ES2257066T3 - Peptidos inhibidores de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I), incluyendo los racematos, diaestereoisómeros e isómeros ópticos: en la que a es 0 ó 1; b es 0 ó 1; Y es H o alquilo C1-C6; B es H, un derivado de acilo de fórmula R7-C(O)- o un sulfo nilo de fórmula R7-SO2, en la que R7 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C1-C6 o alcoxi C1-6; (ii) cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con carboxilo, (alcoxi C1-6)carbonilo o fenilmetoxicarbonilo; (iii) arilo C6 o C10 o aralquilo C7-16 opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-C6; o (iv) Het opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, hidroxi, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, o amido opcionalmente sustituido con alquilo C1-6; R6 es alquilo C1-6 sustituido con carboxilo; R5 es alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con carboxilo; R4 es alquilo C1-10, cicloalquilo C3-7 o (alquilcicloalquilo)C4-10; R3 es alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C7 o (alquilcicloalquilo)C4-C10; R2 es CH2-R20, NH-R20, O-R20 o S-R20, en donde R20 es un cicloalquilo C3-7 saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo)C4-10 que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R21.

Description

Péptidos inhibidores de la hepatitis C.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (HCV). En particular, la presente invención proporciona nuevos péptidos, y análogos de los mismos, composiciones farmacéuticas que contienen tales péptidos, y métodos para usar estos péptidos en el tratamiento de la infección por HCV.

Fundamento de la invención

El virus de la hepatitis C (HCV) es el principal agente etiológico de la hepatitis no-A no-B adquirida después de una transfusión y en comunidad del mundo. Se estima que más de 150 millones de personas están infectadas por el virus en todo el mundo. Un elevado porcentaje de portadores se convierten en infectados crónicos y muchos progresan hasta la enfermedad crónica del hígado, la llamada hepatitis C crónica. Este grupo es a su vez de alto riesgo para graves enfermedades del hígado tales como la cirrosis hepática, el carcinoma hepatocelular y enfermedades hepáticas terminales que producen la muerte.

El mecanismo por el cual el HCV establece persistencia viral y produce una tasa elevada de enfermedad hepática crónica, no ha sido totalmente dilucidado. Se sabe cómo el HCV interacciona con el sistema inmunitario del hospedador y lo elude. Además, aún están por establecer los papeles que desempeñan las respuestas inmunitarias celulares y hormonales en la protección contra la infección por el HCV y contra la enfermedad. Se han publicado inmunoglobulinas para la profilaxis de la hepatitis viral asociada a transfusiones. Sin embargo, actualmente el Centro para el Control de Enfermedades no recomienda inmunoglobulinas con esta finalidad. La falta de una respuesta inmunitaria protectora eficaz está impidiendo el desarrollo de una vacuna o de medidas profilácticas posteriores a la exposición adecuadas, por lo que a corto plazo las esperanzas están firmemente cifradas en intervenciones antivira-
les.

Se han llevado a cabo diversos estudios clínicos con el objetivo de identificar agentes farmacéuticos capaces de tratar eficazmente la infección por HCV en pacientes que padecen hepatitis C crónica. Estos estudios han implicado el uso de interferón-alfa, sólo o en combinación con otros agentes antivirales. Tales estudios han demostrado que un número sustancial de los participantes no responden a estas terapias y se encontró que, de los que sí responden favorablemente, una elevada proporción recae después de la terminación del tratamiento.

Hasta hace poco, el interferón (IFN) era la única terapia disponible de beneficio probado, aprobada en la clínica para pacientes con hepatitis C crónica. Sin embargo, la velocidad de respuesta sostenida es baja y el tratamiento con interferón produce también graves efectos secundarios (p. ej. retinopatía, tiroiditis, pancreatitis aguda, depresión, etc.) que reduce la calidad de vida de los pacientes tratados. Recientemente se ha aprobado el interferón en combinación con ribavirina para pacientes que no responden al IFN solo. Sin embargo los efectos secundarios producidos por el IFN no se alivian con esta terapia combinada.

Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar agentes antivirales efectivos para el tratamiento de la infección por HCV que superen las limitaciones de las terapias farmacéuticas existentes.

El HCV es un virus de RNA de cadena envuelta positiva en la familia de los Flaviviridae. El genoma de RNA del HCV monocatenario tiene una longitud aproximada de 9500 nucleósidos y tiene un único marco de lectura abierto (ORF: Open Reading Frame) que codifica una única poliproteína grande de aproximadamente 3000 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína es segmentada en múltiples sitios por proteasas celulares y virales produciendo las proteínas estructurales y no estructuralas (NS: Non-Structural). En el caso del HCV, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) es realizada por dos proteasas virales. La primera de ellas, escasamente caracterizada hasta ahora, segmenta en la unión NS2-NS3; la segunda es una proteasa de serina contenida dentro de la región N-terminal de NS3 (en lo sucesivo se la denominará proteasa NS3) y media todas las segmentaciones subsiguientes aguas abajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de segmentación NS3-NS4A, como en trans para los sitios restantes NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. La proteína NS4A parece servir para múltiples funciones, actuando como cofactor para la proteasa NS3, y posiblemente asistiendo en la localización en la membrana de NS3 y otros componentes de replicasa viral. La formación del complejo de la proteína NS3 con NS4A parece necesaria para los eventos de procesamiento, mejorando la eficacia proteolítica en todos los sitios. La proteína NS3 muestra también actividades de nucleósido trifosfatasa y RNA helicasa. NS5B es una RNA polimerasa dependiente de RNA que interviene en la replicación del HCV.

Una estrategia general para el desarrollo de agentes antivirales es inactivar enzimas codificadas viralmente que son esenciales para la replicación del virus. En esta vena, la solicitud de patente WO 97/06804 describe el enantiómero (-) del análogo de nucleósido citosina-1,3-oxatiolano (también conocido como 3TC) como activo contra el HCV. Este compuesto, aunque publicado como seguro en ensayos clínicos previos contra HIV y HBV, ha de ser probado clínicamente como activo contra el HCV, y aún está por publicar su mecanismo de acción contra el virus.

Los intensos esfuerzos para descubrir compuestos que inhiben la proteasa NS3 o la RNA helicasa del HCV han conducido a las siguientes descripciones:

El documento WO 99/07733 describe péptidos y análogos de los mismos que son inhibidores para la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C.

La patente de EE.UU. nº 5.633.388 describe carboxamidas sustituidas con compuestos heterocíclicos y análogos como activos frente el HCV. Estos compuestos están dirigidos contra la actividad de helicasa de la proteína NS3 del virus, pero aún no se han publicado ensayos clínicos.

Chu et al. (Tet. Lett. (1996), 7229-7232) han publicado que una fenantrenoquinona tiene actividad contra la proteasa NS3 del HCV in vitro. No se ha publicado ningún desarrollo más acerca de este compuesto.

En un trabajo presentado en la Novena Conferencia Internacional sobre Investigación Antiviral, Urabandai, Fukyshima, Japón (1996) (Antiviral Research, 30, 1, 1996; A23 (resumen 19)) se publica que los derivados de tiazolidina son inhibidores para la proteasa del HCV.

Varios estudios han publicado compuestos inhibidores para otras proteasas de serina, tales como la elastasa leucocitaria humana. Una familia de estos compuestos se publica en el documento WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Los péptidos descritos en esa solicitud son análogos del morfilinil-carbonil-péptido que son estructuralmente diferentes de los péptidos de la presente invención.

El documento WO 98/17679 de Vertex Pharmaceuticals Inc. describe inhibidores de proteasa de serina, en particular la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C. Estos inhibidores son análogos de péptidos basados en el sustrato natural NS5A/5B. Todos estos péptidos contienen la función carbonilo activada en el terminal C como característica esencial. También se publicó que estos péptidos son activos contra otra proteasa de serina y por tanto no son específicos para la proteasa NS3 del HCV.

Hoffman LaRoche ha publicado también hexapéptidos que son inhibidores de proteinasa útiles como agentes antivirales para el tratamiento de la infección por HCV. Estos péptidos contienen un aldehído o un ácido borónico en el término C.

Steinkühler et al. e Ingallinella et al. han publicado acerca de la inhibición del producto de segmentación N terminal (Biochemistry (1998), 37, 8899-8905 y 8906-8914). Sin embargo, los péptidos y los análogos de péptidos presentados no incluyen ni conducen al diseño de los péptidos de la presente invención.

El documento WO 98/46597 de la Universidad Emory describe inhibidores de proteasas de serina, en particular de proteasa del virus de la hepatitis C. Todos los compuestos descritos son estructuralmente diferentes de los péptidos de la presente invención.

El documento WO 98/46630 de Peptide Therapeutics Ltd. describe inhibidores de la proteasa NS3 de la hepatitis C. Sin embargo, ninguno de los péptidos descritos está relacionado con los péptidos de la invención.

El documento JP 10298151 de Japan Energy Corp. describe derivados de serina sustituidos con N-(2,3-dihidroxibenzoílo) como inhibidores de la proteasa de serina, específicamente como inhibidores de la proteasa viral de la hepatitis C. Estos compuestos no contienen ninguna similitud estructural con los análogos de péptido de la presente invención.

Una ventaja de la presente invención es que proporciona péptidos que son inhibidores para la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C.

Otra ventaja de un aspecto de la presente invención reside en el hecho de que estos péptidos inhiben específicamente la proteasa NS3 y no muestran una actividad inhibidora significativa a concentraciones de hasta 300 \muM contra otras proteasas de serina tales como la elastasa leucocitaria humana (HLE), la elastasa pancreática porcina (PPE), o la quimotripsina pancreática bovina, o proteasas de cisteína tales como la catepsina B hepática humana (Cat B).

Sumario de la invención

Se incluyen en el alcance de la invención los racematos, diastereoisómeros e isómeros ópticos de un compuesto de fórmula (I):

1

en la que

a es 0 ó 1; b es 0 ó 1; Y es H o alquilo C_{1-6};

B es H, un derivado de acilo de fórmula R_{7}-C(O)- o un sulfonilo de fórmula R_{7}-SO_{2} en la que R_{7} es

(i)

alquilo C_{1-10} opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C_{1-6} o alcoxi C_{1-6};

(ii)

cicloalquilo C_{3-7} opcionalmente sustituido con carboxilo, (alcoxi C_{1-6})carbonilo o fenilmetoxicarbonilo;

(iii)

arilo C_{6} o C_{10} o aralquilo C_{7-16} opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}; o

(iv)

Het opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, hidroxi, amino opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, o amido opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6};

R_{6}

es alquilo C_{1-6} sustituido con carboxilo;

R_{5}

es alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con carboxilo;

R_{4}

es alquilo C_{1-10}, cicloalquilo C_{3-7} o (alquilcicloalquilo)C_{4-10};

R_{3}

alquilo C_{1-10}, cicloalquilo C_{3-7} o (alquilcicloalquilo)C_{4-10};

R_{2}

es CH_{2}-R_{20}, NH-R_{20}, O-R_{20} o S-R_{20}, en donde R_{20} es un cicloalquilo C_{3-7} saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo)C_{4-10} que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R_{21}, o

R_{20}

es un arilo C_{6} o C_{10} o aralquilo C_{7-16}, opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R_{21}, o

R_{20}

es Het o Het-(alquilo inferior) opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R_{21}, en donde cada R_{21} es independientemente alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_{1-6}; sulfonilo; NO_{2}; OH; SH; halo; haloalquilo; amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C_{1-6}, arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16}, Het o Het-(alquilo inferior); carboxilo; carboxi(alquilo inferior); arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het, siendo dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R_{22};

\quad

en donde R_{22} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}; sulfonilo; NO_{2}; OH; SH; halo; haloalquilo; carboxilo; amida; o (alquilo inferior)-amida;

R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituido con halógeno; y

W es hidroxi o un amino N-sustituido;

o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.

Se incluye dentro del alcance de la presente invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad viralmente efectiva anti-hepatitis C, de un compuesto de fórmula I, o de una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, en mezcla con un vehículo o agente auxiliar aceptable farmacéuticamente.

Un importante aspecto de la invención implica el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, para la preparación de un medicamento para tratar una infección viral de hepatitis C.

Otro importante aspecto implica un método in vitro para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C exponiendo el virus a una cantidad que inhibe la proteasa NS3 viral de la hepatitis C del compuesto de fórmula I o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, o una composición como se describió anteriormente.

Otro aspecto más implica el uso de una combinación del compuesto de fórmula I o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente y un interferón, para la preparación de un medicamento para tratar una infección viral de hepatitis C.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Como se usan en el presente texto, las definiciones que siguen son válidas a menos que se indique otra cosa:

Con referencia a los casos en los que se usan (R) o (S) para designar la configuración de un radical, p. ej. R_{4} del compuesto de fórmula I, la designación se hace en el contexto del compuesto y no en el contexto del radical solo. Los aminoácidos naturales, con excepción de la glicina, contienen un átomo de carbono quiral. A menos que se indique de forma específica otra cosa, se prefieren los compuestos que contienen aminoácidos naturales con la configuración L. Sin embargo, los solicitantes consideran que, cuando se especifique, algunos aminoácidos de la fórmula I pueden ser de cualquiera de las configuraciones D o L o pueden ser mezclas de isómeros D y L, incluyendo las mezclas racémicas. La designación "P1, P2, P3, etc." como se usa en el presente texto, se refiere a la posición de los restos de aminoácidos partiendo del extremo del término C de los análogos de péptido y prolongándose hacia el término N (es decir, P1 se refiere a la posición 1 desde el término C; P2: posición segunda desde el término C, etc.) (véase Berger A. y Schechter I., Transactions of the Royal Society London serie B257, 249-264 (1970)).

Las abreviaturas para los \alpha-aminoácidos se exponen en la Tabla A.

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TABLA A

Aminoácido	Símbolo
Alanina	Ala
Acido aspártico	Asp
Cisteína	Cys
Ciclohexilglicina (también llamada ácido 2-amino-2-ciclohexilacético)	Chg
Acido glutámico	Glu
Isoleucina	Ile
Leucina	Leu
Fenilalanina	Phe
Prolina	Pro
Valina	Val
terc-butilglicina	Tbg

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Como se usa en el presente texto, la expresión "ácido 1-aminociclopropil-carboxílico" (Acca) se refiere a un compuesto de fórmula:

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2

\newpage

Como se usa en el presente texto, la expresión "terc-butilglicina" (Tbg) se refiere a un compuesto de fórmula:

3

El término "resto" con referencia a un aminoácido o un derivado de aminoácido significa un radical derivado del correspondiente \alpha-aminoácido eliminando el hidroxilo del grupo carboxi y un hidrógeno del grupo \alpha-amino. Por ejemplo, los términos Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar y Tyr representan los "restos" de L-glutamina, L-alanina, glicina, L-isoleucina, L-arginina, ácido L-aspártico, L-fenilalanina, L-serina, L-leucina, L-cisteína, L-asparagina, sarcosina y L-tirosina, respectivamente.

La expresión "cadena secundaria" con referencia a un aminoácido o un resto de aminoácido significa un grupo unido al átomo de carbono \alpha del \alpha-aminoácido. Por ejemplo, la cadena secundaria del grupo R para la glicina es hidrógeno, para la alanina es metilo, para la valina es isopropilo. Para los grupos R específicos o cadenas laterales de los \alpha-aminoácidos, se hace referencia al texto de A.L. Lehninger sobre Bioquímica (véase el capítulo 4 de LEHNINGER A.L.: Biochemistry 2ª edición, Worth Publishers, Inc., N.Y. 1975).

El término "halo" como se usa en el presente texto significa un radical halógeno elegido entre bromo, cloro, fluoro o yodo.

La expresión "alquilo C_{1-6}" o "alquilo inferior", como se usa en el presente texto, bien sea solo o en combinación con otro radical, significa radicales alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen hasta seis átomos de carbono e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo (p. ej. terc-butilo).

La expresión "cicloalquilo C_{3-7}", como se usa en el presente texto, bien sea solo o en combinación con otro radical, significa un radical cicloalquilo que contiene de tres a siete átomos de carbono e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.

La expresión "cicloalquilo insaturado" incluye por ejemplo, el ciclohexenilo:

4

La expresión "alquilcicloalquilo(C_{4-10})", como se usa en el presente texto, significa un radical cicloalquilo que contiene de tres a siete átomos de carbono unido a un radical alquilo, conteniendo los radicales unidos hasta diez átomos de carbono; por ejemplo ciclopropilmetilo, ciclopentiletilo, ciclohexilmetilo, ciclohexiletilo o cicloheptiletilo.

La expresión "alquenilo C_{2-10}", como se usa en el presente texto, bien sea solo o en combinación con otro radical, significa un radical alquilo como se definió anteriormente que contiene de 2 a 10 átomos de carbono, y que además contiene al menos un doble enlace. Por ejemplo, alquenilo incluye alilo y vinilo.

La expresión "alcanoílo C_{1-6}", como se usa en el presente texto, bien sea solo o en combinación con otro radical, significa radicales 1-oxoalquilo lineales o ramificados que contienen de uno a seis átomos de carbono, e incluye formilo, acetilo, 1-oxopropil(propionilo), 2-metil-1-oxopropilo, 1-oxohexilo, y similares.

La expresión "alcoxi C_{1-6}", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa el radical -O(alquilo C_{1-6}) en el que alquilo es como se definió anteriormente, que contiene hasta seis átomos de carbono. Alcoxi incluye metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi y 1,1-dimetiletoxi. Este último radical se conoce normalmente como terc-butoxi.

La expresión "cicloalcoxi C_{3-7}", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa un grupo cicloalquilo C_{3-7} unido a un átomo de oxígeno, tal como, por ejemplo:

5

La expresión "arilo C_{6} o C_{10}", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa un grupo monocíclico aromático que contiene 6 átomos de carbono o bien un grupo bicíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. Por ejemplo, arilo incluye fenilo, 1-naftilo o 2-naftilo.

La expresión "aralquilo C_{7-16}", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa un grupo arilo C_{6} o C_{10} como se definió anteriormente unido a un grupo alquilo, en donde alquilo es como se definió anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Aralquilo C_{7-16} incluye, por ejemplo, bencilo, butilfenilo y 1-naftilmetilo.

La expresión "amino-aralquilo", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa un grupo amino sustituido con un grupo aralquilo C_{7-16}, tal como, por ejemplo, el amino-aralquilo:

6

La expresión "carboxi-alquilo inferior", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa un grupo carboxilo (COOH) unido a un grupo alquilo inferior como se definió anteriormente, e incluye, por ejemplo, ácido butírico.

La expresión "heterociclo" o "Het", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa un radical monovalente derivado de la eliminación de un hidrógeno de un heterociclo de cinco, seis o siete miembros, saturado o insaturado (incluyendo aromático), que contiene de uno a cuatro heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Además, "Het", como se usa en el presente texto, significa un heterociclo como se definió anteriormente fusionado a otro u otros ciclos, sea un heterociclo o cualquier otro ciclo. Los ejemplos de heterociclos adecuados incluyen: pirrolidina, tetrahidrofurano, tiazolidina, pirrol, tiofeno, diazepina, 1H-imidazol, isoxazol, tiazol, tetrazol, piperidina, 1,4-dioxano, 4-morfolina, piridina, pirimidina, tiazolo[4,5-b]-piridina, quinoleína o indol, o los siguientes heterociclos:

7

La expresión "(alquilo inferior)-Het", como se usa en el presente texto, significa un radical heterocíclico como se definió anteriormente unido a través de una cadena o grupo alquilo ramificado, en donde alquilo es como se definió anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos de (alquilo inferior)-Het incluyen:

8

La expresión "éster aceptable farmacéuticamente", como se usa en el presente texto, solo o en combinación con otro radical, significa ésteres del compuesto de fórmula I en los que cualquiera de las funciones carboxilo de la molécula, pero preferentemente el término carboxi, está reemplazada por una función alcoxicarbonilo:

9

en la que el resto R del éster se elige entre alquilo (p. ej. metilo, etilo, n-propilo, t-butilo, n-butilo); alcoxialquilo (p. ej. metoximetilo); alcoxiacilo (p. ej. acetoximetilo); aralquilo (p. ej. bencilo); ariloxialquilo (p. ej. fenoximetilo); arilo (p. ej. fenilo), opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_{1-4} o alcoxi C_{1-4}. Otros ésteres pro-fármaco adecuados pueden encontrarse en "Design of Prodrugs", Bundgaard, H, Ed. Elsevier (1985). Tales ésteres aceptables farmacéuticamente son normalmente hidrolizados in vivo cuando se inyectan en un mamífero y se transforman en la forma ácida del compuesto de fórmula I.

En relación con los ésteres descritos anteriormente, a menos que se especifique otra cosa, cualquier resto alquilo presente contiene ventajosamente de 1 a 16 átomos de carbono, en particular de 1 a 6 átomos de carbono. Cualquier resto arilo presente en tales ésteres comprende ventajosamente un grupo fenilo.

En particular los ésteres pueden ser un éster de alquilo C_{1-16}, un éster de bencilo no sustituido o un éster de bencilo sustituido con al menos un halógeno, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, nitro o trifluorometilo.

La expresión "sal aceptable farmacéuticamente", como se usa en el presente texto, incluye las que derivan de bases aceptables farmacéuticamente. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen colina, etanolamina y etilendiamina. Las sales de Na^{+}, K^{+} y Ca^{++} se consideran también dentro del alcance de la invención (véase también "Pharmaceutical Salts", Birge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. (1977), 66, 1-19).

Realizaciones preferidas

Se incluyen dentro del alcance de esta invención los compuestos de fórmula I en los que B es preferentemente R_{7}-SO_{2} en donde R_{7} es preferentemente arilo C_{6} o C_{10}, un aralquilo C_{7-16} o Het, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C_{1-6}.

Alternativamente, B es preferentemente H o un derivado de acilo de fórmula R_{7}C(O)- en donde R_{7} es preferentemente alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; cicloalquilo C_{3-7} opcionalmente sustituido con hidroxi; amido opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6} o Het; arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C_{1-6} o hidroxi. Más preferentemente, B es H o R_{7}C(O)- en donde R_{7} es más preferentemente alquilo C_{1-6} o heterociclos tales como:

10

Lo más preferentemente, B es H; acetilo;

11

Incluso lo más preferentemente, B es acetilo.

Se incluyen dentro del alcance de la invención compuestos de fórmula I en los que R_{6} es preferentemente la cadena secundaria de Asp o Glu. Lo más preferentemente, R_{6} es la cadena secundaria de Asp. Alternativamente, preferentemente, a es 0 y entonces R_{6} está ausente.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que, preferentemente R_{5} es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-butilglicina (Tbg) y L-Tbg. Más preferentemente, R_{5} es la cadena secundaria de D-Asp, D-Val o D-Glu. Lo más preferentemente, R_{5} es la cadena secundaria de D-Glu.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que preferentemente R_{4} es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por Val, ciclohexilglicina (Chg), Tbg, Ile o Leu. Más preferentemente, R_{4} es la cadena secundaria de Chg o de Ile. Lo más preferentemente, R_{4} es la cadena secundaria de Chg.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que preferentemente Y es H o Me; lo más preferentemente, Y es H.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que preferentemente R_{3} es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por Ile, Chg, Val o Tbg. Más preferentemente, R_{3} es la cadena secundaria de Val, Chg o Tgb. Lo más preferentemente, R_{3} es la cadena secundaria de Val o Tgb.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que preferentemente R_{2} es S-R_{20} o O-R_{20} en donde R_{20} es preferentemente un arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16}, Het o -CH_{2}-Het, todos opcionalmente mono-, di- o tri-sustituidos con R_{21}.

Preferentemente, R_{21} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino; mono- o di-(alquilo inferior)amino; amido opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16}, Het o (alquilo inferior)-Het; NO_{2}; OH; halo; trifluorometilo; carboxilo; arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het, estando dichos grupos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R_{22}. Más preferentemente, R_{21} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino; di(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; arilo C_{6} o C_{10}, o Het, estando dichos grupos arilo o Het opcionalmente sustituidos con R_{22}.

Preferentemente, R_{22} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino; mono- o di-(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; NO_{2}; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo. Más preferentemente, R_{22} es alcoxi C_{1-6}; amino; di(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)-amida; halo; o trifluorometilo.

Más preferentemente, R_{2} es 1-naftilmetoxi; 2-naftilmetoxi; benciloxi, 1-naftiloxi; 2-naftiloxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R_{21} como se definió anteriormente. Lo más preferentemente, R_{2} es 1-naftilmetoxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R_{21} como se definió anteriormente.

Lo más preferentemente aún, R_{2} es:

12

Más preferentemente R_{21A} es amido opcionalmente monosustituido con alquilo C_{1-6}, arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het; o arilo C_{6} o C_{10} o Het opcionalmente sustituido con R_{22}. Lo más preferentemente, R_{21A} es arilo C_{6} o C_{10} o Het, todos opcionalmente sustituidos con R_{22}. Lo más preferente, R_{22} es amino; di(alquilo inferior)amino; o (alquilo inferior)amida. Incluso más preferentemente, R_{22} es amino; dimetilamino; o acetamido.

Incluso lo más preferentemente, R_{21A} es arilo C_{6} o C_{10} o Het, todos no sustituidos.

Preferentemente, R_{21B} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino; di(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; NO_{2}; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo. Más preferentemente, R_{21B} es alcoxi C_{1-6}; o di(alquilo inferior)amino. Lo más preferentemente, R_{21B} es metoxi.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que preferentemente R_{1} es metilo, etilo, propilo, vinilo, todos los cuales están opcionalmente sustituidos con halo. Más preferentemente, R_{1} es etilo, vinilo o bromovinilo. Lo más preferentemente, R_{1} es vinilo.

Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que preferentemente W es hidroxi o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo; o (alquilo inferior)amino, di(alquilo inferior)amino o amino-aralquilo. Más preferentemente, W es hidroxi, o N(R_{13a})R_{13b}, en donde R_{13a} y R_{13b} son independientemente H, arilo o alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con hidroxi o fenilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Lo más preferentemente, W es -OH, -NH-bencilo o -NH-CH(Me)Ph. Aún lo más preferentemente, W es -OH o -NH-(S)CH(Me)-fenilo.

Cuando W es un éster, tal éster se elige preferentemente entre alcoxi C_{1-6}, fenoxi o aril(alcoxi C_{1-6}). Más preferentemente tal éster es metoxi, etoxi, fenoxi, benciloxi, o PhCH(Me)-O-.

Como se describió anteriormente el segmento P1 de los compuestos de fórmula I es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula:

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en la que C_{1} y C_{2} representan cada uno de ellos un átomo de carbono asimétrico en las posiciones 1 y 2 del anillo de ciclopropilo. Aparte de otros posibles centros asimétricos en otros segmentos de los compuestos de fórmula I, la presencia de estos dos centros asimétricos significa que el compuesto de fórmula I puede existir como mezclas racémicas de diastereoisómeros. Como se ilustra en los ejemplos más adelante, pueden prepararse las mezclas racémicas y después separlas en los isómeros ópticos individuales, o pueden prepararse los isómeros ópticos mediante síntesis quiral.

Por tanto, el compuesto de fórmula I puede existir como mezcla racémica de diastereoisómeros en la que R_{1} en posición 2 está orientado sin respecto del carbonilo en posición 1, representado por el radical:

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o el compuesto de fórmula I puede existir como mezcla racémica de diastereoisómeros en la que R_{1} en posición 2 está orientado anti respecto del carbonilo en posición 1, representado por el radical:

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A su vez, las mezclas racémicas pueden ser separadas en isómeros ópticos individuales.

Uno de los hallazgos más interesantes de esta invención se refiere a la orientación espacial del segmento P1. El hallazgo concierne a la configuración del carbono asimétrico en posición 1. Una realización preferida es una en la que el carbono asimétrico en posición 1 tiene la configuración R

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Más explícitamente, cuando el carbono 1 tiene la configuración R, la inhibición de la proteasa NS3 del HCV se mejora más por la posición del sustituyente R_{1} (p. ej. alquilo o alquileno) en el carbono 2 del anillo de ciclopropilo. Uno de los compuestos más preferidos es un isómero óptico que tiene el sustituyente R_{1} y el carbonilo en una orientación sin en la configuración absoluta siguiente:

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En el caso en que R_{1} es etilo, por ejemplo, los átomos de carbono asimétricos en posiciones 1 y 2 tienen la configuración R,R.

A título ilustrativo del papel que desempeña la configuración absoluta del sustituyente sobre el nivel de potencia del compuesto, el compuesto 112 (Tabla 1) que tiene la configuración absoluta como 1R,2R, tiene un valor de la IC_{50} de 1,6 \muM, mientras que el correspondiente isómero 1S,2S (compuesto 113) tiene una IC_{50} de 27,5 \muM. Por consiguiente, el isómero 1R,2R es 25 veces más potente que el correspondiente isómero 1S,2S.

También están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que B es H, (alquilo inferior)-C(O)- o Het-C(O)-;

R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp o Glu;

R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D- ó L:-Asp, Glu, Val o Tbg;

Y es H o metilo;

R_{4} es la cadena secundaria de Val, Chg, Tbg, Ile o Leu;

R_{3} es la cadena secundaria de Ile, Chg, Val o Tbg;

R_{2} es 1-naftilmetoxi, 2-naftilmetoxi, O-Bn,

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19

y R_{22} es amino; di(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; NO_{2}; OH; halo; CF_{3}; o carboxi;

P1 es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula

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en la que R_{1} es etilo, vinilo o bromovinilo; y

W es hidroxi o N(R_{13a})R_{13b}, en donde R_{13a} y R_{13b} son independientemente H, arilo o alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituidos con hidroxi o fenilo; o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otro grupo de compuestos preferido está representado por la fórmula I en la que B es H, acetilo o Het-C(O)-; R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp; R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp, D-Glu o D-Val; Y es H; R_{4} es la cadena secundaria de Chg o Ile; R_{3} es la cadena secundaria de Val, Chg o Tbg; R_{2} es 1-naftilmetoxi, benciloxi, 4-quinolinoxi, o

21

P1 es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula

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en la que R_{1} es Et o -CH=CH_{2} o -CH=CHBr; y

W es hidroxi o -NH-(S)CH(Me)Ph,

o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.

Un grupo de compuestos incluso más preferidos está representado por la fórmula I en la que B es acetilo; R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp; R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Glu; Y es H; R_{4} es la cadena secundaria de Chg; R_{3} es la cadena secundaria de Val o Tbg; R_{2} es:

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P1 es:

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W es hidroxi, o una sal o éster aceptable farmacéuticamente de los mismos.

Finalmente, está incluido en el alcance de la invención cada compuesto de fórmula I presentado en las Tablas 1 a 5.

Según una realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente otro agente anti-HCV. Los ejemplos de agentes anti-HCV incluyen \alpha- o \beta-interferón, ribavirina y amantadina.

Según otra realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente otros inhibidores de proteasa del HCV.

Según otra realización alternativa más, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, helicasa, polimerasa, metaloproteasa o sitio de entrada del ribosoma interno (IRES: Internal Ribosome Entry Site).

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas oralmente, parenteralmente o por medio de un reservorio implantado. Se prefiere la administración oral o la administración por inyección. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener cualquier vehículo, coadyuvante o portador convencional no tóxico aceptable farmacéuticamente. En algunos casos, el pH de la formulación puede ser ajustado con ácidos, bases o tampones aceptables farmacéuticamente para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de suministro. El término parenteral, como se usa en el presente texto, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intrasternal, intratecal e intralesio-
nal.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de preparado estéril inyectable, por ejemplo como una suspensión acuosa u oleaginosa estéril inyectable. Esta suspensión puede ser formulada según métodos conocidos en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween® 80) y agentes de suspensión.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, cápsulas, comprimidos y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubrificantes tales como estearato de magnesio. Para administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran oralmente suspensiones acuosas, el ingrediente activo se combina con agentes de emulsionamiento y de suspensión. Si se desea, pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes y/o aromatizantes y/o colorantes.

Otros vehículos o portadores adecuados para las formulaciones y composiciones anteriormente apuntadas pueden encontrarse en textos farmacéuticos normales, p. ej. en "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 190 ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn. (1995).

Niveles de dosificación entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, preferentemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal al día, de los compuestos inhibidores de la proteasa descritos en el presente texto, son útiles en una monoterapia para la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por el HCV. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención serán administradas de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces al día o, alternativamente, como infusión continua. Tal administración puede usarse como terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con los materiales portadores para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del hospedador tratado y del modo de administración en particular. Un preparado típico contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Preferentemente, tales preparados contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto activo.

Como apreciarán los expertos en la técnica, pueden precisarse dosis inferiores o superiores a las citadas anteriormente. La dosificación y los regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente en concreto dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el curso de la infección, la predisposición del paciente para las infecciones y el criterio del médico encargado del tratamiento. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis sustancialmente inferiores a la dosis óptima de péptido. Después, la dosificación se aumenta en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias dadas. En general, lo más deseable es que se administre el compuesto a un nivel de concentración que generalmente proporcione resultados antivirales efectivos sin provocar efectos secundarios nocivos o deletéreos.

Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un compuesto de fórmula I y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional han de estar presentes en niveles de dosificación entre aproximadamente 10 y 100%, y más preferentemente entre aproximadamente 10% y 80% de la dosificación normalmente administrada en un régimen de monoterapia.

Cuando estos compuestos o sus sales farmacéuticamente aceptables se formulan junto con un vehículo aceptable farmacéuticamente, la composición resultante puede ser administrada in vivo a mamíferos, tales como el hombre, para inhibir la proteasa NS3 del HCV o para tratar o prevenir la infección con el virus HCV. Tal tratamiento puede realizarse también usando los compuestos de esta invención en combinación con agentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, agentes inmunomoduladores, tales como interferones \alpha, \beta o \gamma; otros agentes antivirales, tales como ribavirina o amantadina; otros inhibidores de proteasa NS3 de HCV; inhibidores de otras dianas en el ciclo vital del HCV, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, metaloproteasa o sitio de entrada del ribosoma interno (IRES); o combinaciones de los mismos. Los agentes adicionales pueden ser combinados con los compuestos de esta invención para crear una forma de dosificación individual. Alternativamente, estos agentes adicionales pueden ser administrados por separado a un mamífero como parte de una forma de dosificación múltiple.

En consecuencia, esta invención proporciona métodos para inhibir la actividad de proteasa NS3 del HCV en mamíferos mediante la administración de un compuesto de fórmula I, en la que los sustituyentes son como se definieron antes.

Métodos preferidos son útiles para reducir la actividad de proteasa NS3 del HCV en un mamífero. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de esta invención como componente activo, tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar a dicho mamífero un agente elegido entre un agente inmunomodulador, un agente antiviral, un inhibidor de proteasa del HCV o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV tales como helicasa, polimerasa, metalo-proteasa o IRES. Tal agente adicional puede ser administrado al mamífero antes de, al mismo tiempo, o después de la administración de las composiciones de esta invención.

Métodos alternativos son útiles para inhibir la replicación viral en un mamífero. Tales métodos son útiles para tratar o prevenir enfermedades por el HCV. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de esta invención como componente activo, tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar a dicho mamífero un agente elegido entre un agente inmunomodulador, un agente antiviral, un inhibidor de proteasa del HCV o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV. Tal agente adicional puede ser administrado al mamífero antes de, al mismo tiempo, o después de la administración de la composición según esta invención.

Los compuestos expuestos en el presente texto pueden usarse también como reactivos de laboratorio. Los compuestos de esta invención pueden usarse también para tratar o prevenir la contaminación viral de ciertos materiales, y por tanto para reducir el riesgo de infeción viral del personal médico o de laboratorio, o de pacientes que entran en contacto con tales materiales (p. ej. sangre, tejidos, instrumentos y prendas de vestir quirúrgicos o de laboratorio, y aparatos y materiales para recogida de sangre).

Los compuestos expuestos en el presente texto pueden usarse también como reactivos para investigación. Los compuestos de esta invención pueden usarse también como testigos positivos para validar ensayos suplentes basados en células o ensayos de replicación viral in vitro o in vivo.

Procedimiento

Los compuestos de la presente invención fueron sintetizados de acuerdo con el procedimiento que se ilustra en el esquema I (en el que CPG es un grupo protector de carboxilo y APG es un grupo protector de amino):

Esquema I

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Brevemente expuesto, los grupos P1, P2, P3, P4 y opcionalmente P5 y P6 pueden unirse por técnicas de acoplamiento de péptidos bien conocidas. Los grupos P1, P2, P3, P4 y P5 y P6 pueden unirse por cualquier orden siempre y cuando el compuesto final corresponda a péptidos de fórmula 1. Por ejemplo, P6 puede unirse a P5 para dar P5-P6, que se une a P4-P3-P2-P1; o P6 puede unirse a P5-P4-P3-P2 y después unirse a un P1 apropiadamente protegido en el terminal C.

Generalmente, los péptidos se prolongan desprotegiendo el grupo \alpha-amino del resto N-terminal y acoplando el grupo carboxilo no protegido del siguiente aminoácido adecuadamente protegido en N, mediante un enlace peptídico usando los métodos descritos. Este procedimiento de desprotección y acoplamiento se repite hasta que se obtiene la secuencia deseada. Este acoplamiento puede realizarse con los aminoácidos constituyentes de una manera en etapas, como se representa en el Esquema I, o mediante condensación de fragmentos (dos o varios aminoácidos), o una combinación de ambos procedimientos, o mediante síntesis de péptidos en fase sólida de acuerdo con el método originalmente descrito en Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154.

El acoplamiento entre dos aminoácidos, un aminoácido y un péptido, o dos fragmentos de péptidos, puede realizarse usando procedimientos de acoplamiento estándar, tales como el método de la azida, método del anhídrido de ácido carbónico-carboxílico mixto (cloroformiato de isobutilo), método de la carbodiimida (diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida o carbodiimida soluble en agua), método del éster activo (p-nitrofenil-éster, N-hidroxisuccínico-imido-éster), método del reactivo K de Woodward, método del carbonildiimidazol, métodos de los reactivos fosforados o de oxidación-reducción. Algunos de estos métodos (especialmente el método de la carbodiimida) pueden mejorarse añadiendo 1-hidroxibenzotriazol. Estas reacciones de acoplamiento pueden realizarse bien sea en solución (fase líquida) o bien en fase sólida.

Más explícitamente, la etapa de acoplamiento implica el acoplamiento deshidratante de un carboxilo libre de una sustancia reaccionante, con el grupo amino libre de la otra sustancia reaccionante, en presencia de un agente de acoplamiento, para formar un enlace amida de unión. Descripciones de tales agentes de acoplamiento se encuentran en libros de texto generales acerca de la química de los péptidos, por ejemplo M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 20 ed. rev., ed. Springer-Verlag, Berlín, Alemania (1993). Ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son N,N'-diciclohexilcarbodiimida, 1-hidroxibenzotriazol en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida o N-etil-N'-[(3-dimetilamino)propil]carbodiimida. Un agente de acoplamiento muy práctico y útil es el disponible comercialmente hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris-(dimetilamino)fosfonio, bien sea por sí mismo o en presencia de 1-hidroxibenzotriazol. Otro agente de acoplamiento muy práctico y útil es el disponible comercialmente tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio. Otro agente de acoplamiento muy práctico y útil es el disponible comercialmente hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio.

La reacción de acoplamiento se realiza en un disolvente inerte, p. ej. diclorometano, acetonitrilo o dimetilformamida. Se añade un exceso de una amina terciaria, p. ej. diisopropiletilamina, N-metilmorfolina o N-metilpirrolidina, para mantener la mezcla de reacción en un pH de aproximadamente 8. La temperatura de reacción se encuentra normalmente entre 0EC y 50EC y el tiempo de reacción se encuentra normalmente entre 15 minutos y 24 h.

Cuando se emplea un procedimiento de síntesis en fase sólida, el ácido carboxílico C-terminal se une a un soporte insoluble (normalmente poliestireno). Estos soportes insolubles contienen un grupo que reacciona con el ácido carboxílico para formar un enlace que es estable en las condiciones de prolongación, pero que es fácilmente segmentable más tarde. Ejemplos de ellos son: resina de cloro- o bromometilo, resina de hidroximetilo, y resina de aminometilo. Muchas de estas resinas son disponibles comercialmente con el aminoácido C-terminal deseado ya incorporado. Alternativamente, el aminoácido puede ser incorporado al soporte sólido por métodos conocidos (Wang, S.-S., J. Am. Chem. Soc. (1973) 95, 1328; Atherton, E.; Shepard, R.C. "Solid-phase peptide synthesis; a practical approach" IRL Press: Oxford (1989); 131-148). Además de los precedentes, se describen otros métodos de síntesis de péptidos en Stewart y Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 20 ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1, 2, 3, 5 y 9, Academic Press, Nueva York (1980-1987); Bodansky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Nueva York
(1984).

Los grupos funcionales de los aminoácidos constituyentes han de estar generalmente protegidos durante las reacciones de acoplamiento para evitar la formación de enlaces no deseados. Una relación de grupos protectores que pueden ser usados se encuentra en Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, Nueva York (1981) y "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, Nueva York (1981).

El grupo \alpha-carboxilo del resto C-terminal está normalmente protegido como éster (CPG) que puede ser segmentado para dar el ácido carboxílico. Los grupos protectores que pueden usarse incluyen: 1) alquilésteres tales como ésteres de metilo, trimetilsililetilo y t-butilo, 2) aralquil-ésteres tales como bencilo y bencilo sustituido, o 3) ésteres que pueden ser segmentados por un suave tratamiento básico, o medios reductores suaves, tales como los ésteres de tricloroetilo y fenacilo.

El grupo \alpha-amino de cada aminoácido a acoplar a la cadena peptídica en crecimiento ha de estar protegido (APG). Puede usarse cualquier grupo protector conocido en la técnica. Los ejemplos de tales grupos incluyen: 1) grupos acilo tales como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo y p-toluenosulfonilo; 2) grupos carbamato aromáticos tales como benciloxicarbonilo (Cbz o Z) y benciloxicarbonilos sustituidos, y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) grupos carbamato alifáticos tales como terc-butiloxicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, y aliloxicarbonilo; 4) grupos carbamato de alquilo cíclico tales como ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicarbonilo; 5) grupos alquilo tales como trifenilmetilo y bencilo; 6) trialquilsililos tales como trimetilsililo; y 7) grupos que contienen tiol tales como feniltiocarbonilo y ditiasuccinoílo. El grupo protector \alpha-amino preferido es Bmoc o bien Fmoc. Se dispone comercialmente de muchos derivados de aminoácido adecuadamente protegidos para la síntesis de péptidos.

El grupo protector de \alpha-amino del resto de aminoácido recién añadido es segmentado antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. Cuando se usa el grupo Boc, los métodos de elección son ácido trifluoroacético, puro o en diclorometano, o HCl en dioxano o en acetato de etilo. Después se neutraliza la sal amónica resultante, bien sea antes del acoplamiento o bien in situ, con soluciones básicas tales como tampones acuosos, o aminas terciarias en diclorometano o acetonitrilo o dimetilformamida. Cuando se usa el grupo Fmoc, los reactivos de elección son piperidina o piperidina sustituida en dimetilformamida, pero puede usarse cualquier amina secundaria. La desprotección se lleva a cabo a una temperatura entre 0ºC y la temperatura ambiente (RT), normalmente 20-22ºC.

Cualquiera de los aminoácidos que tienen funcionalidades de cadena lateral ha de ser protegido durante la preparación del péptido usando cualquiera de los grupos anteriormente descritos. Los expertos en la técnica apreciarán que la selección y el uso de grupos protectores adecuados para estas funcionalidades de cadena lateral depende del aminoácido y de la presencia de otros grupos protectores en el péptido. La selección de tal grupo protector es importante por cuanto es necesario que el grupo no sea eliminado durante la desprotección y el acoplamiento del grupo \alpha-amino.

Por ejemplo, cuando se usa Boc como grupo protector de \alpha-amino, son adecuados los siguientes grupos protectores de cadena lateral: pueden usarse restos de p-toluenosulfonilo (tosilo) para proteger la cadena lateral amino de aminoácidos tales como Lys y Arg; pueden usarse restos acetamidometilo, bencilo (Bn) o t-butilsulfonilo para proteger la cadena lateral que contiene sulfuro de cisteína; pueden usarse bencil-éteres (Bn) para proteger las cadenas laterales que contienen hidroxi de la serina, treonina o hidroxiprolina; y pueden usarse bencil-ésteres para proteger las cadenas laterales que contienen carboxi del ácido aspártico y el ácido glutámico.

Cuando se elige Fmoc para la protección de la \alpha-amina, normalmente son aceptables grupos protectores basados en terc-butilo. Por ejemplo, puede usarse Boc para lisina y arginina, terc-butil-éter para serina, treonina e hidroxiprolina, y terc-butil-éster para ácido aspártico y ácido glutámico. Puede usarse el resto trifenilmetilo (tritilo) para proteger la cadena secundaria de la cisteína, que contiene sulfuro.

Cuando W es una amida (w), P1 se acopla a una amina apropiada antes del acoplamiento con P2. Tal aminación puede ser fácilmente reconocida por los expertos en la técnica.

Una vez que se ha completado la prolongación del péptido, se eliminan todos los grupos protectores. Cuando se usa una síntesis en fase líquida, los grupos protectores se eliminan de cualquier manera que venga dictada por la elección de los grupos protectores. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Cuando se usa un procedimiento de síntesis en fase sólida, el péptido se segmenta de la resina simultáneamente con la eliminación de los grupos protectores. Cuando se usa en la síntesis el método de protección con Boc, el tratamiento con HF anhidro que contiene aditivos tales como sulfuro de dimetilo, anisol, tioanisol, o p-cresol a 0ºC es el método preferido para segmentar el péptido de la resina. La segmentación del péptido puede conseguirse también mediante otros reactivos ácidos tales como las mezclas de ácido trifluorometanosulfónico/ácido trifluoroacético. Si se usa el método de protección con Fmoc, el grupo Fmoc N-terminal se segmenta con reactivos descritos anteriormente. Los otros grupos protectores y el péptido se segmentan de la resina usando solución de ácido trifluoracético y varios aditivos tales como anisol, etc.

Síntesis del grupo B formador de casquete y restos P6, P5, P4 y P3

Se introducen distintos grupos de formación de casquete B en P4, P5 o P6 protegidos o en cualquier segmento peptídico con un cloruro de acilo apropiado que, o es comercialmente disponible, o bien su síntesis es bien conocida en la técnica.

Hay distintos restos P6 a P3 disponibles comercialmente, o cuya síntesis es bien conocida en la técnica.

1. Síntesis de restos P2 1.1 Síntesis de precursores

A) Síntesis de derivados de haloarilmetano.

La preparación de halometil-8-quinoleína IId se hizo de acuerdo con el procedimiento de K.N. Campbell et al., J. Amer. Chem. Soc. (1946) 68, 1844.

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Esquema II

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Brevemente expuesto, el ácido 8-quinoleína-carboxílico IIa fue convertido en el correspondiente alcohol IIc por reducción del correspondiente haluro de acilo IIb con un agente reductor tal como hidruro de aluminio y litio. El tratamiento del alcohol IIb con el halohidrácido apropiado da el derivado halo IId deseado. Una realización específica de este procedimiento se presenta en el Ejemplo 1A.

B) Síntesis de derivados de aril-alcoholes.

Se prepararon derivados de 2-fenil-4-hidroxiquinoleína IIIc de acuerdo con Giardina et al. (J. Med. Chem. (1997) 40, 1794-1807).

Esquema III

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R_{22} y R_{21B} = alquilo, OH, SH, halo, NH_{2}, NO_{2}.

Se condensó benzoilacetamida (IIIa) con la anilina apropiada (IIIb) y la imina obtenida se ciclizó con ácido polifosfórico para dar la correspondiente 2-fenil-4-hidroxiquinoleína (IIIc). Una realización específica de este procedimiento se presenta en los Ejemplos 1B y 1C.

1.2 Síntesis de P2

A) La síntesis de prolina 4-sustituida (en la que R^{2} está unido al anillo a través de un átomo de carbono) (con la estereoquímica que se muestra):

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se hace como se muestra en el Esquema IV de acuerdo con los procedimientos descritos por J. Ezquerra et al. (Tetrahedron (1993) 38, 8665-8678) y C. Pedregal et al. (Tetrahedron Lett. (1994) 35, 2053-2056).

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Esquema IV

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Brevemente, el ácido Boc-piroglutámico se protege como éster bencílico. El tratamiento con una base fuerte, tal como litio diisopropilamida, seguido por la adición de un agente de alquilación (Br-R^{20} o I-R^{20}) da los compuestos IVe deseados después de la reducción de la amida y la desprotección del éster.

B) La síntesis de 4-(R)-hidroxiprolina O-aralquilada:

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Cuando R^{20} es arilo, Het, aralquilo o (alquilo inferior)-Het, el proceso puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por E.M. Smith et al. (J. Med. Chem. (1988) 31, 875-885). Brevemente, se trata Boc-4(R)-hidroxiprolina con una base tal como hidruro sódico o K-tBuo, y el alcóxido resultante se hace reaccionar con un halo-R^{20} (Br-R^{20}, I-R^{20}, etc.) para dar los compuestos deseados. En los Ejemplos 2, 3 y 4B se presentan realizaciones específicas de este procedimiento.

C) Alternativamente, cuando R^{20} es arilo o Het, los compuestos pueden también prepararse mediante una reacción de Mitsunobu (Mitsunobu (1981), Synthesis, enero, 1-28; Rano et al. (1995), Tet. Lett. 36 (22), 3779-3792; Krchnak et al. (1995), Tet. Lett. 36 (5), 62193-6196; Richter et al. (1994) Tet. Lett. 35 (27), 4705-4706). Brevemente, se trata el éster metílico de Boc-4(S)-hidroxiprolina disponible comercialmente con el aril-alcohol o tiol apropiado, en presencia de trifenilfosfina y dietilazodicarboxilato (DEAD), y el éster resultante se hidroliza para dar el ácido. Una realización específica de este procedimiento se presenta en el Ejemplo 4A.

Esquema V

31

Alternativamente, la reacción de Mitsunobu puede producirse en fase sólida (Esquema V). El bloque de 96 pocillos del sintetizador Modelo 396 (Advanced ChemTech) se provee con partes alícuotas de compuesto (Va) unido a la resina y se añaden diversos aril-alcoholes o tioles y reactivos apropiados. Después de la incubación, cada producto unido a la resina (Vb) se lava, se seca y se segmenta de la resina.

También puede usarse una reacción de Suzuki (Miyaura et al. (1981) Synth. Comm. 11, 513; Sato et al. (1989), Chem. Lett. 1405; Watanabe et al. (1992) Synlett., 207; Takayuki et al. (1993), J. Org. Chem. 58, 2201; Frenette et al. (1994), Tet. Lett. 35 (49), 9177-9180; Guiles et al. (1996), J. Org. Chem. 61, 5169-5171), para funcionalizar más el sustituyente de arilo.

2. Síntesis de restos P1 (ácido 1-aminociclopropil-carboxílico 2-sustituido)

La síntesis se hizo de acuerdo con el Esquema VI.

Esquema VI

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32

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a) Brevemente, el malonato di-protegido VIa y 1,2-dihaloalcano VIb o sulfato cíclico VIc (sintetizado de acuerdo con K. Burgess y Chun-Yen KE (Synthesis (1996) 1463-1467) se hacen reaccionar bajo condiciones básicas para dar el diéster VId.

b) Se realiza una hidrólisis regioselectiva del éster menos impedido estéricamente para dar el ácido VIe.

c) Este ácido VIe se somete a una redistribución de Curtius para dar una mezcla racémica de derivados de ácido 1-aminociclopropilcarboxílico VIf, siendo R^{1} sin respecto del grupo carboxilo. Una realización específica de esta síntesis se presenta en el Ejemplo 5.

d), e) Alternativamente, la formación de éster selectiva a partir del ácido VIe con un haluro (P^{*}Cl) o alcohol (P^{*}OH) apropiados forma el diéster VIg en el que el éster P^{*} es compatible con la hidrólisis selectiva del éster P. La hidrólisis del éster P proporciona el ácido VIh.

f) Una redistribución de Curtius en VIh da una mezcla racémica de derivados de ácido 1-aminociclopropilcarboxílico VIi siendo el grupo R^{1} anti respecto del grupo carboxílico. Una realización específica de esta síntesis se presenta en el Ejemplo 10.

Se describe más adelante una síntesis alternativa para la preparación de derivados VIf (cuando R^{1} es vinilo, sin respecto del grupo carboxilo).

Esquema VII

33

El tratamiento de la imina VIIa disponible comercialmente con 1,4-dihalobuteno VIIb en presencia de una base produce, después de la hidrólisis de la imina resultante VIIc, VIId que tiene el sustituyente alilo sin respecto del grupo carboxilo. Este procedimiento se presenta en el Ejemplo 11.

La resolución de todas las mezclas enantioméricas anteriores en el carbono 1 (VIe y VIId) puede realizarse mediante:

1)

separación enzimática (Ejemplos 9 y 13);

2)

cristalización con un ácido quiral (Ejemplo 14); o

3)

derivatización química (Ejemplo 6).

Después de la resolución, puede realizarse la determinación de la estereoquímica absoluta como se presenta en el Ejemplo 7.

La resolución y la determinación estereoquímica pueden realizarse de la misma manera para las mezclas enantioméricas en el carbono 1 en el que el sustituyente en C2 es anti respecto al grupo carboxilo (VIi).

En consecuencia, la invención comprende además un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) en el que P1 es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico, que comprende la etapa de:

acoplar un péptido elegido entre el grupo consistente en: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; y APG-P2;

con un producto intermedio P1 de fórmula:

34

en la que R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituido con halógeno, CPG es un grupo protector de carboxilo y APG es un grupo protector de amino, y P6 a P2 son como se definieron antes.

Finalmente, la invención comprende además el uso de un producto intermedio de fórmula:

35

en la que R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituido con halógeno, para la preparación de un compuesto de fórmula I como se definió anteriormente.

Ejemplos

La presente invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Las temperaturas se dan en grados Celsius. Los porcentajes de las soluciones expresan una relación de peso a volumen y las relaciones de las soluciones expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique otra cosa. Los espectros de resonancia nuclear magnética (NMR) se obtuvieron en un espectrómetro Bruker 400 MHz; los desplazamientos químicos (\gamma) se expresan en partes por millón. La cromatografía rápida se llevó a cabo en gel de sílice (SiO2) de acuerdo con la técnica de cromatografía rápida de Still (W.C. Still et al., J. Org. Chem. (1978) 43, 2923).

Las abreviaturas usadas en los ejemplos incluyen Bn: bencilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo [Me_{3}COC(O)]; BSA: albúmina de suero bovino; CHAPS: 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; CH_{2}Cl_{2}=DCM: cloruro de metileno; DEAD: dietilazodicarboxilato; DIAD: diisopropilazodicarboxilato; DIPEA: disopropiletialamina; DMAP: dimetilaminopiridina; DCC: 1,3-diciclohexilcarbodiimida; DME: 1,2-dimetiloxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DTT: ditiotreitol o treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol; DPPA: difenilfosforil-azida; EDTA: ácido etilendiaminatetraacético; Et: etilo; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de etilo; Et_{2}O: dietil-éter; HPLC: cromatografía de líquidos de alto rendimiento; MS: espectrometría de masas (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionization-Time of Flight, FAB: bombardeo con átomos rápidos); LAH: hidruro de aluminio y litio; Me: metilo; MeOH: metanol; MES: (ácido 2-[N-morfolino]etano-sulfónico); NaHMDS: bis(trimetilsilil)amida sódica; NMM: N-metilmorfolina; NMP: N-metilpirrolidina; Pr: propilo; Succ.: 3-carboxipropanoílo; PNA: 4-nitrofenilamino o p-nitroanilina; TBAF: fluoruro de tetra-n-butilamonio; TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TIS: triisopropilsilano; TLC: cromatografía en capa fina; TMSE: trimetilsililetilo; Tris/HCl: hidrocloruro de tris(hidroximetil)aminometano.

Bloques de construccion P2 Ejemplo 1A Síntesis de bromometil-8-quinoleína (1A)

36

A ácido 8-quinoleína-carboxílico disponible comercialmente (2,5 g, 14,4 mmoles) se añadió cloruro de tionilo puro (10 ml, 144 mmoles). Esta mezcla se calentó a 80ºC durante 1 h antes de eliminar por destilación bajo presión reducida el exceso de cloruro de tionilo. Al sólido parduzco resultante se añadió EtOH absoluto (15 ml) que se calentó a 80ºC durante 1 h antes de concentrar bajo vacío. El residuo se repartió entre EtOAc y solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, y la fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un aceite parduzco (2,8 g). Este material (aprox. 14,4 mmoles) se añadió gota a gota a lo largo de 35 minutos a una suspensión de LAH (0,76 g, 20,2 mmoles)/Et_{2}O que fue enfriada a -60ºC. La mezcla de reacción se calentó lentamente a -35ºC a lo largo de 1,5 h antes de completarse la reacción. La reacción se apagó con MgSO_{4}.10H_{2}O lentamente durante 30 min y después con THF húmedo. La mezcla se repartió entre Et_{2}O y solución acuosa de NaHCO_{3} al 10%. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un sólido amarillento (2,31 g, 80% a lo largo de 2 etapas) correspondiente al alcohol. El alcohol (2,3 g, 11,44 mmoles) se disolvió en AcOH/HBr (20 mL, solución al 30% de Aldrich) y se calentó a 70ºC durante 2,5 h. La mezcla se concentró bajo vacío a sequedad, se repartió entre EtOAc (100 mL) y solución acuosa saturada de NaHCO_{3} antes de secar (MgSO_{4}), filtrar y concentrar bajo vacío para dar el compuesto deseado (1A) como un sólido parduzco (2,54 g, 100%).

Ejemplo 1B Síntesis de 2-fenil-4-hidroxiquinoleína (1B)

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37

Se calentó benzoilacetato de etilo disponible comercialmente (6,00 g, 31,2 mmoles) a 85ºC (tubo sellado) en 75 mL de NH_{4}OH al 30% durante 2 horas. El sólido formado al enfriarse se filtró y se calentó a reflujo en agua durante 2 h. La solución se extrajo tres veces con CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas se reunieron, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron. El residuo amarillo se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc:hexano (3:7) para dar la correspondiente amida en forma de un sólido blanco, 1,60 g, 31% de rendimiento.

Esta amida (250 mg, 1,53 mmoles) se sometió a reflujo usando un aparato Dean-Stark con anilina (143 mg, 1,53 mmoles) y anilina\cdotHCl (10 mg, 0,08 mmoles) en tolueno (10 mL) durante 16 h. La solución se concentró para dar un aceite pardo que se mezcló con ácido polifosfórico (2 g) y se calentó a 135ºC durante 20 min. La mezcla de reacción se vertió en agua y se ajustó a pH 8 con NaOH 5 M. La suspensión acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron. El residuo fue sometido a cromatografía rápida sobre gel de sílice, eluyendo con MeOH al 3% en acetato de etilo, para dar 2-fenil-4-hidroxiquinoleína (1B), 67 mg, 20% de rendimiento.

^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 8,11 (d, J=7 Hz, 1H), 7,86-7,83 (m, 2H), 7,77 (d, J=8 Hz, 1H), 7,68 (dd, J=8, 7 Hz, 1H), 7,61-7,58 (m, 3H), 7,35 (dd, J=8, 7 Hz, 1H), 6,34 (s, 1H).

Ejemplo 1C Síntesis de 4-hidroxi-2-fenil-7-metoxiquinoleína (1C)

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4-hidroxi-2-fenil-7-metoxiquinoleína (e)

Una solución de benzoilacetato de etilo (b) (100,0 g, 0,52 moles), m-anisidina (a) (128,1 g, 1,04 moles) y HCl 4N/ dioxano (5,2 mL) en tolueno (1,0 L) se calentó a reflujo durante 6,25 h en una aparato Dean-Stark. La solución en tolueno enfriada se lavó sucesivamente con solución acuosa de HCl al 10% (2 x 300 mL), NaOH 1N (2 x 300 mL), H_{2}O (300 mL) y salmuera (150 mL). La fase en tolueno se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar una mezcla 1,2:1,0 de éster c y amida d (144,6 g, 45%/38% rendimiento en crudo) en forma de un aceite pardo oscuro. El aceite crudo se calentó a 280ºC durante 80 minutos mientras se destilaba el EtOH producido. El sólido oscuro enfriado obtenido se trituró con CH_{2}Cl_{2} (200 mL). La suspensión se filtró y el sólido resultante se lavó con CH_{2}Cl_{2} para dar e (22,6 g, 17% a partir de a) en forma de un sólido beige: ^{1}H NRM (DMSO-d_{6}) \delta 8,00 (d, J=9,0 Hz, 1H), 7,81-7,82 (m, 2H), 7,57-7,59 (m, 3H), 7,20 (d, J=2,2 Hz, 1H), 6,94 (dd, J=9,0, 2,2 Hz, 1H), 6,26 (s, 1H), 3,87 (s, 3H).

4-Cloro-2-fenil-7-metoxiquinoleína (1C)

Una suspensión de e (8,31 g, 33,1 mmoles) en POCl_{3} (90 mL) se calentó a reflujo durante 2 h (solución transparente obtenida al calentar). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se repartió entre NaOH 1N (exotérmico, se añade NaOH 10N para mantener un pH elevado) y EtOAc (500 mL). La capa orgánica se lavó con H_{2}O (100 mL) y salmuera (100 mL), y después se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar 1C (8,60 g, 96%) en forma de un sólido amarillo pálido: ^{1}H NRM (DMSO-d_{6}) \delta 8,28-8,30 (m, 2H), 8,20 (s, 1H), 8,10 (d, J=9,1 Hz, 1H), 7,54-7,58 (m, 3H), 7,52 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,38 (dd, J=9,1, 2,5 Hz, 1H), 3,98 (s, 1H). Esta reacción se repitió tres veces y dio siempre 96-98% de rendimiento, que es significativamente más elevado que el rendimiento de 68% publicado en J. Med. Chem. 1997, 40, 1794.

Ejemplo 2 Síntesis de Boc-4(R)-(naftalen-1-ilmetoxi)prolina (2)

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Se disolvió Boc-4(R)-hidroxiprolina disponible comercialmente (5,00 g, 21,6 mmoles) en THF (100 mL) y se enfrió a 0ºC. Se añadió en porciones hidruro sódico (dispersión al 60% en aceite, 1,85 g, 45,4 mmoles) a lo largo de 10 minutos, y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Después se añadió 1-(bromometil)naftaleno (8,00 g, 36,2 mmoles) (preparado como se describe en E.A. Dixon et al. Can. J. Chem. (1981) 59, 2629-2641) y la mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. La mezcla se vertió en agua (300 mL) y se lavó con hexano. La capa acuosa se acidificó con solución acuosa de HCl al 10% y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se reunieron y se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía rápida (49:49:2 de hexano:acetato de etilo:ácido acético) para dar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (4,51 g, 56% de rendimiento). ^{1}H NRM (DMSO-d_{6}) \delta 8,05 (m, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,29 (d, J=14 Hz, 1H), 7,55-7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (br s, 1H), 4,12 (dd, J=8 Hz, 1H), 3,54-3,42 (m, 2H), 2,45-2,34 (m, 1H), 2,07-1,98 (m, 1H), 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9) 9H).

Ejemplo 3 Síntesis de Boc-4(R)-(8-quinoleína-metiloxi)prolina (3)

40

Se añadió Boc-4-(R)-hidroxiprolina (1,96 g, 8,5 mmoles) en THF anhidro (20 mL) a una suspensión de NaH (1,4 g, 60% en aceite, 34 mmoles) en THF (100 mL). La mezcla se agitó 30 min antes de añadir bromoetil-8-quinoleína del Ejemplo 1A (2,54 g, 11,44 mmoles) en THF (30 mL). La mezcla de reacción se calentó a 70ºC (5 h) antes de destruir cuidadosamente el NaH en exceso con THF húmedo. La reacción se concentró bajo vacío y el material resultante se disolvió en EtOAc y H_{2}O. La fase acuosa básica se separó y se acidificó con solución acuosa de HCl al 10% a pH aprox. 5 antes de extraerla con EtOAc (150 mL). La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un aceite pardo. La purificación mediante cromatografía rápida (eluyente: 10% de MeOH/CHCl_{3}) dio el compuesto deseado en forma de un sólido amarillo pálido (2,73 g, 86%). HPLC (97,5%); ^{1}H NRM (DMSO-d_{6}) muestra poblaciones de rotámeros en una relación 6:4 \delta 12-11,4 (bs, 1H), 8,92 (2xd, J=4,14 y 4,14 Hz, 1H), 8,38 (2xd, J=8,27 y 8,27 Hz, 1H), 7,91 (d, J=7,94 Hz, 1H), 7,77 (d, J=7,0 Hz, 1H), 7,63-7,54 (m, 2H), 5,14 (2xs, 2H), 4,32-4,29 (m, 1H), 4,14-4,97 (m, 1H), 3,52-3,44 (m, 2H), 2,43-2,27 (m, 1H), 2,13-2,04 (m, 1H), 1,36 y 1,34 (2xs, 9H).

Ejemplo 4A Preparación de Boc-4(R)-(7-cloroquinoleína-4-oxo)prolina (4A)

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Se pusieron éster metílico de Boc-4(S)-hidroxiprolina (500 mg, 2,04 mmoles) comercialmente disponible y 7-cloro-4-hidroxiquinoleína (440 mg, 2,45 mmoles), en THF seco (10 mL) a 0ºC. Se añadió trifenilfosfina (641 g, 2,95 mmoles), y a continuación se añadió lentamente DIAD (426 mg, 2,45 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Después se concentró la mezcla de reacción, se recogió en acetato de etilo y se extrajo tres veces con HCl 1N. La fase acuosa se alcalinizó con Na_{2}CO_{3} y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se reunieron, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron para dar un aceite amarillo. El aceite se purificó mediante cromatografía rápida para dar el éster metílico del compuesto 4A en forma de un sólido blanco, 498 g, 58% de rendimiento.

Este éster metílico (400 mg, 0,968 mmoles) fue hidrolizado con solución acuosa de hidróxido sódico 1M (1,7 mL, 1,7 mmoles) en metanol (4 mL), a 0ºC durante 3 h. La solución se concentró para eliminar el metanol y se neutralizó con solución acuosa de HCl 1M. La suspensión se concentró a sequedad y se recogió en metanol (20 mL), las sales se eliminaron por filtración y el filtrado se concentró para dar el compuesto deseado 4A en forma de un sólido blanco, 387 mg, rendimiento cuantitativo.

^{1}H NRM (DMSO-d_{6}) (mezcla de rotámeros aprox. 1:1) \delta 8,74 (d, J=5 Hz, 1H), 8,13-8,09 (m, 1H), 7,99 y 7,98 (s, 1H), 7,58 (d, J=9 Hz, 1H), 7,02 (d, J=5 Hz, 1H), 5,26-5,20 (m, 1H), 4,10-4,01 (m, 1H), 3,81-3,72 (m, 1H), 3,59 (dd, J=12, 10 Hz, 1H), 2,41-2,31 (m, 2H), 1,34 y 1,31 (s, 9H).

Ejemplo 4B Síntesis de Boc-4(R)-(2-fenil-7-metoxiquinoleína-4-oxo)prolina (4B)

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1-[(1,1-Dimetiletoxi)carbonil]-4(R)-[(7-metoxi-2-fenil-4-quinoleinil)oxi]-L-prolina (4B)

Se añadió terc-butóxido potásico (8,16 g, 72,7 mmoles) en pequeñas porciones, a lo largo de 15 minutos, a una solución de 4-(S)-hidroxiprolina disponible comercialmente (6,73 g, 29,1 mmoles) en DMSO (83 mL) mantenida a 25ºC. La mezcla se agitó a 25ºC durante 1,5 h. Se añadió a la mezcla de reacción cloro-2-fenil-7-metoxiquinoleína 1C (8,61 g, 32,0 mmoles) en 4 porciones a lo largo de 15 min. La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante 19 h. La suspensión resultante se vertió en H_{2}O (650 mL) y la mezcla se lavó con Et_{2}O (3 x 150 mL) para eliminar el exceso de cloroquinoleína (más adelante se encontró que el EtOAc era más eficaz). La capa acuosa se acidificó con solución acuosa de HCl 1N (38 mL de 1,5 equiv. calculados requeridos, 43,6 mL) a pH 4 - 5. El sólido blanco que precipitó se recogió mediante filtración. El sólido húmedo se secó bajo presión reducida sobre P_{2}O_{5} para dar el derivado de prolina 4B (12,6 g, 91%, contiene 2,3% p/p de DMSO) en forma de un sólido beige.

^{1}H NRM (DMSO-d_{6}) \delta (mezcla 2:1 de rotámeros) 8,27 (d, J=7,0 Hz, 2H), 8,00, 7,98 (2d, J=9,2, -9,2 Hz, 1H), 7,48-7,56 (m, 3H), 7,45, 7,43 (2s, 1H), 7,39 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J=9,2, 2,5 Hz, 1H)=, 5,53-5,59 (m, 1H), 4,34-4,41 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,76 (br s, 2H), 2,63-2,73 (m, 1H), 2,32-2,43 (m, 1H), 1,36, 1,33 (2s, 9H).

Elementos de construccion P1 Ejemplo 5 Síntesis de la mezcla de ácido (1R,2R)/(1S,2R) 1-amino-2-etilciclopropil-carboxílico

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43

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a) A una suspensión de cloruro de benciltrietilamonio (21,0 g, 92,19 mmoles) en una solución acuosa de NaOH al 50% (92,4 g en 185 mL de H_{2}O) se añadieron sucesivamente malonato de di-terc-butilo (20,0 g, 92,47 mmoles) y 1,2-dibromobutano (30,0 g, 138,93 mmoles). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente y después se añadió una mezcla de hielo y agua. El producto crudo se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3x) y se lavó secuencialmente con agua (3x) y salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se sometió a cromatografía rápida (7 cm, 2 a 4% de Et_{2}O en hexano) para dar el derivado de ciclopropano deseado 5c (19,1 g, 70,7 mmoles, 76% de rendimiento). ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 1,78-17,0 (m, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,44-1,39 (m, 1H), 1,26-1,64 (m, 3H), 1,02 (t, 3H, J=7,6 Hz).

b) A una suspensión de terc-butóxido potásico (6,71 g, 59,79 mmoles, 4,4 eq.) en éter seco (100 mL) a 0ºC se añadió H_{2}O (270 \muL, 15,00 mmoles, 1,1 eq.). Después de 5 min se añadió a la suspensión el diéster 5c (3,675 g, 13,59 mmoles) en éter (10 mL). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, después se vertió en una mezcla de hielo y agua y se lavó con éter (3x). La capa acuosa se acidificó con una solución acuosa de ácido cítrico a 0ºC y se extrajo con AcOEt (3x). Las capas orgánicas reunidas se lavaron sucesivamente con agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (Na_{2}SO_{4}, filtración, concentración), se aisló el ácido 5d deseado en forma de un aceite amarillo pálido (1,86 g, 8,68 mmoles, 64% de rendimiento). ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 2,09-2,01 (m, 1H), 1,98 (dd, J=3,8, 9,2 Hz, 1H), 1,81-1,70 (m, 1H), 1,66 (dd, J=3,0, J=8,2 Hz, 1H), 1,63-1,56 (m, 1H), 1,51 (s, 9H), 1,0 (t, J=7,3 Hz, 3H).

c) Al ácido 5d (2,017 g, 9,414 mmoles) en benceno seco (32 mL) se añadieron sucesivamente Et_{3}N (1,50 mL, 10,76 mmoles, 1,14 eq.) y DPPA (2,20 mL, 10,21 mmoles, 1,08 eq.). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3,5 h y después se añadió 2-trimetilsililetanol (2,70 mL, 18,84 mmoles, 2,0 eq.). El reflujo se mantuvo durante la noche y después la mezcla de reacción se diluyó con Et_{2}O y se lavó sucesivamente con una solución de ácido cítrico al 10%, agua, solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración y concentración), el residuo se purificó mediante cromatografía rápida (5 cm, AcOEt-hexano al 10%) para dar el carbamato 5e deseado (2,60 g, 7,88 mmoles, 84% de rendimiento) en forma de un aceite amarillo pálido. MS (FAB) 330 (MH^{+}); ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,1 (b s, 1H), 4,18-4,13 (m, 2H), 1,68-1,38 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,24-1,18 (m, 1H), 1,00-0,96 (m, 5H), 0,03 (s, 9H).

c) Al carbamato 5e (258 mg, 0,783 mmoles) se añadió una solución de TBAF 1,0 M en THF (940 \muL, 0,94 mmoles, 1,2 eq.). Después de 4,5 h, se añadió una cantidad adicional de TBAF 1,0 M (626 \muL, 0,63 mmoles, 0,8 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, se calentó a reflujo durante 30 minutos y después se diluyó con AcOEt. La solución se lavó sucesivamente con agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración y concentración) se aisló la amina 5f deseada (84 mg, 0,453 mmoles, 58% de rendimiento) en forma de un líquido amarillo pálido. ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 1,96 (b s, 2H), 1,60-1,40 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 1,31-1,20 (m, 1H), 1,14 (dd, J=4,1, 7,3 Hz, 1H), 1,02 (dd, J=4,1, 9,2 Hz, 1H), 0,94 (t, J=7,3 Hz, 3H).

Ejemplo 6 Resolución química del (1R,2R)/(1S,2R)-1-amino-2-etil-ciclopropil-carboxilato de t-butilo (del Ejemplo 5)

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El compuesto 5e del Ejemplo 5 (8,50 g, 25,86 mmoles) fue tratado con TBAF/THF 1M (26 mL) a reflujo durante 45 minutos. La mezcla de reacción enfriada se diluyó con EtOAc, se lavó con agua (3x) y salmuera (1x) y después se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para dar la amina libre en forma de un aceite amarillo claro. La amina libre se disolvió en CH_{2}Cl_{2} anhidro (120 mL), y se añadieron sucesivamente NMM (8,5 mL, 77,57 mmoles), compuesto 2 (Ejemplo 2) (10,08 g, 27,15 mmoles) y HATU (11,79 g, 31,03 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después se elaboró como se describió anteriormente. La mezcla diastereómera cruda se separó mediante cromatografía rápida (eluyente hexano:Et_{2}O; 25:75) para proporcionar el dipéptido 6a (la mancha que eluye menos polar) en forma de una espuma blanca (4,42 g; 64% del rendimiento teórico) y 6b (la mancha que eluye más polar) en forma de una espuma de color marfil (4 g, 57% del rendimiento teórico). En este momento ambos isómeros fueron separados pero aún no se conocía la estereoquímica absoluta.

Ejemplo 7 Determinación de la estereoquímica absoluta de los compuestos 6a y 6b por correlación con (1R-amino-2R-etilciclopropil)carboxilato de t-butilo conocido

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El Prof. A. Charette, de la Universidad de Montreal, proporcionó el compuesto 7a que tiene la estereoquímica absoluta que se indica, que fue determinada por cristalografía de rayos X (J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 12721). El compuesto 7a (13,2 mg, 0,046 mmoles) se disolvió en HCl/EtOAc 1M (240 \muL) y se agitó aproximadamente 48 horas. La mezcla se evaporó a sequedad para dar el compuesto 7b en forma de una pasta amarilla clara, y se acopló con el compuesto 2 (18 mg, 0,049 mmoles) como se describe en el Ejemplo 6, usando NMM (20,3 \muL, 0,185 mmoles) y HATU (21,1 mg, 0,056 mmoles) en CH_{2}Cl_{2}. El material crudo fue purificado mediante cromatografía rápida (eluyente hexano:Et_{2}O; 50:50) para dar el dipéptido 7c en forma de un aceite (7,7 mg; 31%). Comparando por TLC, HPLC y NMR, se encontró que el dipéptido 7c era idéntico al compuesto 6a menos polar obtenido en el Ejemplo 6, identificándose así la estereoquímica absoluta de 6a como (1R,2R).

Ejemplo 8 Preparación de ácido (1R,2R)/(1S,2R)-1-Boc-amino-2-etil-ciclopropil-carboxílico (8a)

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El carbamato 5e del ejemplo 5 (2,6 g, 7,88 mmoles) se agitó durante 40 minutos en TFA a 0ºC. Después se concentró la mezcla y se diluyó con THF (10 mL). Se añadió una solución acuosa de NaOH (700 mg, 17,5 mmoles en 8,8 mL de H_{2}O), seguida por una solución en THF (13 mL) de (Boc)_{2}O (2,06 g, 9,44 mmoles, 1,2 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente (el pH se mantuvo en 8 añadiendo una solución acuosa de NaOH al 10% cuando era necesario), después se diluyó con H_{2}O, se lavó con Et_{2}O (3X) y se acidificó a 0ºC con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3X) y se lavó sucesivamente con H_{2}O (2X) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración y concentración) se aisló el aminoácido protegido con Boc deseado (8a) (788 mg, 3,44 mmoles, 44% de rendimiento). ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,18 (b s, 1H), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,55-1,42 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,32-1,25 (m, 1H), 0,99 (t, 3H, J=7,3 Hz).

Preparación del éster metílico del ácido (1R,2R)/(1S,2R)-1-Boc-amino-2-etil-ciclopropil-carboxílico (8b)

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El derivado Boc 8a (0,30 g, 1,31 mmoles) se disolvió en Et_{2}O (10 mL) y se trató con diazometano recién preparado en Et_{2}O a 0ºC hasta que quedó el color amarillo de un ligero exceso de diazometano. Después de agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a sequedad para dar 8b en forma de un aceite incoloro transparente (0,32 g, 100%).^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,1 (b s, 1H), 3,71 (s, 3H), 1,62-1,57 (m, 2H), 1,55 (s, 9H), 1,53-1,43 (m, 1H), 1,28-1,21 (m, 2H), 0,95 (t, J=7,3Hz, 3H).

Ejemplo 9 Resolución enzimática del (1R,2R)/(1S,2R)Boc-1-amino-2-etil-ciclopropil-carboxilato de metilo

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a) La mezcla enantiomérica del éster metílico del ácido (1S,2S)/(1R,2R) 1-Boc-amino-2-etil-carboxílico del Ejemplo 8 (0,31 g, 1,27 mmoles) se disolvió en acetona (3 mL) y después se diluyó con agua (7 mL), mientras se agitaba rápidamente. El pH de la solución se ajustó en 7,5 con solución acuosa de NaOH 0,05 M antes de añadir Alcalasa® [2,4 L extracto de Novo Nordisk Industrials] (300 mg). Durante la incubación el pH se estabilizó con NaOH y se instaló un pH-estato para controlar la adición de la solución de NaOH. Después de 40 h, la mezcla se diluyó con EtOAc y H_{2}O (con 5 mL de solución sat. de NaHCO_{3}) y se separaron las fases. La fase acuosa se acidificó con solución acuosa de HCl al 10% y se extrajo con EtOAc, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar el ácido 9a (48,5 mg). Se determinó la estereoquímica absoluta usando la correlación descrita en los Ejemplos 6 y 7.

b) El tratamiento de una parte alícuota de ácido 9a con diazometano en Et_{2}O para dar el éster metílico, seguido por el análisis mediante HPLC usando una columna quiral [Chiralcel® OD-H, 2,5% isopropanol(hexano, isocrática] mostró una relación 51:1 del isómero (1S,2S).

a') La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar los ésteres no hidrolizados (0,248 g). Este material fue sometido de nuevo al anterior protocolo enzimático hasta que el pH se mantuvo estable (98 h). Después de extraer como antes, se recuperaron 0,146 mg (100%) de éster no hidrolizado. El análisis mediante HPLC usando una columna quiral mostró una relación de >50:1 en favor del isómero (1R,2R).

b') La fase acuosa se acidificó con solución acuosa de HCl al 10% y se extrajo con EtOAc, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar el análogo ácido (82 mg). Una porción de este material se trató con diazometano y después se analizó mediante HPLC usando una columna quiral como la anterior, que mostró una relación 65:1 del derivado (1S,2S).

Ejemplo 10 Síntesis del ácido (1R,2S)/(1S,2S)-1-amino-2-etil-ciclopropil-carboxílico

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Partiendo del ácido 5d descrito en el Ejemplo 5:

c) A 5d (1,023 g, 4,77 mmoles) en CH_{3}CN (25 mL) se añadieron sucesivamente DBU (860 \muL, 5,75 mmoles, 1,2 eq.) y bromuro de alilo (620 \muL, 7,16 mmoles, 1,5 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante 4 h a temperatura ambiente (RT) y después se concentró. El residuo se diluyó con Et_{2}O y se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10% (2x), agua, solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, H_{2}O (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración y concentración) se aisló el éster 10a deseado (1,106 g, 3,35 mmoles, 91% de rendimiento) en forma de un aceite incoloro. MS (FAB) 255 (MH^{+}); ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,96-5,86 (m, 1H), 5,37-5,22 (m, 2H), 4,70-4,65 (m, 1H), 4,57-4,52 (m, 1H), 1,87-1,79 (m, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,45-1,40 (m, 1H), 1,33-1,24 (m, 3H), 1,03 (t, J=7,3 Hz, 3H).

d) Al éster 10a (1,106 g, 4,349 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 mL) a temperatura ambiente se añadió TFA (5 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 h y después se concentró para dar 10b (854 mg, 4,308 mmoles, 99% de rendimiento). MS (FAB) 199 (MH^{+}); ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,99-5,79 (m, 1H), 5,40-5,30 (m, 2H), 4,71-4,62 (m, 2H), 2,22-2,00 (m, 2H), 1,95-1,88 (m, 1H), 1,84-1,57 (m, 2H), 0,98 (t, J=7,3 Hz, 3H).

e) Al ácido 10b (853 mg, 4,30 mmoles) en benceno seco (14,8 mL) se añadieron sucesivamente Et_{3}N (684 \muL, 4,91 mmoles, 1,14 eq.) y DPPA (992 \muL, 4,40 mmoles, 1,07 eq.). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4,5 h y después se añadió 2-trimetilsililetanol (1,23 mL, 8,58 mmoles, 2,0 eq.). Se mantuvo el reflujo durante la noche y después la mezcla de reacción se diluyó con Et_{2}O y se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10%, agua, solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración, concentración), el residuo se sometió a cromatografía rápida (5 cm, 10 a 15% de AcOEt-hexano) para dar el carbamato 10c (1,212 g, 3,866 mmoles, 90% de rendimiento) en forma de un aceite amarillo pálido. MS (FAB) 314 (MH^{+}); ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,93-5,84 (m, 1H), 5,32-5,20 (m, 2H), 5,05 (b s, 1H), 4,60-4,56 (m, 2H), 4,20-4,11 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 3H), 1,39-1,22 (m, 1H), 1,03 (t, J=7,6 Hz, 3H), 0,96-0,86 (m, 1H), 0,04 (s, 9H).

f) Al carbamato 10c (267 mg, 0,810 mmoles) se añadió una solución de TBAF 1,0 M en THF (1,62 mL, 1,62 mmoles, 2,0 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, se calentó a reflujo durante 30 minutos y después se diluyó con AcOEt. La solución se lavó sucesivamente con agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración y concentración), se aisló la amina deseada 10d (122 mg, 0,721 mmoles, 89% de rendimiento) en forma de un líquido amarillo pálido. ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 5,94-5,86 (m, 1H), 5,31-5,22 (m, 2H), 4,58 (d, J=5,7 Hz, 2H), 1,75 (b s, 2H), 1,61-1,53 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J=7,3 Hz, 3H), 0,70-0,62 (m, 1H).

Ejemplo 11 Síntesis de (1R,2S)/(1S,2S)-1-amino-2-vinilciclopropil-carboxilato de etilo

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a) A una solución en THF (180 mL) de terc-butóxido potásico (4,62 g, 41,17 mmoles, 1,1 eq.) a -78ºC se añadió imina 11a disponible comercialmente (10,0 g, 37,41 mmoles) en THF (45 mL). La mezcla de reacción se calentó a 0ºC y se agitó a esta temperatura durante 40 minutos. La mezcla se volvió a enfriar después a -78ºC para la adición de 1,4-dibromobuteno 11b (8,0 g, 37,40 mmoles) y después se agitó a 0ºC durante 1 h y se enfrió de nuevo a -78ºC para la adición de terc-butóxido potásico (4,62 g, 41,17 mmoles, 1,1 eq.). La mezcla de reacción se agitó finalmente una hora más a 0ºC y se concentró para dar el compuesto 11c.

b,c,d) Se recogió el producto 11c en Et_{2}O (265 mL) y se trató con una solución acuosa de HCl 1N (106 mL). Después de 3,5 h a temperatura ambiente, las capas se separaron y la capa acuosa se lavó con Et_{2}O (2x) y se alcalinizó con una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}. La amina deseada se extrajo con Et_{2}O (3x) y el extracto orgánico reunido se lavó con salmuera. Después del tratamiento habitual (MgSO_{4}, filtración y concentración) el residuo se trató con una solución de HCl 4N en dioxano (187 mL, 748 mmoles). Después de concentrar, se aisló la sal hidrocloruro 11d en forma de un sólido pardo (2,467 g, 12,87 mmoles, 34% de rendimiento).^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 9,17 (b s, 3H), 5,75-5,66 (m, 1H), 5,39 (d, J=17,2 Hz, 1H), 5,21 (d, J=10,2 Hz, 1H), 4,35-4,21 (m, 2H), 2,77-2,70 (m, 1H), 2,05 (dd, J=6,4, 10,2 Hz, 1H), 1,75 (dd, J=6,4, 8,3 Hz, 1H), 1,33 (t, J=7,0 Hz, 3H).

Ejemplo 12 Preparación del éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2S)-1-Boc-amino-2-vinil-ciclopropil-carboxílico

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La sal hidrocloruro 11d (1,0 g, 5,2 mmoles) y (Boc)_{2}O (1,2 g, 5,7 mmoles) se disolvieron en THF (30 mL) y se trataron con DMAP (0,13 g, 1,04 mmoles, 0,2 equiv.) y diisopropiletilamina (2,8 mL, 15,6 mmoles). La mezcla de reacción se calentó 24 horas antes de ser diluida con EtOAc (40 mL) y lavada sucesivamente con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, solución acuosa al 5% de HCl y salmuera saturada. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar, después de purificar mediante cromatografía rápida (15% de EtOAc/hexano), el compuesto 12a (0,29 g, 23%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 5,80-5,72 (m, 1H), 5,29-5,25 (dd, J=17,2, 17,2 Hz, 1H), 5,24-5,1 (b s, 1H), 5,10 (dd, J=9,2, 9,2 Hz, 1H), 4,22-4,13 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 1H), 1,85-1,73 (b s, 1H), 1,55-1,5 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,26 (t, J=7,3 Hz, 3H).

Ejemplo 13 Resolución enzimática del (1R,2S)/(1S,2S)-1-amino-2-vinil-ciclopropil-carboxilato de etilo

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a) El derivado racémico 12a (0,29 g, 1,14 mmoles) se disolvió en acetona (5 mL) y se diluyó con H_{2}O (10 mL). El pH se ajustó en el valor 7,2 con solución acuosa de NaOH 0,2N antes de añadir Alcalase® (300 mg). Para mantener el pH constante durante la incubación, se añadió una solución de NaOH mediante un valorador con pH-estato a lo largo de 9 días, hasta que se hubo añadido la cantidad teórica de base. Después de la extracción ácido/base como se describió en el Ejemplo 9, el éster no hidrolizado (0,15 g, 100%) y el material hidrolizado (0,139 g, 95%) fueron aislados. El análisis del éster no hidrolizado por HPLC usando una columna quiral mostró una relación 43:1 del compuesto deseado 13c. El compuesto 206 (en el que R_{1} es vinilo, Tabla 2) fue hidrogenado (10,8 mg, 0,015 mmoles en 1 mL de EtOH con aproximadamente 1 mL de Pd(OH)_{2} al 20% bajo 1 atm de H_{2} durante 45 minutos) para dar el compuesto 214 (en el que R_{1} es etilo, Tabla 2). Al compuesto 214 le había sido asignada la estereoquímica (1R,2R) basándose en la correlación química como se describió en los Ejemplos 6 y 7, lo que indica que el compuesto 206 (R_{1}=vinilo) tiene la misma configuración absoluta que la representada por 13c (aunque 1R,2S porque R_{1}=vinilo).

Condiciones para análisis por HPLC: Chiracel® OD-H (4,6 mm x 25 cm), condiciones isocráticas usando una fase móvil de 2,5% isopropanol/hexano.

Ejemplo 14 Resolución del (1R,2S)/(1S,2S)-1-amino-2-vinil-ciclopropil-carboxilato de etilo por cristalización con ácido dibenzoil-D-tartárico

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A una solución de 1-amino-2-vinilciclopropil-carboxilato de etilo racémico (1S,2R y 1R,2S) crudo [obtenido a partir del éster etílico de N-(difenilmetilen)glicina (25,0 g, 93,5 mmoles) como se describió en el Ejemplo 13] en EtOAc (800 mL), se añadió ácido dibenzoil-D-tartárico (33,5 g, 93,5 mmoles). La mezcla se calentó a reflujo, se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se enfrió a 0ºC. Se obtuvo un sólido blanco después de 30 minutos. El sólido se filtró, se lavó con EtOAc (100 mL) y se secó con aire. El sólido se suspendió en acetona (70 mL), se trató con ultrasonidos y se filtró (3x). A continuación el sólido se recristalizó dos veces en acetona caliente (cosecha A). Las aguas madre se concentraron y el residuo se recristalizó tres veces en acetona caliente (cosecha B). Las dos cosechas de sólidos blancos amorfos de sal de ácido dibenzoil-D-tartárico se reunieron (5,53 g) y se suspendieron en una mezcla de Et_{2}O (250 mL) y solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (150 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. El filtrado se diluyó con HCl/Et_{2}O 1N (100 mL) y se concentró bajo presión reducida. El residuo oleoso se evaporó con CCl_{4} para dar 1(R)-amino-2(S)-vinil-ciclopropano-carboxilato de etilo hidrocloruro (940 mg, 11% de rendimiento) en forma de un sólido blanco higroscópico, para el cual se asignó la estereoquímica absoluta por correlación con el compuesto 13c del Ejemplo 13.

[\alpha]_{D}^{25} +39,5E (c 1,14 MeOH); [\alpha]_{365}^{25} +88,5E (c 1,14 MeOH); ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 9,07 (br s, 2H), 5,64 (ddd, J=17,2, 10,4, 8,7 Hz, 1H), 5,36 (dd, J=17,2, 1,6 Hz, 1H), 5,19 (dd, J=10,4, 1,6 Hz, 1H), 4,24-4,16 (m, 2H), 2,51-2,45 (m, picos impedidos por el DMSO, 1H), 1,84 (dd, J=10,0, 6,0, 1H), 1,64 (dd, J=8,3, 6,0 Hz, 1H), 1,23 (t, J=7,1 Hz, 3H); MS (ESI) m/z 156 (MH^{+}); se determinó que la pureza enantiomérica era 91% de ee por análisis de HPLC (columna CHIRALPAK AS®, Hex:i-PrOH) del derivado BOC (Ejemplo 13).

Elementos de construccion P4-P2 Ejemplo 15 Síntesis del segmento: Ac-Chg-Chg-Pro (4(R)-naftalen-1-ilmetoxi)-OH (15g)

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El compuesto 15a (igual que el compuesto 2 del Ejemplo 2) (4,45 g, 11,98 mmoles) se disolvió en CH_{3}CN anhidro (60 mL), se añadieron sucesivamente DBU (2,2 mL, 14,38 mmoles) y bromuro de alilo (1,1 mL, 13,18 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó 24 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentró, el aceite resultante se diluyó con EtOAc y agua y se lavó sucesivamente con agua (2x) y salmuera (2x). La capa de EtOAc se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó a sequedad. El aceite amarillo fue purificado mediante cromatografía rápida (eluyente hexano:EtOAc 90:10 a 85:15) para proporcionar el producto 15b en forma de un aceite amarillo (2, 4,17 g; 85% de rendimiento). MS (FAB) 412 MH^{*}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros apr. 1:2, \delta (d, J=8 Hz, 1H), 7,87 (d, J=8 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8 Hz, 1H), 7,55-7,41 (m, 4H), 5,95-5,85 (m, 1H), 5,34-5,21 (m, 2H), 5,03-4,88 (m, 2H), 4,70-4,56 (m, 2H), 4,48 y 4,39
(t, J=8, 15 Hz, 1H), 4,28-4,23 (m, 1H), 3,81-3,55 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, 1H), 2,13-2,05 (m, 1H), 1,44 y 1,41 (s, 9H).

El compuesto 15b (2,08 g, 5,05 mmoles) fue tratado durante 30 minutos a temperatura ambiente con HCl/dioxano 4N. La evaporación a sequedad proporcionó la correspondiente amina-HCl en forma de un aceite. La amina-HCl 15c se disolvió en DCM anhidro (25 mL) y se añadieron sucesivamente NMM (2,2 mL, 20,22 mmoles), Boc-Chg-OH\cdotH_{2}O (1,53 g, 5,56 mmoles) y TBTU (1,95 g, 6,07 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, después se diluyó con EtOAc y se lavó sucesivamente con solución acuosa de ácido cítrico al 10% (2x), solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2x), agua (2x) y salmuera (1x). La capa de EtOAc se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó a sequedad para proporcionar el producto crudo 15d en forma de una espuma blanca-amarillenta (aprox. 2,78 g, 100% de rendimiento). MS (FAB) 551,4 MH^{+}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,03 (d, J=8 Hz, 1H), 7,86 (b d, J=8,5 Hz, 1H), 7,84 (d, J=8 Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 4H), 5,92-5,85 (m, 1H), 5,31 (dd, J=1, 17 Hz, 1H), 5,22 (dd, J=1, 10 Hz, 1H), 5,17 (d, J=9 Hz, 1H), 5,05 (d, J=12 Hz, 1H), 4,91 (d, J=12 Hz, 1H), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,31-4,27 (m, 2H), 4,16 (b d, J=11 Hz, 1H), 3,71 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,47-2,41 (m, 1H), 2.08-1,99 (m, 1H), 1,85-1,63 (m, 5H), 1,44-1,40 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,28-1,00 (m, 5H).

El dipéptido crudo 15d (aprox. 5,05 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (25 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada con Boc-Chg-OH\cdotH_{2}O (1,53 g, 5,55 mmoles) con NMM (2,22 mL, 20,22 mmoles) y TBTU (1,95 g, 6,07 mmoles) en DCM (25 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15d, para dar el tripéptido crudo 15e en forma de una espuma oleosa amarilla. El material crudo fue purificado mediante cromatografía rápida (eluyente hexano:EtOAc 80:20 a 75:25) para proporcionar el tripéptido 15e en forma de una espuma blanca (2,75 g; 79% de rendimiento sobre 2 etapas). MS (FAB) 690,5 MH^{+}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,06 (d, J=8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=8,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8 Hz, 1H), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,41 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,92-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J=1, 17 Hz, 1H), 5,23 (dd, J=1, 10,5 Hz, 1H), 5,04 (d, J=12 Hz, 1H), 4,98 (b d, J=7 Hz, 1H), 4,93 (d, J=12 Hz, 1H), 4,63-4,58 (m, 4H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,10-4,07 (m, 1H), 3,90-3,84 (m, 1H), 3,72 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,48-2,40 (m, 1H), 2.07-1,99 (m, 1H), 1,85-1,55 (m, 12H), 1,43 (s, 9H), 1,23-0,89 (m, 10H).

El tripéptido 15e (2,75 g, 3,99 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (20 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se disolvió en DCM anhidro (20 mL). Se añadieron sucesivamente NMM (1,75 mL, 15,94 mmoles) y anhídrido acético (752 \muL, 7,97 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, y después se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó sucesivamente con solución acuosa de ácido cítrico al 10% (2x), solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó a sequedad para proporcionar el tripéptido crudo 15f en forma de una espuma blanca (2,48 g, 98% de rendimiento). MS (FAB) 632,4 MH+I. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,06 (d, J=8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,83 (d, J=8 Hz, 1H), 7,58-7,40 (m, 4H), 6,36 (d, J=9 Hz, 1H), 6,01 (d, J=9 Hz, 1H), 5,94-5,83 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 5,05 (d, J=12 Hz, 1H), 4,94 (d, J=12 Hz, 1H), 4,64-4,57 (m, 4H), 4,30-4,23 (m, 2H), 4,12-4,08 (m, 1H), 3,73 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,49-2,42 (m, 1H), 2,08-2,01 (m, 1H), 1,99 (s, 3H), 1,85-1,53 (m, 11H), 1,25-0,88 (m, 11H).

El tripéptido crudo 15f (2,48 g, 3,93 mmoles) se disolvió en una mezcla anhidra de CH_{3}CN:DCM (20 mL). Se añadieron sucesivamente trifenilfosfina (53,5 mg, 0,200 mmoles) y catalizador de tetraquis(trifenilfosfina)-paladio(0) (117,9 mg, 0,102 mmoles), y a continuación pirrolidina (353,9 \muL, 4,24 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. A continuación se evaporó el disolvente. El residuo se disolvió en EtOAc y solución acuosa de ácido cítrico al 10%, después se siguió lavando dos veces más con solución acuosa de ácido cítrico al 10%, agua (2x) y salmuera (1x). La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó. El producto crudo se trituró en Et_{2}O:DCM (85:15) para proporcionar, después de filtrar, el tripéptido 15g en forma de un sólido blanco (2,09 g, 90% de rendimiento). MS (FAB) 592,4 MH^{+} 614,3 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,08 (d, J=8 Hz, 1H), 7,93 (b d, J=9 Hz, 1H), 7,88 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8 Hz, 1H), 7,57-7,41 (m, 4H), 6,47 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J=12,5 Hz, 1H), 4,94 (d, J=12,5 Hz, 1H), 4,73 (t, J=9,5, 19 Hz, 1H), 4,44-4,35 (m, 2H), 4,26 (b s, 1H), 4,19 (d, J=11,5 Hz, 1H), 3,75 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,47 (b dd, J=7,5, 13,5 Hz, 1H), 2,20-2,11 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,88-1,41 (m, 11H), 1,30-0,80 (11H).

Ejemplo 16 Síntesis del segmento Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-naftalen-1-ilmetoxi)-OH (16e)

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El compuesto 16a (2,89 g, 7,02 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Val-OH (1,53 g, 7,73 mmoles) con NMM (3,1 mL, 28,09 mmoles) y TBTU (2,71 g, 8,43 mmoles) en DCM (35 mL) durante 32 h como se describió para la síntesis del compuesto 15d, para proporcionar el dipéptido crudo 16b en forma de una espuma oleosa de color marfil (apr. 3,60 g, 100% de rendimiento). MS (FAB) 509,3 MH^{-} 511,3 MH^{+} 533,2 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), \delta 8,04 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=7 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8 Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 4H), 5,93-5,85 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 5,24-5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J=12 Hz, 1H), 4,92 (d, J=12 Hz, 1H), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,31-4,26 (m, 2H), 4,11-4,09 (m, 1H), 3,72 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,07-1,99 (m, 1H), 1,44-1,36 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,01 (d, J=7 Hz, 3H), 0,93 (d, J=7 Hz, 3H).

El dipéptido crudo 16b (aprox. 7,02 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Chg-OH\cdotH_{2}O (2,13 g, 7,73 mmoles) con NMM (3,1 mL, 28,09 mmoles) y TBTU (2,71 g, 8,43 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (35 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15d, para proporcionar el tripéptido crudo 16c en forma de una espuma de color marfil (apr. 4,60 g, 100% de rendimiento). MS (FAB) 648,5 MH^{-} 672,4 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), \delta 8,08 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,82 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,46 (b d, J=8,5 Hz, 1H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J=1, 17 Hz, 1H), 5,23 (dd, J=1, 10,5 Hz, 1H), 5,03 (d, J=12 Hz, 1H), 5,00-4,97 (m, 1H), 4,93 (d, J=12 Hz, 1H), 4,63-4,59 (m, 4H), 4,29-4,27 (m, 1H), 4,10-4,07 (m, 1H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,72 (dd, J=5, 11 Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,10-1,99 (m, 1H), 1,76-1,57 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,20-0,92 (m, 6H), 1,00 (d, J=7 Hz, 3H), 0,93 (d, J=7 Hz, 3H).

El tripéptido crudo 16c (apr. 7,02 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se siguió tratando con anhídrido acético (1,33 mL, 14,05 mmoles) y NMM (3,1 mL, 28,09 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (35 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15d. El producto crudo fue purificado por cromatografía rápida (eluyente hexano:EtOAc 30:70) para proporcionar el tripéptido protegido acetilado 16d en forma de una espuma blanca (3,39 g, 81% de rendimiento sobre 3 etapas). MS (FAB) 590,3 MH^{-} 592,4 MH^{+} 614,4 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,06 (d, J=8 Hz, 1H), 7,88 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,83 (d, J=8 Hz, 1H), 7,58-7,41 (m, 4H), 6,37 (d, J=9 Hz, 1H), 5,97 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J=1, 17 Hz, 1H), 5,24 (dd, J=1, 10,5, 1H), 5,05 (d, J=12 Hz, 1H), 4,94 (d, J=12 Hz, 1H), 4,66-4,57 (m, 4H), 4,31-4,22 (m, 2H), 4,11-4,05 (m, 1H), 3,73 (dd, J=4,5, 11 Hz, 1H), 2,50-2,43 (m, 1H), 2,09-2,01 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,68-1,55 (m, 5H), 1,15-0,89 (m, 6H), 0,99 (d, J=7 Hz, 3H), 0,91 (d, J=7 Hz, 3H).

El tripéptido acetilado 16d (3,39 g, 5,73 mmoles) fue desprotegido por el catalizador tetraquis(trifenilfosfina)-paladio (0) (172,1 mg, 0,149 mmoles) con trifenilfosfina (78,1 mg, 0,298 mmoles) y pirrolidina (516 \muL, 6,10 mmoles) en una mezcla 1:1 de CH_{3}CN:DCM anhidros (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15g. El producto crudo en forma de una espuma de color amarillo claro se trituró en Et_{2}O:DCM (85:15) para proporcionar, después de filtrar, el tripéptido 16e en forma de un sólido blanquecino (3,0 g; 95% de rendimiento). MS (FAB) 550,3 MH^{+}.

^{1}H NMR (CDCl_{3}), \delta 8,08 (d, J=8 Hz, 1H), 8,04 (b d, J=9 Hz, 1H), 7,88 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8 Hz, 1H), 7,58-7,37 (m, 5H), 5,05 (d, J=12 Hz, 1H), 4,94 (d, J=12 Hz, 1H), 4,61 (t, J=9,5, 19,5 Hz, 1H), 4,46-4,37 (m, 2H), 4,27 (b s, 1H), 4,17 (d, J=11 Hz, 1H), 3,74 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,49 (b dd, J=7,5, 13 Hz, 1H), 2,17-2,09 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 2,03-1,94 (m, 1H), 1,79 (b d, J=12,5 Hz, 1H), 1,62-1,43 (m, 5H), 1,08-0,85 (m, 5H), 1,00 (d, J=7Hz, 3H), 0,90 (d, J=7 Hz, 3H).

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(Esquema pasa a página siguiente)

Compuestos de las tablas 1 a 4 Ejemplo 17 Síntesis del compuesto 104 de la Tabla 1

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El compuesto 17a (4,27 g, 7,93 mmoles, descrito como compuesto 6a en el Ejemplo 6) fue tratado con HCl/dioxano 4N (40 mL) durante 5 h, como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se disolvió en THF (10 mL) y se añadió una solución de NaOH (348,7 mg, 8,72 mmoles) en H_{2}O (5 mL), y a continuación se añadió gota a gota (Boc)_{2}O (1,73 g, 7,93 mmoles) disuelto en THF (13 mL). El pH se mantuvo en 8 mediante la adición de solución acuosa de NaOH al 10% a medida que era necesario. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente, después se diluyó con Et_{2}O y H_{2}O y se extrajo una vez más con Et_{2}O. La capa acuosa se acidificó a pH 3 con solución acuosa de ácido cítrico al 10%. La mezcla se extrajo con EtOAc (3x). Los extractos en EtOAc reunidos se lavaron con H_{2}O (2x) y salmuera (1x), y luego se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se evaporaron a sequedad para proporcionar el compuesto 17b crudo en forma de una espuma de color marfil (aprox. 7,93 mmoles). MS (FAB) 481,3 MH^{-}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros apr. 1:1, \delta 8,04 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 5H), 4,96 (b s, 2H), 4,33 (t, J=7,5, 14,5 Hz, 1H), 4,21-4,09 (m, 0,5 H), 3,99- 3,84 (m, 0,5 H), 3,78-3,75 (m, 0,5 H), 3,68-3,62 (m, 0,5 H), 3,61-3,42 (m, 1H), 2,55-2,41 (m, 1H), 2,22-2,11 (m, 1H), 1,61-1,52 (m, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,40-1,31 (m, 1H), 1,25-1,19 (m, 1H), 0,99 (t, J=7,5, 14,5 Hz, 3H).

El compuesto 17b (apr. 7,93 mmoles) fue tratado con DBU (1,18 mL, 93 mmoles) y bromuro de alilo (4,12 mL, 47,61 mmoles) en CH_{3}CN anhidro (40 mL) durante 48 h, como se describió para el compuesto 15b, para proporcionar el dipéptido alilado 17c en forma de una espuma de color marfil (3,54 g; 86% de rendimiento sobre dos etapas). MS (FAB) 521,3 MH^{-} 545,2 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros apr. 1:1, \delta 8,05 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,86 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8 Hz, 1H), 7,55-7,40 (m, 5H), 5,88-5,79 (m, 1H), 5,27 (b d, J=17,5 Hz, 1H), 5,18 (b d, J=10 Hz, 1H), 5,03-4,89 (m, 2H), 4,63-4,50 (m, 2H), 4,44-4,19 (m, 2H), 4,00-3,40 (m, 2H), 2,70-2,02 (m, 2H), 1,66-1,35 (m, 5H), 1,44 (s, 9H), 0,95 (t, J=7,5, 14,5 Hz, 3H).

El dipéptido 17c crudo (1,18 g, 2,26 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (35 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Chg-OH\cdotH_{2}O (684 mg, 2,48 mmoles) con NMM (993 \muL, 9,03 mmoles) y TBTU (870 mg, 2,71 mmoles) en DCM (11 mL) como se describió para el compuesto 15d, para proporcionar el tripéptido 17d crudo en forma de una espuma de color marfil (1,41 g; 95%). MS (FAB) 640,4 MH^{-} 662,3 MH^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,03 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,85 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8 Hz, 1H), 7,56-7,39 (m, 5H), 5,88-5,77 (m, 1H), 5,26 (dd, J=1,5, 17 Hz, 1H), 5,15 (dd, J=1,5, 10,5 Hz, 1H), 5,12 (s, 1H), 5,02-4,92 (m, 2H), 4,72-4,59 (m, 1H), 4,57-4,46 (m, 1H), 4,42-4,35 (m, 1H), 4,33-4,20 (m, 1H), 4,02-3,90 (m, 1H), 3,78-3,70 (m, 1H), 3,67-3,51 (m, 1H), 2,71-2,61 (m, 1H), 2,12-2,02 (m, 1H), 1,79-1,48 (m, 10H), 1,45-1,39 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,25-1,01 (m, 5H), 0,94 (t, J=7,5, 14 Hz, 3H).

El tripéptido 17d crudo (265 mg, 0,400 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (3 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Chg-OH\cdotH_{2}O (143,3 mg, 0,481 mmoles) con NMM (176 \muL, 1,60 mmoles) y TBTU (154,3 mg, 0,481 mmoles) en DCM (3 mL) como se describió para el compuesto 15d, para proporcionar el tripéptido 17e crudo en forma de una espuma de color marfil (apr. 0,400 mmoles; 100%). MS (FAB) 799,5 MH^{-} 801,5 MH^{+} 823 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros apr. 1:1, \delta 8,05 (b d, J=8,5 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,55-7,40 (m, 4H), 7,37 (s, 1H), 6,58-6,41 (m, 1H), 5,89-5,78 (m, 1H), 5,26 (b dd, J=1,5, 17 Hz, 1H), 5,16 (b dd, J=1,5, 10,5 Hz, 1H), 5,20-4,92 (m, 3H), 4,68-4,58 (m, 2H), 4,57-4,47 (m, 1H), 4,43-4,26 (m, 1H), 3,99-3,81 (m, 2H), 3,78-3,60 (m, 2H), 2,67-2,60 (m, 1H), 2,11-2,02 (m, 1H), 1,78-1,42 (m, 14H), 1,44 y 1,43 (s, 9H), 1,25-0,91 (m, 13H), 0,95 (t, J=7,5, 15 Hz, 3H).

El tetrapéptido 17e crudo (apr. 0,400 mmoles) fue tratado con HCl/dioxano 4N (3 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se siguió tratando con anhídrido acético (83 \muL, 0,884 mmoles) y NMM (194 \muL, 1,77 mmoles) en DCM (3 mL) como se describió para el compuesto 15f, para proporcionar el tetrapéptido 17f acetilado crudo en forma de una espuma de color marfil (apr. 0,400 mmoles).

MS (FAB) 741,5 MH^{-} 743,4 MH^{+} 765,4 (M+Na)^{+}.

^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,05 (b d, J=8,5 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,55-7,41 (m, 4H), 7,39 (s, 1H), 6,63-6,48 (m, 1H), 6,01 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,90-5,79 (m, 1H), 5,27 (b dd, J=1,5, 17 Hz, 1H), 5,16 (b dd, J=1,5, 10,5 Hz, 1H), 5,01 (d, J=12 Hz, 1H), 4,96 (d, J=12 Hz, 1H), 4,69-4,48 (m, 3H), 4,44-4,37 (m, 1H), 4,36-4,22 (m, 1H), 3,96 (dd, J=4, 11 Hz, 1H), 3,78- 3,60 (m, 2H), 2,67-2,59 (m, 1H), 2,10-2,00 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,78-1,48 (m, 13H), 1,45-1,35 (m, 1H), 1,26-0,89 (m, 13H), 0,95 (t, J=7,5, 15 Hz, 3H).

El tetrapéptido acetilado 17f (apr. 0,400 mmoles) fue desprotegido por el catalizador tetraquis(trifenilfosfina)-paladio (0) (11,3 mg, 0,010 mmoles) con trifenilfosfina (5,12 mg, 0,020 mmoles) y pirrolidina (34 \muL, 0,406 mmoles) en una mezcla 1:1 de CH_{3}CN:DCM anhidros (2 mL) como se describió para el compuesto 15g. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía rápida (eluyente 11 EtOAc, después, 21 1,92% de HOAc, 3,85% de MeOH en DCM) para proporcionar, después de liofilizar, el compuesto de tetrapéptido 104 de la Tabla 1 en forma de un sólido amorfo blanquecino (193,1 mg; 73% de rendimiento sobre 5 etapas).

MS (FAB) 701,4 MH^{-} 703,4 MH^{+} 725,4 (M+Na)^{+}

^{1}H NMR (DMSO), mezcla de rotámeros apr. 1:5, \delta 8,57 y 8,32 (s, 1H), 8,04 (d, J=7,5, 1H), 7,94 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J=8 Hz, 1H), 7,83-7,78 (m, 2H), 7,58-7,30 (m, 4H), 4,99 (d, J=12 Hz, 1H), 4,90 (d, J=12 Hz, 1H), 4,44-4,29 (m, 2H), 4,29-4,05 (m, 3H), 3,87-3,73 (m, 1H), 2,23- 2,13 (m, 1H), 2,05-1,95 (m, 1H), 1,91 y 1,84 (s, 3H), 1,75-1,40 (m, 15H), 1,29-0,84 (m, 12H), 0,91 (t, J=7,5, 14,5 Hz, 3H).

Ejemplo 18 Síntesis del compuesto 105 de la Tabla 1

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El compuesto 18b, es decir el correspondiente al compuesto 5f del Ejemplo 5, fue acoplado al tripéptido 18a preformado descrito anteriormente en el Ejemplo 15. Más específicamente, el compuesto 18b (apr. 0,521 mmoles) se combinó con el compuesto 18a (323,6 mg, 0,547 mmoles) en DCM (3 mL) y NMM (172 \muL, 1,562 mmoles) y a continuación se añadió HATU (237,6 mg, 0,625 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h, después de lo cual se elaboró como se describió para el compuesto 15d para dar el tetrapéptido crudo en forma de mezcla racémica a P1. Ambos isómeros fueron separados parcialmente mediante cromatografía rápida (eluyente tolueno:EtOAc 40:60). La combinación de las fracciones que eluyeron primero dio una mezcla 9:1 en la que el análogo éster terc-butílico de 17f era el principal componente (58 mg). Las fracciones medias contenían relaciones distintas de los correspondientes ésteres terc-butílicos de 17f y éster terc-butílico del compuesto 105 (163 mg). Las fracciones que eluyen más tarde proporcionaron el correspondiente éster terc-butílico del compuesto 105 como isómero principal (75,8 mg).

Este último éster (74 mg, 0,0975 mmoles) se disolvió en HCl/dioxano 4N (2 mL), se agitó a temperatura ambiente durante 5,5 h y después se evaporó a sequedad para dar un aceite. La purificación mediante cromatografía rápida (eluyente 11 EtOAc, después 21 1,92% de HOAc, 3,85% de MeOH, en DCM) dio, después de liofilizar, el compuesto 105 en forma de un sólido amorfo blanco (38,7 mg, 56% de rendimiento). El análisis por HPLC indicó una relación 3:1 de compuesto 105 y compuesto 104. Datos de MS y NMR para el compuesto 105: MS (FAB) 701,5 MH^{-} 703,5 MH^{+} 725,6 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (DMSO), mezcla de rotámeros apr. 1:2,5, \delta 8,76 y 8,34 (s, 1H), 8,05 (d, J=7,5, 1H), 7,94 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,88 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,85-7,78 (m, 2H), 7,58-7,43 (m, 4H), 4,99 (d, J=12 Hz, 1H), 4,89 (d, J=12 Hz, 1H), 4,41-4,05 (m, 5H), 3,82-3,66 (m, 1H), 2,25-2,11 (m, 1H), 2,11-1,98 (m, 1H), 1,90 y 1,84 (s, 3H), 1,78-1,40 (m, 15H), 1,29-0,82 (m, 12H), 0,90 (t, J=7, 14 Hz, 3H).

Ejemplo 19 Síntesis de los compuestos 103 de la Tabla 1

Siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis del compuesto 104 del Ejemplo 17, las mezclas de los isómeros 1(S),2(R), y 1(R),2(S) del compuesto intermedio 10d, preparado en el Ejemplo 10, fueron acopladas con compuesto 2 para dar una mezcla de compuestos intermedios isómeros 19a y 19b.

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Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 18, los compuestos isómeros 19a y 19b fueron separados y transformados en su correspondiente compuesto de fórmula 1; para aislar el correspondiente compuesto 103 de la Tabla 1.

Datos espectrales:

Compuesto 103: población de rotámeros por NMR apr. (1:8,7)

MS (FAB) m/z 703 (MH^{+}); ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 8,21-8,09 (b s 1H), 8,05 (b d, J=7,63 Hz, 1H), 7,94 (b d, J=7,0 Hz, 1H), 7,91-7,83 (m, 2H), 7,83-7,76 (m, 1H), 7,59-7,5 (m, 3H), 7,50-7,43 (m, 1H), 4,99 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,43-4,30 (m, 3H), 4,23-4,16 (m, 1H), 4,13 (b d, J=10,8 Hz, 1H), 3,71 (dd, J=11,1, 4 Hz, 1H), 2,2-2,02 (m, 2H), 1,87 y 1,84 (2 x s, 3H), 1,81-1,71 (m, 2H), 1,70-1,40 (m, 12H), 1,26-1,06 (m, 4H), 1,04-0,83 (m, 11H), 0,59 (m, 1H).

Ejemplo 20 Síntesis del compuesto 108 de la Tabla 1

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El tetrapéptido 17e crudo del Ejemplo 17 (apr. 0,963 mmoles) fue tratado con solución de HCl/dioxano 4N (5 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-(D)Gly(O-alil)-OH (331,9 mg, 1,155 mmoles) con NMM (423 \muL, 3,850 mmoles) y TBTU (370,8 mg, 1,155 mmoles) en DCM (5 mL) durante 3 h a temperatura ambiente como se describió para el compuesto 15d. Se obtuvo el pentapéptido 20b crudo en forma de una espuma de color marfil (apr. 933,9 mg, 0,963 mmoles). MS (FAB) 968,6 MH^{-} 970,6 MH^{+} 992,5 (M+Na).

^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros apr. 1:4, \delta 8,05 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,87 (b d, J=7,5 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,58-7,34 (m, 5H), 6,77-6,25 (m, 2H), 5,98-5,77 (m, 2H), 5,38-5,21 (m, 4H), 5,16 (dd, J=1,5, 10,5, 1H), 5,06-4,89 (m, 2H), 4,68-4,13 (m, 7H), 3,96-3,52 (m, 4H), 2,69-2,38 (m, 3H), 2,23-1,87 (m, 2H), 1,78-1,37 (m, 17H), 1,46 y 1,44 (s, 9H), 1,22-0,87 (m, 11H), 0,95 (t, J=7, 14,5 Hz, 3H).

El pentapéptido 20b crudo (apr. 0,963 mmoles) fue tratado con solución de HCl/dioxano 4N (5 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Asp(O-alil)-OH (315,6 mg, 1,155 mmoles) con NMM (423 \muL, 3,85 mmoles) y TBTU (370,8 mg, 1,155 mmoles) en DCM (5 mL) como se describió para el compuesto 15d. Se obtuvo el hexapéptido 20c crudo en forma de una espuma de color marfil (apr. 1,083 g, 0,963 mmoles). MS (FAB) 1147,6 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros apr. 1:1, \delta 8,06 (b d, J=8 Hz, 1H), 7,86 (d, J=8 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8 Hz, 1H), 7,59-7,39 (m, 5H), 7,39-6,34 (m, 4H), 5,98-5,76 (m, 3H), 5,38-5,10 (m, 6H), 5,10-4,89 (m, 2H), 4,66-4,05 (m, 10H), 3,87-3,58 (m, 4H), 3,30-2,65 (m, 2H), 2,65-1,89 (m, 3H), 1,79-1,33 (m, 19H), 1,47 y 1,45 (s, 9H), 1,33-0,86 (m, 14H).

El hexapéptido 20c crudo (apr. 0,963 mmoles) fue tratado con solución de HCl/dioxano 4N (5 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acetilada con anhídrido acético (182 \muL, 1,193 mmoles) y NMM (423,5 \muL, 3,850 mmoles) en DCM (5 mL) como se describió para el compuesto 15f, para proporcionar el tetrapéptido acetilado crudo. El residuo en forma de espuma se purificó mediante cromatografía rápida (eluyente: 11 hexano:EtOAc 20:80 a 10:90 y 21 EtOAc puro) para proporcionar el hexapéptido acetilado 20d en forma de una espuma de color marfil (528 mg, 51% de rendimiento sobre 4 etapas). MS (FAB) 1067,6 (MH+) 1089,6 (M+Na).

El hexapéptido acetilado 20d (528 mg, 0,495 mmoles) se disolvió en DCM (3 mL) y se trató con una solución premezclada, agitada durante 15 minutos, de catalizador de tetraquis(trifenilfosfina)-paladio (0) (90 mg, 0,078 mmoles) y pirrolidina (134 \muL, 1,603 mmoles) en DCM (3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, después de lo cual se evaporó el disolvente. El producto crudo fue purificado parcialmente por trituración en Et_{2}O:DCM (85:15), y después purificado en dos tandas mediante HPLC preparativa. La mitad del producto purificado se disolvió en HOAc glacial (5 mL), se filtró a través de un filtro Millipore®: Millex®-HV de 0,45 \mum y se inyectó en una columna de fase inversa C18 Whatman Partisil® 10-ODS-3 (2,2 x 50 cm) equilibrada. Programa de purificación: gradiente lineal a 15 mL/min, 230 \mum, inyectado a 5% A; una vez que hubo eluido todo el HOAc el programa se
inició - a 5% de A durante 10 minutos, 5-58% de A en 70 minutos; A: 0,06% de TFA/CH_{3}CN; B: 0,06% de TFA/H_{2}O. Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica, las fracciones apropiadas de las purificaciones de HPLC se recogieron y se liofilizaron para proporcionar el compuesto de hexapéptido deseado 108, en forma de un sólido amorfo blanco (218,3 mg, 47% de rendimiento).

MS (FAB) 945,5 MH^{-} 947,4 MH^{+} 969,5 (M+Na)^{+} 985,4 (M+K)^{+}. ^{1}H NMR (DMSO), mezcla de rotámeros apr. 1:9, \delta 8,55 y 8,31 (s, 1H), 8,16 (d, J=7,5 Hz, 1H), 8,11 (d, J=8 Hz, 1H), 8,05 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,97-7,85 (m, 2H), 7,88 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,75 (d, J=9 Hz, 1H), 7,59- 7,39 (m, 4H), 4,99 (d, J=12 Hz, 1H), 4,89 (d, J=12 Hz, 1H), 4,53 (dd, J=7, 14 Hz, 1H), 4,08-4,45 (m, 6H), 3,77 (b dd, J=4, 11 Hz, 1H), 2,64 (dd, J=6,5, 16,5 Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,25-2,12 (m, 3H), 2,07 y 1,82 (s, 3H), 2,04-1,86 (m, 2H), 1,80-1,35 (m, 14H), 1,32-0,80 (m, 14H), 0,91 (t, 7,5, 14,5 Hz, 3H).

Ejemplo 21 Síntesis del compuesto 301 de la Tabla 3

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Se añadió una solución de hidróxido de litio monohidrato (23 mg, 0,56 mmoles) en H_{2}O (4 mL) a una solución del compuesto éster 21a (45 mg, 0,185 mmoles, descrita anteriormente como el isómero (R,R) 9c) en MeOH (3,5 mL) y THF (3,5 mL). La solución resultante se agitó vigorosamente durante 16 h y después se repartió entre EtOAc (60 mL) y solución acuosa de HCl al 10% (20 mL). La fase orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar el correspondiente ácido con rendimiento cuantitativo.

Este material (apr. 0,185 mmoles) fue combinado con (S)-(-)-\alpha-metilbencilamina (27 mg, 0,22 mmoles), HATU (77 mg, 0,20 mmoles) y DIPEA (0,11 mL, 0,65 mmoles) en DMF (5 mL). Después de 20 h, la mezcla de reacción se concentró. El residuo disuelto en EtOAc y la solución se lavaron secuencialmente con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, solución acuosa de HCl al 10% y salmuera, antes de secarla (MgSO_{4}), filtrarla y concentrarla bajo vacío. La purificación mediante cromatografía rápida (eluyente 35% de EtOAc/hexano) dio 11 mg (28%) del producto acoplado 21b. Este material (11 mg, 0,033 mmoles) se trató con HCl/dioxano 4N durante 35 minutos. A continuación la mezcla de reacción se concentró a sequedad para dar la sal hidrocloruro de la correspondiente amina. Este último producto fue acoplado con

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(33 mg, 0,036 mmoles, preparado por procedimientos análogos a los del Ejemplo 15 y 20), HATU (14 mg, 0,036 mmoles) y DIPEA (0,116 mL, 0,02 mmoles) en DMF (4 mL). Después de agitar la mezcla de reacción durante 16 h, la mezcla se concentró. El residuo se disolvió en EtOAc. La solución se lavó secuencialmente con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, solución acuosa de HCl al 10% y salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo vacío para dar un sólido blanco. Este material (apr. 0,033) se disolvió en EtOH (6 mL) y se trató con acetato amónico (7 mg, 0,09 mmoles) y Pd/C al 10% (10 mg) bajo una atmósfera de gas hidrógeno. Al cabo de 3 h, la mezcla de reacción se filtró a través de tierra de diatomeas. El filtrado se concentró a sequedad. Después se disolvió el residuo en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para dar un sólido blanco después de liofilizar (17,6 mg, 57% de rendimiento sobre dos etapas).

Datos espectrales: MS (FAB) ES^{-} 932,6 (M-H)^{-}, 954,5 (M-Na)^{-}; HRMS calc. para C_{48}H_{67}N_{7}O_{12} (MH^{+}) 934,49261, encontrado: 934,49010; ^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,90 (s, 1H), 8,24 (d, J=7,95 Hz, 1H), 8,14 (d, J=7,63 Hz, 1H), 7,99 (d, J=8,26 Hz, 1H), 7,79 (d, J=8,9 Hz, 1H), 7,75 (d, J=8,26 Hz, 1H), 7,42-7,17 (m, 10H), 5,00 (quintete, J=7,63 Hz, 1H), 4,7 (m, 1H), 4,52 (d, J=11,76 Hz, 1H), 4,43 (d, J=11,4 Hz, 1H), 4,33-4,2 (m, 6H), 3,70 (dd, J=11,4 y 11,1 Hz, 2H), 2,63 (dd, J=5,7 y 5,7 Hz, 1H), 2,45 (dd, J=7,95 y 7,95 Hz, 1H), 2,21-2,11 (m, 3H), 2,07-1,97 (m, 1H), 1,93-1,83 (m, 2H), 1,81 (s, 3H), 1,78-1,63 (m, 2H), 1,54-1,41 (m, 2H), 1,39 (d, J=7,0 Hz, 3H), 1,29 (dd, J=7,94 y 7,63 Hz, 1H), 1,15 (quintete, J=7,0 Hz, 1H), 1,05 (m, 1H), 0,90 (d, J=6,36 Hz, 6H), 0,88-0,83 (m, 1H), 0,71 (m, 9H).

Ejemplo 22

El compuesto 107 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17.

Población de rotámeros por NMR (1:7,6)

MS (FAB) m/z: 675 (MH+); ^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,35-8,19 (b s, 1H), 8,04 (d, J=7,63 Hz, 1H), 7,93 (b d, J=7,31 Hz, 1H), 7,88 (d, J=8,27 Hz, 1H), 7,86-7,79 (m, 2H), 7,59-7,49 (m, 3H), 7,46 (dd, J=7,95, 7,95 Hz, 1H), 4,98 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,40-4,34 (m, 1H), 4,32 (b s, 1H), 4,29-4,24 (m, 1H), 4,22-4,15 (m, 1H), 4,09 (d, J=11,8 Hz, 1H), 3,74 (dd, J=11,1, 4 Hz, 1H), 2,20-2,12 (m, 1H), 2,05-1,94 (m, 2H), 1,84 (s, 3H), 1,72-1,42 (m, 7H), 1,20-1,13 (m, 1H), 1,08-0,87 (m, 13H), 0,85 (d, J=6,68 Hz, 6H).

Ejemplo 23

El compuesto 114 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17.

Población de rotámeros por NMR (1:7,5)

MS (FAB) m/z: 747 (M+Na^{+}); ^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,40-8,24 (b s, 1H), 8,07-8,01 (m, 1H), 7,96-7,91 (d, J=8,26 Hz, 1H), 7,87 (d, J=8,26 Hz,1H), 7,85-7,78 (m, 2H), 7,58-7,49 (m, 3H), 7,46 (dd, J=7,95, 7,95 Hz, 1H), 7,30-7,21 (m, 4H), 7,20-7,14 (m, 1H), 4,98 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,40-4,34 (m, 1H), 4,34-4,29 (m, 1H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,22-4,15 (m, 1H), 4,09 (d, J=11,8 Hz, 1H), 3,74 (dd, J=11,1, 4 Hz, 1H), 2,95-2,79 (m, 2H), 2,21-2,11 (m, 1H), 2,05-1,94 (m, 2H), 1,89-1,83 (2 x s, 3H), 1,63-1,41 (m, 7H), 1,38-1,30 (m, 1H), 1,27-1,22 (m, 1H), 1,12-0,94 (m, 5H), 0,89 (d, J=6,4 Hz, 3H), 0,84 (d, J=6,4 Hz, 3H).

Ejemplo 24

El compuesto 118 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17.

Población de rotámeros por NMR apr. (1:6,3)

MS (FAB) m/z: 677,4 (MH^{+}); ^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,58 y 8,38 (2 x b s, 1H), 8,04 (d, J=7,63 Hz, 1H), 7,93 (d, J=7,63 Hz, 1H), 7,91-7,81 (m, 3H), 7,59-7,49 (m, 3H), 7,49-7,43 (m, 1H), 4,98 (d, J=12,1 Hz, 1H), 4,89 (d, J=12,1 Hz, 1H), 4,41-4,29 (m, 2H), 4,29-4,14 (m, 2H), 4,1 (d, J=10,8 Hz, 1H), 3,74 (b d, J=7,63, 1 Hz, 1H), 2,21-2,12 (m, 1H), 2,04-1,92 (m, 2H), 1,90 y 1,84 (2 x s, 3H), 1,63-1,41 (m, 9H), 1,39-1,26 (m, 3H), 1,21-1,15 (m, 1H), 1,06-0,92 (m, 5H), 0,92-0,80 (m, 9H).

Ejemplo 25

El compuesto 116 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17.

^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,36 (s, 1H), 8,14 (d, J=8 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8 Hz, 1H), 7,99 (d, J=9 Hz, 1H), 7,79 (d, J=9 Hz, 1H), 7,33-7,26 (m, 5H), 4,54-4,42 (m, 3H), 4,30-4,21 (m, 5H), 4,06 (d, J=11 Hz, 1H), 3,69 (dd, J= Hz, 1H), 2,62 (dd, J=16, 10 Hz, 1H), 2,47-2,42 (m, 1H), 2,18-2,14 (m, 3H), 2,02-1,87 (m, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,74-1,66 (m, 2H), 1,54-1,47 (m, 2H), 1,38-1,27 (m, 2H), 1,21-1,18 (m, 1H), 0,97-0,85 (m, 11H), 0,80-0,70 (m, 7H).

Ejemplo 26

El compuesto 121 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17.

^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 9,12 (d, J=6 Hz, 1H), 8,64 (s, 1H), 8,30 (d, J=8 Hz, 1H), 8,12 (d, J=9 Hz, 1H), 8,05 (dd, J=8, 7 Hz, 1H), 7,97 (d, J=8 Hz, 1H), 7,80 (dd, J=8, 7 Hz, 1H), 7,66 (d, J=9 Hz, 1H), 7,54 (d, J=6 Hz, 1H), 5,70-5,61 (m, 2H), 5,26 (d, J=17 Hz, 1H), 5,07 (d, J=12 Hz, 1H), 4,52 (d, J=12 Hz, 1H), 4,39 (dd, J=9,8 Hz, 1H), 4,23-4,12 (m, 2H), 4,03-3,99 (m, 1H), 2,66-2,54 (m, 1H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,08 (dd, J=9, 17 Hz, 1H), 2,01-1,93 (m, 1H), 1,83 (s, 3H), 1,65-1,46 (m, 5H), 1,41-1,38 (m, 1H), 1,24-1,20 (dd, J=9, 5 Hz, 1H), 1,05-0,78 (m, 12H).

Ejemplo 27

El compuesto 205 de la Tabla 2 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17.

^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 9,14 (d, J=6 Hz, 1H), 8,60, (s, 1H), 8,32 (d, J=8 Hz, 1H), 8,14-8,06 (m, 2H), 7,98 (d, J=8 Hz, 1H), 7,82 (dd, J=8,7 Hz, 1H), 7,66 (d, J=9 Hz, 1H), 7,55 (d, J=8 Hz, 1H), 5,75-5,66 (m, 2H), 5,22 (d, J=17 Hz, 1H), 5,07 (d, J=10 Hz, 1H), 4,50 (d, J=12 Hz, 1H), 4,39 (dd, J=9,9 Hz, 1H), 4,23-4,08 (m, 3H), 2,56-2,50 (m, 1H), 2,36-2,28 (m, 1H), 2,04-1,97 (m, 1H), 1,82 (s, 3H), 1,62-1,41 (m, 7H), 1,24 (dd, J=5,4 Hz, 1H), 0,94-0,75 (m, 12H).

Ejemplo 28

El compuesto 117 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 20.

^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,36 (s, 1H), 8,17 (d, J=8 Hz, 1H), 8,09 (d, J=8 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8 Hz, 1H), 7,96-7,92 (m, 2H), 7,87 (d, J=8 Hz, 1H), 7,77 (d, J=9 Hz, 1H), 7,56-7,45 (m, 4H), 4,99 (d, J=12 Hz, 1H), 4,89 (d, J=12 Hz, 1H), 4,52 (dd, J=14,7 Hz, 1H), 4,37-4,12 (m, 6H), 3,78-3,73 (m, 1H), 2,63 (dd, J=17,6 Hz, 1H), 2,47-2,42 (m, 1H), 2,22-2,16 (m, 3H), 2,04-1,86 (m, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,77-1,71 (m, 1H), 1,69-1,42 (m, 8H), 1,30 (quintete, J=8 Hz, 1H), 1,20 (dd, J=12, 8 Hz, 1H), 1,10-0,85 (m, 15H), 0,76-0,72 (m, 1H).

Ejemplo 29

El compuesto 120 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 20.

^{1}H NMR (DMSO, d_{6}) \delta 8,34 (s, 1H), 8,12 (d, J=8 Hz, 1H), 8,05 (d, J=8 Hz, 1H), 7,95-7,87 (m, 3H), 7,81 (d, J=9 Hz, 1H), 7,64-7,52 (m, 4H), 7,46 (dd, J=8,7 Hz, 1H), 4,99 (d, J=12 Hz, 1H), 4,89 (d, J=12 Hz, 1H), 4,63 (dd, J=14,7 Hz, 1H), 4,37-4,14 (m, 4H), 3,74 (dd, J=11,4 Hz, 1H), 3,41-3,35 (m, 2H), 2,61 (dd, J=16, 7 Hz, 1H), 2,44 (dd, J=16, 8 Hz, 1H), 2,20-2,15 (m, 1H), 2,04-1,96 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,70-1,64 (m, 1H), 1,56-1,43 (m, 7H), 1,30 (quint., J=8 Hz, 1H), 1,20 (dd, J=8,5 Hz, 1H), 0,99-0,72 (m, 21H).

Ejemplo 30 Clonación, expresión y purificación de la proteasa NS3 de HCV tipo 1b recombinante

Se obtuvo suero procedente de un paciente infectado por HCV a través de una colaboración exterior (Bernard Willems, MD, Hospital St-Luc, Montreal, Canadá y Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Santé Publique du Québec, Ste-Anne de Bellevue, Canadá). Se construyó un molde de cDNA de longitud completa manipulado por ingeniería genética del genoma del HCV a partir de fragmentos de DNA obtenidos por transcripción inversa-PCR (RT-PCR) de RNA del suero y usando cebadores específicos elegidos sobre la base de la homología entre otras cepas de genotipo 1b. A partir de la determinación de la secuencia genómica entera, se asignó un genotipo 1b al material aislado de HCV de acuerdo con la clasificación de Simmonds et al. (J. Clin. Microbiol. (1993), 31, p. 1493-1503). Se demostró que la secuencia de aminoácidos de la región no estructural, NS2-NS4B, era más del 93% idéntica al genotipo 1b de HCV (materiales aislados BK, JK y 483) y 88% idéntica al genotipo 1a de HCV (mat. aislado HCV-1). Un fragmento de DNA que codifica el precursor de poliproteína (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) fue generado mediante PCR e introducido en vectores de expresión eucariotas. Después de la transfección transitoria, el procesamiento de la poliproteína mediado por la proteasa NS3 de HCV fue demostrado por la presencia de la proteína NS3 madura usando análisis de transferencia Western. La proteína NS3 madura no fue observada con la expresión de un precursor de poliproteína que contiene la mutación S1165A, que inactiva la proteasa NS3, confirmando la funcionalidad de la proteasa NS3 del HCV.

El fragmento de DNA que codifica la proteasa NS3 del HCV recombinante (aminoácido 1027 a 1206) fue clonado en el vector de expresión bacteriano pET11d. La expresión de la proteasa NS3 en BL21(DE3)pLysS de E. coli fue inducida por incubación con IPTG 1mM durante 3h a 22ºC. Una fermentación típica (18 L) dio aproximadamente 100 g de pasta celular húmeda. Las células se resuspendieron en tampón para lisis (3,0 mL/g) consistente en fosfato sódico 25 mM, pH 7,5, 10% de glicerol (v/v), EDTA 1 mM, 0,01% de NP-40, y se almacenaron a -80ºC. Las células se descongelaron y se homogeneizaron después de añadir DTT 5 mM. Después se añadieron cloruro de magnesio y DNasa al material homogeneizado a las concentraciones finales de 20 mM y 20 \mug/mL respectivamente. Después de una incubación de 25 min a 4ºC, el material homogeneizado fue tratado con ultrasonidos y centrifugado a 15000 x g durante 30 minutos a 4ºC. El pH del líquido sobrenadante se ajustó después en 6,5 usando una solución de fosfato sódico 1M.

Se añadió una etapa adicional de cromatografía de filtración en gel al procedimiento de purificación en 2 etapas descrito en el documento WO 95/22985 (incorporado al presente texto como referencia). Brevemente, el líquido sobrenadante del extracto bacteriano se cargó en una columna SP HiTrap (Pharmacia) previamente equilibrada a una velocidad de flujo de 2 mL/min en tampón A (fosfato sódico 50 mM, pH 6,5, 10% de glicerol, EDTA 1 mM, DTT 5 mM, 0,01% de NP-40). Después se lavó la columna con tampón A que contiene NaCl 0,15 M, y la proteasa se eluyó aplicando 10 volúmenes de la columna de un gradiente lineal de NaCl de 0,15 a 0,3 M. Las fracciones que contienen proteasa NS3 se agruparon y se diluyeron hasta una concentración final de NaCl de 0,1 M. La enzima se purificó más en una columna HiTrap Heparin (Pharmacia) equilibrada en tampón B (fosfato sódico 25 mM, pH 7,5, 10% de glicerol, DTT 5 mM, 0,01% de NP-40). La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 3 mL/min. Después se lavó la columna con tampón B que contiene NaCl 0,15 M a una velocidad de flujo de 1,5 mL/min. Se realizaron dos etapas de lavado en presencia de tampón B que contiene NaCl 0,3 ó 1 M. La proteasa se recuperó en el lavado con NaCl 0,3 M, se diluyó 1 a 3 con tampón B, se volvió a aplicar a la columna HiTrap Heparin, y se eluyó con tampón B que contenía NaCl 0,4 M. Finalmente, las fracciones que contienen proteasa NS3 se aplicaron en una columna Superdex 75 HiLoad 16/60 (Pharmacia) equilibrada en tampón B que contiene NaCl 0,3 M. Se juzgó que la pureza de la proteasa NS30 del HCV obtenida de las fracciones agrupadas era superior al 95%, mediante SDS-PAGE seguida de análisis de densitometría.

La enzima se almacenó a -80ºC y se descongeló en hielo y se diluyó inmediatamente antes de usarla.

Ejemplo 31 Ensayo radiométrico de proteasa NS3 de HCV recombinante/péptido cofactor NS4A

La enzima fue clonada, expresada y preparada de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 31. La enzima se almacenó a -80ºC, se descongeló en hielo y se diluyó inmediatamente antes de su empleo en el tampón de ensayo que contiene el péptido cofactor NS4A.

El sustrato usado para el ensayo radiométrico de proteasa NS3/péptido cofactor NS4A, DDIVPC-SMSYTW, es segmentado entre los restos de cisteína y de serina por la enzima. La secuencia DDIVPC-SMSYTW corresponde al sitio de segmentación natural NS5A/NS5B en el que el resto de cisteína en P2 ha sustituido a una prolina. El péptido sustrato DDIVPC-SMSYTW y el trazador biotina-DDIVPC-SMS[^{125}I-Y]TW se incuban con la proteasa NS3 recombinante y el cofactor del péptido NSA4 KKGSVVIVGRIILSGRK (relación molar de enzima:cofactor 1:100) en ausencia o en presencia de inhibidores. La separación de sustrato de los productos se realiza añadiendo esferas de agarosa recubiertas con avidina a la mezcla de ensayo, seguido de filtración. Las cantidades de producto SMS[^{125}I-Y]TW encontradas en el filtrado permite calcular el porcentaje de conversión de sustrato y el porcentaje de inhibición.

A. Reactivos

Tris y Tris-HCl (UltraPure) fueron obtenidos de Gibco-BRL. El glicerol (UltraPure), MES y BSA se adquirieron de Sigma. El TCEP se obtuvo de Pierce, el DMSO de Aldrich y el NaOH de Anachemia.

Tampón para ensayo: Tris HCl 50 mM, pH 7,5, 30% (p/v) glicerol, 1 mg/mL de BSA, TCEP 1 mM (el TCEP se añade inmediatamente antes de su empleo a partir de una solución madre 1 M).

Sustrato: DDIVPCSMSYTW, concentración final 25 \muM (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC para evitar la oxidación).

Trazador: sustrato monoyodado reducido biotina DDIVPC SMS[^{125}IY]TW (concentración final -1 nM).

Proteasa NS3 tipo 1b de HCV, 25 nM de concentración final (a partir de una solución madre en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, 10% de glicerol, NaCl 300 mM, DTT 5 mM, 0,01% de NP-40).

Péptido cofactor NS4A: KKGSVVIVGRIILSGRK, concentración final 2,5 \muM (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC).

B. Protocolo

El ensayo se realizó en una placa de polipropileno de 96 pocillos de Costar. Cada pocillo contenía:

\bullet

20 \muL de sustrato/trazador en tampón para ensayo;

\bullet

10 \muL de inhibidor en 20% DMSO/tampón para ensayo;

\bullet

10 \muL de proteasa NS3 1b/péptido cofactor NS4 (relación molar 1:100).

También se prepararon en la misma placa de ensayo el blanco (sin inhibidor y sin enzima) y el testigo (sin inhibidor).

La reacción enzimática se inició mediante la adición de la solución de enzima/péptido NS4A y la mezcla de ensayo se incubó durante 40 minutos a 23ºC bajo una agitación suave. Se añadieron diez (10) \muL de NaOH 0,5 N y 10 \muL de MES 1M, pH 5,8, para apagar la reacción enzimática.

Se añadieron veinte (20) \muL de esferas de agarosa recubiertas con avidina (adquiridas a Pierce) en una placa de filtración MADP N65 de Millipore. La mezcla de ensayo apagada se pasó a la placa de filtración y se incubó durante 60 minutos a 23ºC bajo agitación suave.

Las placas se filtraron usando un aparato de filtración MultiScreen Vacuum Manifold Filtration de Millipore, y se pasaron 40 \muL del filtrado a una placa opaca de 96 pocillos que contiene 60 \muL de fluido de centelleo por pocillo.

Los filtrados se sometieron a conteo en un instrumento Packard TopCount usando un protocolo para ^{125}I-líquido durante un minuto.

El % de inhibición se calculó con la ecuación siguiente:

100-[(cuentas_{inhib}-cuentas_{blanco})/(cuentas_{testigo}-cuentas_{blanco})x100]

Se aplicó a los datos de inhibición-concentración un ajuste no lineal a un curva con el modelo de Hill, y se calculó la concentración efectiva al 50% (IC_{50}) usando el programa para ordenador SAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Ejemplo 32 Ensayo de proteína heterodímera NS3-NS4A de longitud completa

La región no codificadora NS2-NS5B-3' fue clonada mediante RT-PCR en el vector pCR73 (Invitrogen) usando RNA extraído del suero de un individuo infectado con genotipo 1b de HCV (proporcionado por el Dr. Bernard Willems, Hospital St-Luc, Montreal, Québec, Canadá). La región de DNA de NS3- NS4A fue después subclonada mediante PCR en el vector de expresión de baculovirus pFastBacJ HTa (Gibco/BRL). La secuencia del vector incluye una región que codifica una secuencia N-terminal de 28 restos que contiene una etiqueta de hexahistidina. El sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BacJ (Gibco/BRL) fue usado para producir el baculovirus recombinante. La NS3 madura de longitud completa y la proteína heterodímera NS4A (His-NS3-NS4AFL) se expresó infectando 10^{6} células Sf21/mL con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 0,1-0,2 a 27ºC. El cultivo infectado se recolectó de 48 a 64 horas más tarde mediante centrifugación a 4ºC. El sedimento de células fue homogeneizado en NaPO_{4} 50 mM, pH 7,5, 40% de glicerol (p/v), \beta-mercaptoetanol 2 mM, en presencia de un coctel de inhibidores de proteasa. Después se extrajo His-NS3-NS4AFL del lisado de células con 1,5% NP-40, 0,5% Triton X-100, NaCl 0,5 M y un tratamiento con DNasa. Después de la ultrafiltración, el extracto soluble se diluyó 1 a 4 y se unió a una columna Hi-Trap de Pharmacia Ni-quelante. El His-NS3-NS4AFL se eluyó en una forma con más del 90% de pureza (estimada mediante SDS-PAGE), usando un gradiente de imidazol de 50 a 400 mM. El producto His-NS3-NS4AFL se almacenó a -80ºC en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, 10% (p/v) de glicerol, NaCl 0,5 M, imidazol 0,25 M, 0,1% de NP-40. Se descongeló en hielo y se diluyó inmediatamente antes de su empleo.

La actividad de proteasa de His-NS3-NS4AFL fue ensayada en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, citrato sódico 0,25 M, 0,01% (p/v) de n-dodecil-\beta-D-maltósido, TCEP 1 mM. Cinco (5) \muM del sustrato apagado internamente antranilil-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO_{2})TW-OH en presencia de varias concentraciones de inhibidor fueron incubados con 1,5 nM de His-NS3-NS4AFL durante 45 minutos a 23ºC. La concentración final de DMSO no excedió el 5,25%. La reacción fue terminada con la adición de MES 1M, pH 5,8. Se controló la fluorescencia del producto N-terminal en un fluorómetro Perkin Elmer LS-50B equipado con un lector de placas de 96 pocillos (longitud de onda de excitación: 325 nm; longitud de onda de emisión: 423 nm). Después se aplicó un ajuste no lineal a una curva usando el modelo de Hill a los datos de % de inhibición- concentración y se calculó la concentración efectiva al 50% (IC_{50}) mediante el empleo del programa SAS (Statistical Software System, SAS Institute Inc., Cary, N.C.).

Ejemplo 33 Ensayo de proteasa NS3 basado en células

Este ensayo se llevó a cabo con células Huh-7, una línea de células humanas derivadas de un hepatoma, co-transfectadas con 2 construcciones de DNA:

- una que expresa una poliproteína que comprende las proteínas no estructurales del HCV fusionadas a tTA por el orden siguiente: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA (llamada NS3);

- la otra que expresa la proteína reportera, fosfatasa alcalina secretada, bajo el control de tTA (llamada SEAP).

La poliproteína ha de ser segmentada por la proteasa NS3 para que se liberen las proteínas maduras. Al liberarse las proteínas maduras, se cree que las proteínas virales formarán un complejo en la membrana del retículo endoplasmático mientras que la tTA emigrará al núcleo y transactivará el gen SEAP. Por consiguiente, la reducción de la actividad proteolítica de NS3 debe conducir a la reducción de los niveles de tTA madura y a la disminución concomitante en la actividad de SEAP.

Para controlar los otros efectos de los compuestos, se hizo una transfección paralela en la que una construcción que expresa tTA sola (llamada tTA) fue co-transfectada con la construcción SEAP de forma que la actividad de SEAP es independiente de la actividad proteolítica de NS3.

Protocolo del ensayo: células Huh-7, desarrolladas en CHO-SFMII + 10% de FCS (suero de ternera fetal) fueron co-transfectadas con NS3 y SEAP o bien con tTA y SEAP, usando el protocolo FuGene (Boehringer Mannheim). Al cabo de 5 h a 37ºC, las células fueron lavadas y tripsinadas, y se pusieron en placas (a razón de 80.000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos que contienen una gama de concentraciones de los compuestos a ensayar. Después de un periodo de incubación de 24 h, se sacó una pate alícuota del medio y se midió la actividad de SEAP en esta parte alícuota con el kit Phospha-Light (Tropix).

Se realizó el análisis del porcentaje de inhibición de la actividad de SEAP con respecto a la concentración de compuesto con el programa SAS, para obtener el valor de la EC_{50}.

La toxicidad del compuesto (TC_{50}) se evaluó después usando el ensayo MTT de la forma que sigue:

Se añaden en cada pocillo 20 \muL de una solución de MTT (5 mg/mL de medio) y se incuban a 37ºC durante 4 horas; se retira el medio y se añaden 50 \muL de HCl 0,01 N + 10% de Triton X-100; después de agitar a temperatura ambiente durante al menos 1 hora, se lee la OD (densidad óptica) de cada pocillo a 595 nm de longitud de onda.

La TC_{50} fue calculada de la misma forma que le EC_{50}.

Ejemplo 34 Ensayos de especificidad

Se determinó la especificidad de los compuestos contra una diversidad de proteasas de serina: elastasa leucocitaria humana, elastasa pancreática porcina y \alpha-quimotripsina pancreática bovina y una proteasa de cisteína: la caetpsina B hepática humana. En todos los casos se utilizó un protocolo de formato de placa de 96 pocillos usando un sustrato colorimétrico de p-nitroanilina (pNA) específico para cada enzima. Cada ensayo incluyó una hora de pre-incubación de enzima-inhibidor a 30ºC, seguida por la adición de sustrato e hidrólisis hasta una conversión de 30%, que se mide en un lector de microplacas UV Thermomax®. Las concentraciones de sustrato se mantuvieron lo más bajas que fue posible en comparación con K_{M} para reducir la competición por el sustrato. Las concentraciones de compuesto variaron desde 300 a 0,06 \muM dependiendo de su potencia. Las condiciones finales para cada ensayo fueron las siguientes:

Tris-HCl 500 mM pH 8, Na_{2}SO_{4} 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 3% de DMSO, 0,01% de Tween®-20 con:

[100 \muM Succ-AAPF-pNA y 250 pM \alpha-quimotripsina], [133 \muM Succ-AAA-pNA y 8 nM elastasa porcina], [133 \muM Succ-AAV-pNA y 8 nM elastasa leucocitaria]; o

[100 mM NaHPO_{4} pH 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1mM TCEP, 0,01% Tween-20, 30 \muM Z-FR-pNa y 5 nM catepsina B (la enzima madre fue activada en tampón que contiene 20 mM TCEP antes de usarse)].

Un ejemplo representativo se resume a continuación para la elastasa porcina:

A una placa de poliestireno de 96 pocillos de fondo redondo se añadió, usando un manipulador de líquidos Biomek (Beckman):

\bullet

40 \muL de tampón para ensayo (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA);

\bullet

20 \muL de solución de enzima (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 40 nM elastasa pancreática porcina); y

\bullet

20 \muL de solución de inhibidor (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween®-20, 1,5 mM - 0,3 \muM de inhibidor, 15% v/v de DMSO).

Después de 60 minutos de preincubación a 30ºC se añadieron a cada pocillo 20 \muL de solución de sustrato (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 M Na_{2}SO_{4}, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 \muM Succ-AAA-pNA), y la mezcla de reacción se siguió incubando a 30ºC durante 60 minutos, después de lo cual se leyó la absorbancia en el lector de placas UV Thermomax®. Se asignaron filas de pocillos para testigos (sin inhibidor) y para blancos (sin inhibidor y sin enzima). Las diluciones secuenciales de uno a dos de la solución de inhibidor fueron realizadas por el manipulador de líquidos en una placa separada usando 50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween®-20, 15% DMSO. Todos los demás ensayos de especificidad se realizaron de una manera similar.

El porcentaje de inhibición fue calculado usando la fórmula:

[1-((UV_{inh}-UV_{blanco})/(UV_{testigo}-UB_{blanco}))] x 100

Se aplicó un ajuste no lineal a una curva con el modelo de Hill a los datos de inhibición-concetración, y se calculó la concentración eficaz al 50% (IC_{50}) usando el programa SAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc., Cary, N.C.).

Tablas de compuestos

Los compuestos de la invención fueron ensayados en uno o en los dos ensayos de los Ejemplo 31 y 32, y se encontró que eran activos con un valor de la IC_{50} por debajo de 50 \muM (A), por debajo de 5 \muM (B), o por debajo de 0,5 \muM (C).

Actividad en las células y especificidad

Compuestos representativos de la invención fueron también ensayados en el análisis basado en células sustituto del Ejemplo 33 y en uno de varios análisis del Ejemplo 34. Por ejemplo, se encontró que el compuesto 233 de la Tabla 2 tenía una IC_{50} de 1 nM en el Ensayo del Ejemplo 32. La EC_{50} determinada por el ensayo del Ejemplo 33 es 5,4 \muM, mientras que otros efectos (tTA) no eran detectables a concentraciones hasta 120 \muM. El compuesto 233 ha sido también analizado en el ensayo MTT y se determinó que su TC_{50} es mayor que 120 \muM, lo que indica que este compuesto es no tóxico a su concentración eficaz. En los ensayos de específicidad del Ejemplo 34, se encontró que el mismo compuesto tiene la actividad siguiente: HLE > 75 \muM; PPE > 75 \muM; \alpha-chim. > 75 \muM; Cat. B > 75 \muM.

Estos resultados indican que esta familia de compuestos es altamente específica para la proteasa NS3.

Las tablas que siguen presentan una relación de compuestos representantivos de la invención. Se usan las abreviaturas siguientes: MS: datos de espectrometría de masas; Ac: acetilo; Bn: bencilo; Chg: ciclohexilglicina (ácido 2-amino-2-ciclohexil-acético); Dnl: dansilo; O-Bn: benciloxi; Pip: ácido pipecólico; Tbg: terc-butilglicina.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

62

63

TABLA 2

64

65

66

67

68

TABLA 3

69

TABLA 4

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70

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TABLA 5

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71

72

Claims (70)

1. Un compuesto de fórmula (I), incluyendo los racematos, diaestereoisómeros e isómeros ópticos:

73

en la que

a es 0 ó 1; b es 0 ó 1; Y es H o alquilo C_{1}-C_{6};

B es H, un derivado de acilo de fórmula R_{7}-C(O)- o un sulfonilo de fórmula R_{7}-SO_{2}, en la que

\quad

R_{7} es

(i)

alquilo C_{1-10} opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1-6};

(ii)

cicloalquilo C_{3-7} opcionalmente sustituido con carboxilo, (alcoxi C_{1-6})carbonilo o fenilmetoxicarbonilo;

(iii)

arilo C_{6} o C_{10} o aralquilo C_{7-16} opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}; o

(iv)

Het opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, hidroxi, amino opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, o amido opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6};

R_{6}

es alquilo C_{1-6} sustituido con carboxilo;

R_{5}

es alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con carboxilo;

R_{4}

es alquilo C_{1-10}, cicloalquilo C_{3-7} o (alquilcicloalquilo)C_{4-10};

R_{3}

es alquilo C_{1}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{7} o (alquilcicloalquilo)C_{4}-C_{10};

R_{2}

es CH_{2}-R_{20}, NH-R_{20}, O-R_{20} o S-R_{20}, en donde R_{20} es un cicloalquilo C_{3-7} saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo)C_{4-10} que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R_{21}, o

R_{20}

es un arilo C_{6} o C_{10} o aralquilo C_{7-16} opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R_{21}, o

R_{20}

es Het o Het-(alquilo inferior) opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R_{21}, en donde cada R_{21} es independientemente alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_{1-6}; sulfonilo; NO_{2}; OH; SH; halo; haloalquilo; amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}, arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16}, Het o (alquilo inferior)-Het; carboxilo; carboxi(alquilo inferior); arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het, siendo dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R_{22};

\quad

en donde R_{22} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_{1-6}; sulfonilo; NO_{2}; OH; SH; halo; haloalquilo; carboxilo; amida; o (alquilo inferior)amida;

R_{1}

es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituido con halógeno; y

W

es hidroxi o un amino N-sustituido;

o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente, con la condición de que

\quad

esté excluido el compuesto (I), en donde

\quad

B es acetilo,

\quad

a y b son 0,

\quad

P4 representa el aminoácido ciclohexilglicina (Chg);

\quad

P3 representa el aminoácido valina (Val);

\quad

R_{2} representa benciloxi (O-Bn);

\quad

P1 representa un grupo racémico de fórmula

74

\quad

y W representa OH.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es H o un derivado acilo de fórmula R_{7}C(O)-, en la que R_{7} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-7} opcionalmente sustituido con hidroxi; amido opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6} o Het; arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het, todos ellos opcionalmente sustituidos con alquilo C_{1-6} o hidroxi.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que R_{7} es alquilo C_{1-6} o Het.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho Het se elige entre el grupo consistente en:

75

76

5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que B se elige entre el grupo consistente en H; acetilo;

77

6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en el que B es acetilo.

7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es R_{7}-SO_{2} y R_{7} es arilo C_{6} o C_{10}, un aralquilo C_{7-16} o Het, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C_{1-6}.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp o Glu.

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp.

10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que a es 0 y entonces R_{6} está ausente.

11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-butilglicina (Tbg) y L-Tbg.

12. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 11, en el que R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp. D-Val o D-Glu.

13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Glu.

14. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{4} es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por Val, ciclohexilglicina (Chg), Tbg, Ile o Leu.

15. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 14, en el que R_{4} es la cadena secundaria de Chg o Ile.

16. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 15, en el que R_{4} es la cadena secundaria de Chg.

17. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Y es H o Me.

18. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 17, en el que Y es H.

19. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{3} es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por Ile, Chg, Val o Tbg.

20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 19, en el que R_{3} es la cadena secundaria de Val, Chg o Tbg.

21. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 20, en el que R_{3} es la cadena secundaria de Val o Tbg.

22. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{2} es S-R_{20}, O-R_{20}, en donde R_{20} es arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16}, Het o -CH_{2}-Het, todos opcionalmente mono-, di- o tri-sustituidos con R_{21};

en donde R_{21} es alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}; amino, mono- o di-(alquilo inferior)amino; amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C_{1-6}, arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16}, Het o Het-(alquilo inferior); NO_{2}; OH; halo; trifluorometilo; carboxilo; arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het, siendo dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R_{22};

en donde R_{22} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino; mono- o di-(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; NO_{2}; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo.

23. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 22, en el que R_{21} es alquilo C_{1-6}; alcoxi C_{1-6}; amino, di-(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida, arilo C_{6} o C_{10}, o Het, siendo dichos arilo o Het opcionalmente sustituidos con R_{22}, en donde R_{22} es alcoxi C_{1-6}; amino; di-(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; halo; o trifluorometilo.

24. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 22, en el que R_{2} es 1-naftilmetoxi; 2-naftilmetoxi; benciloxi; 1-naftiloxi; 2-naftiloxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R_{21} en donde R_{21} es como se definió en la reivindicación 23.

25. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 22, en el que R_{2} es 1-naftilmetoxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R_{21} en donde R_{21} es como se definió en la reivindicación 23.

26. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 25, en el que R_{2} es

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78

\vskip1.000000\baselineskip

en donde R_{21A} es amido opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, arilo C_{6} o C_{10}, aralquilo C_{7-16} o Het; arilo C_{6} o C_{10} o Het opcionalmente sustituidos con R_{22}, y R_{22} es amino, di(alquilo inferior)amino; o (alquilo inferior)amida; y R_{21B} es alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, amino; di(alquilo inferior)amino; (alquilo inferior)amida; NO_{2}; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo.

27. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 26, en el que R_{21A} es arilo C_{6} o C_{10} o Het, todos opcionalmente sustituidos con R_{22} y R_{22}, es amino, dimetilamino o acetamido.

28. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 26, en el que R_{21B} es alcoxi C_{1-6} o di(alquilo inferior)amino.

29. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 28, en el que R_{21B} es metoxi.

30. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el carbono asimétrico en posición 1 tiene la configuración R, representada por las siguientes configuraciones absolutas:

79

en donde R_{1} es como se definió en la reivindicación 1.

31. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el sustituyente R_{1} en P1 está orientado sin respecto al grupo carbonilo, como se representa por la siguiente configuración absoluta:

80

en donde R_{1} es metilo, etilo, propilo, vinilo, todos los cuales están opcionalmente sustituidos con halo.

32. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 31, en el que R_{1} es etilo, vinilo o bromovinilo.

33. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 32, en el que R_{1} es vinilo.

34. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que W es hidroxi, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente; o (alquilo inferior)amino, di(alquilo inferior)amino o amino-aralquilo.

35. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 32, en el que W es hidroxi, o N(R_{13a})R_{13b} en donde R_{13a} y R_{13b} son independientemente H, arilo o alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con hidroxi o fenilo; o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente.

36. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 35, en el que W es -OH, -NH-bencilo o -NH-CH(Me)Ph.

37. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 36, en el que W es -OH o -NH-(S)CH(Me)-fenilo.

38. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 37, en el que, cuando W es un éster, dicho éster se elige entre el grupo formado por alcoxi C_{1-6}, fenoxi o aril(alcoxi C_{1-6}).

39. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 38, en el que dicho éster es metoxi, etoxi, fenoxi, benciloxi o PhCH(Me)-O-.

40. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es H, (alquilo inferior)-C(O)- o Het-C(O)-;

R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp o Glu;

R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D- o L-: Asp, Glu, Val o Tbg;

Y es H o metilo;

R_{4} es la cadena secundaria de Val, Chg, Tbg, Ile o Leu;

R_{3} es hidrógeno o la cadena secundaria de Ile, Chg, Val o Tbg;

R_{2} es 1-naftilmetoxi, 2-naftilmetoxi, O-Bn,

81

82

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en donde R_{22} es amino, di(alquilo inferior)amino, (alquilo inferior)amida, NO_{2}, OH, halo, CF_{3} o COOH;

P1 es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula

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83

\vskip1.000000\baselineskip

en la que R_{1} es etilo, vinilo o bromovinilo; y

W es hidroxi o N(R_{13a})R_{13b} en donde R_{13a} y R_{13b} son independientemente H, arilo o alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con hidroxi o fenilo; o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.

41. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es H, acetilo o Het-C(O)-; R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp; R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp, D-Glu o D-Val; Y es H; R_{4} es la cadena secundaria de Chg o Ile; R_{3} es la cadena secundaria de Val, Chg o Tbg; R_{2} es 1-naftilmetoxi, benciloxi, 4-quinolinoxi, o

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84

P1 es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula

85

en la que R_{1} es Et o CH=CH_{2} o CH=CHBr; y

W es hidroxi o NH-(S)-CHMePh, o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente.

42. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es acetilo; R_{6}, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp; R_{5}, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Glu; Y es H; R_{4} es la cadena secundaria de Chg; R_{3} es la cadena secundaria de Val o Tbg; R_{2} es:

86

P1 es:

87

W es hidroxi, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.

43. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 40 representado por la fórmula:

88

en la que B, P6, P5, P4, P3, R_{2} y R_{1} son como se definen a continuación:

89

44. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 40 representado por la fórmula:

91

en la que P6, P5, P4, P3, R_{2} y R_{1} son como se definen a continuación:

92

93

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

94

\newpage

95

\vskip1.000000\baselineskip

45. El compuesto según la reivindicación 40 representado por la fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

96

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en la que B, P6, P5, P4, P3, R_{2}, R_{1} y W son como se definen a continuación:

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97

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46. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 40 representado por la fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

98

\newpage

en la que B, Y, P4, P3, R_{2} y R_{1} son como se definen a continuación:

1001

47. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 40 representado por la fórmula:

1002

en la que B y R_{20} son como se define a continuación:

1003

99

48. Un hexapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 43, elegido entre el grupo formado por los compuestos nº 108; 116; 117 y 120.

49. Un hexapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 44, elegido entre el grupo formado por los compuestos nº 212; 222; 236 y 238.

50. Un hexapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 45, elegido entre el grupo formado por los compuestos nº 301 y 302.

51. Un tetrapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 43, elegido entre el grupo formado por los compuestos nº 122 y 123.

52. Un tetrapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 44, elegido entre el grupo formado por los compuestos nº 202; 203; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 214; 215; 216; 218; 219; 220; 221; 223; 224; 225; 226; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235.

53. Un tetrapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 46, elegido entre el grupo formado por el compuesto nº 401.

54. Un tetrapéptido de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 47, elegido entre el grupo formado por los compuestos nº 501; 502; 503; 504; 505; 506; 507; 508; 509; 510 y 511.

55. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54 en calidad de medicamento.

56. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad viralmente efectiva anti-hepatitis C de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, mezclada con un medio vehículo o agente auxiliar aceptable farmacéuticamente.

57. El uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección viral de la hepatitis C.

58. Un método in vitro para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C exponiendo el virus a una cantidad, que inhibe la proteasa de NS3 viral de la hepatitis C, del compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, o una composición según la reivindicación 56.

59. El uso de una combinación del compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, y un interferón, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección viral de la hepatitis C.

60. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 56, que comprende además un segundo agente antiviral.

61. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 60, en la que dicho segundo agente antiviral es ribavirina o amantadina.

62. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 56, que comprende además otros inhibidores de proteasa del HCV.

63. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 56, que comprende además un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV, elegidas entre helicasa, polimerasa, metaloproteasa o IRES.

64. Un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que P1 es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico sustituido, que comprende la etapa de:

\bullet

acoplar un péptido elegido entre el grupo formado por APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; y APG-P2;

\bullet

con un intermedio P1 de fórmula:

100

\vskip1.000000\baselineskip

en la que R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituido con halógeno, CPG es un grupo protector de carboxilo, y APG es un grupo protector de amino, y P6 a P2 son como se definieron en la reivindicación 1.

65. Un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que P1 es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico sustituido, que comprende la etapa de:

\bullet

acoplar un péptido elegido entre el grupo formado por APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; y APG-P2;

\bullet

con un intermedio P1 de fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

en la que R_{1} es etilo, vinilo o bromovinilo, CPG es un grupo protector de carboxilo y P6 a P2 son como se definieron en la reivindicación 1.

66. Un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que P1 es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico sustituido, que comprende la etapa de:

\bullet

acoplar un péptido elegido entre el grupo formado por APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; y APG-P2;

\bullet

con un intermedio P1 de fórmula:

102

en la que CPG es un grupo protector de carboxilo, y P6 a P2 son como se definieron en la reivindicación 1.

67. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 64, 65 ó 66, en el que dicho grupo protector de carboxilo (CPG) se elige entre el grupo formado por ésteres alquilo, ésteres aralquilo y ésteres que son segmentables mediante un tratamiento básico suave o por medios reductores suaves.

68. Uso de un análogo de aminoácido de fórmula:

103

en la que R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituidos con halógeno, para la preparación de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1.

69. Uso de un análogo de aminoácido de fórmula:

104

en la que R_{1} es etilo, vinilo o bromovinilo, para la preparación de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1.

70. Uso de un análogo de aminoácido de fórmula:

105

para la preparación de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1.