PT941089E - Uso de agentes anti-microtubulo para tratamento ou prevencao da esclerose multipla - Google Patents

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PT941089E
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polymer
cells
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PT97945697T
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William L Hunter
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Angiotech Pharm Inc
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Description

DESCRICÀO
EPÍGRAFE
USO DE AGENTES ANTI-MICROTUBULO PARA TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DA ESCLEROSE MÚLTIPLA
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se ao uso de um agente anti-microtúbulo para preparar um medicamento para tratar ou prevenir a esclerose múltipla.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As doenças inflamatórias, quer de natureza crónica ou aguda, representam um problema substancial na indústria dos cuidados de saúde. Resumidamente, a inflamação crónica é considerada uma inflamação de duração prolongada (semanas ou meses) na qual a inflamação activa, a destruição dos tecidos e as tentativas de cicatrização ocorrem simultaneamente (Robbins Pathological Basis of Disease by R.S. Cotran, V. Kumar, e S.L. Robbins, W.B. Saunders Co., p.75, 1989). Embora a inflamação crónica possa seguir-se a um episódio inflamatório agudo, também pode começar como um processo insidioso que progride ao longo do tempo, por exemplo, como resultado de uma infecção persistente (e.g., tuberculose, sífilis, infecção fúngica) que provoca uma reacção de hipersensibilidade retardada, exposição prolongada a toxinas endógenas (e.g., lípidos plasmáticos elevados) ou exógena (e.g., sílica, amianto, alcatrão dos cigarros, suturas cirúrgicas), ou reacções auto-imunes contra os tecidos do próprio corpo (e.g., artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, esclerose múltipla, psoríase). As doenças inflamatórias crónicas assim, incluem muitas condições médicas tais como a artrite reumatóide, restenosis, psoríase, esclerose múltipla, adesões cirúrgicas, tuberculose, e doenças inflamatórias do pulmão crónicas (asma, pneumoconiosis, doença pulmonar obstrutiva crónica, pólipos nasais e fibrose pulmonar).
ESCLEROSE MÚLTIPLA A esclerose múltipla (EM), que afecta 350 000 pessoas (mulheres:homens = 2:1) nos Estados Unidos, com 8 000 novos casos declarados por ano, é a doença inflamatória crónica
I mais comum envolvendo o sistema nervoso. Tipicamente, a EM apresenta-se clinicamente como episódios recurreuics Jc ucíices ncurológiccs adversos que ocorrem 20 longo de um período de vários anos. Cerca de metade dos casos evolui para uma fase mais crónica. Embora a doença não resulte muna morte precoce ou deterioração das funções cognitivas, toma 0 paciente inválido perturbando a acuidade visual; estimulando a visão dupla; perturbando as funções motoras que afectam a marcha e o uso das mãos; produzindo incontinência da bexiga e intestinos; espasmos; e défices sensoriais (tacto, dor e sensibilidade térmica). A causa da EM é desconhecida, embora haja evidências consideráveis de que se trata de uma doença auto-imune. Actualmente, não existe qualquer cura para a esclerose múltipla, e os regimes terapêuticos actuais apenas têm sido parcialmente bem sucedidos. Por exemplo, embora agentes quimioterapêuticos tais como o metotrexato, a ciclosporina e azatioprina, tenham sido examinados para 0 tratamento de pacientes com doença progressiva que não reagem ao tratamento, foram demonstrados efeitos benéficos mínimos a longo prazo até à data.
Outras terapêuticas que foram recentemente aprovadas incluem interferon-β para uso em pacientes com EM recorrente-remitente em ambulatório (Paty et al., Neurology 43: 662-667,1993), especificamente Betaseron (interferon β-1β recombinante; interferon beta humano substituído na posição 17, Cys® Ser; Berlex/Chiron) ou Avonex (interferon β-1α recombinante; interferon beta humano glicosilado produzido em células de mamífero; Biogen). Infelizmente, embora 0 Betaseron melhore a qualidade de vida dos pacientes com EM, a progressão da doença não parece melhorar significativamente. Experiências adversas associadas com a terapia por Betaseron incluem: reacções no local da injecção (inflamação, dor, hipersensibilidade e necrose) e uma sintomatologia de tipo gripal (febre, arrepios, ansiedade e confusão). A patente EP-A-0 288 794 revela o uso de determinados derivados calcónicos para tratar uma variedade de condições incluindo tumores, gota e esclerose múltipla.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Resumidamente, a presente invenção fornece o uso de um agente anti-microtúbulo para preparar um medicamento para tratar ou prevenir doenças inflamatórias, compreendendo 2
fornecer um agente anti-microtúbulo a um local de inflamação, em que o agente anti-imcroniDUlO Πcio C uni UCllv&uu tditumtvt v>um α vouuíuiu.
em que
Ar é um grupo 2,5-dimetoxifenil, 2,3,4,-trimetoxifenil, ou 3,4,5-trimetoxifenil;
Ri é um grupo hidrogénio, alquilo (C1-C4), cloro ou bromo; e R2 é -N(R)2 ou -NHCOR em que R é um grupo alquilo (C1-C4) ou um sal farmaceuticamente aceitável daqueles. Exemplos representativos de tais agentes incluem taxanos (e.g., paclitaxel e docetaxel), campotecina, eleuterobina, sarcodictina, epotilones A e B, discodermolida, óxido de deutério (D20), hexilenoglicol (2-metil-2,4-pentanodiol), tubercidina (7-deazaadenosina), LY290181 (2-amino-4-(3-piridil)-4H-nafto(l,2-b)pirano-3-cardonitrilo), fluoreto de alumínio, etilenoglicol bis-(succinimidilsuccinato), éster de etilglicina, anticorpos monoclonais anti-idiotípicos, proteína promotora da congregação do microtúbulo (proteína de tipo taxol, TALP), entumescimento celular induzido por condições hipotónicas (190 mosmol/L) insulina (100 nmol/L) ou glutamina (10 mmol/L), ligação de dineína, giberelina, XCHOl (proteína tipo quinesina), ácido lisofosfatídico, ião lítio, componentes de parede celular vegetal (e.g., poli-L-lisina e extensina), tampões de glicerol, tampão de estabilização de microtúbulo Triton X-100, proteínas associadas a microtúbulo (e.g., MAP2, MAP4, tau, tau grande, ensconsina, factor de alongamento 1-alfa (EF-Ια) e E-MAP-115), entidades celulares (e.g., histona Hl, proteína básica de mielina e cinetócoros), estruturas microtubulares endógenas (e.g., estruturas axonemais, cápsulas GTP e obturadores), túbulo estável constituído apenas por polipéptidos (e.g., STOP145 e STOP220) e tensão de forças mitóticas, bem como quaisquer análogos ou derivados de qualquer um dos supracitados. Noutras modalidades, 0 agente anti-microtúbulo é formulado de modo a compreender ainda um polímero.
Em determinadas modalidades da invenção, os agentes anti-microtúbulo usados para preparar um medicamento podem ser formulados juntamente com outros compostos ou composições, tais como, por exemplo, um unguento, creme, loção, gel, spray ou similar. Em 3
determinadas modalidades, o composto ou composição pode funcionar como um transportador, que pode ser poiiniéiiw uu não poíinicnco. Exemples representativos de. transportadores poliméricos incluem: poli(acetato de etileno-vinilo), copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), copolímeros de poli(ácido láctico) e poli(caprolactona), gelatina, ácido hialurónico, matrizes de colagéneo, e albúmen. Exemplos representativos de outros transportadores adequados incluem, mas não se limitam a etanol; misturas de etanol e glicóis (e.g., etilenoglicol ou propilenoglicol); misturas de etanol e miristato de isopropil ou etanol, miristato de isopropil e água (e.g., 55:5:40); misturas de etanol e eineol ou D-limoneno (com ou sem água); glicóis (e.g., etilenoglicol ou propilenoglicol) e misturas de glicóis tais como propileno glicol e água, glicerol de fosfatidil, glicerol de dioleoilfosfatidil, Transcutol®, ou terpinoleno; misturas de miristato de isopropil e l-hexil-2-pirrolidona, N-dodecil-2-piperidinona ou l-hexil-2-pirrolidona.
Ainda noutros aspectos, o agente anti-microtúbulo pode ser formulado de modo a estar contido em, ou adaptado para ser libertado por um dispositivo ou implante cirúrgico ou médico, tal como por exemplo, stents, suturas, catéteres internos, próteses e similares.
Estes e outros aspectos revelados tomar-se-ão evidentes mediante referência à descrição detalhada que se segue e desenhos anexos. Adicionalmente, são apresentadas abaixo várias referências que descrevem em maior detalhe determinados procedimentos, dispositivos ou composições, e que são assim incorporados por referência na sua totalidade.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura IA é um gráfico que apresenta a resposta de quimiluminescência dos neutrófilos (5x106 células/ml) aos cristais de plasma CPPD opsonisados (50mg/ml). Efeito de paclitaxel (também designado por “taxol”) a (o) nenhum paclitaxel, (·) 4.5 μΜ, (Δ) 14 μΜ, (A) 28 μΜ, ( ) 46 μΜ ; n=3. A Figura 1B é um gráfico que representa a variação da percentagem da inibição da quimiluminescência neutrófila induzida por cristal do plasma CPPD opsonizado pela concentração de paclitaxel. A Figura 1C é um gráfico que apresenta o efeito do fluoreto de alumínio na activação do neutrófilo induzida por zimozan opsonizado medido por quimiluminescência. A Figura 1D é um gráfico que apresenta o efeito do éster de etilglicina na activação do neutrófilo induzida por zimozan opsonizado medido por quimiluminescência. A Figura 1E é um gráfico que apresenta o efeito do LY290181 na quimiluminescência do neutrófilo induzida por zimozan opsonizado. 4 A Figura 2 é um gráfico que apresenta a libertação da lisozima dos neutrófilos pxur/mí) em resposia au» wisíaia de plasma CPPD cpscnizadcs (50 mg/ml). Ffeítn d« paclitaxel a (o) nenhum paclitaxel, (·) 28 μΜ, (Δ) controlo (de células apenas), (A) Controlo (células e paclitaxel a 28 μΜ); n=3. A Figura 3A é um gráfico que apresenta a produção de anião superóxido por neutrófilos (5x106 células/ml) em resposta aos cristais de plasma CPPD opsonizados (50 mg/ml). Efeito de paclitaxel a (o) nenhum paclitaxel, (·) 28 μΜ, (Δ) controlo (de células apenas); n=3. A Figura 3B é um gráfico que representa a variação da percentagem de inibição da produção de anião superóxido por neutrófilos induzidos por cristal de plasma CPPD opsonizado com a concentração de paclitaxel n=3. A Figura 3C é um gráfico que representa o efeito de LY290181 na produção de anião superóxido neutrófilo induzido por cristal CPPD. A Figura 4A é um gráfico que apresenta a resposta de quimiluminescência dos neutrófilos (5x106 células/ml) em resposta ao zimosan de plasma opsonizado (1 mg/ml). Efeito de paclitaxel a (o) nenhum paclitaxel, (·) 28 μΜ, n=3. A Figura 4B é um gráfico que representa a produção de anião superóxido por neutrófilos induzidos por zimosan de plasma opsonizado. Efeito de paclitaxel a (o) nenhum paclitaxel, (·) 28 μΜ, (Δ) Controlo (células apenas), n=3. A Figura 5A é um gráfico que representa a libertação da mieloperoxidase dos neutrófilos (5x106 células/ml) em resposta aos cristais de plasma CPPD opsonizados (50 mg/ml). Efeito de paclitaxel a (o) nenhum paclitaxel, (·) 28 μΜ, (Δ) Controlo (células apenas), (A) Controlo (células com paclitaxel a 28 μΜ); n=3. A Figura 5B é um gráfico que representa a percentagem da inibição da libertação da mieloperoxidase dos neutrófilos em resposta aos cristais de plasma CPPD opsonizados pela concentração de paclitaxel; n=3. A Figura 5C e 5D são gráficos que mostram que LY290181 faz diminuir a libertação quer da lisozima quer da mieloperodidase em neutrófilos induzidos por cristal CPPD. A Figura 6 é um gráfico que representa a proliferação dos sinoviócitos a várias concentrações de paclitaxel. A Figura 7 é um gráfico que representa os efeitos do paclitaxel sobre os queratinócitos in vitro.
As Figuras 8A e 8B mostram o efeito do paclitaxel sobre a morfologia do astrócito. Imagens de microscopia electrónica revelaram processos espessos filamentosos bem 5 organizados em astrócitos de animais transgénicos de controlo, enquanto animais transgénicos -nís alterados. O inHii7.in o uaiauos CUlll pclUllOACl liimaiii aouOCnOj mGrfGÍC^Irt” aparecimento de arredondamento celular do astrócito, processos celulares estreitos, e filamentos citoplasmáticos reduzidos comparativamente com animais não tratados. A Figura 9 é um gráfico que representa a viabilidade das células EOMA tratadas com concentrações de paclitaxel superiores a 10'8 M. A Figura 10 é um gráfico de barras que representa a percentagem de células EOMA apoptóticas em cultura tratadas com concentrações crescentes de paclitaxel.
As Figuras 11A-11E são gráficos que representam o efeito de vários agentes anti-microtubulares nos sinoviócitos após um período de 24 horas.
As Figuras 12A-12H são blots (manchas) que revelam o efeito de vários agentes anti-microtubulares na inibição da expressão da cologenase.
As Figuras 13A-13H são blots que revelam o efeito de vários agentes anti-microtubulares na expressão de proteoglicano.
As Figuras 14A e 14B são duas fotografias de uma CAM tendo um tumor tratado com termopasta de controlo (não carregada). Resumidamente, na Figura 14A a massa branca central é o tecido do tumor. De notar a abundância de vasos sanguíneos que entram no tumor oriundos da CAM de todas as direcções. O tumor induz o crescimento interno da vasculatura do hospedeiro através da produção de “factores angiogénicos”. O tecido do tumor estende-se de forma distai ao longo dos vasos sanguíneos que o abastecem. A Figura 14B é a perspectiva inferior da CAM apresentada na Figura 15A. Resumidamente, esta perspectiva demonstra a aparência radial dos vasos sanguíneos que entram no tumor como os raios de uma roda. De notar que a densidade dos vasos sanguíneos é maior na vizinhança do tumor do que no tecido normal da CAM envolvente. As Figuras 14C e 14D são duas fotografias de uma CAM com um tumor tratado com termopasta carregada de paclitaxel a 20%. Resumidamente, na Figura 14C, a massa branca central é o tecido do tumor. Note-se a escassez de vasos sanguíneos na vizinhança do tecido do tumor. A libertação sustida do agente anti-microtubular é capaz de ultrapassar o estímulo angiogénico produzido pelo tumor. O próprio tumor é pouco vascularizado e diminui de tamanho progressivamente. A Figura 14D é tirada da parte inferior da CAM apresentada em 14C, e demonstra a disrupção do fluxo sanguíneo para dentro do tumor quando comparado com tecido de tumor de controlo. Note-se que a densidade dos 6 vasos sanguíneos é reduzida na vizinhança do tumor e é mais escassa do que a do tecido da UAM envoivenxe normal. A Figura 15A é uma fotografia que mostra uma cultura de ovo sem casca no 6o dia. A Figura 15B é uma imagem digitalizada por computador tirada por um estereomicroscópio de capilares vivos não marcados (1040x). A Figura 15C é uma fotografia de corrosão da fusão que apresenta microvasculatura de membrana corioalantóide (CAM) que é alimentada por vasos subjacentes maiores (setas; 1300x). A Figura 15D é uma fotografia que representa uma secção plástica de 0.5 mm de espessura cortada transversalmente ao longo da CAM, e registada ao nível do microscópio óptico. Esta fotografia mostra a composição da CAM, incluindo uma ectoderme exterior de camada dupla (Ec), uma mesoderme (M) contendo capilares (setas) e células adventícias dispersas, e uma endoderme de camada única (En) (400x). A Figura 15E é uma fotografia ao nível do microscópio electrónico (3500x) na qual a estrutura capilar típica é apresentada mostrando células endoteliais de paredes delgadas (ponta das setas) e um pericito associado.
As Figuras 16A, 16B, 16C e 16D são uma série de imagens digitalizadas de quatro CAMs diferentes não coradas tiradas após 48 horas de exposição a 10pg de paclitaxel por 10 ml de metilcelulose. O disco de metilcelulose transparente (*) contendo paclitaxel está presente em cada CAM e posiciona-se sobre uma zona avascular singular (A) com ilhas sanguíneas (Is) em redor. Estas áreas avasculares estendem-se para além do disco e têm tipicamente um diâmetro de aproximadamente 6 mm. A Figura 16D ilustra o efeito de “acotovelamento” típico (pontas das setas) tanto dos vasos pequenos como dos grandes, sendo redireccionados para longe da periferia da zona avascular. A Figura 17A é uma fotografia (=400x) que mostra que os capilares (pontas das setas) imediatamente periféricos à zona avascular exibem numerosas células endoteliais em mitose. Ectoderme (Ec); Mesoderme (M); Endoderme (En). A Figura 17B (=400x) mostra que dentro da própria zona avascular a estrutura capilar típica foi eliminada e há inúmeras células sanguíneas extravasadas (pontas das setas). A Figura 17C (=400x) mostra que na área central da zona avascular, estão dispersos glóbulos vermelhos através da mesoderme. A Figura 18A (=2200x) apresenta um capilar pequeno contíguo subjacente à camada ectodérmica (Ec) possuindo três células endoteliais em mitose (*). Vários outros tipos de células tanto na ectoderme como na mesoderme estão também em mitose. A Figura 18B (=2800x) mostra que a fase avascular precoce contém células sanguíneas extravasadas 7
subjacentes à ectoderme; estas células sanguíneas estão misturadas com células endoteliais presuntivas (^) e com os seus pioocasos. Vacúolos celulares dsgradativos (ponta da setJ«) A
Figura 18C (=2800x) mostra que em resposta ao paclitaxel, a interface ecto-mesodérmica ficou povoada com células em vários estágios de degradação contendo vacúolos densos e grânulos (pontas das setas). A Figura 19A representa esquematicamente a regulação da transcrição das metaloproteínases da matriz. A Figura 19B é um blot que demonstra que o IL-1 estimula a actividade de transcrição AP-1. A Figura 19C é um gráfico que mostra que a actividade de ligação induzida por IL-1 diminuiu nos lisados dos condrócitos que foram tratados previamente com paclitaxel. A Figura 20 é um blot que mostra que a indução de IL-1 aumenta a colagenase e a estromelisina nos níveis de RNA em condrócitos, e que esta indução pode ser inibida com tratamento prévio com paclitaxel. A Figura 21 é um gráfico de barras que representa os efeitos do paclitaxel na viabilidade dos condrócitos normais in vitro. A Figura 22 é um gráfico que representa a degradação cinética de pseudo primeira ordem observada do paclitaxel (20 pg ml'1) em soluções HPpCD a 10% e HPyCD a 10% a 37°C e pH de 3.7 e 4.9, respectivamente. A Figura 23 é um gráfico que mostra a solubilidade em água da fase para ciclodextrinas e paclitaxel a 37°C. A Figura 24 é um gráfico que representa curvas de segunda ordem da complexação do paclitaxel e yCD, HPPCD ou HPyCD a 37°C. A Figura 25 é uma tabela que mostra a temperatura de fusão, entalpia, peso molecular, polidispersão e viscosidade intrínseca da composição PDLLA-PEG-PDLLA. A Figura 26 é um gráfico que mostra termogramas DSC de PDLLA-PEG-PDLLA e PEG. A taxa de aquecimento foi de 10°C/min. Ver Figura 30 quanto a temperaturas de fusão e entalpia. A Figura 27 é um gráfico que representa a libertação cumulativa de paclitaxel de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA carregados com paclitaxel a 20% em tampão PBS albumina a 37°C. As barras de erro representam o desvio padrão de 4 amostras. Os cilindros de PEG a 40% foram descontinuados no 4o dia devido a desintegração. 8
As Figuras 28A, 28B e 28C são gráficos que representam a mudança nas dimensões, comprimento (A), diâmetro (B), e peso iíquiuu (C) dc cilindres PDLLA-PEO-PDT TΆ carregados com paclitaxel a 20% durante a libertação de paclitaxel in vitro a 37°C. A Figura 29 é uma tabela que apresenta a perda de massa e a mudança na composição de polímero de cilindros PDLLA-PEG-PDLLA (carregados com paclitaxel a 20%) durante a libertação em tampão PBS albumina a 37°C. A Figura 30 é um gráfico que mostra cromatogramas de permeação em gel de cilindros PDLLA-PEG-PDLLA (PEG 20%, 1 mm de diâmetro) carregados com paclitaxel a 20% durante a libertação em tampão PBS albumina a 37°C.
As Figuras 31 A, 31B, 31C e 31D são SEMs de cilindros secos de PDLLA-PEG-PDLLA (carregados com paclitaxel a 20%, 1 mm de diâmetro) antes e durante a libertação do paclitaxel. A: PEG a 20%, dia 0; B: PEG a 30%, dia 0; C: PEG a 20%, dia 69; D: PEG a 30%, dia 69. A Figura 32 é um gráfico que representa a libertação cumulativa de paclitaxel de misturas de PDLLA:PCL carregadas com paclitaxel a 20% e PCL em tampão de PBS albumina a 37°C. As barras de erro representam desvios padrão de 4 amostras. A Figura 33 é um gráfico que representa, num dado período de tempo, a libertação de paclitaxel de pastas PCL em PBS a 37°C. As pastas PCL contêm micropartículas de paclitaxel e vários aditivos preparados usando a malha #140. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 amostras. A Figura 34 é um gráfico que representa períodos de tempo da libertação do paclitaxel de pastas paclitaxel-gelatina-PCL em PBS a 37°C. Este gráfico apresenta os efeitos da concentração da gelatina (malha #140) e o tamanho das micropartículas de paclitaxel-gelatina (1:1) preparadas usando a malha #140 ou a malha #60. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 amostras.
As Figuras 35A e 35B são gráficos que representam o efeito de aditivos (17A; malha #140) e o tamanho das micropartículas (17B; malha #140 ou malha #60) e a proporção do aditivo (malha #140) no comportamento de intumescimento das pastas PCL contendo paclitaxel a 20% seguindo-se a suspensão em água destilada a 37°C. Medições para a pasta preparada com micropartículas a 270 pm em paclitaxel-gelatina e pasta contendo gelatina a 30% foram descontinuadas após 4 horas devido à desintegração da matriz. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 amostras. 9
As Figuras 36A, 36B, 36C e 36D são micrografias electrónicas de varrimento representativas de pastas de paciiiaxei-gclauiia-FCL (20:20:60) antes (36Λ) e depois (36B) ^ suspensão em água destilada a 37°C durante 6 horas. Micrografias 36C e 36D são amplificações de 36B, apresentando uma associação íntima de paclitaxel (em forma de bastonete) e uma matriz de gelatina.
As Figuras 37A e 37B são fotomicrografias representativas de CAMs tratadas com gelatina-PCL (37A) e pastas de paclitaxel-gelatina-PCL (20:20:60; 37B) revelando zonas de avascularidade na CAM tratada com paclitaxel. A Figura 38 é um gráfico que mostra a solubilidade da fase para ciclodextrinas e paclitaxel em água a 37°C. A Figura 39 é um gráfico que mostra curvas de segunda ordem da complexação do paclitaxel e yCD, HPPCD ou HPyCD a 37°C. A Figura 40 é um gráfico que mostra a solubilidade da fase para paclitaxel a 37°C e hidroxipropil-P-ciclodextrina em soluções água:etanol a 50:50. A Figura 41 é um gráfico que mostra os perfis da taxa de dissolução do paclitaxel em soluções HPyCD a 0, 5,10, ou 20% a 37°C. A Figura 42 é um gráfico que representa a degradação cinética de pseudo primeira ordem observada do paclitaxel (20 pg/ml) em soluções HPPCD a 10% e HPyCD a 10% a 37°C e pH de 3.7 e 4.9, respectivamente.
As Figuras 43A e 43B, respectivamente, são dois gráficos que apresentam a libertação de paclitaxel a partir de filmes EVA, e a percentagem de paclitaxel remanescente nestes filmes ao longo do tempo. A Figura 43C é um gráfico que apresenta o aumento de volume de filmes EVA/F127 sem paclitaxel ao longo do tempo. A Figura 43D é um gráfico que apresenta o aumento de volume de filmes EVA/Span 80 sem paclitaxel ao longo do tempo. A Figura 43E é um gráfico que apresenta uma curva tensão w deformação para várias misturas EVA/F127. A Figura 44 é um gráfico que apresenta o efeito da opsonização do plasma de microsferas poliméricas na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos (microsferas de 20 mg/ml em 0.5 ml de células (5x106 células/ml)) para microsferas PCL. 10 A Figura 45 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de plasma T-*l r-i,-T . , r _____________ *_ · ·1 · .Cf___· 1______, t r»1__/r 1 r\ 6 _ ' 1 1 / ou
Pluronic F127 a +l-2Vo na resposta de quimiiuuiiucsCciicia dos ncutrcfilcc (5x!0 células/ml) a microsferas PCL. A Figura 46 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de plasma ou Pluronic F127 a +1-2% na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos (5xl06 células/ml) a microsferas PMMA. A Figura 47 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de plasma ou Pluronic F127 a +1-2% na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos (5x106 células/ml) a microsferas PLA. A Figura 48 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de plasma ou Pluronic F127 a +1-2% na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos (5x106 células/ml) a microsferas EVA.PLA. A Figura 49 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de IgG (2 mg/ml) ou Pluronic F127 a 2% e depois IgG (2 mg/ml) na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos a microsferas PCL. A Figura 50 é um gráfico que apresenta 0 efeito do pré-revestimento de IgG (2 mg/ml) ou Pluronic F127 a 2% e depois IgG (2 mg/ml) na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos a microsferas PMMA. A Figura 51 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de IgG (2 mg/ml) ou Pluronic F127 a 2% e depois IgG (2 mg/ml) na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos a microsferas PVA. A Figura 52 é um gráfico que apresenta o efeito do pré-revestimento de IgG (2 mg/ml) ou Pluronic F127 a 2% e depois IgG (2 mg/ml) na resposta de quimiluminescência dos neutrófilos a microsferas EVA:PLA. A Figura 53A é um gráfico que apresenta os perfis da taxa de libertação das microsferas de policaprolactona contendo paclitaxel a 1%, 2%, 5%, ou 10% em tampão de solução salina de fosfato a 37°C. A Figura 53B é uma fotografia que apresenta uma CAM tratada com as microsferas de controlo. A Figura 53C é uma fotografia que apresenta uma CAM tratada com microsferas carregadas de paclitaxel a 5%. A Figura 54 é um gráfico que descreve a gama de tamanhos de partícula para microsferas de controlo (PLLA:GA - 85:15). 11
A Figura 55 é um gráfico que descreve a gama de tamanhos de partícula para microsferas carregadas com paclitaxei a 20% (FLLà;Gà - 85:15). A Figura 56 é um gráfico que descreve a gama de tamanhos de partícula para microsferas de controlo (PLLA:GA - 85:15). A Figura 57 é um gráfico que descreve a gama de tamanhos de partícula para microsferas carregadas com paclitaxel a 20% (PLLA:GA- 85:15).
As Figuras 58A, 58B, e 58C são gráficos que apresentam os perfis da taxa de libertação de paclitaxel de gamas variáveis de tamanho de microsferas e várias taxas de PLL A e GA.
As Figuras 59A e 59B são gráficos que apresentam os perfis da taxa de libertação de paclitaxel de microsferas com várias taxas de PLLA e GA.
As Figuras 60A e 60B são gráficos que apresentam os perfis da taxa de libertação de paclitaxel de microsferas com várias taxas de PLLA e GA.
As Figuras 61A, 61B, e 61C são gráficos que apresentam os perfis da taxa de libertação de paclitaxel de microsferas de tamanhos variáveis e várias taxas de PLLA e GA. A Figura 62 é um gráfico que descreve a libertação de paclitaxel de microcápsulas de nylon-paclitaxel.
As Figuras 63A e 63B são fotografias de microsferas de PLLA revestidas a fibronectina em tecido da bexiga (63 A), e microsferas de poli(L-lisina) em tecido da bexiga. A Figura 64 é um gráfico que mostra que o paclitaxel micelar melhora os resultados médios diários a nível da artrite no modelo de artrite induzida por colagéneo em ratos.
As Figuras 65A-65D são uma série de raios X que mostram o efeito do paclitaxel micelar no modelo de artrite induzida por colagéneo em ratos.
As Figuras 66A-66C são micrografias electrónicas de varrimento de uma articulação de tornozelo de rato. A Figura 67 é uma perspectiva amplificada que mostra a histopatologia no modelo de artrite induzida por colagéneo em ratos.
As Figuras 68A e 68B são perspectivas amplificadas da vasculatura sinovial no modelo de artrite induzida por colagéneo em ratos. A Figura 69 é um gráfico que descreve a indução da reacção de hipersensibilidade de contacto em orelhas de rato por oxazolona. O tratamento com paclitaxel a 1% em gel ou veículo, no momento da exposição ao antigéneo e depois diariamente. A inflamação da pele 12
foi quantificada por medições do inchaço da orelha quando comparada com a espessura da orelha antes da exposição. <Js dados representam us valores médios +/ SD (desvio paHrSn) (n=5). **p<0.01; ***p<0.001. A Figura 70 é um gráfico que descreve a indução da reacção de hipersensibilidade de contacto em orelhas de rato por oxazolona. O tratamento inicial com paclitaxel a 1% em gel ou veículo, 24 horas após a exposição ao antigéneo e depois diariamente. A inflamação da pele foi quantificada por medições do inchaço da orelha quando comparada com a espessura da orelha antes da exposição. Os dados representam os valores médios +/- SD (n=5). *p<0.05; **p<0.01. A Figura 71 é um gráfico que descreve a indução de inflamação da pele em orelhas de rato por aplicação tópica de PMA. O tratamento inicial com paclitaxel a 1% em gel ou veículo, 1 hora após a aplicação de PMA e posteriormente uma vez por dia. A inflamação da pele foi quantificada por medições do inchaço da orelha quando comparada com a espessura da orelha antes da exposição. Os dados representam os valores médios +/- SD (n=5). *p<0.05; ***p<0.001. A Figura 72 é um gráfico que descreve a indução de inflamação da pele em orelhas de rato por aplicação tópica de PMA. O tratamento inicial com paclitaxel a 1% em gel ou veículo, 24 horas após a aplicação de PMA e posteriormente uma vez por dia. A inflamação da pele foi quantificada por medições do inchaço da orelha quando comparada com a espessura da orelha antes da exposição. Os dados representam os valores médios +/- SD (n=5). **p<0.01; ***p<0.001. A Figura 73 ilustra a indução da inflamação da pele em orelhas de rato por aplicação tópica de PMA. Tratamento prévio com paclitaxel a 1% em gel (orelha direita) ou veículo (orelha esquerda). A imagem foi tirada 48 horas após a aplicação de PMA. De notar a vermelhidão e dilatação dos vasos sanguíneos das orelhas esquerdas tratadas com veículo, quando comparadas com as orelhas direitas tratadas com paclitaxel. Resultados similares foram obtidos para um total de 5 ratos. A Figura 74 é um gráfico que descreve o efeito do paclitaxel no peso corporal de ratinhos transgénicos DM20. Ratinhos transgénicos foram tratados com paclitaxel (2.0 mg/kg) ou veículo três vezes por semana durante 24 dias e depois sacrificados no 27° dia. Os resultados são de dois animais tratados com paclitaxel e um animal não tratado. Animais 13
tratados com paclitaxel demonstraram uma perda de peso mínima, enquanto os animais de controlo apresentaram uma diminuição de 3Uu/o no peso corporal, dc 29g a 22g. A Figura 75 é um gráfico que descreve o efeito da terapia intervalada de altas doses com paclitaxel na progressão dos sintomas clínicos em ratinhos transgénicos. Ratinhos transgénicos foram tratados com paclitaxel 20 mg/kg uma vez por semana durante 4 semanas (semana 0, 1, 2, e 3) e monitorizados durante 10 semanas, a cada dois dias, com pontuações determinadas para cada sintoma. Os dados representam a pontuação média (cumulativa para todos os sintomas) para ratinhos transgénicos tratados com paclitaxel (n=5) e ratinhos de controlo (n=3). O tratamento com paclitaxel reduziu a deterioração causada pela sobre-expressão de DM20 em ratinhos transgénicos, enquanto os ratinhos de controlo se deterioraram muito rapidamente com 2 dos 3 animais não tendo sobrevivido até ao final do protocolo experimental (como indicado).
As Figuras 76A e 76B mostram a pasta de paclitaxel aplicada perivascularmente (à adventícia do vaso sanguíneo) no modelo de artéria carótida em ratos. A superfície adventicial da artéria carótida esquerda comum foi tratada com 2.5 mg de pasta de controlo (76A) ou pasta carregada de paclitaxel a 20% (76B). As artérias de controlo apresentaram um aumento na espessura da parede arterial devido à hiperproliferação das células de músculos lisos, enquanto a artéria tratada com pasta carregada de paclitaxel não revelou evidência de espessamento íntimo.
As Figuras 77A e 77B representam o efeito de proximidade da pasta de paclitaxel perivascular no modelo de artéria carótida em ratos. A pasta carregada de paclitaxel aplicada na região perivascular do vaso imediatamente adjacente preveniu a restenose; contudo, quando a pasta não ficou directamente adjacente à parede vascular, foi evidente uma hiperplasia neoíntima.
As Figuras 78A, 78B e 78C mostram o efeito do paclitaxel na coloração do astrócito por GFAP. Secções cerebrais de animais normais e animais transgénicos (que desenvolveram uma doença neurológica similar à esclerose múltipla) tratados com veículo ou paclitaxel foram corados com GFAP (um marcador para astrócitos activados) e examinados histologicamente. Em ratinhos transgénicos de controlo houve um aumento do número de astrócitos e nos níveis totais de GFAP comparados com secções cerebrais normais. Contudo, a morfologia das células era similar. Secções cerebrais de ratinhos transgénicos tratados com paclitaxel apresentaram um número decrescente de astrócitos e dos níveis GFAP comparados
14 com animais transgénicos não-tratados. Histologicamente, existe um arredondamento e estreitamento celular dos processos esireiadus nu» asírócitos.
As Figuras 79A e 79B são gráficos que mostram que o paclitaxel inibe a estimulação das células T em resposta ao péptido de proteína básica de mielina (GP68-88) e ConA. Foi realizada uma cultura de 48 horas da proliferação das células T de RT-1 com GP68-88 (A) ou ConA (B) como estimulagéneos. O paclitaxel e o seu veículo (micélio) foram adicionados em concentrações graduadas no início da estimulação do antigéneo ou 24 horas depois. Paclitaxel inibiu a proliferação de células T em concentrações tão baixas quanto 0.02 μΜ, independentemente do estimulagéneo.
As Figuras 80A, 80B, 80C e 80D são gráficos que mostram que a tubercidina e o paclitaxel inibem a actividade NF-κΒ induzida quer por IL-1 quer por TNF.
As Figuras 81A e 81B são gráficos que mostram que o efeito de concentrações crescentes de paclitaxel ou camptotecina no crescimento celular de células cancerígenas humanas da próstata (LNCaP) (2xl03 células/poço) medido por coloração com violeta cristal (0.5%) e quantificação por absorvância a 492 nm. A percentagem de crescimento é expressa como a percentagem relativa aos controlos e é dada uma média de 8 resultados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Antes de apresentar a invenção, pode ser útil para a compreensão desta avançar com as definições de determinados termos empregues daqui por diante.
“Doença Inflamatória” como aqui empregue refere-se a esclerose múltipla. “Agentes Anti-microtubulares” deve ser entendido como incluindo qualquer proteína, péptido, substância química, ou outra molécula que prejudique a firnção dos microtúbulos, por exemplo, através da prevenção ou estabilização da polimerização. Pode ser utilizada uma ampla variedade de métodos para determinar a actividade anti-microtubular de um composto particular, incluindo, por exemplo os ensaios descritos por Smith et al. {Câncer Lett. 79{2):213-219,1994) e Mooberry et al., (Câncer Lett. 96{2):261-266,1995).
Como referido acima, o uso de acordo com a invenção é útil para prevenir ou tratar doenças inflamatórias, compreendendo o passo de dispensar um agente anti-microtúbulo ao local da inflamação. Resumidamente, uma ampla variedade de agentes pode ser libertada num local de inflamação (ou potencial local de inflamação), com ou sem um transportador (e.g., 15
um polímero ou unguento), de modo a tratar ou prevenir uma doença inflamatória. Exemplos representativos de tais agentes incluem IuaouOS (c.g., paclitaxcl (discutido detalhadamente abaixo) e docetaxel) (Schiff et al., Nature 211:665-661, 1979; Long & Fairchild, Câncer Research 54:4355-4361, 1994; Ringel & Horwitz, J. Natl. Câncer Inst. 83(4):288-291, 1991; Pazdur et al., Câncer Treat. Rev. 19(4):351-386, 1993), campotecina, elenterobina (e.g., Patente U.S. N° 5 473 057), sarcodictinas (incluindo sarcodictina A), epotilonas A e B (Bollag et al., Câncer Research 55:2325-2333; 1995), discodermolida (ter Haar et al., Biochemistry 35:243-250; 1996), óxido de deutério (D2O) (James & Lefebvre, Genetics 130(2):305-314, 1992; Sollott et al., J. Clin. Invest. 95:1869-1876, 1995), hexileno glico(2-metil-2,4-pentanediol) (Oka et al., Cell Struct. Funct. 16(2):125-134, 1991), tubercidina (7-deazaadenosina) (Mooberry et al., Câncer Lett. 96(2):261-266, 1995), LY290181 (2-amino-4-(3-piridil)-4H-nafto(l,2-b)pirano-3-cardonitrilo) (Panda et al., J. Biol. Chem. 272(12):7681-7687, 1997; Wood et al., Mol. Pharmacol. 52(3):437-444, 1997), fluoreto de alumínio (Song et al., J. Cell. Sei. Suppl. 14:147-150, 1991), bis-(succinimidilsuccinato) de etilenoglicol (Caplow & Shanks, J. Biol. Chem. 265(15):8935-8941, 1990), éster etil glicina (Mejillano et al., Biochemistry 31(13):3478-3483, 1992), anticorpos monoclonais anti-idiotípicos (Leu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91(22):10690-10694, 1994), proteína promotora da união de microtúbulos (proteína do tipo taxol, TALP) (Hwang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 208(3):1174-1180, 1995), inchaço celular induzido por condições hipotónicas (190 mosmol/L), insulina (100 nmol/L) ou glutamina (lOmm/L) (Haussinger et al., Biochem. Cell. Biol. 72(1-2):12-19, 1994), ligação da dineína (Ohba et al., Biochim. Biophys. Acta 1158(3): 323-332, 1993), giberilina (Mita & Shibaoka, Protoplasma 119(1/2):100-109, 1984), XCHOl (proteína de tipo quinesina) (Yonetani et al., Mol. Biol. Cell 7(suppl):211A, 1996), ácido lisofosfatídico (Cook et al., Mol. Biol. Cell 6(suppl):260A, 1995), ião lítio (Bhattacharyya &Wolff, Biochem. Biophys. Res. Commun. 73(2):383-390, 1976), componentes da parede celular vegetal (e.g., poli-L-lisina e extensina) (Akashi et al., Planta 182(3):363-369,1990), tampões de glicerol (Schilstra et al., Biochem. J. 277(pt. 3):839-847, 1991, Farrell & Keates, Biochem. Cell. Biol. 68(11):1256-1261, 1990; Lopez et al., J. Cell. Biochem. 43(3):281-291, 1990), tampão estabilizador de microtúbulo Triton X-100 (Brown et al., J. Cell Sei. 104(Pt. 2):339-352, 1993; Safiejko-Mroczka & Bell, J. Histochem. Cytochem. 44(6):641-656, 1996), proteínas associadas a microtúbulo (e.g., MAP2, MAP4, tau, tau grande, ensconsina, factor de alongamento 1-alfa (EF-Ια) e E-MAP- 16
115) (Burgess et al., Cell Motil. Cytoskeleton 20(4):289-300, 1991; Saoudi et al., J. Cell. Sei. 108(Pt. 1):357-367, 1995; Bulinski & Bossier, J Cdl. Sei. 107(pt. 10):2839-2849, 1994; Ookata et al., J. Cell. Biol. 128(5):849-862, 1995; Boyne et al., J. Comp. Neurol 358(2):279-293, 1995; Ferreira & Cáceres, J. Neurosci. 11(2):392-400, 1991; Thurston et al., Chromosoma 105(1):20-30, 1996; Wang et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 38(2):200-208, 1996; Moore & Cyr, Mol. Biol. Cell 7(suppl):221-A, 1996; Masson & Kreis, J. Cell Biol. 123(2):357-371, 1993), entidades celulares (e.g., histona Hl, proteína básica de mielina e quinetocoros) (Saoudi et al., J. Cell. Sei. 108(Pt. 1):357-367, 1995; Simerly et al., J. Cell Biol. 111(4):1491-1504, 1990), estruturas microtúbulo endógenas (e.g.,estruturas axonemais, cápsulas GTP e obturadores) (Dye et al., Cell Motil. Cytoskeleton 21(3):171-186, 1992; Azhar & Murphy, Cell Motil. Cytoskeleton 15(3):156-161, 1990; Walker et al., J. Cell Biol. 114(1):73-81, 1991; Drechsel & Kirschner, Curr. Biol. 4(12):1053-1061, 1994), túbulo estável constituído apenas por polipéptido (e.g., STOP145 e STOP220) (Pirollet et al., Biochim. Biophys. Acta 1160(1):113-119, 1992; Pirollet et al., Biochemistry 31 (37):8849-8855, 1992; Bosc et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93(5):2125-2130, 1996; Margolis et al., EMBOJ. 9(12):4095-4102, 1990), e tensão de forças mitóticas (Nicklas & Ward, J. Cell. Biol. 126(5):1241-1253, 1994), bem como quaisquer análogos ou derivados de qualquer uma das substâncias acima referidas. Tais compostos podem actuar quer despolimerizando microtúbulos (e.g., colchicina e vinblastina), quer estabilizando a formação de microtúbulos (e.g., paclitaxel).
Numa modalidade preferida da invenção, o agente terapêutico é o paclitaxel, um composto que perturba a formação de microtúbulos ligando-se à tubulina para formar fusos mitóticos anormais. Resumidamente, o paclitaxel é um diterpenóide altamente derivatizado (Wani et al., J. Am. Chem. Soe. 93:2325,1971) que foi obtido a partir do córtex colhido e seco de Taxus brevifolia (Pacific Yew) e Taxomyces Andreanae e Endophytic Fungus do Pacific Yew (Stierle et al., Science 60:214-216, 1993). O “paclitaxel” (que deve ser aqui compreendido de modo a incluir pró-fármacos, análogos e derivados, tais como, por exemplo, TAXOL®, TAXOTERE®, docetaxel, 10-desacetil análogos de paclitaxel e 3’N-desbenzoil-3’N-t-butoxi carbonil análogos de paclitaxel) pode ser prontamente preparado utilizando técnicas conhecidas dos peritos na arte (ver e.g., Schiff et al., Nature 277:665-667, 1979; Long & Fairchild, Câncer Research 54:4355-4361, 1994; Ringel & Horwitz, J. Natl. Câncer Inst. 83(4):288-291, 1991; Pazdur et al., Câncer Treat. Rev. 19(4):351-386, 1993) WO 17
94/07882; WO 94/07881; WO 94/07880; WO 94/07876; WO 93/23555; WO 93/10076; WO 94/00156; WU yj/244/ό; nr 590267; WG 94/20089; r»_x—τ T O XTO„ i aiuuwj u.u. u 5 294 637; 5 283 25?·
5 279 949; 5 274 137; 5 202 448; 5 200 534; 5 229 529; 5 254 580; 5 412 092; 5 395 850; 5 380 751; 5 350 866; 4 857 653; 5 272 171; 5 411 984; 5 248 796; 5 422 364; 5 300 638; 5 294 637; 5 362 831; 5 440 056; 4 814 470; 5 278 324; 5 352 805; 5 411 984; 5 059 699; 4 942 184; Tetrahedron Letters 35(52):9709-9712, 1994; J Med. Chem. 35:4230-4237, 1992; J. Med. Chem. 34:992-998, 1991; J. Natural Prod. 57(10):1404-1410, 1994; J. Natural Prod. 57(11):1580-1583, 1994; J. Am. Chem. Soc. 110:6558-6560, 1988), ou obtido a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo por exemplo, a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (Taxus brevifolia T7402).
Exemplos representativos de tais derivados ou análogos de paclitaxel incluem 7-desoxi-docetaxol, 7,8-ciclopropataxanos, 2-azetidonas N-substituídas, 6,7-epoxi-paclitaxéis, 6,7-paclitaxéis modificados, 10-desacetoxitaxol, 10-desacetiltaxol (a partir de 10 desacetilbacatina III), derivados carbonato e fosfonoxi de taxol, taxol 2’,7-di(l,2-benzenodicarboxilato de sódio), derivados de 10-desacetoxi-11,12-dihidrotaxol-l 0,12(18)-dieno, 10-desacetoxitaxol, Protaxol (derivados de 2’- e/ou 7-O-éster), (derivados de 2’- e/ou 7-O-carbonato), síntese assimétrica da cadeia lateral do taxol, fluorotaxóis, 9-desoxotaxano, (13-acetil-9-desoxobacatina III), 9-desoxotaxol, 7-desoxi-9-desoxotaxol, 10-desacetoxi-7-desoxi-9-desoxotaxol. Derivados contendo gupos hidrogénio ou acetil e um hidroxi e tert-butoxicarbonilamino, derivados de taxol de ácido 2’-0-acil sulfonado e 2’-acriloiltaxol sulfonado, succiniltaxol, formiato de 2’-Y-aminobutiriltaxol, 2’-acetil taxol, 7-acetil taxol, 7-glicinacarbamato taxol, 2’-OH-7-PEG(5000)carbamato taxol, derivados de 2’-benzoil e 2’,7-dibenzoil taxol, outros profármacos, (2’-acetiltaxol; 2’,7-diacetiltaxol; 2’-succiniltaxol; 2’-(beta-alanil)-taxol); formiato de 2’-gama-aminobutiriltaxol; derivados de etilenoglicol de 2’-succiniltaxol; 2’-glutariltaxol; 2’-(N,N-dimetilglicil) taxol; 2’-(2-(N,N-dimetilamino)propionil)taxol, 2’-ortocarboxibenzoil taxol; derivados de ácido 2’-alifático carboxílico de taxol. Profármacos {2’(N,N-dietilaminopropionil)taxol, 2’(N,N-dimetilglicil)taxol, 7(N,N-dimetilglicil)taxol, 2’,7-di-(N,N-dimetilglicil)taxol, 7(N,N-dietilaminopropionil)taxol, 2’,7-di-(N,N-dietilaminopropionil)taxol, 2’-(L-glicil)taxol, 7-(L-glicil)taxol, 2’,7-di-(L-glicil)taxol, 2’-(L-alanil)taxol, 7-(L-alanil)taxol, 2’,7-di-(L-alanil)taxol, 2’-(L-leucil)taxol, 7-(L-leucil)taxol, 2’,7-di-(L-leucil)taxol, 2’-(L-isoleucil)taxol, 7-(L-isoleucil)taxol, 2\7-di-(L-isoleucil)taxol, 2’-(L-valil)taxol, 7-(L-valil)taxol, 2’,7-di-(L- 18 valil)taxol, 2’-(L-fenilalanil)taxol, 7-(L-fenilalanil)taxol, 2’,7-di-(L-fenilalanil)taxol, 2’-(L-prolil)taxol, 7-(L-prolii)taxol, 2\7-di-(L-proin)iaxul, 2’-(L-lisil)taxoI, 7-(L licil)taxo!, 2\7-Ίΐ-(L-lisil)taxol, 2’-(L-glutamil)taxol, 7-(L-glutamil)taxol, 2\7-di-(L-glutamil)taxol, 2’-(L-arginil)taxol, 7-(L-arginil)taxol, 2’,7-di-(L-arginil)taxol}. Análogos de taxol com cadeias laterais de fenilisoserina modificadas, taxotera, (N-debenzoil-N-tert-(butoxicaronil)-lO-desacetiltaxol) e taxanos (e.g., bacatina III, cefalomanina, 10-desacetilbacatina III, brevifoliol, iunantaxusina e taxusina).
Exemplos representativos de agentes despolimerizantes (ou desestabilizantes ou disruptores) microtubulares incluem Nocodazole (Ding et al., J. Exp. Med. 171 (3): 715-727, 1990; Dotti et al., J. Cell Sei. Suppl 15\ 75-84, 1991; Oka et al., Cell Struct. Funct. 16 (2): 125-134, 1991; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136 (1): 71-80, 1997); Citocalasina B (Illinger et al., Biol. Cell 73 (2-3): 131-138, 1991); Vinblastina (Ding et al., J. Exp. Med. 171 (3): 715-727,1990; Dirk et al., Neurochem. Res. 15 (11): 1135-1139,1990; Illinger et al., Biol. Cell 73 (2-3): 131-138, 1991; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136 (1): 71-80, 1997); Vincristina (Dirk et al., Neurochem. Res. 15 (11): 1135-1139, 1990; Ding et al., J. Exp. Med. 171 (3): 715-727, 1990); Colquicina (Allen et al., Am. J. Physiol. 261 (4 Pt. 1): L315-L321, 1991; Ding et al., J. Exp. Med. 171 (3): 715-727, 1990; Gonzalez et al., Exp. Cell. Res. 192 (1): 10-15, 1991; Stargell et al., Mol. Cell. Biol. 12 (4): 1443-1450, 1992); Cl 980 (análogo de colquicina) (Garcia et al., Anticancer Drugs 6 (4): 533-544, 1995); Colcemida (Barlow et al., Cell. Motil. Cytoskeleton 19 (1): 9-17, 1991; Meschini et al., J. Microsc. 176 (Pt 3): 204-210, 1994; Oka et al., Cell Struct. Funct. 16 (2): 125-134,1991); Podofilotoxina (Ding et al., J. Exp. Med. 171 (3): 715-727, 1990); Benomil (Hardwick et al., J. Cell. Biol. 131 (3): 709-720, 1995; Shero et al., Genes Dev. 5 (4): 549-560, 1991); Orizalina (Stargell et al., Mol. Cell. Biol. 12 (4): 1443-1450, 1992); Majusculamida C (Moore, J. Ind. Microbiol. 16 (2): 134-143, 1996); Demecolcina (van Dolah & Ramsdell, J. Cell. Physiol. 166 (1): 49-56, 1996; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136 (1): 71-80, 1997); e Metil-2-benzimidazolecarbamato (MBC) (Brown et al., J. Cell. Biol. 123 (2): 387-403,1993).
FORMULAÇÕES
Como referido acima, agentes terapêuticos anti-microtúbulos aqui descritos podem ser formulados de vários modos, e assim podem compreender adicionalmente um transportador. 19
Assim, pode ser seleccionada uma ampla variedade de transportadores de origem polimérica ou nao polimérica.
Por exemplo, numa modalidade da invenção pode ser utilizada uma ampla variedade de transportadores poliméricos de modo a conter e/ou libertar um ou mais dos agentes terapêuticos acima discutidos, incluindo por exemplo, tanto composições biodegradáveis como não biodegradáveis. Exemplos representativos de composições biodegradáveis incluem a albumina, o colagéneo, a gelatina, o ácido hialurónico, amido, celulose (metilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose, fialato de acetato de celulose, succinato de acetato de celulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose), caseína, dextranos, polissacáridos, fibrinogéneo, poli(D,L lactídeo), poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo), poli(glicolídeo), poli(hidroxibutirato), poli(alquilcarbonato) e poli(ortoésteres), poliésteres, poli(ácido hidroxivalérico), polidioxanona, polí(etileno tereftalato), poli(ácido málico), poli(ácido tartrónico), polianidridos, polifosfazenos, poli(aminoácidos) e os seus copolímeros (ver na generalidade, Illum, L., Davids, S.S. (eds.) “Polymers in Controlled Drug Delivery” Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17: 1 - 22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59: 173 - 196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4: 155 - 180, 1986. Exemplos representativos de polímeros não degradáveis incluem copolímeros de poli(acetato de etilenovinilo) (“EVA”), borracha de silicone, polímeros acrílicos (ácido poliacrílico, ácido polimetilacrílico, polimetilmetacrilato, polialquilcinoacrilato), polietileno, polipropileno, poliamidas (nylon 6,6), poliuretano, poli(éster de uretano), poli(éter de uretano), poli(éster-ureia), poliéteres (poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno), Plurónicos e poli(tetrametilenoglicol)), borrachas de silicone e polímeros vinílicos (polivinilpirrolidona, poli(álcool vinílico), poli(ftalato de acetato vinílico). Podem também ser desenvolvidos polímeros que são tanto aniónicos (e.g., alginato, caragenina, carboximetilcelulose e poli(ácido acrílico), como catiónicos (e.g., quitosano, poli-L-lisina, polietilenimina e poli(alilamina)) (ver na generalidade, Dunn et al., J. Applied Polymer Sei. 50: 353 - 365, 1993; Cascone et al., J. Materiales Sei.: Materiales in Medicine 5: 770 - 774, 1994; Shiraishi et al., Biol. Pharm. Buli. 16 (11): 1164 - 1168,1993; Thacharodi & Rao, Int’l. J. Pharm. 120: 115 - 118, 1995; Miyazaki et al., Int7. J. Pharm. 118: 257 - 263, 1995). Transportadores poliméricos particularmente preferidos incluem poli(acetato de etilenovinilo), oligómeros e polímeros de poli(ácido D,L-láctico), oligómeros e polímeros de poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico, poli(caprolactona), 20
poli(valerolactona), polianidridos, copolímeros de poli(caprolactona) ou poli(ácido láctico) um policíilcnogliccl (c.g., McPEG), e combinações destes.
Transportadores poliméricos podem ser adaptados numa variedade de formas, com características de libertação desejadas e/ou propriedades específicas desejadas. Por exemplo, os transportadores poliméricos podem ser adaptados de modo a libertar um agente terapêutico mediante exposição a um acontecimento desencadeador tal como o pH (ver e.g., Heller et al., “Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems, ” in Polymers irt Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, pp. 175 — 188; Kang et al., J. Applied Polymer Sei. 48: 343 - 354, 1993; Dong et al., J. Controlled Release 19: 171 - 178, 1992; Dong & Hoffman, J. Controlled Release 15: 141 — 152, 1991; Kim et al., J. Controlled Release 28: 143 - 152,1994; Comejo-Bravo et al., J. Controlled Release 33: 223 - 229, 1995; Wu & Lee, Pharm. Res. 10 (10): 1544 - 1547, 1993; Serres et al., Pharm. Res. 13 (2): 196 - 201, 1996; Peppas, “Fundamentais of pH- and Temperature-sensitive Delivery Systems,” in Gumy et al. (eds.), Pulsatile Drug Delivery, Wissenschafliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, pp. 41-55; Doelker, “Cellulose Derivatives,” 1993, in Peppas & Langer (eds.), Biopolymers I, Springer-Verlag, Berlin). Exemplos representativos de polímeros sensíveis ao pH incluem poli(ácido acrílico) e seus derivados (incluindo por exemplo, homopolímeros tais como poli(ácido aminocarboxílico); poli(ácido acrílico); poli(ácido metilacrílico), copolímeros de tais homopolímeros, e copolímeros de poli(ácido acrílico) e acrilmonómeros tais como aqueles discutidos acima. Outros polímeros sensíveis ao pH incluem polissacáridos tais como ftalato de acetato de celulose; ftalato de hidroxipropilmetilcelulose; succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose; trimelilato de acetato de celulose; e quitosano. Outros polímeros sensíveis ao pH incluem qualquer mistura de um polímero sensível ao pH e um polímero solúvel em água.
Do mesmo modo, podem ser adaptados transportadores poliméricos de modo a serem sensíveis à temperatura (ver e.g., Chen et al., “Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafited to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery,” in Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 22: 167-168, Controlled Release Society, Inc., 1995; Okano, “Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery,” in Proceed Inter. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 22: 111 — 112, Controlled Release Society, Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9(3):425-433, 1992; Tung, Int7 J. Pharm. 107:85-90, 1994; Harsh & Gehrke, J. Controlled Release 77:175-186, 21 1991; Bae et al., Pharm. Res. 8(4):531-537, 1991; Dinarvand & D’Emanuele, J. Controlled Kelease 3ó:22i -227,1995; Yu Sc Graiugci, “Novel Tlicrmo-scnsitivc Amphiphilic Gels: PoJy N-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide NetWork Synthesis and Physicochemical Characterization,” Dept. of Chemical & Biological Sei., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 820-821; Zhou & Smid, “Physical Hydrogels of Associative Star Polymers,” Polymer Research Institute, Dept. of Chemistry, College of Environmental Science and Forestry, State Univ. of New York, Syracuse, NY, pp. 822-823; Hoffman et al., “Characterizing Pore Sizes and Water ‘Structure’ in Stimuli-Responsive Hydrogels,” Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, p. 828; Yu & Grainger, “Thermo-sensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels,” Dept. of Chemical & Biological Sei., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 829-830; Kim et al., Pharm. Res. 9(3):283-290, 1992; Bae et al., Pharm. Res. 8(5):624-628, 1991; Kono et al., J. Controlled Release 30:69-75, 1994; Yoshida et al., J. Controlled Release 52:97-102, 1994; Okano et al., J. Controlled Release 36:125-133, 1995; Chun & Kim, J. Controlled Release 38:39-47, 1996; D’Emanuele & Dinarvand, Intl J. Pharm. 118:237-242, 1995; Katono et al., J. Controlled Release 76:215-228, 1991; Hoffman, “Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species,” in Migliaresi et al. (eds.), Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, pp. 161-167; Hoffman, “Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics,” in Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, UT, Feb. 24-27, 1987, pp. 297-305; Gutowska et al., J. Controlled Release 22:95-104, 1992; Palasis & Gehrke, J. Controlled Release 18: 1-12, 1992; Paavola et al., Pharm Res. 12(12): 1997-2002,1995).
Exemplos representativos de polímeros termogelificantes, e a sua temperatura de gelatina ((LCST (°C)) incluem homopolímeros tais como poli(N-metil-N-n-propilacrilamida), 19.8; poli(N-n-propilacrilamida), 21.5; poli(N-metil-N-isopropilacrilamida), 22.3; poli(N-n-propilmetacrilamida), 28.0; poli(N-isopropilacrilamida), 30.9; poli(N,n-dietilacrilamida), 32.0; poli(N-isopropilmetacrilamida), 44.0; poli(N-ciclopropilacrilamida), 45.5; poli(N-etilmetiacrilamida), 50.0; poli(N-metil-N-etilacrilamida), 56.0; poli(N-eiclopropilmetacrilamida), 59.0; poli(N-etilacrilamida), 72.0. Além destes polímeros termogelificantes podem ser feitos preparando copolímeros entre os monómeros acima 22
referidos, ou através da combinação destes homopolímeros com outros polímeros hidrossolúveis, tais como acriimonómeros (e.g., áuiuu awílico c seus derivados, tais como, ácido metilacrílico, acrilato e derivados deste, tais como, butilmetacrilato, acrilamida, e N-n-butilacrilamida).
Outros exemplos representativos de polímeros termogelificantes incluem derivados de éter de cellulose, tais como, hidroxipropilcelulose, 41°C; metilcelulose, 55°C; hidroxipropilmetilcelulose, 66°C; e etilhidroxietilcelulose, o Plurónicos tais como, F-127, 10-15°C; L-122,19°C; L-92,26°C; L-81, 20°C; e L-61,24°C.
Uma grande variedade de formulações podem ser adaptadas pelos transportadores poliméricos da presente invenção, incluindo por exemplo, estruturas em forma de bastonetes pellets, placas, ou cápsulas (ver e.g., Goodel et al., Am. J. Hosp. Pharm. ¥5:1454-1461, 1986; Langer et al., “Controlled release of macromolecules from polymers”, in Biomedical Polymers, Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, Goldberg, E.P., Nakagim, A. (eds.) Academic Press, pp. 113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sei. 69:265-270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sei. 72:1181-1185, 1983; e Bawa et al., J. Controlled Release 1:259-267, 1985). Agentes terapêuticos podem ser ligados por oclusão nas matrizes do polímero, ligados por ligações covalentes, ou encapsulados em microcapsulas. Em certos melhoramentos preferidos da invenção, são fornecidas composições terapêuticas em formulações não capsulares, tais como, microsferas (variando em tamanho de nanometros a micrometros), pastas, fibras de vários tamanhos, filmes e sprays.
Preferivelmente, composições terapêuticas da presente invenção podem ser adaptadas de modo apropriado para serem usadas. Em certos aspectos da presente invenção, a composição deverá ser biocompatível, e deverá libertar um ou mais agentes terapêuticos por períodos de alguns dias ou meses. Por exemplo, são fornecidas composições terapêuticas de “libertação rápida” ou “explosiva” que libertam mais do que 10%, 20%, ou 25% (p/v) de um agente terapêutico (e.g., paclitaxel) por um período de 7 a 10 dias. Tais composições de “libertação rápida” deverão, com certos melhoramentos, dentro de certas modalidades ser capazes de libertar níveis quimioterapêuticos (quando aplicável) de um agente desejável. Noutros melhoramentos, são fornecidas composições terapêuticas de “libertação lenta”, que libertam menos que 1% (p/v) de um agente terapêutico por um período de 7 a 10 dias. Além disso, as composições terapêuticas da presente invenção deverão, preferivelmente, ser estáveis durante alguns meses e capazes de serem produzidas e mantidas em condições de esterilidade. 23
Dentro de certos aspectos da presente invenção, as composições terapêuticas podem ser criadas em qualquer tamanho numa gama de 50 nm a 50G μιη, dependendo de uso particular. Altemativamente, tais composições podem ser também aplicadas prontamente em forma de spray, que solidifica formando um filme ou cobertura. Tais sprays podem ser preparados por microsferas de uma larga gama de tamanhos, incluindo, por exemplo, de 0.1 pm a 3 pm, de 10 pm a 30 pm, e de 30 pm a 100 pm.
As composições terapêuticas da presente invenção, também podem ser preparadas em variadas formas de gel ou “pasta”. Por exemplo, num melhoramento da invenção as composições terapêuticas são fornecidas sob a forma líquida a uma temperatura (e.g., temperaturas superiores a 37°C, tais como, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, ou 60°C), e sólida ou semi-sólida a outra temperatura (e.g., temperatura corporal ambiente, ou qualquer outra temperatura mais baixa do que 37°C). Tais “termopastas” podem ser prontamente feitas com a informação aqui fornecida.
Noutros aspectos da invenção, as composições terapêuticas da presente invenção podem ser formadas como um filme. Preferivelmente, tais filmes são geralmente mais finos que 5, 4, 3, 2 ou 1 mm, mais preferivelmente, com menos que 0.75 mm ou 0.5 mm de espessura, e mais preferivelmente com menos que 500 pm ou 100 pm de espessura. Tais filmes são preferencialmente flexíveis com uma boa força de tensão (e.g., superior a 50, preferencialmente superior a 100, e mais preferencialmente superior a 150 ou 200 N/cm2), boas propriedades de adesão (i.e., com aderência imediata a superfícies molhadas ou húmidas) e ter permeabilidade controlada.
Em certos aspectos da invenção, as composições terapêuticas podem ser formuladas para aplicação tópica. Exemplos representativos incluem: etanol; misturas de etanol e glicóis (e.g., etilenoglicol ou propilenoglicol); misturas de etanol e miristato de isopropil ou etanol, miristato de isopropil e água (e.g., 55:5:40); misturas de etanol e eineol ou D-limoneno (com ou se água); glicóis (e.g., etilenoglicol ou propilenoglicol); e misturas de glicóis, tais como propilenoglicol e água, fosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, Transcutol®, ou terpinoleno; misturas de miristato de isopropil e l-hexil-2-pirrolidona, N-dodecil-2-piperidinona, ou l-hexil-2-pirrolidona. Outros excipientes podem também ser adicionados aos acima mencionados, incluindo por exemplo, ácido oleico e linoleico e sabões tais como laurilsulfato de sódio. Para uma descrição mais detalhada do acima descrito, ver na 24
generalidade, Hoelgaard et al., J. Contr. Rei. 2:111, 1985; Liu et al., J. Pharm. Res. 5:938, J Phr.-.-r.' F.n: 8Ί'Λ.2η 1QQS· 1991; Koy et al., J Pnarm. Sei. S5: 126, 1991, wgião et al., J. Pharm.
Sasaki et al., J. Pharm. Sei. 80:533, 1991; Okabe et al., J. Contr. Rei. 32:243, 1994; Yokomizo et al., J. Contr. Rei. 38:267, 1996; Yokomizo et al., J. Contr. Rei. 42:31, 1996; Mond et al., J. Contr. Rei. 33:12,1994; Michniak et al.. J. Contr. Rei. 32:147, 1994; Sasaki et al., J. Pharm. Sei. 80:533, 1991; Baker & Hadgraft, Pharm. Res. 12:993, 1995; Jasti et al., AAPS Proceedings, 1996; Lee et al., AAPS Proceedings, 1996; Ritschel et al., Skin Pharmacol. 4:235,1991; e McDaid & Deasy, Int. J. Pharm. 133:11,1996.
Em certos melhoramentos da invenção, as composições terapêuticas podem também compreender ingredientes adicionais tais como surfactantes (e.g., Plurónicos, tais como F-127, L-122, L-92. L-81, e L-61).
Noutros aspectos da presente invenção, são fornecidos transportadores poliméricos que estão adaptados para conter e libertar compostos hidrofóbicos, contendo o transportador o composto hidrofóbico em combinação com um carbohidrato, proteína ou polipeptídeo. Em certos melhoramentos, transportador polimérico contém ou compreende regiões, bolsos, ou grânulos de um ou mais compostos hidrofóbicos. Por exemplo, num melhoramento da invenção, os compostos hidrofóbicos podem estar incorporados numa matriz que contém o composto hidrofóbico, seguindo-se a incorporação da matriz no transportador polimérico. A este respeito, pode ser utilizada uma variedade de matrizes, incluindo por exemplo, carbohidratos e polissacáridos, tais como amido, celulose, dextrano, metilcelulose, e ácido hialurónico, proteínas ou polipeptídeos, tais como albumina, colagénio e gelatina. Em melhoramentos alternativos, os compostos hidrofóbicos podem estar contidos num núcleo hidrofóbico, estando este núcleo contido numa capa hidrofílica.
Outros transportadores que podem ser utilizados da mesma forma para conter e libertar os agentes terapêuticos aqui descritos incluem: hidroxipropil β ciclodextrina (Cserhati & Hollo, Int. J. Pharm. 108:69-15, 1994), lipossomas (ver e.g., Sharma et al., Câncer Res. 53:5877-5881, 1993; Sharma & Straubinger, Pharm. Res. 11(60):889-896, 1994; WO 93/18751; Patente U.S. N°. 5 242 073), lipossoma/gel (WO 94/26254), nanocápsulas (Bartoli et al., J. Microencapsulation 7(2): 191-197, 1990), micelas (Alkan-Onyuksel et al., Pharm. Res. 11(2):206-212, 1994), implantes (Jampel et al., Invest. Ophthalm. Vis. Science 34(11):3016-3083, 1993; Walter et al., Câncer Res. 54:22017-2212, 1994), nanopartículas (Violante & Lanzafame PAACR), nanopartículas-modificadas (Patente U.S. N° 5 145 684), 25
nanopartícuias (com superfície modificada) (Patente U.S. N° 5 399 363), emulsão/solução de X----1 /T>_*—TTC \TO c Λ f\H /CQO\ . uiviuv v.u. ITilCv!« /Pufantf» TT Q ΧΓ® S ΛΓΠ compostos fosfolipídicos sintéticos (Patente U.S. N° 4 534 899), dispersão gerada por gás (Patente U.S. N° 5 301 664), emulsões líquidas, espuma, spray, gel, loção, creme, unguento, aerossóis sólidos ou líquidos de gotas, partículas ou vesículas dispersos, microemulsões (Patente U.S. N° 5 330 756), capa polimérica (nano- e micro-cápsula) (Patente U.S. N° 5 439 686), composições à base de taxóides num agente de superfície activo (Patente U.S. N° 5 438 072), emulsão (Tarr et al., Pharm. Res. 4:62-165, 1987), nanosferas (Hagan et al., Proc. Intem. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 22, 1995; Kwon et al., Pharm Res. 12(2): 192-195; Kwon et al., Pharm Res. 10(7):910-914; Yokoyama et al., J Contr. Rei. 32:269-211, 1994; Gref et al., Science 263: 1600-1603, 1994; Bazile et al., J. Pharm. Sei. 54:493-498, 1994) e implantes (Patente U.S. N° 4 882 168).
Como discutido em maior detalhe abaixo, os agentes terapêuticos da presente invenção que estão opcionalmente incorporados num dos transportadores aqui descritos para formar uma composição terapêutica, podem ser preparados e utilizados para tratar ou prevenir uma larga variedade de doenças. TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS Como referido acima, o uso de acordo com a invenção é útil para tratar ou prevenir a esclerose múltipla num método que compreende o passo de administrar a um paciente um agente anti-microtúbulo. 1. Esclerose Múltipla
De acordo com a invenção, agentes anti-microtúbulos podem ser empregues para tratar ou prevenir a esclerose múltipla. Resumidamente, a esclerose múltipla (EM) é uma doença devastadora de desmielinação do sistema nervoso central humano. Embora a sua etiologia e patogénese sejam desconhecidas, pensa-se que factores genéticos, imunológicos e ambientais desempenham aí um papel importante. No curso da doença, há uma desmielinização progressiva no cérebro dos pacientes com EM que resulta na perda da função motora. Embora os mecanismos exactos envolvidos na perda da mielina não sejam compreendidos, existe um aumento na proliferação dos astrócitos e acumulação nas áreas de destruição da mielina. Nestes locais, há uma actividade de tipo macrofágica e actividade da 26
protease aumentada que é pelo menos parcialmente responsável pela degradação da bainha de mieiina. O agente anti-microtúbulo pode ser administrado ao local da inflamação (ou local da potêncial inflamação), de modo a tratar ou prevenir a doença. Agentes anti-microtúbulos adequados estão discutidos abaixo detalhadamente, e incluem por exemplo, taxanos (e.g., paclitaxel e docetaxel), campotecina, eleuterobina, sarcodictina, epotilones A e B, discodermolida, óxido de deutério (D2O), (2-metil-2,4-pentanodiol) hexilenoglicol, tubercidina (7-deazaadenosina), LY290181 (2-amino-4-(3-piridil)-4H-naftol(l,2-b) pirano-3-cardonitrilo), fluoreto de alumínio, etilenoglicol bis-(succinimidilsuccinato), éster de etilglicina, anticorpos monoclonais anti-idiotípicos, proteína promotora da agregação do microtúbulo (proteína de tipo taxol, TALP), intumescimento celular induzido por condições hipotónicas (190 mosmol/L) insulina (100 nmol/L) ou glutamina (10 mmol/L), ligação por dineína, giberelina, XCHOl (proteína tipo quinesina), ácido lisofosfatídico, ião lítio, componente da parede celular vegetal (e.g., poli-L-lisina e extensina), tampões de glicerol, tampão de estabilização de microtúbulo Triton X-100, proteínas associadas a microtúbulo (e.g., MAP2, MAP4, tau, tau grande, ensconsina, factor de alongamento 1-alfa (EF-Ια) e E-MAP-115), entidades celulares (e.g., histona Hl, proteína básica de mieiina e cinetocoros), estruturas microtubulares endógenas (e.g., estruturas axonemais, cápsulas GTP e obturadores), túbulo estável constituído apenas por polipéptido (e.g., STOP145 e STOP220) e tensão de forças mitóticas, bem como quaisquer análogos ou derivados de qualquer um dos referidos acima. Tais agentes podem em determinadas modalidades ser libertados como uma composição juntamente com um transportador polimérico, ou numa formulação de liposoma como discutido mais detalhadamente abaixo e acima. Em determinadas modalidades da invenção, os agentes ou composições podem ser administrados oralmente, intravenosamente ou por administração directa (preferivelmente com orientação por ultrasons, CT, fluoroscopia, MRI ou endoscopia) ao local da doença.
Uma terapia anti-microtúbulo eficaz para a esclerose múltipla irá conseguir um ou mais dos seguintes efeitos: diminuir a gravidade dos sintomas; diminuir a duração das exacerbações, aumentar a frequência e duração dos períodos assintomáticos/de remissão da doença; prevenir a invalidez e incapacidades permanentes; e/ou prevenir/atenuar a progressão crónica da doença. Clinicamente, isto resultará numa melhoria dos sintomas visuais (perda visual, diplopia), perturbações da marcha (fraqueza, instabilidade axial, perda sensorial, 27
espasmos, hiperreflexia, perda de destreza), disfunção das extremidades superiores (fraqueza, espasmos, perda sensoriai), disfunção ua ucxiga (urgência, incontinência, hesitação esvaziamento incompleto), depressão, labilidade emocional e deterioração cognitiva. Patologicamente, o tratamento reduz um ou mais dos seguintes, tais como: perda da mielina, quebra da barreira sangue-cérebro, infiltração peri-vascular de células mononucleares, anomalias imunológicas, formação de cicatrizes glióticas e proliferação de astrócitos, produção de metaloproteinase, e velocidade de condução perturbada. O agente anti-microtúbulo pode ser administrado de qualquer modo para alcançar os objectivos acima. Contudo, métodos preferidos de administração incluem a forma intravenosa, oral, subcutânea, intramuscular ou injecção intratecal. O agente anti-microtúbulo pode ser administrado como uma terapia crónica de baixa dosagem para prevenir a progressão da doença, prolongar a remissão da doença ou diminuir sintomas na doença activa. Altemativamente, o agente terapêutico pode ser administrado em doses mais elevadas como uma terapia de choque para induzir a remissão em doença activa em fase aguda. A dose mínima capaz de alcançar estes objectivos pode ser usada e pode variar de acordo com o paciente, gravidade da doença, formulação do agente administrado ou via de administração. Por exemplo, para paclitaxel, pode ser administrada continuamente uma dose crónica sistémica baixa a 10-50 mg/m de paclitaxel a cada 1-4 semanas dependendo da resposta terapêutica; pode ser administrada sistemicamente uma alta dosagem de choque de 50-250 mg/m2 a cada 1-21 dias por 1-6 ciclos. Outros agentes anti-microtúbulos podem ser administrados em doses equivalentes ajustadas para a potência e a tolerância do agente.
FORMULAÇÃO E ADMINISTRAÇÃO
Como referido acima, os agentes anti-microtúbulos da presente invenção podem ser formulados numa variedade de formas (e.g., microsferas, pastas, filmes, sprays, unguentos, cremes, géis, e similares). Além disso, as composições da presente invenção podem ser formuladas de modo a conter mais de um agentes anti-microtúbulos, de modo a conter uma variedade de compostos adicionais, de modo a ter determinadas propriedades físicas (e.g., elasticidade, um ponto de fusão particular, ou uma taxa de libertação especificada). Em determinadas modalidades da invenção, as composições podem ser combinadas de modo a obter um efeito desejado (e.g., várias preparações de microsferas podem ser combinadas de 28
modo a obter quer uma libertação rápida quer uma libertação lenta ou prolongada de um ou mais agentes anti-microrúbuios).
Agentes anti-microtúbulos podem ser administrados quer isoladamente, quer em combinação com transportador, excepientes ou diluentes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Geraímente, tais transportadores devem ser não-tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues. Vulgarmente, a preparação de tais composições implica combinar o agente terapêutico com tampões, antioxidantes tais como ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluindo glucose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa e outros estabilizadores e excipientes. Solução salina de tampão neutro ou solução salina misturada com soro de albumina não específico são exemplos de diluentes adequados.
Como referido acima, agentes, composições, ou composições farmacêuticas anti-microtúbulos aqui fornecidos podem ser preparados para administração por uma variedade de vias diferentes, incluindo por exemplo, administração tópica a um local de inflamação, oral, rectal, intracraniana, intratecal, intranasal, intraocular, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, sublingual, e intravesical. Outras vias representativas de administração incluem administração directa (preferivelmente com orientação por ultrasons, CT, fluoroscopia, MRI ou endoscopia) ao local da doença.
Os agentes terapêuticos, composições terapêuticas e composições farmacêuticas aqui fornecidos podem ser colocados dentro de contentores, juntamente com material de embalagem o qual forneça instruções relativamente ao uso desses materiais. Geralmente, tais instruções incluem uma explicação tangível que descreva a concentração do reagente, bem como em determinadas modalidades, quantidades relativas de ingredientes excipientes ou diluentes (e.g., água, solução salina, ou PBS) que podem ser necessários para reconstituir o agente anti-microtúbulo, a composição anti-microtúbulo, ou a composição farmacêutica.
Os exemplos que se seguem são oferecidos como forma de ilustração, e não como meio de limitação.
EXEMPLOS
Como discutido acima, a inflamação crónica é um processo caracterizado por infiltração nos tecidos de glóbulos brancos (macrófagos, linfócitos, neutrófilos, e células de plasma), destruição dos tecidos por células inflamatórias e produtos celulares (espécies de
29
oxigénio reactivas, enzimas de degradação dos tecidos tais como metaloproteínases de matriz), e tentativas repetidas de reparação por subsiiiuiçãu do íccido conjuntivo (angmgé.nese e fibrose).
De modo a avaliar os agentes anti-microtúbulo quanto à sua capacidade de efectuar inflamação crónica, seguem-se os seguintes objectivos patológicos/biológicos: (1) inibição da resposta dos glóbulos brancos (macrófagos, neutrófilos e células T) que inicia a cascata inflamatória; (2) inibição da hiperproliferação das células mesenquimais (fibroblastos, sinoviócitos, etc.) que conduz ao desenvolvimento da fibrose e perda das funções orgânicas; (3) inibição da actividade/produção da metaloproteinase da matriz que provoca danos nos tecidos; (4) disrupção da angiogénese que pode reforçar a resposta inflamatória e fornecer o suporte metabólico necessário para o crescimento e desenvolvimento do tecido fibroso; e (5) tudo isto deve ser conseguido sem toxicidade substancial para as células parenquimais normais e sem prejudicar a síntese normal dos componenetes da matriz (e.g., colagéneo e proteoglicanos).
Como apresentado mais detalhadamente abaixo, a actividade dos agentes que estabilizam microtúbulos tais como, por exemplo paclitaxel, foi examinada em vários tecidos e estados de doença inflamatória. Estes agentes demonstram uma capacidade de alterar muitos dos parâmetros de doença acima referidos. EXEMPLO 1
EFEITO DE AGENTES ΑΝΉ-MICROTÚBULOS NA ACTIVIDADE DE NEUTRÓFILOS O exemplo descreve o efeito de agentes anti-microtúbulos na resposta de neutrófilos estimulados com cristais CPPD opsonizados ou zimosan opsonizado. Como demonstrado pelas experiências apresentadas abaixo, os agentes anti-microtúbulos são inibidores potentes da activação do neutrófilo induzida pelo particulado medido por quimiluminescência, produção de anião superóxido e desgranulação em resposta a zimosan ou microcristais de plasma opsonizados. A. Materiais e Métodos
Solução salina de tampão de Hanks (HBSS) com pH 7.4 foi usada ao longo deste estudo. Todos os produtos químicos foram adquiridos à Sigma Chemical Co (St. Louis, MO)
30 a menos que referido de outro modo. Todas as experiências foram executadas a 37°C a menos que explicitada outra temperatura.
1. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS CRISTAIS
Foram preparados cristais CPPD (triclínicos). A distribuição de tamanhos dos cristais foi aproximadamente 33% inferior a 10 pm, 58% entre 10 e 20 pm e 9% superior a 20 pm. os cristais preparados sob as condições acima referidas são isentos de pirogéneo e os cristais produzidos sob condições estéreis isentas de pirogéneo produziram a mesma magnitude de resposta do neutrófilo do que os cristais preparados sob condições laboratoriais normais, não estéreis.
2. OPSONIZAÇÃO DOS CRISTAIS E DO ZIMOSAN
Todas as experiências que estudaram as respostas do neutrófilo aos cristais ou ao zimosan na presença de paclitaxel foram executadas usando zimosan ou CPPD de plasma opsonizado. A opsonização dos cristais ou do zimosan foi executada com plasma heparinizado a 50% numa concentração de 75 mg de CPPD ou 12 mg de zimosan por ml de plasma a 50%. Cristais ou zimosan foram incubados com plasma durante 30 minutos a 37°C e depois lavados em HBSS em excesso.
3. PREPARAÇÃO DOS NEUTRÓFILOS
Os neutrófilos foram preparados a partir de sangue humano total tratado com citrato e recém-colhido. Resumidamente, 400 ml de sangue foram misturados com 80 ml de dextrano a 4% T500 (Pharmacia LKB, Biotechnology AB Uppsala, Suécia) em HBSS e deixado a assentar durante 1 hora. O plasma foi recolhido continuamente e foram aplicados 5 ml a 5 ml de Ficoll Paque (Pharmacia) em tubos de polipropileno de 15 ml (Corning, NY). Após a centrifugação a 500g durante 30 minutos, os pellets de neutrófilo foram limpos de eritrócitos durante 20 segundos de choque hipotónico. Os neutrófilos foram ressuspensos em HBSS, mantidos em gelo e usados para experiências no espaço de 3 horas. A viabilidade e a pureza dos neutrófilos foi sempre superior a 90%. 31 4. INCUBAÇÃO DOS NEUTRÓFILOS COM AGENTES ANTI-MICROTÚBULOS (al Paclitaxel
Uma solução stock de paclitaxel a 12mM em dimetilsulfóxido (DMSO) foi preparada imediatamente antes de cada experiência. Esta solução de reserva foi diluída em DMSO para produzir soluções com concentrações de paclitaxel na ordem dos 1 a 10 mM. Volumes iguais destas soluções de paclitaxel diluídas foram adicionados aos neutrófilos a 5 000 000 células por ml sob vortex suave para obter concentrações de 0 a 50 μΜ com uma concentração de DMSO final de 0.5%. As células foram incubadas durante 20 minutos a 33°C e depois durante 10 minutos a 37°C antes da adição aos cristais ou ao zimosan. (b) Fluoreto de Alumínio
Uma solução stock de fluoreto de alumínio (AIF3) a 1M em HBSS foi preparada de fresco. Esta solução stock foi diluída em HBSS para produzir soluções de AIF3 com concentrações na ordem dos 5 a 100 mM. Volumes iguais (50 μΐ) destas soluções de AIF3 diluídas foram adicionados aos neutrófilos a 5 000 000 células por ml e foram incubadas durante 15 minutos a 37°C. Foi adicionado Luminol (1 μΜ) e depois 20 μΐ de zimosan opsonisado (concentração final = 1 mg/ml) para activar as células. (c) Éster de Etilelicina
Uma solução stock de éster de etilglicina a 100 mM em HBSS foi preparada de fresco. Esta solução stock foi diluída em HBSS para produzir soluções de éster de etilglicina com concentrações na ordem dos 0.5 a 10 mM. Volumes iguais (50 μΐ) destas soluções de éster etilglicina diluídas foram adicionados aos neutrófilos a 5 000 000 células por ml e foram incubadas durante 15 minutos a 37°C. Foi adicionado Luminol (1 μΜ) e depois 20 μΐ de zimosan opsonisado (concentração final = 1 mg/ml) para activar as células. (dl LY290181
Uma solução stock de LY290181 a 100μΜ em HBSS foi preparada de fresco. Esta solução stock foi diluída em HBSS para produzir soluções de LY290181 com concentrações na ordem dos 0.5 a 50 μΜ. Volumes iguais (50 μΐ) destas soluções de LY290181 diluídas foram adicionados aos neutrófilos a 5 000 000 células por ml e foram incubadas durante 15 32
minutos a 37°C. Foi adicionado Luminol (1 μΜ) e depois 20 μΐ de zimosan opsonisado (concentração final = 1 mg/ml) para activar as céiuias.
5. ENSAIO DE QUIMILUMINESCÊNCIA
Todos os estudos de quimiluminescência foram executadas a uma concentração celular de 5 000 000 células /ml em HBSS com CPPD (50 mg/ml). Em todas as experiências foram adicionados 0.5 ml de células a 25 mg de CPPD ou 0.5 mg de zimosan em tubos Eppendorf de 1.5 ml tapados. Foram adicionados 10 μΐ de Luminol dissolvido em DMSO a 25% em HBSS para obter uma concentração final de 1 μΜ e as amostras foram misturadas para iniciar a activação do neutrófilo pelos cristais ou pelo zimosan. A quimiluminescência foi monitorizada usando um Luminómetro LKB (Model 1250) a 37°C durante 20 minutos com agitação imediatamente antes das medições para ressuspender os cristais ou zimosan. Tubos de controlo continham células, fármaco, e luminol (cristais ausentes).
6. PRODUÇÃO DE ANIÃO SUPERÓXIDO
As concentrações de anião superóxido foram medidas usando o ensaio de redução do citocromo C passível de inibição pela superóxido dismutase. Resumidamente, 25 mg de cristais ou 0.5 mg de zimosan foram colocados num tubo Eppendorf de 1.5 ml tapado e aquecidos a 37°C. Foram adicionados 0.5 ml de células a 37°C juntamente com ferricitocromo C (concentração final 1.2 mg/ml) e as células foram activadas através de agitação com os tubos tapados. No momento adequado os tubos foram centrifugados a 10 000 g durante 10 segundos e o sobrenadante foi recolhido para ensaio pela medição da absorvância a 550 nm. Os tubos de controlo foram compostos sob as mesmas condições com a inclusão de superóxido dismutase a 600 unidades por ml.
7. ENSAIO DE DESGRANULAÇÃO DO NEUTRÓFILO
Tubos Eppendorf de 1.5 ml contendo quer 25 mg de CPPD ou 1 mg de zimosan foram pré-aquecidos a 37°C. Foram adicionados 0.5 ml de células a 37°C, a que se seguiu a agitação vigorosa para iniciar as reacções. Na altura adequada, os tubos foram centrifugados a 10 OOOg durante 10 segundos e 0.4 ml de sobrenadante foi armazenado a -20°C para um ensaio posterior.
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A lisozima foi medida pela diminuição na absorvância a 450 nm de uma suspensão de Micrococcus lysodeikticus. Resumidamente, Micrococcus iysoueikiivuS foi suspenso a 0.1 mg/ml em tampão de fosfato de potássio 65 mM, pH 6.2 e a absorvância a 450 nm foi ajustada por diluição para 0.7 unidades. O cristal (ou zimosan) e o sobrenadante celular (100 μΐ) foi adicionado a 2.5 ml da suspensão Micrococcus e a diminuição na absorvância foi monitorizada. Foram preparados padrões de lisozima (clara do ovo de galinha) na ordem dos 0 a 2000 unidades/ml e obteve-se um gráfico de calibração da concentração da lisozima contra a taxa de diminuição na absorvância a 450 nm. A actividade da mieloperoxidase (MPO) foi medida pelo aumento na absorvância a 450 nm que acompanha a oxidação da dianisidina. 7.8 mg de dianisidina foram dissolvidos em 100 ml de 0.1 M de tampão de citrato, pH 5.5 a 3.2 mM por sonicação. Para uma cuvette de 1 ml, foram adicionados 0.89 ml da solução de dianisidina, seguida de 50 μΐ de Triton x 100 a 1%, 10 μΐ de um peróxido de hidrogéneo a 0.05% em solução aquosa e 50 μΐ de sobrenadante de células-cristal. A actividade MPO foi determinada a partir da mudança na absorvância (450 nm) por minuto, Delta  450, usando a seguinte equação:
Oxidação de dianisidina (nmol/min) = 50 x Delta Á 450 8. VIABILIDADE DOS NEUTRÓFILOS
Para determinar o efeito dos agentes anti-microtúbulos na viabilidade de neutrófilos foi medida a libertação da enzima marcadora citoplasmática, lactato desidrogenase (LDH). Também foram testados tubos de controlo contendo células com fármaco (cristais ausentes) de experiências de desgranulação quanto ao LDH. B, Resultados
Em todas as experiências foi determinada a significância estatística usando o teste de t-Student e a significância foi reivindicada para p<0.05. Onde são apresentadas barras de erro elas descrevem um desvio padrão relativamente ao valor médio para determinado valor de n.
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1. VIABILIDADE DOS NEUTRÓFILOS (a) Paclitaxel
Os neutrófilos tratados com paclitaxel a 46 μΜ durante uma hora a 37°C não apresentaram qualquer aumento de nível de libertação de LDH (sempre inferior a 5% do total) relativamente aos controlos, indicando que o paclitaxel não causou a morte das células. (bl Fluoreto de Alumínio
Os neutrófilos tratados com fluoreto de alumínio com uma concentração na ordem dos 5 a 100 mM durante uma hora a 37°C não apresentaram qualquer aumento de nível de libertação de LDH relativamente aos controlos, indicando que o Flureto de Alumínio não causou a morte das células. (cl Éster de Etilglicina
Os neutrófilos tratados com éster de etilglicina com uma concentração na ordem dos 0.5 a 20 mM durante uma hora a 37°C não apresentaram qualquer aumento de nível de libertação de LDH relativamente aos controlos, indicando que o éster de etilglicina não causou a morte das células.
2. QUIMILUMINESCÊNCIA (a) Paclitaxel O paclitaxel a 28 μΜ produziu uma inibição forte da quimiluminescência do neutrófilo induzida quer pelo CPPD opsonizado com plasma quer pelo zimosan opsonizado com plasma - como mostram as Figuras 1 A, 1B e 2A, respectivamente. A inibição da resposta do pico de quimiluminescência foi de 52% (+/- 12%) e 45% (+/- 11%) para o CPPD e o zimosan, respectivamente. A inibição pelo paclitaxel a 28 μΜ da quimiluminescência induzida quer pelo CPPD opsonizado com plasma quer pelo zimosan opsonizado com plasma foi significativa em todas as vezes de 3 a 16 minutos (Figuras 1 e 4A). As Figuras IA e 1B mostram a dependência da concentração da inibição pelo paclitaxel da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo CPPD opsonizado com plasma. Em todas as experiências as amostras de controlo nunca produziram valores de quimiluminescência superiores a 5 mV e a adição de paclitaxel em qualquer das concentrações usadas neste estudo não teve efeito sobre os valores de quimiluminescência dos controlos. 35
(b) Fluoreto de Alumínio O Fluoreto de Alumínio em concentrações entre us 5 c os ICC mM produziu um?» forte inibição da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo zimosan opsonizado com plasma, como mostra a Figura 1C. Esta Figura mostra a dependência da concentração da inibição pelo AIF3 da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo zimosan opsonizado com plasma. A adição de AIF3 em qualquer das concentrações usadas neste estudo não teve efeito sobre os valores de quimiluminescência dos controlos. (c) Éster de Etilglicina O éster de etilglicina em concentrações entre os 0.5 e os 20 mM produziu uma forte inibição da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo zimosan opsonizado com plasma, como mostra a Figura 1D. Esta Figura mostra a dependência da concentração da inibição pelo éster de etilglicina da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo zimosan opsonizado com plasma. A adição de éster de etilglicina em qualquer das concentrações usadas neste estudo não teve efeito sobre os valores de quimiluminescência dos controlos. íd) LY290181 LY290181 em concentrações entre os 0.5 e os 50 μΜ produziu uma forte inibição da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo zimosan opsonizado com plasma, como mostra a Figura 1E. Esta Figura mostra a dependência da concentração da inibição pelo LY290181 da quimiluminescência do neutrófilo induzida pelo zimosan opsonizado com plasma. A adição de LY290181 em qualquer das concentrações usadas neste estudo não teve efeito sobre os valores de quimiluminescência dos controlos.
3. PRODUÇÃO DE SUPERÓXIDO O curso temporal da produção de anião superóxido induzido por cristal CPPD opsonizado com plasma, como medido pela redução do citocromo C passível de inibição pela superóxido dismutase (SOD), está apresentado na Figura 3. O tratamento das células com paclitaxel a 28 μΜ produziu uma diminuição na quantidade de superóxido produzido em todos os momentos. Esta diminuição foi significativa em todos os momentos apresentados na Figura 3A. A dependência da concentração desta inibição está representada na Figura 3B. A estimulação da produção de anião superóxido por zimosan opsonizado (Figura 4B) apresentou
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um curso de tempo similar à activação induzida por CPPD. A inibição da produção de anião superóxido induzido por zimosan pui paoliíõxêl a 28 μΜ foi menos drástica dc que a inibição da activação por CPPD mas foi significativa em todos os momentos apresentados na Figura 4B. O tratamento de neutrófilos induzidos por cristal CPPD com LY290181 a 17 μΜ também produziu uma diminuição na quantidade de superóxido produzido (Figura 3C).
4. DESGRANULAÇÃO DO NEUTRÓFILO A desgranulação do neutrófilo foi monitorizada pela libertação da mieloperoxidase e da lisozima induzida por cristal CPPD opsonizado com plasma ou libertação da mieloperoxidase induzida por zimosan opsonizado com plasma. Demonstrou-se que quantidades suficientes destas duas enzimas são libertadas no meio extracelular quando os cristais CPPD revestidos com plasma são usados para estimular neutrófilos sem a necessidade de adição de citocalasina B às células. As Figuras 5 e 2 mostram o curso temporal da libertação de MPO e lisozima respectivamente, a partir de neutrófilos estimulados por CPPD revestido com plasma. A Figura 5A mostra que o paclitaxel inibe a libertação de mieloperoxidase a partir dos neutrófilos activados por CPPD opsonizado com plasma nos primeiros 9 minutos da incubação de células-cristal. O paclitaxel inibiu significativamente a libertação da mieloperoxidase induzida por CPPD em todos os momentos como mostra a Figura 5A. A Figura 5B mostra a dependência da concentração da inibição por paclitaxel da libertação da mieloperoxidase induzida por CPPD. O paclitaxel a 28 μΜ reduziu a libertação da lisozima e esta inibição da desgranulação foi significativa em todos os momentos como mostra a Figura 2.
Apenas quantidades reduzidas de MPO e lisozima foram libertadas quando os neutrófilos foram estimulados com zimosan opsonizado. Apesar destes níveis baixos foi possível monitorizar 50% da inibição da libertação de MPO após 9 minutos de incubação na presença de paclitaxel a 28 μΜ que foi estatisticamente significativo (p<0.05) (dados não apresentados). O tratamento de neutrófilos induzidos por cristal CPPD com LY290181 a 17 μΜ diminuiu quer a libertação da lisozima quer da mieloperoxidase a partir das células (Figuras 5Ce 5D). 37 C. Discussão inibidores potentes da activação do neutrófilo induzida por cristal. Adicionalmente, ao revelar níveis similares de inibição das respostas do neutrófilo a outra forma de activador particulado, o zimosan opsonizado, é evidente que a actividade inibitória do paclitaxel e outros agentes anti-microtúbulos não se limita a respostas do neutrófilo aos cristais. Paclitaxel, fluoreto de alumínio, éster de etilglicina, e LY290181 também revelaram ser inibidores potentes da activação do neutrófilo induzida por zimosan sem provocar a morte das células. LY290181 revelou diminuir a produção de anião superóxido e a desgranulação dos neutrófilos induzidos por cristal CPPD. EXEMPLO 2
RESPOSTA DAS CÉLULAS T A ESTÍMULOS ANTIGÉNICOS
De modo a determinar se o paclitaxel afecta a activação das células T em resposta a estimulagénios, foram estimulados clones de células T TR1 quer com o péptido de proteína básico de mielina, GP68-88, ou a lectina, conA, durante 48 horas na ausência ou presença de concentrações crescentes de paclitaxel numa formulação micelar. O paclitaxel foi adicionado no início da experiência ou 24 horas após a estimulação das células com péptido ou conA. A incorporação de timidina tritiada foi determinada como uma medida da proliferação das células T em resposta à estimulação por péptido ou conA.
Os resultados demonstraram que a estimulação das células T aumentou em resposta ao péptido GP68-88 e conA. Na presença de micelas poliméricas de controlo, a estimulação das células T em resposta a ambos os antagonistas não foi alterada. Contudo, o tratamento com micelas de paclitaxel, quer no início da experiência quer 24 horas depois da estimulação, diminuiu a resposta das células T de um modo dependente da concentração. Sob ambas as condições, a proliferação das células T foi completamente inibida por paclitaxel 0.02 μΜ (Figura 79).
Estes dados indicam que o paclitaxel é um inibidor potente da proliferação das células T em resposta à estimulação induzida por antigénio. 38 EXEMPLO 3 EFEITO DO PACLITAXEL NA PROLIFERAÇÃO CELULAR NO SINOVIÓCITO IN VITRO Duas experiências foram conduzidas de modo a avaliar o efeito de concentrações diferentes de paclitaxel na incorporação da timidina tritiada (uma medida da síntese de DNA do sinoviócito) e na proliferação celular in vitro. A. Materiais e Métodos
1. INCORPORAÇÃO DA 3H-TIMIDINA NOS SINOVIÓCITOS
Os sinoviócitos foram incubados em concentrações diferentes de paclitaxel (10‘5M, 10' M, 10' M, e 10' M) continuamente durante 6 ou 24 horas in vitro. Nestes tempos, foram adicionados lxlO6 cpm de 3H-timidina à cultura celular e incubados durante 2 horas a 37°C. As células foram colocadas num colector celular, lavadas através de um filtro, os filtros foram cortados e a quantidade de radiação contida nas secções do filtro foram determinadas. Uma vez verificado o conteúdo de timidina incorporada nas células, este foi usado para determinar a taxa de proliferação celular. Esta experiência foi repetida três vezes e os dados foram reunidos.
2. PROFILAÇÃO DO SINOVIÓCITO
Fibroblastos sinoviais bovinos foram postos a crescer na presença e ausência de concentrações diferentes de paclitaxel (10"5M, 10'6M, 10'7M, e 10'8M) durante 24 horas. No final deste período de tempo o número total de células de sinoviócito viáveis foi determinado visualmente por contagem por exclusão com corante usando coloração de azul tripano. Esta experiência foi conduzida 4 vezes e os dados reunidos. B. Resultados
1. INCORPORAÇÃO DA 3H-TIMIDINA NOS SINOVIÓCITOS
Este estudo demonstrou que o paclitaxel em concentrações baixas inibe a incorporação de 3H-timidina (e por extensão a síntese de DNA) nos sinoviócitos a o \ concentrações tão baixas quanto 10' M. As 6 horas não houve diferença significativa entre o grau de inibição produzido pelas concentrações mais elevadas relativamente às concentrações mais baixas de paclitaxel (Figura 8). Contudo, às 24 horas algum do efeito tinha sido perdido 39
a concentrações mais baixas do fármaco (10'8M), mas ainda era substancialmente inferior ao verificado nos animais de controlo.
2. PROLIFERAÇÃO DO SINOVIÓCITO
Este estudo demonstrou que o paclitaxel foi citotóxico para fibroblastos sinoviais em proliferação de uma forma dependente da concentração. O paclitaxel em concentrações tão baixas quanto 10' M é capaz de inibir a proliferação dos sinoviócitos (Figura 9). A concentrações mais elevadas de paclitaxel (10'6M e 10'5M) o fármaco foi tóxico para os fibroblastos sinoviais in vitro. C. Discussão O estudo acima referido demonstra que o paclitaxel é capaz de inibir a proliferação de fibroblastos derivados do sinóvio a concentrações relativamente baixas in vitro. Deste modo, dado o papel do tecido conjuntivo no desenvolvimento de inflamação crónica e o seu comportamento durante a patogenese da doença inflamatória, bloquear a proliferação celular irá afectar favoravelmente o resultado da doença in vivo. EXEMPLO 4 ('Exemplo de Referência')
CARACTERIZAÇÃO DA ACTIVIDADE DO PACLITAXEL NOS OUERATINÓCITOS HUMANOS EPIDÉRMICOS IN VITRO
Foram investigados os efeitos do paclitaxel dependentes da dose e do tempo nos queratinócitos humanos normais activamente proliferantes e nos queratinócitos HaCAT (queratinócitos epidérmicos humanos espontaneamente imortalizados). A. Materiais e Métodos O efeito do paclitaxel nos queratinócitos foi avaliado determinando o número de células e incorporação de 3H-timidina pelas células. Para a incorporação da timidina, os queratinócitos plaqueados em baixa densidade (em DMEM, complementado com antibióticos, glutamina, e FCS a 10%) foram tratados com concentrações de paclitaxel de 0 a 10"4 M durante 6 horas durante o crescimento logarítmico. 3H-timidina foi adicionada às células e incubada durante 6 horas adicionais. As células foram colhidas e a radioactividade foi determinada. Para determinar o número total de células, os queratinócitos foram plaqueados 40
como descrito e incubados na presença e ausência de paclitaxel durante 4 dias. Após a ΐηρηΚοροη ac rplnlac fnram rnIhldí,c p ^AntaHac atrai/pc Hn pncain Hp ^XCÍUS?0 UcanHn coloração de azul tripano. B. Resultados
Foi determinado o número de células viáveis como percentagem de controlos não tratados. Numa concentração de paclitaxel de 10'9 M, a viabilidade celular foi superior a
A 100% dos controlos não tratados, enquanto a 10' Ma viabilidade foi ligeiramente inferior a 87% (Figura 7). Houve uma queda significativa na viabilidade celular a uma concentração de paclitaxel de 10'7 M ou superior. C. Discussão O paclitaxel foi extremamente citotóxico aos queratinócitos humanos a concentrações tão baixas quanto 10' M. Na psoríase, os queratinócitos são células anormalmente proliferantes e uma vez que o paclitaxel estabiliza os microtúbulos, é esperado o seu efeito neste sistema mitoticamente activo. Noutros estudos, o paclitaxel revelou ser citotóxico para os sinoviócitos proliferantes, mas não ter qualquer efeito nos condrócitos não-proliferantes. Assim, o paclitaxel pode actuar nas células hiperproliferantes nas lesões psoriáticas, ao mesmo tempo que não é tóxico para as células epidérmicas normais. φ EXEMPLO 5 EFEITO DO PACLITAXEL NA PROLIFERAÇÃO DOS ASTRÓCITOS É amplamente aceite que existe um aumento no número dos astrócitos fibrosos em lesões EM, que se pensa estarem envolvidos na destruição da mielina através da produção de citoquinas e metaloproteinases da matriz (Mastronardi et al., J. Neurosci. Res. 36:315-324, 1993; Chandler et al., J. Neuroimmunol. 72:155-161, 1997). Astrócitos fibrosos têm níveis elevados de proteína acídica fibrilar glial (GFAP) que serve como um marcador bioquímico pela proliferação do astrócito fibroso. A capacidade de micelas de paclitaxel para inibir a proliferação do astrócito foi avaliada num modelo para ratos transgénicos de doença desmielinizante (Mastronardi et al., J. Neurosci. Res. 36:315-324, 1993). 41 A. Materiais e Métodos
Administração subcutânea áe terapia uc paeníoAcl contínua (2 mg/kg total de 10 injecções) foi iniciado no início clínico da doença (aproxidamente 4 meses de idade). Cinco animais receberam paclitaxel micelar, dois ratos foram usados como controlos: um dos quais foi um animal não tratado normal e o outro foi um animal da mesma ninhada transgénico não tratado. Apenas foi utilizado um rato transgénico como controlo porque o curso da doença foi bem estabelecido no laboratório. Animais com quatro meses de idade foram injectados com paclitaxel micelar, depois de aparecerem os primeiros sinais de patologia neurológica de EM.
Três dias depois da décima injecção, terminou-se o estudo experimental e os tecidos cerebrais foram processados para análise histológica. Para microscopia óptica, os tecidos foram fixados em formalina e embebidos em parafina. Os cortes foram corados com anticorpo anti-GFAP (DACO), lavados e depois postos a reagir com anticorpo secundário conjugado com HPP. Os cortes foram corados para HPP e contra-corados com hematoxilina. Para microscopia electrónica, os tecidos foram fixados em 2.5% de glutaraldeído e solução salina de tampão fosfato (pH 7.2) e fixada posteriormente com tetróxido de ósmio a 1%. Foram preparados e visionados cortes com um microscópio electrónico de transmissão EX II JEOL 1200. B. Resultados
À medida que a patologia neurológica progride, os níveis de GFAP elevam-se no cérebro dos ratos transgénicos; pensa-se que isto reflecte um aumento no número de astrócitos fibrosos presentes. Em contraste, ratinhos transgénicos tratados com paclitaxel têm níveis aproximadamente normais de GFAP (Tabela 1). Estes dados sugerem que o paclitaxel pode inibir a proliferação dos astrócitos in vivo o que pode contribuir para a prevenção da desmielinização na EM. 42 TABELA 1 Quantifirarãr» He GFAP em Homoeenado Cerebral Grupo GFAP GFAP (ng) (ng/pg proteína homogenada) Ratinhos Normais 0.64 +/- 0.02 12.8 Ratinhos Transgénicos 1.80+/-0.10 36.0 Ratinhos Transgénicos 0.69 +/- 0.05 13.8 Tratados com Paclitaxel
Análise posterior de GFAP em tecido cerebral foi avaliada histologicamente. A Figura 78 ilustra cortes cerebrais de ratinhos normais, ratinhos transgénicos de controlo não tratados com paclitaxel e ratinhos transgénicos tratados com paclitaxel.
Embora ratinhos transgénicos de controlo tenham números mais elevados de astrócitos fibrosos, a morfologia dos astrócitos é similar à vista em animais normais (processos estelares espessos que proliferam a partir do corpo das células). Contudo, em ratinhos transgénicos tratados com paclitaxel o número de astrócitos fibrosos diminuiu significativamente. Além disso, observam-se duas mudanças morfológicas: ò corpo da célula dos astrócitos fibrosos parece arredondar-se (o que revelou conduzir à apoptose em cultura) e os processos celulares tomam-se muito finos em tomo do corpo da célula. A análise ultraestrutural usando microscopia electrónica revelou que os astrócitos de ratinhos transgénicos se caracterizaram por processos astrocíticos densamente corados com origem no corpo da célula. Estes processos amplos contêm um sistema bem organizado de filamentos que indicam uma célula activada viável. Contudo, a morfologia dos astrócitos em animais transgénicos tratados com paclitaxel caracterizou-se por arredondamento celular, processos filamentosos finos e deplecção intracelular e desorganização das proteínas filamentosas (Figura 80). C. Conclusões
Estes dados demonstram que o paclitaxel provoca mudanças nos astrócitos fibrosos in vivo, o tipo celular mais proliferativo nas lesões da EM. É provável que o paclitaxel também esteja a inibir a função dos processos astrocíticos e, assim, possa alterar os acontecimentos celulares envolvidos na destruição da mielina. 43
EXEMPLO 6 EFEITO DO FÁCLITAXELNA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS ENDOTELIAIS De forma a determinar se o paclitaxel inibe a proliferação das células endoteliais, células EOMA (uma linha celular endotelial) foram plaqueadas a baixa densidade e incubadas na ausência e na presença de concentrações crescentes de paclitaxel durante 48 horas. Após a incubação, o número de células viáveis foi determinado usando o ensaio de exclusão por coloração com azul tripano. Os resultados (fornecidos na Figura 9) mostram que o paclitaxel a concentrações de 10'8M inibiu a proliferação das células endoteliais em mais de 50% e a concentrações de 10'7 M ou superiores inibiu completamente a proliferação celular. Estes dados demonstram que o paclitaxel é um inibidor potente da proliferação das células endoteliais. Todos os ensaios de toxicidade celular foram executados três vezes, e cada medição individual foi feita em triplicado.
De modo a determinar o efeito do paclitaxel no ciclo e apoptose celular endotelial, foram incubadas células EOMA na ausência e na presença de concentrações crescentes de paclitaxel durante 24 horas. As células foram fixadas com formaldeído a 3.7% em solução salina de tampão fostato durante 20 minutos, coradas com DAPI (4’-6-diaminido-2-fenilindole), 1 pg/ml, e examinadas com uma objectiva 40x sob óptica epifluorescente. As células apoptóticas foram avaliadas registando as células com núcleos fragmentados e cromatina condensada. Os dados mostram que concentrações de paclitaxel superiores a 10' M induziram apoptose das células endoteliais. (Figura 10). EXEMPLO 7 PROTOCOLO DE ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO (MTD No primeiro dia, foram plaqueados 5 - 10 x 104 sinoviócitos por poço (placa de 96 poços). A coluna #1 foi mantida isenta de células (branco). No segundo dia, a placa foi agitada para retirar o meio e foram adicionados 200 μΐ de meio contendo várias concentrações do fármaco. As células foram expostas durante 6 horas, 24 horas ou 4 dias. Não foi adicionado qualquer fármaco às colunas #1 e #2 (branco e controlo não tratado, respectivamente). O meio contendo o fármaco foi retirado e foram adicionados 200 μΐ de meio fresco completo. As células foram então deixadas a crescer durante mais 3 ou 4 dias. No quinto dia, foram adicionados 20 μΐ de sal de brometo de dimetiltiazol difeniltetrazólio (MTT) (5 mg/ml PBS) e deixados a incubar durante 4 horas a 37°C. O meio foi decantado e foram 44
adicionados 200 μΐ de DMSO. A placa foi agitada durante 30 minutos e a absorvância foi lida a 562 nm.
Resultados
Os dados foram representados como a % de sobrevivência que foi obtida através da divisão do número de células remanescentes após o tratamento pelo número de células na coluna #2 de controlo não tratada (o número de células foi obtido a partir de um padrão determinado antes do ensaio). O IC50, a concentração de fármaco que mata 50% da população, pode ser interpolado a partir das Figuras 11 A-E. Para uma exposição de 24 horas o composto LY290181 revelou ser o mais potente dos agentes anti-microtúbulo na redução e inibição da proliferação celular com um IC50 inferior a 5 nM (Figura C). O paclitaxel, a epotilona B e a tubercidina foram ligeiramente menos potentes com IC50S em tomo dos 30 nM (Figura A), 45 nM (Figura F) e 45 nM (Figura B), respectivamente. Finalmente os IC50S para fluoreto de alumínio (AIF3) e hexilenoglicol foram significativamente superiores com valores em tomo dos 32 μΜ (Figura E) e 64 mM (Figura D), respectivamente. EXEMPLO 8
EFEITO DO PACLITAXEL E DE OUTROS AGENTES ANTI-MICROTÚBULOS NA PRODUÇÃO DE METALOPROTEINASE DA MATRIZ A. Materiais e Métodos
1. A ACTIVIDADE DE TRANSCRIÇÃO AP-1 ESTIMULADA POR IL-1 É INIBIDA POR PACLITAXEL
Os condrócitos foram transfectados com constructos que contêm um gene repórter CAT transportado por AP-1 e estimulados com IL-1. Foi adicionada IL-1 (50 ng/ml) e aqueles foram incubados durante 24 horas na ausência e presença de paclitaxel em várias concentrações. O tratamento com paclitaxel diminuiu a actividade do CAT de um modo dependente da concentração (média ± d.p.). Os dados assinalados com asterisco (*) são significativos quando comparados com a actividade do CAT induzido por IL-1 de acordo com um teste t, p < 0,05. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. 45
2. EFEITO DO PACLITAXEL NA ACTIVIDADE DE LIGAÇÃO DO DNA AP-1 INDUZIDA POR IL-1, DNA AP-I A actividade de ligação foi testada com uma sonda de sequência AP-1 humana marcada radioactivamente e ensaio de comutação de mobilidade em gel. Extractos de condrócitos não tratados ou tratados com quantidades diversas de paclitaxel (10'7 a 10'1 2 M) seguidos por IL-Ιβ (20 ng/ml) foram incubados no gelo com um excesso de sonda durante 30 minutos, seguido por electroforese em gel não desnaturante. A faixa “com” contém oligonucleotido AP-1 não marcado em excesso. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. 3. EFEITO DO PACLITAXEL NA EXPRESSÃO DE mRNA MMP-1 E MMP-3 INDUZIDA PORIL-1
As células foram tratadas com paclitaxel em diversas concentrações (10‘7 a 10'2 M) durante 24 horas. Depois foram tratadas com IL-Ιβ (20 ng/ml) por mais 18 horas na presença de paclitaxel. O RNA total foi isolado e os níveis de mRNA MMP-1 foram determinados por análise Northern Blot. As manchas foram subsequentemente removidas e re-sondadas com cDNA GAPDH de rato marcadas radioactivamente com 32P, o qual foi usado como um gene de preparação. Os resultados apresentados são representativos de quatro experiências independentes. Quantificação dos níveis de colagenase-1 e expressão de estromelisina de mRNA. Os níveis de expressão de MMP-1 e MMP-3 foram normalizados com GAPDH. 46 1 EFEITO DE OUTROS ΑΝΊΊ-MICROTÚBULOS NA EXPRESSÃO DA COLAGENASE Foram isoladas culturas frescas de condrócitos primários a partir de cartilagens de vitela. Foram plaqueadas 2.5 x 103 células por ml em placas de cultura de 100x20mm e incubadas em meio Ham F12 contendo FBS a 5% de um dia para o outro a 37°C. As células ficaram em meio isento de soro, sem nutrientes, de um dia para o outro, e depois tratadas com agentes anti-microtúbulo em várias concentrações durante 6 horas. Foi então adicionada IL-1 (20 ng/ml) a cada placa e as placas foram incubadas durante mais 18 horas. O RNA total foi isolado através do método do isotiocianato de guanidina acidificada e sujeito a electroforese num gel desnaturado. Amostras de RNA desnaturado (15 pg) foram analisadas por 2 electroforese em gel num gel desnaturado a 1%, transferidas para uma membrana de nylon e 3 hibridadas com a sonda de cDNA de colagenase marcada com 32P. cDNA de desidrase de
fosfato de gliceraldeído marcado com 32P (GAPDH) como um padrão interno para garantir um carregamento aproximadamente igual. Os filmes expostos foram varridos C dliauSãuvj quantitativamente com ImageQuant. B. Resultados
1. PROMOTORES DA FAMÍLIA DAS METALOPROTEINASES DA MATRIZ A Figura 19A mostra que todas as metaloproteinases da matriz continham os elementos transcripcionais AP-1 e PEA-3 com excepção da Gelatinase B. Ficou bem estabelecido que a expressão das metaloproteinases da matriz tais como as colagenases e estromelisinas dependem da activação dos factores de transcrição AP-1. Assim, os inibidores de AP-1 irão inibir a expressão das metaloproteinases da matriz. 2. EFEITO DO PACLITAXEL NA ACTIVIDADE DE TRANSCRIÇÃO AP-1
Como demostrado na Figura 19B, o IL-1 estimulou 5 vezes a actividade transcripcional de AP-1. O tratamento prévio de condrócitos transitoriamente transfectados com paclitaxel reduziu a actividade de CAT do gene repórter AP-1 induzida por IL-1. Assim, a actividade de AP-1 induzida por IL-1 foi reduzida nos condrócitos pelo paclitaxel de um modo dependente da concentração (10'7 a IO'1 2 3 M). Estes dados demostraram que o paclitaxel é um inibidor potente da actividade AP-1 em condrócitos.
47 1 EFEITO DA ACTIVIDADE DE LIGAÇÃO DO DNA AP-1 2
De forma a confirmar que a inibição pelo paclitaxel da actividade AP-1 não se deveu a efeitos não-específicos, foi examinado o efeito do paclitaxel na ligação de AP-1 induzida por IL-1 aos oligonucleótidos usando lisados nucleares de condrócito. Como apresentado na Figura 19C, a actividade de ligação induzida por IL-1 diminuiu em lisados derivados de condrócitos que foram tratados previamente com paclitaxel em concentrações de IO'7 a 10'3 M 3 durante 24 horas. A inibição pelo paclitaxel da actividade transcripcional de AP-1 correlacionou-se de perto com a diminuição na ligação de AP-1 ao DNA.
4. EFEITO DO PACLITAXEL NA EXPRESSÃO DA COLAGENASE E DA ESTROMELISINA
Uma vez que o paclitaxel foi um inibidor potente da actividade AP-1, foi examinado o efeito do paclitaxel ou a expressão da colagenase e estromelisina induzidas por IL-1, duas importantes metaloproteinases da matriz envolvidas nas doenças inflamatórias. Resumidamente, como apresentado na Figura 20, a indução por IL-1 aumenta os níveis de mRNA de colagenase e estromelisina nos condrócitos. O tratamento prévio dos condrócitos com paclitaxel durante 24 horas reduziu significativamente os níveis de mRNA de colagenase e estromelisina. Com paclitaxel a 10'5 M, a inibição foi completa. Os resultados mostram que o paclitaxel inibiu completamente a expressão de duas metaloproteinases da matriz em concentrações similares àquelas em que inibe a actividade AP-1. 5. EFEITO DE OUTROS ΑΝΉ-MICROTÚBULO NA EXPRESSÃO DA COLAGENASE As Figuras 12A-H demostram que os agentes anti-micrtúbulo inibiram a expressão da colagenase. A expressão da colagenase foi estimulada pela adição de IL-1 que é uma citoquina pró-inflamatória. A incubação prévia dos condrócitos com vários agentes anti-microtúbulo, especificamente LY290181, hexilenoglicol, óxido de deutério, éster de etilglicina, AIF3, epotilona de tubercidina e etilenoglicol bis(succinimidilsuccinato), evitaram todos a expressão da colagenase induzida por IL-1 em concentrações tão baixas quanto 1x10" 7M. C. Discussão O paclitaxel foi capaz de inibir a expressão da colagenase e estromelisina in vitro a concentrações de 10"6 M. Uma vez que esta inibição pode ser explicada pela inibição da actividade AP-1, um passo necessário na indução de todas as metaloproteinases da matriz com excepção da gelatinase B, espera-se que o paclitaxel iniba outras metaloproteinases da matriz que são dependentes de AP-1. Os níveis destas metaloproteinases da matriz são elevados em todas as doenças inflamatórias e desempenham um papel primordial na degradação da matriz, migração e proliferação celular, e angiogénese. Assim, a inibição pelo paclitaxel da expressão das metaloproteinases da matriz, tais como colagenase e estromelisina terá um efeito benéfico nas doenças inflamatórias. 48 EXEMPLO 9
EFEITO PUS ALrfcNJLES ANn-IvSCRGTU5UL0 NA EXPRESSÃO DOS
PROTEOGLICANOS
Foram isoladas culturas frescas de condrócitos primários a partir de cartilagens de vitela. Foram plaqueadas 2.5xl06 células por ml em placas de cultura de 100x20mm e incubadas em meio Ham F12 contendo FBS a 5% de um dia para o outro a 37°C. As células foram colocadas em meio isento de soro, sem nutrientes, durante a noite, e depois tratadas com agentes anti-microtúbulo em várias concentrações (ΙΟ'7 Μ, ΙΟ'6 Μ, 10'5 M e 1CT4 M) durante 6 horas. Foi então adicionada IL-1 (20 ng/ml) a cada placa e as placas foram incubadas durante mais 18 horas. O RNA total foi isolado através do método de isotiocianato de guanidina acidificada e sujeito a electroforese num gel desnaturado. Amostras de RNA desnaturado (15 pg) foram analisadas por electroforese em gel num gel desnaturado a 1%, transferidas para uma membrana de nylon e hibridadas com a sonda de cDNA de proteoglicano marcada com 32P (aggrecan). cDNA de desidrase de fosfato de gliceraldeído marcado com 32P (GAPDH) como um padrão interno para garantir um carregamento aproximadamente igual. Os filmes expostos foram varridos e analisados quantitativamente com ImageQuant.
Resultados
As Figuras 13A-H mostram que os agentes anti-microtúbulo que tiveram um efeito inibitório na expressão da colagenase (Exemplo 8), especificamente LY290181, hexilenoglicol, óxido de deutério, éster de etilglicina, AIF3, epotilona de tubercidina e etilenoglicol bis(succinimidilsuccinato), não afectaram a expressão do aggrecan, um componente principal da matriz da cartilagem, em todas as concentrações avaliadas. EXEMPLO 10 ENSAIO DE ACTIVIDADE NF-κΒ (BASEADO EM CÉLULA SI IL-1 e TNF foram ambos identificados como sendo citoquinas pro-inflamatórias que activam a transcrição de genes conduzidos por um factor de transcrição denominado NF-kB também envolvido em processos inflamatórios. O efeito inflamatório de IL-1 e TNF pode assim, ser avaliado indirectamente por meio de um ensaio ao gene repórter (NF-κΒ) que reage à estimulação IL-1 eTNF. 49
No primeiro dia foram plaqueados por poço 5x104 NIH-3T3 (fibroblasto de murino), estavelmente transfectados com um construcro repórter NF-κΒ (Luciferase, Frumcga Cuip.) (placa de 24 poços). Uma vez confluente (no dia 3-4), as células foram colocadas sem nutrientes substituindo o meio completo por 1 ml de meio isento de soro. Após 24 horas sem nutrientes, as células foram tratadas com várias concentrações de agentes anti-microtúbulo 6 horas antes da adição de IL-1 (20 ng/ml) e TNF (20 ng/ml). As células foram expostas a IL-1 e TNF durante 1 hora e 16 horas e a actividade de NF-κΒ foi medida 24 horas depois. No quinto dia, o meio foi retirado e as células foram lavadas uma vez com PBS. As células foram então extraídas durante 15 minutos com 250 μΐ de tampão de lise (Promega Corp., Wisconsin). A actividade transcricional de NF-κΒ foi avaliada adicionando 25 μΐ de substracto de luciferase a um tubo contendo 2.5 μΐ de extracto celular. O tubo foi imediatamente inserido num luminómetro (Tumer Designs) e a emissão de luz foi medida durante 10 segundos. Os dados de luciferase foram então normalizados para a concentração de proteínas.
Resultados
Os dados foram expressos apresentando a interferência que os agentes anti-microtúbulo exibiram na indução de NF-κΒ (indução múltipla). Como apresentado nas Figuras 80A, 80B, 80C e 80D, a tubercidina e o paclitaxel inibiram a actividade de NF-κΒ induzida quer por IL-1 quer por TNF. O efeito inibitório da tubercidina e do paclitaxel para os tratamentos de 6 horas e de 24 horas foram de cerca de ΙΟμΜ e 2 μΜ, respectivamente. EXEMPLO 11 (Exemplo de Referência! INIBIÇÃO DA ANGIOGÉNESE DE TUMOR PELO PACLITAXEL Embriões fertilizados de pinto doméstico foram incubados durante 4 dias antes das suas cascas serem removidas. Os conteúdos dos ovos foram esvaziados removendo a casca localizada em redor do espaço aéreo, rompendo a membrana interior da casca, perfurando a extremidade oposta da casca e deixando os conteúdos do ovo deslizarem suavemente para fora através da extremidade perfurada. Os conteúdos foram esvaziados para dentro de tijelas de vidro esterilizadas de fundo redondo, cobertos com tampas de placas de petri, e incubados a uma humidade relativa de 90% e 3% de dióxido de carbono. 50
Células MDAY-D2 (um tumor linfóide murino) foram injectadas em ratinhos e aeixaaas transioimcir_sc cm iwiiuics cum uxii ciiuc w.j v/ i.\j iviuIU sacrificados, os locais de tumor foram limpos com álcool, excisados, colocados em meio de cultura de tecido estéril, e cortados em quadrados de 1 mm sob uma câmara de fluxo laminar. Antes de colocar os tumores dissecados nos embriões de pinto com 9 dias, as superfícies CAM foram raspadas suavemente com uma agulha de calibre 30 para garantir a implantação do tumor. Os tumores foram então colocados nas CAMs após 8 dias de incubação (4 dias depois de ter sido retirada a casca), e deixados a crescer na CAM durante 4 dias de modo a estabelecer um abastecimento vascular. Foram preparados 4 embriões utilizando este método, cada embrião recebendo 3 tumores. No 12° dia, cada um dos 3 tumores nos embriões recebeu uma termopasta carregada com paclitaxel a 20%, ou uma termopasta não carregada ou ainda nenhum tratamento. Os tratamentos foram prosseguidos durante dois dias antes de os resultados serem registados.
Os tumores de MDAY-D2 explantados segregam factores angiogénicos que induzem o crescimento interno de capilares (derivados da CAM) para dentro da massa do tumor e que permitem o seu crescimento em tamanho. Uma vez que todos os vasos do tumor são derivados da CAM, enquanto todas as células do tumor derivam do explante, é possível avaliar o efeito das intervenções terapêuticas nestes dois processos independentemente. Este ensaio tem sido usado para determinar a eficácia da termopasta carregada com paclitaxel na: (a) inibição da vascularização do tumor e (b) inibição do crescimento das próprias células do tumor.
Avaliação estereomicroscópica in vivo directa e exame histológico de tecidos fixos a partir deste estudo demostraram o seguinte. Nos tumores tratados com termopasta carregada com paclitaxel a 20%, houve uma redução do número de vasos sanguíneos que abastecem o tumor (Figuras 14C e 14D), uma redução do número de vasos sanguíneos dentro do tumor, uma redução do número de vasos sanguíneos na periferia do tumor (a área que é tipicamente mais altamente vascularizada num tumor sólido) quando comparados com tumores de controlo (Figuras 14A e 14B). Os tumores começaram a diminuir de tamanho e massa durante os dois dias em que o estudo foi conduzido. Adicionalmente, numerosas células endoteliais foram observadas envolvidas em divisão celular indicando que a proliferação celular endotelial tinha sido afectada. As células do tumor foram também frequentemente observadas em mitose. Todos os 4 embriões apresentaram um padrão consistente com a termopasta 51 carregada de paclitaxel a 20% suprimindo a vascularidade do tumor enquanto a termopasta não carregada nao tinha qualquer efeito.
Comparativamente, nas CAMs tratadas com a termopasta não carregada, os tumores estavam bem vascularizados com um aumento do número e densidade de vasos quando comparados com os do tecido normal circundante, e dramaticamente mais vasos do que os que foram observados em tumores tratados com pasta carregada com paclitaxel. Os vasos recém-formados entraram no tumor a partir de todos os ângulos com a aparência de raios ligados ao centro de uma roda (Figuras 14A e 14B). Os tumores de controlo continuaram a aumentar de tamanho e massa durante o decurso do estudo. Histologicamente, foram observados numerosos capilares de parede fina dilatados na periferia do tumor e algumas células endoteliais foram observadas em divisão celular. O tecido do tumor estava bem vascularizado e viável em todos os momentos.
Como um exemplo, nos dois tumores de tamanho idêntico (inicialmente, no momento da explantação) colocados na mesma CAM, obtiveram-se os seguintes dados. Para o tumor tratado com termopasta carregada de paclitaxel a 20%, o tumor media 330 mm x 597 mm; a periferia imediata do tumor tinha 14 vasos sanguíneos, enquanto a massa do tumor apenas tinha 3-4 pequenos capilares. Para o tumor tratado com termopasta não-carregada, o tamanho do tumor era 623 mm x 678 mm; a periferia imediata do tumor tinha 54 vasos sanguíneos, enquanto a massa do tumor tinha 12-14 pequenos vasos sanguíneos. Adicionalmente, a própria CAM circundante continha muito mais vasos sanguíneos quando comparada com a área em tomo do tumor tratado com paclitaxel.
Este estudo demonstra que a termopasta liberta quantidades suficientes de paclitaxel para inibir a angiogénese patológica que acompanha o crescimento e desenvolvimento tumoral. Sob estas condições, a angiogénese é estimulada ao máximo pelas células do tumor que produzem factores angiogénicos capazes de induzir o crescimento interno de capilares a partir do tecido envolvente para dentro da massa do tumor. A termopasta carregada com paclitaxel a 20% é capaz de bloquear este processo e limitar a capacidade do tecido do tumor de manter um fornecimento sanguíneo adequado. Isto resulta numa diminuição na massa do tumor quer através de um efeito citotóxico do fármaco sobre as próprias células do tumor quer através da privação de nutrientes necessários para o crescimento e expansão do tecido. 52 EXEMPLO 12
IN1BICÃU L)A AJNUlúubiNKSc/ rr,LG ? ACEITA A. Ensaios de Membrana de Pinto Corioalantóide ('“CAM”)
Embriões fertilizados de pinto doméstico foram incubados durante 3 dias antes da cultura sem casca. Neste procedimento, os conteúdos do ovo foram esvaziados por remoção da casca localizada em redor do espaço aéreo. A membrana da casca interior foi então rompida e a extremidade oposta da casca foi perfurada para permitir que os conteúdos do ovo deslizassem suavemente pela ponta furada. Os conteúdos do ovo foram esvaziados para dentro de tijelas de vidro esterilizadas de fundo redondo e cobertas com tampas de placas de petri. Estas foram então colocadas numa incubadora com uma humidade relativa de 90% e 3% de CO2 e incubadas durante 3 dias.
Foi misturado Paclitaxel (Sigma, St. Louis, MI) em concentrações de 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 30 pg por alíquota de 10 μΐ de metilcelulose aquosa a 0.5%. Já que o paclitaxel é insolúvel na água, foram utilizadas contas de vidro para produzir partículas finas. Alíquotas de dez microlitros desta solução foram secas em parafilme durante 1 hora formando discos de 2 mm de diâmetro. Os discos secos contendo paclitaxel foram então cuidadosamente colocados na extremidade crescente de cada CAM no 6o dia de incubação. Obtiveram-se controlos colocando discos de metilcelulose sem paclitaxel nos CAMs durante o mesmo período de tempo. Após uma exposição de 2 dias (8o dia de incubação) a vasculatura foi examinada com a ajuda de um estereomicroscópio. Foi injectado Lyposin II, uma solução opaca branca, na CAM para aumentar a visibilidade dos detalhes vasculares. A vasculatura de embriões vivos sem corante foi visualizada usando um estereomicroscópio Zeiss que foi conjugado com uma câmara de vídeo (Dage-MTI Inc., Cidade de Michigan, IN). Estes sinais de vídeo foram então exibidos numa ampliação de 160 vezes e capturados usando um sistema de análise de imagem (Vidas, Kontron; Etching, Alemanha). Foram então feitos negativos das imagens num gravador de gráficos (Model 3000; Matrix Intruments, Orangeburg, NY).
As membranas de um embrião sem casca de 8 dias de idade foram submersas em glutaraldeído a 2% num tampão cacodilato de sódio 0.1 M; fixante adicional foi injectado sob a CAM. Após 10 minutos in situ, a CAM foi removida e colocada em fixante fresco durante 2 horas à temperatura ambiente. O tecido foi então deixado a lavar durante a noite em tampão cacodilato contendo sacarose a 6%. As áreas de interesse foram fixadas posteriormente em 53 1% de tetróxido de ósmio durante 1.5 horas a 4°C. Os tecidos foram então desidratados numa série de graus de etanol, com permuta de soívenre com óxido uc píopilcno c embebidos em resina Spurr. Secções finas foram cortadas com uma faca de diamante, colocadas em grelhas de cobre, coradas e examinadas num microscópio electrónico Joel 1200EX. Similarmente, foram cortadas secções de 0.5 mm e coradas com azul de tolueno para microscopia óptica.
No 1 Io dia de desenvolvimento, os embriões de pinto foram usados para a técnica de fundição por corrosão. Foi injectada resina Mercox (Ted Pella, Inc., Redding, CA) para dentro da vasculatura CAM utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 30. O material de fusão consistia em 2.5 gramas de polímero CL-2B Mercox e 0.05 gramas de catalisador (55% de peróxido de benzoílo) tendo um tempo de polimerização de 5 minutos. Após a injecção, deixou-se ficar o plástico in situ durante uma hora à temperatura ambiente e em seguida durante a noite numa estufa a 65°C. A CAM foi então colocada numa solução aquosa de hidróxido de sódio a 50% para digerir todos os componentes orgânicos. Os plásticos fundidos foram lavados extensivamente em água destilada, secos com ar, revestidos com ouro/paládio, e observados com o microscópio electrónico de varrimento Philips 501B.
Os resultados das experiências acima estão apresentados nas Figuras 15-18. Em resumo, as características gerais da cultura de ovos sem casca de pinto normal são apresentados na Figura 15 A. No 6o dia de incubação, o embrião está centralmente posicionado numa rede de vasos sanguíneos em expansão radial; a CAM desenvolve-se adjacentemente ao embrião. Estes vasos crescentes situam-se perto da superfície e são imediatamente visíveis tomando este sistema um modelo idealizado para o estudo da angiogénese. Redes capilares vivas e sem corante da CAM podem ser visualizadas de forma não invasiva com um estereomicroscópio. A Figura 15B ilustra uma tal área vascular na qual os elementos celulares do sangue dentro dos capilares foram gravados com o uso de uma conjugação vídeo/computador. A arquitectura tri-dimensional de tais redes capilares de CAM é apresentada através do método de fundição por corrosão e visualizado no microscópio electrónico de varrimento (Figura 15C). Estas fusões revelaram vasos subjacentes que se projectam em direcção à superfície da CAM onde formam uma única camada de capilares anastomóticos.
Secções transversais da CAM mostram uma ectoderme exterior consistindo em uma dupla camada de células, uma camada mesodermal mais espessa contendo capilares subjacentes à ectoderme, células adventícias, e uma camada celular endodérmica interna única 54 (Figura 15D). Ao nível do microscópio electrónico, são demonstrados os detalhes estruturais típicos dos capilares da CAiví. Tipicamente, esics vasus siíuõni "òc cm asouviayuv; piCXlITiC. com a camada interna de células da ectoderme (Figura 15E).
Após 48 horas de exposição a paclitaxel em concentrações de 0.25, 0.5,1, 5,10, 30 pg cada CAM foi examinada sob condições in vivo com um estereomicroscópio equipado com uma conjugação de câmara de vídeo/computador de forma a avaliar os efeitos na angiogénese. Esta estrutura de imagem foi usada numa ampliação de 160 vezes que permitia a visualização directa das células sanguíneas dentro dos capilares; deste modo, o fluxo sanguíneo em áreas de interesse poderia ser facilmente avaliado e gravado. Neste estudo, a inibição da angiogénese foi definida como uma área da CAM (medindo de 2 a 6 mm de diâmetro) desprovida de uma rede capilar e de fluxo sanguíneo vascular. Através das várias experiências, foram avaliadas as zonas avasculares num gradiente avascular de 4 pontos (Tabela 1). Esta escala representa o grau de inibição geral com a inibição máxima representada por 3 na escala de gradiente avascular. O paclitaxel foi muito consistente e induziu uma zona avascular máxima (6 mm de diâmetro ou um 3 na escala de gradiente avascular) em 48 horas consoante s sua concentração. TABELA 1
GRADIENTE AVASCULAR 0 -- vascularidade normal 1 -- carece de algum movimento microvascular 21 - pequena zona avascular de aproximadamente 2 mm de diâmetro 31 — avascularidade que se estende para lá do disco (6 mm de diâmetro) 55 1 - indica uma resposta antiangiogénica positiva
Os dados experimentais, segundo as doses, dos efeitos de vários agentes terapêuticos em concentrações diferentes são apresentados na Tabela 2. TABELA 2 .nucuiv i ΛηρρηττΑΡίΐη inimran/n i Paclitaxel Metilcelulose (10 μΐ) 0.25 pg 2/11 Metilcelulose (10 μΐ) 0.5 pg 6/11 Metilcelulose (10 μΐ) 1 Pg 6/15 Metilcelulose (10 μΐ) 5 Pg 20/27 Metilcelulose (10 μΐ) 10 pg 16/21 Metilcelulose (10 μΐ) 30 pg 31/31 Pasta PCL (3 mg) 0.05% 0/9 Pasta PCL (3 mg) 0.10% 1/8 Pasta PCL (3 mg) 0.25% 5/7 Pasta PCL (3 mg) 0.5% 4/4 Pasta PCL (3 mg) 1% 8/8 Pasta PCL (3 mg) 2% 10/10 Pasta PCL (3 mg) 5% 10/10 Pasta PCL (3 mg) 10% 9/9 Pasta PCL (3 mg) 20% 6/6 Gelatina 20%: Pasta PCL 60% (3 mg) 20% 5/6 Gelatina (1 mg) 20% 17/17 Suspensão oftálmica (2x10 μΐ) 0.3% 1/12 Suspensão oftálmica (2x15 μΐ) 0.3% 3/3 Suspensão oftálmica (1x15 μΐ) 0.3% 15/15 Suspensão oftálmica de microsferas (15 μΐ) 10% 4/4 Revestimento de stent (~1 mg) 2.5% 5/5 Revestimento de stent (~1 mg) 10% 1/1 Revestimento de stent (~1 mg) 33% 3/3 Solução de ciclodextrina (10 μΐ) 10% 5/5 Formulação micelar seca (1 mg) 10% Excessivamente tóxico Solução micelar (10 μΐ) 10% Excessivamente tóxico Solução micelar (10 μΐ) 4 Pg 1/1 — Excessivamente tóxico 56
Taxol cremóforo (10 μΐ) 4pg 1/1 - F.xcessivamente tóxico Flocos de 4 PCL: 1 MePEG (1 mg) 20% 10/13 Pasta de PCL: MePEG (3 mg) 20% 6/9 Microsferas (mucoadesivas) 20% 7/7 Microsferas (EVA) 0.6% 2/2 Microsferas de libertação lenta (30-100 pm) 20% 11/11 Microsferas de libertação lenta (30-100 pm) 10% 1/8 Microsferas de libertação média (10-30 pm) 20% 5/6 Microsferas de libertação média (10-30 pm) 10% 5/9 Microsferas de libertação rápida (1-10 pm) 20% 8/11 Microsferas de libertação rápida (1-10 pm) 10% 9/9 bacatina Pasta (2 mg) 2 pg 2/3 Metilcelulose (5 pl) 5 Pg 4/7 metotrexato Pasta PCL (3 mg) 1% 0/13 Pasta PCL (3 mg) 2% 0/3 Pasta PCL (3 mg) 20% 0/1 Pasta PCL:MePEG (3 mg) 2% 1/1 Pasta 95 PCL:5 MePEG (3 mg) 1% 0/6 Pasta 95 PCL: 5 MePEG (3 mg) 10% 0/5 Metilcelulose (10 pl) 2 Pg 0/8 Acetato de prednisolona Suspensão oftálmica (2x10 pl) 1% 3/4 Suspensão oftálmica (2x15 pl) 1% 1/1 Picnogenol (proantocianidina) Metilcelulose (10 pl) 10 pg 1/18 Pasta PCL (3 mg) 15% 1/2 Pasta PCL (3 mg) 30% Excessivamente 57 tóxico v ci uiuAiiia » * - j.li--1..1___/1 Λ ..1\ IVIVIUVVIUIUJV ^ 1 V f·**/ 1 Π nft — —o n/R Metilcelulose (10 μΐ) 675 pg 0/2 Fragmento de sulfato de heparano d) Metilcelulose (10 μΐ) 0.2 μg 0/6 Fragmento de sulfato de heparano (2) Metilcelulose (10 μΐ) 0.4 μg 0/7 Vanadato Microsferas (1 mg) 5% 0/5 Sulfato de vanadilo Pasta PCL (3 mg) 2.5% 0/3 BMOV Pasta PCL (3 mg) 10% Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 25% Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 35% Excessivamente tóxico BEOV Pasta PCL (3 mg) 10% Excessivamente tóxico s-fosfonato Pasta PLA 80%:MePEG 20% (1 mg) 20% Excessivamente tóxico Pasta PCL (1 mg) 2% 2/7 Pasta PCL (3 mg) 1% 0/9 Pasta PCL (3 mg) 2% 0/6 Pasta PCL (3 mg) 4% 0/3 Pasta PCL (3 mg) 8% 1/9 Tamoxifeno Metilcelulose (10 μΐ) 5 Pg 0/2 Pó de cartilagem de tubarão N/A 1 mg 0/5 Estramustina de fosfato de sódio Pasta PCL (3 mg) 5% 0/6 Pasta PCL (3 mg) 10% 0/6 · Vinblastina Metilcelulose (10 μΐ) 9pg Excessivamente tóxico Metilcelulose (10 μΐ) 2 Pg Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 0.25% 4/6 58
Pasta PCL (3 mg) 0.5% 0/4 Γ>«,,♦„ ΌΓΤ /"2 τύ-,γτΛ A VWW» » y- ***©J 1% ? n Pasta PCL (3 mg) 2% Excessivamente tóxico Vincristina Metilcelulose (10 μΐ) 9pg Excessivamente tóxico Metilcelulose (10 μΐ) 1 Pg Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 0.05% 1/1 - Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 0.1% 2/2- Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 0.25% 1/1 - Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 0.5% Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 1% Excessivamente tóxico Pasta PCL (3 mg) 2% Excessivamente tóxico Diterpeno-1 Metilcelulose (10 μΐ) 3 pg 0/5 Diterpeno-2 Metilcelulose (10 μΐ) 3 Pg 0/5 Lavendustina-c Pasta PCL (3 mg) 10% 0/14 Pasta PCL (3 mg) 20% 0/10 MDHC (inibidor de tirosina) Pasta PCL (3 mg) 20% 0/8 Erbstatina Pasta PCL (3 mg) 20% 0/5- Excessivamente tóxico Genisteína Pasta PCL (3 mg) 10% 0/7 Pasta PCL (3 mg) 20% 0/4 Erbimisina Pasta PCL (3 mg) 2% 3/4 Pasta PCL (3 mg) 0.5% 1/1 Camptotecina Pasta PCL (3 mg) 0.25% 3/4 59
Pasta PCL (3 mg) 1% 2/3 nrr /1 X UdlU X 5?Λ 4/S Acetato de cortiso-na e suramina Metilcelulose (10 μΐ) 20 pg/70 pg 2/4 Metilcelulose (10 μ.1) 50 pg/40 pg 5/14 Metilcelulose (10 μΐ) 50 μg/50 pg 3/26 Metilcelulose (10 μΐ) 20 pg/50 pg 0/24 Metilcelulose (10 μΐ) 70 pg/70 μg 0/9 suramina e tetrahido S Metilcelulose (10 μΐ) 50 μg/50 pg 0/6 Sulfato de protamina Metilcelulose (10 μΐ) 50 pg 0/10 Metilcelulose (10 μΐ) 100 pg 1/10 TIMP Metilcelulose (10 μΐ) 15 pg 0/5 Colcicina Metilcelulose (10 μΐ) 3pg 1/1 - Excessivamente tóxico São também apresentadas CAMs típicas tratadas com paclitaxel com o disco de metilcelulose transparente posicionado centralmente sobre a zona avascular medindo 6 mm de diâmetro. Numa amplificação ligeiramente maior, a periferia de tais zonas avasculares é claramente evidente (Figura 16C); os vasos funcionais circundantes foram ffequentemente redireccionados para longe da fonte de paclitaxel (Figuras 16C e 16D). Tal redireccionamento angular do fluxo sanguíneo nunca foi observado em condições normais. Outra característica dos efeitos do paclitaxel foi a formação de ilhas sanguíneas dentro da zona avascular representando a agregação de células sanguíneas.
As alterações morfológicas associadas da CAM tratada com paclitaxel são imediatamente evidentes tanto ao nível do microscópio óptico como no electrónico. Por conveniência de apresentação, são apresentadas três fases distintas da transição geral do estado normal para o estado avascular. Perto da periferia da zona avascular a CAM é marcada com contraste por uma abundância de células mitóticas entre todas as três camadas germinais (Figuras 17A e 18A). Esta divisão mitótica realçada foi também uma observação consistente para as células endoteliais capilares. Contudo, as células endoteliais permaneceram juncionalmente intactas sem extravasamento das células sanguíneas. Com degradação 60
posterior, a CAM caracteriza-se pelo colapso e dissolução dos capilares (Figuras 17B e 18B). As células endoteliais presumptivas, tipicamente envolvidas na miiose, amua niãínvíTi uma relação espacial próxima com as células sanguíneas e permanecem subjacentes à ectoderme; contudo, estas células não estão juncionalmente ligadas. A porção mais central da zona avascular foi caracterizada por uma camada ectodermal e endodermal espessada (Figuras 17C e 18C). Embora estas camadas tenham sido espessadas, as junções celulares permaneceram intactas e as camadas mantiveram as suas características estruturais. Dentro da mesoderme, células dispersas mitoticamente envolvidas eram abundantes; estas células não exibiram a polarização celular endotelial observada na fase anterior. Além disso, ao longo desta região avascular eram comuns células degenerativas como indicado através dos vacuolos de densidade electrónica e fragmentos celulares (Figura 18C).
Em suma, este estudo demonstrou que 48 horas após a aplicação do paclitaxel à CAM, a angiogénese foi inibida. A inibição de vasos sanguíneos formou uma zona avascular, que foi representada por três fases transicionais do efeito do paclitaxel. A área central, a mais afectada da zona avascular, continha capilares rebentados com glóbulos vermelhos extravasados; isto indicava que as junções intercelulares entre as células endoteliais estavam ausentes. As células da endoderme e da ectoderme mantiveram as suas junções intercelulares e por conseguinte estas camadas germinais permaneceram intactas; contudo, estavam ligeiramente adensadas. A medida que se aproximava a área vascular normal, os vasos sanguíneos retinham os seus complexos juncionais e assim também permaneciam intactos. Na periferia da zona tratada com paclitaxel, o crescimento adicional dos vasos sanguíneos foi inibido, o que se tomou evidente pelo típico efeito de redireccionamento ou “cotovelamento” dos vasos sanguíneos (Figura 16D).
As zonas avasculares tratadas com paclitaxel também revelaram uma abundância de células envolvidas pela mitose em todas as três camadas germinais da CAM; isto só aconteceu com o paclitaxel, já que nenhum estudo anterior ilustrou tal acontecimento. Por estarem envolvidas na mitose, as células endoteliais não podiam passar pelas suas funções metabólicas normais envolvidas na angiogénese. Em comparação, a zona avascular formada pelo acetato de cortisona e suramina não produz células mitoticamente envolvidas na CAM; aqueles apenas evitam o crescimento adicional de vasos sanguíneos para dentro da área tratada. Assim, embora os agentes sejam anti-angiogénicos, existem muitos pontos nos quais o processo angiogénico pode ser alvejado.
61
Também foram observados os efeitos do paclitaxel no decurso das 48 horas. Durante este período de observação, notou-se que a inibição da angiogénese UtUUlia ιαυ υυυΟ CC7T1C 9 horas após a aplicação. Secções histológicas revelaram uma morfologia similar àquela que é vista na primeira fase de transição da zona avascular às 48 horas ilustrado nas Figuras 17A e 18A. Além disso, observámos o processo de revascularização na zona avascular previamente observada. Descobriu-se que a zona avascular formada por heparina e esteróides angiostáticos se tomava revascularizada 60 horas após a aplicação. No nosso estudo, as zonas avasculares tratadas com paclitaxel não revascularizavam pelo menos até sete dias após a aplicação, implicando um efeito a longo termo mais potente. EXEMPLO 13
EFEITO DO PACLITAXEL E DA CAMPTOTECINA NA PROLIFERAÇÃO CELULAR LNCAP
Materiais e Métodos Células LNCaP foram semeadas em concentrações de 2x10 e 1x10 células/poço respectivamente em placas de 96 poços. Após 48 horas, foram adicionadas concentrações diferentes de paclitaxel ou camptotecina (25 μΐ) em cada poço de cultura e as placas foram incubadas a 37°C durante 5 dias. Após a incubação, as células foram fixadas com solução de glutaraldeído a 1%, e coradas durante 5 minutos com violeta de cristal a 0.5%. O corante foi sucessivamente eluído com 100 μΐ de uma solução tampão e a absorvância foi lida num leitor de microplaca Titertek Multiskan usando um comprimento de onda de absorvância de 492 nm. O crescimento celular foi expresso como uma percentagem relativa aos poços de controlo na ausência do composto (estabelecido a 100%).
Resultados O paclitaxel inibiu o crescimento celular de LNCaP com um EC50 de aproximadamente 0.09 nM. Experiências de apoptose foram executadas nas células nos poços após o tratamento com paclitaxel usando ensaios de fragmentação de DNA. A apoptose extensiva das células foi observada indicando que 0 paclitaxel foi citotóxico através de um mecanismo apoptótico. A Camptotecina foi extremamente potente na sua acção citotóxica contra as células LNCaP. Concentrações tão baixas quanto 0.001 nM foram tóxicas para mais de 60% das
62 células. Assim, o EC50 para este fármaco contra as células LNCaP deve basear-se na gama de concentração temtomoíar.
Tabela 1 N Paclitaxel (nM) Absorvância 492 nm % de Crescimento 16 0.001 0.049±0.05 100 16 0.01 0.40±0.03 81 8 0.05 0.36±0.02 73 8 0.1 0.20±0.03 40 8 1 0.025±0.01 5 8 10 0.027±0.01 5 8 100 0.033±0.01 6
Absorvância 492 nm dos controlos = 0.49±0.06
Tabela 2 N Camptotecina (Nm) Absorvância 492 nm % de Crescimento 16 0.001 0.169±0.05 36 8 0.05 0.14±0.04 29 8 0.1 0.10±0.02 21 8 1 0.10±0.02 21 8 10 0.088±0.02 17 15 100 0.038±0.01 8
Absorvância 492 nm dos controlos = 0.47±0.05 EXEMPLO 14
ACITVIDADE DE ANTI-ANGIOGÉNESE DE AGENTES ANTI-MICROTÚBULO
ADICIONAIS
Para além do paclitaxel, outros agentes anti-microtúbulo podem ser igualmente incorporados nos transportadores poliméricos. Exemplos representativos que são fornecidos abaixo incluem a camptotecina, e alcaloides vinca tais como a vinblastina. e a vincristina, e agentes estabilizadores de microtúbulo tais como a tubercidina, o fluoreto de alumínio e LY290181. 63
A. Incorporação de Agentes em PCL
Os agentes loram moídos com almofariz e piiãu pai a icduAi o lãíiianlic dc partícula z menos de 5 microns. Isto foi então misturado como um pó seco com policaprolactona (peso molecular 18000 Birmingham Polymers, AL USA). A mistura foi aquecida a 65°C durante 5 minutos e a mistura derretida de polímero/agente foi agitada até ficar uma pasta macia durante 5 minutos. A pasta derretida foi então colocada numa seringa de 1 ml e extrudida para formar pellets de 3 mg. Estes pellets foram então colocados na CAM no 6o dia de gestação para avaliar as suas propriedades anti-angiogénicas.
B. Efeitos da Pasta PCL Carregada com Camptotecina sobre a CAM
Termopasta carregada com camptotecina foi eficaz na inibição da angiogénese quando comparada com pellets PCL de controlo. Para uma carga de 5% de fármaco, 4/5 das CAMs testadas apresentaram uma potente inibição da angiogénese. Adicionalmente, para uma carga de 1% e 0.25%, 2/3 e 3/4 das CAMs apresentaram inibição da angiogénese, respectivamente. Deste modo, é evidente a partir destes resultados que a camptotecina foi libertada de modo suficiente da termopasta PCL e tem eficácia terapêutica anti-angiogénica.
C. Efeitos da Pasta PCL Carregada com Vinblastina - e Vincristina - sobre a CAM
Ao testar as formulações na CAM, tomou-se evidente que os agentes estavam a ser libertados do pellet PCL em quantidades suficientes para induzir um efeito biológico. Quer a vinblastina quer a vincristina induziram efeitos anti-angiogénicos no ensaio da CAM quando comparados com pellets de termopasta PCL de controlo. A concentrações de carga de fármaco de 0.5% e 0.1%, a vincristina induziu a inibição da angiogénese em todas as CAMs testadas. Quando foram testadas concentrações excedendo os 2%, atingiram-se níveis de fármaco tóxicos e ocorreu uma morte embriónica inesperada. A vinblastina também foi eficaz na inibição da angigénese na CAM a concentrações de 0.25%, 0.5% e 1%. No entanto, a concentrações excedendo os 2%, a vinblastina revelou-se tóxica para o embrião.
D. Efeitos da Pasta PCL Carregada com Tubercidina sobre a CAM
Pasta carregada com tubercidina foi eficaz na inibição da angiogénese quando comparada com pellets de controlo. Num carregamento de 1% de fármaco, a tubercidina 64 induziu a inibição da angiogénese em 1/3 das CAMs testadas. Contudo, a concentrações mais elevadas de farmaco com um carregamento a oyo, α mu^iCiuína uuuiu j/Otcxitcmcnte a angiogénese em 2/3 das CAMs. Assim, a partir destes resultados tomou-se evidente que a tubercidina foi suficientemente libertada da pasta PCL e que tem uma actividade anti-angiogénica potente.
E. Efeitos da Pasta PCL Carregada com Fluoreto de Alumínio sobre a CAM
Pastas PCL carregadas com fluoreto de alumínio (AIF3) foram eficazes na inibição da angiogénese com um carregamento de 20% de fármaco quando comparadas com pellets de controlo. Num carregamento de 20% de fármaco, 2/4 das CAMs apresentaram inibição da angiogénese como evidenciado por uma zona avascular medindo entre 2 a 6 mm de diâmetro. Contudo, a concentrações mais baixas de fármaco, 1% e 5%, a inibição da angiogénese não foi evidente (0/6 e 0/5 das CAMs, respectivamente). Assim, o fluoreto de alumínio foi eficaz na indução da inibição da angiogénese apenas em concentrações mais elevadas de fármaco.
F. Efeitos da Pasta PCL Carregada com LY290181 sobre a CAM A avaliação do efeito da pasta PCL carregada com LY290181 a 5% sobre a CAM revelou que LY290181 induziu a inibição da angiogénese em 1/3 das CAMs testadas. Contudo, a um carregamento de fármaco de 1%, LY290181 não induziu uma resposta anti-angiogénica (n=2). EXEMPLO 15 EFEITO DO PACLITAXEL SOBRE A VIABTI.TDADE DAS CÉLULAS NÃO-
PROLIFERANTES
Embora seja importante que um agente modificador da doença seja capaz de inibir fortemente uma variedade de actividades celulares inapropriadas (proliferação, inflamação, produção de enzimas proteolíticas) que ocorrem em excesso durante o desenvolvimento de inflamação crónica, este não deve ser tóxico para os tecidos normais. É particularmente crítico que as células normais não sejam danificadas, na medida em que isto conduziria à progressão da doença. Neste exemplo, foi examinado o efeito do paclitaxel na viabilidade de células normais em não divisão in vitro, utilizando condrócitos cultivados para crescer confluentemente. 65
Resumidamente, os condrócitos foram incubados na presença de Paclitaxel (10'5 M, 1U M e 1U MJ ou ausência (controlo) iiuruni.e ι δ. uuias. πυ um úcsíc pcnodc dc tempo, fci determinado visualmente o número total de células viáveis por exclusão com corante azul de triptano. Esta experiência foi conduzida por 4 vezes e os resultados foram recolhidos.
Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 21. Resumidamente, como é evidente a partir da Figura 21, o paclitaxel não afecta a viabilidade das células não-proliferativas normais in vitro mesmo com concentrações elevadas (10‘5 M) de paclitaxel. Mais especificamente, mesmo em concentrações de fármaco suficientes para bloquear os processos patológicos descritos nos exemplos precedentes não há citotoxicidade para os condrócitos normais. EXEMPLO 16
SELECCÃO DO INCREMENTAPOR DE PERMEACÃO PARA A FORMULAÇÃO TÓPICA DE
PACLITAXEL A. Solubilidade do Paclitaxel em vários incrementadores
Foram examinados os seguintes incrementadores de permeação: Transcutol®, etanol, propilenoglicol, miristato de isopropilo, ácido oleico, e Transcutolimiristatò de isopropil (9:1 v:v). Foi pré-aquecido um milímetro de cada incrementador em frascos de vidro até à temperatura de 37°C e foi adicionado paclitaxel em excesso. Uma amostra de 0.5 ml de fluído de cada frasco foi centrifúgada a 37°C e 13 000 rpm durante 2 minutos. Alíquotas (0.1 ml) de sobrenadante dos tubos de centrífuga foram transferidas para frascos volumétricos e diluídas com metanol. O conteúdo de paclitaxel foi avaliado por cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC). B. Coeficiente de Partição
Uma quantidade específica de paclitaxel foi dissolvida num volume de incrementador aquecido a 37°C. Foram adicionadas aliquotas (lml) desta solução a 1 ml de octanol num frasco de vidro de 4 ml. Solução salina de tampão fosfato (1 ml) (pH 7.4) foi então adicionada e os frascos foram colocados em vortex para criar uma emulsão. Os frascos foram colocados numa estufa a 37°C durante 16 horas, após o que foram removidos 0.1 ml de fase de octanol de cada frasco e diluídos com 9.9 ml de metanol. Para as fases aquosas, foram recolhidas 66 amostras de 0.5 ml dos frascos de ácido oleico, miristato de isopropilo e propilenoglicol e diluídos com 0.5 mi de meianoi. uus írascus uc Tumscuíol, ídiaíii i^tiiãdâs cunostrcís dc 0.1 ml e diluídas com 9.9 ml de TranscutohPBS 50:50 e dos frascos de etanol foram retiradas amostras de 0.1 ml e diluídas com uma razão etanol:PBS de 50:50. O conteúdo em paclitaxel foi determinado por HPLC. Cada determinação foi executada em triplicado. C. Resultados A solubilidade do paclitaxel em cada incrementador a 37°C está referida na Tabela 1.
Tabela 1: Concentração de Paclitaxel em Saturação em Vários incrementadores de Permeação
Concentração de Paclitaxel (mg/ml) Incrementador Média Desvio Padrão Transcotol111' 346.85 2.59 Etanol 68.91 3.49 Propilenoglicol 21.56 0.11 Meristato de isopropilo 0.43 0.01 Acido oleico 0.31 0.01 Transcotol*:Meristato de 353.93 0.42 isopropil (9:1 v:v)
Os coeficientes de partição octanol/água Ko/w, estão enumerados na Tabela 2.
Tabela 2: Coeficiente de Partição octanol/água do Paclitaxel em Várias Soluções de incrementador
Incrementador ^o/w Desvio Padrão Transcotol141 25.25 0.27 Etanol 6.88 0.13 Propilenoglicol 37.13 2.48 Meristato de isopropilo oo Acido oleico 00
Para actuar eficazmente, o paclitaxel tem que penetrar na pele para os estratos inferiores da epiderme viável. Estabeleceu-se que para os fármacos penetrarem a epiderme viável, têm 67
de possuir um coeficiente de partição octanol/água de aproximadamente 100 (Hadgrafi: J.H. & Walters K., Drug absorption enhancements, á.G. de Boers Eu., Korwuud Fublishcis, 1994). Com base nos resultados das Tabelas 1 e 2, propilenoglicol e Transcutol mostram a melhor combinação de paclitaxel solubilizante e incrementação da partição da fase oleosa para a fase aquosa.
Contudo, o Ko/w produzido quer pelo Transcutol quer pelo propilenoglicol pode ser de algum modo baixo, e assim eles foram combinados com miristato de isopropilo que tem um Ko/w infinito, numa tentativa de aumentar a solubilidade do paclitaxel na fase de octanol. O miristato de isopropilo e o Transcutol foram misturados numa proporção de 1:9 em volume. O miristato de isopropilo dissolveu-se imediatamente à temperatura ambiente no Transcutol. De modo a formar uma fase homogénea, o propilenoglicol e o miristato de isopropilo foram também misturados com etanol numa proporção de 4:3.5:0.5 de propilenoglicol:etanol:miristato de isopropilo. Os resultados K<,/w estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3: Coeficientes de Partição Octanol/Água do Paclitaxel nas Combinações de incrementador
Incrementador Ko/w Desvio Padrão Transcotol^rMeristato de isopropilo (9:1) 43.45 0.43 Propilenoglicol:Etanol:Meristato de isopropilo (0.4:3.5:0.5) 42.39 1.66 A adição de miristato de isopropilo ao Transcutol resultou num aumento significativo do coeficiente de partição. Contudo, a solução propilenoglicol.etanol.miristato de isopropilo não resultou numa melhoria significativa do coeficiente de partição, comparativamente ao propilenoglicol considerado isoladamente. Este último resultado, e o facto de o etanol ter revelado exacerbar a condição psoriática, eliminou efectivamente esta combinação de incrementadores de considerações futuras. Além disso, a adição do miristato de isopropilo aumentou de facto a solubilidade do paclitaxel comparativamente à sua solubilidade no Transcutol considerado isoladamente. A solubilidade do paclitaxel no Transcutol foi de 346.9 mg/ml enquanto que na combinação Transcutol :miristato de isopropilo a solubilidade 68 aumentou para 353.9 mg/ml. Deste modo, foi escolhida esta combinação de incrementadores para os estudos cutâneos. EXEMPLO 17
PREPARAÇÃO E ANÁLISE DE FORMULAÇÕES DE PACLITAXEL TÓPICAS
A. Preparação de unguento de paclitaxel A
Transcutol (3.2 g), miristato de isopropilo (0.3 g), labrasol (2.5 g), paclitaxel (0.01 g) e 3H-paclitaxel a 0.5 mCi/ml (0.3 ml) foram combinados num frasco de cintilação de 20 ml. Num outro frasco de cintilação, foram combinados labrafil (2.5 g), arlacel 165 (1.2 g) e compritol (0.3 g) e aquecidos a 70°C até estarem completamente fundidos. Os conteúdos do primeiro frasco de cintilação foram adicionados à mistura fundida, colocados em vortex até homogenizar e deixados arrefecer.
B. Preparação de unguento de paclitaxel B
Transcutol (2.5 g), miristato de isopropilo (1.0 g), labrasol (2.5 g), paclitaxel (0.01 g) e 3H-paclitaxel a 0.5 mCi/ml (0.3 ml) foram combinados num frasco de cintilação de 20 ml. Num outro frasco de cintilação, foram combinados labrafil (2.5 g), arlacel 165 (1.2 g) e compritol (0.3 g) e aquecidos a 70°C até estarem completamente fundidos. Os conteúdos do primeiro frasco de cintilação foram adicionados à mistura fundida, colocados em vortex até homogenizar e deixados arrefecer. C. Preparação da pele e estudo de penetração
Pele congelada, excisada de porquinho Yucatan foi armazenada a -70°C até ser utilizada. Amostras de pele foram preparadas usando um furador de cortiça n° 10 para puncionar discos da pele congelada. As amostras foram lavadas com uma solução de estreptomiocina-penicilina e colocadas em sacos de congelação e armazenados a -70°C.
Cortes cutâneos foram montados em células de difusão Franz, com o estrato córneo voltado para cima. A solução receptora de fundo foi uma solução de amoxicilina a 0.05% em água R.O. Uma célula dadora fixada em cada superfície cutânea. O unguento de paclitaxel foi aquecido até se fundir (40 a 50°C) e retirado para dentro de uma seringa. Enquanto ainda 69 estava derretido, 0.1 ml foram extrudidos sobre cada superfície cutânea. As células dadoras foram cobertas com um disco de vidro e a moniagem foi UciAaua Uuiouíc 24 horas.
Passadas 24 horas, as células foram desfixadas, o unguento em excesso foi removido e armazenado num frasco de cintilação. A superfície cutânea foi rapidamente lavada com 3 ml de diclorometano (DCM) e seca. O DCM de lavagem foi armazenado no mesmo frasco do que o unguento excedente. Os cortes de pele e a solução receptora foram colocados em frascos de cintilação separados. A pele foi arrefecida a -30°C em cortes de 30 pm e recolhida em frascos separados. As aparas iniciais e pele remanescente foram também recolhidos em frascos de vidro separados. As amostras de pele cortada foram dissolvidas adicionando 0.5 ml de solubilizador de tecido a cada frasco. As amostras foram deixadas a dissolver de um dia para o outro à temperatura ambiente. No dia seguinte, foram adicionados 3 ml de mistura de cintilação aos frascos. Para as soluções de lavagem DCM, foram transferidos 100 μΐ de 1 ml de acetonitrilo e depois foram adicionados 3 ml de mistura de cintilação. A radioactividade de todas as soluções foi medida usando um contador beta.
As amostras de pele foram fixadas nas células de difusão Franz e separadas em três grupos. Cada amostra foi tratada correspondentemente (nenhum tratamento ou unguento B com ou sem paclitaxel). Decorridas 24 horas, as amostras foram removidas e processadas usando técnicas histológicas padronizadas. D. Resultados A partir das secções histológicas, a secção de estrato córneo de pele não tratada revelou ter uma espessura de 50 a 120 pm enquanto a epiderme viável tinha entre 400 e 700 pm de espessura. Para o unguento que continha miristato de isopropilo a 3% p/p (unguento A), a concentração de paclitaxel na pele foi essencialmente constante em 1 pg/ml (1.2 xlO'6 M) no estrato córneo e por toda a epiderme viável. Para o unguento que continha miristato de isopropilo a 10% p/p (unguento B), a concentração de paclitaxel manteve-se constante no estrato córneo e epiderme viável, mas superior no estrato cómeo (6pg/ml versus 2pg/ml). Não se encontrou qualquer radioactividade na solução receptora para cada investigação de unguento, indicando que o paclitaxel não passou completamente através da secção cutânea. Não foram observadas diferenças grosseiras quando o unguento contendo paclitaxel foi aplicado. 70 EXEMPLO 18 (Exemplo de Referência')
UESENVOI.viivii-vin ιϋ utt, ruKiviULÁi^ur/S SIS i eivíICAS DE PACLTTAXET. Ρ AR A D
TRATAMENTO DE PSORÍASE
Em casos severos de psoríase, são considerados aceitáveis tratamentos mais agressivos e, assim, as toxicidades associadas ao tratamento sistémico com paclitaxel são aceitáveis. A formulação sistémica para o paclitaxel é constituída por copolímeros em bloco duplo, amfifílicos, que em soluções aquosas formam micelas constituídas por um núcleo hidrófobo e uma cobertura hidrofílica em água. Os copolímeros em bloco duplo de poli(DL-lactídeo)-bloco-metoxipolietilenoglicol (PDLLA-MePEG), policaprolactona-bloco- metoxipolietilenoglicol (PCL-MePEG) e poli(DL lactídeo-co-caprolactona)-bloco- metoxipolietilenoglicol (PDLLACL-MePEG) podem ser sintetizados usando um procedimento de polimerização por fusão em massa, ou métodos similares. Resumidamente, quantidades determinadas de monómeros de DL-lactídeo, caprolactona e metoxipolietilenoglicóis com pesos moleculares diferentes foram aquecidos (130°C) até à fusão, sob arejamento com nitrogénio e agitados. O catalisador octoato de estanho (0,2% p/p) foi adicionado aos monómeros em fusão. A polimerização foi realizada durante 4 horas. Os pesos moleculares, concentrações críticas de micelas e carga máxima de paclitaxel foram medidas por GPC, fluorescência e testes de solubilização, respectivamente (Figura 22). Foram obtidas elevadas capacidades de carga de paclitaxel. A capacidade de solubilizar paclitaxel depende da composição e concentração dos copolímeros (figuras 22 e 23). O copolímero PDLLA-MePEG deu o paclitaxel solúvel mais estável (Figuras 23 e 24). A forte associação dentro do núcleo interno das micelas poliméricas constitui um ambiente com elevada capacidade para transportar fármacos hidrofóbicos tais como o paclitaxel. Os fármacos podem ser acoplados covalentemente aos copolímeros em bloco, para formar uma estrutura micelar, ou podem ser incorporados fisicamente dentro dos núcleos hidrofóbicos das micelas. Os mecanismos de libertação do fármaco da micela incluem difusão a partir do núcleo e permutas entre as cadeias poliméricas da simples e as micelas. A pequena dimensão das micelas (normalmente inferiores a 100 nm) vão eliminai as dificuldades associadas à injecção de partículas maiores. 71 EXEMPLO 19
PROCEDIMENTO PAKA ΡΚϋΡϋΖϊκ TERIvíOFASTA
Cinco gramas de policaprolactona peso molecular 10 000 a 20 000; (Polysciences, Warrington Penn. USA) um frasco de vidro de cintilação de 20 ml que foi colocado numa proveta de 600 ml contendo 50 ml de água pesada. A proveta foi aquecida suavemente a 65°C e conservada a essa temperatura durante 20 minutos até fusão do polímero. Um peso determinado de paclitaxel, ou outro inibidor de angiogénese, foi completamente misturado ao polímero fundido a 65°C. O polímero em fusão foi depositado numa matriz pré-aquecida (estufa a 60°C) e deixado a arrefecer até à solidificação do polímero. O polímero foi cortado em pequenos pedaços (tamanho aproximado 2mm por 2mm) e foi colocado numa seringa de vidro de 1 ml. A seringa de vidro foi colocada em posição vertical (a ponta tapada virada para baixo) numa proveta de vidro de 500 ml contendo água destilada a 65°C (placa de aquecimento Corning) até à fusão completa do polímero. O êmbolo foi inserido na seringa para comprimir o polímero fundido numa massa pegajosa na ponta do cilindro. A seringa foi tapada e deixada arrefecer à temperatura ambiente.
Para aplicação, a seringa foi reaquecida a 60°C e administrada como um líquido que solidifica quando entra em contacto com a temperatura corporal. EXEMPLO 20
MODIFICAÇÃO DA LIBERTAÇÃO DE PACLITAXEL DA TERMOPASTA USANDO PDLLA-PEG-PDLLA E POLIfD.L. ÁCIDO LÁCTICO! DE BAIXO PESO MOLECULAR A. Preparação de PDLLA-PEG-PDLLA e PDLLA de baixo peso molecular DL-lactídeo foi adquirido na Aldrich. Polietilenoglicol (PEG) com 8000 de peso molecular, octoato de estanho, e ácido DL-láctico foram obtidos na Sigma. Poli-ε-caprolactona com 20000 de peso molecular foi obtido na Birmingham Polymers (Birmingham AL). Paclitaxel foi adquirido na Hauser Chemicals (Boulder, CO). Os padrões de polistireno com uma distribuição estreita de pesos moleculares foram adquiridos na Polysciences (Warrington, PA). O acetonitrilo e o cloreto de metileno foram de graduação HPLC (Fisher Scientific). 72 O copolímero em bloco triplo de PDLLA-PEG-PDLLA foi sintetizado por uma polimenzaçao ae aoemara ae anei. ivionomeros ue uL-mcuucu c rcu cm miciciuco proporções foram misturados e foi adicionado octoato de estanho 0.5 % em peso. A polimerização foi conduzida a 150°C durante 3.5 horas. O PDLLA de baixo peso molecular foi sintetizado através da policondensação de ácido DL-láctico. A reacção foi efectuada em frasco de vidro em condições de suave purga por nitrogénio, agitação mecânica e aquecimento a 180°C por 1.5 horas. O peso molecular de PDLLA foi cerca de 800, medido por titulação dos grupos de ácido carboxílico das extremidades. B. Manufactura das formulações de pasta
Foram misturadas cuidadosamente cargas de paclitaxel de 20% e 30% com copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA ou misturas de PDLLA:PCL 90:10, 80:20 e 70:30 ftmdidas a cerca de 60°C. As pastas carregadas de paclitaxel foram pesadas em seringas de 1 ml e armazenadas a 4°C. C. Caracterização de PDLLA-PEG-PDLLA e das misturas de pasta
Os pesos moleculares e distribuições de copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA foram determinados à temperatura ambiente por GPC usando uma bomba de HPLC Shimadzu LC-10AD e um detector de índice de refracção Shimadzu RID-6A (Kyoto, Japão), acoplados a uma coluna de gel de 104 Â Hewelet Packard PI. A fase móvel foi clorofórmio com um fluxo de 1 ml/minuto. O volume de injecção da amostra foi de 20 μΐ com concentração de polímero de 0.2 % (p/v). Os pesos moleculares dos polímeros foram determinados por utilização de padrões de polistireno. A viscosidade intrínseca de PDLLA-PEG-PDLLA em CHCI3 a 25°C foi medida com um viscosimetro Cannon-Fenske. A análise térmica dos copolímeros foi efectuada por calorimetria de varrimento diferencial (DSC) usando um controlador TA Instruments 2000 e DuPont 910S DSC (Newcastle, Dclaware). A taxa de aquecimento foi de 10°C/min e 0 copolímero e as amostras de matriz paclitaxel/copolímero foram pesadas (3-5 mg) em cadinhos de amostra abertos e frisados de alumínio.
Foi usada ressonância magnética nuclear (RMN) *H para determinar a composição química do polímero. Os espectros de *H RMN de PDLLA-PEG-PDLLA carregado com 73
paclitaxel foram obtidos em CDCI3 usando um instrumento de RMN (Bruker, AC-200E) a p. · 1 λ n/ ZUU iVinz. j\ cuiieciuicivíiu uc puiniiciu ιυι i —a /d. A morfologia da pasta paclitaxel/PDLLA-PEG-PDLLA foi investigada utilizando microscopia de varrimento electrónico (SEM) (Hitachi F-2300). A amostra foi revestida com 60% Au e 40% Pd (10-15 nm de espessura) usando um instrumento Hummer (Technics, USA). D. Libertação de paclitaxel in vitro
Um pequeno pellet de pasta de PDLLA:PCL carregada com paclitaxel 20% (cerca de 2 mg) ou um cilindro (feito por extrusão da pasta fundida através de uma seringa) de 20% de pasta de PDLLA-PEG-PDLLA carregada com paclitaxel 20% foram colocados em tubos de vidro de 14 ml com tampa contendo IO ml de tampão de fosfato salino (pH 7.4) com 0.4 g/L de albumina. O tubo foi incubado a 37°C com agitação rotativa suave. O sobrenadante foi retirado periodicamente para análise de paclitaxel e substituído por tampão PBS/albumina fresco. O sobrenadante (lOml) foi extraído com l ml de cloreto de metileno. A fase aquosa foi decantada e a fase de cloreto de metileno foi seca sob fluxo de nitrogénio a 60°C. O resíduo seco foi reconstituído numa mistura de água:acetonitrilo 40:60 e centrifugado a 10000 g durante cerca de l min. A quantidade de paclitaxel no sobrenadante foi analisada por HPLC. A análise de HPLC foi realizada usando uma bomba HO A e uma coluna C-8 ultrasphere (Beckman), e um detector UV SPD-6A regulado para 232nm, um autoinjector SIL-9A e um integrador C-R3A (Shimadzu). O volume de injecção foi de 20 μΐ e a taxa de fluxo foi de l ml/min. A fase móvel consistiu em acetonitrilo 58%, metanol 5% e água destilada 37%. E. Resultados e Discussão O peso molecular e distribuição de pesos moleculares de PDLLA-PEG-PDLLA, relativa a padrões de polistireno, foram medidos por GPC (Figura 30). A viscosidade intrínseca dos copolímeros em CHCI3 a 25°C foi determinada usando um viscosímetro Canon-Fenske. O peso molecular e viscosidade intrínseca diminuíram com o aumento de conteúdo de PEG. As polidispersões de PDLLA-PEG-PDLLA com conteúdo em PEG de 10% - 40% foram de 2.4 a 3.5. No entanto, o copolímero com 70% de PEG tinha uma distribuição de peso molecular estreita com polidispersão de l.2l. Isto poderá dever-se ao elevado conteúdo de PEG, que reduz a probabilidade de reacções paralelas tais como transesteriflcações, que 74 resultam numa elevada distribuição de pesos moleculares de polímero. Altemativamente, uma « 1 1 1' 1 11.. m!_____1 ______U_______ esiruiura Ciuuiaua UUS UUpUlilllClUd UC U1UWU lilUiUlUUlCV-lUUlUllllWU pi/uc IWOUUOi num ruiui artificialmente baixo de polidispersão. São apresentadas nas figuras 25 e 26 análises de DSC de PEG puro e de copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA. O PEG e PDLLA-PEG-PDLLA com conteúdo de PEG de 70% e 40% mostraram picos endotérmicos com diminuição de entalpia e temperatura à medida que o conteúdo de PEG no copolímero diminuía. Os picos endotérmicos nos copolímeros com 70% e 40% de PEG deveram-se provavelmente a fusão da região PEG, indicando a ocorrência de separação de fases. Enquanto o PEG puro apresentou um pico de fusão agudo, tanto o copolímero com 70% de PEG como com 40% de PEG mostraram picos largos, com um ressalto distinto no caso do PEG a 70%. Os picos de fusão alargados podem ser resultado da interferência do PDLLA com a cristalização do PEG. O ressalto no caso do PEG a 70% pode representar a transição de vidro da região PDLLA. Não ocorreram alterações térmicas nos copolímeros com conteúdo de PEG de 10%, 20% e 30% na gama de temperaturas 10-250°C, indicando a ausência de cristalização significativa (e assim separação de fases).
Os termogramas DSC das misturas PDLLA:PCL (70:30, 80:20, 90:10) sem paclitaxel ou com 20% de paclitaxel apresentaram um pico endotérmico a cerca de 60°C, resultado da fiisão de PCL. Devido à natureza amorfa do PDLLA e ao seu baixo peso molecular (800), a fusão e transição de vidro do PDLLA não foram observadas. Não foram observadas alterações térmicas devidas à recristalização ou fusão do paclitaxel.
Os copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA contendo 20% e 30% de PEG foram seleccionados como materiais de formulação óptimos para a pasta pelas .seguintes razões: PDLLA-PEG-PDLLA contendo 10% de PEG não permitiu fusão à temperatura de cerca de 60°C; Os copolímeros contendo 40% e 70% de PEG derreteram prontamente a 60°C, e os copolímeros contendo 20% e 30% de PEG tomaram-se num líquido viscoso entre 50 e 60°C; e o intumescimento dos copolímeros contendo 40% e 70% de PEG em água foi muito elevado, resultando na rápida dispersão das pastas em água.
Os perfis de libertação in vitro do paclitaxel dos cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA está apresentado na figura 27. O ensaio medindo a libertação de cilindros com 40% de PEG foi descontinuado porque os cilindros tinham um elevado grau de intumescimento (absorção de cerca de 200% de água durante um dia) e desintegraram-se em poucos dias. A fracção libertada de paclitaxel dos cilindros com 30% de PEG aumentou gradualmente ao longo de 70 75 dias. A fracção libertada dos cilindros com 20% de PEG aumentou lentamente até aos 30 dias, e enião aumentou bruscamente, seguinuu-sc uuiiu jjciíuuu de aumcuiu giauua.1. Geuticu unic* diferença significativa na extensão dos aumentos abruptos de libertação de paclitaxel de cada cilindro individualmente (com PEG a 20%). Antes do aumento brusco, a fracção libertada de paclitaxel foi mais baixa para copolímeros de conteúdo inferior de PEG para o mesmo diâmetro de cilindro (lmm). Os cilindros com 40% e 30% de PEG apresentaram taxas de libertação de paclitaxel bastante mais elevadas do que os cilindros com 20% de PEG. Por exemplo, o cilindro com 30% de PEG libertou 17% do paclitaxel em 30 dias, comparado com uma libertação de 2% no cilindro com 20% de PEG. Os cilindros com diâmetros menores resultaram em taxas de libertação mais rápidas (e.g. em 30 dias os cilindros com 30% de PEG com 0.65 mm e 1 mm de diâmetro libertaram 26% e 17% de paclitaxel, respectivamente (Figura 27)).
As observações acima descritas podem ser explicadas pelos mecanismos de libertação do paclitaxel dos cilindros. O paclitaxel encontrava-se disperso no polímero como um cristal, como observado por microscopia óptica. Os cristais começaram a dissolver-se na matriz do copolímero a 170°C e dissolveram-se completamente a 180°C, como observado em termogramas DSC de microscopia de fase quente de pastas de PDLLA-PEG-PDLLA (30% de PEG) carregadas com 20% de paclitaxel, que revelaram uma pequena recristalização exotérmica (16 J/g, 190°C) e fusão endotérmica (6 J/g, 212°C) de paclitaxel (Figura 25), indicando a recristalização do paclitaxel no copolímero fundido após os 180°C. Neste tipo de matriz fármaco/polímero, o paclitaxel podia ser libertado por difusão e/ou erosão de polímero.
No caso de difusão controlada, o fármaco pode ser libertado por difusão molecular no polímero e/ou através de canais abertos formados por partículas ligadas de fármaco. Assim, a 20% de carga, algumas partículas de paclitaxel foram isoladas, e o paclitaxel pode ser libertado por dissolução no copolímero seguida de difusão. Outras partículas de paclitaxel poderão formar aglomerados com ligação à superfície, e ser libertados por difusão por canal. Em ambos os casos, os cilindros com menor dimensão apresentaram libertação do fármaco mais rápida, devido a uma via de difusão mais curta (Figura 27).
As alterações dimensionais e absorção de água pelos cilindros foram registados durante a libertação (Figura 28). As alterações em comprimento, diâmetro e peso líquido dos cilindros com 30% de PEG aumentaram rapidamente para atingirem um máximo em 2 dias, permaneceram inalteradas durante cerca de 15 dias e então diminuíram gradualmente. O 76 diâmetro inicial do cilindro não alterou o comportamento de intumescimento. Para o cilindro com 2(J% de FiiG, o comprimento diminuiu ίύ% num dia e estabiiizou, enquanto o diâincuu e a absorção de água aumentaram gradualmente com o tempo. Devido à existência de mais PEG no copolímero, este absorveu mais água, para facilitar a difusão do paclitaxel, observando-se uma mais rápida libertação (Figura 27). A degradação do peso molecular do copolímero pasta de PDLLA-PEG-PDLLA foi monitorizada por GPC. Para o cilindro com 20% de PEG, o volume de eluição na posição do pico aumentou com o tempo, indicando uma redução do peso molecular do polímero durante o ensaio de libertação (Fig. 30). No dia 69 observou-se uma distribuição bifásica do peso molecular. O peso molecular do polímero dos cilindros com 30% de PEG (lmm e 0.65 mm) também diminuiu. No entanto, não se observou distribuição bifásica.
Os espectros de RMN revelaram um pico do PEG a 3.6 ppm e picos de PDLLA a 1.65 ppm e 5.1 ppm. A área do pico correspondente ao PEG, relativamente ao PDLLA, no copolímero diminuiu significativamente após 69 dias (Figura 29), indicando a dissolução do PEG após a sua dissociação do PDLLA. A perda de massa seca dos cilindros foi também registada (Figura 29), e mostra uma taxa de degradação diminuindo pela ordem: PEG a 30% -0.65 mm > PEG a 30% -1 mm > PEG a 20% -1 mm.
As alterações morfológicas dos cilindros secos antes e durante a libertação de paclitaxel foram observadas, usando SEM (Figura 31). Resumidamente, antes da libertação foram observados cristais de paclitaxel sólido e matrizes de polímero não porosas (Figuras 31A e 31B). Após 69 dias de libertação, não se observaram quaisquer cristais de paclitaxel e as matrizes continham muitos poros devido à degradação do polímero e absorção de água (Figuras 31C e 31D).
Os cilindros com 30% PEG mostraram intumescimento extenso após apenas dois dias em água (Figura 28) e, assim, a dificuldade de difusão do bloco de PEG hidrossolúvel desagregado e do PDLLA degradado (/'. e., oligómeros de ácido DL-láctico) foi reduzida. Porque que a perda de massa e degradação dos cilindros com 30% de PEG foi contínua, a contribuição da libertação por erosão aumentou gradualmente, resultando numa libertação sustida de paclitaxel sem alterações abruptas (Figura 27). Para os cilindros com 20% de PEG, o intumescimento inicial foi baixo (Figura 28) resultando numa baixa difusão dos produtos de degradação. Assim, os produtos de degradação da região interior foram primeiramente retidos, ao mesmo tempo que havia menos produtos de degradação na região externa, devido à mais curta via de difusão. Os produtos de degradação aceleraram a taxa de degradação, já que as extremidades com grupos ácidos carboxíiicos uos uiigúmcrus uaialisoitun as degradações hidrolíticas. Isto resultou numa capa de alto peso molecular e um interior com baixo peso molecular como indicado pela distribuição bifásica do peso molecular do copolímero (Figura 30, dia 69). Como a ruptura da capa estava dependente de factores como a força, espessura e defeitos dos produtos da degradação do interior e da própria capa, o início e extensão da perda de produtos da degradação interior foi muito variável. O ponto temporal para a ruptura de libertação e a extensão da ruptura foram diferentes nas 4 amostras testadas porque a ruptura da capa não foi consistente e o fármaco no polímero não estava microscopicamente homogéneo (Figura 27). A libertação de paclitaxel de misturas de PDLLA-PCL e PCL puro estão apresentadas na figura 32. Resumidamente, a fracção libertada aumentou com o conteúdo de PDLLA na mistura. Por exemplo, em 10 dias, o paclitaxel libertado de PDLLA:PCL 80:20, 70:30 e 0:100 foi 17%, 11% e 6% respectivamente. Após uma ruptura inicial no primeiro dia, obteve-se uma libertação aproximadamente constante para a pasta PDLLA:PCL 80:20. Não foi observado grau de intumescimento significativo durante a libertação. Para as misturas PDLLA:PCL, porque o PDLLA apresentava um peso molecular muito baixo de cerca de 800, foi rapidamente hidrolizado em produtos solúveis em água sem um grande atraso em perda de massa. O PCL serviu como material de sustentação, para impedir a rápida desintegração da pasta. Assim, a taxa de libertação aumentou com o conteúdo de PDLLA na mistura devido à degradação aumentada. A erosão contínua de PDLLA controlou a libertação de paclitaxel, resultando numa libertação constante. A libertação de paclitaxel de PCL puro foi provavelmente controlada por difusão, devido à lenta taxa de degradação do PCL (em 1-2 anos).
Foram encontradas dificuldades no estudo da libertação de pasta de PDLLA:PCL 90:10 carregada com 20% de paclitaxel devido à desintegração do pellet de pasta em 24 horas de incubação. Resumidamente, durante as primeiras 12 horas de incubação foram retiradas amostras a todas as horas para garantir as condições de submersão para libertação de paclitaxel. Em 10 horas foi libertado 25-35% de paclitaxel da pasta com 90:10. A pasta de PDLLA:PCL 90:10 contendo 30% de paclitaxel libertou mais paclitaxel do que a pasta de PDLLA:PCL 90:10 contendo 20% de paclitaxel. Assim, a modulação da taxa de libertação de paclitaxel, que foi regulada pelas propriedades do polímero e agentes 78 quimioterapêuticos, tal como pelo local de administração, foi importante para o desenvoivimenio da ierapia iuual. EXEMPLO 21
PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES POLIMÉRICAS CONTENDO ADITIVOS SOLÚVEIS EM
ÁGUA E PACLITAXEL A. Preparação de composições poliméricas
Foram preparadas micropartícuias de co-precipitados de paclitaxel/aditivo e subsequentemente adicionadas ao PCL par formar pastas. Resumidamente, foi dissolvido paclitaxel (100 mg) em 0.5 ml de etanol (95%) e misturado com o aditivo (100 mg) previamente dissolvido ou disperso em 1.0 ml de água destilada. A mistura foi triturada até se formar uma pasta suave. A pasta foi espalhada numa placa de Petri e seca ao ar durante a noite, a 37°C. A massa seca foi pulverizada usando um almofariz e um pilão e peneirada com crivo de #140 (106 pm) (Endecotts Test Sieves Ltd, London, England). As micropartículas (40%) foram incorporadas no PCL (60%) fundido a 65°C, correspondendo a uma carga de 20% de paclitaxel. Os aditivos usados no estudo foram gelatina (Tipo B, 100 bloom, Fisher scientific), metilcelulose, (British Drug Houses), dextrano, T500 (Pharmacia, Sweden), albumina (Fisher scientific), e cloreto de sódio (Fisher scientific). As micropartículas de paclitaxel e gelatina ou albumina foram preparadas como descrito anteriormente, mas foram peneiradas com crivo de #60 (270 pm) (Endecotts Test Sieves Ltd, London, England) para avaliar o efeito do tamanho das micropartículas na libertação de paclitaxel da pasta. As pastas foram também preparadas para conter 10, 20 ou 30% de gelatina e 20% de paclitaxel em PCL para estudar o efeito da proporção do aditivo na libertação do fármaco. A menos que especificado de outro modo, as pastas contendo 20% de paclitaxel disperso em PCL foram preparadas para servir como controlo dos estudos de taxa de libertação. B. Estudos de libertação de fármaco
Um pellet de pasta carregada com paclitaxel com aproximadamente 2.5 mg foi suspenso em 50 ml de PBS 10 mM (pH 7.4) em tubos com tampa de rosca. Os tubos foram tombados em posição invertida a 37°C e a intervalos dados foram removidos 49.5 ml de sobrenadante, filtrado num filtro de membrana com 0.45 pm e retidos para análise de 79 paclitaxel. Um volume igual de PBS foi reposto em cada tubo para manter as condições de submersão durante υ esiuuo. Fara a anáiisc, os íiiirados foram extraídos com 3 x i mi de diclorometano (DCM), os extractos de DCM foram evaporados até à secura sob um fluxo de nitrogénio e redissolvidos em 1 ml de acetonitrilo. A análise foi feita por HPLC usando uma fase móvel de água:metanol:acetonitrilo (35:5:58) com um fluxo de 1 ml/minuto (Beckman Isocratic Pump), uma coluna de fase reversa Cl8 (Beckman) e detecção UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm. C. Estudos de intumescimento
As pastas de paclitaxel/aditivo/PCL, preparadas usando micropartículas de paclitaxel/aditivo, peneiradas a #140 (e #60 só no caso da gelatina), foram extrudidas para formar cilindros, cortaram-se pedaços, e mediu-se o peso, diâmetro e comprimento de cada pedaço usando um micrómetro (Mitutoyo Digimatic). Os pedaços foram suspensos em água destilada (10 ml) a 37°C e a intervalos pré-determinados a água foi retirada, foram medidos o diâmetro e comprimento dos pedaços cilíndricos e as amostras foram pesadas. A morfologia das amostras (antes e depois da suspensão em água) foi examinada usando um microscópio de varrimento electrónico (SEM) (Hitachi F-2300). As amostras foram cobertas com 60% Au e 40% Pd (espessura 10-15 nm) usando um Hummer Instrument (Technics, USA). D. Estudos de membrana corioalantóide ÍCAM) de embriões de pinto
Foram incubados embriões de pinto doméstico fertilizados durante 4 dias antes da cultura sem casca. O conteúdo dos ovos foi incubado com humidade relativa de 90% e 3% de CO2 e ao dia 6 de incubação foram colocados directamente na superfície da CAM fragmentos de 1 mg de pasta carregada com paclitaxel (contendo 6% de paclitaxel, 24% de gelatina e 70% de PCL) ou controlos (30% de gelatina em PCL). Após 2 dias de exposição a vasculatura foi examinada usando um estereomicroscópio em interface com uma câmara de vídeo; os sinais de vídeo foram então visualizados num computador e impressos por vídeo. E. Resultados e discussão
As micropartículas de co-precipitado de paclitaxel e gelatina ou albumina eram duras e quebradiças e foram prontamente incorporadas em PCL, enquanto que os outros aditivos 80 produziram partículas suaves que apresentaram tendência para se fragmentarem durante a
A Figura 33 mostra a libertação de paclitaxel das pastas contendo 20% de paclitaxel em PCL ou 20% de paclitaxel, 20% de aditivo e 60% de PCL, ao longo do tempo. A libertação de paclitaxel do PCL com ou sem aditivos seguiu um padrão bifásico: inicialmente, houve uma libertação mais rápida de fármaco, seguida de uma libertação mais lenta de fármaco. O período inicial de libertação mais rápida de paclitaxel das pastas pensou-se ser devido à dissolução do paclitaxel localizado na superfície, ou difusão do paclitaxel das regiões superficiais da pasta. A fase subsequente de perfil de libertação mais lento pode ser
atribuído a uma diminuição da área de superfície efectiva das partículas de fármaco em contacto com o tampão, uma lenta entrada do tampão na matriz polimérica ou um aumento médio das vias de difusão do fármaco através da matriz polimérica.
Ambas as fases dos perfis da libertação do paclitaxel do PCL aumentaram com a presença de aditivos hidrofílicos, tendo a gelatina, albumina e metilcelulose produzido os aumentos de taxa de libertação de fármaco mais elevados (Figura 33). Houve maior aumento na libertação de paclitaxel da matriz do polímero quando se usaram partículas de aditivo de maior dimensão (270 pm) para preparar a pasta, comparado com quando se usaram partículas de aditivo de paclitaxel mais pequenas (106 pm) (Figura 34). O aumento da quantidade de aditivo (e. g. gelatina) produziu um aumento correspondente na libertação de fármaco (Figura 34). A Figura 35A mostra o comportamento de intumescimento das pastas contendo 20% de paclitaxel, 20% de aditivo e 60% de PCL. A taxa de intumescimento seguiu a ordem: gelatina > albumina > metilcelulose > dextrano > cloreto de sódio. Adicionalmente, a taxa de intumescimento aumentou quando se adicionou à pasta uma proporção mais elevada de polímero hidrosolúvel (Figura 35B). As pastas contendo gelatina ou albumina incharam rapidamente nas primeiras 8-10 horas, e subsequentemente a taxa de intumescimento diminuiu quando a alteração no volume da amostra foi superior a 40%. A pasta preparada usando partículas de paclitaxel-gelatina maiores (270 pm) intumesceram a uma taxa mais rápida do que as preparadas com partículas de paclitaxel-gelatina menores (106 pm). Todas as pastas se desintegraram quando o volume aumentou mais que 50%. Os estudos de SEM mostraram que o intumescimento das pastas foi acompanhado de quebras da matriz (Figura 36). A ampliações mais altas, (Figuras 36C e 36D), após intumescimento, havia evidência de 81
cristais de paclitaxel em forma de agulha ou bastonete na superfície da pasta em associação
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Agentes hidrofílicos, osmóticos ou intumescentes, embebidos como partículas discretas no polímero hidrófobo, resultaram em libertação do fármaco através da acção combinada de erosão da matriz, difusão do fármaco através da matriz do polímero, e/ou difusão e/ou fluxo convexo através de poros criados na matriz pela dissolução dos aditivos hidrossolúveis. Os agentes osmóticos e polímeros intumescíveis dispersos num polímero hidrofóbico absorveriam água (actuando como agentes retentores de água), dissolver-se-iam ou inchariam, exercendo uma pressão de turgência que poderia causar rupturas no septo (cobertura do polímero) entre partículas adjacentes, criando microcanais e, assim, facilitando a saída de moléculas de fármaco para o meio envolvente, por difusão ou fluxo convexo. O intumescimento e quebras da matriz da pasta (Figura 36) resultaria provavelmente na formação de microcanais através do interior da matriz. As diferentes taxas e extensão de intumescimento dos polímeros (Figura 35) podem contribuir para as diferenças nas taxas de libertação de paclitaxel observadas (Figuras 33 e 34). A figura 37 mostra CAMs tratadas com pasta de controlo de gelatina-PCL (Figura 37A) e pasta com 20% de paclitaxel-gelatina-PCL (Figura 37B). A pasta na superfície das CAMs são indicadas pelas setas nas figuras. As CAMs com pasta de controlo mostram uma arquitectura de rede de capilares normal. As CAMs tratadas com a pasta de paclitaxel-PCL mostraram consistentemente regressão vascular e zonas com ausência de rede capilar. A incorporação de aditivos na pasta aumentou marcadamente o diâmetro da zona avascular (Figura 37).
Este estudo mostrou que a libertação in vitro de paclitaxel do PCL podia ser aumentada por incorporação de micropartículas de paclitaxel/polímeros hidrofílicos na matriz de PCL. Estudos in vivo avaliando a eficácia da formulação no tratamento de tumores subcutâneos em ratos mostraram também que a pasta de paclitaxel/gelatina/PCL reduziu significativamente a massa tumoral. Factores como tipo o de agente hidrossolúvel, tamanho das micropartículas e proporção de aditivos mostraram ter influência nas características de libertação do fármaco. 82 EXEMPLO 22 ΓΚΙ,Α^Ε,υΐΐνίΕ,ΙΝ IU ΓΛΚΛ rr^UU/LllV lNAlNUr/\a l/\ A nanopasta é um suspensão de microsferas num gel hidrofílico. Num aspecto da invenção, o gel ou pasta podem se untados no tecido, como método de colocar microsferas carregadas com fármaco perto do tecido alvo. Sendo à base de água, a pasta rapidamente se dilui nos fluidos corporais causando uma diminuição na espessura da pasta e as microsferas tendem a depositar-se no tecido próximo. Um conjunto de fármaco encapsulado em microsfera é assim colocado próximo do tecido alvo.
Os reagentes e equipamento utilizados neste ensaio incluíram provetas de vidro, Carbopol 925 (pharmaceutical grade, Goodyear Chemical Co.), água destilada, hidróxido de sódio (1 M) em solução aquosa, solução de hidróxido de sódio (5 M) em solução aquosa, microsferas com gama de tamanho de 0.1 lm a 3 lm suspensas em água a 20% p/v (ver anteriormente).
1. PREPARAÇÃO DE CARBOPOL GEL 5% P/V
Foi adicionada uma quantidade suficiente de carbopol a hidróxido de sódio 1 M para obter uma solução a 5% p/v. Para dissolver o carbopol em hidróxido de sódio 1 M, a mistura foi deixada em repouso durante aproximadamente uma hora. Durante este período de tempo, a mistura foi agitada e, após uma hora, o pH foi ajustado a 7.4 usando hidróxido de sódio 5 M, até o carbopol estar totalmente dissolvido. Quando o pH 7.4 foi atingido, o gel foi coberto e deixado em repouso durante 2 a 3 horas.
2. PROCEDIMENTO DE PRODUÇÃO DE NANOPASTA
Foi adicionada uma quantidade suficiente de microsferas com 0.1 pm a 3 pm a água para produzir uma suspensão de microsferas a 20%. Colocou-se gel de carbopol (8 ml de 5% p/v) numa proveta de vidro e adicionou-se 2 ml da suspensão de microsferas a 20%. A mistura foi agitada para dispersar cuidadosamente as microsferas no gel. Esta mistura foi armazenada a 4°C. 83
EXEMPLO 23 ^OIvirLnXACAG uE r ACLI i AXr.I, CGIví CICLODEX i rvI7\ÁS A. Materiais O paclitaxel foi obtido na Hauser Chemicals Inc (Boulder, Colorado). O fosfato de dissódio (Fisher), ácido cítrico (British Drug Houses), hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPpCD), γ-ciclodextrina (γ-CD) e hidroxipropil-y-ciclodextrina (HPyCD) foram obtidos da American Maize-Products Company (Hammond, Indiana) e foram usados tal como recebidos. B. 1. Métodos
ESTUDOS DE SOLUBILIDADE
Foram adicionadas quantidades excessivas de paclitaxel (5mg) a soluções aquosas contendo várias concentrações de γ-CD, ΗΡγ-CD e ΗΡβ-CD e agitadas suavemente durante cerca de 24 horas a 37°C. Após equilíbrio, foram filtradas alíquotas da suspensão com um filtro de membrana de 0.45 pm (Milipore), diluídas adequadamente e analisadas usando HPLC. A fase móvel era composta por uma mistura de acetonitrilo, metanol e água (58:5:37) a um fluxo de 1.0 ml/minuto. Foi também investigada a solubilidade de paclitaxel num solvente composto de água e etanol (95%) 50:50 contendo várias concentrações, até 10%, de ΗΡβ-CD. Adicionalmente, foram investigados os perfis de taxa de dissolução de paclitaxel adicionando 2 mg de paclitaxel (tal como recebido) a soluções de 0, 5, 10 ou 20 % de HPyCD ou 2 mg de paclitaxel previamente hidratado (por suspensão em água durante 7 dias) em água pura e agitando suavemente a 37°C. Fora retiradas alíquotas a vários intervalos de tempo e analisadas para o paclitaxel.
2. ESTUDOS DE ESTABILIDADE
As soluções contendo 20% de HPpCD ou HPyCD tinham valores de pH de 3.9 e 5.2, respectivamente. A estabilidade de paclitaxel em soluções de ciclodextrina foi investigada, através de ensaios de paclitaxel em soluções (20 pg/ml) contendo 10 ou 20 % de HPyCD ou ΗΡβ-CD em água ou mistura de água-etanol 50:50, a 37°C ou 55°C a vários intervalos de tempo. Adicionalmente determinou-se a estabilidade de paclitaxel em soluções (1 pg/ml) contendo 1%, 2% ou 5% de FD^CD a 55°C. i 84 C. Resultados
Ϊ. ESTUDOS DE SOLUBILIDADE A solubilidade de paclitaxel aumentou ao longo de toda a gama de concentrações de CD estudadas; o ΗΡβ-CD produziu o maior aumento de solubilidade de paclitaxel (Figura 38). A forma das curvas de solubilidade sugere que as estequiometrias foram de ordem superior a complexos de 1:1. O paclitaxel formou curvas do Tipo Ap quer com ΗΡβ-CD como com ΗΡγ-CD, e curvas do Tipo An com γ-CD. A solubilidade de paclitaxel em soluções a 50% de ΗΡβ-CD em água foi de 3.2 mg/ml a 37°C, o que constituiu um aumento de 2000-vezes da solubilidade de paclitaxel em água. As constantes de estabilidade estimadas (da Figura 39) para complexos de primeira ordem de paclitaxel-ciclodextrinas foram de 3.1, 5.8 e 7.2 M'1 para γ-CD, ΗΡγ-CD e ΗΡβ-CD e para complexos de segunda ordem foram de 0.785 x 103, 1.886 x 103 e 7.965 x 103 M'1 para γ-CD, ΗΡγ-CD e ΗΡβ-CD, respectivamente. Os valores de constantes de estabilidade observados sugerem que a inclusão de complexos formados por paclitaxel com ciclodextrinas foram predominantemente complexos de segunda ordem. A solubilidade de paclitaxel em misturas águaretanol 50:50 aumentou com o aumento da concentração de ciclodextrinas (Figura 40) como observado para complexações em água pura. A constante de estabilidade aparente para a complexação de paclitaxel e ΗΡβ-CD na presença de 50% de etanol (26.57 M'1) foi significativamente mais baixa (cerca de 300 vezes) que a constante de estabilidade na ausência de etanol. A constante de estabilidade mais baixa pode ser atribuída a alterações na constante dieléctrica ou na polaridade do solvente na presença de etanol.
Os perfis de dissolução do paclitaxel em soluções de γ-CD a 0, 5, 10 e 20% (Figura 41) ilustram a formação de soluções de paclitaxel metaestáveis em água pura ou nas soluções de ciclodextrina; a quantidade de paclitaxel em solução aumentou gradualmente, atingindo um máximo, e decresceu subsequentemente. Estudos de dissolução usando amostras de paclitaxel que foram previamente hidratadas por suspensão em água durante 48 horas não mostraram formação de soluções metaestáveis. Adicionalmente, análises de DSC do paclitaxel hidratado (seco em estufa de vácuo à temperatura ambiente) mostraram dois largos picos endotérmicos entre 60 e 110°C. Estes picos foram acompanhados por perdas de massa 85 de cerca de 4.5% (determinada por análise termogravimétrica) indicando a presença de hidrato(s). Uma perda de massa de cerca de 2.1% sugeriria a íormaçào de um mononidraio dc paclitaxel. Assim, a ocorrência de picos de DSC entre 60°C e 110°C e a perda de massa de cerca de 4.5% sugerem a presença de um dihidrato. Não houve evidência de pico(s) endotérmico(s) entre 60°C e 110°C (resultados de DSC) ou perda de peso (resultados de TGA) nas amostras de paclitaxel tal como recebidas. Assim, o paclitaxel (tal como recebido) estava anidro e à suspensão com água dissolveu-se para formar uma solução supersaturada que recristalizou como um hidrato de mais baixa solubilidade (Figura 41).
2. ESTUDOS DE ESTABILIDADE A degradação de paclitaxel foi dependente da concentração de ciclodextrinas e seguiu uma cinética de degradação de pseudo primeira ordem (e. g. Figura 42). A taxa de degradação de paclitaxel em soluções (1 pg/ml de paclitaxel) contendo 1% de ΗΡβ-CD a 55°C foi mais rápida (k=3.38 x 10'3 h*1) do que a taxa às concentrações mais altas de ciclodextrina. Foram
Λ 1 Λ I observadas constantes de taxa de degradação de 1.78 x 10‘ h‘ e 0.96 x 10 h‘ para paclitaxel em 10% de ΗΡβ-CD e ΗΡγ-CD, respectivamente. As soluções de paclitaxel (1 pg/ml) contendo 2, 4, 6 ou 8% de ΗΡβ-CD não apresentaram diferenças significativas nas taxas de degradação das obtidas com soluções de ΗΡβ-CD a 10 ou 20% (20 pg/ml). A presença de etanol não afectou adversamente a estabilidade de paclitaxel nas soluções de ciclodextrina. D. Conclusão
Este estudo mostrou que a solubilidade de paclitaxel podia ser aumentada por complexação com ciclodextrinas. Estas formulações de ciclodextrina de base aquosa podem ser utilizadas no tratamento de várias doenças inflamatórias. EXEMPLO 24
COMPOSIÇÕES POLIMÉRICAS COM CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE PACLITAXEL PDLLA-MePEG e PDLLA-PEG-PDLLA são copolímeros de bloco com regiões hidrófobas (PDLLA) e hidrofílicas (PEG ou MePEG). A pesos moleculares e composições químicas apropriadas, podem formar pequenos agregados com núcleo hidrófobo PDLLA e .1 capa hidrofílica (MePEG). O paclitaxel pode ser incorporado no núcleo hidrófobo, conferindo-se assim uma “solubilidade" acrescida ao pacíitaxeí. A. Materiais O D,L-lactídeo foi adquirido na Aldrich, o octoato de estanho, polietilenoglicol (peso mol. 8000), MePEG (peso mol. 2000 e 5000) eram da Sigma. O MePEG (peso mol. 750) foi da Union Carbide. Os copolímeros foram sintetizados por um procedimento de polimerização de abertura de anel, usando octoato de estanho como catalisador (Deng et al. J. Polym. Lett. 28\ 411-416,1990; Cohn et al. J. Biomed. Mater. Res. 22·, 993 - 1009,1988).
Para a síntese do PDLLA-MePEG, foi colocado numa ampola de vidro de 10 ml uma mistura de DL-Lactídeo/MePEG/octoato de estanho. A ampola foi ligada ao vácuo e selada com chama. A polimerização foi conseguida por incubação da ampola a 150°C em banho de óleo por 3 horas. Para a síntese de PDLLA-PEG-PDLLA, foi transferida para um frasco de vidro uma mistura de DL-Lactídeo/PEG/octoato de estanho, que foi selado com rolha de borracha e aquecido por 3 horas num fomo a 150°C. As composições iniciais dos copolímeros são dadas nas Tabelas 1 e 2. Em todos os casos, a quantidade de octoato de estanho foi de 0.5% - 0.7%. B. Métodos
Os polímeros foram dissolvidos em acetonitrilo e centrifugados a 10000 g durante 5 minutos para eliminar impurezas não dissolvidas. A solução de acetonitrilo de paclitaxel foi então adicionada a cada solução de polímero para dar origem a uma solução com paclitaxel (paclitaxel + polímero) a 10% em peso. O solvente acetonitrilo foi então removido para se obter uma matriz limpa de paclitaxel/PDLLA-MePEG, sob fluxo de nitrogénio e aquecimento a 60°C. Foi adicionada água destilada, solução salina NaCl 0.9% ou dextrose a 5% numa proporção de quatro vezes o peso da matriz. A matriz foi finalmente dissolvida com a ajuda de um misturador de vortex e aquecimento periódico a 60°C. Foram obtidas em todos os casos soluções límpidas. As dimensões das partículas eram todas inferiores a 50 nm, como determinado por um dimensionador de partículas submicron (NICOMP Model 270). As formulações são fornecidas na Tabela 1. 87
Tabela 1. Formulações de Paclitaxel/PDLLA-MePEG* PDLLA-MePEG Meio de dissolução Carga de Paclitaxel (concentrado final de paclitaxel) 2000/50/50 água 10%(20mg/ml) 2000/40/60 água 10% (20 mg/ml) 2000/50/50 solução salina 0.9% 5% (10 mg/ml) 2000/50/50 solução salina 0.9% 10% (20 mg/ml) 2000/50/50 dextrose 5% 10% (10 mg/ml) 2000/50/50 dextrose 5% 10% (20 mg/ml)
No caso do PDLLA-PEG-PDLLA (Tabela 2), porque os copolímeros não se dissolvem em água, o paclitaxel e o polímero foram co-dissolvidos em acetona. Adicionou-se gradualmente água ou uma mistura de água/acetona a esta solução de polímero/paclitaxel, para induzir a formação de esferas de polímero/paclitaxel.
Tabela 2. Composição de PDLLA-PEG-PDLLA
Nome do coDOlímero Peso de PEG ίεΊ Peso de DL-Lactídeo ícl PDLLA-PEG-PDLLA 90/10 1 9 PDLLA-PEG-PDLLA 80/20 2 8 PDLLA-PEG-PDLLA 70/30 3 7 PDLLA-PEG-PDLLA 60/40 4 6 PDLLA-PEG-PDLLA 30/70 14 6 • peso molecular de PEG. 8000. 88 c.
Resultados
Muitas das formulações PDLLA-MePEG tormam soluções iimpidas em água, soiução salina 0.9% ou 5% dextrose. Indicando a formação de pequenos agregados na gama dos nanómetros. As micelas de PDLLA-MePEG forma carregadas com paclitaxel com sucesso. Por exemplo, à carga de 5% (que representa 10 mg de paclitaxel em 1 ml de paclitaxel/ PDLLA-MePEG/ sistema aquoso), obteve-se uma solução límpida com 2000/50/50 e 2000/40/60. O tamanho das partículas foi de cerca de 60 nm. EXEMPLO 25 PROCEDIMENTO DE PRODUÇÃO DE FILME O termo filme refere-se a polímeros formados numa de muitas formas geométricas. O filme pode ser uma folha fina elástica de polímero, ou um disco de polímero de 2 mm de espessura, podendo qualquer um ser aplicado na superfície do tecido para prevenir formação posterior de cicatrizes ou aderências. Este filme foi concebido para ser colocado em tecido exposto, para que qualquer fármaco encapsulado possa ser libertado do polímero durante um longo período de tempo, no local do tecido. Os filmes podem ser feitos por diversos processos, incluindo, por exemplo, por moldes, ou por vaporização.
Na técnica de moldes, o polímero foi fundido e colocado numa forma ou dissolvido em diclorometano e colocado numa forma. O polímero ou solidificou por arrefecimento, ou então solidificou à medida que o solvente evaporou, respectivamenté. Na técnica de vaporização, o polímero foi dissolvido em solvente e vaporizado num vidro. A medida que o solvente foi evaporando, o polímero solidificou no vidro. Vaporizações repetidas permitiram a constituição de um polímero num filme com a possibilidade de ser separado do vidro.
Os reagentes e equipamento que foram utilizados nestas experiências incluíram uma pequena proveta, um agitador mecânico de placa quente Corning, moldes de fundição (e. g. tampas de tubo de centrífuga de 50 ml) e estrutura para suporte dos moldes, frascos de cintilação de vidro de 20 ml com tampa (com inserção de plástico), atomizador TLC, depósito de gás nitrogénio, policaprolactona (“PCL” - peso mol. 10000 a 20000; Polysciences), paclitaxel (Sigma 95% de pureza), etanol, acetato de etilenovinilo (“EVA”) “lavado” (ver anteriormente), ácido poli(DL)láctico (“PLA” - peso mol. 15000 a 25000; Polysciences), DCM (HPLC grade; Fisher Scientific). 89
1 PROCEDIMENTO PARA PRODUZIR FILMES -MODELAGEM POR FUSÃO
Foi colocada uma pequena proveta de vidro com peso conhecido de FCL numa proveta maior contendo água (para servir como banho de água) e colocado numa placa quente a 70°C até o polímero estar totalmente fundido. Um peso determinado de fármaco foi adicionado ao polímero fundido e a mistura agitada cuidadosamente. O polímero fundido foi colocado no molde e deixado a arrefecer. 2 PROCEDIMENTO PARA PRODUZIR FILMES -MODELAGEM POR SOLVENTE Um peso conhecido de PCL foi pesado directamente em frascos de cintilação de vidro de 20 ml adicionou-se volume suficiente de DCM para obter uma solução a 10% p/v. A solução foi misturada, seguindo-se a adição de paclitaxel suficiente para conseguir a concentração final de paclitaxel desejada. A solução foi agitada num vortex para dissolver o paclitaxel, deixada em repouso durante uma hora (para diminuir a presença de bolhas de ar) e depositada suavemente num molde. O molde foi colocado numa hotte com exaustão durante uma noite, permitindo a evaporação do DCM.
3 PROCEDIMENTO PARA PRODUZIR FILMES - VAPORIZAÇÃO
Uma quantidade suficiente de polímero foi pesada directamente em frascos de cintilação de vidro de 20 ml adicionou-se volume suficiente de DCM para obter uma solução a 2% p/v. A solução foi misturada para dissolver o polímero. Usando uma pipeta automática, foi transferido um volume adequado (5 ml no mínimo) da solução de polímero a 2% para outro frasco decintilação de vidro de 20 ml. Adicionou-se à solução paclitaxel suficiente e dissolveu-se agitando o frasco com tampa. Para preparar a vaporização, a tampa do frasco foi removida e o tubo do atomizador de TLC mergulhado na solução de polímero. O depósito de nitrogénio foi ligado à entrada de gás do atomizador e a pressão aumentou gradualmente até se iniciar a atomização e a vaporização. Os moldes foram vaporizados usando 5 segundos de vaporização alternada com tempos de secagem de 15 segundos entre vaporizações. Continuou-se com a vaporização até estar depositada no molde uma espessura de polímero adequada. 90 EXEMPLO 26
HLMbS ^υίΛΜί,Κΐυυ» tAKKbUfluua ιϋϊνί AGc-N i c, icRAFEUTICO COIvirGSiG FGR ACETATO DE ETILENOVINIL E SURFACTANTE
Dentro deste exemplo foram investigados dois tipos de filmes: filmes de EVA puros carregados com paclitaxel e filmes de misturas de EVA/surfactante carregados com paclitaxel.
Os surfactantes em estudo são dois surfactantes hidrofóbicos (Span 80 e Pluronic L101) e um surfactante hidrofílico (Pluronic F127). Os surfactantes plurónicos são eles próprios polímeros que apresentam uma propriedade atractiva já que podem ser misturados com EVA para optimizar várias propriedades de libertação de fármaco. O span 80 é uma molécula mais pequena que se dispersa na matriz polimérica e não se mistura.
Os surfactantes foram úteis na modulação das taxas de libertação do paclitaxel dos filmes e na optimização de certos parâmetros físicos dos filmes. Um aspecto dos filmes de misturas com surfactantes que indicou que as taxas de libertação de fármaco podem ser controladas foi a capacidade de variação da taxa e da extensão de intumescimento dos compostos em água. A difusão da água na matriz polímero-fármaco foi crítica para a libertação do fármaco do transportador. As figuras 43C e 43D mostram o grau de intumescimento dos filmes à medida que os níveis de surfactante na mistura foram alterados. Os filmes de EVA puros não mostraram extensão de intumescimento significativa em 2 meses. No entanto, ao aumentar o nível de surfactante adicionado ao EVA, foi possível aumentar o grau de intumescimento do composto, e por aumentar a hidrofilicidade, o intumescimento aumentou.
Os resultados de ensaios com estes filmes estão apresentados abaixo nas figuras 43 A-E. Resumidamente, a figura 43 A mostra a libertação de paclitaxel (em mg) ao longo do tempo de filmes de EVA puros. A figura 43B mostra a percentagem de fármaco remanescente nos mesmos filmes. Como pode ser visto nestas duas figuras, à medida que a carga de paclitaxel aumenta (i.e., aumenta a percentagem de paclitaxel por peso) os níveis de libertação de fármaco aumentam, mostrando a esperada dependência da concentração. A medida que aumenta a carga de paclitaxel, a percentagem de paclitaxel remanescente no filme também aumenta, indicando que uma carga superior pode ser atractiva para formulações de libertação de longa duração. 91 A força física e elasticidade dos filmes foi determinada e está apresentada na figura 43E. Kesumidamente, a figura 43E mostra curvas de rensão/esforço para íiimes de EVA puros e de misturas de EVA/surfactante. Esta medição grosseira de tensão demonstrou que a elasticidade dos filmes aumentava com a adição de Pluronic F127, e que a força de esforço (tensão de quebra) aumentava de uma forma dependente da concentração, com a adição de Pluronic F127. A elasticidade e a força são considerações importantes na concepção de um filme, que tem que ser manipulado para aplicações clínicas particulares sem causar deformações permanentes do composto.
Os dados acima demonstram a capacidade de certos aditivos surfactantes de controlarem as taxas de libertação de fármaco e de alterarem as características físicas do veículo. EXEMPLO 27 PROCEDIMENTO PARA PRODUZIR NANOSPRAY Nanospray é uma suspensão de pequenas microsferas em solução salina. Se as microsferas forem muito pequenas, (/. e. inferiores a 1 pm de diâmetro) formam um coloide de tal forma que a suspensão não sedimenta sob a gravidade. Como descrito em maior pormenor abaixo, uma suspensão de micropartículas de 0.1 pm a 1 pm podem ser criadas de forma adequada para deposição por aerossóis directamente num tecido durante cirurgia (e. g., para adesão vascular), via intervenção laparoscópica, ou através de um aerossol de bomba digital (e. g., para ser dispensado topicamente). Os equipamentos e materiais usados para produção de nanospray incluem proveta de 200 ml com camisa de arrefecimento de água (Kimax ou Pyrex), banho de água circulante Haake, agitador de topo e controlador com diâmetro de 2 polegadas (4 lâminas, agitador com o aço inoxidável de tipo propulsor; marca Fisher), proveta de vidro de 500 ml, placa de agitação/aquecimento (marca Corning), tubos de centrífuga de polipropileno de 4 x 50 ml (Nalgene), frascos de cintilação de vidro com tampas de inserção de plástico, centrífuga de bancada (Beckman), centrífuga de alta velocidade -modelo de chão (JS 21 Beckman), balança analítica Mettler (AJ 100, 0.1 mg) balança digital de carregamente de topo Mettler (AE 163, 0.01 mg), pipetador automático (Gilson), pontas de pipeta estéreis, aerossol de bomba (Pfeiffer pharmaceuticals) de 20 ml, câmara de fluxo laminar, PCL (peso mol. 10000 a 20000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania, USA), EVA “lavado” (ver anteriormente), PLA (peso mol. 15000 a 25000; polysciences), álcool de 92 polivinilo (“PVA” - peso mol. 124000 a 186000; 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co., Ivíiiwaukee, WI USA), DCiví uu cluiciu uc uiciilciiu, (KFLC grauc Fisiier Seiciiiiíic), água destilada, solução salina estéril (Becton e Dickenson, ou equivalente). 1 PREPARAÇAO DE SOLUÇÕES DE POLÍMERO A 5% (P/V)
Dependendo da solução de polímero a preparar, os compostos seguintes foram pesados directamente em frascos de cintilação de vidro de 20 ml: 1.00 g de PCL ou PLA ou 0.50 g cada de PLA e EVA lavado. Usando um cilindro de medição, adicionaram-se 20 ml de DCM e o tubo foi hermeticamente tapado. O tubo foi deixado em repouso à temperatura ambiente (25°C) até à dissolução do polímero. 2 PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO STOCK DE PVA A 3.5% (P/V) A solução foi preparada seguindo o procedimento dado em seguida, ou por dissolução de solução stock 5% (p/v) de PVA preparada para produzir microsferas (ver Exemplo 28). Resumidamente, pesou-se 17.5 g de PVA directamente para uma proveta de 600 ml e adicionou-se 500 ml de água destilada. A proveta foi tapada e colocada numa proveta de vidro de 2000 ml contendo 300 ml de água. O PVA foi agitado a 300 rpm a 85°C até à dissolução completa.
3 PROCEDIMENTO PARA PRODUZIR NANOSPRAY
Resumidamente, foram colocados 100 ml de solução de PVA 3.5% na proveta de 200 ml com camisa de arrefecimento de água ligada a um banho de água Haake. Os conteúdos da proveta foram agitados a 3000 rpm e 10 ml da solução de polímero (solução de polímero usada com base no tipo de nanospray a ser produzido) foi submersa no PVA em agitação durante um período de 2 minutos usando um pipetador automático de 5 ml. 3 minutos depois, a velocidade de agitação foi ajustada a 2500 rpm (+/- 200 rpm) durante 2.5 horas. Após 2.5 horas, a lâmina de agitação foi removida da preparação de nanospray e lavada com 10 ml de água destilada, permitindo que a solução de lavagem entrasse na preparação de nanospray. A preparação de microsfera foi colocada numa proveta de 500 ml. O banho de água coberto foi lavado com 70 ml de água destilada deixando a solução de lavagem de 70 ml entrar na preparação de microsferas. Os 180 ml de preparação de microsferas foram agitados com uma vareta de vidro, e distribuídos igualmente por quatro tubos de centrífuga de 93 polipropileno de 50 ml, que foram centrifugados a 10000 g (+/- 1000 g) durante 10 minutos.
Λ suiuyau uc r va iui icuiaua uc taua penei uc iiuuuaiçiâd c ucdpiczaua. nuiuOiiuwãc agiiâ destilada (5 ml) a cada tubo e agitou-se no vortex. As quatro suspensões de microsferas foram reunidas num tubo de centrífuga usando 20 ml de água destilada e centrifugados a 10 000 g (+/- 1000 g) durante 10 minutos. O sobrenadante foi retirados do pellet de microsferas e adicionaram-se 40 ml de água destilada, sendo a preparação agitada no vortex (este processo foi repetido 3x). A preparação de microsferas foi então transferida para um frasco de cintilação de vidro previamente pesado.
O frasco foi deixado em repouso durante 1 hora à temperatura ambiente (25°C) para permitir a sedimentação por acção da gravidade das microsferas com diâmetro de 2 pm e 3 pm. Após 1 hora, os 9 ml do topo da suspensão foram retirados, colocados num tubo de centrífuga estéril de 50 ml com tampa, e centrifugados a 10000 g (+/- 1000 g) durante 10 min. O sobredante foi desprezado e o pellet ressuspendido em solução salina estéril, centrifugando a suspensão a 10000 g (+/- 1000 g) durante 10 min. O sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido em solução salina estéril. A quantidade de solução salina usada dependeu da concentração final de suspensão requerida (usualmente 10% p/v). A suspensão de nanospray foi adicionada ao aerossol. EXEMPLO 28
MANUFACTURA DE MICROSFERAS
Os equipamentos usados para produção de microsferas incluem: proveta de 200 ml com camisa de arrefecimento de água (Kimax ou Pyrex), banho de água circulante Haake, agitador de topo e controlador com diâmetro de 2 polegadas (4 lâminas, agitador com o aço inoxidável do tipo propulsor; marca Fisher), proveta de vidro de 500 ml, placa de agitação/aquecimento (marca Corning), tubos de centrífuga de polipropileno de 4 x 50 ml (Nalgene), frascos de cintilação de vidro com tampas de inserção de plástico, centrífuga de bancada (Beckman), centrífuga de alta velocidade - modelo de chão (JS 21 Beckman), balança analítica Mettler (AJ 100, 0.1 mg) balança digital Mettler de carregamento de topo (AE 163, 0.01 mg), pipetador automático (Gilson). Os reagentes incluem PCL (peso mol. 10000 a 20000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania, USA), EVA “lavado” (ver o anterior método de “lavagem”), PLA (peso mol. 15000 a 25000; Polysciences), álcool de polivinilo 94
(“PVA” - peso mol. 124000 a 186000; 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, riTT τ tc a \ nnx λ χ~ λ___x:i___55. tttyt r* - j _ r?*_i n ^____j - m . -1 - tt x uunyj χ/\^ιπ \jn νιυινιυ uv uivuivuu 5 ixi íjU giauv x iDiiwi JVlbllllilt ç agua UÇdUiaua. A. Preparação de soluções de polímero a 5% íp/vl DCL (1.00 g) ou PLA, ou 0.50 g de cada de PLA e EVA lavado foram pesados directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 ml. Vinte mililitros de DCM foram adicionados. O tubo foi tapado e armazenado à temperatura ambiente (25°C) durante uma hora (pode-se agitar ocasionalmente), ou até à dissolução completa do polímero. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante pelo menos duas semanas. B. Preparação de solução stock de PVA a 5% (p/vl
Pesaram-se 25 g de PVA directamente numa proveta de vidro de 600 ml e adicionaram-se 500 ml de água destilada, juntamente com uma barra de agitação de 3 polegadas coberta com teflon. A proveta foi coberta com vidro para evitar perdas por evaporação, e colocada numa proveta de vidro de 2000 ml contendo 300 ml de água. O PVA foi agitado a 300 rpm a 85°C (placa de aquecimento/agitação Corning) durante 2 horas ou até dissolução completa. A dissolução de PVA foi determinada por verificação visual; a solução deveria estar límpida. A solução foi então transferida para um contentor de armazenamento de vidro com tampa de rosca e armazenado a 4°C durante um máximo de dois meses. A solução, no entanto, tem que ser aquecida até à temperatura ambiente antes de ser utilizada ou diluída. C. Procedimento para produção de microsferas
Com base no tamanho de microsferas a produzir (ver Tabela 1), colocaram-se 100 ml de solução PVA (concentrações dadas na tabela 1) na proveta de 200 ml com camisa de arrefecimento de água. O banho de água circulante Haake foi ligado a esta proveta e o conteúdo equilibrado a 27°C (+/- 1°C) durante 10 min. Com base no tamanho de microsferas a produzir (ver Tabela 1), ajustou-se a velocidade inicial do agitador de topo, colocando-se a lâmina do agitador de topo a meia altura na solução de PVA. A agitação foi então iniciada, e adicionou-se gota a gota 10 ml de solução de polímero (solução de polímero usada dependente do tipo de microsfera a produzir) no PVA em agitação, usando um pipetador automático de 5 ml por um período de 2 minutos. Após 3 minutos a velocidade de agitação foi ajustada (ver Tabela 1), e a solução foi agitada durante mais 2.5 horas. A lâmina de agitação 95
V 1 -¾1 foi então removida da preparação de microsferas e lavada com 10 ml de água destilada de fnrm o q /"ii i o o onlnnÕn A a loirqnam ι γλΗοππο «%πι·η /tatilwA A η Μ«·/\Μη«ιηΑΑΑ A Λ lys««A λ-Γα-α Λ V V v* uvAMyMV WV i** » T VlkMWUV |/M1M V»V11U V UU ^/1 V|/U1 UyUV ViV 11U VI VOlVl UJl 1 1 preparação de microsferas foi então colocada numa proveta de 500 ml e o banho de água coberto foi lavado com 70 ml de água destilada que foram escorridos para a preparação de microsferas. Os 180 ml de preparação de microsferas foram então agitados com uma vareta de vidro, e distribuídos igualmente por quatro tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Os tubos foram então tapados e centrifugados durante 10 minutos (força apresentada na Tabela 1). Retiraram-se 45 ml de solução de PVA de cada pellet de microsferas.
Tabela 1
Concentrações de PVA, velocidades de agitação e força centrífuga requeridos para cada gama de diâmetro de microsferas FASE DE PRODUÇÃO GAMA DE DIÂMETRO DE MICROSFERAS 30 pm a 100 pm 10pma30pm 0.1 pm a 3 pm Concentração de PVA 2.5% (p/v) (/. e. diluindo a solução stock a 5% com água destilada) 2.5% (p/v) (/. e., solução stock não diluída) 3.5% (p/v) (/'. e. diluindo a solução stock a 5% com água destilada) Velocidade de agitação inicial 500 rpm +/- 50 rpm 500 rpm +/- 50 rpm 3000 rpm +/- 200 rpm Velocidade de agitação ajustada 500 rpm +/- 50 rpm 500 rpm +/- 50 rpm 2500 rpm +/- 200 rpm Força centrífuga 1000 g +/- 100 g (modelo de bancada) 1000 g +/- 100 g (modelo de bancada) 10 000 g +/- 1000 g (modelo de alta velocidade)
Adicionaram-se então 5 ml de água destilada a cada tubo de centrífuga e agitou-se no vortex para ressuspender as microsferas. As quatro suspensões de microsferas foram reunidas num tubo de centrífuga com 20 ml de água, e centrifugadas por mais 10 minutos (força apresentada na Tabela 1). Este processo foi repetido mais duas vezes para um total de três 96 lavagens. As microsferas foram então centrifugadas uma última vez e ressuspendidas em 10 ml de água destilada. Após a última lavagem, a preparaçao de microsferas foi transferida ραία um frasco de cintilação de vidro previamente pesado. O tubo foi tapado e deixado durante a noite à temperatura ambiente (25°C), para permitir que as microsferas sedimentassem sob acção da gravidade. Como as microsferas com dimensão da gama 0.1 pm a 3 pm não sedimentam com a gravidade, ficaram na suspensão de 10 ml. D. Secagem das microsferas de 30 pm a 100 um ou de 10 pm a 30 pm de diâmetro O sobrenadante foi retirado do sedimento de microsferas após uma noite em repouso, à temperatura ambiente. Deixou-se secar as microsferas nos tubos destapados por um período de uma semana ou até estarem completamente secas (tubo com peso constante). Consegue-se secagem mais rápida deixando os tubos sem tampas sob um lento fluxo de gás nitrogénio (fluxo aprox. 10 ml/minuto) na hotte de exaustão. Quando completamente secos (tubo com peso constante), os tubos foram pesados e tapados. Os tubos tapados e etiquetados foram armazenados à temperatura ambiente num armário. Normalmente, as microsferas não foram armazenadas por mais de 3 meses. E. Determinação da concentração da suspensão das microsferas de diâmetro de 0.1 pm a 3 um
As microsferas com esta gama de tamanho não sedimentaram, tendo sido deixadas na suspensão a 4°C durante um período máximo de quatro semanas. Para determinar a concentração de microsferas na suspensão de 10 ml, pipetou-se uma amostra de 200 pl da suspensão para um microtubo de 1.5 ml de centrífuga previamente pesado. O tubo foi então centrifugado a 10000 g (microcentrífuga de bancada Eppendorf), o sobrenadante removido, e o tubo deixado secar durante a noite a 50°C. O tubo foi então pesado novamente para determinar o peso das microsferas secas contidas no tubo. F. Manufactura de microsferas carregadas com paclitaxel
Para preparar microsferas contendo com paclitaxel, colocou-se directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 ml uma quantidade adequada de paclitaxel pesado (com base na percentagem de paclitaxel a ser encapsulado). Adicionaram-se então 10 ml de solução 97 de polímero apropriada ao tubo contendo o paclitaxel, que foi agitado no vortex até dissolução do paciiiaxci.
As microsferas contendo paclitaxel podem ser produzidas essencialmente como descrito acima nos passos de (C) a (E). EXEMPLO 29
MICROSFERAS COBERTAS COM SURFACTANTE A. Materiais e Métodos
As microsferas foram produzidas a partir de poli (DL) ácido láctico (PLA), polimetilmetacrilato (PMMA), policaprolactona (PCL) e acetato de etilenovinilo (EVA):PLA 50:50, essencialmente como descrito anteriormente. Os tamanho variaram entre 10 e 100 pm com diâmetro médio de 45 pm.
Obteve-se sangue humano de voluntários saudáveis. Os neutrófilos (glóbulos brancos) foram separados do sangue usando sedimentação por dextrano e técnicas de centrifugação de Ficoll Hypaque. Os neutrófilos foram ressuspendidos em HBSS a 5 milhões de células por ml.
Os níveis de activação de neutrófilos foram determinados por geração de espécies de oxigénio reactivo, detectado por quimiluminescência. Em particular, a quimiluminescência foi determinada usando um luminómetro LKB com amplificador luminol 1 pM. O pré-revestimento (ou opsonização) com plasma das microsferas foi feito suspendendo 10 mg de microsferas em 0.5 ml de plasma e agitando a 37°C por 30 minutos.
As microsferas foram então lavadas em 1 ml de HBSS e o pellet das microsferas centrifugadas adicionado à suspensão de neutrófilos a 37°C ao tempo t=0. As superfícies das microsferas foram modificadas usando o surfactante denominado de Pluronic F127 (BASF) por suspensão de 10 mg de microsferas em 0.5 ml de solução de F127 a 2% p/p em HBSS por 30 min a 37°C. As microsferas foram lavadas duas vezes em 1 ml de HBSS antes da adição aos neutrófilos ou ao plasma para revestimento prévio adicional. B. Resultados A figura 44 mostra que as microsferas não tratadas apresentam valores de quimiluminescência inferiores a 50 mV. Estes valores representam níveis baixos de activação 98 C-. de neutrófilos. Para comparação, microcristais inflamatórios podem dar valores próximos dos 1000 mV, e activadores químicos snlnvp.is podem apresentar valores próximos dc 5000 mV. No entanto, quando as microsferas são pré-revestidas com plasma, todos os valores de quimiluminescência são amplificados para a gama dos 100 a 300 mV (Figura 44). Estes valores de resposta ou activação de neutrófilos podem ser considerados ligeiramente inflamatórios. A melhor resposta foi obtida com PMMA, podendo ser considerado como o mais inflamatório. Tanto o PLA com o PCL se tomaram três a quatro vezes mais potentes na activação dos neutrófilos após pré tratamento com plasma (ou opsonização) mas há pouca diferença entre os dois polímeros neste aspecto. A mistura EVA:PLA é pouco provável que venha a ser usada em formulações angiogénicas, já que as microsferas são difíceis de secar e ressuspender em tampão aquoso. Este efeito do plasma é denominado opsonização e resulta da adsorção de anticorpos ou moléculas de complemento na superfície. Estas espécies adsorvidas interagem com receptores nas glóbulos brancos e causam uma activação celular amplificada.
As figuras 45-48 descrevem os efeitos do pré-revestimento com plasma de PCL, PMMA, PLA e EVA:PLA, respectivamente, bem como mostram o efeito do pré-revestimento com Pluronic F127 antes do pré-revestimento das microsferas com plasma. Estas figuras mostram todas o mesmo efeito: (1) o pré-revestimento com plasma amplifica a resposta; (2) o pré-revestimento com Pluronic F127 não tem qualquer efeito isolado; (3) a resposta de neutrófilos amplificada por pré-revestimento com plasma pode ser fortemente inibida pelo pré-tratamento da superfície das microsferas com Pluronic F127 a 2%. A natureza das espécies de proteínas adsorvidas do plasma foi também estudada por electroforese. Usando este método, mostrou-se que o pré-tratamento da superfície polimérica com Pluronic F127 inibiu a adsorção de anticorpos à superfície polimérica.
Da mesma forma, as figuras 49-52, mostram o efeito do pré-revestimento de microsferas de PCL, PMMA, PLA e EVA:PLA (respectivamente) com IgG (2 mg/ml) ou Pluronic F127 a 2% seguido de IgG (2 mg/ml). Como pode ser observado nestas figuras, a resposta amplificada causada pelo pré-revestimento das microsferas com IgG pode ser inibida por tratamento com Pluronic F127.
Estes resultados mostram que pelo pré-tratamento das superfícies poliméricas de todos os quatro tipos de microsferas com Pluronic F127, a resposta “inflamatória” dos neutrófilos às microsferas pode ser inibida. 99
_1 V ί. '4 EXEMPLO 30 ENCAPSULACÃO DE AGENTE TERAPÊUTICO EM MICROSFERAS DE POT I<V- CAPROLACTONAt
INIBIÇÃO DE ANGIOGÉNESE NO ENSAIO DE CAM POR MICROSFERAS CARREGADAS
COM PACLITAXEL
Este exemplo avalia o perfil das taxas de libertação in vitro de paclitaxel de microsferas biodegradáveis de poli(e-caprolactona) (PCL) e demonstra a actividade anti-angiogénica in vivo do paclitaxel libertado dessas microsferas quando colocado na CAM.
Os reagentes utilizados nestes ensaios incluem: PCL (peso molecular 35000 - 45000; adquirido em Polysciences (Warrington, PA)); DCM de Fisher Scienfic Co., Canada; álcool de polivinilo (PVP) (peso molecular 12000 - 18000, 99% hidrolizado) da Aldrich Chemical Co. Milwauke, Wis.) e paclitaxel da Sigma Chemical Co. (St Louis, MO). Excepto se especificado de outro modo, todos os produtos químicos e reagentes foram utilizados tal como fornecidos. Ao longo do ensaio usou-se água destilada. A. Preparação das microsferas
As microsferas foram preparadas essencialmente como descrito no Exemplo 28, utilizando o método de evaporação de solvente. Resumidamente, as microsferas carregadas com paclitaxel a 5% p/p foram preparadas dissolvendo 10 mg de paclitaxel e 190 mg de PCL em 2 ml de DCM, sendo adicionadas a 100 ml de solução aquosa de PVP a 1% e agitadas a 1000 rpm a 25°C durante 2 horas. A suspensão de microsferas foi centrifugada a 1000 x g por 10 minutos (Beckman GPR), o sobrenadante removido e as microsferas lavadas três vezes com água. As microsferas lavadas foram secas ao ar durante a noite e armazenadas à temperatura ambiente. Prepararam-se também microsferas de controlo (isentas de paclitaxel) como descrito acima. Prepararam-se também microsferas contendo 1% e 2% de paclitaxel. As microsferas foram dimensionadas usando um microscópio óptico com um micrómetro de fase. B. Eficiência de encapsulacão
Um peso pré-determinado de microsferas carregadas com fármaco (cerca de 5 mg) foi dissolvido em 8 ml de acetonitrílo e adicionou-se 2 ml de água destilada para precipitar o polímero. A mistura foi centrifugada a 1000 g por 10 minutos e a quantidade de paclitaxel 100 encapsulado foi calculado pela absorvância do sobrenadante medida num espectrofotómetro de UV fHewlett-Packard X4S? A Array Spectrcphctcmetcr) a 222 nm. C. Estudos de libertação de fármaco
Suspenderam-se cerca de 10 mg de microsferas carregadas com paclitaxel em 20 ml de PBS 10 mM (pH 7.4) em tubos com tampa de rosca. Os tubos foram invertidos a 37°C e a intervalos pré-estabelecidos, foram retirados 19.5 ml de sobrenadante (após permitir que as microsferas se depositassem no fundo), que foram filtrados através de um filtro de membrana de 0.45 pm e retidos para análise de paclitaxel. Em cada tubo foi reposto um volume igual de PBS para manter as condições de submersão ao longo do ensaio. Os filtrados foram extraídos com 3 x 1 ml de DCM, sendo os extractos de DCM evaporados até secagem sob um fluxo de nitrogénio, redissolvidos em 1 ml de acetonitrilo e analisados por HPLC usando uma fase móvel de água:metanol:acetonitrilo (37:5:58) a um fluxo de 1 ml/minuto (Beckman Isocratic Pump), uma coluna de fase reversa C8 (Beckman) e detecção por UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm.
D. Estudos de CAM
Foram incubados embriões de pinto doméstico fertilizados, durante 4 dias antes da cultura sem casca. Ao 6o dia de incubação foram colocados directamente na superfície da CAM alíquotas de 1 mg de microsferas carregadas com paclitaxel a 5% ou controlos (isentos de paclitaxel). Após 2 dias de exposição a vasculatura foi examinada usando um estereomicroscópio em interface com uma câmara de vídeo; os sinais de vídeo foram então visualizados num computador e impressos por vídeo. E. Microscopia de varrimento electrónico
As microsferas foram colocadas em suportes de amostra, cobertas com salpicos de ouro e colocadas num Philips 501B SEM operando a 15 kV. F. Resultados A gama de tamanhos das amostras de microsfera era entre 30 - 100 pm, apesar de haver evidência da existência em todos os lotes de microsferas carregadas de paclitaxel ou 101 controlos de algumas microsferas fora desta gama. A eficiência de carga de paclitaxel em microsferas de PCT. foi semnre. superior a 95% para todas os cargos dc fsnnaco cm csiuiiu. A microscopia de varrimento electrónico demonstrou que as microsferas eram todas esféricas e que muitas apresentavam uma morfologia de superfície rugosa ou picada. Não pareceu haver indícios de fármaco sólido na superfície das microsferas. A Figura 53A mostra o decurso do tempo de libertação de paclitaxel de microsferas de PCL carregadas com 1%, 2% e 5%. Os perfis de taxa de libertação foram bifásicos. Houve uma libertação inicialmente rápida de paclitaxel ou fase de “explosão” em todas as cargas de fármaco. A fase de “explosão” ocorreu durante 1-2 dias, na carga de 1% e 2% de paclitaxel e durante 3-4 dias para as microsferas carregadas com 5%. A fase inicial de libertação rápida foi seguida de uma fase de libertação de fármaco significativamente mais lenta. Para as microsferas contendo 1% e 2% de paclitaxel, não houve mais libertação de fármaco depois de decorridos 21 dias. Com a carga de 5% de paclitaxel, as microsferas tinham libertado cerca de 20% do conteúdo total de fármaco ao fim de 21 dias. A Figura 53B mostra CAMs tratadas com microsferas de PCL de controlo e a Figura 53C mostra o tratamento com microsferas carregadas com 5% de paclitaxel. A CAM com microsferas de controlo mostrou uma arquitectura de rede capilar normal. A CAM tratada com microsferas de PCL - paclitaxel mostrou regressão vascular marcada e zonas isentas de rede capilar. G. Discussão O método de evaporação de solvente para fabricar microsferas carregadas com paclitaxel produziu eficiências de encapsulação de paclitaxel muito elevadas, entre 95-100%. Isto deveu-se à fraca solubilidade do paclitaxel em água, com a sua natureza hidrofóbica favorecendo a sua partição na fase do solvente orgânico contendo o polímero. O perfil de libertação bifásica de paclitaxel foi típico do padrão de libertação de muitos fármacos de matrizes poliméricas biodegradáveis. Poli(s-caprolactona) é um poliester alifático que pode ser degradado por hidrólise sob condições fisiológicas, e é não tóxico e compatível com tecido. A degradação de PCL é significativamente mais lenta do que a dos polímeros e copolímeros de ácidos láctico e glicólico extensivamente investigados, e é, assim, adequado para a concepção de sistemas de libertação de fármacos de longa duração. Pensou-se que fase inicial rápida ou de “explosão” do paclitaxel fosse devida à libertação difusa do 102 fármaco da região superficial das microsferas (próximo da superfície da microsfera). A libertação de paclitaxel na se.minHa (mais lenta) dos perfis dc libertação nãu é provável que se deva à degradação ou erosão de PCL, porque alguns estudos demonstraram que em condições in vitro em água não havia perda significativa de massa ou erosão de superfície de PCL num período de 7.5 semanas. A fase mais lenta de libertação do paclitaxel deveu-se provavelmente à dissolução do fármaco nos poros cheios de fluido na matriz do polímero e difusão através dos poros. A taxa mais elevada de libertação na maior carga de paclitaxel foi provavelmente resultado de uma rede de poros mais extensa na matriz do polímero.
As microsferas com carga de 5% de paclitaxel mostraram libertar fármaco suficiente para produzir inibição extensiva de angiogénese quando colocadas na CAM. A inibição do crescimento de vasos sanguíneos resultou em zonas avasculares, como mostrado na figura 53C. EXEMPLO 31 MANUFACTURA DE MICROSFERAS DE PLGA As microsferas foram manufacturadas a partir de copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico (PLGA). A. Método
As microsferas foram fabricadas na gama de tamanhos 0.5-10 pm, 10-20 pm e 30 - 100 pm, usando métodos Standard (o polímero foi dissolvido em diclorometano e emulsionado numa solução de álcool de polivinilo com agitação como descrito anteriormente nos métodos de fabricação de microsferas de PCL ou PDLLA). Foram usadas várias razões de PLLA e GA em polímeros com diferentes pesos moleculares (dados como Viscosidade Intrínseca (I. V.)). B. Resultado
As microsferas foram produzidas com sucesso a partir dos seguintes polímeros iniciais: PLLA : GA I.V. 50 : 50 0.74 103
50 50 0.78 «n CA i η/r •s v/ 1 .\J\J 65 35 0.55 75 25 0.55 85 15 0.56 O paclitaxel a 10% ou 20% de carga foi incorporado com sucesso em todas estas microsferas. Nas figuras 54-57 são dados alguns exemplos de distribuições de tamanho para um polímero inicial (85:15,1.V. = 0.56). Foram realizados ensaios de libertação de paclitaxel usando microsferas de vários tamanhos e composições. As taxas de libertação estão apresentadas nas Figuras 58-61. EXEMPLO 32 ENCAPSULAMENTO DE PACLITAXEL EM MICROCÁPSULAS DE NYLON Os agentes terapêuticos podem também ser encapsulados numa ampla variedade de transportadores que podem ser formados numa forma ou aparelho seleccionados. Por exemplo, e como descrito em maior detalhe abaixo, o paclitaxel pode ser incorporado em microcápsulas de nylon, que podem ser formuladas em válvulas de coração artificiais, transplantes vasculares, fios cirúrgicos ou suturas. A. Preparação das microcápsulas carregadas com paclitaxel O paclitaxel foi encapsulado em microcápsulas de nylon usando técnicas de polimerização interfacial. Resumidamente, dissolveram-se 100 mg de paclitaxel e 100 mg de Pluronic F127 em 1 ml de DCM e adicionaram-se 0.4 ml (cerca de 500 mg) de cloreto de adipóleo (ADC). Esta solução foi homogeneizada em solução PVA a 2% usando um homogeneizador Polytron (ajustado a 1) durante 15 segundos. Adicionou-se gota a gota uma solução de 1,6-hexanodiamina (HMD) em 5 ml de água destilada durante a'homogeneização. A mistura foi homogeneizada durante mais 10 segundos após a adição da solução de HMD. A mistura foi transferida para uma proveta e agitada com um agitador magnético durante 3 horas. A mistura foi centrifugada, recolhida e ressuspensa em 1 ml de água destilada. 104
B. Eficiência de encapsulacão/carga de paclitaxel ______________j. λ r ...i j_ __________*· _ _ r· r r» i iiuaicuirdc vuta uc \j.j mi uc dudpciidau c aò uiiuuMCia^ luiain scuas. rcs<u<llli"5c cerca de 2.5 mg de microcápsulas e suspenderam-se em 10 ml de acetonitrilo durante 24 horas. O sobrenadante foi analisado para paclitaxel e o resultado expresso em percentagem de paclitaxel. Estudos preliminares mostraram que o paclitaxel podia ser encapsulado em microcápsulas de nylon em cargas elevadas (até 60%) e com elevadas eficiências de encapsulação (superiores a 80%). C. Estudos de libertação de paclitaxel
Suspenderam-se cerca de 2.5 mg de microsferas de nylon-paclitaxel em 50 ml de água contendo cloreto de sódio e ureia a 1 M cada, e analisou-se periodicamente. A libertação de paclitaxel foi rápida, sendo mais de 95% do fármaco libertado após 72 horas (Figura 62). EXEMPLO 33
MICROSFERAS BIOADESIVAS A. Preparação das microsferas bioadesivas
Foram feitas microsferas de 100 kg/mol PLLA com uma gama de diâmetros de partícula de 10-60 μιη. As microsferas foram incubadas em solução de hidróxido de sódio para produzir grupos de ácido carboxílico na superfície por hidrólise do poliester. A reacção foi caracterizada com respeito à concentração de hidróxido de sódio e tempo de incubação através da medida da carga superficial. A reacção ficou completa após 45 minutos de incubação em hidróxido de sódio 0.1 M. Após o tratamento com a base, as microsferas foram cobertas com dimetilaminoproilcarbodiimida (DEC), um agente de ligação cruzada, por suspensão das microsferas em solução alcoólica de DEC e permitindo a secagem da mistura até um pó dispersível. A razão de pesos de microsferas para DEC foi de 9:1. Após a secagem das microsferas, estas foram dispersas com agitação numa solução de poli(ácido acrílico) (PAA) a 2% (p/v), permitindo a reacção do DEC com o PAA para produzir uma rede insolúvel em água de PAA em ligações cruzadas na superfície das microsferas. Foi usada microscopia de varrimento electrónico para confirmar a presença de PAA na superfície das microsferas. 105
Foi revelado por calorimetria de varrimento diferencial das microsferas antes e depois do tratamento com a base que, por SEM, não se observaram «Iterações da propriedades térmicas na globalidade (Tg, fusão e grau de cristalinidade). B. Taxas de libertação de paclitaxel in vitro
Foram preparadas microsferas carregadas com paclitaxel (cargas a 10 e 30% p/p) com a mesma gama de diâmetros de partícula, e analisaram-se os perfis de libertação in vitro por 10 dias em PBS. A libertação foi proporcional à carga de fármaco, com libertação de 400 pg de paclitaxel de 5 mg de microsferas carregadas a 30% em 10 dias e libertação de 150 pg de microsferas carregadas a 10% no mesmo período. A eficiência de encapsulação foi cerca de 80%. As microsferas carregadas de paclitaxel foram incubadas em hidróxido de sódio 0.1 M por 45 minutos e o potencial zeta foi medido antes e depois da incubação com hidróxido de sódio. A carga da superfície das microsferas carregadas com paclitaxel foram menores que nas microsferas sem paclitaxel tanto antes como depois do tratamento com a base. C. Preparação e avaliação in vitro de PLLA revestido com poli-lisina ou fibronectina
Foram preparadas microsferas de PLLA contendo 1% de Negro de Sudão (para corar as microsferas). Estas esferas foram suspensas numa solução de poli-lisina a 2% (p/volume) (Sigma Chemicals - Hydrobromell form) ou fibronectina (Sigma) durante 10 minutos. As microsferas foram lavadas em tampão uma vez e colocadas na face interior de bexigas de rato preparada de fresco. As bexigas foram deixadas por 10 minutos e depois lavadas três vezes em tampão. Após o processo, estavam presentes na bexiga microsferas residuais (ligadas), mostrando assim que tinha ocorrido bioadesão (Figuras 63A e 63B) tanto para as microsferas cobertas com fibronectina como para as cobertas com poli-l-lisina. EXEMPLO 34 (Exemplo de referência-)
PREVENÇÃO DO ESTABELECIMENTO DE ARTRITE POR PACLITAEL NO MODELO DE
RATO CIA A. Materiais e métodos
Ratos Louvain Fêmea singénicos pesando entre 120 e 150 gramas foram injectados intradermicamente com 0.5 mg de colagénio II de pinto nativo (Genzyme, Boston, MA) 106 solubilizado em ácido acético 0.1 M e emulsificado em FIA (Difco, Detroit, MI). Aproximadamenxe 9 dias após a imunização, os animais desenvoiverarn uma puiiaririie cuin alterações histológicas de formação de pannus e erosão de osso/cartilagem. Usaram-se um total de 45 ratos em 4 protocolos: um grupo controlo (n=17) que recebeu apenas o veículo e 3 grupos de tratamento com paclitaxel, consistindo num protocolo de prevenção e dois de supressão. De modo a avaliar o efeito do paclitaxel, foram administrados intra-peritonealmente (i.p.) paclitaxel (solubilizado numa diluição 1:1 de etanol e Cremophor E. L.® (Sigma) e adicionados a uma solução salina para uma concentração final de 4.8 mg/ml de paclitaxel em etanol e Cremophor E. L.® a 5% p/v) com início no dia 2 após imunização (protocolo de prevenção) ou no início da artrite no dia 9 (protocolo de supressão). Para o protocolo de prevenção (n=8), o paclitaxel foi administrado numa concentração de 1 mg/kg de peso corporal começando no dia 2 com 5 doses subsequentes nos dias 5, 7, 9, 12 e 14. Para o protocolo de supressão de dose elevada (n=10), o paclitaxel (1 mg/kg de peso corporal) foi administrado em dias alternados com início no dia 9. Para o protocolo de supressão de dose baixa (n=10), o paclitaxel foi administrado a 1 mg/kg de peso corporal nos dias 9, 11 e 13 e depois a 75% deste nível de dosagem (0.75 mg/kg de peso corporal) em dias alternados até ao dia 21. Os animais de controlo e experimentais foram avaliados quanto à gravidade da doença, tanto clinica como radiograficamente, por indivíduos desconhecedores dos grupos de tratamento, num ensaio cego. A gravidade de inflamação para cada membro foi avaliada diariamente e classificada com base em níveis padronizados de inchaço e eritema periarticular (0 correspondendo a normal e 4 a grave). Os animais foram avaliados radiograficamente no dia 28 do ensaio. As radiografias de ambos os membros posteriores foram classificadas pelo grau de inchaço do tecido mole, estreitamento do espaço das articulações, destruição óssea, e formação de novo osso periostal. Foi usada uma escala de 0-3 para quantificar cada membro (0= normal, 1 = inchaço do tecido mole, 2= erosão precoce do osso, 3 = destruição óssea grave e/ou anquilose). A avaliação histológica das articulações foi completada na conclusão do ensaio. A hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) ao CII foi determinada por ensaio de audição radiométrico completado ao dia 28. Os índices de audição radiométrica >1.4 representam uma resposta significativa a CII. A presença de anticorpos IgG anti-CII foi determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA). Foram obtidas amostras de soro no dia 26, que foram diluídas 1:2560, sendo os resultados expressos como a densidade óptica média a 490 nm, em alíquotas quadruplicadas. Os níveis de “ruído de fundo” de soros de ratos normais a esta diiuição são 0 e disiiiigueiri-sc proiiiaiixcnic dos soros dc raios imunizados oom colagénio. B. Resultados
Neste modelo, o tratamento com paclitaxel instituído antes do estabelecimento da artrite impediram completamente o desenvolvimento da doença em todos os ratos tratados (mesmo após a descontinuação do tratamento com paclitaxel) quando comparado com o grupo controlo de veículo.
Nos animais controlo houve um aumento progressivo dos sintomas clínicos da doença até a ocorrência de deformação das articulações e perda de função. Os animais que receberam paclitaxel quer em doses altas quer em doses baixas após o início da artrite demonstraram melhorias clínicas significativas. Em média, as classificações clínicas foram equivalentes às observadas no início do tratamento, indicando uma capacidade do paclitaxel em prevenir a progressão clínica da doença.
Os animais que receberam paclitaxel foram capazes de suportar o peso e deambular e mostraram poucos, se quaisquer, efeitos tóxicos do tratamento. Foi observada a cura de feridas e crescimento capilar renovado no local de vacinação nos animais tratados. Os animais tratados com paclitaxel ganharam peso relativamente aos controlos.
Nenhum dos ratos no protocolo de prevenção de artrite com paclitaxel manifestou quaisquer alterações radiográficas ou artrite clínica. Tanto os grupos de doses altas de paclitaxel como os de doses baixas apresentaram doença radiográfica significativamente inferior quando comparados com o grupo controlo. Mais, a avaliação histológica revelou que os ratos do grupo controlo apresentaram pannus marcado, com erosão de ossos e cartilagens, ao contrário dos ratos tratados com paclitaxel, que apresentavam pannus mínimo ou nenhum, com preservação da cartilagem articular.
Usando um ensaio de ELISA, os anticorpos IgG contra colagénio tipo II foram significativamente mais baixos nos ratos tratados com paclitaxel quando comparados com o grupo controlo; os ratos no protocolo de prevenção tinham anticorpos IgG significativamente mais baixos quando comparados com os ratos nos protocolos de supressão com doses altas e baixas de paclitaxel. 108 c.
Discussão O noplitovel ά
α ’1TVt tiMiIuiiviitC VIutvi u u uuiiiv u puLWUVicuiliCiilC JJcllcl UULIUM lipUS U.C doenças auto imunes já que bloqueia o processo da doença quando administrado após imunização mas antes do início da artrite. Os resultados indicam que o paclitaxel conseguiu revogar completamente o início da artrite quando iniciado 2 dias após a imunização com CII. Com tratamento com paclitaxel no protocolo de supressão, a gravidade da artrite continuou a diminuir durante a duração da administração de paclitaxel, mas começou a subir dentro de 4 dias após a cessação do tratamento em ambos os protocolos de supressão. No entanto, uma intervenção precoce com paclitaxel aparentemente atenuou a necessidade para terapia contínua. EXEMPLO 35 (Exemplo de referência) REGRESSÃO DA ARTRITE INDUZIDA POR COLAGÉNIO COM PACLITAXEL O paclitaxel demonstrou efeitos modificadores de doença no modelo CIA quando administrado sistemicamente em formulação micelar. Para avaliar o efeito potencial modificador de doença do paclitaxel, foi administrado intra-peritonialmente (i.p.) paclitaxel micelar (isento de Cremophor), a cada quatro dias (q.o.d.) a 5 mg/kg (grupo 1) ou a 10 mg/kg (grupo 2) a animais imunizados no início de artrite clinicamente detectável (dia 9). Administrou-se paclitaxel durante o período de avaliação. Comparado com a terapia Standard, um terceiro grupo recebeu metotrexato a 0.3 mg/kg i.p. (dose equivalente à humana) nos dias 0, 5 e 10 após o início da artrite. Um quarto grupo recebeu terapia combinada de metotrexato (0.3 mg/kg) e paclitaxel micelar (10 mg/kg). Os animais experimentais e de controlo (grupo 5) foram avaliados quanto à gravidade de doença tanto clínica como radiograficamente por indivíduos desconhecedores dos grupos de tratamento, num ensaio cego. A gravidade de inflamação para cada membro foi avaliada diariamente e classificada com base em níveis padronizados de inchaço e eritema periarticular (0 correspondendo a normal e 4 a grave). Os animais foram avaliados radiograficamente no dia 28 do ensaio. As radiografias de ambos os membros posteriores foram classificadas pelo grau de inchaço do tecido mole, estreitamento do espaço das articulações, destruição óssea, e formação de novo osso periostal. Foi usada uma escala de 0-3 para quantificar cada membro posterior (0= normal, 1 = inchaço do tecido mole, 2= erosão precoce do osso, 3 = destruição óssea severa e/ou anquilose) (Brahn et al., Arthrítis Rheum. 37: 839-845, 1994; Oliver et al., Cell. 109
Immunol., 157: 291-299, 1994). A avaliação histológica das articulações foi completada na conclusão do ensaio.
Neste modelo, os tratamentos por paclitaxel micelar instituído antes do início da artrite impediram completamente o desenvolvimento da doença mesmo após a descontinuação do tratamento com paclitaxel. Nos animais controlo houve um aumento progressivo dos sintomas clínicos da doença (Figura 64) até a ocorrência de deformação das articulações e perda de função. Os animais que receberam terapia com metotrexato não melhoraram estatisticamente quando comparados com os controlos (Figura 64 & tabela 1). Os animais que receberam doses baixas de paclitaxel micelar (5 mg/kg) após o início da artrite mostraram alguma melhoria, mas os animais que receberam paclitaxel micelar a 10 mg/kg mostraram uma melhoria clínica altamente significativa (p=0.0002) (Figura 64). Em média, as classificações clínicas foram equivalentes às observadas no início do tratamento, indicando uma capacidade do paclitaxel micelar em prevenir a progressão clínica da doença (Tabela 1).
Tabela 1 Paclitaxel micelar melhora os índices clínicos no modelo de ratos com artrite induzida por colagénio índice de artrite no Classificação média Anticorpo anti dia 10 máxima de artrite colagenase II Controlos artríticos 6.1+0.6 6.410.5 0.19910.0042 (n=ll) Metotrexato (0.3 5.4±0.6 5.710.5 0.18210.0.0034 mg/Kg) (n=5) (p=NS) (p<0.03) Paclitaxel micelar (5 4.3±1.8 4.311.8 0.17610.0.0042 mg/Kg) (n=4) (p=NS) (p=NS) (p<0.01) Paclitaxel micelar 2.010.7 3.810.7 0.16210.0194 (10 mg/Kg) (n=5) (p=0.0002) (p=0.0002) (p<0.02) Comb. Paclitaxel 1.110.5 3.610.9 0.16410.0090 micelar (10 (p=0.0001) (p^O.OOOl) (pO.OOOl) mg/Kg)/Metotrexato (0.3 mg/Kg) (n=7) • O índice artrítico quantificou níveis de intumescimento e eritema periarticular, 0 representando normalidade e á representando gravidade, c classificação m^ima possívei de 5 para a soma dos membros posteriores. Testes-t compararam ratos tratados com fármaco com ratos de controlo com artrite induzida por colagénio no 10 dia após o estabelecimento da artrite. • Classificações clínicas dos animais tratados com paclitaxel foram significativamente inferiores às dos animais de controlo e foram equivalentes às observadas no início do tratamento, indicando uma capacidade para prevenir a progressão da doença. • NS = não significativo.
Os animais que receberam paclitaxel micelar foram capazes de suportar o peso e deambular e não apresentaram quaisquer efeitos tóxicos do tratamento. Foi observada a cura de feridas e renovação do crescimento capilar no local de vacinação nos animais tratados. Os animais tratados com paclitaxel micelar ganharam peso relativamente aos controlos. Os animais que receberam paclitaxel micelar e metotrexato toleraram bem a terapia e mostraram melhorias clínicas impressionantes (p ^ 0.0001), relativamente aos controlos (Figura 64). Usando um teste de anticorpos imuno-enzimático (ELISA), os níveis de anticorpos IgG contra o colagénio tipo II foram mais baixos nos ratos tratados com paclitaxel e com a combinação (MTX/paclitaxel), quando comparados com os controlos.
Os estudos radiográficos também demonstraram uma melhoria significativa com a terapia com paclitaxel. Enquanto os controlos e os animais tratados com metotrexato apresentaram evidências radiográficas de inchaço do tecido mole, estreitamento do espaço das articulações, destruição óssea, e formação de novo osso periostal, os animais tratados com paclitaxel tinham articulações com características quase normais em raio-x (Figura 65).
De facto, apenas uma baixa percentagem (17 a 18%) dos animais que receberam o paclitaxel só (10 mg/kg) ou em combinação com metotrexato desenvolveram erosões das cartilagens. As erosões das cartilagens, um indicador importante da progressão/resultado da doença, ocorreu quatro vezes mais frequentemente nos animais controlo (72%) ou nos que receberam metotrexato isolado, do que nos animais que receberam terapia com paclitaxel micelar (Tabela 2). 111
Tabela 2 uuvviui mwiiiuiu uo iiiuiVLiO ldUlU^IdilCUS CIX1 lilLUiS com artrite induzida por colagénio Percentagem de Classificação animais com radiográfica erosões Controlos artríticos 72% 4.31±0.45 (n=32) Metotrexato 76% 4.25±0.64 (0.3 mg/Kg) (n=17) (P=NS) (P=NS) Paclitaxel micelar 50% 3.25+1.60 (5 mg/Kg) (n=8) (p=NS) (p=NS) Paclitaxel micelar 17% 1.78+0.60 (10 mg/Kg) (n=18) (p=0.0005) (p<0.003) Comb. Paclitaxel 18% 1.45+0.39 micelar (10 mg/Kg) (p=0.0003) (pO.0001) / Metotrexato (0.3 mg/Kg) (n=22) • Radiografias de ambos os membros posteriores, de ratos com artrite induzida por colagénio (CIA), foram graduadas pelo grau de intumescimento dos tecidos moles, estreitamento do espaço entre as articulações, destruição óssea e formação periosteal de ossos novos. Uma escala integral de 0 a 3 foi usada para quantificar cada membro, com uma classificação máxima possível de 6 para a soma de ambos os membros. • A presença de erosões na cartilagem, um indicador importante da progressão da doença / resultado, ocorre quatro vezes mais frequentemente em animais de controlo (72%) do que em animais que recebem a terapia de paclitaxel micelar (18%).
Micrografias de varrimento electrónico ilustram o efeito condroprotector da terapia com paclitaxel in vivo. A superfície articular normal é caracterizada por uma matriz de cartilagem intacta suave envolvida por um fino revestimento sinovial (Figura 66A). Na CIA, a 112 superfície de cartilagem está erodida pelo MMP produzido pelo tecido de pannus e pelo SiiióviO liiíiâiiiauu (Figuia 663). A iimíiiz, supciliuml Ua cariilagem é digerida, expondo os condrócitos ou as lacunas vazias que estes ocupavam (Figura 66B - inserção). Nos animais com CIA que receberam tratamento com paclitaxel após o início de artrite clínica, a superfície das articulações permaneceu intacta (Figura 66C) e a matriz da cartilagem estava aparentemente e em grande parte normal, mesmo em amplificação elevada (Figura 66B -inserção). Não se observou formação de tecido pannus ou hipertrofia sinovial nos grupos tratados com paclitaxel.
Histologicamente, a CIA é caracterizada por hipertrofia sinovial marcada, infiltração de células inflamatórias no sinóvio e destruição de cartilagens (Figura 67A). Nos animais tratados com paclitaxel, o sinóvio estava aparentemente normal, com apenas uma ou duas camadas de sinoviócitos e sem infiltração de células inflamatórias (Figura 67B).
Também foi avaliada a corrosão por moldes para determinar se o paclitaxel era capaz de bloquear a angiogénese no sinóvio de animais com CIA. O Polímero mercox foi infundido na artéria femural de animais sacrificados a uma pressão de 100 mmHg. Permitiu-se a sua solidificação in situ e os tecidos foram subsequentemente digeridos para produzir um molde de vasculatura dos membros inferiores. Micrografias de varrimento electrónico de moldes da vasculatura sinovial em animais com CIA revelou a projecção de rebentos capilares com extremidades cegas projectando-se para dentro em direcção ao espaço das articulações (Figura 68A). Estes vasos aparentavam ser morfologicamente similares aos vasos angiogénicos em crescimento descritos em tumores sólidos ou outras condições angiogénicas (Figura 68C -inserção). Em contraste, os vasos sinovióticos dos animais tratados com paclitaxel estavam dispostos em arcos capilares (Figura 68B) sem evidência de rebentos neovasculares.
Houve involução da proliferação de vasos e estruturas morfológicas vasculares nos receptores de paclitaxel/MTX, semelhante à encontrada em controlos simples. Estes estudos sugerem que a terapia com paclitaxel micelar ou com a combinação paclitaxel/metotrexato pode regredir a neovascularização, inibir processos inflamatórios, fazer regredir sinoviose instalada e prevenir destruição das articulações.
Foi demonstrado que a administração sistémica de paclitaxel é um tratamento viável para a artrite. O curso natural da doença é o de inflamação e remissão, resultando cada inflamação sucessiva em danos adicionais que em última análise levam à destruição das articulações. Existe potencial para uma terapia sistémica, de curta duração e dose elevada, a
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ser usada para induzir remissão da doença ou terapia com dose baixa sustentada para manter o cnntrnln Ha Hnp.nç? Métodos alternativos de dispensar o paclitaxel incluem injccção ariicuiar directa do fármaco nas articulações atingidas nos doentes com doença em que 1 ou 2 articulações são predominantes. EXEMPLO 36 (Exemplo de Referência)
AVALIAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE PACLITAXEL EM MODELOS ANIMAIS DE PSORÍASE A. Modelo de angiogénese de pele
Usa-se um novo modelo animal para investigar a angiogénese específica da pele. São usados ratos imunodeficientes SCDI como receptores de transplantes de superfície de linhas humanas de queratinócitos transfectados com factor de crescimento endoteliar vascular (VEGF) em orientação directa ou inversa. Transplantam-se os queratinócitos para a pele dos ratos receptores via uso de um ensaio de câmara de transplante de silicone modificada. Permite-se a diferenciação dos queratinócitos e a indução de angiogénese da pele. O paclitaxel é então administrado ou sistemicamente ou topicamente (creme, unguento, loção, gel), e efectuam-se medidas morfométricas de número e dimensões de vasos em grupos tratados e não tratados. B. Modelo em ratos de reaccões de hinersensibilidade cutânea do tino retardado
Usou-se o modelo em ratos de reacções de hipersensibilidade cutânea do tipo retardado para investigar os efeitos do paclitaxel em inflamação cutânea induzida. Resumidamente, os ratos foram sensibilizados com oxazolona por aplicação tópica do composto na pele. Cinco dias depois, os ratos foram testados com oxazolona por aplicação tópica do composto na pele da orelha (orelha esquerda: oxazolona, orelha direita: veículo simples), resultando em inflamação cutânea, reacção de hipersensibilidade do tipo retardado. A extensão de inflamação foi quantificada através de medidas do inchaço das orelhas num período de 48 horas (ver Figuras 69 e 70). Foram avaliadas secções de tecido de 1 pm, embebidas em Epon e coradas com Giemsa, quanto à presença de células inflamatórias, quanto à presença de células germinativas do tecido e seu grau de activação, e quanto ao grau de hiperplasia epidérmica. O paclitaxel foi administrado quer sistemicamente quer 114 topicamente para quantificação do seu efeito nas reacções de inflamação cutânea neste ηΛΛ/ΊβΐΛ fM 1Μ1ΙΛ C. Resultados
Estes estudos demonstraram que a aplicação tópica de paclitaxel a l% comparada com veículo simples em tratamentos de inflamação cutânea induzida experimentalmente em ratos revelou que o paclitaxel possui efeitos inibitórios em inflamação cutânea. Em reacções de hipersensibilidade do tipo retardado induzidas experimentalmente, houve uma diminuição significativa do inchaço da orelha nas orelhas tratadas topicamente com paclitaxel a l% comparado com veículo simples. As aplicações tópicas de paclitaxel. a l% inibiram significativamente o inchaço da orelha e o eritema da pele (vermelhidão) induzida pela aplicação tópica de PMA (forbol 12-miristol 13-acetato) (ver Figuras 71 e 72). Como ilustrado na Figura 73, a orelha tratada com paclitaxel (orelha direita) tinha uma aparência normal quando comparada com os controlos (orelha esquerda). Obtiveram-se resultados semelhantes num total de 5 ratos.
Para avaliar a irritação cutânea do paclitaxel a l% comparado com o veículo simples, 20 μΐ destas duas formulações foram aplicadas diariamente a cada lado das orelhas durante 8 dias. Após 8 dias, não foi detectada irritação da pele após a aplicação quer de veículo simples, quer de formulação de paclitaxel a l% em pele de orelha de rato inflamada ou normal. EXEMPLO 37 (Exemplo de Referência) AVALIAÇÃO DE REJEIÇÃO CRÓNICA NUM MODELO ANIMAL Na maioria dos receptores de transplantes cardíacos desenvolve-se uma forma acelerada de aterosclerose, que limita a sobrevivência de enxertos a longo prazo. O modelo de transplante cardíaco com ratos heterotópicos Lewis-F344 de rejeição crónica constitui um modelo experimental útil porque produz lesões ateroscleróticas em fases, em aloenxertos sobreviventes de longo e médio prazo. As vantagens do modelo Lewis-F344 são: (i) a incidência e severidade de lesões ateroscleróticas em enxertos sobreviventes a longo prazo é elevada; e (ii) uma fase inflamatória de desenvolvimento de lesões é reconhecida facilmente já que o sistema não exige imunossupressão.
Usam-se ratos de Lewis adultos machos como dadores e ratos F-344 como receptores. Transplantam-se 20 aloenxertos cardíacos abdominais heterotópicos fazendo uma longa ll5
incisão abdominal central nos receptores anestesiados para expôr a aorta e a veia cava inferior. Os dois vasos são separados um do ouxro e do recido conjuntivo que os envoive c colocam-se pequenas pinças nos vasos. Fazem-se incisões longitudinais (2 a 3 mm) em cada vaso no local de anastomose. Abre-se o abdómen dos ratos dadores anestesiados para injecção de 300 unidades de heparina aquosa na veia cava inferior. A parede do peito é aberta para expôr o coração. As veias cavas são ligadas, seguindo-se as transecções da aorta ascendente e da artéria pulmonar principal, com a origem dos vasos a 2 ou 3 mm de distância para a esquerda ligados ao coração. As veias cavas distais às ligaduras são divididas e as ligaduras colocadas à volta da massa do átrio esquerdo e veias pulmonares. Os vasos no lado pulmonar das ligaduras são divididos e o coração removido. O coração do dador é colocado na cavidade abdominal do receptor e as aortas suturadas juntas no local de incisão do vaso receptor. De forma semelhante, a artéria pulmonar é ligada no local de incisão na veia cava inferior do mesmo modo. As pinças dos vasos são abertas (veia cava proximal, cava e aorta distais, e aorta proximal) para minimizar o sangramento pelos orifícios das agulhas.
Após o transplante, injectou-se através do epicárdio ao comprimento da superfície externa das artérias coronárias de 10 ratos, pasta de paclitaxel (33%) em policaprolactona (PCL) (n=10) ou pasta de PCL simples (n=10), de forma a que a área da artéria embebida no miocárdio permanecesse por tratar.
Todos os receptores receberam uma injecção intramuscular única de penicilina G (100 000 unidades) no momento de enxerto. Os aloenxertos são seguidos por palpação diária e a sua função determinada numa escala de 1 a 4, com 4 representando um batimento cardíaco normal e 0 a ausência de actividade mecânica. Sacrificaram-se 5 ratos de cada grupo aos 14 dias e os outros 5 aos 28 dias. Os ratos foram observados para perda de peso e outros sinais de doença sistémica. Após 14 ou 28 dias, os animais são anestesiados e o coração exposto da mesma forma que no ensaio inicial. As artérias coronárias cobertas ou não cobertas são isoladas, fixadas em formaldeído tamponizado a 10% e examinadas histologicamente. A experiência inicial pode ser modificada usando filmes de paclitaxel/EVA ou stents revestidos nas artérias coronárias após o transplante. O filme EVA é aplicado na superfície extraluminar da artéria coronária de forma semelhante à acima descrita, e o stent revestido é colocado intraluminarmente. 116
Adicionalmente, estas investigações podem ser alargadas a transplantes de outros orgãos xai com iranspiames de enxerto (e. g., veias, peie). EXEMPLO 38 EFEITOS DO PACLTTAXF.T. NTJM MODELO ANIMAL DE EM Foi examinada a capacidade das micelas de paclitaxel inibirem a progressão dos sintomas e patogénese de EM num modelo de rato transgénico desmielinizante (Mastronardi et al. J. Neurosci. Res. 36: 315-324, 1993). Estes ratos transgénicos contêm 70 cópias do transgene DM20, um proteolípido de mielina. Clinicamente, os animais eram normais até aos 3 meses de idade. Após os 3 meses, apareciam sinais de patologia neurológica, como convulsões, tremuras, mobilidade dos membros posteriores, desestabilização da marcha, coxear traseiro, marcha oscilante e redução do nível de actividade, que aumentavam progressivamente de gravidade até à morte dos animais entre os 6 e 8 meses de idade. Os sinais clínicos foram relacionados histologicamente com a desmielinização e com o aumento da proliferação de astrócitos fibrosos no cérebro (Mastronardi et al. J. Neurosci. Res. 36: 315-324,1993). A. Materiais e Métodos
Foram efectuados dois estudos animais usando administração subcutânea ou com um protocolo terapêutico de dose baixa contínua de paclitaxel (2.0 mg/kg; 3x por semana, total de 10 injecções) ou com um protocolo terapêutico de dose elevada “choque” de paclitaxel (20 mg/kg; quatro vezes, uma vez por semana), iniciados ao início clínico da doença (aproximadamente 4 meses de idade). Para o protocolo de dose baixa, 5 animais receberam paclitaxel micelar, dois ratos foram usados como controlo; um rato era um rato não tratado normal e outro um equivalente transgénico. Só foi usado um rato transgénico de controlo porque o decurso da doença em laboratório estava bem estabelecido. Os animais com 4 meses foram injectados com paclitaxel micelar, após os sinais iniciais de EM atingirem a classificação de 1+ nas categorias de sintomas já descritas acima. O decurso do tratamento foi de 24 dias (2.0 mg/kg de paclitaxel; 3x por semana, x 10 doses). Em cada dia de injecção determinaram-se o peso corporal e sintomatologia clínica. 117 B. Resultados
Gs 5 animais 411c receberam paciuaxci não apreseniaram perda de peso significaiiva. No entanto, o rato transgénico não tratado apresentou uma diminuição de 30% de peso, de 29 g para 22 g (Figura 74), tal como normalmente associado à progressão da doença.
Os indicadores clínicos de EM, tais como, tremuras, mobilidade dos membros posteriores, convulsões, tremuras da cabeça, desestabilização da marcha, coxear traseiro e grau de actividade, foram monitorizados diariamente. Ao início do tratamento, os animais tinham uma classificação de 1+ na maioria das categorias de sintomas. Os animais não tratados progrediram de classificação 1+ para 4+ ao longo dos 27 dias seguintes em vários sintomas; A classificação 3+ caracterizou-se por equilíbrio fraco, uma das características principais da doença. No grupo tratado com paclitaxel, todos os 5 animais permaneceram com classificação 1+ durante o mesmo período de tempo em todos os sintomas monitorizados (Tabela 1). TABELA 1 Efeito de paclitaxel contínuo em baixa dose na progressão dos sintomas de esclerose múltipla em ratos transgénicos Ratos Idade (meses) Convulsões Tremuras Paralisia dos membros posteriores Tremores da cabeça Baixa de peso (%) Animais 3 1+ 1+ 1+ 1+ 0 transgénicos (não tratados) 6 2+-3+ 2+-3+ 2+-4+ 3+ 30% Animais 3 1+ 1+ 1+ 1+ 0 transgénicos (tratados com paclitaxel) 6 1+ 1+ 1+ 1+ 5 -10% Animais de 3 0 0 0 0 0 controlo (tratados com paclitaxel 6 0 0 0 0 0 - 5% • Os animais transgénicos não tratados apresentaram progressão dos sintomas graves durante 27 dias enquanto que os animais tratados com paclitaxel apresentaram sintomas neurológicos mínimos durante o mesmo período. • Uma classificação de 1+ significa sinais concretos mas mínimos; 4+ é moribundo. 118
Para o protocolo de dose elevada, os ratos foram tratados com 20 mg/kg de paclitaxel uma vez por semana durante 4 semanas para imitar os intervalos de quimioterapia de puisu (dada mensalmente para cancros de ovário e mama) tal como usado em doentes oncológicos. Os animais foram monitorizados por 10 semanas, a cada dois dias, e as classificações determinadas para cada sintoma. Em 3 animais não tratados, os sintomas neurológicos progrediram rapidamente e dois dos animais morreram (na semana 5 e na semana 9) durante o decurso do ensaio; o terceiro animal, que sobreviveu, apresentava sintomas clínicos graves. Nos 5 ratos transgénicos que receberam tratamento com paclitaxel iniciado após início dos sintomas, verificou-se uma redução nas classificações de EM relativamente aos controlos, após a primeira semana de monitorização e, a partir daí, não foi observada mais deterioração neurológica. Nestes animais, não foi observada progressão da doença, permanecendo os animais em remissão clínica tanto durante a terapia (semanas 0 - 3), como após a cessação do tratamento farmacológico (semanas 4-10) (Figura 75). C. Conclusões O paclitaxel evitou a progressão rápida dos sintomas neurológicos observados neste modelo animal de EM tanto com alta como com baixa dosagem. Estes dados sugerem que o paclitaxel pode ser um agente terapêutico potencial de doenças desmielinizantes. EXEMPLO 39 (Exemplo de Referência)
AVALIAÇÃO DO PACLITAXEL R OUTROS AGENTES ESTABILIZADORES DE MICROTÚBULO PARA O TRATAMENTO DE PÓLIPOS NASAIS
Para avaliar a eficácia de formulações contendo paclitaxel ou outros agentes no tratamento de pólipos nasais usam-se culturas de células epiteliais e/ou culturas de tecido de pólipos nasais. Esta abordagem é baseada na premissa que as células epiteliais libertam citoquinas e contribuem para a inflamação crónica detectada nas poliposes nasais, bem como na rinite e na asma, e que uma libertação prolongada de medicação poderá prevenir a eosinofilia e inibir a expressão dos genes de citoquinas.
Podem usar-se como insuflantes formulações de paclitaxel incluindo soluções (uso de ciclodextrinas) ou suspensões contendo paclitaxel encapsulado em polímeros mucoaderentes para utilização como sprays nasais, e/ou paclitaxel micro-encapsulado em polímeros mucoaderentes. Estas formulações são usadas nos estudos detalhados abaixo. 119 A. fcieito ae paclíxaxei in viiro
Manuseamento de tecidos - Obtêm-se amostras de mucosa nasal (NM) normal de doentes sem evidência clínica de rinite e com teste skin-prick negativo durante cirurgia de reconstrução nasal. Obtêm-se amostras de pólipos nasais (NP) de doentes com teste de skin-prick negativo ou positivo sujeitos a polipectomia nasal. As amostras nasais são colocadas em meio Ham’s F2 suplementado com 100 Ul/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e 2 pg/ml de anfoterricina B, sendo transportadas de imediato para o laboratório.
Cultura de células epiteliais - São isoladas células epiteliais nasais de NM e NP por digestão com protease como apresentado em seguida. As amostras de tecido são lavadas 2-3 vezes com meio Ham’s F2 suplementado com 100 Ul/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e 2 pg/ml de anfoterricina B e incubadas em Ham’s F2 com protease tipo XIV a 0.1% a 4°C de um dia para o outro. Após incubação, adiciona-se 10% de FBS para neutralizar a actividade da protease e as células epiteliais são separadas por agitação suave. As suspensões de células são filtradas por um filtro de dissociação celular com poro de 60, e
centrifugadas a 500 g por 10 minutos à temperatura ambiente. O pellet celular é então ressuspendido em meio de cultura Ham’s F2 definido hormonalmente, Ham’s HD contendo os seguintes reagentes: 100 Ul/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 2 pg/ml de anfoterricina B, 150 pg/ml de glutamina, 5 pg/ml de transferina, 5 pg/ml de insulina, 25 ng/ml de factor de crescimento de epiderme, 15 pg/ml de suplemento de crescimento de células endoteliais, 200 pM de triiodotrionina e 100 nM de hidrocortisona. Distribuem-se então suspensões celulares (105 células/poço) por poços revestidos com colagénio em 2 ml de Ham’s HD e a cultura é feita numa atmosfera húmida de 5% de CO2 a 37°C. O meio de cultura é mudado no dia seguinte e subsequentemente em dias alternados. Consegue-se uma cultura confluente em monocamada após 6-10 dias de cultura.
Geração de meio acondicionador de epitélios humanos (HECM) - Quando as células epiteliais atingem a confluência, muda-se do meio Ham’s HD para o meio RPMI 1640 (Irvin, Scotland) suplementado com 100 Ul/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 2 pg/ml de anfoterricina B, 150 pg/ml de glutamina e 25 mM de tampão Hepes (RPMI 10%). O HECM, que é gerado após 48 horas de incubação com RPMI (10%), é recolhido da cultura, 120 centrifugado a 400 g por 10 minutos à temperatura ambiente (RT), esterilizado por filtração através de filtro de 0.22 μτη e armazenado a -70:C aié à uiiiização.
Sobrevivência de eosinófilos e efeito do paclitaxel - Os eosinófilos são isolados do sangue periférico e o efeito do HECM de NM ou de NP na sobrevivência dos eosinófilos é determinado de duas formas diferentes: análise ao longo do tempo e resposta à dosagem. Em ensaios de curso de tempo, incubam-se eosinófilos numa concentração de aproximadamente 250 000/ml em 6 poços de cultura de tecidos com ou sem (controlo negativo) HECM a 50%, e os índices de sobrevivência determinados aos dias 2, 4, 6 e 8. Conduzem-se outros ensaios com 1-50% de HECM. Nos ensaios em que se pretende testar o efeito de fármacos (e.g.,
paclitaxel) na sobrevivência de eosinófilos induzidos por HECM, o fármaco (paclitaxel) de 0.1 nM a 10 μΜ é incubado com os eosinófilos a 37°C por 1 hora antes da adição de HECM. Em cada ensaio usam-se sempre poços de controlo negativo (meio de cultura simples) e controlo positivo (meio de cultura com HECM). Para investigar se os fármacos têm algum efeito tóxico, comparam-se as viabilidades dos eosinófilos incubados com o fármaco (a várias concentrações) com eosinófilos cultivados em RPMI a 10% simples durante 24 horas. B. Efeito de paclitaxel na expressão de genes de citoquinas e sua libertação das células epiteliais
As células epiteliais obtidas de pólipos nasais e de mucosa nasal normal são cultivadas
até à confluência, gera-se o meio acondicionador de epitélios humanos com ou sem paclitaxel (ou outros agentes) e os sobrenadantes são medidos por ELISA. A expressão de genes de citoquinas é investigada por reacção de amplificação genómica com transcrição reversa (RT-PCR), como descrito por Mullol et al., Clinicai and Experimental allergy 25: 607-615, 1995.
Os resultados mostram se o paclitaxel modula a expressão de genes de citoquinas através da inibição de sobrevivência dos eosinófilos. A principal desvantagem em utilizar culturas de células primárias é que estas demoram 10 dias até atingirem a confluência, dissociando as funções celulares do meio local, tal como os efeitos sistémicos, que teriam levado à doença em primeira instância. No entanto, este é um excelente modelo in vitro/ex vivo para estudar factores de crescimento reguladores das funções e proliferação de células estruturais (e. g. células epiteliais) e assim elucidar alguns aspectos da inflamação de mucosas. 121 ρ τ :_____ι _________; λ s.ι:________ι........... ν· i-/it/vi myuv inmiivivp,ivu uv mvumumvij \jUlimwJ UV llOjaiO limilOilU3
Mediação por paclitaxel e outros agentes - Obtêm-se pólipos na altura de ressecção e estes são lavados 5 vezes com tampão de Tyrode e fragmentados com finas tesouras em réplicas de cerca de 200 mg de peso seco. As réplicas são suspendidas em 3 ml de tampão contendo várias concentrações de paclitaxel a 37°C e testadas (5 minutos mais tarde) com 0.2 pg/ml de antigéneo E. Após 15 minutos de incubação com o antigéneo, os difusados são removidos e o tecido fervido em tampão fresco durante 10 minutos para extrair a histamina residual. A libertação de histamina e SRS-A são determinadas usando HPLC. EXEMPLO 40
ADMINISTRAÇÃO PERIVASCULAR DE AGENTES DISRUPTORES DAS FUNÇÕES
MICROTUBULARES
Foram conduzidos estudos para avaliar a eficácia de filme EVA ou pasta cirúrgica (PCL) carregada com paclitaxel-camptotecina como tratamento perivascular de restenose. A. Materiais e métodos
Foram anestesiados por injecção intramuscular de Innovar (0.33 ml/kg) ratos WISTAR pesando 250 a 300 g. Após sedação, foram anestesiados com Halotano. Após estabelecimento da anestesia geral, rapou-se o pelo na região do pescoço, prendeu-se a pele com pinças e lavou-se com zaragatoa com Betadine. Fez-se uma incisão vertical sobre a artéria carótida esquerda e a artéria carótida externa foi exposta. Colocaram-se duas ligaduras à volta da artéria carótida externa e procedeu-se a uma arteriotomia transversa. Introduziu-se então um cateter de balão French Fogarty número 2 na artéria carótida, que foi passado para dentro da artéria carótida comum esquerda e o balão foi insuflado com solução salina. O endotélio foi desnudado por passagem do balão insuflado para cima e para baixo da artéria carótida três vezes. O cateter foi então removido, e a ligadura desatada da artéria carótida externa esquerda.
Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de 10 para receber nenhum tratamento, polímero simples (filme EVA ou pasta PCL), ou polímero mais 20% de paclitaxel. A mistura polimérica (2.5 mg) foi colocada de forma circunferencial em tomo da artéria carótida. A ferida foi então fechada. Foram sacrificados cinco ratos de cada grupo ao 122
14° e os restantes 5 ao 28° dias. Entretanto, os ratos foram observados para perda de peso ou ourros sinais de doença sisiémiea. Após i4 ou 28 dias, os animais foram aiicsicsiauos c a artéria carótida esquerda isolada, fixada com formaldeido tamponizado a 10% e examinadas histologicamente.
Num estudo preliminar, dois ratos foram tratados com filme EVA carregado com camptotecina a 10% durante 14 dias para determinar a eficácia da camptotecina neste modelo de doença. B. Resultados
Os resultados deste estudo revelaram que os polímeros carregados com paclitaxel (20%) preveniam completamente a restenose, enquanto que nos animais controlo e nos animais que receberam polímero simples houve desenvolvimento de compromisso luminal entre 28% e 55%, 14 e 28 dias após os danos com o balão (Figuras 76A e 76B).
Houve uma inibição absoluta de hiperplasia intimai quando o paclitaxel esteve em contacto com a parede do vaso. No entanto, o efeito foi muito localizado, como evidenciado pelo efeito não homogéneo do paclitaxel onde não foi possível manter o fármaco adjacente à parede do vaso (Figuras 77A e 77B).
Os dados preliminares mostram que o filme EVA carregado com camptotecina foi eficaz na prevenção de resposta restenótica no modelo animal da doença. A camptotecina inibiu completamente a hiperplasia intimai nos dois animais testados. EXEMPLO 41 (Exemplo de Referência) EFEITOS DO PACLITAXEL NUM MODELO ANIMAL DE ADESÃO CIRÚRGICA Foi examinado o uso de filmes EVA carregados com paclitaxel para reduzir a formação de adesão no modelo de trompa uterina de coelho.
Anestesiam-se coelhos brancos fêmea da Nova Zelândia e efectua-se laparotomia através de uma incisão central. As trompas uterinas são expostas e um segmento de 5 cm de comprimento de cada é raspada com uma lâmina de bisturi. Esta acção abrasiva é suficiente para remover a membrana serosa, resultando em sangramento pontilhado. Os coelhos são distribuídos aleatoriamente pelos grupos controlo ou de tratamento com paclitaxel e por períodos de avaliação pós-operatória ás duas, quatro e oito semanas. No grupo tratado com paclitaxel, cada trompa uterina é completamente envolvida em filme EVA carregado com 123
paclitaxel após a acção abrasiva. A camada musculoperitonial é fechada com suturas e a camada cutânia com Iragmentos de peie.
Os animais foram avaliados para formação de adesão dois, quatro ou oito semanais após a cirurgia. Os animais são humanamente submetidos a eutanásia e efectuadas autópsias. As trompas uterinas são examinadas grosseiramente e histologicamente usando técnicas Standard de microscopia. Grosseiramente, adesões são graduadas usando um sistema de classificação Standard que é baseado no facto de 5 cm da trompa uterina estar traumatizada; assim, a extensão de formação de adesão é determinada medindo a área que contém adesões. Usa-se o seguinte sistema de classificação: 0 = nenhuma adesão, 1 = adesão em 25% da área, 2 = adesão em 50% da área, 3 = adesão na totalidade do envolvimento. A severidade da adesão é medida da seguinte forma: 0 = nenhuma resistência à separação, 0.5 = alguma resistência (necessária força moderada), 1 = necessária dissecção fina. A classificação total é aditiva, com as classificações de 0 - 4 representando tanto extensão como severidade. EXEMPLO 42 (Exemplo de Referência")
PACLITAXEL MICELAR NO TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL (ΊΒΡ1 A doença inflamatória intestinal (IBD), nomeadamente a doença de Crohn e a colite ulcerosa, caracteriza-se por períodos de abrandamento e remissão. O melhor modelo disponível de IBD é produzido no rato por injecção intracolónica de ácido de 2,4,6-trinitrobenzeno sulfónico (TNB) numa solução etanólica e salina (Morris et al., Gastroenterology, 96: 795-803, 1989). Uma única administração inicia uma inflamação crónica e aguda que persiste durante várias semanas. No entanto, farmacologicamente, o cólon de coelho tem mostrado mais semelhanças com o cólon humano do que o rato. ('Gastroenterology, 99: 13424-13432, 1990).
Usaram-se em todos os ensaios coelhos brancos da Nova Zelândia. Os animais são anestesiados por via intravenosa (i.v.) com pentobarbitol. Insere-se rectalmete um tubo de alimentação infantil, de forma a que a ponta se encontre 20 cm proximal ao anus, para injecção de TNB (0.6 ml; 40 mg em 25% de etanol em solução salina). Uma semana após a administração de TNB, os coelhos são aleatoriamente distribuídos em 3 grupos de tratamento. Por esta altura, os animais ou não recebem nenhum tratamento, ou receberam micelas simples 124 (i.v.) ou paclitaxel micelar (i.v.). Isto repete-se todos os 4 dias durante um total de 4 rratamentos.
Durante o decurso do estudo, os coelhos são examinados semanalmente por endoscopia usando um bronquioscópio pediátrico e sob anestesia geral, induzida como descrito acima. Os danos são quantificados por um endoscopista (desconhecedor), de acordo com a escala seguinte: 0, nenhuma anomalia; 1, inflamação, sem ulceração; 2, inflamação e ulceração em 1 local (< 1 cm); 3, dois ou mais locais de inflamação e ulceração ou um local principal de inflamação e ulceração (>1 cm) ao longo do comprimento do cólon.
Após o último tratamento, os coelhos são sacrificados com eutanol às 24 horas e 1, 2, 4 e 6 semanas. O cólon inteiro é isolado, ressectado e aberto ao longo do limite anti-mesentérico, lavado com solução salina e colocado em solução de sal equilibrada de Hank’s contendo antibióticos. O cólon é examinado com um estereomicroscópio e classificado de acordo com os mesmos critérios da endoscopia. Da mesma forma, na autópsia são seleccionadas amostras ao longo de todo o comprimento do cólon, desde o anus até ao cólon ascendente, tanto de zonas obviamente inflamadas ou ulceradas como de cólon normal. Os tecidos são fixados com formaldeído a 10% e processados para embeber em parafina; são cortadas secções de 5 pm e coradas com hemotoxilina e eosina. Examinam-se as lâminas para a presença ou ausência de histopatologia de IBD. O ensaio inicial pode ser modificado para utilização de paclitaxel oral após a indução de colite em coelhos pela injecção intracolónica de TNB. Os animais são distribuídos aleatoriamente em 3 grupos, não recebendo tratamento, recebendo veículo simples ou recebendo paclitaxel formulado oralmente. EXEMPLO 43 fExemplo de Referência! EFEITO DO PACLITAXEL NUM MODELO ANIMAL DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Determinou-se a eficácia de paclitaxel num modelo animal de lupus eritematoso sistémico tratando fêmeas de ratos NZB/NZW Fi (B/W) com paclitaxel micelar. Esta estirpe de ratos desenvolve uma doença semlhante ao SLE humano. Com um mês de idade, estes ratos, comparados com ratos normais, têm um nível elevado dè células B no fígado, que segregam imunoglobulinas expontaneamente. Aos 2 meses de idade há um elevado nível de anticorpos anti SS-DNA. Aos 5 meses de idade, as imunoglobulinas acumulam-se ao longo 125 das paredes dos capilares glomerulares. Pelos 9 meses de idade, desenvolve-se uma giumeruiuneiriic, c juyo uus raius r>/ w iiiuitcih. A. Materiais e Métodos
Os ratos fêmea B/W são adquiridos no The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Distribuem-se aleatoriamente por grupos de controlo e tratamento os ratos fêmea B/W com cinco meses de idade. Os grupos de tratamento recebem ou uma dose baixa contínua de paclitaxel micelar (2.0 mg/kg; 3 vezes por semana, total de 10 injecções) ou uma dose elevada “de choque” de paclitaxel micelar (20 mg/kg; quatro vezes, semanalmente). O grupo controlo recebe micelas de controlo. A intervalos de tempo pré determinados, os ratos B/W com idades comparáveis tratados com paclitaxel ou controlos não tratados são sacrificados, removem-se os seus fígados assepticamente e preparam-se suspensões de células únicas para contagem de linfócitos. Para identificar as sub-populações de linfócitos de fígado, é conduzida uma análise com fluorescência. O número de células/milhão de células B de fígado que segregam imunoglobulinas (IgG, IgM, imunoglobulinas totais) expontaneamente, ou anticorpos anti ss-DNA é determinado usando ELISA.
Lisboa, -8*513001
ÍRANCISCO DE NOVAES
AGENTE OEiCIAL DA PROPRIEDADE INDUS TRIAL
Av. Ducf.:3 D' Ávila, 32, T - 1C00 LIS30A Ta.: S47763 / 3155038 126

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES í- Uso de um agenie cuiii-imcru iu'uuiai para u launeu uc um iiicdiumnciiíG põiâ tratar a esclerose múltipla, caracterizado pelo facto de o medicamento ser adequado para administração a um doente em quantidade com eficácia terapêutica do dito agente anti-microtubular, de tal forma que a dita esclerose múltipla é tratada, o agente não sendo um derivado de calcone com a estrutura: 0
    C CH
  2. 2- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do referido agente anti-microtubular ser seleccionado do grupo que consiste em epotilona A ou B, discodermolida, óxido de deutério (D20), hexilenoglicol, tubercidina, LY290181, fluoreto de alumínio, bis-(succinimidilsuccinato) de etilenoglicol, ester de etilglicina, bem assim como análogos ou derivados destes.
    *2 Em que Ar é um grupo 2,5-dimetoxifenil, 2,3,4-trimetoxifenil, ou 3,4,5-trimetoxifenil Ri é um hidrogénio, grupo alquilo (C1-C4), cloro ou bromo; e R2 é um -N(R)2 ou -NHCOR em que R é um grupo alquilo (C1-C4), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
  3. 3- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido agente anti-microtubular ser o paclitaxel, ou um análogo ou derivado deste.
  4. 4- O uso, conforme reivindicado nas reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o referido agente anti-microtubular ser adequado para administração subcutânea ou intramuscular.
  5. 5- O uso, conforme reivindicado nas reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o referido agente anti-microtubular ser adequado para administração oral ou intravenosa. 1
  6. 6- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o icícimu pacliuiAci ser adequado para administração na dosagem de 10 a 50 mg/m2, uma vez a cada uma a quatro semanas.
  7. 7- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido paclitaxel ser adequado para administração na dosagem de 50 a 250 mg/m2, a cada 1-21 dias por 1-6 ciclos.
  8. 8- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o referido agente compreender também um polímero.
  9. 9- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero ser formado em microsferas com uma dimensão média entre 0.5 e 200 pm.
  10. 10- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero ser um copolímero de ácido láctico e ácido glicólico.
  11. 11- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero compreender poli(caprolactona).
  12. 12- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero compreender poli(ácido láctico).
  13. 13- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto o aqui referido polímero ser um copolímero de poli(ácido láctico) e polietilenoglicol.
  14. 14- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero ser um copolímero de poli(caprolactona) e polietilenoglicol.
  15. 15- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero compreender acetato de etilenovinil.
  16. 16- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero compreender miristato de isopropil.
  17. 17- O uso, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido polímero ser um polímero de bloco duplo ou triplo. -8. ASO. 2001 Lisboa,
    FRANCISCO DE NOVAES AGENTE OFICIAL DA PROPREDADE INDUSTRIAL Av. Duque D' Ávila, 32, í - 10CO LISBOA TEL.: 547763/3155038 2
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