DE69724016T2

DE69724016T2 - Verwendung von anti-mikrotubuli mitteln zur behandlung von entzündlichen erkrankungen der atemwege

Info

Publication number: DE69724016T2
Application number: DE69724016T
Authority: DE
Inventors: William L. Hunter
Original assignee: Angiotech International AG
Current assignee: Angiotech International AG
Priority date: 1996-12-02
Filing date: 1997-12-02
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2017-12-03
Also published as: EP1582210A3; KR20050098031A; HK1033422A1; EP0941089A2; DE69704877D1; CN101011576B; DE69722681D1; BR9713673A; KR20000069265A; EP1090637A3; EP1092433A2; DE69722681T2; JP2002226399A; JP2001503785A; DE69724016D1; EP1092433A3; EP0941089B1; ATE201138T1; EP1070502A2; ATE241977T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung eines Anti-Mikrotubuli-Mittels zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen entzündliche Erkrankungen der Atemwege.
Hintergrund der Erfindung
Entzündliche Erkrankungen, ob von einer chronischen oder akuten Natur, stellen ein substantielles Problem in der Gesundheitsversorgungs-Industrie dar Kurz gesagt, wird chronische Entzündung als Entzündung von einer verlängerten Dauer (Wochen oder Monate) betrachtet, in denen aktive Entzündung, Gewebezerstörung und Versuche zur Heilung gleichzeitig fortschreiten (Robbins Pathological Basis of Disease by R. S. Cotran, V. Kumar, and S. L. Robbins, W. B. Saunders Co., p. 75, 1989). Obwohl chronische Entzündung einer akuten Entzündungsepisode folgen kann, kann sie ebenfalls als ein schleichender Prozeß beginnen, der mit der Zeit fortschreitet, z. B. als ein Ergebnis einer persistenten Infektion (z. B., Tuberkulose, Syphilis, Pilzinfektion) die eine verzögerte Hypersensitivitätsreaktion, verlängerte Exponierung gegenüber endogenen (z. B. erhöhten Plasmalipiden) oder exogenen (z. B. Silica, Asbest, Zigarettenteer, chirurgischem Nahtmaterial) Toxinen verursacht oder als Autoimunreaktionen gegen die Gewebe des eigenen Körpers (z. B., rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus Erythematosus, Multiple Sklerose, Psoriasis). Chronische Entzündungserkrankungen schließen daher viele verbreitete medizinische Konditionen, so wie Rheumatoidarthritis, Restenosis, Psoriasis, Multiple Sklerose, chirurgische Adhäsionen, Tuberkulose und chronische Entzündungserkrankungen der Lunge (z. B. Asthma, Pneumoconiose, chronische obstruktive Lungenerkrankung, nasale Polypen und pulmonare Fibrose) ein.
Entzündliche Lungenerkrankungen
Chronische entzündliche Lungenerkrankungen, einschließlich zum Beispiel Asthma, Pneumoconiose, chronische obstruktive Lungenerkrankung, Nasenpolypen und Lungenfibrose, beeinträchtigen viele Leute weltweit. Typischerweise sind solche Krankheiten durch einen invasiven entzündlichen Prozeß und durch eine Verdickung der betroffenen Gewebe gekennzeichnet.
Zum Beispiel sind Nasenpolypen durch ein verdicktes Gewebe der Nasenschleimhaut gekennzeichnet. Polypen können bei respiratorischen Krankheiten, wie etwa Asthma, zystischer Fibrose, primärer Ciliendyskinesie und Immunschwächen, auftreten. Es wird davon ausgegangen, daß Nasenpolypen sich als Ausprägung von chronischen entzündlichen Prozessen, die die oberen Atemwege betreffen, entwickeln. Sie werden bei 36% von Patienten mit einer Aspirin-Intoleranz, 7% bei solchen mit Asthma, 0,1% bei Kindern und ungefähr 20% bei Patienten mit zystischer Fibrose gefunden. Andere Zustände, die mit Nasenpolypen assoziiert sind, sind das Churg-Strauss-Syndrom, allergische Pilz-Sinusitis und Cilien-dyskinetisches Syndrom und Youngsches Syndrom. Ungefähr 40% der Patienten mit einer chirurgischen Polypektomie zeigen ein Wiederauftreten (Settipane, Allergy Asthma Proc. 17(5): 231–236, 1996).
Die Hauptsymptome der Nasenpolypose sind Nasenverstopfung und Störung des Geruchssinns. Die Ziele einer medizinischen Behandlung einer Nasenpolypose sind (1) die Eliminierung von Nasenpolypen und Rhinitis-Symptomen, (2) eine Wiederherstellung der Nasenatmung und des Geruchssinns, und (3) eine Verhinderung eines Wiederauftretens. Ein Verschluß des Nasenwegs durch einige wenige große Polypen kann durch eine einfache Polypektomie behandelt werden, um dem Patienten zu helfen, durch die Nase zu atmen. Das Ziel einer Operation ist es, die physiologischen Eigenschaften der Nase wiederherzustellen, indem der Luftweg so frei wie möglich von Polypen gemacht wird, und eine Drainage der infizierten Höhlen zu ermöglichen. Jedoch ist eine wiederauftretende Nasen-Polypose eines der häufigsten ungelösten Probleme der klinischen Rhinologie. Eine komplementäre medizinische Behandlung der Polypose ist immer notwendig, da eine Operation nicht die entzündliche Komponente der Schleimhauterkrankung behandeln kann. Topische Corticosteroide sind die am weitesten verwendete Behandlung, um die Größe der Polypen zu reduzieren und um ein Wiederauftreten nach der Operation zu verhindern. Steroide verringern die Rhinitis, verbessern die Nasenatmung, reduzieren die Größe der Polypen und verringern die Wiederauftretungsrate, aber sie haben einen vernachlässigbaren Effekt auf den Geruchssinn und auf jegliche Sinus-Pathologie. Die Verwendung von Steroiden bei der Polypose ist jedoch mit infektiösen Komplikationen assoziiert, die Antibiotika erfordern. Andere Arzneien zur Behandlung von Nasen-Polypose schließen H1-Rezeptor-Antagonisten (z. B. Azelastin HCL) und Anti-Diuretica (z. B. Furosemid) ein. Diese Behandlungen sind nicht immer effektiv, und die Rückfallraten sind immer noch sehr hoch. Die gegenwärtige medizinische Behandlung der Nasen-Polypose verwendet Corticosteroide, um die Symptome der Krankheit zu lindern, hat aber keine Wirkung gegen die der Krankheit zugrundeliegenden Pathologie. Zusätzlich ist ein Wiederauftreten der Krankheit oder eine Resistenz gegenüber einer Steroidtherapie bei Patienten mit Nasenpolypen beobachtet worden.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen entzündliche Krankheiten der Atemwege bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Anti-Mikrotubuli-Mittels zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen entzündliche Erkrankungen zur Verfügung, umfassend Zuführung eines Anti-Mikrotubuli-Mittels zu einer entzündlichen Stelle. Repräsentative Beispiele von solchen Mitteln schließen Taxane (z. B., Paclitaxel und Docetaxel), Campothecin, Eleutherobin, Sarcodictyine, Epothilone A und B, Discodermolid, Deuteriumoxid (D₂O), Hexylenglykol (2-Methyl-2,4-pentanediol), Tubercidin (7-Deazaadenosin), LY290181 (2-Amino-4-(3-pyridyl)-4H-naphto(1,2-b)pyran-3-cardonitril), Aluminiumfluorid, Ethylenglykol-bis-(succinimidylsuccinat), Glyzinethylester, monoklonale anti-idiotypische Antikörper, Mikrotubulus Assembly Promoting Protein (Taxol-ähnliches Protein, TALP), Zellquellung induziert durch hypotonische (190 mosmol/l) Bedingungen, Insulin (100 mmol/l) oder Glutamin (10 mmol/l), Dyneinbindung, Gibberelin, XCHO1 (Kinesin-ähnliches Protein), Lysophosphatidsäure, Lithiumion, Pflanzen-Zellwandkomponenten (z. B. Poly-L-lysin und Extensin), Glyzerinpuffer, Triton X-100 Mikrotubulus-stabilisierender Puffer, Mikrotubulus assoziierte Proteine (z. B. MAP2, MAP4, tau, big tau, Ensconsin, Elongation factor-1-alpha (EF-1α) und E-MAP-115), zelluläre Bestandteile (z. B. Histon H1, Myelinbasisches Protein und Kinetochore), endogene mikrotubuläre Strukturen (z. B. axonemale Strukturen, Plugs und GTP-Kappen), stabile Tubulus-only-Polypetide (z. B. STOP145 und STOP220) und Spannung durch mitotische Kräfte, sowie jegliche Analoga und Derivate von einem der oben Genannten. Innerhalb anderer Ausführungsformen ist das Anti-Mikrotubuli-Mittel formuliert, um weiter ein Polymer zu umfassen.
Innerhalb bestimmter Ausführungsformen können die gemäß der Erfindung verwendeten Anti-Mikrotubuli-Mittel zusammen mit anderen Verbindungen oder Zusammensetzungen formuliert werden, so wie z. B. eine Einreibung, Creme, Lotion, Gel, Spray oder ähnlichem. Innerhalb bestimmter Ausführungsformen kann die Verbindung oder Zusammensetzung als ein Träger fungieren, der entweder polymerisch oder nicht-polymerisch sein kann. Repräsentative Beispiele von polymerischen Trägern schließen Poly(ethylenvinylacetat), Copolymere von Milchsäure und Glykolsäure, Poly(caprolakton), Poly(milchsäure), Copolymere von Poly(milchsäure) und Poly(caprolakton), Gelatine, Hyaluridonsäure, Kollagenmatrizes und Albumin ein. Repräsentative Beispiele von anderen geeigneten Trägern schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Ethanol; Gemische von Ethanol und Glykolen (z. B. Ethylenglykol oder Propylenglykol); Gemische von Ethanol und Isopropylmyristat oder Ethanol, Isopropylmyristat und Wasser (z. B. 55 : 5 : 40); Gemische von Ethanol und Eineol oder D-Limonen (mit oder ohne Wasser); Glykole (z. B., Ethylenglykol oder Propylenglykol) und Gemische von Glykolen, so wie Propylenglykol und Wasser, Phosphatidylglyzerin, Dioleoylphosphatidylglyzerin, Transcutol^®, oder Terpinolen und Gemische von Isopropylmyristat und 1-Hexyl-2-pyrrolidon, N-Dodecyl-2-pipridinon oder 1-Hexyl-2-pyrrolidon.
Innerhalb noch anderer Aspekte kann das Anti-Mikrotubuli-Mittel so formuliert werden, um innerhalb einer chirurgischen oder medizinischen Vorrichtung oder eines Implantats, wie, z. B., Stents, Nahtmaterialien, Verweilkathetern, Prothesen und ähnlichen, enthalten zu sein oder von diesen freigesetzt zu werden.
Diese und andere offenbarte Aspekte werden nach Bezugnahme auf die folgende genaue Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen offensichtlich werden. Zusätzlich sind verschiedene Referenzen im folgenden angegeben, die verschiedene Verfahren, Vorrichtungen oder Zusammensetzungen genauer beschreiben und daher durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt einen Graphen, der die Chemilumineszenzantwort von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/ml) zu Plasma-opsonisierten CPPD Kristallen (50 mg/ml) zeigt. Effekt von Paclitaxel (auch als „Taxol" bezeichnet) bei (o) kein Paclitaxel, (•) 4,5 μM, (Δ) 14 μM,
28 μM, (☐) 46 μM; n = 3. 1B ist ein Graph, der den zeitlichen Verlauf der Konzentrationsab hängigkeit der Paclixatelinhibierung von plasmaopsonisierten CPPD Kristall-induzierten Neutrophilen-Chemilumineszenz darstellt. 1C ist ein Graph, der den Effekt von Aluminiumfluorid auf opsonisierte Zymozan-induzierte Neutrophilen-Aktivierung, durch Chemolumineszenz gemessen, zeigt. 1D ist ein Graph, der den Effekt von Glyzinethylester auf opsonisierte Zymozan-induzierte Neutrophilen-Aktivierung, durch Chemilumineszenz gemessen, zeigt. 1E zeigt einen Graph, der den Effekt von LY290181 auf die opsonisierte Zymozan-induzierte Neutrophilen-Chemilumineszenz zeigt.
2 ist ein Graph, der die Lysozym-Freisetzung von Neutrophilen (5 × 10⁶/ml) in Antwort auf plasmaopsonisierte CPPD Kristalle (50 mg/ml) zeigt. Effekte von Paclitaxel, bei (o) kein Paclitaxel, (•) 28 μM, (Δ) Kontrolle (Zellen allein),
Kontrolle (Zellen und Paclitaxel bei 28 μM); n = 3.
3A ist ein Graph, der die Superoxidanionproduktion durch Neutrophile (5 × 10⁶ Zellen/ml) in Antwort auf plasmaopsonisierte CPPD Kristalle (50 mg/ml) zeigt. Effekt von Paclitaxel, bei (o) kein Paclitaxel (•) 28 μM, (Δ) Kontrolle (Zellen allein); n = 3. 3B in ein Graph, der den Zeitverlauf der Konzentrationsabhängigkeit von Paclitaxel-Inhibierung von plasmaopsonisierten CPPD Kristall-induzierten Neutrophilen-Superoxidanionproduktion zeigt; n = 3. 3C ist ein Graph, der den Effekt von LY290181 auf CPPD Kristallinduzierte Neutrophilen-Superoxidanionerzeugung darstellt.
4A ist ein Graph, der die Chemilumineszenzantwort von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/nil) in Antwort auf plasmaopsonisiertes Zymosan (1 mg/ml) zeigt. Effekt von Paclitaxel, bei (o) kein Paclitaxel, (•) 28 μM; n = 3. 4B ist ein Graph, der die plasmaopsonisierte Zymosan-induzierte Neutrophilen-Superoxidanionproduktion darstellt. Effekt von Paclitaxel, bei (o) kein Paclitaxel, (•) 28 μM, (Δ) Kontrolle (Zellen allein); n = 3.
5A ist ein Graph, der die Freisetzung von Myeloperoxidase von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/ml) in Antwort auf plasmaopsonisierte CPPD Kristalle (50 mg/ml) zeigt. Effekt von Paclitaxel, bei (o) kein Paclitaxel, (•) 28 μM, (Δ) Kontrolle (Zellen allein),
Kontrolle (Zellen mit Paclitaxel bei 28 μM); n = 3. 5B ist ein Graph, der die Konzentrationsabhängigkeit der Paclitaxelinhibierung der Myeloperoxidasefreisetzung von Neutrophilen in Antwort auf plasmaopsonisierte CPPD Kristalle zeigt; n = 3. 5C und 5D sind Gra phen die zeigen, daß LY290181 sowohl die Lysozym als auch die Myeloperoxidasefreisetzung in CPPD Kristall- induzierten Neutrophilen verringert.
6 ist ein Graph, der die Teilung von Synoviozyten bei verschiedenen Konzentrationen von Paclitaxel zeigt.
7 ist ein Graph, der die Effekte von Paclitaxel auf Keratinozyten in vitro zeigt.
8A und 8B zeigen den Effekt von Paclitaxel auf Astrozytenmorphologie. Elektronenmikroskopische Bilder zeigten dicke, gut-organisierte filamentöse Prozesse in Astrozyten von transgenen Kontrolltieren, wohingegen transgene Tiere, die mit Paclitaxel behandelt wurden morphologisch veränderte Astrozyten aufwiesen. Paclitaxel induzierte eine Astrozyten-Zellabrundung, verdünnte zelluläre Prozesse und reduzierte zytoplasmatische Filamente im Vergleich zu unbehandelten Tieren.
9 ist ein Graph, der die Lebensfähigkeit von EOMA Zellen zeigt, die mit Paclitaxelkonzentrationen von mehr als 10^–8 M behandelt wurden.
10 zeigt ein Balkendiagramm, das die Prozentzahlen von apoptotischen EOMA Zellen in Kultur zeigt, die mit ansteigenden Konzentrationen von Paclitaxel behandelt wurden.
11A–11E sind Graphen, die den Effekt von verschiedenen Anti-Mikrotubuli-Mitteln auf Synoviozyten nach einer Zeitdauer von 24 Stunden zeigen.
12A–12H sind Blots, die den Effekt von verschiedenen Anti-Mikrotubuli-Mitteln bei der Inhibierung der Kollagenaseexpression zeigen.
13A–13H sind Blots, die den Effekt von verschiedenen Anti-Mikrotubuli-Mitteln auf die Proteoglykanexpression zeigen.
14A und 14B sind zwei Photographien einer CAM, der einen Tumor aufweist, der mit Kontroll (unbeladener) Thermopaste behandelt wurde. Kurz gesagt, ist die zentrale weiße Masse in 14A das Tumorgewebe. Beachte die Fülle von Blutgefäßen, die in den Tumor von der CAM in alle Richtungen eindringen. Der Tumor induziert die Einwachsung der Wirtsvaskulatur durch die Produktion von „angiogenen Faktoren". Das Tumorgewebe erstreckt sich distal entlang der Blutgefäße, die es versorgen. 14C ist eine Ansicht der Unterseite der in 15A gezeigten CAM. Kurz, zeigt diese Ansicht das radiale Auftreten der Blutgefäße, die in den Tumor wie die Speichen eines Rades eindringen. Beachte, daß die Blutgefäßdichte in der Nähe des Tumors größer ist als in der normalen umgebenden CAM Gewebe. 14C und 14D sind zwei Photographien einer CAM mit einem Tumor, der mit 20% Paclitaxel-beladener Thermopaste behandelt ist. Kurz ist die zentrale weiße Masse in 14C das Tumorgewebe. Beachte die geringe Zahl von Blutgefäßen in der Nähe des Tumorgewebes. Die verzögerte Freisetzung des Anti-Mikrotubuli-Mittels ist in der Lage, den durch den Tumor produzierten angiogenetischen Stimulus zu überwinden. Der Tumor selber wird wenig vaskularisiert und nimmt zunehmend in seiner Größe ab. 14D ist von der Unterseite der in 14C gezeigten CAM heraufgenommen und verdeutlicht die Unterbrechung des Blutflusses in den Tumor, wenn mit Kontrolltumorgewebe verglichen. Beachte, daß die Blutgefäßdichte in der Nähe des Tumors reduziert ist und geringer ist, als die des normalen umgebenden CAM Gewebes.
15A zeigt eine Photographie, die eine schalenlose Eikultur am Tag 6 zeigt. 15B ist ein digitalisiertes Computer-dargestelltes Bild von lebenden, ungefärbten Kapillaren (1040 ×), das mit einem Stereomikroskop aufgenommen wurde. 15C zeigt eine Photographie eines Korrosion-abgusses der die chorioallentische Membran (CAM)-Mikrovaskulatur zeigt, die durch größere, darunterliegende Gefäße (Pfeile; 1300 ×) versagt werden. 15D zeigt eine Photographie, die einen 0,5 mm dicken plastischen Sektionsschnitt transvers durch die CAM zeigt und bei Lichtmikroskop Level aufgezeichnet ist. Diese Photographie zeigt die Zusammensetzung die CAM, daß ein äußeres doppellagiges Ectoderm (Ec), ein Mesoderm (M), das Kapillaren (Pfeile) und verteilte adventitiale Zellen enthält und ein einzellagiges Endoderm (En) (400 ×). 15E zeigt eine Photographie bei elektronenmikroskopischem Level (3500 ×), worin eine typische kapilläre Struktur gezeigt wird, die dünnwandige Endothelzellen (Pfeilspitzen) und eine assoziierte Perizyte zeigt.
16A, 16B, 16C und 16D sind eine Serie von digitalisierten Bildern von vier verschiedenen ungefärbten CAMen, die nach einer 48-stündigen Exposition zu 10 μg Paclitaxel pro 10 ml Methylzellulose aufgenommen sind. Die durchsichtige Methylzellulose-Scheibe (*), die Paclitaxel enthält, ist auf jeder CAM vorhanden und ist über einer einzelnen avaskulären Zone (A) mit umgebenden Blutinseln (Is) positioniert. Diese avaskulären Bereiche erstrecken sich über die Scheibe hinaus und weisen typischerweise einen Durchmesser von ungefähr 6 mm auf. 16D zeigt den typischen „Ellbogen" Effekt (Pfeilspitzen) von sowohl schmalen und großen Gefäßen, die weg von der Peripherie der avaskulären Zone gerichtet sind.
17A ist eine Photographie (= 400 ×) die zeigt, daß die Kapillaren (Pfeilspitzen) unmittelbar peripher zu der avaskulären Zone eine Vielzahl von Endothelzellen aufweisen, die in der Mitose festgehalten sind. Ectoderm (Ec); Mesoderm (M); Endoderm (En). 17B (_ 400 ×) zeigt, daß innerhalb der avaskulären Zone die typische kapilläre Struktur gründlich eliminiert wurde und daß zahlreiche extravasierte Blutzellen (Pfeilspitzen) vorhanden sind. 17C (= 400 ×) zeigt, daß in dem zentralen Bereich der avaskulären Zone rote Blutzellen -innerhalb des Mesoderms verteilt sind.
18A (= 2200 ×) zeigt eine schmale Kapillare, die unterhalb der ectodermalen Lage (EC) liegt, die drei Endothelzellen besitzt, die in der Mitose festgehalten sind (*). Verschiedene andere Zelltypen in sowohl dem Ectoderm und Mesoderm sind ebenfalls in der Mitose festgehalten. 18B (= 2800 ×) zeigt die frühe avaskuläre Phase, die extravasierte Blutzellen direkt unterhalb des Ectoderms enthält; diese Blutzellen sind mit vermutlichen Endothelzellen (*) und ihren Ausstülpungen vermischt. Degradative zelluläre Vakuolen (Pfeilspitzen). 18C (= 2800 ×) zeigt, daß in Antwort auf Paclitaxel die ecto-mesodermale Grenzfläche mit Zellen in verschiedenen Phasen des Abbaus, die dichte Vakuolen und Granulae (Pfeilspitzen) enthalten, besiedelt wird.
19A stellt schematisch die transkriptionelle Regulation von Matrix-Metalloproteinasen dar. 19B ist ein Blot, der zeigt, daß IL-1 die AP-1 transkriptionelle Aktivität stimuliert. 19C ist ein Graph, der zeigt, daß die IL-1 induzierte Bindungsaktivtät in Lysaten von Chondrozyten, die mit Paclitaxel vorbehandelt wurden, abnimmt.
20 ist ein Blot, der zeigt, daß IL-1 Induktion die Kollagenase und Stromelisin-RNA Level in Chondrozyten erhöht, und daß diese Induktion durch eine Vorbehandlung mit Paclitaxel inhibiert werden kann.
21 ist ein Balkendiagramm, das die Effekte von Paclitaxel auf die Lebensfähigkeit von normalen Chondrozyten in vitro zeigt.
22 ist ein Graph, der jeweils den beobachteten pseudo Abbau erster kinetischer Ordnung von Paclitaxel (20 μm ml^–1 in 10% HPβCD und 10% HPγCD Lösungen bei 37°C und jeweils pH von 3,7 und 4,9 darstellt).
23 zeigt einen Graph, der die Phasenlöslichkeit für Cyclodextrine und Paclitaxel in Wasser bei 37°C zeigt.
24 ist ein Graph, der Diagramme zweiter Ordnung der Komplexierung von Paclitaxel und γCD, HPβCD oder HPγCD bei 37°C zeigt.
25 ist eine Tabelle, welche die Schmelztemperatur, Enthalpie, das Molekulargewicht, die Polydispersität und intrinsische Viskosität einer PDLLA-PEG-PDLLA Zusammensetzung zeigt.
26 ist ein Graph, der DSC Thermogramme von PDLLA-PEG-PDLLA und PEG zeigt. Die Erhitzungsrate war 10°C/Min. Siehe 30 für Schmelztemperaturen und Enthalpien.
27 ist ein Graph, der die kumulative Freisetzung von 20% Paclitaxel-beladenen PDLLA-PEG-PDLLA Zylindern in PBS Albuminpuffer bei 37°C zeigt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 4 Proben dar. Zylinder von 40% PEG wurden nach 4 Tagen aufgrund ihrer Auflösung entfernt.
28A, 28B und 28C sind Graphen, welche die Veränderung in den Dimensionen, der Länge (A), dem Durchmesser (B) und dem Naßgewicht (C) von mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA-PEG-PDLLA Zylindern während der in vitro Freisetzung von Paclitaxel bei 37 °C zeigen.
29 ist eine Tabelle, welche den Masseverlust und die Polymerzusammensetzungsveränderung von PDLLA-PEG-PDLLA Zylindern (beladen mit 20% Paclitaxel) während der Freisetzung in PBS Albuminpuffer bei 37°C zeigen.
30 ist ein Graph, der Gelpermeationschromatogramme von PDLLA-PEG-PDLLA Zylindern (20% PEG, 1 mm Durchmesser), die mit 20% Paclitaxel beladen sind, während der Freisetzung in PBS Albuminpuffer bei 37°C zeigt.
31A, 31B, 31C und 31D sind SEMs von getrockneten PDLLA-PEG-PDLLA Zylindern (beladen mit 20% Paclitaxel, 1 mm im Durchmesser) vor und während der Paclitaxel-Freisetzung. A: 20% PEG, Tag 0; B: 30% PEG, Tag 0; C: 20% PEG, Tag 69; D: 30% PEG, Tag 69.
32 ist ein Graph, der die gleichzeitige Freisetzung von Paclitaxel von 20% Paclitaxel beladenen PDLLA : PCL Gemischen und PCL in PBS Albuminpuffer bei 37°C zeigt. Die Federbalken stellen die Standardabweichung von 4 Proben dar.
33 ist ein Graph, der über einen Zeitverlauf hinweg die Freisetzung von Paclitaxel von PCL Pasten in PBS bei 37°C zeigt. Die PCL Pasten enthalten Mikropartikel von Paclitaxel und verschiedene Zusatzstoffe, hergestellt unter der Verwendung von mesh #140. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
34 ist ein Graph, der Zeitverläufe der Paclitaxelfreisetzung aus Paclitaxel-Gelatine-PCL Pasten in PBS bei 37°C darstellt. Dieser Graph zeigt die Effekte von Gelatinekonzentration (mesh #140) und die Größe von Paclitaxel-Gelatine (1 : 1) Mikropartikeln, die unter der Verwendung von mesh #140 oder mesh #60 hergestellt wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
35A und 35B sind Graphen, die den Effekt von Zusatzstoffen (17A; mesh #140) und die Größe von Mikropartikeln (17B; mesh #140 oder #60) und die Proportion der Zusatzstoffe (mesh #140) auf die Quellungseigenschaften von PCL Pasten, die 20% Paclitaxel enthalten, gefolgt von Suspension in destilliertem Wasser bei 37°C darstellen. Die Messungen für die Paste, die mit 270 μm Mikropartikeln in Paclitaxel-Gelatine und die Paste, die 30% Gelatine enthielt, wurden nach 4 Stunden aufgrund der Desintegration der Matrix abgebrochen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
36A, 36B, 36C und 36D sind repräsentative Scanning Elektronen-Mikrographien von Paclitaxel-Gelatine-PCL (20 : 20 : 60) Pasten vor (36A) und nach (36B) Suspendierung in destilliertem Wasser bei 37°C für 6 Stunden. Mikrographien 36C und 36D sind größere Vergrößerungen von 36B, die die enge Assoziierung von Paclitaxel (stabförmig) und Gelatinematrix zeigen.
37A und 37B sind repräsentative Photomikrographien von CAMs, die mit Gelatine-PCL (37A) und Paclitaxel-Gelatine-PCL (20 : 20 : 60; 37B) Pasten behandelt worden, die Zonen von Avaskularität in der Paclitaxel behandelten CAM zeigen.
38 ist ein Graph, der die Phasenlöslichkeit für Cyclodextrine und Paclitaxel in Wasser bei 37°C zeigt.
39 ist ein Graph, der Diagramme zweiter Ordnung der Komplexierung von Paclitaxel und γCD, HPβCD oder HPγCD bei 37°C zeigt.
40 ist ein Graph, der die Phasenlöslichkeit für Paclitaxel bei 37°C und Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin in 50 : 50 Wasser : Ethanollösungen zeigt.
41 ist ein Graph, der die Lösungsratenprofile von Paclitaxel in 0, 5, 10 oder 20% HPγCD Lösungen bei 37°C zeigt.
42 ist ein Graph, der den beobachteten pseudo Abbau erster kinetischer Ordnung von Paclitaxel (20 μg/ml) in 10% HPβCD und 10% HPγCD Lösungen bei 37°C und jeweils pH von 3,7 und 4,9 zeigt.
43A und 43B zeigen jeweils zwei Graphen, die die Freisetzung von Paclitaxel von EVA-Filmen und die Prozentsätze von in denselben Filmen über die Zeit verbleibendem Paclitaxel zeigen. 43C ist ein Graph, der die Quellung von EVA/F127 Filmen mit keinem Paclitaxel über die Zeit hinweg zeigt. 43D ist ein Graph, der die Quellung von EVA/Span 80 Filmen mit keinem Paclitaxel über die Zeit hinweg zeigt. 43E ist ein Graph, der eine Zug gegenüber Spannungskurve für verschiedene EVA/F127 Gemische zeigt.
44 ist ein Graph, der den Effekt von Plasmaopsonisierung von polymerischen Mikrosphären auf die Chemilumineszenzantwort von Neutrophilen (20 mg/ml Mikrosphären in 0,5 ml von Zellen (Konz. 5 × 10⁶ Zellen/ml)) auf PCL Mikrosphären zeigt.
45 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von Plasma +/– 2% Pluronic F127 auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/ml) auf PCL Mikrosphären zeigt.
46 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von Plasma +/– 2% Pluronic F127 auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/ml) auf PMMA Mikrosphären zeigt.
47 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von Plasma +/– 2% Pluronic F127 auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/ml) auf PLA Mikrosphären zeigt.
48 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von Plasma +/– 2% Pluronic F127 auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen (5 × 10⁶ Zellen/ml) auf EVA : PLA Mikrosphären zeigt.
49 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von IgG (2 mg/ml), oder 2% Pluronic F127 und dann IgG (2 mg/ml) auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen auf PCL Mikrosphären zeigt.
50 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von IgG (2 mg/ml), oder 2% Pluronic F127 und dann IgG (2 mg/ml) auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen auf PMMA Mikrosphären zeigt.
51 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von IgG (2 mg/ml), oder 2% P1uronic F127 und dann IgG (2 mg/ml) auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen auf PVA Mikrosphären zeigt.
52 ist ein Graph, der den Effekt der Vorbeschichtung von IgG (2 mg/ml), oder 2% Pluronic F127 und dann IgG (2 mg/ml) auf die chemilumineszente Antwort von Neutrophilen auf EVA : PLA Mikrosphären zeigt.
53A ist ein Graph, der die Freisetzungsratenprofile von Polycaprolakton-Mikrosphären zeigt, die 1%, 2%, 5% oder 10% Paclitaxel in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung bei 37 °C, enthalten, zeigt. 53B ist eine Photographie, die ein CAM zeigt, das mit Kontrollmikrosphären behandelt wurde. 53C zeigt eine Photographie, die ein CAM zeigt, das mit 5% Paclitaxel beladenen Mikrosphären behandelt wurde.
54 zeigt einen Graph, der den Bereich von Partikelgrößen für Kontrollmikrosphären (PLLA : GA – 85 : 15) zeigt.
55 zeigt einen Graph, der den Bereich von Partikelgrößen für 20% Paclitaxel beladene Mikrosphären (PLLA : GA – 85 : 15) zeigt.
56 zeigt einen Graph, der den Bereich von Partikelgrößen für Kontrollmikrosphären (PLLA : GA – 85 : 15) zeigt.
57 zeigt einen Graph, der den Bereich von Partikelgrößen für 20% Paclitaxel beladene Mikrosphären (PLLA : GA – 85 : 15) zeigt.
58A, 58B und 58C sind Graphen, die die Freisetzungsratenprofile von Paclitaxel aus verschiedenen Bereichen von Mikrosphärengrößen und verschiedenen Verhältnissen von PLLA und GA zeigen.
59A und 59B sind Graphen, die die Freisetzungsratenprofile von Paclitaxel von Mikrosphären mit verschiedenen Verhältnissen von PLLA und GA zeigen.
60A und 60B sind Graphen, die die Freisetzungsratenprofile von Paclitaxel von Mikrosphären mit verschiedenen Verhältnissen von PLLA und GA zeigen.
61A, 61B und 61C sind Graphen, die die Freisetzungsratenprofile von Paclitaxel von Mikrosphären von verschiedenen Größen und mit verschiedenen Verhältnissen von PLLA und GA zeigen.
62 ist ein Graph, der Paclitaxelfreisetzung von Paclitaxel-Nylonmikrokapseln zeigt.
63A und 63B sind Photographien von Fibronektin beschichteten PLLA Mikrosphären auf Blasengewebe (63A) und Poly (L-lysin) Mikrosphären auf Blasengewebe.
75 zeigt einen Graph, der den Effekt einer Hochdosis-Intervall-Paclitaxeltherapie auf das Fortschreiten von klinischen Symptomen in transgenen Mäusen darstellt. Transgene Mäuse wurden mit 20 mg/kg Paclitaxel einmal wöchentlich für vier Wochen (Woche 0, 1, 2 und 3) behandelt und alle 2 Tage für 10 Wochen beobachtet, wobei Werte für jedes Symptom bestimmt wurden. Die Daten zeigen die Mittelwerte (kumulativ für alle Symptome) für Paclitaxel behandelte transgene Mäuse (n = 5) und Kontrollmäuse (n = 3). Die Paclitaxelbehandlung reduzierte die durch die Überexpression von DM20 in Transgenen verursachte Verschlechterung, wohingegen sich die Kontrollmäuse sehr schnell verschlechterten, wobei zwei von drei Tieren nicht bis zum Ende des experimentellen Protokolls überlebten (wie angegeben).
76A und 76B zeigen eine perivaskulär (zu der Adventitia des Blutgefäßes) angewendete Paclitaxelpaste in dem Ratten-Karotiden-Arterienmodell. Die adventiale Oberfläche der linken gemeinsamen Karotidenarterie wurde mit 2,5 mg von entweder Kontrollpaste (76A) oder 20% Paclitaxel-beladener Paste (76B) behandelt. Die Kontrollarterien zeigten eine Zunahme in der Dicke der arteriellen Wand aufgrund der Hyperproliferation der glatten Muskelzellen, wohingegen die mit Paclitaxel-beladener Paste behandelte Arterie keine Anzeichen von intimaler Verdickung zeigte.
77A und 77B zeigen den Proximitätseffekt von perivaskulärer Paclitaxelpaste im Ratten-Karotiden-Arterienmodell. Paclitaxel-beladene Paste, die unmittelbar angrenzend zu der perivaskulären Region des Gefäßes angewendet wurde beugte Restenosis vor, jedoch, wenn die Paste nicht direkt angrenzend an die vaskuläre Wand war, war neointimale Hyerplasie evident.
78A, 78B und 78C zeigen den Effekt von Paclitaxel auf Astrozyten GFAP Färbung. Hirnschnitte von normalen Tieren und transgenen Tieren (die eine neurologische Erkrankung ähnlich zu Multipler Sklerose entwickeln), die mit Vehikel oder Paclitaxel behandelt wurden, wurden mit GFAP (ein Marker für aktivierte Astrozyten) gefärbt und histologisch untersucht. In Kontroll-transgenen Mäusen war eine Zunahme in der Zahl von Astrozyten und Gesamt GFAP Leveln im Vergleich zu normalen Hirnschnitten zu sehen. Jedoch war die Morphologie der Zellen ähnlich. Hirnschnitte von Paclitaxel-behandelten Mäusen zeigten verringerte Zahlen von Astrozyten und GFAP Leveln im Vergleich zu unbehandelten transgenen Tieren. Hi stologisch war eine Zellrundung und Verdünnung von Stellat-Ausstülpungen in Astrozyten vorhanden.
79A und 79B sind Graphen, die zeigen, daß Paclitaxel die T-Zellstimulierung in Antwort auf Myelin basisches Proteinpeptid (GP68-88) und ConA inhibiert. Eine 48-Stundenkultur der T-Zellproliferation von RT-1 wurde mit GP68-88 (A) oder ConA (B) als stimulierende Agenzien durchgeführt. Paclitaxel und sein Vehikel (Mizellen) wurden in abgestuften Konzentrationen bei Anfang der Antigenstimulierung oder 24 Stunden später hinzugefügt. Paclitaxel inhibierte die T-Zellproliferation bei Konzentrationen so gering wie 0,02 μM, unabhängig von dem stimulierenden Agens.
80A, 808, 80C und 80D sind Graphen, die zeigen, daß Tuberzidin und Paclitaxel beide die IL-1 und TNF-induzierte NF-_κB Aktivität inhibieren.
81A und 81B sind Graphen, die den Effekt von zunehmenden Konzentrationen von Paclitaxel oder Camptothecin auf das Zellwachstum von menschlichen Prostatakrebszellen (LNCaP) (2 × 10³ Zellen/Napf) zeigen, wie durch Kristallviolett (0,5%)-Färbung und Quantifizierung durch Absorption bei 492 nm gemessen wurde. Prozent-Wachstum ist als % relativ zu Kontrollen ausgedrückt und ein Mittel von 8 Ergebnissen ist gezeigt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Vor weiteren Ausführungen zur Erfindung mag es für ein Verständnis davon hilfreich sein, Definitionen von bestimmten Begriffen, die im folgenden verwendet werden, auszuführen.
„Entzündliche Erkrankung" wie hier verwendet, bezieht sich auf Multiple Sklerose.
„Anti-Mikrotubuli Mittel" sollten so verstanden werden, daß sie jedes Protein, Peptid, Chemikalie oder anderes Molekül einschließen, das die Funktion von Mikrotubuli beeinflußt, z. B. durch die Prävention oder Stabilisierung von Polymerisation. Eine große Vielzahl von Verfahren können angewendet werden, um die anti-Mikrotubuli Aktivität einer bestimmten Verbindung zu bestimmen, einschließlich z. B. den von Smith et al. (Cancer Lett 79(2): 213–219, 1994) und Mooberry et al., (Cancer Lett. 96(2): 261–266, 1995) beschriebenen Tests.
Wie oben angegeben, ist die Verwendung gemäß der Erfindung zur Behandlung oder der Vorbeugung von Entzündungerkrankungen brauchbar, umfassend den Schritt von Zuführung eines anti-Mikrotubuli Mittels zu der Stelle der Entzündung. Kurz gesagt kann eine große Vielzahl von Mitteln zu der Stelle der Entzündung (oder potentiellen Stelle von Entzündung) zugeführt werden, entweder mit oder ohne einen Träger (z. B. ein Polymer oder Einreibung), um eine entzündliche Erkrankung zu behandeln oder ihr vorzubeugen. Repräsentative Beispiele von solchen Mitteln schließen Taxane (z. B. Paclitaxel (genauer im folgenden beschrieben) und Docetaxel) (Schiff et al., Nature 277: 665–667, 1979; Long and Fairchild, Cancer Research 54: 4355-4361, 1994, Ringel and Horwitz, J. Natl. Cancer Inst. 83(4): 288–291, 1991; Pazdur et al., Cancer Treat. Rev. 19(4): 351–386, 1993), Campothecin, Elentherobin (z. B. US-Patent Nr. 5,473,057), Sarcodictyine (einschließlich Sarcodictyin A), Epothilone A und B (Bollag et al., Cancer Research 55: 2325–2333, 1995), Discodermolid (ter Haar et al., Biochemistry 35: 243–250, 1996), Deuteriumoxid (D₂O) (James and Lefebvre, Genetics 130(2): 305–314, 1992; Sollott et al., J. Clin. Invest. 95: 1869–1876, 1995), Hexylenglycol (2-Methyl-2,4-pentandiol) (Oka et al., Cell Struct. Funct. 16(2): 125–134, 1991), Tubercidin (7-Deazaadenosin) (Mooberry et al., Cancer Lett. 96(2): 261–266, 1995), LY290181 (2-Amino-4-(3-pyridyl)-4H-naphto(1,2-b)pyran-3-cardonitril) (Panda et al., J. Biol. Chem. 272(12): 7681–7687, 1997; Wood et al., Mol. Pharmacol. 52(3): 437–444, 1997), Aluminiumfluorid (Song et al., J. Cell. Sci. Suppl. 14: 147–150, 1991), Ethylenglykol bis-(succinimidylsuccinat) (Caplow and Shanks, J. Biol. Chem. 265(15): 8935–8941, 1990), Glyzinethylester (Mejillano et al., Biochemistry 31(13): 3478–3483, 1992), monoklonale anti-idiotypische Antikörper (Leu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22): 10690-10694, 1994), mikrotubuli assembly promoting Protein (Taxol-ähnliches Protein, TALP) (Hwang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 208(3): 1174–1180, 1995) durch hypotonische (190 mosmol/L) Bedingungen induzierte Zellquellung, Insulin (100 nmol/L) oder Glutamin (10 nmol/L) (Haussinger et al., Biochem. Cell. Biol. 72(1–2): 12–19, 1994), Dyneinbindung (Ohba et al., Biochem. Biophys. Acta 1158(3): 323–332, 1993), Gibberelin (Mita and Shibaoka, Protoplasma 119(1/2): 100–109, 1984), XCHO 1 (Kinesin-ähnliches Protein) (Yonetani et al., Mol. Biol. Cell 7(suppl): 211 A, 1996), Lysophophatidsäure (Cook et al., Mol. Biol. Cell 6(suppl): 260A, 1995), Lithiumion (Bhattacharyya und Wolff, Biochem. Biophys. Res. Commun. 73(2): 383–390, 1976), Pflanzenzellwandkomponenten (z. B. Poly-L-Lysin und Extensin) (Akashi et al., Planta 182(3): 363–369, 1990), Glyzerinpuffer (Schilstra et al., Biochem J. 277 (Pt. 3): 839–847, 1991; Farrell and Keates, Biochem. Cell. Biol. 68(11): 1256–1261, 1990; Lopez et al., J. Cell. Biochem. 43(3): 281–291, 1990), Triton X-100 Mikrotubuli stabilisierender Puffer (Brown et al., J. Cell Sci. 104(Pt. 2): 339–352, 1993; Safiejko-Mroczka and Bell, J. Histochem. Cytochem. 44(6): 641–656, 1996), Mikrotubuli assoziierte Proteine (z. B. MAP2, MAP4, tau, big tau, Ensconsin, Elongation factor-1-alpha (EF-1α) und E-MAP-115) (Burgess et al., Cell Motil. Cytokeleton 20(4): 289–300, 1991; Saoudi et al., J. Cell. Sci. 108(Pt. 1): 357–367, 1995; Bulinski and Bossler, J. Cell. Sci. 107(Pt. 10): 2839–2849, 1994; Ookata et al., J. Cell Biol. 128(5): 849-862, 1995; Boyne et al., J. Comp. Neurol. 358(2): 279-293, 1995; Ferreira and Caceres, J. Neurosci. 11(2): 392–400, 1991; Thurston et al., Chromosoma 105(1): 20–30, 1996; Wang et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 38(2): 200–208, 1996; Moore and Cyr, Mol. Biol. Cell 7(suppl): 221-A, 1996; Masson und Kreis, J. Cell Biol. 123(2), 357–371, 1993), zelluläre Bestandteile (z. B. Histon H1, Myelin basisches Protein und Kinetochore) (Saoudi et al., J. Cell. Sci. 108(Pt. 1): 357–367, 1995; Simerly et al., J. Cell Biol. 111(4): 1491–1504, 1990) endogene mikrotubuläre Strukturen (z. B. axonemale Strukturen, Plugs und GTP Kappen) (Dye et al., Cell Motil. Cytoskeleton 21(3): 171–186, 1992; Azhar und Murphy, Cell Motil. Cytoskeleton 15(3): 156–161, 1990; Walker et al., J. Cell Biol. 114(1): 73–81, 1991; Drechsel und Kirschner, Curr. Biol. 4(12): 1053–1061, 1994), stabile Tubuli only Polypeptide (z. B. STOP145 und STOP220) (Pirollet et al., Biochim. Biophys. Acta 1160(1): 113–119, 1992; Pirollet et al., Biochemistry 31(37): 8849–8855, 1992; Bosc et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(5): 2125–2130, 1996; Margolis et al., EMBO J. 9(12): 4095–4102, 1990) und Spannung von mitotischen Kräften (Nicklas und Ward, J. Cell Biol. 126(5): 1241–1253, 1994), sowie jede Analoga und Derivate von jedem der oben genannten. Solche Verbindungen können entweder durch Depolymerisierung von Mikrotubuli (z. B. Colchizin und Vinblastin) oder durch Stabilisierung der Mikrotubulusbildung (z. B. Paclitaxel) wirken.
Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das therapeutische Mittel Paclitaxel, eine Verbindung, die die Mikrotubulibildung durch Bindung an Tubulin unterbricht, um abnormale mitotischen Spindeln zu bilden. Kurz gesagt ist Paclitaxel ein hoch derivatisiertes Diterpenoid (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 2325, 1971), das von der geernteten und getrockneten Rinde von Taxus brevifolia (Pazifische Eibe) und Taxomyces Andranae und Endophytic Fungus der Pazifischen Eibe (Stierte et al., Science 60: 214–216, 1993) erhalten wurde. „Paclitaxel" (welches hier so verstanden sollte, daß es Produgs, Analoga und Derivate so wie z. B. TAXOL^®, TAXOTERE^®, Docetaxel, 10-Desacetyl-Analoga von Paclitaxel und 3'N-Desbenzoyl-3'N-t-butoxycarbonylanaloga von Paclitaxel einschließt) kann unter der Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken leicht hergestellt werden (siehe z. B. Schiff et al., Nature 277: 665–667, 1979; Long und Fairchild, Cancer Research 54: 4355– 4361, 1994; Ringel und Horwitz, J. Natl. Cancer Inst. 83(4): 288–291, 1991; Pazdur et al., Cancer Treat. Rev. 19(4): 351–386, 1993; WO 94/07882; WO 94/07881; WO 94/07880; WO 94/07876; WO 93/23555; WO 93/10076; WO 94/00156; WO 93/24476; EP 590267 ; WO 94/20089; US Patent Nr. 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; 5,254,580; 5,412,092; 5,395,850; 5,380,751; 5,350,866; 4,857,653; 5,272,171; 5,411,984; 5,248,796; 5,248,796; 5,422,364; 5,300,638; 5,294,637; 5,362,831; 5,440,056; 4,814,470; 5,278,324; 5,352,805; 5,411,984; 5,059,699; 4,942,184; Tetrahedron Letters 35(52): 9709–9712, 1994; J. Med. Chem. 35: 4230–4237, 1992; J. Med. Chem. 34: 992– 998, 1991; J. Natural Prod. 57(10): 1404–1410, 1994; J. Natural Prod. 57(11): 1580–1583, 1994; J. Am. Chem. Soc. 110: 6558–6560, 1988), oder von einer Vielzahl von gewerblichen Quellen, einschließlich z. B., Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri /T7402 – von Taxus brevifolia) erhalten werden kann.
Repräsentative Beispiele von solchen Paclitaxelderivaten oder Analoga schließen 7-Desoxydocetaxol, 7,8-Cyklopropataxane, N-substituierte 2-Azetidone, 6,7-Epoxy-Paclitaxele, 6,7-modifizierte Paclitaxele, 10-Desacetoxytaxol, 10-Desacetyltaxol (von 10-Desacetylbaccatin III), Phosphonooxy- und Karbonatderivate von Taxol, Taxol 2',7-di(Natrium- 1,2-benzoldicarboxylat, 10-Desacetoxy-11,12-dihydrotaxol-10,12(18)-dienderivate, 10-Desacetoxytaxol, Protaxol (2'-und/oder 7-O-Ester Derivate), (2'-und/oder 7-O-Karbonat Derivate), asymmetrische Synthese von Taxolseitenkette, Fluortaxole, 9-Desoxotaxan, (13-Acetyl-9-desoxobaccatin III, 9-Desoxotaxol, 7-Desoxy-9-desoxotaxol, 10-Desacetoxy-7-desoxy-9-desoxotaxol, Derivate, die Wasserstoff oder eine Acetylgruppe enthalten und ein Hydroxy- und tert-Butoxycarbonylamino-, sulfoniertes 2'-Acryloyltaxol und sulfoniertes 2'-O-Acylsäuretaxolderivate, Succinyltaxol, 2'-γ-Aminobutyryltaxolformat, 2'-Acetyltaxol, 7-Acetyltaxol, 7-Glyzincarbamattaxol, 2'-OH-7-PEG(5000) Carbamattaxol, 2'-Benzoyl und 2',7-Dibenzoyltaxolderivate, andere Prodrugs (2'-Acetyltaxol; 2',7-Diacetyltaxol; 2'Succinyltaxol; 2'-(beta-Alanyl)-taxol); 2'gamma-Aminobutyryltaxolformat; Ethylenglykolderivate von 2'-Succinyltaxol; 2'-Glutaryltaxol; 2'-(N,N-Dimethylglycyl)taxol; 2'-(2-(N,N-Dimethylamino)propionyl)taxol; 2'Orthocarboxybenzoyltaxol; 2'aliphatische Carboxylsäurederivate von Taxol, Prodrugs {2'(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2'(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 7(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 2',7-di-(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 7(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2',7-di-(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2'-(L-Glycyl)taxol, 7-(L-Glycyl)taxol, 2',7-di(L-Glycyl)taxol, 2'-(L-Alanyl)taxol, 7-(L-Alanyl)taxol, 2',7-di(L-Alanyl)taxol, 2'-(L-Leucyl)taxol, 7-(L-Leucyl)taxol, 2',7-di(L- Leucyl)taxol, 2'-(L-Isoleucyl)taxol, 7-(L-Isoleucyl)taxol, 2',7-di(L-Isoleucyl)taxol, 2'-(L-Valyl)taxol, 7-(L-Valyl)taxol, 2'7-di(L-Valyl)taxol, 2'-(L-Phenylalanyl)taxol, 7-(L-Phenylalanyl)taxol, 2',7-di(L-Phenylalanyl)taxol, 2'-(L-Prolyl)taxol, 7-(L-Prolyl)taxol, 2',7-di(L-Prolyl)taxol, 2'-(L-Lysyl)taxol, 7-(L-Lysyl)taxol, 2',7-di(L-Lysyl)taxol, 2'-(L-Glutamyl)taxol, 7-(L-Glutamyl)taxol, 2',7-di(L-Glutamyl)taxol, 2'-(L-Arginyl)taxol, 7-(L-Arginyl)taxol, 2',7-di(L-Arginyl)taxol}, Taxol Analoga mit modifizierten Phenylisoserinseitenketten, Taxotere, (N-Desbenzoyl-N-tert-(butoxycarbonyl)-10-desacetyltaxol und Taxane (z. B., Baccatin III, Cephalomannin, 10-Desacetylbaccatin III, Brevifoliol, Yunantaxusin und Taxusin). Repräsentative Beispiele von Mikrotubuli depolymerisierenden (oder destabilisierenden oder unterbrechenden) Mitteln schließen Nocodazol (Ding et al., J. Exp. Med. 171(3): 715–727, 1990; Dotti et al., J. Cell. Sci. Suppl. 15: 75–84, 1991; Oka et al., Cell. Struct. Funct. 16(2): 125–134, 1991; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136(1): 71–80, 1997); Cytochalasin B (Illinger et al., Biol. Cell. 73(2–3): 131–138, 1991); Vinblastin (Ding et al., J. Exp. Med. 171(3): 715–727, 1990; Dirk et al., Neurochem. Res. 15(11): 1135–1139, 1990; Illinger et al., Biol. Cell. 73(2– 3): 131–138, 1991; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136(1): 71–80, 1997); Vincristin (Dirk et al., Neurochem. Res. 15(11): 1135–1139, 1990; Ding et al., J. Exp. Med. 171(3): 715–727, 1990); Colchizin (Allen et al., Am. J. Physiol. 261(4 Pt. 1): L315–L321, 1991; Ding et al., J. Exp. Med. 171(3): 715–727, 1990; Gonzalez et al., Exp. Cell. Res. 192(1): 10–15, 1991; Stargell et al., Mol. Cell. Biol. 12(4): 1443–1450, 1992); C1 980 (Colchizin-Analog) (Garcia et al., Anticancer Drugs 6(4): 533–544, 1995); Colzemid (Barlow et al., Cell. Motil. Cytoskeleton 19(1): 9–17, 1991; Meschini et al., J. Microsc. 176(Pt. 3): 204–210, 1994; Oka et al., Cell. Struct. Funct. 16(2): 125–134, 1991); Podophyllotoxin (Ding et al., J. Exp. Med. 171(3): 715– 727, 1990); Benomyl (Hardwick et al., J. Cell Biol. 131(3): 709–720, 1995; Shero et al., Genes Dev. 5(4): 549–560, 1991); Oryzalin (Stargell et al., Mol. Cell. Biol. 12(4): 1443–1450, 1992); Majusculamid C (Moore, J. Ind. Microbiol. 16(2): 134–143, 1996); Demecolzin (Van Dolah und Ramsdell, J. Cell. Physiol. 166(1): 49–56, 1996; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136(1): 71–80, 1997); und Methyl-2-benzimidazolcarbamat (MBC) (Brown et al., J. Cell. Biol. 123(2): 387– 403, 1993) ein.
Formulierungen
Wie oben angegeben, können die hier beschriebenen therapeutischen Anti-Mikrotubuli-Mittel auf eine Vielzahl von Arten formuliert sein und können daher zusätzlich einen Träger umfassen. In dieser Hinsicht kann eine große Vielzahl von Trägern entweder polymerischen oder nicht-polymerischen Ursprungs ausgewählt werden.
Zum Beispiel kann innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung eine große Vielzahl von polymerischen Trägern verwendet werden, um eines oder mehrere der oben diskutierten therapeutischen Mittel zu enthalten und/oder zuzuführen, einschließlich z. B. sowohl bioabbaubaren und nicht-bioabbaubaren Zusammensetzungen. Repräsentative Beispiele von bioabbaubaren Zusammensetzungen schließen Albumin, Collagen, Gelatine, Hyaluridonsäure, Stärke, Cellulose (Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat, Celluloseacetatsuccinat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat), Casein, Dextrane, Polysaccharide, Fibrinogen, Poly(D,L-lactid), Poly(D,L-lactid-co-glycolid), Poly(glycolid), Poly(hydroxybutyrat), Poly(alkylcarbonat) und Poly(orthoester), Polyester, Poly(hydroxyvaleriansäure), Polydioxanon, Poly(ethylenterephthalat), Poly(malinsäure), Poly(tartronsäure), Polyanhydride, Polyphosphazene, Poly(aminosäuren) und deren Copolymere (siehe allgemein, Illum, L., Davids, S. S. (eds.) „Polymers in Controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17: 1–22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59: 173–196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4: 155–0180, 1986) ein. Repräsentative Beispiele von nicht-abbaubaren Polymeren schließen Polyethylen-vinylacetat) („EVA")-Copolymere, Silikongummi, Acrylischepolymere (Polyacrylsäure, Polymethylacrylsäure, Polymethylmethacrylat, Polyalkylcynoacrylat), Polyethylen, Polypropylen, Polyamide (Nylon 6,6), Polyurethan, Poly(esterurethane), Poly(etherurethane), Poly (ester-harnstoff), Polyether (Poly(ethylenoxid)), Poly(propylenoxid), Pluronics und Poly(tetramethylenglycol)), Silikongummis und Vinylpolymere (Polyvinylpyrrolidon, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylacetatphthalat) ein. Es können auch Polymere entwikkelt werden, die entweder anionisch (z. B. Alginat, Carrageenin, Carboxymethylcellulose und Poly(acrylsäure), oder kationisch (z. B., Chitosan, Poly-L-lysin, Polyethylenimin, und Poly(allylamin)) (siehe im allgemeinen, Dunn et al., J. Applied Polymer Sci. 50: 353–365, 1993; Cascone et al., J. Materials Sci.: Materials in Medicine 5: 770–774, 1994; Shiraishi et al., Biol. Pharm. Bull. 16(11): 1164–1168, 1993; Thacharodi und Rao, Int'l J. Pharm. 120: 115–118, 1995; Miyazaki et al., Int'l J. Pharm. 118: 257–263, 1995) sind. Besonders bevorzugte polymere Träger schließen Poly(ethylenvinylacetat), Poly (D,L-milchsäure) Oligomere und Polymere, Poly (L-milchsäure) Oligomere und Polymere, Poly(glykolsäure), Copolymere von Milchsäure und Glykolsäure, Poly(caprolacton), Poly(valerolacton), Polyanhydride, Copolymere von Poly(caprolacton) oder Poly(milchsäure) mit einem Polyethylenglykol (z. B., McPEG) und Gemische davon ein.
Polymere Träger können in einer Vielzahl von Formen, mit gewünschten Freisetzungscharakteristiken und/oder mit spezifischen gewünschten Eigenschaften gestaltet werden. Zum Beispiel können polymere Träger gestaltet werden, um ein therapeutisches Mittel nach Aussetzen gegenüber einem spezifischen auslösenden Ereignis, so wie pH (siehe z. B. Heller et al., „Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems" in Polymers in Medicine 111, Elsevier Science Publisher B. V., Amsterdam, 1988, pp. 175–188; Kang et al., J. Applied Polymer Sci. 48: 343–354, 1993; Dong et al., J. Controlled Release 19: 171–178, 1992; Dong und Hoffman, J. Controlled Release 15: 141–152, 1991; Kim et al., J. Controlled Release 28: 143–152, 1994; Cornejo-Bravo et al., J. Controlled Release 33: 223–229, 1995; Wu und Lee, Pharm. Res. 10(10): 1544–1547, 1993; Serres et al., Pharm. Res. 13(2): 196–201, 1996; Peppas, „Fundamentals of pH- and Temperature-Sensitive Delivery Systems" in Gurny et al. (eds.), Pulsatile Drug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, pp. 41–55; Doelker, „Cellulose Derivatives," 1993, in Peppas und Langer (eds.), Biopolymers I, Springer-Verlag, Berlin) freizusetzen. Repräsentative Beispiele von pH-sensitiven Polymeren schließen Poly(acrylsäure) und seine Derivate (einschließlich z. B. Homopolymere so wie Poly(aminocarboxylsäure); Poly(acrylsäure); Poly(methylacrylsäure), Copolymere von solchen Homopolymeren und Copolymere von Poly(acrylsäure) und Acrylmonomeren so wie die oben diskutierten ein. Andere pH-sensitive Polymere schließen Polysaccharide, so wie Celluloseacetatphtahalat; Hydroxypropylmethylcellulosephthalat; Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat; Celluloseacetattrimellilat und Chitosan ein. Noch andere pH-sensitive Polymere schließen jede Mischung eines pH-sensitiven Polymers und eines wasserlöslichen Polymers ein.
Ähnlich können polymere Träger gestaltet werden, die temperatur-sensitiv sind (siehe z. B. Chen et al., „Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery", in Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22: 167–168, Controlled Release Society, Inc., 1995; Okano, „Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery" in Proceed Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22: 111–112, Controlled Release Society, Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9(3): 425–433, 1992; Tung, Int'l J. Pharm. 107: 85–90, 1994; Harsh und Gehrke, J. Controlled Release 17: 175–186, 1991; Bae et al., Pharm. Res. 8(4): 531–537, 1991; Dinarvand und D'Emanuele, J. Controlled Release 36: 221–227, 1995; Yu und Grainger, „Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels: Poly N-Isopropylacrylamidco-sodium Acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis and Physicochemical Characterization", Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 820–821; Zhou und Smid, „Physical Hydrogels of Associative Star Polymers", Polymer Research Institue, Dept. of Chemistry, College of Envionmental Science and Forestry, State Univ. of New York, Syracuse, NY, pp. 822–823; Hoffmann et al., „Characterizing Pore Sizes and Water 'Structure' in Stimuli-Responive Hydrogels" Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, p. 828; Yu und Grainger, „Thermosensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-Isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels", Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institue of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 829–830; Kim et al., Pharm. Res. 9(3): 283–290, 1992; Bae et al., Pharm. Res. 8(5): 624–628, 1991; Kono et al., J. Controlled Release 30: 69–75, 1994; Yoshida et al., J. Controlled Release 32: 97–102, 1994; Okano et al., J. Controlled Release 36: 125–133, 1995; Chun und Kim, J. Controlled Release 38: 39–47, 1996; D'Emanuele und Dinarvand, Int'l J. Pharm. 118: 237–242, 1995; Katono et al., J. Controlled Release 16: 215–228, 1991; Hoffman, „Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species", in Migliaresi et al. (eds.), Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, pp. 161–167; Hoffman, „Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics", in Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, UT, Geb. 24–27, 1987, pp. 297–305; Gutowska et al., J., Controlled Release 22: 95–104, 1992; Palasis und Gehrke, J. Controlled Release 18: 1–12, 1992; Paavola et al., Pharm. Res. 12(12): 1997–2002, 1995).
Repräsentative Beispiele von thermogelierenden Polymeren und ihre Gelatinisierungstemperatur (LCST (°C)) schließen Homopolymere, so wie Poly(N-methyl-N-n-propylacrylamid), 19,8; Poly(N-n-propylacrylamid), 21,5; Poly(N-methyl-N-isopropylacrylamid), 22,3; Poly(N-n-propylmethacrylamid), 28,0; Poly(N-isopropylacrylamid), 30,9; Poly(N, n-diethylacrylamid), 32,0; Poly(N-isopropylmethacrylamid), 44,0; Poly(N-cyclopropylacrylamid), 45,5; Poly(N-ethylmethylacrylamid), 50,0; Poly(N-methyl-N-ethylacrylamid), 56,0; Poly(N-cyclopropylmethacrylamid), 59,0; und Poly(N-ethylacrylamid), 72,0 ein. Darüberhinaus können thermogelierende Polymere durch Herstellung von Copoly meren zwischen (unter) Monomeren von den oben genannten hergestellt werden oder durch Kombination solcher Homopolymere mit anderen wasserlöslichen Polymeren so wie Acrylmonomeren (z. B., Acrylsäure und Derivate davon, so wie Methylacrylsäure, Acrylat und Derivate davon, so wie Butylmethacrylat, Acrylamid und N-n-Butyacrylamid).
Andere repräsentative Beispiele von thermogelierenden Polymeren schließen Celluloseetherderivate so wie Hydroxypropylcellulose, 41°C; Methylcellulose, 55°C; Hydroxypropylmethylcellulose, 66°C; und Ethylhydroxyethylcellulose und Pluronics, so wie F-127, 10 – 15°C; L-122, 19°C; L-92, 26°C; L-81, 20°C und L-61, 24°C ein.
Eine große Vielzahl von Formen können durch die polymeren Träger gestaltet werden, einschließlich, zum Beispiel, stabförmiger Vorrichtungen, Pellets, Tafeln oder Kapseln (siehe z. B., Goodell et al., Am J. Hosp. Pharm. 43: 1454–1461, 1986; Langer et al., „Controlled release of macromolecules from polymers" in Biomedical Polymers, Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomediacal Use, Goldberg, E. P., Nakagim, A. (eds.) Academic Press, pp. 113–137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sci. 69: 265–270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sci. 72: 1181–1185, 1983; und Bawa et al., J. Controlled Release 1: 259–267, 1985). Therapeutische Mittel können durch Einschluß in die Matrices des Polymer gekoppelt werden, durch kovalente Bindungen gebunden oder in Mikrokapseln eingekapselt werden. Innerhalb bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung werden Zusammensetzungen in nicht-kapselförmigen Formulierungen, so wie Mikrosphären (im Bereich von Nanometern zu Mikrometern in der Größe), Pasten, Fäden verschiedener Größe, Filme und Sprays zur Verfügung gestellt.
Bevorzugterweise werden therapeutische Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, auf eine Weise gestaltet, die für die gedachte Verwendung geeignet ist. Innerhalb bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung sollte die therapeutische Zusammensetzung biokompatibel sein und eines oder mehrere der therapeutischen Mittel über eine Zeit von verschiedenen Tagen bis Monaten freisetzen. Zum Beispiel werden „quick release" oder „hurst" therapeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die mehr als 10%, 20% oder 25% (w/v) eines therapeutischen Mittels (z. B. Paclitaxel) über eine Zeit von 7 bis 10 Tagen freisetzen. Solche „quick release" Zusammensetzungen sollten innerhalb bestimmter Ausführungsformen in der Lage sein, chemotherapeutische Level (wo erforderlich) eines gewünschten Mittels freizusetzen. Innerhalb anderer Ausführungsformen werden „low release" therapeutische Zusammen setzungen zur Verfügung gestellt, die weniger als 1% (w/v) eines therapeutischen Mittels über eine Zeitdauer von 7 bis 10 Tagen freisetzen. Weiter sollten die therapeutischen Zusammensetzung der vorliegende Erfindung bevorzugterweise stabil für mehrere Monate sein und dazu geeignet sein, unter sterilen Bedingungen hergestellt und aufbewahrt zu werden.
Innerhalb bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung können therapeutische Zusammensetzungen in jeder Größe von 50 nm bis 500 μm in Abhängigkeit von der bestimmten Verwendung gestaltet werden. Alternativ können solche Zusammensetzung auch leicht als ein „Spray" angewendet werden, das sich zu einem Film oder einer Beschichtung verfestigt. Solche Sprays können aus Mikrosphären aus einer großen Auswahl von Größen hergestellt werden, einschließlich, zum Beispiel, von 0,1 μm bis 3 μm, von 10 μm bis 30 μm und von 30 μm bis 100 μm.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, können ebenfalls in einer Vielzahl von „Pasten" oder Gelformen hergestellt werden. Zum Beispiel werden innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung therapeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die bei einer Temperatur flüssig sind (z. B. bei Temperaturen höher als 37°C, so wie 40°C, 45°C, 50°C, 55°C oder 60°C) und bei einer anderen Temperatur fest oder semi-fest sind (z. B. gewöhnliche Körpertemperatur oder jede Temperatur niedriger als 37°C). Solche „Thermopasten" können leicht nach der hier zur Verfügung gestellten Offenbarung hergestellt werden.
Innerhalb anderer Aspekte der Erfindung können die therapeutischen Zusammensetzungen als ein Film geformt werden. Bevorzugterweise sind solche Filme im allgemeinen weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 mm dick, weiter bevorzugt weniger als 0,75 mm oder 0,5 mm dick und am meisten bevorzugt weniger als 500 μm bis 100 μm dick. Solche Filme sind bevorzugterweise flexibel mit einer guten Zugfestigkeit (z. B. größer als 50, bevorzugt größer als 100 und am meisten bevorzugt größer als 150 oder 200 N/cm²), guten Anheftungseigenschaften (d. h. leicht anheftend auf feuchten oder nassen Oberflächen) und weisen eine kontrollierte Permeabilität auf.
Innerhalb weiterer Aspekte der Erfindung können die therapeutischen Zusammensetzungen zur topischen Applikation formuliert sein. Repräsentative Beispiele schließen ein: Ethanol; Gemische von Ethanol und Glykolen (z. B. Ethylenglykol oder Propylenglykol); Gemische von Ethanol und Isopropylmyristat oder Ethanol, Isopropylmyristat und Wasser (z. B. 55 : 5 : 40); Gemische von Ethanol und Eineol oder D-Limonen (mit oder ohne Wasser); Glykole (z. B. Ethylenglykol oder Propylenglykol) und Gemische von Glykolen so wie Propylenglykol und Wasser, Phosphatidylglycerin, Dioleoylphosphatidylglycerin, Transcutol^® oder Terpinolen; Gemische von Isopropylmyristat und 1-Hexyl-2-pyrrolidon, N-Dodecyl-2-piperidinone oder 1-Hexyl-2-pyrrolidon. Andere Zusatzstoffe können ebenfalls zu den oben genannten hinzugefügt werden, einschließlich zum Beispiel Säuren, so wie Ölsäure und Linolsäure und Seifen so wie Natriumlaurylsulfat. Für eine genauere Beschreibung der oben genannten, siehe im allgemeinen Hoelgaard et al., J. Contr. Rel. 2: 111; 1985; Liu et al., Pharm. Res. 8: 938, 1991; Roy et al., J. Pharm. Sci. 83: 126, 1991; Ogiso et al., J. Pharm. Sci. 84: 482, 1995; Sasaki et al., J. Pharm. Sci. 80: 533, 1991; Okabe et al., J. Contr. Rel. 32: 243, 1994; Yokomizo et al., J. Contr. Rel. 38: 267, 1996; Yokomizo et al., J. Contr. Rel. 42: 37, 1996; Mond et al., J. Contr. Rel. 33: 72, 1994; Michniak et al., J. Contr. Rel. 32: 147, 1994; Sasaki et al., J. Pharm. Sci. 80: 533, 1991; Baker & Hadgraft, Pharm. Res. 12: 993, 1995; Jasti et al., AAPS Proceedings, 1996; Lee et al., AAPS Proceedings, 1996; Ritschel et al., Skin Pharmacol. 4: 235, 1991; und McDaid & Deasy, Int. J. Pharm. 133: 71, 1996.
Innerhalb bestimmter Ausführungsformen der Erfindung können die therapeutischen Zusammensetzungen ebenfalls zusätzliche Inhaltsstoffe, so wie oberflächenaktive Stoffe (z. B. Pluronics so wie F-127, L-122, L-92, L-81 und L-61) umfassen.
Innerhalb weiterer Aspekte der vorliegenden Erfindung werden polymerische Träger zur Verfügung gestellt, die dazu angepaßt sind, eine hydrophobe Verbindung zu enthalten und freizusetzen, wobei der Träger die hydrophobe Verbindung in Kombination mit einem Carbohydrat, Protein oder Polypeptid enthält. Innerhalb bestimmter Ausführungsformen enthält oder umfaßt der polymerische Träger Regionen, Taschen oder Granulae von einer oder mehreren hydrophoben Verbindungen. Zum Beispiel können innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung hydrophobe Verbindungen in einer Matrix inkorporiert vorliegen, die die hydrophobe Verbindung enthält, gefolgt von Inkorporieren der Matrix innerhalb des polymeren Trägers. Eine Vielzahl von Matrices können in dieser Hinsicht verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Carbohydrate und Polysaccharide, so wie Stärke, Cellulose, Dextran, Methylcellulose und Hyaluridonsäure, Proteine oder Polypeptide so wie Albumin, Collagen und Gelatine. Innerhalb alternativer Ausführungsformen können hydrophobe Verbindungen innerhalb eines hydrophoben Kerns enthalten sein und dieser Kern ist innerhalb einer hydrophilen Schale enthalten.
Andere Träger, die ebenfalls verwendet werden können, um die hier beschriebenen therapeutischen Mittel zu enthalten und zuzuführen schließen ein: Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (Cserhati und Hollo, Int. J. Pharm. 108: 69–75, 1994), Liposomen (siehe z. B. Sharma et al., Cancer Res. 53: 5877–5881, 1993; Sharma und Straubinger, Pharm. Res. 11(60): 889–896, 1994; WO 93/18751; US Patent Nr. 5,242,073), Liposom/Gel (WO 94/26254), Nanokapseln (Bartoli et al., J. Microencapsulation 7(2): 191–197, 1990), Mizellen (Alkan-Onyuksel et al., Pharm. Res. 11(2): 206–212, 1994), Implantate (Jampel et al., Invest. Ophthalm. Vis. Science 34(11): 3076–3083, 1993; Walter et al., Cancer Res. 54: 22017–2212, 1994), Nanopartikel (Violante und Lanzafame PAACR), Nanopartikel – modifiziert (US Patent Nr. 5,145,684), Nanopartikel (Oberflächen-modifiziert) (US Patent Nr. 5,399,363), Taxol-Emulsion/Lösung (US Patent Nr. 5,407,683), Mizelle (oberflächenaktiver Stoff) (US Patent Nr. 5,403,858); synthetische Phospholipidverbindungen (US Patent Nr. 4,534,899), gasübertragene Dispersionen (US Patent Nr. 5,301,664), flüssige Emulsionen, Schaum, Spray, Gel, Lotion, Creme, Einreibung, dispergierte Vesikel, Partikel oder Tröpfchen fester oder flüssiger Aerosole, Mikroemulsionen (US Patent Nr. 5,330,756), Polymerschalen (Nano- und Mikrokapsel) (US Patent Nr. 5,439,686), Taxoid-basierende Zusammensetzungen in einem Oberflächen-aktiven Mittel (US Patent Nr. 5,438,072), Emulsion (Tarr et al., Pharm Res. 4: 62–165, 1987), Nanosphären (Hagan et al., Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 22, 1995; Kwon et al., Pharm Res 12(2): 192–195; Kwon et al., Pharm Res. 10(7): 970–974; Yokoyama et al., J. Contr. Rel. 32: 269–277, 1994; Gref et al., Science 263: 1600–1603, 1994; Bazile et al., J. Pharm. Sci. 84: 493–498, 1994) und Implantate (US Patent Nr. 4,882,168).
Wie unten genauer diskutiert, können therapeutische Mittel der vorliegenden Erfindung, die um eine therapeutische Zusammensetzung zu bilden gegebenenfalls in einem oder mehreren der hier beschriebenen Träger inkorporiert sind hergestellt und verwendet werden, um eine große Vielzahl von Erkrankungen zu behandeln oder vorzubeugen.
Behandlung von oder Vorbeugung gegen entzündliche Erkrankungen
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Mittel zum Behandeln von oder Vorbeugen gegen entzündliche Krankheiten der Atemwege bereit, umfassend den Schritt der Verabreichung eines Anti-Mikrotubuli-Mittels an einen Patienten. Repräsentative Beispiele von entzündlichen Krankheiten schließen zum Beispiel Nasenpolypen oder chronische Sinusitis ein.
Andere Beispiele von entzündlichen Krankheiten der Atemwege schließen Asthma, Hypersensivitätspneumonitis, Asbestose, Silicose und andere Formen der Pneumoconiose, chronische Bronchitis und chronische obstruktive Atemwegserkrankung ein.
Chronische entzündliche Krankheiten der Atemwege
Innerhalb anderer Aspekte der Erfindung können Anti-Mikrotubuli-Mittel (und Zusammensetzungen) verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln oder gegen diese vorzubeugen, wie etwa chronische entzündliche Krankheiten der Atemwege. Insbesondere kann das Anti-Mikrotubuli-Mittel an die Entzündungsstelle (oder eine potentielle Entzündungsstelle) verabreicht werden, um die Krankheit zu behandeln. Geeignete Anti-Mikrotubuli-Mittel werden im Detail oben diskutiert und schließen zum Beispiel Taxane (z. B. Paclitaxel und Docetaxel), Camptothecin, Eleutherobin, Sarcodictyine, Epothilone A und B, Discodermolid, Deuteriumoxid (D₂O), Hexylenglycol (2-Methyl-2,4-Pentandiol), Tubercidin (7-Deazaadenosin), LY290181 (2-Amino-4-(3-pyridyl)-4H-naphtho(1,2-b)pyran-3-cardonitril), Aluminiumfluorid, Ethylenglycol-bis-(succinimidylsuccinat), Glycinethylester, anti-idiotypische monoklonale Antikörper, Microtubuli-Assembly-förderndes Protein (Taxol-artiges Protein, TALP), Zellschwellung, induziert durch hypotone Bedingungen (190 mosmol/L), Insulin (100 nmol/L) oder Glutamin (10 mmol/L), Dyneinbindung, Gibberellin, XCHO1 (Kinesin-artiges Protein), Lysophosphatidsäure, Lithiumion, pflanzliche Zellwandbestandteile (z. B., Poly-L-Lysin und Extensiv), Glycerolpuffer, Triton-X-100-Microtubuli-stabilisierender Puffer, Microtubuli-assoziierte Proteine (z. B., MAP2, MAP4, tau, big tau, Ensconsin, Elongationsfaktor-1-alpha (EF-1 alpha) und E-MAP-115), zelluläre Gruppen (z. B., Histon H1, Myelinbasisches Protein und Kinetochoren), endogene microtubuläre Strukturen (z. B., axonemale Strukturen, Verschlüsse und GTP-Kappen), stabiles Tubulus-only-Polypeptid (z. B., STOP 145 und STOP220) und Zug aufgrund von Mitosekräften, sowie beliebige Analoge und Derivate der obigen Mittel ein. Solche Mittel können innerhalb bestimmter Ausführungsformen als eine Zusammensetzung zusammen mit einem polymeren Träger oder in einer Liposomenformulierung abgegeben werden, wie in größeren Einzelheiten sowohl oben als auch weiter unten diskutiert wird. Innerhalb bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung können die Mittel oder Zusammensetzungen intranasal, systemisch, mittels Inhalation, topisch (z. B. im Falle von Nasenpolypen) oder in die Sinushöhlungen verabreicht werden.
ASTHMA
Innerhalb bestimmter Aspekte der Erfindung können Anti-Mikrotubuli-Mittel verwendet werden, um Asthma zu behandeln oder ihm vorzubeugen. Kurz gesagt, ist Asthma ein Zustand, der durch wiederkehrende Episoden einer Verlegung der Atemwege charakterisiert ist, die sich spontan oder in Antwort auf eine Behandlung auflösen kann. Obwohl seine genaue Ätiologie nicht bekannt ist, ist der Zustand eine übertriebene Bronchien-verengende und entzündliche Antwort auf Reize, die 5% der Population betrifft. Eine effektive Anti-Mikrotubuli-Therapie für Asthma würde eines oder mehrere der pathologischen Merkmale des Zustands verändern, wie etwa die Infiltration durch Entzündungszellen (T-Zellen, Mastzellen, Eosinophile) und Aktivität verringern, die Proliferation und Verdickung der Atemwegsschleimhaut reduzieren, die Proliferation und Hypertrophie der glatten Muskelzellen in der Atemwegswand inhibieren, die Schleimsekretion in das Lumen der Atemwege verringern, die Aktivität von entzündlichen Cytokinen (IL-3, IL-4, IL-5, GMSF) blockieren, die die Entzündung induzieren und fortsetzen, und Hyperplasie und Hypertrophie der sekretorischen Drüsen inhibieren.
Klinisch würde eine effektive Anti-Mikrotubuli-Therapie für Asthma eines oder mehrere der folgenden Elemente erzielen: Verringerung der Heftigkeit der Syndrome, Verringerung der Dauer der Verschlechterungen, Erhöhung der Frequenz und Dauer der Krankheitsrückgangsperioden, Verhinderung einer festen Verschlechterung und Behinderung, und Verhinderung einer chronischen Progression der Atemnot, des Hustens und des Keuchens, während gleichzeitig Hypoxie, FEV₁ (erzwungenes Expirationsvolumen in einer Sekunde), Luftstromwiderstand und Hypokapnie/respiratorische Alkalose verbessert wird und der V : Q-Mismatch (Ventilation : Perfusion) verringert wird.
Das Anti-Mikrotubuli-Mittel kann auf jede beliebige Weise verabreicht werden, um die obigen Zielpunkte zu erreichen. Bevorzugte Verabreichungsverfahren schließen Inhalations-Verfahren (z. B. mittels eines Dosis-abmessenden Inhalators, Vernebelers, über einen Endotrachealtubus, Inhalation von Mikropartikeln) und systemische Behandlungen (intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion oder orale Zubereitung) ein. Eine systemische Behandlung würde an Patienten mit schweren Verschlechterungen oder an solche Patienten ver abreicht werden, bei denen eine Inhalationstherapie nicht geeignet war. Die minimale Dosis, die in der Lage ist, eine klinische oder pathologische Verbesserung zu erzeugen, würde verwendet werden. Zum Beispiel kann im Falle von Paclitaxel eine systemische, chronisch niedrig dosierte Therapie in 10 bis 50 mg/m² alle 1–4 Wochen verabreicht werden, abhängig von der Antwort; eine hochdosierte "Puls"-Therapie kann in 50 bis 250 mg/m² bei dem akut kranken Patienten verabreicht werden. Für eine Inhalationstherapie können 0,01% bis 1% Paclitaxel direkt inhaliert werden über die oben erwähnten Abgabevehikel/Formulierungen. Dies würde zu einer Abgabe von 1 bis 50 mg/m² von Paclitaxel direkt in die Atemwege führen. Diese Dosis würde gemäß der Antwort titriert werden. Andere Anti-Mikrotubuli-Mittel können in äquivalenten Dosen verabreicht werden, die hinsichtlich ihrer Potenz und Erträglichkeit des Mittels eingestellt werden.
CHRONISCHE OBSTRUKTIVE LUNGENERKRANKUNG (COPD)
COPD schließt eine Vielzahl von Zuständen (chronische Bronchitis, asthmatische Bronchitis, chronische obstruktive Bronchitis und Emphysem) ein, die zu einer chronischen Verstopfung der Luftwege führen. Diese Zustände können eine schwere Behinderung verursachen und sind die viertgrößte Todesursache in den USA. Klinisch sind alle Formen durch Atemnot, Husten, Keuchen und wiederkehrende Infektionen der Atemwege gekennzeichnet. Zeichen der Krankheit schließen ein verringertes FEV₁, ein erhöhtes Residualvolumen, einen V : Q-Mismatch und eine Hypoxämie ein. Pathologisch liegt eine erhöhte Schleimproduktion, Hyperplasie der Schleimdrüsen, erhöhte Proteaseaktivitität (hauptsächlich Elastase), Entzündung der Atemwege und Zerstörung der Alveolarwände vor. Trotz eines weiten Bereichs an Ätiologien (wobei Rauchen die häufigste ist) hätte eine Verbesserung von jedem der obigen Symptome, Anzeichen oder pathologischen Vorgängen eine günstige Auswirkung auf den Zustand; eine wirksame Anti-Mikrotubuli-Therapie für COPD würde für deshalb wenigstens eines der oben erwähnten Symptome verändern. Eine Behandlung mit einem Anti-Mikrotubuli-Mittel würde, wie zuvor für Asthma beschrieben, verabreicht werden: Inhaliertes Paclitaxel würde in 1 bis 50 mg/m² gegeben werden, mit Wiederholungen je nach Bedarf, für eine systemische Paclitaxel-Therapie würden 10 bis 50 mg/m² alle 1 bis 4 Wochen in chronischer Verabreichung gegeben werden oder 50 bis 250 mg/m² als ein "Puls" bei dem akut kranken Patienten gegeben werden. Andere Anti-Mikrotubuli-Mittel würden in klinisch äquivalenten Dosen verabreicht werden.
Formulierung und Verabreichung
Wie oben angegeben können, die Anti-Mikrotubuli Mittel der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Formen formuliert werden (z. B. Mikrosphären, Pasten, Filme, Sprays, Einreibungen, Cremes, Gele und ähnliches). Weiterhin können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen formuliert werden, um mehr als ein anti-Mikrotubuli Mittel zu enthalten, um eine Vielzahl von zusätzlichen Verbindungen zu enthalten oder um bestimmte physikalische Eigenschaften (z. B. Elastizität, einen bestimmten Schmelzpunkt oder eine spezifische Freisetzungsrate) aufzuweisen. Innerhalb bestimmter Ausführungsformen können Zusammensetzungen kombiniert werden, um einen gewünschten Effekt zu erreichen (z. B. mehrere Präparationen von Mikrosphären können kombiniert werden, um sowohl eine schnelle und eine langsame und verlängerte Freisetzung von einem oder mehreren anti-Mikrotubuli Mitteln zu erreichen).
Anti-Mikrotubuli-Mittel können entweder allein oder in Kombination mit pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Trägern, Zusätzen oder Verdünnungsmitteln verabreicht werden. Im allgemeinen sollten solche Träger bei den angewendeten Dosen und Konzentrationen für den Empfänger nicht toxisch sein. Gewöhnlich bringt die Herstellung von solchen Zusammensetzungen die Kombination des therapeutischen Mittels mit Puffern, Antioxidantien, so wie Ascorbinsäure, Polypeptide niederen Molekulargewichts (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Carbohydraten einschließlich Glukose, Saccharose, oder Dextrinen, Chelatbildnern, so wie EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Zusatzstoffen mit sich. Neutral gepufferte Kochsalzlösung oder mit nicht spezifischem Serumalbumin gemischte Kochsalzlösung sind beispielhafte geeignete Verdünnungsmittel.
Wie oben angegeben, können die anti-Mikrotubuli Mittel, Zusammensetzungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hier zur Verfügung gestellt werden, zur Verabreichung über eine Vielzahl von verschiedenen Wegen hergestellt werden, einschließlich z. B. topisch zu einer entzündlichen Stelle, oral, rektal, intracranial, intrathekal, intranasal, intraokular, intravenös, subkutan, intraperitoneal, intramuskulär, sublingual und intravesikal. Andere repräsentative Wege der Verabreichung schließen direkte Verabreichung (bevorzugterweise mit Ultraschall, CT, fluoroskopischer, MRI oder endoskopischer Führung) zu der Erkrankungsstelle ein.
Die hier zur Verfügung gestellten therapeutischen Mittel, therapeutischen Zusammensetzungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen können innerhalb von Behältern zusammen mit Verpackungsmaterial, das Anweisungen in Bezug auf die Verwendung von solchen Materialien zur Verfügung stellt, enthalten sein. Im allgemeinen schließen solche Anweisungen eine faßbare Beschreibung ein, welche die Reagenzienkonzentration sowie innerhalb bestimmter Ausführungsformen relative Mengen von zugesetzten Inhaltsstoffen oder Verdünnungsmitteln (z. B. Wasser, Kochsalzlösung oder PBS) ein, die erforderlich sein können, um das Anti-Mikrotubuli-Mittel, die Anti-Mikrotubuli-Zusammensetzungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen zu rekonstituieren.
Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
BEISPIELE
Wie oben beschrieben, ist chronische Entzündung ein Prozeß, der durch die Gewebeinfiltration mit weißen Blutzellen (Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen und Plasmazellen), Gewebezerstörung durch entzündliche Zellen und Zellprodukte (reaktive Sauerstoffspezies, gewebeabbauende Enzyme, so wie Matrixmetalloproteinasen) und wiederholte Versuche der Reparatur durch Bindegewebsersatz (Angiogenese und Fibrose) gekennzeichnet ist.
Um die Anti-Mikrotubuli-Mittel auf ihre Fähigkeit hin zu untersuchen, die chronische Entzündung zu beeinflußen, wurden die folgenden pathologischen biologischen Endpunkte (untersucht): (1) Inhibierung der weißen Blutzellantwort (Makrophagen, Neutrophile und T-Zellen), welche die entzündliche Kaskade initiiert; (2) Inhibierung der Hyperproliferation von mesenchymalen Zellen (Fibroblasten, Synoviozyten, usw.) die zu der Entwicklung von der Fibrose und Verlust von Organfunktion führt; (3) Inhibierung von Matrixmetalloproteinase Produktion/Aktivität, die Gewebeschädigung verursacht; (4) Unterbrechung der Angiogenese, welche die entzündliche Antwort verstärken kann und die metabolische Unterstützung zur Verfügung stellt, die für das Wachstum und die Entwicklung des fibrösen Gewebes nötig ist; und (5) als dies muß ohne eine wesentliche Toxizität auf normale parenchymale Zellen oder eine Beeinträchtigung der normalen Synthese der Matrixkomponenten (z. B. Collagen und Proteoglykane) erreicht werden.
Wie unten genauer beschrieben ist, wurde die Aktivität von Mitteln, die Mikrotubuli stabilisieren, so wie z. B. Paclitaxel, in verschiedenen Geweben und entzündlichen Erkrankungsstadien untersucht. Diese Mittel zeigen eine Fähigkeit, viele dieser oben genannten Erkrankungsparameter zu beeinflussen.
BEISPIEL 1
EFFEKT VON ANTI-MIKROTUBULI-MITTELN AUF NEUTROPHILEN AKTIVITÄT
Das Beispiel beschreibt den Effekt von Anti-Mikrotubuli-Mitteln auf die Antwort von Neutrophilen, die mit opsonisierten CPPD-Kristallen oder opsonisiertem Zymosan stimuliert wurden. Wie durch im folgenden beschriebene Experimente gezeigt, sind Anti-Mikrotubuli-Mittel starke Inhibitoren von Partikel-induzierter Neutrophilen-Aktivierung, wie durch Chemilumineszenz, Superoxid-Anion-Produktion und Degranulierung in Antwort auf Plasmaopsonisierte Mikrokristalle oder Zymosan gemessen.
A. Materialien und Methoden
Hanks gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) pH 7,4 wurde in dieser Studie verwendet. Alle Chemikalien wurden von Sigmas Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben, wenn nicht anders angegeben. Alle Experiemente wurden bei 37°C durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.
1. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON KRISTALLEN
CPPD (triklinische) Kristalle wurden hergestellt. Die Größenverteilung der Kristalle war ungefähr 33% weniger als 10 μm, 58% zwischen 10 und 20 μm und 9% größer als 20 μm. Kristalle, die unter den oben genannten Bedingungen hergestellt wurden, sind Pyrogen-frei, und unter sterilen, Pyrogen-freien Bedingungen hergestellte Kristalle ergaben dieselbe Größenordnung von Neutrophilen-Antwort wie Kristalle, die unter normalen, nicht-sterilen Laborbedingungen hergestellt wurden.
2. OPSONIESIERUNG VON KRISTALLEN UND ZYMOSAN
Alle Experimente, welche die Neutrophilen-Antworten auf Kristalle oder Zymosan in Anwesenheit von Paclitaxel untersuchten, wurden unter der Verwendung von Plasma-opsonisiertem CPPD oder Zymosan durchgeführt. Opsonisie rung von Kristallen oder Zymosan wurde mit 50% heparinisiertem Plasma bei einer Konzentration 75 mg CPPD oder 12 mg Zymosan pro ml von 50% Plasma durchgeführt. Kristalle oder Zymosan wurden mit Plasma für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann in Überschuß HBSS gewaschen.
3. NEUTROPHILEN PRÄPARATION
Neutrophile wurden von frisch gesammeltem menschlichem citriertem Gesamtblut präpariert. Kurz, wurden 400 ml Blut mit 80 ml 4% Dextran T500 (Pharmacia LKB, Biotechnology AB Uppsala, Schweden) in HBSS gemischt und für eine Stunde setzen gelassen. Plasma wurde kontinuierlich gesammelt und 5 ml zu 5 ml Ficoll Paque (Pharmacia) in 15 ml Polypropylengefäßen (Coming, NY hinzugegeben. Nach Zentrifugieren bei 500 g für 30 Minuten wurden die Neutrophilen-Pellets durch 20 Sekunden hypotonischen Schock frei von Erythrocyten gewaschen. Neutrophile wurden in HBSS resuspendiert, auf Eis aufbewahrt und innerhalb von 3 Stunden für Experimente verwendet. Die Neutrophilen-Lebensfähigkeit und Reinheit war immer größer als 90%.
4. INKUBATION VON NEUTROPHILEN MIT ANTI-MIKROTUBULI MITTELN.
(a) Paclitaxel
Eine Stammlösung von Paclitaxel bei 12 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde vor jedem Experiment frisch hergestellt. Diese Stammlösung wurde in DMSO verdünnt, um Lösungen von Paclitaxel im Konzentrationsbereich von 1 bis 10 mM zu ergeben. Gleiche Volumen von diesen verdünnten Paclitaxellösungen wurden zu Neutrophilen bei 5.000.000 Zellen pro ml unter sanftem Mischen hinzugefügt, um Konzentrationen von 0 bis 50 μM mit einer finalen DMSO Konzentration von 0,5% zu erhalten. Die Zellen wurden für 20 Minuten bei 33°C inkubiert, dann für 10 Minuten bei 37°C vor Zugabe von Kristallen oder Zymosan.
(b) Aluminiumfluorid
Eine Stammlösung von Aluminiumfluorid (AlF₃) bei 1 M in HBSS wurde frisch hergestellt. Diese Stammlösung wurde in HBSS verdünnt, um Lösungen von AlF₃ im Konzentrationsbereich von 5 bis 100 mM zu erhalten. Gleiche Volumen (50 μl) von diesen verdünnten AlF₃ Lösungen wurden zu Neutrophi len bei 5.000.000 Zellen pro ml zugefügt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Luminol (1 μM) wurde hinzugefügt und dann 20 μl von opsonisiertem Zymosan (finale Konzentration = 1 mg/ml), um die Zellen zu aktivieren.
(c) Glyzinethylester
Eine Stammlösung von Glyzinethylester bei 100 mM in HBSS wurde frisch hergestellt. Diese Stammlösung wurde in HBSS verdünnt, um Lösungen von Glyzinethylester im Konzentrationsbereich von 0,5 bis 10 mM zu ergeben. Gleiche Volumen (50 μl) von diesen verdünnten Glyzinethylester Lösungen wurden zu Neutrophilen bei 5.000.000 Zellen pro ml hinzugefügt und fir 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Luminol (1 μM) wurde hinzugefügt und dann 20 μl von opsonisiertem Zymosan (finale Konzentration = 1 mg/ml), um die Zellen zu aktivieren.
(d) LY290181
Eine Stammlösung von LY290181 bei 100 μM in HBSS wurde frisch hergestellt. Diese Stammlösung wurde in HBSS verdünnt, um Lösungen von LY290181 im Konzentrationsbereich von 0,5 bis 50 μM zu ergeben. Gleiche Volumen (50 μl) von diesen verdünnten LY290181-Lösungen wurden zu Neutrophilen bei 5.000.000 Zellen pro ml hinzugefügt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Luminol (1 μM) wurde hinzugefügt und dann 20 μl von opsonisiertem Zymosan (finale Konzentration = 1 mg/ml), um die Zellen zu aktivieren.
5. CHEMILUMINESZENZTEST
Alle Chemilumineszenz-Untersuchungen wurden bei einer Zellkonzentration von 5.000.000 Zellen/ml in HBSS mit CPPD (50 mg/ml) durchgeführt. In allen Experimenten wurden 0,5 ml Zellen zu 25 mg von CPPD oder 0,5 mg Zymosan in 1,5 ml zugedeckelten Eppendorf-Gefäßen hinzugefügt. 10 μl von Luminol, gelöst in 25% DMSO in HBSS, wurde bis zu einer finalen Konzentration von 1 μM hinzugefügt und die Proben wurden gemischt, um die Neutrophilen-Aktivierung durch die Kristalle oder Zymosan zu initiieren. Die Chemilumineszenz wurde unter der Verwendung eines LKB Luminometer (Modell 1250) bei 37°C für 20 Minuten mit Schütteln unmittelbar vor den Messungen, um die Kristalle oder Zymosan zu resuspendieren, verfolgt. Kontrollgefäße enthielten Zellen, Wirkstoff und Luminol (Kristalle fehlten).
6. SUPEROXIDANION ERZEUGUNG
Die Superoxidanion-Konzentrationen wurden unter der Verwendung des Superoxid-Dismutase inhibierbaren Reduktion von Cytochrom C Tests gemessen. Kurz, wurden 25 mg Kristalle oder 0,5 mg Zymosan in einem 1,5 ml gedekkelten Eppendorf-Gefäß plaziert und auf 37°C erwärmt. 0,5 ml Zellen bei 37°C wurden zusammen mit Ferricytochrom C (finale Konzentration 1,2 mg/ml) hinzugefügt und die Zellen wurden durch Schütteln der zugedeckelten Gefäße aktiviert. Zu geeigneten Zeiten wurden die Gefäße bei 10.000 g für 10 Sekunden zentrifugiert und der Überstand für den Test durch Messen der Absorption bei 550 nm gesammelt. Kontrollgefäße wurden unter denselben Bedingungen mit Einschluß von Superoxid-Dismutase bei 600 Units pro ml angesetzt.
7. NEUTROPHILEN-DEGRANULIERUNGSTEST
Ein und ein halber Mililiter Eppendorf Gefäße, die entweder 25 mg CPPD oder 1 mg Zymosan enthielten, wurden auf 37°C vorgewärmt. 0,5 ml von Zellen bei 37°C wurden hinzugefügt, gefolgt von kräftigem Schütteln, um die Reaktion zu starten. Zu geeigneten Zeiten wurden die Gefäße bei 10.000 g für 10 Sekunden zentrifugiert und 0,4 ml von Überstand wurde bei –20°C für spätere Tests gelagert.
Lysozym wurde durch die Abnahme der Absorption bei 450 nm einer Micrococcus lysodeikticus-Suspension gemessen. Kurz gesagt, wurde Micrococcus lysodeikticus bei 0,1 mg/ml in 65 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,2 suspendiert und die Absorption bei 450 nm wurde auf 0,7 Units durch Verdünnung eingestellt. Die Kristall (oder Zymosan) und Zellüberstand (100 μl) wurden zu 2,5 ml der Micrococcus Suspension hinzugefügt und die Abnahme der Absorption wurde verfolgt. Lysozymstandards (Hühnereiweis) im Bereich von 0 bis 2000 Units/ml wurden hergestellt und eine Kalibrierungskurve der Lysozymkonzentration gegen die Rate der Abnahme der Absorption bei 450 nm wurde erhalten.
Die Myeloperoxidase (MPO) Aktivität wurde durch die Zunahme der Absorption bei 450 nm, die die Oxidation von Dianisidin begleitet, gemessen. 7,8 mg Dianisidin wurden in 100 ml 0,1 M Zitratpuffer, pH 5,5 bei 3,2 mM durch Beschallung gelöst. Zu einer 1 ml Küvette wurden 0,89 ml der Dianisidinlösung hinzugefügt, gefolgt von 50 μl 1% Triton 100, 10 μl einer 0,005% Wasserstoffperoxidlösung in Wasser und 50 μl Kristall- Zellüberstand. Die MPO Aktivität wurde aus der Änderung in der Absorption (450 nm) pro Minute, delta Å 450, unter der Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt: Dianisidin-Oxidation (nmol/min) = 50 × delta Å 450
B. NEUTROPHILEN LEBENSFÄHIGKEIT
Um den Effekt der anti-Mikrotubuli Mittel auf die Neutrophilen-Lebensfähigkeit zu bestimmen, wurde die Freisetzung des zytoplasmatischen Markerenzyms, Lactat-Dehydrogenase (LDH) gemessen. Kontrollgefäße, die Zellen mit Wirkstoff (Kristalle fehlten) von Degranulationsexperimenten enthielten, wurden ebenfalls auf LDH getestet.
B. Ergebnisse
In allen Experimenten wurde die statistische Signifikanz unter der Anwendung des Studenten t-Tests bestimmt und die Signifikanz wurde bei p < 0,05 ermittelt. Wo Fehlerbalken gezeigt sind, beschreiben sie eine Standardabweichung um den Mittelwert für die n-Zahl, die angegeben ist.
1. NEUTROPHILEN-LEBENSFÄHIGKEIT
(a) Paclitaxel
Neutrophile, die mit Paclitaxel bei 46 μM für eine Stunde bei 37°C behandelt wurden, zeigten keine erhöhten Level von LDH Freisetzung (immer weniger als 5% gesamt) über die Kontrollen, was daraufhin deutet, daß Paclitaxel keinen Zelltod verursachte.
(b) Aluminiumfluorid
Neutrophile, die mit Aluminiumfluorid in einem Konzentrationsbereich von 5 bis 100 mM für 1 Stunde bei 37°C behandelt wurden, zeigten keinen erhöhten Level von LDH Freisetzung über die Kontrollen, was darauf hinwies, daß Aluminiumfluorid keinen Zelltod verusachte.
(c) Glyzinethylester
Neutrophile, die mit Glyzinethylester in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 20 mM für 1 Stunde bei 37°C behandelt wurden, zeigten keinen erhöhten Level der LDH Freisetzung über die Kontrollen, was darauf hindeutete, daß Glyzinethylester keinen Zelltod verursachte.
2. CHEMILUMINESZENZ
(a) Paclitaxel
Paclitaxel bei 28 μM ergab eine starke Inhibierung von sowohl Plasmaopsonisiertes CPD- und Plasma-opsonisiertes Zymosan-induzierter Neutrophilen-Chemilumineszenz, wie jeweils in 1A, 1B und 2A gezeigt ist. Die Inhibierung der Peak-Chemilumineszenzantwort war 52% (+/–12%) und 45% (+/–11%) für jeweils CPPD und Zymosan. Die Inhibierung durch Paclitaxel bei 28 μM von sowohl Plasma-opsonisiertes CPPD- und Plasma-opsonisiertes Zymosan-induzierter Chemilumineszenz war bei allen Zeiten von 3 bis 16 Minuten (1 und 4A) signifikant. 1A und 1B zeigen die Konzentrationsabhängigkeit der Paclitaxel-Inhibierung von Plasma opsonisiertem CPPD-induzierter Neutrophilen-Chemilumineszenz. In allen Experimenten ergaben Kontrollproben niemals Chemilumineszenzwerte von mehr als 5 mV und die Zugabe von Paclitaxel bei allen Konzentrationen, die in dieser Studie verwendet wurden, hatte keinen Effekt auf die Chemilumineszenzwerte der Kontrollen.
(b) Aluminiumfluorid
Aluminiumfluorid bei Konzentrationen von 5 bis 100 mM ergab eine starke Inhibierung der Plasma opsonisiertem Zymosan-induzierten Neutrophilen-Chemilumineszenz, wie in 1 C gezeigt. Diese Figur zeigt die Konzentrationsabhängigkeit von der AlF₃ Inhibierung Plasma-opsonisiertem Zymosan induzierter Neutrophilen-Chemilumineszenz. Die Zugabe von AlF₃ bei allen in dieser Studie verwendeten Konzentrationen hatte keinen Effekt auf die Chemilumineszenzwerte von Kontrollen.
(c) Glyzinethylester
Glyzinethylester ergab bei Konzentrationen von 0,5 bis 20 mM eine starke Inhibierung von Plasma opsonisierter Zymosan-induzierter Neutrophilen-Chemilumineszenz, wie in 1D gezeigt ist. Diese Figur zeigt die Konzentrationsabhängigkeit von Glyzinethylesterinhibierung von Plasma opsonisiertem Zymosan-induzierter Neutrophilen-Chemilumineszenz. Die Zugabe von Glyzinethylester bei allen Konzentrationen, die in dieser Studie verwendet wurden, hatte keinen Effekt auf die Chemilumineszenzwerte von Kontrollen.
(d) LY290181
LY290181 bei Konzentrationen von 0,5 bis 50 μM ergab eine starke Inhibierung der von Plasma opsonisiertem Zymosan-induzierten Neutrophilen-Chemilumineszenz, wie in 1E gezeigt ist. Diese Figur zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der LY290181 Inhibierung von Plasma opsonisiertem Zymosan-induzierter Neutrophilen-Chemilumineszenz. Die Zugabe von LY290181 in allen in dieser Studie verwendeten Konzentrationen hatte keinen Effekt auf die Chemilumineszenzwerte von Kontrollen.
3. SUPEROXIDERZEUGUNG
Der Zeitverlauf von Plasma opsonisierten CPPD Kristallen-induzierter Superoxidanionproduktion, wie durch die durch Superoxid-Dismutase (SOD) inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen, ist in 3 gezeigt. Behandlung von Zellen mit Paclitaxel bei 28 μM ergab eine Abnahme der Menge von erzeugtem Superoxid zu allen Zeiten. Diese Abnahme war zu allen Zeiten signifikant, die in 3A gezeigt sind. Die Konzentrationsabhängigkeit dieser Inhibierung ist in 3B gezeigt. Stimulierung von Superoxidanionproduktion durch opsonisiertes Zymosan (4B) zeigte einen ähnlichen Zeitverlauf zu CPPD-induzierter Aktivierung. Die Inhibierung von Zymosaninduzierter Superoxidanionproduktion durch Paclitaxel bei 28 μM war weniger dramatisch als die Inhibierung von CPPD Aktivierung, aber war zu allen Zeiten, die in 4B gezeigt sind, signifikant.
Die Behandlung von CPPD Kristall-induzierten Neutrophilen mit LY290181 bei 17 μM ergab ebenfalls eine Abnahme in der Menge von erzeugtem Superoxid (3C).
4. NEUTROPHILENDEGRANULIERUNG
Die Neutrophilendegranulierung wurde durch die Plasma opsonisierten CPPD Kristall-induzierte Freisetzung von Myeloperoxidase und Lysozym oder die Plasma opsonisiertem Zymosan-induzierte Freisetzung von Myeloperoxidase verfolgt. Es wurde gezeigt, daß ausreichende Mengen dieser zwei Enzyme in das extrazelluläre Medium freigesetzt werden, wenn Plasma beschichtete CPPD Kristalle verwendet werden, um Neutrophile zu stimulieren, ohne den Bedarf einer Zugabe von Cytochalasin B zu den Zellen. 5 und 2 zeigen jeweils den Zeitverlauf der Freisetzung von MPO und Lysozym aus Neutrophilen, die dwch Plasma-beschichtetes CPPD stimuliert wurden. 5A zeigt, daß Paclitaxel die Myeloperoxidase Freisetzung von Plasma opsoniesierten CPPD aktivierten Neutrophilen in den ersten 9 Minuten der Kristall-Zellinkubation inhibiert. Paclitaxel inhibiert die CPPD-induzierte Myeloperoxidase Freisetzung signifikant zu allen Zeiten, wie in 5A gezeigt ist. 5B zeigt die Konzentrationsabhängikeit der Paclitaxel Inhibierung auf CPPD-induzierte Myeloperoxidase Freisetzung.
Paclitaxel bei 28 μM reduzierte die Lysozymfreisetzung und diese Inhibierung der Degranulation war zu allen Zeiten, wie in 2 gezeigt, signifikant.
Nur kleine Mengen von MPO und Lysozym wurden freigesetzt, wenn Neutrophile mit opsonisiertem Zymosan stimuliert wurden. Trotz dieser niedrigen Level war es möglich, eine 50% Inhibierung von MPO Freisetzung nach 9 Minuten Inkubation in Anwesenheit von Paclitaxel bei 28 μM zu verfolgen, die statistisch signifikant (p < 0,05) (Daten nicht gezeigt) war. Die Behandlung von CPPD Kristall-induzierten Neutrophilen mit LY290181 bei 17 μM verringerte sowohl die Lysozym als auch die Myeloperoxidase Freisetzung von den Zellen (5C und 5D).
C. Diskussion
Diese Experimente zeigen, daß Paclitaxel und andere anti-Mikrotubuli Mittel starke Inhibitoren von Kristall-induzierter Neutrophilen-Aktivierung sind. Zusätzlich ist es durch Aufzeigen ähnlicher Level der Inhibierung bei der Neutrophilen-Antwort auf eine andere Form von partikulärem Aktivator, opsonisiertem Zymosan, ersichtlich, daß die inhibitorische Aktivität von Paclitaxel und anderen anti-Mikrotubuli Mitteln nicht auf die Neutrophilen-Antwort auf Kristalle begrenzt ist. Paclitaxel, Aluminiumfluorid, Glyzinethylester und LY290181 konnten ebenfalls als starke Inhibitoren Zymosaninduzierter Neutrophilen-Aktivierung ohne Verursachen von Zelltod identifiziert werden. Es wurde gezeigt, daß LY290181 die Superoxidanionproduktion und die Degranulation von CPPD Kristall-induzierten Neutrophilen verringerte.
BEISPIEL 2
T-ZELLANTWORT AUF ANTIGENSTIMULUS
Um zu bestimmen, ob Paclitaxel die T-Zellaktivierung in Antwort auf stimulierende Mittel beeinflußt, wurden TR1 T-Zellklone mit entweder Myelin-basischem-Proteinpeptid GP68-88 oder dem Lectin conA für 48 Stunden in Abwesenheit oder Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von Paclitaxel in einer mizellären Formulierung stimuliert. Paclitaxel wurde bei Beginn des Experiments oder 24 Stunden nach der Stimulierung von Zellen mit Peptid oder conA hinzugefügt. Tritiumthymidin-Einbau wurde als ein Maß der T-Zellproliferation in Antwort auf Peptid oder conA Stimulierung gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die T-Zellstimulierung in Antwort auf die Peptide GP68-88 und conA zunahm. In Anwesenheit von Kontroll-Polymeren Mizellen war die T-Zellstimulierung in Antwort auf beide Agonisten nicht verändert. Jedoch verringerte eine Behandlung mit Paclitaxel-Mizellen, entweder zu Beginn des Experiments oder 24 Stunden nach der Stimulierung, die T-Zellantwort auf konzentrationsabhängige Weise. Unter beiden Bedingungen wurde die T-Zellproliferation durch 0,02 μM Paclitaxel vollständig inhibiert (79).
Diese Daten zeigen, daß Paclitaxel ein potenter Inhibitor der T-Zellproliferation in Antwort auf eine Antigen-induzierte Stimulierung ist.
BEISPIEL 3
EFFEKT VON PACLITAXEL AUF DIE SYNOVIOZYTEN-ZELLTEILUNG IN VITRO
Zwei Experimente wurden durchgeführt, um den Effekt von unterschiedlichen Konzentrationen von Paclitaxel auf den Tritiumthymidin-Einbau (ein Maß der DNA-Synthese der Synoviozyten) und die Zellteilung in vitro zu untersuchen.
A. Materialien und Methoden
1. ³H-THYMIDINEINBAU IN SYNOVIOZYTEN
Synoviozyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Paclitaxel (10^–5 M, 10^–6 M, 10^–7 M und 10^–8 M) kontinuierlich für 6 oder 24 Stunden in vitro inkubiert. Zu diesen Zeiten wurden 1 × 10⁶ cpm ³H-Thymidin zu der Zellkultur hinzugefügt und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch ein Zell-Erntegerät plaziert, durch einen Filter gewaschen, die Filter wurden zerschnitten und die Menge von in den Filterausschnitten enthaltene Radioaktivität wurde bestimmt. Sobald die Menge von in den Zellen eingebautem Thymidin festgestellt wurde, wurde diese dazu verwendet, die Rate der Zellteilung zu bestimmen. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt und die Daten ausgewertet.
2. SYNOVIOZYTEN ZELLTEILUNG
Rinder-synoviale Fibroblasten wurden in Anwesenheit und Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen (10^–5 M, 10^–6 M, 10^–7 M und 10^–8 M) von Paclitaxel für 24 Stunden angezogen. Am Ende dieser Zeitspanne wurde die Gesamtzahl von lebensfähigen Synoviozytenzellen visuell durch Farbstoff-Ausschlußzählung unter der Verwendung von Trypan-Blaufärbung bestimmt. Dieses Experiment wurde 4 mal durchgeführt und die Daten ausgewertet.
B. Ergebnisse
1. ³H-THYMIDIN-EINBAU IN SYNOVIOZYTEN
Diese Studie zeigt, daß Paclitaxel bei niedrigen Konzentrationen den Einbau von ³H-Thymidin (und bei Ausdehnung die DNA-Synthese) in Synoviozyten bei so geringen Konzentrationen wie 10^–8 M inhibiert. Bei 6 Stunden konnte kein signifikanter Unterschied zwischen dem Ausmaß von durch die höheren versus die niedrigeren Konzentrationen von Paclitaxel (8) produzierte Inhibierung gezeigt werden. Jedoch ging bei niedrigeren Konzentrationen der Droge (10^–8 M) nach 24 Stunden einiges des Effekts verloren, aber war dennoch wesentlich niedriger als die, die in Kontrolltieren gesehen wurde.
2. SYNOVIOZYTEN ZELLTEILUNG
Diese Studie zeigte, daß Paclitaxel auf konzentrationsabhängige Weise zytotoxisch für sich teilende synoviale Fibroblasten war. Paclitaxel bei Konzentrationen so niedrig wie 10^–7 M ist in der Lage, die Zellteilung von den Synoviozyten (9) zu inhibieren. Bei höheren Konzentratioen Paclitaxel (10^–6 M und 10^–5 M) war die Droge für die synovialen Fibroblasten in vitro toxisch.
C. Diskussion
Die oben aufgeführte Studie zeigte, daß Paclitaxel in der Lage ist, die Zellteilung von Fibroblasten, die aus dem Synovium stammen, bei relativ niedrigen Konzentrationen in vitro zu inhibieren. Daher, die Rolle von Bindegewebe bei der Entwicklung von chronischer Entzündung und ihrem Verhalten während der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen gegeben, wird die Blockade der Zellteilung den Ausgang der Krankheit in vivo vorteilhaft beeinflußen.
BEISPIEL 4 (Vergleichsbeispiel)
CHARAKTERISIERUNG VON PACLITAXEL-AKTIVITÄT AUF MENSCHLICHE EPIDERMALE KERATINOZYTEN IN VITRO
Die Zeit- und Dosis-abhängigen Effekte von Paclitaxel auf sich aktiv teilende normale menschliche Keratinozyten und HaCAT Keratinozyten (spontan immortalisierte menschliche epidermale Keratinozyten) wurde untersucht.
A. Materialien und Methoden
Der Effekt von Paclitaxel auf Keratinozyten wurde durch Bestimmung der Zellzahl und ³H-Thymidin-Einbau durch die Zellen ermittelt. Für den Thymidin-Einbau wurden Keratinozyten bei niedriger Dichte plattiert (in DMEM, mit 10% FCS, Glutamin und Antibiotika ergänzt), die mit Paclitaxel Konzentrationen von 0 bis 10^–4 M für 6 Stunden während logarithmischem Wachstum behandelt wurden. ³H-Thymidin wurde zu den Zellen hinzugefügt und für weitere 6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und die Radioaktivität bestimmt. Um die Gesamtzellzahlen zu bestimmen, wurden die Keratinozyten wie beschrieben plattiert und in Anwesenheit und Abwesenheit von Paclitaxel für 4 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gesammelt und durch den Trypan-Blau Ausschlußtest gezählt.
B. Ergebnisse
Die Zahl von lebensfähigen Zellen wurde als ein Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen bestimmt. Bei einer Paclitaxel-Konzentration von 10^–9 M, war die Zell-Lebensfähigkeit größer als 100% der unbehandelten Kontrollen, während bei 10^–8 M die Lebensfähigkeit geringfügig weniger bei 87% war (7). Es konnte eine signifikante Abnahme in der Zell-Lebensfähigkeit bei einer Paklitaxelkonzentration von 10^–7 M oder höher festgestellt werden.
C. Diskussion
Paclitaxel war bei Konzentrationen so gering wie 10^–7 M extrem zytotoxisch gegenüber menschlichen Keratinozyten. In Psoriasis sind Keratinozyten sich abnormal teilende Zellen und weil Paclitaxel Mikrotubuli stabilisiert, wird sein Effekt in diesem mitotisch aktiven System erwartet. In anderen Untersuchungen wurde Paclitaxel als zytotoxisch gegenüber sich teilenden Synoviozyten gefunden, wobei jedoch kein Effekt auf sich nicht teilende Chondrozyten gefunden wurde. Daher wirkt Paclitaxel vielleicht auf die hyperproliferierenden Zellen in Psoriasis-Läsionen, während es nicht giftig gegenüber normalen epidermalen Zellen ist.
BEISPIEL 5 (Vergleichsbeispiel)
EFFEKT VON PACLITAXEL AUF ASTROZYTEN-ZELLTEILUNG
Es ist gut bekannt, daß es eine Zunahme in der Zahl von fibrösen Astrozyten in MS Läsionen gibt, von denen vermutet wird, daß sie an der Zerstörung von Myelin durch die Produktion von Zytokinen und Matrixmetalloproteinasen beteiligt sind (Mastronardi et al., J. Neurosci. Res. 36: 315–324, 1993; Chandler et al., J. Neuroimmunol. 72: 155–161, 1997). Fibröse Astrozyten weisen hohe Level von glialem fibrillärem saurem Protein (GFAP) auf, das als ein biochemischer Marker für die fibröse Astrozytenproliferation dient. Die Fähigkeit von Paclitaxel-Mizellen, die Astrozytenproliferation zu inhibieren, wurde in einem transgenen Mausmodell von demyelinisierender Erkrankung untersucht (Mastronardi et al., J. Neurosci. Res. 36: 315–324, 1993).
A. Materialien und Methoden
Die subkutane Verabreichung von kontinuierlicher Paclitaxeltherapie (2 mg/kg; 3 × pro Woche, insgesamt 10 Injektionen) wurde bei klinischem Ausbruch der Erkrankung (ungefähr in einem Alter von 4 Monaten) begonnen. Fünf Tiere erhielten mizelläres Paclitaxel, zwei Mäuse wurden als Kontrollen verwendet, eine Maus war eine unbehandelte Normale und eine war eine unbehandelter transgener Littermate. Nur eine transgene Maus wurde als Kontrolle verwendet, da der Verlauf der Erkrankung im Labor gut etabliert ist. Vier Monate alte Tiere wurden mit mizellärem Paclitaxel beimpft, nachdem die anfänglichen Anzeichen von neurologischer Pathologie von MS ersichtlich waren.
Drei Tage nach der zehnten Injektion wurde die experimentelle Untersuchung beendet und Hirngewebe zur histologischen Analyse verarbeitet. Zur Lichtmikroskopie wurden die Gewebe in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte wurden mit Anti-GFAP Antikörper (DACO) markiert, gewaschen und dann mit einem sekundären Antikörper, der mit HPP konjugiert war, reagiert. Die Schnitte wurden auf HPP gefärbt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Zur Elektronenmikroskopie wurden die Gewebe in 2,5% Glutaraldehyd und Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) fixiert und mit 1% Osmiumtetroxid nach-fixiert. Schnitte wurden präpariert und mit einem JEOL 1200 EXII Transmissions EM betrachtet.
B. Ergebgnisse
Während die neurologische Pathologie fortschreitet, sind die Level von GFAP in den transgenen Maushirnen erhöht; es wird vermutet, daß dies eine Zunahme in der Zahl der vorhandenen fibrösen Astrozyten wiederspiegelt. Im Gegenteil dazu weisen die transgenen Mäuse, die mit Paclitaxel behandelt wurden, nahezu normale Level von GFAP (Tabelle 1) auf. Diese Daten lassen vermuten, daß Paclitaxel vielleicht die Astrozytenproliferation in vivo inhibiert, was zur Vorbeugung der Demyelinisierung in MS beitragen kann.
Die weitere Analyse von GFAP in Hirngewebe wurde histologisch untersucht. 78 zeigt Hirnschnitte von normalen Mäusen, Kontroll-transgenen Mäusen, die nicht mit Paclitaxel behandelt wurden, und transgenen Mäusen, die mit Paclitaxel behandelt wurden.
Obwohl die Kontroll-transgenen Mäuse eine höhere Zahl von fibrösen Astrozyten aufweisen, ist die Morphologie von den Astrozyten ähnlich zu denen, die in normalen Tieren gesehen werden (dicke Sternfortsätze, die vom Zellkörper ausgehen). Jedoch nahm die Zahl von fibrösen Astrozyten in den mit Paclitaxel behandelten transgenen Mäusen signifikant ab. Weiterhin werden zwei morphologische Veränderungen beobachtet: Der Zellkörper der fibrösen Astrozyten scheint sich abzurunden (was, wie gezeigt wurde, zu einer Apoptose in der Kultur führt) und die zellulären Fortsätze werden um den Zellkörper herum sehr dünn.
Eine weitere ultrastrukturelle Analyse unter der Verwendung der Elektronenmikrospkopie zeigte, daß die Astrozyten von transgenen Mäusen durch dicht gefärbte astrozytische Fortsätze, die vom Zellkörper ausgehen, gekennzeichnet waren. Diese breiten Fortsätze enthalten eine gut organisierte Anordnung von Filamenten, die auf eine lebensfähige, aktivierte Zelle hindeuten. Jedoch war die Morphologie der Astrozyten von transgenen Tieren, die mit Paclitaxel behandelt wurden durch Zellabrundung, dünne filamentöse Fortsätze und intrazelluläre Depletion und Desorganisation von filamentösen Proteinen (80) gekennzeichnet.
C. Schlußfolgerungen
Diese Daten zeigen, daß Paclitaxel Veränderungen von fibrösen Astrozyten in vivo verursacht, dem sich am meisten teilenden Zelltyp in MS Läsionen. Es ist wahrscheinlich, daß Paclitaxel auch die Funktion von astrozytischen Fortsätzen inhibiert und daher die zellulären Geschehnisse verändern kann, die an der Myelinzerstörung beteiligt sind.
BEISPIEL 6
EFFEKT VON PACLITAXEL AUF ENDOTHELZELLTEILUNG
Um zu bestimmen, ob Paclitaxel die Endothelzellteilung inhibiert, wurden EOMA Zellen (eine Endothelzellinie) bei niedriger Dichte plattiert und in Abwesenheit und Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von Paclitaxel für 48 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Zahl von lebensfähigen Zellen unter der Verwendung des Trypan-Blau Ausschlußtests bestimmt. Die Ergebnisse (zur Verfügung gestellt in 9) zeigen, daß Paclitaxel bei Konzentrationen von 10^–8 M die Endothelzellteilung um über 50% inhibierte und Konzentrationen von 10^–7 M oder größer die Zellteilung vollständig inhibierten. Diese Daten zeigen, daß Paclitaxel ein potenter Inhibitor der Endothelzellteilung ist. Alle Zell-Toxizitätstests wurden dreimal durchgeführt und jede individuelle Messung wurde in dreifachen Ansätzen durchgeführt.
Um den Effekt von Paclitaxel auf den Endothelzellzyklus und die Apoptose zu bestimmen, wurden die EOMA Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von Paclitaxel für 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit 3,7% Formaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung für 20 Minuten fixiert, mit DAPI gefärbt (4'-6-Diaminido-2-phenylindol), 1 μg/ml, und mit einem 40 × Objektiv unter epifluoreszenter Optik untersucht. Apoptotische Zellen wurden durch Bewertung der Zellen auf fragmentierte Kerne und kondensiertes Chromatin evaluiert. Die Daten zeigen, daß Konzentrationen von Paclitaxel größer als 10^–8 M die Endothelzell-Apoptose induzierte (10).
BEISPIEL 7
ZELLTEILUNGSTEST-PROTOKOLL (MTT)
Am Tag eins wurden 5 – 10 × 10⁴ Synoviozyten pro Napf (96-Napfplatte) plattiert. Reihe #1 wurde frei von Zellen gehalten (Nullprobe). Am Tag 2 wurde die Platte umgestürzt, um das Medium abzugießen und 200 μl Medium, das verschiedene Konzentrationen von Wirkstoff enthielt, wurde hinzugefügt. Die Zellen wurden für 6 Stunden, 24 Stunden oder 4 Tage exponiert. Es wurde kein Wirkstoff zu Reihen #1 und #2 (jeweils Nullprobe und unbehandelte Kontrolle) hinzugefügt. Das Medium, das den Wirkstoff enthielt, wurde abgegossen und 200 μl von frischem Komplettmedium wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden dann für zusätzliche 3 bis 4 Tage wachsen gelassen. Am Tag 5 wurden 20 μl Dimethylthiazoldiphenyltetrazolium Bromidsalz (MTT) (5 mg/ml PBS) hinzugefügt und für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde abgegossen und 200 μl DMSO wurden hinzugefügt. Die Platte wurde für 30 Minuten geschüttelt und die Absorption bei 562 nm gemessen.
Ergebnisse
Die Daten wurden als die % von Überleben ausgedrückt, die durch Teilen der Zahl von Zellen, die nach der Behandlung übrigblieben, durch die Zahl von Zellen in der unbehandelten Kontrollreihe #2 (die Zahl von Zellen wurden vor einem Standard erhalten, der vor dem Test durchgeführt wurde) erhalten wurde. Die IC₅₀, die Konzentration von Wirkstoff, die 50% der Population abtötet, kann aus den 11A–E interpoliert werden. Für eine 24-stündige Exponierung wurde die LY290181-Verbindung als der am meisten potente anti-Mikrotubuli Mittel gefunden, um die Zellteilung zu reduzieren und inhibieren, mit einer IC₅₀ von weniger als 5 nM (C). Paclitaxel, Epothilon B und Tubercidin waren geringfügig weniger potent, mit IC₅₀en um jeweils 30 nM (A), 45 nM (F) und 45 nM (B). Zuletzt waren die IC₅₀en für Aluminiumfluorid (AlF₃) und Hexylenglykol signifikant höher, mit Werten jeweils um 32 μM (E) und 64 mM (D).
BEISPIEL 8
EFFEKT VON PACLITAXEL UND ANDEREN ANTI-MIKROTUBULI-MITTELN AUF DIE MATRIX METALLOPROTEINASEPRODUKTION
A. Materialien und Methoden
1. IL-1 STIMULIERTE AP-1 TRANSKRIPTIONELLE AKTIVITÄT WIRD DURCH PACLITAXEL INHIBIERT
Chrondozyten wurden mit Konstrukten transfiziert, die ein AP-1 angetriebenes CAT-Reportergen enhielten und mit IL-1 stimuliert, IL-1 (50 ng/ml) wurde hinzugefügt und für 24 Stunden in Abwesenheit und Anwesenheit von Paclitaxel bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Die Paclitaxelbehandlung verringerte die CAT Aktivität auf eine konzentrationsabhängige Weise (Mittel ±SD). Die Daten markiert mit einem Sternchen (*) sind signifikant, verglichen mit IL-1 induzierter CAT-Aktivität, gemäß eines t-Tests, P < 0,05. Die gezeigten Ergebnisse sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ.
2. EFFEKT VON PACLITAXEL AUF IL-1 INDUZIERTE AP-1 DNA BINDUNGAKTIVITÄT, AP-1 DNA
Die Bindungsaktivität wurde mit einer radiomarkierten menschlichen AP-1 Sequenzsonde und Gelmobilitäts-Veränderungstests getestet. Extrakte von mit verschiedenen Konzentrationen von Paclitaxel (10^–7 bis 10^–5 M) unbehandelten oder behandelten Chondrozyten, gefolgt von IL-1β (20 ng/ml) wurden mit Überschuß an Sonde auf Eis für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von nichtdenaturierender Gelelektrophorese. Die „com" Spur enthielt einen Überschuß von unmarkiertem AP-1 Oligonukleotid. Die gezeigten Ergebnisse sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ.
3. EFFEKT VON PACLITAXEL AUF IL-1 INDUZIERTE MMP-1 UND MMP-3 MRNA EXPRESSION
Zellen wurden mit Paclitaxel bei verschiedenen Konzentrationen (10^–7 bis 10^–5 M) für 24 Stunden behandelt. Dann wurde mit IL-1β (20 ng/ml) für weitere 18 Stunden in Anwesenheit von Paclitaxel behandelt. Gesamt-RNA wurde isoliert und die MMP-1 mRNA Level wurden durch Northern Blot Analyse bestimmt. Die Blots wurden nachfolgend gestrippt und mit ³²P-radioaktiv markierter Ratten-GAPDH-cDNA nochmals getestet, was als ein housekeeping-Gen verwendet wurde. Die gezeigten Ergebnisse sind für vier unabhängige Experimente repräsentativ. Die Quantifizierung von Collagenase-1- und Stromelysin-Expressions-mRNA Level. Die MMP-1 und MMP-3 Expressionslevel wurden mit GAPDH normalisiert.
4. EFFEKT VON ANDEREN ANTI-MIKROTUBULI AUF DIE COLLAGENASE-EXPRESSION
Primäre Chondrozytenkulturen wurden frisch aus Kalbsknorpel isoliert. Die Zellen wurden bei 2,5 × 10^–6 pro ml in 100 × 20 mm Kulturschalen ausplattiert und in Ham's F12 Medium, enthaltend 5% FBS über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in Serum-freiem Medium über Nacht ausgehungert und dann mit anti-Mikrotubuli Mitteln bei verschiedenen Konzentrationen für 6 Stunden behandelt. IL-1 (20 ng/ml) wurde dann zu jeder Platte hinzugefügt und die Platten für weitere 18 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde durch die angesäuerte Guanidinisothiocyanatmethode isoliert und einer Elektrophorese auf einem denaturierenden Gel unterzogen. Denaturierte RNA-Proben (15 μg) wurden durch Gel-Elektrophorese in einem 1% denaturierten Gel analysiert, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der ³²P-markierten Collagenase cDNA Sonde hybridisiert. ³²P-markierte-Glyzeraldehydphosphatasedehydrase (GAPDH)-cDNA wurde als ein interner Standard verwertet, um ungefähr gleiche Beladungen sicher zu stellen. Die exponierten Filme wurden gescannt und mit ImageQuant quantitativ analysiert.
B. Ergebnisse
1. PROMOTOREN DER FAMILIE VON MATRIX-METALLOPROTEINASEN
19A zeigt, daß alle Matrix-Metalloproteinasen mit Ausnahme von Gelatinase B die transkriptionellen Elemente AP-1 und PEA-3 enthielten. Es ist gut etabliert, daß die Expression von Matrix-Metalloproteinasen, so wie Collagenasen und Stromelysinen von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 abhängen. Daher würden Inhibitoren von AP-1 die Expression von Matrix-Metalloproteinasen inhibieren.
2. EFFEKT VON PACLITAXEL AUF AP-1 TRANSKRIPTIONELLE AKTIVITÄT
Wie in 19B gezeigt, stimuliert IL-1 AP-1 transkriptionelle Aktivität 5-fach. Vorbehandlung von transient transfizierten Chondrozyten mit Paclitaxel reduzierte IL-1-induzierte AP-1-Reportergen-CAT-Aktivität. Daher war IL-1 induzierte AP-1 Aktivität in Chondrozyten durch Paclitaxel auf konzentrationsabhängige Weise (10^–7 bis 10^–5 M) reduziert. Diese Daten zeigten, daß Paclitaxel ein potenter Inibitor von AP-1 Aktivität in Chondrozyten war.
3. EFFEKT VON PACLITAXEL AUF AP-1 DNA BINDUNGSAKTIVITÄT
Um zu bestätigen, daß die Paclitaxel-Inhibierung der AP-1 Aktivität nicht aufgrund von nicht-spezifischen Effekten vorlag, wurde der Effekt von Paclitaxel auf IL-1 induzierte AP-1 Bindung an Oligonukleotide unter der Verwendung von Chondrozyten-nukleären Lysaten untersucht. Wie in 19C gezeigt, nahm die IL-1 induzierte Bindungsaktivität in Lysaten von Chondrozyten ab, die mit Paclitaxel bei Konzentrationen von 10^–7 bis 10^–5 M für 24 Stunden vorbehandelt wurden. Die Paclitaxel-Inhibierung von AP-1 transkriptioneller Aktivität korrelierte eng mit der Abnahme der AP-1 Bindung an DNA.
4. EFFEKT VON PACLITAXEL AUF COLLAGENASE UND STROMELYSIN EXPRESSION
Weil Paclitaxel ein potenter Inhibitor von AP-1-Aktivität war, wurde der Effekt von Paclitaxel oder IL-1 induzierter Collagenase- und Stromelysin-Expression, zwei wichtigen Matrix-Metalloproteinasen, die bei entzündlichen Erkrankungen beteiligt sind, untersucht. Kurz, wie in 20 gezeigt, erhöht die IL-1 Induktion Collagenase- und Stromelysin-mRNA Level in Chondrozyten. Vorbehandlung von Chondrozyten mit Paclitaxel für 24 Stunden reduzierte die Level von Collagenase- und Stromelysin-mRNA singnifikant. Bei 10^–5 M Paclitaxel war eine komplette Inhibierung vorhanden. Die Ergebnisse zeigen, daß Paclitaxel die Expression von zwei Matrix-Metalloproteinasen bei Konzentrationen ähnlich zu denen, bei denen es AP-1 Aktivität inhibiert, inhibierte.
5. EFFEKT VON ANDEREN ANTI-MIKROTUBULI AUF COLLAGNASE EXPRESSION
12A–H zeigen, daß anti-Mikrotubuli Mittel die Collagenase Expression inhibierten. Die Expression von Collagenase wurde durch die Zugabe von IL-1, das ein proinflammatorisches Cytokin ist, stimuliert. Vor-Inkubation von Chondrozyten mit verschiedenen anti-Mikrotubuli Mitteln, spezifisch LY290181, Hexylenglykol, Deuteriumoxid, Glyzinethylester, AlF₃, Tubercidin, Epothilon und Ethylenglykol bis-(Succinimidylsuccinat) beugten alle einer IL-1-induzierten Collagenaseexpression bei Konzentrationen so gering wie 1 × 10^–7 M vor.
C. Diskussion
Paclitaxel war in der Lage, die Collagenase- und Stromelysin-Expression in vitro bei Konzentrationen von 10^–6 M zu inhibieren. Weil diese Inhibierung durch die Inhibierung der AP-1 Aktivität erklärt werden kann, ein essentieller Schritt bei der Induktion von allen Matrix-Metalloproteinasen mit Ausnahme von Gelatinase B, wird erwartet, daß Paclitaxel andere Matrix-Metalloproteinasen, die AP-1 abhängig sind, inhibiert. Die Level von diesen Matrix-Metalloproteinasen sind bei allen entzündlichen Erkrankungen erhöht und spielen eine prinzipielle Rolle bei Matrixabbau, zellulärer Wanderung und Teilung und Angiogenese. Daher wird die Paclitaxel Inhibierung der Expression von Matrix-Metalloproteinasen, so wie Collagenase und Stromelysin einen vorteilhaften Effekt bei entzündlichen Erkrankungen haben.
BEISPIEL 9
EFFEKT VON ANTI-MIKROTUBULI-MITTELN AUF DIE EXPRESSION VON PROTEOGLYKANEN
Primäre Chondrozyten-Kulturen wurden frisch aus Kalbsknorpel isoliert. Die Zellen wurden bei 2,5 × 10^–6 pro ml in 100 × 20 mm Kulturschalen plattiert und in Ham's F12 Medium, enthaltend 5% FBS, über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in Serum-freiem Medium über Nacht ausgehungert und dann mit anti-Mikrotubuli Mitteln bei verschiedenen Konzentrationen (10^–7 M, 10^–6 M, 10^–5 M und 10^–4 M) für 6 Stunden behandelt. IL-1 (20 ng/ml) wurde dann zu jeder Platte hinzugegeben und die Platten für weitere 18 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde durch die angesäuerte Guanidin-Isothiocyanat-Methode isoliert und auf einem denturierenden Gel einer Elektrophorese unterzogen. Denaturierte RNA-Proben (15 μg) wurden einer Gelelektrophorese in einem 1% denaturierten Gel unterzogen, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der ³²P-markierten Proteglykan (Aggrecan) cDNA Sonde hybridisiert. ³²P-markierte Glyzeraldehydphosphatasedehydrase (GAPDH) cDNA wurde als ein interner Standard verwendet, um ungefähr gleiche Beladung sicher zu stellen. Die exponierten Filme wurden gescannt und mit ImageQuant quantitativ analysiert.
Ergebnisse
13A–H zeigen, daß die anti-Mikrotubuli Mittel, die einen inhibitorischen Effekt auf die Collagenase-Expression (Beispiel 8), spezifisch LY290181, Hexylenglykol, Deuteriumoxid, Glyzinethylester, AlF₃, Tubercidin Epothilon und Ethylenglykol bis(Succinimidylsuccinat) hatten, die Expression von Aggrecan, einer Hauptkomponente der Knorpelmatrix, bei allen untersuchten Konzentrationen nicht beeinflussen.
BEISPIEL 10
NF-κB AKTIVITÄT (ZELL-BASIERTER) TEST
IL-1 und TNF wurden beide als proinflammatorische Cytokine identifiziert, die die Transkription von Genen aktivieren, die durch einen Transkriptionsfaktor mit Namen NF-κB, der ebenfalls in entzündlichen Prozessen beteiligt ist, angetrieben werden. Der inflammatorische Effekt von IL-1 und TNF kann daher indirekt mittels eines Reportergentests (NF-κB), der auf die IL-1- und TNF-Stimulierung anspricht, ermittelt werden.
Am Tag eins, wurden 5 × 10^–4 NIH-3T3 (Maus-Fibroblasten), stabil mit einem NF-κB Reporterkonstrukt (Luciferase, Promega Corp.) transfiziert, pro Napf (24-Napfplatte) ausplattiert. Sobald konfluent (am Tag 3–4) wurden die Zellen durch Ersetzen des Komplettmediums mit 1 ml von Serum-freiem Medium ausgehungert. Nach einer 24-stündigen Hungerphase wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von anti-Mikrotubuli Mitteln für 6 Stunden vor der Zugabe von IL-1 (20 ng/ml) und TNF (20 ng/ml) behandelt. Die Zellen wurden gegenüber IL-1 und TNF für eine Stunde und 16 Stunden exponiert und die NF-κB-Aktivität 24 Stunden später gemessen. Am Tag 5 wurde das Medium verworfen, und die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann für 15 Minuten mit 250 μl Lyse-Puffer (Promega Corp., Wisconsin) extrahiert. Die NF-κB Transkriptionsaktivität wurde durch Zugabe von 25 μl von Luciferase-Substrat zu einem Gefäß, enthaltend 2,5 μl Zellextrakt, ermittelt. Das Gefäß wurde unmittelbar in ein Luminometer (Turner Designs) eingeführt und die Lichtemission für 10 Sekunden gemessen. Die Luciferasedaten wurden dann auf Proteinkonzentration normalisiert.
Ergebnisse
Die Daten wurden durch die Interferenz ausgedrückt, die die anti-Mikrotubuli Mittel auf die NF-κB Induktion (fache Induktion) zeigten. Wie in 80A, 80B, 80C und 80D gezeigt, inhibierten Tubercidin und Paclitaxel beide IL-1 und TNF-induzierte-NF-κB-Aktivität. Der inhibitorische Effekt von Tubercidin und Paclitaxel für die 6 Stunden und 24 Stunden Behandlung war jeweils um 10 μM und 2 μM.
BEISPIEL 11
INHIBIERUNG VON TUMORANGIOGENESE DURCH PACLITAXEL
Befruchtete Haushuhn Embryos werden für 4 Tage vor dem Entfernen ihrer Schalen inkubiert. Die Ei-Inhalte werden durch Entfernen der Schale, die um den Zwischenraum lokalisiert ist, Durchschnitte der inneren Schalenmembran, Perforation des gegenüberliegenden Endes der Schale und sanftes Herausgleiten des Ei-Inhalts aus dem stumpfen Ende, ausgeleert. Die Inhalte werden dann in Rundboden sterilisierte Glasschalen, die mit Petrischalendeckeln abgedeckt waren, geleert und bei 90% relativer Luftfeuchtigkeit und 3% Kohlenstoffdioxid inkubiert.
MDAY-D2 Zellen (ein Maus-Lymphoid-Tumor) werden in Mäuse injiziert und zu Tumoren mit einem Gewicht von 0,5–1,0 g heranwachsen gelassen. Die Mäuse werden getötet, die Tumorstellen mit Alkohol gewischt, ausgeschnitten, in sterilen Gewebekulturmedien plaziert und in 1 mm Stücke unter einer Abluft-Haube gewürfelt. Vor dem Plazieren der sezierten Tumore auf den 9 Tage alten Hühnerembryonen wurden die CAM-Oberflächen sanft mit einer 30 Gauge-Nadel angerauht, um die Tumorimplantation sicherzustellen. Die Tumore werden dann auf den CAMs nach 8 Tagen Inkubation (4 Tage nach Entfernen der Schale) plaziert und auf der CAM für 4 Tage wachsen gelassen, um eine vaskuläre Zufuhr zu etablieren. Vier Embryonen wurden unter der Verwendung dieser Methode hergestellt, wobei jeder Embryo drei Tumore erhielt. An Tag 12 erhielt jeder der 3 Tumore auf den Embryonen entweder 20% Paclitaxel-beladene Thermopaste, unbeladene Thermopaste oder keine Behandlung. Die Behandlungen wurden für zwei Tage vor der Aufnahme der Ergebnisse fortgesetzt.
Die explantierten MDAYD2 Tumore sekretierten angiogenetische Faktoren, welche die Einwachsung von Kapillaren (abstammend von der CAM) in die Tumormasse induzieren und diese ihnen erlauben, in der Größe weiter zuzunehmen. Weil alle Blutgefäße des Tumors von der CAM stammen, während die Tumorzellen von dem Explantat stammen, ist es möglich, den Effekt von therapeutischen Interventionen auf diese zwei Prozesse unabhängig voneinander zu ermitteln. Dieser Test wurde verwendet, um die Effektivität von Paclitaxel-beladener Thermopaste auf: (a) Inhibierung der Vaskularisierung des Tumors und (b) Inhibierung des Wachstums der Tumorzellen selber zu bestimmen.
Die direkte in vivo stereomikroskopische Evaluierung und histologische Untersuchung von fixierten Geweben dieser Studie zeigten das folgende. In den mit 20%-Paclitaxel-beladener Thermopaste konnte eine Reduktion in der Zahl von Blutgefäßen, die den Tumor versorgten (14C und 14D), gefunden werden, eine Reduktion in der Zahl der Blutgefäße innerhalb des Tumors und eine Reduktion in der Zahl der Blutgefäße in der Peripherie des Tumors (der Bereich, der typischerweise der am meisten vaskularisierte in einem festen Tumor ist), wenn mit Kontrolltumoren (14A und 14B) verglichen. Die Tumore begannen während der zwei Tage, in denen die Studie durchgeführt wurde Größe und Masse abzunehmen, Zusätzlich konnte gesehen werden, daß zahlreiche Endothelzellen in der Zellteilung arretiert wurden, was anzeigte, daß die Endothelzellteilung beeinträchtigt wurde. Es wurden ebenfalls regelmäßig Tumorzellen gesehen, die in der Methode festgehalten wurden. Alle 4 Embryonen zeigten ein konsistentes Muster mit der 20% Paclitaxel-beladenen Thermopaste, die die Tumor-Vaskularisierung unterdrückte, während die unbeladene Thermopaste keinen Effekt aufwies.
Im Vergleich waren die Tumore in den CAMs, die mit unbeladener Thermopaste behandelt waren, gut vaskularisiert, mit einer Zunahme in der Zahl und Dichte der Gefäße, wenn mit der von normalem umgebenen Gewebe verglichen und mit dramatisch mehr Gefäßen, als in den Tumoren, die mit Paclitaxel-beladener Paste behandelt wurden, beobachtet werden konnte. Die neu gebildeten Gefäße drangen in den Tumor von allen Winkeln ein, was ihnen ein Aussehen von Speichen verlieh, die an der Mitte eines Rades angebracht sind (14A und 14B). Die Kontrolltumore setzten ihre Zunahme an Größe und Masse während des Verlaufs der Studie fort. Histologisch konnten zahlreiche erweiterte dünnwandige Kapillaren in der Peripherie des Tumors gesehen werden und wenige Endothelzellen wurden gesehen, die in der Zellteilung waren. Das Tumorgewebe war gut vaskularisiert und durch und durch lebensfähig.
Als ein Beispiel wurde in zwei ähnlich-großen (anfangs, bei der Zeit der Explantierung) Tumoren, die auf derselben CAM angebracht waren, die folgende Daten erhalten. Für den mit Paclitaxel-beladener Thermopaste behandelten Tumor wurde der Tumor mit 330 mm × 597 mm gemessen, die unmittelbare Umgebung des Tumors weist 15 Blutgefäße auf, während die Tumormasse nur 3–4 kleine Kapillaren aufweist. Für den mit unbeladener Paste behandelten Tumor war die Tumorgröße 623 mm × 678 mm; die unmittelbare Umgebung des Tumors wies 54 Blutgefäße auf, während die Tumormasse 12–14 kleine Blutgefäße aufwies. Zusätzlich enthielt die umgebende CAM selber viele weitere Blutgefäße, wenn mit der Umgebung verglichen, die den Paclitaxel-behandelten Tumor umgibt.
Diese Studie zeigt, daß Thermopaste ausreichende Mengen von Paclitaxel freisetzt, um die pathologische Angiogenese zu inhibieren, die Tumorwachstum und -entwicklung begleitet. Unter diesen Bedingungen wird die Angiogenese maximal durch die Tumorzellen stimuliert, die angiogenetische Faktoren produzieren, die in der Lage sind, das Einwachsen von Kapillaren von dem umgebenden Gewebe in die Tumormasse zu induzieren. Die 20% Paclitaxelbeladene Thermopaste ist in der Lage, diesen Prozeß zu blockieren und die Fähigkeit des Tumorgewebes zu begrenzen, eine ausreichende Blutzufuhr aufrecht zu erhalten. Dies führt zu einer Abnahme in der Tumormasse, sowohl durch einen zytotoxischen Effekt des Wirkstoffs auf die Tumorzellen selber und durch Verarmen des Gewebes an den für Wachstum und Ausdehnung benötigten Nährstoffen.
BEISPIEL 12
INHIBIERUNG VON ANGIOGENESE DURCH PACLITAXEL
A. Hühner-Chorioallanto-Membran ("CAM") Tests
Befruchtete Haushuhnembryonen wurden für 3 Tage vor der schalenlosen Kultivierung inkubiert. Bei diesem Verfahren wurden die Ei-Inhalte durch Entfernen der um den Luftraum befindlichen Schale entleert. Die innere Schalenmembran wurde dann aufgeschnitten und das gegenüberliegende Ende der Schale wurde perforiert, um es dem Inhalt des Eies zu erlauben, sanft aus dem stumpfen Ende herauszugleiten. Die Eiinhalte wurden in Rundboden sterilisierte Glasschalen geleert und mit Petrischalendeckeln abgedeckt. Diese wurden dann in einen Inkubator bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% CO₂ plaziert und für 3 Tage inkubiert.
Paclitaxel (Sigma, St. Louis, MI) wurde bei Konzentrationen von 0,25, 0,5, 1, 5, 10, 30 μg pro 10 μl Aliquot 0,5% wässriger Methylcellulose gemischt. Weil Paclitaxel im Wasser unlöslich ist, wurden Glasperlen verwendet, um feine Partikel zu erzeugen. Zehn Mikroliter-Aliquots dieser Lösung wurden auf Parafilm für eine Stunde getrocknet, wobei Scheiben 2 mm im Durchmesser gebildet wurden. Die getrockneten Scheiben, die Paclitaxel enthielten, wurden dann sorgfältig auf der wachsenden Kante jeder CAM an Tag 6 der Inkubation plaziert. Kontrollen wurden durch Plazierung von Paclitaxel-freien Methylcellulosescheiben auf den CAMs über denselben Zeitverlauf hinweg erhalten. Nach einer 2-tägigen Exponierung (Tag 8 der Inkubation) wurde die Vaskulatur mit Hilfe eines Stereomikroskops untersucht. Liposyn II, eine weiße opaque Lösung, wurde in die CAM injiziert, um die Sichtbarkeit der vaskulären Details zu erhöhen. Die Vaskulatur von ungefärbten, lebenden Embryos wurde unter der Verwendung eines Zeiss Stereomikroskops abgebildet, was mit einer Videokamera verbunden war (Dage-MTI Inc., Michigan City, IN). Diese Videosignale wurden dann bei 160 × Vergrößerung dargestellt und unter der Verwendung eines Bildanalysesystems (Vidas, Kontron; Etching, Deutschland) festgehalten. Bild-Negative wurden dann auf einen Graphikrekorder (Modell 3000; Matrix Instruments, Orangeburg, NY) hergestellt.
Die Membranen des 8 Tage alten Embryos wurden mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer gespült; zusätzlicher Fixierer wurde unter die CAM injiziert. Nach 10 Minuten in situ wurde die CAM entfernt und in frisches Fixiermittel für 2 Stunden bei Raumtemperatur plaziert. Das Gewebe wurde dann über Nacht in Cacodylatpuffer, enthaltend 6% Sucrose, gewaschen. Die Bereiche von Interesse wurden in 1% Osmiumtetroxid für 1,5 Stunden bei 4°C postfixiert. Die Gewebe wurden dann in einer stufenweisen Serie von Ethanol dehydriert, das Lösungsmittel mit Propylenoxid ausgetauscht und in Spurr-Harz eingebettet. Dünnschnitte wurden mit einem Diamantmesser geschnitten, auf Kupfernetze plaziert, gefärbt und in einem Joel 1200EX Elektronenmikroskop untersucht. Ähnlich wurden 0,5 mm Schnitte ausgeschnitten und mit Tolol-Blau für Lichtmikroskopie gefärbt.
Am Tag 11 der Entwicklung wurden die Hühnerembryonen für die Korrosionsgießtechnik verwendet. Mercox-Harz (Ted Pella, Inc., Redding, CA) wurde in die CAM-Vaskulatur unter der Verwendung einer 30-Gauge hypodermischen Nadel injiziert. Das Gußmaterial bestand aus 2,5 Gramm Mercox CL-2B Polymer und 0,05 Gramm Katalysator (55% Benzoylperoxid), der eine 5 Minuten Polymerisationszeit aufwies. Nach Injektion wurde es dem Plastik erlaubt, sich in situ für eine Stunde bei Raumtemperatur zu setzen und dann über Nacht in einem Ofen bei 65°C. Die CAM wurde dann in 50% wässriger Lösung Natriumhydroxid plaziert, um alle organischen Komponenten zu verdauen. Die Plastikgüsse wurden extensiv in destilliertem Wasser gewaschen, luftgetrocknet, mit Gold/Palladium beschichtet und mit dem Philips 501B Scanningelektronenmikroskop betrachtet.
Die Ergebnisse der oben genannten Experimente sind in 15–18 gezeigt. Kurz sind die allgemeinen Merkmale der normalen Hühner schalenlosen Eikultur in 15A gezeigt. An Tag 6 der Inkubation ist der Embryo in der Mitte eines radial sich erstreckenden Netzwerks von Blutgefäßen positioniert; die CAM entwickelt sich angrenzend an den Embryo. Diese wachsenden Gefäße liegen dicht an der Oberfläche und sich leicht sichtbar, was dieses System zu einem idealisierten Modell zur Untersuchung von Angiogenese macht. Lebende, ungefärbte kapillare Netzwerke der CAM können nicht-invasiv mit einem Stereomikroskop abgebildet werden. 15B bildet einen solchen vaskulären Bereich ab, in dem die zellulären Blutelemente innerhalb der Kapillaren unter der Verwendung eines Video/Computer-Interface aufgenommen wurden. Die 3-dimensionale Architektur von solchen CAM kapillaren Netzwerken ist durch die Korrosionsgießmethode gezeigt und im Scanningelektronenmikroskop ( 15C) betrachtet. Diese Güsse ergaben unterliegende Gefäße, die in Richtung der CAM-Oberfläche vorstießen, wo sie eine einzelne Lage von anastomotischen Kapillaren bilden.
Querschnitte durch die CAM zeigen ein äußeres Ectoderm, das aus einer doppelten Zellage, einer breiteren mesodermalen Lage, die Kapillaren enthält die unterhalb des Ectoderms anliegen, adventitialen Zellen und einer inneren, einzelnen endodermalen Zellenlage (15D) bestehen. Auf dem elektronenmikroskopischen Level werden die typischen strukturellen Details der CAM-Kapillaren gezeigt. Typischerweise liegen diese Gefäße in dichter Assoziierung mit der inneren Zellage von Ectoderm ( 15E) vor.
Nach 48 Stunden Exponierung zu Paclitaxel bei Konzentrationen von 0,25, 0,5, 1, 5, 10 oder 30 μg wurde jede CAM unter lebenden Bedingungen mit einem Stereomikroskop, das mit einer Video/Computerschnittstelle ausgerüstet war untersucht, um die Effekte auf die Angiogenese zu evaluieren. Dieser Bildaufzeichnungsauf6au wurde bei einer Vergrößerung von 160 × verwendet, was die direkte Visualisierung von Blutzellen innerhalb der Kapillaren erlaubte; wodurch der Blutfluß in Bereichen von Interesse leicht erfaßt und aufgezeichnet werden konnte. Für diese Untersuchung wurde die Inhibierung der Angiogenese als ein Bereich der CAM (die 2–6 mm im Durchmesser maß) definiert, der ein kapillares Netzwerk und ein vaskulärer Blutfluß fehlte. Während der Experimente wurden die avaskulären Zonen auf einem 4 Punkte avaskulären Gradienten (Tabelle 1) erfaßt. Diese Skala stellte den Grad der gesamten Inhibierung dar, wobei maximale Inhibierung als eine 3 auf der avaskulären Gradienten-Skala war. Paclitaxel war sehr konsistent und induzierte eine maximale avaskuläre Zone (6 mm im Durchmesser oder eine 3 auf der avaskulären Gradientenskala) innerhalb von 48 Stunden, in Abhängigkeit von seiner Konzentration.
TABELLE 1 AVASKULÄRER GRADIENT
Die Dosis-abhängigen, experimentellen Daten der Effekte von einer Vielzahl therapeutischer Mittel bei verschiedenen Konzentrationen sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
Typische Paclitaxel-behandelte CAMs sind ebenfalls gezeigt, wobei die transparente Methylcellulose Scheibe in der Mitte über der avaskulären Zone, die 6 mm im Durchmesser mißt, positioniert ist. Bei einer leicht höheren Vergrößerung ist die Umgebung von solch avaskulären Zonen klar ersichtlich (16C); die umgebenden funktionalen Gefäße waren oftmals in Richtung weg von der Quelle von Paclitaxel gerichtet (16C und 16D). Solche abgewinkelte Umleitung von Blutfluß wurde niemals unter normalen Bedingungen beobachtet. Ein anderes Merkmal der Effekte von Paclitaxel war die Bildung von Blutinseln innerhalb der avaskulären Zone, was die Aggregation von Blutzellen darstellte.
Die assoziierten morphologischen Veränderungen der Paclitaxel-behandelten CAM sind leicht sowohl bei Licht- als auch Eelektronenmikroskopischen Leveln ersichtlich. Für die Bequemlichkeit der Darstellung sind drei verschiedene Phasen des allgemeinen Übergangs von dem normalen zum avaskulären Zustand gezeigt. Nahe der Periphärie der avaskulären Zone ist die CAM durch ein Fehlen von mitotischen Zellen innerhalb aller drei Keimlagen ( 17A und 18A) gekennzeichnet. Diese verstärkte mitotische Teilung war ebenfalls eine übereinstimmende Beobachtung für kapillare Endothelzellen. Jedoch blieben die Endothelzellen verbundenerweise mit keinerlei Extravasation von Blutzellen intakt. Bei weiterem Abbau ist die CAM durch den Zusammenbruch und die Auflösung von Kapillaren (17B und 18B) gekennzeichnet. Die vermutlicherweise Endothelzellen, typischerweise in der Mitose festgehalten, halten weiter eine dichte spatiale Beziehung mit Blutzellen aufrecht und liegen unterhalb angrenzend an das Ektoderm; jedoch sind diese Zellen nicht durch Verbindungen verknüpft. Der am meisten zentrale Teil der avaskulären Zone war durch eine verdickte ektodermale und endodermale Lage (17C und 18C) gekennzeichnet. Obwohl diese Lagen verdickt waren, blieben die zellulären Verbindungen intakt, und die Lagen behielten ihre strukturellen Charakteristika bei. Innerhalb des Mesoderms waren verstreute mitotisch arretierte Zelle abundant; diese Zellen zeigten keine Endothelzellen-Polarisierung, die in der früheren Phase beobachtet wurde. Ebenfalls, innerhalb dieser avaskulären Region, waren degenerierende Zellen verbreitet, wie durch Elektronen-dichten Vakuolen und zellulären Debris (18C) festgestellt wurde.
Zusammengefaßt zeigte diese Untersuchung, daß 48 Stunden nach Paclitaxel-Applikation zu der CAM die Angiogenese inhibiert war. Die Blutgefäß-Inhibierung bildete eine avaskuläre Zone, die durch drei Transitions-Phasen des Effekts von Paclitaxel repräsentiert war. Der mittlere, am meisten betroffene Bereich der avaskulären Zone enthielt unterbrochene Kapillaren mit extravasierten roten Blutzellen; dies zeigte an, daß interzelluläre Verbindungen zwischen Endothelzellen fehlten. Die Zellen des Endoderm und Ektoderm behielten ihre interzellulären Verbindungen bei und daher verblieben diese Keimlagen intakt; jedoch waren diese leicht verdickt. Während sich dem normal vaskulären Bereich genähert wurde, erhielten die Blutgefäße ihre Verbindungs-Komplexe zurück und verblieben daher ebenfalls intakt. An der Peripherie der Paclitaxel-behandelten Zone, war weiteres Blutgefäßwachstum inhibiert, was durch den typischen Umlenkungs- oder „Ellenbogen"-Effekt der Blutgefäße ersichtlich war (16D).
Paclitaxel-behandelte avaskuläre Zonen zeigten ebenfalls ein Fehlen von in der Mitose arretierten Zellen in allen drei Keimlagen der CAM; dies war bei Paclitaxel einmalig, weil keine vorhergegangene Untersuchung solch ein Ereignis gezeigt hat. Durch die Arretierung in der Mitose, konnten Endothelzellen nicht ihre normalen methabolischen Funktionen durchlaufen, die an der Angiogenese beteiligt sind. Im Vergleich produzierte die avaskuläre Zone, die durch Suramin und Cortisonacetat gebildet wurde, keine mitotisch arretierten Zellen in der CAM; sie verhinderten nur weiteres Blutgefäßwachstum in den behandelten Bereich hinein. Daher, obwohl diese Mittel anti-angiogene sind, gibt es viele Punkte, in denen der angiogenetische Prozeß angegriffen werden kann.
Die Effekte von Paclitaxel über die 48 Stunden Dauer hinweg wurden ebenfalls beobachtet. Während dieser Periode der Beobachtung wurde bemerkt, daß die Inhibierung der Angiogenese so früh wie 9 Stunden nach Applikation auftritt. Histologische Schnitte ergaben eine ähnliche Morphologie, wie in der ersten Transitionsphase der avaskulären Zone bei 48 Stunden gesehen wird, dargestellt in 17A und 18A. Ebenfalls beobachteten wir einen Revaskularisierungsprozeß in die vorher beobachtete avaskuläre Zone hinein. Es konnte gefunden werden, daß die durch Heparin und angiostatische Steroide gebildete avaskuläre Zone 60 Stunden nach Applikation revaskularisiert wurde. Bei einer Untersuchung wurden die Paclitaxel-behandelten avaskulären Zonen für mindestens 7 Tage nach Anwendung nicht revaskularisierten, was einen potenteren Langzeiteffekt impliziert.
BEISPIEL 13
EFFEKT VON PACLITAXEL UND CAMPTOTHECIN AUF LNCAP ZELLTEILUNG
Materialen und Methoden
LNCaP Zellen wurden bei Konzentrationen von jeweils 2 × 10³ und 1 × 10³ Zellen/Napf in 96 Napfplatten ausgesät. Nach 48 Stunden wurden verschiedene Konzentrationen von Paclitaxel oder Camptothecin (25 μl) in jeden Kulturnapf hinzugefügt und die Platten wurden bei 37°C für 5 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 1% Glutaraldehydlösung fixiert und für 5 Minuten mit 0,5% Kristallviolett gefärbt. Die Farbe wurde sukzessiv mit 100 μl von Pufferlösung eluiert und die Absorption wurde auf einem Titertek Multiskan-Mikroplatten-Lesegerät unter der Verwendung einer Absorptions-Wellenlänge von 492 nm gelesen. Zellwachstum wurde als ein Prozentwert relativ zu Kontrollnäpfen mit Abwesenheit der Verbindung ausgedrückt (auf 100% gesetzt).
Ergebnisse
Paclitaxel inhibierte das LNCaP Zellwachstum mit einer EC₅₀ von ungefähr 0,09 nM. Apoptose-Experimente wurden an den Zellen in den Näpfen nach der Paclitaxelbehandlung unter der Anwendung von DNA Fragmentierungstests durchgeführt. Eine extensive Apoptose von Zellen wurde beobachtet, was anzeigte, daß Paclitaxel durch einen apoptotischen Mechanismus zytotoxisch war.
Camptothecin war in seiner zytoxischen Wirkung gegen LNCaP Zellen extrem wirksam. Konzentrationen so niedrig wie 0,001 nM waren für über 60% der Zellen toxisch. Daher muß die EC₅₀ für diesen Wirkstoff gegen LNCaP Zellen im femtomolaren Konzentrationsbereich liegen.
Tabelle 1
Tabelle 2
BEISPIEL 14
ANTI-ANGIOGENE AKTIVITÄT VON WEITEREN ANTI-MIKROTUBULI MITTELN
Zusätzlich zu Paclitaxel können andere Anti-Mikrotubuli-Mittel ähnlich in polymere Träger inkorporiert werden. Repräsentative Beispiele, die im folgenden zur Verfügung gestellt werden, schließen Campothecin und Vinca-Alkaloide, so wie Vinblastin und Vincristin und Mikrotubuli-stabilisierende Mittel, so wie Tubercidin, Aluminiumfluorid und LY290181 ein.
A. Inkorporation von Mitteln in PCL
Die Mittel wurden mit einem Mörser und Stößel gemahlen, um die Partikelgröße auf unter 5 Mikron zu verringern. Dies wurde dann als ein trockenes Pulver mit Polycaprolacton (Molekulargewicht, 18.000 Birmingham Polymers, AL, USA) gemischt. Das Gemisch wurde auf 65°C für 5 Minuten erhitzt und das geschmolzene Polymer/Mittel Gemisch wurde für 5 Minuten zu einer glatten Paste verrührt. Die geschmolzene Paste wurde dann in einer 1 ml Spritze aufgenommen und extrudiert, um 3 mg Pellets zu bilden. Diese Pellets wurden dann am Tag 6 der Gestation auf die CAM plaziert, um ihre anti-angiogenetischen Eigenschaften zu erfassen.
B. Effekte von Camptothecin-beladener PCL Paste auf die CAM
Camptothecin-beladene Thermopaste war bei der Inhibierung der Angiogenese effektiv, wenn mit Kontroll-PCL Pellets verglichen. Bei 5% Wirkstoffbeladung zeigten 4/5 der getesteten CAMen eine wirksame Angiogenese-Inhibierung. Zusätzlich zeigten bei 1% 0,25% Beladung jeweils 2/3 und ¾ der CAMen angiogenetische Inhibierung. Da her wird aus diesen Ergebnissen ersichtlich, daß Camptothecin von der PCL Thermopaste ausreichend freigesetzt wurde und es eine therapeutische anti-angiogenetische Effizienz besitzt.
C. Effekte von Vinblastin- und Vincristin- beladener PCL Paste auf die CAM
Wenn die Formulierungen auf der CAM getestet wurden, war es offensichtlich, daß die aus Mittel von dem PCL Pellet in ausreichenden Mengen freigesetzt wurden, um einen biologischen Effekt zu induzieren. Sowohl Vinblastin als auch Vincristin induzierten anti-angiogenetische Effekte in dem CAM Assay, wenn mit Kontroll PCL Thermopasten Pellets verglichen.
Bei Konzentrationen von 0,5% und 0,1% Wirkstoffbeladung induzierte Vincristin eine angiogenetische Inhibierung in allen der getesteten CAMen. Wenn Konzentrationen getestet wurden die 2% überschritten, wurden toxische Wirkstofflevel erreicht und ein unerwarteter embryonischer Tod trat auf.
Vinblastin war ebenfalls bei Inhibierung der Angiogenese auf der CAM bei Konzentrationen von 0,25%, 0,5% und 1% effektiv. Jedoch war Vinblastin bei Konzentrationen, die 2% überschritten, für den Embryo toxisch.
D. Effekte von Tubercidin- beladener PCL Paste auf die CAM
Tubercidin-beladene Paste war im Vergleich zu Kontrollpellets bei der Inhibierung der Angiogenese effektiv. Bei 1% Wirkstoffbeladung; induzierte Tubercidin eine Angiogenese-Inhibierung bei 1/3 der CAMen, die getestet wurden. Jedoch inhibierte Tubercidin bei größeren Wirkstoffkonzentrationen von 5% Wirkstoffbeladung wirksam die Angiogenese in 2/3 CAMen. Daher war es von diesen Ergebnissen ersichtlich, daß Tubercidin ausreichend von der PCL-Paste freigesetzt wurde und es eine wirksame angio-angiogenetische Aktivität aufweist.
E. Effekte von Aluminiumfluorid-beladener PCT Paste auf die CAM
Mit Aluminiumfluorid (ALF₃) beladene PCL Pasten waren bei der Inhibierung der Angiogenese bei einer 20% Wirkstoffbeladung im Vergleich zu Kontrollpellets effektiv. Bei 20% Wirkstoffbeladung zeigten 2/4 der CAMen eine Angiogenese-Inhibierung, wie durch eine avaskuläre Zone, die zwischen 2 bis 6 mm in Durchmes ser maß, ersichtlich war. Jedoch war bei niedrigerer Wirkstoffbeladung, 1% und 5%, die Angiogenese-Inhibierung nicht ersichtlich (jeweils 0/6 und 0/5 der CAMen). Daher war Aluminiumfluorid bei der Induktion der Angiogenese-Inhibierung nur bei höheren Wirkstoffkonzentrationen effektiv.
F. Effekte von LY290181-beladener PCL Paste auf die CAM
Die Untersuchung von PCL-Paste, die mit 5% LY290181 beladen war auf die CAM ergab, daß LY290181 die Angiogenese-Inhibierung in 1/3 der getesteten CAMen induzierte. Bei einer 1% Wirkstoffbeladung induzierte LY290181 jedoch keine antiangiogenetische Antwort (n = 2).
BEISPIEL 15
EFFEKT VON PACLITAXEL AUF DIE LEBENSFÄHIGKEIT VON NICHT-PROLIFERIERENDEN ZELLEN
Während es wichtig ist, daß ein Krankheits-veränderndes Mittel in der Lage ist, eine Vielzahl von ungeeigneten zellulären Aktivitäten (Teilung, Entzündung, proteolytische Enzymproduktion) stark zu inhibieren, die während der Entwicklung von chronischer Entzündung im Übermaß auftreten, darf es für die normalen Gewebe nicht toxisch sein. Es ist insbesondere wichtig, daß normale Zellen nicht beschädigt werden, weil dies zu einem Fortschreiten der Krankheit führen würde. In diesem Beispiel wurde der Effekt von Paclitaxel auf die Lebensfähigkeit von normalen nicht-teilenden Zellen in vitro untersucht, wobei bis zur Konfluenz angezogene kultivierte Chondrozyten verwendet wurden.
Kurz gesagt, wurden die Chondrozyten in Anwesenheit (10^–5 M, 10^–7 M und 10^–9 M) oder Abwesenheit (Kontrolle) von Paclitaxel für 72 Stunden inkubiert. Am Ende dieser Zeitperiode wurde die Gesamtzahl von lebensfähigen Zellen visuell durch Trypanblau-Farbstoffexklusion bestimmt. Dieses Experiment wurde 4 mal durchgeführt und die Daten ausgewertet.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 21 gezeigt. Kurz gesagt, wie ersichtlich von 21, beeinträchtigt Paclitaxel die Lebensfähigkeit von normalen nicht-teilenden Zellen in vitro sogar bei hohen Konzentrationen (10^–5 M) von Paclitaxel nicht. Genauer gibt es sogar bei Wirkstoffkonzentrationen, die ausreichend sind, um die in den voranstehenden Beispielen beschriebenen pathologischen Prozesse zu blockieren, keine Zytotoxizität auf normale Chondrozyten.
BEISPIEL 16
AUSWAHL VON PERMEATIONSVERSTÄRKER FÜR TOPISCHE PACLITAXELFORMULIERUNG
A. Löslichkeit von Paclitaxel in verschiedenen Verstärkern
Die folgenden Permeationsverstärker wurden untersucht: Transcutol^®, Ethanol, Propylenglykol, Isopropylmyristat, Ölsäure und Transcutol : Isopropylmyristat (9 : 1 v : v). Ein Mililiter von jedem Verstärker wurde in Glasgefäßen auf 37°C vorgeheizt und Überschuß an Paclitaxel wurde hinzugefügt. Eine Probe von 0,5 ml der Flüssigkeit von jedem Gefäß wurde bei 37°C und 13000 U/min für 2 min. zentrifugiert. Aliquots (0,1 ml) Überstand von den Zentrifugenröhrchen wurde in volumenmetrische Flaschen transferiert und mit Methanol verdünnt. Der Paclitaxelgehalt wurde durch High Pressure Liquid Chromatographie (HPLC) bestimmt.
B. Trennungs-Koeffizient
Eine spezifische Menge von Paclitaxel wurde in einem Volumen von Verstärker, der auf 37°C erwärmt war, gelöst. Aliquots (1 ml) dieser Lösung wurde zu 1 ml Oktanol in einem 4 ml Glasgefäß hinzugefügt. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1 ml) (pH 7,4) wurden dann zugefügt und die Gefäße gevortext, um eine Emulsion herzustellen. Die Gefäße wurden in einem 37°C-Ofen für 16 Stunden plaziert, wonach 0,1 ml Oktanolphase von jedem Gefäß entfernt wurde und mit 9,9 ml Methanol verdünnt wurde. Für die Wasserphasen wurden 0,5 ml von der Ölsäure und dem Isopropylmyristatgefäßen gesammelt und 0,5 ml wurden von den Propylenglykolgefäßen gesammelt und mit 0,5 ml Methanol verdünnt. Von den Transcutolgefäßen wurde 0,1 ml gesammelt und mit 9,9 ml 50 : 50 Transkutol : PBS verdünnt und 0,1 ml von den Ethanolgefäßen wurde gesammelt und mit 50 : 50 Ethanol : PBS verdünnt. Der Paclitaxelgehalt wurde durch HPLC bestimmt. Jede Bestimmung wurde in drei Ansätzen durchgeführt.
C. Ergebgnisse
Die Löslichkeit von Paclitaxel in jedem Verstärker bei 37°C ist in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1: Konzentration von Paclitaxel bei Sättigung in verschiedenen Permea tionsverstärkern.
Die Octanol/Wasser Trennungs-Koeffizienten, K_o/w, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Octanol/Wasser Trennungs-Koeffizienten von Paclitaxel in verschiedenen Verstärkerlösungen
Um effektiv zu wirken, muß Paclitaxel die Haut bis zu den niedrigeren Strata der lebendigen Epidermis durchdringen. Es war bekannt, daß Wirkstoffe, um die lebendige Epidermis zu durchdringen, einen Octanol/Wasser Trennungs-Koeffizienten von nahezu 100 besitzen müssen (Hadgraft J. H. und Walters K., Drug absoption enhancements, A. G. de Boers Ed., Harwood Publishers, 1994). Basierend auf den Ergebnissen in Tabellen 1 und 2 zeigen Propylenglykol und Transcutol die beste Kombination von Lösung von Paclitaxel und Verstärkung seiner Trennung von einer Ölphase zu einer wässrigen Phase.
Jedoch können die von sowohl Transcutol als auch Propylenglykol produzierten K_o/w ein wenig niedrig sein, daher wurden sie in einem Versuch, die Löslichkeit von Paclitaxel in der Octanolphase zu erhöhen, mit Isopropylmyristat kombiniert, das einen unbegrenzten K_o/w aufweist. Isopropylmyristat und Transcutol wurden in einem 1 : 9 Volumenverhältnis gemischt. Das Isopropylmyristat löste sich leicht bei Raumtemperatur im Transcutol. Um eine homogene Phase zu bilden, wurden das Propylenglykol und das Isopropylmyristat ebenfalls mit Ethanol in einem Verhältnis von 4 : 3,5 : 0,5 Propylenglykol : Ethanol : Isopropylmyristat gemischt. Die K_o/w Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3: Octanol/Wasser Trennungs-Koeffizienten von Paclitaxel in Verstärkerkombination
Die Zugabe von Isopropylmyristat zum Transcutol führte zu einem signifikanten Anstieg des Trennungs-Koeffizienten. Jedoch führte die Propylenglykol : Ethanol : Isopropylmyristatlösung nicht zu einer signifikanten Verbesserung des Trennungs-Koeffizienten über den von Propylenglykol allein. Dieses letzte Ergebnis und die Tatsache, daß für Ethanol gefunden wurde, daß es die psoriatische Bedingung verschlechterte, schloß diese Verstärkerkombination effektiv von weiterer Betrachtung aus. Weiterhin erhöhte die Zugabe von Isopropylmyristat aktuell die Löslichkeit von Paclitaxel über seine Löslichkeit in Trancutol allein. Die Löslichkeit von Paclitaxel in Transcutol war 346,9 mg/ml, wohingegen die Löslichkeit in der Transcutol : Isopropylmyristat Kombination auf 353,9 mg/ml anstieg. Daher wurde diese Verstärkerkombination in den Hautstudien gewählt.
BEISPIEL 17
HERSTELLUNG UND ANALYSE VON TOPISCHEN PACLITAXELFORMULIERUNGEN
A. Herstellung von Paclitaxel-Salbe A
Transcutol (3,2 g), Isopropylmyristat (0,3 g), Labrasol (2,5 g), Paclitaxel (0,01 g) und 0,5 mCi/ml ³H-Paclitaxel (0,3 ml) wurden in einem 20 ml Scintillationsgefäß kombiniert. In einem getrennten Scintillationsgefäß wurden Labrafil (2,5 g), Arlacel 165 (1,2 g) und Compritol (0,3 g) kombiniert und auf 70°C bis zum vollständigen Schmelzen erwärmt. Die Inhalte des ersten Scintillationsgefäßes wurden zur Schmelze hinzugegeben, bis zur Homogenität gevortext und abkühlen gelassen.
B. Herstellung von Paclitaxel-Salbe B
Transcutol (2,5 g), Isopropylmyristat (1,0 g), Labrasol (2,5 g), Paclitaxel (0,01 g) und 0,5 mCi/ml ³H-Paclitaxel (0,3 ml) wurden in einem 20 ml Scintillationsgefäß kombiniert. In einem getrennten Scintillationsgefäß wurden Labrafil (2,5 g), Arlacel 165 (1,2 g) und Compritol (0,3 g) kombiniert und auf 70°C bis zum vollständigen Schmelzen erhitzt. Die Inhalte des ersten Scintillationsgefäßes werden zur Schmelze hinzugegeben, bis zur Homogenität gevortext und abkühlen gelassen.
C. Hautpräparation und Penetrationsuntersuchung
Gefrorene, ausgeschnittene Yucatan Zwerg-Schweinehaut wurde bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Hautproben wurden unter der Verwendung eines Nr. 10 Korkbohrers hergestellt, um Scheiben aus der gefrorenen Haut herauszustechen. Die Proben wurden mit einer Streptomycin-Penicillinlösung gewaschen und in Gefrierbeuteln plaziert und bei –70°C gelagert.
Hautschnitte wurden auf Franz Diffusionszellen montiert, wobei die Stratum Corneum nach oben lag. Die untere Rezeptorlösung war eine 0,05 Amoxicillinlösung in R. O. Wasser. Eine Donorzelle wurde auf jede Hautoberfläche geklammert. Die Paclitaxeleinreibung wurde bis zum Schmelzen erwärmt (40 bis 50°C) und in eine Spritze aufgezogen. Während immer noch geschmolzen, wurden 0,1 ml auf jede Hautoberfläche extrudiert. Die Donorzellen wurden mit einer Glasscheibe abgedeckt und der Versuchsaufbau für 24 Stunden stehen gelassen.
Nach 24 Stunden wurden die Zellen auseinandergebaut, überschüssige Einreibung entfernt und in einem Scintillationsgefäß gelagert. Die Hautoberfläche wurde schnell mit 3 ml Dichlormethan (DCM) gewaschen und getrocknet. Das Wasch-DCM wurde in demselben Gefäß gelagert, wie der Überschuß an Einreibung. Die Hautschnitte und die Rezeptorlösung wurden in getrennte Scintillationsgefäße plaziert. Die Haut wurde bei –30°C in 30 μm-Schnitte cryotomiert und in verschiedenen Gefäßen gesammelt. Die anfänglichen Rasuren und die verbliebene Haut wurden ebenfalls in verschiedenen Glasgefäßen gesammelt. Die geschnittenen Hautproben wurden durch Zugabe von 0,5 ml von Gewebelösungsmittel zu jedem Gefäß gelöst. Die Proben wurden über Nacht stehen gelassen, um sich bei Raumtemperatur zu lösen. Am folgenden Tag wurde 3 ml des Scintillationscocktails zu den Gefäßen hinzugefügt. Für die DCM Waschlösungen wurden 100 μl zu 1 ml Acetonitril transferiert und dann wurden 3 ml Scintillationscocktail hinzugefügt. Die Radioaktivität aller dieser Lösungen wurden unter der Verwendung eines Beta Counters gemessen.
Hautproben wurden auf den Franz Diffusionszellen montiert und in drei Gruppen eingeteilt. Jede Probe wurde entsprechend behandelt (keine Behandlung oder Einreibung B mit oder ohne Paclitaxel). Nach 24 Stunden wurden die Proben entfernt und unter der Verwendung von Standardtechniken histologisch verarbeitet.
D. Ergebgnisse
Von den histologischen Schnitten konnte der Stratum Corneum Teil der unbehandelten Haut als zwischen 50 bis 120 um dick bestimmt werden, während die lebensfähige Epidermis zwischen 400 bis 700 um dick war. Für die Einreibung, die 3% w/w Isopropylmyristat (Einreibung A) enthielt, war die Konzentration von Paclitaxel in der Haut im wesentlichen konstant bei 1 μg/ml (1,2 × 10^–6 M) in der Stratum Corneum und innerhalb der lebenden Epidermis. Für die Einreibung, die 10% w/w Isopropylmyristat (Einreibung B) enthielt, war die Paclitaxelkonzentration in der Stratum Corneum und der lebendigen Epidermis konstant, jedoch höher in dem Stratum Corneum (6 μg/ml gegenüber 2 μg/ml). Es konnte keine Radioaktivität in der Rezeptorlösung für jede der Einreibungsuntersuchung gefunden werden, war darauf hindeutete, daß Paclitaxel nicht vollständig durch die Hautschnitte hindurchdrang. Keine wesentlichen Unterschiede wurden beobachtet, wenn die Paclitaxel enthaltende Einreibung aufgebracht wurde.
BEISPIEL 18 (Vergleichsbeispiel)
ENTWICKLUNG VON SYSTEMISCHEN FORMULIERUNGEN VON PACLITAXEL FÜR DIE BEHANDLUNG VON PSORIASIS
Bei schweren Fällen von Psoriasis werden aggressivere Behandlungen als akzeptabel angesehen und daher können die mit der systemischen Behandlung mit Paclitaxel assoziierten Toxizitäten akzeptierbar sein.
Die systemische Formulierung von Paclitaxel umfaßt amphiphile Diblock-Copolymere, die in wässrigen Lösungen Mizellen bilden, die aus einem hydrophoben Kern und einer hydrophilen Schale in Wasser bestehen. Diblock-Copolymere von Poly(DL-Lactid)-Block-Methoxypolyethylenglykol (PDLLA-McPEG), Polycaprolacton-Block-Methoxypolyethylenglykol (PCL-McPEG) und Poly(DL-Lactid-co-caprolacton)-Block-Methoxypolyethylenglykol (PDLLACL-McPEG) können unter der Verwendung eines Bulgschmelz-Polymerisationsverfahren oder ähnlicher Verfahren synthetisiert werden. Kurz gesagt wurden vorgegebene Mengen von Monomeren von DL-Lactid, Caprolacton und Methoxypolyethylenglykolen mit verschiedenen Molekulargewichten bis zum Schmelzen unter der Begasung mit Stickstoff erhitzt (130°C) und gerührt. Der Katalysator Stannooctoat (0,2% w/w) wurde zu den geschmolzenen Monomeren hinzugefügt. Die Polymerisation wurde für 4 Stunden durchgeführt. Die Molekulargewichte, kritische Mizellenkonzentrationen und die maximalen Paclitaxel-Beladungen wurden jeweils mit GPC, Fluoreszenz und Löslichkeitsuntersuchungen gemessen (22). Hohe Paclitaxel-Trägerkapazitäten wurden erhalten. Die Fähigkeit zur Lösung von Paclitaxel hängt von den Zusammensetzungen und Konzentrationen der Copolymere ab (22 und 23). PDLLA-MePEG ergab das meiste stabil gelöste Paclitaxel (23 und 24).
Die starke Assoziierung innerhalb des inneren Kerns der polymeren Mizellen stellt eine Umgebung hoher Kapazität als Träger für hydrophobe Wirkstoffe, so wie Paclitaxel, dar. Die Wirkstoffe können kovalent an Block Copolymere gebunden werden, um eine Mizellenstruktur zu bilden oder können innerhalb der hydrophoben Kerne der Mizellen physikalisch inkorporiert werden. Die Mechanismen der Wirkstoff-Freisetzung von den Mizellen schließen Diffusion aus dem Kern und den Austausch zwischen den einzelnen Polymerketten und den Mizellen ein. Die kleine Größe der Mizellen (gewöhnlicherweise weniger als 100 nm) wird die mit der Injektion von größeren Partikeln verbundenen Schwierigkeiten eliminieren.
BEISPIEL 19
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON THERMOPASTE
Fünf Gramm Polycaprolacton Mol. Gew. 10.000 bis 20.000 (Polysciences, Warrington Penn. USA) wurden in ein 20 ml Glas Scintillationsgefäß eingewogen, das in ein 600 ml Becherglas, das 50 ml Wasser enthielt, plaziert wurde. Das Becherglas wurde sanft auf 65°C erhitzt und bei dieser Temperatur für 20 Minuten gehalten, bis das Polymer geschmolzen war. Ein bekanntes Gewicht von Paclitaxel oder anderem Angiogenese-Inhibitor wurde bei 75°C in das geschmolzene Polymer gleichmäßig hineingemischt. Das geschmolzene Polymer wurde in eine vorgewärmte (60°C Ofen) Form gegossen und abkühlen gelassen, bis das Polymer sich verfestigte. Das Polymer wurde in kleine Stücke (ungefähr 2 mm mal 2 mm Größe) geschnitten und wurde in eine 1 ml Glasspritze plaziert.
Die Glasspritze wurde dann aufrecht (die zugedeckelte Spitze nach unten) in ein 500 ml Becherglas, das destilliertes Wasser bei 65°C enthielt (Corning heiße Platte) plaziert, bis das Polymer vollständig geschmolzen war. Der Kolben wurde dann in die Spritze eingeführt, um das geschmolzene Polymer zu einer klebrigen Masse am spitzen Ende der Trommel zusammenzudrücken. Die Spritze wurde dann zugedeckelt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Zur Applikation wurde die Spritze auf 60°C aufgewärmt und als eine Flüssigkeit verabreicht, die sich verfestigte, wenn sie auf Körpertemperatur abgekühlt wurde.
BEISPIEL 20
MODIFIKATION VON PACLITAXEL-FREISETZUNG VON THERMOPASTE UNTER DER VERWENDUNG VON PDLLA-PEG-PDLLA UND POLY (D,L, MILCHSÄURE) NIEDEREN MOLEKULARGEWICHTS
A. Herstellung von PDLLA-PEG-PDLLA und PDLLA niederen Molekulargewichts
DL-Lactid wurde von Aldrich erworben. Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 8.000, Stannooctoat und DL-Milchsäure wurden von Sigma erhalten. Poly-ε-caprolacton (PCL) mit einem Molekulargewicht von 20.000 wurde von Birmingham Polymers (Birmingham, AL) erhalten. Paclitaxel wurde von Hauser Chemicals (Boulder, CO) erworben. Polystyrolstandards mit engen Molekulargewichtsverteilungen wurden von Polysciences (Warrington, PA) erworben. Acetonitril und Methylenchlorid hatten HPLC Grad (Fisher Scientific).
Das Triblock Copolymer von PDLLA-PEG-PDLLA wurde durch eine Ringöffnungspolymerisierung synthetisiert. Monomere von DL-Lactid und PEG in verschiedenen Verhältnissen wurden gemischt und 0,5 Gew.-% Stannooctoat wurde hinzugegeben. Die Polymerisation wurde bei 150°C für 3,5 Stunden ausgeführt. PDLLA niederen Molekulargewichts wurde durch Polykondensation von DL-Milchsäure synthetisiert. Die Reaktion wurde in einer Glasflasche unter den Bedingungen von sanfter Stickstoffbegasung, mechanischem Rühren und Erhitzen auf 180°C für 1,5 Stunden durchgeführt. Das PDLLA-Molekulargewicht war ungefähr 800, wie durch Titration der Carboxylsäure-Endgruppen gemessen wurde.
B. Herstellung von Pastenformulierungen
Paclitaxel bei Beladungen von 20% oder 30% wurde in entweder die PDLLA-PEG-PDLLA Copolymere oder Gemische von PDLLA : PCL 90 : 10, 80 : 20 und 70 : 30, die bei ungefähr 60°C geschmolzen wurden, kräftig eingemischt. Die Paclitaxel-beladenen Pasten wurden in 1 ml Spritzen eingewogen und bei 4°C gelagert.
C. Charakterisierung von PDLLA-PEG-PDLLA und den Pastengemischen
Die Molekulargewichte und Verteilungen von den PDLLA-PEG-PDLLA Copolymeren wurden bei Raumtemperatur durch GPC unter der Verwendung einer Shimadzu LC-10AD HPLC Pumpe und einem Shimadzu RID-6A refraktiven Index-Detektor (Kyoto, Japan), der an eine 10⁴ Å Hewlett Packard P1 Gelsäule gekoppelt war, bestimmt. Die mobile Phase war Chloroform mit einer Flußrate von 1 ml/Minute. Das Injektionsvolumen der Probe war 20 μl bei einer Polymerkonzentration von 0,2% (w/v). Die Molekulargewichte der Polymere wurden relativ zu Polystyrolstandards bestimmt. Die intrinsische Viskosität von PDLLA-PEG-PDLLA in CHCl₃ bei 25°C wurde mit einem Cannon-Fenske Viskosimeter gemessen.
Die thermische Analyse der Copolymere wurde durch differentielle Scanning Kalorimetrie (DSC) unter der Verwendung eines TA Instruments 2000 Controllers und Du-Pont 910S DSC (Newcastle, Delaware) durchgeführt. Die Erhitzungsrate war 10°C/Minute und die Copolymer- und Paclitaxel/Copolymer-Matrixproben wurden in gebogene offene Aluminiumprobenpfannen eingewogen (3–5 mg).
¹H Kernspin-Resonanz (NMR) wurde verwendet, um die chemische Zusammensetzung des Polymers zu bestimmen. ¹H NMR Spektra von Paclitaxel-beladener PDLLA-PEG-PDLLA wurden in CDCl₃ unter der Verwendung eines NMR Instruments (Bruker, AC-200E) bei 200 MHz erhalten. Die Konzentration des Polymers war 1–2%.
Die Morphologie der Paclitaxel/PDLLA-PEG-PDLLA Paste wurde unter der Verwendung eines Scanning Elektronenmikroskops (SEM) (Hitachi F-2300) untersucht. Die Probe wurde mit 60% Au und 40% Pd (Dicke 10–15 nm) unter der Verwendung eines Hummer-Instruments (Technics, USA) beschichtet.
D. In vitro Freisetzung von Paclitaxel
Ein kleines Pellet von 20% Paclitaxel-beladener PDLLA : PCL Paste (ungefähr 2 mg) oder ein Zylinder (hergestellt durch Extrudieren von geschmolzener Paste durch eine Spritze) von 20% Paclitaxel-beladener PDLLA-PEG-PDLLA Paste wurden in bedekkelte 14 ml Glasgefäße plaziert, die 10 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 0,4 g/L Albumin enthielten. Das Röhrchen wurde bei 37°C unter sanftem Rotationsmixen inkubiert. Der Überstand wurde periodisch zur Paclitaxel-Analyse entnommen und durch frischen PBS/Albuminpuffer ersetzt. Der Überstand (10 ml) wurde mit 1 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Wasserphase wurde abgegossen und die Methylenchloridphase wurde unter einem Strom von Stickstoff bei 60°C getrocknet. Der getrocknete Rest wurde in einem 40 : 60 Wasser : Acetonitrilgemisch rekonstituiert und bei 10.000 g für ungefähr 1 Min. zentrifugiert. Die Menge von Paclitaxel im dem Überstand wurde dann durch HPLC analysiert. Die HPLC-Analyse wurde unter der Verwendung einer 110A Pumpe und C-8 Ultrasphärensäule (Beckman) und einem auf 232 nm eingestellten SPD-6A UV Detektor, einem SIL-9A Autoinjektor und einem C-R3A Integrator (Shimadzu) durchgeführt. Das Injektionsvolumen war 20 μl und die Flußrate war lml/Minute. Die mobile Phase war 58% Acetonitril, 5% Methanol und 37% destilliertes Wasser.
E. Ergebnisse und Diskussion
Das Molekulargewicht und die Molekulargewichtsverteilung von PDLLA-PEG-PDLLA, relativ zu Polystyrolstandards, wurde durch GPC gemessen (30). Die intrinsische Viskosität des Copolymers in CHCl₃ bei 25°C wurde unter der Verwendung eines Canon-Fenske Viskosimeters bestimmt. Das Molekulargewicht und die in trinsische Viskosität nahm mit ansteigendem PEG-Gehalt ab. Die Polydispersitäten von PDLLA-PEG-PDLLA mit PEG-Gehalten von 10%–40% waren von 2,4 bis 3,5. Jedoch wies das Copolymer mit 70% PEG eine engere Molekulargewichtsverteilung mit einer Polydispersität von 1,21 auf. Dies kann an dem hohen PEG-Gehalt liegen, der die Chance von Nebenreaktionen so wie Transesterfizierungen reduziert, die zu einer weiten Verteilung von Polymermolekulargewichten führt. Alternativ kann eine aufgewickelte Struktur der hydrophoben-hydrophilen Block-Copolymere zu einem künstlich-geringen Polydispersitätswert führen.
DSC Scans von reinem PEG und PDLLA-PEG-PDLLA Copolymeren sind in 25 und 26 dargestellt. Das PEG und PDLLA-PEG-PDLLA mit PEG-Gehalten von 70% und 40% zeigten endotherme Peaks mit abnehmender Enthalpie und Temperatur, während der PEG-Gehalt des Copolymers abnahm. Die endothermen Peaks in den Copolymeren von 40% und 70% PEG waren wahrscheinlich durch das Schmelzen der PEG-Region bedingt, was das Auftreten von Phasentrennung zeigte. Während reines PEG einen scharfen Schmelzpeak hat, zeigten die Copolymere von sowohl 70% und 40% PEG breite Peaks mit einer distinkten Schulter im Fall von 70% PEG. Die breiten Schmelzpeaks können von der Interferenz von PDLLA mit der Kristallisation mit PEG herrühren. Die Schulter im Falle von 70% PEG kann die Glastransition der PDLLA-Region darstellen. Keine thermischen Veränderungen traten bei den Copolymeren mit PEG-Gehalten von 10%, 20% und 30% in einem Temperaturbereich von 10–250°C auf, was darauf hindeutete, daß keine signifikante Kristallisation (daher vielleicht die Phasentrennung) auftrat.
DSC Thermogramme von PDLLA : PCL (70 : 30, 80 : 20, 90 : 10) Gemischen ohne Paclitaxel oder mit 20% Paclitaxel zeigten einen endothermen Peak bei ungefähr 60°C, der vom Schmelzen von PCL resultierte. Aufgrund der amorphen Natur von PDLLA und seines geringen Molekulargewichts (800) wurden die Schmelz- und Glastransitionstemperaturen von PDLLA nicht beobachtet. Keine thermischen Veränderungen aufgrund der Rekristallisierung oder Schmelzen von Paclitaxel wurde beobachtet.
PDLLA-PEG-PDLLA Copolymere mit 20% und 30% PEG-Gehalt wurden als optimale Formulierungsmaterialien für die Paste aus den folgenden Gründen ausgewählt: PDLLA-PEG-PDLLA mit 10% PEG konnte nicht bei einer Temperatur von ungefähr 60°C geschmolzen werden; die Copolymere von 40% und 70% PEG waren bei 60°C vollständig geschmolzen und die 20% und 30% Copolymere wurden zwischen 50°C und 60°C eine viskose Flüssigkeit; und die Quellung von 40% und 70% PEG Copolymeren in Wasser war sehr hoch, was zu einer schnellen Dispersion der Pasten in Wasser führte.
Die in vitro Freisetzungsprofile von Paclitaxel aus PDLLA-PEG-PDLLA Zylindern sind in 27 gezeigt. Das Experiment, das die Freisetzung aus dem 40% PEG Zylinder maß wurde unterbrochen, weil die Zylinder einen sehr hohen Grad an Quellung aufwiesen (ungefähr 200% Wasseraufnahme innerhalb eines Tages) und sich in ein paar Tagen auflösten. Die freigesetzte Fraktion von Paclitaxel aus den 30% PEG Zylindern nahm über 70 Tage hinweg graduell zu. Die freigesetzte Fraktion aus den 20% PEG Zylindern nahm bis zu 30 Tagen langsam zu und nahm dann abrupt zu, gefolgt von einer weiteren Periode von gradueller Zunahme. Ein signifikanter Unterschied existierte bei dem Ausmaß, in dem jeder individuelle Zylinder (20% PEG-Gehalt) die abrupte Veränderung bei der Paclitaxel-Freisetzung zeigte. Vor der abrupten Zunahme war die Freisetzungsfraktion von Paclitaxel für Copolymere mit geringerem PEG-Gehalt bei demselben Zylinderdurchmesser (1 mm) geringer. Die 40% und 30% PEG Zylinder zeigten sehr viel höhere Paclitaxel-Freisetzungsraten, als die 20% PEG Zylinder. Zum Beispiel setzte der Zylinder aus 30% PEG 17% Paclitaxel in 30 Tagen im Vergleich zu einer 2% Freisetzung aus dem 20% PEG Zylinder frei. Die Zylinder mit schmaleren Durchmessern führten zu schnelleren Freisetzungsraten (z. B. setzten die 30% PEG Zylinder mit 0,65 mm und 1 mm Durchmessern in 30 Tagen jeweils 26% und 17% Paclitaxel frei (27)).
Die oben genannten Beobachtungen können vielleicht durch die Freisetzungsmechanismen von Paclitaxel aus den Zylindern erklärt werden. Paclitaxel war in dem Polymer als Kristalle, wie durch optische Mikroskopie beobachtet werden konnte, verteilt. Die Kristalle begannen sich bei 170°C in der Copolymer-Matrix zu lösen und waren bei 180°C vollständig gelöst, wie durch heiße Phase Mikroskopie DSC Thermogramme von 20% Paclitaxel-beladener PDLLA-PEG-PDLLA (30% PEG) Paste beobachtet werden konnte, die ein schmales Rekristallisations-Exotherm (16 J/g, 190°C) und ein Schmelz-Endotherm (6 J/g, 212°C) für Paclitaxel ergab (25), was auf die Rekristallisierung von Paclitaxel von der Copolymer Schmelze nach 180°C hindeutet. In diesem Typ von Wirkstoff/Polymermatrix könnte Paclitaxel durch Diffusion und/oder Polymererosion freigesetzt werden.
In dem diffusionskontrollierten Fall kann Wirkstoff durch molekulare Diffusion in dem Polymer und/oder durch offene Kanäle, die durch miteinander verbundene Wirkstoffpartikel gebildet werden, freigesetzt werden. Daher waren bei 20% Beladung einige Paclitaxel Partikel von isoliert und Paclitaxel könnte durch Lösung in dem Co-Polymer, gefolgt von Diffusion, freigesetzt worden sein. Andere Partikel von Paclitaxel könnten Cluster bilden, die mit der Oberfläche verbunden sind und durch Kanaldiffusion freigesetzt werden. In beiden Fällen ergaben die Zylinder mit kleineren Abmessungen eine schnellere Wirkstoff-Freisetzung aufgrund des kürzeren Diffusionsweges (27).
Die Abmessungsveränderungen und Wasseraufnahmen der Zylinder wurden während der Freisetzung aufgezeichnet (28). Die Veränderungen in der Länge, dem Durchmesser und dem Naßgewicht der 30% PEG Zylinder stiegen innerhalb von 2 Tagen schnell auf ein Maximum an, blieben für ungefähr 15 Tage unverändert und nahmen dann graduell ab. Der anfängliche Durchmesser des Zylinders beeinflußte das Quellverhalten nicht. Für den Zylinder von 20% PEG nahm die Länge innerhalb eines Tages um 10% zu und klang dann ab, während der Durchmesser und die Wasseraufnahme graduell über die Zeit zunahmen. Weil mehr PEG in dem Copolymer mehr Wasser aufnahm, um die Diffusion des Paclitaxel zu erleichtern, wurde eine schnellere Freisetzung beobachtet (27).
Der Copolymer-Molekulargewichtsabbau von PDLLA-PEG-PDLLA Paste wurde durch GPC verfolgt. Für den 20% PEG Zylinder nahm das Elutionsvolumen an der Peak-Position mit der Zeit zu, was auf ein verringertes Polymer-Molekulargewicht während des Verlaufs des Freisetzungsexperiments (30) hindeutete. Eine biphasische Molekulargewichtsverteilung wurde an Tag 69 beobachtet. Das Polymer-Molekulargewicht war für die 30% PEG Zylinder (1 mm und 0,65 mm) ebenfalls verringert. Jedoch wurde keine biphasische Verteilung beobachtet.
NMR-Spectra ergaben einen PEG-Peak bei 3,6 ppm und PDLLA-Peaks bei 1,65 ppm und 5,1 ppm. Die Peakfläche von PEG relativ zu PDLLA in dem Copolymer nahm si gnifikant nach 69 Tagen ab (29), was auf eine Lösung des PEGs nach seiner Dissoziation von PDLLA hindeutete. Der Trockenmassenverlust der Zylinder wurde ebenfalls aufgenommen (29) und zeigt eine Abbaurate, die in der Reihenfolge 30% PEG-0,65 mm > 30% PEG-1 mm > 20% PEG-1 mm abnimmt.
Die morphologischen Veränderungen der getrockneten Zylinder vor und während der Paclitaxel-Freisetzung wurden unter der Verwendung von SEM beobachtet (31). Kurz gesagt, wurden feste Paclitaxel-Kristalle und nicht-poröse Polymermatrizes vor der Freisetzung angesehen (31A und 31B). Nach 69 Tagen Freisetzung wurden keine Paclitaxel-Kristalle beobachtet und die Matrizes enthielten aufgrund des Polymerabbaus und der Wasseraufnahme viele Poren (31 C und 31 D).
Die 30% PEG-Zylinder zeigten eine extensive Quellung nach nur zwei Tagen in Wasser (28) und daher war die Verhinderung der Diffusion der losgelösten wasserlöslichen PEG Block und abgebautem PDLLA (d. h., DL-Milchsäureoligomere) verringert. Weil der Massenverlust und der Abbau der 30% PEG-Zylinder kontinuierlich war, nahm der Beitrag der Freisetzung aufgrund von Erosion graduell zu, was zu einer verzögerten Freisetzung von Paclitaxel ohne jede abrupte Veränderung führte ( 27). Für die 20% PEG-Zylinder war die Quellung anfangs gering (28), was zu einer langsamen Diffusion der Abbauprodukte führte. Daher wurden die Abbauprodukte zunächst in der inneren Region zurückgehalten, während aufgrund des kurzen Diffusionswegs weniger Abbauprodukte in der äußeren Region vorhanden waren. Die Abbauprodukte beschleunigten die Abbaurate, weil die Carboxylsäure-Endgruppen der Oligomere den hydrolytischen Abbau katalysierten. Dies führte zu einer Schale hohen Molekulargewichts und einem Inneren niederen Molekulargewichts, wie durch die biphasische Copolymer-Molekulargewichtsverteilung angezeigt wurde (30, Tag 69). Weil die Schalenaufbrechung von Faktoren wie der Stärke, Dicke und Defekte der Schale und inneren Abbauprodukten abhängig war, waren der Beginn und das Ausmaß des Verlust von inneren Abbauprodukten sehr variabel. Weil die Schalenaufbrechung nicht gleichmäßig war und der Wirkstoff in dem Polymer nicht mikroskopisch homogen verteilt war, waren die Zeitpunkte für den Freisetzungsstoß und das Ausmaß des Ausstoßes für die vier untersuchten Proben unterschiedlich (27).
Die Freisetzung von Paclitaxel von PDLLA und PCL Gemischen und reinem PCL sind in 32 gezeigt. Kurz gesagt, nahm die freigesetzte Fraktion mit dem PDLLA-Gehalt in dem Gemisch zu. Z. B. war das freigesetzte Paclitaxel von 80 : 20, 70 : 30 und 0 : 100 PDLLA : PCL jeweils 17%, 11% und 6% innerhalb von zehn Tagen. Nach einem anfänglichen Ausstoß in einem Tag wurde eine ungefähr konstante Freisetzung von der 80 : 20 PDLLA : PCL Paste erhalten. Keine signifikantes Ausmaß von Quellung wurde während der Freisetzung beobachtet. Für die PDLLA : PCL Gemische, da PDLLA ein sehr niedriges Molekulargewicht von ungefähr 800 hat, wurde es schnell in wasserlösliche Produkte hydrolysiert, ohne eine lange Verzögerung des Masseverlusts. PCL diente als das "Halte"-Material, um ein schnelles Auflösen der Paste zu verhindern. Daher nahm die Freisetzungsrate aufgrund des verstärkten Abbaus mit dem PDLLA Gehalt in dem Gemisch zu. Der kontinuierliche Abbau des PDLLA kontrollierte die Freisetzung von Paclitaxel und führte zu einer konstanten Freisetzung. Die Freisetzung von Paclitaxel aus reinem PCL war aufgrund der langsamen Abbaurate (in 1–2 Jahren) von PCL wahrscheinlich diffusionskontrolliert.
In der Freisetzungsstudie für 20% Paclitaxel beladene 90 : 10 PDLLA : PCL-Paste wurde aufgrund der Desintegration des Pastenpellets innerhalb von 24 Stunden Inkubation Schwierigkeiten begegnet. Kurz gesagt, wurden während der ersten 12 Stunden der Inkubation jede Stunde Proben genommen, um sinkende Bedingungen für die Paclitaxelfreisetzung sicherzustellen. Das freigesetzte Paclitaxel von der 90 : 10 Paste waren 25–35% innerhalb von 10 Stunden.
Paste aus 90 : 10 PDLLA : PCL, enthaltend 30% Paclitaxel setzte mehr Paclitaxel als 90 : 10 PDLLA : PCL Paste, enthaltend 20% Paclitaxel frei. Daher war die Modulation der Freisetzungsrate von Paclitaxel, die durch die Eigenschaften der Polymer- und Chemotherapie-Mitteln sowie die Stelle der Verabreichung reguliert war, bei der Entwicklung der lokalen Therapie wichtig.
BEISPIEL 21
HERSTELLUNG VON POLYMER ZUSAMMENSETZUNGEN ENTHALTEND WASSERLÖSLICHE ZUSÄTZE UND PACLITAXEL
A. Herstellung von Polymer-Zusammensetzungen
Mikropartikel aus Co-Präzipitaten von Paclitaxel/Zusatzstoff wurden hergestellt und anschließend zu PCL hinzugegeben, um Pasten zu bilden. Kurz gesagt, wurde Paclitaxel (100 mg) in 0,5 ml Ethanol (95%) gelöst und mit dem vorher in 1,0 ml destilliertem Wasser gelösten oder dispergierten Zusatzstoff (100 mg) gemischt. Das Gemisch wurde pulverisiert, bis eine glatte Paste gebildet wurde. Die Paste wurde auf eine Petrischale verteilt und über Nacht bei 37°C luftgetrocknet. Die getrocknete Masse wurde unter der Verwendung eines Mörsers und Stößels pulverisiert und durch ein Mesh #140 (106 μm) Sieb (Endecotts Test Sieves Ltd., London, England) passiert. Die Mikropartikel (40%) wurden dann in geschmolzenes PCL (60%) bei 65°C inkorporiert, was einer 20% Beladung von Paclitaxel entspricht. Die in der Studie verwendeten Zusatzstoffe waren Gelatine (Typ B, 100 bloom, Fisher Scientific), Methylcellulose, (Britsh Drug Houses), Dextran, T500 (Pharmacia, Schweden), Albumin (Fisher Scientific) und Natriumchlorid (Fisher Scientific). Mikropartikel aus Paclitaxel und Gelatine oder Albumin wurden wie oben beschrieben hergestellt, wurden aber durch ein Mesh #60 (270 μm) Sieb (Endecotts Test Sieves Ltd., London, England) passiert, um den Effekt von Mikropartikelgröße auf die Freisetzung von Paclitaxel aus der Paste zu evaluieren. Ebenfalls wurden Pasten hergestellt, die 10, 20 oder 30% Gelatine und 20% Paclitaxel in PCL enthielten, um den Effekt der Proportion des Zusatzstoffs auf die Wirkstofffreisetzung zu untersuchen. Wenn nicht anders angegeben, wurden Pasten hergestellt, die 20% Paclitaxel, dispergiert in PCL enthielten, um als Kontrollen für die Freisetzungsraten-Untersuchungen zu dienen.
B. Wirkstoff-Freisetzungsstudien
Ein ungefähr 2,5 mg Pellet aus Paclitaxel-beladener Paste wurde in 50 ml 10 mM PBS (pH 7,4) in Schraub-Verschluß Gefäßen suspendiert. Die Röhrchen wurden Endeüber-Ende bei 37°C gemischt und zu vorgegebenen Zeitintervallen wurden 49,5 ml Überstand entfernt, durch einen 0,45 μm Membranfilter filtriert und zur Paclitaxelanalyse aufbewahrt. Ein gleiches Volumen PBS wurde in jedem Röhrchen ersetzt, um die Sink-Bedingungen während der Studie aufrechtzuerhalten. Zur Analyse wurden die Filtrate mit 3 × 1 ml Dichlormethan (DCM) extrahiert, die DCM Extrakte bis zur Trocknung unter einem Strom von Stickstoff evaporiert und in 1 ml Acetonitril gelöst. Die Analyse wurde durch HPLC unter der Verwendung einer mobilen Phase aus Wasser : Methanol : Acetonitril (37 : 5 : 58) bei einer Flußrate von 1 ml/Minute (Beckman Isocratic Pump), einer C18 Reverse-Phase-Säule (Beckman), und UV Nachweis (Shimadzu SPD A) bei 232 nm durchgeführt.
C. Quellungsstudien
Paclitaxel/Zusatzstoff/PCL Pasten, die unter Verwendung von Paclitaxel-Zusatzstoff Mikropartikeln von Mesh #140 (und #60 für nur Gelatine) hergestellt wurden, wurden extrudiert, um Zylinder zu formen, Stücke wurden abgeschnitten, gewogen und der Durchmesser und die Länge von jedem Stück wurden unter der Verwendung eines Mikrometer (Mitutoyo Digimatic) gemessen. Die Stücke wurden in destilliertem Wasser suspendiert (10 ml) bei 37°C und zu vorbestimmten Intervallen wurde das Wasser abgegossen und der Durchmesser und die Länge der zylindrischen Stücke wurden gemessen und die Proben gewogen. Die Morphologie der Proben (vor und nach der Suspension in Wasser) wurde unter der Verwendung eines Scanning-Elektron-Mikroskops (SEM) (Hitachi F-2300) untersucht. Die Proben wurden mit 60% Au und 40% Pd (Dicke 10–15 nm) unter der Verwendung eines Hummer-Instruments (Technics, USA) beschichtet.
D. Hühnerembryo Chorioallantoidmembran (CAM)-Untersuchungen
Befruchtete Haushuhnembryonen wurden für vier Tage vor der Anzucht ohne Schale inkubiert. Die Eierinhalte wurden bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% CO₂ inkubiert und an Tag 6 der Inkubation wurden 1 mg Stücke der Paclitaxel-beladenen Paste (enthaltend 6% Paclitaxel, 24% Gelatine und 70% PCL) oder Kontrolle (30% Gelatine in PCL) Pasten wurden direkt auf die CAM Oberfläche plaziert. Nach einer 2-tägigen Exponierung wurde die Vaskulatur unter der Verwendung eines Stereomikroskops, das mit einer Videokamera verbunden war, untersucht; die Videosignale wurden dann auf einem Computer dargestellt und videoausgedruckt.
E. Ergebnisse und Diskussionen
Mikropartikel von Co-präzipitiertem Paclitaxel und Gelatine oder Albumin waren hart und brüchig und wurden leicht in PCL inkorporiert, während die anderen Zusatzstoffe weiche Partikel ergaben, die eine Tendenz zum Aufbrechen während der Herstellung der Paste zeigten.
33 zeigt die Zeitverläufe der Paclitaxelfreisetzung aus Pasten, die 20% Paclitaxel in PCL oder 20% Paclitaxel, 20% Zusatzstoff und 60% PCL enthielten. Die Freisetzung von Paclitaxel aus PCL mit oder ohne Zusatzstoffe folgte einem bi-phasischen Freisetzungsmuster; anfänglich gab es eine schnellere Wirkstoff-Freisetzungsrate, gefolgt von einer langsameren Wirkstoff-Freisetzungsrate des Wirkstoffs. Die anfängliche Periode der schnelleren Freisetzungsrate von Paclitaxel aus den Pasten wurde als auf der Lösung von Paclitaxel, daß auf der Oberfläche lokalisiert war oder Diffusion von Paclitaxel von den superfiziellen Regionen der Paste basierend betrachtet. Die folgende langsamere Phase der Freisetzungsprofile kann mit einer Verringerung der effektiven Oberfläche der Wirkstoffpartikel, die in Kontakt mit dem Puffer stehen, einem langsamen Eindringen des Puffers in die Polymermatrix oder einer Zunahme der mittleren Diffusionsstrecken des Wirkstoffes durch die Polymermatrix im Zusammenhang stehend gesehen werden.
Beide Phasen der Freisetzungsprofile von Paclitaxel aus PCL nahmen in Anwesenheit der hydrophilen Zusatzstoffe zu, wobei Gelatine, Albumin und Methylcellulose die höchsten Zunahmen in den Wirkstoff-Freisetzungsraten erzeugten (33). Es gab weitere Zunahmen in der Freisetzung von Paclitaxel aus der Polymermatrix, wenn größere Paclitaxel-Additiv-Partikel (270 μm) verwendet wurden um die Paste herzustellen, im Vergleich zu wenn die kleineren Paclitaxel-Additiv-Partikel (106 μm) verwendet wurden (34). Zunahmen in der Menge des Zusatzstoffes (z. B. Gelatine) ergab einen entsprechenden Anstieg der Wirkstoff-Freisetzung (34). 35A zeigt das Quellverhalten von Pasten, die 20% Paclitaxel, 20% Zusatzstoff und 60% PCL enthalten. Die Raten der Quellung folgten der Reihenfolge Gelatine > Albumin > Methylcellulose > Dextran > Natriumchlorid. Zusätzlich nahm die Quellungsrate zu, wenn ein höherer Anteil des wasserlöslichen Polymers zu der Paste hinzugefügt wurde (35B). Die Pasten, die Gelatine oder Albumin enthielten, quollen schnell innerhalb der ersten 8–10 Stunden und anschließend nahm die Rate der Quellung ab, wenn die Veränderung in dem Volumen der Probe größer als 40% war. Die unter der Verwendung der größeren (270 μm) Paclitaxel-Gelatine Partikeln hergestellte Paste quoll mit einer schnelleren Rate auf, als die mit den kleineren (106 μm) Paclitaxel-Gelatine Partikeln hergestellte. Alle Pasten desintegrierten, wenn das Volumen mehr als 50% zunahm. Die SEM Untersuchungen zeigten, daß die Quellung der Pasten von einem Aufbrechen der Matrix begleitet war (36). Bei hohen Vergrößerungen ( 36C und 36D) konnten Hinweise auf Nadel-oder-Stab-förmige Paclitaxel-Kristalle auf der Oberfläche der Paste und in enger Assoziierung mit Gelatine im Anschluß an die Quellung gefunden werden (36C und 36D).
Osmotische oder quellfähige, hydrophile Mittel, die als diskrete Partikel in das hydrophobe Polymer eingebettet wären, führten zu einer Wirkstoff-Freisetzung durch eine Kombination von Matrixerosion, Diffusion des Wirkstoffs durch die Polymermatrix und/oder Diffusion und/oder konvektiven Fluß durch die durch Lösung von den wasserlöslichen Zusatzstoffen in der Matrix gebildeten Poren. In einem hydrophoben Polymer dispergierte quellfähige Polymere und osmotische Mittel würden Wasser binden (als Saugmittel funktionieren), sich lösen oder quellen und bewirken einen Turgordruck, der das Septum (die Polymerlage) zwischen angrenzenden Partikeln zerreißen würde, was Mikrokanäle erzeugt und daher ein Austreten der Wirkstoffmoleküle in das umgebende Medium durch Diffusion oder konvektiven Fluß erleichtert. Die Quellung und das Brechen der Pastenmatrix (36) führte wahrscheinlich zu der Bildung von Mikrokanälen durch das Innere der Matrix. Die verschiedenen Raten und Ausmaße der Quellung der Polymere (35) können zu den Unterschieden in den beobachteten Paclitaxelfreisetzungsraten beitragen (33 und 34).
37 zeigt CAMs, die mit Kontroll-Gelatine-PCL Paste (37A) und 20% Paclitaxel-Gelatine-PCL Paste (37B) behandelt wurde. Die Paste auf der Oberfläche der CAMen sind durch die Pfeile in den Figuren gezeigt. Die CAM mit der Kontrollpaste zeigt eine normale kapillare Netzwerkarchitektur. Die mit der Paclitaxel-PCL Paste behandelten CAMen zeigen konsistent vaskuläre Regression und Zonen, denen ein kapillares Netzwerk fehlt. Die Inkorporierung von Zusatzstoffen in der Paste vergrößerte den Durchmesser der avaskulären Zone (37) merklich.
Diese Untersuchung zeigte, daß die in vitro Freisetzung von Paclitaxel aus PCL durch die Inkorporierung von Paclitaxel/hydrophilen Polymer-Mikropartikeln in PCL Matrix gesteigert werden konnte. In vivo Studien, die die Effizienz der Formulierung bei der Behandlung von subkutanen Tumoren in Mäusen untersuchten, zeigten ebenfalls, daß die Paclitaxel/Gelatine/PCL-Paste die Tumormasse signifikant reduzierte. Faktoren wie der Typ von wasserlöslichem Mittel, die Größe der Mikropartikel und die Propor tion der Zusatzstoffe konnten als die Freisetzungscharakteristika des Wirkstoffs beeinflussend gezeigt werden.
BEISPIEL 22
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON NANOPASTE
Nanopaste ist eine Suspension von Mikrosphären in einen hydrophilen Gel. Innerhalb eines Aspekts der Erfindung kann das Gel oder die Paste als ein Verfahren zur Lokalisierung von Wirkstoff-geladenen Mikrosphären in der Nähe des Zielgewebes über Gewebe geschmiert werden. Weil Wasser-basiert, wurde die Paste bald mit Körperflüssigkeiten verdünnt, was eine Abnahme in der Klebrigkeit der Paste und eine Tendenz der Mikrosphären verursachte, auf nahegelegenem Gewebe abgelagert zu werden. Ein Pool von in Mikrosphären abgekapseltem Wirkstoff wird dadurch nahe dem Zielgewebe lokalisiert.
Reagenzien und Ausrüstung, die innerhalb dieser Experimente verwendet wurden, schließen Bechergläser, Carbopol 925 (pharmazeutischer Grad, Goodyear Chemical Co.), destilliertes Wasser, Natriumhydroxid (1 M) in Wasser-Lösung, Natriumhydroxidlösung (5 M) in Wasser-Lösung, Mikrosphären im Größenbereich von 0,1 μm zu 3 μm suspendiert in Wasser bei 20% w/v (siehe vorher) ein.
1. HERSTELLUNG VON 5% W/V CARBOPOLGEL
Eine ausreichende Menge von Carbopol wurde zu 1 M Natriumhydroxid hinzugegeben, um eine 5% w/v Lösung zu erhalten. Um das Carbopol in der 1 M Hydroxidlösung zu lösen, wurde die Lösung für ungefähr eine Stunde stehen gelassen. Während dieser Zeitperiode wurde das Gemisch gerührt und, nach einer Stunde, wurde der pH unter der Verwendung von 5 M Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt, bis das Carbopol vollständig gelöst war. Sobald ein pH von 7,4 erreicht war, wurde das Gel abgedeckt und für 2 bis 3 Stunden stehen gelassen.
2. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON NANOPASTE
Eine ausreichende Menge von 0,1 μm bis 3 μm Mikrosphären wurde zu Wasser hinzugegeben, um eine 20% Suspension der Mikrosphären herzustellen. Carbopolgel (8 ml der 5% w/v) wurde in ein Becherglas plaziert und 2 ml der 20% Mikrosphären Suspension wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde gerührt, um die Mikrosphären gründlich in Gel zu verteilen. Das Gemisch wurde bei 4°C gelagert.
BEISPIEL 23
KOMPLEXIERUNG VON PACLITAXEL MIT CYCLODEXTRINEN
A. Materialien
Paclitaxel wurde von Hauser Chemicals Inc. (Boulder, Colorado) erhalten. Dinatriumphosphat (Fisher), Zitronensäure (British Drug Houses), Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPβCD), γ-Cyclodextrin (γ-CD) und Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin (HPγCD) wurden von American Maize-Products Company (Hammond, Indiana) erhalten und wurden verwendet wie erhalten.
B. Verfahren
1. LÖSLICHKEITSSTUDIEN
Überschußmengen von Paclitaxel (5 mg) wurden zu wässrigen Lösungen hinzugefügt, die verschiedene Konzentrationen von γ-CD, HPγ-CD oder HPβ-CD enthielten und für ungefähr 24 Stunden bei 37°C sanft gemischt. Nach Equilibrierung wurden Aliquots der Suspension durch einen 0,45 μm Membranfilter (Millipore) gefiltert, geeignet verdünnt und unter der Verwendung von HPLC analysiert. Die mobile Phase war aus einem Gemisch von Acetonitril, Methanol und Wasser (58 : 5 : 37) bei einer Flußrate von 1,0 ml/Minute zusammengesetzt. Die Löslichkeit von Paclitaxel in einem Lösemittel, das aus 50 : 50 Wasser und Ethanol (95%) zusammengesetzt war und verschiedene Konzentrationen von bis zu 10% HPβ-CD enthielt, wurde ebenfalls untersucht. Zusätzlich wurden Auflösungsratenprofile von Paclitaxel durch Zugabe von 2 mg Paclitaxel (wie erhalten) zu 0, 5, 10 oder 20% HPγ-CD Lösungen oder 2 mg vorher hydratisiertem Paclitaxel (durch Suspendierung in Wasser für 7 Tage) zu reinem Wasser und sanften Mischen bei 37°C untersucht. Zu verschiedenen Zeitintervallen wurden Aliquots genommen und auf Paclitaxel untersucht.
2. STABILITÄTSUNTERSUCHUNGEN
Die Lösungen enthaltend 20% HPβCD oder HPγCD wiesen jeweils pH-Werte von 3,9 und 5,2 auf. Die Stabilität von Paclitaxel in Cyclodextrinlösungen wurde durch Untersuchung von Paclitaxel in Lösungen (20 μg ml), enthaltend 10 oder 20% HPγ-CD oder HPβ-CD in entweder Wasser oder einem 50 : 50 Wasser-Ethanol-Gemisch bei 37°C oder 55°C bei verschiedenen Zeitintervallen getestet. Zusätzlich wurde die Stabilität von Paclitaxel in Lösungen (1 μg/ml), die 1%, 2% oder 5% HPβCD bei 55°C enthielten, untersucht.
C. Ergebnisse
1. LÖSLICHKEITSSTUDIEN
Die Löslichkeit von Paclitaxel nahm über den gesamten untersuchten CD-Konzentrationsbereich hinweg zu; wobei HPβ-CD die größte Zunahme bei der Löslichkeit von Paclitaxel ergab (38). Die Form der Löslichkeitskurven läßt vermuten, daß die Stoichiometrien von einer höheren Ordnung als 1 : 1 Komplexe waren. Paclitaxel bildete mit sowohl HPβ-CD und HPγ-CD Typ A_P Kurven und Typ A_N Kurven mit γ-CD. Die Löslichkeit von Paclitaxel in einer 50% Lösung HPβ-CD in Wasser war 3,2 mg/ml bei 37°C, was eine ungefähr 2000-fache Zunahme über die Löslichkeit von Paclitaxel in Wasser war. Die geschätzten Stabilitätskonstanten (von 39) für Komplexe erster Ordnung von Paclitaxel-Cyclodextrinen waren jeweils 3,1, 5,8 und 7,2 M^–1 für γ-CD, HPγ-CD und HPβ-CD und die für Komplexe zweiter Ordnung waren jeweils 0,785 × 10³, 1,886 × 10³ und 7,965 × 10³ M^–1 für γ-CD, HPγ-CD und HPβ-CD. Die Werte der beobachteten Stabilitätskonstanten lassen vermuten, daß die durch Paclitaxel mit Cyclodextrinen gebildeten Einschlußkomplexe vorherrschend Komplexe zweiter Ordnung waren.
Die Löslichkeit von Paclitaxel in 50 : 50 Wasser : Ethanol Gemischen nahm mit einer Zunahme in der Cyclodextrinkonzentration (40) zu, wie für Komplexierung in reinem Wasser beobachtet. Die offensichtliche Stabilitätskonstante für die Komplexierung von Paclitaxel und HPβ-CD in Anwesenheit von 50% Ethanol (26,57 M^–1) war signifikant geringer (ungefähr 300 mal), als die Stabilitätskonstante in Abwesenheit von Ethanol. Die geringere Stabilitätskonstante kann auf eine Veränderung in der dielektrischen Konstante oder der Polarität des Lösemittels in Anwesenheit von Ethanol zurückgeführt werden.
Die Lösungsprofile von Paclitaxel in 0, 5, 10 und 20% γ-CD Lösungen ( 41) zeigen die Bildung von einer metastabilen Lösung von Paclitaxel in reinem Wasser oder den Cyclodextrinlösungen; die Menge von Paclitaxel in Lösung nahm graduell zu, erreichte ein Maximum und nahm anschließend ab. Lösungsuntersuchungen unter der Verwendung von Paclitaxelproben, die vorher durch Suspendierung in Wasser für 48 Stunden hydratisiert waren, zeigten keine Bildung der metastabilen Lösung. Zusätzlich zeigte die DSC Analyse des hydratisierten Paclitaxels (getrocknet in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur) zwei breite endotherme Peaks zwischen 60 und 110°C. Diese Peaks wurden von einem ungefähr 4,5%igen Gewichtsverlust (bestimmt durch thermogravimetrische Analyse) begleitet, was auf die Anwesenheit von Hydraten) hindeutet. Ein Gewichtsverlust von ungefähr 2,1% würde auf die Bildung eines Paclitaxelmonohydratens schließen lassen. Daher läßt das Auftreten der DSC Peaks zwischen 60°C und 110°C und der Gewichtsverlust von ungefähr 4,5% auf die Anwesenheit eines Dihydrats schließen. Es konnte kein Hinweis auf endotherme Peaks zwischen 60°C und 110°C (DSC Ergebnisse) oder ein Gewichtsverlust (TGA Ergebnisse) für die Paclitaxelproben wie erhalten festgestellt werden. Daher war das (wie erhaltene) Paclitaxel wasserfrei und löste sich bei Suspension in Wasser unter Bildung einer supergesättigten Lösung, die als ein Hydrat niedrigerer Löslichkeit rekristallisierte (41).
2. STABILITÄTSSTUDIEN
Der Paclitaxelabbau hing von der Konzentration des Cyclodextrins ab und folgte Pseudo-Abbaukinetiken erster Ordnung (z. B. 42). Die Rate des Abbaus von Paclitaxel in Lösungen (1 μg/ml Paclitaxel), enthaltend 1% HPβ-CD ist bei 55°C schneller (k = 3,38 × 10^–3 h^–1) als die Rate bei höheren Cyclodextrinkonzentrationen. Abbauraten-Konstanten von jeweils 1,78 × 10^–3 h^–1 und 0,96 × 10^–3 h^–1 wurden für Paclitaxel in 10% HPβ-CD und HPγ-CD beobachtet. Paclitaxellösungen (1 μg/ml), enthaltend 2, 4, 6 oder 8% HPβ-CD zeigten keinen signifikanten Unterschied bei der Abbaurate von Denen, die mit den 10 oder 20% HPβ-CD Lösungen (20 μg/ml) erhalten wurden. Die Anwesenheit von Ethanol hatte keinen negativen Einfluß auf die Stabilität von Paclitaxel in den Cyclodextrinlösungen.
D. Ergebnis
Diese Studie zeigte, daß die Löslichkeit von Paclitaxel durch Komplexierung mit Cyclodextrinen vergrößert werden konnte. Diese Wasser-basierenden Cyclodextrinformulierungen können bei der Behandlung von verschiedenen entzündlichen Erkrankungen verwendet werden.
BEISPIEL 24
POLYMER-ZUSAMMENSETZUNGEN MIT ZUNEHMENDEN KONZENTRATIONEN VON PACLITAXEL
PDLLA-MePEG und PDLLA-PEG-PDLLA sind Blockcopolymere mit hydrophoben (PDLLA) und hydrophilen (PEG oder MePEG) Regionen. Bei geeigneten Molekulargewichten und chemischer Zusammensetzung können sie kleine Aggregate von hydrophobem (PDLLA) Kern und hydrophilen (MePEG) Schalen bilden. Paclitaxel kann in den hydrophoben Kern geladen werden, wodurch Paclitaxel mit einer erhöhten "Löslichkeit" zur Verfügung gestellt wird.
A. Materialien
D,L-Lactid wurde von Aldrich erworben, Stannooctoat, Poly(ethylenglycol) (Mol. Gew. 8000), MePEG (Mol. Gew. 2000 und 5000) waren von Sigma. MePEG (Mol. Gew. 750) war von Union Carbide. Die Copolymere wurden durch ein Ringöffnungs-Polymerisationsverfahren unter der Verwendung von Stannooctoat als Katalysator synthetisiert (Deng et al, J. Polym. Sci., Polym, Lett. 28: 411–416, 1990; Cohn et al, J. Biomed, Mater. Res. 22: 993–1009, 1988).
Zur Synthese von PDLLA-MePEG wurde ein Gemisch von DL-Lactid/MePEG/Stannooctoat in eine 10 Milliliter Glasampulle gegeben. Die Ampulle wurde an ein Vakuum angeschlossen und mit einer Flamme versiegelt. Die Polymerisation wurde durch Inkubieren der Ampulle in einem 150°C-Ölbad für 3 Stunden durchgeführt. Zur Synthese von PDLLA-PEG-PDLLA wurde ein Gemisch von D,L-Lactid/PEG/Stannooctoat in eine Glasflasche überführt, mit einem Gummistopfen verschlossen und für 3 Stunden in einem 150°C-Ofen erhitzt. Die Ausgangszusammensetzungen der Copolymere sind in Tabellen 1 und 2 angegeben. In allen Fällen war die Menge Stannooctoat 0,5%–0,7%.
B. Methoden
Die Polymere wurden in Acetonitril gelöst und bei 10.000 g für 5 Minuten zentrifugiert, um alle nicht löslichen Verunreinigungen abzutrennen. Die Paclitaxel-Acetonitrillösung wurde dann zu jeder Polymerlösung hinzugegeben, um eine Lösung mit Paclitaxel (Paclitaxel + Polymer) von 10% Gew. zu ergeben. Das Lösemittel Acetonitril wurde dann unter einem Strom von Stickstoff und 60°C Erwärmung entfernt, um eine klare Paclitaxel/PDLLA-MePEG Matrix zu erhalten. Destilliertes Wasser, 0,9% NaCl Kochsalzlösung oder 5% Dextrose wurde in viermaligem Gewicht der Matrix hinzugefügt. Die Matrix zuletzt mit der Hilfe von Vortex-Mischen und periodischer Erwärmung auf 60°C "gelöst". Klare Lösungen wurden in allen Fällen erhalten. Die Partikelgrößen waren alle unter 50 nm, wie durch einen Submicronpartikelsizer (NICOMP Modell 270) bestimmt. Die Formulierungen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Formulierungen von Paclitaxel/PDLLA-MePEG*
Im Fall von PDLLA-PEG-PDLLA (Tabelle 2) wurden das Paclitaxel und das Polymer in Aceton co-gelöst, da die Copolymere sich nicht in Wasser lösen können. Wasser oder ein Gemisch von Wasser/Aceton wurde allmählich zu dieser Paclitaxelpolymerlösung hinzugegeben, um die Bildung von Paclitaxel/Polymersphären zu induzieren.
Tabelle 2: Zusammensetzung von PDLLA-PEG-PDLLA
C. Ergebnisse
Viele der PDLLA-MePEG Zusammensetzungen bilden klaren Lösungen in Wasser, 0,9% Kochsalzlösung oder 5% Dextrose, was auf die Bildung von kleinen Aggregaten im Bereich von Nanometern hinweist. Paclitaxel wurde erfolgreich in PDLLA-McPEG Mizellen geladen. Z. B. wurde bei 10% Beladung (dies bedeutet 10 mg Paclitaxel in 1 ml Paclitaxel/PDLLA-MePEG/wässriges System) eine klare Lösung von 2000-50/50 und 2000-40/60 erhalten. Die Partikelgröße war ungefähr 60 nm.
BEISPIEL 25
VERFAHREN ZUR FILMHERSTELLUNG
Der Begriff Film bezeichnet ein Polymer, das in eine von vielen geometrischen Formen geformt ist. Der Film kann ein dünnes elastisches Blatt aus Polymer oder eine 2 mm dicke Scheibe von Polymer sein, von denen jedes auf die Gewebeoberfläche aufgebracht werden kann, um nachfolgende Vernarbungs- und Adhäsionsbildung zu vermeiden. Dieser Film wurde dazu gestaltet, um auf freigelegtes Gewebe plaziert zu werden, so daß jeder verkapselte Wirkstoff von dem Polymer über eine lange Zeitdauer an der Gewebestelle freigesetzt werden kann. Filme können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, einschließlich z. B. durch Gießen oder durch Sprühen.
Bei der Gießtechnik wurde das Polymer entweder geschmolzen und in eine Form gegossen oder in Dichlormethan gelöst und in eine Form gegossen. Das Polymer verfestigte sich dann entweder während es sich abkühlte oder verfestigte sich, wenn das Lösemittel verdampfte. Bei der Sprühtechnik wurde das Polymer in Lösemittel gelöst und auf Glas gesprüht, während das Lösemittel verdampfte, verfestigte sich das Polymer auf dem Glas. Ein wiederholtes Sprühen ermöglichte den Aufbau eines Polymers in Form eines Films, der vom Glas abgezogen werden kann.
Reagenzien und Ausrüstung, die innerhalb dieser Experimente verwendet wurden, schließen ein kleines Becherglas, ein Corning heiße Platte-Rührgerät, Gießformen (z. B. 50 ml Zentrifugenröhrendeckel) und eine Form-Haltevorrichtung, 20 ml Glas Scintillationsgefäß mit Kappe (Plastik Insert Typ), einen TLC-Atomizer, ein Stickstoffgastank, Polycaprolacton ("PCL – Mol. Gew. 10.000 bis 20.000; Polysciences), Paclitaxel (Sigma 95% Reinheit), Ethanol, "gewaschenes" (siehe vorher) Ethylenvinylacetat ("EVA"), Poly(DL)Milchsäure ("PLA" – Mol. Gew. 15.000 bis 25.000; Polysciences), DCM (HPLC Grad; Fisher Scientific) ein.
1. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FILMEN – SCHMELZGUSS
Ein kleines Becherglas mit einem bekannten Gewicht an PCL wurde in ein größeres Bechergefäß plaziert, das Wasser enthielt (um als ein Wasserbad zu fungieren) und auf eine heiße Platte bei 70°C plaziert, bis das Polymer voll-ständig geschmolzen war. Ein bekanntes Gewicht Wirkstoff wurde zu dem geschmolzenen Polymer hinzugegeben und das Gemisch gründlich gerührt. Das geschmolzene Polymer wurde in eine Form gegossen und abkühlen gelassen.
2. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FILMEN – LÖSEMITTEL GIESSEN
Ein bekanntes Gewicht an PCL wurde direkt in ein 20 ml Glas-Scintillationsgefäß eingewogen und ausreichend DCM wurde hinzugegeben, um eine 10% w/v Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde gemischt, gefolgt von der Zugabe von ausreichend Paclitaxel um die gewünschte finale Paclitaxelkonzentration zu erhalten. Die Lösung wurde gevortext, um das Paclitaxel zu lösen, eine Stunde ruhig stehen gelassen (um das Vorhandensein von Luftblasen zu verringern) und dann langsam in eine Form gegossen. Die Form wurde unter einer Abzugshaube über Nacht plaziert, wobei es dem DCM ermöglicht wurde, abzudampfen.
3. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FILMEN – GESPRÜHT
Eine ausreichende Menge an Polymer wurde direkt in ein 20 ml Glas-Scintillationsgefäß eingewogen und ausreichend DCM wurde hinzugefügt, um eine 2% w/v Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde gemischt, um das Polymer zu lösen. Unter der Verwendung einer automatischen Pipette wurde ein geeignetes Volumen (Minimum 5 ml) der 2% Polymerlösung in ein getrenntes 20 ml Glas-Scintillationsgefäß überführt. Ausreichend Paclitaxel wurde zu der Lösung hinzugefügt und durch Schütteln des zugedeckten Gefäßes gelöst. Zur Vorbereitung zum Sprühen wurde die Kappe des Gefäßes entfernt und der Schlauch des TLC-Atomizers in die Polymerlösung getaucht.
Der Stickstofftank wurde mit dem Gaseinlaß des Atomizers verbunden und der Druck wurde graduell erhöht, bis das Atomarisieren und Sprühen begann. Die Formen wurden unter der Verwendung von 5 Sekunden oszillierendem Sprühen mit einer 15 Sekunden Trocknungszeit zwischen dem Sprühen besprüht. Das Sprühen wurde fortgesetzt, bis eine geeignete Dicke an Polymer auf der Form aufgetragen war.
BEISPIEL 26
MIT THERAPEUTISCHEN MITTELN BELADENE POLYMERFILME, ZUSAMMENGESETZT AUS ETHYLENVINYLACETAT UND EINEM OBERFLÄCHENAKTIVEN STOFF
Innerhalb dieses Beispiels wurden zwei Typen von Filmen untersucht: reine EVA Filme, die mit Paclitaxel beladen waren und EVA/oberflächenaktiver Stoff Mischfilme, die mit Paclitaxel beladen waren.
Die oberflächenaktiven Stoffe, die untersucht wurden, sind zwei hydrophobe oberflächenaktive Stoffe (Span 80 und Pluronic L101) und ein hydrophiler oberflächenaktiver Stoff (Pluronic F127). Die Pluronic oberflächenaktiven Stoffe waren ihrerseits Polymere, was eine attraktive Eigenschaft ist, weil diese mit EVA gemischt werden können, um verschiedene Wirkstoff-Zuführungseigenschaften optimieren zu können. Span 80 ist ein kleineres Molekül, das in der Polymermatrix dispergiert und keine Gemische bildet.
Oberflächenaktive Stoffe waren bei der Modulation der Freisetzungsraten von Paclitaxel aus den Filmen und der Optimierung von bestimmten physikalischen Parametern der Filme brauchbar. Ein Aspekt der oberflächenaktiver Stoff-Gemischfilme, der darauf hinwies, daß Wirkstoffreisetzungsraten kontrolliert werden können, war die Möglichkeit, die Rate und das Ausmaß zu variieren in dem die Verbindung in Wasser quoll. Die Diffusion von Wasser in eine Polymer-Wirkstoffmatrix war für die Freisetzung von Wirkstoff aus dem Träger wichtig. 43C und 43D zeigen das Ausmaß der Quellung der Filme, während die Menge von oberflächenaktivem Stoff in dem Gemisch verändert wurde. Reine EVA Filme quollen in über 2 Monaten nicht in einem signifikanten Umfang. Jedoch war es möglich, das Ausmaß der Quellung der Verbindung durch Erhöhung der Menge von dem zu dem EVA zugegebenen oberflächenaktiven Mittel zu erhöhen, und durch die Erhöhung der Hydrophilizität nahm die Quellung zu.
Die Ergebnisse der Experimente mit diesen Filmen sind unten in 43A–E gezeigt. Kurz gesagt, beschreibt 43A die Paclitaxelfreisetzung (in mg) über die Zeit aus reinen EVA Filmen. 43B zeigt den Prozentsatz von verbleibendem Wirkstoff für dieselben Filme. Wie aus diesen zwei Figuren gesehen werden kann, stiegen die Wirkstoffreisetzungsraten an, während die Paclitaxelbeladung zunahm (d. h. Prozentsatz von Paclitaxel pro Gewicht nahm zu), was die erwartete Konzentrationsabhängigkeit deutlich machte. Während die Paclitaxelbeladung zunahm, nahm der Prozentsatz von in dem Film verbleibendem Paclitaxel ebenfalls zu, was darauf hindeutete, daß eine höhere Beladung für Langzeit-Freisetzungsformulierungen attraktiver sein kann.
Die physikalische Stärke und Elastizität der Filme wurde untersucht und ist in 43E dargestellt. Kurz gesagt, zeigt die 43E Dehnungs-/Spannungskurven für reine EVA- und EVA/oberflächenaktiver Stoff-Mischfilme. Diese groben Dehnungsmessungen zeigten, daß die Elastizität der Filme durch die Zugabe von Pluronic F127 zunahm und daß die Zugfestigkeit (Dehnung bei Bruch) in einer konzentrationsabhängigen Weise mit der Zugabe von Pluronic F127 zunahm. Elastizität und Stärke sind wichtige Überlegungen bei der Konstruktion eines Film, der für bestimmte klinische Anwendungen bearbeitet werden muß, ohne permanente Deformationen der Verbindung zu verursachen.
Die oben genannten Daten zeigen die Fähigkeit von bestimmten oberflächenaktiven Zusatzstoffen, die Wirkstoffreisetzungsraten zu kontrollieren und die physikalischen Eigenschaften des Vehikels zu verändern.
BEISPIEL 27
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON NANOSPRAY
Nanospray ist eine Suspension von kleinen Mikrosphären in Kochsalzlösung. Wenn die Mikrosphären sehr klein sind (d. h. unter 1 μm im Durchmesser) bilden sie ein Kolloid, so daß sich die Suspension unter Schwerkraft nicht absetzen wird. Wie unten genauer beschrieben, kann eine Suspension von 0,1 μm bis 1 μm Mikropartikeln hergestellt werden, die geeignet für Aerosol-Aufbringung auf Gewebe direkt zum Zeitpunkt der Chirurgie (z. B. für vaskulären Adhäsionen), via laproskopische Intervention oder durch ein fingergepumptes Aerosol (z. B. um topisch verabreicht zu werden) ist. Ausrüstung und Materialien, die verwendet wurden um Nanospray herzustellen, schließen ein 200 ml wasserumspültes Becherglas (Kimax oder Pyrex), ein Haake zirkulierendes Wasserbad, ein Überkopfrührgerät und einen Controller mit 2 inch Durchmesser (4 Klingen, Propellertyp rostfreier Stahlrührer; Fisher brand), einen 500 ml Becherglas, ein Heizplatten/Rührer (Corning brand), 4 × 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen (Nalgene), Glas-Scintillationsgefäße mit Plastik Insert Kappen, eine Tischzentrifuge (Beckmann), eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge – Bodenmodell (JS 21 Beckmann), eine Mettler-analytische-Waage (AJ 100, 0,1 mg), eine Mettler-digitale-Toplader-Waage (AE 163, 0,01 mg), eine automatische Pipette (Gilson), sterile Pipettenspitzen, pumpenangetriebenes Aerosol (Pfeiffer Pharmaceuticals) 20 ml, eine Abzugshaube, PCL (Mol. Gew. 10.000 bis 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania USA), "gewaschenes" (siehe vorher) EVA, PLA (Mol. Gew. 15.000 bis 25.000; Polysciences), Polyvinylalkohol ("PVA" – Mol. Gew. 124.000 bis 186.000; 99% hydrolysiert; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI USA), DCM oder "Methylenchlorid"; HPLC Grad Fisher Scientific), destilliertes Wasser und sterile Kochsalzlösung (Becton and Dickenson oder äquivalent) ein.
1. HERSTELLUNG VON 5% (W/V) POLYMERLÖSUNGEN
Abhängig von den hergestellten Polymerlösungen wurde das Folgende direkt in ein 20 ml Glas-Scintillationsgefäß eingewogen: 1,00 g PCL oder PLA oder 0,50 g sowohl PLA und gewaschenes EVA. Unter der Verwendung eines Meßzylinders, wurde 20 ml DCM hinzugefügt und das Gefäß dicht verschlossen. Dem Gefäß wurde erlaubt, bei Raumtemperatur (25°C) zu stehen, bis alles Polymer gelöst war.
2. HERSTELLUNG VON 3,5% (W/V) VORRATSLÖSUNG VON PVA
Die Lösung wurde durch Befolgen der unten angegebenen Prozedur hergestellt oder durch Verdünnung der 5% (w/v) PVA Vorratslösung, die zur Herstellung von Mikrosphären (siehe Beispiel 28) hergestellt wurde. Kurz gesagt, wurden 17,5 g PVA direkt in einen 600 ml Becherglas eingewogen und 500 ml destilliertes Wasser hinzugefigt. Das Becherglas wurde abgedeckt und in ein 2000 ml Becherglas plaziert, das 300 ml Wasser enthielt. Das PVA wurde bei 300 U/min. bei 85°C bis zum vollständigen Lösen gerührt.
3. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON NANOSPRAY
Kurz gesagt, wurden 100 ml der 3,5% PVA-Lösung in den 200 ml wasserumspülten Becherglas in einem angeschlossenen Haake-Wasserbad plaziert. Die Inhalte des Becherglases wurden bei 3000 U/min. gerührt und 10 ml Polymerlösung (die verwendete Polymerlösung basierte auf dem Typ von Nanospray, das hergestellt wurde) wurde in das rührende PVA über einen Zeitraum von 2 Minuten unter der Verwendung einer 5 ml automatischen Pipette eingetropft. Nach 3 Minuten wurde die Rührgeschwindigkeit auf 2500 U/min. (+/– 200 U/min.) für 2,5 Stunden eingestellt. Nach 2,5 Stunden wurde die Rührklinge aus der Nanospraypräparation entfernt und mit 10 ml destilliertem Wasser gespült, wobei es der Waschlösung erlaubt wurde, in die Nanospraypräparation hineinzufließen.
Die Mikrosphären-Präparation wurde in ein 500 ml Becherglas eingegossen. Das umspülte Wasserbad wurde mit 70 ml destilliertem Wasser gewaschen, wobei es der 70 ml Waschlösung erlaubt wurde, sich mit der Mikrosphärenpräparation zu vereinigen. Die 180 ml Mikrosphärenpräparation wurde mit einem Glasstab gerührt und gleichmäßig in vier Polypropylen 50 ml Zentrifugenröhrchen eingegossen, die bei 10.000 g (+/– 1000 g) für 10 Minuten zentrifugiert wurden. Die PVA-Lösung wurde von jedem Mikrosphärenpellet abgegossen und entsorgt. Destilliertes Wasser (5 ml) wurde zu jedem Zentrifugenröhrchen hinzugefügt und gevortext. Die vier Mikrosphärensuspensionen wurden in ein Zentrifugenröhrchen unter der Verwendung von 20 ml destilliertem Wasser vereinigt und für 10 Minuten bei 10.000 g (+/– 1000 g) zentrifugiert.
Der Überstand wurde von dem Mikrosphärenpellet abgetrennt und 40 ml destilliertes Wasser wurde hinzugefügt und die Mikrosphärenpräparation gevortext (dieses Verfahren wurde 3 × wiederholt). Die Mikrosphärenpräparation wurde dann in ein vorgewogenes Glas-Scintillationsgefäß überführt.
Das Gefäß wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur (25°C) stehen gelassen, um es den 2 μm und 3 μm Durchmesser Mikrosphären zu erlauben, sich unter Schwerkraft abzusetzen. Nach einer Stunde, wurden die oberen 9 ml Suspension abgegossen, in ein steriles bedeckeltes 50 ml Zentrifugengefäß plaziert und bei 10.000 g (+/– 1000 g) für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet wurde zum Zentrifugieren der Suspension bei 10.000 g (+/– 1000 g) für 10 Minuten in 20 ml steriler Kochsalzlösung resuspendiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet wurde in steriler Kochsalzlösung resuspendiert. Die Menge Kochsalzlösung, die verwendet wurde, war abhängig von der final benötigten Suspensionskonzentration (gewöhnlicherweise 10% w/v). Die Nanospraysuspension wurde zu dem Aerosol hinzugefügt.
BEISPIEL 28
HERSTELLUNG VON MIKROSPHÄREN
Die zur Herstellung von Mikrosphären verwendete Ausrüstung schloß ein: 200 ml wasserumspültes Becherglas (Kimax oder Pyrex), Haake zirkulierendes Wasserbad, Überkopf-Rührgerät und Controller mit 2 inch Durchmesser (4 Klingen, Propellertyp rostfreier Stahlrührer – Fisher brand), 500 ml Becherglas, heiße Platte/Rührer (Corning brand), 4 × 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen (Nalgene), Glas-Scintillationsgefäße mit Plastik-Insert-Deckeln, Tischzentrifuge (GPR Beckman), Hochgeschwindigkeitszentrifuge- Bodenmodell (JS 21 Beckman), Mettler-analytische-Waage (AJ 100, 0,1 mg), Mettler-digitale-Toplader-Waage (AE 163, 0,01 mg), automatische Pipette (Gilson). Reagenzien schlossen PCL (Mol. Gew. 10.000 bis 20.000; Polysciences, Warrington Pennsylvania, USA), "gewaschenes" (siehe späteres Verfahren das "Waschen") EVA, PLA (Mol. Gew. 15000 bis 25000; Polysciences), Polyvinylalkohol ("PVA" – Mol. Gew. 124.000 bis 186.000; 99% hydrolysiert; Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, USA), DCM oder "Methylenchlorid"; HPLC-Grad Fisher scientific und destilliertes Wasser ein.
A. Herstellung von 5% (w/v) Polymerlösungen
DCL (1,00 g) oder PLA, oder 0,50 g sowohl PLA und gewaschenem EVA wurden direkt in ein 20 ml Glas-Scintillationsgefäß eingewogen. Zwanzig Millimeter DCM wurden dann hinzugefügt. Das Gefäß wurde zugedeckelt und bei Raumtemperatur (25°C) für eine Stunde gelagert (gelegentliches Schütteln kann verwendet werden) oder bis alles Polymer gelöst wurde. Die Lösung kann bei Raumtemperatur für mindestens zwei Wochen gelagert werden.
B. Herstellung von 5% (w/v) Vorratslösung PVA
Fünfundzwanzig Gramm PVA wurden direkt in einen 600 ml Becherglas eingewogen und 500 ml destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, zusammen mit einem 3 inch Teflon beschichteten Rührfischchen. Das Becherglas wurde mit Glas abgedeckt, um Verdampfungsverluste zu verringern und in einen 2000 ml Becherglas, enthaltend 300 ml Wasser plaziert. Das PVA wurde bei 300 U/min. bei 85°C (Corning heiße Platte/Rührer) für 2 Stunden oder bis zum vollständigen Lösen gerührt. Die Lösung PVA wurde durch optische Kontrolle bestimmt; die Lösung sollte klar sein. Die Lösung wurde dann in einen Glas-Schraubdeckel-Vorratsbehälter transferiert und bei 4°C für maximal 2 Monate gelagert. Die Lösung, mußte jedoch vor der Verwendung oder Verdünnung auf Raumtemperatur erwärmt werden.
C. Verfahren zur Herstellung von Mikrosphären
Basierend auf der Größe der hergestellten Mikrosphären (siehe Tabelle 1) wurden 100 ml der PVA-Lösung (Konzentrationen sind in Tabelle 1 angegeben) in das 200 ml wasserumspülte Becherglas plaziert. Ein Haake zirkulierendes Wasserbad wurde mit dem Bottich verbunden und den Inhalten wurde es erlaubt, für 10 Minuten auf 27°C (+/– 1°C) zu equilibrieren. Basierend auf der Größe der hergestellten Mikrosphären (siehe Tabelle 1) wurde die Startgeschwindigkeit des Überkopf-Rührgerät eingestellt und die Klinge des Überkopf-Rührgerät bis zur halben Tiefe in die PVA-Lösung eingetaucht. Der Rührer wurde dann gestartet und 10 ml der Polymerlösung (die verwendete Polymerlösung basierte auf dem Typ von Mikrosphären, die hergestellt wurden) wurden dann in das gerührte PVA über eine Zeitdauer von 2 Minuten unter der Verwendung einer 5 ml automatischen Pipette eingetropft. Nach 3 Minuten wurde die Rührgeschwindigkeit eingestellt (siehe Tabelle 1) und die Lösung für weitere 2,5 Stunden gerührt. Die Rührklinge wurde dann aus der Mikrosphärenpräparation ent fernt und mit 10 ml von destilliertem Wasser gespült, so daß die Waschlösung in die Mikrosphärenpräparation ablief. Die Mikrosphärenpräparation wurde dann in ein 500 ml Becherglas gegossen und das umspülte Wasserbad mit 70 ml destillierten Wasser gewaschen, dem ebenfalls erlaubt wurde, in die Mikrosphärenpräparation abzulaufen. Die 180 ml Mikrosphärenpräparation wurde dann mit einem Glasstab gerührt und gleiche Mengen wurden in vier Polypropylen-50-ml-Zentrifugenröhrchen gegosssen. Die Röhrchen wurden dann zugedeckelt und für 10 Minuten (Kraft in Tabelle 1 angegeben) zentrifugiert. 45 ml der PVA-Lösung wurden von jedem Mikrosphärenpellet abgegossen.
Tabelle 1 PVA-Konzentrationen, Rührgeschwindigkeiten und Zentrifugationskraft-Anforderungen für jeden Durchmesserbereich von Mikrosphären
5 ml destilliertes Wasser wurden dann zu jedem Zentrifugenröhrchen hinzugegeben und gevortext, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Die vier Mikrosphärensuspensionen wurden dann in einem Zentrifugenröhrchen zusammen mit 20 ml destilliertem Wasser vereinigt und für weitere 10 Minuten zentrifugiert (Kraft in Tabelle 1 angegeben). Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male für eine Gesamtzahl von drei Waschungen wiederholt. Die Mikrosphären wurden dann ein letztes mal zentrifugiert und in 10 ml destilliertem Wasser resuspendiert.
Nach einem letzten Waschen wurde die Mikrosphärenpräparation in ein vorgewogenes Glas-Scintillationsgefäß transferiert. Das Gefäß wurde zugedeckelt und über Nacht bei Raumtemperatur (25°C) belassen, um es den Mikrosphären zu erlauben, sich unter Schwerkraft abzusetzen. Weil Mikrosphären, die in Größenbereiche von 0,1 μm bis 3 μm fallen, sich nicht unter Schwerkraft absetzen, wurden sie in den 10 ml Suspensionen zurückgelassen.
D. Trocknen von 10 μm bis 30 μm oder 30 μm bis 100 μm Durchmesser-Mikrosphären
Nachdem sich die Mikrosphären bei Raumtemperatur über Nacht abgesetzt hatten, wurde der Überstand von den sedimentierten Mikrosphären abgetrennt. Den Mikrosphären wurde es erlaubt, in dem nicht zugedeckelten Gefäß in einer Schublade für eine Zeit von einer Woche oder bis zur vollständigen Trocknung (Gefäß bei gleichbleibenden Gewicht) zu trocknen. Ein schnelleres Trocknen kann durch Stehenlassen des nicht zugedeckelten Gefäßes unter einem langsamen Strom von Stickstoffgas (Fluß ungefähr 10 ml/Minute) in der Abzugshaube erhalten werden. Wenn vollständig getrocknet (Gefäß bei konstantem Gewicht) wurde das Gefäß gewogen und zugedeckelt. Das markierte, zugedeckelte Gefäß wurde bei Raumtemperatur in einer Schublade gelagert. Mikrosphären wurden normalerweise nicht länger als 3 Monate gelagert.
E. Bestimmung der Konzentration 0,1 μm bis 3 μm Durchmesser Mikrosphärensuspension
Diese Größenbereiche von Mikrosphären setzten sich nicht durch Sedimentation ab, daher wurden sie in Suspensionen bei 4°C für ein Maximum von vier Wochen belassen. Um die Konzentration von Mikrosphären in den 10 ml Suspension zu bestimmen wurde eine 200 μl Probe der Suspension in ein 1,5 ml vorgewogenes Mikrofugengefäß pipettiert. Das Gefäß wurde dann bei 10000 g (Eppendorf Tischzentrifuge) zentrifugiert, der Überstand entfernt und es dem Röhrchen erlaubt, bei 50°C über Nacht zu trocknen. Das Gefäß wurde dann nochmals gewogen, um das Gewicht der getrockneten Mikrosphären innerhalb des Gefäßes zu bestimmen.
F. Herstellung von Paclitaxel-beladenen Mikrosphären
Um Paclitaxel enthaltene Mikrosphären herzustellen, wurde eine geeignete Menge von gewogenem Paclitaxel (basierend auf dem Prozentsatz von Paclitaxel, der eingekapselt werden sollte) direkt in einem 20 ml Glas-Scintillationsgefäß plaziert 10 ml einer ge eigneten Polymerlösung wurden dann zu dem Gefäß hinzugefügt, daß das Paclitaxel enthielt, welches dann gevortext wurde, bis sich das Paclitaxel löste.
Mikrosphären, die Paclitaxel enthielten, können dann im wesentlichen wie oben in Schritten (C) bis (E) beschrieben hergestellt werden.
BEISPIEL 29
MIT OBERFLÄCHENAKTIVEN STOFFEN BESCHICHTETE MIKROSPHÄREN
A. Materialien und Methoden
Mikrosphären wurden aus Poly (DL) Milchsäure (PLA), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycaprolacton (PCL) und 50 : 50 Ethylenvinylacetat (EVA) : PLA im wesentlichen wie oben beschrieben, hergestellt. Die Größe reichte von 10 bis 100 μm, mit einem mittleren Durchmesser von 45 μm.
Menschliches Blut wurde von gesunden Freiwilligen erhalten. Neutrophile (weiße Blutzellen) wurden aus dem Blut unter der Verwendung von Dextran-Sedimentation und Ficoll Hypaque Zentrifugationstechniken abgetrennt. Neutrophile wurden bei 5 Millionen Zellen pro ml in HBSS suspendiert.
Die Neutrophilen-Aktivierungslevel wurden durch die Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies bestimmt, wie durch Chemilumineszenz nachgewiesen wurde. Insbesondere wurde die Chemilumineszenz unter der Verwendung eines LKB Luminometers mit 1 μM Luminol-Enhancer bestimmt. Plasma-Vorbeschichtung (oder Opsonisierung) von Mikrosphären wurde durch suspendieren von 10 mg Mikrosphären in 0,5 ml Plasma und Schütteln bei 37°C für 30 Minuten durchgeführt.
Die Mikrosphären wurden dann in 1 ml HBSS gewaschen und das zentrifugierte Mikrosphärenpellet zu der Neutophilen-Suspension bei 37°C zum Zeitpunkt t = 0 hinzugefügt. Die Mikrosphären-Oberflächen wurden unter der Verwendung eines oberflächenaktiven Stoffes, genannt Pluronic F127 (BASF), modifiziert, indem 10 mg Mikrosphären in 0,5 ml 2% w/w Lösung von F127 in HBSS für 30 Minuten bei 37°C suspendiert wurden. Die Mikrosphären wurden dann zweimal in 1 ml HBSS gewaschen, bevor sie zu Neutrophilen oder zu Plasma zur weiteren Vorbeschichtung hinzugefügt wurden.
B. Ergebnisse
44 zeigt, daß die unbehandelten Mikrosphären Chemilumineszenz-Werte von weniger als 50 mV ergeben. Diese Werte stellen niedrigere Level von Neutrophilen-Aktivierung dar. Zum Vergleich, könnten entzündliche Mikrokristalle Werte von nahezu 1000 mV ergeben, lösliche chemische Aktivatoren könnten Werte von nahezu 5000 mV ergeben. Jedoch, wenn die Mikrosphären mit Plasma vorbeschichtet werden, werden alle Chemilumineszenz-Werte bis zum 100 bis 300 mV Bereich (44) verstärkt. Diese Level der Neutrophilen-Antwort oder Aktivierung können als mild entzündlich betrachtet werden. PMMA ergab die stärkste Antwort und könnte als am meisten entzündlich betrachtet werden. PLA und PCL wurden beide drei- bis viermal mehr bei der Aktivierung von Neutrophilen nach Plasma Vorbehandlung (oder Opsonisierung) wirksam, aber gibt es in dieser Hinsicht wenig Unterschied zwischen diesen beiden Polymeren. EVA : PLA wird wahrscheinlich nicht in Angionese-Formulierungen verwendet werden, da die Mikrosphären schwierig zu trocknen und in wässrigem Puffer zu resuspendieren sind. Dieser Effekt von Plasma wird Opsonisierung genannt und ergibt sich aus der Absorption von Antikörpern oder Komplementmolekülen auf der Oberfläche. Diese absorbierten Spezies interagieren mit Rezeptoren auf weißen Blutzellen und verursachen eine verstärkte Zellaktivierung.
45–48 beschreiben die Effekte des Plasma-Vorbeschichtens von jeweils PCL, PMMA, PLA und EVA : PLA, sowie den Effekt von Pluronic F127-Vorbeschichtung vor der Plasma-Vorbeschichtung von Mikrosphären. Diese Figuren zeigen alle denselben Effekt: (1) Plasma-Vorbeschichten verstärkt die Antwort; (2) Pluronic F127 Vorbeschichtung hat alleine keinen Effekt; (3) die verstärkte Neutrophilen-Antwort, die durch das Plasma-Vorbeschichten verursacht wird, kann stark durch Vorbeschichten der Mikrosphärenoberfläche mit 2% Pluronic F127 inhibiert werden.
Die Art der absorbierten Proteinspezies aus Plasma wurde ebenfalls durch Elektrophorese untersucht. Durch Verwendung dieses Verfahrens konnte gezeigt werden, daß die Vorbehandlung der Polymeroberfläche mit Pluronic F127 die Absorption von Antikörpern auf die Polymeroberfläche inhibierte.
Ähnlich zeigen 49–52 den Effekt von (jeweils) Vorbeschichten von PCL, PMMA, PLA oder EVA : PLA Mikrosphären mit entweder IgG (2 mg/ml) oder 2% Pluronic F127, dann IgG (2 mg/ml). Wie aus diesen Figuren gesehen werden kann, kann die verstärkte Antwort, die durch Vorbeschichtung der Mikrosphären mit IgG verursacht wird, durch Behandlung mit Pluronic F127 inhibiert werden.
Dieses Ergebnis zeigt, daß durch Vorbehandlung der Polymer-Oberfläche aller vier Typen von Mikrosphären mit Pluronic F127 die "entzündliche" Antwort von Neutophilen auf Mikrosphären inhibiert werden könnte.
BEISPIEL 30
EINKAPSELUNG VON THERAPEUTISCHEM MITTEL IN POLY(E-CAPROLACTON) MIKROSPHÄREN. INHIBIERUNG DER ANGIOGENESE DES CAM TESTS DURCH PACLITAXEL-BELADENE MIKROSPHÄREN
Dies Beispiel bestimmt das in vitro Freisetzungsratenprofil von Paclitaxel aus bioabbaubaren Mikrosphären aus Poly (ε-caprolacton) (PCL) und zeigt die in vivo anti-angiogenetische Aktivität von Paclitaxel, das aus diesen Mikrosphären freigesetzt wird, wenn diese auf den CAMen plaziert werden.
Reagenzien, die in diesen Experimenten verwendet wurden, schließen ein: PCL (Molekulargewicht 35.000–45.000; erworben von Polysciences (Warrington, PA)); DCM von Fisher Scientific Co., Kanada; Polyvinylalkohol (PVP) (Molekulargewicht 12.000–18.000, 99% hydrolysiert) von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) und Paclitaxel von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien und Reagenzien wie angeliefert verwendet. Destilliertes Wasser wird überall verwendet.
A. Präparation von Mikrosphären
Mikrosphären wurden im wesentlichen wie im Beispiel 28 beschrieben hergestellt, wobei das Lösemittel-Evaporationverfahren angewendet wurde. Kurz gesagt, wurden 5% w/w Paclitaxel-beladene Mikrosphären durch Lösen von 10 mg Paclitaxel und 190 mg PCL in 2 ml DCM, Hinzufügen zu 100 ml 1% PVP wässriger Lösung und rühren bei 1000 U/min. bei 25°C für 2 Stunden hergestellt. Die Suspension der Mikrosphären wurde bei 1000 × g für 10 Minuten (Beckman GPR) zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Mikrosphären dreimal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Mikrosphären wurden über Nacht Luft-getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert. Kontroll-Mikrosphären (Paclitaxel fehlte) wurden wie oben beschrieben hergestellt. Mikrosphären, die 1% und 2% Paclitaxel enthielten, wurden ebenfalls hergestellt. Die Mikrosphären wurden unter der Verwendung eines optischen Mikroskops mit einem Phasenmikrometer gemessen.
B. Einkapselungseffizienz
Ein bekanntes Gewicht von Wirkstoff-beladenen Mikrosphären (ungefähr 5 mg) wurde in 8 ml Acetonitril gelöst und 2 ml destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, um das Polymer zu fällen. Das Gemisch wurde bei 1000 g für 10 Minuten zentrifugiert und die Menge von eingekapseltem Paclitaxel wurde aus der Absorption des in einem UV-Spektrophotometer (Hewlett-Packard 8452A Diode Array Spektrophotometer) bei 232 nm gemessenen Überstands berechnet.
C. Wirkstoff-Freisetzungsstudien
Ungefähr 10 mg Paclitaxel-beladener Mikrosphären wurden in 20 ml 10 mM PBS (pH 7,4) in Schraubdeckelgefäßen suspendiert. Die Gefäße wurden Ende-über-Ende bei 37°C gemischt und zu bestimmten Zeitintervallen wurden 19,5 ml Überstand abgenommen (nachdem es den Mikrosphären erlaubt wurde, sich am Boden abzusetzen), durch einen 0,45 μm Membranfilter filtriert und zur Paclitaxelanalyse aufbewahrt. Ein gleiches Volumen von PBS wurde in jedem Gefäß ersetzt, um die Sinkbedingungen während der Studie beizubehalten. Die Filtrate wurde mit 3 × 1 ml DCM extrahiert, die DCM Extrakte bis zum Trocknen unter einem Stickstoffstrom evaporiert, in 1 ml Acetonitril gelöst und durch HPLC analysiert, wobei eine mobile Phase von Wasser: Methanol : Acetonitril (37 : 5 : 58) bei einer Flußrate von 1 ml/Minute (Beckman Isocratic Pump), eine C8 reverse Phase-Säule (Beckman) und UV Nachweis (Shimadzu SPD A) bei 232 nm verwendet wurden.
D. CAM Studien
Befruchtete Haushuhnembryos wurden für 4 Tage vor der schalenlosen Kultur inkubiert. An Tag 6 der Inkubation wurden 1 mg Aliquots 5% Paclitaxel-beladenen oder Kontroll-(Paclitaxel-freien) Mikrosphären direkt auf die CAM-Oberfläche plaziert. Nach einer 2-tägigen Exponierung wurde die Vaskulatur unter der Verwendung eines mit einer Videokamera verbundenen Stereomikroskops untersucht; die Videosignale wurden dann auf einem Computer dargestellt und videogedruckt.
E. Scanning-Elektronenmikroskopie
Mikrosphären wurden auf Probenhaltern plaziert, mit Gold spritzbeschichtet und dann in einem Philips 501B SEM plaziert, das bei 15 kV betrieben wurde.
F. Ergebnisse
Der Größenbereich für die Mikrosphärenproben war zwischen 30–100 μm, obwohl es in allen Paclitaxel-beladenen oder Kontroll-Mikrosphärenchargen Hinweise auf einige Mikrosphären gab, die aus diesem Bereich herausfielen. Die Effizienz der Beladung von PCL Mikrosphären mit Paclitaxel war für alle untersuchten Wirkstoffbeladungen immer größer als 95%. Scanning Elektronenmikroskopie zeigte, daß die Mikrosphären alle sphärisch waren und viele eine rauhe oder löchrige Oberflächen-Morphologie zeigten. Es gab keine Hinweise auf festen Wirkstoff auf der Oberfläche der Mikrosphären.
Die Zeitverläufe der Paclitaxelfreisetzung von 1%, 2% und 5% beladenen PCL Mikrosphären sind in 53A gezeigt. Die Freisetzungsratenprofile waren biphasisch. Es konnte eine anfängliche schnelle Freisetzung von Paclitaxel oder "hurst Phase" bei allen Wirkstoffbeladungen gefunden werden. Die hurst Phase trat über 1–2 Tage bei 1% und 2% Paclitaxelbeladung und über 3–4 Tagen für 5% beladene Mikrosphären auf. Die anfängliche Phase der schnellen Freisetzung wurde von einer Phase von wesentlich langsamerer Wirkstoffreisetzung gefolgt. Bei Mikrosphären, die 1% oder 2% Paclitaxel enthielten, konnte keine weitere Wirkstoffreisetzung nach 21 Tagen gefunden werden. Bei 5% Paclitaxelbeladung hatten die Mikrosphären ungefähr 20% des gesamten Wirkstoffgehalts nach 21 Tagen freigesetzt.
53B zeigt CAMen, die mit Kontroll-PCL-Mikrosphären behandelt wurden und 53C zeigt Behandlung mit 5% Paclitaxel-beladenen Mikrosphären. Die CAM mit den Kontroll-Mikrosphären zeigte einen normalen kapillaren Netzwerkaufbau. Die mit Paclitaxel-PCL Mikrosphären behandelte CAM zeigte sichtliche vaskuläre Regression und Zonen, die frei von kapillarem Netzwerk waren.
G. Diskussion
Das Lösemittel-Evaporationsverfahren der Paclitaxel-beladenen Mikrosphären produzierte sehr hohe Paclitaxel-Einkapselungseffizienzen von ungefähr 95–100%. Dies erfolgte aufgrund der schlechten Wasserlöslichkeit von Paclitaxel und seiner hydrophoben Natur, die eine Trennung in der organischen Lösemittelphase bevorzugte, die das Polymer enthält.
Das biphasische Freisetzungsprofil für Paclitaxel war typisch für das Freisetzungsmuster von vielen Wirkstoffen aus bioabbaubaren Polymermatrices. Poly(ε-caprolacton) ist ein aliphatisches Polyester, daß durch Hydrolyse unter physiologischen Bedingungen abgebaut werden kann und nicht giftig und gewebekompatibel ist. Der Abbau von PCL ist signifikant langsamer, als der von den extensiv untersuchten Polymeren und Copolymeren aus Milch- und Glycolsäuren und ist daher für den Ausbau von Langzeit-Wirkstoffreisetzungssystemen geeignet. Die anfängliche schnelle oder burst Phase der Paclitaxelfreisetzung wurde als auf Diffusionsfreisetzung des Wirkstoffs aus der Oberflächenregion der Mikrosphären (nahe der Oberfläche der Mikrosphäre) beruhend betrachtet. Die Freisetzung von Paclitaxel in der zweiten (langsameren) Phase des Freisetzungsprofiles erfolgte wahrscheinlich nicht aufgrund von Abbau oder Erosion von PCL, weil Studien gezeigt haben, daß unter in vitro Bedingungen in Wasser ein signifikanter Gewichtsverlust oder Oberflächenerosion von PCL über eine 7,5-wöchige Zeitdauer hinweg gefunden wurde. Die langsamere Phase der Paclitaxelfreisetzung erfolgte wahrscheinlich aufgrund von Lösung des Wirkstoffs innerhalb flüssigkeitsgefüllter Poren in der Polymermatrix und Diffusion durch die Poren. Die höhere Freisetzungsrate bei höherer Paclitaxelbeladung war wahrscheinlich ein Ergebnis eines ausgedehnteren Porennetzwerks innerhalb der Polymermatrix.
Paclitaxelmikrosphären mit 5% Beladung konnten als ausreichend Wirkstofffreisetzung gezeigt werden, um eine extensive Inhibierung der Angiogenese zu ergeben, wenn sie auf dem CAM plaziert wurden. Die Inhibierung von Blutgefäßwachstum führte zu einer avaskulären Zone, wie in 53C gezeigt ist.
BEISPIEL 31
HERSTELLUNG VON PLGA MIKROSPHÄREN
Mikrosphären wurden aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymeren (PLGA) hergestellt.
A. Verfahren
Mikrosphären wurden in den Größenbereichen 0,5 bis 10 μm, 10–20 μm und 30–100 μm unter der Verwendung von Standardverfahren (Polymer wurde in Dichlormethan gelöst und in einer Polyvinylalkohollösung bei Rühren emulgiert, wie vorher bei den PCL oder PDLLA Mikrosphären-Herstellungsverfahren beschrieben) hergestellt. Verschiede Verhältnisse von PLLA zu GA wurden als die Polymere mit verschiedenen Molekulargewichten (angegeben als Intrinsische Viskosität (LV.)) verwendet.
B. Ergebnis
Mikrosphären wurden aus den folgenden Ausgangspolymeren erfolgreich hergestellt:
Paclitaxel bei 10% oder 20% Beladungen wurde erfolgreich in all diese Mikrosphären inkorporiert. Beispiele der Größenverteilungen für ein Ausgangspolymer (85 : 15, IV = 0,56) sind in den 54–57 angegeben. Paclitaxel-Freisetzungsexperimente wurden unter der Verwendung von Mikrosphären von verschiedenen Größen und verschiedenen Zusammensetzungen durchgeführt. Die Freisetzungsraten sind in den 58–61 gezeigt.
BEISPIEL 32
EINKAPSELUNG VON PACLITAXEL IN NYLONMIKROKAPSELN
Therapeutische Mittel können auch in eine große Vielzahl von Trägern eingekapselt werden, die zu einer ausgewählten Form oder Vorrichtung geformt werden können. Zum Beispiel, wie im Folgenden genau beschrieben, kann Paclitaxel in Nylonmikrokapseln inkorporiert werden, die in künstliche Herzklappen, vaskuläre Pfropfen, chirurgische Siebe oder Nahtmaterial formuliert werden können.
A. Herstellung von Paclitaxel-beladenen Mikrokapseln
Paclitaxel wurde in Nylonmikrokapseln unter der Verwendung der Interface-Polymerisationstechniken eingekapselt. Kurz gesagt, wurden 100 mg Paclitaxel und 100 mg Pluronic F-127 in 1 ml DCM gelöst und 0,4 ml (ungefähr 500 mg) Adipoylchlorid (ADC) wurden hinzugefügt. Diese Lösung wurde in 2% PVA Lösung unter der Verwendung des Polytronhomogenisators (Stufe 1) für 15 Sekunden homogenisiert. Eine Lösung von 1,6-Hexandiamin (HMD) in 5 ml destilliertem Wasser wurde tropfenweise während der Homogenisierung hinzugefügt. Das Gemisch wurde nach der Zugabe der HMD Lösung für weitere 10 Sekunden homogenisiert. Das Gemisch wurde in ein Becherglas transferiert und mit einem Magnetrührer für 3 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, gesammelt und in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert.
B. Einkapselungseffizienz/Paclitaxel-Beladung
Ungefähr 0,5 ml der Suspension wurden filtriert und die Mikrosphären wurden getrocknet. Ungefähr 2,5 ml der Mikrokapseln wurden gewogen und in 10 ml Acetonitril für 24 Stunden suspendiert. Der Überstand wurde auf Paclitaxel analysiert und das Ergebnis wurde als ein Prozentsatz an Paclitaxel ausgedrückt. Vorläufige Untersuchungen haben gezeigt, daß Paclitaxel in Nylonmikrokapseln in einer hohen Beladung (bis zu 60%) und mit einer hohen Einkapselungseffizienz (größer als 80%) eingekapselt werden konnte.
C. Paclitaxel-Freisetzungsstudien
Ungefähr 2,5 mg der Paclitaxel-Nylonmikrosphären wurden in 50 ml Wasser, enthaltend 1 M sowohl von Natriumchlorid und Harnstoff, suspendiert und periodisch analysiert. Die Freisetzung von Paclitaxel aus der Mikrokapsel erfolgte schnell, wobei mehr als 95% des Wirkstoffs nach 72 Stunden freigesetzt wurden (62).
BEISPIEL 33
BIOADHÄSIVE MIKROSPHÄREN
A. Herstellung von bioadhäsiven Mikrosphären
Mikrosphären wurden aus 100k g/mol PLLA mit einem Partikeldurchmesserbereich von 10–60 μm hergestellt. Die Mikrosphären wurden in einer Natriumhydroxidlösung inkubiert, um Carboxylsäuregruppen auf der Oberfläche durch Hydrolyse des Polyesters herzustellen. Die Reaktion wurde in Bezug auf die Natriumhydroxid-Konzentration und Inkubationszeit durch Messung der Oberflächenladung gekennzeichnet. Die Reaktion erreichte ihren Abschluß nach 45 Minuten Inkubation in 0,1 M Natriumhydroxid. Im Anschluß an die Ausgangsbehandlung waren die Mikrosphären mit Dimethylaminoproylcarbodümid (DEC), einem kreuzvernetzenden Agens, beschichtet, indem die Mikrosphären in einer alkoholischen Lösung DEC suspendiert wurden und es dem Gemisch erlaubt wurde, in ein dispersibles Puder zu trocknen. Das Gewichtsverhältnis von Mikrosphären zu DEC war 9 : 1. Nachdem die Mikrosphären getrocknet wurden, wurden sie unter Rühren in einer 2% w/v Lösung Poly(Acrylsäure) (PAA) dispergiert und es dem DEC erlaubt, mit PAA zu reagieren, um ein wasserunlösliches Netzwerk von kreuzvernetztem PAA auf den Mikrosphärenoberflächen zu ergeben. Scanning Elektronenmikroskopie wurde verwendet, um die Anwesenheit von PAA auf der Oberfläche der Mikrosphären zu bestätigen.
Differenzielle Scanning Kalorimetrie der Mikrosphären vor und nach der Behandlung mit Base ergaben, daß keine Veränderungen in den thermalen Eigenschaften der Rohmasse (Tg, Schmelzen und Grad der Kristallinität) mittels SEM beobachtet wurden.
B. In vitro Paclitaxel-Freisetzungsraten
Paclitaxel-beladene Mikrosphären (10% und 30% w/w Beladungen) mit demselben Partikeldurchmesser-Größenbereich und in vitro Freisetzungsprofile für 10 Tage Freisetzung in PBS wurden hergestellt. Die Freisetzung war proportional zur Wirkstoffbeladung, wobei 400 μg von Paclitaxel aus 5 mg von 30% beladenen Mikrosphären in 10 Tagen freigesetzt wurden und 150 μg von 10% beladenen Mikrosphären in derselben Zeit freigesetzt wurden. Die Effizienz der Einkapselung war ungefähr 80%. Die Paclitaxel-beladenen Mikrosphären wurden für 45 Minuten in 0,1 M Natriumhydroxid inkubiert und das Zeta-Potential vor und nach Inkubation in Natriumhydroxid gemes sen. Die Oberflächenladung von Paclitaxel-beladenen Mikrosphären war sowohl vor und nach der Behandlung mit Base niedriger, als bei Mikrosphären mit keinem Paclitaxel.
C. Herstellung und in vitro Evaluierung von PLLA, beschichtet mit entweder Poly-L oder Fibronectin
PLLA Mikrosphären wurden hergestellt, die 1% Sudanschwarz (um die Mikrosphären zu färben) enthielten. Diese Sphären wurden in einer 2% (w/Volumen) Lösung von entweder Poly-Lysin (Sigma chemicals – Hydrobromell Form) oder Fibronectin (Sigma) für 10 Minuten suspendiert. Die Mikrosphären wurden einmal im Puffer gewaschen und auf die innere Oberfläche von frisch präparierten Blasen von Ratten plaziert. Die Blase wurden für 10 Minuten stehen gelassen und dann dreimal in Puffer gewaschen. Restliche (gebundene) Mikrosphäxen waren auf der Blasenwand nach den Prozeß sowohl bei Fibronectin- und Poly-L-Lysin beschichteten Mikrosphären vorhanden, was daher zeigte, daß eine Bioadhäsion stattgefunden hatte (63A und 63B).
BEISPIEL 34 (Vergleichsbeispiel)
EVALUIERUNG VON CHRONISCHER ABSTOSSUNG IN EINEM TIERMODELL
Eine beschleunigte Form von Arteriosklerose entwickelt sich bei der Mehrheit von Herztransplantatempfängern und begrenzt ein Langzeittransplantat-Überleben. Das Lewis-F344 heterotopische Rattenherztransplantationsmodell chronischer Abstoßung ist ein brauchbares experimentelles Modell, weil es artheriosklerotische Läsionen in Phasen, in Medium und Langzeit-Überlebende Allotransplantate produziert. Die Vorteile des Lewis-F344 Modells sind, daß: (i) das Auftreten und die Schwere von artheriosklerotischen Läsionen bei langüberlebenden Transplantaten ziemlich hoch ist; und (ii) eine entzündliche Phase bei der Entwicklung von Läsionen leicht erkannt wird, weil dieses System keine Immunsuppressionen benötigt.
Erwachsene männliche Lewis Ratten dienen als Spender und F-344 Ratten als Empfänger. 20 heterotopische abdominale Herzallotransplantate wurden durch Anbringen eines langen abdominalen Einschnitts entlang der Mittellinie in betäubten Empfängern, um die Aorta und die hintere Vena Cava freizulegen, transplantiert. Die zwei Gefäße werden voneinander und dem umgebenden Bindegewebe getrennt und kleine Klammern auf den Gefäßen angebracht. Längseinschnitte (2 bis 3 mm) wurden an der Stelle der Anastomosis in jedes Gefäß angebracht.
Das Abdomen von betäubten Spenderratten wird zur Injektion von 300 Units wässrigem Heparin in die hintere Vena Cava geöffnet. Der Brustraum wird geöffnet, um das Herz freizulegen. Die Venae Cavae werden ligiert, gefolgt durch die Transektion der absteigenden Aorta und hauptpulmonären Arterie, wobei Gefäßansätze von 2–3 mm Länge an das Herz angeheftet verbleiben. Die Venae Cavae distal zu den Ligaturen werden getrennt und die Ligaturen um die Masse der übrigen Atrium- und Pulmonar-Venen herum plaziert. Die Gefäße auf der Lungenseite der Ligaturen werden geteilt und das Herz wird entfernt.
Das Spenderherz wird in die abdominale Höhlung des Empfängers plaziert und die Aortae werden an der Stelle des Einschnitts des Empfängergefäßes zusammengenäht. Ähnlich wird die pulmonare Arterie mit der Einschnittstelle der inferioren Vena Cava auf ähnliche Weise verbunden. Die Gefäßklemmen werden entfernt (proximale Vena Cava, distale Cava und Aorta, und proximale Aorta) um Blutung aus den Nadellöchern zu minimieren.
Nach der Transplantation wird Paclitaxel (33%) in Polycaprolacton (PCL) Paste (n = 10) oder PCL Paste allein (n = 10) durch das Epicardium über eine Länge der äußeren Oberfläche einer Koronalarterie in 10 Ratten injiziert, so daß der in das Myocardium eingebettete Arterienbereich unbehandelt verbleibt.
Alle Empfänger erhalten eine einzelne intramuskuläre Injektion von Penicillin G (100000 Units) zum Zeitpunkt der Transplantation. Die Allotransplantate werden durch tägliches Abtasten verfolgt und ihre Funktion auf einer Skala von 1 bis 4 bewertet, wobei 4 einen normalen Herzschlag und 0 das Fehlen von mechanischer Aktivität darstellen. Fünf Ratten jeder Gruppe werden nach 14 Tagen getötet und die letzten fünf nach 28 Tagen. Die Ratten werden auf Gewichtsverlust und andere Anzeichen von systemischer Erkrankung beobachtet. Nach 14 oder 28 Tagen werden die Tiere betäubt und das Herz in der Weise des anfänglichen Experiments freigelegt. Beschichtete und unbeschichtete Koronalarterien werden isoliert, in 10% gepuffertem Formaldehyd fixiert und auf Histologie untersucht.
Das anfängliche Experiment kann zur Verwendung von Paclitaxel/EVA Film oder beschichteten Stents in den Koronalarterien im Anschluß an die Transplantation modifiziert werden. Der EVA Film wird auf die extraluminale Oberfläche der Koronalarterien auf ähnliche Weise wie oben aufgebracht, während der beschichtete Stent intraluminal plaziert wird.
Zusätzlich können diese Untersuchungen weiter ausgedehnt werden, um andere Organtransplantate sowie Pfropftransplantate (z. B. Venen, Haut) einzuschließen.
BEISPIEL 35 (Vergleichsbeispiel)
EVALUIERUNG VON PACLITAXEL UND ANDEREN MICROTUBULI STABILISIERENDEN MITTELN ZUR BEHANDLUNG VON NASALEN POLYPEN
Epithelzellkulturen und/oder Kulturen von nasalem Polypengewebe werden verwendet, um die Effizienz von Formulierungen, die Paclitaxel oder andere Mittel enthielten, bei der Behandlung von nasalen Polypen zu ermitteln. Dieser Ansatz basiert auf der Annahme, daß Epithelzellen Cytokine freisetzen und zu der bei nasalen Polypen sowie in Rhinitis und Asthma nachgewiesenen chronischen Entzündung beitragen, und daß eine verlängerte Freisetzungsmedikation Eosinophilia vorbeugen wird und die Cytokin-Genexpression inhibiert.
Paclitaxelformulierungen, die Lösungen enthielten (die Verwendung von Cyclodextrin) oder Suspensionen, die Paclitaxel eingekapselt in mucoadhesive Polymere enthielten, zur Verwendung als nasale Sprays und/oder mikro-eingekapseltes Paclitaxel in mucoadhesiven Polymeren wurden als Insufflationen verwendet. Diese Formulierungen werden in den unten genauer angegebenen Untersuchungen verwendet.
A. Effekt von Paclitacel in vitro
Gewebebehandlung – Normale nasale Mucosaproben (NM) werden von Patienten mit keinem klinischen Hinweis auf Rhinitis und negativem Haut-Strich Stichtest während nasaler rekonstruktiver Chirurgie erhalten. Nasale Polypen (NP) Proben wurden von Patienten mit positivem und negativem Haut-Strich Stichtest erhalten, die nasaler Polypenectomie unterzogen werden. Die nasalen Proben wurden in Ham's F 12 Medium, ergänzt mit 100 Ul/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 μg/ml Amphotericin B plaziert und sofort ins Labor transportiert.
Epithelzellkultur – Nasale Epithelzellen aus NM und NP werden durch Proteaseverdau wie folgt isoliert. Die Gewebeproben werden 2–3 mal mit Ham's F 12, ergänzt mit 100 UUmI Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 μg/ml Amphotericin B, gespült und dann in einer 0,1% Proteasetyp XIV in Ham's F12 bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach Inkubation wird 10% FBS hinzugefügt, um die Proteaseaktivität zu neutralisieren und die Ephitelzellen werden durch sanftes Schütteln abgelöst. Die Zellsuspensionen werden durch ein 60 mesh Zellteilungssieb filtriert und bei 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Zellpellet wird dann in hormonal-definiertem Ham's F12 Kulturmedium (Ham's HD), enthaltend die folgenden Reagenzien resuspendiert: 100 Ul/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 μg/ml Amphotericin B, 150 μg/ml Glutamin, 5 μg/ml Transferin, 5 μg/ml Insulin, 25 ng/ml Epidermalwachstumsfaktor, 15 μg/ml Endothelzellwachstums-Supplement, 200 pM Trijodthryonin und 100 nM Hydrokortison. Zellsuspensionen (10⁵ Zellen/Napf) werden dann in Collagen beschichteten Näpfen in 2 ml Ham's HD plaziert und bei 37°C in einer 5% CO₂ befeuchteten Atmosphäre kultiviert. Das Kulturmedium wird an Tag gewechselt und anschließend jeden weiteren Tag. Die Monolayer Zellkonfluenz ist nach 6–10 Tagen Kultur erreicht.
Menschliches Epithel konditioniertes Medium (HECM) Herstellung – Wenn die Epithelzellkulturen die Konfluenz erreichten, wurde das Ham's HD durch RPMI 1640 Medium (Irvin, Schottland) ersetzt, das mit 100 Ul/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 μg/ml Amphotericin B, 150 μg/ml Glutamin und 25 mM Hepespuffer (RPMI 10%) ergänzt war. HECM, das nach 48 Stunden Inkubation mit RPMI (10%) erzeugt wurde, wird von Kulturen geerntet, bei 400 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, durch Filtration durch 0,22 μm Filter sterilisiert und bei – 70°C bis zur Verwendung gelagert.
Überleben von Eosinophilen und Effekt von Paclitaxel – Eosinophile werden aus dem peripheren Blut isoliert und der Effekt von HECM von sowohl NM und NP auf das Überleben der Eosinophilen wird auf zwei verschiedene Arten bestimmt: Zeit-Verlauf und Dosis-Antwortanalysen. Bei Zeit-Verlauf Experimenten werden die Eosinophilen bei einer Konzentration von ungefähr 250.000/ml in sechs Napf-Gewebekulturen mit oder ohne (negative Kontrolle) 50% HECM inkubiert und ein Überlebensindex an Tagen 2, 4, 6 und 8 ermittelt. Andere Experimente werden mit 1 bis 50% HECM durchgeführt. In Experimenten in denen der Effekt von Wirkstoffen (z. B. Paclitaxel) auf HECM induziertes Eosinophilen-Überleben getestet wird, wird der Wirkstoff (Paclitaxel) von 0,1 nM bis 10 μM mit Eosinophilen bei 37°C über 1 Stunde vor der Zugabe von HECM inkubiert. In jedem Experiment werden negative Kontrolle- (nur Kulturmedium) und positive Kontrollnäpfe (Kulturmedium mit HECM) immer mit untersucht. Um zu untersuchen, ob die Wirkstoffe irgendeinen toxischen Effekt aufweisen, wurde die Lebensfähigkeit von mit dem Wirkstoff (verschiedene Konzentrationen) inkubierten Eosinophilen mit Eosinophilen verglichen, die über einen Zeitraum von 24 Stunden mit RPMI 10% allein kultiviert wurden.
B. Effekt von Paclitaxel auf Cytokingenexpression und Freisetzung von Epithelzellen
Von nasalen Polypen und normaler nasaler Mucosa erhaltene Epithelzellen werden bis zur Konfluenz kultiviert, humanes konditioniertes Epithelzell-Medium, das mit oder ohne Paclitaxel (oder anderen Mitteln) erzeugt wurde und Überstände werden durch ELISA gemessen. Die Cytokin-Genexpression wird durch reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), wie beschrieben von Mullol et al., Clinical and Experimental Allergy 25: 607–615, 1995, untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, daß Paclitaxel die Cytokin-Genexpression als ein Mittel zur Inhibierung des Überlebens von Eosinophilen moduliert. Der hauptsächliche Nachteil bei der Verwendung von primären Zellkulturen ist der, daß es 10 Tage dauert, bis die Zellen Konfluenz erreichen, was die zellulären Funktionen aus der lokalen Umgebung sowie systemischen Effekten trennt, die hauptsächlich zu der Krankheit geführt hätten. Jedoch ist dies ein ausgezeichnetes in vitro/ex vivo Modell, um die Wachstumsfaktoren zu untersuchen, die die Funktion und Proliferation von strukturellen Zellen (z. B. Epithelzellen) regulieren und dadurch einige Aspekte von Mucosaentzündung zu untersuchen.
C. Immunologische Freisetzung von chemischen Mediatoren von menschlichen nasalen Polypen
Vermittlung durch Paclitaxel und andere Mittel – Polypen werden zur Zeit der Resektion erhalten und 5 mal mit Tyrode's Puffer gewaschen und mit einem Skalpell in Replikate von ungefähr 200 mg Naßgewicht fragmentiert. Die Replikate werden in 3 ml Puffer suspendiert, der verschiedene Konzentrationen von Paclitaxel bei 37°C enthält und mit 0,2 μg/ml Antigen E konfrontiert (5 Minuten später). Nach 15 Minuten Inkubation mit dem Antigen werden die Diffusate entfernt und die Gewebe in frischem Puffer für 10 Minuten gekocht, um das restliche Histamin zu extrahieren. Das freigesetzte Histamin und SRS-A werden unter der Verwendung von HPLC untersucht.
BEISPIEL 36
PERIVASCULÄRE VERABREICHUNG VON MITTELN, WELCHE DIE MICROTUBULI FUNKTION UNTERBRECHEN
Studien wurden durchgeführt, um die Effizienz von Paclitaxel-Camptothecin beladener chirurgischer Paste (PCL) und/oder eines EVA Films als eine perivaskuläre Behandlung für Restenosis zu untersuchen.
A. Materialien und Methoden
WISTAR Ratten, die 250 bis 300 g wiegen, wurden durch die intramuskuläre Injektion von Innovar (0,33 ml/kg) betäubt. Einmal betäubt, wurden sie dann unter Halothanbetäubung plaziert. Nachdem eine allgemeine Anästhesie etabliert war, wurde das Fell über der Nackenregion rasiert, die Haut geklammert und mit Betadin gesäubert. Ein vertikaler Einschnitt wurde über der linken Carotidenarterie durchgeführt und die externe Carotidenarterie freigelegt. Zwei Ligaturen wurden um die externe Carotidenarterie herum plaziert und eine transverse Arteriothomie wurde durchgeführt. Ein Nummer 2 French Fogarty Ballonkatheter wurde dann in die Carotidenarterie eingeführt und in die linke gemeinsame Carotidenarterie eingeschoben und der Ballon mit Kochsalzlösung aufgepumpt. Das Endothelium wurde durch dreifache Passage des aufgepumpten Ballons auf und ab entlang der Carotidenarterie freigelegt. Der Katheter wurde dann entfernt und die Ligatur von der linken externen Carotidenarterie abgebunden.
Die Ratten wurden zufällig in Gruppen von 10 verteilt, um entweder keine Behandlung, Polymer allein (EVA Film oder PCL Paste) oder Polymer plus 20% Paclitaxel zu empfangen. Das Polymergemisch (2,5 mg) wurde um die Carotidenarterie herum auf kreisförmige Weise angebracht. Die Wunde wurde dann geschlossen. Fünf Ratten von jeder Gruppe wurden am 14. und die restlichen fünf am 28. Tag getötet. In der Zwischenzeit wurde die Ratten auf Gewichtsverlust oder andere Anzeichen systemischer Erkrankung beobachtet. Nach 14 oder 28 Tagen wurden die Tiere betäubt und die linke Carotidenarterie wurde isoliert, mit 10% gepuffertem Formaldehyd fixiert und histologisch untersucht.
Als eine vorhergehende Studie wurden zwei Ratten mit 10% Camptothecin-beladenem EVA Film für 14 Tage behandelt, um die Effizienz von Camptothecin in diesem Erkrankungsmodell zu untersuchen.
B. Ergebnisse
Die Ergebnisse aus diesen Studien zeigten, daß Paclitaxel-beladene (20%) Polymere die Restenosis vollständig verhinderten, wohingegen die Kontrolltiere und die Tiere, die Polymer allein erhielten, zwischen 28% und 55% luminale Beeinträchtigungen bei 14 und 28 Tagen nach Ballon-Verletzung entwickelten (76A und 76B).
Es konnte eine absolute Inhibierung von intimer Hyperplasie dort gefunden werden, wo Paclitaxel im Kontakt mit der Gefäßwand vorlag. Jedoch war der Effekt sehr lokal, wie durch den ungleichmäßigen Effekt von Paclitaxel, an den Stellen wo es unmöglich war, den Wirkstoff direkt angrenzend an die Gefäßwand zu halten, gezeigt werden konnte (76A und 76B).
Vorhergehende Daten haben gezeigt, daß Camptothecin-beladener EVA Film bei der Vorbeugung einer Restenosisantwort in diesem Tiermodell der Erkrankung wirksam war. Camptothecin inhibierte die intime Hyperplasie in den zwei getesteten Tieren vollständig.
BEISPIEL 37 (Vergleichsbeispiel)
EFFEKTE VON PACLITAXEL IN EINEM TIERMODELL VON CHIRURGISCHEN ANHEFTUNGEN
Die Verwendung eines Paclitaxel-beladenen EVA Films, um Anheftungsbildung zu reduzieren, wird in dem Kaninchen-Uterushorn-Modell untersucht.
New Zealand weibliche weiße Kaninchen werden betäubt und eine Laparotomie wird durch einen Einschnitt entlang der Mittellinie durchgeführt. Die Uterushörner werden freigelegt und ein 5 cm langes Segment von jedem wird unter der Verwendung einer Skalpellklinge abgeschabt. Dieses Abschaben ist ausreichend, um die Serosa zu entfernen, was zu einer punktuellen Blutung führt. Die Kaninchen werden zufällig zu den Kontroll- oder Paclitaxelbehandelten Gruppen zugeteilt und post-operativen Evaluierungsperioden von zwei, vier und acht Wochen unterzogen. In der Paclitaxel behandelten Gruppe wird jedes Uterushorn im Anschluß an das Abschaben komplett mit Paclitaxel-beladenem EVA Film umwickelt. Die muskuloperitoneale Lage wird durch Nähte und die kutane Lage mit Hautklammern geschlossen.
Die Tiere werden zwei, vier oder acht Wochen nach der Chirurgie auf die Anheftungsbildung hin untersucht. Die Tiere werden human euthanasiert und Nekropsien durchgeführt. Die Gebärmutterhörner werden optisch und histologisch unter der Verwendung von Standardmikroskoptechniken untersucht. Optisch werden die Anheftungen unter der Verwendung eines Standardbewertungssystems eingestuft, das auf der Tatsache basiert, daß 5 cm des Uterushorns traumatisiert ist; daher wird das Ausmaß der Anheftungsbildung durch Messen der Länge des Bereichs, der Anheftung enthält, bestimmt. Das folgende Einstufungssystem wird verwendet: 0 = keine Anheftung, 1 = Anheftung in 25% des Bereichs, 2 = Anheftung in 50% des Bereichs und 3 = Anheftung über die gesamte Länge. Die Schwere der Anheftung wird wie folgt gemessen: 0 = kein Widerstand gegenüber Trennung, 0,5 = einiger Widerstand (mittlere Kraft erforderlich) und 1 = scharfes Trennen benötigt. Der Gesamtgrad ist additiv, wobei der Adhäsionswert von von 0–4 reicht, was sowohl Ausmaß und Schwere darstellt.
BEISPIEL 38 (Vergleichsbeispiel)
EFFEKT VON PACLITAXEL IN EINEM TIERMODELL VON SYSTEMISCHEM LUPUS-ERYTHEMATOSUS
Die Effizienz von Paclitaxel bei systemischem Lupus Erythematosus wird durch die Behandlung von weiblichen NZB/NZW F₁ Mäusen (B/W) mit mizellärem Paclitaxel bestimmt. Die ser Mäusestamm entwickelt eine Erkrankung ähnlich zu menschlichem SLE. In einem Alter von einem Monat weisen diese Mäuse einen erhöhten Level von Milz B-Zellen auf, die wenn mit normalen Mäusen verglichen, spontan Immunglobulin sekretieren. Hohe Level von antissDNA Antikörper treten in einem Alter von 2 Monaten auf. In einem Alter von fünf Monaten sammelt sich Immunglobulin entlang der glomerularen Kapillarwände an. Schwere Glomerulonephritis entsteht und in einem Alter von 9 Monaten sind 50% der B/W Mäuse tot.
A. Materialien und Methoden
Weibliche B/W Mäuse werden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) erworben. Fünf Monate alte weibliche B/W Mäuse werden zufällig zu Behandlungs- und Kontrollgruppen zugeteilt. Die Behandlungsgruppen erhalten entweder ein niedrig dosiertes kontinuierliches mizelläres Paclitaxel (2,0 mg/kg; dreimal pro Woche, insgesamt 10 Injektionen) oder ein Hochdosis "Puls" mizelläres Paclitaxel (20 mg/kg; viermal, einmal wöchentlich). Die Kontrollgruppe erhält Kontrollmizellen.
Zu vorbestimmten Zeitintervallen werden die Paclitaxel-behandelten und unbehandelten Kontroll B/W Mäuse vergleichbaren Alters getötet, ihre Milzen steril entfernt und Einzelzellsuspensionen zur Lymphozytenzählung hergestellt. Um Milzlymphozyten-Subpopulationen zu identifizieren, wird Fluoreszenzanalyse durchgeführt. Die Zahl von Zellen/Millionen Milz B-Zellen, die spontan Immunglobulin (IgG, IgM, Gesamt-Immunglobulin) oder anti-ssDNA Antikörper sekretieren wird durch ELISA bestimmt.
Aus dem vorangehenden wird ersichtlich werden, daß, obwohl bestimmte Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Illustrationszwecken beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Entsprechend ist die Erfindung nicht begrenzt, außer durch die angehängten Ansprüche.

Claims

Verwendung eines Antimikrotubulimittels zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung chronischer entzündlicher Erkrankung der Atemwege, wobei das Medikament angepaßt ist an die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Antimikrotubulimittels an einen Patienten, so daß besagte entzündliche Erkrankung der Atemwege behandelt oder verhindert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Antimikrotubulimittel ein Taxan ist.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Antimikrotubulimittel Paclitaxel ist.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Antimikrotubulimittel Docetaxel ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antimikrotubulimittel nasal, intranasal, systemisch, durch Inhalation, topisch oder in die Nasennebenhöhlen verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege Asthma ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antimikrotubulimittel durch Inhalation, vorzugsweise mit einem abgemessene Dosen abgebenden Inhalationsgerät, Vernebelungsgerät, über einen Endotrachealtubus oder durch Inhalation von Mikropartikeln, verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antimikrotubulimittel systemisch, vorzugsweise intravenös, durch subkutane oder intramuskuläre Injektion oder durch orale Zubereitung, verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege chronische obstruktive Lungenerkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Paclitaxel durch Inhalation mit einer Dosis von 1 bis 50 mg/m² verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Paclitaxel systemisch mit einer Dosis von 10 bis 50 mg/m² alle 1 bis 4 Wochen verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Paclitaxel systemisch mit einer Dosis von 50 bis 250 mg/m² verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege chronische entzündliche Lungenerkrankung ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antimikrotubulimittel zusammen mit einem Spray formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung oder Zusammensetzung ein polymerer Trägerstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Poly(caprolacton) umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Poly(milchsäure) umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Copolymer aus Poly(milchsäure) und Poly(caprolacton) ist.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Poly(ethylenvinylacetat) umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Isopropylmyristat umfaßt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antimikrotubulimittel enthalten ist in oder angepaßt ist zur Freisetzung aus einer (einem) chirurgischen oder medizinischen Einheit oder Implantat, vorzugsweise einem Stent, einem Nahtmaterial, einem Dauerkatheter oder einer Prothese.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verabreichung des Antimikrotubulimittels einen nasalen Polypen behandelt oder verhindert.
Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Antimikrotubulimittel zusammen mit einer weiteren Verbindung oder Zusammensetzung formuliert ist, vorzugsweise einer (einem) Salbe, Creme, Lotion, Gel oder Spray.