd, J = 17, 6 Hz, 1 H), 2.47-2.42 (m, 1 H), 2.22-2.16 (m, 3 H), 2.04-1.86 (m, 2 H), 1.82 (S, 3 H), 1.77-1.71 (m, 1 H), 1.69-1.42 (m, 8 H), 1.30 (quint., J = 8 Hz, 1 H), 1.20 (dd, J = 12, 8 Hz, 1 H), 1.10-0.85 (m, 15 H), 0.76-0.72 (m, 1 H).

PRIMER 29

Jedinjenje 120 iz tabele 1 sintetizovano je prema protokolu opisanom u primeru 20.

<T>H NMR (DMSO-de) 5 8.34 (s, 1 H), 8.12 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.05 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.95-7.87 (m, 3 H), 7.81 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.64-7.52 (m, 4 H), 7.46 (dd, J = 8, 7 Hz, 1 H), 4.99 (d, J = 12 HZ, 1 H), 4.89 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.63 (dd, J s 14, 7 Hz. 1 H), 4.37-4.14 (m, 4 H), 3.74 (dd, J = 11, 4 Hz, 1 H), 3.41-3.35 (m, 2 H), 2.61 (dd, J = 16, 7 Hz, 1 H), 2.44 (dd, J = 16, 8 Hz, 1 H), 2.20-2.15 (m, 1 H), 2.04-1.96 (m, 3 H), 1.82

(s, 3 H), 1.70-1.64 (m, 1 H), 1.56-1.43 (m, 7 H), 1.30 (quint., J = 8 Hz, 1 H), 1.20 (dd,

J = 8, 5 Hz, 1 H), 0.99-0.72 (m, 21 H).

PRIMER 30

Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje NS3 proteaze rekombinantnog HCV tipa lb Serum pacijenta inficiranog HCV-om je nabavljen preko spoljnih saradnika (Bernard Willems MD, Hopital St-Luc, Montreal, Canada i Dr. Donald Murphv, Laboratoire de Sante Publique du Quebec, Ste-Anne de Bellevue, Canada). Napravljena matrica cDNK HCV genoma pune dužine, konstruisana je od fragmenata DNK koji su dobijeni u procesu reverzne transkripcije i reakciji lančanog umnožavanja (RT-PCR), na osnovu RNK iz seruma i korišćenjem specifičnih prajmera selektovanih na osnovu homologije među ostalim genotipovima lb sojeva. Na osnovu određivanja cele genomske sekvence, genotip lb je svrstan u HCV izolat, prema klasifikaciji Simmondsa sa saradnicima (J. Clin. Microb., (1993), 31, p.1493-1503). Za sekvencu amino kiselina nestrukturnog regiona, NS2-NS4B, pokazano je da je preko 93% identična genotipu lb HCV-a (izolata BK, JK i 483) i 88% identična genotipu la HCV-a (HCV-1 izolat). Fragment DNK koji kodira pre-kurzorski poliprotein (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) dobijen je PCR metodom i potom je unet u eukariotski ekspresioni vektor. Nakon prolazne transfekcije, obrada poliproteina koja se vrši posredstvom NS3 proteaze HC virusa, pokazana je prisustvom zrelog NS3 proteina, Western blot analizom. Zreli NS3 protein nije primećen prilikom ekspresije prekurzorskog poliproteina koji sadrži mutaciju S1165A, koja inaktivira NS3 proteazu, što potvrđuje funkcionalnost NS3 proteaze HCV-a.

DNK fragment koji kodira rekombinantnu NS3 proteazu HCV-a (amino kiseline 1027 do 1206) kloniran je u bakterijski ekspresioni vektor pETlld. Ekspresija NS3 proteaze uK coli BL21(DE3)pLysSje indukovana inkubacijom sa lmM IPTG, 3 h na 22 C. Tipična fermentacija (18 lit.) daje odprilike 100 g stelje (wet cell paste). Ćelije su resuspendovane u puferu za lizu (3,0 ml/g) koji sadrži 25 mM natrijum--fosfat, pH 7,5, 10% glicerol (v/v), 1 mM EDTA, 0,01% NP-40 i čuvane su na -80 C. Ćelije su otopljene i homogenizovane a zatim im je dodat 5 mM DTT. Potom su homogenatu dodati magnezijum-hlorid i DNKaza u finalnim koncentracijama od 20 mM, odnosno 20 pg/ml. Nakon inkubacije od 25 minuta na 4 °C, homogenat je sonifikovan i centrifugiran na 15.000 x g 30 minuta na 4 °C. Zatim je pH superna-tanta podešena na 6,5 pomoću IM rastvora natrijum-fosfata.

Dodatni stupanj, hromatografija na gelu, uveden je u dvostepeni postupak za prečišćavanje, opisan u WO 95/22985 (ovde uvrštena u reference). Ukratko, super-natant bakterijskog ekstrakta je unet u SP HiTrap kolonu (Pharmacia), koja je predhodno ekvilibrisana pri protoku od 2 ml/min, u puferu A (50 mM natrijum--fosfat, pH 6,5, 10% glicerol, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01% NP-40). Kolona je potom isprana puferom A koji sadrži 0,15 M NaCl i proteaza je eluirana primenom 10 volumena kolone, linearnog gradijenta, od 0,15 do 0,3 M NaCl. Frakcije koje su sadržavale NS3 proteazu su sjedinjene i razblažene tako da je finalna koncentracija NaCl iznosila 0,1M. Enzim je dalje prečišćen na HiTrap Heparin koloni (Pharmacia) ekvilibrisanoj u puferu B (25 mM natrijum-fosfat, pH 7,5, 10% glicerol, 5 mM DTT, 0,01% NP-40). Uzorak je nanošen pri protoku od 3 ml/min. Kolona je zatim isprana puferom B koji sadrži 0,15 M NaCl, pri protoku od 1,5 ml/min. Dvostepe-na ispiranja su izvođena u prisustvu pufera B koji je sadržavao 0,3 ili IM NaCl. Proteaza je oporavljena ispiranjem sa 0.3M rastvorom NaCl, trostruko je razblažena rastvorom B, a zatim ponovo naneta na HiTrap Heparin kolonu i eluirana puferom B sa 0,4M NaCl. Konačno, frakcija koja sadrži NS3 proteazu je naneta na Superdex<®>75 HiLoad 16/60 kolonu (Pharmacia) koja je ekvilibrisana u puferu B sa 0,3M HiLoad 16/60 kolonu (Pharmacia) koja je ekvilibrisana u puferu B sa 0,3M NaCl. Čistoća NS3 proteaze HC virusa dobijena iz sakupljenih frakcija procenjena je na više od 95%, metodom SDS elektroforeze na poliakrilamidnom gelu, a zatim denzitometrijskom analizom.

Enzim je čuvan na -80 °C a otapan je na ledu neposredno pre upotrebe.

Primer 31

Radiometrijski test, recombinanta NS3 proteaza HCV-a/peptidni NS4Akofaktor Enzim je kloniran, eksprimiran i pripremljen po protokolu opisanom u primeru 30. Enzim je čuvan na -80 °C a topljen je na ledu i rastvaran neposredno pre upotrebe u puferu za test, koji sadrži peptidni kofaktor NS4A

Supstrat DDrvTC-SMSYTW koji je korišćen u radiometrijskom testu NS3 protea-za/NS4A peptidni kofaktor, enzim je sekvencu DDIVPC-SMSYTW sekao između cisteinskih i serinskih ostataka. Sekvenca DDIVPC-SMSYTW odgovara normal-nom mestu sečenja (obrade) NS5A/NS5B, na kome je cisteinski ostatak u P2 zam-enjen prolinom. Peptidni supstrat DDIVPC-SMSYTW i obeleživač biotin-DDIVPC-SMS[<125>I-Y]TW, inkubirani su sa rekombinantnom NS3 proteazom i sa NS4A pep-tidnim kofaktorom KKGSVVIVGRIILSGRK (molski odnos, enzim:kofaktor 1:100), sa i bez inhibitora. Odvajanje supstrata od proizvoda je izvođeno dodavanjem avidinom obloženih agaroznih kuglica smeši za test, a zatim filtracijom. Količina proizvoda SMS[<125>I-Y]TW nađena u filtratu omogućava izračunavanje procenta konverzije supstrata i procenta inhibicije.

A. Reagensi

Tris i Tris-HCl (Ultra Pure) su nabavljeni od Gibco-BRL-a. Glicerol (Ultra Pure), MES i BSA su kupljeni u Sigmi. TCEP je nabavljen od Pierce-a, DMSO od Aldrich--a, a NaOH ođ Anachemia.

Pufer za test 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 30% (mas./v) glicerol, 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP (TCEP se dodaje neposredno pre upotrebe iz IM osnovnog (stok) rastvora u vodi).

Supstrat DDIVPC-SMSYTW, 25 pM finalne koncentracije (od 2 mM osnovnog rastvora u DMSO Čuvan na -20 °C kako bi se izbegla oksidacija).

Obeleživač: redukovani monojodirani supstrat bioun-DDIYTC-SMS[<125>I-Y]TW (~1 nM finalne koncentracije).

NS3 proteaza tipa lb HCV-a, 25 nM finalne koncentracije (od osnovnog rastvora u 50 mM natrijum-fosfata, pH 7,5, 10% glicerol, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,01% NP-40).

NS4A peptidni kofaktor: KKGSVVIVGRIILSGRK, 2,5 pM finalne koncentracije (od 2 mM osnovnog rastvora u DMSO-u, čuvano na -20 °C).

B. Protokol

Test je izveden u polistirenskim mikrotitar pločama sa 96 udubljenja (sudića) od Costar-a. Svako udubljenje je sadržavalo: • 20 pl supstrata / obeleživač u puferu za test; • 10 pl ± inhibitora u 20% DMSO / pufer za test;

• 10 pl NS3 proteaze lb / NS4 peptidni kofaktor (molski odnos 1:100).

Šlepa proba (bez inhibitora i bez enzima) i kontrola (bez inhibitora), takode su pripremljeni na istoj ploči za test

Enzimska reakcija je otpočela dodavanjem enzima/peptidnog rastvora NS4A a zatim je smeša za test inkubirana 40 minuta na 23 °C, sa blagim mućkanjem. Zatim je dodato deset (10) pl 0,5M NaOH i 10 pl IM MES, pH 5,8, radi prekidanja enzimske reakcije.

Dvadeset (20) pl avidinom obloženih agaroznih kuglica (kupljenog od "Pierce-a")

je dodato u filtracionu ploču Milipore MADP N65. Test smeša, predhodno "presečena" (prekinuta), prebačena je u filtracionu ploču i inkubirana 60 minuta na 23 °C, uz blago pokretanje.

Ploče su filtrirane korišćenjem Milipore MultiScreen Vacuum Manifold Filtration aparature, i 40 ml filtrata je prebačeno u neprozirne mikrotitar ploče sa 96 udubljenja koje su sadržavale svaka po 60 pl scintilacione tečnosti.

Filtrati su mereni Packard TopCunt instrumentom, korišćenjem postupka za rad sa<125>I, u tečnosti, u trajanju od 1 minuta.

Procenat inhibicije je izračunavan prema sledećoj formuli:

100 - [ (vrednostinh - vrednos<t>siepepr.) / (vrednostcti - vrednostsiepg pr) x 100 ]

Nelinearna kriva koja odgovara Hilovom modelu upotrebljena je za podatke inhibicija/koncentracija, a 50% efektivne koncentracije (IC50) Je izračunato upotrebom SAS softvera (Statistical Sofrvvare System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Primer 32

Test heterodimernog proteina NS3-NS4A pune dužine

Nekodirajući NS2-NS5B-3' region, kloniranje pomoću RT-PCR-om u vektor pCR®3 (Invitrogen), upotrebom RNK izolovane iz seruma individua zaraženih HCV-om genotipa lb (obezbeđenih od Dr. Bernard Willems Hopital St-Luc, Montreal, Quebec, Canada). NS3-NS4A DNK region je zatim PCR-om subkloniran u ekspresioni vektor HTa baculo-virusa pFastBac™ (Gibco/BRL). Vektorska sekvenca sadrži i region koji kodira 28-ostatak N-terminalne sekvence, koja vsadrži heksahistidinski dodatak. Baculovirusni Bac-to-Bac™ ekspresioni sistem (Gibco/- BRL) je korišcen za proizvodnju baculovirusnog rekombinanta. Infekcijom sa IO<6>Sf21 ćelija/ml sa rekombinantom baculovirusa pri višestrukoj infekciji od 0,1 - 0,2 pri 27 °C, bili su eksprimirani zreli NS3 pune dužine i NS4A heterodimerni protein (His-NS3-NS4AFL). Inficirana kultura je pokupljena 48 - 64 časova kasnije centrifu-giranjem na 4 °C. Celijski talog je homogenizovan u 50 mM NaP04, pH 7,5, 40% glicerola (mas./v), 2 mM B-merkaptoetanola, u prisustvu koktela inhibitora proteaze. His-NS3-NS4AFL je zatim ekstrahovan iz ćelijskog lizata sa 1,5 % NP-40, 0,5 % Triton X-100, 0.5M NaCl, i tretiran DNKazom. Nakon ultracentrifugiranja rastvo-reni ekstrakt bio je razblažen 4 puta i nanet na Hi-Trap Ni-helatacionu kolonu (Pharmacia). His-NS3-NS4AFL je eluiran u >90% čistom obliku (sudeći po SDS elektroforezi na poliakrilamidnom gelu), korišćenjem 50 - 400 mM gradijenta imi-dazola. His-NS3-NS4AFL je čuvan na -80 °C u 50 mM natrijum-fosfatu, pH 7,5,10 %

(mas./v) glicerolu, 0,5M NaCl, 0,25 mM imidazolu, 0,1 % NP-40. Otopljavan je na ledu i razblaživan neposredno pre upotrebe.

Aktivnost proteaze His-NS3-NS4AFL je bila određena u 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,25 M natrijum citrata, 0,01 % (mas./v) n-dodecil-B-D-maltozide, 1 mM TCEP. Po pet (5) pM potpuno "utišanog" supstrata antranilil-DDIVPAbu[C(0)-0]-AMY (3-N02)TW-OH u prisustvu različitih koncentracija inhibitora, inkubirano je sa 1,5 nM His-NS3-NS4AFL u trajanju od 45 minuta na 23 °C. Finalna koncentracija DMSO-a nije prelazila 5,25 %. Reakcija je prekinuta dodavanjem 1 M MES, pH 5,8. Fluorescencija N-terminalnog produkta praćena je na fluorometru Perkin-Elmer LS-50B, opremljenom sa čitačem za mikrotitar ploče sa 96 udubljenja (talasna dužina pobuđivanja: 325 nm, emisiona dužina talasa: 423 nm). Nelinearna kriva koja odgovara Hilovom modelu upotrebljena je zatim za podatke inhibicija/- koncentracija, i 50% efektivne koncentracije (IC50) je izračunato upotrebom SAS softvera (Statistical Softvvare Svstem; SAS

Institute, Inc. Cary, N.C.)

Primer 33

Test baziran na ćelijama sa NS3 proteazom

Ovaj test je izveden sa sa Huh-7 ćelijama, humane ćelijske linije proizvedene od hepatoma, kotransfektovane sa 2 DNK konstrukta: - jednim koji eksprimira poliprotein koji sadrži nestrukturne proteine HCV-a fuzionisane u tTA sledećim redosledom: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA (nazvanim NS3); - drugim koji eksprimira reporter protein, koji luči alkalnu fosfatazu, pod kontro-lom tTA (nazvanim SEAP).

Poliprotein mora biti isečen NS3 proteazom kako bi zreli proteini bili oslobođeni. Usled oslobađanja zrelih proteina, veruje se da virusni proteini formiraju kompleks na membrani endoplazmatiČnog retikuluma, dok tTA migrira u jedro i transak-tivira SEAP gen. Zbog toga, smanjenje proteolitičke aktivnosti NS3 poliproteina trebalo bi da dovede do smanjenja nivoa zrelog tTA i do pratećeg pada aktivnosti SEAP-a.

U cilju kontrole drugih efekata jedinjenja, izvršene su paralelne transfekcije gde je konstrukt koji eksprimira samo tTA (nazvan tTA) bio kotransfektovan sa SEAP konstruktom tako daje aktivnost SEAP-a nezavisna od proteolitičke aktivnosti NS3 poliproteina.

Protokol testa: Huh-7 ćelije gajene u CHO-SFMII +10% FCS (fetalni goveđi serum) su kotrnsfektovane sa bilo NS3 i SEAP ili tTA i SEAP, korišćenjem FuGene proto-kola (Boehringer Mannheim). Nakon 5 sati, na 37 °C, ćelije su oprane, tripsinizo-vane i zasađene (80.000 ćelija/udubljenju) u mikroititar ploče sa 96 udubljenja koja su sadržavala opseg koncentracija jedinjenja koje se testira. Nakon 24-časovne inkubacije uziman je uzorak medijuma pa je u tom alikvotu merena aktivnost SEAP-a, korišćenjem Phospha-Light komercijalnog kompleta (Tropbc).

Analiza procenta inhibicije aktivnosti SEAP-a, u zavisnosti od koncentracije jedinjenja, vršena je sa SAS softverom kako bi se dobio EC50.

Toksičnost sastojka (TC5o) je zatim utvrđena korišćenjem MTT testa na sledeći način: 20 pl MTT rastvora (5 mg/ml medijuma) je dodato u svako udubljenje na mikrotitar ploči i inkubirano je 4 sata, na 37 °C;

medijum je uklonjen i dodato je 50 ul 0.01M HC1 + 10% Triton X-100;

nakon mućkanja na sobnoj temperaturi bar 1 čas, OD svakog udubljenja je očitana pri talasnoj dužini od 595 nm.

TC50je izračunat na isti način kao i EC50

Primer 34

Specifičnost testova

Specifičnost jedinjenja je određivana prema raznolikosti serinskih proteaza: humane leukocitne elastaze, elastaze pankresa svinje i pankreasnog a-himotripsina govečeta i jedne cisteinske proteaze: humanog katepsina B jetre. U svim slučajevima sa mikrotitar pločama sa 96 udubljenja, upotrebljen je protokol koji koristi kolorimetrijski p-nitroanilin (pNA), supstrat specifičan za svaki korišćeni enzim. Svaki test je sadržavao jednočasovnu preinkubaciju sa inhibitorom enzima na 30 °C, praćenu dodavanjem supstrata i hidrolize do « 30% konverzije, merene na UV Thermomax® čitaču mikrotitar ploča. Koncentracije supstrata su održavane što je niže moguće u poređenju sa Kmu cilju smanjenja supstratne kompeticije. Koncentracije jedinjenja su varirale od 300 do 0,06 pM u zavisnosti od njihove potencije. Konačni uslovi za svaki test su bili sledeći: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M Na2S04, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01%Tween-20 sa;

[100 pM Succ-AAPF-pNA i 250 pM a-himotripsina], [133 pM Succ-AAA-pNA i 8 nM elastaze svinje], [133 pM Succ-AAV-pNAi 8 nM elastaze leukocita]; ili [100 mM NaHP04pH 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP, 0,01% Tween-20, 30 pM Z-FR-pNA i 5 nM katepsina B (enzim iz stoka je pre upotrebe aktiviran u puferu koji sadrži 20 mM TCEP-a)].

Reprezentativni primer prikazan je u sledećem, za elastazu pankreasa svinje:

U polistirenskoj mikrotitar ploči sa 96 udubljenja sa ravnim dnom korišćenjem Biomek poluautomatske pipete (Beckman) dodato je: . 40 pl pufera za test (50 mM Tris-HCl pH 8,50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA); * 20 pl rastvora enzima (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02%Tween-20,40 nM pankreasne elastaze svinje); i 20 pl rasvora inhibitora (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02%Tween-20,1,5 mM -0,3 pM inhibitora, 15 % (v/v) DMSO). Nakon preinkubatije od 60 min, pri 30 °C, dodato je 20 pl rastvora supstrata 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 M Na2S04, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 pM Succ-AAA-pNA) u svako udubljenje, pa je reakcioni sistem zatim inkubiran na 30 °C u trajanju od 60 min, posle čega je očitana apsorpcija na Thermomax® UV čitaču mikrotitar ploča. Redovi udubljenja su određeni kao kontrole (bez inhibitora) i kao slepe probe (bez inhibitora i bez enzima).

Sledeće dvostruko razblaživanje rastvora inhibitora je izvedeno na posebnoj ploči sa 50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20, 15 % DMSO, korišćenjem poluautomatske pipete. Svi ostali testovi specifičnosti su izvršeni na sličan način.

Procenat inhibicije je računat prema sledećoj formuli:

Nelinearna kriva koja odgovara Hilovom modelu upotrebljena je za podatke inhibicija/koncentracija, a 50 % efektivne koncentracije (IC5o) je izračunato upotrebom SAS softvera (Statistical Software Svstem; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

TABELE JEDINJENJA

Jedinjenja prema pronalaska su testirana bilo u jednom ili u oba testa, primera 31 i 32, i nađeno je da su aktivna sa IC50ispod 50 pM( A) ;ispod 5 pM( B)ili ispod 0,5 pM( C).

Aktivnost u ćelijama i specifičnost

Reprezentativna jedinjenja prema pronalasku su takođe testirana u surogat testu, baziranom na ćelijama primera 33, i u jednom od nekoliko testova primera 34. Na primer, za jedinjenje 233, iz tabele 2, nađeno je da ima IC5nod 1 nM u testu iz primera 32. EC5o, kako je određen u testu iz primera 33 iznosi 5,4 pM, dok drugi efekti (tTA) nisu mogli da se utvrde pri koncentracijama do 120<p>M. Jedinjenje 233 takođe je testirano u MTT testu i nađeno je da je njegovo TC50veće od 120 pM, što ukazuje da to jedinjenje nije toksično pri koncentracijama pri kojima je efikasno. Na osnovu specifičnosti testova iz primera 34 nađeno je da isto jedinjenje ima sledeću aktivnost: HLE >75 pM; PPE >75 pM; a-Chim. >75 pM; CatB >75 pM.

Ovi rezultati ukazuju na to da je ova familija jedinjenja visokospecifična za NS3 proteazu.

Sledeće tabele nabrajaju reprezentativne uzorke na osnovu pronalaska. Korišćene su sledeće skraćenice: MS: podaci masene spektrometrije; Ac: acetil; Bn: benzil; Chg: cikloheksilglicin (2-amino-2-cikloheksil-sirćetna kiselina); Dnl: danzil; O-Bn: benziloksi; Pip: pipekolinska kiselina; Tbg: ferc-butilglicin.

Claims (1)

1. Jedinjenje formule (I), uključujući racemate, dijastereoizomere i optičke izomere:

   u kojoj

   a jeste 0 ili 1; b jeste 0 ili 1; Y jeste H ili C^g alkil grupa;

   B je H, acil derivat formule R7-C(O)- ili sulfonil, formule R7-SO2gde

   R7jeste grupa (i) Cmoalkil eventualno supstituisana sa grupom karboksil, Ci_6alkanoiloksi ili C^g alkoksi; (ii) C3.7cikloalkil eventualno supstituisana sa grupom karboksil,

   (Ci.6alkoksi)karbonil ili fenilmetoksikarbonil; (iii) C6ili C10aril ili C7.16aralkil eventualno supstituisane sa grupom Ci.5alkil, hidroksi, ili amino eventualno supstituisanom saC\. qalkilom;

   ili (iv) Het eventualno supstituisana sa grupom C^g alkil, hidroksi, amino eventualno supstituisanom sa Cwalkilom, ili amido eventualno supstituisanom sa C^ alkilom;

   Rg jeste C^s alkil supstituisan sa karboksilom;

   R5jeste C1.6alkil eventualno supstituisan sa karboksilom;

   R4 je Cmo alkil, C3.7cikloalkil ili C440(alkilcikloalkil);

   R3je Cmo alkil, C3.7 cikloalkil ili C^o (alkilcikloalkil);

   R2 je CH2-R2f>NH-R20,0-R20 ili S-R20, gde R20 jeste zasićen ili nezasićen C3.7cikloalkil ili C440(alkil cikloalkil) eventualno mono-, di- ili tri-supsittuisani sa R21,

   ili R20je C5ili Cio aru ili C7-16aralkil eventualno mono-, di ili tri-supstituisani sa R21

   ili R2o je Het ili (niži alkil)-Het eventualno mono-, di- ili tri-supstituisani sa ?21.

   gde svaki R2ijeste nezavisno grupa C^ alkil; Ch6alkoksi; amino eventualno mono- ili di-supstituisana sa C^ alkilom; sulfonil; N02; OH; SH; halogeno; halogenoalkil; amido eventualno mono supstituisana sa grupom Cj.6alkil, C6ili C^ aril, C7„i6aralkil, Het ili (niži alkil)-Het; karboksil; karboksi(niži alkil); C6ili C10aril, C7.i6aralkil ili Het, a pomenute aril, aralki ili Het eventualno su supstituisane sa R22;

   gde R22jeste C1.6alkil; Cwalkoksi; amino eventualno mono- ili di-supstituisana sa Ci_6alkilom; sulfonil; N02; OH; SH; halogeno; halogenoalkil; karboksil; amid; ili (niži alkil) amid;

   Rije Ci_6alkil ili C2.6alkenil eventualno supstituisane sa halogenom; a W je hidroksi ili N-supstituisana amino grupa;

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar, pod uslovom da je jedinjenje formule (I) isključeno,

   gde

   B je acetil,

   a i b su 0,

   P4 predstavlja cikloheksilglicin amino kiselinu (Chg);

   P3 predstavlja valin amino kiselinu (Val);

   R2 predstavlja benziloksi (O-Bn);

   Pl predstavlja racemsku grupu formule

   i W predstavlja OH.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što B jeste H ili acil derivat formule R7-C(O)-, gde R7jeste Ci.g alkil; Ci_6alkoksi; C3.7cikloalkil eventualno supstituisan hidroksilom; amido eventualno supstituisan sa grupom C^g alkil ili Het; C6ili C!0a"!. C7-16aralkil ili Het svi eventualno supstituisani sa grupom Cj.g alkil ili hidroksi. Jedinjenje prema zahtevu 2, što R7jeste C^g alkil ili Het Jedinjenje prema zahtevu 3, što pomenuti Het jeste izabran iz grupe koja se sastoji od:

   Jedinjenje prema zahtevu 2, što je B odabrano iz grupe koju čine: H; acetil;

   Jedinjenje prema zahtevu 5, što B jeste acetil.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što B jeste R7-SO2a R7je Cg ili C^ aril, C7.16aralkil ili Het svi eventualno supstituisani sa C^ alkilom.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što Rg, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp ili Glu.

   Jedinjenje prema zahtevu 8, što Rg, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što a jeste 0 a tada je Rg odsutan.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac amino kiseline odabrane iz grupe koju čine: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-buitlglicin CTbg) i L-Tbg.

   Jedinjenje prema zahtevu 11, što R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Asp, D-Val ili D-Glu.

   Jedinjenje prema zahtevu 12, što R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Glu.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što R4jeste bočni lanac amino kiseline odabrane iz grupe koju čine: Val, cikloheksilglicin (Chg), Tbg, Ile ili Leu.

   Jedinjenje prema zahtevu 14, što R4 jeste bočni lanac u Chg ili Ile. Jedinjenje prema zahtevu 15, što R4 jeste bočni lanac u Chg.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što Y jeste H, ili Me.

   Jedinjenje prema zahtevu 17, što Y jeste H.

   Jedinjenje prema zahtevu 1, što R3jeste bočni lanac amino kiseline odabrane iz grupe koju čine: Ile, Chg, Val ili Tbg.

   Jedinjenje prema zahtevu 19, što R3 jeste bočni lanac u Val, Chg ili Tbg. Jedinjenje prema zahtevu 20, što R3 jeste bočni lanac u Val ili Tbg. Jedinjenje prema zahtevu 1, što R2 jeste S-R20, O-R20, gde R20jeste grupa Cg ili Cioaril, C7.16aralkil, Het ili -CH^Het, sve eventualno mono-, di- ili tri-supstituisane sa R21;

   gde R2ijeste grupa C^alkil, Ch6alkoksi; amino, mono- ili di(niži alkil)amino; amido eventualno monosupstituisana sa grupom C1.6alkil, Cg ili Cioaril, C7.j6aralkil, Het ili (niži alkil)-Het; N02; OH; halogeno; trifluorometil; karboksil; Cg ili C10aril, C7.i6aralkil, ili Het, a pomenute aril, aralkil ili Het eventualno su supstituisane sa R^;

   gde R22 jeste Ci„g alkil; C^g alkoksi; amino; mono- ili di-(niži alkil)-amino; (niži alkil)amid; N02; OH; halogeno; trifluorometil;

   ili karboksil.

   Jedinjenje prema zahtevu 22, što R2ijeste Cwalkil; CM alkoksi; amino; di(niži alkil)amino; (niži alkil)amid; Cg ili Cjoaril, ili Het, a pomenuti aril ili Het eventualno su supstituisani sa R22, gde R22jeste C^g alkoksi; amino; di(niži alkil) amino; (niži alkil)amid; halogeno ili trifluorometil.

   Jedinjenje prema zahtevu 22, što R2jeste 1-naftilmetoksi; 2-naftilmetoksi; benziloksi, 1-naftiloksi; 2-naftiloksi; ili hinolinoksi, nesupstituisan, mono- ili di-supstitisan sa R2igde R2ijeste kao što je definisano u zahtevu 23.

   Jedinjenje prema zahtevu 22, što R2jeste 1-naftilmetoksi; ili hinolinoksi, nesupstituisan, mono- ili di-supstitisan sa R2igde R21jeste kao što je definisano u zahtevu 23.

   Jedinjenje prema zahtevu 25, što R2 jeste: gde R2iajeste amido grupa eventualno supstituisana sa grupom C^g alkil, C6ili C10aril, C7.16aralkil ili Het; C6ili C^ aril ili Het eventualno supstituisani sa R22, a R22 jeste amino, di(niži alkil) amino; ili (niži alkil)amid; a R2ib jeste C^g alkil; C^g alkoksi; amino; di(niži alkil)amino; (niži alkil)amid; N02; OH; halogeno; trifluorometil; ili karboksil. Jedinjenje prema zahtevu 26, što R2ia jeste Cg ili Cio aril ili Het, svi eventualno supstituisani sa R^ a R22jeste amino, dimetilamino ili acetamido grupa. Jedinjenje prema zahtevu 26, što R2ibjeste C^g alkoksi ili di (niži alkil) amino grupa. Jedinjenje prema zahtevu 28, što R21g jeste metoksi grupa. Jedinjenje prema zahtevu 1, što asimetričan atom ugljenika u položaju 1 ima .^konfiguraciju, prikazanu pomoću sledeće apsolutne konfguracije:

   gde Ri jeste kao što je definisano u zahtevu 1.

   Jedinjenje prema zahtevu 30, što je Risupstituent na Pl orijentisansynu odnosu na karbonil grupu kao što je prikazano sledećom apsolutnom konfiguracijom: gde Rijeste metil, etil, propil, vinil, od kojih su svi eventualno supstituisani sa halogenom. Jedinjenje prema zahtevu 31, što Rx jeste etil, vinil ili bromovinil. Jedinjenje prema zahtevu 32, što Rijeste vinil. Jedinjenje prema zahtevu 1, što W jeste hidroksi grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar; ili (niži alkil)amino, di(niži alkil)amino ili amino aralkil. Jedinjenje prema zahtevu 32, što W jeste hidroksi, ili NOR^JR^t,, gde R13ai Ri3b jesu nezavisno H, aril ili C? alkil eventualno supstituisani sa grupom hidroksi ili fenil; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Jedinjenje prema zahtevu 35, što W jeste -OH, -NH-benzil ili -NH-CH(Me)Ph. Jedinjenje prema zahtevu 36, što W jeste -OH ili -NH-fSJCH (Me)-fenil. Jedinjenje prema zahtevu 37, što W jeste estar, a pomenuti estar je odabran iz grupe koju čine: Cw alkoksi, fenoksi, ili aril(Ci.6alkoksi). Jedinjenje prema zahtevu 38, što pomenuti estar jeste metoksi, etoksi, fenoksi, benziloksi ili PhCH(Me)-0-. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, što B jeste H, niži alkilC(O)- ili Het-C(O)-; Rg, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp ili Glu; R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D- ili L-: Asp, Glu, Val ili Tbg: Y jeste H ili metil; Rtjeste bočni lanac u Val, Chg, Tbg, Ile ili Leu; R3je vodonik ili bočni lanac u Ile, Chg, Val ili Tbg; R2 je 1-naftilmetoksi, 2-naftilmetoski, O-Bn, gde R22 jeste amino, di (niži alkil)amino, (niži alkil)amid, NO2, OH, halogeno, CF3, ili COOH grupa; Pl je ciklopropilni prstenasti sistem formule gde Rijeste etil, vinil ili bromovinil; a W je hidroksi grupa ili N (Ri3a)Ri3bgde R13ai R13bjesu nezavisno H, aril ili Ci_g alkil eventualno supstituisani sa grupom hidroksi ili fenil; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, što B jeste H, acetil ili Het-C(O)-; Rg, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp; R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D -Asp, D -Glu ili D -Val; Y je H; R4je bočni lanac u Chg ili Ile; R3je bočni lanac u Val, Chg ili Tbg; R2je 1-naftilmetoksi, benziloksi, 4-hinolinoksi, ili Pl je ciklopropilni prstenasti sistem formule gde Rjjeste Et ili CH=CH2ili CH=CHBr; a W je hidroksi grupa ili NH-(S^ -CHMePh, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, što B jeste acetil; Rg, kada je prisutan, jeste bočni lanac u Asp; R5, kada je prisutan, jeste bočni lanac u D-Glu; Y je H; R4je bočni lanac u Chg; R3je bočni lanac u Val ili Tbg; R2je: Pije:

   W je hidroksi grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar.

   Jedinjenje prema zahtevu 40, prikazano formulom:

   u kojoj su B, P6, P5, P4, P3, R2i Ridefinisani kao što sledi: 44. Jedinjenja prema zahtevu 40, prikazano formulom:

   u kojoj su P6, P5, P4, P3, R2i Ridefinisani kao što sledi:

   Jedinjenja prema zahtevu 40, prikazano formulom:

   kojoj su B, P6, P5, P4, P3, R2, Rii W definisani kao što sledi:

   Jedinjenja prema zahtevu 40, prikazano formulom:

   u kojoj su B, Y, P4, P3, R2i Ridefinisani kao što sledi:

   Jedinjenja prema zahtevu 40, prikazano formulom:

   u kojoj su B i R2odefinisani kao što sledi:

   Heksapeptid formule I, prema zahtevu 43, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 108; 116; 117 i 120.

   Heksapeptid formule I, prema zahtevu 44, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 212; 222; 236 i 238.

   Heksapeptid formule I, prema zahtevu 45, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 301 i 302.

   Tetrapeptid formule I, prema zahtevu 43, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 122 i 123.

   Tetrapeptid formule I, prema zahtevu 44, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 202; 203; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 214; 215; 216; 218; 219; 220; 221; 223; 224; 225; 226; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235.

   Tetrapeptid formule I, prema zahtevu 46, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 401.

   Tetrapeptid formule I, prema zahtevu 47, odabran iz grupe koju čine jedinjenja #: 501; 502; 503; 504; 505; 506; 507; 508; 509; 510 i 511.

   Jedinjenje, prema bilo kom od zahteva 1 do 54, kao medikament. Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-hepatitis C virusno efikasnu količinu jedinjenja formule I, prema zahtevu 1, ili njegovu terapeutski prihvatljivu so ili estar, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosećim medijumom ili pomoćnim sredstvom.

   Upotreba jedinjenja formule I, prema zahtevu 1, ili njegove terapeutski prihvatljive soli ili estra za pripremu medikamenta za lečenje infekcije izazvane hepatitis C virusom.

   In vitropostupak inhibiranja replikacije hepatitis C virusa putem izlaganja virusa količini jedinjenja formule I, prema zahtevu 1, koja inhibira virusnu NS3 proteazu hepatitisa C, ili njegovoj terapeutski prihvatljivoj soli ili estra, ili kompoziciji prema zahtevu 56.

   Upotreba kombinacije jedinjenja formule I, prema zahtevu 1, ili njegove terapeutski prihvatljive soli ili estra, i interferona u pripremi medikamenta za lečenje infekcije izazvane hepatitis C virusom.

   Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 56 koja sadrži još i drugo antivirusno sredstvo.

   Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 60, što drugo pomenuto anti- -virusno sredstvo jeste ribavirin ili amantadin.

   Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 56, koja sadrži još i druge inhibitore HCV proteaze.

   Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 56, koja sadrži inhibitor drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, odabran između: helikaze, polimeraze, metaloproteaze ili IRES-a.

   Postupak za pripremanje peptidnog analoga formule (I), prema zahtevu 1, gde Pl jeste ostatak supstituisane aminociklopropil-karboksilne kiseline, što sadži stupanj: • kuplovanja peptida odabranog iz grupe koju čine: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; i APG-P2; • sa intermedijerom Pl, formule:

   u kojoj Ri jeste grupa Ci.6alkil ili C2-6alkenil, eventualno supstituisane sa halogenom, CPG je zaštitna grupa karboksila, a P6 do P2 su definisani kao u zahtevu 1.

   Postupak za pripremanje peptidnog analoga formule (I), prema zahtevu 1, gde je Pl ostatak supstituisane aminociklopropil-karboksilne kiseline,

   što sadži stupanj: • kuplovanja peptida odabranog iz grupe koju čine: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; i APG-P2; • sa intermedijerom Pl, formule:

   u kojoj Rijeste etil, vinil ili bromovinil grupa, CPG je zaštitna grupa karboksila, a P6 do P2 su definisani kao u zahtevu 1.

   Postupak za pripremanje peptidnog analoga formule (I), prema zahtevu 1, gde je Pl ostatak supstituisane aminociklopropil-karboksilne kiseline, što sadži stupanj: • kuplovanja peptida odabranog iz grupe koju čine: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; i APG-P2; • sa intermedijerom Pl, formule:

   u kojoj CPG je zaštitna grupa karboksila, a P6 do P2 su definisani kao u zahtevu 1.

   Postupak prema zahtevu 64, 65 ili 66, što pomenuta zaštitna karboksilna grupa (CPG) jeste odabrana iz grupe koju čine:

   alkil estri, aralkil estri, i estri koji mogu da se razlože putem blago baznog tretiranja ili pomoću blagog redukcionog sredstva.

   Upotreba amino kiselinskog analoga, formule: što Rijeste C^g alkil ili C2.6alkenil eventualno supstituisani sa halogenom, za pripremanje jedinjenja formule I, prema zahtevu 1. Upotreba amino kiselinskog analoga, formule:

   što Rijeste etil, vinil ili bromovinil, za pripremanje jedinjenja formule I, prema zahtevu 1.

   Upotreba amino kiselinskog analoga, formule: za pripremanje jedinjenja formule I, prema zahtevu 1.