SK286846B6 - Peptidové analógy, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, ich použitie a medziprodukty - Google Patents

Abstract

Peptidové analógy všeobecného vzorca (I), v ktorom a znamená 0 alebo 1, b znamená 0 alebo 1, Y znamená H alebo C1-6alkyl, B znamená H, acylový derivát alebo sulfonylový derivát, W znamená hydroxy alebo N-substituované amino, alebo ich farmaceuticky prijateľné soli alebo estery a ich použitie na liečbu infekcie vírusom hepatitídy C (HCV).

Description

Predložený vynález sa týka zlúčenín, farmaceutických prostriedkov a ich použitia na liečenie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV). Predložený vynález poskytuje najmä peptidové analógy a ich medziprodukty, farmaceutické prostriedky obsahujúce takéto peptidy a použitie týchto peptidov na liečbu HCV infekcie.

Doterajší stav techniky

Vírus hepatitídy C (HCV) je hlavným etiologickým činidlom post-transfúznej a v komunite získanej hepatitídy inej ako A a B na celom svete. Odhaduje sa, že viac ako 150 miliónov ľudí na celom svete je infikovaných týmto vírusom. Vysoké percento prenášačov sa stáva chronicky infikovaným a u mnohých prenášačov sa vyvinie chronické ochorenie pečene nazývané chronická hepatitída C. Pri tejto skupine je tiež vysoké riziko vážneho ochorenia pečene, ako napríklad cirhózy pečene, hepatobunkového karcinómu a terminálneho ochorenia pečene, ktoré vedie k smrti.

Ešte nebol podrobne objasnený mechanizmus, ktorým sa zavádza perzistencia HCV vírusu, a ktorý' spôsobuje vysoký pomer chronickej choroby pečene. V súčasnosti nie je známe ako HCV interaguje s hostiteľským systémom a ako uniká jeho pozornosti. Okrem toho musia byť ešte objasnené úlohy bunkových a humorálnych imunitných odpovedí pri ochrane proti HCV infekcii a chorobe. Publikovalo sa, že na prevenciu vírusovej hepatitídy spojenej s transfúziou sú vhodné imunoglobulíny. Ale Centrum na kontrolu chorôb (Center for Disease Control) v súčasnosti neodporúča imunoglobulíny na tento účel.

Chýbanie účinnej ochrannej imunitnej odpovede brzdí vývoj vakcíny alebo adekvátnych post-expozičných preventívnych prostriedkov, takže nádeje na najbližší čas sú pevne spojené s protivírusovými intervenciami.

Uskutočňovali sa rôzne klinické štúdie s cieľom identifikovať farmaceutické činidlá schopné účinne liečiť HCV infekciu u pacientov postihnutých chronickou hepatitídou C. Tieto štúdie zahŕňali použitie interferónu alfa, samotného a v kombinácii s inými protivírusovými činidlami. Takéto štúdie ukázali, že podstatné množstvo účastníkov neodpovedá na tieto terapie a zistilo sa, že veľká časť z tých, ktorí priaznivo odpovedajú, znovu ochorie po ukončení liečby.

Doteraz bol interferón (IFN) jedinou dostupnou liečbou, ktorá mala potvrdený úžitok overený u klinických pacientov s chronickou hepatitídou C. Ale podiel trvalej odpovede je nízky a liečba interferónom indukuje aj ťažké vedľajšie účinky (t. j. retinopatiu, tyroiditídu, akútnu pankreatitídu, depresiu), ktoré znižujú kvalitu života ošetrovaných pacientov. V súčasnosti sa osvedčila pre pacientov, ktorí neodpovedajú na samostatný IFN, kombinácia interferónu s ribavirinom. Ale touto kombinačnou terapiou sa nezmierňujú vedľajšie účinky spôsobené IFN.

Preto existuje potreba vyvinúť účinné protivírusové činidlá na liečbu HCV infekcie, ktoré prekonajú obmedzenia existujúcich farmaceutických terapií.

HCV je obalený vírus s kladnou jednovláknovou RNA a patrí do čeľade Flaviviridae. Jednovláknový HCV RNA genóm je dlhý približne 9 500 nukleotidov a má jediný otvorený čítací rámec (ORF), ktorý kóduje jediný veľký polyproteín s približne 3 000 aminokyselinami. V infikovaných bunkách sa tento polyproteín štiepi na viacerých miestach bunkovými a vírusovými proteázami, čim sa produkujú štruktúrne a neštruktúrne (NS) proteíny. V prípade HCV sa generovanie zrelých neštruktúrnych proteínov (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a NS5B) uskutočňuje dvoma vírusovými proteázami. Prvá, ešte slabo charakterizovaná, štiepi v prepojení NS2-NS3; druhá proteáza je serínová proteáza nachádzajúca sa v N-koncovej oblasti NS3 (tu ďalej označovaná ako NS3 proteáza) a sprostredkúva všetky následné štiepenia smerom dolu od NS3, tak v cis, v NS3-NS4A štiepiacom mieste, ako aj v trans, v ostávajúcich NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B miestach. Zdá sa, že NS4A proteín má viacero funkcií, slúži ako kofaktor pre NS3 proteázu a možno asistuje pri membránovej lokalizácii NS3 a iných zložiek vírusovej replikázy. Zdá sa, že vytvorenie komplexu NS3 proteínu s NS4A je nevyhnutné pre procesné deje, na zosilnenie proteolytickej účinnosti vo všetkých miestach. NS3 proteín má aj nukleozid trifosfatázový účinok a RNA helikázový účinok. NS5B je RNA-závislá RNA polymeráza, ktorá sa podieľa na replikácii HCV.

Všeobecnou stratégiou na vývoj protivirusových činidiel je inaktivovať vírusom kódované enzýmy, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu vírusu. V tomto duchu opisuje prihláška vynálezu WO 97/06804 (-) enantiomér nukleozidového analógu cytozín-l,3-oxatiolánu (známy aj ako 3TC) ako účinný proti HCV. Hoci bolo publikované, že táto zlúčenina bola bezpečná v predchádzajúcich klinických testoch proti HIV a HBV, musí byť ešte klinicky potvrdené, že je účinná proti HCV a musí byť ešte publikovaný mechanizmus jej účinku proti vírusu.

Intenzívne snahy nájsť zlúčeniny, ktoré inhibujú NS3 proteázu alebo RNA helikázu HCV viedli k nasledujúcim publikáciám:

US patent 5633388 opisuje heterocyklické substituované karboxamidy a analógy ako účinné proti HCV. Tieto zlúčeniny sú nasmerované proti helikázovej aktivite NS3 proteínu vírusu, ale ešte neboli publikované klinické testy.

Chu a ďalší (Tet. Lett., (1996), 7229-7232) publikovali, že fenantrénchinón je účinný in vitro proti HCV NS3 proteáze. Nebol publikovaný žiadny ďalší vývoj týkajúci sa tejto zlúčeniny.

Článok prezentovaný na Deviatej medzinárodnej konferencii o protivírusovom výskume, Urabandai, Fukyshima, Japonsko (1996) (Antiviral Research, 30, 1, 1996; A23 (anotácia 19)) uvádza, že tiazolidínové deriváty inhibujú HCV proteázu.

V niekoľkých štúdiách boli publikované zlúčeniny inhibujúce iné serínové proteázy, ako napríklad ľudskú leukocytovú elastázu. Jedna rodina týchto zlúčenín je publikovaná vo WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Peptidy nárokované v tej prihláške sú morfolinylkarbonyl-benzoyl-peptidové analógy, ktoré sa štrukturálne líšia od peptidov podľa predloženého vynálezu.

WO 98/17679 v mene Vertcx Pharmaceuticals Inc. opisuje inhibítory serinovej proteázy, najmä NS3 proteázy vírusu hepatitídy C. Tieto inhibítory sú peptidové analógy založené na NS5A/5B prirodzenom substráte. Všetky tieto peptidy zahŕňajú C-koncovú aktivovanú karbonylovú funkciu ako podstatný znak. Bolo publikované, že tieto peptidy sú účinné aj proti inej serinovej proteáze, a teda nie sú špecifické pre HCV NS3 proteázu.

Aj Hoffman LaRoche publikoval hexapeptidy, ktoré sú proteinázovými inhibítormi užitočnými ako protivírusové činidlá na liečbu HCV infekcie. Tieto peptidy obsahujú na C-konci aldehyd alebo kyselinu borovú.

Steinkiihler a ďalší a Ingallinella a ďalší publikovali inhibíciu N-koncového štiepneho produktu (Biochemistry (1998), 37, 8899-8905 a 8906-8914). Ale prezentované peptidy a peptidové analógy nezahŕňajú, ani nevedú k návrhu peptidov podľa predloženého vynálezu.

WO 98/46579 v mene Emory University opisuje serínové proteázové inhibítory, najmä inhibítory proteázy vírusu hepatitídy C. Všetky nárokované zlúčeniny sa štrukturálne líšia od peptidov podľa predloženého vynálezu.

WO 98/46630 v mene Peptide Therapeutics Ltd. opisuje inhibítory NS3 proteázy hepatitídy C. Ale žiadny z peptidov nie je príbuzný s peptidmi podľa vynálezu.

JP10298151 v mene Japan Energy Corp. opisuje /V-(2,3-dihydroxybenzoyl)-substituované serínové deriváty ako serínové proteázové inhibítory, konkrétne ako inhibítory proteázy hepatitídy C. Tieto zlúčeniny nezahŕňajú žiadnu štrukturálnu podobnosť s peptidovými analógmi podľa predloženého vynálezu.

Jednou výhodou predloženého vynálezu je, že poskytuje peptidy, ktoré inhibujú NS3 proteázu vírusu hepatitídy C.

Ďalšia výhoda jedného predmetu predloženého vynálezu spočíva v skutočnosti, že tieto peptidy špecificky inhibujú NS3 proteázu a nemajú žiadny významný inhibičný účinok proti iným serínovým proteázam, ako napríklad ľudskej leukocytovej elastáze (HLE), prasačej pankreatickej elastáze (PPE) alebo hovädziemu pankreatickému chymotrypsínu, alebo proti cysteínovým proteázam, ako napríklad ľudskému pečeňovému katepsínu B (Cat B) v koncentráciách do 300 μΜ.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú racemáty, diastereoizoméry a optické izoméry peptidových analógov všeobecného vzorca (I)

kde a znamená 0 alebo 1; b znamená 0 alebo 1; Y znamená H alebo Cj.₆ alkyl;

B znamená H, acylový derivát vzorca R⁷-C(O)- alebo sulfonyl vzorca R⁷-SO₂, kde R⁷ znamená (i) C]_io alkyl voliteľne substituovaný karboxylom, C_w alkanoyloxy alebo Ε._ό alkoxy;

(ii) C3.7 cykloalkyl voliteľne substituovaný karboxylom, (C_w alkoxy)karbonyl alebo fenylmetoxykarbonyl;

(iii) C₆ alebo C_l() aryl alebo C₇.i₆ aralkyl voliteľne substituovaný C|.₆ alkylom, hydroxy alebo amino voliteľne substituované C u, alkylom; alebo (iv) Het voliteľne substituovaný C_x_₆ alkylom, hydroxy, amino voliteľne substituované Cj.₆ alkylom, alebo amido voliteľne substituované C|.₆ alkylom;

R⁶, ak je prítomné, znamená C_}.₆ alkyl substituovaný karboxylom;

R⁵, ak je prítomné, znamená C|.₆ alkyl voliteľne substituovaný karboxylom;

R⁴ znamená Ci__l0 alkyl C₃.₇ cykloalkyl alebo C₄._l0 (alkylcykloalkyl);

R³ znamená Cj.io alkyl, C₃.₇ cykloalkyl alebo C₄.₁₀(alkylcykloalkyl);

R² znamená CH2-R²°, NH-R²⁰, O-R²⁰ alebo S-R²⁰, kde R²⁰ znamená nasýtený alebo nenasýtený C3.₇ cykloal10 kyl alebo C₄.₁₀ (alkylcykloalkyl), ktorý je voliteľne mono-, di- alebo tri-substituovaný R²¹, alebo R²⁰ znamená C₆ alebo C10 aryl, C₇.₁₆ aralkyl, ktorý je voliteľne mono-, di- alebo tri-substituovaný R²¹, alebo alebo R²⁰ znamená Het alebo (Ci.₆ alkyl)-Het voliteľne mono-, di- alebo tri-substituovaný R²¹, kde R²¹ znamená nezávisle Ci_₆ alkyl; C|.₆ alkoxy; amino voliteľne mono- alebo di-substituované C₍.₆ alky15 lom; sulfonyl; NO₂; OH; SH; halogén; halogénalkyl; amido voliteľne monosubstituované C|.₆ alkylom, G, alebo C_]0 arylom, C₇.|₆ aralkylom, Het alebo (C]_₆alkyl)-Het; karboxyl; karboxylC^alkyl); C₆ alebo C_l0 ary], C₇.₁₆ aralkyl alebo Het, pričom uvedený aryl, aralkyl alebo Het je voliteľne substituovaný R²²;

kde R²² znamená Ci_g alkyl; C|.6 alkoxy; amino voliteľne mono- alebo di-substituované C|.₆ alkylom; sulfonyl; NO₂; OH; SH; halogén; halogénalkyl; karboxyl; amid; alebo (C_t_₆ alkyl)amid;

R¹ znamená Cj.₆ alkyl alebo C₂_6 alkcnyl voliteľne substituovaný halogénom; a

W znamená hydroxy alebo N-substituovanú aminoskupinu;

alebo ich farmaceutický prijateľné soli alebo estery.

Vynález zahŕňa takisto farmaceutický prostriedok obsahujúci zlúčeninu všeobecného vzorca (I) alebo jej terapeuticky prijateľnú soľ, alebo ester v takom množstve, ktoré je účinné proti vírusu hepatitídy C, v zmesi s 25 farmaceutický prijateľným nosičovým médiom alebo pomocným činidlom.

Ďalej vynález zahŕňa spôsob liečby infekcie vírusom hepatitídy C u cicavcov podávaním zlúčeniny vzorca (I) alebo jej terapeuticky prijateľnej soli, alebo esteru v takom množstve, ktoré je účinné proti vírusu hepatitídy C, alebo podávaním opísaného prostriedku, cicavcovi.

Ďalej vynález zahŕňa spôsob inhibovania replikácie vírusu hepatitídy C vystavením vírusu zlúčenine 30 vzorca (I) alebo jej terapeuticky prijateľnej soli, alebo esteru v takom množstve, ktoré inhibuje NS3 proteázu vírusu hepatitídy C, alebo opísanému farmaceutickému prostriedku.

Ďalej vynález zahŕňa spôsob liečby infekcie cicavca vírusom hepatitídy C podávaním kombinácie zlúčeniny vzorca (I) alebo jej terapeuticky prijateľnej soli, alebo esteru v takom množstve, ktoré je účinné proti vírusu hepatitídy C, a interferónu cicavcovi. Do rozsahu tohto vynálezu spadá aj farmaceutický prostriedok ob35 sahujúci túto kombináciu v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičovým médiom alebo pomocným činidlom.

Definície

Ak nie je uvedené inak, aplikujú sa tu použité nasledujúce definície:

V prípadoch, kde sa používa (R) alebo (5) na označenie konfigurácie radikálu, napr. R⁴ zlúčeniny vzorca (I), robí sa označenie v kontexte zlúčeniny, a nie v kontexte samotného radikálu.

Prirodzené aminokyseliny, s výnimkou glycínu, obsahujú chirálny atóm uhlíka. Ak nie je v konkrétnom prípade uvedené inak, výhodné sú zlúčeniny obsahujúce prirodzené aminokyseliny s L-konfiguráciou. Ale prihlasovatelia počítajú s tým, že, ak sa to špecificky uvedie, môžu niektoré aminokyseliny vzorca (I) byť 45 buď v D-, alebo v L-konfigurácii, alebo môžu byť zmesami D- a L-izomérov vrátane racemických zmesí.

Tak ako je používané tu, znamená označenie „P 1, P2, P3 atď. “ polohu aminokyselinového zvyšku začínajúc od C-konca peptidových analógov a pokračujúc smerom k N-koncu (t. j. P1 znamená polohu 1 od C-konca, P2 znamená druhú polohu od C-konca atď.) (pozri Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London šerieš B257, 249-264 (1970)).

Skratky a-aminokyselín sú uvedené v tabuľke A.

Tabuľka A

Aminokyselina	Symbol
Alanín	Ala
Kyselina asparágová	Asp
Cysteín	Cys
Cyklohexylglycín (označovaný aj ako kyselina 2-amino-2-cyklohexyloctová)	Chg
Kyselina glutámová	Glu
Izoleucín	íle

Aminokyselina	Symbol
Leucín	Leu
Fenylalanín	Phe
Prolín	Pro
Valín	Val
terc-butylglycín	Tbg

Tak ako je používaný, tu znamená výraz „kyselina 1-aminocyklopropyl-karboxylová“ (Acca) zlúčeninu vzorca:

Tak ako je používaný tu znamená výraz „rerobutylglycín“ (Tbg) zlúčeninu vzorca:

Výraz „zvyšok“ znamená vo vzťahu k aminokyseline alebo derivátu aminokyseliny radikál odvodený od zodpovedajúcej ct-aminokyseliny elimináciou hydroxylovej alebo karboxylovej skupiny a jedného vodíka a-aminoskupiny. Napríklad výrazy Gin, Ala, Gly, íle, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar a Tyr predstavujú postupne so zachovaným poradím „zvyšky“ L-glutamínu, L-alanínu, glycínu, L-izoleucinu, L-arginínu, kyseliny L-asparágovej, L-fenylalanínu, L-serínu, L-leucínu, L-cysteínu, L-asparagínu, sarkozínu a L-tyrozínu.

Výraz „bočný reťazec“ znamená vo vzťahu k aminokyseline alebo k aminokyselinovému zvyšku skupinu pripojenú na α-uhlíkový atóm α-aminokyseliny. Napríklad, R-skupinovým bočným reťazcom glycínu je vodík, alanínu metyl, valínu izopropyl. Špecifické R-skupiny alebo bočné reťazce α-aminokyselín sú uvedené v A.L. Lehninger, Biochemistry (pozri kapitolu 4).

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „halogén“ halogénový radikál vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje bróm, chlór, fluór alebo jód.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C_w alkyl“ alebo „( Cj.^alkyl“, buď sám, alebo v kombinácii s iným radikálom, nerozvetvené alebo rozvetvené alkylové radikály obsahujúce do 6 atómov uhlíka a zahŕňajúce napríklad metyl, etyl, propyl, butyl, hexyl, 1-metyletyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl (napr. íerc-butyl).

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C₃.₇ cykloalkyl“, buď sám, alebo v kombinácii s iným radikálom, cykloalkylový radikál obsahujúci tri až sedem atómov uhlíka a zahŕňajúci cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl a cykloheptyl.

Výraz „nenasýtený cykloalkyl“ zahŕňa napríklad cyklohexenyl:

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C4.10 (alkylcykloalkyl)“ cykloalkylový radikál obsahujúci tri až sedem atómov uhlíka spojený s alkylovým radikálom, pričom spojené radikály obsahujú do desať atómov uhlíka; napríklad cyklopropyl-metyl, cyklopentyletyl, cyklohexylmetyl, cyklohexyletyl alebo cykloheptyletyl.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C₂-io alkenyl“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, alkylový radikál, ako je definovaný, obsahujúci 2 až 10 atómov uhlíka a ďalej obsahujúci najmenej jednu dvojitú väzbu. Aklenyl zahŕňa napríklad alyl a vinyl.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C].₆ alkanoyl“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, nerozvetvené alebo rozvetvené 1-oxoalkylové radikály obsahujúce jeden až šesť atómov uhlíka a zahŕňajúce formyl, acetyl, 1-oxopropyl (propionyl), 2-metyl-l-oxopropyl, 1-oxohexyl a podobne.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C|_₆ alkoxy“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, radikál -O(C_b6 alkyl), kde alkyl je definovaný a obsahuje do šesť atómov uhlíka. Alkoxy zahŕňa metoxy, etoxy, propoxy, 1-metyl-etoxy, butoxy a 1,1-dimetyletoxy. Posledná zlúčenina je bežne známa ako Zerc-butoxy.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C₃.₇ cykloalkoxy“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, C₃.₇ cykloalkylovú skupinu spojenú s atómom kyslíka, ako napríklad:

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C₆ alebo C₁₀ aryl“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, buď aromatickú monocyklickú skupinu obsahujúcu 6 atómov uhlíka, alebo aromatickú bicyklickú skupinu obsahujúcu 10 atómov uhlíka. Aryl zahŕňa napríklad fenyl, 1-naftyl alebo 2-naftyl.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „C₇.₁₆ aralkyl“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, C₆ alebo C,o aryl, ako je definovaný, spojený s alkylovou skupinou, pričom alkyl je definovaný a obsahuje 1 až 6 atómov uhlíka. C₇.|₆ aralkyl zahŕňa napríklad benzyl, butylfenyl a 1 -naftylmetyl.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „aminoaralkyl“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, aminoskupinu substituovanú C₇.₁₆ aralkyl skupinou, ako napríklad aminoaralkyl:

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „karboxy(C|.₆)alkyľ‘, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, karboxylovú skupinu (COOH) pripojenú cez (nižšiu)alkylovú skupinu, ako je definovaná, a zahŕňa napríklad kyselinu maslovú.

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „heterocyklus“ alebo „Het“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, monovalentný radikál odvodený odstránením vodíka z päť-, šesť- alebo sedem-člennej nasýtenej alebo nenasýtenej (vrátane aromatickej) heterocyklickej zlúčeniny obsahujúcej jeden až štyri heteroatómy vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa dusík, kyslík a síru. Okrem toho, „Het“, tak ako je tu používaný, znamená heterocyklickú zlúčeninu, ako je definovaná, fuzovanú s jedným alebo viacerými inými cyklami, ktoré sú buď heterocyklami, alebo akýmikoľvek inými cyklami. Príklady vhodných heterocyklov zahŕňajú: pyrolidín, tetrahydrofurán, tiazolidin, pyrol, tiofén, diazepín, l//-imidazol, izoxazol, tiazol, tetrazol, piperidín, 1,4-dioxán, 4-morfolín, pyridín, pyrimidín, tiazolo[4,5-b]-pyridin, chinolín alebo indol, alebo nasledujúce heterocykly;

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „( C|.₆ alkyl)-Het“ heterocyklický radikál, ako je definovaný, pripojený cez nerozvetvenú alebo rozvetvenú alkylovú skupinu, kde alkyl je definovaný a obsahuje 1 až 6 atómov uhlíka. Príklady (C_h6 alkyl)-Het zahŕňajú:

Tak ako je používaný tu, znamená výraz „farmaceutický prijateľný ester“, buď samostatne, alebo v kombinácii s iným radikálom, estery zlúčeniny vzorca (I), v ktorých je ktorákoľvek z karboxylových funkčných skupín, ale výhodne karboxylová koncová skupina, nahradená alkoxykarbonylovou funkčnou skupinou:

v ktorej R časť esteru je vybraná zo skupiny, ktorá zahŕňa alkyl (napr. metyl, etyl, κ-propyl, terc-butyl, «-butyl); alkoxyalkyl (napr. metoxymetyl); alkoxyacyl (napr. acetoxymetyl); aralkyl (napr. benzyl); aryloxyalkyl (napr. fenoxymetyl); aryl (napr. fenyl), voliteľne substituované halogénom, C_M alkylom alebo Cm alkoxy. Iné vhodné prekurzorové estery je možné nájsť v Design of prodrugs, Bundgaard, H. vyd. Elsevier (1985), pričom táto publikácia je tu zahrnutá jej citáciou. Takéto farmaceutický prijateľné estery sú zvyčajne in vivo, keď sa injekčné podajú cicavcovi, hydrolyzované a transformované na kyselinovú formu zlúčeniny vzorca ^(I)·

S ohľadom na opísané estery, ak nie je špecifikované inak, obsahuje akýkoľvek prítomný alkylový substituent výhodne 1 až 16 atómov uhlíka, najmä 1 až 6 atómov uhlíka. Akýkoľvek arylový substituent nachádzajúci sa v takýchto esteroch výhodne zahŕňa fenylovú skupinu.

Estermi môžu byť najmä C[.₁₆ alkylester, nesubstituovaný benzylester alebo benzylester substituovaný najmenej jedným halogénom, C_t.₆ alkylom, C_b6 alkoxy, nitro alebo trifluórmetylom.

Tak ako je používaný tu, zahŕňa výraz „farmaceutický prijateľná soľ“ soli odvodené od farmaceutický prijateľných zásad. Príklady vhodných zásad zahŕňajú cholin, etanolamín a etyléndiamín. Rozsah vynálezu zahŕňa aj Na⁺, K⁺ a Ca⁺⁺ soli (pozri aj Pharmaceutical salts, Birge, S.M. a ďalší, J. Pharm. Sci. (1977), 66, 1-19, zahrnuté touto citáciou).

V ýhodné uskutočnenia

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde

B výhodne znamená R⁷-SO2, kde R⁷ výhodne znamená C6 alebo C_l0 aryl, C₇._]6aralkyl alebo Het, pričom všetky sú voliteľne substituované C|.₆ alkylom.

Alternatívne, B výhodne znamená H alebo acylový derivát vzorca R⁷C(O)-, kde R⁷ výhodne znamená Cw alkyl; Cw alkoxy; C3.7 cykloalkyl voliteľne substituovaný s hydroxy; amido voliteľne substituované s Cw alkylom alebo Het; C6 alebo C10 aryl, C7.16 aralkyl alebo Het, všetko voliteľne substituované s C|.6 alkylom alebo hydroxy. Výhodnejšie B znamená H alebo R⁷C(O)-, kde R⁷ výhodnejšie znamená C|.Ŕ alkyl alebo heterocykly ako:

Výhodnejšie B znamená H; acetyl;

Najvýhodnejšie B znamená acetyl.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde R⁶, ak je prítomné, výhodne znamená bočný reťazec Asp alebo Glu. Najvýhodnejšie R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp. Alternatívne a výhodne znamená 0 a potom R⁶ chýba.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde R⁵, ak je prítomné, výhodne znamená bočný reťazec aminokyseliny vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, O-terc-butylglycín (Tbg) a L-Tbg. Výhodnejšie znamená R⁵, ak je prítomné, bočný reťazec D-Asp, D-Val alebo D-Glu. Najvýhodnejšie znamená R⁵, ak je prítomné, bočný reťazec D-Glu. Alternatívne, znamená a výhodne 0 a b znamená 0, a potom R⁶ a R⁵ nie sú prítomné.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde výhodne R⁴ znamená bočný reťazec aminokyseliny vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z: Val, cyklohexyl-glycínu (Chg), Tbg, íle alebo Leu. Výhodnejšie znamená R⁴ bočný reťazec Chg alebo íle. Najvýhodnejšie znamená R⁴ bočný reťazec Chg.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde Y výhodne znamená H alebo Me. Najvýhodnejšie Y znamená H.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde R³ výhodne znamená bočný reťazec aminokyseliny vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje íle, Chg, Val alebo Tbg. Výhodnejšie R° znamená bočný reťazec Val, Chg alebo Tbg. Najvýhodnejšie znamená R³ bočný reťazec Val alebo Tbg.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde R² výhodne znamená S-R²⁰ alebo O-R²⁰, kde R²⁰ výhodne znamená C₆ alebo C_l0 aryl, C₇_i₆ aralkyl, Het alebo -CH₂-Het, pričom všetky sú mono-, di- alebo trisubstituované s R²¹.

R²¹ výhodne znamená Ci„6 alkyl; C,.6 alkoxy; amino; mono- alebo di-( Ci.6 alkyljamino; amido voliteľne mono-substituovaný s C|.fi alkylom, C6 alebo Clo arylom, C7.|6 aralkylom, Het alebo (C|_6 aľkyl)-Het; NO2; OH; halogén; trifluórmetyl; karboxyl; C6 alebo C)o aryl, C7.I6 aralkyl, alebo Het, pričom aryl, aralkyl alebo Het sú voliteľne substituované s R²². Výhodnejšie, R²¹ znamená C|.6 alkyl; C,.₆ alkoxy; amino; di(C|.₆ alkyljamino; (Ci.₆ alkyljamid; C₆ alebo C₁₀ aryl alebo Het, pričom aryl alebo Het sú voliteľne substituované s R²².

R²² výhodne znamená Ci_6 alkyl; Cj.6 alkoxy; amino; mono- alebo di-( Ci_6 alkyljamino; (C|_6 alkyljamid; NO2; OH; halogén; trifluórmetyl alebo karboxyl. Výhodnejšie znamená R²² Cb6 alkoxy; amino; di-( C|.₆ alkyljamino; (C_b6 alkyljamid; halogén alebo trifluórmetyl.

Výhodnejšie znamená R² 1-naftylmetoxy; 2-naftylmetoxy; benzyloxy, 1-naftyl-oxy; 2-naftyloxy; alebo chinolínoxy nesubstituované alebo mono-, alebo di-substituované s R²¹, ako je definované. Najvýhodnejšie znamená R² 1-naftylmetoxy alebo chinolínoxy nesubstituované alebo mono- alebo di-substituované s R²¹, ako je definované.

Ešte výhodnejšie znamená R²:

21B

Výhodnejšie znamená R^2IA amido voliteľne mono-substituované C].6 alkylom, C6 alebo C|0 arylom, C7.16 aralkylom alebo Het; alebo C6 alebo Clu aryl alebo Het voliteľne substituované R²². Najvýhodnejšie znamená R^{2I A} C6 alebo Cm aryl alebo Het voliteľne substituované R²². Najvýhodnejšie znamená R²² amino; di(C|.₆ alkyljamino; alebo (C,.₆ alkyljamid. Ešte výhodnejšie znamená R²² amino; dimetyl-amino alebo acetamido.

Ešte výhodnejšie znamená R^2IA C₆ alebo C|₀ aryl alebo Het, všetko nesubstituované.

Výhodne znamená R^2,B alkyl; Cb6 alkoxy; amino; di-( Ci.fi alkyljamino; (Cj.(, alkyljamid; NO2; OH; halogén; trifluórmetyl alebo karboxyl. Výhodnejšie znamená R^2IB Ci.6 alkoxy; amino; di-( C_w alkyljamino. Najvýhodnejšie znamená R^21B metoxy.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde R¹ výhodne znamená metyl, etyl, propyl, vinyl, pričom všetky sú voliteľne substituované halogénom. Výhodnejšie znamená R¹ etyl, vinyl alebo brómvinyl. Najvýhodnejšie znamená R¹ vinyl.

Rozsah vynálezu zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde W výhodne znamená hydroxy alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ, alebo ester; alebo (C|.₆alkyl)-amino, di(C|.₆ alkyljamino alebo aminoaralkyl. Výhodnejšie W znamená hydroxy alebo N(R^l3ajR^13b, kde R^l3a a R^l3h znamenajú nezávisle H, aryl alebo Cj₆ alkyl voliteľne substituované s hydroxy alebo fenylom; alebo ich farmaceutický prijateľnú soľ. Najvýhodnejšie znamená W -OH, -NH-benzyl alebo -NH-CH(Me)Ph. Ešte výhodnejšie znamená W -OH alebo -NH-(5)CH(Mej-fenyl.

Ak W znamená ester, je takýto ester výhodne vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa C7.₆ alkoxy, fenoxy alebo aryl(C_b6 alkoxyj. Výhodnejšie je takýmto esterom metoxy, etoxy, fenoxy, benzyloxy alebo PhCH(Me)-O-.

Ako je opísané, je Pl segment zlúčenín vzorca (Ij cyklopropylovým kruhovým systémom vzorca:

kde tak Cj, ako aj C? predstavujú asymetrický atóm uhlíka v polohách 1 a 2 cyklo-propylového kruhu. Bez ohľadu na iné možné asymetrické centrá v iných segmentoch zlúčenín vzorca (I), znamená prítomnosť týchto dvoch asymetrických centier, že zlúčenina vzorca (I) môže existovať vo forme racemických zmesí diastereoizomérov. Ako je ilustrované v uvedených príkladoch, je možné pripraviť racemické zmesi a potom ich rozdeliť na jednotlivé optické izoméry, alebo je možné tieto optické izoméry pripraviť chirálnou syntézou.

Takže zlúčenina vzorca (I) môže existovať vo forme racemickej zmesi diastereoizomérov, v ktorých je R¹ v polohe 2 v orientácii syn vzhľadom ku karbonylu v polohe 1, čo reprezentuje nasledujúci radikál:

alebo môže zlúčenina vzorca (I) existovať vo forme racemickej zmesi diastereoizomérov, v ktorých je R¹ v polohe 2 v orientácii anti vzhľadom ku karbonylu v polohe 1, čo reprezentuje nasledujúci radikál:

alebo

Naopak, racemické zmesi môžu byť rozdelené na jednotlivé optické izoméry.

Najzaujímavejšie zistenie tohto vynálezu sa týka priestorovej orientácie PI segmentu. Zistenie sa týka konfigurácie asymetrického uhlíka v polohe 1. Vo výhodnom uskutočnení má asymetrický uhlík v polohe 1 R konfiguráciu.

Konkrétnejšie, ak má uhlík 1 R konfiguráciu, inhibícia HCV NS3 proteázy je ešte zosilnená polohou substituenta R¹ (napr. alkylu alebo alkylénu) na uhlíku 2 cyklopropylového kruhu. Najvýhodnejšou zlúčeninou je optický izomér, ktorý má R¹ substituent a karbonyl v syn orientácii v nasledujúcej absolútnej konfigurácii:

V prípade, že R¹ je napríklad etyl, majú asymetrické atómy uhlíka v polohách 1 a 2 R, Ä konfiguráciu.

Ako ilustrácia vplyvu absolútnej konfigurácie substituenta na úroveň potenciálu zlúčeniny sa uvádza zlúčenina 112 (tabuľka 1) s absolútnou konfiguráciou ÍR, 2R, ktorá má IC₅₀ 1,6 μΜ, zatiaľ čo zodpovedajúci 1S,2R izomér (zlúčenina 113) má IC₅₀ 27,5 μΜ. Takže IR,2R izomér je 25-krát účinnejší ako zodpovedajúci 1S,2S izomér.

Rozsah predloženého vynálezu ďalej zahŕňa zlúčeniny vzorca (I), kde B znamená H, C]_₆ alkyl-C(O)alebo Het-C(O)-;

R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp alebo Glu;

R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D- alebo L-: Asp, Glu, Val alebo Tbg;

Y znamená H alebo metyl;

R⁴ znamená bočný reťazec Val, Chg, Tbg, íle alebo Leu;

R³ znamená bočný reťazec íle, Chg, Val alebo Tbg;

R² znamená 1-naftylmetoxy, 2-naftylmetoxy, O-Bn,

nhcoch,. halogén, NH₂, NO₂₎ alkoxy a R²² znamená amino; di(Ci_₆ alkyl)amino; (C₍.₆ alkyljamid; NO₂; OH; halogén; CF₃ alebo karboxy; P1 znamená cyklopropylový kruhový systém vzorca

kde R¹ znamená etyl, vinyl alebo brómvinyl; a

W znamená hydroxy alebo N(R^l3a)R^l3b, kde R^l3a a R^l3b znamenajú nezávisle H, aryl alebo C|.₆ alkyl voliteľne substituovaný hydroxy alebo fenylom, alebo ich farmaceutický prijateľná soľ alebo ester.

Ďalšia výhodná skupina zlúčenín je reprezentovaná vzorcom (I), v ktorom B znamená H, acetyl alebo Het-C(O)-; R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp; R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D-Asp, D-Glu alebo D-Val; Y znamená H; R⁴ znamená bočný reťazec Chg alebo íle; R³ znamená bočný reťazec Val, Chg alebo Tbg; R² znamená 1 -naftylmetoxy, benzyloxy, 4-chinolinoxy alebo

OMe. halogén, NH₂, alebo NO₂,

PI znamená cyklopropylový kruhový systém vzorca

kde R¹ znamená Et alebo -CH=CH₂ alebo -CH=CHBr; a

W znamená hydroxy alebo -NH-(S)CH(Me)Ph, alebo ich farmaceutický prijateľná soľ alebo ester.

Ešte ďalšia výhodná skupina zlúčenín je reprezentovaná vzorcom (I), v ktorom B znamená acetyl; R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp; R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D-Glu; Y znamená H; R⁴ znamená bočný reťazec Chg; R³ znamená bočný reťazec Val alebo Tbg;

R² znamená:

PI znamená:

a

W znamená hydroxy, alebo ich farmaceutický prijateľná soľ alebo ester.

Nakoniec vynálezu zahŕňa každú zlúčeninu vzorca (I), ktorá je uvedená v tabuľkách 1 až 5.

V súlade s alternatívnym uskutočnením môžu farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu obsahovať ešte iné anti-HCV činidlo. Príklady anti-HCV činidiel zahŕňajú a- alebo β-interferón, ribavirín a amantadín.

V súlade s iným alternatívnym uskutočnením môžu farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu obsahovať ešte iné inhibítory HCV proteázy.

V súlade ešte s iným alternatívnym uskutočnením môžu farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu obsahovať ešte inhibítory iných cieľov v HCV životnom cykle vrátane, ale bez obmedzenia, napríklad helikázy, polymerázy, metaloproteázy alebo vnútorného ribozómovcho vstupného miesta (IRES).

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu sa môžu podávať orálne, parenterálne alebo prostredníctvom implantovaného zásobníka. Výhodné je orálne podávanie alebo podávanie injekciou. Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať akékoľvek bežné netoxické farmaceutický prijateľné nosiče, adjuvans alebo vehikulá. V niektorých prípadoch je možné nastaviť pH farmaceutického prostriedku farmaceutický prijateľnými kyselinami, zásadami alebo tlmivými roztokmi, aby sa posilnila stabilita zlúčeniny vo farmaceutickom prostriedku alebo stabilita formy, v ktorej sa podáva. Tak, ako je používaný tu, zahŕňa výraz parenterálne subkutánne, intrakutánne, intravenózne, intramuskuláme, intraartikuláme, intrasynoviálne, intrastemálne, intratekálne a intralézne injekčné alebo infuzne techniky.

Farmaceutické prostriedky môžu byť vo forme sterilného injektovateľného prípravku, napríklad vo forme injektovateľnej vodnej alebo olejovej suspenzie. Túto suspenziu je možné formulovať technikami, ktoré sú v oblasti známe, použitím vhodných dispergačných alebo zmáčacích činidiel (ako napríklad Tween 80) a suspendačných činidiel.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu sa môžu orálne podávať v akejkoľvek orálne prijateľnej dávkovej forme, vrátane, ale bez obmedzenia, kapsúl, tabliet a vodných suspenzií alebo roztokov. V prípade tabliet na orálne použitie zahŕňajú bežne používané nosiče laktózu a obilný škrob. Typicky sa pridávajú aj mazacie činidlá, ako napríklad stearan horečnatý. Na orálne podanie vo forme kapsuly, zahŕňajú užitočné riedidlá laktózu a vysušený obilný škrob. Keď sa vodné suspenzie podávajú orálne, kombinuje sa účinná zložka s emulzifikačnými a suspendačnými činidlami. Ak je to želateľné, je možné pridávať určité sladidlá a/alebo dochucovadlá, a/alebo farbiace činidlá.

Iné vhodné vehikulá alebo nosiče pre uvedené farmaceutické prostriedky je možné nájsť v štandardných farmaceutických textoch, napr. v „Remington’s Pharmaceutical Sciences“, The Science and Practice of Pharmacy, 19. vyd. Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995).

Na monoterapiu na prevenciu a liečbu HCV sprostredkovaného ochorenia sú účinné dávkové hladiny medzi približne 0,01 a približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti na deň, výhodne medzi približne 0,5 a približne 75 mg/kg telesnej hmotnosti na deň tu opísaných zlúčenín inhibujúcich proteázu. Typicky sa farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu budú podávať približne raz až približne päťkrát denne alebo, alternatívne, ako kontinuálna infúzia. Takéto podávanie môže byť použité ako chronická alebo ako akútna liečba. Množstvo účinnej zložky, ktoré sa môže kombinovať s nosičovými materiálmi na vytvorenie jednotkovej dávkovej formy, sa bude meniť v závislosti od liečeného hostiteľa a najmä v závislosti od spôsobu podávania. Typický prípravok bude obsahovať od približne 5 % do približne 95 % hmotn. účinnej zlúčeniny. Výhodne budú takéto prípravky obsahovať od približne 20 % do približne 80 % hmotn. účinnej zlúčeniny.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že môže byť potrebné použitie nižšej alebo vyššej dávky, ako sú tie, ktoré boli uvedené. Špecifická dávka a liečebné režimy pre ktoréhokoľvek pacienta budú závisieť od rôznych faktorov vrátane účinku konkrétnej použitej zlúčeniny, veku, telesnej hmotnosti, celkového zdravotného stavu, pohlavia, diéty, času podania, rýchlosti vylučovania, kombinácie liečiv, závažnosti a priebehu infekcie, pacientovej dispozície na infekciu a od posúdenia ošetrujúceho lekára. Vo všeobecnosti sa liečba začína malými dávkami, podstatne nižšími ako je optimálna dávka peptidu. Potom sa dávka zvyšuje malými zvýšeniami, pokiaľ sa nedosiahne optimálny účinok za daných okolností. Vo všeobecnosti je najviac želateľné podávať zlúčeninu v koncentračnej hladine, ktorá generálne zabezpečí protivírusové účinné výsledky, bez toho, aby spôsobila akékoľvek škodlivé alebo ničivé vedľajšie účinky.

Keď prostriedky podľa tohto vynálezu obsahujú kombináciu zlúčeniny vzorca (I) a jedného alebo viacerých prídavných terapeutických alebo profylaktických činidiel, tak zlúčenina, ako aj prídavné činidlo by mali byť prítomné v dávkových hladinách medzi približne 10 a 100 % a výhodnejšie medzi približne 10 a 80 % dávky, ktorá sa normálne podáva v monoterapeutickom režime.

Keď sú tieto zlúčeniny alebo ich farmaceutický prijateľné soli formulované spolu s farmaceutický prijateľným nosičom, môže byť výsledný prostriedok in vivo podávaný cicavcom, ako napríklad človeku, aby sa inhibovala HCV NS3 proteáza alebo aby sa liečila, alebo aby sa predchádzalo HCV vírusovej infekcii. Takáto liečba sa môže dosiahnuť aj použitím zlúčenín podľa tohto vynálezu v kombinácii s činidlami, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: imunomodulačné činidlá, ako napríklad α-, β- alebo γ-interferóny; iné protiví rusové činidlá, ako ribavirín, amantadín; iné inhibítory HCV NS3 proteázy; inhibítory iných cieľov HCV životného cyklu, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, helikázu, polymerázu, metaloproteázu alebo vnútorné ribozómové vstupné miesto (IRES); alebo ich kombinácie. Na vytvorenie jednotkovej dávkovej formy je možné kombinovať so zlúčeninami podľa tohto vynálezu prídavné činidlá. Alternatívne je možné tieto prídavné činidlá podávať cicavcovi oddelene, ako časť viacobsahovej dávkovej formy.

V súlade s tým iné uskutočnenie tohto vynálezu poskytuje spôsoby inhibície HVC NS3 proteázového účinku v cicavcoch podávaním zlúčeniny vzorca (I), pričom substituenty sú definované.

Vo výhodnom uskutočnení sú tieto spôsoby užitočné na znižovanie HCV NS3 proteázového účinku v cicavcovi. Ak farmaceutický prostriedok obsahuje ako účinnú zložku len zlúčeninu podľa tohto vynálezu, môžu takéto spôsoby ďalej zahŕňať krok podávania činidla vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje imunomodulačné činidlo, protivírusové činidlo, HCV proteázový inhibítor alebo inhibítor iných cieľov HCV životného cyklu, ako helikázy, polymerázy, metaloproteázy alebo IRES, uvedenému cicavcovi. Takéto prídavné činidlo môže byť cicavcovi podávané pred, zároveň s alebo po podaní prostriedkov podľa tohto vynálezu.

V alternatívnom výhodnom uskutočnení sú tieto spôsoby užitočné na inhibíciu vírusovej replikácie v cicavcovi. Takéto spôsoby sú užitočné na liečbu alebo prevenciu HCV ochorenia. Ak farmaceutický prostriedok obsahuje ako účinnú zložku len zlúčeninu podľa tohto vynálezu, môžu takéto spôsoby ďalej zahŕňať krok podávania činidla vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje imunomodulačné činidlo, protivírusové činidlo, HCV proteázový inhibítor alebo inhibítor iných cieľov HCV životného cyklu, uvedenému cicavcovi. Takéto prídavné činidlo môže byť cicavcovi podávané pred, zároveň s alebo po podaní prostriedku podľa tohto vynálezu.

Tu uvedené zlúčeniny môžu byť použité aj ako laboratórne činidlá. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť použité aj na ošetrenie alebo prevenciu kontaminácie materiálov vírusom a tak na zníženie rizika vírusovej infekcie laboratórneho alebo medicínskeho personálu, alebo pacientov, ktorí prichádzajú do kontaktu s takýmito materiálmi (napr. krvou, tkanivami, chirurgickými nástrojmi a zariadeniami, laboratórnymi nástrojmi a zariadeniami a zariadeniami a materiálmi na odber krvi).

Tu uvedené zlúčeniny môžu byť použité aj ako výskumné činidlá. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť použité aj ako pozitívna kontrola na overenie náhradkových bunkových testov alebo in vitro alebo in vivo vírusových replikačných testov.

Postup

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa syntetizovali postupom ilustrovaným na schéme I (kde CPG znamená karboxylovú ochrannú skupinu a APG znamena amino ochrannú skupinu):

Schéma I

APG-P2-P1-(w alebo CPG)

APG-P3-P2-P1-(w alebo CPG)

APG-P3-P2-P1-(w alebo CPG)

APG-P5-P4-P3-P2-P1-(w alebo CPG)

APG-P6-P5-P4-P3-P2-P1-(w alebo CPG)

B-P6-P5-P4-P3-P2-P1 -W vzorec (I)

Stručne, PI, P2, P3, P4 a voliteľne P5 a P6 sa môžu spájať dobre známymi technikami peptidového párovania. PI, P2, P3, P4 a P5 a P6 skupiny sa spolu môžu spájať v akomkoľvek poradí, pokiaľ konečná zlúčeni na zodpovedá peptidom vzorca (I). Napríklad P6 môže byť pripojené na P5, čím vznikne P5-P6, ktoré sa pripojí na P4-P3-P2-P1; alebo P6 sa môže pripojiť na P5-P4-P3-P2 a potom sa pripojiť na príslušné PI chránené na C-konci.

Vo všeobecnosti sa peptidy predlžujú odstránením ochrannej skupiny z α-amino skupiny N-koncového zvyšku a spárovaním nechránenej karboxylovej skupiny s ďalšou vhodnou aminokyselinou chránenou na N-konci prostredníctvom peptidovej väzby použitím opísaných metód. Tento postup odstraňovania ochrannej skupiny a párovania sa opakuje, pokiaľ sa nezíska požadovaná sekvencia. Toto párovanie sa môže uskutočňovať s konštitučnými aminokyselinami spôsobom postupných krokov, ako je znázornené na schéme I, alebo kondenzáciou fragmentov (dvoch alebo niekoľkých aminokyselín), alebo kombináciou oboch postupov, alebo peptidovou syntézou na tuhej fáze podľa spôsobu pôvodne opísaného v Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154, pričom opis tejto publikácie je tu zahrnutý jej citáciou.

Párovanie medzi dvoma aminokyselinami, aminokyselinou a peptidom alebo dvoma peptidovými fragmentmi sa môže uskutočňovať použitím štandardných párovacích postupov, ako napríklad azidovou metódou, metódou využívajúcou zmiešané anhydridy kyseliny uhličitej a kyseliny karboxylovej (izobutyl chloroformát), karbodiimidovým spôsobom (dicyklohexylkarbodiimid, diizopropylkarbodiimid alebo vo vode rozpustný karbodiimid), spôsobom s aktívnym esterom (p-nitrofenylový ester, A'-hydroxyjantaranimidoester), K-metódou s Woodwardovým reakčným činidlom, karbonyldiimidazolovým spôsobom, spôsobmi s fosforečnými reakčnými činidlami alebo oxidačno-redukčnými spôsobmi. Niektoré z týchto metód (najmä karbodiimidový spôsob) môžu byť zosilnené pridaním 1-hydroxybenzotriazolu. Tieto párovacie reakcie sa môžu uskutočňovať buď v roztoku (v kvapalnej fáze), alebo v tuhej fáze.

Konkrétnejšie, párovací krok zahŕňa dehydratačné párovanie voľného karboxylu jedného reaktantu s voľnou aminoskupinou druhého reaktantu v prítomnosti párovacieho činidla na vytvorenie amidovej väzby. Opis takýchto párovacích činidiel sa nachádza vo všeobecných učebniciach peptidovej chémie, napr. v M. Bodanszky, „Peptide Chemistry“, 2. vyd., Springer-Verlag, Berlín, Nemecko, (1993). Príkladmi vhodných párovacich činidiel sú A'.jV-dicyklohexyl-karbodiimid, 1-hydroxybenzotriazol v prítomnosti /VjV-dicyklohexylkarbodiimidu alebo jV-etyl-A'’-[(3-dimetylamino)propyl]karbodiimidu. Veľmi praktickým a užitočným párovacím činidlom je komerčne dostupný (benzotriazol-l-yloxy)tris-(dimetylamino)-fosfóniumhexafluórfosfát buď samostatný, alebo v prítomnosti 1-hydroxybenzo-triazolu. Iným veľmi praktickým a užitočným párovacím činidlom je komerčne dostupný 2-(177-benzotriazol-l -yl)-WM,M-tetrametyluróniumtetrafluórborát. Ešte iným veľmi praktickým a užitočným párovacím činidlom je komerčne dostupný 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-N, N, Ν', /V-tetrametyluróniumhexafluór fosfát.

Kopulačná reakcia sa uskutočňuje v inertnom rozpúšťadle, napr. dichlór-metáne, acetonitrile alebo dimetylformamide. Pridáva sa nadbytok terciárneho amínu, napr. diizopropyletylamínu, A-metylmorfolínu alebo /V-metylpyrolidínu, aby sa pH reakčnej zmesi udržalo na približne 8. Reakčná teplota je zvyčajne v rozsahu medzi 0 °C a 50 °C a reakčný čas je zvyčajne v rozsahu medzi 15 minút a 24 hodín.

Keď sa použije syntetický postup na tuhej fáze, C-koncová karboxylová kyselina sa pripojí na nerozpustný nosič (zvyčajne polystyrén). Tieto nerozpustné nosiče obsahujú skupinu, ktorá bude reagovať s karboxylovou skupinou a vytvorí sa väzba, ktoré je stabilná v predlžovacích podmienkach, ale je ju možné neskôr jednoducho štiepiť. Príkladmi takýchto nosičov sú: chlór- alebo brómmetylová živica, hydroxymetylová živica a aminometylová živica. Mnohé z týchto živíc sú komerčne dostupné, pričom už majú inkorporovanú požadovanú C-koncovú aminokyselinu. Alternatívne je možné do tuhého podkladu známymi metódami inkorporovať aminokyselinu, Wang, S.-S., J. Am. Chem. Soc., (1973), 95, 1328; Atherton, E.; Shepard, R.C. „Solid-phase peptide synthesis; a practical approach“ IRL Press: Oxford, (1989); 131-148. Okrem uvedených sú iné spôsoby peptidovej syntézy opísané v Stewarl a Young, „Solid Phase Peptide Synthesis“, 2. vyd., Peirce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Vyd., „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology“, zv. 1, 2, 3, 5 a 9, Academic Press, New York, (1980-1987); Bodansky a ďalší, „The Practice of Peptide Synthesis“ Springer-Verlag, New York (1984), ktorých opis je tu začlenený ich citáciou.

Funkčné skupiny konštitučných aminokyselín musia byť vo všeobecnosti počas párovacích reakcii chránené, aby sa vylúčilo vytváranie nežiaducich väzieb. Zoznam ochranných skupín, ktoré môžu byť použité, je uvedený v Greene, „Protective Groups in Organic Chemistry“, John Wiley & Sons, New York (1981) a „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology“, zv. 3, Academic Press, New York (1981), ktorých opis je tu zahrnutý ich citáciou.

α-Karboxylová skupina C-koncového zvyšku jc zvyčajne chránená ako ester (CPG), ktorý je možné rozštiepiť za vzniku karboxylovej kyseliny. Ochranné skupiny, ktoré je možné použiť, zahŕňajú: 1. alkylestery, ako metyl, trimetylsilyletyl a terc-butyl, 2. aralkylestery, ako benzyl a substituovaný benzyl, alebo 3. estery, ktoré je možné štiepiť ošetrením s miernou zásadou alebo s miernymi redukčnými prostriedkami, ako trichlóretyl a fenacylestery.

α-Aminoskupina každej aminokyseliny, ktorá sa má kopulovať, aby rástol peptidový reťazec, musí byť chránená (APG). Použitá môže byť akákoľvek ochranná skupina známa v oblasti. Príklady takýchto skupín zahŕňajú: 1. acylové skupiny, ako formyl, trifluóracetyl, ftalyl a p-toluénsulfonyl; 2. aromatické karbamátové skupiny, ako benzyloxykarbonyl (Cbz alebo Z) a substituované benzyl-oxykarbonyly a 9-fluorenylmetyloxykarbonyl (Fmoc); 3. alifatické karbamátové skupiny, ako ferc-butyloxykarbonyl (boe), etoxykarbonyl, diizopropylmetoxykarbonyl a alyloxykarbonyl; 4. cyklické alkylové karbamátové skupiny, ako cyklopentyloxy-karbonyl a adamantyloxykarbonyl; 5. alkylové skupiny, ako trifenylmetyl a benzyl; 6. trialkylsilyl, ako trimetylsilyl; a 7. tiol obsahujúce skupiny, ako fenyltiokarbonyl a ditiasukcinoyl. Výhodnou a-amino ochrannou skupinou je buď Boe, alebo Fmoc. Mnohé aminokyselinové deriváty vhodne chránené na peptidovú syntézu sú komerčne dostupné.

a-Amino ochranná skupina novo pridaného aminokyselinového zvyšku sa odštepuje pred pripojením nasledujúcej aminokyseliny. Ak sa použije Boe skupina, zvolenými spôsobmi sú kyselina trifluóroctová, čistá alebo v dichlórmetáne, alebo HC1 v dioxáne alebo v etylacetáte. Výsledná amónna soľ sa potom neutralizuje buď pred párovaním, alebo in situ, so zásaditými roztokmi, ako napríklad vodnými tlmivými roztokmi, alebo terciámymi amínmi v dichlórmetáne alebo acetonitrile, alebo dimetylformamide. Ak sa použije Fmoc skupina, vybranými reakčnými činidlami sú piperidín alebo substituovaný piperidín v dimetylformamide, ale môže byť použitý akýkoľvek sekundárny amín. Odstraňovanie ochrannej skupiny sa uskutočňuje pri teplote medzi 0 °C a laboratórnou teplotou (RT), zvyčajne pri teplote 20 až 22 °C.

Ktorákoľvek aminokyselina, ktorá má bočný reťazec s funkčnou skupinou, musí byť počas prípravy peptidu chránená použitím ktorejkoľvek z opísaných skupín. Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že výber a použitie vhodných ochranných skupín pre tieto funkčné skupiny na bočných reťazcoch bude závisieť od aminokyseliny a od prítomnosti iných ochranných skupín v peptide. Výber takýchto ochranných skupín je dôležitý v tom, že skupina sa nesmie odstrániť počas odstraňovania ochrannej skupiny a pripájania aaminoskupiny.

Napríklad, ak sa ako α-amino ochranná skupina použije Boe, vhodné sú nasledujúce ochranné skupiny bočného reťazca: p-toluénsulfonylové (tozylové) substituenty môžu byť použité na ochranu amino bočného reťazca aminokyselín, ako Lys a Arg; acetamidometyl, benzyl (Bn) alebo íerc-butylsulfonylové substituenty môžu byť použité na ochranu cysteínových bočných reťazcov obsahujúcich sulfid; benzyl (bn) étery môžu byť použité na ochranu serínových, treonínových alebo hydroxyprolinových bočných reťazcov obsahujúcich hydroxy; a benzylestery môžu byť použité na ochranu bočných reťazcov kyseliny asparágovej a glutámovej, ktoré obsahujú karboxy.

Ak sa na ochranu α-atninu vyberie Fmoc, zvyčajne sú akceptovateľné ochranné skupiny založené na terc-butyle. Napríklad, Boe je možné použiť pre lyzín a arginín, /erc-butyléter pre serín, treonín a hydroxyprolín a fôrobutylester pre kyselinu asparágovú a kyselinu glutámovú. Na ochranu cysteínového bočného reťazca obsahujúceho sulfid je možné použiť trifenylmetylový (Trityl) substituent.

Ak W znamená amid (w), potom sa PI pripája na príslušný amín pred pripojením na P2. Priemerný odborník v oblasti určí takúto aminácie bez problémov.

Po ukončení predlžovania peptidu sa všetky ochranné skupiny odstránia. Ak sa použije syntéza v kvapalnej fáze, odstraňujú sa ochranné skupiny akýmkoľvek spôsobom, ktorý je diktovaný výberom ochranných skupín. Pre priemerného odborníka v oblasti sú tieto postupy veľmi dobre známe.

Ak sa použije syntéza na tuhej fáze, peptid sa odštiepi od živice spolu s odstránením ochranných skupín. Keď sa pri syntéze použije Boe ochranný spôsob, je výhodným postupom na odštiepenie peptidu od živice ošetrenie s bezvodnou HF obsahujúcou aditíva, ako dimetylsulfid, anizol, tioanizol alebo p-krezol, pri 0 °C. Odštiepenie peptidu sa môže uskutočňovať aj inými kyselinovými reakčnými činidlami, ako napríklad zmesami kyseliny trifluórmetánsulfónovej a kyseliny trifluóroctovej. Ak sa použije Fmoc ochranná metóda, odštepuje sa N-koncová Fmoc skupina opísanými reakčnými činidlami. Iné ochranné skupiny a peptid sa odštepujú od živice použitím roztoku kyseliny trifluóroctovej a rôznych aditiv, ako napríklad anizolu atď.

Syntéza ukončovacej skupiny B a P6, P5, P4 a P3 častí

Rôzne ukončovacie skupiny B sa zavádzajú na ochranu P4, P5 alebo P6 alebo akéhokoľvek iného peptidového segmentu s príslušným acylchloridom alebo sulfonylchloridom, ktoré sú buď komerčne dostupné, alebo ktorých syntéza je v oblasti dobre známa.

Rôzne P6 až P3 segmenty sú dostupné komerčne alebo je ich syntéza dobre známa v oblasti.

1. Syntéza P2 segmentov

1.1 Syntéza prekurzorov

A) Syntéza halogénarylmetánových derivátov

Príprava halogénmetyl-8-chinolínu Ild sa uskutočnila postupom uvedeným v K.N. Campbell a ďalší, J. Amer. Chem. Soc., (1946), 68, 1844.

Schéma II

b

-->

(llc)

Stručne, kyselina 8-chinolínkarboxylová, Ha, sa konvertovala na zodpovedajúci alkohol, líc, redukciou zodpovedajúceho acylhalidu, Ilb, s redukčným činidlom, ako napríklad s hydridom lítnohlinitým. Ošetrením alkoholu, Ilb, s príslušnou hydrohalogénovou kyselinou vzniká požadovaný halogénový derivát, Ild. Konkrétne uskutočnenie tohto postupuje prezentované príkladom 1 A.

B) Syntéza derivátov arylalkoholov

2-Fenyl-4-hydroxychinolínové deriváty, Hlc, sa pripravili podľa Giardina a ďalší, (J. Med. Chem., (1997), 40, 1794-1807).

Schéma III

R²² & R^21B = alkyl, OH, SH, halogén, NH₂, NO₂.

Benzoylacetamid vzorca (Hla) sa kondenzoval s príslušným anilínom vzorca (Illb) a získaný imin sa cyklizoval s kyselinou polyfosforečnou, čím vznikol zodpovedajúci 2-fenyl-4-hydroxychinolín vzorca (Hlc). Konkrétne uskutočnenie tohto spôsobuje prezentované príkladmi 1B a 1C.

1.2. Syntéza P2

A) Syntéza 4-substituovaného prolínu (kde R² je pripojené na kruh prostredníctvom atómu uhlíka s uvedenou priestorovou štruktúrou):

Boe

sa uskutočňuje, ako je znázornené na schéme IV, podľa postupov opísaných v J. Ezquerra a ďalší (Tetrahedron, (1993), 38, 8665-8678) a C. Pedregal a ďalší (Tetrahedron Lett., (1994), 35, 2053-2056).

SK 286846 Β6

Schéma IV

Stručne, Boc-pyroglutámová kyselina je chránená ako benzylester. Výsledkom ošetrenia so silnou zásadou, ako diizopropylamid litny, po pridaní alkylačného činidla (Br-R²⁰ alebo I-R²⁰), po redukcii amidu a odstránení ochrannej skupiny esteru, sú želané zlúčeniny IVe.

B) Syntéza O-aralkylovaného 4-(Ä)-hydroxyprolínu:

Ak R²⁰ znamená aryl, Het, aralkyl alebo (Ci.₆ alkyl)-Het, spôsob sa môže uskutočňovať postupom opísaným v E.M. Smith a ďalší (J. Med. Chem. (1988), 31, 875-885). Stručne, komerčne dostupný Boc-4(7?)-hydroxyprolín sa ošetrí so zásadou, ako napríklad hydridom sodným alebo K-/BuO, a výsledný alkoxid sa uvedie do reakcie s halogén-R²'’ (Br-R²⁰,1-R²⁰ atď.), čím vzniknú želané zlúčeniny. Konkrétne uskutočnenia tohto postupu sú uvedené v príkladoch 2, 3 a 4B.

C) Alternatívne, ak R²⁰ znamená aryl alebo Het, zlúčeniny je možné pripraviť aj Mitsunobu reakciou (Mitsunobu (1981), Synthesis, január 1-28; Ráno a ďalší, (1995), Tet. Lett. 36(22), 3779-3792; Krchnak a ďalší, (1995), Tet. Lett. 36(5), 62193-6196; Richter a ďalší, (1994), Tet. Lett. 35(27), 4705-4706). Stručne, komerčne dostupný Boc-4(5)-hydroxyprolínmetylester sa ošetrí s príslušným aryl-alkoholom alebo tiolom v prítomnosti trifenyfosfmu a dietylazodikarboxylátu (DEAD) a výsledný ester sa hydrolyzuje na kyselinu. Konkrétne uskutočnenie tohto postupuje uvedené v príklade 4A.

Schéma V

OH A	Ar-OH
	alebo Ar-SH
O

<Va) <Vb)

Alternatívne sa Mitsunobu reakcie môžu uskutočňovať v tuhej fáze (schéma V). Do 96-jamkového bloku syntetizátora Model 396 (advanced ChemTech) sa umiestnia alikvóty na živicu naviazanej zlúčeniny (Va) a pridajú sa rôzne arylalkoholy alebo tioly a príslušné reakčné činidlá. Po inkubovaní sa každý, na živicu naviazaný, produkt (Vb) premyje, vysuší a odštiepi zo živice.

Na pripojenie ďalšej funkčnej skupiny na arylový substituent je možné použiť aj Suzuki reakciu (Miyaura a ďalší, (1981), Synth. Comm. 11, 513; Sato a ďalší, (1989), Chem. Lett., 1405; Watanabe a ďalší, (1992),

Synlett., 207; Takayuki a ďalší (1993), J. Org. Chem. 58, 2201; Frenette a ďalší, (1994), Tet. Lett. 35(49), 9177-9180; Guiles a ďalší, (1996), J. Org. Chem. 61, 5169-5171).

2. Syntéza PI segmentov (2-substituovaná 1-aminocyklopropylkarboxylová kyselina

Syntéza sa uskutočňovala podľa schémy VI.

Schéma VI

PO,C

R' syn k esteru halo (Vla)

a) Stručne, di-chránený malonát Vla a 1,2-dihalogénalkán VIb alebo cyklický sulfát VIc (syntetizovaný podľa K. Burgess a Chun-Yen KE (Synthesis, (1996), 1463-1467) reagujú v zásaditých podmienkach, čím vznikne diester VId.

b) Uskutočňuje sa regionálne selektívna hydrolýza menej skrytého esteru, čim vzniká kyselina Vie.

c) Táto kyselina Vie sa podrobí Curtiusovému preskupeniu, čím vznikne racemická zmes derivátov kyseliny 1-aminocyklopropylkarboxylovej Vlf, ktoré majú R¹ v polohe syn proti karboxylovej skupine. Konkrétne uskutočnenie tejto syntézy je uvedené v príklade 5.

d) , e) Alternatívne, vytvorenie selektívneho esteru z kyseliny Vie s príslušným halidom (P*C1) alebo alkoholom (P*OH) vytvára diester VIg, v ktorom je P* ester kompatibilný so selektívnou hydrolýzou P esteru. Výsledkom hydrolýzy P esteru je kyselina Vlh.

f) Výsledkom Curtiusového preskupenia na Vlh je racemická zmes derivátov kyseliny 1-aminocyklopropylkarboxylovej Vli, v ktorých je R¹ skupina v polohe anti vzhľadom na karboxylovú skupinu. Konkrétne uskutočnenie tejto syntézy je uvedené v príklade 10.

Alternatívna syntéza na prípravu derivátov Vlf (kde R¹ znamená vinyl, syn vzhľadom na karboxylovú skupinu) je opísaná nižšie.

Schéma VII

Výsledkom ošetrenia komerčne dostupného imínu VIIA s 1,4-dihalogén-buténom VHb v prítomnosti zásady, po hydrolýze vzniknutého imínu Vile, je Vlld, ktorý má alkylový substituent v polohe syn vzhľadom na karboxylovú skupinu. Tento postup je ilustrovaný v príklade 11.

Rozdelenie všetkých uvedených enantiomémych zmesí na uhlíku 1 (Vie a Vlld) sa môže uskutočňovať:

1. enzymatickou separáciou (príklad 9 a 13);

2. kryštalizáciou s chirálnou kyselinou (príklad 14) alebo

3. chemickou derivatizáciou (príklad 6).

Po rozdelení je možné stanovovať absolútnu priestorovú štruktúru postupom uvedeným v príklade 7.

Ak je substituent na C2 v polohe anti proti karboxylovej skupine (Vli), rozdelenie a stanovovanie priestorovej štruktúry sa môže uskutočňovať rovnakým spôsobom ako pri enantiomémych zmesiach na uhlíku 1.

Z toho vyplýva, že vynález ďalej zahŕňa spôsob prípravy peptidového analógu vzorca (I), kde PI je substituované zvyškom kyseliny aminocyklopropyl-karboxylovej, ktorý zahŕňa krok: spájania peptidu vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; a APG-P2; s PI medziproduktom vzorca:

alebo kde R¹ znamená C|.₆ alkyl alebo C₂.₆ alkenyl voliteľne substituovaný s halogénom, CPG znamená karboxyl chrániacu skupinu a APG znamená amino chrániacu skupinu a P6 až P2 sú definované.

Nakoniec vynález zahŕňa aj medziprodukt vzorca:

kde R¹ znamená C_k6 alkyl alebo C₂.₆ alkenyl voliteľne substituovaný halogénom, na prípravu zlúčeniny vzorca (I), ako je definované.

Predložený vynález je podrobnejšie ilustrovaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Teploty sú udávané v stupňoch Celzia. Percentá roztokov vyjadrujú vzťah hmotnosti ku objemu a pomery roztokov vyjadrujú vzťah objemu k objemu, ak nie je uvedené inak. Spektrá jadrovej magnetickej rezonancie (NMR) sa zaznamenávali na Bruker 400 MHz spektrometri; chemické posuny (δ) sa zaznamenávali ako diely na milión. Blesková chromatografia sa uskutočňovala na kremičitom géli (SiO₂) podľa Stillovej techniky bleskovej chromatografie (W.C. Still a ďalší, J. Org. Chem. (1978), 43, 2923).

V príkladoch používané skratky zahŕňajú Bn: benzyl; Boe: ŕerc-butyloxy-karbonyl [Me₃COC(O)]; BSA: hovädzí sérový albumín; CHAPS: 3-[(3-cholamido-propyl)-dimetylamónio]-l-propánsulfonát; DBU: 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]undek-7-én; CH₂C1₂=DCM: metylénchlorid; DEAD: dietylazodikarboxylát; DIAD: diizopropylazo-dikarboxylát; DIPEA: diizopropyletylamín; DMAP: dimetylaminopyndín; DCC: 1,3-dicyklohexylkarbodiimid; DME: 1,2-dimetyoxyetán; DMF: dimetylformamíd; DMSO: dimetylsulfoxid; DTT: ditiotreitol alebo treo-l,4-dimerkapto-2,3-butándiol; DPPA: difenylfosforylazid; EDTA: kyselina etyléndiamíntetraoctová; Et: etyl; EtOH: etanol; EtOAc: etylacetát; Et₂O: dietyléter; HATU: [Ο-7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tctrametyluróniumhexafluórfosfát]; HPLC: kvapalná chromatografia s vysokou rozlišovacou schopnosťou; MS: hmotnostná spektrometria (MALDI-TOG: matricou podporená laserová disorpčná ionizácia - čas preletu, FAB: rýchle bombardovanie atómov); LAH: hydrid litnatohlinitý; Me: metyl; MeOH: metanol; MES: kyselina (2-[A-morfolino]etánsulfónová); NaHMDS: bis(trimetylsilyl)amid sodný; NMM: A-metyl-morfolín; NMP: Λ'-metylpyrolidín; Pr: propyl; Succ: 3-karboxypropanoyl; PNA: 4-nitrofenylamino alebo p-nitroanilín; TB AF: tetra-n-butylamóniumfluorid; TBTU: 2-( 1 //-benzotr iazol-1 - y 1)-1,1,3,3 -tetrametyluróniumtetrafluórborát; TCEP: tris(2-karboxyetyl)fosfínhydrochlorid; TFA: kyselina trifluóroctová; THF: tetrahydrofurán; TIS: triizopropylsilán; TLC: chromatografia na tenkej vrstve; TMSE: trimetylsilyletyl; Tris/HCl: hydrochlond tris(hydroxymetyl)ammometánu.

P2 stavebné bloky

Príklad IA

Syntéza brómmetyl-8-chinolínu (1 A)

Br

Ku komerčne dostupnej kyseline 8-chinolínkarboxylovej (2,5 g, 14,4 mmol) sa pridal čistý tionylchlorid (10 ml, 144 mmol). Táto zmes sa hodinu zahrievala na 80 °C pred tým, ako sa za zníženého tlaku oddestiloval nadbytok tionylchloridu. Ku výslednej hnedej tuhej látke sa pridal absolútny EtOH (15 ml), ktorý sa zahrieval 1 hodinu na 80 °C pred tým, ako sa látka skoncentrovala in vacuo. Zvyšok sa rozdelil medzi EtOAc a nasýtený vodný NaHCO₃ a organická fáza sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala, čím vznikol hnedý olej (2,8 g). Tento materiál (približne 14,4 mmol) sa po kvapkách počas 35 minút pridával do LAH (0,76 g, 20,2 mmol)/Et₂O suspenzie, ktorá bola ochladená na -60 °C. Pred tým, ako sa ukončila reakcia, sa reakčná zmes v priebehu 1,5-hodiny pomaly zahriala na -35 °C. Reakcia sa pomaly v priebehu 30 minút zmierňovala s MgSO₄.10H₂O a potom sa zmáčala s THF. Zmes sa rozdelila medzi Et₂O a 10 % vodný NaHCO₃. Organická fáza sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala sa a skoncentrovala sa, čím vznikla žltá tuhá látka (2,31 g, 80 % po 2 krokoch) zodpovedajúca alkoholu. Alkohol (2,3 g, 11,44 mmol) sa rozpustil v AcOH/HBr (20 ml, 30 % roztok od firmy Aldrich) a zahrieval sa na 70 °C počas 2,5-hodiny. Zmes sa skoncentrovala in vacuo do sucha, rozdelila sa medzi EtOAc (100 ml) a nasýtený vodný NaHCO₃, predtým sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala, čím vznikla požadovaná zlúčenina (IA) vo forme hnedej tuhej látky (2,54 g, 100 %).

(1B)

Príklad 1B

Syntéza 2-fenyl-4-hydroxychinolínu (1B)

Komerčne dostupný etylbenzoylacetát (6,00 g, 31,2 mmol) sa zahrieval na 85 °C (utesnená skúmavka) v 75 ml 30 % NH₄OH 2 hodiny. Tuhá látka vytvorená ochladením sa prefiltrovala a refluxovala sa vo vode 2 hodiny. Roztok sa trikrát extrahoval s CH₂C1₂. Organické vrstvy sa spojili, vysušili sa na MgSO₄, prefiltrovali sa a skoncentrovali sa. Žltý zvyšok sa podrobil bleskovej chromatografii na kremičitom géli, eluoval sa 10 zmesou EtOAc : hexán (3 : 7), čím vznikol zodpovedajúci amid vo forme bielej tuhej látky, 1,60 g, 31 % výťažok.

Tento amid (250 mg, 1,53 mmol) sa refluxoval použitím Dean-Stark aparatúry s anilínom (143 mg, 1,53 mmol) a anilín.HCl (10 mg, 0,08 mmol) v toluéne (10 ml) 16 hodín. Roztok sa skoncentroval, aby sa získal hnedý olej, ktorý s zmiešal s kyselinou polyfosforečnou (2 g) a 20 minút sa zahrieval na 135 °C. Reakčná 15 zmes sa vliala do vody a s 5M NaOH sa nastavilo pH na 8. Vodná suspenzia sa dvakrát extrahovala s etylacetátom. Organické vrstvy sa spojili, premyli sa s roztokom NaCl, vysušili sa na MgSO₄, prefiltrovali sa a skoncentrovali sa. Zvyšok sa podrobil bleskovej chromatografii na kremičitom géli, eluoval sa 3 % MeOH v etylacetáte, čím vznikol 2-fenyl-4-hydroxychinolín (1B), 67 mg, 20 % výťažok.

'H NMR (DMSO-d₆) δ 8 8,11 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7,86-7,83 (m, 2 H), 7,77 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,68 (dd, J = 8,7 20 Hz, 1 H), 7,61-7,58 (m, 3 II), 7,35 (dd, J = 8,7 Hz, 1 H), 6,34 (s, 1 H).

Príklad 1C

Syntéza 4-hydroxy-2-fenyl-7-metoxychinolínu (1C)

θ')

260-28CTC zahrievanie

(1C)

4-Hydroxy-2 -fenyl-7-metoxychinolín (e)

Roztok etylbenzoylacetátu (b) (100,0 g, 0,52 mol), nz-anizidínu (a) (128,1 g, 1,04 mol) a 4N zmesi HCl/dioxán (5,2 ml) v toluéne (1,0 1) sa refluxoval 6,25-hodiny v Dean-Stark aparatúre. Ochladený toluénový 30 roztok sa postupne premýval s vodnou 10 % HC1 (2 x 300 ml), IN NaOH (2 x 300 ml), H₂O (300 ml) a soľným roztokom (150 ml). Toluénová fáza sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala sa a skoncentrovala sa za zníženého tlaku, čím vznikla 1,2 : 1,0 zmes esteru c a amidu d (144,6 g, 45 %/38 % surový výťažok), vo forme tmavohnedého oleja. Surový olej sa zahrieval 80 minút na 280 °C, pokiaľ sa destiloval generovaný EtOH. Získaná ochladená tmavá tuhá látka sa rozdrvila na jemný prášok s CH2C1₂ (200 ml). Suspenzia sa prefiltro35 vala a výsledná tuhá látka sa premyla s CH₂C1₂, čím vznikla zlúčenina e (22,6 g, 17 % z a) vo forme béžovej tuhej látky:

'H NMR (DMSO-d₆) δ 8,00 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 7,81-7,82 (m, 2H), 7,57-7,59 (m, 3H), 7,20 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 6,94 (dd, J = 9,0,2,2 Hz, 1 H), 6,26 (s, 1 H), 3,87 (s, 3H),

4-Chlór-2-fenyl-7-metoxychinolín (1 C)

Suspenzia látky e (8,31 g, 33,1 mmol) v POC1₃ (90 ml) sa zahrievala do refluxu 2 hodiny (zahriatím sa získal číry roztok). Reakčná zmes sa skoncentrovala za zníženého tlaku. Zvyšok sa rozdelil medzi IN NaOH (exotermická reakcia, pridávanie 10N NaOH na udržanie vysokého pH) a EtOAc (500 ml). Organická vrstva sa premyla s H₂O (100 ml) a soľným roztokom (100 ml) a potom sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala za zníženého tlaku, čím vznikla zlúčenina 1C (8,60 g, 96 %), vo forme svetložltej tuhej látky. 'H NMR (DMSO-de) δ 8,28-8,30 (m, 2H), 8,20 (s, 1H), 8,10 (d, J=9,l Hz, 1H), 7,54-7,58 (m, 3H), 7,52 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,38 (dd, J=9,l, 2,5 Hz, 1H), 3,98 (s, 3H). Táto reakcia sa opakovala trikrát a vždy s výťažkom 96 až 98 %, čo je významne vyšší výťažok ako 68 % publikovaných v J. Med. Chem. 1997,40,1794.

Príklad 2

Syntéza Box-4(Ä)-(naftalén-l-ylmetoxy)prolínu (2)

Boe

(2)

Komerčne dostupný Boc-4(Ä)-hydroxyprolín (5,00 g, 21,6 mmol) sa rozpustil v THF (100 ml) a ochladil sa na 0 °C. Postupne v priebehu 10 minút sa pridával hydrid sodný (60 % disperzia v oleji, 1,85 g, 45,4 mmol) a suspenzia sa miešala jednu hodinu pri laboratórnej teplote. Potom sa pridal l-(brómmetyl)naftalén (8,00 g, 36,2 mmol) (pripravený ako je opísané v E.A. Dixon a ďalší Can. J. Chem., (1981), 59, 2629-2641) a zmes sa za refluxu zahrievala 18 hodín. Zmes sa vliala do vody (300 ml) a premyla sa s hexánom. Vodná vrstva sa okyslila s 10 % vodnou HC1 a dvakrát sa extrahovala s etylacetátom. Organické vrstvy sa spojili, premyli sa so soľným roztokom, vysušili sa (MgSO₄), prefiltrovali sa a skoncentrovali sa. Zvyšok sa purifikoval bleskovou chromatografiou (49 : 49 : 2 hexán : etylacetát : kyselina octová), čím vznikla zlúčenina uvedená v názve príkladu vo forme bezfarebného oleja (4,51 g, 56 % výťažok).

'H NMR (DMSO-d₆) indikuje prítomnosť dvoch rotamérov: 8,05 (m, 1 H), 7,94 (m, 1 H), 7,29 (d, J=14 Hz, 1H), 7,55-7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (br, s, 1H), 4,12 (dd, J=J=8 Hz, 1H), 3,54-3,42 (m, 2H), 2,45-2,34 (m, 1 H), 2,07-1,98 (m, 1 H) 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9) 9H).

Príklad 3

Syntéza Boc-4(R)-(8-chinolm-metoxy)prolínu (3)

(3)

Boc-4-(J?)-hydroxyprolin (1,96 g, 8,5 mmol) v bezvodnom THF (20 ml) sa pridal do suspenzie NaH (1,4 g, 60 % v oleji, 34 mmol) v THF (100 ml). Táto zmes sa miešala 30 minút predtým, ako sa pridal brómmetyl-8-chinolín z príkladu IA (2,54 g, 11,44 mmol) v THF (30 ml). Reakčná zmes sa zahrievala na 70 °C (5 hodín) predtým, ako sa opatrne odstránil nadbytok NaH s mokrým THF. Reakčná zmes sa in vacuo skoncentrovala a výsledný materiál sa rozpustil v EtOAc a H₂O. Oddelila sa zásaditá vodná fáza a okyslila sa % vodnou HCl na pH približne 5, pričom predtým sa extrahovala s EtOAc (150 ml). Organická fáza sa vysušila (MgSO₄), prefíltrovala a skoncentrovala sa, čím vznikol hnedý olej. Výsledkom purifikácie bleskovou chromatografiou (eluent: 10 % MeOH/CHCl₃) bola želaná zlúčenina vo forme svetložltej tuhej látky (2,73 g, 86 %).

HPLC (97,5 %); 'H-MNR (DMSO-d_ó) má rotamérovú populáciu v pomere 6 : 4, δ 12-11,4 (bs, 1 H), 8,92 (2 x d, J = 4,14 a 4,14 Hz, 1 H), 8,38 (2 x d, J = 8,27 a 8,27 Hz, 1 H), 7,91 (d, J = 7,94 Hz, 1 H), 7,77 (d, J = 7,0 Hz, 1 H), 7,63-7,54 (m, 2H), 5,14 (2 x s, 2H), 4,32-4,29 (m, 1 H), 4,14-4,07 (m, 1 H), 3,52-3,44 (m, 2H), 2,43-2,27 (m, 1 H), 2,13-2,04 (m, 1 H), 1,36 a 1,34 (2 x s, 9H).

Príklad 4A

Príprava Boc-4(Ä)-(7-chlórchinolín-4-oxo)prolínu (4A)

(4A)

Komerčne dostupný Boc-4(S)-hydroxyprolínmetyIester (500 mg, 2,04 mmol) a 7-chlór-4-hydroxychinolin (440 mg, 2,45 mmol) sa umiestnili do suchého THF (10 ml) pri 0 °C. Pridal sa trifenylfosfín (641 mg, 2,95 mmol) a nasledovalo pomalé pridávanie DIAD (426 mg, 2,45 mmol). Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 20 hodín. Potom sa reakčná zmes skoncentrovala pridaním do etylacetátu a extrahovala sa trikrát s IN HCl. Zvýšila sa zásaditosť vodnej fázy s Na₂CO₃ a dvakrát sa extrahovala s etylacetátom. Organické vrstvy sa spojili, vysušili sa na MgSO₄, prefiltrovali sa a skoncentrovali sa, čím vznikol žltý olej. Olej sa purifikoval bleskovou chromatografiou, čím vznikol metylester zlúčeniny 4A vo forme bielej tuhej látky, 498 mg, 58 % výťažok.

Tento metylester (400 mg, 0,986 mmol) sa hydrolyzoval s IM vodným hydroxidom sodným (1,7 ml, 1,7 mmol) v metanole (4 ml) pri 0 °C 3 hodiny. Roztok sa skoncentroval, aby sa odstránil metanol, a neutralizoval sa s IM vodnou HCl. Suspenzia sa skoncentrovala do sucha a pridala sa do metanolu (20 ml), soli sa odfiltrovali a filtrát sa skoncentroval, čím vznikla želaná zlúčenina 4A vo forme tuhej látky, 387 mg, vyp. výťažok.

‘H NMR (DMSO-d₆) (zmes rotamérov približne 1 : 1) δ 8,74 (d, J = 5 Hz, 1 H), 8,13-8,09 (m, 1 H), (s, 1 H), 7,58 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,02 (d, J = 5 Hz, 1 H), 5,265,20 (m, 1 H), (m, 1 H), 3,81-3,72 (m, 1 H), 3,59 (dd, J = = 12,10 Hz, 1 H), 2,41-2,31 (m, 2 H), 1,34 a 1,31 (s, 9H).

Príklad 4B

Syntéza Boc-4(7?)-(2-fenyl-7-metoxychinolín-4-oxo)prolínu (4B)

(4B) l-[(l,l-Dimetyletoxy)karbonyl]-4(7?)-[(7-metoxy-2-fenyl-4-chinolinyl)oxy]-L-prolín (4B)

Terc-butoxid draselný (8,16 g, 72,7 mmol) sa pridával po malých častiach v priebehu 15 minút do roztoku komerčne dostupného 4-(S)-hydroxyprolínu (6,73 g, 29,1 mmol) v DMSO (83 ml), pričom teplota sa udržiavala na 25 °C. Zmes sa miešala 1,5-hodiny pri 25 °C. Do reakčnej zmesi sa pridal chlór-2-fenyl-7-metoxychinolín 1C (8,61 g, 32,0 mmol) v 4 častiach v priebehu 15 minút. Reakčná zmes sa miešala 19 hodín pri teplote 15 °C. Výsledná suspenzia sa vliala do vody (650 ml) a zmes sa premyla s Et₂O (3 x 150 ml), aby sa odstránil nadbytok chlórchinolínu (neskôr sa zistilo, že EtOAc je účinnejší). Vodná vrstva sa okyslila s vodnou IN HC1 (potrebných 38 ml vypočítaného 1,5 eqv., 43,6 ml) na pH 4 až 5. Filtráciou sa izolovala biela tuhá látka, ktorá sa precipitovala. Vlhká tuhá látka sa vysušila za zníženého tlaku na P₂O₅, čím vznikol prolinový derivát 4B (12,6 g, 91 %, obsahuje 2,3 % hmotn. DMSO) vo forme béžovej tuhej látky.

'H NMR (DMSO-d₆) δ (zmes rotamérov 2:1) 8,27 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 8,00, 7,98 (2d, J = 9,2, ~9,2 Hz, 1H), 7,48-7,56 (m, 3H), 7,45, 7,43 (2s, 1 H), 7,39 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1H), 5,53-5,59 (m, 1H), 4,34-4,41 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,76 (široký s, 2H), 2,63-2,73 (m, 1H), 2,32-2,43 (m, 1 H), 1,36,1,33 (2s, 9H).

Pl stavebné bloky

Príklad 5

Syntéza zmesi kyseliny (ÍR, 2R)/(1S,2R) l-amino-2-etylcyklopropylkarboxylovej

ButO₂Cz CO₂tBu (5a)

c) EtjN DPPA benzén potom 2-trimetylsilyle!anol —---------p».

reSux

Me₃Si\Z° H

(5e)

(5f) etyl syn k esteru zmes (RR)/(SR)

a) Do suspenzie benzyltrietylamóniumchloridu (21,0 g, 92,19 mmol) v 50 % vodnom NaOH roztoku (92,4 g v 185 ml II₂O) sa postupne pridal di-rerc-butyl-malonát (20,0 g, 92,47 mmol) a 1,2-dibrómbután (30,0 g, 138,93 mmol). Reakčná zmes sa cez noc silno miešala pri laboratórnej teplote a potom sa pridala zmes ľadu a vody. Surový produkt sa extrahoval s CH₂C1₂ (3x) a postupne sa premýval s vodou (3x) a soľným roztokom. Organická vrstva sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala. Zvyšok sa podrobil bleskovej chromatografii (7 cm, 2 až 4 % Et₂O v hexáne), aby sa získal požadovaný cyklopropánový derivát 5c (19,1 g, 70,7 mmol, 76 % výťažok).

'H NMR (CDClj) δ 1,78-1,70 (m, 1 H), 1,47 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,44-1,39 (m, 1H), 1,26-1,64 (m, 3H), 1,02 (ί, 3H, J=7,6 Hz).

b) K suspenzii íerc-butoxidu (6,71 g, 59,79 mmol, 4,4 dielu) v suchom éteri (100 ml) sa pri 0 °C pridala H₂O (270 pl, 15,00 mmol, 1,1 dielu). Po 5 minútach sa do suspenzie pridal diester 5c (3,675 g, 13,59 mmol) v éteri (10 ml). Reakčná zmes sa miešala cez noc pri laboratórnej teplote, potom sa vliala do zmesi ľadu a vody a premyla sa s éterom (3x). Vodná vrstva sa okyslila s 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej pri 0 °C a extrahovala sa s AcOEt (3x). Spojená organická vrstva sa postupne premývala s vodou (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (Na₂SO₄, fdtrácia, koncentrácia) sa izolovala želaná kyselina 5d vo forme svetložltého oleja (1,86 g, 8,68 mmol, 64 % výťažok).

’H NMR (CDClj) δ 2,09-2,01 (m, 1 H), 1,98 (dd, J= 3,8,9,2 Hz, 1H), (m, 1H), 1,66 (dd, J= 3,0, J= 8,2 Hz, 1H), 1,63-1,56 (m, 1H), 1,51 (s, 9H), 1,0 (t, J= 7,3 Hz, 3H),

c) Ku kyseline 5d (2,017 g, 9,141 mmol) v suchom benzéne (32 ml) sa postupne pridával Et₃N (1,50 ml, 10,76 mmol, 1,14 dielu) a DPPA (2,20 ml, 10,21 mmol, 1,08 dielu). Reakčná zmes sa refluxovala 3,5 hodiny a potom sa pridal 2-trimetylsilyletanol (2,70 ml, 18,84 mmol, 2,0 dielu). Reflux sa udržiaval cez noc a potom sa reakčná zmes nariedila s Et₂O a postupne sa premývala s 10 % roztokom kyseliny citrónovej, vodou, nasýteným vodným NaHCO₃, vodou (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₄, filtrácia, koncentrácia) sa zvyšok purifikoval bleskovou chromatografiou (5 cm, 10 % AcOEt-hexán), aby sa získal želaný karbamát 5e (2,60 g, 7,88 mmol, 84 % výťažok) vo forme svetložltého oleja.

MS (FAB) 330 (MH⁺); ’H NMR (CDCI₃) δ 5,1 (bs, 1H), 4,18-4,13 (m, 2H), 1,68-1,38 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,24-1,18 (m, 1H), 1,00-0,96 (m, 5H), 0,03 (s, 9H).

d) Ku karbamátu 5e (258 mg, 0,783 mmol) sa pridal l,0M TBAF roztok v THF (940 μΐ, 0,94 mmol, 1,2 dielu). Po 4,5 hodine sa pridalo ďalšie množstvo l,0M TBAF (626 μΐ, 0,63 mmol, 0,8 dielu). Reakčná zmes sa cez noc miešala pri laboratórnej teplote, refluxovala sa 30 minút a potom sa nariedila s AcOEt. Roztok sa postupne premýval s vodou (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₄, filtrácia, koncentrácia) sa izoloval želaný amín 5f (84 mg, 0,453 mmol, 58 % výťažok) vo forme svetložltej kvapaliny.

'H NMR (CDC1₃) δ 1,96 (bs, 2H), 1,60-1,40 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 1,31-1,20 (m, 1H), 1,14 (dd, J= 4,1, 7,3 Hz, 1H), 1,02 (dd, J= 4,1,9,2 Hz, 1H), 0,94 (t, J= 7,3 Hz, 3H).

Príklad 6

Chemické rozdelenie rerc-butyl-(lR,2Ä)/(15,2R)l-amino-2-etylcyklopropyl-karboxylátu (z príkladu 5)

Izoméry oddelené stĺpcovou chromatografiou

RR izomér SR izomér

Zlúčenina 5e z príkladu 5 (8,50 g, 25,86 mmol) sa ošetrovala s IM TBAF/THF (26 ml) za refluxu 45 minút. Ochladená reakčná zmes sa zriedila s EtOAc, premyla sa s vodou (3x) a soľným roztokom (lx), potom sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a odparovala, čím vznikol voľný amín vo forme svetložltého oleja. Voľný amín sa rozpustil v bezvodnom CH₂C1₂ (120 ml) a postupne sa pridal NMM (8,5 ml, 77,57 mmol), zlúčenina 2 (príklad 2) (10,08 g, 27,15 mmol) a HATU (11,79 g, 31,03 mmol). Reakčná zmes sa cez noc miešala pri laboratórnej teplote a potom sa spracovala, ako je opísané. Surová diastereoméma zmes sa oddelila bleskovou chromatografiou (eluent-hexán: Et₂O; 25 : 75), čím vznikol dipeptid 6a (menej polárny elučný bod) vo forme bielej peny (4,42 g; 64 % teoretického výťažku) a 6b (polámejší elučný bod) vo forme slonovinobielej peny (4 g, 57 % teoretického výťažku). V tomto čase sa oddelili oba izoméry, ale ich absolútna priestorová štruktúra ešte nebola známa.

Príklad 7

Stanovenie absolútnej priestorovej štruktúry zlúčenín 6a a 6b koreláciou so známym terc-butyl( 1 R-amino-2R-etylcyklopropyl)karboxylátom

Priame porovnanie pomocou TLC, HPLC a NMR

Prof. A. Charette z University of Montreal poskytol zlúčeninu 7a, ktorá má uvedenú priestorovú štruktúru, ktorá bola stanovená rontgenovou kryštalografiou (J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 12721). Zlúčenina 7a (13,2 mg, 0,046 mmol) sa rozpustila v IM HCl/EtOAc (240 μΐ) a miešala sa približne 48 hodín. Zmes sa odparovala do sucha, čim vznikla zlúčenina 7b vo forme svetložltej pasty, ktorá sa spojila so zlúčeninou 2(18 mg, 0,049 mmol), ako je opísané v príklade 6, použitím NMM (20,3 μΐ, 0,185 mmol) a HATU (21,1 mg, 0,056 tnmol) v CH₂CL. Surový materiál sa purifikoval bleskovou chromatografiou (eluent-hexán:Et₂O; 50 : 50), čím vznikol dipeptíd 7c vo forme oleja (7,7 mg; 31 %). Prostredníctvom TLC, HPLC a NMR porovnávania sa zistilo, že dipeptid 7c je identický s menej polárnou zlúčeninou 6a získanou v príklade 6, a tak sa identifikovala absolútna priestorová štruktúra 6a ako (1R,2R).

Príklad 8

Príprava kyseliny (lR,2R)/(lS,2R)-l-Boc-amino-2-etylcyklopropylkarboxylovej (8a) (5e)

N COJBu

H ²

1. TFA, 0°C

2. vod.NaOH, THF (Boc)₂O

Karbamát 5a z príkladu 5 (2,6 g, 7,88 mmol) sa miešal 40 minút v TFA pri 0 °C. Zmes sa potom skoncentrovala a nariedila s THF (10 ml). Pridal sa vodný roztok NaOH (700 mg, 17,5 mmol v 8,8 ml H₂O) a následne THF (13 ml) roztok (Boc)₂O (2,06 g, 9,44 mmol, 1,2 dielu). Reakčná zmes sa miešala cez noc pri laboratórnej teplote (pH sa udržiavalo na 8 pridávaním 10 % vodného roztoku NaOH, ak to bolo potrebné), potom sa nariedila s H₂O, premyla sa s Et₂O (3x) a okyslila sa pri 0 °C s 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej. Vodná vrstva sa extrahovala s EtOAc (3x) a postupne sa premývala s H₂O (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₄, filtrácia a koncentrácia) sa izolovala Boc-chránená aminokyselina (8a) (788 mg, 3,44 nrmol, 44 % výťažok).

'H NMR (CDClj) δ 5,18 (bs, 1H), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,55-1,42 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,32-1,25 (m, 1H), 0,99 (t, 3H, J= 7,3 Hz),

Príprava metylesteru kyseliny (1R,2R)/(1S,2R)-l-Boc-amino-2-etylcyklopropyl-karboxylovej (8b)

CHgN/E^O

Et₂O

O’C

(8a) (8b)

Boe derivát 8a (0,30 g, 1,31 mmol) sa rozpustil v Et₂O (10 ml) a pôsobilo sa naň čerstvo pripraveným diazometánom v Et₂O pri 0 °C, pokiaľ neostala žltá farba mierneho nadbytku diazometánu. Po 20 minútovom miešaní pri laboratórnej teplote sa reakčná zmes skoncentrovala do sucha, čím vznikla 8b vo forme čistého bezfarebného oleja (0,32 g, 100 %).

'H NMR (CDCIj) δ 5,1 (bs, 1H), 3,71 (s, 3H), 1,62-1,57 (m, 2H), 1,55 (s, 9H), 1,53-1,43 (m, 1H), 1,28-1,21 (m, 2H), 0,95 (t, J = 7,3 Hz, 3H),

Príklad 9

Enzymatické rozdelenie metyl-(lÄ,2R)/(lS,2R)-Boc-l-amino-2-etylcyklopropyl-karboxylátu

zmes (S,R)/(R.R)

* Analýza prostredníctvom HPLC použitím ChiralceL OD-H kolóny ** Iné, tiež prijateľné estery (napr. Et)

a) Enantioméma zmes metylesteru kyseliny (lR,2R)/(15,2Ä)-l-Boc-amino-2-etylkarboxylovej z príkladu 8 (0,31 g, 1,27 mmol) sa rozpustila v acetóne (3 ml) a potom sa nariedila vodou (7 ml), pričom sa rýchlo miešala. PH roztoku sa nastavilo na 7,5 0,05M vodným NaOH pred tým, ako sa pridala Alcalase® [2,41 extrakt od firmy Novo Nordisk Industrials] (300 mg). Počas inkubovania sa pH stabilizovalo s NaOH a bol nastavený pH stat, aby sa monitorovalo pridávanie NaOH roztoku. Po 40 hodinách sa zmes nariedila s EtOAc a H₂O (s 5 ml nasýteného NaHCO₃) a oddelili sa fázy. Vodná fáza sa okyslila s 10 % vodnou HC1 a extrahovala sa s EtOAc, vysušila sa (MgSO₄), prefiltrovala sa a skoncentrovala sa, čím vznikla kyselina 9a (48,5 mg). Stanovila sa absolútna priestorová štruktúra použitím korelácie opísanej v príkladoch 6 a 7.

b) Po pôsobení diazometánu v Et₂O na alikvotu kyseliny 9a, aby vznikol metylester, nasledovala analýza prostredníctvom HPLC použitím chirálnej kolóny [Chiralcel® OD-H, 2,5 % izopropanol/hexán, izokratický] majúci pomer 51:1 (15,27?) izoméru.

a’) Organická fáza sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala, čím vznikli nehydrolyzované estery (0,248 g). Tento materiál sa znova podrobil uvedenému enzymatickému postupu, až kým pH neostalo stabilné (98 hodín). Po rovnakej extrakcii ako predtým sa izolovalo 0,146 mg (100 %) nehydrolyzovaného esteru. Analýza prostredníctvom HPLC využívajúcej chirálnu kolónu dokázala pomer >50 : 1 v prospech (1Ä,27?) izoméru.

b’) Vodná fáza sa okyslila s 10 % vodnou HC1 a extrahovala sa s EtOAc, vysušila sa (MgSO₄), prefiltrovala sa a skoncentrovala sa, čím vznikol analóg kyseliny (82 mg). Na časť tohto materiálu sa pôsobilo diazometánom a potom sa analyzoval prostredníctvom HPLC použitím chirálnej kolóny, ako bolo uvedené, pričom sa vykázal pomer 65 : 1 v prospech (15,27?) derivátu.

Príklad 10

Syntéza kyseliny (1 /?, 25)/(15,2S)l-amino-2-etylcyklopropylkarboxylovej

etyl syn k esteru

C) DBU,

CH₃CN

RT

d) TFA, Ch^CL, —--------RT

e) DPPA benzén potom 2-trimetyfsily!etanol —-----reíliÄ . .

alylOOC (10b)

f)1,OMTBAF

------------------------------------1

THF

RT až reflux

(10d) alylOOC

etyl anti ku kyseline (RS) / (SS)

Vychádza sa z kyseliny 5d opísanej v príklade 5:

c) K 5d (1,023 g, 4,77 mmol) v CH₃CN (25 ml) sa postupne pridával DBU (860 μΐ, 5,75 mmol, 1,2 dielu) a alkyl bromid (620 μΐ, 7,16 mmol, 1,5 dielu). Reakčná zmes sa miešala 4 hodiny pri laboratórnej teplote a potom sa skoncentrovala. Zvyšok sa nanedil s Et₂O a postupne sa premýval s 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej (2x), H₂O, nasýteným vodným NaHCO₃, H₂O (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₄, filtrácia a koncentrácia) sa izoloval želaný ester 10a (1,106 g, 3,35 mmol, 91 % výťažok) vo forme bezfarebného oleja.

MS (FAB) 255 (MH⁺); 'H NMR (CDC1₃) δ 5,96-5,86 (m, 1 H), 5,37-5,22 (m, 211), 4,70-4,65 (m, 1 H), 4,57-4,52 (m, 1 H), 1,87-1,79 (m, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,45-1,40 (m, 1H), 1,33-1,24 (m, 3H), 1,03 (t, J=7,3 Hz, 3H).

d) K esteru 10a (1,106 g, 4,349 mmol) v suchom CH₂C1₂ (5 ml) sa pri laboratórnej teplote pridal TFA (5 ml). Reakčná zmes sa 1,5-hodiny miešala a potom sa skoncentrovala, čím vznikla 10b (854 mg, 4,308 mmol, 99 % výťažok).

MS (FAB) 199 (MH⁺); 'H NMR (CDC1₃) δ 5,99-5,79 (m, 1H), 5,40-5,30 (m, 2H), 4,71-4,62 (m, 2H), 2,22-2,00 (m, 2H), 1,95-1,88 (m, 1H), 1,84-1,57 (m, 2H), 0,98 (t, J= 7,3 Hz, 3H).

e) K 10b (853 mg, 4,30 mmol) v suchom benzéne (14,8 ml) sa postupne pridával Et₃N (684 μΐ, 4,91 mmol, 1,14 dielu) a DPPA (992 μΐ, 4,60 mmol, 1,07 dielu). Reakčná zmes sa refluxovala 4,5 hodiny a potom sa pridal 2-trimetylsilyl-etanol (1,23 ml, 8,58 mmol, 2,0 dielu). Reflux sa udržiaval cez noc a potom sa reakčná zmes nariedila s Et₂O a postupne sa premývala s 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej, vodou, nasýteným vodným NaHCO₃, vodou (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₄, filtrácia a koncentrácia) sa zvyšok podrobil bleskovej chromatografii (5 cm, 10 až 15 % AcOEt-hexán), čím vznikol karbamát 10c (1,212 g, 3,866 mmol, 90 % výťažok) vo forme svetložltého oleja.

MS (FAB) 314 (MH⁺); 'H NMR (CDC1₃) δ 5,93-5,84 (m, 1H), 5,32-5,20 (m, 2H), 5,05 (bs, 1H), 4,60-4,56 (m, 2H), 4,20-4,11 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 3H), 1,39-1,22 (m, 1H), 1,03 (t, J= 7,6 Hz, 3H), 0,96-0,86 (m, 1H), 0,04 (s, 9H).

f) Ku karbamátu 10c (267 mg, 0,810 mmol) sa pridal 1,OM TBAF roztok v THF (1,62 ml, 1,62 mmol, 2,0 dielov). Reakčná zmes sa miešala cez noc pri laboratórnej teplote, refluxovala sa 30 minút a potom sa nariedila s AcOEt. Roztok sa postupne premýval s vodou (2x) a soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₄, filtrácia a koncentrácia) sa izoloval požadovaný amín 1 Od (122 mg, 0,721 mmol, 89 % výťažok) vo forme svetložltej kvapaliny.

‘H NMR (CDC1₃) δ 5,94-5,86 (m, 1H), 5,31-5,22 (m, 2H), 4,58 (d, J= 5,7 Hz, 2H), 1,75 (bs, 2H), 1,61-1,53 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J= 7,3 Hz, 3H), 0,70-0,62 (m, 1H).

Príklad 11

Syntéza e ty 1 - (17?,25)/( 15,25)-1 -amino-2-vinylcyklopropylkarboxylátu (na)

Br (iib)

a) BuOK

THF

-78'CažO’C

vinyl syn k esteru

CO₂Et (ne)

b)1Nvod.HCI

Et,0

c) NaHCO₃

d) 4 N HCI/dioxán

a) K THF roztoku (180 ml) íerc-butoxidu draselného (4,62 g, 41,17 mmol, 1,1 dielu) sa pri -78 °C pridal komerčne dostupný imín 1 la (10,0 g, 37,41 mmol) v THF (45 ml). Reakčná zmes sa zahriala na 0 °C a miešala sa pri tejto teplote 40 minút. Zmes sa potom ochladila späť na -78 °C, aby sa mohol pridať 1,4-dibrómbutén 11b (8,0 g, 37,40 mmol) a potom sa miešala pri 0 °C hodinu a ochladila sa späť na -78 °C, aby sa pridal íerc-butoxid draselný (4,62 g, 41,17 mmol, 1,1 dielu). Reakčná zmes sa nakoniec miešala ešte jednu hodinu pri 0 °C a skoncentrovala sa, čím vznikla zlúčenina 1 lc.

b) , c), d) 11c sa vstrebala do Et₂O (265 ml) a ošetrila sa s IN vodným roztokom HC1 (106 ml). Po 3,5-hodine sa pri laboratórnej teplote vrstvy oddelili a vodná vrstva sa premyla s Et₂O (2x) a zvýšilo sa pH s nasýteným vodným roztokom NaHCO₃. Požadovaný amín sa extrahoval s Et₂O (3x) a spojený organický extrakt sa premyl so soľným roztokom. Po zvyčajnom ošetrení (MgSO₊, filtrácia a koncentrácia) sa zvyšok ošetril so 4N roztokom HC1 v dioxáne (187 ml, 748 mmol). Po skoncentrovaní sa izolovala hydrochloridová soľ 1 ld vo forme hnedej tuhej látky (2,467 g, 12,87 mmol, 34 % výťažok).

‘H NMR (CDC1₃) δ 9,17 (bs, 3H), 5,75-5,66 (m, 1H), 5,39 (d, J= 17,2 Hz, 1H), 5,21 (d, J= 10,2 Hz, 1H), 4,35-4,21 (m, 2H), 2,77-2,70 (m, 1H), 2,05 (dd, J= 6,4-10,2 Hz, 1H), 1,75 (dd, > 6,4-8,3 Hz, 1H), 1,33 (t, J= = 7, 0 Hz, 3H).

Príklad 12

Príprava etylesteru kyseliny (17?,2S)/(15,25)-l-Boc-amino-2-vinylcyklo-propylkarboxylovej

Cl H N+ CO.Et (11 d) (Boc)₂O

DIPEA

DMAP

THF (12a) viny! syn k esteru

Hydrochloridová soľ 1 ld (1,0 g, 5,2 mmol) a (Boc)₂O (1,2 g, 5,7 mmol) sa rozpustili v THF (30 ml) a ošetrili sa s DMAP (0,13 g, 1,04 mmol, 0,2 dielu) a diizopropyletylamínom (2,8 ml, 15,6 mmol). Reakčná zmes sa miešala 24 hodín predtým, ako bola zriedená s EtOAc (40 ml) a postupne sa premývala s nasýteným vodným NaHCO₃, 5 % vodnou HC1 a nasýteným voľným roztokom. Organická fáza sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala sa a skoncentrovala sa, čím vznikla po purifikácii bleskovou chromatografiou (15 % EtOAc/hexán) 12a (0,29 g, 23 %).

'H NMR /CDC1₃) δ 5,80-5,72 (m, 1H), 5,29-5,25 (dd, J = 17,2, 17,2 Hz, 1H), 5,24-5,1 (bs, 1H), 5,10 (dd, J = =9,2, 9,2 Hz, 1H), 4,22-4,13 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 1H), 1,85-1,73 (bs, 1H), 1,55-1,5 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,26 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

Príklad 13

Enzymatické rozdelenie etyl-( 1 R,25)/( 15,25)-1 -amino-2-vinylcyklopropylkarboxylátu

a) alkaláza

NaOH

vinyl syn k esteru (13a)(S,S)

* Analýza prostredníctvom HPLC použitím Chiralcel® OD-H kolóny

a) Racemický derivát 12a (0,29 g, 1,14 mmol) sa rozpustil v acetóne (5 ml) a nariedil sa s H₂O (10 ml). PH sa nastavilo s 0,2N vodným NaOH na 7,2 predtým, ako sa pridala Alcalase® (300 mg). Aby sa počas inkubovania udržiavalo pH konštantné, pridával sa NaOH roztok pH stat titrovaním počas 9 dní, pokiaľ sa nepridalo teoretické množstvo zásady. Po extrakcii kyselina/zásada, ako bola opísaná v príklade 9, sa izoloval nehydrolyzovaný ester (0,15 g, 100 %) a hydrolyzovaný materiál (0,139 g, 95 %). Analýza nehydrolyzovaného esteru prostredníctvom HPLC použitím chirálnej kolóny mala pomer 43 : 1 v prospech želanej zlúčeniny 13c. Zlúčenina 206 (kde R¹ znamená vinyl, tabuľka 2) sa hydrogenovala (10,8 mg, 0,015 mmol v 1 ml EtOH s približne 1 ml 20 % Pd(OH)₂ pri tlaku 101 325 Pa H₂ 45 minút), čím sa získala zlúčenina 214 (kde R¹ znamená etyl, tabuľka 2). Zlúčenine 214 bola priradená (1 R,2R) priestorová štruktúra na základe chemickej korelácie opísanej v príkladoch 6 a 7, z čoho vyplýva, že zlúčenina 206 (R¹ znamená vinyl) má rovnakú absolútnu konfiguráciu ako 13c (aj keď 1R,2S, pretože R¹ znamená vinyl).

Podmienky HPLC analýzy: Chiralcel® OD-H (4,6 mm x 25 cm), izokratické podmienky použitím mobilnej fázy 2,5 % zmesi izopropanol/hexán.

Príklad 14

Rozdelenie (17?,25)/(15,25)-l-amino-2-vinylcyklopropylkarboxylátu kryštalizáciou s kyselinou dibenzoyl-D-vínnou

(14)

Do roztoku surového racemického (15,25 a 17?,2S) etyl-l-amino-2-vinyl-cyklopropylkarboxylátu [získaný z /V-(difcnylmetylén)glycinetylcstcru (25,0 g, 93,5 mol), ako je opísané v príklade 13] v EtOAc (800 ml) sa pridala kyselina dibenzoyl-D-vínna (33,5 g, 93,5 mol). Zmes sa zahriala do refluxu, nechala sa 15 minút pri laboratórnej teplote a potom sa ochladila na 0 °C. Po 30 minútach sa získala biela tuhá látka. Tuhá látka sa prefiltrovala, premyla sa s EtOAc (100 ml) a vysušila sa na vzduchu. Tuhá látka sa rozsuspendovala v acetóne (70 ml), sonifikovala sa a prefiltrovala sa (3x). Tuhá látka sa potom rekryštalizovala dvakrát v horúcom acetóne (zber A). Materské lúhy sa skoncentrovali a zvyšok sa trikrát rekryštalizoval v horúcom acetóne (zber B). Obe zozbierané amorfné biele tuhé látky kyseliny dibenzoyl-D-vínnej sa spojili (5,53 g) a rozsuspendovali sa v zmesi Et₂O (250 ml) a nasýteného NaHCO₃ roztoku (150 ml). Organická vrstva sa premyla so soľným roztokom, vysušila sa (MgSO₄) a prefiltrovala sa. Filtrát sa nariedil s IN HCI/EtjO (100 ml) a skoncentroval sa za zníženého tlaku. Olejový zvyšok sa odparoval s CC1₄, čím sa získal hydrochlorid etyl-l(7?)-amino-2(5)-vinylcyklopropánkarboxylátu (940 mg, 11 % výťažok) vo forme bielej hygroskopickej tuhej látky, ktorej sa priradila absolútna priestorová štruktúra koreláciou so zlúčeninou 13c podľa príkladu 13.

[a]²⁵D +39,5 °C (c 1,14 MeOH); [oc]^2S365 +88,5 °C (c 1,14 MeOH); 'H NMR (DMSO-d₆) δ 9,07 (široký s, 2H), 5,64 (ddd, J=17,2, 10,4, 8,7 Hz, 1H), 5,36 (dd, J=17,2,l,6 Hz, 1H), 5,19 (dd, J=10,4, 1,6 Hz, 1H), 4,24-4,16 (m, 2H), 2,51-2,45 (m, vrcholy skryté prostredníctvom DMSO, 1H), 1,84 (dd, J=10,0, 6,0 Hz, 1H), 1,64 (dd, J=8,3, 6,0 Hz, 1H), 1,23 (t, J=7,l Hz, 3H); MS (ESI) m/z 156 (MH)+; enantioméma čistota sa stanovila na 91 % ee prostredníctvom HPLC analýzy (CHIRALPAK AS® kolóna, Hex:i-PrOH) Boe derivátu (príklad 13).

P4-P2 stavebné bloky

Príklad 15

Syntéza segmentu: Ac-Chg-Chg-Pro (4(Ä)-naftalén-l-ylmetoxy)-OH (15 g)

zlúčenina z príkladu 2 (15a) (15b)

(15d) (15e)

Zlúčenina 15a (rovnaká ako zlúčenina 2 z príkladu 2) (4,45 g, 11,98 mmol) sa rozpustila v bezvodnom CH₃CN (60 ml). Postupne sa pridal DBU (2,2 ml, 14,38 mmol) a alkylbromid (1,1 ml, 13,18 mmol) a reakčná zmes sa miešala 24 hodín pri laboratórnej teplote. Zmes sa skoncentrovala, výsledný olej sa nariedil s EtOAc a vodou a postupne sa premýval s vodou (2x) a soľným roztokom (lx). EtOAc vrstva sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a odparovala do sucha. Žltý olej sa purifikoval bleskovou chromatografiou (eluent : : hexán : EtOAc; 90 : 10 až 85 : 15), čím vznikol produkt 15b vo forme žltého oleja (24,17 g, 85 % výťažok). MS (FAB) 412 MH⁺ 'H NMR (CDClj), zmes rotamérov približne 1 : 2, δ (d, J= 8Hz, 1H), 7,87 (d, J= 8Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,55-7,41 (m, 4H), 5,95-5,85 (m, 1H), 5,34-5,21 (m, 2H), 5,034,88 (m, 2H), 4,70-4,56 (m, 2H), 4,48 & 4,39 (t, J= 8,15Hz, 1H), 4,28-4,23 (m, 1H), 3,81-3,55 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, 1H), 2,13-2,05 (m, 1H), 1,44 & 1,41 (s, 9H),

Na zlúčeninu 15b (2,08 g, 5,05 mrnol) sa 30 minút pôsobilo pri laboratórnej teplote so 4N HCl/dioxán. Výsledkom evaporácie do sucha bol zodpovedajúci amín-HCl vo forme oleja. Amín-HCl 15c sa rozpustil v bezvodnom DCM (25 ml) a postupne sa pridal NMM (2,2 ml, 20,22 mmol), Boc-Chg-OH»H₂O (1,53 g, 5,56 mmol) a TBTU (1,95 g, 6,07 mmol). Reakčná zmes sa cez noc miešala pri laboratórnej teplote a potom sa nariedila s EtOAc a postupne sa premývala s 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej (2x), nasýteným vodným NaHCO₃ (2x), vodou (2x) a soľným roztokom (1 x). EtOAc vrstva sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala sa a odparovala sa do sucha, čím vznikol surový produkt 15d vo forme žltobielej peny (približne 2,78 g, 100 % výťažok).

MS (FAB) 551,4 MH⁺ ’H NMR (CDC1₃), δ 8,03 (d, J= 8Hz, 1H), 7,86 (b d, J= 8,5Hz, 1H), 7,84 (d, J= 8Hz, 1H), 7,567,40 (m, 4H), 5,92-5,85 (m, 1H), 5,31 (dd, J= 1,17Hz, 1H), 5,22 (dd, J= 1,10Hz, 1H), 5,17 (d, J= =9Hz, 1H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,91 (d, J= 12Hz, 1H), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,31-4,27 (m, 2H), 4,16 (b d, J= =11 Hz, 1H), 3,71 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2,472,41 (m, 1H), 2,08-1,99 (m, 1H), 1,85-1,63 (m, 5H), 1,44-1,40 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,28-1,00 (m, 5H).

Na surový dipeptid 15d (približne 5,05 mmol) sa pôsobilo 4N HCl/'dioxánom (25ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15c. Surová hydrochloridová soľ sa pripojila na Boc-Chg-OH«H₂O (1,53 g, 5,55 mmol) s NMM (2,22 ml, 20,22 mmol) a TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) v DCM (25 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15d, aby vznikol surový tripeptid 15e vo forme žltej olejovitej peny. Surový materiál sa purifikoval bleskovou chromatografiou (eluent: hexán : EtOAc; 80 : 20 až 75 : 25), čím vznikol tripeptid 15e vo forme bielej peny (2,75 g; 79 % výťažok po 2 krokoch).

MS (FAB) 690,5 MH⁺, ’H NMR (CDClj), prevažne jeden rotamér, δ 8,06 (d, J= 8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= =8,5Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,41 (d, J= 8,5Hz, 1H), 5,92-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J=l,17Hz, 1H), 5,23 (dd, J= 1, 10,5Hz, 1H), 5,04 (d, J= 12Hz, 1H), 4,98 (b d, J= 7Hz, 1H), 4,93 (d, J=12Hz, 1H), 4,63-4,58 (m, 4H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,10-4,07 (m, 1H), 3,90-3,84 (m, 1H), 3,72 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2,48-2,40 (m, 1H), 2,07-1,99 (m, 1H), 1,83-1,55 (m, 12H), 1,43 (s, 9H), 1,23-0,89 (m, 10H),

Na tripeptid 15e (2,75 g, 3,99 mmol) sa pôsobilo 4N HCl/dioxánom (20 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15c. Surová hydrochloridová soľ sa rozpustila v bezvodnom DCM (20 ml). Postupne sa pridával NMM (1,75 ml, 15,94 mmol) a anhydrid kyseliny octovej (752 μΐ, 7,97 mmol). Reakčná zmes sa cez noc miešala pri laboratórnej teplote a potom sa nanedila s EtOAc. Organická vrstva sa premývala postupne s 10 % vodnou kyselinou citrónovou (2x), nasýteným vodným NaHCO₃ (2x), vodou (2x) a soľným roztokom (lx), vysušila sa (MgSO₄), prefiltrovala sa a odparovala sa do sucha, čím vznikol surový tripeptid 15f vo forme bielej peny (2,48 g, 98 % výťažok).

MS (FAB) 632,4 MH+I. ’H NMR (CDC1₃), prevažne jeden rotamér, δ 8,06 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= =8Hz, 1H), 7,83 (d, J= 8Hz, 1H), 7,58-7,40 (m, 4H), 6,36 (d, J= 9Hz, 1H), 6,01 (d, J= 9Hz, 1H), 5,94-5,83 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 5,25-5,21 (m, 1H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12Hz, 1H), 4,64-4,57 (m, 4H), 4,30-4,23 (m, 2H), 4,12-4,08 (m, 1H), 3,73 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2,49-2,42 (m, 1H), 2,08-2,01 (m, 1H), 1,99 (s, 3H), 1,85-1,53 (m, 11H), 1,25-0,88 (m, 11H).

Surový tripeptid 15f (2,48 g, 3,93 mmol) sa rozpustil v bezvodnej zmesi CH₃CN : DCM (20 ml). Postupne sa pridal trifenylfosfín (53,5 mg, 0,200 mmol) a tetrakis(trifenylfosfín)-paládiový (0) katalyzátor (117,9 mg, 0,102 mmol) a nasledoval pyrolidín (353,9 μΐ, 4,24 mmol). Reakčná zmes sa miešala 18 hodín pri laboratórnej teplote. Potom sa odparovalo rozpúšťadlo. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc a 10 % vodnej kyseline citrónovej a potom sa premyl dvakrát s 10 % vodnou kyselinou citrónovou, vodou (2x) a soľným roztokom (lx). Organická vrstva sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a odparovala. Surový produkt sa rozotrel v zmesi Et₂O : : DCM (85 : 15), čím po filtrácii vznikol tripeptid 15 g vo forme bielej tuhej látky (2,09 g, 90 % výťažok). MS (FAB) 592,4 MH⁺ 614,3 (M+Na)¹. Ή NMR (CDC1₃), prevažne jeden rotamér, δ 8,08 (d, J= 8Hz, 1H), 7,93 (b d, J= 9Hz, 1H), 7,88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,57-7,41 (m, 4H), 6,47 (d, J= 8,5Hz, 1H), 5,05 (d, J= 12,5Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12,5Hz, 1H), 4,73 (t, J= 9,5, 19Hz, 1H), 4,44-4,35 (m, 2H), 4,26 (b s, 1H), 4,19 (d, J= 11,5Hz, 1H), 3,75 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2,47 (b dd, J= 7,5, 13,5Hz, 1H), 2,20-2,11 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,88-1,41 (m, 11H), 1,30-0,80 (11H).

Príklad 16

Syntéza segmentu Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-naftalén-l-ylmetoxy)-OH (16e)

(16a) (16b)

(16c)

(16e)

Na zlúčeninu 16a (2,89 g, 7,02 mmol) sa pôsobilo so 4N zmesou HCl/dioxán (30 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15c. Surová hydrochloridová soľ sa pripájala na Boc-Val-OH (1,53 g, 7,73 mmol) s NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) a TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) v DCM (35 ml) 3,5 hodiny, ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15 d, aby vznikol surový dipeptid 16b vo forme slonovinovobielej olej ovitej peny (približne 3,60 g, 100 % výťažok).

MS (FAB) 509,3 MH’ 511,3 MH⁺ 533,2 (M+Na)⁺. 'H NMR (CDC1₃) δ 8,04 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= =7IIz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 4H), 5,93-5,85 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 5,24-5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J= 12Hz, 1H), 4,92 (d, J= 12Hz, 1H), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,31-4,26 (m, 2H), 4,11-4,09 (m, 1H), 3,72 (dd, J= 4,11 Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,07-1,99 (m, 1H), 1,44-1,36 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,01 (d, J= =7Hz, 3H), 0,93 (d, J= 7Hz, 3H),

Na surový dipeptid 16b (približne 7,02 mmol) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán (30 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15c. Surová hydrochloridová soľ sa pripájala na Boc-Chg-OH«H₂O (2,13 g, 7,73 mmol) s NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) a TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) v CH₂C1₂ (35 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15d, aby vznikol surový tripeptid 16c vo forme slonovinovobielej peny (približne 4,6 g, 100 % výťažok).

MS (FAB) 648,5 MH' 672,4 (M+Na)⁺. Ή NMR (CDC1₃) δ 8,06 (b d, J=8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,82 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,46 (b d, J= 8,5Hz, 1H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J= 1,17Hz, 1H), 5,23 (dd, J= 1, 10,5Hz, III), 5,03 (d, J= 12Hz, 1H), 5,00-4,97 (m, 1H), 4,93 (d, J=, 12Hz, 1H), 4,63-4,59 (m, 4H), 4,29-4,27 (m, 1H), 4,10-4,07 (m, 1H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,72 (dd, J= 5,11Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,10-1,99 (m, 1H), 1,76-1,57 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,20-0,92 (m, 6H), 1,00 (d, J= 7Hz, 3H), 0,93 (d, J= =7Hz, 3H).

Na surový tripeptid 16c (približne 7,02 mmol) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán (30 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15c. Na surovú hydro-chloridovú soľ sa ďalej pôsobilo anhydridom kyseliny octovej (1,33 ml, 14,05 mmol) a NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) v CH₂C1₂ (35 ml), ako bolo opísané pri syntéze zlúčeniny 15d. Surový produkt sa purifikoval bleskovou chromatografiou (eluent: hexán : EtOAc; 30 : 70), čím vznikol acetylovaný chránený tripeptid 16d vo forme bielej peny (3,39 g, 81 % výťažok po 3 krokoch). MS (FAB) 590,3 MH' 592,4 MH⁺ 614,4 (M+Na)⁺ 'H NMR (CDC1₃), prevažne jeden rotamér, δ 8,06 (d, J= 8Hz, 1H), 7,88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,83 (d, J= 8Hz, 1H), 7,58-7,41 (m, 4H), 6,37 (d, J= 9Hz, 1H), 5,97 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J= =l,17Hz, 1H), 5,24 (dd, J= 1, 10,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12Hz, 1H), 4,66-4,57 (m, 4H), 4,31-4,22 (m, 2H), 4,11-4,05 (m, 1H), 3,73 (dd, J= Hz, 1H), 2,50-2,43 (m, 1H), 2,09-2,01 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,68-1,55 (m, 5H), 1,15-0,89 (m, 6H), 0,99 (d, J= 7IIz, 3H), 0,91 (d, J= 7Hz, 3H),

Z acetylovaného tripeptidu 16d (3,39 g, 5,73 mmol) sa odstránila ochranná skupina prostredníctvom tetrakis(trifenylfosfín)-paládiového (0) katalyzátora (172,1 mg, 0,149 mmol) s trifenylfosfmom (78,1 mg, 0,298 mmol) a pyrolidínom (516 μΐ, 6,19 mmol) v 1 : 1 zmesi bezvodného CH₃CN : DCM (30 ml), ako bolo opísa né pri syntéze zlúčeniny 15g. Surový svetložltý penový produkt sa rozotrel v zmesi Et₂O : DCM (85 : 15), čím po filtrácii vznikol tripeptid 16e vo forme špinavobielej tuhej látky (3,0 g; 95 % výťažok).

MS (FAB) 550,3 MH‘ 'H NMR (CDClj) δ 8,08 (d, J= 8Hz, 1H), 8,04 (b d, J= 9Hz, 1H), 7,88 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 5 1H), 7,58-7,37 (m, 5H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12Hz, 1H), 4,61 (t, J= 9,5, 19,5Hz, 1H), 4,46-4,37 (m, 2H), 4.27 (b s, 1H), 4,17 (d, J= 11Hz, 1H), 3,74 (dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,49 (bdd, J=7,5,13Hz, III), 2,17-2,09 (m, ÍH), 2,04 (s, 3H), 2,03-1,94 (m, 1H), 1,79 (bd, J=12,5Hz, 1H), 1,62-1,43 (m, 5H), 1,08-0,85 (m, 5H), 1,00 (d, J= 7Hz, 3H), 0,90 (d, J= 7Hz, 3H),

Zlúčeniny uvedené v tabuľkách 1 až 4

Príklad 17

Syntéza zlúčeniny 104 uvedenej v tabuľke 1

(17a)=(6a)

(17c)

C17f)

zlúčenina 104

Na zlúčeninu 17a (4,27 g, 7,93 mmol, opísaná ako zlúčenina 6a v príklade 6) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán (40 ml) 5 hodín, ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Surová hydrochloridová soľ sa rozpustila v THF (10 ml) a pridal sa roztok NaOH (348,7 mg, 8,72 mmol) v H₂O (5 ml) a následne sa po kvapkách pridával (Boc)₂O (1,73 g, 7,93 mmol) rozpustený v THF (13 ml). PH sa udržiavalo na hodnote 8 pridávaním, ak to bolo potrebné, 10 % vodného NaOH. Reakčná zmes sa silno miešala, potom sa rozriedila s Et₂O a H₂O a extrahovala sa ešte raz z Et₂O. Vodná vrstva sa okyslila na pH 3 s 10 % vodnou kyselinou citrónovou. Zmes sa extrahovala s EtOAc (3x). Spojené EtOAc extrakty sa premyli s H₂O (2x), so soľným roztokom (lx), vysušili sa (MgSO₄), prefíltrovali a odparovali sa do sucha, čim vznikla surová zlúčenina 17b vo forme slonovinovobielej peny (približne 7,93 mmol).

MS (FAB) 481,3 MH *H NMR (CDC1₃), zmes rotamérov približne 1 : 1, δ 8,04 (bd, J= 7,5Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,82 (d, J= 7,5Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 5H), 4,96 (b s, 2H), 4,33 (t, J= 7,5, 14,5Hz, 1H), 4,21-4,09 (m, 0,5H), 3,99-3,84 (m, 0,5H), 3,78-3,75 (m, 0,5H), 3,68-3,62 (m, 0,5H), 3,61-3,42 (m, 1H), 2,55-2,41 (m, 1H), 2,22-2,11 (m, 1H), 1,61-1,52 (m, 3H), 1,43 (s, 9H), 1.40-1,31 (m, 1H), 1,25-1,19 (m, 1H), 0,99 (t, J=7,5,14,5Hz, 3H).

Na zlúčeninu 17b (približne 7,93 mmol) sa pôsobilo s DBU (1,18 ml, 93 mmol) a allylbromidom (4,12 ml, 47,61 mmol) vbezvodnom CH₃CN (40 ml) 48 hodín, ako bolo opísané pre zlúčeninu 15b, čím sa poskytol allylovaný dipeptid 17c vo forme slonovinovobielej peny (3,54 g, 86 % výťažok po 2 krokoch). MS (FAB) 521,3 MH' 545,2 (M+Na)⁺. 'H NMR (CDC1₃), zmes rotamérov približne 1:1, δ 8,05 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,86 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,55-7,40 (m, 5H), 5,88-5,79 (m, 1H), 5,27 (b d, J= =17,5Hz, 1H), 5,18 (b d, J= 10Hz, 1H), 5,03-4,89 (m, 2H), 4,63-4,50 (m, 2H), 4,44-4,19 (m, 2H), 4,00-3,40 (m, 2H), 2,70-2,02 (m, 2H), 1,66-1,35 (m, 5H), 1,44 (s, 9H), 0,95 (t, J= 7,5,14,5Hz, 3H).

Na surový dipeptid 17c (1,18 g, 2,26 mmol) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán (35 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Surová hydrochloridová soľ sa spájala s Boc-Chg-OH»H₂O (684 mg, 2,48 mmol) s NMM (993 μΐ, 9,03 mmol) a TBTU (870 mg, 2,71 mmol) v DCM (11 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15d, čím vznikol tripeptid 17d vo forme slonovinovobielej peny (1,41 g; 95 %).

MS (FAB) 660,4 MH“ 662,3 MH⁺. 'H NMR (CDC1₃), prevažne jeden rotamér, δ 8,03 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,85 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,81 (d, J= 8Hz, 1H), 7,56-7,39 (m, 5H), 5,88-5,77 (m, 1H), 5,26 (dd, J= 1,5, 17Hz, 1H), 5,15 (dd, J= 1,5, 10,5Hz, 1H), 5,12 (s, 1H), 5,02-4,92 (m, 2H), 4,72-4,59 (m, 1H), 4,57-4,46 (m, 1H), 4,42-4,35 (m, 1H), 4,33-4,20 (m, 1H), 4,02-3,90 (m, 1H), 3,78-3,70 (m, 1H), 3,67-3,51 (m, 1H), 2,71-2,61 (m, 1H), 2,12-2,02 (m, 1H), 1,79-1,48 (m, 10H), 1,45-1,39 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,25-1,01 (m, 5H), 0,94 (t, 3H).

Na surový tripeptid 17d (265 mg, 0,400 mmol) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán (3 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Surová hydrochloridová soľ sa spájala s Boc-Chg-OH«H₂O (143,3 mg, 0,521 mmol) s NMM (176 μΐ, 1,60 mmol) a TBTU (154,3 mg, 0,481 mmol) v DCM (3 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15d, čím vznikol tetrapeptid 17e vo forme slonovinovobielej peny (približne 0,400 mmol; 100 %).

MS (FAB) 799,5 MH 801,5 MH⁺ 823 (M+Na)⁺. 'H NMR (CDC1₃), zmes rotamérov približne 1 : 1, δ 8,05 (b d, J= 8,5Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,81 (d, J= 8,5Hz, 1H), 7,55-7,40 (m, 4H), 7,37 (s, 1H), 6,58-6,41 (m, 1H), 5,89-5,78 (m, 1H), 5,26 (b dd, J= 1,5, 17Hz, 1H), 5,16 (b dd, J= 1,5, 10,5Hz, 1H), 5,20-4,92 (m, 3H), 4,68-4,58 (m, 2H), 4,57-4,47 (m, 1H), 4,43-4,26 (m, 1H), 3,99-3,81 (m, 2H), 3,78-3,60 (m, 2H), 2,67-2,60 (m, 1H), 2,11-2,02 (m, 1H), 1,78-1,42 (m, 14H), (s, 9H), 1,25-0,91 (m, 13H), 0,95 (t, J= 7,5,15Hz, 3H).

Na surový tetrapeptid 17e (približne 0,400 mmol) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán (3 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Na surovú hydrochloridovú soľ sa ďalej pôsobilo anhydridom kyseliny octovej (83 μΐ, 0,884 mmol) a NMM (194 μΐ, 1,77 mmol) v DCM (3 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15f, čím vznikol surový acetylovaný tetrapeptid 17f vo forme slonovinovobielej peny (približne 0,400 mmol). MS (FAB) 741,5 MH 743,4 MH' 765,4 (M+Na)⁺.

'H NMR (CDClj) δ 8,05 (b d, J= 8,5Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8,5Hz, 1H), 7,55-7,41 (m, 4H), 7,39 (s, 1H), 6,63-6,48 (m, 1H), 6,01 (d, J= 8,5Hz, 1H), 5,90-5,79 (m, 1H), 5,27 (b dd, J= 1,5, 17Hz, 1H), 5,16 (b dd, J= 1,5,10, 5Hz, 1H), 5,01 (d, J= 12Hz, 1H), 4,96 (d, J= 12Hz, 1H), 4,69-4,48 (m, 3H), 4,44-4,37 (m, 1H), 4,36-4,22 (m, 1H), 3,96 (dd, J=4,llHz, 1H), 3,78-3,60 (m, 2H), 2,67-2,59 (m, 1H), 2,10-2,00 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,78-1,48 (m, 13H), 1,45-1,35 (m, 1H), 1,26-0,89 (m, 13H), 0,95 (t, J= 7,5,15Hz, 3H).

Z acetylovaného tetrapeptidu 17f (približne 0,400 mmol) sa odstránila ochranná skupina prostredníctvom tetrakis(trifenylfosfin)paládiového(0) katalyzátora (11,3 mg, 0,010 mmol) s trifenylfosfinom (5,12 mg, 0,020 mmol) a pyrolidínom (34 μΐ, 0,406 mmol) v 1 : 1 zmesi bezvodného CH₃CN : DCM (2 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15g. Surový produkt sa purifikoval bleskovou chromatografiou (eluent - 1. EtOAc, potom 2. 1,92 % HOAc, 3,85 % MeOH v DCM), čím vznikla, po lyofilizácii, tetrapeptidová zlúčenina 104 uvedená v tabuľke 1 vo forme špinavobielej amorfnej tuhej látky (193,1 mg; 73 % výťažok po 5 krokoch). MS (FAB) 701,4 MH 703,4 MH⁺ 725,4 (M+Na)⁺, ’H NMR (DMSO), zmes rotamérov približne 1:5, δ 8,57 & 8,32 (s, 1H), 8,04 (d, J= 7,5Hz, 1H), 7,94 (b d, J= =7,5Hz, 1H), 7,88 (d, J= 8Hz, 1H), 7,83-7,78 (m, 2H), 7,587,30 (m, 4H), 4,99 (d, J= 12Hz, 1H), 4,90 (d, J= =12Hz, 1H), 4,44-4,29 (m, 2H), 4,29-4,05 (m, 3H), 3,87-3,73 (m, 1H), 2,23-2,13 (m, 1H), 2,05-1,95 (m, 1H), 1,91 & 1,84 (s, 3H), 1,75-1,40 (m, 15H), 1,29-0,84 (m, 12H), 0,91 (t, J= 7,5,14,5Hz, 3H),

Príklad 18

Syntéza zlúčeniny 105 uvedenej v tabuľke 1

(18a) (18b)

Zlúčenina 18b, t. j. zodpovedajúca zlúčenine 5 f z príkladu 5, sa spájala s vopred vytvoreným tripeptidom 18a opísaným skôr, v príklade 15. Konkrétnejšie, zlúčenina 18 b (približne 0,521 mmol) sa spojila so zlúčeninou 18a (323,6 mg, 0,547 mmol) v DCM (3 ml) a NMM (172 μΐ, 1,562 mmol) a nasledovalo pridanie HATU (237,6 mg, 0,625 mmol). Reakčná zmes sa pri laboratórnej teplote miešala 18 hodín, a potom bola spracovaná, ako bolo opísané pre zlúčeninu 15d, čím vznikol surový tetrapeptid vo forme racemickej zmesi na PI. Oba izoméry sa čiastočne oddelili bleskovou chromatografiou (eluent - toluén : EtOAc; 40 : 60). Spojením najprv sa eluujúcich frakcií vznikla 9 : 1 zmes, v ktorej bol hlavnou zložkou analogický terc-butylester zlúčeniny 17f (58 mg). Stredné frakcie obsahovali odlišné pomery zodpovedajúcich terc-butylesterov zlúčeniny 17f a ŕerc-butylesteru zlúčeniny 105 (163 mg). Neskoršie eluujúce frakcie poskytovali ako hlavný izomér zodpovedajúci terc-butylester zlúčeniny 105 (75,8 mg).

Neskorší ester (74 mg, 0,0975 mmol) sa rozpustil v 4N zmesi HCl/dioxán (2 ml), miešal sa pri laboratórnej teplote 5,5 hodiny, potom sa odparoval do sucha, čím vznikol olej. Výsledkom purifikácie bleskovou chromatografiou (eluent - 1. EtOAc, potom 2. 1,92 % HOAc, 3,85 % MeOH, v DCM) bola po lyofilizácii zlúčenina 105 vo forme špinavobielej amorfnej tuhej látky (38,7 mg, 56 % výťažok). Z HPLC analýzy vyplynul 3 : 1 pomer zlúčeniny 105 a zlúčeniny 104. MS a NMR údaje pre zlúčeninu 105: MS (FAB) 701,5 MH' 703,5 MH⁺ 725,6 (M+Na)⁺.

'H NMR (DMSO), zmes rotamérov približne 1:2,5, δ 8,76 & 8,34 (s, 1H), 8,05 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,94 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,88 (d, J=8,5Hz, 1H), 7,85-7,78 (m, 2H), 7,59-7,43 (m, 4H), 4,99 (d, J= 12IIz, 1H), 4,89 (d, J= 12Hz, 1H), 4,41-4,05 (m, 5H), 3,82-3,66 (m, 1H), 2,25-2,11 (m, 1H), 2,11-1,98 (m. 1H), 1,90 & 1,84 (s, 3H), 1,78-1,40 (m, 15H), 1,39-0,82 (m, 12H), 0,90 (t, J= 7,14Hz, 3H),

Príklad 19

Syntéza zlúčenín 103 uvedených v tabuľke 1

Podľa postupu na syntézu zlúčeniny 104 opísanému v príklade 17 sa zmesi 1(R),2(R) a 1(R),2(S) izomérov medziproduktu lOd, pripravené v príklade 10, spájali so zlúčeninou 2, čím vznikla zmes izomémych medziproduktových zlúčenín 19a a 19b

(19a)

Podľa postupov uvedených v príklade 18 sa izoméme zlúčeniny 19a a 19b oddelili a transformovali na ich zodpovedajúcu zlúčeninu vzorca (1). aby sa izolovala zodpovedajúca zlúčenina 103 uvedená v tabuľke 1. Spektrálne údaje:

Zlúčenina 103: Rotamérna populácia prostredníctvom NMR približne (1 : 8,7):

MS (FAB) m/z: 703 (MH+); *H-NMR (DMSO-dé) δ 8,21-8,09 (bs, 1H), 8,05 (bd, J = 7,63 Hz, 1H), 7,94 (bd, J = 7,0 Hz, 1H), 7,91-7,83 (m, 2H), 7,83-7,76 (m, 1H), 7,59-7,5 (m, 3H), 7,5-7,43 (m, 1H), 4,99 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,43-4,30 (m, 3H), 4,23-4,16 (m, 1H), 4,13 (bd, J = 10,8 Hz, 1H), 3,71 (dd, J = 11,1, 4 Hz, 1H), 2,2-2,02 (m, 2H), 1,87 a 1,84 (2 x s, 3H), 1,81-1,71 (m, 2H), 1,70-1,40 (m, 12H), 1,26-1,06 (m, 4H), 1,04-0,83 (m, 11H), 0,59 (m, 1H).

Príklad 20

Syntéza zlúčeniny 108 uvedenej v tabuľke 1

(20d) zlúčenina 108

Na surový tetrapeptid 17e z príkladu 17 (približne 0,963 mmol) sa pôsobilo 4N roztokom HCl/dioxán (5 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Surová hydrochloridová soľ sa pripájala na Boc-(D)Glu(O-alyl)-OH (331,9 mg, 1,155 mmol) s NMM (423 μΐ, 3,850 mmol) a TBTU (370,8 mg, 1,155 mmol) v DCM (5 ml) 3 hodiny pri laboratórnej teplote, ako bolo opísané pre zlúčeninu 15d. Surový pentapeptid 20b sa získal vo forme slonovinovobielej peny (približne 933,9 mg, 0,963 mmol).

MS (FAB) 968,6 MH’ 970,6 MH⁺ 992,5 (M+Na), 'H NMR (CDC1₃), zmes rotamérov približne 1 : 4, δ 8,05 (d, J= 8,5Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,81 (d, J= 8,5Hz, 1H), 7,58-7,34 (m, 5H), 6,77-6,25 (m, 2H), 5,98-5,77 (m, 2H), 5,38-5,21 (m, 4H), 5,16 (dd, J= 1,5, 10,5Hz, 1H), 5,06-4,89 (m, 2H), 4,68-4,13 (m, 7H), 3,96-3,52 (m, 4H), 2,69-2,38 (m, 3H), 2,23-1,87 (m, 2H), 1,78-1,37 (m, 17H), 1,46 & 1,44 (s, 9H), 1,22-0,87 (m, 11H), 0,95 (t, J= 7, 14,5Hz, 3H),

Na surový pentapeptid 20b (približne 0,963 mmol) sa pôsobilo 4N roztokom HCl/dioxán (5 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Surová hydrochloridová soľ sa pripájala na Boc-Asp(O-alyl)-OH (315,6 mg, 1,155 mmol) s NMM (423 μΐ, 3,850 mmol) a TBTU (370,8 mg, 1,155 mmol) v DCM (5 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15d. Surový hexapeptid 20c sa získal vo forme slonovinovobielej peny (približne 1,083 g, 0,963 mmol).

MS (FAB) 1147,6 (M+Na)⁺. *H NMR (CDC1₃), zmes rotamérov približne 1 : 1, δ 8,06 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,86 (d, J= 8Hz, 1H), 7,81 (d, J= 8Hz, 1H), 7,59-7,39 (m, 5H), 7,39-6,34 (m, 4H), 5,98-5,76 (m, 3H), 5,38-5,10 (m, 6H), 5,10-4,89 (m, 2H), 4,66-4,05 (m, 10H), 3,87-3,58 (m, 4H), 3,30-2,65 (m, 2H), 2,65-1,89 (m 3H), 1,79-1,33 (m, 19H), (s, 9H), 1,33-0,86 (m, 14H).

Na surový hexapeptid 20c (približne 0,963 mmol) sa pôsobilo 4N roztokom HCl/dioxán (5 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15c. Surová hydrochloridová soľ sa acetylovala s anhydridom kyseliny octovej (182 μΐ, 1,193 mmol) a NMM (423,5 μΐ, 3,850 mmol) v DCM (5 ml), ako bolo opísané pre zlúčeninu 15f, čím vznikol surový acetylovaný tetrapeptid. Penový zvyšok sa purifikoval bleskovou chromatografiou (eluent: 1. hexán : EtOAc 20 : 80 až 10 : 90 a 2. čistý EtOAc), čím vznikol acetylovaný hexapeptid 20d vo forme slonovinovobielej peny (528 mg, 51 % výťažok po 4 krokoch). MS (FAB) 1067,6 (MH+) 1089,6 (M+Na).

Acetylovaný hexapeptid 20d (528 mg, 0,495 mmol) sa rozpustil v DCM (3 ml) a pôsobilo sa naň vopred zmiešaným, 15 minút miešaným roztokom tetrakis(trifenyl-fosfin)paládiového(0) katalyzátora (90 mg, 0,078 mmol) a pyrolidínu (134 pl, 1,603 mmol) v DCM (3 ml). Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 48 hodín a potom sa odparovalo rozpúšťadlo. Surový produkt sa purifikoval čiastočne rozotretím v zmesi Et₂O : : DCM (85 : 15), potom purifikáciou v dvoch dávkach preparačnou HPLC. Polovica čiastočne purifikovaného materiálu sa rozpustila v ľadovej HOAc (5 ml), prefiltrovala sa cez Millipore®: Millex®-HV 0,45 pm filter a injekciou sa naniesla na ekvilibrovanú Whatman Partisil® 10-ODS-3 (2,2x50cm) C18 reverznú fázovú kolónu. Purifikačný program: lineárny gradient s rýchlosťou 15 ml/min., 230 pm, injekciou nanesené v koncentrácii 5 % A; keď sa eluovali všetky HOAc, program začal - 5 % A 10 minút, 5 až 58 % A do 70 minút; A: 0,06 % TFA/CH3CN; B: 0,06 % TFA/H₂O. Frakcie sa analyzovali analytickou HPLC, príslušné frakcie z oboch HPLC purifikácii sa zhromaždili a lyofilizovali, čim vznikla želaná hexapeptidová zlúčenina 108 vo forme bielej amorfnej tuhej látky (218,3 mg, 47 % výťažok).

MS (FAB) 945,5 MH' 947,4 MH⁺ 969,5 (M+Na)⁺ 985,4 (M+K)⁺. ’H NMR (DMSO), zmes rotamérov približne 1:9, δ 8,55 & 8,31 (s, 1H), 8,16 (d, J= 7,5Hz, 1H), 8,11 (d, J= 8Hz, 1H), 8,05 (d, J= 8,5Hz, 1H), 7,97-7,85 (m, 2H), 7,88 (d, J= 8,5Hz, 1H), 7,75 (d, J= 9Hz, 1H), 7,59-7,39 (m, 4H), 4,99 (d, J= 12Hz, 1H), 4,89 (d, J= 12Hz, 1H), 4,53 (dd, J= 7, 14Hz, 1H), 4,08-4,45 (m, 6H), 3,77 (b dd, J= 4,11Hz, 1H), 2,64 (dd, J= =6,5, 16,5Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,25-2,12 (m, 3H), 2,07 & 1,82 (s, 3H), 2,04-1,86 (m, 2H), 1,80-1,35 (m, 14H), 1,32-0,80 (m, 14H), 0,91 (t, J= 7,5, 14,5Hz, 3H).

Príklad 21

Syntéza zlúčeniny 301 uvedenej v tabuľke 3

(21ä)=(9c) (21b)

Roztok monohydrátu hydroxidu litneho (23 mg, 0,56 mmol) v H₂O (4 ml) sa pridal do roztoku esterovej zlúčeniny 21a (45 mg, 0,185 mmol, predtým opísaná ako (R,R) izomér 9c) v MeOH (3,5 ml) a THF (3,5 ml). Výsledný roztok sa silno miešal 16 hodín a potom sa rozdelil medzi EtOAc (60 ml) a 10 % vodnú HC1 (20 ml). Organická fáza sa oddelila, vysušila (MgSO₄), prefiltrovala a skoncentrovala, čím vznikla zodpovedajúca kyselina v kvantitatívnom výťažku.

Tento materiál (približne 0,185 mmol) sa spojil s (S)-(-)-a-metylbenzyl-amínom (27 mg, 0,22 mmol), HATU (77 mg, 0,20 mmol) a DIPEA (0,11 ml, 0,65 mmol) v DMF (5 ml). Po 20 hodinách sa reakčná zmes skoncentrovala. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc a roztok sa postupne premýval s nasýteným vodným NaHCO₃, 10 % vodnou HC1 a soľným roztokom, potom sa vysušil (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval in vacuo. Výsledkom purifikácie bleskovou chromatografiou (eluent: 35 % EtOAc/hexán) bolo 11 mg (28 %) spojeného produktu 21b. Na tento materiál (11 mg, 0,03 mmol) sa pôsobilo 4N zmesou HCl/dioxán 35 minút. Reakčná zmes sa potom skoncentrovala do sucha, čím vznikla hydrochloridová soľ zodpovedajúceho amínu. Posledný uvedený produkt sa spájal s:

OCH₂Ph

Ac-Asp(OBn)-D-Glu(OBn)-lle-Val-N^^

C(O)OH (33 mg, 0,036 mmol, pripraveným postupmi analogickými s postupmi uvedenými v príkladoch 15 a 20), HATU (14 mg, 0,036 mmol) a DIPEA (0,116 ml, 0,02 mmol) v DMF (4 ml). Po 16 hodinovom miešaní reakčnej zmesi sa táto skoncentrovala. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc. Roztok sa postupne premýval s nasýteným vodným NaHCO₃, 10 % vodnou HC1 a soľným roztokom, vysušil sa (MgSO₄), prefiltroval a skoncentroval sa in vacuo, čim vznikla biela tuhá látka. Tento materiál (približne 0,033 mg) sa rozpustil v EtOH (6 ml) a ošetril sa s octanom amónnym (7 mg, 0,09 mmol) a 10 % Pd/C (10 mg) vo vodíkovej atmosfére. Po troch hodinách sa reakčná zmes prefiltrovala cez kremelinu. Filtrát sa skoncentroval do sucha. Zvyšok sa potom rozpustil v DMSO a purifikoval sa preparatívnou HPLC, čím, po lyofilizácii, vznikla biela tuhá látka (17,6 mg, 57 % výťažok po dvoch krokoch).

Spektrálne údaje:

MS (FAB) ES' 932,6 (M-H)', 954,5 (Μ-Na)’; HRMS vypočítané pre Ο^Η^ΝγΟ^ (MH⁺) 934,49261, zistené: 934,49010; 'H-NMR (DMSO, dg) δ 8,90 (s, 1H), 8,24 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 7,63 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 7,42-7,17 (m, 10H), 5,00 (kvintet, J = 7,63 Hz, 1H), 4,7 (m, 1H), 4,52 (d, J = 11,76 Hz, 1H), 4,43 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,33-4,2 (m, 6H), 3,70 (dd, J = 11,4 a 11,1 Hz, 2H), 2,63 (dd, J = 5,7 a 5,7 Hz, 1H), 2,45 (dd, J = 7,95 a 7,95 Hz, 1H), 2,21-2,11 (m, 3H), 2,07-1,97 (m, 1H), 1,93-1,83 (m, 2H), 1,81 (s, 3H), 1,78-1,63 (m, 2H), 1,54-1,41 (m, 2H), 1,39 (d, J = =7,0 Hz, 3H), 1,29 (dd, J = 7,94 a 7,63 Hz, 1H), 1,15 (kvintet, J = 7,0 Hz, 1H), 1,05 (m, 1Η), 0,90 (d, J = =6,36 Hz, 6H), 0,88-0,83 (m, 1H), 0,71 (m, 9H).

Príklad 22

Zlúčenina 107 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 17.

Rotaméma populácia prostredníctvom NMR (1 : 7 : 6)

MS (FAB) m/z: 675 (MH+); 'H-NMR (DMSO-dô) δ 8,35-8,19 (bs, 1H), 8,04 (d, J = 7,63 Hz, 1H), 7,93 (bd, J = 7,31Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,27 Hz, 1H), 7,86-7,79 (m, 2H), 7,59-7,49 (m, 3H), 7,46 (dd, J = 7,95, 7,95 Hz, 1H), 4,98 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,40-4,34 (m, 1H), 4,32 (bs, 1H), 4,29-4,24 (m, 1H), 4,22-4,15 (m, 1H), 4,09 (d, J = 11,8 Hz, 1 H), 3,74 (dd, J = 11,1,4 Hz, 1H), 2,20-2,12 (m, 1H), 2,05-1,94 (m, 2H), 1,84 (s, 3H), 1,72-1,42 (m, 7H), 1,20-1,13 (m, 1H), 1,08-0,87 (m, 13Η), 0,85 (d, J = 6,68 Hz, 6H).

Príklad 23

Zlúčenina 114 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 17.

Rotamérna populácia prostredníctvomNMR (1 : 7 : 5):

MS (FAB) m/z: 747 (M+Na⁺); 'H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,40-8,24 (bs, 1H), 8,07-8,01 (m, 1H), 7,96-7,91 (m, 1H), 7,87 (d J = 8,26 Hz, 1H), 7,85-7,78 (m, 2H), 7,58-7,49 (m, 3H), 7,46 (dd, J = 7,95-7,95 Hz, 1H), 7,30-7,21 (m, 4H), 7,20-7,14 (m, 1H), 4,98 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,40-4,34 (m, 1H), 4,34-4,29 (m, 1H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,22-4,15 (m, 1H), 4,09 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 3,74 (dd, J = 11,1,4 Hz, 1H), 2,95-2,79 (m, 2H), 2,21-2,11 (m, 1H), 2,05-1,94 (m, 2H), 1,89-1,83 (2 x s, 3H), 1,63-1,41 (m, 7H), 1,38-1,30 (m, 1H), 1,27-1,22 (m, 1H), 1,12-0,94 (m, 5H), 0,89 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,4 Hz, 3H),

Príklad 24

Zlúčenina 118 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 17. Rotamérna populácia prostredníctvom NMR približne (1 : 6 : 3):

MS (FAB) m/z: 677,4 (MH+); 'H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,58 and 8,38 (2 x bs, 1H), 8,04 (d, J = 7,63 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 7,63 Hz, 1H), 7,91-7,81 (m, 3H), 7,59-7,49 (m, 3H), 7,49-7,43 (m, 1H), 4,98 (d, J = 12,1Hz, 1H), 4,89 (d, J = 12,1Hz, 1H), 4,41-4,29 (m, 2H), 4,29-4,14 (m, 2H), 4,1 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 3,74 (bd, J = 7,63 Hz, 1H), 2,21-2,12 (m, 1H), 2,04-1,92 (m, 2H), 1,90 and 1,84 (2 x s, 3H), 1,63-1,41 (m, 9H), 1,39-1,26 (m, 3H), 1,21-1,15 (m, 1H), 1,06-0,92 (m, 5H), 0,92-0,80 (m, 9H),

Príklad 25

Zlúčenina 116 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 17.

'H NMR (DMSO-dý) δ 8,36 (s, 1H), 8,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,33-7,26 (m, 5 H), 4,54-4,42 (m, 3H), 4,30-4,21 (m, 5 H), 4,06 (d, J = 11Hz, 1H), 3,69 (dd, J = Hz, 1H), 2,62 (dd, J = 16,10 Hz, 1H), 2,47-2,42 (m, 1H), 2,18-2,14 (m, 3 H), 2,02-1,87 (m, 2 H), 1,82 (s, 3H), 1,74-1,66 (m, 2 H), 1,54-1,47 (m, 2 H), 1,38-1,27 (m, 2 H), 1,21-1,18 (m, 1H), 0,97-0,85 (m, 11H), 0,80-0,70 (m, 7 H).

Príklad 26

Zlúčenina 121 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 17.

'H NMR (DMSO-d₆) δ 9,12 (d, J = 6 Hz, 1H), 8,64 (s, 1H), 8,30 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,05 (dd, J = 8,7 Hz, 1H), 7,97 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,80 (dd, J = 8, 7 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,70-5,61 (m, 2 H), 5,26 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,39 (dd, J = 9,8 Hz, 1H), 4,23-4,12 (m, 2 H), 4,03-3,99 (m, 1H), 2,66-2,54 (m, III), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,08 (dd, J = 9,17 Hz, 1H), 2,01-1,93 (m, 1H), 1,83 (s, 3 H), 1,65-1,46 (m, 5 H), 1,41-1,38 (m, 1H), 1,24-1,20 (dd, J = 9, 5 Hz, 1H), 01,05-0,78 (m, 12 H),

Príklad 27

Zlúčenina 205 uvedená v tabuľke 2 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 17.

^]H NMR (DMSO-dJ δ 9,14 (d, J = 6 Hz, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,32 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,14-8,06 (m, 2 H), 7,98 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,82 (dd, J = 8,7 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 9Hz, 1H), 7,55 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,75-5,66 (m, 2 H), 5,22 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,50 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,39 (dd, J = 9, 9 Hz, 1H), 4,23-4,08 (m, 3H), 2,56-2,50 (m, 1H), 2,36-2,28 (m, 1H), 2,04-1,97 (m, 1H), 1,82 (s, 3 H), 1,621,41 (m, 7 H), 1,24 (dd, J = 5,4 Hz, 1H), 0,94-0,75 (m, 12 H).

Príklad 28

Zlúčenina 117 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 20.

'H NMR (DMSO-d₆) δ 8,36 (s, 1H), 8,17 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,96-7,92 (m, 2 H), 7,87 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,56-7,45 (m, 4 H), 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,52 (dd, J = 14, 7 Hz, 1H), 4,37-4,12 (m, 6 II), 3,78-3,73 (m, 1H), 2,63 (dd, J = = 17, 6 Hz, 1H), 2,47-2,42 (m, 1H), 2,22-2,16 (m, 3 H), 2,04-1,86 (m, 2 H), 1,82 (s, 3 H), 1,771,71 (m, 1H), 1,69-1,42 (m, 8 H), 1,30 (kvintet, J = 8 Hz, 1H), 1,20 (dd, J = 12,8 Hz, 1H), 1,10-0,85 (m, 15 H), 0,76-0,72 (m, 1H).

Príklad 29

Zlúčenina 120 uvedená v tabuľke 1 sa syntetizovala podľa postupu opísaného v príklade 20.

'H NMR (DMSO-d₆) δ 8,34 (s, 1H), 8,12 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,95-7,87 (m, 3 H), 7,81 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,64-7,52 (m, 4 H), 7,46 (dd, J = 8,7 Hz, 1H), 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,63 (dd, J = 14,7 Hz, 1H), 4,37-4,14 (m, 4 H), 3,74 (dd, J = 11, 4 Hz, 1H), 3,41-3,35 (m, 2 H), 2,61 (dd, J = 16, 7 Hz, 1H), 2,44 (dd, J = 16,8 Hz, 1H), 2,20-2,15 (m, 1H), 2,04-1,96 (m, 3 H), 1,82 (s, 3 H), 1,70-1,64 (m, 1H), 1,56-1,43 (m, 7 H), 1,30 (kvintet, J = 8 Hz, 1H), 1,20 (dd, J = 8,5 Hz, 1H), 0,99-0,72 (m, 21H).

Príklad 30

Klonovanie, expresia a purifikácia rekombinantnej HCV NS3 proteázy typu lb

Sérum z HCV-infikovaného pacienta sa získalo prostredníctvom externej spolupráce (Bernard Willems MD, Hôpital St-Luc, Montreal, Kanada a Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Danté Publique du Québec, Ste-Anne de Bellevue, Kanada). Umelý cDNA templát s úplnou dĺžkou HCV genómu sa skonštruoval z DNA fragmentov získaných reverznou transkripčnou-PCR (RT-PCR) sérovej RNA a použitím špecifických primerov vybraných na základe homológie medzi inými kmeňmi s genotypom lb. Na základe stanovenia ce lej genomickej sekvencie sa k HCV izolátu priradil genotyp lb v súlade s klasifikáciou podľa Simmonds a ďalší (J. Clin. Microbiol., (1993), 31, str. 1493-1503). Ukázalo sa, že aminokyselinová sekvencia neštruktúrnej oblasti NS2-NS4B je viac ako na 93 % zhodná s HCV genotypom lb (BK, JK a 483 izoláty) a na 88 % zhodná s HCV genotypom la (HCV-1 izolát). DNA fragment kódujúci polyproteínový prekurzor (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) sa generoval prostredníctvom PCR a zaviedol sa do eukaryotických expresných vektorov. Po prechodnej transfekcii sa demonštrovalo spracovanie polyproteínu sprostredkované HCV NS3 proteázou prítomnosťou zrelého NS3 proteínu použitím Western blot analýzy. Zrelý NS3 proteín sa nepozoroval pri expresii polyproteínového prekurzora obsahujúceho mutáciu S1165A, ktorá inaktivuje NS3 proteázu, čo potvrdilo funkčnosť HCV NS3 proteázy.

DNA fragment kódujúci rekombinantnú HCV NS3 proteázu (aminokyseliny 1027 až 1206) sa klonoval v pETl ld bakteriálnom expresnom vektore. Expresia NS3 proteázy v E. coli BL21 (DE3)pLysS sa indukovala inkubovaním s lmM IPTG 3 hodiny pri 22 °C. Výsledkom typickej fermentácie (181) bolo približne 100 g mokrej bunkovej pasty. Bunky sa rozsuspendovali v lyzačnom tlmivom roztoku (3,0 ml/g) pozostávajúcom z 25mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, 10 % glycerolu (v/v), lmM EDTA, 0,01 % NP-40, ktorý sa uskladňoval pri -80 °C. Bunky sa roztopili a homogenizovali a nasledovalo pridanie 5mM DTT. Potom sa do homogenátu pridal chlorid horečnatý v konečnej koncentrácii 20 mM a DNáza v konečnej koncentrácii 20 pg/ml. Po 25 minútach inkubovania pri 4 °C sa homogenát sonifikoval a centrifugoval pri 15 000 ot./min. 30 minút pri 4 °C. PH supematantu sa potom nastavilo na 6,5 použitím IM roztoku fosforečnanu sodného.

K dvojkrokovému purifikačnému postupu opísanému vo WO 95/22985 (tu zahrnutý jeho citáciou) sa pridal ďalší krok gélovej filtračnej chromatografie. V stručnosti, supematant z bakteriálneho extraktu sa naniesol na SP HiTrap kolónu (Pharmacia), ktorá bola predtým ekvilibrovaná, s prietokovou rýchlosťou 2 ml/min. v tlmivom roztoku A (50 mM fosforečnan sodný, pH 6,5, 10 % glycerol, lmM EDTA, 5mM DTT, 0,01 % NP-40). Kolóna sa potom premyla s tlmivým roztokom A obsahujúcim 0,15M NaCl a proteáza sa eluovala aplikovaním 10 objemov kolóny lineárneho 0,15 až 0,3 M NaCl gradientu. Frakcie obsahujúce NS3 proteázu sa spojili a nariedili sa do konečnej koncentrácie NaCl s hodnotou 0,1 M. Enzým sa ďalej purifikoval na HiTrap Heparínovej kolóne (Pharmacia) ekvilibrovanej v tlmivom roztoku B (25mM fosforečnan sodný, pH 7,5, 10 % glycerol, 5mM DTT, 0,01 % NP-40). Vzorky sa naniesli s prietokovou rýchlosťou 3 ml/min. Kolóna sa potom premyla s tlmivým roztokom B obsahujúcim 0,15M NaCl s prietokovou rýchlosťou 1,5 ml/min. Dva kroky premývania sa uskutočňovali v prítomnosti tlmivého roztoku B obsahujúceho 0,3 alebo IM NaCl. Proteáza sa izolovala v 0,3M NaCl premývaní, 3-krát sa nariedila tlmivým roztokom B, znova sa naniesla na HiTrap Heparínovú kolónu a eluovala sa s tlmivým roztokom B obsahujúcim 0,4M NaCl. Nakoniec sa frakcie obsahujúce NS3 proteázu naniesli na Superdex 75 HÍLoad 16/60 kolónu (Pharmacia) ekvilibrovanú v tlmivom roztoku B obsahujúcom 0,3M NaCl. Čistota HCV NS3 proteázy získanej zo spojených frakcií sa určila ako vyššia ako 95 % prostredníctvom SDS-PAGE, po ktorej nasledovala denzitometrická analýza.

Enzým sa uskladňoval pri -80 °C a tesne pred použitím sa rozmrazil na ľade a nariedil.

Príklad 31

Rádiometrický test s rekombinantným HCV NS3 proteáza/NS4A kofaktorovým peptidom

Enzým sa klonoval, exprimoval a pripravil podľa postupu opísaného v príklade 30. Enzým sa uskladňoval pri -80 °C a tesne pred použitím sa rozmrazil na ľade a nariedil sa v testovacom tlmivom roztoku obsahujúcom NS4A kofaktorový peptid.

Substrát používaný na NS3 proteáza/NS4A kofaktorový peptidový rádiometrický test, DDIVPC-SMSYTW, sa štiepi enzýmom medzi cysteínovým a serínovým zvyškom. Sekvencia DDIVPC-SMSYTW zodpovedá NS5A/NS5B prirodzenému štiepnemu miestu, v ktorom je cysteínový zvyšok v polohe P2 nahradený prolínom. Peptidový substrát DDIVPC-SMSYTW a stopovací biotín-DDIVPC-SMS[¹²⁵I-Y]TW sa inkubujú s rekombinantnou NS3 proteázou a NS4A peptidovým kofaktorom KKGSVVIVGRIILSGRK (molámy pomer enzým : kofaktor = 1 : 100) bez alebo v prítomnosti inhibítorov. Oddelenie substrátu od produktov sa uskutočňuje pridaním agarózových guľôčok obalených avidínom do testovacej zmesi a následnou filtráciou. Množstvo SMS[¹²⁵I-Y]TW produktu nachádzajúceho sa vo filtráte umožňuje vypočítanie percenta subsfrátovej konverzie a percenta inhibície.

A. Reakčné činidlá

Tris a Tris-HCl (UltraPure) sa získali od Gibco-BRL. Glycerol (UltraPure), MES a BSA sa kúpili od firmy Sigma. TCEP sa získal od firmy Pierce, DMSO od firmy Aldrich a NaOH od firmy Anachemia.

Testovací tlmivý roztok: 50mM Tris HCl, pH 7,5, 30 % (w/v) glycerol, 1 mg/ml BSA, lmM TCEP (TCEP sa pridával tesne pred použitím z IM zásobného roztoku vo vode).

Substrát: DDIVPCSMSYTW, 25μΜ konečná koncentrácia (z 2mM zásobného roztoku v DMSO uskladňovaného pri -20 °C, aby sa zabránilo oxidácii).

Stopovacie činidlo: redukovaný mono-jodidovaný substrátový biotín DDIVPC SMS[¹²⁵I-Y]TW (približne lnM končená koncentrácia).

HCV NS3 proteáza typu lb, 25nM konečná koncentrácia (zo zásobného roztoku v 50mM fosforečnane sodnom, pH 7,5, 10 % glycerole, 300mM NaCl, 5mM DTT, 0,01 % NP-40).

NS4A kofaktorový peptid: KKGSVVIVGRIILSGRK, 2,5μΜ konečná koncentrácia (z 2mM zásobného roztoku v DMSO uskladňovanom pri -20 °C).

B. Postup

Test sa uskutočňoval v 96-jamkovej polypropylénovej platni od firmy Costar. Každá jamka obsahovala:

- 20 μΐ zmesi substrát/stopovacie činidlo v testovacom tlmivom roztoku;

- 10 μΐ ± inhibítor v 20 % zmesi DMSO/testovací tlmivý roztok;

-10 μΐ zmesi NS3 proteáza lb/NS4 kofaktorový peptid (molámy pomer 1 : 100).

Na rovnakej testovacej platni sa pripravil aj blank (bez inhibítora a bez enzýmu) a kontrola (bez enzýmu).

Enzymatická reakcia sa iniciovala pridaním enzým/NS4A peptidového roztoku a testovacia zmes sa inkubovala 40 minút pri 23 °C s miernym kolísaním. Pridalo sa desať (10) μΐ 0,5N NaOH a 10 μΐ IM MES, pH 5,8 sa pridalo na zastavenie enzymatickej reakcie.

Do Millipore MADP N65 filtračnej platne sa pridalo dvadsať (20) μΐ agarózových guľôčok obalených avidínom (kúpené od firmy Pierce). Zastavená testovacia zmes sa preniesla na filtračnú platňu a inkubovala sa 60 minút pri 23 °C s miernym kolísaním.

Platne sa prefiltrovali použitím Millipore MultiScreen Vacuum Manifold Fitration aparatúry a 40 μΐ filtrátu sa prenieslo na nepriehľadnú 96-jamkovú platňu obsahujúcu 60 μΐ scintilačnej kvapaliny na jamku.

Filtráty sa spočítali na Packard TopCount zariadení použitím ¹²⁵I-kvapalného protokolu pre 1 minútu.

Percento inhibície sa vypočítalo podľa nasledujúceho vzťahu:

100-[(impulz_intl - impulz_b|_ank)/(impulz_ctrimpulz_b|_ank)xl00]

Na inhibično-koncentračné údaje sa aplikovala nelineárna krivka zosúladená s Hill modelom a 50 % účinná koncentrácia (IC50) sa vypočítala použitím SAS softvéru (Štatistický Softwarový Systém; SAS Inštitúte, Inc. Čary, N.C.).

Príklad 32

Test s NS3-NS4A heterodimérovým proteínom s úplnou dĺžkou

NS2-NS5B-3’ nekódujúca oblasť sa vklonovala prostredníctvom RT-PCR do pCR®3 vektora (Invitrogen) použitím RNA extraktu zo séra jedinca infikovaného HCV s genotypom lb (poskytnutý Dr. Bernardom Willemsom, Hôpital St-Luc, Montreal, Quebec, Kanada). NS3-NS4A DNA oblasť sa potom subklonovala prostredníctvom PCR do pFastBac™ HTa bakulovírusového expresného vektora (Gibco/BRL). Vektorová sekvencia zahŕňa oblasť kódujúcu 28-zvyškovú N-koncovú sekvenciu, ktorá obsahuje hexahistidínový prívesok. Bac-to-Bac™ bakulovírusový expresný systém (Gibco/BRL) bol použitý na produkciu rekombinantného bakulovírusu. Kompletný zrelý NS3 a NS4A heterodimérový proteín (His-NS3-NS4AFL) sa exprimoval infikovaním 10^s Sf21 buniek/ml s rekombinantným bakulovírusom s mutiplicitou infekcie 0,1 až 0,2 pri 27 °C. Infikovaná kultúra sa zozbierala o 48 až 64 hodín centrifugáciou pri 4 °C. Bunkový pelet sa homogenizoval v 50mM NaPO₄, pH 7,5, 40 % glycerole (w/v), 2mM β-merkaptoetanole v prítomnosti kokteilu proteázových inhibítorov. His-NS3-NS4AFL sa potom extrahoval z bunkového lyzátu s 1,5 % NP-40, 0,5 % Triton X-100, 0,5M NaCl a pôsobením DNázy. Po ultracentrifugácii sa extrakt roztoku nariedil 4-krát a naviazal sa na Pharmacia Hi-Trap Ni-chelatačnú kolónu. His-NS3-NS4AFL sa eluoval vo viac ako na 90 % čistej forme (ako sa stanovilo prostredníctvom SDS-PAGE) použitím 50 až 400mM imidazolového gradientu. His-NS3-NS4AFL sa uskladňoval pri -80 °C v 50mM fosforečnane sodnom, pH 7,5, 10 % (w/v) glycerole, 0,5M NaCl, 0,25M imidazole, 0,1 % NP-40. Tesne pred použitím sa rozmrazil na ľade a nariedil.

Proteázový účinok His-NS3-NS4AFL sa testoval v 50mM Tris-HCl, pH 8,0, 0.25M citráte sodnom, 0,01 % (w/v) n-dodecyl-fi-D-maltozide, lmM TCEP. Päť (5) μΜ vnútorne zastaveného substrátu antranilylDDIVPAbu[C(0)-0]-AMY(3-N0₂)TW-OH sa v prítomnosti rôznych koncentrácií inhibítora inkubovalo s 1,5 nM HÍS-NS3-NS4AFI. 45 minút pri 23 °C. Konečná DMSO koncentrácia nepresiahla 5,25 %. Reakcia sa ukončila pridaním IM MES, pH 5,8. Fluorescencia N-koncového produktu sa monitorovala na Perkin-Elmer LS-50B fluorometri vybavenom čítačom 96-jamkových platní (excitačná vlnová dĺžka: 325 nm; emisná vlnová dĺžka: 423 nm). Na percentuálne inhibično-koncentračné údaje sa aplikovala nelineárna krivka zosúladená s Hill modelom a 50 % účinná koncentrácia (IC₅₀) sa vypočítala použitím SAS (Štatistický Softwarový Systém; SAS Inštitúte, Inc. Čary, N.C.).

Príklad 33

NS3 proteázový bunkový test

Tento test sa uskutočnil s Huh-7 bunkami, čo sú ľudské bunky odvodené od hepatómu, kotransfekované s 2 DNA konštruktmi:

-jedným, exprimujúcim polyprotein, ktorý obsahuje HCV neštruktúme proteíny fuzované s tTA v nasledujúcom poradí: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA (nazývaný NS3);

-druhým, exprimujúcim reporterový proteín, vylučovanú alkalickú fosfatázu, pod kontrolou tTA (nazývaný SEAP).

Polyprotein sa musí štiepiť NS3 proteázou, aby sa vylučovali zrelé proteíny. Verí sa, že pri vylučovaní zrelých proteínov vytvárajú vírusové proteíny komplex na membráne endoplazmatického retikula, zatiaľ čo tTA migruje do jadra a transaktivuje SEAP gén. Preto by redukcia NS3 proteolytického účinku mala viesť k zníženiu úrovní zrelého tTa a k z toho vyplývajúcemu poklesu SEAP aktivity.

Na kontrolu iných účinkov zlúčenín sa uskutočnila paralelná transfekcia, pri ktorej sa konštrukt exprimujúci len tTA (nazývaný tTA) kotransfekoval so SEAP konštruktom, takže SEAP účinok nebol závislý od NS3 proteolytickej aktivity.

Postup testu: Huh-7 bunky, narastené v CHO-SFMII + 10 % FCS (fetálne teľacie sérum) sa kotransfekovali buď s NS3 a SEAP, alebo s tTA a SEAP, použitím FuGene postupu (Boehringer Mannheim). Po 5 hodinách pri 37 °C sa bunky premyli, trypsinizovali sa a vysiali sa (80 000 buniek na jamku) na 96 jamkové platne obsahujúce testované zlúčeniny v určitom rozsahu koncentrácií. Po 24-hodinovom inkubačnom čase sa odobrali alikvoty média a merala sa SEAP aktivita v týchto alikvotách s Phospha-Light kitom (Tropix).

Aby sa získalo EC₅₀, uskutočňovala sa analýza percenta inhibície SEAP účinku s ohľadom na koncentráciu zlúčeniny so SAS softvérom.

Použitím MTT testu sa potom nasledovne stanovila toxicita zlúčeniny (TC50):

- pridalo sa 20 μΐ MTT roztoku (5 mg/ml média) na jamku a inkubovalo sa pri 37 °C 4 hodiny;

- médium sa odstránilo a pridalo sa 50 μΐ 0,01N HCI + 10 % Triton X-100;

- po najmenej hodinovom pretrepávaní pri laboratórnej teplote sa odčítala OD každej jamky pri vlnovej dĺžke 595 nm.

TC₅₀ sa vypočítalo rovnakým spôsobom ako EC₅₀.

Príklad 34

Testy špecificity

Špecificita zlúčenín sa stanovovala vo vzťahu k rôznym serínovým proteázam: ľudská leukocytová elastáza, pankreatická elastáza ošípaných a hovädzí pankreatický α-chymotrypsín, a k jednej cysteínovej proteáze: ľudský pečeňový katepsín B. Vo všetkých prípadoch sa použil 96-jamkový platňový formát používajúci kolorimetrický p-nitroanilínový (pNA) substrát špecifický pre každý enzým. Každý test zahŕňal hodinovú predinkubáciu enzým-inhibítor pri 30 °C a nasledovalo pridanie substrátu a hydrolýza na približne 30 % konverziu, čo sa meralo na UV Thermomax® mikroplatňovom snímači. Koncentrácie substrátov sa udržiavali tak nízko, ako to bolo možné v porovnaní s K_M, aby sa znížila substrátová kompetícia. Koncentrácie zlúčenín sa menili v rozsahu od 300 do 0,06 μΜ v závislosti od ich účinku. Konečné podmienky pre každý test boli nasledovné:

50mM Tris-HCl pH 8, 0,5M Na₂SO₄, 50mM NaCl, 0,lmM EDTA, 3 % DMSO, 0,01 % Tween-20 s;

[100μΜ Succ-AAPF-pNA a 250pM α-chymotrypsín], [133μΜ Succ-AAA-pNA a 8nM prasacia elastáza], [133μΜ Succ-AAV-pNA a 8nM leukocytová elastáza]; alebo [lOOmM NaHPO₄ pH 6, 0,lmM EDTA, 3 % DMSO, lmM TCEP, 0,01 % Tween-20, 30μΜ Z-FR-pNA a 5nM katepsín B (zásobný enzým sa aktivuje pred použitím v tlmivom roztoku obsahujúcom 20mM TCEP)].

Nižšie je zhrnutý reprezentatívny príklad s prasacou pankreatickou elastázou:

Do polystyrénovej 96-jamkovej platne s plochým dnom sa použitím Biomek kvapalného manipulátora (Beckman) pridalo:

- 40 μΐ testovacieho tlmivého roztoku (50mM Tris-HCl pH 8, 50mM NaCl, 0,lmM EDTA);

- 20 μΐ enzymatického roztoku (50mM Tris-HCl pH 8, 50mM NaCl, 0,lmM EDTA), 0,02 % Tween-20, 40nM prasacia pankreatická elastáza); a

- 20 μΐ inhibítorového roztoku (50mM Tris-HCl pH 8, 50mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20, 1,5 mM až 0,3 μΜ inhibítora, 15 % v/v DMSO).

Po 60 minútach predinkubácie pri 30 °C sa do každej jamky pridalo 20 μΐ substrátového roztoku (50mM Tris-HCl pH 8, 0,5M Na₂SO₄, 50mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 μΜ Succ-AAPF-pNA) a reakčná zmes sa ďalej inkubovala pri 30 °C 60 minút a potom sa odčítala absorbancia na UV Thermomax® platňovom snímači. Jeden rad jamiek bol vyhradený pre kontroly (bez inhibítora) a jeden pre blanky (bez inhibítora aj enzýmu).

Kvapalným manipulátorom sa na oddelenej platni uskutočnili postupné 2-násobné riedenia inhibítorového roztoku použitím 50mM Tris-HCl pH 8, 50mM NaCI, 0,lmM EDTA, 0,02 % Tween-20, 15 % DMSO. Podobným spôsobom sa uskutočňovali všetky ďalšie testy špecificity.

Percento inhibície sa vypočítalo použitím nasledujúceho vzorca:

[l-((UV_inb - UV_blank)/(UV_ctl-UV_blank))]xl00.

Na inhibično-koncentračné údaje sa aplikovala nelineárna krivka zosúladená s Hill modelom a 50 % účinná koncentrácia (IC₅₀) sa vypočítala použitím SAS softvéru (Štatistický Softwarový Systém; SAS Inštitúte, Inc. Čary, N.C.).

Tabuľky zlúčenín

Zlúčeniny podľa vynálezu sa testovali buď v jednom, alebo oboch testoch uvedených v príkladoch 31 a 32 a zistilo sa, že sú účinné s IC₅₀ hodnotou nižšou ako 50 μΜ (A); nižšou ako 5 μΜ (B) alebo nižšou ako 0,5 μΜ (C).

Účinok v bunkách a špecificita

Reprezentatívne zlúčeniny podľa vynálezu sa testovali aj v teste podľa príkladu 33 založenom na náhradkových bunkách a v jednom alebo niekoľkých testoch podľa príkladu 34. Napríklad sa zistilo, že zlúčenina 233 z tabuľky 2 má IC₅₀ 1 nM v teste podľa príkladu 32. EC₅₀ stanovené testom podľa príkladu 33 je 5,4 μΜ, zatiaľ čo iné účinky (tTA) neboli detegovateľné v koncentráciách do 120 μΜ. Zlúčenina 233 bola testovaná aj v MTT teste a jej TC₅₀ bolo stanovené na viac ako 120 μΜ, z čoho vyplýva, že zlúčenina nie je toxická vo svojej účinnej koncentrácii. V špecifickom teste podľa príkladu 34 sa zistilo, že rovnaká zlúčenina má nasledujúci účinok: HLE>75 pm; PPE>75pm; a-Chym.>75 μΜ; Cat. B>75 μΜ.

Z týchto výsledkov vyplýva, že táto rodina zlúčenín je vysoko špecifická pre NS3 proteázu.

Nasledujúce tabuľky uvádzajú reprezentatívne zlúčeniny podľa vynálezu. Používané sú nasledujúce skratky: MS: údaje hmotnostnej spektroskopie; Ac: acetyl; Bn: benzyl; Chg: cyklohexylglycin (kyselina 2-amino-2-cyklohexyloctová); Dni: Danzyl; O-Bn: benzyloxy; Pip: kyselina pipekolová; Tbg: ŕerc-butylglycin.

Tabuľka 1

P1

Zlúč. č.	B	P6	P5	P4	P3	Rľ	R	P1 C1-C2	MS (MH*J	Rozsah účinku
101	Ac	—	...	Chg	Val	OBn	Et	1R.2R	613,4	A
102	Ac	—	...	Chg	Val	OBn	Et	1R,2?	613,4	A
103	Ac	—	—	Chg	Chg	1-NpCH2O	Et	1R,2?	703	B
104	Ac	...	...	Chg	Chg	1-NpCH2O	Et	1R.2R	703,4	B
105	Ac	—	—	Chg	Chg	1-NpCH2O	Et	1S.2S	703,5	B
106	Ac	—	___	Chg	Val	1-NpCH2O	Me	1R,2?	649,5	A
107	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	CHMe2	1R,2?	M+-Na 699	B

108	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Chg	1-NpCHíO	Et	1R.2R	947,4	C
109	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	CH2OCH2Ph	1R,2?	M+Na 777,4	A
110	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	CH2OCH2Ph	1R,2?	M+Na 777,4	A
111	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	(CH2)2Ph	1R,2?	M+Na 761	A
112	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	Et	1R.2R	M+Na 685	B

113	Ac		...	Chg	Val	1-NpCH2O	Et	1S,2S	M+Na 685	A
114	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	Bn	1R,2?	M+Na 747	A
115	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	Bn	1R,2?	M+Na 747	A
116	Ac	Asp	D-Glu	lle	Val	OBn	Et	1R.2R	M+Na 929,4	C
117	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Val	1-NpCH2O	Et	1R.2R	677,4	C
118	Ac	...	—	Chg	Val	1-NpCH2O	Pr	1R,2?	677,4	B
119	Ac			Chg	Val	1-NpCH2O	Pr	1R,2?	M+Na 899,5	A
120	Ac	Asp	D-Val	Chg	Val	1-NpCH2O	Et	1R.2R	648,3	C
121	Ac			Chg	Val	k	vinyl	1S.2R	726,6	B
122	Ac			Chg	Val		etyl	1R.2S	740,3	C
123	Ac			Chg	Val	tyty	propyl	1R,2R		C

Tabuľka 2

P1

Zlúč. č.	P6	P5	P4	P3	F?	R1	MS (MH+)	Rozs. účinku
201		—	Chg	Val	OBn	ch=ch2	611,3	B
202	—	...	Chg	Chg	1-NpCH2O	ch=ch2	701,3	C
203	—	...	Chg	Val	1-NpCH2O	ch=ch2	661,1	C
204	—	...	Chg	Val	OBn	CH-CHBr*	687,4	B
205			Chg	Val	cpo 0 X	ch=ch2	648,4	C
206			Chg	Val	θχρθ	ch=ch2	724,4	C
207			Chg	Tbg	x	ch=ch2	738,4	C
208			Chg	Val	Yry° x	ch=ch2	758,5	C
209			Chg	Val	ΑγΥ \	ch=ch2	754,5	C
210			Chg	Val	CAq x	ch=ch2	754,3	C

211			Chg	Val		ch=ch2	754,3	C
212	Asp	D-Glu	Chg	Val		ch=ch2	968,4	C
213			Chg	Val	O 1 yU	ch=ch2	719,3	B
214			Chg	Val	0 X	etyl	726,4	C
215			Val	Chg	Cy-XX X	ch=ch2	648,3	C
216			Chg	Val	T 0 ^νΛτνύχ H yU 0 \	ch=ch2	781,6	C
217			Chg	Val	0 x	ch=ch2	690,6	B
218			Chg	Val	o g h UU 0 x	ch=ch2	776,4	C

219			Chg	Val	N-N O \ L 11 N 0 X	CH=CH2	759,3	C
220			Chg	Val	Q o 0 \	ch=ch2	795,3	C
221			Chg	Val	Q H UU \	ch=ch2	796,3	C
222	Asp	D-Glu	Chg	Tbg		ch=ch2	982,4	C
223			Chg	Val	%, nV Ύη I c \	ch=ch2	825,3	C
224			Chg	Tbg	CXyAy 0 x	ch=ch2	798,3	C
225			Chg	Val	Οχθ^χΧ 1 ô x	ch=ch2	784,2	C
226			Chg	Val	θχχτ 0 x	ch=ch2	752,2	C

227			Chg	Val	Q 0 \	CH=CH2	715,4	B
228			Chg	Tbg	/ o C/~°z	ch=ch2	692,2	C
229			Chg	Val	αγγγ\ ΧΛ \ 1	ch=ch2	743,2	C
230			Chg	Val	N· Á N B Ί 0 \	ch=ch2	716,3	C
231			Chg	Tbg	\	ch=ch2	738,3	C
232			Chg	Tbg	θγγτΥ ! o x	ch=ch2	796,4	c
233			Chg	Tbg	í 0 x	ch=ch2	768,3	c

234			Chg	Tbg	0 x	CH=CH2	739,4	C
235			Chg	Val	o x	vinyl	782,2	C
236	Asp	D-Glu	lle	Val	O-Bn	vinyl	829,3	C
237			Chg	Val	AwT 'X-T 0 x	vinyl	768,4	B
238	Asp	D-Glu	Chg	Tbg	Οχζχθ'0'. x	vinyl	1012, 6	C

*Br izomérový pomer 5,5:2

Tabuľka 3

Zlúč, č,	B	P6	P5	P4	P3	-----R2	R1	W	MS (M-H)	Rozs. účinku
301	Ac	Asp	D-Glu	lle	Val	OBn	Et	NH-(S)- CHMePh	932,6	C
302	Dni	Asp	D-Glu	Chg	Tbg	4/ / Á o /	vinyl	OH	1203, 5	C

Tabuľka 4

Zlúč. č.	B	Y	P4	P3	R2	F	MS (Mľ-T)	Rozs. účinku
401	Ac	Me	Chg	Tbg	Ονγγ0-	vinyl	782,3	C

Tabuľka 5

Zlúč.	B	R20	MS	Rozs. účinku
501	Qy- O	0 x	802,4	C
502	CX^'X^ 0	X	852,4	C

503		0 x	851,3	C
504	o	0 x	851,3	C
505	ŕNY^i O	x	851,3	C
506	H	L^O 0 x	696,3	C
507	X 0	0 X	871,4	C

508	o,_ ii 0	θνγχ XAx □ X	855,4	C
509	H	\	726,7	C
510	ΛΑ \—z o=\	o x	901,7	C
511	Dni	yy O-/A za o /	959,4	c

Claims (69)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptidové analógy všeobecného vzorca (I), vrátane ich racemátov, diastereoizomérov a optických izomérov

   P6 P5 P4 P3 P2 P1

   -R' ° (I), kde a znamená 0 alebo 1; b znamená 0 alebo 1; Y znamená H alebo Ci_₆ alkyl;

   B znamená H, acylový derivát vzorca R⁷-C(O)- alebo sulfonyl vzorca R⁷-SO₂, kde

   R⁷ znamená (i) Ci_io alkyl voliteľne substituovaný karboxylom, C].₆ alkanoyloxy alebo C,._fl alkoxy;

   (ii) C₃.₇ cykloalkyl voliteľne substituovaný karboxylom, (C_b6 alkoxy)karbonyl alebo fenylmetoxykarbonyl;

   (iii) C₆ alebo C_l0 aryl alebo C₇.i₆ aralkyl voliteľne substituovaný C|.₆ alkylom, hydroxy alebo amino voliteľne substituované C|._(! alkylom; alebo (iv) Het voliteľne substituovaný C|_6 alkylom, hydroxy, amino voliteľne substituované Ci_₆ alkylom, alebo amido voliteľne substituované C_h6 alkylom, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, každý obsahujúci 1 alebo 2 atómy dusíka ;

   R⁶, ak je prítomné, znamená C_b6 alkyl substituovaný karboxylom;

   R³, ak je prítomné, znamená C|.₆ alkyl voliteľne substituovaný karboxylom;

   R⁴ znamená Cmo alkyl, C₃.₇ cykloalkyl alebo C4.10 (alkylcykloalkyl);

   R³ znamená C,._lo alkyl, C3.7 cykloalkyl alebo C₄.i₀ (alkylcykloalkyl);

   R² znamená CH2-R²⁰, NH-R²⁰, O-R²⁰ alebo S-R²⁰, kde R²⁰ znamená nasýtený alebo nenasýtený C3.₇ cykloalkyl alebo C4.10 (alkylcykloalkyl), ktorý je voliteľne mono-, di- alebo tri-substituovaný R²¹, alebo R²⁰ znamená C₆ alebo C10 aryl, C₇._]6 aralkyl, ktorý je voliteľne mono-, di- alebo tri-substituovaný R²¹, alebo

   R²⁰ znamená Het alebo (Cj^ alkyl)-Het voliteľne mono-, di- alebo tri-substituovaný R²¹, pričom Het je 6členný monocyklický heterocyklický kruh obsahujúci 1 atóm dusíka alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, obsahujúci 1 až 4 atómy dusíka;

   kde R²¹ znamená nezávisle C_t.₆ alkyl; alkoxy; amino voliteľne mono- alebo di-substituované C|.₆ alkylom; sulfonyl; NO₂; OH; SH; halogén; halogénalkyl; amido voliteľne monosubstituované Cj.₆ alkylom, C₆ alebo C₁₀ arylom, C₇.₁₆ aralkylom, Het, alebo (C_b6 alkyl)-Het; karboxyl; karboxy(C].₆ alkyl), pričom Het je v každom prípade nezávisle vybrané zo skupiny: pyridyl, morfolinyl, tetrazolyl a benzodioxozolyl; C₆ alebo C₁₀ aryl; C₇.i₆ aralkyl alebo Het, pričom uvedený aryl, aralkyl alebo Het je voliteľne substituovaný R²²;

   kde R²² znamená C_t.₆ alkyl; C].₆ alkoxy; amino voliteľne mono- alebo di-substituované Ci_6 alkylom; sulfonyl; NO₂; OH; SH; halogén; halogénalkyl; karboxyl; amid alebo (Ci_₆ alkyljamid;

   R¹ znamená C|.₆ alkyl alebo C₂.₆ alkenyl voliteľne substituovaný halogénom; a

   W znamená hydroxy alebo N-substituovanú aminoskupinu;

   alebo ich farmaceutický prijateľné soli alebo estery.
2. 2. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde B znamená H alebo acylový derivát vzorca R⁷C(O)-, kde R⁷ znamená C|._ô alkyl; C|._č alkoxy; C₃.₇ cykloalkyl voliteľne substituovaný hydroxyskupinou; amido voliteľne substituované Ci_₆ alkylom alebo Het; C₆ alebo C₎₀ aryl, C₇.₁₆ aralkyl alebo Het, všetko voliteľne substituované Ci_₆ alkylom alebo hydroxyskupinou, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh alebo 10-Členný bicyklický heterocyklický kruh, každý obsahujúci 1 alebo 2 atómy dusíka.
3. 3. Peptidové analógy podľa nároku 2, kde R⁷ znamená C].₆ alkyl alebo Het, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, každý obsahujúci 1 alebo 2 atómy dusíka.
4. 4. Peptidové analógy podľa nároku 3, kde Het je vybraná zo skupiny, ktorá pozostáva z:
5. 5. Peptidové analógy podľa nároku 2, kde B je vybrané zo skupiny, ktorá pozostáva z: H, acetylu;

   alebo
6. 6. Peptidové analógy podľa nároku 5, kde B znamená acetyl.
7. 7. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde B znamená R⁷-SO2, kde R⁷ znamená C6 alebo C₁₀ aryl, C₇.|₆ aralkyl alebo Het, všetko voliteľne substituované s Cj.₆ alkylom, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, každý obsahujúci 1 alebo 2 atómy dusíka.
8. 8. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp alebo Glu.
9. 9. Peptidové analógy podľa nároku 8, kde R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp.
10. 10. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde a znamená 0 a R⁶ potom nie je prítomné.
11. 11. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec aminokyseliny vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-ŕerc-butylglycin (Tbg) a L-Tbg. _s
12. 12. Peptidové analógy podľa nároku 11, kde R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D-Asp, D-Val alebo D-Glu.
13. 13. Peptidové analógy podľa nároku 12, kde R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D-Glu.
14. 14. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde a znamená 0 a b znamená 0, a potom R⁶ a R⁵ nie sú prítomné.
15. 15. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde R⁴ znamená bočný reťazec aminokyseliny vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z: Val, cyklohexylglycínu (Chg), Tbg, íle alebo Leu.
16. 16. Peptidové analógy podľa nároku 15, kde R⁴ znamená bočný reťazec Chg alebo íle.
17. 17. Peptidové analógy podľa nároku 16, kde R⁴ znamená bočný reťazec Chg.
18. 18. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde Y znamená H alebo Me.
19. 19. Peptidové analógy podľa nároku 18, kde Y znamená H.
20. 20. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde R³ znamená bočný reťazec aminokyseliny vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje: Ue, Chg, Val alebo Tbg.
21. 21. Peptidové analógy podľa nároku 20, kde R³ znamená bočný reťazec Val, Chg alebo Tbg.
22. 22. Peptidové analógy podľa nároku 21, kde R³ znamená bočný reťazec Val alebo Tbg.
23. 23. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde R² znamená S-R²⁰ alebo O-R²⁰, kde R²⁰ znamená C_t alebo C|₀ aryl, C₇.₁₆ aralkyl, Het alebo -CH₂-Het, pričom všetky sú mono-, di- alebo tri-substituované s R²¹, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh obsahujúci 1 atóm dusíka alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, obsahujúci 1 až 4 atómy dusíka;

    kde R²¹ znamená Cpe, alkyl; C^,, alkoxy; amino; mono- alebo di-( C|.,, alkyljamino; amido voliteľne monosubstituovaný s C|.₆ alkylom, C₆ alebo C₁₀ arylom, C₇.|₆ aralkylom, Het alebo (C|.₆ alkyl)-Het; NO₂; OH; halogén; trifluórmetyl; karboxyl; C₆ alebo C_lo aryl, C₇.₁₆ aralkyl alebo Het, pričom Het je v každom prípade nezávisle vybrané zo skupiny: pyrídyl, morfolinyl, tetrazolyl a benzodioxozolyl; a pričom aryl, aralkyl alebo Het sú voliteľne substituované s R²²;

    kde R²² znamená C_M alkyl; C_w alkoxy; amino; mono- alebo di-( C].₆ alkyljamino; (Ci.₆ alkyljamid; NO₂; OH; halogén; trifluórmetyl alebo karboxyl.
24. 24. Peptidové analógy podľa nároku 23, kde R²¹ znamená Ci.6 alkyl; C i_6 alkoxy; amino; di(Ci.6 alkyljamino; (Ci_6 alkyljamid; C6 alebo Cl0 aryl alebo Het, pričom Het je v každom prípade nezávisle vybrané zo skupiny: pyridyl, morfolinyl, tetrazolyl a benzodioxozolyl; a pričom aryl alebo Het sú voliteľne substituované s R²², kde R²² znamená C]_6 alkoxy; amino; di-( Ci_₆ alkyljamino; (Ci_₆ alkyljamid; halogén alebo trifluórmetyl.
25. 25. Petidové analógy podľa nároku 23, kde R² znamená 1-naftylmetoxy; 2-naftylmetoxy; benzyloxy, 1-naftyloxy; 2-naftyloxy; alebo chinolínoxy nesubstituované, mono alebo di-substituované s R²¹, pričom R²¹ je určené v nároku 23.
26. 26. Petidové analógy podľa nároku 23, kde R² znamená 1-naftylmetoxy; alebo chinolínoxy nesubstituované, mono alebo di-substituované s R²¹, pričom R²¹ je určené v nároku 23.
27. 27. Peptidové analógy podľa nároku 26, kde R² znamená:

    kde R^2ia znamená amido voliteľne mono-substituované C(.6 alkylom, C6 alebo Cw arylom, C7.16 aralkylom alebo Het; alebo C6, alebo C]0 aryl, alebo Het voliteľne substituované R²², pričom Het je v každom prípade nezávisle vybrané zo skupiny: pyridyl, morfolinyl, tetrazolyl a benzodioxozolyl; a R²² znamená amino; di(C(_₆ alkyljamino; alebo (C,^ alkyljamid a R^21B znamená C_w alkyl; C₁₆ alkoxy; amino; di-( Cj.₆ alkyljamino; (C|.₆ alkyljamid; NO₂; OH; halogén; trifluórmetyl alebo karboxyl.
28. 28. Peptidové analógy podľa nároku 27, kde R^2lA znamená C_f, alebo Cio aryl, alebo Het, všetko voliteľne substituované s R²², pričom Het je v každom prípade nezávisle vybrané zo skupiny: pyridyl, morfolinyl, tetrazolyl a benzodioxozolyl; a R²² znamená amino, dimetyl-amino alebo acetamido.
29. 29. Peptidové analógy podľa nároku 27, kde R^21B znamená C_b6 alkyl; C[.₆ alkoxy alebo di-( C|._s alkyljamino.
30. 30. Peptidové analógy podľa nároku 29, kde R^2IB znamená metoxy.
31. 31. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde asymetrický uhlík v polohe 1 má R konfiguráciu znázornenú nasledujúcimi absolútnymi konfiguráciami:

    /^R1 R¹ -N alebo H ľl 0 H ll 0

    kde R¹ je určené v nároku 1.
32. 32. Peptidové analógy podľa nároku 31, kde R¹ substituent na PI je orientovaný syn vzhľadom na karbonylovú skupinu, ako je znázornené nasledujúcou absolútnou konfiguráciou: kde R¹ znamená metyl, etyl, propyl, vinyl, pričom všetky sú voliteľne substituované halogénom.
33. 33. Peptidové analógy podľa nároku 32, kde R¹ znamená etyl, vinyl alebo brómvinyl.
34. 34. Peptidové analógy podľa nároku 33, kde R¹ znamená vinyl.
35. 35. Peptidové analógy podľa nároku 1, kde W znamená hydroxy alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ alebo ester; alebo (C 1₆ alkyljamino, di(Ci_₆ alkylj-amino alebo aminoaralkyl.
36. 36. Peptidové analógy podľa nároku 33, kde W znamená hydroxy alebo N(R^l3a)R^13b, kde R^13a a R^13b znamenajú nezávisle H, aryl alebo C|.6 alkyl voliteľne substituované hydroxy alebo fenylom; alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
37. 37. Peptidové analógy podľa nároku 36, kde W znamená -OH, -NH-benzyl alebo -NH-CH(Me)Ph.
38. 38. Peptidové analógy podľa nároku 37, kde W znamená -OH alebo -NH-(S)CH(Me)-fenyl.
39. 39. Peptidové analógy podľa nároku 38, kde W znamená ester, pričom uvedený ester je vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa C|_6 alkoxy, fenoxy alebo aryl-(C|.e alkoxy).
40. 40. Peptidové analógy podľa nároku 39, kde esterom je metoxy, etoxy, fenoxy, benzyloxy alebo PhCH(Me)-O-.
41. 41. Peptidové analógy vzorca (I) podľa nároku 1, kde B znamená H, C|_₍₎ alkyl-C(O)- alebo Het-C(O)-, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, každý obsahujúci 1 alebo 2 atómy dusíka;

    R⁶, ak j e prítomné, znamená bočný reťazec Asp alebo Glu;

    R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D- alebo L-: Asp, Glu, Val alebo Tbg;

    Y znamená H alebo metyl;

    R⁴ znamená bočný reťazec Val, Chg, Tbg, íle alebo Leu;

    R³ znamená vodík alebo bočný reťazec íle, Chg, Val alebo Tbg;

    R² znamená 1-naftylmetoxy, 2-naftylmetoxy, O-Bn, halogén, NH₂, NO₂, alkoxy pričom Het je v každom prípade nezávisle vybrané zo skupiny: pyridyl, morfolinyl, tetrazolyl a benzodioxozolyl; a kde R²² znamená amino; difC).,, alkyljamino; (Cj_₆ alkyljamid; NO₂; OH; halogén; CF₃ alebo COOH; P1 znamená cyklopropylový kruhový systém vzorca kde R¹ znamená etyl, vinyl alebo brómvinyl; a

    W znamená hydroxy alebo N(R^l3a)R^13b, kde R^l3a a R^l3b znamenajú nezávisle H, aryl alebo C|.₆ alkyl voliteľne substituovaný hydroxy alebo fenylom, alebo ich farmaceutický prijateľné soli alebo estery.
42. 42. Peptidové analógy vzorca (I) podľa nároku 1, kde B znamená H, acetyl alebo Het-C(O)-, pričom Het je 6-členný monocyklický heterocyklický kruh alebo 10-členný bicyklický heterocyklický kruh, každý obsahujúci 1 alebo 2 atómy dusíka;

    R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp; R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D-Asp, D-Glu alebo D-Val; Y znamená H; R⁴ znamená bočný reťazec Chg alebo íle; R³ znamená bočný reťazec Val, Chg alebo Tbg; R² znamená 1-naftylmetoxy, benzyloxy, 4-chinolinoxy alebo

    OMe, halogén, NH₂, alebo NO₂

    PI znamená cyklopropylový kruhový systém vzorca kde R¹ znamená Et alebo -CH=CH₂, alebo -CH=CHBr; a

    W znamená hydroxy alebo -NH-(S)CH(Me)Ph, alebojej farmaceutický prijateľná soľ alebo ester.
43. 43. Peptidové analógy vzorca (I) podľa nároku 1, kde B znamená acetyl; R⁶, ak je prítomné, znamená bočný reťazec Asp; R⁵, ak je prítomné, znamená bočný reťazec D-Glu; Y znamená H; R⁴ znamená bočný reťazec Chg; R³ znamená bočný reťazec Val alebo Tbg;

    R² znamená

    OMe

    PI znamená

    5 W znamená hydroxy, alebo ich farmaceutický prijateľné soli alebo estery.
44. 44. Peptidové analógy podľa nároku 41 reprezentované vzorcom

    B kde B, P6, P5, P4, P3, R² a R¹ sú určené:

    Zlúč. v c. B P6 P5 P4 P3 R² R¹ P1 C1-C2 101 Ac — — Chg Val OBn Et 1R,2R 102 Ac — — Chg Val OBn Et 1R,2? 103 Ac .— — Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1R,2? 104 Ac — — Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1R,2R 105 Ac — — Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1S,2S 106 Ac — — Chg Val 1-NpCH₂O Me 1R,2? 107 Ac Chg Val 1-NpCH₂O CHMe₂ 1 R.2? 108 Ac Asp D-Glu Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1R.2R 109 Ac Chg Val 1-NpCH₂O CH₂OCH₂Ph 1R,2?

    110 Ac ——— ——— Chg Val 1-NpCH₂O CH₂OCH₂Ph 1R,2? 111 Ac Chg Val 1-NpCH_zO (CH₂)₂Ph 1R,2? 112 Ac Chg Val 1-NpCH₂O Et 1R,2R 113 Ac Chg Val 1-NpCH₂O Et 1S.2S 114 Ac Chg Val 1-NpCH₂O Bn 1R,2? 115 Ac Chg Val 1-NpCH₂O Bn 1R,2? 116 Ac Asp D-Glu lle Val OBn Et 1R.2R 117 Ac Asp D-Glu Chg Val 1-NpCH_zO Et 1R.2R 118 Ac — — Chg Val 1-NpCH₂O Pr 1R,2? 119 Ac Chg Val 1-NpCH₂O Pr 1R,2? 120 Ac Asp D-Val Chg Val 1-NpCH₂O Et 1R,2R 121 Ac Chg Val ςο L vinyl 1S.2R 122 Ac Chg Val etyl 1R.2S 123 Ac Chg Val propyl 1R,2R _
45. 45. Peptidové analógy podľa nároku 41 reprezentované vzorcom

    PI kde P6, P5, P4, P3, R² a R¹ sú definované:

    Zlúč. č. P6 P5 P4 P3 R^z R¹ 201 ... ... Chg Val OBn ch=ch₂ 202 — — Chg Chg 1-NpCH_zO ch=ch₂ 203 — — Chg Val 1-NpCH₂O ch=ch₂ 204 — — Chg Val OBn CH=CHBr* 205 Chg Val CH=CH₂ 206 Chg Val ch=ch₂ 207 Chg Tbg 0 X ch=ch₂

    208 Chg Val χχχχ \ ch=ch₂ 209 Chg Val x ch=ch₂ 210 Chg Val x ch=ch₂ 211 Chg Val ch=ch₂ 212 Asp D-Glu Chg Val °x ch=ch₂ 213 Chg Val o ch=ch₂ 214 Chg Val x etyl 215 Val Chg x čh=ch₂

    216 Chg Val hY X j 0 x x CH=CH₂ 217 Chg Val 0 X ch=ch₂ 218 Chg Val °'^XY í? ^h ψυ 0 x ch=ch₂ 219 Chg Val n-n 9 N U jí N/X 'Λ/γ γη 0 x ch=ch₂ 220 Chg Val 0° ^ΛΥφΟ 0 x ch=ch₂ 221 Chg Val 0 ^H UU 0 X ch=ch₂ 222 Asp D-Glu Chg Tbg ch=ch₂

    223 Chg Val X sχο CH=CH₂ 224 Chg Tbg Ογ^ΝγΟχ \ ch=ch₂ 225 Chg Val My^NyL·⁰^ ch=ch₂ 226 Chg Val Cw \ ch=ch₂ 227 Chg Val 0 rX ^NX\Y 0 \ ch=ch₂ 228 Chg Tbg YXX c X CH=CH_Z 229 Chg Val ^CIY^NYY^C kAA₀ \ ¹ ch=ch₂

    230 Chg Val ’> ľ N, 1 ^N T Hl x ch=ch₂ 231 Chg Tbg 0 x ch=ch₂ 232 Chg Tbg Ο-φ-γ 0 x ch=ch₂ 233 Chg Tbg 0 x ch=ch₂ 234 Chg Tbg o x ch=ch₂ 235 Chg Val C F, rc N Jx. ~cô 0 x vinyl 236 Asp D-Glu lle Val O-Bn vinyl 237 Chg Val i 0 C< * Xyx 1 0 X vinyl

    P6

    B

    O

    R^s

    H

    N kde B, P6, P5, P4, P3, R², R¹ a W sú určené:

    Zlúč. č. B P6 P5 P4 P3 R² R W 301 Ac Asp D-Glu lle Val OBn Et NH-(S)- CHMePh 302 Dni Asp D-Glu Chg Tbg vinyl OH
46. 47. Peptidové analógy podľa nároku 41 reprezentované vzorcom
47. 48. Peptidové analógy podľa nároku 41 reprezentované vzorcom

    5 kde B a R²⁰ sú určené:

    Zlúč. B 501 ja AA n I ilty >N. > h ^N ΛΤ m ty 0 0 x 502 ... ty'' J\L T ty ík L/ 1 1 u Yl Xstyx o 0 x 503 ty' tyA II II 1 ^N<r L Π o 0 x

    504 n tyty aAa-^* r o AA M- x ✓ TI tyAo X 505 .N. f íl I Aty LA tyl· , ťl Ά. T 0 1 Atytyty ty 0 x

    506 H 0 x 507 XCv 0 508 <O> \—₂ ^o=\ 0 x 509 H CíXyxxyxX I °x 510 o O \ 511 Dni Οχζχθ'Χ °x
48. 49. Hexapeptid vzorca (I) podľa nároku 44, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeniny č: 108, 116, 117 a 120.

    5
49. 50. Hexapeptid vzorca (I) podľa nároku 45, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeniny č: 212,

    222, 236 a 238.
50. 51. Hexapeptid vzorca (I) podľa nároku 46, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeniny č: 301 a 302.
51. 52. Tetrapeptid vzorca (I) podľa nároku 44, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeniny č: 122 a

    10 123.
52. 53. Tetrapeptid vzorca (I) podľa nároku 45, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeniny č: 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 214, 215, 216, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 231,232,233,234,235.
53. 54. Tetrapeptid vzorca (I) podľa nároku 47, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeninu č: 401.
54. 55. Tetrapeptid vzorca (I) podľa nároku 48, ktorý je vybraný zo skupiny obsahujúcej zlúčeniny č: 501. 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510 a 511.
55. 56. Spôsob prípravy peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom PI znamená substituovaný aminocyklopropylový zvyšok karboxylovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    - spájanie peptidu vybraného zo skupiny obsahujúcej: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2 a APG-P2;

    s P1 medziproduktom vzorca

    O-CPG kde R¹ znamená C₁₆ alkyl alebo C₂.₆ alkenyl, voliteľne substituovaný s halogénom,

    APG znamená amino ochrannú skupinu, CPG znamená karboxyl chrániacu skupinu a P 6 až P2 sú určené v nároku 1.
56. 57. Spôsob prípravy peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom PI znamená substituovaný aminocyklopropylový zvyšok karboxylovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    - spájanie peptidu vybraného zo skupiny obsahujúcej: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2 a APG-P2;

    s P1 medziproduktom vzorca kde R¹ znamená etyl, vinyl alebo brómvinyl, APG znamená amino ochrannú skupinu, CPG znamená karboxyl chrániacu skupinu a P6 až P2 sú určené v nároku 1.
57. 58. Spôsob prípravy peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom PI znamená substituovaný aminocyklopropylový zvyšok karboxylovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    - spájanie peptidu vybraného zo skupiny obsahujúcej: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2 a APG-P2;

    s PI medziproduktom vzorca kde APG znamená amino ochrannú skupinu, CPG znamená karboxyl chrániacu skupinu a P6 až P2 sú určené v nároku 1.
58. 59. Spôsob podľa nárokov 64, 65 alebo 66, vyznačujúci sa tým, že karboxyl chrániaca skupina je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje: alkylester, aralkylestery a estery, ktoré sú štiepiteľné pôsobením miernych zásad alebo miernych redukčných činidiel.
59. 60. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptidový analóg všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 v množstve účinnom proti vírusu hepatitídy C alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ alebo ester, v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičovým médiom alebo s pomocným činidlom.

    t ý m , že druhým antivírut ý m , že obsahuje iné inhit ý m , že ďalej obsahuje in-
60. 61. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 60, vyznačujúci druhé antivírusové činidlo.
61. 62. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 61, vyznačujúci sovým činidlom je ribavirín alebo amantadín.
62. 63. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 60, vyznačujúci bítory HCV proteázy.
63. 64. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 60, vyznačujúci hibítor iných cieľov HCV životného cyklu, ktoré sú vybrané z: helikázy, polymerázy, metaloproteázy alebo vnútorného ribozómového vstupného miesta - IRES.
64. 65. Použitie peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo jeho terapeuticky prijateľnej soli alebo esteru na výrobu lieku na liečenie cicavca infikovaného vírusom hepatitídy C.
65. 66. Použitie peptidového analógu všeobecného vzorca (1) podľa nároku 1 alebo jeho terapeuticky prijateľnej soli alebo esteru, ktoré inhibujú NS3 proteázu vírusu hepatitídy C na výrobu lieku na inhibovanie replikácie vírusu hepatitídy C u cicavca.
66. 67. Použitie peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli alebo esteru spolu s interferónom na výrobu lieku na liečenie infekcie spôsobenej vírusom hepatitídy C.
67. 68. Aminokyselinový analóg vzorca

    OH kde R¹ znamená C|.₆ alkyl alebo C₂._fj alkenyl voliteľne substituovaný halogénom, ako medziprodukt na prípravu peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1.
68. 69. Aminokyselinový analóg vzorca kde R¹ znamená etyl, vinyl alebo brómvinyl, ako medziprodukt na prípravu peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1.
69. 70. Aminokyselinový analóg vzorca ako medziprodukt na prípravu peptidového analógu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1.