MXPA01001422A - Peptidos inhibidores de la hepatitis c - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I) en la que a es 0ó1;b es 0ó1;Y es H o alquilo C1-6;B es H, un derivado de acilo o un derivado de sulfonilo;R6, cuando estápresente, es alquilo C1-6 sustituido con carboxilo;R5, cuando estápresente, es alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con carboxilo;R4 es alquilo C1-10, cicloalquilo C3-7 o (alquilcicloalquilo) - C4-10;R3 es alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con carboxilo, cicloalquilo C3-7 o (alquilcicloalquilo) C4-10;R2 es CH2- R20, NH-R20, O-R20, en donde R20 es un cicloalquilo C3-7 saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo) C4-10 que estáopcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R21, o R20 es un arilo C6 o C10, aralquilo C7-16, Het o (alquil inferior) - -Het, todos ellos opcionalmente mono-, di- o tri-sustituidos con R21, en donde cada R21 es independientemente alquilo C1-6;alcoxi C1-6;amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C1-6;sulfonilo;NO2;OH;SH;halo;haloalquilo;amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C1-6, arilo C6 o C10, aralquilo C7- 16, Het o (alquil inferior) -Het;carboxilo;carboxi (alquil inferior);arilo C6 o C10, aralquilo C7-16 o Het;estando dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R22;en donde R22 es alquilo C1-6;alcoxi C1-6;amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C1-6;sulfonilo;NO2;OH;SH;halo;haloalquilo;carboxilo;amida;o (alquil inferior) amida;R1 es alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido con halógeno;y W es hidroxi o un amino N-sustituido;o una sal oéster del mismo aceptable farmacéuticamente;y su uso en la preparación de un medicamento para tratar infecciones por el virus de la hepatitis C.

Description

PEPTIDOS INHIBIDORES DE LA HEPATITIS C CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (HCV) . En particular, la presente invención proporciona nuevos péptidos, análogos y compuestos intermedios de los mismos, composiciones farmacéuticas que contienen tales péptidos, y métodos para usar estos péptidos en el tratamiento de la infección por HCV.

FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN El virus de la hepatitis C (HCV) es el principal agente etiológico de la hepatitis no-A no-B adquirida después de una transfusión y en comunidad del mundo. Se estima que más de 150 millones de personas están infectadas por el virus en todo el mundo. Un elevado porcentaje de portadores se convierten en infectados crónicos y muchos progresan hasta la enfermedad crónica del hígado, la llamada hepatitis C crónica. Este grupo es a su vez de alto riesgo para graves enfermedades del hígado tales como la cirrosis hepática, el carcinoma hepatocelular y enfermedades hepáticas terminales que producen la muerte. El mecanismo por el cual el HCV establece persistencia viral y produce una tasa elevada de enfermedad hepática crónica, no ha sido totalmente dilucidado. Se sabe cómo el HCV interacciona con el sistema inmunitario del hospedador y lo elude. Además, aún están por establecer los papeles que desempeñan las respuestas inmunitarias celulares y hormonales en la protección contra la infección por el HCV y contra la enfermedad. Se han publicado inmunoglobulinas para la profilaxis de la hepatitis viral asociada a transfusiones. Sin embargo, actualmente el Centro para el Control de Enfermedades no recomienda inmunoglobulinas con esta finalidad. La falta de una respuesta inmunitaria protectora eficaz está impidiendo el desarrollo de una , vacuna o de medidas Ref: 126861 profilácticas posteriores a la exposición adecuadas, por lo que a corto plazo las esperanzas están firmemente cifradas en intervenciones antivirales. Se han llevado a cabo diversos estudios clínicos con el objetivo de identificar agentes farmacéuticos capaces de tratar eficazmente la infección por HCV en pacientes que padecen hepatitis C crónica. Estos estudios han implicado el uso de interferón-alfa, solo o en combinación con otros agentes anti-virales. Tales estudios han demostrado que un número sustan-cial de los participantes no responden a estas terapias y se encontró que, de los que sí responden favorablemente, una elevada proporción recae después de la terminación del tratamiento. Hasta hace poco, el interferón (IFN) era la única terapia disponible de beneficio probado, aprobada en la clínica para pacientes con hepatitis C crónica. Sin embargo, la velocidad de respuesta sostenida es.baja y el tratamiento con interferón produce también graves efectos secundarios (p. ej . retinopatía, tiroiditis, pancreatitis aguda, depresión) que reduce la calidad de vida de los pacientes tratados. Recientemente se ha aprobado el interferón en combinación con ribavirina para pacientes que no responden al IFN solo. Sin embargo, los efectos secundarios producidos por el IFN no se alivian con esta terapia combinada. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar agentes antivirales efectivos para el tratamiento de la infección por HCV que superen las limitaciones de las terapias farmacéuticas existentes. El HCV es un virus de RNA con envuelta de cadena positiva en la familia de los Flaviviridae . El genoma de RNA del HCV monocatenario tiene una longitud aproximada de 9500 nucleótidos y tiene un único marco de lectura abierto (ORF: Open Reading Frame) que codifica una única poliproteína grande de aproximadamente 3000 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína es segmentada en múltiples sitios por proteasas celulares y virales produciendo las proteínas estructurales y no estructúralas (NS: Non-Structural) . En el caso del HCV, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) es realizada por dos proteasas virales. La primera de ellas, escasamente caracterizada hasta ahora, segmenta en la unión NS2-NS3; la segunda es una proteasa de serina contenida dentro de la región N-terminal de NS3 (en lo sucesivo se la denominará proteasa NS3) y media todas las segmentaciones subsiguientes aguas abajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de segmentación NS3-NS4A, como en trans para los sitios restantes NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. La proteína NS4A parece servir para múltiples funciones, actuando como cofactor para la proteasa NS3 , y posiblemente asistiendo en la localización en la membrana de NS3 y otros componentes de replicasa viral. La formación del complejo de la proteína NS3 con NS4A parece necesaria para los eventos de procesamiento, mejorando la eficacia proteolítica en. todos los sitios. La proteína NS3 muestra también actividades de nucleósido trifosfatasa y RNA helicasa. NS5B es una RNA polimerasa dependiente de RNA que interviene en la replicación del HCV. Una estrategia general para el desarrollo de agentes antivirales es inactivar enzimas codificadas viralmente que son esenciales para la replicación del virus. En esta vena, la solicitud de patente WO 97/06804 describe el enantiómero (-) del análogo de nucleósido citosina-1, 3-oxatiolano (también conocido como 3TC) como activo contra el HCV. Este compuesto, aunque publicado como seguro en ensayos clínicos previos contra HIV y HBV, ha de ser probado clínicamente como activo contra el HCV, y aún está por publicar su mecanismo de acción contra el virus. Los intensos esfuerzos para descubrir compuestos que inhiban la proteasa NS3 o la RNA helicasa del HCV han conducido a las siguientes descripciones: la patente de EE.UU. n° 5.633.388 describe carboxamidas sustituidas con compuestos heterocíclicos y análogos como activos frente el HCV. Estos compuestos están dirigidos contra la actividad de helicasa de la proteína NS3 del virus, pero aún no se han publicado ensayos clínicos. Chu et al . (Tet. Lett. (1996), 7229-7232) han publicado que una fenantrenoquinona tiene actividad contra la proteasa NS3 del HCV in vi tro . No se ha publicado ningún desarrollo más acerca de este compuesto. En un trabajo presentado en la Novena Conferencia Internacional sobre Investigación Antiviral, Urabandai, Fukyshima, Japón (1996) (Antiviral Research, 3,0, 1, 1996; A23 (resumen 19) ) se publica que los derivados de tiazolidina son inhibidores para la proteasa del HCV. Varios estudios han publicado compuestos inhibidores para otras proteasas de serina, tales como la elastasa leucocitapa humana. Una familia de estos compuestos se publica en el do-cumento WO 95/33764 (Hoechst Marión Roussel, 1995). Los péptidos descritos en esa solicitud son análogos del morfilinil-carbonil -péptido que son. estructuralmente diferentes de los péptidos de la presente invención. El documento WO 98/17679 de Vértex Pharmaceuticals Inc. describe inhibidores de proteasa de serina, en particular la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C. Estos inhibidores son análogos de péptidos basados en el sustrato natural NS5A/5B. Todos estos péptidos contienen la función carbonilo activada en el terminal C como característica esencial. Tam-bien se publicó que estos péptidos son activos contra otra proteasa de serina y, por tanto, no son específicos para la proteasa NS3 del HCV. Hoffman LaRoche ha publicado también hexapéptidos que son inhibidores de proteinasa útiles como agentes antivirales para el tratamiento de la infección por HCV. Estos péptidos contienen un aldehido o un ácido borónico en el término C. Steinkühler et al . e Ingallinella et al . han publicado acerca de la inhibición del producto de segmentación N terminal (Biochemistry (1998), 37, 8899-8905 y 8906-8914). Sin embargo, los péptidos y los análogos de péptidos presentados no incluyen ni conducen al diseño de los péptidos de la pre- senté invención. El documento WO 98/46597 de la Universidad Emory describe inhibidores de proteasas de serina, en particular de proteasa del virus de la hepatitis C. Todos los compuestos descritos son estructuralmente diferentes de los péptidos de la presente invención. El documento WO 98/46630 de Peptide Therapeutics Ltd. describe inhibidores de la proteasa NS3 de la hepatitis C. Sin embargo, ninguno de los péptidos descritos está relacionado con los péptidos de la invención. El documento JP 10298151 de Japan Energy Corp. describe derivados de serina sustituidos con N- (2 , 3-dihidroxibenzoílo) como inhibidores de la proteasa de serina, específicamente como inhibidores de la proteasa viral de la hepatitis C. Estos compuestos no contienen ninguna similitud estructural con los análogos de péptido de la presente invención. Una ventaja de la presente invención es que proporciona péptidos que son inhibidores para la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C. Otra ventaja de un aspecto de la presente invención reside en el hecho de que estos péptidos inhiben específicamente la proteasa NS3 y no muestran una actividad inhibidora significativa a concentraciones de hasta 300 µM contra otras proteasas de serina tales como la elastasa leucocitaria humana (HLE) , la elastasa pancreática porcina (PPE) o la quimotripsina pancreática bovina, o proteasas de cisteína tales como la catepsina B hepática humana (Cat B) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se incluyen en el alcance de la invención los racematos, diastereoisómeros e isómeros ópticos de un compuesto de fórmula (I) : P6 P5 P4 P3 P2 P1 en la que a es O ó 1; b es O ó 1; Y es H o alquilo C_-C6; B es H, un derivado de acilo de fórmula R7-C(0)- o un sulfonilo de fórmula R7-S02, en la que R7 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C1-6 o alcoxi Cx_6 ; (ii) cicloalquilo C3.7 opcionalmente sustituido con carboxilo, (alcoxi C_.6) carbonilo o fenilmetoxicarbonilo; (iii) arilo C6 o C10 o aralquilo C7.16 opcionalmente sus- tituido con alquilo C_.6, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con alquilo o (iv) Het opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, hidroxi, amino opcionalmente sustituido con alquilo C__6, o amido opcionalmente sustituido con alquilo C_.g; Rß, cuando está presente, es alquilo C__6 sustituido con carboxilo; Rs, cuando está presente,, es alquilo C__6 opcionalmente sustituido con carboxilo; R4esalquil0Ci.it), cicloalquilo C3.7 o (alquilcicloalquilo) C4._0; R3 es alquilo C_.__, cicloalquilo C3.7 o (alquilcicloalquilo) C4.10; R2 es CH2-R20, NH-R20, O-R20 ó S-R20, en donde R20 es un cicloalquilo C3.7 saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo) C4.10 que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R21, o R20 es un arilo C6 o C10 o aralquilo C7-16, opcionalmente mo-no-, di- o tri-sustituido con R21, o R20 es Het o Het- (alquilo inferior) opcionalmente mono- , di -o tri-sustituido con R21, en donde cada R21 es independientemente alquilo C__6; alcoxi C_.é; amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_.6; sulfonilo; N02; OH; SH; halo; haloalquilo; amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C_.6, arilo C6 o C10, aralquilo C7_16, Het o Het- (alquilo inferior) ,- carboxilo; carboxi (alquilo inferior); arilo Cß o C10, aralquilo C7.16 o Het, estando dichos arilo, aral- quilo o Het opcionalmente sustituidos con R22; en donde R22 es alquilo C_.6; alcoxi C_-6; amino op- cionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_.6; sulfonilo; N02; OH; SH; halo; haloalquilo; carboxilo; amida; o (alquilo inferior) amida; Rx es alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido con halógeno; y W es hidroxi o un amino N-sustituido; o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente. Se incluye dentro del alcance de la presente invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad viral -mente efectiva anti-hepatitis C, de un compuesto de fórmula I, o de una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, en mezcla con un medio vehículo o agente auxiliar aceptable farmacéuticamente . Un importante aspecto de la invención implica un método para tratar una infección viral de hepatitis C en un mamífero, administrando al mamífero una cantidad viralmente efectiva anti-hepatitis C del compuesto de fórmula I, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, o una composición como se describió anteriormente. Otro importante aspecto implica un método para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C exponiendo el virus a una cantidad que inhibe la proteasa NS3 viral de la hepatitis C del compuesto de fórmula I o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, o una composición como se descri-bió anteriormente. Todavía otro aspecto implica un método para tratar una infección viral de hepatitis C en un mamífero, administrando a dicho mamífero una cantidad viralmente efectiva anti-hepatitis C de una combinación del compuesto de fórmula I, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, y un interferón. Una composición farmacéutica que comprende la combinación mezclada con un medio vehículo o agente auxiliar aceptable farmacéuticamente está también dentro del alcance de esta invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se usan en el presente texto, las definiciones que siguen son válidas a menos que se indique otra cosa: Con referencia a los casos en los que se usan (i?) o (S) para designar la configuración de un radical, p. ej . R4 del compuesto de fórmula I, la designación se hace en el contexto del compuesto y no en el contexto del radical solo. Los aminoácidos naturales, con excepción de la glicina, contienen un átomo de carbono quiral . A menos que se indique de forma específica otra cosa, se prefieren los compuestos que contienen aminoácidos naturales con la configuración L. Sin embargo, los solicitantes consideran que, cuando se especifique, algunos aminoácidos de la fórmula I pueden ser de cualquiera de las configuraciones D o L o pueden ser mezclas de isómeros D y L, incluyendo las mezclas racémicas. La designación "Pl, P2 , P3 , etc." como se usa en el presente texto, se refiere a la posición de los restos de aminoácidos partiendo del extremo del término C de los análogos de péptido y prolongándose hacia el término N (es decir, Pl se refiere a la posición 1 desde el término C; P2 : posición segunda desde el término C, etc.) (véase Berger A. y Schechter I., Transactions of the Royal Society London serie B257, 249-264 (1970) ) . Las abreviaturas para los a-aminoácidos se exponen en la Tabla A.

TABLA A Como se usa en el presente texto, la expresión "ácido 1--aminociclopropil-carboxílico" (Acca) se refiere a un compuesto de fórmula: Como se usa en el presente texto, la expresión "terc-bu-tilglicina" (Tbg) se refiere a un compuesto de fórmula: El término "resto" con referencia a un aminoácido o un derivado de aminoácido significa un radical derivado del correspondiente a-aminoácido eliminando el hidroxilo del grupo carboxi y un hidrógeno del grupo a-amino. Por ejemplo, los términos Gln, Ala, Gly, He, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar y Tyr representan los "restos" de L-glutamina, L- -alanina, glicina, L-isoleucina, L-arginina, ácido L-aspárti-co, L-fenilalanina, L-serina, L-leucina, L-cisteína, L-aspa-ragina, sarcosina y L-tirosina, respectivamente. La expresión "cadena secundaria", con referencia a un aminoácido o un resto de aminoácido, significa un grupo unido al átomo de carbono a del a-aminoácido. Por ejemplo, la cadena secundaria del grupo R para la glicina es hidrógeno, para la alanina es metilo, para la valina es isopropilo. Para los grupos R específicos o cadenas laterales de los a-aminoácidos , se hace referencia al texto de A.L. Lehninger sobre Bioquímica (véase el capítulo 4). El término "halo", como se usa en el presente texto, significa un radical halógeno elegido entre bromo, cloro, fluoro o yodo. La expresión "alquilo C__6" o "alquilo (inferior)", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro radical, significa radicales alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen hasta seis átomos de carbono e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1, 1-dimetiletilo (p. ej . tere-butilo). La expresión "cicloalquilo C3.7", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro ra-dical, significa un radical cicloalquilo que contiene de tres a siete átomos de carbono e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. La expresión "cicloalquilo insaturado" incluye, por ejemplo, el ciclohexenilo: La expresión "alquilcicloalquilo (C4.10) " , como se usa en el presente texto, significa un radical cicloalquilo que contiene de tres a siete átomos de carbono unidos a un radical alquilo, conteniendo los radicales unidos hasta diez átomos de carbono; por ejemplo, ciclopropilmetilo, ciclopentiletilo, ci-clohexilmetilo, ciclohexiletilo o cicloheptiletilo. La expresión "alquenilo C2.10", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en.combinación con otro radical, significa un radical alquilo" como se definió anteriormente que contiene de 2 a 10 átomos de carbono, y que además contiene al menos un doble enlace. Por ejemplo, alquenilo incluye alilo y vinilo. La expresión "alcanoílo C_.6", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro radical, significa radicales 1-oxoalquilo lineales o ramificados que contienen de uno a seis átomos de carbono, e incluye formilo, acetilo, 1-oxopropil (propionilo) , 2-metil-l-oxopropilo, 1-oxohexi-lo, y similares. La expresión "alcoxi C_-6", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa el radical -O (alquilo C1-6) , en el que alquilo es como se definió anteriormente, que contiene hasta seis átomos de carbono. Al-coxi incluye metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi y 1, 1-dimetiletoxi . Este último radical se conoce normalmente como terc-butoxi . La expresión "cicloalcoxi C3.7", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa un grupo cicloalquilo C3.7 unido a un átomo de oxígeno, tal como, por ejemplo: La expresión "arilo Cg o C10", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa un grupo monocíclico aromático que contiene 6 átomos de carbono o bien un grupo bicíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. Por ejemplo, arilo incluye fenilo, 1-naftilo ó 2-naf-tilo.

La expresión "aralquilo C7.16", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa un grupo arilo C6 o C10 como se definió anteriormente unido a un grupo alquilo, en donde alquilo es como se definió anterior-mente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Aralquilo C7-16 incluye, por ejemplo, beñcilo, butilfenilo y l-naftilmetilo.

La expresión "amino-aralquilo" , como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa un grupo amino sustituido con un grupo aralquilo C7.16, tal como, por ejemplo, el amino-aralquilo : La expresión "carboxi -alquilo (inferior)", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa un grupo carboxilo (COOH) unido a un grupo alquilo (inferior) como se definió anteriormente, e incluye, por ejemplo, ácido butírico. La expresión "heterociclo" o "Het", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa un radical monovalente derivado de la eliminación de un hidrógeno de un heterociclo de cinco, seis o siete miembros, saturado o insaturado (incluido aromático) , que contiene de uno a cuatro heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Además, "Het", como se usa en el presente texto, significa un heterociclo como se definió anteriormente condensado con otro u otros ciclos, sea un heterociclo o cualquier otro ciclo. Ejemplos de heterociclos adecuados incluyen: pirrolidi-na, tetrahidrofurano, tiazolidina, pirrol, tiofeno, diazepina, 1H-imidazol, isoxazol, tiazol, tetrazol, piperidina, 1,4-dio-xano, 4-morfolina, piridina, pirimidina, tiazolo [4 , 5-b] -piridina, quinolina o indol, o los siguientes heterociclos: La expresión "(alquilo inferior) -Het" , como se usa en el presente texto, significa un radical heterocíclico como se definió anteriormente unido a través de una cadena o grupo alquilo ramificado, en donde alquilo es como se definió anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Ejemplos de (alquilo inferior) -Het" incluyen: La expresión "éster aceptable farmacéuticamente", como se usa en el presente texto, sola o en combinación con otro radical, significa esteres del compuesto de fórmula I en los que cualquiera de las funciones carboxilo de la molécula, pero preferentemente el término carboxi, está reemplazado por una función alcoxicarbonilo : en la que el resto R del éster se elige entre alquilo (p. ej . metilo, etilo, n-propilo, t-butilo, n-butilo) ; alcoxialquilo (p. ej . metoximetilo); alcoxiacilo (p. ej . acetoximetilo) ; aralquilo (p. ej . bencilo); ariloxialquilo (p. ej . fenoximeti-lo); arilo (p. ej . fenilo), opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_.4 o alcoxi C__4. Otros esteres de profármaco adecuados pueden encontrarse en Design of Prodrugs, Bund-gaard, H, comp. Elsevier (1985) , incorporado al presente texto como referencia. Tales esteres aceptables farmacéuticamente son normalmente hidrolizados in vivo cuando se inyectan en un mamífero y se transforman en la forma acida del compuesto de fórmula I . En relación con los esteres descritos anteriormente, a menos que se especifique otra cosa, cualquier resto alquilo presente contiene ventajosamente de 1 a 16 átomos de carbono, en particular de 1 a 6 átomos de carbono. Cualquier resto ari- lo presente en tales esteres comprende ventajosamente un grupo fenilo. En particular los esteres pueden ser un éster de alquilo C1-16, un éster de bencilo no sustituido o un éster de bencilo sustituido con al menos un halógeno, alquilo C_.6, alcoxi C1-ß, nitro o trifluorometilo.-* La expresión "sal aceptable farmacéuticamente", como se usa en el presente texto, incluye las que derivan de bases aceptables farmacéuticamente. Ejemplos de bases adecuadas incluyen colina, etanolamina y etilendiamina. Las sales de Na*, K+ y Ca*" se consideran también dentro del alcance de la invención (véase también Pharmaceutical salts, Birge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. (1977), 66_, 1-19, incorporado al presente texto como referencia) .

Realizaciones preferidas Se incluyen dentro, del alcance de esta invención los compuestos de fórmula I en los que B es preferentemente R7-S02, en donde R7 es preferentemente arilo C6 o C10, un aralquilo C7.16 o Het, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C1-6. Alternativamente, B es preferentemente H o un derivado de acilo de fórmula R7C(0)-, en donde R7 es preferentemente alquilo C__6; alcoxi C:.6; cicloalquilo C3.7 opcionalmente sustituido con hidroxi; amido opcionalmente sustituido con alquilo C_.6 o Het; arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C__6 o hidroxi. Más preferentemente, B es H o R7C(0)-, en donde R7 es más preferentemente alquilo C__6 o heterociclos tales como: Lo más preferentemente, B es H; acetilo; Incluso lo más preferentemente, B es acetilo. Se incluyen dentro del alcance de la invención compuestos de fórmula I, en los que Rß, cuando está presente, es prefe-rentemente la cadena secundaria de Asp o Glu. Lo más preferentemente, R6, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp. Alternativamente, de manera preferente, a es 0 y entonces R6 está ausente. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I en la que, preferentemente, R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-butilglicina (Tbg) yL-Tbg. Más preferentemente, R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp, D-Val o D-Glu. Lo más preferentemente, R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Glu. Alternativamente, preferentemente a es 0 y. b es 0, y entonces tanto R6 como R5 están ausentes. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que, preferentemente, R4 es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: Val, ciclohexilglicina (Chg) , Tbg, He o Leu. Más preferentemente, R4 es la cadena secundaria de Chg o de He. Lo más preferentemente, R4 es la cadena secundaria de Chg. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que, preferentemente, Y es H o Me. Lo más preferentemente, Y es H. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que, preferentemente, R3 es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por He, Chg, Val o Tbg. Más preferentemente, R3 es la cadena secundaria de Val, Chg o Tgb . Lo más preferentemente, R3 es la cadena secundaria de Val o Tgb. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que, preferentemente, R2 es S-R20 u O-R20, en donde R20 es preferentemente un arilo C6 o C10, aralquilo C7.16, Het o -CH2-Het, todos opcionalmente mono-, di- o tri-sustituidos con R21. Preferentemente, R21 es alquilo C_.6; alcoxi C__6; amino; mono- o di- (alquil inferior) amino; amido opcionalmente sustituido con alquilo C_.6, arilo C6 o C10, aralquilo C7.16, Het o (alquil inferior) -Het ; N02; OH; halo; trifluorometilo; carboxilo; arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het, estando dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R22. Más preferentemente, R21 es alquilo C_.6; alcoxi C__6; amino; di (alquil inferior) amino; (alquil inferior) amida; arilo C6 o C10, o Het, estando dichos arilo o Het opcionalmente sustituidos con R22. Preferentemente, R22 es alquilo alcoxi C_.6; amino; mono- o di- (alquil inferior) amino; (alquil inferior) amida; N02; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo. Más preferentemente, R22 es alcoxi C_.6; amino; di (alquil inferior) amino ; (alquil inferior) - amida; halo; o trifluorometilo. Más preferentemente, R2 es 1-naftilmetoxi ; 2-naftilmeto-xi benciloxi, 1-naftiloxi; 2-naftiloxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R21 como se definió anteriormente. Lo más preferentemente, R2 es 1-naftilmetoxi ; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R21 como se definió anteriormente. Lo más preferentemente aún, R2 es : Más preferentemente R21A es amido opcionalmente monosusti-tuido con alquilo C_ 6, arilo C6 o C1C, aralquilo C7.16 o Het; o arilo C6 o C10 o Het opcionalmente sustituido con R22. Lo más preferentemente, R21A es arilo C6 o C,0 o Het, todos opcional -mente sustituidos con R22. Lo más preferente, R22 es amino ; di (alquil inferior) amino ; o (alquil inferior) amida . Incluso más preferentemente, R22 es amino; dimetilamino; o acetamido. Incluso lo más preferentemente, R21A es arilo C6 o C10 o Het, todos no sustituidos. Preferentemente, R21B es alquilo C..6; alcoxi C_.6; amino; di (alquil inferior) aminq; (alquil inferior) amida; N02; OH; halo; trifluorometilo; o 'carboxilo. Más preferentemente, R21B es alcoxi C1-6; o di (alquil inferior) amino. Lo más preferentemente, R21B es metoxi. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que, preferentemente, Rx es metilo, etilo, propilo, vinilo, todos los cuales están opcionalmente sustituidos con halo. Más preferentemente, Rx es etilo, vinilo o bromovinilo. Lo más preferentemente, R? es vinilo. Están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que, preferentemente, W es hidroxi o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo; o (alquil inferior) amino, di (alquil inferior) amino o amino-aralquilo. Más preferentemente, W es hidroxi, o N(R13,)R13b, en donde R13a y R13b son independientemente H, arilo o alquilo C_.6 opcional -mente sustituido con hidroxi o fenilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Lo más preferentemente, W es -OH, -NH-bencilo o -NH-CH (Me) Ph. Aún lo más preferentemente, W es -OH o -NH- (S)CH (Me) -fenilo. Cuando W es un éster, tal éster se elige preferentemente entre alcoxi C_.6, fenoxi o aril (alcoxi . Más preferentemente, tal éster es metoxi, etoxi, fenoxi, benciloxi o PhCH(Me) -O- . Como se describió aquí anteriormente, el segmento Pl de los compuestos de fórmula I es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula: en la que C2 y C2 representan cada uno de ellos un átomo de carbono asimétrico en las posiciones 1 y 2 del anillo de ciclopropilo. Aparte de otros posibles centros asimétricos en otros segmentos de los compuestos de fórmula I, la presencia de estos dos centros asimétricos significa que el compuesto de fórmula I puede existir como mezclas racémicas de diastereoi-sómeros . Como se ilustra en los ejemplos más adelante, pueden prepararse las mezclas racémicas y después separarlas en los isómeros ópticos individuales, o pueden prepararse los isómeros ópticos mediante síntesis quiral. Por tanto, el compuesto de fórmla I puede existir como mezcla racémica de diastereoisómeros, en la que Rx en posición 2 está orientado sin respecto del carbonilo en posición 1, representado por el radical: o el compuesto de fórmula I puede existir como una mezcla racémica de diastereoisómeros, en la que Rx en posición 2 está orientado apti respecto del carbonilo en posición 1, represen-tado por el radical: A su vez, las mezclas racémicas pueden ser separadas en isómeros ópticos individuales. Uno de los hallazgos más interesantes de esta invención se refiere a la orientación espacial del segmento Pl. El hallazgo concierne a la configuración del carbono asimétrico en posición 1. Una realización preferida es una en la que el carbono asimétrico en posición 1 tiene la configuración R Más explícitamente, cuando el carbono 1 tiene la configuración R, la inhibición de la proteasa NS3 del HCV se mejora más por la posición del sustituyente R_^ (p. ej . alquilo o alquileno) en el carbono 2 del anillo de ciclopropilo. Uno de los compuestos más preferidos es un isómero óptico que tiene el sustituyente Rx y el carbonilo en una orientación sin en la configuración absoluta siguiente: En el caso en que Rx es etilo, por ejemplo, los átomos de carbono asimétricos en las posiciones 1 y 2 tienen la configu-ración R, R . A título ilustrativo del papel que desempeña la configuración absoluta del sustituyente sobre el nivel de potencia del compuesto, el compuesto 112 (Tabla 1) que tiene la configuración absoluta como 1R, 2R , tiene un valor de la CI50 de 1,6 µM, mientras que el correspondiente isómero 1S, 2S (compuesto 113) tiene una CI50 de 27,5 µM. Por consiguiente, el isómero 1R, 2R es 25 veces más potente que el correspondiente isómero 1S, 2S . También están incluidos en el alcance de la invención compuestos de fórmula I, en la que B es H, alquil inferior--C(O) - o Het-C(O) -; R6, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp o Glu; R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D- ó L:- Asp, Glu, Val o Tbg; Y es H o metilo; R4 es la cadena secundaria de Val, Chg, Tbg, He o Leu; R3 es la cadena secundaria de He, Chg, Val o Tbg; R2 es 1-naftilmetoxi, 2-naftilmetoxi, O-Bn, y R22 es amino; di (alquil inf erior) amino; (alquil inferior) ami da ; N02 ; OH; halo; CF3 ; o carboxi ; Pl es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula en la que R_, es o o romov n o; y W es hidroxi o N(R13a)R13b, en donde R13, y R13b son independiente- mente H, arilo o alquilo C_.g opcionalmente sustituidos con hidroxi o fenilo; o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo. Un grupo adicional de compuestos preferido está represen-tado por la fórmula I, en la que B es H, acetilo o Het-C(O)-; R6, cuando está presente," es la cadena secundaria de Asp; R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp, D-Glu o D-Val; Y es H; R4 es la cadena secundaria de Chg o He; R3 es la cadena secundaria de Val, Chg o Tbg; R2 es 1-naftilmeto-xi , benciloxi, 4 -quinolinoxi , o halo, NH- o NO, Pl es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula en la que R_. es Et o -CH=CH2 o -CH=CHBr; y W es hidroxi o -NH- (S) CH (Me) Ph, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente. Un grupo de compuestos incluso más preferidos está representado por la fórmula I, en la que B es acetilo; R6, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp; R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Glu; Y es H; R4 es la cadena secundaria de Chg; R3 es la cadena secundaria de Val o Tbg; R2 es: Pl es: W es hidroxi, o una sal o éster aceptable farmacéuticamente de los mismos. Finalmente, está incluido en el alcance de la invención cada compuesto de fórmula I presentado en las Tablas 1 a 5. Según una realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente otro agente anti -HCV. Ejemplos de agentes anti-HCV incluyen at-o ß- interferón, ribavirina y amantadina. Según otra realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente otros inhibidores de proteasa del HCV. Según otra realización alternativa más, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicional -mente un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, helicasa, polimerasa, metaloproteasa o sitio de entrada del ribosoma interno (IRES: Internal Ribosome Entry Site) . Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas oralmente, parenteralmente o por medio de un reservorio implantado. Se prefiere la administración oral o la administración por inyección. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener cualesquiera vehículos, coadyuvantes o portadores convencionales no tóxicos aceptables farmacéuticamente. En algunos casos, el pH de la formulación puede ser ajustado con ácidos, bases o tampones aceptables farmacéuticamente para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de suministro. El término parenteral, como se usa en el presente texto, incluye técnicas de inyec -ción o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial , intrasternal , intratecal e intralesional . Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de un preparado estéril inyectable, por ejemplo como una suspensión acuosa u oleaginosa estéril inyectable. Esta suspensión puede ser formulada según métodos conocidos en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, cápsulas, comprimidos y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para administración oral en forma de cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran oralmente suspensiones acuosas, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y suspendedores . Si se desea, pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes y/o aromatizantes y/o colorantes. Otros vehículos o portadores adecuados para las formulaciones y composiciones anteriormente apuntadas pueden encontrarse en textos farmacéuticos normales, p. ej . en "Reming-ton's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19* ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn. (1995) . Niveles de dosificación entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, preferentemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal al día, de los compuestos inhibidores de la proteasa descritos en el presente texto, son útiles en una mono-terapia para la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por el HCV. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención serán administradas de aproximadamente l a aproximadamente 5 veces al día o, alternativamente, como infusión continua. Tal administración puede usarse como tera- pia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con los materiales portadores para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del hospedador tratado y del modo de administración particular. Un preparado típico contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p) . Preferentemente, tales preparados contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto activo. Como apreciarán los expertos en la técnica, pueden pre-cisarse dosis inferiores o superiores a las citadas anteriormente. La dosificación y los regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente en concreto dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado ge-neral de salud, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el curso de. la infección, la predisposición del paciente para las infecciones y el criterio del médico encargado del tratamiento. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis sustancialmente inferiores a la dosis óptima del péptido. Después, la dosificación se aumenta en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias dadas. En general, lo más deseable es que se administre el compuesto a un nivel de concentración que gene-raímente proporcione resultados antivirales efectivos sin provocar efectos secundarios nocivos o deletéreos. Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un compuesto de fórmula I y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional han de estar presentes en niveles de dosificación entre aproximadamente 10 y 100%, y más preferentemente entre aproximadamente 10% y 80% de la dosificación normalmente administrada en un régimen de monoterapia. Cuando estos compuestos o sus sales farmacéuticamente aceptables se formulan junto con un vehículo aceptable farmacéuticamente, la composición resultante puede ser adminis- trada in vivo a mamíferos, tales como el hombre, para inhibir la proteasa NS3 del HCV o para tratar o prevenir la infección con el virus HCV. Tal tratamiento puede realizarse también usando los compuestos de esta invención en combinación con agentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, agentes in-munomoduladores , tales como interferones , ß o , - otros agentes antivirales, tales como ribavirina o amantadina; otros inhibidores de proteasa NS3 de HCV; inhibidores de otras dianas en el ciclo vital del HCV, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, helicasa, polimerasa, metaloproteasa o sitio de entrada del ribosoma interno (IRES); o combinaciones de los mismos. Los agentes adicionales pueden ser combinados con los compuestos de esta invención para crear una forma de dosificación individual. Alternativamente, estos agentes adicionales pueden ser administrados por separado a un mamífero como parte de una forma de dosificación múltiple. En consecuencia, otra realización de esta invención proporciona métodos para inhibir la actividad de proteasa NS3 del HCV en mamíferos mediante la administración de un compuesto de fórmula I, en la que los sustituyentes son como se definieron antes . En una realización preferida, estos métodos son útiles para reducir la actividad de proteasa NS3 del HCV en un mamífero. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de esta invención como componente activo, tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar a dicho mamífero un agente elegido entre un agente inmunomodu-lador, un agente antiviral, un inhibidor de proteasa del HCV o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV tales como helicasa, polimerasa, metaloproteasa o IRES. Tal agente adicional puede ser administrado al mamífero antes de, al mismo tiempo, o después de la administración de las composiciones de esta invención. En una realización preferida alternativa, estos métodos son útiles para inhibir la replicación viral en un mamífero.

Tales métodos son útiles para tratar o prevenir enfermedades por el HCV. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de esta invención como componente activo, tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar a dicho mamífero un agente elegido entre un agente in-munomodulador, un agente. antiviral, un inhibidor de proteasa del HCV o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV. Tal agente adicional puede ser administrado al mamífero antes de, al mismo tiempo, o después de la administración de la composición según esta invención. Los compuestos expuestos en el presente texto pueden usarse también como reactivos de laboratorio. Los compuestos de esta invención pueden usarse también para tratar o prevenir la contaminación viral de ciertos materiales y, por tanto, para reducir el riesgo de infeción viral del personal médico o de laboratorio, o de pacientes que entran en contacto con tales materiales (p. ej . sangre, tejidos, instrumentos y prendas de vestir quirúrgicos o de laboratorio, y aparatos y materiales para recogida de sangre) . Los compuestos expuestos en el presente texto pueden usarse también como reactivos para investigación. Los compuestos de esta invención pueden usarse también como testigos positivos para validar ensayos suplentes basados en células o ensayos de replicación viral in vi tro o in vivo .

PROCEDIMIENTO Los compuestos de la presente invención fueron sintetizados de acuerdo con el procedimiento que se ilustra en el esquema de resa an I (en el que CPG es un grupo protector de carboxilo y APG es un grupo protector de amino) : ESQUEMA DE RE-O.0EN I CPG) P1 P1-(wo CPG) + APG-P2 "* APG-P2-P1-(w o.

P2-P1-(w o- CPG) + APG-P3 APG-P3-P2-P1-(w o CPG) APG-P3-P2-P1-{ o CPG) APG-P5-P4-P3-P2-P1-( w o CPG) + APG-P5 APG-P6.P5.P4-P3-P2-PMW o. CPG) I . B.p6.p5-P4-P3-P2-P1- Formula I Brevemente expuesto, los grupos Pl, P2 , P3 , P4 y opcionalmente P5 y P6 pueden unirse por técnicas de acoplamiento de péptidos bien conocidas. Los grupos Pl, P2, P3 , P4 y P5 y P6 pueden unirse por cualquier orden siempre y cuando el compuesto final corresponda a péptidos de fórmula I. Por ejemplo, P6 puede unirse a P5 para dar P5-P6, que se une a P4-P3-P2-P1; o P6 puede unirse a P5-P4-P3-P2 y después unirse a un Pl apropiadamente protegido en el terminal C. Generalmente, los péptidos se prolongan desprotegiendo el grupo a-amino del resto N-terminal y acoplando el grupo carboxilo no protegido del siguiente aminoácido adecuadamente protegido en N, mediante un enlace peptídico, usando los métodos descritos. Este procedimiento de desprotección y acopla-miento se repite hasta que se obtiene la secuencia deseada. Este acoplamiento puede realizarse con los aminoácidos cons- tituyentes de una manera en etapas, como se presenta en el Esquema de reacción I o mediante condensación de fragmentos (dos o varios aminoácidos) , o una combinación de ambos procedimientos, o mediante síntesis de péptidos en fase sólida de acuerdo con el método originalmente descrito en Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), j35., 2149-2154, cuya descripción se incorpora al presente texto como referencia. El acoplamiento entre dos aminoácidos, un aminoácido y un péptido, o dos fragmentos de péptidos, puede realizarse usando procedimientos de acoplamiento estándar, tales como el método de la azida, el método del anhídrido de ácido carbóni-co-carboxílico mixto (cloroformiato de isobutilo) , el método de la carbodiimida (diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcar-bodiimida o carbodiimida soluble en agua) , el método del éster activo (éster p-nitrofenílico, imidoéster N-hidroxisuccínico) , el método del reactivo K de oodward, el método del carbo-nildiimidazol, métodos de los reactivos fosforados o de oxidación-reducción. Algunos de estos métodos (especialmente el método de la carbodiimida) pueden mejorarse añadiendo 1-hi-droxibenzotriazol . Estas reacciones de acoplamiento pueden realizarse bien sea en solución (fase líquida) o bien en fase sólida. Más explícitamente, la etapa de acoplamiento implica el acoplamiento deshidratante de un carboxilo libre de una sus-tancia reaccionante con el grupo amino libre de la otra sustancia reaccionante, en presencia de un agente de acoplamiento, para formar un enlace amida de unión. Descripciones de tales agentes de acoplamiento se encuentran en libros de texto generales acerca de la química de los péptidos, por ejemplo M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2a ed. rev., editorial Springer, Berlín, Alemania (1993) . Ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son N,N' -diciclohexilcarbodiimida, l-hi-droxibenzotriazol en presencia de N,N' -diciclohexilcarbodii-mida o N-etil-N' -[ (3 -dimetilamino) propil] carbodiimida. Un agente de acoplamiento muy práctico y útil es el hexafluoro-fosfato de (benzotriazol-1-iloxi) tris- (dimetilamino) fosfonio disponible comercialmente, bien sea por sí mismo o en presencia de 1-hidroxibenzotriazol . Otro agente de acoplamiento muy práctico y útil es el tetrafluoroborato de 2-(lH-benzo- triazol-1-il) -N,N,N' ,N' -tetrametiluronio disponible comercial-mente. Otro agente de acoplamiento muy práctico y útil es el hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-l-il) -N,N,N' ,N' - -tetrametiluronio disponible comercialmente. La reacción de acoplamiento se realiza en un disolvente inerte, p. ej. diclorometano, acetonitrilo o dimetilformamida . Se añade un exceso de una amina terciaria, p. ej . diisopropiletilamina, N-metilmorfolina o N-metilpirrolidina, para mantener la mezcla de reacción en un pH de aproximadamente 8. La temperatura de reacción se encuentra normalmente entre O'C y 50°C y el tiempo de reacción se encuentra normalmente entre 15 minutos y 24 h. Cuando se emplea un procedimiento de síntesis en fase sólida, el ácido carboxílico C-terminal se une a un soporte insoluble (normalmente poliestireno) . Estos soportes isolubles contienen un grupo que reaccionará con el ácido carboxílico para formar un enlace que es estable en las condiciones de prolongación, pero que es fácilmente segmentable más tarde. Ejemplos de ellos son: resina de cloro- o bromo-metilo, resina de hidroxime ilo, y resina de aminometilo. Muchas de estas resinas están disponibles comercialmente con el aminoácido C--terminal deseado ya incorporado. Alternativamente, el aminoácido puede ser incorporado al soporte sólido por métodos conocidos (Wang, S.-S., J. Am. Chem. Soc. (1973) 95., 1328; Atherton, E.; Shepard, R.C. "Solid-phase peptide synthesis; a practical approach" IRL Press: Oxford (1989) ; 131-148) . Además de los precedentes, se describen otros métodos de síntesis de péptidos en Stewart y Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2* ed. , Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, comps., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vols. 1, 2, 3, 5 y 9, Academic Press, Nueva York (1980-1987); Bodanszky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", editorial Springer, Nueva York (1984), cuyas descripciones se incorporan al presente texto como referencia. Los grupos funcionales de los aminoácidos constituyentes han de estar generalmente protegidos durante las reacciones de acoplamiento para evitar .la formación de enlaces no deseados. Una relación de grupos protectores que pueden ser usados se encuentra en Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry" , John Wiley and Sons, Nueva York (1981) y "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, Nueva York (1981) , cuyas descripciones se incorporan al presente texto como referencia. El grupo a-carboxilo del resto C-terminal está normalmente protegido como un éster (CPG) que puede ser segmentado para dar el ácido carboxílico. Los grupos protectores que pueden usarse incluyen: 1) esteres alquílicos tales como esteres de metilo, trimetilsililetilo y t-butilo, 2) aralquil-ésteres tales como bencilo y bencilo sustituido, o 3) esteres que pueden ser segmentados por un suave tratamiento básico, o medios reductores suaves, tales como los esteres de tricloroe-tilo y fenacilo. El grupo a-amino de cada aminoácido a acoplar a la cadena peptídica en crecimiento ha de estar protegido (APG) . Puede usarse cualquier grupo protector conocido en la técnica. Ejemplos de tales grupos incluyen: 1) grupos acilo tales como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo y p-toluenosulfonilo; 2) grupos carbamato aromáticos tales como benciloxicarbonilo (Cbz o Z) y benciloxicarbonilos sustituidos, y 9-fluorenilmetiloxi-carbonilo (Fmoc) ; 3) grupos carbamato alifáticos tales como terc-butiloxicarbonilo (Boc) , etoxicarbonilo, diisopropilmeto-xicarbonilo y aliloxicarbonilo; 4) grupos carbamato de alquilo cíclico tales como ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicar-bonilo; 5) grupos alquilo tales como trifenilmetilo y bencilo; 6) trialquilsililos tales como trimetilsililo; y 7) grupos que contienen tiol tales como feniltiocarbonilo y ditiasuccinoílo . El grupo protector de a-amino preferido es Boc o bien Fmoc. Se dispone comercialmente de muchos derivados de aminoácido adecuadamente protegidos para la síntesis de péptidos. El grupo protector de a-amino del resto de aminoácido recién añadido es segmentado antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. Cuando se usa el grupo Boc, los métodos de elección son ácido trifluoroacético, puro o en diclorometano, o HCl en dioxano o en acerato de etilo. Después se neutraliza la sal amónica resultante, bien sea antes del acoplamiento o bien in si tu, con soluciones básicas tales como tampones acuosos, o aminas terciarias en diclorometano o acetonitrilo o di-metilformamida. Cuando se usa el grupo Fmoc, los reactivos de elección son piperidina o piperidina sustituida en dimetilformamida, pero puede usarse cualquier amina secundaria. La desprotección se lleva a cabo a una temperatura entre 0°C y la temperatura ambiente (RT) , normalmente 20-22°C. Cualquiera de los aminoácidos que tienen funcionalidades de cadena lateral ha de ser protegido durante la preparación del péptido usando cualquiera de los grupos anteriormente descritos. Los expertos en la técnica apreciarán que la selección y el uso de grupos protectores adecuados para estas funcionalidades de cadena lateral depende del aminoácido y de la presencia de otros grupos protectores en el péptido. La selección de tal grupo protector es importante por cuanto es necesario que el grupo no sea eliminado durante la desprotección y el acoplamiento del grupo a-amino. Por ejemplo, cuando se usa Boc como grupo protector de a-amino, son adecuados los siguientes grupos protectores de cadena lateral: pueden usarse restos de p-toluenosulfonilo (tosilo) para proteger la cadena lateral amino de aminoácidos tales como Lys y Arg; pueden usarse restos acetamidometilo, bencilo (Bn) o t-butilsulfonilo para proteger la cadena lateral que contiene sulfuro de cisteína; pueden usarse bencil (Bn) -éteres para proteger las cadenas laterales que contienen hidroxi de la serina, treonina o hidroxiprolina; y pueden usarse bencil-esteres para proteger las cadenas laterales que contienen carboxi del ácido aspártico y el ácido glutámico. Cuando se elige Fmoc para la protección de la a-amina, normalmente son aceptables grupos protectores basados en tere-butilo. Por ejemplo, puede usarse Boc para lisina y arginina, terc-butil-éter para serina, treonina e hidroxiprolina, y éster terc-butílico para ácido aspártico y ácido glutámico. Puede usarse el resto trifenilmetilo (tritilo) para proteger la cadena secundaria de la cisteína, que contiene sulfuro.

Cuando es una amida (w) , Pl se acopla a una amina apropiada antes del acoplamiento con P2. Tal aminación puede ser fácilmente reconocida por los expertos en la técnica. Una vez que se ha completado la prolongación del péptido, se eliminan todos los grupos protectores. Cuando se usa una síntesis en fase líquida, los grupos protectores se eliminan de cualquier manera que venga dictada por la elección de los grupos protectores. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Cuando se usa un procedimiento de síntesis en fase sólida, el péptido se segmenta de la resina simultáneamente con la eliminación de los grupos protectores. Cuando se usa en la síntesis el método de protección con Boc, el tratamiento con HF anhidro que contiene aditivos tales como sulfuro de dimetilo, anisol, tioanisol o p-cresol a 0°C es el método preferido para segmentar el péptido de la resina. La segmentación del péptido puede conseguirse también mediante otros reactivos ácidos tales como las mezclas de ácido trifluorometanosulfóni-co/ácido trifluoroacético. Si se usa el método de protección con Fmoc, el grupo Fmoc N-terminal se segmenta con reactivos descritos anteriormente. Los otros grupos protectores y el péptido se segmentan de la resina usando solución de ácido trifluoracético y diversos aditivos tales como anisol, etc.

Síntesis del grupo B formador de casquete y restos P6, P5, P4 y P3 Se introducen distintos grupos de formación de casquete B en P4 , P5 o P6 protegidos o en cualquier segmento peptídico con un cloruro de acilo apropiado que, o es comercialmente disponible, o bien su síntesis es bien conocida en la técnica.

Hay distintos restos P6 a P3 disponibles comercialmente, o cuya síntesis es bien conocida en la técnica. 1. Síntesis de restos P2 1.1 Síntesis de precursores : A) Síntesis de derivados de haloarilmetano. La preparación de halometil-8-quinoleína lid se hizo de acuerdo con el procedimiento de K.N. Campbell et al., J. Amer. Chem. Soc. (1946) 68, 1844.

ESQUEMA DE REACCIÓN II Brevemente expuesto, el ácido 8-quinolina-carboxílico lia fue convertido en el correspondiente alcohol lie por reducción del correspondiente haluro de acilo Ilb con un agente reductor tal como hidruro de litio y aluminio. El tratamiento del alco-hol Ilb con el halohidrácido apropiado da el derivado halo lid deseado. Una realización específica de este procedimiento se presenta en el Ejemplo ÍA. B) Síntesis de derivados de aril-alcoholes . Se prepararon derivados de 2-fenil-4-hidroxiquinoleína lile de acuerdo con Giardina et al. (J. Med. Chem. (1997) 40, 1794-1807) .

ESQUEMA DE REACCIÓN III R22 Y R2IB = alquilo, OH, SH, halo, NH2, N02.

Se condensó benzoilacetamida (Illa) con la anilina apro-piada (Illb) y la imina obtenida se ciclizó con ácido polifosfórico para dar la correspondiente 2-fenil-4-hidroxiquinoleína (lile) . Una realización específica de este procedimiento se presenta en los Ejemplos IB y 1C. 1.2 Síntesis de P2 : A) La síntesis de prolina 4 -sustituida (en la que R2 está unido al anillo a través de un átomo de carbono) (con la estereoquímica que se muestra) : se hace como se muestra en el Esquema de reacción IV de acuerdo con los procedimientos descritos por J. Ezquerra et al. (Tetrahedron (1993) 3_8, 8665-8678) y C. Pedregal et al. (Tetrahedron Lett. (1994) 35., 2053-2056) .

ESQUEMA DE REACCIÓN IV COOBn IVd IVe Brevemente, el ácido Boc-piroglutámico se protege como éster bencílico. El tratamiento con una base fuerte, tal como diisopropilamiduro de litio, seguido por la adición de un agente de alquilación (Br-R: I-R 20, da los compuestos IVe deseados después de la reducción de la amida y la desprotección del éster.

B) La síntesis de 4 - (J?) -hidroxiprolina O-aralquilada : Cuando R20 es arilo, Het, aralquilo o (alquil inferior) -Het, el proceso puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por E.M. Smith et al. (J. Med. Chem. (1988) 3_1, 875-885) . Brevemente, se trata Boc-4 (J?) -hidroxiprolina con una base tal como hidruro sódico o K-tBuo, y el alcóxido resultante se hace reaccionar con un halo-R20 (Br-R20, I-R20, etc.) para dar los compuestos deseados. En los Ejemplos 2, 3 y 4B se presentan realizaciones específicas de este procedí -miento.

C) Alternativamente, cuando R20 es arilo o Het, los compuestos pueden también prepararse mediante una reacción de Mitsu-nobu (Mitsunobu (1981), Synthesis, enero, 1-28; Rano et al. (1995), Tet. Lett. 36(22) , 3779-3792; Krchnak et al. (1995), Tet. Lett. 36(5) . 62193-62196; Richter et al. (1994) Tet. Lett. 35 (27) , 4705-4706). Brevemente, se trata el éster metílico de Boc-4 (S) -hidroxiprolina disponible comercialmente con el alcohol arílico o tiol apropiado, en presencia de trifenilfosfina y dietilazodicarboxilato (DEAD) , y el éster resultante se hidroliza para dar el ácido. Una realización específica de este procedimiento se presenta en el Ejemplo 4A.

ESQUEMA DE REACCIÓN V Alternativamente, la reacción de Mitsunobu puede produ-cirse en feee sólida (Eequara de reacnóh V). EL bloque de 96 pcsdllos del sintetizador Modelo 396 (Advanced ChemTech) se provee de partes alícuotas de compuesto (Va) unido a la resina y se añaden diversos alcoholes arílicos o tioles y reactivos apropiados. Después de la incubación, cada producto unido a la resina (Vb) se lava, se seca y se segmenta de la resina. También puede usarse una reacción de Suzuki (Miyaura et al. (1981) Synth.' Comm. 11, 513; Sato et al. (1989), Chem. Lett. 1405; Watanabe et al. (1992) Synlett . , 207; Takayuki et al. (1993), J. Org. Chem. 58., 2201; Frenette et al. (1994), Tet. Lett. 35 (49) . 9177-9180; Guiles et al. (1996), J. Org. Chem. 61, 5169-5171), para funciona- lizar más el sustituyente de arilo.

Síntesis de restos Pl (ácido 1-a inociclopropil- carboxí lico 2 -sustituido) de acuerdo con el Esquema de reacción VI.

La síntesis se hizo ESQUEMA DE REACCIÓN VI a) Brevemente, el malonato di-protegido Vía y 1,2-dihaloal- cano VIb o sulfato cíclico VIc (sintetizado de acuerdo con K. Burgess y Chun-Yen KE (Synthesis, (1996) , 1463-1467) se hacen reaccionar bajo condiciones básicas para dar el diéster Vid. b) Se realiza una hidrólisis regioselectiva del éster menos impedido estéricamente para dar el ácido VIe. c) Este ácido VIe se somete a una redistribución de Curtius para dar una mezcla racémica de derivados de ácido 1-aminoci- clopropilcarboxílico Vlf, estando R1 sin respecto del grupo carboxilo. Una realización específica de esta síntesis se presenta en el Ejemplo 5. d) , e) Alternativamente, la formación de éster selectiva a partir del ácido VIe con un haluro (P*C1) o alcohol (P*OH) apropiados forma el diéster VIg, en el que el éster P* es co - patible con la hidrólisis selectiva del éster P. La hidrólisis del éster P proporciona el ácido VIh. f ) Una redistribución de Curtius en VIh da una mezcla racé- mica de derivados de ácido 1-aminociclopropilcarboxílico Vli estando el grupo R1 anti respecto del grupo carboxílico. Una realización específica de esta síntesis se presenta en el Ejemplo 10. Se describe más adelante una síntesis alternativa para la preparación de derivados Vlf (cuando R1 es vinilo, sin respecto del grupo carboxilo) .

ESQUEMA DE REACCIÓN VII El tratamiento de la imina Vlla disponible comercialmente con 1, 4-dihalobuteno Vllb en presencia de una base produce, después de la hidrólisis de la imina resultante VIIc, Vlld que tiene el sustituyente alilo sin respecto del grupo carboxilo. Este procedimiento se presenta en el Ejemplo 11. La resolución de todas las mezclas enantioméricas anteriores en el carbono 1 (VIe y Vlld) puede realizarse mediante: 1) separación enzimática (Ejemplos 9 y 13) ,- 2) cristalización con un ácido quiral (Ejemplo 14); ó 3) derivatización química (Ejemplo 6). Después de la resolución, puede realizarse la determinación de la estereoquímica absoluta como se presenta en el Ejemplo 7. La resolución y la determinación estereoquímica pueden realizarse de la misma manera para las mezclas enantioméricas en el carbono 1 en el que el sustituyente en C2 es anti respecto al grupo carboxilo (Vli) . En consecuencia, la invención comprende, además, un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) en el que Pl es un resto de ácido aminociclopro-pil-carboxílico, que comprende la etapa de: acoplar un péptido elegido entre el grupo consistente en: APG--P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4 -P3 -P2 ; APG-P4 -P3 -P2 ; APG-P3-P2; y APG-P2; con un producto intermedio Pl de fórmula: en la que Rx es alquilo C__6 o alquenilo C2.6 opcionalmente sustituido con halógeno, CPG es un grupo protector de carboxi-lo y APG es un grupo protector de amino, y P6 a P2 son como se definieron antes. Finalmente, la invención comprende también el uso de un producto intermedio de fórmula: en la que Rx es alquilo C_.6 o alquenilo C2.6 opcionalmente sustituido con halógeno, para la preparación de un compuesto de fórmula I como se definió anteriormente.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Las temperaturas se dan en grados Celsius. Los porcentajes de las soluciones expresan una relación de peso a volumen y las relaciones de las soluciones expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique otra cosa. Los es-pectros de resonancia nuclear magnética (NMR) se obtuvieron en un espectrómetro Bruker de 400 MHz; los desplazamientos químicos (d) se expresan en partes por millón. La cromatografía con resolución rápida se llevó a cabo en gel de sílice (Si02) de acuerdo con la técnica de cromatografía con resolución rápida de Still (W.C. Still et al., J. Org. Chem. (1978), 43, 2923). Las abreviaturas usadas en los ejemplos incluyen Bn: bencilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo {Me3COC(0)}; BSA: albúmina de suero bovino; CHAPS : 3- [ (3 -colamidopropil) -dimetilamonio] -1-propanosulfonato; DBU: 1 , 8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno; CH_C12=DCM: cloruro de metileno; DEAD: dietilazodicarboxilato; DIAD: diisopropilazodicarboxilato; DIPEA: disopropiletialami-na,- DMAP: dimetilaminopirídina; DCC: 1, 3-diciclohexilcarbodii-mida; DME: 1 , 2-dimetoxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DTT: ditiotreitol o treo-1, 4-dimercapto-2 , 3--butanodiol; DPPA: difenilfosforil-azida; EDTA: ácido etilen-diaminatetraacético; Et : etilo; EtOH: etanol; EtOAc : acetato de etilo; Et20: dietil-éter; HATU: [hexafluorofosfato de 0-7- -azabenzotriazol-1-il) -1, 1,3, 3 -tetrametiluronio] ; HPLC: cromatografía de líquidos de alto rendimiento; MS: espectrometría de masas (MALDI-TOF: Matrix Assisted Láser Disorption Ioniza- tion-Time of Flight, FAB: bombardeo con átomos rápidos) ; LAH: hidruro de litio y aluminio; Me: metilo; MeOH: metanol; MES: (ácido 2- {N-morfolino}etanosulfónico) ; NaHMDS: bis (trimetilsilil) amida sódica; NMM: N-metilmorfolina; NMP: N-metilpirroli- dina; Pr: propilo; Succ : 3 -carboxipropanoílo; PNA: 4-nitrofe-nilamino o p-nitroanilina; TBAF: fluoruro de tetra-n-butilamo-nio; TBTU: tetrafluoroborato de 2- (lH-benzotriazol-1-il) - -1, 1, 3 , 3 -tetrametiluronio; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TIS: triisopropilsilano; TLC: cromatografía en capa fina; TMSE: trimetilsililetilo; Tris/HCl : hidrocloruro de tris (hidroximetil) aminometano.

BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN P2 Ej emplo ÍA Síntesis de bromometil-8-guinole na (ÍA) : A ácido 8-quinolina-carboxílico disponible comercialmente (2,5 g, 14,4 mmol) se añadió cloruro de tionilo puro (10 ml , 144 mmol) . Esta mezcla se calentó a 80°C durante 1 h antes de eliminar por destilación bajo presión reducida el exceso de cloruro de tionilo. Al sólido parduzco resultante se añadió EtOH absoluto (15 ml) que se calentó a 80°C durante 1 h antes de concentrar bajo vacío. El residuo se repartió entre EtOAc y solución acuosa saturada de NaHC03, y la fase orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar un aceite parduzco (2,8 g) . Este material (aprox. 14,4 mmol) se añadió gota a gota a lo largo de 35 min a una suspensión de LAH (0,76 g, 20,2 mmol)/Et20 que fue enfriada a -60°C. La mezcla de reacción se calentó lentamente a -35 °C a lo largo de 1,5 h antes de completarse la reacción. La reacción se sofocó con MgSO4.10H2O lentamente durante 30 min y después con THF húmedo. La mezcla se repartió entre Et20 y solución acuosa de NaHC03 al 10%. La fase orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar un sólido amarillento (2,31 g, 80% a lo largo de 2 etapas) correspondiente al alcohol. El alcohol (2,3 g, 11,44 mmol) se disolvió en AcOH/HBr (20 mL, solución al 30% de Aldrich) y se calentó a 70°C durante 2,5 h. La mezcla se concentró bajo vacío a sequedad, se repartió entre EtOAc (100 mL) y solución acuosa saturada de NaHC03 antes de secar (MgS04) , filtrar y concentrar bajo vacío para dar el compuesto deseado (ÍA) como un sólido parduzco (2,54 g, 100%).

Ejemplo IB Síntesis de 2-fenil-4-hidroxiguinoleína (IB): Se calentó benzoilacetato de etilo disponible comercialmente (6,00 g, 31,2 mmol) a 85°C (tubo cerrado herméticamente) en 75 mL de NH4OH al 30% durante 2 horas. El sólido formado al enfriarse se filtró y se calentó a reflujo en agua durante 2 horas. La solución se extrajo tres veces con CH2C12. Las capas orgánicas se reunieron, se secaron sobre MgS04 , se filtraron y se concentraron. El residuo amarillo se sometió a cromatografía con resolución rápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc: hexano (3:7) para dar la correspondiente amida en forma de un sólido blanco, 1,60 g, 31% de rendimiento. Esta amida (250 mg, 1,53 mmol) se sometió a reflujo usando un aparato Dean-Stark con anilina (143 mg, 1,53 mmol) y anilina*HCl (10 mg, 0,08 mmol) en tolueno (10 mL) durante 16 h. La solución se concentró para dar un aceite pardo que se mezcló con ácido polifosfórico (2 g) y se calentó a 135°C durante 20 min. La mezcla de reacción se vertió en agua y se ajustó a pH 8 con NaOH 5 M. La suspensión acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentraron. El residuo fue sometido a cromatografía con resolución rápida sobre gel de sílice, eluyendo con MeOH al 3% en acetato de etilo, para dar 2-fenil-4-hidro-xiquinolina (IB), 67 mg, 20% de rendimiento. "-H NR (DMSO-dg) d 8,11 (d, J = 7 Hz, 1H) , 7,86-7,83 (m, 2H) , 7,77 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,68 (dd, J = 8, 7 Hz , 1H) , 7,61-7,58 (m, 3H) , 7,35 (dd, J = 8, 7 Hz, 1H) , 6,34 (s, 1H) .

EJEMPLO 1C Síntesis de 4-hidroxi-2-fenil-7-metoxiquinoleína (1C) 4 -hidroxi-2-fenil-7-metoxiquinolina (e) : Una solución de benzoilacetato de etilo (b) (100,0 g, 0,52 mol), m-anisidina (a) (128,1 g, 1,04 mol) y HCl 4N/dio-xano (5,2 mL) en tolueno (1,0 L) se calentó a reflujo durante 6,25 h en una aparato Dean-Stark. La solución en tolueno enfriada se lavó sucesivamente con solución acuosa de HCl al 10% (2 x 300 mL) , NaOH 1N (2 x 300 mL) , H20 (300 mL) y salmuera (150 mL) . La fase en tolueno se secó (MgS04) , se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar una mezcla 1,2:1,0 de éster c y amida d (144,6 g, 45%/38% rendimiento en crudo) en forma de un aceite pardo oscuro. El aceite crudo se calentó a 280°C durante 80 min mientras se destilaba el EtOH producido. El sólido oscuro enfriado obtenido se trituró con CH2C12 (200 mL) . La suspensión se filtró y el sólido resultante se lavó con CH2C12 para dar e (22,6 g, 17% a partir de a) en forma de un sólido beige: "? NMR (DMSO-d6) d 8 , 00 (d, J = 9, 0 Hz , 1H) , 7,81-7,82 (m, 2H) , 7,57-7,59 (m, 3H) , 7,20 (d, J = 2,2 Hz , 1H) , 6,94 (dd, J = 9,0, 2,2 Hz, 1H) , 6,26 (s, 1H) , 3,87 (s, 3H) . 4-cloro-2-fenil-7-metoxiquinolina (1C) : Una suspensión de e (8,31 g, 33,1 mmol) en P0C13 (90 mL) se calentó a reflujo durante 2 h (solución transparente obtenida al calentar) . La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se repartió entre NaOH 1N (exotérmico, se añade NaOH ION para mantener un pH elevado) y EtOAc (500 mL) . La capa orgánica se lavó con H20 (100 mL) y salmuera (100 mL) , y después se secó (MgS04) , se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar 1C (8,60 g, 96%) en forma de un sólido amarillo pálido: XH NMR (DMSO-d6) d 8,28--8,30 (m, 2H) , 8,20 (s, 1H) , 8,10 (d, J = 9,1 Hz, 1H) , 7,54--7,58 (m, 3H) , 7,52 (d, J = 2,5 Hz , 1H) , 7,38 (dd, J = 9,1, 2,5 Hz , 1H) , 3,98 (s, 3H) . Esta reacción se repitió tres veces y dio siempre 96-98% de rendimiento, que es significativamente más elevado que el rendimiento de 68% publicado en J. Med. Chem. 1997, 40, 1794.

EJEMPLO 2 Síntesis de Boc-4 (R) - (naftalen-1-ilmetoxi) prolina (2) (2) Se disolvió Boc-4 (i?) -hidroxiprolina disponible comercialmente (5,00 g, 21,6 mmol) en THF (100 mL) y se enfrió a 0°C. Se añadió en porciones hidruro sódico (dispersión al 60% en aceite, 1,85 g, 45,4 mmol) a lo largo de 10 minutos, y la suspensión se agitó a temperatura ambiente (TA) durante 1 h. Después se añadió 1- (bromometil) naftaleno (8,00 g, 36,2 mmol) (preparado como se describe en E.A. Dixon et al. Can. J. Chem. (1981) , 59, 2629-2641) y la mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. La mezcla se vertió en agua (300 mL) y se lavó con hexano. La capa acuosa se acidificó con HCl acuoso al 10% y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se reunieron y se lavaron con salmuera, se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía con resolución rápida (49:49:2 de hexano: acetato de etilo: ácido acético) para dar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (4,51 g, 56% de rendimiento) . :H NMR (DMSO-d6) indicaba la presencia de dos rotámeros: d 8,05 (m, 1H) , 7,94 (m, 1H) , 7,29 (d, J = 14 Hz, 1H) , 7,55-7,45 (m, 4H) , 4,96 (m, 2H) , 4,26 (s ancho, 1H) , 4,12 (dd, J = J = 8 Hz, 1H) , 3,54-3,42 (m, 2H) , 2,45-2,34 (m, 1H) , 2,07-1,98 (m, 1H) , 1,36 (s, (3/9) 9H) , 1,34 (s, (6/9) 9H) .

EJEMPLO 3 Síntesis de Boc-4 (R) - (8-quinolina-metoxi) prolina (3): Se añadió Boc-4- (R) -hidroxiprolina (1,96 g, 8,5 mmol) en THF anhidro (20 mL) a una suspensión de NaH (1,4 g, 60% en aceite, 34 mmol) en THF (100 mL) . La mezcla se agitó durante min antes de añadir bromometil- 8 -quinolina del Ejemplo ÍA (2,54 g, 11,44 mmol) en THF (30 mL) . La mezcla de reacción se calentó a 70°C (5 h) antes de destruir cuidadosamente el NaH en exceso con THF húmedo. La reacción se concentró bajo vacío y el material resultante se disolvió en EtOAc y H20. La fase acuosa de carácter básico se separó y se acidificó con HCl acuoso al 10% a pH aprox. 5 antes de extraerla con EtOAc (150 mL) . La fase orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar un aceite pardo. La purificación mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente: MeOH al 10%/ CHC13) dio el compuesto deseado en forma de un sólido amarillo pálido (2,73 g, 86%). HPLC (97,5%); ? NMR (DMSO-d6) muestra poblaciones de rotámeros en una relación 6:4, d 12-11,4 (s ancho, 1H), 8, 92 (2 x d, J = 4,14 y 4,14 Hz, 1H), 8,38 (2 x d, J = 8,27 y 8,27 Hz , 1H) , 7,91 (d, J = 7,94 Hz, 1H) , 7,77 (d, J = 7,0 Hz, 1H) , 7,63-7,54 (m, 2H) , 5,14 (2 X s, 2H) , 4,32- -4,29 (m, 1H) , 4,14-4,07 (m, 1H) , 3,52-3,44 (m, 2H) , 2,43-2,27 (m, 1H) , 2,13-2,04 (m, 1H) , 1,36 y 1,34 (2 x s, 9H) .

EJEMPLO 4A Preparación de Boc-4 (R) - (7 -cloroquinolina-4-oxo) prolina (4A) : Se pusieron éster metílico de Boc-4 ( S) -hidroxiprolina (500 mg, 2,04 mmol) comercialmente disponible y 7-cloro-4-hidroxiquinolina (440 mg, 2,45 mmol) en THF seco (10 mL) a 0°C. Se añadió trifenilfosfina (641 mg, 2,95 mmol) , seguido de la adición lenta de DIAD (426 mg, 2,45 mmol) . La mezcla se agitó a TA durante 20 h. Después se concentró la mezcla de reacción, se recogió en acetato de etilo y se extrajo tres veces con HCl 1N. La fase acuosa se alcalinizó con Na2C03 y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se reunieron, se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentraron para dar un aceite amarillo. El aceite se purificó mediante cromatografía con resolución rápida para dar el éster metílico del compuesto 4A en forma de un sólido blanco, 498 mg, 58% de rendimiento. Este éster metílico (400 mg, 0,986 mmol) fue hidrolizado con hidróxido sódico acuoso 1M (1,7 mL, 1,7 mmol) en metanol (4 mL) , a 0°C, durante 3 h. La solución se concentró para eliminar el metanol y se neutralizó con HCl acuoso 1M. La suspensión se concentró a sequedad y se recogió en metanol (20 mL) , las sales se eliminaron por filtración y el filtrado se concentró para dar el compuesto deseado 4A en forma de un sólido blanco, 387 mg, rendimiento cuantitativo. H NMR (DMSO-dg) (mezcla de rotámeros aprox. 1:1) d 8,74 (d, J = 5 Hz, 1H) , 8,13-8,09 (m, 1H) , 7,99 y 7,98 (s, 1H) , 7,58 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,02 (d, J = 5 Hz, 1H) , 5,26-5,20 (m, 1H) , 4,10-4,01 (m, 1H) , 3,81-3,72 (m, 1H) , 3,59 (dd, J = 12, 10 Hz, 1H) , 2,41-2,31 (m, 2H) , 1,34 y 1,31 (s, 9H) .

EJEMPLO 4B Síntesis de Boc-4 (R) - (2-fenil-7-metoxiquinolina-4-oxo) rolina (4B) : 1- [ (1, 1-dimetiletoxi) carbonil] -4 (R) - [ (7-metoxi-2-fenil-4-qui-nolinil) oxi] -L-prolina (4B) : Se añadió terc-butóxido potásico (8,16 g, 72,7 mmol) en pequeñas porciones, a lo largo de 15 min, a una solución de 4 - - (5) -hidroxiprolina disponible comercialmente (6,73 g, 29,1 mmol) en DMSO (83 mL) mantenida a 25°C. La mezcla se agitó a 25°C durante 1,5 h. Se añadió a la mezcla de reacción cloro-2- -fenil-7-metoxiquinolina 1C (8,61 g, 32,0 mmol) en 4 porciones a lo largo de 15 min. La mezcla de reacción se agitó a 25°C durante 19 h. La suspensión resultante se vertió en H20 (650 mL) y la mezcla se lavó con Et20 (3 x 150 mL) para eliminar el exceso de cloroquinolina (más adelante se encontró que el EtOAc era más eficaz) . La capa acuosa se acidificó con solución acuosa de HCl 1N (38 mL de 1,5 equiv. calculados requeridos, 43,6 mL) a pH 4 - 5. El sólido blanco que precipitó se recogió mediante filtración. El sólido húmedo se secó bajo presión reducida sobre P2Os para dar el derivado de prolina 4B (12,6 g, 91%, contiene 2,3% p/p de DMSO) en forma de un sólido beige: *H NMR (DMSO-dg) d (mezcla 2:1 de rotámeros) 8,27 (d, J = 7,0 Hz, 2H) , 8,00, 7,98 (2d, J = 9,2, -9,2 Hz , 1H) , 7,48-7,56 (m, 3H) , 7,45, 7,43 (2s, 1H) , 7,39 (d, J = 2,5 Hz, 1H) , 7,17 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1H) , 5,53-5,59 (m, 1H) , 4,34-4,41 (m, 1H) , 3,93 (s, 3H) , 3,76 (s ancho, 2H) , 2,63-2,73 ( , 1H) , 2,32-2,43 (m, 1H) , 1,36, 1,33 (2s, 9H) .

ELEMENTOS DE CONSTRUCCIÓN Pl EJEMPLO 5 Síntesis de la mezcla de ácido ( IR, 2R)/( 1S, 2R) l-amino-2 -etil-ciclopropil-carboxílico 5c c) Et J, DPPA después 2-tn u refino a) A una suspensión de cloruro de benciltrietilamonio (21,0 g, 92,19 mmol) en una solución acuosa de NaOH al 50% (92,4 g en 185 mL de H20) se añadieron sucesivamente malonato de di- tere-butilo (20,0 g, 92,47 mmol) y 1, 2-dibromobutano (30,0 g, 138,93 mmol). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante la noche a TA y después se añadió una mezcla de hielo y agua. El producto crudo se extrajo con CH2C12 (3x) y se lavó secuencialmente con agua (3x) y salmuera. La capa orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró. El residuo se sometió a cromatografía con resolución rápida (7 cm, 2 a 4% de Et20 en hexano) para dar el derivado de ciclopropano deseado 5c (19,1 g, 70,7 mmol, 76% de rendimiento). ? NMR (CDCl.) d 1,78-1,70 (m, 1H) , 1,47 (s, 9H) , 1,46 (s, 9H) , 1,44-1,39 (m, 1H) , 1,26--1,64 (m, 3H) , 1,02 (t, 3H, J = 7,6 Hz). b) A una suspensión de terc-butóxido potásico (6,71 g, 59,79 mmol, 4,4 eq.) en éter seco (100 mL) a 0°C se añadió H20 (270 µL, 15,00 mmol, 1,1 eq. ) . Después de 5 min se añadió a la suspensión el diéster 5c (3,675 g, 13,59 mmol) en éter (10 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA, después se vertió en una mezcla de hielo y agua y se lavó con éter (3x) . La capa acuosa se acidificó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10% a 0°C y se extrajo con AcOEt (3x) . Las capas orgánicas reunidas se lavaron sucesivamente con agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (Na2S04, filtración, concentración) , se aisló el ácido 5d deseado en forma de un aceite amarillo pálido (1,86 g, 8,68 mmol, 64% de rendimiento). :H NMR (CDC13) d 2,09-2,01 (m, 1H) , 1,98 (dd, J = 3,8, 9,2 Hz, 1H) , 1,81-1,70 (m, 1H) , 1,66 (dd, J = 3,0, J = 8,2 Hz, 1H) , 1,63-1,56 (m, 1H) , 1,51 (s, 9H) , 1,0 (t, J = 7,3 Hz, 3H) . c) Al ácido 5d (2,017 g, 9,414 mmol) en benceno seco (32 mL) se añadieron sucesivamente Et3N (1,50 mL, 10,76 mmol, 1,14 eq.) y DPPA (2,20 mL, 10,21 mmol, 1,08 eq.). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3,5 h y después se añadió 2-trimetilsililetanol (2,70 mL, 18,84 mmol, 2,0 eq.). El reflujo se mantuvo durante la noche y después la mezcla de reacción se diluyó con Et20 y se lavó sucesivamente con una solución de ácido cítrico al 10%, agua, solución acuosa satu-rada de NaHC03, agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgS04, filtración y concentración) , el residuo se purificó mediante cromatografía con resolución rápida (5 cm, AcOEt-hexano al 10%) para dar el carbamato 5e deseado (2,60 g, 7,88 mmol, 84% de rendimiento) en forma de un aceite amarillo pálido. MS (FAB) 330 (MH*) ; 'H NMR (CDCl3) d 5,1 (s ancho, 1H) , 4,18-4,13 (m, 2H) , 1,68-1,38 (m, 4H) , 1,45 (s, 9H) , 1,24-1,18 (m, 1H) , 1,00-0,96 (m, 5H) , 0,03 (s, 9H) . d) Al carbamato 5e (258 mg, 0,783 mmol) se añadió una solu-ción de TBAF 1,0 M en THF (940 µL, 0,94 mmol, 1,2 eq.). Después de 4,5 h, se añadió una cantidad adicional de TBAF 1,0 M (626 µL, 0,63 mmol, 0,8 eq.) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA, se calentó a reflujo durante 30 min y después se diluyó con AcOEt . La solución se lavó sucesivamente con agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgS04, filtración y concentración) se aisló la amina 5f deseada (84 mg, 0,453 mmol, 58% de rendimiento) en forma de un líquido amarillo pálido. ? NMR (CDC13) d 1,96 (s ancho, 2H) , 1,60-1,40 (m, 2H) , 1,47 (s, 9H) , 1,31-1,20 (m, 1H) , 1,14 (dd, J = 4,1, 7,3 Hz, 1H) , 1,02 (dd, J = 4,1, 9,2 Hz, 1H) , 0,94 (t, J = 7,3 Hz, 3H) .

EJEMPLO 6 Resolución química del ( lR, 2R)/( 1S, 2R ) -l-amino-2-etil-ciclo-propil-carboxilato de t-butilo (del Ejemplo 5) : 6a 6b Isómeros separados por cromatogr. en columna Isómero RR Isómero SR El compuesto 5e del Ejemplo 5 (8,50 g, 25,86 mmol) fue tratado con TBAF/THF 1M (26 mL) a reflujo durante 45 min. La mezcla de reacción enfriada se diluyó con EtOAc, se lavó con agua (3x) y salmuera (lx) y después se secó (MgS04) , se filtró y se evaporó para proporcionar la amina libre en forma de un aceite amarillo claro. La amina libre se disolvió en CH2C12 anhidro (120 mL) , y se añadieron sucesivamente NMM (8,5 mL, 77,57 mmol), compuesto 2 (Ejemplo 2) (10,08 g, 27,15 mmol) y HATU (11,79 g, 31,03 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche y después se elaboró como se describió anteriormente. La mezcla diastereoisómera cruda se separó mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente - hexa-no:Et20; 25:75) para proporcionar el dipéptido 6a (la mancha que eluye menos polar) en forma de una espuma blanca (4,42 g; 64% del rendimiento teórico) y 6b (la mancha que eluye más polar) en forma de una espuma de color marfil (4 g, 57% del rendimiento teórico) . En este momento ambos isómeros fueron separados, pero aún no se conocía la estereoquímica absoluta.

EJEMPLO 7 Determinación de la estereoquímica absoluta de los compuestos 6a y 6b por correlación con ( lR-amino-2R-etilciclopropil) carboxilato de t-butilo conocido compuesto publicado Comparación directa por TLC, HPLC y NMR El Prof. A. Charette, de la Universidad de Montreal, proporcionó el compuesto 7a que tiene la estereoquímica absoluta que se indica, que fue determinada por cristalografía de rayos X (J. Am. Chem. Soc, 1995, ¿17. 12721). El compuesto 7a (13,2 mg, 0,046 mmol) se disolvió en HCl/EtOAc 1M (240 µL) y se agitó durante aproximadamente 48 horas. La mezcla se evaporó a sequedad para proporcionar el compuesto 7b en forma de una pasta amarilla clara, y se acopló con el compuesto 2 (18 mg, 0,049 mmol) como se describe en el Ejemplo 6, usando NMM (20,3 µL, 0,185 mmol) y HATU (21,1 mg, 0,056 mmol) en CH2C12. El material crudo fue purificado mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente - he-xano:Et20; 50:50) para proporcionar el dipéptido 7c en forma de un aceite (7,7 mg; 31%) . Comparando por TLC, HPLC y NMR, se encontró que el dipéptido 7c era idéntico al compuesto 6a menos polar obtenido en el Ejemplo 6, identificándose así la estereoquímica absoluta de 6a como (1R, 2R) .

EJEMPLO 8 Preparación de ácido (1R, 2R )/(lS, 2R) -l-Boc-amino-2-etil-ciclopropil-carboxílico (8a) : Me3S¡- 5e 8a El carbamato 5e del ejemplo 5 (2,6 g, 7,88 mmol) se agitó durante 40 min en TFA a 0°C. Después se concentró la mezcla y se diluyó con THF (10 mL) . Se añadió una solución acuosa de NaOH (700 mg, 17,5 mmol en 8,8 mL de H20) , seguida por una solución en THF (13 mL) de (Boc)20 (2,06 g, 9,44 mmol, 1,2 eq.) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente (el pH se mantuvo en 8 añadiendo una solución acuosa de NaOH al 10% cuando era necesario) , después se diluyó con H20, se lavó con Et20 (3X) y se acidificó a 0°C con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3X) y se lavó sucesivamente con H20 (2X) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgS04, filtración y concentración) se aisló el aminoácido protegido con Boc deseado (8a) (788 mg, 3,44 mmol, 44% de rendimiento) . 'H NMR (CDC13) d 5,18 (s ancho, 1H) , 1,64-1,58 (m, 2H) , 1,55- -1,42 (m, 2H) , 1,45 (s, 9H) , 1,32-1,25 (m, 1H) , 0,99 (t, 3H, J = 7,3 Hz) .

Preparación del éster metílico del ácido ( lR, 2R)/( ÍS , 2R) -1--Boc-amino-2-etil-ciclopropil-carboxílico (8b): 8a 8b El derivado Boc 8a (0,30 g, 1,31 mmol) se disolvió en Et20 (10 mL) y se trató con diazometano recién preparado en Et20 a 0°C hasta que quedó el color amarillo de un ligero exceso de diazometano. Después de agitar durante 20 min a TA, la mezcla de reacción se concentró a sequedad para dar 8b en forma de un aceite incoloro transparente (0,32 g, 100%).^ NMR (CDClj) d 5,1 (s ancho, 1H) , 3,71 (s, 3H) , 1,62-1,57 (m, 2H) , 1,55 (s, 9H) , 1,53-1,43 (m, 1H) , 1,28-1,21 (m, 2H) , 0,95 (t, J = 7,3Hz, 3H) .

EJEMPLO 9 Resolución enzimáticadel (1R, 2R)/(1S, 2R) -Boc-l-amino-2-etil-ciclopropil-carboxilato de metilo: 'Análisis por HPLC usando una columna Chiralcel® OD-H "Otros esteres también aceptables (p. ej . Et) a) La mezcla enantiomérica del éster metílico del ácido (ÍS, 2R) / (1R, 2R) l-Boc-amino-2-etil-carboxílico del Ejemplo 8 (0,31 g, 1,27 mmol) se disolvió en acetona (3 mL) y después se diluyó con agua (7 mL) , mientras se agitaba rápidamente. El pH de la solución se ajustó en 7 , 5 con NaOH acuoso 0,05 M antes de añadir Alcalase® [2,4 L extracto de Novo Nordisk Industriáis] (300 mg) . Durante la incubación el pH se estabilizó con NaOH y se instaló un pH-estato para controlar la adición de la solución de NaOH. Después de 40 h, la mezcla se diluyó con EtOAc y H20 (con 5 mL de NaHC03 sat . ) y se separaron las fases. La fase acuosa se acidificó con HCl acuoso al 10% y se extrajo con EtOAc, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar el ácido 9a (48,5 mg) . Se determinó la estereoquímica absoluta usando la correlación descrita en los Ejemplos 6 y 7. b) El tratamiento de una parte alícuota de ácido 9a con di-azometano en Et20 para dar el éster metílico, seguido por el análisis mediante HPLC usando una columna quiral [Chiralcel^ OD-H, 2,5% isopropanol/hexano, isocrática] mostró una relación 51:1 del isómero (1S, 2R) . a' ) La fase orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar los esteres no hidrolizados (0,248 g) . Este material fue sometido de nuevo al anterior protocolo enzimático hasta que el pH se mantuvo estable (98 h) . Después de extraer como antes, se recuperaron 0,146 mg (100%) de éster no hidrolizado. El análisis mediante HPLC usando una columna quiral mostró una relación de >50:1 en favor del isómero (1R, 2R) . b') La fase acuosa se acidificó con HCl acuoso al 10% y se extrajo con EtOAc, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar el análogo ácido (82 mg) . Una porción de este material se trató con diazometano y después se analizó mediante HPLC usando una columna quiral como la anterior, que mostró una relación 65:1 del derivado (1S, 2R) .

EJEMPLO 10 Síntesis del ácido ( 1R, 2S )/( ÍS , 2S ) -l-amino-2-etil-ciclopro-pil-carboxílico: etilo apO resp. al áado (RSVISS) Partiendo del ácido 5d descrito en el Ejemplo 5: c) A 5d (1,023 g, 4,77 mmol) en CH3CN (25 mL) se añadieron sucesivamente DBU (860 µL, 5,75 mmol, 1,2 eq.) y bromuro de alilo (620 µL, 7,16 mmol, 1,5 eq.) . La mezcla de reacción se agitó durante 4 h a TA y después se concentró. El residuo se diluyó con Et20 y se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10% (2x) , H20, NaHC03 acuoso saturado, H20 (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgS04, filtración y concentración) se aisló el éster 10a deseado (1,106 g, 3,35 mmol, 91% de rendimiento) en forma de un aceite incoloro. MS (FAB) 255 (MH*) ; :H NMR (CDC13) d 5,96-5,86 (m, 1H) , 5,37-5,22 (m, 2H) , 4,70-4,65 (ra, 1H) , 4,57-4,52 (m, 1H) , 1,87-1,79 (m, 1H) , 1,47 (s, 9H) , 1,45-1,40 (m, 1H) , 1,33-1,24 (m, 3H) , 1,03 (t, J = 7,3 Hz, 3H) . d) Al éster 10a (1,106 g, 4,349 mmol) en CH2C12 seco (5 mL) a TA se añadió TFA (5 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 h y después se concentró para dar 10b (854 mg, 4,308 mmol, 99% de rendimiento). MS (FAB) 199 (MH*) ; XH NMR (CDCI3) d 5,99-5,79 (m, 1H) , 5,40-5,30 (m, 2H) , 4,71-4,62 (m, 2H) , 2,22-2,00 (m, 2H) , 1,95-1,88 (m, 1H) , 1,84-1,57 (m, 2H) , 0,98 (t, J = 7,3 Hz, 3H) . e) Al ácido 10b (853 mg, 4,30 mmol) en benceno seco (14,8 L) se añadieron sucesivamente Et3N (684 µL, 4,91 mmol, 1,14 eq.) y DPPA (992 µL, 4,60 mmol, 1,07 eq . ) . La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 4,5 h y después se añadió 2-trimetilsililetanol (1,23 mL, 8,58 mmol, 2,0 eq.). Se mantuvo el reflujo durante la noche y después la mezcla de reacción se diluyó con Et20 y se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10%, agua, NaHC03 acuoso saturado, agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgS04, filtración, concentración) , el residuo se some-tió a cromatografía con resolución rápida (5 cm, 10 a 15% de AcOEt-hexano) para dar el carbamato 10c (1,212 g, 3,866 mmol, 90% de rendimiento) en forma de un aceite amarillo pálido. MS (FAB) 314 (MH*) ; XH NMR (CDCl3) d 5,93-5,84 (m, 1H) , 5,32-5,20 (m, 2H) , 5,05 (s ancho, 1H) , 4,60-4,56 (m, 2H) , 4,20-4,11 ( , 2H) , 1,71-1,60 (m, 3H) , 1,39-1,22 (m, 1H) , 1,03 (t, J = 7,6 Hz, 3H) , 0,96-0,86 (m, 1H) , 0,04 (s, 9H) . f) Al carbamato 10c (267 mg, 0,810 mmol) se añadió una solución de TBAF 1,0 M en THF (1,62 mL, 1,62 mmol, 2,0 eq.) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA, se sometió a reflujo durante 30 min y después se diluyó con AcOEt. La solución se lavó sucesivamente con agua (2x) y salmuera. Después del tratamiento habitual (MgS04, filtración y concentración) , se aisló la amina deseada lOd (122 mg, 0,721 mmol, 89% de rendimiento) en forma de un líquido amarillo pálido. ?U NMR (CDC13) d 5,94-5,86 (m, 1H) , 5,31-5,22 (m, 2H) , 4,58 (d, J = 5,7 Hz , 2H) , 1,75 (s ancho, 2H) , 1,61- -1,53 ( , 2H) , 1,51-1,42 (m, 2H) , 1,00 (t, J = 7,3 Hz, 3H) , 0,70-0,62 (m, 1H) .

EJEMPLO 11 Síntesis de (1R, 2S )/(lS, 2S) -l-amino-2-vinilciclopropil-carbo-xilato de etilo: b)1 aq. HCl Et20 c) NaHC03 d) 4N HCI/dioxano 11d vinilo sin respecto al éster a) A una solución en THF (180 mL) de terc-butóxido potásico (4,62 g, 41,17 mmol, 1,1 eq.) a -78°C se añadió imina Ha disponible comercialmente (10,0 g, 37,41 mmol) en THF (45 mL) . La mezcla de reacción se calentó a 0°C y se agitó a esta temperatura durante 40 min. La mezcla se volvió a enfriar después a -78°C para la adición de 1 , 4-dibromobuteno 11b (8,0 g, 37,40 mmol) y después se agitó a 0°C durante 1 h y se enfrió de nuevo a -78°C para la adición de terc-butóxido potásico (4,62 g, 41,17 mmol, 1,1 eq.) . La mezcla de reacción se agitó finalmente una hora más a 0°C y se concentró para dar el compuesto 11c. b,c,d) 11c se recogió en Et20 (265 mL) y se trató con una solución acuosa de HCl 1N (106 mL) . Después de 3,5 h a TA, las capas se separaron y la capa acuosa se lavó con Et20 (2x) y se alcalinizó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La amina deseada se extrajo con Et20 (3x) y el extracto orgánico reunido se lavó con salmuera. Después del tratamien-to habitual (MgS04, filtración y concentración) el residuo se trató con una solución de HCl 4N en dioxano (187 mL, 748 mmol) . Después de concentrar, se aisló la sal hidrocloruro lid en forma de un sólido pardo (2,467 g, 12,87 mmol, 34% de rendimiento) .'H NMR (CDC13) d 9,17 (s ancho, 3H) , 5,75-5,66 (m, 1H) , 5,39 (d, J = 17,2 Hz, 1H) , 5,21 (d, J = 10,2 Hz, 1H) , 4,35-4,21 (m, 2H) , 2,77-2,70 (m, 1H) , 2,05 (dd, J = 6 , 4 , 10,2 Hz, 1H) , 1,75 (dd, J = 6,4, 8,3 Hz, 1H) , 1,33 (t, J = 7, 0 Hz, 3H) .

EJEMPLO 12 Preparación del éster etílico del ácido ( 1R, 2S )/( 1S, 2S ) -1--Boc-amino-2 -vinil-ciclopropil-carboxílico: vimlo sin resp. éster La sal hidrocloruro lid (1,0 g, 5,2 mmol) y (Boc) -O (1,2 g, 5,7 mmol) se disolvieron en THF (30 mL) y se trataron con DMAP (0,13 g, 1,04 mmol, 0,2 equiv.) y diisopropiletilamina (2,8 mL, 15,6 mmol) . La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas antes de ser diluida con EtOAc (40 mL) y se lavó sucesivamente con NaHC03 (ag.) saturado, HCl acuoso al 5% y salmuera saturada. La fase orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar, después de purificar mediante cromatografía con resolución rápida (15% de EtOAc/hexano) , el compuesto 12a (0,29 g, 23%). *H NMR (CDC13) d 5,80-5,72 (m, 1H) , 5,29-5,25 (dd, J = 17,2, 17,2 Hz, 1H) , 5,24-5,1 (s ancho, 1H) , 5,10 (dd, J = 9,2, 9,2 Hz, 1H) , 4,22-4,13 (m, 2H) , 2,15-2,04 (m, 1H) , 1,85-1,73 (s ancho, 1H) , 1,55-1,5 (m, 1H) , 1,49 (s, 9H) , 1,26 (t, J = 7,3 Hz, 3H) .

EJEMPLO 13 Resolución enzimática del ( lR, 2S)/( 1S, 2S ) -l-amino-2-vinil-ci-clopropil-carboxilato de etilo: 0X vinilo sin resp. éster Análisis por HPLC usando un columna Chiralcel® OD-H a) El derivado racémico 12a (0,29 g, 1,14 mmol) se disolvió en acetona (5 mL) y se diluyó con H20 (10 mL) . El pH se ajustó en el valor 7,2 con NaOH acuoso 0 , 2N antes de añadir Alcalase® (300 mg) . Para mantener el pH constante durante la incubación, se añadió una solución de NaOH mediante un valorador con pH-estato a lo largo de 9 días, hasta que se hubo añadido la cantidad teórica de base. Después de la extracción ácido/base como se describió en el Ejemplo 9, el éster no hidrolizado (0,15 g, 100%) y el material hidrolizado (0,139 g, 95%) fueron aislados. El análisis del éster no hidrolizado por HPLC usando una columna quiral mostró una relación 43:1 del compuesto deseado 13c. El compuesto 206 (en el que Rx es vinilo, Tabla 2) fue hidrogenado (10,8 mg, 0,015 mmol en 1 mL de EtOH con aproximadamente 1 mL de Pd(OH)2 al 20% bajo 1 at . de H2 durante 45 min) para proporcionar el compuesto 214 (en el que R1 es etilo, Tabla 2 ) . Al compuesto 214 le había sido asignada la estereoquímica (1R, 2R) basando- se en la correlación química como se describió en los Ejemplos 6 y 7, lo que indica que el compuesto 206 (R1=vini- lo) tiene la misma configuración absoluta que la representada por 13c (aunque 1R, 2S porque R_.=vinilo) . Condiciones para análisis por HPLC: Chiralcel® OD-H (4,6 mm x 25 cm) , condiciones isocráticas usando una fase móvil de 2,5% isopropanol/hexano .

EJEMPLO 14 Resolución del ( 1R, 2S )/( 1S, 2S ) -l-amino-2-vinil-ciclopropil-carboxilato de etilo por cristalización con ácido dibenzoil- -D-tartárico Auna solución de l-amino-2-vinilciclopropil-carboxilato de etilo racémico ( 1S, 2S y 1R, 2S) crudo [obtenido a partir del éster etílico de N- (difenilmetilen) glicina (25,0 g, 93,5 mmol) como se describió en el Ejemplo 13] en EtOAc (800 mL) , se añadió ácido dibenzoil -D-tartárico (33,5 g, 93,5 mmol) . La mezcla se calentó a reflujo, se dejó a TA durante 15 min y después se enfrió a 0°C. Se obtuvo un sólido blanco después de 30 min. El sólido se filtró, se lavó con EtOAc (100 mL) y se secó con aire. El sólido se suspendió en acetona (70 mL) , se trató con ultrasonidos y se filtró (3x) . A continuación, el sólido se recristalizó dos veces en acetona caliente (cosecha A) . Las aguas madre se concentraron y el residuo se recristalizó tres veces en acetona caliente (cosecha B) . Las dos cosechas de sólidos blancos amorfos de sal de ácido dibenzoil-D-tartárico se reunieron (5,53 g) y se suspendieron en una mezcla de Et20 (250 mL) y solución acuosa saturada de NaHC03 (150 mL) . La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó (MgS04) y se filtró. El filtrado se diluyó con HCl/Et-,0 1N (100 mL) y se concentró bajo presión reducida. El residuo oleoso se evaporó con CC14 para dar 1 (R) -amino-2 (S) -vinil -ciclopropano-carboxilato de etilo hidrocloruro (940 mg, 11% de rendimiento) en forma de un sólido blanco higroscópico, para el cual se asignó la estereoquímica absoluta por correlación con el compuesto 13c del Ejemplo 13. [a]D25 +39,5° (c 1,14 MeOH); [a] 36525 +88,5° (c 1,14 MeOH); XH NMR (DMSO-dg) d 9,07 (s ancho, 2H) , 5,64 (ddd, J = 17,2, 10,4, 8,7 Hz, 1H) , 5,36 (dd, J = 17,2, 1,6 Hz, 1H) , 5,19 (dd, J = 10,4, 1,6 Hz, 1H) , 4,24-4,16 (m, 2H) , 2,51-2,45 (m, picos impedidos por el DMSO, 1H) , 1,84 (dd, J = 10,0, 6,0 Hz, 1H) , 1,64 (dd, J = 8,3, 6,0 Hz, 1H) , 1,23 (t, J = 7,1 Hz, 3H) ; MS (ESI) m/z 156 (MH*) ; se determinó que la pureza enantiomérica era 91% de ee por análisis de HPLC (columna CHIRALPAK AS®, Hex:i-PrOH) del derivado BOC (Ejemplo 13).

ELEMENTOS DE CONSTRUCCIÓN P4-P2 Ejemplo 15 Síntesis del segmento: Ac-Chg-Chg- ro (4(R ) -naftalen- 1-ilme-toxi)-OH (15g) descrito en el Ej . 2 15a 15b El compuesto 15a (igual que el compuesto 2 del Ejemplo 2) (4,45 g, 11,98 mmol) se disolvió en CH3CN anhidro (60 mL) , se añadieron sucesivamente DBU (2,2 mL, 14,38 mmol) y bromuro de alilo (1,1 mL, 13,18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 h a TA. La mezcla se concentró, el aceite resultante se diluyó con EtOAc y agua y se lavó sucesivamente con agua (2x) y salmuera (lx) . La capa de EtOAc se secó (MgS04) , se filtró y se evaporó a sequedad. El aceite amarillo fue purificado mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente: hexano :EtOAc 90:10 a 85:15) para proporcionar el producto 15b en forma de un aceite amarillo (2, 4,17 g; 85% de rendimiento) . MS (FAB) 412 MH*; :H NMR (CDC13) , mezcla de rotámeros aprox. 1:2, d (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,87 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,55-7,41 (m, 4H) , 5,95-5,85 (m, 1H) , 5,34-5,21 (m, 2H) , 5,03-4,88 (m, 2H) , 4,70-4,56 (m, 2H) , 4,48 y 4,39 (t, J = 8, 15 Hz, 1H) , 4,28--4,23 (m, 1H) , 3,81-3,55 (m, 2H) , 2,46-2,36 (m, 1H) , 2,13--2,05 (m, 1H) , 1,44 y 1,41 (s, 9H) . El compuesto 15b (2,08 g, 5,05 mmol) fue tratado durante 30 min a TA con HCl/dioxano 4N. La evaporación a sequedad proporcionó la correspondiente amina-HCl en forma de un aceite. La amina-HCl 15c se disolvió en DCM anhidro (25 mL) y se añadieron sucesivamente NMM (2,2 mL, 20,22 mmol), Boc--Chg-OH«H20 (1,53 g, 5,56 mmol) y TBTU (1,95 g, 6,07 mmol). La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche, después se diluyó con EtOAc y se lavó sucesivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x) , NaHC03 acuoso saturado (2x) , agua (2x) y salmuera (lx) . La capa de EtOAc se secó (MgS04) , se filtró y se evaporó a sequedad para proporcionar el producto crudo 15d en forma de una espuma blanca-amarillenta (aprox. 2,78 g, 100% de rendimiento). MS (FAB) 551,4 MH*; 'H NMR (CDC13). d 8,03 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,86 (d ancho, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,84 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,56-7,40 (m, 4H) , 5,92-5,85 (m, 1H) , 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H) , 5,22 (dd, J = 1, 10 Hz, 1H) , 5,17 (d, J = 9 Hz, 1H) , 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,91 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,67-4,60 (m, 3H) , 4,31-4,27 ( , 2H) , 4,16 (d ancho, J = 11 Hz, 1H) , 3,71 (dd, J = 4, 11 Hz , 1H) , 2,47-2,41 (m, 1H) , 2,08-1,99 (m, 1H) , 1,85-1,63 (m, 5H) , 1,44-1,40 (m, 1H) , 1,36 (s, 9H) , 1,28-1, 00 (m, 5H) . El dipéptido crudo 15d (aprox. 5,05 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (25 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada con Boc-Chg-OH«H20 (1,53 g, 5,55 mmol) con NMM (2,22 mL, 20,22 mmol) y TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) en DCM (25 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15d, para proporcio-nar el tripéptido crudo 15e en forma de una espuma oleosa amarilla. El material crudo fue purificado mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente: hexano:EtOAc 80:20 a 75:25) para proporcionar el tripéptido 15e en forma de una espuma blanca (2,75 g; 79% de rendimiento a lo largo de 2 etapas). MS (FAB) 690,5 MH* ; ? NMR (CDC13) , principalmente un rstámero, d 8,06 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,57-7,40 (m, 4H) , 6,41 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 5,92-5,84 (m, 1H) , 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H) , 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H) , 5,04 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,98 (d ancho, J = 7 Hz, 1H) , 4,93 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,63--4,58 (m, 4H) , 4,29-4,25 (m, 1H) , 4,10-4,07 (m, 1H) , 3,90--3,84 (m, 1H) , 3,72 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H) , 2,48-2,40 (m, 1H) , 2,07-1,99 (m, 1H) , 1,83-1,55 (m, 12H) , 1,43 (s, 9H) , 1,23-0,89 (m, 10H) . El tripéptido 15e (2,75 g, 3,99 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (20 L) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se disolvió en DCM anhidro (20 mL) . Se añadieron sucesivamente NMM (1,75 mL, 15,94 mmol) y anhídrido acético (752 µL, 7,97 mmol) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA, y después se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó sucesivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x) , NaHC03 acuoso saturado (2x) , agua (2x) y salmuera (Ix) , se secó (MgS04) , se filtró y se evaporó a sequedad para proporcionar el tripéptido crudo 15f en forma de una espuma blanca (2,48 g, 98% de rendimiento) . MS (FAB) 632,4 MH+I . :H NMR (CDC13) , principalmente un rotámero, d 8,06 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,83 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,58-7,40 (m, 4H) , 6,36 (d, J = 9 Hz, 1H) , 6,01 (d, J = 9 Hz, 1H) , 5,94-5,83 (m, 1H) , 5,34-5,28 (m, 1H) , 5,25-5,21 (m, 1H) , 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,64-4,57 (m, 4H) , 4,30-4,23 (m, 2H) , 4,12-4,08 (m, 1H) , 3,73 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H) , 2,49-2,42 (m, 1H) , 2,08-2,01 (m, 1H) , 1,99 (s, 3H) , 1,85-1,53 ( , 11H) , 1,25-0,88 (m, 11H) . El tripéptido crudo 15f (2,48 g, 3,93 mmol) se disolvió en una mezcla anhidra de CH3CN:DCM (20 mL) . Se añadieron sucesivamente trifenilfosfina (53,5 mg, 0,200 mmol) y catalizador de tetraquis (trifenilfosfina) -paladio (0) (117,9 mg, 0,102 mmol) , seguido de pirrolidina (353,9 µL, 4,24 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a TA durante 18 h. A continuación se evaporó el disolvente. El residuo se disolvió en EtOAc y ácido cítrico acuoso al 10%, y se lavó adicionalmente dos veces más con ácido cítrico acuos al 10%, agua (2x) y salmuera (lx) . La capa orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se evaporó. El producto crudo se trituró en Et20:DCM (85:15) para proporcionar, después de filtrar, el tripéptido 15g en forma de un sólido blanco (2,09 g, 90% de rendimiento) . MS (FAB) 592,4 MH* 614,3 (M+Na)*. :H NMR (CDCl3) , principalmente un rotámero, d 8,08 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,93 (d ancho, J = 9 Hz, 1H) , 7,88 (d ancho, J=8 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,57-7,41 (m, 4H) , 6,47 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 5,05 (d, J = 12,5 Hz, 1H) , 4,94 (d, J = 12,5 Hz, 1H) , 4,73 (t, J = 9,5, 19 Hz, 1H) , 4,44-4,35 (m, 2H) , 4,26 (s ancho, 1H) , 4,19 (d, J = 11,5 Hz, 1H) , 3,75 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H) , 2,47 (dd ancho, J = 7,5, 13,5 Hz, 1H) , 2,20-2,11 ( , 1H) , 2,04 (s, 3H) , 1,88--1,41 (m, 11H) , 1,30-0,80 (11H) .

EJEMPLO 16 Síntesis del segmento Ac-Chg-Val-Pro (1 (R) -naftalen-1-ilmeto-xi)-OH (16e) Boc- 16c 16d El compuesto 16a (2,89 g, 7,02 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc--Val-OH (1,53 g, 7,73 mmol) con NMM (3,1 mL, 28,09 mmol) y TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) en DCM (35 mL) durante 3X h como se describió para la síntesis del compuesto 15d, para proporcio- nar el dipéptido crudo 16b en forma de una espuma oleosa de color marfil (aprox. 3,60 g, 100% de rendimiento). MS (FAB) 509,3 MH' 511,3 MH* 533,2 (M+Na)*. *H NMR (CDCl3) , d 8,04 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 7 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,56-7,40 (m, 4H) , 5,93-5,85 (m, 1H) , 5,34- -5,28 (m, 1H) , 5,24-5,19 (m, 2H) , 5,04 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4.92 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,67-4,60 (m, 3H) , 4,31-4,26 (m, 2H) , 4,11-4,09 (m, 1H) , 3,72 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H) , 2,48- -2,41 (m, 1H) , 2,07-1,99 (m, 1H) , 1,44-1,36 (m, 1H) , 1,37 (s, 9H) , 1,01 (d, J = 7 Hz, 3H) , 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H) . El dipéptido crudo 16b (aprox. 7,02 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c . La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Chg-OH*H20 (2,13 g, 7,73 mmol) con NMM (3,1 mL, 28,09 mmol) y TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) en CH2C12 (35 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15d, para proporcionar el tripéptido crudo 16c en forma de una espuma de color marfil (aprox. 4,6 g, 100% de rendimiento). MS (FAB) 648,5 MH" 672,4 (M+Na)*. XH NMR (CDC13) , d 8,06 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,82 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,57-7,40 (m, 4H) , 6,46 (d ancho, J = 8,5 Hz, 1H) , 5,94--5,84 (m, 1H) , 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H) , 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H) , 5,03 (d, J = 12 Hz, 1H) , 5,00-4,97 (m, 1H) , 4.93 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,63-4,59 (m, 4H) , 4,29-4,27 (m, 1H) , 4,10-4,07 (m, 1H) , 3,92-3,86 (m, 1H) , 3,72 (dd, J = 5, 11 Hz, 1H) , 2,48-2,41 (m, 1H) , 2,10-1,99 (m, 1H) , 1,76-1,57 ( , 6H) , 1,43 (s, 9H) , 1,20-0,92 (m, 6H) , 1,00 (d, J = 7 Hz, 3H) , 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H) . El tripéptido crudo 16c (aprox..7, 02 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se siguió tratando con anhídrido acético (1,33 mL, 14,05 mmol) y NMM (3,1 L, 28,09 mmol) en CH2C12 (35 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15d. El producto crudo fue purificado por cromatografía con resolución rápida (eluyente: hexano: EtOAc 30:70) para proporcionar el tripéptido protegido acetilado 16d en forma de una espuma blanca (3,39 g, 81% de rendimiento a lo largo de 3 etapas) . MS (FAB) 590,3 MH- 592,4 MH+ 614,4 (M+Na)*. :H NMR (CDC13) , principalmente un rotámero, d 8,06 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,88 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,83 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,58-7,41 (m, 4H) , 6,37 (d, J = 9 Hz, 1H) , 5,97 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 5,94-5,84 (m, 1H) , 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H) , 5,24 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H) , 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,66-4,57 (m, 4H) , 4,31- -4,22 (m, 2H) , 4,11-4,05 (m, 1H) , 3,73 (dd, J = 4,5, 11 Hz, 1H) , 2,50-2,43 (m, 1H) , 2,09-2,01 (m, 2H) , 2,00 (s, 3H) , 1,68-1,55 (m, 5H) , 1,15-0,89 (m, 6H) , 0,99 (d, J = 7 Hz, 3H) , 0, 91 (d, J = 7 Hz, 3H) . El tripéptido acetilado 16d (3,39 g, 5,73 mmol) fue desprotegido por el catalizador tetraquis (trifenilfosfina) -paladio(O) (172,1 mg, 0,149 mmol) con trifenilfosfina (78,1 mg, 0,298 mmol) y pirrolidina (516 µL, 6,19 mmol) en una mezcla 1:1 de CH3CN:DCM anhidros (30 mL) como se describió para la síntesis del compuesto 15g. El producto crudo en forma de una espuma de color amarillo claro se trituró en Et20:DCM (85:15) para proporcionar, después de filtrar, el tripéptido 16e en forma de un sólido blanquecino (3,0 g; 95% de rendimiento). MS (FAB) 550,3 MH" -H NMR (CDC13) , d 8,08 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,04 (d ancho, J = 9 Hz, 1H) , 7,88 (d ancho, J = 7, 5 Hz, 1H) , 7, 82 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,58-7,37 (m, 5H) , 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,61 (t, J = 9,5, 19,5 Hz, 1H) , 4,46-4,37 (m, 2H) , 4,27 (s ancho, 1H) , 4,17 (d, J = 11 Hz, 1H) , 3,74 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H) , 2,49 (dd ancho, J = 7,5, 13 Hz, 1H) , 2, 17--2,09 (m, 1H) , 2,04 (s, 3H) , 2,03-1,94 (m, 1H) , 1,79 (d ancho, J = 12,5 Hz, 1H) , 1,62-1,43 (m, 5H) , 1,08-0,85 (m, 5H) , 1,00 (d, J = 7 Hz, 3H) , 0,90 (d, J = 7 Hz, 3H) .

COMPUESTOS DE LAS TABLAS 1 A 4 EJEMPLO 17 Síntesis del compuesto 104 de la Tabla 1 17f compuesto 104 El compuesto 17a (4,27 g, 7,93 mmol, descrito como compuesto 6a en el Ejemplo 6) fue tratado con HCl/dioxano 4N (40 mL) durante 5 h, como se describió para el compuesto 15c.

La sal hidrocloruro cruda se disolvió en THF (10. mL) y se añadió una solución de NaOH (348,7 mg, 8,72 mmol) en H20 (5 mL) , seguido de la adición gota a gota de (Boc)20 (1,73 g, 7,93 mmol) disuelto en THF (13 mL) . El pH se mantuvo en 8 mediante la adición de NaOH acuoso al 10% a medida que era necesario. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente, después se diluyó con Et20 y H20 y se extrajo una vez más con Et20. La capa acuosa se acidificó a pH 3 con ácido cítrico acuoso al 10%. La mezcla se extrajo con EtOAc (3x) . Los extractos en EtOAc reunidos se lavaron con H20 (2x) y salmuera (lx) , se secaron (MgS04) , se filtraron y se evaporaron a sequedad para proporcionar el compuesto 17b crudo en forma de una espuma de color marfil (aprox. 7,93 mmol) . MS (FAB) 481,3 MH" . XH NMR (CDCl3) , mezcla de rotámeros aprox. 1:1, d 8,04 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,56-7,40 (m, 5H) , 4,96 (s ancho, 2H) , 4,33 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 1H) , 4,21-4,09 (m, 0,5 H) , 3,99-3,84 (m, 0,5 H), 3,78-3,75 (m, 0,5 H), 3,68-3,62 (m, 0,5 H) , 3,61-3,42 (m, 1H) , 2,55-2,41 ( , 1H) , 2,22-2,11 (m, 1H) , 1,61-1,52 (m, 3H) , 1,43 (s, 9H) , 1,40-1,31 (m, 1H) , 1,25-1,19 (m, 1H) , 0,99 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 3H) . El compuesto 17b (aprox. 7,93 mmol) fue tratado con DBU (1,18 mL, 93 mmol) y bromuro de alilo (4,12 mL, 47,61 mmol) en CH3CN anhidro (40 mL) durante 48 h, como se describió para el compuesto 15b, para proporcionar el dipéptido alilado 17c en forma de una espuma de color marfil (3,54 g; 86% de rendimiento a lo largo de 2 etapas). MS (FAB) 521,3 MH" 545,2 (M+Na)*. H NMR (CDC13) , mezcla de rotámeros aprox. 1:1, d 8, 05 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7, 86 (d ancho, J = 7, 5 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,55-7,40 (m, 5H) , 5,88-5,79 (m, 1H) , 5,27 (d ancho, J = 17,5 Hz, 1H) , 5,18 (d ancho, J = 10 Hz , 1H) , 5,03-4,89 (m, 2H) , 4,63-4,50 (m, 2H) , 4,44-4,19 (m, 2H) , 4,00-3,40 (m, 2H) , 2,70-2,02 (m, 2H) , 1,66-1,35 (m, 5H) , 1,44 (s, 9H) , 0,95 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 3H) . El dipéptido 17c crudo (1,18 g, 2,26 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (35 mL) como se describió para el compues- to 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Chg- -OH»H20 (684 mg, 2,48 mmol) con NMM (993 µL, 9,03 mmol) y TBTU (870 mg, 2,71 mmol) en DCM (11 mL) como se describió para el compuesto 15d, para proporcionar el tripéptido 17d crudo en forma de una espuma de color marfil (1,41 g; 95%) . MS (FAB) 660,4 MH" 662,3 MH* . :H NMR (CDCl3) , principalmente un rotámero, d 8,03 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,85 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,81 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,56-7,39 (m, 5H) , 5,88-5,77 (m, 1H) , 5,26 (dd, J = 1,5, 17 Hz, 1H) , 5,15 (dd, J = 1,5, 10,5 Hz, 1H) , 5,12 (s, 1H) , 5,02-4,92 (m, 2H) , 4,72- -4,59 (m, 1H) , 4,57-4,46 (m, 1H) , 4,42-4,35 (m, 1H) , 4,33- -4,20 (m, 1H) , 4,02-3,90 (m, 1H) , 3,78-3,70 (m, 1H) , 3,67- -3,51 (m, 1H) , 2,71-2,61 (m, 1H) , 2,12-2,02 (m, 1H) , 1,79- -1,48 (m, 10H) , 1,45-1,39 ( , 1H) , 1,38 (s, 9H) , 1,25-1,01 (m, 5H) , 0,94 (t, J = 7,5, 14 Hz, 3H) . El tripéptido 17d crudo (265 mg, 0,400 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (3 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Chg-OH*H20 (143,3 mg, 0,521 mmol) con NMM (176 µL, 1,60 mmol) y TBTU (154,3 mg, 0,481 mmol) en DCM (3 mL) como se describió para el compuesto 15d, para proporcionar el tripéptido 17e crudo en forma de una espuma de color marfil (aprox. 0,400 mmol; 100%). MS (FAB) 799,5 MH' 801,5 MH* 823 (M+Na)*. *H NMR (CDC13) , mezcla de rotámeros aprox. 1:1, d 8,05 (d ancho, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,55-7,40 (m, 4H) , 7,37 (s, 1H) , 6,58-6,41 (m, 1H) , 5,89-5,78 (m, 1H) , 5,26 (dd ancho, J = 1,5, 17 Hz, 1H) , 5,16 (dd ancho, J = 1,5, 10,5 Hz, 1H) , 5,20-4,92 (m, 3H) , 4,68-4,58 (m, 2H) , 4,57-4,47 (m, 1H) , 4,43-4,26 (m, 1H) , 3,99-3,81 (m, 2H) , 3,78-3,60 ( , 2H) , 2,67-2,60 (m, 1H) , 2,11-2,02 (m, 1H) , 1,78-1,42 ( , 14H) , 1,44 y 1,43 (s, 9H) , 1,25-0,91 (m, 13H) , 0,95 (t, J = 7,5, 15 Hz, 3H) . El tetrapéptido 17e crudo (aprox. 0,400 mmol) fue tratado con HCl/dioxano 4N (3 mL) como se describió para el com-puesto 15c. La sal hidrocloruro cruda se siguió tratando con anhídrido acético (83 µL, 0,884 mmol) y NMM (194 µL, 1,77 mmol) en DCM (3 mL) como se describió para el compuesto 15f, para proporcionar el tetrapéptido 17f acetilado crudo en forma de una espuma de color marfil (aprox. 0,400 mmol) . MS (FAB) 741,5 MH* 743,4 MH+ 765,4 (M+Na) + . H NMR (CDC13) d 8,05 (d ancho, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,82 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,55-7,41 (m, 4H) , 7,39 (s, 1H) , 6, 63-6, 48 (m, 1H) , 6,01 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 5,90-5,79 (m, 1H) , 5,27 (dd ancho, J = 1,5, 17 Hz, 1H) , 5,16 (dd ancho, J = 1,5, 10,5 Hz, 1H) , 5,01 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,96 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,69-4,48 (m, 3H) , 4,44- -4,37 (m, 1H) , 4,36-4,22 (m, 1H) , 3,96 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H) , 3,78-3,60 (m, 2H) , 2,67-2,59 (m, 1H) , 2,10-2,00 (m, 1H) , 2,01 (s, 3H) , 1,78-1,48 (m, 13H) , 1,45-1,35 (m, 1H) , 1,26- -0,89 (m, 13H) , 0,95 (t, J = 7,5, 15 Hz, 3H) . El tetrapéptido acetilado 17f (aprox. 0,400 mmol) fue desprotegido por el catalizador tetraquis (trifenilfosfina) -paladio (0) (11,3 mg, 0,010 mmol) con trifenilfosfina (5,12 mg, 0,020 mmol) y pirrolidina (34 µL, 0,406 mmol) en una mezcla 1:1 de CH3CN:DCM anhidros (2 mL) como se describió pa-ra el compuesto 15g. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente Io EtOAc, después, 2° 1,92% de HOAc, 3,85% de MeOH en DCM) para proporcionar, después de liofilizar, el compuesto de tetrapéptido 104 de la Tabla 1 en forma de un sólido amorfo blanquecino (193,1 g; 73% de rendimiento a lo largo de 5 etapas) . MS (FAB) 701,4 MH" 703,4 MH* 725,4 (M+Na)* XH NMR (DMSO), mezcla de rotámeros aprox. 1:5, d 8,57 y 8,32 (s, 1H) , 8,04 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,94 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,88 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,83-7,78 (m, 2H) , 7,58-7,30 (m, 4H) , 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,90 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,44--4,29 (m, 2H) , 4,29-4,05 (m, 3H) , 3,87-3,73 (m, 1H) , 2,23--2,13 (m, 1H) , 2,05-1,95 (m, 1H) , 1,91 y 1,84 (s, 3H) , 1,75--1,40- (m, 15H) , 1,29-0,84 (m, 12H) , 0,91 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 3H) .

Ejemplo 18 Síntesis del compuesto 105 de la Tabla 1 18a 18b compuesto 105 El compuesto 18b, es decir el correspondiente al compuesto 5f del Ejemplo 5, fue acoplado al tripéptido 18a pre-formado descrito anteriormente en el Ejemplo 15. Más específicamente, el compuesto 18b (aprox. 0,521 mmol) se combinó con el compuesto 18a (323,6 mg, 0,547 mmol) en DCM (3 mL) y NMM (172 µL, 1,562 mmol), seguido de la adición de HATU (237,6 mg, 0,625 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a TA durante 18 h, después de lo cual se elaboró como se describió para el compuesto 15d para dar el tetrapéptido crudo en forma de mezcla racémica a Pl . Ambos isómeros fueron separados parcialmente mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente - tolueno:EtOAc 40:60). La combinación de las fracciones que eluyeron primero dio una mezcla 9:1 en la que el análogo éster tere-butílico de 17f era el principal componente (58 mg) . Las fracciones medias contenían relaciones distintas de los correspondientes esteres tere-butílicos de 17f y el compuesto éster terc-butílico 105 (163 mg) . Las fracciones que eluyen más tarde proporcionaron el correspondiente éster tere-butílico del compuesto 105 como el isómero principal (75,8 mg) . Este último éster (74 mg, 0,0975 mmol) se disolvió en HCl/dioxano 4N (2 mL) , se agitó a TA durante 5,5 h y después se evaporó a sequedad para dar un aceite. La purificación mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente - Io EtOAc, después 2o 1,92% de HOAc, 3,85% de MeOH, en DCM) dio, después de liofilizar, el compuesto 105 en forma de un sólido amorfo blanco (38,7 mg, 56% de rendimiento) . El análisis por HPLC indicó una relación 3:1 de compuesto 105 y compuesto 104. Datos de MS y NMR para el compuesto 105: MS (FAB) 701,5 MH" 703,5 MH* 725,6 (M+Na)*. XH NMR (DMSO), mezcla de rotámeros aprox. 1:2,5, d 8,76 y 8,34 (s, 1H) , 8,05 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,94 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,85-7,78 (m, 2H) , 7,59-7,43 (m, 4H) , 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,41-4,05 (m, 5H) , 3,82--3,66 (m, 1H) , 2,25-2,11 (m, 1H) , 2,11-1,98 (m, 1H) , 1,90 y 1,84 (s, 3H) , 1,78-1,40 (m, 15H) , 1,39-0,82 (m, 12H) , 0,90 (t, J = 7, 14 Hz, 3H) .

EJEMPLO 19 Síntesis de los compuestos 103 de la Tabla 1 Siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis del compuesto 104 del Ejemplo 17, las mezclas de los isómeros 1 (R) , 2 (R) , y 1 (R) ,2 (S) del compuesto intermedio lOd, preparado en el Ejemplo 10, fueron acopladas con el compuesto 2 para dar una mezcla de compuestos intermedios isómeros 19a y 19b.

Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 18, los compuestos isómeros 19a y 19b fueron separados y transformados en su correspondiente compuesto de fórmula 1; para aislar el correspondiente compuesto 103 de la Tabla 1. Datos espectrales: Compuesto 103: población de rotámeros por NMR aprox. (1:8,7) : MS (FAB) m/z 703 (MH+) ; XH NMR (DMSO-d6) d 8,21-8,09 (s ancho, 1H) , 8,05 (d ancho, J = 7,63 Hz, 1H) , 7,94 (d ancho, J = 7,0 Hz, 1H) , 7,91-7,83 (m, 2H) , 7,83-7,76 (m, 1H) , 7,59-7,5 (m, 3H) , 7,5-7,43 (m, 1H) , 4,99 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 4,43-4,30 (m, 3H) , 4,23-4,16 (m, 1H) , 4,13 (d ancho, J = 10,8 Hz, 1H) , 3,71 (dd, J = 11,1, 4 Hz, 1H) , 2,2--2,02 (m, 2H) , 1,87 y 1,84 (2 x s, 3H) , 1,81-1,71 (m, 2H) , 1,70-1,40 (m, 12H) , 1,26-1,06 (m, 4H) , 1,04-0,83 (m, 11H) , 0,59 (m, 1H) .

EJEMPLO 20 Síntesis del compuesto 108 de la Tabla 1 O Ac-Asp I 20d Compuesto 108 El tetrapéptido 17e crudo del Ejemplo 17 (aprox. 0,963 mmol) fue tratado con solución de HCl/dioxano 4N (5 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc- (D)Glu(O-alil) -OH (331,9 mg, 1,155 mmol) con NMM (423 µL, 3,850 mmol) y TBTU (370,8 mg, 1,155 mmol) en DCM (5 mL) durante 3 h a TA como se describió para el compuesto 15d. Se obtuvo el pentapéptido 20b crudo en forma de una espuma de color marfil (aprox. 933,9 mg, 0,963 mmol) . MS (FAB) 968,6 MH" 970,6 MH* 992,5 (M+Na). XH NMR (CDCl3) , mezcla de rotámeros aprox. 1:4, d 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,87 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,58-7,34 (m, 5H) , 6,77-6,25 (m, 2H) , 5,98-5,77 (m, 2H) , 5,38-5,21 (m, 4H) , 5,16 (dd, J = 1,5, 10,5 Hz, 1H) , 5,06-4,89 (m, 2H) , 4,68-4,13 (m, 7H) , 3,96-3,52 (m, 4H) , 2,69-2,38 (m, 3H) , 2,23-1,87 (m, 2H) , 1,78-1,37 (m, 17H) , 1,46 y 1,44 (s, 9H) , 1,22-0,87 (m, 11H) , 0,95 (t, J = 7, 14,5 Hz, 3H) . El pentapéptido 20b crudo (aprox. 0,963 mmol) fue tratado con solución de HCl/dioxano 4N (5 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acoplada a Boc-Asp(O-alil) -OH (315,6 mg, 1,155 mmol) con NMM (423 µL, 3,85 mmol) y TBTU (370,8 mg, 1,155 mmol) en DCM (5 mL) como se describió para el compuesto 15d. Se obtuvo el hexapéptido 20c crudo en forma de una espuma de color marfil (aprox. 1,083 g, 0,963 mmol). MS (FAB) 1147,6 (M+Na)*. XH NMR (CDC13) , mezcla de rotámeros aprox. 1:1, d 8,06 (d ancho, J = 8 Hz, 1H) , 7,86 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,81 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,59--7,39 (m, 5H) , 7,39-6,34 (m, 4H) , 5,98-5,76 (m, 3H) , 5,38--5,10 (m, 6H) , 5,10-4,89 (m, 2H) , 4,66-4,05 (m, 10H) , 3,87--3,58 (m, 4H) , 3,30-2,65 (m, 2H) , 2,65-1,89 (m, 3H) , 1,79--1,33 (m, 19H) , 1,47 y 1,45 (s, 9H) , 1,33-0,86 (m, 14H) . El hexapéptido 20c crudo (aprox. 0,963 mmol) fue tratado con solución de HCl/dioxano 4N (5 mL) como se describió para el compuesto 15c. La sal hidrocloruro cruda fue acetilada con anhídrido acético (182 µL, 1,193 mmol) y NMM (423,5 µL, 3,850 mmol) en DCM (5 mL) como se describió para el compuesto 15f , para proporcionar el tetrapéptido acetilado crudo. El residuo en forma de espuma se purificó mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente: Io hexano:EtOAc 20:80 a 10:90 y 2 ° EtOAc puro) para proporcionar el hexapéptido acetilado 20d en forma de una espuma de color marfil (528 mg, 51% de rendimiento a lo largo de 4 etapas). MS (FAB) 1067,6 (MH+) 1089,6 (M+Na) . El hexapéptido acetilado 20d (528 mg, 0,495 mmol) se disolvió en DCM (3 mL) y se trató con una solución premezcla-da, agitada durante 15 min, de catalizador de tetraquis (trifenilfosfina) -paladio (0) (90 mg, 0,078 mmol) y pirrolidina (134 µL, 1,603 mmol) en DCM (3 mL) . La mezcla de reacción se agitó a TA durante 48 h, después de lo cual se evaporó el disolvente. El producto crudo fue purificado parcialmente por trituración en Et20:DCM (85:15), y después purificado en dos tandas mediante HPLC preparativa. La mitad del producto parcialmente purificado se disolvió en HOAc glacial (5 mL) , se filtró a través de un filtro Millipore®: Millex®-HV de 0,45 µm y se inyectó en una columna de fase inversa C18 Whatman Partisil® 10-ODS-3 (2,2 x 50 cm) equilibrada. Programa de purificación: gradiente lineal a 15 mL/min, 230 µm, inyectado a 5% de A; una vez que hubo eluido todo el HOAc, el programa se inició - a 5% de A durante 10 min, 5-58% de A en 70 min; A: 0,06% de TFA/CH3CN; B: 0,06% de TFA/H20. Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica, las fracciones apropiadas de las purificaciones de HPLC se recogieron y se liofilizaron para proporcionar el compuesto de hexapéptido deseado 108, en forma de un sólido amorfo blanco (218,3 mg, 47% de rendimiento). MS (FAB) 945,5 MH" 947,4 MH* 969,5 (M+Na)+ 985,4 (M+K) + . XH NMR (DMSO), mezcla de rotámeros aprox. 1:9, d 8,55 y 8,31 (s, 1H) , 8,16 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 8,11 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,97-7,85 (m, 2H) , 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 7,75 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,59-7,39 (m, 4H) , 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 12 Hz , 1H) , 4,53 (dd, J = 7, 14 Hz, 1H) , 4,08-4,45 (m, 6H) , 3,77 (dd ancho, J = 4, 11 Hz, 1H) , 2,64 (dd, J = 6,5, 16,5 Hz, 1H) , 2,48-2,41 (m, 1H) , 2,25-2,12 (m, 3H) , 2,07 y 1,82 (s, 3H) , 2,04-1,86 (m, 2H) , 1,80-1,35 (m, 14H) , 1,32-0,80 (m, 14H) , 0,91 (t, J = 7,5, 14,5 Hz, 3H) .

EJEMPLO 21 Síntesis del compuesto 301 de la Tabla 3 21c Compuesto 301 Se añadió una solución de hidróxido de litio monohidrato (23 mg, 0,56 mmol) en H20 (4 mL) a una solución del compuesto éster 21a (45 mg, 0,185 mmol, descrita anteriormente como el isómero (R, R) 9c) en MeOH (3,5 mL) y THF (3,5 mL) . La solución resultante se agitó vigorosamente durante 16 h y después se repartió entre EtOAc (60 mL) y HCl acuoso al 10% (20 mL) . La fase orgánica se separó, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar el correspondiente ácido con un rendimien-to cuantitativo . Este material (aprox. 0,185 mmol) fue combinado con (S) - - (-) -a-metilbencilamina (27 mg, 0,22 mmol), HATU (77 mg, 0,20 mmol) y DIPEA (0,11 mL, 0,65 mmol) en DMF (5 mL) . Después de 20 h, la mezcla de reacción se concentró. El residuo se disolvió en EtOAc y la solución se lavó secuencialmente con NaHC03 acuoso saturado, HCl acuoso al 10% y salmuera, antes de secarla (MgS04) , filtrarla y concentrarla bajo vacío. La purificación mediante cromatografía con resolución rápida (eluyente: 35% de EtOAc/hexano) dio 11 mg (28%) del producto acoplado 21b. Este material (11 mg, 0,033 mmol) se trató con HCl/dioxano 4N durante 35 min. A continuación, la mezcla de reacción se concentró a sequedad para dar la sal hidrocloruro de la correspondiente amina. Este último producto fue acoplado con h (33 mg, 0,036 mmol, preparado por procedimientos análogos a los del Ejemplo 15 y 20), HATU (14 mg, 0,036 mmol) y DIPEA (0,116 mL, 0,02 mmol) en DMF (4 mL) . Después de agitar la mezcla de reacción durante 16 h, la mezcla se concentró. El residuo se disolvió en EtOAc. La solución se lavó secuencialmente con NaHC03 acuoso saturado, HCl acuoso al 10% y salmuera, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró bajo vacío para dar un sólido blanco. Este material (aprox. 0,033) se disolvió en EtOH (6 mL) y se trató con acetato amónico (7 mg, 0,09 mmol) y Pd/C al 10% (10 mg) bajo una atmósfera de gas hidrógeno. Al cabo de 3 h, la mezcla de reacción se filtró a tra- vés de tierra de diatomeas. El filtrado se concentró a sequedad. Después se disolvió el residuo en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa para dar un sólido blanco después de liofilizar (17,6 mg, 57% de rendimiento a lo largo de dos etapas) . Datos espectrales: MS (FAB) ES" 932,6 (M-H)", 954,5 (M-Na)"; HRMS cale. para C48H67N7012 (MH*) 934,49261, encontrado: 934,49010; XH NMR (DMSO, d6) d 8,90 (s, 1H) , 8,24 (d, J = 7,95 Hz, 1H) , 8,14 (d, J = 7,63 Hz, 1H) , 7,99 (d, J = 8,26 Hz, 1H) , 7,79 (d, J = 8,9 Hz, 1H) , 7,75 (d, J = 8,26 Hz, 1H) , 7,42-7,17 (m, 10H) , 5,00 (quíntete, J = 7,63 Hz, 1H) , 4,7 (m, 1H) , 4,52 (d, J = 11,76 Hz , 1H) , 4,43 (d, J = 11,4 Hz, 1H) , 4,33-4,2 (m, 6H) , 3,70 (dd, J = 11,4 y 11,1 Hz, 2H) , 2,63 (dd, J = 5,7 y 5,7 Hz, 1H) , 2,45 (dd, J = 7,95 y 7,95 Hz, 1H) , 2,21-2,11 (m, 3H) , 2,07-1,97 (m, 1H) , 1,93-1,83 (m, 2H) , 1,81 (s, 3H) , 1,78-1,63 ( , 2H) , 1,54-1,41 ( , 2H) , 1,39 (d, J = 7,0 Hz, 3H) , 1,29 (dd, J = 7,94 y 7,63 Hz, 1H) , 1,15 (quíntete, J = 7,0 Hz, 1H) , 1,05 (m, 1H) , 0,90 (d, J = 6,36 Hz, 6H) , 0,88-0,83 (m, 1H) , 0,71 (m, 9H) .

EJEMPLO 22 El compuesto 107 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17. Población de rotámeros por NMR (1:7,6): MS (FAB) m/z: 675 (MH+); 'H NMR (DMSO-d6) d 8,35-8,19 (s ancho, 1H) , 8, 04 (d, J = 7, 63 Hz, 1H) , 7, 93 (d ancho, J = 7,31 Hz, 1H) , 7,88 (d, J = 8,27 Hz, 1H) , 7,86-7,79 (m, 2H) , 7,59--7,49 (m, 3H) , 7,46 (dd, J = 7,95, 7,95 Hz, 1H) , 4,98 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 4,40-4,34 (m, 1H) , 4,32 (s ancho, 1H) , 4,29-4,24 (m, 1H) , 4,22-4,15 (m, 1H) , 4,09 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 3,74 (dd, J = 11,1, 4 Hz, 1H) , 2,20-2,12 (m, 1H) , 2,05-1,94 (m, 2H) , 1,84 (s, 3H) , 1,72-1,42 (m, 7H) , 1,20-1,13 (m, 1H) , 1,08-0,87 (m, 13H) , 0,85 (d, J = 6,68 Hz, 6H) .

EJEMPLO 23 El compuesto 114 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17. Población de rotámeros por NMR (1:7,5): MS (FAB) m/z: 747 (M+Na+) ; XH NMR (DMSO-d6) d 8,40-8,24 (s ancho, 1H) , 8,07-8,01 (m, 1H) , 7,96-7,91 (m, 1H) , 7,87 (d, J = 8,26 Hz, 1H) , 7,85-7,78 (m, 2H) , 7,58-7,49 (m, 3H) , 7,46 (dd, J = 7,95, 7,95 Hz, 1H) , 7,30-7,21 (m, 4H) , 7,20-7,14 (m, 1H) , 4,98 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 11,8 Hz, 1H) , 4,40-4,34 (m, 1H) , 4,34-4,29 (m, 1H) , 4,29-4,25 (m, 1H) , 4,22-4,15 (m, 1H) , 4,09 (d, J = 11,8 Hz , 1H) , 3,74 (dd, J = 11,1, 4 Hz, 1H) , 2,95-2,79 (m, 2H) , 2,21-2,11 (m, 1H) , 2,05--1,94 (m, 2H) , 1,89-1,83 (2 x s, 3H) , 1,63-1,41 (m, 7H) , 1,38-1,30 (m, 1H) , 1,27-1,22 (m, 1H) , 1,12-0,94 (m, 5H) , 0,89 (d, J = 6,4 Hz, 3H) , 0,84 (d, J = 6,4 Hz, 3H) .

EJEMPLO 24 El compuesto 118 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17. Población de rotámeros por NMR aprox. (1:6,3) : MS (FAB) m/z: 677,4 (MH*) ; XH NMR (DMSO-d6) d 8,58 y 8,38 (2 x s ancho, 1H) , 8 , 04 (d, J = 7, 63 Hz, 1H) , 7,93 (d, J = 7, 63 Hz, 1H) , 7,91-7,81 (m, 3H) , 7,59-7,49 (m, 3H) , 7,49-7,43 (m, 1H) , 4,98 (d, J = 12,1 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 12,1 Hz, 1H) , 4,41-4,29 (m, 2H) , 4,29-4,14 (m, 2H) , 4,1 (d, J = 10,8 Hz, 1H) , 3,74 (d ancho, J = 7,63 Hz, 1H) , 2,21-2,12 (m, 1H) , 2,04-1,92 (m, 2H) , 1,90 y 1,84 (2 x s, 3H) , 1,63-1,41 (m, 9H) , 1,39-1,26 (m, 3H) , 1,21-1,15 (m, 1H) , 1,06-0,92 (m, 5H) , 0, 92-0,80 (m, 9H) .

EJEMPLO 25 El compuesto 116 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17. ?H-NMR (DMSO-d6) d 8,36 (s, 1H) , 8,14 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,04 (d, J -= 8 Hz', 1H) , 7,99 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,79 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,33-7,26 (m, 5H) , 4,54-4,42 (m, 3H) , 4,30-4,21 (m, 5H) , 4,06 (d, J = 11 Hz, 1H) , 3,69 (dd, J = Hz, 1H) , 2,62 (dd, J = 16, 10 Hz, 1H) , 2,47-2,42 (m, 1H) , 2,18-2,14 (m, 3H) , 2,02- -1,87 (m, 2H) , 1,82 (s, 3H) , 1,74-1,66 (m, 2H) , 1,54-1,47 (m, 2H) , 1,38-1,27 (m, 2H) , 1,21-1,18 (m, 1H) , 0,97-0,85 (m, 11H) , 0,80-0,70 (m, 7H) .

EJEMPLO 26 El compuesto 121 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17. XH NMR (DMSO-dg) d 9,12 (d, J = 6 Hz, 1H) , 8,64 (s, 1H) , 8,30 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,12 (d, J = 9 Hz, 1H) , 8,05 (dd, J = 8, 7 Hz, 1H) , 7,97 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,80 (dd, J = 8, 7 Hz, 1H) , 7,66 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,54 (d, J = 6 Hz, 1H) , 5,70--5,61 (m, 2H) , 5,26 (d, J = 17 Hz, 1H) , 5,07 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,52 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,39 (dd, J = 9,8 Hz, 1H) , 4,23-4,12 (m, 2H) , 4,03-3,99 (m, 1H) , 2,66-2,54 (m, 1H) , 2,35-2,28 (m, 1H) , 2,08 (dd, J = 9, 17 Hz, 1H) , 2,01-1,93 (m, 1H) , 1,83 (s, 3H) , 1,65-1,46 (m, 5H) , 1,41-1,38 (m, 1H) , 1,24-1,20 (dd, J = 9, 5 Hz, 1H) , 1,05-0,78 (m, 12H) .

EJEMPLO 27 El compuesto 205 de la Tabla 2 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 17. XH NMR (DMSO-d6) d 9,14 (d, J = 6 Hz, 1H) , 8,60, (s, 1H) , 8,32 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,14-8,06 (m, 2H) , 7,98 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,82 (dd, J = 8,7 Hz, 1H) , 7,66 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,55 (d, J = 8 Hz, 1H) , 5,75-5,66 ( , 2H) , 5,22 (d, J = 17 Hz, 1H) , 5,07 (d, J = 10 Hz, 1H) , 4,50 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,39 (dd, J = 9, 9 Hz, 1H) , 4,23-4,08 (m, 3H) , 2,56-2,50 (m, 1H) , 2,36--2,28 (m, 1H) , 2,04-1,97 (m, 1H) , 1,82 (s, 3H) , 1,62-1,41 (m, 7H) , 1,24 (dd, J = 5,4 Hz, 1H) , 0,94-0,75 (m, 12H) .

EJEMPLO 28 El compuesto 117 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 20. 'H NMR (DMSO-d6) d 8,36 (s, 1H) , 8,17 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,09 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,04 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,96-7,92 (m, 2H) , 7,87 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,77 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,56-7,45 (m, 4H) , 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,52 (dd, J = 14,7 Hz, 1H) , 4,37-4,12 (m, 6H) , 3,78-3,73 (m, 1H) , 2,63 (dd, J = 17,6 Hz, 1H) , 2,47-2,42 (m, 1H) , 2,22-2,16 (m, 3H) , 2,04-1,86 (m, 2H) , 1,82 (s, 3H) , 1,77-1,71 (m, 1H) , 1,69-1,42 (m, 8H) , 1,30 (quíntete, J = 8 Hz, 1H) , 1,20 (dd, J = 12, 8 Hz, 1H) , 1,10-0,85 (m, 15H) , 0,76-0,72 (m, 1H) .

EJEMPLO 29 El compuesto 120 de la Tabla 1 fue sintetizado de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 20. XH NMR (DMSO-dg) d 8,34 (s, 1H) , 8,12 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8,05 (d, J = 8 Hz, 1H) , 7,95-7,87 (m, 3H) , 7,81 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,64-7,52 (m, 4H) , 7,46 (dd, J =8, 7 Hz, 1H) , 4,99 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,89 (d, J = 12 Hz, 1H) , 4,63 (dd, J = 14,7 Hz, 1H) , 4,37-4,14 (m, 4H) , 3,74 (dd, J = 11, 4 Hz, 1H) , 3,41-3,35 (m, 2H) , 2,61 (dd, J = 16, 7 Hz, 1H) , 2,44 (dd, J = 16, 8 Hz, 1H) , 2,20-2,15 (m, 1H) , 2,04-1,96 (m, 3H) , 1,82 (s, 3H) , 1,70-1,64 (m, 1H) , 1,56-1,43 (m, 7H) , 1,30 (quint., J = 8 Hz, 1H) , 1,20 (dd, J = 8, 5 Hz, 1H) , 0,99-0,72 (m, 21H) .

EJEMPLO 30 Clonación, expresión y purificación de la proteasa NS3 de HCV tipo Ib recombinante Se obtuvo suero procedente de un paciente infectado por HCV a través de una colaboración exterior (Bernard Willems, MD, Hospital St-Luc, Montreal, Canadá y Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Santé Publique du Québec, Ste-Anne de Belle-vue, Canadá) . Se construyó un molde de cDNA de longitud completa manipulado por ingeniería genética del genoma del HCV a partir de fragmentos de DNA obtenidos por transcripción inversa-PCR (RT-PCR) de RNA del suero y usando cebadores específicos elegidos sobre la base de la homología entre otras cepas -de genotipo Ib. A partir de la determinación de la se-cuencia genómica entera, se asignó un genotipo Ib al material aislado de HCV de acuerdo con la clasificación de Simmonds et al. (J. Clin. Microbiol. (1993), 31, págs . 1493-1503). Se demostró que la secuencia de aminoácidos de la región no estructural, NS2-NS4B, era más del 93% idéntica al genotipo Ib de HCV (materiales aislados BK, JK y 483) y 88% idéntica al genotipo la de HCV (mat . aislado HCV-1) . Un fragmento de DNA que codifica el precursor de poliproteína (NS3/NS4A/NS4B/ NS5A/NS5B) fue generado mediante PCR e introducido en vectores de expresión eucariotas. Después de la transfección transitoria, el procesamiento de la poliproteína mediado por la proteasa NS3 de HCV fue demostrado por la presencia de la proteína NS3 madura usando análisis de transferencia Western. La proteína NS3 madura no fue observada con la expresión de un precursor de poliproteína que contiene la mutación S1165A, que inactiva la proteasa NS3, confirmando la funcionalidad de la proteasa NS3 del HCV. El fragmento de DNA que codifica la proteasa NS3 del HCV recombinante (aminoácidos 1027 a 1206) fue clonado en el vector de expresión bacteriano pETlld. La expresión de la proteasa NS3 en BL21 (DE3) pLysS de E. coli fue inducida por incu-Pación con IPTG lmM durante 3h a 22 °C. Una fermentación típica (18 L) dio aproximadamente 100 g de pasta de células húmeda. Las células se resuspendieron en tampón para lisis (3,0 mL/g) consistente en fosfato sódico 25 mM, pH 7,5, glicerol al 10% (v/v), EDTA 1 mM, NP-40 al 0,01%, y se almacenaron a -80°C. Las células se descongelaron y se homogeneizaron después de añadir DTT 5 mM. Después se añadieron cloruro de magnesio y DNasa al material homogeneizado a las concentraciones finales de 20 mM y 20 µg/mL, respectivamente. Después de una incubación durante 25 min a 4°C, el material ho oge-neizado fue tratado con ultrasonidos y centrifugado a 15000 x g durante 30 min a 4°C. El pH del líquido sobrenadante se ajustó después en 6 , 5 usando una solución de fosfato sódico 1M. Se añadió una etapa adicional de cromatografía de fil-tración en gel al procedimiento de purificación en 2 etapas descrito en el documento WO 95/22985 (incorporado al presente texto como referencia) . Brevemente, el líquido sobrenadante del extracto bacteriano se cargó en una columna SP HiTrap (Pharmacia) previamente equilibrada a un caudal de 2 mL/min en tampón A (fosfato sódico 50 mM, pH 6,5, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, DTT 5 mM, NP-40 al 0,01%). Después se lavó la columna con tampón A que contenía NaCl 0,15 M, y la proteasa se eluyó aplicando 10 volúmenes de la columna de un gradiente lineal de NaCl de 0,15 a 0,3 M. Las fracciones que contienen proteasa NS3 se agruparon y se diluyeron hasta una concéntración final de NaCl de 0,1 M. La enzima se purificó adicionalmente en una columna HiTrap Heparin (Pharmacia) equilibrada en tampón B (fosfato sódico 25 mM, pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 5 mM, NP-40 al 0,01%) . La muestra se cargó a un caudal de 3 mL/min. Después se lavó la columna con tampón B que conte-nía NaCl 0,15 M a un caudal de 1,5 mL/min. Se realizaron dos etapas de lavado en presencia de tampón B que contenía NaCl 0,3 ó 1 M. La proteasa se recuperó en el lavado con NaCl 0,3 M, se diluyó 1 a 3 veces con tampón B, se volvió a aplicar a la columna HiTrap Heparin, y se eluyó con tampón B que conte-nía NaCl 0,4 M. Finalmente, las fracciones que contenían proteasa NS3 se aplicaron en una columna Superdex 75 HiLoad 16/60 (Pharmacia) equilibrada en tampón B que contenía NaCl 0,3 M. Se juzgó que la pureza de la proteasa NS30 del HCV obtenida de las fracciones agrupadas era superior al 95%, mediante SDS-PAGE seguida de análisis de densitometría . La enzima se almacenó a -80°C y se descongeló en hielo y se diluyó inmediatamente antes de usarla.

EJEMPLO 31 Ensayo radiométrico de proteasa NS3 de HCV recombinante/pép-tido cofactor NS4A La enzima fue clonada, expresada y preparada de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 30. La enzima se almacenó a -80°C, se descongeló en hielo y se diluyó inmedia-tamente antes de su empleo en el tampón de ensayo que contenía el péptido cofactor NS4A.

El sustrato usado para el ensayo radiométrico de proteasa NS3/péptido cofactor NS4A, DDIVPC-SMSYTW, es segmentado entre los restos de cisteína y de serina por la enzima. La secuencia DDIVPC-SMSYTW corresponde al sitio de segmentación natural NS5A/NS5B en el que el resto de cisteína en P2 ha sido sustituido por una prolina. El péptido sustrato DDIVPC- -SMSYTW y el trazador biotina-DDIVPC-SMS [12SI-Y] TW se incuban con la proteasa NS3 recombinante y el cofactor del péptido NSA4 KKGSWIVGRIILSGRK (relación molar de enzima: cofactor 1:100) en ausencia o en presencia de inhibidores. La separación de sustrato de los productos se realiza añadiendo glóbulos de agarosa recubiertos con avidina a la mezcla de ensayo, seguido de filtración. Las cantidades de producto SMS [125I-Y] TW encontradas en el filtrado permiten calcular el porcentaje de conversión de sustrato y el porcentaje de inhibición.

A. Reactivos Tris y Tris-HCl (UltraPure) fueron obtenidos de Gibco--BRL. El glicerol (UltraPure) , MES y BSA se adquirieron de Sigma. El TCEP se obtuvo de Pierce, el DMSO de Aldrich y el NaOH de Anachemia. Tampón para ensayo: Tris HCl 50 mM, pH 7,5, glicerol al 30% (p/v) , l mg/mL de BSA, TCEP 1 mM (el TCEP se añade in-mediatamente antes de su empleo a partir de una solución madre 1 M en agua) . Sustrato: DDIVPCSMSYTW, concentración final 25 µM (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20°C para evitar la oxidación) . Trazador: sustrato onoyodado reducido biotina DDIVPC SMS[125IY]TW (concentración final -1 nM) . Proteasa NS3 tipo Ib de HCV, 25 nM de concentración final (a partir de una solución madre en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, glicerol al 10%, NaCl 300 mM, DTT 5 mM, NP-40 al 0,01%) . Péptido cofactor NS4A: KKGSWIVGRIILSGRK, concentración final 2,5 µM (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20°C) .

B. Protocolo El ensayo se realizó en una placa de polipropileno de 96 pocilios de Costar. Cada pocilio contenía: • 20 µL de sustrato/trazador en tampón para ensayo; • 10 µL de inhibidor en 20% DMSO/tampón para ensayo; • 10 µL de proteasa NS3 lb/péptido cofactor NS4 (relación molar 1 : 100) . También se prepararon en la misma placa de ensayo el blanco (sin inhibidor y sin enzima) y el testigo (sin inhibidor) . La reacción enzimática se inició mediante la adición de la solución de enzima/péptido NS4A y la mezcla de ensayo se incubó durante 40 min a 23°C bajo una agitación suave. Se añadieron diez (10) µL de NaOH 0,5 N y 10 µL de MES 1M, pH ,8, para sofocar la reacción enzimática. Se añadieron veinte (20) µL de glóbulos de agarosa re-cubiertas con avidina (adquiridos de Pierce) en una placa de filtración MADP N65 de Millipore. La mezcla de ensayo sofocada se transfirió a la placa de filtración y se incubó durante 60 min a 23°C bajo agitación suave. Las placas se filtraron usando un aparato de filtración MultiScreen Vacuum Manifold Filtration de Millipore, y se transfirieron 40 µL del filtrado a una placa opaca de 96 pocilios que contenía 60 µL de fluido de centelleo por pocilio. Los filtrados se sometieron a recuento en un instrumento Packard TopCount usando un protocolo para 1 5I -líquido durante 1 minuto. El % de inhibición se calculó con la ecuación siguiente: 100- [ (cuentas?r.,..-cuentasblanco) / (cuentascesc?go-cuentasbianco) xlOO] Se aplicó a los datos de inhibición- concentración un ajuste no lineal a un curva con el modelo de Hill, y se calculó la concentración efectiva al 50% (CI50) usando el programa para ordenador SAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

EJEMPLO 32 Ensayo de proteína heterodímera NS3-NS4A de longitud completa La región no codificadora NS2-NS5B-3' fue clonada mediante RT-PCR en el vector pCR®3 (Invitrogen) usando RNA ex-traído del suero de un individuo infectado con genotipo Ib de HCV (proporcionado por el Dr. Bernard Willems, Hospital St-Luc, Montreal, Québec, Canadá) . La región de DNA de NS3-NS4A fue después subclonada mediante PCR en el vector de expresión de baculovirus pFastBac™ HTa (Gibco/BRL) . La secuencia del vector incluye una región que codifica una secuencia N-terminal de 28 restos que contiene una etiqueta de hexahisti-dina. El sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac™ (Gibco/BRL) fue usado para producir el baculovirus recombinante. La NS3 madura de longitud completa y la proteína hete-rodímera NS4A (His-NS3-NS4AFL) se expresó infectando 106 células Sf21/mL con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 0,1-0,2 a 27°C. El cultivo infectado se recolectó 48 a 64 h más tarde mediante centrifugación a 4°C. El sedimento de células fue homogeneizado en NaP04 50 mM, pH 7,5, glicerol al 40% (p/v), <3-mercaptoetanol 2 mM, en presencia de un coctel de inhibidores de proteasa. Después se extrajo His-NS3-NS4AFL del lisado de células con NP-40 al 1,5%, 0,5% de Tritón X-100, NaCl 0,5 M y un tratamiento con DNasa. Después de la ultracentrifugación, el extracto soluble se diluyó 4 veces y se unió a una columna Hi-Trap de Pharmacia Ni-quelante. El His-NS3 -NS4AFL se eluyó en una forma con > 90% de pureza (estimada mediante SDS-PAGE) , usando un gradiente de imidazol de 50 a 400 mM. El producto His-NS3--NS4AFL se almacenó a -80°C en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, glicerol al 10% (p/v), NaCl 0,5 M, imidazol 0,25 M, NP-40 al 0,1%. Se descongeló en hielo y se diluyó inmediatamente antes de su empleo. La actividad de proteasa de His-NS3-NS4AFL fue ensayada en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, citrato sódico 0,25 M, n-dodecil- -/?-D-maltósido al 0,01% (p/v), TCEP 1 mM. Cinco (5) µM del sustrato sofocado internamente antranilil-DDIVPAbu [C (0) -O] - -AMY(3-N02) TW-OH en presencia de diversas concentraciones de inhibidor fueron incubados con 1,5 nM de HÍS-NS3-NS4AFL durante 45 min a 23 °C. La concentración final de DMSO no excedió el 5,25%. La reacción fue terminada con la adición de MES 1M, pH 5,8. Se controló la fluorescencia del producto N--terminal en un fluorómetro Perkin Elmer LS-50B equipado con un lector de placas de 96 pocilios (longitud de onda de excitación: 325 nm; longitud de onda de emisión: 423 nm) . Después se aplicó un ajuste no lineal a una curva usando el modelo de Hill a los datos de % de inhibición-concentración y se calculó la concentración efectiva al 50% (Cl50) mediante el empleo del programa SAS (Statistical Software System, SAS Institute Inc., Cary, N.C.).

EJEMPLO 33 Ensayo de proteasa NS3 basado en células Este ensayo se llevó a cabo con células Huh-7, una línea de células humanas derivadas de un hepatoma, co-transfectadas con 2 construcciones de DNA: - una que expresa una poliproteína que comprende las proteínas no estructurales del HCV fusionadas a tTA por el orden siguiente: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA (llamada NS3) ; la otra que expresa la proteína reportera, fosfatasa alcalina secretada, bajo el control de tTA (llamada SEAP) . La poliproteína ha de ser segmentada por la proteasa NS3 para que se liberen las proteínas maduras. Al liberarse las proteínas maduras, se cree que las proteínas virales formarán un complejo en la membrana del retículo endoplasmático, mientras que la tTA emigrará al núcleo y transactivará el gen SEAP. Por consiguiente, la reducción de la actividad proteolítica de NS3 debe conducir a la reducción de los niveles de tTA madura y a la disminución concomitante en la actividad de SEAP. Para controlar los otros efectos de los compuestos, se hizo una transfección paralela en la que una construcción que expresa tTA sola (llamada tTA) fue co-transfectada con la construcción SEAP, de forma que la actividad de SEAP es independiente de la actividad proteolítica de NS3. Protocolo del ensayo: células Huh-7, desarrolladas en CHO-SFMII + 10% de FCS (suero de ternera fetal) fueron co-transfectadas con NS3 y SEAP o bien con tTA y SEAP, usando el protocolo FuGene (Boehringer Mannheim) . Al cabo de 5 h a 37°, las células fueron lavadas y tripsinadas, y se pusieron en placas (a razón de 80.000 células/pocilio) en placas de 96 pocilios que contienen una gama de concentraciones de los compuestos a ensayar. Después de un periodo de incubación de 24 h, se retiró una parte alícuota del medio y se midió la actividad de SEAP en esta parte alícuota con el ki t Phospha-Light (Tropix) . Se realizó el análisis del porcentaje de inhibición de la actividad de SEAP con respecto a la concentración de compuesto con el programa SAS, para obtener el valor de la CES0.

La toxicidad del compuesto (TC50) se evaluó después usando el ensayo MTT de la forma que sigue: Se añaden en cada pocilio 20 µL de una solución de MTT (5 mg/mL de medio) y se incuban a 37° durante 4 h; se retiró el medio y se añadieron 50 µL de HCl 0,01 N + 10% de Tritón X-100; después de agitar a TA durante al menos 1 h, se leyó la DO (densidad óptica) de cada pocilio a 595 nm de longitud de onda. La TC50 fue calculada de la misma forma que la CE50.

EJEMPLO 34 Ensayos de especificidad Se determinó la especificidad de los compuestos contra una diversidad de proteasas de serina: elastasa leucocitaria humana, elastasa pancreática porcina y a-quimotripsina pan- creática bovina y una proteasa de cisteína: la catepsina B hepática humana. En todos los casos se utilizó un protocolo de formato de placa de 96 pocilios usando un sustrato colorí -métrico de p-nitroanilina (pNA) específico para cada enzima. Cada ensayo incluía 1 h de pre-incubación de enzima-inhibidor a 30°C, seguida por la adición de sustrato e hidrólisis hasta una conversión de «=30%, que se mide en un lector de micropla-cas UV Thermomax®. Las concentraciones de sustrato se mantuvieron lo más bajas posible en comparación con K„ para reducir la competición por el sustrato. Las concentraciones de compuesto variaron desde 300 a 0,06 µM dependiendo de su potencia. Las condiciones finales para cada ensayo fueron las siguientes: Tris-HCl 500 mM pH 8 , Na2S04 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 3% de DMSO, 0,01% de Tween-20 con: [100 µM de Succ-AAPF-pNA y 250 pM de a-quimotripsina] , [133 µM de Succ-AAA-pNA y 8 nM de elastasa porcina] , [133 µM de Succ-AAV-pNA y 8 nM de elastasa leucocitaria] ; o [NaHP04 100 mM, pH 6, EDTA 0,1 mM, 3% de DMSO, TCEP 1 mM, 0,01% de Tween-20, 30 µM de Z-FR-pNa y 5 nM de catepsina B (la enzima madre fue activada en tampón que contenía TCEP 20 mM antes de usarse) ] . Un ejemplo representativo se resume a continuación para la elastasa pancreática porcina: A una placa de poliestireno de 96 pocilios de fondo plano se añadieron, usando un manipulador de líquidos Biomek (Beckman) : • 40 µL de tampón para ensayo (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM) ; • 20 µL de solución de enzima (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 0,02% de Tween-20, 40 nM de elastasa pancreática porcina) ; y • 20 µL de solución de inhibidor (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 0,02% de Tween-20, 1,5 mM - 0,3 µM de inhibidor, DMSO al 15% v/v) . Después de 60 min de preincubación a 30°C se añadieron a cada pocilio 20 µL de solución de sustrato (Tris-HCl 50 mM, pH 8, Na2S04 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 665 µM de Succ- -AAA-pNA) , y la mezcla de reacción se incubó adicionalmente a 30°C durante 60 min, después de lo cual se leyó la absor-bancia en el lector de placas UV Thermomax®. Se asignaron filas de pocilios para testigos (sin inhibidor) y para blancos (sin inhibidor y sin enzima) . Las diluciones secuenciales dobles de la solución de inhibidor fueron realizadas por el manipulador de líquidos en una placa separada usando Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 0,02% de Tween-20, DMSO al 15%. Todos los demás ensayos de especificidad se realizaron de una manera similar. El porcentaje de inhibición fue calculado usando la fórmula: [l-((UV?nh-UVblanco)/(UVtest?ao-UBblanco))] x 100 Se aplicó un ajuste no lineal a una curva con el modelo de Hill a los datos de inhibición-concentración, y se calculó la concentración eficaz al 50% (CI50) usando el programa SAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc., Cary, N.C. ) .

TABLAS DE COMPU?STOS Los compuestos de la invención fueron ensayados en uno o en los dos ensayos de los Ejemplo 31 y 32, y se encontró que eran activos con un valor de la CI50 por debajo de 50 µM (A), por debajo de 5 µM (B) o por debajo de 0,5 µM (C) .

Actividad en las células y especificidad: Compuestos representativos de la invención fueron también ensayados en el análisis basado en células subrogado del Ejemplo 33 y en uno o varios análisis del Ejemplo 34. Por ejemplo, se encontró que el compuesto 233 de la Tabla 2 tenía una CI50 de 1 nM en el Ensayo del Ejemplo 32. La CE50, deter- minada por el ensayo del Ejemplo 33, es 5,4 µM, mientras que otros efectos (tTA) no eran detectables a concentraciones de hasta 120 µM. El compuesto 233 ha sido también analizado en el ensayo MTT y se determinó que su TC50 es mayor que 120 µM, lo que indica que este compuesto es no tóxico a su concentración eficaz. En los ensayos de especificidad del Ejemplo 34, se encontró que el mismo compuesto tiene la actividad siguiente: HLE > 75 µM; PPE > 75 µM; a-quim. > 75 µM; Cat. B > 75 µM. Estos resultados indican que esta familia de compuestos es altamente específica para la proteasa NS3. Las tablas que siguen presentan una relación de compuestos representantivos de la invención. Se usan las abreviaturas siguientes: MS : datos de espectrometría de masas; Ac : acetilo; Bn: bencilo; Chg: ciclohexilglicina (ácido 2-amino--2-ciclohexil-acético) ; Dnl : dansilo; O-Bn: benciloxi; Pip : ácido pipecólico; Tbg: tere-butilglicina .

TABLA 1 TABLA 2 P6 P5 P4 P3 P2 P1 TABLA 3 TABLA 5 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (5)

1. IffilVTNDICACTO ES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1 . Un compuesto de fórmula ( I ) , incluyendo los racematos , diaestereoisómeros e isómeros ópticos : caracterizado porque: a es 0 ó 1 ; b es 0 ó 1 Y es H o alquilo C_.6; B es H, un derivado de acilo de fórmula R7-C(0) o un sulfo-nilo de fórmula R7-S02, en la que R7 es (i) alquilo C_.10 opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C1-6 o alcoxi C__6; (ii) cicloalquilo C3.7 opcionalmente sustituido con carboxilo, (alcoxi C_.6) carbonilo o fenilmetoxicarbonilo; (iii) arilo C6 o C10 o aralquilo C7.16 opcionalmente sustituido con alquilo C__6, hidroxi o amino opcionalmente sustituido con alquilo C..6; o (iv) Het opcionalmente sustituido con alquilo C_.6/ hidroxi, amino opcionalmente sustituido con alquilo C_.6 o amido opcionalmente sustituido con alquilo C__6; R6, cuando está presente, es alquilo C_.6 sustituido con carboxilo; R5, cuando está presente, es alquilo C1.6 opcionalmente sustituido con carboxilo; R4 es alquilo C. 10, cicloalquilo C3.7 o (alquilcicloalqui-lo)C4.10; R3 es alquilo C_.10, cicloalquilo C3.7 o (alquilcicloalqui-lo) C4.:o/- R2 es CH, -R20 , NH-R20 , O-R20 ó S-R20 , en donde R20 es un cicloal quilo C3 , saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo) C4.10 que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R21, o R20 es un arilo C6 o C10 o aralquilo C7.16 opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R21, o R20 es Het o Het- (alquilo inferior) opcionalmente mono- , di-o tri-sustituido con R21, en donde cada R21 es independientemente alquilo C_.6; alcoxi C_.6; amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C1-6; sulfonilo; N02; OH; SH; halo; haloalquilo; amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C1-6, arilo C6 o C10, aralquilo C7.16, Het o (alquilo inferior) -Het; carboxilo; carboxi (alquilo inferior) ; arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het, estando dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R22; en donde R22 es alquilo C__6; alcoxi C_.6; ammo opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_.6; sulfonilo; N02; OH; SH; halo; haloalquilo; carboxilo; amida; o (alquil inferior) amida; R_. es alquilo C__6 o alquenilo C2.6 opcionalmente sustituido con halógeno; y W es hidroxi o un arrimo N-sustituido; o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.
2. 2 . EL c rpuestD según la reivindi ración 1, caraclprizarib parque cuando B es H o un derivado acilo de fórmula R7C(0)-, en la que R7 es alquilo C_.6; alcoxi C1_6 , cicloalquilo C3.7 opcio-nalmente sustituido con hidroxi; amido opcionalmente sustituido con alquilo C__6 o Het; arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het, todos ellos opcionalmente sustituidos con alquilo C_.6 o hidroxi .
3. 3 . EL aarpuesto según la r virriir-aaón 2, carar?eri-zacb porque R7 es alquilo C__6 o Het .
4. 4 . EL cprpjesto según la reivirriicar---?n 3, cara-±erizacb parque dicho Het se elige entre el grupo consistente en :

   5. EL crpuesto según . la reivipiLcación 2, parque B se elige entre el grupo consistente en H; acetilo;

   6. EL cprpuasto según la reiv-urhcaci?n 5, araclet izado porgue B es acetilo. 7. EL ccrrpuastE) según la reivirrl Trión 1, caracterizado perqué B es R7-S02 y R7 es arilo C6 o C10, un aralquilo C7.16 o Het, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C_.6. 8. EL carpuesto según la rejvijtn ración 1, caract erizado porque R6, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp o Glu. 9. EL aarpuesto según la 8, cararterizacb porgue R6, cuando está presente, es la cadena secundaria de Aso. 10. EL compuesto según la reiv-rdicaaón 1, porgue a es 0 y entonces R« está ausente. 11. EL carpuesto según la reivipiifartirn 1, carar?erizado perqué R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: D-Asp, L-Asp, D- -Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc-butilglicina (Tbg) y L-Tbg.

   12. EL aarpuesto según la reivirri ración 11, caraerpri 7a±> porgue R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp. D-Val o D-Glu. 13. EL carpuesto según la reiv-urtiarión 12, caractrizaio porgue R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Glu. 14. EL cprpuesto según la parque a es 0 y b es 0, y entonces ambos grupos R6 y R7 están ausentes. 15. EL crrrpuesto según la re?virii-caaón 1, caracteri zado porgue R4 es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: Val, ciclohexilglicina (Chg) , Tbg, lie o Leu. 16. EL carpuesto segón la re?virri-j-ac-ión 15, rar;* •!=*- i 7arfr> perqué R4 es la cadena secundaria de Chg o lie.

   17. EL oarpjesto según la reiV-Lrriica -ón 16, üdractFrizarib porque R4 es la cadena secundaria de Chq. 18. EL crmpuesto segal la reiviná-j-a-d? 1, c-sracrjerizado porque Y es H o Me. 19. EL aarpuesto según la reiv_J?dirarión 18, cdi Letizacb perqué Y es H. 20. EL carpuesto según la reivirrii-cación 1, caraerjerizair) perqué R3 es la cadena secundaria de un aminoácido elegido entre el grupo formado por: lie, Chg, Val o Tbg. 21. EL cprpuesto según la reiv_utrtirartirV? 20, caracberizadb porque R3 es la cadena secundaria de Val, Chg o Tbg. 22. EL csrpuesto según la reivindi raraón 21, (___racl erizao porque R3 es la cadena secundaria de Val o Tbg. 23. El carpuesto según la reivinrtirarñrn 1, carar-±erizado porgue R2 es S-R20, O-R20, en donde R20 es arilo C6 o C10, aralquilo C7.16, Het o -CH2-Het, todos opcionalmente mono-, di- o tri- - sustituidos con R21; en donde R21 es alquilo C_.6, alcoxi C1-6; amino, mono- o di- (alquil inf erior) amino; amido opcionalmente monosus- tituido con alquilo C_.6, arilo C6 o C10, aralquilo C7.16, Het o (alquil inf erior) -Het ; N02; OH; halo; trifluorometilo; carboxilo; arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het, estando dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R22 ; en donde R22 es alquilo C_.6; alcoxi C__6; amino; mono- o di- (alquil inf erior) amino; (alquil inferior) amida; N02; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo. 2 . EL caipuesto según la reivirriirartión 23, caracterizado perqué R21 es alquilo C_.6; alcoxi C_.6; amino, di- (alquil inf erior) a-mino; (alquil inf erior) amida, arilo C6 o C10, o Het, estando dichos arilo o Het opcionalmente sustituidos con R22, en donde R22 es alcoxi C_.6; amino; di- (alquil inf erior) amino; (alquil inferior) amida; halo o trifluorometilo. 25. EL a_ppuesto según la reivir i ración 23, carat ñri zade» perqué R2 es 1 -naf tilmetoxi; 2 -naf tilmetoxi ; benciloxi; 1-naftiloxi; 2-naftiloxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R21, en donde R21 es como se definió en la reivindicación 23. 26. EL carpuesto según la reivirrlicacdón 23, caracterizado ccraue R2 es 1 -naf tilmetoxi; o quinolinoxi no sustituido, mono- o di-sustituido con R21, en donde R21 es como se definió en la reivindicación 23. 27. EL c-arpuesto según la 26, caracterizado perqué R2 es : en donde R21A es amido opcionalmente sustituido con alquilo C_.6, arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het; arilo C6 o C10 o Het opcionalmente sustituidos con R22, y R22 es amino, di (alquil inferior) amino; o (alquil inf erior) amida; y R21B es alquilo C_.6, alcoxi C__6, amino; di (alquil inf erior) amino; (alquil inferior) amida; N02; OH; halo; trifluorometilo; o carboxilo. 28. EL carpuesto según la r vipiirarir 27, caracteriza o perqué R21A es arilo C6 o C1C o Het, todos opcionalmente sustituidos con R22, y R22 es amino, dimetilamino o acetamido. 29. El o rpuesto según la reivi-nctifarrión 27, caracterizado perqué R21B es alcoxi C_.6 o di- (alquil inf erior) amino. 3 . £ a-rrpuesto según la reivinilcarpón 29, cararpr izado porque R21B es metoxi . 31. EL carpuesto según la reiv-rti ración 1, carar-*Rri zad porgue el carbono asimétrico en posición 1 tiene la configuración R, representada por las siguientes configuraciones absolutas: en donde es como se definió en la reivindicación 1. 32. EL aarpuesto según la reivirpieaaón 31, cai-acl Eria porque el sustituyente Rx en Pl está orientado sin respecto al grupo carbonilo, como se representa por la siguiente configuración absoluta : en donde x es metilo, etilo, propilo, vinilo, todos los cuales están opcionalmente sustituidos con halo. 33. EL carpuesto según la 32, caracterizado porgue Rx es etilo, vinilo o bromovinilo. 34. EL sarpuesto según la reivirri-jtartirh 33, caraclTri zado parque Rx es vinilo. 35. EL c rpuesto según la reivirpirarrirri 1, cara-terizado porque W es hidroxi, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéu-ticamente; o (alquil inf erior) amino, di- (alquil inferior) amino o amino-aralquilo. 36. EL carpuesto según la reivindicara oh 33, caracterizado porque W es hidroxi, o N (R13a) R13b, en donde R13. y R13b son independientemente H, arilo o alquilo C_.6 opcionalmente sustituido con hidroxi o fenilo; o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente . 37. EL carpuesto según la reivirttiraión 36, caracl erizado perqué W es -OH, -NH-bencilo o -NH-CH (Me) Ph. 38 • EL a-irpuesto según la 37, car acia- i zado perqué W es -OH o -NH- (S)CH (Me) -fenilo. 39. EL carpesto según la reivirrii ración 38, caracterizado porque cuando W es un éster, dicho éster se elige entre el grupo formado por: alcoxi C__6, fenoxi o aril (alcoxi CI-6) . 40 • EL carpuesto según la - vi-rrri rara rh 39, caracterizado porque dicho éster es metoxi, etoxi, fenoxi, benciloxi o PhCH(Me) -O- . 41 . EL COrpiRStP de fiÚOtuLa I según la rvñvitrtirrrñ?n l, porque B es H, (alquil inferior) -C (0) - o Het-C(O)-; R6, cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp o Glu; R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D- o L- : Asp, Glu, Val o Tbg; Y es H o metilo; R4 es la cadena secundaria de Val, Chg, Tbg, lie o Leu; R3 es hidrógeno o la cadena secundaria de lie, Chg, Val o Tbg; R2 es 1-naftilmetoxi, 2 -naftilmetoxi, O-Bn, en donde R22 es amino, di (alquil inferior) amino, (alquil infe- rior) amida, N02, OH, halo, CF3 o COOH; Pl es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula en la que Rx es etilo, vinilo o bromovinilo; y W es hidroxi o N(R13a)R13b, en donde R13a y R13b son independientemente H, arilo o alquilo Cx.6 opcionalmente sustituido con hidroxi o fenilo; o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente . 4 . EL carpuesto de fiáprula I según la 1, caractFri zarh porque B es H , acetilo o Het -C (O) - ; R6 , cuando está presente, es la cadena secundaria de Asp; R5, cuando está presente, es la cadena secundaria de D-Asp, D-Glu o D-Val; Y es H; R4 es la cadena secundaria de Chg o lie; R3 es la cadena secundaria de Val, Chg o Tbg; R2 es 1-naftilmetoxi , benciloxi, 4 -quinolinoxi, o halo, NH- o NO, Pl es un sistema de anillo de ciclopropilo de fórmula en la que R1 es Et o CH=CH2 o CH=CHBr; y W es hidroxi o NH- (5) -CHMePh, o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente . 43 . EL carpuesto ds formula I según la - virrti ración 1, caracterizado porque B es acetilo ; Rs » cuando está presente , es la cadena secundaria de Asp ; R5 , cuando está presente , es la cadena secundaria de D-Glu; Y es H; R4 es la cadena secundaria de Chg ; R3 es la cadena secundaria de Val o Tbg ; R2 es : Pl es : y W es hidroxi, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente . 44. El compuesto según la reivindicación 41, representado por la fórmula: caracterizado porque B, P6, P5, P4, P3, R2 y R son como se definen a continuación: Ph ~m ~Ac~ -- — "Chg~ Val" ~ -NJ?CH2Ó~~ (CH2)2 ?K2?~ Ph — — — - 120 Ac Asp D-Vaí Chg Val l-NpCH2O 1R.2R

   45. El compuesto según la reivindicación 41, representado por la fórmula: P1 caracterizado porque P6, P5, P4, P3, R„ y son como se definen a continuación: Tab.2 . P6 P5 P4 P3 R2 Ri comp. n° 20Í _ _ ~~~Chg" ' Val ~~ CH=CH2 "202 " — " ¿h¡ " " Chg~ ?-NpCH20 ~ CH=?CH2 203 — Chg " Val" " l-NpCH2O CH=CH2 g~ — — — - 204 — " Ch " Val ~ "C-feCHBr* c Tab. 2 P6 P5 P4 P3 Ri comp. comp. nQ comp. n9 . 229 - Chg Val " ct???° " ~ O¿=CH¡ \ ? comp. nd ¡ 237 Chg Val ? vinil° 238 Asp D-Glu vinilo

   46. El compuesto según la reivindicación 41, represen-tado por la fórmula: caracterizado porgue B, P6, P5, P4, P3, R R y W son como se definen a continuación: comp. n2 301 Ac Asp D-Glu Ue Val OBn 1 Et NH-(S)- CHMcPh 302 Dnl Asp D-Glu Chg Tbg Viniio OH

   47. El compuesto según la reivindicación 41, representado por la fórmula: caracterizado porque B, Y, P4 , P3, R~ y R. son como se def inen a continuación : 48 . El compuesto según la reivindicación 41 , represen-tado por la fórmula : caracterizado porque B son como se definen y R2o continuación : ! Tab.5 ~ B_ Tab.
5. 5 B *.-->

   49. üh hexapépticb de faprula I según la reivirAca ón 44, porque es elegidD entre el grupo faorado por los carpuestos Ñas: 108; 116; 117; y 120. 50. Un hexapépti?b de fOrrrula I según la reivirrfi rarrirh 45, caracterzarV) perqué es l^ idp entre el grupo foriiüdo per los carpuestos as: 212; 222; 236; y 238. 51. Un ha?.-f Hr--? de fsrpula I según la reivirriira-ñón 46, caracterizado aarpuestos Ñas: 44, caracterizarb los carpuestos 45, caracterizado los crmpuestos n°s: 202; 203; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 214; 215; 216; 218; 219; 220; 221; 223; 224; 225; 226; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235. fórmula I según la reiviidjcarrión 47, caracterizado el grupo formado par el cxppuesto ND: fiórrrula I segii la r vi?tiirarirh parque es elegido entre el grupo fioreb por ls cerrpuestos n°S: 501; 502; 503; 504; 505; 506; 507; 508; 509; 510 y 511. 56. Lha ü-i?_.?irión f apraoéut-Lca carácter- i ada parque una can-tidad viralmente efectiva anti-hepatitis C de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, mezclada con un vehículo o agente auxiliar aceptables farmacéuticamente.

   57. El uso de una combinación de una cantidad efectiva del compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, o una composición como se describió anteriormente, para la manufactura de un medicamento para tratar una infección viral de hepatitis C en un mamífero. 58. El uso de una combinación de una cantidad efectiva del compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, o una composición según la reivindicación 56, para la manufactura de un medicamento para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C exponiendo el virus a una cantidad, que inhibe la proteasa de NS3 viral de la hepatitis C, de dicha combinación. 59. El uso de una combinación del compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, o una sal o éster del mismo aceptable terapéuticamente, y un interferón, para la manufactura de un medicamento para tratar una infección viral de hepatitis C en un mamífero. 60. La composición farmacéutica según la reivindicación 56, caracterizada porque comprende además un segundo agente antiviral . 61. La composición farmacéutica según la reivindicación 60, caracterizada porque dicho segundo agente antiviral es ribavirina o amantadina. 62. La composición farmacéutica según la reivindicación 56, caracterizada porque además comprende otros inhibidores de proteasa del HCV. 63. La composición farmacéutica según la reivindicación 56, caracterizada porque además comprende un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV, elegidas entre: helicasa, polimerasa, metaloproteasa o IRES. 64. Un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) según la reivindicación 1, en el que Pl es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico sustituido, caracterizado porque comprende la etapa de: • acoplar un péptido elegido entre el grupo formado por: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3- P2; APG-P3-P2; y APG-P2; • Con un intermedio Pl de fórmula: en la que R_ es alquilo C__6 o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido con halógeno, CPG es un grupo protector de carboxilo, y APG es un grupo protector de amino, y P6 a P2 son como se definieron en la reivindicación 1. 65. Un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) según la reivindicación 1, en el que Pl es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico sustituido, caracterizado porque comprende la etapa de: • acoplar un péptido elegido entre el grupo formado por: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG- P3-P2; y APG-P2; • con un intermedio Pl de fórmula: en la que Ri es etilo, vinilo o bro ovinilo, CPG es un grupo protector de carboxilico y P6 a P2 son como se definieron en la reivindicación 1. 66. Un procedimiento para la preparación de un análogo de péptido de fórmula (I) según la reivindicación 1, en el que Pl es un resto de ácido aminociclopropil-carboxílico sustituido, caracterizado porque comprende la etapa de: • acoplar un péptido elegido entre el grupo formado por: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3-P2; APG- P3-P2; y APG-P2; • con un intermedio Pl de fórmula: en la que CPG es un grupo protector de carboxilo y P6 a P2 son como se definieron en 'la reivindicación 1. 67. El procedimiento según las reivindicaciones 61, 62 ó 63, caracterizado porque dicho grupo protector de carboxilo (CPG) se elige entre el grupo formado por: esteres de alquilo, esteres de aralquilo y esteres que son segmentables mediante un tratamiento básico suave o por medios reductores suaves.

   68. Uso de un análogo de aminoácido de fórmula: en la que R_. es alquilo C?_6 o alquenilo C2_6 opcionalmente sustituido con halógeno, para la preparación de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1. 69. Uso de un análogo de aminoácido de fórmula: en la que R_ es etilo, vinilo o bromovinilo, para la preparación de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1. 70. Uso de un análogo de aminoácido de fórmula: Para la preparación de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1. RESUMEN DE LA INVENCIÓN en la que a es 0 ó 1; b es 0 ó 1; Y es H o alquilo C1-6; B es H, un derivado de acilo o un derivado de sulfonilo; R6, cuando está presente, es alquilo C_.6 sustituido con carboxilo; R5, cuando está presente, es alquilo C__6 opcionalmente sustituido con carboxilo; R4 es alquilo C_.10, cicloalquilo C3.7 o (alquilcicloalquilo) -C4.10; R3 es alquilo C_._0 opcionalmente sustituido con carboxilo, cicloalquilo C3.7 o (alquilcicloalquilo) C4-10; R, es CH.-R,0, NH-R,0, 0-R,n ó S-R,„, en donde 20 es un cicloal-quilo C3.7 saturado o insaturado o (alquilcicloalquilo) C4.10 que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con R21, o R20 es un arilo C6 o C10, aralquilo C7.16, Het o (alquil inferior) --Het, todos ellos opcionalmente mono- , di- o tri-sustituidos con R21, en donde cada R21 es independientemente alquilo C_.6; alcoxi C_.6; amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo C_.6; sulfonilo; N02; OH; SH; halo; haloalquilo; amido opcionalmente mono-sustituido con alquilo C_.6, arilo C6 C_o/ aralquilo C7.16, Het o (alquil inferior) -Het ; carboxilo; carboxi (alquil inferior) ; arilo C6 o C10, aralquilo C7.16 o Het; estando dichos arilo, aralquilo o Het opcionalmente sustituidos con R 2.3' en donde R22 es alquilo alcoxi C_.6; amino opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo sulfonilo; N02; OH; SH; halo; haloalquilo; carboxilo; amida; o (alquil inferior) amida; R1 es alquilo C_.6 o alquenilo C2.6 opcionalmente sustituido con halógeno; y W es hidroxi o un amino N-sustituido; o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.