ES2207451T3 - Uso de agentes anti-microtubulos para tratar enfermedades inflamatorias respiratorias del tracto respiratorio. - Google Patents

Uso de agentes anti-microtubulos para tratar enfermedades inflamatorias respiratorias del tracto respiratorio.

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ES2207451T3
ES2207451T3 ES00123534T ES00123534T ES2207451T3 ES 2207451 T3 ES2207451 T3 ES 2207451T3 ES 00123534 T ES00123534 T ES 00123534T ES 00123534 T ES00123534 T ES 00123534T ES 2207451 T3 ES2207451 T3 ES 2207451T3
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William L. Hunter
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Angiotech International AG
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Abstract

Uso de un agente anti-microtúbulos para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio, en el que el medicamento está adaptado para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del agente anti-microtúbulos, de forma que sea tratada o prevenida dicha enfermedad inflamatoria del tracto respiratorio.

Description

Uso de agentes anti-microtúbulos para tratar enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio.
Campo técnico
La presente invención se refiere al uso de un agente anti-microtúbulos para preparar un medicamento para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades inflamatorias, tanto de naturaleza crónica como aguda, representan un problema sustancial en la industria sanitaria. Brevemente, la inflamación crónica se considera que es una inflamación de una duración prolongada (semanas o meses) en la que la inflamación activa, la destrucción de tejidos y los intentos de curar tienen lugar simultáneamente (Robbins Pathological Basis of Disease by R.S. Cotran, V. Kumar y S.L. Robbins, W.B. Saunders Co., pag. 75, 1989). Aunque a la inflamación crónica puede seguir un episodio inflamatorio agudo, puede comenzar también como un procedimiento insidioso que progresa con el tiempo, por ejemplo, como consecuencia de una infección persistente (por ejemplo, tuberculosis, sífilis, infección fúngica) que causa una reacción de hipersensibilidad retardada, exposición prolongada a toxinas endógenas (por ejemplo, lípidos en plasma elevados) o exógenos (por ejemplo, sílice, asbestos, alquitrán de cigarrillos o saturas quirúrgicas), o reacciones autoinmunes contra los tejidos del propio cuerpo (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, esclerosis múltiples o psoriasis). Por lo tanto, las enfermedades inflamatorias crónicas incluyen muchos estados médicos comunes tales como artritis reumatoide, restenosis, psoriasis, esclerosis múltiples, adhesiones quirúrgicas, tuberculosis y enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas (por ejemplo, asma, neumoconiosis, enfermedad de obstrucción pulmonar crónica, pólipos nasales y fibrosis pulmonar).
Enfermedades inflamatorias pulmonares
Las enfermedades inflamatorias crónicas pulmonares que incluyen, por ejemplo, asma, neumoconiosis, enfermedad de obstrucción pulmonar crónica, pólipos nasales y fibrosis pulmonar, afectan a muchas personas en todo el mundo. Normalmente estas enfermedades están caracterizadas por un procedimiento inflamatorio invasivo y un engrosamiento de los tejidos afectados.
Por ejemplo, los pólipos nasales se caracterizan por un tejido engrosado del recubrimiento nasal. Los pólipos se pueden producir en enfermedades respiratorias como asma, fibrosis cística, disquinesia ciliar primaria y deficiencias autoinmunes. Los pólipos nasales se cree que se desarrollan como una manifestación de procedimientos inflamatorios crónicos que afectan a las vías respiratorias superiores. Se ha encontrado en un 36% de pacientes con intolerancia a la aspirina, 7% de ellos con asma, 0,1% en niños y aproximadamente 20% en los que tienen fibrosis cística. Otros estados asociados con los pólipos nasales son el síndrome de Churg-Strauss, sinusitis fúngica alérgica y síndrome disquinético ciliar y síndrome de Young. Aproximadamente un 40% de los pacientes con polipectomías quirúrgicas tuvieron recaídas (Settipane, Allergy Asthma Proc. 17(5):231-236, 1996).
Los síntomas principales de la poliposis nasal son obstrucción nasal y perturbación del sentido del olfato. Los objetivos del tratamiento médico de la poliposis nasal son (1) eliminar pólipos nasales y síntomas de rinitis, (2) volver a establecer la respiración nasal y el olfato y (3) evitar la recaída. La oclusión del conducto nasal por unos pocos pólipos grandes puede ser tratada mediante una simple polipectomía para ayudar al paciente a respirar a través de la nariz. El objetivo de la cirugía es restablecer las propiedades fisiológicas de la nariz y hacer que las vías respiratorias estén tan exentas de pólipos como sea posible y permitir el drenaje de los senos infectados. Sin embargo, la poliposis nasal recurrente es uno de los problemas sin resolver más comunes de la rinología clínica. El tratamiento médico complementario de la poliposis es siempre necesario ya que la cirugía no puede tratar el componente inflamatorio de la enfermedad mucosal. Los corticoesteroides tópicos son el tratamiento más ampliamente utilizado para reducir el tamaño de los pólipos y evitar la recaída después de la cirugía. Los esteroides reducen la rinitis, mejoran la respiración nasal, reducen el tamaño de los pólipos y disminuyen la tasa de recaída, pero tienen un efecto despreciable sobre el sentido del olfato y sobre cualquier patología de los senos. Sin embargo, el uso del esteroides en la poliposis está asociado con complicaciones infecciosas que requieren antibióticos. Otros fármacos para el tratamiento de la poliposis nasal incluyen antagonistas de receptor H1 (por ejemplo, azelastine-HCl) y anti-diuréticos (por ejemplo, furosimida). Estos tratamientos no siempre son eficaces y las tasas de recaída son todavía muy elevadas. El tratamiento médico actual para la poliposis nasal utiliza corticoesteroides para aliviar los síntomas de la enfermedad, pero no tiene ninguna acción contra la patología subyacente de la enfermedad. Además, en pacientes con pólipos nasales se han observado la recaída de la enfermedad o la resistencia a la terapia de esteroides.
Sumario de la invención
Brevemente expuesto, la presente invención proporciona el uso de un agente anti-microtúbulos para preparar un medicamento para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias, que comprende suministrar a un sitio de inflamación un agente anti-microtúbulos. Ejemplos representativos de estos agentes incluyen taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), campotecina, eleuterobina, sarcodictiina, epotilonas A y B, discodermolida, óxido de deuterio (D_{2}O), hexilenglicol (2-metil-2,4-pentanodiol), tubercidina (7-de-sazaadenosina), LY29081 (2-amino-4-(3-piridil)-4H-nafto(1,2-b)piran-3-carbonitrilo), fluoruro de aluminio, bis-(succinimidilsuccinato) de etilenglicol, éster etílico de glicina, anticuerpos monoclonales anti-idiotípicos, proteína favorecedora de conjuntos de microtúbulos (proteína de tipo taxol, TALP), hinchamiento celular inducido por estados hipotónicos (190 mosmol/l), insulina (10 nmol/l) o glutamina (10 nmol/l), unión a dineina, gibberlina, XCHO1 (proteína de tipo cinesina), ácido lisofosfatídico, ion de litio, componentes de la pared celular de plantas (por ejemplo, poli-L-lisina y extensina), tampones de glicerol, tampón estabilizante de microtúbulos Triton X-100, proteínas asociadas a microtúbulos (por ejemplo, MAP2, MAP4, tau, tau grande, ensconsina, factor 1-alfa de alargamiento (EF-1\alpha) y E-MAP-115), entidades celulares (por ejemplo, histona H1, proteína básica de mielina y cinetocoros), estructuras microtubulares endógenas (por ejemplo, estructuras axonemales, tapones y remates de GTP), túbulo estable solo polipéptido (por ejemplo, STOP145 y STOP220 y tensión de fuerzas mitóticas, así como cualesquiera análogos y derivados de cualquiera de los que anteceden. Dentro de otras realizaciones, el agente anti-microtúbulos es formulado para que comprenda adicionalmente un polímero.
Dentro de ciertas realizaciones de la invención, los agentes anti-microtúbulos usados según la invención pueden ser formulados junto a otros compuestos o composiciones tales como, por ejemplo, un ungüento, crema, loción, gel, pulverización o similar. Dentro de ciertas realizaciones, el compuesto o composición puede actuar como un vehículo, que puede ser polímero o no polímero. Ejemplos representativos de vehículos polímeros incluyen poli(etileno-acetato de vinilo), copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), copolímeros de poli(ácido láctico) y poli(caprolactona), gelatina, ácido hialurónico, matrices de colágeno y albumen. Ejemplos representativos de otros vehículos adecuados incluyen, pero sin estar limitados a etanol, mezclas de etanol y glicoles (por ejemplo, etilenglicol o propilenglicol); mezclas de etanol y miristato de isopropilo o etanol, miristato de isopropilo y agua (por ejemplo, 55:5:40); mezclas de etanol y eineol o d-limoneno (con o sin agua); glicoles (por ejemplo, etilenglicol o propilenglicol) y mezclas de glicoles tales como propilenglicol y agua, fosfatidil-glicerol, dioleoilfosfatidil-glicerol. Transcutol® o terpinoleno; mezclas de miristato de isopropilo y 1-hexil-2-pirrolidona, N-dodecil-2-piperidinona o 1-hexil-2-pirrolidona.
Dentro de todavía otros aspectos, el agente anti-microtúbulos puede ser formulado para que esté contenido o adaptado para ser liberado por un dispositivo o implante quirúrgico o médico tal como, por ejemplo, desviaciones quirúrgicas, suturas, catéteres de alojamiento interno, prótesis y similares.
Estos y otros aspectos descritos resultarán más evidentes mediante la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anejos. Además, se exponen con posterioridad diversas referencias que describen más en detalle ciertos procedimientos, dispositivos o composiciones y, por lo tanto, son incorporados como referencia en su totalidad.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es un gráfico que muestra la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos (5 x 10^{6} células/ml) a cristales de CPPD opsonizados con plasma (50 mg/ml). El efecto de paclitaxel (también denominado como "taxol") a (\medcirc) sin paclitaxel, (\bullet) 4,5 \muM, (\Delta) 14 \muM, (\ding{115}) (28 \muM, (\medcirc) 46 \muM; n=3. La figura 1B es un gráfico que muestra la dependencia de la concentración en el transcurso del tiempo de la inhibición por paclitaxel de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por cristales de CPPD opsonizados con plasma. La Figura 1C es un gráfico que muestra el efecto del fluoruro de aluminio sobre la activación de neutrófilos inducida por zimosano, medida por quimioluminiscencia. La Figura 1D es un gráfico que muestra el efecto del éster etílico de glicina sobre la activación de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado medida por quimioluminiscencia. La Figura 1E es un gráfico que muestra el efecto de LY290181 sobre quimioluminiscencia de neutrófilo inducida por zimosano opsonizado.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la liberación de lisozimas a partir de neutrófilos (5 x 10^{6}/ml) en respuesta a cristales de CPPD opsonizados con plasma (50 mg/ml). El efecto de paclitaxel a (\medcirc) sin paclitaxel, (\bullet) 28 \muM, (\Delta) testigo (células solas), (\ding{115}) testigos (células y paclitaxel a 28 \muM), n=3.
La Figura 3A es un gráfico que muestra la producción de anión de superóxido por neutrófilos (5 x 10^{6} células/ml) en respuesta a cristales de CPPD opsonizados con plasma (50 mg/ml). El efecto de paclitaxel a (\medcirc) sin paclitaxel, (\bullet) 28 \muM, (\Delta) testigo (células solas); n=3. La Figura 3B es un gráfico que muestra la dependencia de la concentración en el transcurso del tiempo de la inhibición por paclitaxel de la producción de aniones de superóxido en neutrófilos inducidos por cristales de CPPD opsonizados con plasma; n=3. La Figura 3C es un gráfico que expone el efecto de LY290181 sobre la generaciones de aniones de superóxidos en neutrófilos inducidos por cristales de CPPD.
La Figura 4A es un gráfico que muestra la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos (5 x 10^{6} células/ml) en respuesta a zimosano opsonizado con plasma (1 mg/ml). Efecto de paclitaxel a (\medcirc) sin paclitaxel, (\bullet) 28 \muM; n=3. La Figura 4B es un gráfico que muestra la producción de aniones de superóxido en neutrófilos inducidos por zimosano opsonizado con plasma. Efecto de paclitaxel a (\medcirc) sin paclitaxel, (\bullet) 28 \muM, (\Delta) testigo (células solas); n=3.
La Figura 5A es un gráfico que muestra la liberación de mieloperoxidasa a partir de neutrófilos (5 x 10^{6} células/ml) en respuesta a cristales de CPPD opsonizados con plasma (50 mg/ml). Efecto de paclitaxel a (\medcirc) sin paclitaxel, (\bullet) 28 \muM, (\Delta) testigo (células solas), (\ding{115}) testigo (células con paclitaxel a 28 \muM); n=3. La Figura 5B es un gráfico que muestra la dependencia de la concentración de la inhibición por paclitaxel de la liberación de mieloperoxidasa a partir de neutrófilos en respuesta a cristales de CPPD opsonizados con plasma; n=3. Las Figuras 5C y 5D son gráficos que muestran que LY290181 disminuye la liberación tanto de lisozimas como de mieloperoxidasa en neutrófilos inducidos por cristales de CPPD.
La Figura 6 es un gráfico que expone la proliferación de sinoviocitos a diversas concentraciones de paclitaxel.
La Figura 7 es un gráfico que expone los efectos de paclitaxel sobre queratinocitos in vitro.
Las Figuras 8A y 8B muestra el efecto de paclitaxel sobre la morfología de astrocitos. Las imágenes de microscopía electrónica pusieron de manifiesto procedimientos filamentosos gruesos bien organizados en astrocitos de animales testigos transgénicos, mientras que los animales transgénicos tratados con paclitaxel tenían astrocitos morfológicamente alterados. El paclitaxel indujo el redondeo de las células de astrocitos, procedimientos celulares adelgazados y filamentos citoplásmicos reducidos con relación a animales no tratados.
La Figura 9 es un gráfico que expone la viabilidad de células EOMA tratadas con concentraciones de paclitaxel mayores que 10^{-8} M.
La Figura 10 es un gráfico de barras que expone el porcentaje de células EOMA apoptólicas en un cultivo tratado con concentraciones crecientes de paclitaxel.
Las Figuras 11A-11E son gráficos que exponen el efecto de diversos agentes anti-microtúbulos sobre sinoviocitos después de un período de 24 horas.
Las Figuras 12A-12H son manchas que muestran el efecto de diversos agentes anti-microtúbulos en la inhibición de la expresión de colagenasa.
Las Figuras 13A-13H son manchas que muestran el efecto de diversos agentes anti-microtúbulos sobre la expresión de proteoglicano.
Las Figuras 14A y 14B son dos fotografías de una CAM que tiene un tumor tratado con termopasta testigo (sin carga). Brevemente, en la Figura 14A la masa blanca central es el tejido tumoral. Debe apreciarse la abundancia de vasos sanguíneos que entra en el tumor desde la CAM en todas las direcciones. El tumor induce el crecimiento interno de la vascularización hospedante a través de la producción de "factores angiogénicos". El tejido tumoral se expande distalmente a lo largo de los vasos sanguíneos que lo suministran. La Figura 14B es una vista desde el lado interno de la CAM mostrado en 15A. Brevemente, esta consideración demuestra la apariencia radial de los vasos sanguíneos que entran en el tumor como los radios de una rueda. Debe apreciarse que la densidad de los vasos sanguíneos es mayor en las proximidades del tumor que en el tejido normal circundante de la CAM. Las Figuras 14C y 14D son dos fotografías de una CAM que tiene un tumor tratado con termopasta con contenido de paclitaxel al 20%. Brevemente, en la Figura 14C la masa blanca central es el tejido tumoral. Debe apreciarse la escasez de vasos sanguíneos en las proximidades del tejido tumoral. La liberación sostenida del agente anti-microtúbulos es capaz de superar el estímulo angiogénico producido por el tumor. El tumor en sí está escasamente vascularizado y es de tamaño progresivamente decreciente. La Figura 14D está tomada desde el lado de debajo de la CAM mostrado en 14C y demuestra la interrupción de flujo sanguíneo en el tumor cuando se compara con un tejido tumoral testigo. Debe apreciarse que la densidad de los vasos sanguíneos se reduce en las proximidades del tumor y está más disperso que el del tejido de la CAM circundante normal.
La figura 15A es una fotografía que muestra un cultivo de huevo sin cáscara en el día 6. La Figura 15B es una imagen digitalizada mostrada por ordenador tomada con un estereomicroscopio de capilaridades vivas no teñidas (1040x). La Figura 15C es una fotografía de una extensión de corrosión que muestra una microvascularización de membrana corioalentoica (CAM) que es alimentada por vasos subyacentes mayores (flechas; 1300x). La Figura 15D es una fotografía que expone una sección de plástico de 0,5 mm de grosor cortada transversalmente a través de la CAM, y registrada al nivel del microscopio de luz. Esta fotografía muestra la composición de la CAM, incluido un ectodermo (Ec) externo de doble capa, un mesodermo (M) que contiene capilaridades (flecha) y células adventicias dispersadas, y un endodermo (En) de capa única (400x). La Figura 15E es una fotografía al nivel de microscopio electrónico (3500x) en la que se presenta una estructura típicamente capilar que muestra células endoteliales de pared delgada (cabezas de las flechas) y un pericito asociado.
Las Figuras 16A, 16B, 16C y 16D son una serie de imágenes digitalizadas de cuatro CAMs sin teñir diferentes tomadas después de 48 horas de exposición a 10 \mug de paclitaxel por 10 ml de metilcelulosa. El disco de metilcelulosa transparente (*) que contiene paclitaxel está presente en cada CAM y está colocado sobre una zona (A) avascular singular con islotes de sangre (Is) circundantes. Estas zonas avasculares se extienden más allá del disco y tienen típicamente un diámetro de aproximadamente 6 mm. La Figura 16D ilustra el efecto de "acodamiento" típico (cabezas de flechas) de vasos tanto pequeños como grandes que son redirigidos hacia fuera desde la periferia de la zona avascular.
La Figura 17A es una fotografía (=400x) que muestra las capilaridades (cabezas de flechas) inmediatamente periféricas a la zona avascular que exhibe numerosas células endoteliales detenidas en mitosis. Ectodermo (Ec); mesodermo (M); endodermo (En). La Figura 17B (=400x) muestra que dentro de la propia zona avascular la estructura típica de capilaridad ha sido eliminada y hay numerosas células sanguíneas extravasadas. La Figura 17C (=400x) muestra que en la zona central de la zona avascular, están dispersados glóbulos rojos por todo el mesodermo.
La Figura 18A (=2.200x) muestra una pequeña capilaridad que se sitúa de forma subyacente a la capa ectodérmica (Ec) que posee tres células endoteliales detenidas en mitosis (*). Otros diversos tipos de células tanto en el ectodermo como en el mesodermo están también detenidas en mitosis. La Figura 18B (=2.800x) muestra que la fase avascular temprana contiene células sanguíneas extravasadas subyacentes al ectodermo; estas células sanguíneas están entremezcladas con células presumiblemente endoteliales (*) y sus procedimientos. Vacuolas celulares degradativas (cabezas de flechas). La Figura 18C (=2.800x) muestra que en respuesta al paclitaxel, la superficie interfacial ecto-mesodérmica ha resultado poblada con células en diversas etapas de degradación que contienen vacuolas y gránulos densos (cabezas de flechas).
La figura 19A expone esquemáticamente la regulación transcripcional de metaloproteinasas de matriz. La Figura 19B es una mancha que demuestra que la IL-1 estimula la actividad transcripcional de AP-1. La Figura 19C es un gráfico que muestra que la IL-1 inducía la actividad de unión disminuida en lisados de condrocitos que fueron previamente tratados con paclitaxel.
La Figura 20 es una mancha que muestra que la inducción de IL-1 aumenta los niveles de colagenasa y estromelisina en RNA en condrocitos, y que esta inducción puede ser inhibida mediante tratamiento previo con paclitaxel.
La Figura 21 es un gráfico de barras que expone los efectos del paclitaxel sobre la viabilidad de condrocitos normales in vitro.
La Figura 22 es un gráfico que representa la degradación de pseudo-primer orden cinético observada de paclitaxel (20 \mug/ml^{-1}) en soluciones al 10% de HP\betaCD y al 10% de HP\gammaCD a 37ºC y pH de 3,7 y 4,9, respectivamente.
La Figura 23 es un gráfico que muestra la solubilidad de fases de ciclodextrinas y paclitaxel en agua a 37ºC.
La Figura 24 es un gráfico que muestra representaciones de segundo orden de la complejación de paclitaxel y \gammaCD, HP\betaCD o HP\gammaCD a 37ºC.
La Figura 25 es una tabla que muestra la temperatura de fusión, entalpía, peso molecular, polidispersidad y viscosidad intrínseca de una composición de PDLLA-PEG-PDLLA.
La Figura 26 es un gráfico que expone termogramas de DSC de PDLLA-PEG-PDLLA y PEG. La velocidad de calentamiento fue de 10ºC/minuto. Obsérvese la Figura 30 para temperaturas de fusión y entalpías.
La Fusión 27 es un gráfico que expone la liberación acumulativa de paclitaxel a partir de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA con contenido de 20% de paclitaxel en tampón de PBS-albúmina a 37ºC. Las barras de error representan la desviación típica de 4 muestras. Cilindros de PEG al 40% fueron interrumpidos a los 4 días debido a la disgregación.
Las Figuras 28A, 28B y 28C son gráficos que exponen el cambio de dimensiones, longitud (A), diámetro (B) y peso en seco (C) de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA con 20% de contenido de paclitaxel durante la liberación in vitro de paclitaxel a 37ºC.
La Figura 29 es una tabla que muestra la pérdida de masa y el cambio de composición de polímeros de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA (con un contenido de 20% de paclitaxel) durante la liberación de tampón en PBS-albúmina 37ºC.
La Figura 30 es un gráfico que muestra los cromatogramas de permeación sobre gel de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA (20% de PEG, diámetro de 1 mm) con un contenido de 20% de paclitaxel durante la liberación en tampón de PBS-albúmina a 37ºC.
Las Figuras 31A, 31B, 31C y 31D son SEMs de cilindros de PDLLA-pEG-PDLLA (con contenido de 20% de paclitaxel, 1 mm de diámetro) antes y durante la liberación de paclitaxel. A: 20% de PEG, día 0; B: 30% de PEG, día 0; C: 20% de PEG, día 69; D: 30% de PEG, día 69.
La Figura 32 es un gráfico que expone la liberación acumulativa de paclitaxel a partir de mezclas de PDLLA:PCL con contenido de 20% de paclitaxel y PCL en tampón de PBS-albúmina a 37ºC. Las barras de error representan las desviaciones típicas de 4 muestras.
La Figura 33 es un gráfico que expone, durante el transcurso del tiempo, la liberación de paclitaxel a partir de pastas de PCL en PBS a 37ºC. Las pastas de PCL contienen micropartículas de paclitaxel y diversos aditivos preparados usando una malla nº 140. Las barras de error representan la desviación típica de 3 muestras.
La Figura 34 es un gráfico que expone los transcursos del tiempo de liberación de paclitaxel a partir de pastas de paclitaxel-gelatina-PCL en PBS a 37ºC. Este gráfico muestra los efectos de la concentración de gelatina (malla nº 140) y el tamaño de las micropartículas de paclitaxel-gelatina (1:1) preparadas usando una malla nº 140 o malla nº 60. Las barras de error representan la desviación típica de 3 muestras.
Las Figuras 35A y 35B son gráficos que exponen el efecto de aditivos (17A; malla nº 140) y el tamaño de las micropartículas (17B; malla nº 140 o nº 60) y la proporción del aditivo (malla nº 140) sobre el comportamiento de hinchamiento de pastas de PCL que contienen 20% de paclitaxel después de una suspensión en agua destilada a 37ºC. Las mediciones para la pasta preparada con micropartículas de 270 \mum en paclitaxel-gelatina y pasta que contiene 30% de gelatina fueron interrumpidas después de 4 horas debido a la disgregación de la matriz. Las barras de error representan la desviación típica de 3 muestras.
Las Figuras 36A, 36B, 36C y 36D son micrografías electrónicas de exploración de pastas de paclitaxel-gelatina-PCL (20:20:60) antes (36A) y después (36B) de poner en suspensión en agua destilada a 37ºC durante 6 horas. Las micrografías 36C y 36D son aumentos superiores de 36B, que muestran la asociación íntima de paclitaxel (en forma de varillas) y la matriz de gelatina.
Las Figuras 37A y 37B son fotomicrografías representativas de CAMs tratadas con pastas de gelatina-PCL (37A) y paclitaxel-gelatina-PCL (20:20:60; 37B) que muestran zonas de avascularización en la CAM tratada con paclitaxel.
La Figura 38 es un gráfico que muestra la solubilidad de fases de ciclodextrinas y paclitaxel en agua a 37ºC.
La Figura 39 es un gráfico que muestra representaciones de segundo orden de la complejación de paclitaxel y \gammaCD, HP\betaCD o HP\gammaCD a 37ºC.
La Figura 40 es un gráfico que muestra la solubilidad de fases para paclitaxel a 37ºC e hidroxipropil-\beta-ciclodextrina en soluciones en agua:etanol, 50:50.
La Figura 41 es un gráfico que muestra perfiles de la velocidad de disolución de paclitaxel en soluciones de HP\gammaCD al 0, 5, 10 ó 20% a 37ºC.
La Figura 42 es un gráfico que representa la degradación cinética de pseudo-primer orden observada de paclitaxel (20 \mug/ml) en soluciones al 10% de HP\betaCD y al 10% de HP\gammaCD a 37ºC y pH de 3,7 y 4,9, respectivamente.
Las Figuras 43A y 43B, respectivamente, son dos gráficos que muestran la liberación de paclitaxel desde películas de EVA, y el porcentaje de paclitaxel que permanece en esas mismas películas a lo largo del tiempo. La Figura 43C es un gráfico que muestra el hinchamiento de películas de EVA/F127 sin paclitaxel a lo largo del tiempo. La Figura 43D es un gráfico que muestra el hinchamiento de películas de EVA/Span 80 sin paclitaxel a lo largo del tiempo. La Figura 43E es un gráfico que muestra la curva de deformación frente a tensión para diversas mezclas de EVA/F127.
La Figura 44 es un gráfico que muestra el efecto de la opsonización en plasma de microesferas polímeras sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos (20 mg/ml de microesferas en 0,5 ml de células (conc. 5x10^{6} células/ml)) respecto a microesferas de PCL.
La Figura 45 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de plasma +/- 2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos (5x10^{6} células/ml) respecto a microesferas de PCL.
La Figura 46 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de plasma +/- 2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos (5x10^{6} células/ml) respecto a microesferas de PMMA.
La Figura 47 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de plasma +/- 2% de Pluronic F127 en la respuesta a la quimioluminiscencia de neutrófilos (5x10^{6} células/ml) respecto a microesferas de PLA.
La Figura 48 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de plasma +/- 2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos (5x10^{6} células/ml) respecto a microesferas de EVA:PLA.
La Figura 49 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de IgG (2 mg/ml) o 2% de Pluronic F127 y seguidamente IgG (2 mg/ml) sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos respecto a microesferas de PCL.
La Figura 50 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de IgG (2 mg/ml) o 2% de Pluronic F127 y seguidamente IgG (2 mg/ml) sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos respecto a microesferas de PMMA.
La Figura 51 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de IgG (2 mg/ml) o 2% de Pluronic F127 y seguidamente IgG (2 mg/ml) sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos respecto a microesferas de PVA.
La Figura 52 es un gráfico que muestra el efecto de aplicar un revestimiento previo de IgG (2 mg/ml) o 2% de Pluronic F127 y seguidamente IgG (2 mg/ml) sobre la respuesta de quimioluminiscencia de neutrófilos respecto a microesferas de EVA:PLA.
La Figura 53A es un gráfico que muestra perfiles de la velocidad de liberación a partir de microesferas de policaprolactona que contienen 1%, 2%, 5% ó 10% de paclitaxel en solución salina tamponada con fosfato a 37ºC. La Figura 53B es una fotografía que muestra una CAM tratada con microesferas testigos. La Figura 53C es una fotografía que muestra una CAM tratada con microesferas con un contenido de 5% de paclitaxel.
La Figura 54 es un gráfico que expone el intervalo de tamaños de partículas para microesferas testigos (PLLA:GA - 85:15).
La Figura 55 es un gráfico que expone el intervalo de tamaños de partículas para microesferas con contenido de 20% de paclitaxel (PLLA:GA - 85:15).
La Figura 56 es un gráfico que expone el intervalo de tamaños de partículas para microesferas testigos (PLLA:GA - 85:15).
La Figura 57 es un gráfico que expone el intervalo de tamaños de partículas para microesferas con contenido de 20% de paclitaxel (PLLA:GA - 85:15).
Las Figuras 58A, 58B y 58C son gráficos que muestran los perfiles de la velocidad de liberación de paclitaxel a partir de intervalos variables de tamaños de microesferas y diversas relaciones de PLLA y GA.
Las Figuras 59A y 59B son gráficos que muestran los perfiles de la velocidad de liberación de paclitaxel a partir de microesferas con varias relaciones de PLLA y GA.
Las Figuras 60A y 60B son gráficos que muestran los perfiles de la velocidad de liberación de paclitaxel a partir de microesferas con varias relaciones de PLLA y GA.
Las Figuras 61A, 61B y 61C son gráficos que muestran los perfiles de la velocidad de liberación de paclitaxel a partir de microesferas de tamaño variable y diversas relaciones de PLLA y GA.
La Figura 62 es un gráfico que expone la liberación de paclitaxel a partir de microcápsulas de paclitaxel-nilón.
Las Figuras 63A y 63B son fotografías de microesferas de PLLA revestidas con fibronectina sobre tejido de vejiga (63A) y microesferas de poli(L-lisina) sobre tejido de vejiga.
La Figura 75 es un gráfico que expone el efecto de una terapia de paclitaxel con intervalos de dosis elevadas sobre el progreso de los síntomas clínicos en ratones transgénicos. Los ratones transgénicos fueron tratados con 20 mg/kg de paclitaxel una vez a la semana durante 4 semanas (semanas 0, 1, 2 y 3) y fueron verificados durante 10 semanas, cada dos días, con valoraciones determinadas para cada síntoma. Los datos representan la puntuación media (acumulativa para todos los síntomas) para ratones transgénicos tratados con paclitaxel (n=5) y ratones testigos (n=3). El tratamiento con paclitaxel redujo el deterioro causado por la sobre-expresión de DM20 en los transgénicos, mientras que los ratones testigos se deterioraron muy rápidamente, de forma que no sobrevivieron 2 de cada 3 ratones al final del protocolo experimental (como se indica).
Las Figuras 76A y 76B muestran una pasta de paclitaxel aplicada por vía perivascular (en las adventicias del vaso sanguíneo) en el modelo de arteria carótida de rata. La superficie adventicia de la arteria carótida común izquierda fue tratada con 2,5 mg de una pasta testigo (76A) o una pasta con un contenido de 20% de paclitaxel (76B). Las arterias testigos mostraron un aumento de grosor de la pared arterial debido a la hiperproliferación de las células de los músculos lisos, mientras que la arteria tratada con pasta con contenido de paclitaxel no mostró ninguna evidencia de engrosamiento íntimo.
Las Figuras 77A y 77B exponen el efecto de proximidad de pasta de paclitaxel perivascular en el modelo de arteria carótida de rata. La pasta con contenido de paclitaxel aplicada de forma inmediatamente adyacente a la zona perivascular del vaso evitó la restenosis; sin embargo, cuando la pasta no era directamente adyacente a la pared vascular, fue evidente una hiperplasia neoíntima de la pared vascular.
Las Figuras 78A, 78B y 78C muestran el efecto de paclitaxel sobre la tinción con GFAP de astrocitos. Las secciones del cerebro de animales normales y animales transgénicos (que desarrollaron una enfermedad neurológica similar a la esclerosis múltiple) tratados con vehículo o paclitaxel fueron teñidas con GFAP (un marcador para astrocitos activados) y fueron examinadas histológicamente. En los ratones transgénicos testigos hubo un aumento del número de astrocitos y los niveles de GFAP total en comparación con las secciones de los cerebros normales. Sin embargo, la morfología de las células era similar. Las secciones del cerebro de los ratones transgénicos tratados con paclitaxel mostraban números de astrocitos y niveles de GFAP disminuidos en comparación con los animales transgénicos sin tratar. Histológicamente, hay un redondeo celular y un adelgazamiento de los procedimientos estrellados en astrocitos.
Las Figuras 79A y 79B son gráficos que muestran que el paclitaxel inhibe la estimulación de células T en respuesta al péptido proteico básico mielina (GP68-88) y ConA. Un cultivo de 48 horas de proliferación de células T de RT-1 se realizó con GP68-88 (A) o ConA (B) como estimulágenos. Se añadieron paclitaxel y su vehículo (micelas) a concentraciones graduadas al comienzo de la estimulación con antígeno o 24 horas después. El paclitaxel inhibió la proliferación de células T a concentraciones tan bajas como 0,02 \muM, independientemente del estimulágeno.
Las Figuras 80A, 80B, 80C y 80D son gráficos que muestran que la tubercidina y el paclitaxel inhiben la actividad de NF-\kappaB inducida por IL-1 y TNF.
Las Figuras 81A y 81B son gráficos que muestran el efecto de concentraciones crecientes de paclitaxel o campotecina sobre el crecimiento celular de células de cáncer de próstata humano (LNCaP) (2x103 células/pocillo) medidas por tinción con violeta cristal (0,5%) y cuantificación por absorbancia a 492 nm. El porcentaje de crecimiento se expresa como % con relación a testigos y se proporciona una media de 8 resultados.
Descripción detallada de la invención
Antes de exponer la invención, puede ser útil para su comprensión exponer las definiciones de ciertos términos que se usarán con posterioridad.
"Enfermedad inflamatoria", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a cualquiera de un cierto número de enfermedades que están caracterizadas por cambios vasculares: edema e infiltración de neutrófilos (por ejemplo, reacciones inflamatorias agudas), infiltración de tejidos por células mononucleares; destrucción de tejidos por células inflamatorias, células de tejidos conectivos y sus productos celulares; e intentos de reparación por sustitución de tejidos conectivos (por ejemplo, reacciones inflamatorias crónicas). Ejemplos representativos de estas enfermedades incluyen muchos estados médicos comunes como artritis, aterosclerosis, psoriasis, enfermedad de inflamación intestinal, esclerosis múltiple, adhesiones quirúrgicas, restenosis, tuberculosis, rechazo de injertos y enfermedades respiratorias de inflamación crónica (por ejemplo, asma, neumoconiosis, enfermedad pulmonar de obstrucción crónica, pólipos nasales y fibrosis pulmonar).
"Agentes anti-microtúbulos" debe entenderse que incluye cualquier proteína, péptido, producto químico u otra molécula que dificulte la función de los microtúbulos, por ejemplo, a través de la prevención o estabilización de la polimerización. Se puede utilizar una amplia diversidad de métodos para determinar la actividad anti-microtúbulos de un compuesto particular incluidos, por ejemplo, los ensayos descritos por Smith et al. (Cancer Lett 79(2):213-219, 1994) y Mooberry et al., (Cancer Lett. 96(2):261-266, 1995).
Como se indicó anteriormente, el uso según la invención es útil para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias, que comprende la etapa de suministrar al sitio de la inflamación un agente anti-microtúbulos. Brevemente, se puede suministrar una amplia diversidad de agentes a un sitio de inflamación (o sitio potencial de inflamación) con o sin un vehículo (por ejemplo, un polímero o ungüento) con el fin de tratar o prevenir una enfermedad inflamatoria. Ejemplos representativos de tales agentes incluyen taxanos (por ejemplo, paclitaxel (expuesto más en detalle con posterioridad) y docetaxel) (Schiff et al., Nature 277:665-667, 1979; Long y Fairchild, Cancer Research 54:4355-4361, 1994; Ringel y Horwitz, J. Natl. Cancer Inst. 83(4):288-291, 1991; Pazdur et al., Cancer Treat. Rev. 19(4):351-386, 1993), campotecina, electerobina (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.473.057, sarcodictiinas (incluida sarcodictiina A), epotilonas A y B (Bollag et al., Cancer Research 55:2325-2333, 1995), discodermolida (ter Haar et al., Biochemistry 35:243-250, 1996), óxido de deuterio (D_{2}O) (James y Lefebvre, Genetics (130(2):305-314, 1992; Sollott et al., J. Clin, Invest. 95:1869-1876, 1995), hexilenglicol (2-metil-2,4-pentanodiol (Oka et al., Cell Struct. Funct. 16(2):125-134, 1991), tubercidina (7-desazaadenosina) (Mooberry et al., Cancer lett. 96(2):261-266, 1995), LY290181 (2-amino-4-(3-piridil)-4H-nafto (1,2-b)piran-3-carbonitrilo) panda et al., J. Biol. Chem. 272(12):7681-7687, 1997; Wood et al., Mol. Pharmacol. 52(3):437-444, 1997), fluoruro de aluminio (Song et al., J. Cell. Sci. Suppl. 14:147-150, 1991), bis-(succinimidilsuccinato) de etilenglicol (Caplow y Shanks, J. Biol. Chem. 265(15):8935-8941, 1990), éster etílico de glicina (Mejillano et al., Biochemistry 31(13):3478-3483, 1992), anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales (Leu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22):10690-10694, 1994), proteína favorecedora de conjuntos de microtúbulos (proteína de tipo taxol, TALP) (Hwang et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 208(3):1174-1880, 1995), hinchamiento celular inducido por condiciones hipotónicas (190 mosmol/l), insulina (100 nmol/l) o glutamina (10 mmol/l) (Haussinger et al., Biochem Cell. Biol. 72(1-2):12-19, 1994), unión a dineína (Ohba et al., Biochim. Biophys. Acta 1158(3):323-332, 1993), gibberelina (Mita y Shibaoka, Protoplasma 119(1/2):100-109, 1984), XCHO1 (proteína de tipo kinesina) (Yonetani et al., Mol. Biol. Cell 7(suppl): 211A, 1996), ácido lisofosfatídico (Cook et al., Mol. Biol. Cell 6(suppl):260A, 1995), ion de litio (Bhattacharyya y Wolff, Biochem. Biophys. Res. Commun. 73(2): 383-390, 1976) componentes de las paredes de células de plantas (por ejemplo, poli-1-lisina y extensina) (Akashi et al., Planta 182(3):363-369, 1990), tampones de glicerol (Schilstra et al., Biochem. J. 277(Pt. 3): 839.847, 1991; Farrell y Keates, Biochem. Cell. Biol. 68(11): 1256-1261; 1990); Lopes et al., J. Cell. Biochem. 43(3):281-291, 1990), tampón estabilizante de microtúbulos Triton X-100 (Brown et al., J. Cell Sci. 104(Pt.2): 339-352, 1993; Safiejko-Mroczka y Bell, J. Histochem. Cytochem. 44(6): 641-656, 1996), proteínas asociadas a microtúbulos (por ejemplo, MAP2, MAP4, tau, big tau, ensconsina, factor de alargamiento 1-alfa (EF-1á) y E-MAP-115) (Burgess et al., Cell Motil. Cytoskeleton 20(4):289-300, 1991; Saoudi et al., J. Cell. Sci. 108(Pt. 1): 357-367, 1995; Bulinski y Bossler, J. Cell. Sci. 107(Pt. 10): 2839-2849, 1994; Ookata et al., J. Cell Ciol 128(5): 849-862, 1995; Boyne et al., J. Comp. Neurol. 358(2): 279-293, 1995; Ferreira y Caceres, J. Neurosci. 11(2): 392-400, 1991; Thurston et al., Chromosoma 105(1): 20-30, 1996; Wang et al., Brain Res. MOl. Brain Res. 38(2): 200-208, 1996; Moore y Cyr, Mol. Biol. Cell 7(suppl): 221-A, 1996; Masson y Kreis, J. Cell Biol. 123(2), 357-371, 1993), entidades celulares (por ejemplo, histona H1, proteína básica mielina y cinetocoros) (Saoudi et al., J. Cell. Sci. 108(pt. 1): 357-367, 1995; Simerly et al., J. Cell Biol. 111(4): 1491-1504, 1990), estructuras microtubulares endógenas (por ejemplo, estructuras axonemales, tapones y remates de GTP) (Dye et al., Cell Motil. Cytoskeleton 21(3): 171-186, 1992; Azhar y Murphy, Cell Motil Cytoskeleton 15(3): 156-161, 1990; Walker et al., J. Cell Biol. 114(1): 73-81, 1991; Drechsel y Kirschner, Curr. Biol. 4(12): 1053-1061, 1994), polipéptidos solo estables en túbulos (por ejemplo, STOP145 y STOP220) (Pirollet et al., Biochim. Biophys. Acta 1160(1):
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Dentro de una realización preferida de la invención, el agente terapéutico es paclitaxel, un compuesto que interrumpe la formación de microtúbulos mediante la unión a tubulina para formar agujas mitóticas anormales. Brevemente, el paclitaxel es un diterpenoide altamente derivado (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93:2325, 1971) que ha sido obtenido a partir de la corteza cultivada y secada de Taxus brevifolia (tejo del Pacífico) y Taxomyces Andreanae y Endophytic Fungus del tejo del Pacífico (Stierle et al., Science 60:214-216, 1993). El "paclitaxel" (que debe entenderse en la presente memoria descriptiva que incluye los profármacos, análogos y derivados tales como, por ejemplo, TAXOL®, TAXOTERE®, Docetaxel, análogos de 10-desacetilo de paclitaxel y análogos de 3'-N-desbenzoil-3'-N-t-butoxicarbonilo de paclitaxel) se puede preparar fácilmente utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Schiff et al., Nature 277:665-667, 1979; Long y Fairchild, Cancer Research 54: 4355-4361, 1994; Ringel y Horwitz, J. Natl. Cancer Inst. 83:(4):288-291, 1991; Pazdur et al., Cancer Treat. Rev. 19(4): 351-386, 1993; documentos 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876; WO 93/23555, WO 93/10076, WO 94/00156, WO 93/24476, EP 590267, WO 94/20089; patentes de EE.UU. nº 5.294.637, 5.283.253, 5.279.949, 5.274.137, 5.202,448, 5.200.534, 5.229.529, 5.254.580, 5.412.092, 5.395.850, 5.380.751, 5.350.866, 4.857.653, 5.272.171, 5.411.984,
5.248.796, 5.422.364, 5.300.638, 5.294.637, 5.362.831, 5.440.056, 4.814.470, 5.278.324, 5.352.805, 5.411.984,
5.059.699, 4.942.184; Tetrahedron Letters 35(52): 9709-9712, 1994; J. Med. Chem. 35:4230-4237, 1992; J. Med. Chem. 34:992-998, 1991; J. Natural Prod. 57(10):1404-1410, 1994; J. Natural Prod. 57(11):1580-1583, 1994; J. Am. Chem. Soc. 110:6558-6560, 1988), o puede ser obtenido a partir de una diversidad de fuentes comerciales incluidas, por ejemplo, la empresa Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (T7402 - de Taxus brevifolia).
Ejemplos representativos de tales derivados o análogos de paclitaxel incluyen 7-desoxi-docetaxol, 7,8-ciclopropa-taxanos, 2-azetidonas sustituidas en N, 6,7-epoxipaclitaxeles, paclitaxeles modificados en 6,7,10-desacetoxitaxol, 10-desacetiltaxol (a partir de 10-desacetil-bacatina III), derivados de fosfonooxi y carbonato de taxol, 2,7-di(1,2-bencenodicarboxilato de sodio) de taxol, derivados de 10-desacetoxi-11,12-dihidrotaxol-10,12(18)-dieno, 10-desacetoxitaxol, Protaxol (derivados de 2'- y/o 7-O-éster), derivados de 2'- y/o 7-O-carbonato), síntesis asimétrica de cadenas laterales de taxol, fluorotaxoles, 9-desoxotaxano, 13-acetil-9-desoxo-bacatina III, 9-desoxotaxol, 7-desoxi-9-desoxotaxol, 10-desacetoxi-7-desoxi-9-desoxotaxol, derivados que contienen hidrógeno o un grupo acetilo y uno hidroxi y terc-butoxicarbonilamino, derivados de 2'-acriloiltaxol sulfonado y 2'O-acil-ácido-taxol sulfonado, succiniltaxol, formiato de 2'-\gamma-aminobutiriltaxol, 2'-acetil-taxol, 7-acetil-taxol, 7-glicina-carbamato-taxol, 2'-OH-7-PEG(5000)-carbamato-taxol, derivados de taxol de 2'-benzoilo y 2'-7-dibenzoilo, otros profármacos (2'-acetiltaxol; 2',7-diacetiltaxol; 2'-succiniltaxol; 2'-(beta-alanil)-taxol); formiato de 2'-gamma-aminobutiriltaxol; derivados de etilenglicol de 2'-succiniltaxol; 2'-glutariltaxol; 2'-(N,N-dimetilglicil)taxol; 2'-(2-(N,N-dimetilamino)propionil)taxol; 2'-ortocarboxibenzoil-taxol; derivados de ácido 2'-alifático-carboxílico de taxol, profármacos {2'-(N,N- -dimetilaminopropionil)taxol, 2'-(N,N-dimetilglicil)taxol, 7-(N,N-dimetilglicil)taxol, 2',7-di-(N,N-dimetilglicil)-taxol, 7-(N,N-dimetilaminopropionil)taxol, 2',7-di(N,N-dietilaminopropionil)taxol, 2'-(L-glicil)taxol, 7-(L-gli-il)taxol, 2',7-di(L-glicil)taxol, 2'-(L-alanil)taxol, 7-(L-alanil)taxol, 2',7-di(L-alanil)taxol, 2'-(L-leucil)-taxol, 7-(L-leucil)taxol, 2',7-di(L-leucil)taxol, 2'-(L-isoleucil)taxol, 7-(L-isoleucil)taxol, 2',7-di(L-isoleucil) taxol, 2'-(L-valil)taxol, 7-(L-valil)taxol, 2',7-di(L-valil)taxol, 2'-(L-fenilalanil)taxol, 7-(L-fenilalanil)taxol, 2',7-di(L-fenilalanil)taxol, 2'-(L-prolil)taxol, 7-(L-prolil)taxol, 2',7-di(L-prolil)taxol, 2'-(L-lisil)taxol, 7-(L-lisil)taxol, 2',7-di(L-lisil)taxol, 2'-(L-glutamil)taxol, 7-(L-glutamil)taxol, 2',7-di(L-glutamil)taxol, 2'-(L-arginil)taxol, 7-(L-arginil)taxol, 2',7-di(L-arginil)taxol}, análogos de taxol con cadenas laterales de fenilisoserina modificada, taxotere (N-desbenzoil-N-terc-(butoxicarbonil)-10-desacetiltaxol y taxanos (por ejemplo, bacatina III, cefalomina, 10-desacetilbacatina III, brevifoliol, yunantaxusina y taxusina).
Ejemplos representativos de agentes de despolimerización (o desestabilización o interrupción) de microtúbulos incluyen Nocodazol (Ding et al., J. Exp. Med. 171(3):715-727, 1990; Dotti et al., J. Cell Sci. Suppl. 15:75-84, 1991; Oka et al., Cell Struct. Funct. 16(2):125-134, 1991; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136(1):71-80, 1997); Quitocalasina B (Illinger et al., Biol. Cell 73(2-3):131-138, 1991); Vinblastina (Ding et al., J. Exp. Med. 171(3): 715-727. 1990: Dirk et al., Neurochem. Res. 15(11): 1135-1139, 1990; Illinger et al., Biol Cell 73(2-3):131-138, 1991; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136(1):71-80, 1997); Vincristina (Dirk et al., Neurochem Res. 15(11):1135-1139, 1990; Ding et al., J. Exp. Med. 171(3):715-727, 1990); Colquicina (Allen et al., Am. J. Physiol, 261(4 Pt.1):L315-L321, 1991; Ding et al., J. Exp. Med. 171(3):715-727, 1990; Gonzalez et al., Exp. Cell. Res. 192(1):10-15, 1991; Stargell et al., Mol. Cell. Biol. 12(4):1443-1450, 1992); CI 980 (análogo de colquicina) (García et al., Anticancer Drugs 6(4):533-544, 1995); Colcemid (Barlow et al., Cell. Motil. Cytoskeleton 19(1):9-17, 1991; Meschini et al., J. microsc. 176(Pt. 3):204-210, 1994; Oka et al., Cell Struct. Funct. 16(2):125-134, 1991); Podofilotoxina (Ding et al., J. Exp. Med. 171(3):715-727, 1990); Benomilo (Hardwick et al., J. Cell. Biol. 131(3):709-720, 1995; Shero et al., Genes Dev. 5(4):549-560, 1991); Orizalina (Stargell et al., Mol. Cell. Biol. 12(4):1443-1450, 1992); Majusculamida C (Moore, J. Ind. Microbiol. 16(2):134-143- 1996); Demecolcina (Van Dolah y Ramsdell, J. Cell. Physiol. 166(1):49-56, 1996; Wiemer et al., J. Cell. Biol. 136(1):71-80, 1997); y metil-2-bencimidazolcarbamato (MBC) (Brown et al., J. Cell. Biol. 123(2):387-403, 1993).
Formulaciones
Como se indicó anteriormente, los agentes terapéuticos anti-microtúbulos descritos en la presente memoria descriptiva pueden ser formulados en una diversidad de maneras y, por tanto, pueden comprender adicionalmente un vehículo. A este respecto, se puede seleccionar una amplia diversidad de vehículos de origen polímero o no polímero.
Por ejemplo, dentro de una realización de la invención se puede utilizar una amplia diversidad de vehículos polímeros para contener y/o suministrar uno o más de los agentes terapéuticos anteriormente expuestos incluidos, por ejemplo, composiciones tanto biodegradables como no biodegradables. Ejemplos representativos de composiciones biodegradables incluyen albúmina, colágeno, gelatina, ácido hialurónico, almidón, celulosa (metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, acetato-ftalato de celulosa, acetato-succinato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), caseína, dextranos, polisacáridos, fibrinógeno, poli(D,L-lactida), poli(D,L-lactida-Co-glicólido), poli(glicólido), poli(hidroxibutirato, poli(alquilcarbonato) y poli(ortoésteres), poliésteres, poli(ácido hidroxivalérico), polidioxanona, poli(tereftalato de etileno), poli(ácido málico), poli(ácido tartrónico), polianhídridos, polifosfacenos, poli(aminoácidos) y sus copolímeros (véase generalmente Illum, L. Davids, S.S. (eds.) "Polymers in Controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17:1-22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59:173-196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4:155-0180, 1986). Ejemplos representativos de polímeros no degradables incluyen copolímeros de poli(etileno - acetato de vinilo) ("EVA"), caucho de silicona, polímeros acrílicos (poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), poli(metacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de alquilo)), polietileno, polipropileno, poliamidas (nilón 6,6), poliuretano, poli(éster-uretanos), poli(éter-uretanos), poli(éster-urea), poliéteres, poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno), Pluronics y poli(tetrametilenglicol)), cauchos de silicona y polímeros vinílicos (polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli(acetato-ftalato de vinilo). Se puede desarrollar también polímeros que sean aniónicos (por ejemplo, alginato, carragenina, carboximetil-celulosa y poli(ácido acrílco)), o catiónicos (por ejemplo, quitosano, poli-L-lisina-polietilenimina y poli(alilamina)) (véase generalmente Dunn et al., J. Applied Polymer Sci. 50:353.365, 1993; Cascone et al., J. Materials Sci.: Materials in Medicine 5:770-774, 1994; Shiraishi et al., Biol. Pharm. Bull. 16(11):1164-1168, 1993; Thacharodi y Rao, Int'l J. Pharm. 120:115.118, 1995; Miyazaki et al., Int'l J. Pharm. 118:257-263, 1995). Los vehículos polímeros particularmente preferidos incluyen oligómeros y polímeros de poli(etileno-acetato de vinilo), poli(D,L-ácido láctico), oligómeros y polímeros de poli(L-ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, poli(caprolactona), poli(valerolactona), polianhídridos, copolímeros de poli(caprolactona) o poli(ácido láctico) con polietilenglicol (por ejemplo, MePEG) y sus mezclas.
Los vehículos polímeros pueden ser modelados en una diversidad de formas, con características de liberación deseadas y/o con propiedades específicas deseadas. Por ejemplo, los vehículos polímeros pueden ser modelados para liberar un agente terapéutico tras la exposición a un acontecimiento desencadenante específico tal como el pH (véase por ejemplo, Heller et al., "Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems", in Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, pag. 175-188; Kang et al., J. Applied Polymer Sci. 48:343-354, 1993; Dong et al., J. Controlled Release 19:171-178, 1992; Dong y Hoffman, J. Controlled Release 15:141-152, 1991; Kim et al., J. Controlled Release 28:143-152, 1994; Cornejo-Bravo et al., J. Controlled Release 33:223-229, 1995; Wu y Lee, Pharm. Res. 10(10):1544-1547, 1993; Serres et al., Pharm. Res. 13(2):196-201, 1996; Peppas, "Funda- mentals of pH- and Temperatura-Sensitive Delivery Systems", in Gurny et al. (eds), Pulsatile Drug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, pag. 41-55; Doelker, "Cellulose Derivatives", 1993, in Peppas y Langer (eds), Biopolymers I, Springer-Verlag, Berlin). Ejemplos representativos de polímeros sensibles al pH incluyen poli(ácido acrílico) y sus derivados (incluidos, por ejemplo, homopolímeros tales como poli(ácido aminocarboxílico); poli(ácido acrílico); poli(ácido metil-acrílico), copolímeros de tales homopolímeros y copolímeros de poli(ácido acrílico) y monómeros acrílicos, como los anteriormente expuestos. Otros polímeros sensibles al pH incluyen polisacáridos tales como acetato-ftalato de celulosa; ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa; acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa; acetato-trimetilato de celulosa y quitosano. Todavía, otros polímeros sensibles al pH incluyen cualquier mezcla de un polímero sensible al pH y un polímero soluble en agua.
Análogamente, los vehículos polímeros pueden ser moderados para que sean sensibles a la temperatura (véase, por ejemplo, la publicación de Chen et al., "Novel Hidrogels of a Temperatura-Sensitive Pluronic Grafted of a Bioadhesive Polyacrylid Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery", en Proceed, Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22:167-168, Controlled Release Society, Incl, 1995; Okano, "Molecular Design of Stimuli-Responsive Hidrogels for Temperal Controlled Drug Delivery", en Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22:111-112, Controlled Release Society Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9(3):425-433, 1992, Tung, Int'l J. Pharm. 107:85-90, 1994; Harsh y Gehrke, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 17:175-186, 1991; Bae et al., Pharm. Res. 8/4):531-537, 199; Dinarvand y D'Emanuele, J. Controlled Release 36:221-227, 1995; Yu y Grainger, "Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels: Poly N-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis and Pjysicochemical Characterization", Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pag. 820-821; Zhou y Smid, "Physical Hydrogels of Associative Star Polymers", Polymer Research Indstitute, Dept. of Chemistry, College of Environmental Science and Forestry, State Univ. of New York, Syracuse, NY, pag. 822-823; Hoffman et al., "Characterizing Pore Sizes and Water ``Structure'' in Stimuli-Responsive Hydrogels", Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, pag. 828; Yu y Grainger, "Thermo-sensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels", Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pag. 829-830; Kim et al., Pharm. Res. 93(3):283-290, 1992; Bae et al., Pharm. Res. 8(5):624-628, 1991; Kono et al., J. Controlled Release 30:69-75, 1994; Yoshida et al., J. Controlled Release 32:97-102, 1994 Okano et al., J. Controlled Release 36:125-133, 1995; Chun y Kim, J. Controlled Release 38:39-47, 1996; D'Emanuele y Dinarvand, Int'l J. Pharm. 118:237-242, 1995; Katono et al., J. Controlled Release 16:215-228, 1991; Hoffman, "Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species", en Migliaresi et al. (eds), Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, pag. 161-167; Hoffman, "Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics", en Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Sustems, Salt Lake City, UT, Feb. 24-27, 1987, pag. 297-305; Gutowska et al., J. Controlled Release 22:95-104, 1992; Palasis y Gehrke, J. Controlled Release 18:1-12, 1992; Paavola et al., Pharm. Res. 12(12):1997-2002, 1995).
Ejemplos representativos de polímeros termogelificantes, y su temperatura de gelatina (LCST (ºC)) incluyen homopolímeros tales como poli(N-metil-N-n-propilacrilamida), 19,8; poli(N-n-propilacrilamida), 21,5; poli(N-metil-N-isopropilacrilamida, 22,3; poli(N-n-propilmetacrilamida), 28,0; poli(N-isopropilacrilamida), 30,9; poli(N-n-dietila-crilamida), 32,0; poli(N-isopropilmetacrilamida), 44,0; poli(N-ciclopropilacrilamida), 45,5; poli(N-etilmetilacrilamida), 50,0; poli(N-metil-N-etilacrilamida), 56,0; poli(N-ciclopropilmetacrilamida), 59,0; poli(N-etilacrilamida), 72,0. Además de ello, los polímeros termogelificantes se pueden elaborar preparando copolímeros entre monómeros de los que anteceden, o combinando tales homopolímeros con otros polímeros solubles en agua tales como monómeros acrílicos (por ejemplo, ácido acrílico y sus derivados tales como ácido metacrílico, acrilato y sus derivados tales como metacrilato, acrilamida y N-n-butilacrilamida).
Otros ejemplos representativos de polímeros termogelificantes incluyen derivados de éteres de celulosa tales como hidroxipropil-celulosa, 41ºC; metil-celulosa, 55ºC; hidroxi- propilmetil-celulosa, 66ºC y etilhidroxietil-celulosa, y Pluronics tales como F-127, 10-15ºC; L-122, 19ºC, L-92, 26ºC; L-81, 20ºC y L-61, 24ºC.
Se puede modelar una amplia diversidad de formas mediante los vehículos polímeros de la presente invención que incluyen, por ejemplo, dispositivos en forma de varillas, gránulos, tabletas o cápsulas (véase, por ejemplo, Goodell et al., J. Hosp. Pharm. 43:1454-1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from Polymers", en Biomedical Polymers, Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, Goldberg, E.P., Nakagim, A. (eds) Academic Press, pag. 113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sci. 69:265-270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sci. 72:1181-1185, 1983; y Bawa et al., J. Controlled Release 1:259-267, 1985). Los agentes terapéuticos pueden estar unidos por oclusión en las matrices de polímeros, unidos por enlaces covalentes o encapsulados en microcápsulas. Dentro de ciertas realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan composiciones terapéuticas en formulaciones no capsulares tales como microesferas (con un tamaño que varía en 1 intervalo de nanómetros a micrómetros), pastas, filamentos de diversos tamaños, películas y pulverizaciones.
Preferentemente, las composiciones terapéuticas descritas en la presente memoria descriptiva se modelan de una manera apropiada para el uso previsto. Dentro de ciertos aspectos de la presente invención, la composición terapéutica debe ser biocompatible y liberar uno o más agentes terapéuticos durante un período de varios días a meses. Por ejemplo, se proporcionan composiciones terapéuticas de "liberación rápida" o "súbitas" que liberan más de 10%, 20% o 25% (p/v) de un agente terapéutico (por ejemplo, paclitaxel) durante un período de 7 a 10 días. Tales composiciones de "liberación rápida" deben ser capaces, en ciertas realizaciones, de liberar niveles quimioterapéuticos (cuando sea aplicable) de un agente deseado. Dentro de otras realizaciones, se proporcionan composiciones terapéuticas de "liberación lenta" que liberan menos de 1% (p/v) de un agente terapéutico durante un período de 7 a 10 días. Adicionalmente, las composiciones terapéuticas de la presente invención deben ser preferentemente estables durante varios meses y capaces de ser producidas y mantenidas bajo condiciones estériles.
En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones terapéuticas pueden ser modeladas en cualquier tamaño que varíe en el intervalo de 50 nm a 500 \mum, dependiendo del uso particular. Alternativamente, tales composiciones pueden ser también fácilmente aplicadas en forma de una "pulverización" que solidifique en forma de una película o revestimiento. Tales pulverizaciones pueden ser preparadas a partir de microesferas de una amplia gama de tamaños, incluidos, por ejemplo, de 0,1 \mum a 3 \mum de 10 \mum a 30 \mum y de 30 \mum a 100 \mum.
Las composiciones terapéuticas descritas en la presente memoria descriptiva pueden ser preparadas también en una diversidad de formas de "pasta" o gel. Por ejemplo, en una realización de la invención, se proporcionan composiciones terapéuticas que son líquidas a una temperatura (por ejemplo, una temperatura mayor que 37ºC, tal como 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC o 60ºC) y sólidas o semi-sólidas a otra temperatura (por ejemplo, la temperatura ambiente corporal o cualquier temperatura inferior a 37ºC). Tales "termopastas" se pueden preparar fácilmente dada la descripción proporcionada en la presente memoria descriptiva.
Dentro de todavía otros aspectos de la invención, las composiciones terapéuticas se pueden formar como una película. Preferentemente, tales películas tienen generalmente menos de 5, 4, 3, 2 ó 1 mm de grosor, más preferentemente menos de 0,75 mm o 0,5 mm de grosor y, lo más preferentemente, menos de 500 \mum a 100 \mum de grosor. Tales películas son preferentemente flexibles con una buena resistencia a la tracción (por ejemplo, mayor que 50, preferentemente mayor que 100 y, más preferentemente, mayor que 150 ó 200 N/cm^{2}), buenas propiedades adhesivas (es decir, se adhiere fácilmente a superficies húmedas o mojadas) y tienen una permeabilidad controlada.
Dentro de aspectos adicionales de la invención, las composiciones terapéuticas pueden ser formuladas para una aplicación tópica. Ejemplos representativos incluyen: etanol; mezclas de etanol y glicoles (por ejemplo, etilenglicol o propilenglicol); mezclas de etanol y miristato de isopropilo o etanol, miristato de isopropilo y agua (por ejemplo, 55:5:40), mezclas de etanol y eineol o D-limoneno (con o sin agua); glicoles (por ejemplo, etilenglicol o propilenglicol) y mezclas de glicoles tales como propilenglicol y agua, fosfatidil-glicerol, dioleilfosfatidil-glicerol, Transcutol® o terpinoleno; mezclas de miristato de isopropilo y 1-hexil-2-pirrolidona, N-dodecil-2-piperidinona o 1-hexil-2-pirrolidona. Se pueden añadir también otros excipientes a lo que antecede incluidos, por ejemplo, ácidos tales como ácido oleico y ácido linoleico y jabones tales como lauril-sulfato de sodio. Para una descripción más detallada de lo que antecede véase, generalmente, Hoelgaard et al., J. Contr. Rel. 2:111, 1985; Liu et al., Pharm. Res. 8:938, 1991; Roy et al., J. Pharm. Sci. 83:126, 1992; Ogiso et al., J. Pharm. Sci. 84:482, 1995; Sasaki et al., J. Pharm. Sci. 80:533, 1991; Okabe et al., J. Contr. Rel. 32243, 1994; Yokomizo et al., J. Contr. Rel. 38:267, 1996 Yokomizo et al., J. Contr. Rel. 42:37, 1996; Mond et al., J. Contr. Rel. 33:72, 1994; Michniak et al., J. Contr. Rel. 32:147, 1994; Sasaki et al., J. Pharm. Sci. 80:533, 1991; Baker & Hadgraft, Pharm. Res.12:993, 1995; Jasti et al., AAPS Proceedings, 1996; Lee et al., AAPS Procedings, 1996; Ritschel et al., Skin Pharmacol, 4:235, 1991; y McDaid & Deasy, Int. J. Pharm.. 133:71, 1996.
Dentro de ciertas realizaciones de la invención, las composiciones terapéuticas pueden comprender también ingredientes adicionales tales como tensioactivos (por ejemplo, Pluronics tales como F-127, L-122, L-92, L-81 y
L-61).
Dentro de aspectos adicionales de la presente invención, se proporcionan vehículos polímeros que están adaptados para contener y liberar un compuesto hidrófobo, de forma que el vehículo contiene el compuesto hidrófobo en combinación con un carbohidrato, proteína o polipéptido. Dentro de ciertas realizaciones, el vehículo polímero contiene o comprende zonas, embolsamientos o gránulos de uno o más compuestos hidrófobos. Por ejemplo, dentro de una realización de la invención, los compuestos hidrófobos pueden ser incorporados en una matriz que contiene el compuesto hidrófobo, a lo que sigue la incorporación de la matriz en el vehículo polímero. Se puede utilizar una diversidad de matrices a este respecto incluidas, por ejemplo, carbohidratos y polisacáridos tales como almidón, celulosa, dextrano, metilcelulosa y ácido hialurónico, proteínas o polipéptidos tales como albúmina, colágeno y gelatina. Dentro de realizaciones alternativas, los compuestos hidrófobos pueden estar contenidos en un núcleo hidrófobo y éste núcleo contenido en una corteza hidrófila.
Otros vehículos que pueden ser análogamente utilizados para contener y suministrar los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen: hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (Cserhati y Hollo, Int. J. Pharm. 108:69-75, 1994), liposomas (véase, por ejemplo, Sharma et al., Cancer Res. 53:5877-5881, 1993; Sharma y Straubinger, Pharm. Res. 11(60):889-896, 1994; documento WO 93/18751 y patente de EE.UU. nº 5.242.073), liposoma/gel (documento WO 94/2654), nanocápsulas (Bartoli et al., J. Microencapsulation 7(2):191-197, 1990), micelas (Alkan-Onyuksel et al., Pharm. Res. 11(2):206-212, 1994), implantes (Jampel et al., Invest. Ophthalm. Vis. Science 34(11):3076-3083, 1993; Walter et al., Cancer Res. 54:22017-2212,1994), nanopartículas (Violante y Lanzafame PAACR), nanopartículas modificadas (patente de EE.UU. nº 5.145.684), nanopartículas (superficie modificada) (patente de EE.UU. nº 5.399.363), emulsión/solución de taxol (patente de EE.UU. nº 5.407.683), micela (tensioactivo) (patente de EE.UU. nº 5.403.858), compuestos fosfolípidos sintéticos (patente de EE.UU. nº 4.534.899), dispersión portada en gas (patente de EE.UU. nº 5.301.664), emulsiones líquidas, espuma, pulverización, gel, loción, crema, ungüento, vesículas dispersadas, partículas o gotitas de aerosoles sólidos o líquidos, microemulsiones (patente de EE.UU. nº 5.330.756), corteza polímera (nano- y micro-cápsula) (patente de EE.UU. nº 5.439.686), composiciones basadas en taxoides en una gente tensioactivo (patente de EE.UU. nº. 5.438.072), emulsión (Tarr et al., Pharm Res. 4:62-165, 1987), nanoesferas (Hagan et al., Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater, 22, 1995; Kwon et al., Pharm Res. 12(2):192.195; Kwon et al., Pharm Res.10(7):970-974; Yokoyama et al., J. Contr. Rel. 32:269-277, 1994; Gref et al., Science 263:1600-1603, 1994; Bazile et al., J. Pharm. Sci. 84:493.498, 1994) e implantes (patente de EE.UU. nº 4.882.168).
Como se expone más en detalle con posterioridad, los agentes terapéuticos de la presente invención, que son opcionalmente incorporados en uno de los vehículos descritos en la presente memoria descriptiva para formar una composición terapéutica, pueden ser preparados y utilizados para tratar o prevenir una amplia diversidad de enfermedades.
Tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias
Como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona medios para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio, que comprenden la etapa de administrar a un paciente un agente anti-microtúbulos. Ejemplos representativos de dichas enfermedades inflamatorias incluyen, por ejemplo, pólipos nasales o sinusitis crónica.
Otros ejemplos de enfermedades inflamatorias incluyen asma, neumonitis de hipersensibilidad, asbestosis, silicosis y otras formas de neumoconiosis, bronquitis crónica y enfermedad de obstrucción crónica de las vías respiratorias.
Enfermedades inflamatorias crónicas del tracto respiratorio
Dentro de otros aspectos de la invención, los agentes (y composiciones) anti-microtúbulos pueden ser utilizados para tratar o prevenir enfermedades como la enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio. En particular, el agente anti-microtúbulos puede ser administrado al sitio de inflamación (o sitio potencial de inflamación) con el fin de tratar la enfermedad. Los agentes anti-microtúbulos adecuados se exponen en detalle con anterioridad e incluyen, por ejemplo, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), campotecina, eleuterobina, sarcodictinas, epotiolonas A y B, discodermolida, óxido de deuterio (D_{2}O), hexilenglicol (2-metil-2,4-pentanodiol), tubercidina (7-diazaadenosina), LY290181 (2-amino-4(3-piridil)-4H-nafto(1,2-b)pirian-3-carbodinitrilo), fluoruro de aluminio, etilenglicol-bis-(succinimidilsuccinato), éster glicinoetíico, anticuerpos anti-idiotípicos monoclanes, proteína favorecedora del ensamblaje de microtúbulos (proteína de tipo taxol, TALP), hinchamiento celular inducido por condiciones hiptóticas (190 mosmol/l), insulina (100 nmol/l) o glutamina (10 mmol/l), unión a dineína, giberlina, XCHO1 (proteína de tipo quinesina), ácido lisofosfatídico, ion litio, componentes de la pared celular vegetal (por ejemplo, poli-L-Lisina y extensina), tampones de glicerol, tampón estabilizador de microtúbulos Triton X-100, proteínas asociadas a microtúbulos (por ejemplo, MAP2, MAP4, tau, tau grande, ensconsina, factor de alargamiento 1-alfa (EF-1\alpha) y E-MAP-115), entidades celulares (por ejemplo, histona H1, proteína básica de mielina y cinetocoros), estructuras microtubulares endógenas (por ejemplo, estructuras de axonemal, tapones y tapaderas de GTP), túbulo estable solo polipéptido (por ejemplo, STOP145 y STOP220) y tensión de fuerzas mitóticas, así como cualquiera de los análogos y derivados de cualquiera de los que anteceden. Estos agentes pueden ser suministrados, en ciertas realizaciones, en forma de una composición junto con un vehículo polímero, o en una formulación de liposomas como se expone más en detalle tanto en lo que antecede como en lo que sigue. Dentro de las realizaciones preferidas de la invención, los agentes o composiciones pueden ser administrados por vía intranasal, sistémica, por inahalación, por vía tópica (por ejemplo, en el caso de pólipos nasales) o en las cavidades de los senos.
Asma
En ciertos aspectos de la invención, los agentes anti-microtúbulos pueden ser utilizados para tratar o prevenir el asma. Brevemente, el asma es un estado caracterizado por episodios recurrentes de obstrucción de las vías respiratorias que pueden ser resueltos espontáneamente o en respuesta al tratamiento. Aunque su etiología exacta no es conocida, el estado es una respuesta broncoconstrictora e inflamatoria exagerada a estímulos que afecta a un 5% de la población. Una terapia de anti-microtúbulos eficaz para asma alteraría una o más de las características patológicas del estado, como disminuir la infiltración y actividad de las células inflamatorias (células T, células cebadas o eosinófilos), reducir la proliferación y engrosamiento del epitelio de las vías respiratorias, inhibir la proliferación de las células de los músculos lisos y la hipertrofía en la pared de las vías respiratorias, disminuir la secreción mucosa en el lumen de las vías respiratorias, bloquear la actividad de citoquinas inflamatorias (IL-3, IL-4, IL-5, GMSF) que inducen y perpetúan la inflamación e inhiben la hiperplasia y la hipertrofia en las glándulas secretoras de las vías respiratorias.
Clínicamente, una terapia de anti-microtúbulos eficaz para el asma realizaría uno o más de lo que sigue: disminuir la gravedad de los síntomas, disminuir la duración de las exacerbaciones, aumentar la frecuencia y duración de los períodos de remisión de la enfermedad, prevenir el deterioro fijado y la incapacidad y prevenir la progresión crónica de disnea, catarro y respiración silbante; mientras se mejora la hipoxia, FEV_{1} (volumen de expiración forzada en un segundo), resistencia al flujo de aire e hipocapnia/alcalosis respiratoria y disminución de la coincidencia V:Q (ventilación:perfusión).
El agente anti-microtúbulos puede ser administrada de cualquier manera para conseguir los objetivos finales anteriores. Los métodos de administración preferidos incluyen tratamientos inhalados (por ejemplo, por inhalador de dosis medida) nebulizador, a través de un tubo endo-traqueal, inhalación de micropartículas) y sistémicos (inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular o preparación oral). El tratamiento sistémico sería administrado a pacientes con exacerbaciones graves en los que la terapia inhalada no fuera adecuada. Se usaría la dosis mínima capaz de producir una mejora clínica o patológica. Por ejemplo, para el paclitaxel, la terapia de dosis baja crónica sistémica puede ser administrada de 10 a 50 mg/m^{2} cada la 4 semanas dependiendo de la respuesta; una dosis elevada de terapia por "impulsos" puede ser administrada de 50 a 250 mg/m^{2} en el paciente agudamente enfermo. Para una terapia inhalada, puede ser directamente inhalado 0,01% a 1% de paclitaxel a través de los vehículos/formulaciones de suministro anteriormente mencionados. Esto daría lugar a un suministro de 1 a 50 mg/m^{2} de paclitaxel directamente al tracto respiratorio. Esta dosis sería titulada según la respuesta. Otros agentes anti-microtúbulos pueden ser administrados a dosis equivalente ajustadas para la potencia y tolerancia del agente.
Enfermedad de Obstrucción Pulmonar Crónica (COPD)
La OCPD incluye una diversidad de estados (bronquitis crónica, bronquitis asmática, bronquitis de obstrucción crónica y enfisema) que conducen a una obstrucción crónica de las vías respiratorias. Estos estados pueden provocar una incapacidad grave y son la cuarta causa principal de muerte en los EE.UU. Clínicamente, están todos caracterizados por disnea, catarro, respiración silbante e infecciones recurrentes del tracto respiratorio. Las indicaciones de la enfermedad incluyen un FEV_{1} disminuido, volumen residual aumentado, discordancia V:Q e hipoxemia. Patológicamente, hay una producción aumentada de mucosa, hiperplasia de las glándulas mucosas, actividad aumentada de proteasas (principalmente elastasa), inflamación de las vías respiratorias y destrucción de la pared alveolar. A pesar de una amplia gama de etiologías (siendo el tabaquismo la más común), la mejora de cualquiera de los síntomas, indicaciones o procedimientos patológicos anteriores afectaría favorablemente al estado; por lo tanto, una terapia de anti-microtúbulos eficaz para COPD alteraría al menos uno de los anteriormente mencionados. El tratamiento con un agente anti-microtúbulos sería administrado como se describió anteriormente para el asma: el paclitaxel inhalado sería proporcionado de 1 a 50 mg/m^{2} repetido en la medida necesaria, y para una terapia sistémica de paclitaxel se proporcionarían 10 a 50 mg/m^{2} cada 1 a 4 semanas en una administración crónica o 50 a 250 mg/m^{2} proporcionados en forma de "impulsos" en el paciente agudamente enfermo. Otros agentes anti-microtúbulos serían administrados a dosis clínicamente equivalentes.
Formulación y administración
Como se indicó anteriormente, los agentes anti-microtúbulos de la presente invención pueden ser formulados en una diversidad de formas (por ejemplo, microesferas, pastas, películas, pulverizaciones, ungüentos, cremas, geles y similares). Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para que contengan más de un agente anti-microtúbulos, para contener una diversidad de compuestos adicionales o para tener ciertas propiedades físicas (por ejemplo, elasticidad, un punto de fusión particular o una velocidad de liberación especificada). En ciertas realizaciones de la invención, las composiciones pueden ser combinadas con el fin de conseguir un efecto deseado (por ejemplo, diversas preparaciones de microesferas pueden ser combinadas con el fin de conseguir una liberación tanto rápida como lenta o prolongada de uno o más agentes anti-microtúbulos).
Los angentes anti-microtúbulos pueden ser administrados solos o bien en combinación con vehículos, excipientes o diluyentes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Generalmente, tales vehículos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de tales composiciones incluye combinar el agente terapéutico con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero no específica son ejemplos de diluyentes apropiados.
Como se indicó anteriormente, los agentes anti-microtúbulos, composiciones o composiciones farmacéuticas proporcionadas por la presente invención pueden ser preparados para una administración mediante una diversidad de vías diferentes incluidas, por ejemplo, la vía tópica a un sitio de inflamación, oral, rectal, intracraneal, intratecal, intranasal, intraocular, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, sublingual e intravesicular. Otras vías representativas de administración incluyen la administración directa (preferentemente con guía de ultrasonidos, CT, fluoroscópica, MRI o endoscópica) al sitio de la enfermedad.
Los agentes terapéuticos, composiciones terapéuticas y composiciones farmacéuticas proporcionadas por la presente invención pueden ser colocadas en recipientes junto con un material de envasado que proporcione las instrucciones en lo que respecta al uso de tales materiales. Generalmente, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración de los reactivos, así como en ciertas realizaciones, las cantidades relativas de ingredientes o diluyentes excipientes (por ejemplo, agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir el agente anti-microtúbulos, la composición anti-microtúbulos o la composición farmacéutica.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación.
Ejemplos
Como se expuso anteriormente, la inflamación crónica es un procedimiento caracterizado por la infiltración de tejidos con glóbulos blancos (macrófagos, linfocitos, neutrófilos y células plasmáticas), destrucción de tejidos por células inflamatorias y productos celulares (especies reactivas con oxígeno, enzimas de degradación de tejidos tales como metaloproteinasas de matriz) e intentos repetidos de reparación por sustitución del tejido conectivo (angiogénesis y fibrosis).
Con el fin de valorar los agentes anti-microtúbulos en cuanto a su capacidad para afectar a una inflamación crónica sobre los siguientes objetivos finales patológico/biológicos: (1) inhibición de la respuesta de glóbulos blancos (macrófagos, neutrófilos y células T) que inicia la cáscara inflamatoria; (2) inhibición de la hiperproliferación de células mesenquimales (fibroblastos, sinoviocitos, etc.) que conduce al desarrollo de fibrosis y pérdida de función de los órganos; (3) inhibición de la producción/actividad de metaloproteinasa de matriz que causa el deterioro de tejidos; (4) interrupción de la angiogénesis que aumenta la respuesta inflamatoria y proporciona el soporte metabólico necesario para el crecimiento y desarrollo del tejido fibroso; y (5) todo esto se debe conseguir sin toxicidad sustancial para las células parenquimales normales ni obstaculizar la síntesis normal de los componentes de la matriz (por ejemplo, colágeno y proteoglicanos).
Como se expone más en detalle con posterioridad, la actividad de los agentes que estabilizan microtúbulos tales como, por ejemplo, el paclitaxel, ha sido examinada en diversos tejidos y estados de enfermedades inflamatorias. Estos agentes demuestran una capacidad para alterar muchos de los parámetros de las enfermedades ante-
riores.
Ejemplo 1 Efecto de agentes anti-microtúbulos sobre la actividad de neutrófilos
El ejemplo describe el efecto de los agentes anti-microtúbulos sobre la respuesta de neutrófilos estimulados con cristales de CPPD opsonizados o zimosano opsonizado. Como se muestran en los modelos experimentales expuestos a continuación, los angentes anti-microtúbulos son fuertes inhibidores de la activación de neutrófilos inducida por partículas según se mide mediante quimioluminiscencia, producción de aniones de superóxidos y desgranulación en respuesta a microcristales o zimosano opsonizados con plasma.
A. Materiales y métodos
Se usó solución salina tamponada de Hanks (HBSS), pH 7,4 en todo este estudio. Todos los productos químicos fueron adquiridos de la empresa Sima Chemical Co. (St. Louis, MO) salvo que se establezca otra cosa. Todos los experimentos se realizaron a 37ºC salvo que se establezca otra cosa.
1. Preparación y caracterización de cristales
Se prepararon cristales de CPPD (triclínicos). La distribución de tamaños de los cristales fue de aproximadamente un 33% menor que 10 \mum, 58% entre 10 y 20 \mum y 9% mayor que 20 \mum. Los cristales preparados bajo las condiciones anteriores están exentos de pirógenos y los cristales producidos bajo condiciones exentas de pirógenos y estériles produjeron la misma magnitud de respuesta de neutrófilos que los cristales preparados bajo condiciones de laboratorio normales no estériles.
2. Opsonización de cristales y zimosano
Todos los experimentos que estudiaron las respuestas de neutrófilos a cristales o zimosano en presencia de paclitaxel se realizaron usando CPPD o zimosano opsonizados con plasma. La opsonización de cristales o zimosano se hizo con plasma heparinizado al 50% a una concentración de 75 mg de CPPD o 12 mg de zimosano por ml de plasma al 50%. Los cristales o el zimosano fueron incubados con plasma durante 30 minutos a 37ºC y seguidamente lavados en HBSS en exceso.
3. Preparación de neutrófilos
Los neutrófilos se prepararon a partir de sangre completa citrada humana recientemente recogida. Brevemente, 400 ml de sangre fueron mezclados con 80 ml de dextrano T500 al 4% (Pharmacia LKB, Biotechnology AB Uppsala, Suecia) en HBSS y se dejó que se depositaran durante 1 hora. El plasma fue recogido continuamente y se aplicaron 5 ml a 5 ml de Ficoll Paque (Pharmacia) en tubos de polipropileno de 15 ml (Coming, NY). Después de centrifugar a 500 g durante 30 minutos, los sedimentos de neutrófilos fueron lavados hasta dejarlos exentos de eritrocitos mediante 20 segundos de choque hipotónico. Los neutrófilos se volvieron a poner en suspensión en HBSS, se mantuvieron en hielo y se usaron para experimentos en 3 horas. La viabilidad y la pureza de los neutrófilos fue siempre mayor que 90%.
4. Incubación de neutrófilos con agentes anti-microtúbulos (a) Paclitaxel
Una solución madre de paclitaxel a 12 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) fue recientemente preparada antes de cada experimento. Esta solución madre fue diluida en DMSO para proporcionar soluciones de paclitaxel en el intervalo de concentración de 1 a 10 mM. Se añadieron volúmenes iguales de estas soluciones diluidas de paclitaxel a neutrófilos a 5.000.000 de células por ml bajo centrifugación suave para conseguir concentraciones de 0 a 50 \muM con una concentración final en DMSO de 0,5%. Las células se incubaron durante 20 minutos a 33ºC y seguidamente durante 10 minutos a 37ºC antes de la adición a cristales o zimosano.
(b) Fluoruro de aluminio
Se preparó recientemente una solución madre de fluoruro de aluminio (AlF_{3}) a 1 M en HBSS. Esta solución madre fue diluida en HBSS para proporcionar soluciones de AlF_{3} en el intervalo de concentraciones de 5 a 100 mM. Se añadieron volúmenes iguales (50 \mul) de estas soluciones diluidas de Alf_{3} a neutrófilos a 5.000.000 de células por ml incubadas durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió luminol (1 \muM) y seguidamente 20 \mul de zimosano opsonizado (concentración final = 1 mg/ml) para activar las células.
(c) Éster etílico de glicina
Se preparó recientemente una solución madre de éster etílico de glicina a 100 mM en HBSS. Esta solución madre fue diluida en HBSS para proporcionar soluciones de éster tílico de glicina en el intervalo de concentraciones de 0,5 a 10 mM. Se añadieron volúmenes iguales (50 \mul) de estas soluciones diluidas de éster etílico de glicina a neutrófilos a 5.000.000 de células por ml y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió luminol (1 \muM) y seguidamente 20 \mul de zimosano opsonizado (concentración final = 1 mg/ml) para activar las células.
(d) LY290181
Se preparó recientemente una solución madre de LY290181 a 100 \muM en HBSS. Esta solución madre fue diluida en HBSS para proporcionar soluciones de LY290181 en el intervalo de concentraciones de 0,5 a 50 \muM. Se añadieron volúmenes iguales (50 \mul) de estas soluciones diluidas de LY290181 a neutrófilos a 5.000.000 de células por ml y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió luminol (1 \muM) y seguidamente 20 \mul de zimosano opsonizado (concentración final = 1 mg/ml) para activar las células.
5. Ensayo de quimioluminiscencia
Todos los estudios de quimioluminiscencia se realizaron a concentraciones de células de 5.000.000 de células/ml en HBSS con CPPD (50 mg/ml). En todos los experimentos se añadieron 0,5 ml de células a 25 mg de CPPD o 0,5 mg de zimosano en 1,5 ml de tubos Eppendorf tapados. Se añadieron 10 \mul de luminol disueltos en DMSO al 25% en HBSS hasta una concentración final de 1 M y las muestras se mezclaron para iniciar la activación de neutrófilos por los cristales el zimosano. La quimioluminiscencia se verificó usando un luminómetro LKB (modelo 1250) a 37ºC durante 20 minutos con agitación inmediatamente antes de las mediciones para volver a poner en suspensión los cristales o el zimosano. Los tubos testigos contenían células, fármaco y luminol (los cristales estaban ausentes).
6. Generación de anión de superóxido
Las concentraciones de aniones de superóxidos se midieron usando la reducción inhibible de superóxido-dismutasa del ensayo del citocromo C. Brevemente, 25 mg de cristales o 0,5 mg de zimosano se colocaron en un tubo Eppendorf tapado de 1,5 ml y se calentaron a 37ºC. Se añadieron 0,5 ml de células a 37ºC junto con ferricitocromo C (concentración final 1,2 mg/ml) y las células fueron activadas volteando los tubos tapados. En los momentos adecuados, los tubos fueron centrifugados a 10.000 g durante 10 segundos y la materia sobrenadante se recogió para ser ensayada midiendo la absorbancia a 550 nm. Los tubos testigos fueron constituidos bajo las mismas condiciones, con la inclusión de superóxido-dismutasa a 600 unidades por ml.
7. Ensayo de desgranulación de enutrófilos
Tubos Eppendorf de 1 milímetro y medio que contienen 25 mg de CCPPD o 1 mg de zimosano fueron precalentados a 37ºC. Se añadieron 0,5 ml de células a 37ºC y seguidamente se agitó vigorosamente para iniciar las reacciones. En los tiempos apropiados, los tubos fueron centrifugados a 10.000 g durante 10 segundos y se almacenaron 0,4 ml de la materia sobrenadante a -20ºC para un ensayo posterior.
Se ensayó la lisozima por la disminución de la absorbancia a 450 nm de una suspensión de Micrococcus lisodeikticus. Brevemente, se puso en suspensión Micrococcus lisodeikticus a 0,1 mg/ml en tampón de fosfato de potasio 65 mM, pH 6,2, y se ajustó la absorbancia a 450 nm hasta 0,7 unidades por dilución. El cristal (o el zimosano) y la materia celular sobrenadante (100 \mul) fueron añadidos a 2,5 ml de la suspensión de Micrococcus y se verificó la disminución de la absorbancia. Se prepararon patrones de lisozimas (clara de huevo de gallina) en el intervalo de 0 a 2.000 unidades/ml y se obtuvo un gráfico de calibración de la concentración de lisozima frente a la velocidad de la disminución de la absorbancia a 450 nm.
Se midió la actividad de mieloperoxidasa (MPO) mediante el aumento de absorbancia a 450 mm que acompaña a la oxidación de dianisidina. Se disolvieron 7,8 mg de dianisidina en 100 ml de tampón de citrato 0,1 M, pH 5,5, a 3,2 mM, por sonicación. A una cubeta de 1 ml se añadieron 0,89 ml de la solución de dianisidina, seguida de 50 \mul de Triton x 100 al 1%, 10 \mul de peróxido de hidrógeno al 0,05% en solución acuosa y 50 \mul de materia sobrenadante de cristales-células. La actividad de MPO se determinó a partir del cambio en la absorbancia (450 nm) por minuto, Delta 450, usando la siguiente ecuación:
Oxidación de dianisidina (nmol/min) = 50 x Delta \ring{A} 450
8. Viabilidad de neutrófilos
Para determinar el efecto de los agentes anti-microtúbulos sobre la viabilidad de neutrófilos, se midió la liberación de la enzima marcadora citoplásmica, lactato-deshidrogenasa (LDH). Se ensayaron también en cuanto a LDH tubos testigos que contenían células con fármacos (en ausencia de cristales) a partir de experimentos de desgranulación.
B. Resultados
En todos los experimentos se determinó el carácter significativo estadístico usando el ensayo t de Students y se reivindicó un carácter significativo a p<0,05. Cuando se muestran barras de error, describen una desviación típica alrededor del valor medio para el número n dado.
1. Viabilidad de neutrófilo (a) Paclitaxel
Los neutrófilos tratados con paclitaxel a 46 AM durante una hora a 37ºC no mostraron ningún nivel aumentado de liberación de LDH (siempre menor que 5% del total) por encima de los testigos, indicando que el paclitaxel no causó muerte celular.
(b) Fluoruro de aluminio
Los neutrófilos tratados con fluoruro de aluminio a un intervalo de concentraciones de 5 a 100 mM durante 1 hora a 37ºC no mostraron ningún nivel aumentado de liberación de LDH por encima de los testigos, indicando que el fluoruro de aluminio no causó muerte celular.
(c) Éster etílico de glicina
Los neutrófilos tratados con éster etílico de glicina a un intervalo de concentraciones de 0,5 a 20 mM durante 1 hora a 37ºC no mostraron ningún nivel aumentado de liberación de LDH por encima de los testigos indicando que el éster etílico de glicina no causó muerte celular.
2. Quimioluminiscencia (a) Paclitaxel
El paclitaxel a 28 \muM produjo una fuerte inhibición de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida tanto por CPPD opsonizado con plasma como zimosano opsonizado con plasma, como se muestra en las Figuras 1A, 1B y 2A, respectivamente. La inhibición de la respuesta pico de quimioluminiscencia fue de 52% (+/-12%) y 45% (+/-11%) para CPPD y zimosano, respectivamente. La inhibición por paclitaxel a 28 \muM de la quimioluminiscencia inducida tanto por CPPD opsonizado con plasma como zimosano opsonizado con plasma fue significativa para todos los tiempos desde 3 hasta 16 minutos (Figuras 1 y 4A). Las Figuras 1A y 1B muestran la dependencia de la concentración de la inhibición por paclitaxel de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por CPPD opsonizado con plasma. En todos los experimentos, las muestras testigo no produjeron nunca valores de la quimioluminiscencia mayores que 5 mV y la adición de paclitaxel a todas las concentraciones usadas en este estudio no tuvo ningún efecto sobre los valores de la quimioluminiscencia de los testigos.
(b) Fluoruro de aluminio
El fluoruro de aluminio a concentraciones de 5 a 100 mM produjo una fuerte inhibición de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado con plasma, como se muestra en la Figura 1C. Esta figura muestra la dependencia de la concentración de la inhibición por AlF_{3} de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado con plasma. La adición de AlF_{3} a todas las concentraciones usadas en este estudio no tuvo ningún efecto sobre los valores de la quimioluminiscencia de los testigos.
(c) Éster etílico de glicina
El éster etílico de glicina a concentraciones de 0,5 a 20 mM produjo una fuerte inhibición de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado con plasma, como se muestra en la Figura 1D. Esta figura muestra la dependencia de la concentración de la inhibición de éster etílico de glicina de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado con plasma. La adición de éster etílico de glicina a todas las concentraciones usadas en este ensayo no tuvo ningún efecto sobre los valores de la quimioluminiscencia de los testigos.
(d) LY290181
El LY290181 a concentraciones de 0,5 a 50 \muM produjo una fuerte inhibición de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado con plasma, como se muestra en la Figura 1E. Esta figura muestra la dependencia de la concentración de la inhibición de LY290181 de la quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por zimosano opsonizado con plasma. La adición de LY290181 a todas las concentraciones usadas en este estudio no tuvo ningún efecto sobre los valores de la quimioluminiscencia de los testigos.
3. Generación de superóxidos
El transcurso del tiempo de la producción de aniones de superóxido inducidos por cristales de CPPD opsonizados con plasma, medido por la reducción inhibible de superóxido-dismutasa (SOD) de citocromo C se muestra en la Figura 3. El tratamiento de las células con paclitaxel a 28 \muM produjo una disminución en la cantidad de superóxido generado para todos los tiempos. Esta disminución fue significativa para todos los tiempos mostrados en la Figura 3A. La dependencia de la concentración de esta inhibición se muestra en la Figura 3B. La estimulación de la producción de aniones de superóxido por zimosano opsonizado (Figura 4B) mostró un transcurso del tiempo similar a la activación inducida por CPPD. La producción de aniones de superóxido inducida por zimosano por paclitaxel a 28 \muM fue menos considerable que la inhibición de la activación por CPPD, pero fue significativa para todos los tiempos mostrados en la Figura 4B.
El tratamiento de neutrófilos inducidos por cristales de CPPD con LY290181 a 47 \muM produjo también una disminución en la cantidad de superóxido generado (Figura 3C).
4. Desgranulación de neutrófilos
La desgranulación de neutrófilos se verificó por la liberación inducida por cristales de CPPD opsonizados con plasma de mieloperoxidasa y lisozima o la liberación inducida por zimosano opsonizado con plasma de mieloperoxidasa. Se ha mostrado que cantidades suficientes de estas dos enzimas son liberadas en los medios extracelulares cuando se usan cristales de CPPD revestidos con plasma para estimular neutrófilos sin necesidad de añadir citocalasina B a las células. Las Figuras 5 y 2 muestran el transcurso del tiempo de la liberación de MPO y lisozima respectivamente, a partir de neutrófilos estimulados por CPPD revestidos con plasma. La Figura 5A muestra que el paclitaxel inhibe la liberación de mieloperoxidasa a partir de neutrófilos activados por CPPD opsonizado con plasma en los primeros 9 minutos de la incubación de los cristales-células. El paclitaxel inhibió significativamente la liberación de mieloperoxidasa inducida por CPPD para todos los tiempos, como se muestra en la Figura 5A. La Figura 5B muestra la dependencia de la concentración de la inhibición por paclitaxel de la liberación de mieloperoxidasa inducida por CPPD:
El paclitaxel a 28 \muM redujo la liberación de lisozima, y esta inhibición de la desgranulación fue significativa para todos los tiempos, como se muestra en la Figura 2.
Solamente cantidades menores de MPO y lisozima fueron liberadas cuando los neutrófilos fueron estimulados con zimosano opsonizado. A pesar de estos bajos niveles, fue posible verificar una inhibición del 50% de la liberación de MPO después de una incubación de 9 minutos en presencia de paclitaxel a 28 \muM, pero fue estadísticamente significativa (p<0,05) (no se muestran los datos). El tratamiento de neutrófilos inducidos por cristales de CPPD con LY290181 a 17 \muM disminuyó la liberación tanto de lisozima como de mieloperoxidasa desde las células (Figuras 5C y 5D).
C. Explicación
Estos experimentos demuestran que el paclitaxel y otros agentes anti-microtúbulos son fuertes inhibidores de la activación de neutrófilos inducidas por cristales. Además, mostrando niveles similares de inhibición en respuestas de neutrófilos a otra forma de activador en forma de partículas, el zimosano opsonizado, es evidente que la actividad inhibidora del paclitaxel y otros agentes anti-microtúbulos no se limita a las respuestas de neutrófilos a cristales. El paclitaxel, fluoruro de aluminio, éster etílico de glicina y LY290181 mostraron también que eran fuertes inhibidores de la activación de neutrófilos inducida por zimosano sin causar la muerte celular. El LY290181 se mostró que disminuía la producción de aniones de superóxidos y la desgranulación de neutrófilos inducida por cristales de CPDD.
Ejemplo 2 Respuesta de células T a un estímulo antigénico
Con el fin de determinar si el paclitaxel afecta a la activación de células T en respuesta a estimulagenes, clones de células T TR1 fueron estimulados con el péptido de proteína básica de mielina, GP68-88, o la lectina, con A, durante 48 horas en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de paclitaxel en una formulación micelar. El paclitaxel fue añadido al comienzo de experimento o 24 horas después de la estimulación de las células con péptido o con A. La incorporación de timidina tritiada se determinó como una medida de la proliferación de células T en respuesta a una estimulación con péptidos o con A.
Los resultados demostraron que la estimulación de células T aumentaron en respuesta al péptido GP68-88 y con A. En presencia de micelas polímeros testigos, la estimulación de células T en respuesta a ambos agonistas no se alteró. Sin embargo, el tratamiento con micelas de paclitaxel, al comienzo del experimento o bien 24 horas después de la estimulación, disminuyó la respuesta de células T en una manera dependiente de la concentración. Bajo ambas condiciones, la proliferación de células T fue completamente inhibida por paclitaxel 0,02 \muM (Figura 79).
Estos datos indican que el paclitaxel es un potente inhibidor de la proliferación de células T en respuesta a la estimulación inducida por antígenos.
Ejemplo 3 Efecto de paclitaxel sobre la proliferación de células de sinoviocitos in vitro
Los experimentos se realizaron con el fin de valorar el efecto de concentraciones diferentes de paclitaxel sobre la incorporación de timidina tritiada (una medición de la síntesis de DNA de sinoviocitos) y la proliferación celular in vitro.
A. Materiales y métodos 1. Incorporación de H^{3}-timidina en sinoviocitos
Se incubaron sinoviocitos con concentraciones diferentes de paclitaxel (10^{-5} M, 10^{-6} M, 10^{-7} M y 10^{-8} M) continuamente durante 6 ó 24 horas in vitro. En estos valores del tiempo, se añadió 1 x 10^{-6} cpm de H^{3}-timidina al cultivo celular y se incubó durante 2 horas a 37ºC. Las células se colocaron a través de un colector celular, se lavaron a través de un filtro, los filtros se cortaron y se determinó la cantidad de radiación contenida en las secciones del filtro. Una vez que se determinó la cantidad de timidina incorporada en las células, se usó para determinar la velocidad de proliferación celular. Este experimento se repitió tres veces y se confrontaron los datos.
2. Proliferación de sinoviocitos
Se hicieron crecer fibroblastos sinoviales bovinos en presencia y ausencia de concentraciones diferentes (10^{-5} M, 10^{-6} M, 10^{-7} M y 10^{-8} M) de paclitaxel durante 24 horas. Al final de este período de tiempo, se determinó el número total de células de sinoviocitos viables visualmente por recuento mediante exclusión con colorante usando una tinción con azul de trípano. Este experimento se realizó 4 veces y se recogieron los datos.
B. Resultados 1. Incorporación de H^{3}-timidina en sinoviocitos
Este estudio demostró que el paclitaxel a bajas concentraciones inhibe la incorporación de H^{3}-timidina (y por extensión la síntesis de DNA) en sinoviocitos a concentraciones tan bajas como 10^{-8} M. A las seis horas no hubo ninguna diferencia significativa entre el grado de inhibición producido por las concentraciones superiores frente a las inferiores de paclitaxel (Figura 8). Sin embargo, en 24 horas se perdió parte del efecto a las concentraciones inferiores del fármaco (10-8 M), pero era todavía sustancialmente inferior que el observado en animales testigos.
2. Proliferación de sinoviocitos
Este estudio demostró que el paclitaxel era citotóxico para la proliferación de fibroblastos sinoviales en una manera dependiente de la concentración. El paclitaxel a concentraciones tan bajas como 10^{-7} M es capaz de inhibir la proliferación de los sinoviocitos (Figura 9). A concentraciones más elevadas de paclitaxel (10^{-6} M y 10^{-5} M) el fármaco era tóxico respecto a los fibroblastos sinoviales in vitro.
C. Explicación
El estudio anterior demuestra que el paclitaxel es capaz de inhibir la proliferación de fibroblastos derivados de sinovio a concentraciones relativamente bajas in vitro. Por lo tanto, dada la función del tejido conectivo en el desarrollo de la inflamación crónica y su comportamiento durante la patogénesis de la enfermedad inflamatoria, el bloqueo de la proliferación celular afectará favorablemente al desenlace de la enfermedad in vivo.
Ejemplo 4 (Ejemplo de referencia)
Caracterización de la actividad de paclitaxel sobre queratinocitos epidermales humanos in vitro
Se investigó los efectos dependientes del tiempo y de la dosis de paclitaxel sobre queratinocitos humanos de proliferación activamente normal y queratinocitos HaCAT (queratinocitos epidérmicos humanos espontáneamente inmortalizados).
A. Materiales y métodos
El efecto de paclitaxel sobre los queratinocitos se valoró determinando el número de células y la incorporación de H^{3}-timidina por las células. Para la incorporación de timidina, los queratinocitos dispuestos en placas a baja densidad (en DMEM, complementado con 10% de FCS, glutamina, antibióticos) fueron tratados con concentraciones de paclitaxel de 0 a 10^{-4} M durante 6 horas durante el crecimiento logarítmico. La H^{3}-timidina fue añadida a las células e incubada durante 6 horas adicionales. Las células fueron recolectadas y se determinó la radioactividad. Para determinar los números totales de células, los queratinocitos fueron dispuestos en placas como se describió y fueron incubados en presencia y ausencia de paclitaxel durante 4 días. Después de la incubación, las células fueron recogidas y contadas mediante el ensayo de exclusión de azul de trípano.
B. Resultados
Se determinó el número de células viables como un porcentaje de testigos sin tratar. A una concentración de paclitaxel de 10^{-9} M, la viabilidad celular fue mayor que 100% de testigos sin tratar, mientras que a una viabilidad de 10^{-8} M, la viabilidad fue ligeramente menor a 87% (Figura 7). Hubo una caída significativa de la viabilidad celular a una concentración de paclitaxel de 10^{-7} o mayor.
C. Explicación
El paclitaxel fue extremadamente citotóxico para queratinocitos humanos a concentraciones tan bajas como 10^{-7} M. En la psoriasis, los queratinocitos son células anormalmente proliferadoras, y como el paclitaxel estabiliza los microtúbulos, es de esperar su efecto en este sistema mitóticamente activo. En otros estudios, se encontró que el paclitaxel era citotóxico para sinoviocitos en proliferación, pero no tenía ningún efecto sobre condrocitos no proliferantes. Por tanto, el paclitaxel puede actuar sobre las células hiperproliferantes en lesiones psoriáticas, mientras que es no tóxico para las células epideramales normales.
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Ejemplo 5 (Ejemplo de Referencia)
Efecto de paclitaxel sobre la proliferación de astrocitos
Está bien establecido que hay un aumento en los números de astrocitos fribrosos en las lesiones de MS, que se cree que están involucrados en la destrucción de mielina a través de la producción de citoquinas y metaloproteinasas de matriz (Mastronardi et al., J. Neurosci. Res. 36:315-324, 1993; Chandler et al., J. Neuroimmunol. 72:155-161, 1997). Los astrocitos fibrosos tienen niveles elevados de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) que sirve como un marcador bioquímico para la proliferación de astrocitos fibrosos. La capacidad de las micelas de paclitaxel para inhibir la proliferación de astrocitos se valoró en un modelo de ratón transgénico de enfermedad desmielinante (Mastronarci et al., J. Neurosci. Res. 36:315-324, 1993).
A. Materiales y métodos
La administración subcutánea de una terapia continua de paclitaxel (2 mg/kg; 3 x semana, total de 10 inyecciones) se inició al comienzo clínico de la enfermedad (aproximadamente 4 meses de tiempo). Cinco animales recibieron paclitaxel micelar, dos ratones fueron usados como testigos; un ratón era uno normal no tratado y uno era un ejemplar transgénico sin tratar. Solo se usó un ratón transgénico como testigo porque el transcurso de la enfermedad ha sido bien establecido en el laboratorio. Animales de cuatro meses de edad fueron inyectados con paclitaxel micelar después de que fueran evidentes las señales iniciales de la patología neurológica de la MS.
Tres días después de la décima inyección, se terminó el estudio experimental y los tejidos cerebrales fueron tratados para análisis histológicos. Para el microscopio de luz, los tejidos fueron fijados en formalina e incrustados en parafina. Las secciones fueron teñidas con anticuerpo anti-GFAP (DACO), lavados y seguidamente se hicieron reaccionar con anticuerpo secundario conjugado con HPP. Las secciones fueron teñidas para HPP y contra-teñidas con hematoxilina. Para el microscopio electrónico, los tejidos fueron fijados en glutaraldehído al 2,5% y solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) y posteriormente fijados con tetróxido de osmio al 1%. Las secciones fueron preparadas y observadas con un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1200 EX II.
B. Resultados
A medida que progresa la patología neurológica, los niveles de GFAP se elevan en los cerebros de ratones transgénicos. Esto se cree que refleja un aumento del número de astrocitos fibrosos presentes. Por el contrario, los ratones transgénicos tratados con paclitaxel tenían niveles casi normales de GFAP (Tabla 1). Estos datos sugieren que el paclitaxel puede inhibir la proliferación de astrocitos in vivo, lo que puede contribuir a la prevención de la desmielinación en la MS.
1
Un análisis adicional de GFAP en el tejido de cerebro fue valorado histológicamente. La Figura 78 ilustra secciones de cerebro de ratones normales, ratones transgénicos testigos no tratados con paclitaxel y ratones transgénicos tratados con paclitaxel.
Aunque los ratones transgénicos testigos tienen números más elevados de astrocitos fibrosos, la morfología de los astrocitos es similar a la observada en animales normales (procedimientos estrellados gruesos extendiéndose desde la estructura celular). Sin embargo, en los ratones transgénicos tratados con paclitaxel, el número de astrocitos fibrosos disminuyó significativamente. Adicionalmente, se observaron dos cambios morfológicos: la estructura celular de los astrocitos fibrosos parece redondearse (que se ha mostrado que conduce a apoptosis en el cultivo) y los procedimientos celulares se hacen muy finos alrededor de la estructura celular.
Un análisis ultraestructural adicional usando microscopía electrónica ha mostrado que los astrocitos de ratones transgénicos estaban caracterizados por procedimientos astrocíticos densamente teñidos que se originaban a partir de la estructura celular. Estos procedimientos amplios contienen una disposición bien organizada de filamentos que indican una célula viable activada. Sin embargo, la morfología de los astrocitos en los animales trangénicos tratados con paclitaxel estaba caracterizada por un redondeo celular, procedimientos filamentosos finos y agotamiento intracelular y desorganización de proteínas filamentosas (Figura 80).
C. Conclusiones
Estos datos demuestran que el paclitaxel causa cambios respecto a los astrocitos fibrosos in vivo, el tipo de célula más proliferadora en las lesiones de MS. Es probable que el paclitaxel esté inhibiendo también la función de los procedimientos astrocíticos y, por tanto, puede alterar los acontecimientos celulares involucrados en la destrucción de mielina.
Ejemplo 6 Efecto de paclitaxel sobre la proliferación de células endoteliales
Con el fin de determinar si el paclitaxel inhibe la proliferación de células endoteliales, células de EOMA (una línea celular endotelial) fueron colocadas a baja densidad y fueron incubadas en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de paclitaxel durante 48 horas. Después de la incubación, se determinó el número de células viables usando el ensayo de exclusión de azul de trípano. Los resultados (proporcionados en la Figura 9) muestran que el paclitaxel a concentraciones de 10^{-8} M inhibía la proliferación de células endoteliales por encima de 50% y a concentraciones de 10^{-7} M o mayores se inhibió completamente la proliferación celular. Estos datos demuestran que el paclitaxel es un potente inhibidor de la proliferación de células endoteliales. Se realizaron unos ensayos de toxicidad celular tres veces, y cada medición individual se hizo por triplicado.
Con el fin de determinar el efecto del paclitaxel sobre la ciclación de células endoteliales y la apoptosis, se incubaron células EOMA en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de paclitaxel durante 24 horas. Las células fueron fijadas con formaldehído al 3,7% en solución salina tamponada con fosfato durante 20 minutos y teñidas con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), 1 \mug/ml y se examinaron con un objetivo de 40x bajo instrumentos ópticos epifluorescentes. Las células apoptóticas fueron evaluadas valorando las células en cuanto a núcleos fragmentados y cromatina condensada. Los datos muestran que las concentraciones de paclitaxel mayores que 10^{-8} M indujeron la apoptosis de células endoteliales (Figura 10).
Ejemplo 7 Protocolo de ensayo de proliferación (MTT)
En el primer día, 5-10 x 10^{4} sinoviocitos fueron dispuestos en placas por pocillo (placa de 96 pocillos). La columna nº 1 se mantuvo exenta de células (ensayo en blanco). En el día 2, la placa se hizo pasar rápidamente para desechar el medio y se añadieron 200 \mul de medio que contenía diversas concentraciones de fármaco. Las células fueron expuestas durante 6 horas, 24 horas ó 4 días. No se añadió fármaco a las columnas nº 1 y nº 2 (blanco y testigo sin tratar, respectivamente). El medio que contenía el fármaco fue desechado y se añadieron 200 \mul de medio completo de nueva aportación. Seguidamente se dejó que las células crecieran durante 3 a 4 días adicionales. En el día cinco, se añadieron 200 \mul de sal de bromuro de dimetiltiazoldifeniltetrazolio (MTT) (5 mg/ml PBS) y se dejó incubar durante 4 horas a 37ºC. El medio fue sedimentado y se añadieron 200 \mul de DMSO. La Placa fue agitada durante 30 minutos y se leyó la absorbancia a 562 nm.
Resultados
Los datos se expresaron como el % de supervivencia que se obtuvo dividiendo el número de células que permanecía después del tratamiento por el número de células en la columna nº 2 testigo sin tratar (el número de células se obtuvo a partir de un patrón hecho antes del ensayo). La IC_{50}, la concentración de fármaco que destruye un 50% de la población, puede ser interpolada a partir de las Figuras 1A-E. Durante una exposición de 24 horas, el compuesto LY290181 se encontró que era el agente anti-microtúbulos más potente para reducir e inhibir la proliferación de células, con una IC_{50} de menos de 5 nM (Figura C). El paclitaxel, la epotilona B y la tubercidina eran ligeramente menos potentes con IC_{50}s de aproximadamente 30 nM (Figura A), 45 nM (Figura F) y 45 nM (Figura B), respectivamente. Finalmente, las IC_{50}s para fluoruro de aluminio (AlF_{3}) y hexilenglicol fueron significativamente mayores, con valores de aproximadamente 32 \muM (Figura E) y 64 mM (Figura D), respectivamente.
Ejemplo 8 Efecto de paclitaxel y otros agentes anti-microtúbulos sobre la producción de metaloproteinasa de matriz A. Materiales y métodos 1. Actividad transcripcional de AP-1 estimulada por IL-1 inhibida por paclitaxel
Fueron transfectados condrocitos con construcciones que contenían un gen reportero CAT conducido por AP-1, y estimulados con IL-1, se añadió IL-1 (50 ng/ml) y se incubó durante 24 horas en ausencia y presencia de paclitaxel a diversas concentraciones. El tratamiento con paclitaxel disminuyó la actividad de CAT en una manera dependiente de la concentración (media + SD). Los datos señalados con un asterisco (*) tienen carácter significativo comparados con la actividad de CAT inducida por IL-1 según un ensayo t, P<0,05. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
2. Efecto de paclitaxel sobre la actividad de unión de DNA de AP-1 inducida por IL-1, DNA de AP-1
La actividad de unión fue ensayada con una sonda de secuencia de AP-1 humana radiomarcada y un ensayo del cambio de la movilidad sobre gel. Extractos de condrocitos sin tratar o tratados con diversas cantidades de paclitaxel (10^{-7} a 10^{-5} M) seguida de IL 1\beta (20 ng/ml) fueron incubados con sonda en exceso sobre hielo durante 30 minutos y seguidamente mediante electroforesis de gel no desnaturalizante. La hilera "com" contiene oligonucleótido de AP-1 sin marcar en exceso. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
3. Efecto de paclitaxel sobre la expresión de mRNA de MMP-1 y MMP-3 inducida por IL-1
Se trataron células con paclitaxel a diversas concentraciones (10^{-7} a 10^{-5} M) durante 24 horas. Seguidamente, fueron tratadas con IL-1 \beta (20 ng/ml) durante 18 horas adicionales en presencia de paclitaxel. Se aisló el RNA total, y se determinaron los niveles de mRNA de MMP-1 mediante un análisis de transferencia Northern. Las transferencias fueron seguidamente retiradas y nuevamente examinadas con GAPDH- cDNA de rata radiomarcado con P^{32}, que se usó como un gen doméstico. Los resultados mostrados son representativos de cuatro experimentos independientes. Cuantificación de niveles de mRNA de expresión de colagenasa-1 y estromelisina. Los niveles de expresión de MP-1 y MMP-3 fueron normalizados con GAPDH.
4. Efecto de otros anti-microtúbulos sobre la expresión de colagenasa
Cultivos de condrocitos primarios fueron recientemente aislados a partir de cartílago de ternera. Las células se dispusieron en placas a 2,5 x 10^{6} por ml en platos de cultivo de 100 x 200 mm y fueron incubadas en medio F12 de Ham que contenía 5% de FBS durante una noche a 37ºC. Las células fueron subalimentadas en medio exento de suero durante una noche y seguidamente tratadas con agentes anti-microtúbulos a diversas concentraciones durante 6 horas. Seguidamente se añadió IL-1 (20 ng/mg) a cada placa y las placas fueron incubadas durante 18 horas adicionales. Se aisló RNA total mediante el método de isotiocianato de guanidina acidificado y fue sometido a electroforesis sobre un gel desnaturalizado. Se analizaron muestras de RNA desnaturalizadas (15 \mug) por electroforesis sobre gel en gel desnaturalizado al 1% y fueron transferidas a una membrana de nilón e hibridadas con la sonda de colagenasa-cDNA marcada con P^{32}. El gliceraldehído-fosfato-deshidrasa (GAPDH)-cDNA marcado con P^{32} es un patrón interno para asegurar una carga aproximadamente igual. Las películas expuestas fueron exploradas y cuantitativamente analizadas con ImageQuant.
B. Resultados 1. Promotores sobre el grupo de metaloproteinasas de matriz
La Figura 19A muestra que todas las metaloproteinasas de matriz contenían los elementos transcripcionales AP-1 y PEA-3, con la excepción de la Gelatinasa B. Se ha establecido bien que la expresión de metaloproteinasas de matriz tales como colagenasas y estromelisinas dependen de la activación de los factores de transcripción AP-1. Por tanto, los inhibidores de AP-1 inhibirán la expresión de metalo-proteinasas de matriz.
2. Efecto de paclitaxel sobre la actividad transcripcional de AP-1
Como se demostró en la Figura 19B, la IL-1 estimuló 5 veces la actividad transcripcional de AP-1. El pretratamiento de condrocitos transitoriamente transfectados con paclitaxel redujo la actividad CAT del gen reportero AP-1 inducido por IL-1. Por tanto, la actividad de AP-1 inducida por IL-1 se redujo en condrocitos por paclitaxel de una manera dependiente de la concentración (10^{-7} a 10^{-5} M). Estos datos demostraron que el paclitaxel era un potente inhibidor de la actividad de AP-1 en condrocitos.
3. Efecto de paclitaxel sobre la actividad de unión de DNA de AP-1
Para confirmar que la inhibición por paclitaxel de la actividad de AP-1 no era debida a efectos no específicos, se examinó el efecto de paclitaxel sobre la unión de AP-1 inducida por IL-1 a oligonucleótidos usando lisados nucleares de condrocitos. Como se muestra en la Figura 19C, la actividad de unión inducida por IL-1 disminuía en lisados de condrocitos que habían sido pretratados con paclitaxel a una concentración de 10^{-7} a 10^{-5} M durante 24 horas. La inhibición por paclitaxel de la actividad transcripcional de AP-1 se correlacionaba estrechamente con la disminución de la unión de AP-1 a DNA.
4. Efecto de paclitaxel sobre la expresión de colagenasa y estromelisina
Como el paclitaxel era un inhibidor potente de la actividad de AP-1, se examinó el efecto del paclitaxel o la expresión de colagenasa y estromelisina inducida por IL-1, dos metaloproteinasas de matriz importantes involucradas en las enfermedades inflamatorias. Brevemente, como se muestra en la Figura 20, la inducción de IL-1 aumenta los niveles de mRNA de colagenasa y estromelisina en condrocitos. El pretratamiento de condrocitos con paclitaxel durante 24 horas redujo significativamente los niveles de mRNA de colagenasa y estromelisina. Para un valor de paclitaxel de 10^{-5} M, hubo una inhibición completa. Los resultados muestran que el paclitaxel inhibió completamente la expresión de dos metaloproteinasas de matriz a concentraciones similares a las que inhibe la actividad de AP-1.
5. Efecto de otros anti-microtúbulos sobre la expresión de colagenasa
Las Figuras 12A-H demuestran que los agentes anti-microtúbulos inhibían la expresión de colagenasa. La expresión de colagenasa fue estimulada mediante la adición de IL-1, que es una citoquina proinflamatoria. La pre-incubación de condrocitos con diversos agentes anti-microtúbulos, específicamente LY290181, hexilen-glicol, óxido de deuterio, éster etílico de glicina, AlF_{3}, tubercidina-epotilona y bis(succinimidilsuccinato) de etilenglicol, evitó en todos los casos de expresión de colagenasa inducida por IL-1 a concentraciones tan bajas como 1 x 10^{-7} M.
C. Explicación
El paclitaxel fue capaz de inhibir la expresión de colagenasa y estromelisina in vitro a concentraciones de 10^{-6} M. Como esta inhibición puede ser explicada por la inhibición de la actividad de AP-1, una etapa requerida en la reducción de todas las metaloproteinasas de matriz con la excepción de gelatinasa B, es de esperar que el paclitaxel inhiba otras metaloproteinasas de matriz que sean dependiente de AP-1. Los niveles de estas metaloproteinasas de matriz son elevados en todas las enfermedades inflamatorias y desempeñan una función principal en la degradación de la matriz, en el desplazamiento y proliferación celular y en la angiogénesis. Por tanto, la inhibición por paclitaxel de la expresión de metaloproteinasas de matriz tales como colagenasa y estromelisina tendrá un efecto ventajoso en las enfermedades inflamatorias.
Ejemplo 9 Efecto de agentes anti-microtúbulos sobre la expresión de proteoglicanos
Se aislaron de forma reciente cultivos de condrocitos primarios aislados a partir de cartílago de ternera. Las células se dispusieron en placas a 2,5 x 10^{-6} por ml en platos de cultivo de 100 x 200 mm y se incubaron en medio F12 de Ham que contenía FBS al 5% durante una noche a 37ºC. Las células fueron subalimentadas en medio exento de suero durante una noche y seguidamente fueron tratadas con agentes anti-microtúbulos a diversas concentraciones 10^{-17} M, 10^{-6} M, 10^{-5} M y 10^{-4} M) durante 6 horas. Seguidamente se añadió IL-1 (20 ng/ml) a cada placa y las placas se incubaron durante 18 horas adicionales. El RNA total se aisló mediante el método de isotiocianato de guanidina acidificado y fue sometido a electroforesis sobre un gel desnaturalizado. Las muestras de RNA desnaturalizadas (15 \mug) fueron analizadas por electroforesis sobre gel en un gel desnaturalizado al 1%, transferidas a una membrana de nilón e hibridadas con la sonda de cDNA de proteoglicano marcado con P^{32} (aggrecan). El cDNA de gliceraldehído-fosfato-deshidrasa marcado con P^{32} (GAPDH) es un patrón interno para asegurar una carga aproximadamente igual. Las películas expuestas fueron exploradas y cuantitativamente analizas con ImageQuant.
Resultados
Las Figuras 13A-H muestran que los agentes anti-microtúbulos que tenían un efecto inhibidor sobre la expresión de colagenasa (Ejemplo 8), específicamente LY290181, hexilen- glicol, óxido de deuterio, éster etílico de glicina, AlF_{3}, turbecidina-epotilona y bis(succinimidilsuccinato) de etilenglicol, no afectaron a la expresión de aggrecan, un componente principal de la matriz de los cartílagos, en todas las concentraciones evaluadas.
Ejemplo 10 Ensayo de actividad NF-\kappaB (basado en células)
La IL-1 y el TNF fueron identificados ambos como citoquinas proinflamatorias que activan la transcripción de genes conducidos por un factor de transcripción denominado NF-\kappaB, involucrado también en procedimientos inflamatorios. Por lo tanto, el efecto inflamatorio de IL-1 y TNF puede ser indirectamente valorado por medio de un ensayo de gen reportero (NF-\kappaB) que responda a la estimulación de IL-1 y TNF.
En el día primero, 5 x 10^{4} NIH-3T3 (fibroblasto de murina), establemente transfectado con construcción reportera NF-\kappaB (Luciferase, Promega Corp.), fue dispuesto en placas por pocillo (placa de 24 pocillos). Una vez que eran confluentes (en los días 3-4), las células fueron subalimentadas sustituyendo el medio completo con 1 ml de medio exento de suero. Después de 24 horas de subalimentación, las células las fueron tratadas con diversas concentraciones de agentes anti-microtúbulos 6 horas antes de la adición de IL-1 (20 ng/ml) y TNF (20 ng/ml). Las células fueron expuestas a IL-1 y TNF durante 1 hora y 16 horas y la actividad de NF-\kappaB se midió 24 horas después. En el quinto día, el medio fue desechado y las células fueron aclaradas una vez con PBS. Las células fueron seguidamente extraídas durante 15 minutos con 250 \mul de tampón de lisis (Promega Corp., Wisconsin). La actividad transcripcional de NF-\kappaB se valoró añadiendo 25 \mul de sustrato de luciferasa a un tubo que contenía 2,5 \mul de extracto de células. El tubo fue inmediatamente insertado en un luminómetro (Turner Designs) y se midió la emisión de luz durante 10 segundos. Los datos de la luciferasa fueron seguidamente normalizados para la concentración de proteínas.
Resultados
Los datos fueron expresados mostrando la interferencia que los agentes anti-microtúbulos exhibían sobre la inducción de NF-\kappaB (inducción multiplicada). Como se muestra en las Figuras 80A, 80B, 80C y 80D, la tubercidina y el paclitaxel inhibían la actividad de NF-\kappaB inducida tanto por IL-1 como por TNF. El efecto inhibidor de la tubercidina y el paclitaxel para los tratamiento de 6 horas y 24 horas fue de aproximadamente 10 \muM y 2 \muM, respectivamente.
Ejemplo 11 Inhibición de la angiogénesis tumoral por paclitaxel
Embriones de pollos domésticos fertilizados se incuban durante 4 días antes de retirar sus cáscaras. Los contenidos de los huevos se vacían retirando la cáscara colocada alrededor del espacio aéreo, quebrando la membrana de la cáscara interior, perforando el extremo opuesto de la cáscara y permitiendo que los contenidos de los huevos se deslicen suavemente fuera del extremo despuntado. Los contenidos se vacían en cuencos de vidrio esterilizados de fondo redondo, tapados con tapas de platos de petri y son incubados a una humedad relativa de 90% y 3% de dióxido de carbono.
Se inyectan células MDAY-D2 (un tumor linfoide murina) en ratones y se deja que crezcan en forma de tumores que pesan 0,5-1,0 g. Los ratones son sacrificados, los sitios tumorales son limpiados con alcohol, cortados, colocados en medios de cultivos de tejidos estériles y troceados en trozos de 1 mm bajo una campana de flujo laminar. Antes de colocar los tumores diseccionados en los embriones de pollo de 9 días de edad, las superficies de CAM son suavemente raspadas con una aguja de calibre 30 para asegurar la implantación de los tumores. Los tumores se colocan seguidamente en las CAMs después de 8 días de incubación (4 días después del descascarillado) y se deja que crezcan en los CAM durante cuatro días para establecer un suministro vascular. Cuatro embriones son preparados utilizando este método, recibiendo cada embrión 3 tumores. En el día 12, cada uno de los 3 tumores en los embriones recibió termopasta con contenido de 20% de paclitaxel, termopasta sin contenido o ningún tratamiento. Los tratamientos se continuaron durante dos días antes de que se registraran los resultados.
Los tumores de MDAY-D2 explantados segregan factores angiogénicos que inducen el crecimiento interno de capilaridades (derivadas de la CAM) en la masa tumoral y se permite que esto continúe para que crezca de tamaño. Como todos los vasos del tumor derivan de la CAM, aunque todas las células tumorales derivan del explante, es posible valorar el efecto de las intervenciones terapéuticas sobre estos dos procedimientos independientemente. Este ensayo ha sido usado para determinar la eficacia de la termopasta con contenido de paclitaxel sobre: (a) la inhibición de la vascularización del tumor y (b) la inhibición del crecimiento de las propias células tumorales.
La evaluación estereomicroscópica in vivo directa y el examen histológico de los tejidos fijados de este estudio demostraron lo siguiente. En los tumores tratados con termopasta con contenido de 20% de paclitaxel, hubo una reducción en el número de vasos sanguíneos que suministraban el tumor (Figuras 14C y 14D), una reducción en el número de vasos sanguíneos dentro del tumor y una reducción en el número de vasos sanguíneos en la periferia del tumor (el área que es típicamente la más altamente vascularizada en un tumor sólido) si se compara con tumores testigos (Figuras 14A y 14B). Los tumores comenzaron a disminuir de tamaño y masa durante los dos días en que se realizó el estudio. Adicionalmente, se observó que numerosas células endoteliales se detenían en la división celular, indicando que había sido afectada la proliferación de células endoteliales. Se observó también que las células tumorales frecuentemente se detenían en la mitosis. La totalidad de los 4 embriones mostró un modelo congruente con que la termopasta con contenido de 20% de paclitaxel suprimía la vascularización tumoral, mientras que la termopasta sin contenido no tenía ningún efecto.
En comparación, en CAMs tratados con termopasta sin contenido, los tumores estaban bien vascularizados, con un aumento en el número y la densidad de vasos, si se compara con el del tejido circundante normal, y considerablemente más vasos de los que se observaban en los tumores tratados con pasta con contenido de paclitaxel. Los vasos recientemente formados entraron en el tumor desde todos los ángulos, apareciendo como radios unidos al centro de una rueda (Figuras 14A y 14B). Los tumores controlados continuaron aumentando de tamaño y de masa durante el transcurso del estudio. Hitológicamente, se observaron numerosas capilaridades dilatadas de pared delgada en la periferia del tumor y se observó que pocas células endoteliales estaban en división celular. El tejido tumoral estaba bien vascularizado y era viable en su totalidad.
Como un ejemplo, se obtuvieron los siguientes datos en dos tumores de tamaño similar (inicialmente, en el momento de la explantación) colocados en la misma CAM. Para el tumor tratado con termopasta con contenido de 20% de paclitaxel, el tumor medía 330 mm x 597 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 14 vasos sanguíneos, mientras que la masa tumoral tenía solamente 3-4 pequeñas capilaridades. Para el tumor tratado con termopasta con contenido de 20% de paclitaxel, el tumor medía 330 mm x 597 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 14 vasos sanguíneos, mientras que la masa tumoral tenía solamente 3-4 pequeñas capilaridades: para el tumor tratado con termopasta sin contenido, el tamaño del tumor era de 623 mm x 678 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 14 vasos sanguíneos, mientras que la masa tumoral tenía solamente 34-4 pequeñas capilaridades. Para el tumor tratado con termopasta sin contenido, el tamaño del tumor era 623 mm x 678 mm: la periferia inmediata del tumor tenía 54 vasos sanguíneos, mientras que la masa tumoral tenía 12-14 pequeños vasos sanguíneos. Además, la CAM circundante en sí contenía muchos más vasos sanguíneos en comparación con la zona que rodeaba al tumor tratado con paclitaxel.
Este estudio demuestra que la termopasta libera suficientes cantidades de paclitaxel para inhibir la angiogénesis patológica que acompaña el crecimiento y el desarrollo del tumor. Bajo estas condiciones, la angiogénesis se ve estimulada al máximo por las células tumorales que producen factores angiogénicos capaces de inducir el crecimiento interno de capilaridades desde el tejido circundante en la masa tumoral. La temopasta con contenido de 20% de paclitaxel es capaz de bloquear este procedimiento y limitar la capacidad del tejido tumoral para mantener un suministro sanguíneo adecuado. Esto da lugar a una disminución de la masa tumoral a través tanto de un efecto citotóxico del fármaco sobre las propias células tumorales como privando al tejido de los nutrientes requeridos para el crecimiento y la expansión.
Ejemplo 12 Inhibición de la agiogénesis por paclitaxel A. Ensayos de membrana corioalantoica de pollo ("CAM")
Embriones de pollo fertilizados fueron incubados durante 3 días antes del cultivo sin cáscaras. En este procedimiento, los contenidos de los huevos fueron vaciados retirando la cáscara colocada alrededor del espacio de aire. La membrana del interior de las cáscaras fue seguidamente suprimida y el extremo opuesto de la cáscara fue perforado para permitir que el contenido del huevo se deslizara suavemente desde el extremo despuntado. El contenido del huevo fue vaciado en unos cuencos de vidrios esterilizados de fondo redondo y fueron tapados con tapas de platos de petri. Estos fueron seguidamente colocados en un incubador a una humedad relativa de 90% y 3% de CO_{2} y fueron incubados durante 3 días.
Se mezcló paclitaxel (Sigma, St. Louis, MI) a concentraciones de 0,25, 0,5, 1, 5, 10, 30 \mug por parte alícuota de 10 \mul de mitilcelulosa acuosa al 0,5%. Como el paclitaxel es insoluble en agua, se usaron gránulos de vídrio para producir partículas finas. Se secaron partes alícuotas de 10 microlitros de esta solución sobre parafina durante 1 hora formando discos de 2 mm de diámetro. Los discos secos que contenían paclitaxel fueron cuidadosamente colocados a continuación en el borde en crecimiento de cada CAM en el día 6 de incubación. Se obtuvieron testigos colocando discos de metilcelulosa exentos de paclitaxel en las CAMs durante el mismo transcurso de tiempo. Después de una exposición de 2 días (día 8 de incubación), la vascularización fue examinada por medio de un estereomicroscopio. Se inyectó Liposyn II, una solución opaca blanca, en la CAM para aumentar la visibilidad de los detalles vasculares. La vascularización de los embriones vivos no teñidos se expuso en imágenes usando un estereomicroscopio Zeiss que estaba en interfase con una cámara de vídeo (Dage-MTI Inc., Michigan City, IN). Estas señales de vídeo fueron seguidamente exhibidas a 160 aumentos y capturadas usando un sistema de análisis de imágenes (Vidas, Contron; Etching, Alemania). Se prepararon seguidamente los negativos de las imágenes en un registrador de gráficos (Modelo 3000; Matrix Instruments, Orangeburg, NY).
Las membranas de los embriones sin cáscara de 8 días de edad fueron inundadas con glutaraldehído al 2% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M; se inyectó fijador adicional bajo la CAM. Después de 10 minutos in situ, la CAM fue retirada y colocada en fijador de nueva aportación durante 2 horas a temperatura ambiente. El tejido fue seguidamente lavado durante una noche en tampón de cadodilato que contenía sacarosa al 6%. Las zonas de interés fueron posteriormente fijadas en tetróxido de osmio al 1% durante 1,5 horas a 4ºC. Los tejidos fueron seguidamente deshidratados en series graduadas de etanoles, disolvente intercambiado con óxido de propileno e incrustados en resina Spurr. Se cortaron secciones finas con una cuchilla de diamante, se colocaron en rejillas de cobre, se tiñeron y se examinaron en un microscopio electrónico Joel 1200EX. Análogamente, se cortaron secciones de 0,5 mm y se tiñeron con azul de tolueno para el microscopio de luz.
En el día 11 de desarrollo, los embriones de pollo se usaron para la técnica de supresión de la corrosión. Se inyectó resina Mercox (Ted Pella, Inc., Redding, CA) en la vascularización de la CAM usando una aguja hipodérmica de calibre 30. El material supresor consistía en 2,5 gramos de polímero Mercox CL-2B y 0,05 gramos de catalizador (peróxido de benzoilo al 55%) que tenía un tiempo de polimerización de 5 minutos. Después de la inyección, se dejó que el plástico se asentara in situ durante una hora a temperatura ambiente y seguidamente durante una noche en una estufa a 65ºC. La CAM se colocó seguidamente en una solución acuosa al 50% de hidróxido de sodio para digerir todos los componentes orgánicos. Los parches de plástico se observaron extensivamente en agua destilada, se secaron con aire, fueron revestido con oro/paladio y observados con el microscopio electrónico de exploración Philips 501B.
Los resultados de los experimentos anteriores se muestran en las Figuras 15-18. Brevemente, las características generales del cultivo de huevo sin cáscara de pollo normal se muestran en la Figura 15A. En el día 6 de la incubación, el embrión está colocado de forma central respecto a una red en expansión radial de vasos sanguíneos; la CAM se desarrolla adyacente al embrión. Estos vasos en crecimiento se sitúan cercanos a la superficie y son fácilmente visibles haciendo este sistema un modelo idealizado para el estudio de la angiogénesis. Las redes capilares vivas sin teñir de la CAM se pueden exponer como imágenes de forma no invasiva con un estereomicroscopio. La figura 15B ilustra tal zona vascular en la que los elementos de los glóbulos sanguíneos fueron registrados usando una interfase de vídeo/ordenador. La arquitectura tridimensional de tales redes de capilaridad de CAM se muestra por el método de supresión de la corrosión y fue observada en el microscopio electrónico de exploración (Figura 15C). Estas supresiones pusieron de manifiesto vasos subyacentes que se proyectaban hacia la superficie de la CAM en la que forman una única capa de capilaridades anastomóticas.
Las secciones inversas a través de la CAM muestran un ectodermo externo que consiste en una doble capa celular, una capa mesodérmica más amplia que contiene capilaridades y se sitúan subyacentes al ectodermo, células adventicias y una capa interna endodérmica única (Figura 15D). Al nivel del microscopio electrónico, se demuestran los detalles estructurales típicos de las capilaridades de la CAM. Típicamente, estos vasos se sitúan es estrecha asociación con la capa celular interna del ectodermo (Figura 15E).
Después de 48 horas de exposición a paclitaxel a concentraciones de 0,25, 0,5, 1, 5, 10 ó 30 \mug, cada CAM fue examinada bajo condiciones vivas con un estereomicroscopio equipado con una interfase de vídeo/ordenador con el fin de evaluar los efectos sobre la angiogénesis. Esta constitución de las imágenes fue usada a un aumento de 160 veces que permitió la visualización directa de las células sanguíneas en las capilaridades; así el flujo de sangre en las zonas de interés pudo ser fácilmente valorado y registrado. Para este estudio, la inhibición de la angiogénesis se definió como una zona de la CAM (que mide 2-6 mm de diámetro) que carece de una red de capilaridad y flujo sanguíneo vascular. En todos los experimentos, las zonas avasculares fueron valoradas en un gradiente avascular de 4 puntos (Tabla 1). Esta escala representa el grado de inhibición global, siendo representada la inhibición máxima como un 3 en la escala de gradiente avascular. El paclitaxel fue muy congruente e indujo una zona evascular máxima (6 mm de diámetro o un 3 en la escala de gradiente avascular) en 48 horas, dependiendo de su concentración.
TABLA 1 Gradiente avascular
0 - - vascularización normal
1 - - falta de algún movimiento microvascular
2* - - zona avascular pequeña de aproximadamente 2 mm de diámetro
3* - - avascularización que se extiende más allá del disco (6 mm de diámetro)
* - indica una respuesta de antiangiogénesis positiva
Los datos experimentales dependientes de la dosis de los efectos de diversos agentes terapéuticos a diferentes concentraciones se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
2
3
4
5
Las CAMs típicas tratadas con paclitaxel se muestran también en el disco de metilcelulosa transparente colocado de forma central sobre la zona avascular, que mide 6 mm de diámetro. A un aumento ligeramente superior, la periferia de tales zonas avasculares es claramente evidente (Figura 16C); los vasos funcionales circundantes estaban a menudo redirigidos hacia fuera desde la fuente de paclitaxel (Figuras 16C y 16D). Tal redireccionamiento angular del flujo sanguíneo no se observó nunca bajo condiciones normales. Otra característica de los efectos del paclitaxel fue la formación de islas de sangre en la zona avascular, que representaban la agregación de células sanguíneas.
Las alteraciones morfológica asociadas de la CAM tratada con paclitaxel son ya fácilmente evidentes a niveles de microscopio tanto de luz como electrónico. Para la conveniencia de la presentación, se muestran tres fases distintas de la transición general desde el estado normal al avascular. Cerca de la periferia de la zona avascular, la CAM está resaltada por una abundancia de células mitóticas dentro de la totalidad de las tres capas de gérmenes (Figuras 17A y 18A). Esta división mitótica aumentada fue también una observación congruente en cuanto a las células endoteliales de capilaridad. Sin embargo, las células endoteliales permanecieron intactas en empalme sin extravasación de células sanguíneas. Con una degradación adicional, la CAM se caracteriza por la rotura y disolución de las capilaridades (Figuras 17B y 18B). Las células endoteliales presuntivas, típicamente detenidas en mitosis, mantienen todavía una relación espacial estrecha con las células sanguíneas y se sitúan subyacentes al ectodermo; sin embargo, estas células no están unidas por empalme. La parte más central de la zona avascular se caracterizaba por una capa espesada ectodérmica y endodérmica (Figuras 17C y 18C). Aunque estas capas estaban espesadas, los empalmes celulares permanecieron intactos y las capas mantuvieron sus características estructurales. Dentro del mesodermo, las células dispersadas mitóticamente deteñidas eran abundantes; estas células no exhibieron la polarización de células endoteliales observada en la primera fase. También, en todas esta zona avascular, las células degenerantes eran comunes según se apreció por las vacuolas densas de electrones y el debris celular (Figura 18C).
En resumen, este estudio demostró que 48 horas después a la aplicación del paclitaxel a la CAM, la angiogénesis fue inhibida. La inhibición de los vasos sanguíneos formó como una zona avascular que estaba representada por las tres fases de transición del efecto del paclitaxel. La zona central más afectada de la zona avascular contenía capilaridades interrumpidas con glóbulos rojos extravasados; esto indicaba que estaban ausente los empalmes intracelulares entre las células endoteliales. Las células del endodermo y el ectodermo mantenían sus empalmes intercelulares y, por lo tanto, estas capas de gérmenes permanecieron intactas; sin embargo, estaban ligeramente espesadas. A medida que se aproximaban a la zona avascular normal, los vasos sanguíneos retenían sus complejos de empalme y, por lo tanto, permanecían también intactos. En la periferia de la zona tratada con paclitaxel, se inhibió adicionalmente el crecimiento de los vasos, que era evidente por el redireccionamiento típico o efecto de "acodamiento" de los vasos sanguíneos (Figura 16D).
Las zonas avasculares tratadas con paclitaxel pusieron de manifiesto también una abundancia de células detenidas en mitosis en la totalidad de las tres capas de gérmenes de la CAM; esto era único para el paclitaxel ya que ningún estudio previo había ilustrado tal acontecimiento. Siendo detenidas en la mitosis, las células endoteliales no pudieron experimentar sus funciones metabólicas normales involucradas en la angiogénesis. En comparación, la zona avascular formada por la suramina y el acetato de cortisona no produjo las células mitóticamente detenidas en la CAM; solamente evitaron el crecimiento de vasos sanguíneos adicionales en la zona tratada. Por lo tanto, incluso aunque estos agentes son anti-angiogénicos, hay muchos puntos en los que el procedimiento de angiogénesis puede ser dirigido a diana.
Se observaron también los efectos del paclitaxel durante el período de 48 horas. Durante este período de observación, se apreció que la inhibición de la angiogénesis se producía pronto, 9 horas después en la aplicación. Las secciones histológicas pusieron de manifiesto una morfología similar según se observó en la primera fase de transición de la zona avascular a las 48 horas, ilustrada en las Figuras 17A y 18A. También se observó en el procedimiento de revascularización en la zona avascular previamente observada. Se ha encontrado que la zona avascular formada por la heparina y los esteroides angiostáticos resultó revascularizada 60 horas después de la aplicación. En un estudio, las zonas avasculares tratadas con paclitaxel no se revascularizaron durante al menos 7 días después de la aplicación, lo que implica un efecto más potente a largo plazo.
Ejemplo 13 Efecto de paclitaxel y campotecina sobre la proliferación de células LNCaP Materiales y métodos
Células LNCaP fueron sembradas a concentraciones de 2x10^{3} y 1x10^{3} células/pocillo, respectivamente, en placas de 96 pocillos. Después de 48 horas, se añadieron diferentes concentraciones de paclitaxel o campotecina (25 \mul) en cada pocillo de cultivo y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 5 días. Después de la incubación, las células fueron finadas con solución al 1% de gluteraldehído, y fueron teñidas durante 5 minutos con violeta cristalino al 0,5%. El colorante fue sucesivamente eluido con 100 \mul de solución tamponante y la absorbancia fue leída en un lector de microplacas Titertek Multiskan usando una longitud de onda de absorbancia de 492 mm. El crecimiento celular fue expresado como un porcentaje con relación a pocillos testigo en ausencia del compuesto (ajustado a 100%).
Resultados
El paclitaxel inhibió el crecimiento de células LNCaP con una EC_{50} de aproximadamente 0,09 nM. Se realizaron experimentos de apoptosis sobre la células en los pocillos después del tratamiento con paclitaxel usando ensayos de fragmentación de DNA. Se observó una apoptosis extensiva de células que indicaba que el paclitaxel era citotóxico mediante un mecanismo apoptótico.
La campotecina era extremadamente potente en su acción citotóxica frente a las células LNCaP. Concentraciones tan bajas como 0,001 nM eran tóxicas hasta por encima de un 60% de las células. Por lo tanto, la EC_{50} para este fármaco frente a células LNCaP debe situarse en el intervalo de concentraciones femtomolares.
TABLA 1
N Paclitaxel I (nM) Absorbancia 492 nm % Crecimiento
16 0,001 0,049\pm0,05 100
16 0,01 0,04\pm0,03 81
8 0,05 0,36\pm0,02 73
8 0,1 0,20\pm0,03 40
8 1 0,025\pm0,01 5
8 10 0,027\pm0,01 5
8 100 0,033\pm0,01 6
Absorbancia de 492 nm de testigos = 0,49\pm0,06
TABLA 2
N Paclitaxel I (nM) Absorbancia 492 nm % Crecimiento
16 0,001 0,169\pm0,05 36
8 0,05 0,14\pm0,04 29
8 0,1 0,10\pm0,02 21
8 1 0,10\pm0,02 21
8 10 0,088\pm0,02 17
15 100 0,038\pm0,01 8
Absorbancia de 492 nm de testigos = 0,47\pm0,05
Ejemplo 14 Actividad anti-angiogénesis de agentes anti-microtúbulos adicionales
Además del paclitaxel, pueden ser incorporados otros agentes anti-microtúbulos en los vehículos polímeros. Los ejemplos representativos que se proporcionan con posterioridad incluyen comptotecina y alcaloides vinca tales como vinblastina y vincristina, y agentes estabilizadores de microtúbulos tales como tubercidina, fluoruro de aluminio y LY290181.
A. Incorporación de agentes de PCL
Los agentes fueron triturados con un mortero de martillos para reducir el tamaño de partículas hasta por debajo de 5 micrómetros. Estos fueron seguidamente mezclados en forma de un polvo seco con policaprolactona (peso molecular 18.000, Birmingham Polymers. AL EE.UU.). La mezcla fue calentada a 65ºC durante 5 minutos y seguidamente la mezcla fundida de polímero/agente fue agitada en forma de una pasta suave durante 5 minutos. Seguidamente se recogió la pasta fundía en una jeringuilla de 1 ml y fue extruida para formar gránulos de 3 mg. Estos gránulos se colocan seguidamente en la CAM en el día 6 de gestación para valorar sus propiedades anti-angiogénicas.
B. Efectos de pasta de PCL con contenido de campotecina sobre la CAM
La termopasta con contenido de campotecina fue eficaz para inhibir la angiogénesis si se compara con los gránulos testigo de PCL. Para un contenido de fármaco de 5%, 4/5 de las CAMs ensayadas mostraron una potente inhibición de la angiogénesis. Además, para contenidos de 1% y 0,25%, 2/3 y 3/4 de las CAMs mostraron inhibición de la angiogénesis, respectivamente. Por lo tanto, es evidente a partir de estos resultados que la campotecina fue suficientemente liberada a partir de la termopasta de PCL y que tiene eficacia terapéutica anti-angiogénica.
C. Efectos de pasta de PCL con contenido de vinblastina y vincristina sobre la CAM
Cuando se ensayaron las formulaciones sobre la CAM, era evidente que los agentes que estaban siendo liberados del gránulo de PCL en cantidades suficientes para inducir un efecto biológico. Tanto la vinblastina como la vincristina indujeron efectos anti-angiogénicos en el ensayo de la CAM si se comparan con gránulos de termopasta de PCL testigo.
A concentraciones de 0,5% y 0,1% de contenido de fármaco, la vincristina indujo una inhibición de la angiogénesis en todas las CAMs ensayadas. Cuando se ensayaron concentraciones sobrepasaban un 2%, se consiguieron niveles tóxicos de fármaco y se produjo una muerte embriónica inesperada.
La vinblastina fue eficaz también para inhibir la angiogénesis en la CAM a concentraciones de 0,25%, 0,5% y 1%. Sin embargo, a concentraciones que sobrepasaran un 2%, la vinblastina fue tóxica para el embrión.
D. Efectos de pasta de PCL con contenido de tubercidina sobre la CAM
La pasta con contenido de tubercidina fue eficaz para inhibir la angiogénesis si se compara con gránulos testigo. Para un contenido de fármaco de 1%, la tubercidina indujo una inhibición de la angiogénesis en 1/3 de las CAMs ensayadas. Sin embargo, a concentraciones mayores de fármaco de un contenido de fármaco de 5%, la tubercidina, inhibió con potencia la angiogénesis en 2/3 de las CAMs. Por lo tanto, era evidente a partir de estos resultados que la tubercidina era suficientemente liberada a partir de la pasta de PLC y que tiene una potencia actividad anti-angiogénica.
E. Efectos de pasta de PCL con contenido de fluoruro de aluminio sobre la CAM
Las pastas de PCL con contenido de fluoruro de aluminio (AlF_{3}) fueron eficaces para inhibir la angiogénesis para un contenido de fármaco de 20% si se compara con los gránulos testigo. Para un contenido de fármaco de 20%, 2/4 de las CAMs mostraron inhibición de la angiogénesis según se puso de manifiesto por una zona avascular que medía entre 2 y 6 mm de diámetro. Sin embargo, para un contenido inferior de fármaco, 1% y 5%, no fue evidente la inhibición de la angiogénesis (0/6 y 0/5 CAMs, respectivamente). Por lo tanto, el fluoruro de aluminio fue eficaz para inducir la inhibición de la angiogénesis solamente a concentraciones superiores de fármaco.
F. Efecto de pasta de PCL con contenido de LY290181 sobre la CAM
La valoración de la pasta de PCL con contenido de 5% de LY290181 sobre la CAM puso de manifiesto que el LY290818 indujo una inhibición de la angiogénesis en 1/3 de las CAMs ensayadas. Sin embargo, para un contenido de fármaco de 1%, el LY290181 no indujo ninguna respuesta anti-angiogénesis (n=2).
Ejemplo 15 Efecto de paclitaxel sobre la viabilidad de células no proliferantes
Aunque es importante que un agente modificador de enfermedades sea capaz de inhibir fuertemente una diversidad de actividades celulares (proliferación, inflamación, producción de enzimas proteolíticas) que se producen en exceso durante el desarrollo de una inflamación crónica, no debe ser tóxico para los tejidos normales. Es particularmente crítico que las células normales no se deterioren, ya que esto conduciría a un progreso de la enfermedad. En este ejemplo, se examinó el efecto del paclitaxel sobre la viabilidad de células normales que no se dividen, utilizando condrocitos cultivados hechos crecer hasta la confluencia.
Brevemente, los condrocitos fueron incubados en presencia (10^{-5} M, 10^{-7} M y 10^{-9} M) o ausencia (testigo) de paclitaxel durante 72 horas. Al final de este período de tiempo, el número total de células viables se determinó visualmente por exclusión con colorante de azul de trípano. Este experimento se realizó 4 veces y se contrastaron 
\hbox{los
datos.}
Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 21. Brevemente, como es evidente a partir de la Figura 21, el paclitaxel no afecta a la viabilidad de células normales no proliferantes in vitro incluso a concentraciones elevadas (10^{-5} M) de paclitaxel. Más específicamente, incluso a concentraciones de fármaco suficientes para bloquear los procedimientos patológicos descritos en los ejemplos precedentes, no hubo citotoxicidad para condrocitos normales.
Ejemplo 16 Selección de mejorador de la penetración para una formulación tópica de paclitaxel A. Solubilidad de paclitaxel en diversos mejoradores
Se examinaron los siguientes mejoradores de la penetración: Transcutol®, etanol, propilenglicol, miristato de isopropilo, ácido oléico y Transcutol:miristato de isopropilo (9:1 v:v). Un mililitro de cada mejorador en viales de vidrio fue precalentado a 37ºC y se añadió paclitaxel en exceso. Una muestra de 0,5 ml del fluido de cada vial fue centrifugada a 37ºC y 13000 rpm durante 2 minutos. Se transfirieron partes alícuotas (0,1 ml) de materia sobrenadante de los tubos de centrifugadora a matraces volumétricos y fueron diluidas con metanol. Se valoró el contenido de paclitaxel por cromatografía líquida a presión elevada (HPLC).
B. Coeficiente de partición
Se disolvió una cantidad específica de paclitaxel en un volumen de mejorador calentado a 37ºC. Se añadieron partes alícuotas (1 ml) de esta solución a 1 ml de octanol en un vial de vidrio de 4 ml. Seguidamente se añadió solución salina tamponada con fosfato (1 ml) (pH 7,4) y los viales fueron centrifugados para crear una emulsión. Los viales se colocaron en una estufa a 37ºC durante 16 horas, después de lo cual se retiraron 0,1 ml de la fase de octanol de cada vial y se diluyeron con 9,9 ml de metanol. Para las fases acuosas, se tomaron muestras de 0,5 ml de los viales de ácido oleico y miristato de isopropilo y se tomaron muestras de 0,5 ml de los viales de propilenglicol y se diluyeron con 0,5 ml de metanol. De los viales de Transcutol, se tomaron muestras de 0,1 ml y se diluyeron con 9,9 ml de Transcutol:PBS 50:50 y se tomaron muestras de 0,1 ml de los viales de etanol y se diluyeron con 50:50 de etanol:PBS. El contenido de paclitaxel se determinó por HPLS. Cada determinación se realizó por triplicado.
C. Resultados TABLA 1 Concentración de paclitaxel en saturación en diversos mejoradores de la penetración
Concentración de paclitaxel (mg/ml)
Mejorador Media Desviación típica
Transcutol® 346,85 2,59
Etanol 68,91 3,49
Propilenglicol 21,56 0,11
Miristato de isopropilo 0,43 0,01
Ácido oleico 0,31 0,01
Transcutol®:miristato de isopripilo 353,93 0,42
(9:1 v:v)
Los coeficientes de partición de octanol/agua, K_{o/w}, se recogen en la Tabla 2.
TABLA 2 Coeficiente de partición de octanol/agua de paclitaxel en diversas soluciones de mejoradores
Mejorador K_{o/w} Desviación típica
Transcutol® 25,25 0,27
Etanol 6,88 0,13
Propilenglicol 37,13 2,48
Miristato de isopropilo \infty -
Ácido oleico \infty -
Para actuar eficazmente, el paclitaxel debe penetrar en la piel hasta los estratos inferiores de la epidermis viable. Se ha establecido que para que los fármacos penetren por la epidermis fiable, deben poseer un coeficiente de partición de octanol/agua de 100 o cercano a él (Hadgraft J.H. y Walters K., Drug absorption enhancements, A.G. de Boers Ed., Harwood Publishers, 1994). Basándose en los resultados de las Tablas 1 y 2, el propilenglicol y el Transcutol muestran la mejor combinación de solubilización de paclitaxel y el aumento de su partición de una fase aceitosa respecto a una fase acuosa.
Sin embargo, la K_{o/w} producida tanto por Transcutol como por propilenglicol puede ser algo baja, por lo tanto, se combinaron con miristato de isopropilo que tiene una K_{o/w} infinita en un intento por aumentar la solubilidad del paclitaxel en la fase de octanol. El miristato de isopropilo y el Transcutol se mezclaron en una relación en volumen de 1:9. El miristato de isopropilo se disolvió fácilmente a temperatura ambiente en el Transcutol. Con el fin de formar una fase homogénea, el propilenglicol y el miristato de isopropilo se mezclaron también con etanol en una relación 4:3,5:0,5 de propilenglicol:etanol:miristato de isopropilo. Los resultado de K_{o/w} se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3 Coeficientes de partición en octanol/agua de paclitaxel en mejorador
Combinaciones
Mejorador K_{o/w} Desviación típica
Transcutol®miristato de isopropilo 43,45 0,43
(9:1)
Propilenglicol:etanol:miristato de 42,39 1,66
isopropilo (4,0:3,5:0,5)
La adición de miristato de isopropilo al Transcutol dió lugar a un aumento significativo del coeficiente de partición. Sin embargo, la solución de propilenglicol:etanol:miristato de isopropilo no dió lugar a una mejora significativa del coeficiente de partición sobre el del propilenglicol solo. Este último resultado, y el hecho de que el etanol se había encontrado que exacerbaba el estado psoriático, eliminó efectivamente esta combinación mejoradora de una consideración adicional. Además de ello, la adición de miristato de isopropilo aumentó realmente la solubilidad de paclitaxel sobre su solubilidad en Transcutol solo. La solubilidad de paclitaxel en Transcutol era de 346,9 mg/ml, mientras que en una combinación de Transcutol:miristato de isopropilo, la solubilidad aumentó hasta 353,9 mg/ml. Por lo tanto, esta combinación mejoradora fue escogida en los estudios de la piel.
Ejemplo 17 Preparación y análisis de formulaciones tópicas de paclitaxel A. Preparación de ungüento A de paclitaxel
Se combinaron Transcutol (3,2 g), miristato de isopropilo (0,3 g), labrasol (3,5 g), paclitaxel (0,01 g) y 0,5 mCi/ml de H^{3}-paclitaxel (0,3 ml) en un vial de escintilación de 20 ml. En un vial de escintilación separado, se combinaron labrafil (2,5 g), arlacel 165 (1,2 g) y compritol (0,3 g) y se calentaron a 70ºC hasta que se fundieron completamente. El contenido del primero vial de escintilación se añadió a la materia fundida, se centrifugó hasta homogeneidad y se dejó enfriar.
B. Preparación de ungüento B de paclitaxel
Se combinaron transcutol (2,5 g), miristato de isopropilo (1,0 g), labrasol (2,5 g), paclitaxel (0,01 g) y 0,5 mCi/ml de H^{3}-paclitaxel (0,3 ml) en un vial de escintilación de 20 ml. En un vial de escintilación separado, se combinaron labrafil (2,5 g), arlacel 165 (1,2 g) y compritol (0,3 g) y se calentaron a 70ºC hasta que se fundieron completamente. El contenido del primero vial de escintilación fue añadido a la materia fundida, fue centrifugado hasta homogeneidad y se dejó enfriar.
C. Preparación para la piel y estudio de penetración
Piel de mini-cobaya de Yucatán cortada y congelada fue almacenada a -70ºC hasta que fue usada. Las muestras de piel fueron preparadas usando un perforador de corcho nº 10 para taladrar discos desde la piel congelada. Las muestras fueron aclaradas con una solución estreptomicina-penecilina y se colocaron en bolsas de congelador y se almacenaron a -70ºC.
Se dispusieron secciones de piel en celdas de difusión Franz, con el estrato córneo boca arriba. La solución receptora inferior era una solución de amoxicilina al 0,5% en agua. Una celda donante fue retenida en cada superficie de la piel. El ungüento de paclitaxel fue calentado hasta que se fundió (40 a 50ºC) y fue retirado en una jeringuilla. Mientras todavía estaba fundido, se extruyó 0,1 ml en cada superficie de la piel. Las celdas donantes fueron cubiertas con un disco de vidrio y conjunto se dejó durante 24 horas.
Después de 24 horas, las celdas fueron desmontadas, el ungüento en exceso fue separado y almacenado en un vial de escintilación. La superficie de la piel fue rápidamente lavada con 3 ml de diclorometano (DCM) y secada. El DCM fue almacenado en el mismo vial como el ungüento en exceso. Las secciones de piel y la solución receptora se colocaron en viales de escintilación separados. La piel fue criotomada a -30ºC en secciones de 30 \mum y recogida en viales de vidrio separados. Las muestras de piel cortadas se disolvieron añadiendo 0,5 ml de solubilizador de tejidos a cada vial. Las muestras se dejaron durante una noche que se disolvieran a temperatura ambiente. Al día siguiente, se añadieron 3 ml de combinación de escintilación a los viales. Para las soluciones de lavado de DCM, se transfirieron 100 \mul a 1 ml de acetonitrilo y seguidamente se añadieron 3 ml de combinación de escintilación. La radioactividad de todas las soluciones fue medida usando un contador beta.
Se dispusieron muestras de piel en las celdas de difusión Franz y se separaron en tres grupos. Cada muestra fue tratada en concordancia (sin tratamiento ni ungüento B con o sin paclitaxel). Después de 34 horas, las muestras fueron retiradas y tratadas usando técnicas histológicas estándar.
C. Resultados
A partir de las secciones histológicas, la sección del estrato córneo de la piel sin tratar se encontró que tenía entre 50 y 120 \mum de grosor, mientras que la epidermis viable tenía entre 400 y 700 \mug de grosor. Para el ungüento que contenía 3% p/p de miristato de isopropilo (ungüento A), la concentración de paclitaxel en la piel era esencialmente constante a 1 \mug/ml (1,2 x 10^{-6} M) en el estrato córneo y por toda la epidermis viable. Para el ungüento que contenía 10% p/p de miristato de isopropilo (ungüento B), la concentración de paclitaxel era constante en el estrato córneo y la epidermis viable, pero mayor en el estrato córneo (6 \mug/ml frente a 2 \mug/ml). No hubo radioactividad en la solución receptora para cada investigación del ungüento, indicando que el paclitaxel no pasó completamente a través de la sección de la piel.
No se apreciaron grandes diferencias cuando se aplicó el ungüento que contenía paclitaxel.
Ejemplo 18 (Ejemplo de referencia)
Desarrollo de formulaciones sistémicas de paclitaxel para el tratamiento de la psoriasis
En casos graves de psoriasis, los tratamientos más agresivos se consideran aceptables y, por lo tanto, las toxicidades asociadas con el tratamiento sistémico con paclitaxel pueden ser aceptables.
La formulación sistémica para paclitaxel está comprendida por copolímeros dibloques anfifílicos que, en soluciones acuosas, formasmeciles que consisten en un núcleo hidrófobo y una corteza hidrófila en agua. Se pueden sintetizar copolímeros dibloques de poli(DL-lactida)-bloquemetoxipolietilenglicol (PDLLA-MePEG), policaprolactona-bloque-metoxi-polietilenglicol (PCL-MePEG) y poli-(DL-lactida-cocaprolactona)-bloque-metoxi-polietilenglicol (PDLLACL-MePEG) usando un procedimiento de polimerización en estado fundido en masa, o métodos similares. Brevemente, cantidades dadas de monómeros DL-lactida, caprolactona y metoxipolietilenglicoles con diferentes pesos moleculares fueron calentadas (130ºC) hasta fundir bajo el burbujeo de nitrógeno y fueron agitadas. El catalizador octoato estannoso (0,2% p/p) fue añadido a los monómeros fundidos. La polimerización se llevó a cabo durante 4 horas. Los pesos moleculares, concentraciones críticas de micelas y contenidos máximos de paclitaxel se midieron con ensayos GPC, fluorescencia y solubilización, respectivamente (Figura 22). Se obtuvieron elevadas capacidades de transporte de paclitaxel. La capacidad para solubilizar paclitaxel depende de las composiciones y las concentraciones de los copolímeros (Figuras 22 y 23). El PDLLA-MePEG proporcionó el paclitaxel solubilizado más estable (Figuras 23 y 24).
La fuerte asociación en el núcleo interno de las micelas polímeras presenta un entorno de elevada capacidad para transportar fármacos hidrófobos tal como el paclitaxel. Los fármacos pueden estar covalentemente acoplados a copolímeros de bloques para formar una estructura micelar o pueden ser físicamente incorporados en los núcleos hidrófobos de las micelas. Los mecanismos de liberación de fármacos desde las micelas incluyen la difusión desde el núcleo y el intercambio entre los polímeros de cadenas únicas y las micelas. El pequeño tamaño de las micelas (normalmente menos de 100 nm) eliminará las dificultades asociadas con la inyección de partículas mayores.
Ejemplo 19 Procedimiento para producir termopasta
Cinco gramos de policaprolactona de peso molecular 10.000 a 20.000; (Polyscienes, Warrington Penn. EE.UU.) un vial de escintilación de vidrio de 20 ml se colocó en un vaso de 600 ml que contenía 50 ml de agua pesada. El vaso fue suavemente calentado a 65ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 20 minutos hasta que el polímero fundió. Se mezcló a fondo un peso conocido de paclitaxel, u otro inhibidor de angiogénesis, en el polímero fundido a 65ºC. El polímero fundido se vertió en un molde previamente calentado (60ºC, estufa) y se dejó enfriar hasta que el polímero solidificó. El polímero se cortó en pequeños trozos (aproximadamente 2 mm por 2 mm de tamaño) y se colocó en una jeringuilla de vidrio de 1 ml.
La jeringuilla de vidrio fue seguidamente colocada boca arriba (extremo tapado hacia abajo) en un vaso de vidrio que 500 ml que contenía agua destilada a 65ºC (placa caliente corning) hasta que el polímero se fundió completamente. El inmersor fue seguidamente insertado en la jeringuilla para comprimir el polímero fundido en forma de una masa pegajosa en el extremo de la punta del barril. La jeringuilla fue tapada y se dejó enfriar a temperatura ambiente.
Para la aplicación, la jeringuilla fue nuevamente calentada a 60ºC y administrada en forma de un líquido que solidificó cuando se enfrió a temperatura ambiente.
Ejemplo 20 Modificación de la liberación de paclitaxel a partir de termopasta usando PDLLA-PEG-PDLLA y poli(D,L-ácido láctico de bajo peso molecular A. Preparación de PDLLA-PEG-PDLLA y DPLLA de bajo peso molecular
El DL-lactida fue adquirido de la empresa Aldrich. Se obtuvieron polietilenglicol (PEG) con un peso molecular de 8.000, octoato estannoso y DL-ácido láctico de la empresa Sigma. Se obtuvo poli-\varepsilon-caprolactona (PCL) con un peso molecular de 20.000 de la empresa Birmingham Polymers (Birmingham, AL). El paclitaxel fue adquirido de la empresa Hauser Chemicals (Boulder, CO). Los patrones de poliestireno con distribuciones estrechas del peso molecular fueron adquiridos de la empresa Polysciences (Warrington, PA). El acetonitrilo y el cloruro de metileno fueron de calidad HPLC (Fischer Scientific).
El copolímero tribloques de PDLLA-PEG-PDLLA fue sintetizado mediante una polimerización con apertura del anillo. Los monómeros de DL-lactida y PEG en diferentes relaciones fueron mezclados y se añadió 0,5% en peso de octoato estannoso al 0,5% en peso. La polimerización se llevó a cabo a 150ºC durante 3,5 horas. El PDLLA de bajo peso molecular se sintetizó por medio de policondensación de DL-ácido láctico. La reacción se realizó en un matraz de vidrio bajo las condiciones de purga suave con nitrógeno, agitación mecánica y calentamiento a 180ºC durante 1,5 horas. El peso molecular del PDLLA era de aproximadamente 800, medido titulando los grupos terminales de ácido carboxílico.
B. Elaboración de formulaciones de pasta
El paclitaxel con contenidos de 20% o 30% fue mezclado a fondo en los copolímeros de PDLL-APEG-PDLLA o mezclas de PDLLA:PCL 90:10, 80:20 y 70:30 fundidas a aproximadamente 60ºC. Las pastas con contenido de paclitaxel fueron pesadas en jeringuillas de 1 ml y almacenadas a 4ºC.
C. Caracterización de PDLLA-PEG-PDLLA y las mezclas de pastas
Los pesos moleculares y las distribuciones de los copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA se determinaron a temperatura ambiente por GPC usando una bomba Shimadzul LC-10AD HPLC y un detector del índice de refracción RID-6A Shimadzu (Kyoto, Japón) acoplado a una columna de gel Hewlett Packard P1 de 10^{4}. La fase móvil era cloroformo con un caudal de 1 ml/minuto. El volumen de inyección de la muestra fue de 20 \mul a una concentración de polímero de 0,2% (p/v). Los pesos moleculares de los polímeros se determinaron con relación a patrones de poliestireno. La viscosidad intrínseca de PDLLA-PEG-PDLLA en CHDl_{3} a 25ºC se midió con un viscosímetro Cannon-Fenske.
El análisis térmico de los copolímeros se llevó a cabo por calorimetría de exploración (DSC) usando un controlador TA Instruments 2000 y DuPont 910S (Newcastle, Delaware). La velocidad de calentamiento fue de 10ºC/minuto y el copolímero y las muestras de matriz de paclitaxel/copolímero se pesaron (3-5 mg) en bandejas para muestras de aluminio abiertas y onduladas.
Se usó resonancia magnética nuclear H^{1} (RMN) para determinar la composición química del polímero. Los espectros de H^{1}-RMN de PDLLA-PEG-PDLLA con contenido de paclitaxel se obtuvieron en CDCl_{3} usando un instrumento de RMN (Bruker, AC-200E) a 200 MHz. La concentración de polímero fue de 1-2%.
La morfología de la pasta de paclitaxel/PDLLA-PEG-PDLLA fue investigada usando microscopía electrónica de exploración (SEM) (Hitachi F-2300). La muestra fue revestida con 60% de Au y 40% de Pd (grosor 10-15 nm) usando un instrumento Hummer (Technics, EE.UU.).
D. Liberación in vitro de paclitaxel
Un gránulo pequeño de pasta de PDLLA:PCL con contenido de 20% de paclitaxel (aproximadamente 2 mg) o un cilindro (preparado extruyendo pasta fundida a través de una jeringuilla) de pasta de PDLLA-PEG-PDLLA con contenido de 20% de paclitaxel se colocaron en tubos de vidrio de 14 ml tapados que contenían 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con 0,4 g/l de albúmina. El tubo fue incubado a 37ºC con mezcla rotatoria suave. La materia sobrenadante fue retirada periódicamente para un análisis de paclitaxel y sustituida con tampón de PBS/albúmina de nueva aportación. La materia sobrenadante (10 ml) fue extraída con 1 ml de cloruro de metileno. La fase acuosa fue separada por decantación y la fase de cloruro de metileno fue secada bajo una corriente de nitrógeno a 60ºC. El residuo seco fue reconstituido en una mezcla 40:60 de agua:acetonitrilo y centrifugado a 10.000 g durante aproximadamente 1 minuto. La cantidad de paclitaxel en la materia sobrenadante fue seguidamente analizada mediante HPLC. El análisis de HPLC se realizó usando una bomba 110A y una columna de utraesferas C-8 (Beckman) y un detector de UV SPD-6A ajustado a 232 nm, un autoinyector SIL-9A y un integrador C-R3A (Shimadzu). El volumen de inyección fue 20 \mul y el caudal fue 1 ml/minuto. La fase móvil era de 58% acetonitrilo, 5% metano y 37% agua destilada.
E. Resultados y explicación
El peso molecular y la distribución de pesos moleculares de PDLLA-PEG-PDLLA, con relación a patrones de poliestireno, se midió por GPC (Figura 30). La viscosidad intrínseca del copolímero en CHCl_{3} a 25ºC se determinó usando un viscosímetro Canon-Fenske. El peso molecular y la viscosidad intrínseca disminuyeron con un contenido creciente de PEG. Las polidispersidades de PDLLA-PEG-PDLLA con contenido de PEG de 10%-40% fueron de 2,4 a 3,5. Sin embargo, el copolímero con 70% de PEG tenía una distribución estrecha de pesos moleculares con una polidispersidad de 1,21. Esto puede ser debido a un elevado contenido de PEG que reduce la posibilidad de reacciones secundarias tales como la transesterificación, que dan lugar a una distribución amplia de pesos moleculares del polímero. Alternativamente, una estructura enrollada del copolímeros de bloques hidrófobo-hidrófilo puede dar lugar a un valor artificial bajo de la polidispersidad.
Las exploraciones por DSC de los copolímeros puros de PEG y PDLLA-PEG-PDLLA se proporcionan en las Figuras 25 y 26. El PEG y el PDLLA-PEG- PDLLA con contenidos de PEG de70% y 40% mostraron picos endotérmicos con entalpía y temperatura decrecientes a medida que disminuía el contenido de PEG del copolímero. Los picos endotérmicos en los copolímeros de 40% y 70% de PEG eran debidos probablemente a la fusión de la zona de PEG, indicando la aparición de la separación de fases. Aunque el PEG puro tenía un punto de fusión nítido, los copolímeros tanto de 70% como de 40% de PEGs mostraron picos amplios con un acodamiento distinto en el caso de 70% de PEG. Los picos de fusión amplios han resultado de la interferencia de PDLLA con la cristalización de PEG. El acodamiento en el caso de 70% de PEG puede representar la transición vítrea de la zona de PDLLA. No se produjeron cambios térmicos en los copolímeros con contenido de PEG de 10%, 20% y 30% en un intervalo de temperatura de 10-250ºC, indicando que no se había producido ninguna cristalización significativa (por lo tanto, puede ser la separación de fases).
Los termogramas de DSC de mezclas de PDLLA:PCL (70:30, 80:20, 90:10) sin paclitaxel o con 20% de paclitaxel mostraron un pico endotérmico a aproximadamente 60ºC, que resultaba de la fusión de PCL. Debido a la naturaleza amorfa del PDLLA y su bajo peso molecular (800), no se observaron la fusión y las transiciones vítreas de PDLLA. No se observaron cambios térmicos debidos a la recristalización o fusión de paclitaxel.
Los copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA de 20% y 30% de contenido de PEG se seleccionaron como materiales de formulación óptima para la pasta por las siguientes razones: un PDLLA-PEG-PDLLA de 10% de PEG no pudo ser fundido a una temperatura de aproximadamente 60ºC; los copolímeros de 40% y 70% de PEG se fundieron fácilmente a 60ºC y el copolímero de 20% y 30% de PEG se hizo un líquido viscoso entre 50ºC y 60ºC; y el hinchamiento de copolímeros de 40% y 70% de PEG en agua fue muy elevado, dando lugar a una rápida dispersión de las pastas en agua.
Los perfiles de liberación in vitro de paclitaxel a partir de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA se muestran en la Figura 27. El experimento que medía la liberación a partir de cilindros de 40% de PEG se terminó, ya que los cilindros tenían un grado de hinchamiento muy elevado (aproximadamente 200% de absorción de agua en un día) y se disgregaron en pocos días. La fracción liberada de paclitaxel a partir de los cilindros de 30% de PEG aumento gradualmente durante 70 días. La fracción liberada a partir de los cilindros de 20% de PEG aumentó lentamente hasta 30 días y seguidamente aumentó de forma abrupta, lo que estuvo seguido de otro período de aumento gradual. Existió una diferencia significativa en el alcance hasta el que cada cilindro individual (20% de contenido de PEG9 mostró el cambio abrupto en la liberación de paclitaxel. Antes del aumento abrupto, la fracción de liberación de paclitaxel era inferior para copolímeros de contenido menor de PEG para el mismo diámetro del cilindro (1 mm). Los cilindros de 40% y 30% de PEG mostraron velocidades de liberación de paclitaxel mucho más elevadas que los cilindros de 20% de PEG. Por ejemplo, el cilindro de 30% de PEG liberó 17% de paclitaxel en 30 días, comparado con una liberación de 2% a partir del cilindro de 20% de PEG. Los cilindros con diámetros más pequeños dieron lugar a velocidades de liberación más elevadas (por ejemplo, en 30 días los cilindros de 30% de PEG con diámetros de 0,65 mm y 1 m liberaron 26% y 17% de paclitaxel, respectivamente (Figura 27)).
Las observaciones anteriores pueden ser explicadas por los mecanismos de liberación de paclitaxel desde los cilindros. El paclitaxel fue dispersado en el polímero en forma de cristales, como se observó por microscopía óptica. Los cristales comenzaron a disolverse en la matriz del copolímero a 170ºC y se disolvieron completamente a 180ºC, ya que termogramas de DSC por microscopía en etapa caliente de pasta de PDLLA-PEG-PDLLA con contenido de 20% de paclitaxel (30% PEG) pusieron de manifiesto una pequeña exotermia de recristalización (16 J/g, 190ºC) y una exotermia de fusión (6 J7g, 212ºC) para paclitaxel (Figura 25), indicando la recristalización de paclitaxel a partir de la masa fundida de copolímero después de los 180ºC. En este tipo de matriz de fármaco/polímero, el paclitaxel pudo ser liberado por medio de difusión y/o erosión del polímero.
En el caso de difusión controlada, el fármaco puede ser liberado por difusión molecular en el polímero y/o a través de los canales abiertos formados por las partículas conectadas del fármaco. Por lo tanto, para un contenido de 20%, algunas partículas de paclitaxel fueron aisladas y el paclitaxel puede ser liberado por disolución en el copolímero seguida de difusión. Otras partículas de paclitaxel podrían formar agregados que conecten con la superficie y ser liberados a través de difusión por los canales. En ambos casos, los cilindros con una dimensión más pequeña proporcionaron una liberación de fármaco más rápida debido a la trayectoria de difusión más corta (Figura 27).
Los cambios de dimensiones y la absorción de agua de los cilindros fueron registrados durante la liberación (Figura 28). Los cambios de longitud, diámetro y peso en húmedo de los cilindros con 30% de PEG aumentaron rápidamente hasta un máximo en 2 días, permanecieron inalterados durante aproximadamente 15 días y seguidamente disminuyeron gradualmente. El diámetro inicial del cilindro no estuvo afectado por el comportamiento del hinchamiento. Para el cilindro de 20% de PEG, la longitud disminuyó en 10% en un día y se niveló, mientras que el diámetro y la absorción de agua aumentaron gradualmente a lo largo del tiempo. Como más PEG en el copolímero absorbía más agua para facilitar la difusión de paclitaxel, se observó una liberación más rápida (Figura 27).
La degradación del peso molecular del copolímero de la pasta de PDLLA-PEG-PDLLA fue verificado por GPC. Para el cilindro de 20% de PEG, el volumen de edición en la posición pico aumentó con el tiempo, indicando un peso molecular del polímero reducido durante el transcurso del experimento de liberación (Figura 30). Se observó una distribución bifásica de pesos moleculares en el día 69. El peso molecular del polímero disminuyó también para los cilindros de 30% de PEG (1 mm y 0,65 mm). Sin embargo, no se observó ninguna distribución bifásica.
Los espectros de RMN pusieron de manifiesto un pico de PEG a 3,6 ppm y picos de PDLLA a 1,65 ppm y 5,1 ppm. El área del pico de PEG con relación a PDLLA en el copolímero disminuyó significativamente después de 69 días (Figura 29), indicando la disolución de PEG después de su disociación del PDLLA. La pérdida de masa seca de los cilindros fue registrada también (Figura 29) y muestra una velocidad de degradación decreciente del orden de 30% de PEG - 0,65 mm > 30% de PET - 1 mm > 20% de PEG - 1 mm.
Los cambios morfológicos de los cilindros secos antes de la liberación de paclitaxel y durante la misma se observaron usando SEM (Figura 31). Brevemente, se observaron cristales sólidos de paclitaxel y matrices polímeras no porosas antes de la liberación (Figuras 31A y 31B). Después de 69 días de liberación, no se observaron cristales de paclitaxel y las matrices contenían muchos poros debido a la degradación del polímero y la absorción de agua (Figuras 31C y 31D).
Los cilindros de 30% de PEG mostraron un hinchamiento extensivo después de solo dos días en agua (Figura 28) y, por lo tanto, se redujo la obstaculización a la difusión del bloque de PEG soluble en agua desprendido y el PDLLA degradado (es decir, oligómeros de DL-ácido láctico). Como la pérdida de masa y la degradación de los cilindros de 30% de PEG eran contínuas, la contribución de la liberación por erosión aumentó gradualmente dando lugar a una liberación sostenida de paclitaxel sin ningún cambio abrupto (Figura 27). Para los cilindros de 20% de PEG, el hinchamiento era bajo inicialmente (Figura 28) dando lugar a una difusión lenta de los productos de degradación. Por lo tanto, los productos de degradación en la zona interior fueron primeramente retenidos, mientras que hubo menos productos de degradación en la zona externa debido a la corta trayectoria de difusión, los productos de degradación aceleraron la velocidad de degradación, ya que los grupos terminales de ácido carboxílico de los oligómeros catalizaban la degradación hidrolítica. Esto dio lugar a una corteza de peso molecular elevado y un interior de bajo peso molecular, según se indicó por la distribución bifásica de pesos moleculares de los copolímeros (Figura 30, día 69). Como la rotura de la cáscara dependía de factores tales como la resistencia, grosor y defectos de la cáscara y productos de degradación del interior, el comienzo y el alcance de la pérdida de los productos de degradación interior fueron muy variables. Como la rotura de la cáscara no era congruente y el fármaco en el polímero no era microscópicamente homogéneo, el valor del tiempo para una aparición brusca de la liberación y el alcance de la aparición brusca fueron diferentes para las cuatro muestras ensayadas (Figura 27).
La liberación de paclitaxel a partir de mezclas de PDLLA y PCL y PCL puro se muestran en la Figura 32. Brevemente, la fracción liberada aumentaba con el contenido de PDLLA en la mezcla. Por ejemplo, en 10 días, el paclitaxel liberado a partir de PDLLA:PCL 80:20, 70:30 y 0:100 fue de 17%, 11% y 6%, respectivamente. Después de una aparición brusca inicial en un día, se obtuvo una liberación aproximadamente constante de pasta de PDLLA:PCL 80:20. No se observó ningún grado significativo de hinchamiento durante la liberación. Para las mezclas de PDLLA:PCL, como el PDLLA tenía un peso molecular muy bajo de aproximadamente 800, fue hidrolizado rápidamente en productos solubles en agua sin un retraso largo en la pérdida de masa. La PCL se observó como el material de "soporte" para evitar que la pasta se disgregara rápidamente. Por lo tanto, la velocidad de liberación aumentó con el contenido de PDLLA en la mezcla debido a la degradación aumentada. La erosión continua de PDLLA controló la liberación de paclitaxel y dio lugar a una liberación constante. La liberación de paclitaxel a partir de PCL puro fue probablemente controlada por la difusión debido a la baja velocidad de degradación (en 1-2 años) de PCL.
Se encontraron dificultades en el estudio de liberación para pasta de PDLLA:PCL 90:10 con contenido en 20% de paclitaxel debido a la disgregación del granulado de pasta en 24 horas de incubación. Brevemente, durante las 12 primeras horas de incubación, las muestras fueron tomadas cada hora con el fin de asegurar las condiciones de caída para la liberación de paclitaxel. El paclitaxel liberado a partir de la pasta 90:10 fue 25-35% en 10 horas.
La pasta de 90:10 de PDLLA:PCL que contienen 30% de paclitaxel liberó más paclitaxel que la pasta de PDLLA:PCL 90:10 que contienen 20% de paclitaxel. Por tanto, la modulación de la velocidad de liberación de paclitaxel, que estaba regulada por las propiedades del polímero y los agentes quimioterapéuticos, así como por el sitio de administración, era importante en el desarrollo de la terapia local.
Ejemplo 21 Preparación de composiciones polímeras que contienen aditivos solubles en agua y paclitaxel A. Preparación de composiciones polímeras
Se prepararon micropartículas de co-precipitados de paclitaxel/aditivo y posteriormente fueron añadidas a PCL para formas pastas. Brevemente, se disolvió paclitaxel (100 mg) en 0,5 ml de etanol (95%) y se mezcló con el aditivo (100 mg) previamente disuelto o dispersado en 1,0 ml de agua destilada. La mezcla fue triturada hasta que se formó una pasta suave. La pasta fue extendida en un plato de Petri y fue secada con aire durante una noche a 37ºC. La masa seca fue pulverizada usando un mortero de martillos y se hizo pasar a través de un tamiz de malla nº 140 (106 \mum) (Endecotts Test Sieves Ltd, Londres, Inglaterra). Las micropartículas (40%) fueron seguidamente incorporadas en PCL fundido (60%) a 65ºC que correspondía a un contenido de 20% de paclitaxel. Los aditivos usados en el estudio fueron gelatina (tipo B, categoría 100, Fisher Scientific, metilcelulosa (British Drug Houses), dextrano, T500 (Pharmatia, Suecia), albúmina (Fisher Scientific) y cloruro de sodio (Fisher Scientific). Las micropartículas de paclitaxel y gelatina o albúmina se prepararon como se describió anteriormente, pero se hicieron pasar a través de un tamiz de malla nº 60 (270 \mum) (Endecotts Test Sieves Ltd, Londres, Inglaterra) para evaluar el efecto del tamaño de las micropartículas sobre la liberación de paclitaxel desde la pasta. Las pastas se prepararon también para que contuvieran 10, 20 ó 30% de gelatina y 20% de paclitaxel en PCL para estudiar el efecto de la proporción del aditivo sobre la liberación de fármaco. Salvo que se especifique otra cosa, se prepararon pastas que contenían 20% de paclitaxel dispersado en PCL para que sirvieran como testigos para los estudios de la velocidad de liberación.
B. Estudios de la liberación de fármaco
Se puso en suspensión un granulado de aproximadamente 2,5 mg de pasta con contenido de paclitaxel en 50 ml de PBS 10 mM (pH 7,4) en tubos tapados con rosca. Los tubos se balancearon de un extremo al otro a 37ºC y a intervalos de tiempo dados se retiraron 49 ml de materia sobrenadante, se filtró a través de un filtro de membrana de 0,45 \mum y se retuvo para el análisis de paclitaxel. Se sustituyó un volumen igual de PBS en cada tubo para mantener las condiciones de inmersión durante todo el estudio. Para el análisis, los filtrados fueron extraídos con 3 x 1 ml de diclorometano (DCM), los extractos de DCM se evaporaron hasta sequedad bajo una corriente de nitrógeno y se volvieron a disolver en 1 ml de acetonitrilo. El análisis fue por HPÑC usando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58) a un caudal de 1 ml/minuto (bomba Beckman Isocratic), una columna de fase inversa C18 (Beckman) y detección UV (Shimadzu SPD A) a 232 mm.
C. Estudios del hinchamiento
Pastas de paclitaxel/aditivo/PCL, preparadas usando micropartículas con aditivo de paclitaxel de tamaño de malla nº 140 (y nº 60 para gelatina solar) fueron extruidas para formar cilindros, los trozos fueron cortados, pesados y se midieron el diámetro y la longitud de cada trozo usando un micrómetro (Mitutoyo Digimatic). Los trozos se pusieron en suspensión en agua destilada (10 ml) a 37ºC y a intervalos predeterminados el agua fue desechada y se midieron el diámetro y la longitud de los trozos cilíndricos y las muestras se pesaron. La morfología de las muestras (antes y después de poner en suspensión en agua) fue examinada usando microscopía electrónica de exploración (SEM) (Hitachi F-2300). Las muestras fueron revestidas con 60% de Au y 40% de Pd (grosor 10-15 nm) usando un instrumento Hummer Instrument (Technics, EE.UU.).
C. Estudios de la membrana corioalantoica de embrión de pollo (CAM)
Embriones de pollo doméstico fertilizados fueron incubados durante 4 días antes del cultivo sin cáscara. Los contenidos de los huevos fueron incubados a una humedad relativa de 90% y 3% de CO_{2} y en el día 6 de incubación, se colocaron directamente sobre la superficie de la CAM 1 mg de trozos de pasta con contenido de paclitaxel (que contenían 6% de paclitaxel, 24% de gelatina y 70% de PCL) o testigos (30% de gelatina en PCL). Después de 2 días de exposición, la vascularización fue examinada usando un estereo-microscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales de vídeo fueron seguidamente exhibidas en un ordenador e impresas en vídeo.
E. Resultados y explicación
Las micropartículas de paclitaxel co-precipitado y gelatina o albúmina eran duras y quebradizas y fueron fácilmente incorporadas en PCL, mientras que los demás aditivos produjeron partículas blandas que mostraron una tendencia a la descomposición durante la preparación de la pasta.
La Figura 33 muestra los transcursos de tiempo de la liberación de paclitaxel desde pastas que contenían 20% de paclitaxel en PCL o 20% de paclitaxel, 20% de aditivo y 60% de PCL. La liberación de paclitaxel desde PCL con o sin aditivos siguió un modelo de liberación bifásico; inicialmente, hubo una velocidad de liberación de fármaco mayor seguida de una liberación de fármaco más lenta para el fármaco. El período incial de velocidad de liberación mayor de paclitaxel desde las pastas se creía que era debido a la disolución del paclitaxel colocado en la superficie o la difusión de paclitaxel desde las zonas superficiales de la pasta. La fase más lenta posterior de los perfiles de liberación puede ser atribuida a una disminución del área superficial eficaz de las partículas de fármaco en contacto con el tampón, un ingreso lento de tampón en la matriz de polímero o un aumento de las trayectorias medias de difusión del fármaco a través de la matriz polímera.
Las dos fases de los perfiles de liberación de paclitaxel desde PCL aumentaron en presencia de los aditivos hidrófilos, de los que la gelatina, albúmina y metil-celulosa producían un mayor aumento de las velocidades de liberación de fármaco (Figura 33). Hubo aumento adicionales en la liberación de paclitaxel desde la matriz polímera cuando se usaron partículas mayores de paclitaxel-aditivo (270 \mum) para preparar la pasta si se compara con cuando se usaron partículas de paclitaxel-aditivo más pequeñas (106 \mum) (Figura 34). Los aumentos en la cantidad de aditivo (por ejemplo, gelatina) produjeron un aumento correspondiente de la liberación de fármaco (Figura 34). La Figura 35A muestra el comportamiento de hinchamiento de pastas que contienen 20% de paclitaxel, 20% de aditivo y 60% de PCL. La velocidad de hinchamiento siguió el orden gelatina > albúmina > metilcelulosa > dextrano > cloruro de sodio. Además, la velocidad de hinchamiento aumentó cuando se añadió una proporción mayor del polímero soluble en agua a la pasta (Figura 35B). Las pastas que contenían gelatina o albúmina se hincharon rápidamente en las primeras 8-10 horas, y posteriormente la velocidad de hinchamiento disminuyó cuando el cambio de volumen de la muestra fue mayor que 40%. La pasta preparada usando las partículas mayores de paclitaxel-gelatina (270 \mul) se hincharon a una velocidad mayor que las preparadas con las partículas más pequeñas de paclitaxel-gelatina (106 \mum). Todas las pastas se disgregaron cuando el volumen aumentó a más de 50%. Los estudios de SEM mostraron que el hinchamiento de las pastas estuvo acompañado por el agrietamiento de la matriz (Figura 36). Para aumentos mayores (Figuras 36C y 36D) hubo evidencia de cristales de paclitaxel en forma de agujas o varillas en la superficie de la pasta y en estrecha asociación con gelatina después del hinchamiento (Figuras 36C y 36D).
Los agentes hidrófilos osmóticos o hinchables absorbidos en forma de partículas discretas en el polímero hidrófobo dieron lugar a una liberación de fármaco mediante una combinación de erosión de la matriz, difusión de fármaco a través de la matriz polímera y/o difusión y/o flujo convectivo a través de los poros creados en la matriz por la disolución de los aditivos solubles en agua. Los agentes osmóticos y los polímeros hinchables dispersados en un polímero hidrófobo serían absorbidos en agua (actuando como agentes de empape), se disolvería o se hincharía y ejercería una presión turgente que podría romper las separaciones (la capa polímera) entre partículas adyacentes, creando microcanales y facilitando así el escape de las moléculas de fármaco en los medios circundantes por flujo de difusión o convectivo. El hinchamiento y el agrietamiento de la matriz de pasta (Figura 36) dio lugar probablemente a la formación de microcanales por todo el interior de la matriz. Las diferentes velocidades y el alcance del hinchamiento de los polímeros (Figura 35) puede contribuir a las diferencias en las velocidades de liberación de paclitaxel observadas (Figura 33 y 34).
La Figura 37 muestra CAMs tratadas con pasta de gelatina-PCL (Figura 37A) y pasta de 20% de paclitaxel-gelatina-PCL (Figura 37B). La pasta en la superficie de las CAMs se muestran mediante las flechas en las Figuras. La CAM con la pasta testigo muestra una arquitectura reticular de capilaridad normal. Las CAMs tratadas con pasta de paclitaxel-PCL mostraron de forma consistente una regresión vascular y zonas que carecían de una red capilar. La incorporación de aditivos en la pasta aumentó considerablemente el diámetro de la zona avascular (Figura 37).
Este estudio mostró que la liberación in vitro de paclitaxel a partir de PCL podría ser aumentada mediante la incorporación de micropartículas de paclitaxel/polímero hidrófilo en la matriz de PCL. Estudios in vivo que evaluaron la eficacia de la formación para tratar tumores subcutáneos en ratones mostraron también que la pasta de paclitaxel/gelatina/PCL redujo significativamente la masa tumoral. Factores tales como el tipo de agente soluble en agua, el tamaño de las micropartículas y la proporción de los aditivos se mostró que ejercían una influencia sobre las características de liberación del fármaco.
Ejemplo 22 Procedimiento para producir nanopastas
La nanopasta es una suspensión de microesferas en un gel hidrófilo. En un aspecto de la invención, el gel o pasta puede ser extendido sobre el tejido como un método para colocar microesferas con contenido de fármaco próximas al tejido diana. Al estar basada en agua, la pasta resulta rápidamente diluida con los fluidos corporales provocando una disminución del grosor de la pasta y una tendencia de las microesferas a ser depositadas en el tejido cercano. Se coloca así una acumulación de fármaco encapsulado en microesferas próxima al tejido diana.
Los reactivos y la instalación que se utilizaron en estos experimentos incluyen vasos de vidrio, Carbopol 925 (grado farmacéutico, Goodyear Chemical Co.,), agua destilada, hidróxido de sodio (1 M) en solución acuosa, solución de hidróxido de sodio (5 M) en solución acuosa, microesferas en 1 intervalo de tamaños de 0,1 mm a 3 mm puestas en suspensión en agua a 20% p/v (véase lo que antecede).
1. Preparación de gel de cabopol al 5% p/v
Se añadió una cantidad suficiente de carbopol a hidróxido de sodio 1 M para conseguir una solución al 5% p/v. Para disolver el carbopol en el hidróxido de sodio 1 M, la mezcla se dejó asentar durante aproximadamente una hora. Durante este período de tiempo, la mezcla fue agitada y, después de una hora, el pH se ajustó a 7,4 usando hidróxido de sodio 5 M hasta que el carbopol se disolvió completamente. Una vez que se consiguió un pH de 7,4, el gel se convirtió y se dejó asentar durante 2 a 3 horas.
2. Procedimiento para producir nanopasta
Una cantidad suficiente de microesferas de 0,1 \mum a 3 \mum fue añadida a agua para producir una suspensión al 20% de las microesferas. Se colocó gel de carbopol (8 ml del 5% p/v) en un vaso de vidrio y se añadieron 2 ml de la suspensión de microesferas al 20%. La mezcla se agitó para dispersar completamente las microesferas por todo el gel. La mezcla fue almacenada a 4ºC.
Ejemplo 23 Complejación de paclitaxel con ciclodextrinas A. Materiales
El paclitaxel se obtuvo de la empresa Hauser Chemical Inc. (Boulder, Colorado). Se obtuvieron fostato de disodio (Fisher) ácido cítrico (British Drug Houses), hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (HP\betaCD), \gamma-ciclodextrina (\gamma-CD) e hidroxipropil-\gamma-ciclodextrina (HP\gammaCD) de la empresa American Maize-Products Company (Hammond, Indiana) y se usaron tal como se recibieron.
B. Métodos 1. Estudios de solubilidad
Se añadieron cantidades en exceso de paclitaxel (5 mg) a soluciones acuosas que contenían diversas concentraciones de \gamma-CD, HP\gamma-CD o HP\beta-CD y se agitaron suavemente durante aproximadamente 24 horas a 37ºC. Tras llegar a un equilibrio, partes alícuotas de la suspensión fueron filtradas a través de un filtro de membrana de 0,45 \mum (Millipore), adecuadamente diluido y fueron analizadas usando MPLC. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de acetonitrilo, metanol y agua (58:5:37) a un caudal de 1,0 ml/minuto. Se investigó también la solubilidad de paclitaxel en un disolvente compuesto por 50:50 de agua y etanol (95%) que contenía diversas concentraciones, hasta 10%, de HP\beta-CD. Además, se investigaron los perfiles de la velocidad de disolución de paclitaxel añadiendo 2 mg de paclitaxel (tal como se recibió) a soluciones al 0, 5, 10, o 20% de HP\gammaCD o 2 mg de paclitaxel previamente hidratado (poniendo en suspensión en agua durante 7 días) a agua pura y agitando suavemente a 37ºC. Las partes alícuotas se tomaron a diversos intervalos de tiempo y se ensayaron en cuanto a paclitaxel.
2. Estudios de estabilidad
Las soluciones que contenían 20% de HP\betaCD o HP\gammaCD tenían valores del pH de 3,9 y 5,2, respectivamente. La estabilidad de paclitaxel en soluciones de ciclodextrina se investigó ensayando paclitaxel en soluciones (20 \mug/ml) que contenían 10 ó 20% de HP\gammaCD o HP\betaCD en agua o bien una mezcla de agua-etanol 50:50 a 37ºC o 55ºC, a diversos intervalos de tiempo. Además, se determinó la estabilidad de paclitaxel en soluciones (1 \mug/ml) que contenían 1%, 2% o 5% de HP\betaCD a 55ºC.
C. Resultados 1. Estudios de solubilidad
La solubilidad de paclitaxel aumentó sobre la totalidad del intervalo de concentración de CD estudiado; la HP\betaCD produjo el mayor aumento en la solubilidad de paclitaxel (Figura 38). La forma de las curvas de solubilidad sugerían que las estequiometrías fueron de un orden mayor que un complejo 1:1. El paclitaxel formó curvas de tipo A_{p} tanto con HP\beta-CD como con HP\gamma-CD y curvas de tipo A_{N} con \gamma-CD. La solubilidad de paclitaxel en una solución al 50% de HP\beta-CD en agua fue de 3,2 mg/ml a 37ºC, que era un aumento de aproximadamente 2.000 veces sobre la solubilidad de paclitaxel en agua. Las constantes de estabilidad estimadas (a partir de la Figura 39) para complejos de primer orden de paclitaxel-ciclodextrinas fueron 3,1, 5,8 y 7,2 m^{-1} para \gamma-CD, HP\gamma-CD y HP\beta-CD y los complejos de segundo orden fueron 0,784 x 10^{3}, 1,886 x 10^{3} y 7,965 x 10^{3} M^{-1} para \gamma-CD, HP\gamma-CD y HP\beta-CD, respectivamente. Los valores de las constantes de estabilidad observadas sugirieron que los complejos de inclusión formados por paclitaxel con ciclodextrinas eran predominantemente complejos de segundo orden.
La solubilidad de paclitaxel en una mezcla de agua:etanol 50:50 aumentó con un aumento en la concentración de ciclodextrina (Figura 40), según se observó para la complejación en agua pura. La constante de estabilidad aparente para la complejación de paclitaxel y HP\beta-CD en presencia de etanol al 50% (26,57 M^{-1}) fue significativamente inferior (aproximadamente 300 veces) que la constante de estabilidad en ausencia de etanol. La constante de estabilidad inferior puede ser atribuida a un cambio en la constante dieléctrica o de la polaridad del disolvente en presencia de etanol.
Los perfiles de disolución de paclitaxel en soluciones de \gamma-CD al 0, 5, 10 y 20% (Figura 41) ilustran la formación de una solución metastable de paclitaxel en agua pura o las soluciones de ciclodextrina; la cantidad de paclitaxel en solución aumentó gradualmente, alcanzó un máximo y posteriormente disminuyó. Los estudios de disolución usando muestras de paclitaxel que fueron previamente hidratadas poniendo en suspensión en agua durante 48 horas no mostraron la formación de la solución metastable. Además, un análisis por DSC del paclitaxel hidratado (secado en estufa a vacío a temperatura ambiente) mostraron dos picos endotérmicos amplios entre 60 y 110ºC. Estos picos estuvieron acompañados de una pérdida de peso de aproximadamente 4,5% (determinada por análisis termogravimétrico), indicando la presencia de hidrato(s). Una pérdida de peso de aproximadamente 2,1% sugeriría la formación de un monohidrato de paclitaxel. Por lo tanto, la aparición de los picos de DSC entre 60ºC y 110ºC y la pérdida de peso de aproximadamente 4,5% sugieren la presencia de un dihidrato. No hubo ninguna evidencia de pico(s) endotérmico(s) entre 60ºC y 110ºC (resultados de DSC) ni una pérdida de peso (resultados por TGA) para las muestras de paclitaxel tal como se recibieron. Por lo tanto el paclitaxel (tal como se recibió) era anhidro y en suspensión en agua se disolvió para formar una solución supersaturada que recristalizó en forma de un hidrato de solubilidad inferior (Figura 41).
2. Estudios de estabilidad
La degradación de paclitaxel depende de la concentración de la ciclodextrina y siguió una cinética de degradación de pseudo-primer orden (por ejemplo, Figura 42). La velocidad de degradación de paclitaxel en soluciones (1 \mug/ml de paclitaxel) que contienen 1% de HP\beta-CD a 55ºC son más rápidas (k = 3,38 x 10^{-3} h^{-1}) que la velocidad a concentraciones superiores de ciclodextrina. Las constantes de la velocidad de degradación de 1,78 x 10^{-3} h^{-1} y 0,96 x 10^{-3} h^{-1} fueron observadas para paclitaxel en 10% de HP\beta-CD y HP\gamma-CD, respectivamente. Las soluciones de paclitaxel (1 \mug/ml) que contenían 2, 4, 6 ó 8% de HP\beta-CD no mostraron ninguna diferencia significativa en la velocidad de degradación respecto a las obtenidas con las soluciones de 10 ó 20% de HP\betaCD (20 \mug/ml). La presencia de etanol no afectó adversamente a la estabilidad de paclitaxel en soluciones de ciclodextrina.
D. Conclusión
Este estudio mostró que la solubilidad de paclitaxel pudo ser aumentada mediante la complejación con ciclodextrinas. Estas formulaciones de ciclodextrinas de base acuosa puede ser utilizadas en el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias.
Ejemplo 24 Composiciones polímeras con concentraciones aumentadas de paclitaxel
El PDLLA-MePEG y el PDLLA-PEG-PDLLA son copolímeros de bloques con zonas hidrófobas (PDLLA) e hidrófilas (PEG y MePEG). A pesos moleculares y una composición química apropiados, pueden formar agregados diminutos de núcleo hidrófobo de PDLLA y corteza hidrófila de MePEG. El paclitaxel puede ser introducido en el núcleo hidrófobo, proporcionando así paclitaxel con una "solubilidad" aumentada.
A. Materiales
Se adquirió D,L-lactida de la empresa Aldrich, y el octoato estannoso, polietilenglicol (peso molecular 8.000), y MePEG (peso molecular 2.000 y 5.000) eran de la empresa Sigma. El MePEG (peso molecular 750) era de la empresa Unión Carbide. Los copolímeros fueron sintetizados mediante un procedimiento de polimerización con abertura del anillo usando octoato estannoso como catalizador (Deng et al. J. Polym. Sci., Polym, Lett. 28:411-416, 1990; Cohn et al, J. Biomed, Mater. Res. 22:993-1009, 1988).
Para sintetizar PDLLA-MePEG, se añadió una mezcla de DL-lactida/MePEG/octoato estannoso a una ampolla de vidrio de 10 mililitros. La ampolla fue conectada a un vacío y sellada con llama. La polimerización se realizó incubando la ampolla en un baño de aceite a 150ºC durante 3 horas. Para sintetizar PDLLA-PEG-PDLLA, una mezcla de D,L-lactida/PEG/octoato estannoso fue transferida a un matraz de vidrio, se selló con un tapón de caucho y se calentó durante 3 horas en una estufa a 150ºC. Las composiciones de partida de los copolímeros se proporcionan en las Tablas 1 y 2. En todos lo casos, la cantidad de octoato estannoso fue de 0,5%-0,7%.
B. Métodos
Los polímeros se disolvieron en acetonitrilo y se centrifugaron a 10.000 g durante 5 minutos para desechar cualesquiera impurezas no solubles. Seguidamente se añadió la solución en acetonitrilo de paclitaxel a cada solución de polímero para proporcionar una solución con paclitaxel (paclitaxel + polímero) de 10% en peso. El acetonitrilo del disolvente fue seguidamente separado para obtener una matriz transparente de paclitaxel/PDLLA-MePEG, bajo una corriente de nitrógeno y calentando a 60ºC. Se añadieron agua destilada, solución salina de NaCl al 0,9% o dextrosa al 5% en 4 veces el peso de la matriz. La matriz fue finalmente "disuelta" por medio de mezcladura por centrifugación y calentamiento periódico a 60ºC. Se obtuvieron soluciones transparentes en todos los casos. Los tamaños de las particulas estuvieron todos por debajo de 50 nm según se determinó mediante un dispositivo dimensionador de partículas submicrónicas (NICOMP modelo 270). Las formulaciones se proporcionan en la Tabla 1.
TABLA 1 Formulaciones de paclitaxel/PDLLA-MePEG*
PDLLA-MePEG Medios disolventes Contenido de paclitaxel
(concentrado final de paclitaxel)
2000/50/50 agua 10% (20 mg/ml)
2000/40/60 agua 10% (20 mg/ml)
2000/50/50 sol. salina al 0,9% 5% (10 mg/ml)
2000/50/50 sol. salina al 0,9% 10% (20 mg/ml)
2000/50/50 dextrosa al 5% 10% (10 mg/ml)
2000/50/50 dextrosa al 5% 10% (20 mg/ml)
En el caso de PDLLA-PEG-PDLLA (Tabla 2), como los copolímeros no se pueden disolver en agua, el paclitaxel y el polímero fueron conjuntamente disueltos en acetona. Se añadió gradualmente agua o una mezcla de agua/acetona a esta solución de paclitaxel-polímero para inducir la formación de esferas de paclitaxel/polímero.
TABLA 2 Composición de PDLLA-PEG-PDLLA
Nombre de copolímero Peso de PEG (g) Peso de DL-lactida (g)
PDLLA-PEG-PDLLA 90/10 1 9
PDLLA-PEG-PDLLA 80/20 2 8
PDLLA-PEG-PDLLA 70/30 3 7
PDLLA-PEG-PDLLA 60/40 4 6
PDLLA-PEG-PDLLA 30/70 14 6
* peso molecular de PEG 8.000.
C. Resultados
Muchas de las composiciones de PDLLA-MePEG forman soluciones transparentes en agua, solución salina al 0,9% o dextrosa al 5%, indicando la formación de agregados diminutos en el intervalo de nanómetros. El paclitaxel fue introducido en las micelas de PDLLA-MePEG satisfactoriamente. Por ejemplo, a un % de contenido (esto representa 10 mg de paclitaxel en 1 ml de paclitaxel/PDLLA-MePEG/sistema acuoso) se obtuvo una solución transparente de 2000-50/50 y 2000-40/60. El tamaño de partículas fue de aproximadamente 60 mm.
Ejemplo 25 Procedimiento para producir una película
El término "películas" se refiere a un polímero formado en una de muchas forman geométricas. La película puede ser una lámina elástica fina de polímero o un disco grueso de 2 mm de polímero, cualquiera de los cuales puede ser aplicado a la superficie del tejido para evitar la posterior cicatrización y formación de adhesiones. Esta película se diseñó para ser colocada en el tejido expuesto de forma que cualquier fármaco encapsulado pueda ser liberado desde el polímero durante un período de tiempo largo en el sitio del tejido. Las películas se pueden preparar mediante diversos procedimientos que incluyen, por ejemplo, extensión y pulverización.
En la técnica de extensión, el polímero fue fundido o bien vertido en una forma o disuelto en diclorometano y vertido en una forma. El polímero seguidamente solidificó a medida que era enfriado o solidificó a medida que se evaporaba el disolvente, respectivamente. En la técnica de pulverización, el polímero fue disuelto en un disolvente y pulverizado sobre vidrio, a medida que el disolvente se evaporaba el polímero solidificó sobre el vidrio. Una pulverización repetida hizo posible la constitución de polímero en forma de una película que puede ser desprendida del vidrio.
Los reactivos y la instalación que se utilizaron en estos experimentos incluyen un pequeño vaso de precipitado, un agitador de placa caliente Corning, moldes de conformación (por ejemplo, tapones de tubos de centrifugadora de 50 ml) y aparato de sujeción de los moldes, vial de escintilación de vidrio de 20 ml con tapón (tipo inserción de plástico), atomizador de TLC, depósito de gas de nitrógeno, policaprolactona ("PCL"-peso molecular 10.000 ó 20.000; Polysciences), paclitaxel (Sigma, 95% de pureza), etanol, etileno-acetato de vinilo ("EVA") (véase lo que antecede), poli(DL)-ácido láctico ("PLA"-peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences) y DCM (grado de HPLC; Fisher Scientific).
1. Procedimiento para producir películas-extensión en estado fundido
Un pequeño vaso de precipitado de vidrio con un peso conocido de PCL fue colocado en un matraz mayor que contenía agua (para actuar como un baño de agua) y se colocó en una placa caliente a 70ºC hasta que el polímero se fundió completamente. Se añadió un peso conocido de fármaco al polímero fundido y la mezcla se agitó a fondo. El polímero fundido fue vertido en un molde y se dejó enfriar.
2. Procedimiento para producir películas-extensión en disolvente
Un peso conocido de PCL fue colocado directamente en un vial de escintilación de vidrio de 20 ml y se añadió suficiente DCM para conseguir una solución al 10% p/v. La solución se mezcló y seguidamente se añadió suficiente paclitaxel para conseguir la concentración final deseada de paclitaxel. La solución fue removida para disolver el paclitaxel, se dejó asentar durante una hora (para disminuir la presencia de burbujas de aire) y seguidamente se vertió lentamente en un molde. El molde se colocó en la campaña para humos durante una noche, permitiendo que se evaporara el DCM.
3. Procedimiento para producir películas pulverizadas
Una cantidad suficiente de polímero fue pesada directamente en un vial de escintilación de vidrio de 20 ml y se añadió suficiente DCM para conseguir una solución al 2% p/v. La solución se mezcló para disolver el polímero. Usando una pipeta automática, se transfirió un volumen adecuado (mínimo 5 ml) de la solución de polímero al 2% a un vial de escintilación de vidrio de 20 ml separado. Se añadió suficiente paclitaxel a la solución y se disolvió agitando el vial tapado. Para prepararlo para la pulverización, el tapón del vial fue retirado y el cilindro del atomizador de TCL se sumergió en la solución de polímero.
El depósito de nitrógeno se conectó a la entrada de gas del atomizador y la presión se aumentó gradualmente hasta que comenzó la atomización y pulverización. Los moldes fueron pulverizados usando pulverizaciones oscilantes de 5 segundos con un tiempo de secado de 15 segundos entre pulverizaciones. La pulverización se continuó hasta que un grosor adecuado de polímero fue depositado sobre el estado.
Ejemplo 26 Películas polímeras con contenido de agente terapéutico compuestas por etileno-acetato de vinilo y un tensioactivo
Se investigaron dos tipos de películas en este Ejemplo: películas de EVA puro con contenido de paclitaxel y películas de mezclas de EVA/tensioactivo con contenido de paclitaxel.
Los tensioactivos que se examinaron fueron dos tensioactivos hidrófobos (Span 80 y Pluronic L101) y un tensioactivo hidrófilo (Pluronic F127). Los tensioactivos Pluronic eran en sí mismos polímeros que tenían una propiedad atractiva ya que podían ser mezclados con EVA para optimizar diversas propiedades del suministro del fármaco. El Span 80 es una molécula más pequeña que se dispersa en la matriz de polímero y no forma una mezcla.
Los tensioactivos fueron útiles para modular las velocidades de liberación de paclitaxel a partir de películas y optimizar ciertos parámetros físicos de las películas. Un aspecto de las películas de mezclas de tensioactivos que indicó que las velocidades de liberación de fármaco podían ser controladas fue la capacidad de variar la velocidad y el alcance hasta los que el compuesto se hinchaba en agua. La difusión de agua en una matriz de polímero-fármaco era crítica para la liberación de fármaco a partir del vehículo. Las Figuras 43C y 43D muestran el grado de hinchamiento de las películas a medida que se alteraba el nivel de tensioactivo en la mezcla. Las películas de EVA puro no se hincharon en ninguna medida significativa durante 2 meses. Sin embargo, aumentando el nivel de tensioactivo añadido al EVA, era posible aumentar el grado de hinchamiento del compuesto y, aumentando la hidrofobicidad, se aumentó el hinchamiento.
Los resultados de los experimentos con estas películas se muestran con posterioridad en las Figuras 43A-E. Brevemente, la Figura 43A muestra la liberación de paclitaxel (en mg) a lo largo del tiempo a partir de películas de EVA puro. La Figura 43B muestra el porcentaje de fármaco que permanecía en las mismas películas. Como se puede observar a partir de estas dos figuras, a medida que aumentaba el contenido de paclitaxel (es decir, el porcentaje de paclitaxel por peso aumentado) aumentaba las velocidades de liberación de fármaco, mostrando la dependencia de la concentración esperada. A medida que se aumentó el contenido de paclitaxel, aumentó también el porcentaje de paclitaxel que permanecía en la película, indicando que un contenido superior puede ser más atractivo para formulaciones de liberación a largo plazo.
La resistencia física y la elasticidad de las películas se valoró como se presenta en la figura 43E. Brevemente, la Figura 43E muestra las curvas de tensión/deformación para películas de EVA puro y mezclas de EVA/tensioactivo. Esta medición en bruto de la tensión demostró que la elasticidad de las películas se aumentaba con la adición de Pluronic F127, y que la resistencia a la tracción (tensión a la rotura) se aumentaba de una manera dependiente de la concentración con la adición de Pluronic F127. La elasticidad y la resistencia son consideraciones importantes en el diseño de una película que deba ser manipulada para aplicaciones clínicas particulares sin causar una deformación permanente del compuesto.
Los datos anteriores demuestran la capacidad de ciertos aditivos densioactivos para controlar las velocidades de liberación de fármaco y alterar las características físicas del vehículo.
Ejemplo 27 Procedimiento para producir una nanopulverización
La nanopulverización es una suspensión de microesferas pequeñas en solución salina. Si las microesferas son muy pequeñas (es decir, por debajo de 1 \mum de diámetro) forman un coloide, de forma que la suspensión no sedimentará por la gravedad. Como se describe más en detalle con posterioridad, una suspensión de micropartículas de 0,1 \mum a 1 \mum puede ser creada de forma adecuada para una deposición por aerosol sobre un tejido directamente en el momento de la cirugía (por ejemplo, para adhesiones vasculares) a través de una intervención laproscópica o a través de un aerosol bombeado con los dedos (por ejemplo, para ser suministrada por vía tópica). Las instalaciones y los materiales que pueden ser utilizados para producir nanopulverizaciones incluyen un vaso de precipitado encamisado con agua de 200 ml (Kimax o Pyrex), un baño de agua en circulación Haake, un agitador elevado y un controlador de 2 pulgadas (5,08 cm) de diámetro (propulsor de 4 paletas de tipo agitador de acero inoxidable; marca Fisher), vaso de precipitado de vidrio de 500 ml, placa caliente/agitador (marca Corning), tubos de centrifugadora de polipropileno de 4 x 50 ml (Nalgene), viales de escintilación de vidrio con tapones de inserción de plástico, centrifugadora superior de mesa (Beckman), centrifugadora de velocidad elevada - modelo para suelo (JS 21 Beckman), equilibrador analítico Mettler (AJ 100, 0,1 mg), equilibrador de carga superior digital Mettler (AE 163, 0,01 mg), pipetera automática (Gilson), puntas de pipetas estériles, aerosol de acción por bombeo (productos farmacéuticos Pfeiffer) 20 ml, campana de flujo laminar, PCL (peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences; Warrington, Pennsylvania, EE.UU.), EVA "lavado" (véase lo que antecede), PLA (peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), poli(alcohol vinílico)
("PVA" - peso molecular 124.000 a 186.000; 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI EE.UU.), DCM o "cloruro de metileno" (grado HPLC, Fisher Scientific), agua destilada y solución salida estéril (Becton and
Dickenson o equivalente).
1. Preparación de soluciones de polímero al 5% (P/V)
Dependiendo de la solución de polímero que esté siendo preparada, se pesó lo siguiente directamente en un vial de escintilación de vidrio de 20 ml: 1,00 g de PCL o PLA o 0,50 g de cada uno de PLA y EVA lavado. Usando un cilindro medidor, se añadieron 20 ml de DCM y el vial fue herméticamente tapado. El vial se dejó asentar a temperatura ambiente (25ºC) hasta que todo el polímero se hubo disuelto.
2. Preparación de solución madre al 3,5% (P/V) de PVA
La solución se preparó siguiendo el procedimiento que se proporcionó con anterioridad, o diluyendo la solución madres de PVA al 5% (P/V) preparada para la producción de microesferas (véase el Ejemplo 28). Brevemente, 17,5 g de PVA se pesaron directamente en un vaso de precipitado de vidrio de 600 ml y se añadieron 500 ml de agua destilada. El vaso de precipitado se tapó y se colocó en un vaso de precipitado de 2.000 ml que contenía 300 ml de agua. El PVA se agitó a 300 rpm a 85ºC hasta que se disolvió completamente.
3. Procedimiento para producir nanopulverización
Brevemente, 100 ml de la solución de PVA al 3,5% se colocaron en el vaso de precipitado encamisado con agua de 200 ml con un baño de agua Haake conectado. El contenido del vaso de precipitado se agitó a 3.000 rpm y se pipetearon 10 ml de solución de polímero (solución de polímero usada basada en el tipo de nanopulverización que esté siendo producida) en el PVA en agitación durante un período de 2 minutos, usando un pipeteador automático de 5 ml. Después de 3 minutos, la velocidad de agitación se ajustó a 2.500 rpm (+/- 200 rpm) durante 2,5 horas. Después de 2,5 horas la paleta de agitación se retiró de la preparación de nanopulverización y se aclaró con 10 ml de agua destilada, dejando que la solución de aclarado fuera a la preparación de nanopulverización.
La preparación de microesferas se vertió en un vaso de precipitado de 500 ml. El baño de agua con encamisado se lavó con 70 ml de agua destilada, dejando que los 70 ml de solución de aclarado fueran a la preparación de microesferas. La preparación de microesferas de 180 ml fue agitada con una varilla de vidrio y se vertió igualmente en cuatro tubos de centrifugadora de 50 ml de polipropileno, que se centrifugaron a 10.000 g (+/- 1.000 g) durante 10 minutos. La solución de PVA se retiró de cada sedimentación de microesferas y se desechó. Se añadió agua destilada (5 ml) a cada tubo de centrifugadora y se centrifugó. Las cuatro suspensiones de microesferas se reunieron en un tubo de centrifugadora usando 20 ml de agua destilada y se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 g
(+/- 1.000 g). La materia sobrenadante se retiró del sedimento de microesferas y se añadieron 40 ml de agua destilada, y la preparación de microesferas fue centrifugada (este procedimiento se repitió 3 veces). La preparación de microesferas fue seguidamente transferida a un vial de escintilación de vidrio previamente pesado.
El vial se dejó asentar durante 1 hora a temperatura ambiente (25ºC) para permitir que las microesferas de 2 \mum y 3 \mum de diámetro sedimentaran bajo la acción de la gravedad. Después de 1 hora, los 9 ml superiores de la suspensión se retiraron, se colocaron en un tubo de centrifugadora de 50 ml tapado estéril y se centrifugaron a 10.000 g
(+/- 1.000 g) durante 10 minutos. La materia sobrenadante se desecho y el sedimento se volvió a poner en suspensión en 20 ml de solución salina estéril centrifugando la suspensión a 10.000 g (+/- 1.000 g) durante 10 minutos. La materia sobrenadante se desechó y el sedimento se volvió a poner en suspensión en solución salina estéril. La cantidad de solución salina usada dependió de la concentración final requerida para la suspensión (habitualmente 10% p/v). La suspensión de nanopulverización fue añadida al aerosol.
Ejemplo 28 Elaboración de microesferas
La instalación usada para la elaboración de microesferas incluye: vaso de precipitado con encamisado de agua de 200 ml (Kimax o Pyrex), baño de agua en circulación Haake, agitador elevado y controlador con 2 pulgadas (5,08 cm) de diámetro (agitador de acero inoxidable de tipo propulsor, 4 paletas, marca Fisher), vaso de precipitado de vidrio de 500 ml, placa caliente/agitador (marca Corning), tubos de centrifugadora de polipropileno de 4 x 50 ml (Nalgene), viales de escintilación con tapones de inserción de plástico, centrifugadora superior de mesa (GPR Beckman), centrifugadora de velocidad elevada, modelo de suelo (JS 21 Beckman), equilibrador analítico Mettler (AJ 100, 0,1 mg), equilibrador de carga superior digital Mettler (AE 163, 0,01 mg), y pipeteador automático (Gilson). Los reactivos incluyen PCL (peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania, EE.UU.), EVA "lavado" (véase el método posterior de "lavado"), PLA (peso molecular 15.000 a 25.000; POlysciences), poli(alcohol vinílico) ("PVA" - peso molecular 124.000 a 186.000; 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI, EE.UU), DCM o "cloruro de metileno"; grado de HPLC, Fisher Scientific y agua destilada.
A. Preparación de soluciones de polímeros al 5% (p/v)
Se pesaron directamente DCL (1,00 g) o PLA, 0,50 g de cada uno de PLA y EVA lavado en un vial de escintilación de vidrio de 20 ml. Seguidamente se añadieron 20 mililitros de DCM. El víal fue tapado y almacenado a temperatura ambiente (25ºC) durante una hora (se puede usar una agitación ocasional) o hasta que todo el polímero se disolvió. La solución puede ser almacenada a temperatura ambiente durante al menos dos semanas.
B. Preparación de solución madre al 5% (p/v) de PVA
Se pesaron 25 gramos de PVA directamente en un vaso de precipitado de vidrio de 600 ml y se añadieron 500 ml de agua destilada junto con una barra de agitación revestida con Teflon de 3 pulgadas (7,62 cm). El vaso de precipitado se tapó con vidrio para disminuir pérdidas por evaporación y se colocó en un vaso de precipitado de vidrio de 2.000 ml que contenía 300 ml de agua. El PVA fue agitado a 300 rpm a 85ºC (placa caliente Corning/agitador) durante 2 horas o hasta que se disolvió completamente. La disolución del PVA se determinó por una verificación visual; la solución debe ser transparente. La solución fue seguidamente transferida a un recipiente de almacenamiento con tapón roscado de vidrio y se almacenó a 4ºC durante un máximo de dos meses. Sin embargo, la solución debe ser calentada a temperatura ambiente antes de su uso o dilución.
C. Procedimiento para producir microesferas
Basándose en el tamaño de las microesferas que se estaban preparando (véase la Tabla 1), se colocaron 100 ml de solución de PVA (concentraciones proporcionadas en la Tabla 1) en el vaso de precipitado con encamisado de agua de 200 ml. Se conectó un baño de agua en circulación Haake a este vaso de precipitado y el contenido se dejó que se equilibrara a 27ºC (+/- 1ºC) durante 10 minutos. Basándose en el tamaño de las microesferas que se estaban preparando (véase la Tabla 1), la velocidad de partida del agitador elevado se ajustó y la paleta del agitador elevado se colocó a mitad de camino por debajo de la solución de PVA. Se puso en marcha el agitador y seguidamente se hicieron gotear 10 ml de solución de polímero (solución de polímero usada basada en el tipo de microesferas que estaban siendo producidas) en el PVA en agitación durante un período de 2 minutos usando un pipeteador automático de 5 ml. Después de 3 minutos, la velocidad del agitador se ajustó (véase la Tabla 1) y la solución se agitó durante 2,5 horas adicionales. La paleta de agitación fue seguidamente retirada de la preparación de microesferas y se aclaró con 10 ml de agua destilada, de forma que la solución de aclarado se purgara en la preparación de microesferas. La preparación de microesferas fue seguidamente vertida en un vaso de precipitado de 500 ml y el baño de agua con encamisado se lavó con 70 ml de agua destilada, que se dejó también purgar en la preparación de microesferas. La preparación de microesferas de 180 ml fue seguidamente agitada con una varilla de vidrio y se vertieron cantidades iguales en cuatro tubos de centrifugadora de 50 ml de polipropileno. Los tubos fueron seguidamente tapados y centrifugados durante 10 minutos (fuerza proporcionada en la Tabla 1). Se retiraron 24 mililitros de la solución de PVA de cada sedimento 
\hbox{de
microesferas.}
TABLA 1 Concentraciones de PVA, velocidades de agitación y requisitos de fuerza centrífuga por cada intervalo de diámetros de microesferas
6
Seguidamente se añadieron 5 mililitros de agua destilada a cada tubo de centrifugadora y se centrifugó para volver a poner en suspensión las microesferas. Las cuatro suspensiones de microesferas se reunieron seguidamente en un tubo de centrifugadora junto con 20 ml de agua destilada y se centrifugaron durante otros 10 minutos (fuerza dada en la Tabla 1). Este procedimiento se repitió dos veces adicionales durante un total de tres lavados. Las microesferas fueron seguidamente centrifugadas una vez final y se volvieron a poner en suspensión en 10 ml de agua destilada. Después del lavado final, la preparación de microesferas fue transferida a un vial de escintilación de vidrio previamente pesado. El vial fue tapado y se dejó durante una noche a temperatura ambiente (25ºC) con el fin de permitir que las microesferas sedimentaran bajo la acción de la gravedad. Como las microesferas que caían en el intervalo de tamaños de 0,1 \mum a 3 \mum no sedimentaron bajo la acción de la gravedad, se dejaron en la suspensión de 10 ml.
D. Secado de microesferas de 10 \mum a 30 \mum o de 30 \mum a 100 \mum de diámetro
Después de que las microesferas se asentaron a temperatura ambiente durante una noche, la materia sobrenadante fue retirada de las microesferas sedimentadas. Las microesferas se dejaron secar en el vial sin tapar en un cajón durante un período de una semana o hasta que estaban completamente secas (vial a peso constante). Se puede realizar un secado más rápido dejando el vial sin tapar bajo una corriente lenta de gas nitrógeno (flujo de aproximadamente 10 ml/minuto) en la campana para humos. Cuando estaba completamente seco (vial a peso constante), el vial se pesó y se tapó. El vial tapado y etiquetado se almacenó a temperatura ambiente en un cajón. Las microesferas se almacenaron normalmente durante no más de 3 meses.
E. Determinación de la concentración de la suspensión de microesferas de 0,1 \mum a 3 \mum de diámetro
Este intervalo de tamaños de microesferas no se separó por sedimentación, por lo que se dejaron en suspensión a 4ºC durante un máximo de cuatro semanas. Para determinar la concentración de microesferas en la suspensión de 10 ml, una muestra de 200 \mul de la suspensión fue pipeteada en un tubo de microcentrifugadora previamente pesado de 1,5 ml. El tubo fue seguidamente centrifugado a 10.000 g (microcentrifugadora superior de mesa Eppendorf), la materia sobrenadante se separó y el tubo se dejó secar a 50ºC durante una noche. El tubo fue seguidamente pesado otra vez con el fin de determinar el peso de microesferas secas en el tubo.
F. Elaboración de microesferas con contenido de paclitaxel
Con el fin de preparar microesferas que contenían paclitaxel, se colocó una cantidad de paclitaxel pesado (basado en el porcentaje de paclitaxel que iba a ser encapsulado) directamente en un vial de escintilación de vidrio de 20 ml. Seguidamente se añadieron 10 mililitros de una solución de polímeros apropiada al vial que contenía el paclitaxel, que fue seguidamente centrifugado hasta que el paclitaxel se disolvió.
Seguidamente se pueden producir microesferas que contienen paclitaxel esencialmente como se describió anteriormente en las etapas (C) a (E).
Ejemplo 29 Microesferas revestidas con tensioactivo A. Materiales y métodos
Se elaboraron microesferas a partir de poli(DL-ácido láctico) (PLA), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli- caprolactona (PLC) y 50% de etileno-acetato de vinilo (EVA):PLA esencialmente como se describió con anterioridad. El tamaño varió en el intervalo de 10 a 100 \mum con un diámetro medio de 45 \mum.
Se obtuvo sangre humana de voluntarios sanos. Los neutrófilos (glóbulos blancos) se separaron de la sangre usando sedimentación con dextrano y técnicas de centrifugación Ficoll Hypaque. Los neutrófilos se pusieron en suspensión a 5 millones de células por ml en HBSS.
Los niveles de activación de neutrófilos se determinaron por la generación de especies reactivas de oxígeno según se determinó por quimioluminiscencia. En particular, la quimioluminiscencia se determinó usando un luminómetro LKB con un mejorador de luminol 1 \muM. El pre-revestimiento con plasma (u oxonización) de las microesferas se realizó poniendo en suspensión 10 mg de microesferas en 0,5 ml de plasma y agitando a 37ºC durante 30 minutos.
Las microesferas fueron seguidamente lavadas con 1 ml de HBSS y el sedimento de microesferas centrifugadas se añadió a la suspensión de neutrófilos a 37ºC para un tiempo t = 0. Las superficies de las microesferas fueron modificadas usando un tensioactivo denominado Pluronic F127 (BASF) poniendo en suspensión 10 mg de microesferas en 0,5 ml de solución al 2% p/p de F127 en HBSS durante 30 minutos a 37ºC. Las microesferas fueron seguidamente elevadas dos veces en 1 ml de HBSS antes de añadirlas a los neutrófilos o el plasma para un pre-revestimiento
adicional.
B. Resultados
La Figura 44 muestra que las microesferas sin tratar proporcionan valores de la quimioluminiscencia menores que 50 mV. Estos valores representan niveles bajos de activación de neutrófilos. A modo de comparación, los microcristales inflamatorios pueden proporcionar valores próximos a 1.000 mV, los activadores químicos solubles pueden proporcionar valores próximos a 5.000 mV. Sin embargo, cuando las microesferas son previamente revestidas con plasma, todos los valores de la quimioluminiscencia son amplificados hasta el intervalo de 100 a 300 mV (Figura 44). Estos niveles de respuesta o activación de neutrófilos pueden ser considerados como suavemente inflamatorios. El PMMA proporcionó la respuesta mayor y se pudo considerar como el más inflamatorio. El PLA y la PCL resultaron ambos de tres a cuatro veces más potentes en la activación de neutrófilos después de un pretratamiento con plasma (u oxonización), pero hay poca diferencia entre los dos polímeros a este respecto. El EVA:PLA no es probable que sea usado en las formulaciones de angiogénesis ya que las microesferas son difíciles de secar y se vuelven a poner en suspensión en tampón acuoso. Este efecto del plasma se denomina oxonización y da lugar a la adsorción de anticuerpos o moléculas complementarias sobre la superficie. Estas especies absorbidas interaccionan con los receptores o glóbulos blancos y causan una activación celular amplificada.
Las Figuras 45-48 describen los efectos del pretratamiento con plasma de PCL, PMMA, PLA y EVA:PLA, y muestran también el efecto de un revestimiento con Pluronic F127 antes del revestimiento previo con plasma de las microesferas. Estas cifras muestran todas el mismo efecto: (1) el revestimiento previo con plasma amplifica la respuesta; (2) el revestimiento previo con Pluronic F127 no tiene ningún efecto por sí mismo; (3) la respuesta de neutrófilos amplificada causada por el revestimiento previo con plasma puede ser fuertemente inhibida pretratando la superficie de las esferas con 2% de Pluronic F127.
La naturaleza de las especies de proteínas adsorbidas a partir de plasma se estudió también por electroforesis. Usando este método, se mostró que el pretratamiento de la superficie polímera con Pluronic F127 inhibía la adsorción de anticuerpos a la superficie polímera.
Las Figuras 49-52 muestran análogamente el efecto de revestir previamente microesferas con PCL, PMMA, PLA o EVA:PLA (respectivamente) con IgG (2 mg/ml) o bien 2% de Pluronic F127 y seguidamente IgG (2 mg/ml). Como se puede observar a partir de estas cifras, la respuesta amplificada causada por el revestimiento previo de microesferas con IgG puede ser inhibida mediante tratamiento con Pluronic F127.
Este resultado muestra que pretratando la superficie polímera de la totalidad de los cuatro tipos de microesferas con Pluronic F127, puede ser inhibida la respuesta "inflamatoria" de neutrófilos a microesferas.
Ejemplo 30 Encapsulación de agente terapéutico en microesferas de poli(\varepsilon-caprolactona). Inhibición de angiogénesis en el ensayo de CAM por microesferas con contenido de paclitaxel
Este ejemplo evalúa el perfil de la velocidad de liberación in vitro de paclitaxel desde microesferas biodegradables de poli(\varepsilon-caprolactona) (PCL) y demuestra la actividad anti-angiogénica in vivo del paclitaxel liberado desde estas microesferas cuando se colocan en la CAM.
Los reactivos que se utilizaron en estos experimentos incluyen: PCL (peso molecular 35.000-45.000; adquirido de la empresa Polysciences (Warrington, PA)); DCM de la empresa Fisher Scientific Co., Canadá; poli(alcohol vinílico) (PVP) (peso molecular 12.000-18.000, 99% hidrolizado) de la empresa Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) y paclitaxel de la empresa Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Salvo que se establezca otra cosa, todos los productos químicos y reactivos se usan tal como son suministrados. Se usa agua destilada en todos ellos.
A. Preparación de microesferas
Las microesferas se prepararon esencialmente como se describió en el Ejemplo 28 utilizando el método de evaporación del disolvente. Brevemente, se prepararon microesferas con contenido de 5% p/p de paclitaxel disolviendo 10 mg de paclitaxel y 190 mg de PCL en 2 ml de DCM, añadiendo 100 ml de solución acuosa de PVP al 1% y agitando a 1.000 rpm a 25ºC durante 2 horas. La suspensión de microesferas fue centrifugada a 1.000 x g durante 10 minutos (Beckman GPR), la materia sobrenadante se separó y las microesferas se lavaron tres veces con agua. Las microesferas lavadas se secaron con aire durante una noche y se almacenaron a temperatura ambiente. Se prepararon microesferas testigo (en ausencia de paclitaxel) como se describió anteriormente. Se prepararon también microesferas que contenían 1% y 2% de paclitaxel. Las microesferas fueron dimensionadas usando un microscopio óptico con un micrómetro por etapas.
B. Eficacia de la encapsulación
Un peso conocido de microesferas con contenido de fármaco (aproximadamente 5 mg) se disolvió en 8 ml de acetonitrilo y se añadieron 2 ml de agua destilada para precipitar el polímero. La mezcla se centrifugó a 1.000 g durante 10 minutos y la cantidad de paclitaxel encapsulado se calculó a partir de la absorbancia de la materia sobrenadante medida en un espectrofotómetro UV (espectrofo-tómetro de conjuntos de diodos Hewlett-Packard 8452A) a 232 nm.
C. Estudios de liberación de fármaco
Se pusieron en suspensión aproximadamente 10 mg de microesferas con contenido de paclitaxel en 20 ml de PBS 10 mM (pH 7,4) en tubos tapados a rosca. Los tubos fueron volteados de un extremo a otro a 37ºC y a intervalos de tiempo dados se retiraron 19,5 ml de materia sobrenadante (después de permitir que las microesferas sedimentaran en la parte inferior), se filtró a través de un filtro de membrana de 0,45 \mum y se retuvieron para un análisis de paclitaxel. Se volvió a colocar un volumen igual de PBS en cada tubo para mantener las condiciones de inmersión durante todo el estudio. Los filtrados se extrajeron con 3 x 1 ml de DCM, los extractos de DCM se evaporaron hasta sequedad usando una corriente de nitrógeno, se volvieron a disolver en 1 ml de acetonitrilo y se analizaron por HPLC usando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58) a un caudal de 1 ml/minuto (bomba isocrática Beckman), una columna de fase inversa C8 (Beckman) y detección UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm.
D. Estudios de la CAM
Embriones de pollo domésticos fertilizados fueron incubados durante 4 días antes de su cultivo en ausencia de cáscara. En el día 6 de incubación, se colocaron partes alícuotas de 1 mg de microesferas con contenido de 5% de paclitaxel o testigo (exentas de paclitaxel) directamente sobre la superficie de la CAM. Después de una exposición de 2 días, la vascularización se examinó usando un estereomicroscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales de vídeo fueron seguidamente exhibidas en un ordenador e impresas en vídeo.
E. Microscopía electrónica de exploración
Se colocaron microesferas en sujeciones para muestras, revestidas por pulverización iónica con oro y seguidamente colocadas en un dispositivo Philips 501B SEM que funcionaba a 15 kV.
F. Resultados
El intervalo de tamaños para las muestras de microesferas fue entre 30-100 \mum, aunque hubo evidencia en todas las tandas de microesferas con contenido de paclitaxel o testigos de algunas microesferas que caían fuera de este intervalo. La eficacia de incluir un contenido de microesferas de PCL con paclitaxel fue siempre mayor que 95% para todos los contenidos de fármaco estudiados. Una microscopía electrónica de exploración demostró que las microesferas eran todas esféricas y muchas mostraban una morfología superficial rugosa o picada. No parecía haber ninguna evidencia de fármaco sólido sobre la superficie de las microesferas.
Los transcursos del tiempo de la liberación de paclitaxel de microesferas con contenido de PCL de 1%, 2% y 5% se muestran en la Figura 53A. Los perfiles de las velocidades de liberación fueron bifásicos. Hubo una liberación inicial rápida de paclitaxel o "fase de aumento brusco" para todos los contenidos de fármaco. La fase de aumento brusco se produjo sobre 1-2 días para un contenido de paclitaxel de 1% y 2% y sobre 3-4 días para microesferas con contenido de 5%. La fase inicial de liberación rápida estuvo seguida de una fase de liberación de fármaco significativamente más lenta. Para microesferas que contenían 1% ó 2% de paclitaxel no hubo liberación adicional de fármaco después de 21 días. Para un contenido de paclitaxel de 5%, las microesferas habían liberado aproximadamente 20% del contenido total de fármaco después de 21 días.
La Figura 53B muestra CAMs tratadas con microesferas de PCL testigos, y la Figura 53C muestra un tratamiento con microesferas con contenido de 5% de paclitaxel. La CAM con las microesferas testigos mostraron una arquitectura de red capilar normal. La CAM tratada con microesferas de paclitaxel-PCL mostró una regresión vascular considerable y zonas que estaban desprovistas de una red capilar.
G. Explicación
El método de evaporación del disolvente para elaborar microesferas con contenido de paclitaxel produjo eficacias de encapsulación de paclitaxel muy elevadas entre 95-100%. Esto era debido a la escasa solubilidad en agua del paclitaxel y que su naturaleza hidrófoba favorecía la división en partes de la fase de disolvente orgánico que contenía el polímero.
El perfil de liberación bifásico para paclitaxel era típico del modelo de liberación para muchos fármacos a partir de matrices polímeras biodegradables. La poli(\varepsilon-caprolactona) es un poliéster alifático que puede ser degradado por hidrólisis bajo condiciones fisiológicas y es no tóxica y compatible con los tejidos. La degradación de PCL es significativamente más lenta que la de los polímeros y copolímeros intensivamente investigados de ácidos láctico y glicólico y, por lo tanto, es adecuada para el diseño de sistemas de suministro de fármacos a largo plazo. La fase inicial rápida o de aumento brusco de liberación de paclitaxel se creía que era debida a la liberación por difusión del fármaco desde la zona superficial de las microesferas (próxima a la superficie de la microesfera). La liberación de paclitaxel en la segunda fase (más lenta) de los perfiles de liberación probablemente no era debida a la degradación o erosión de la PCl porque los estudios han mostrado que, bajo condiciones in vitro en agua, no hubo ninguna pérdida significativa de peso o erosión superficial de PCL durante un período de 7,5 semanas. La fase más lenta de liberación de paclitaxel era debida probablemente a la disolución del fármaco en los poros rellenos con fluido en la matriz polímera y a la difusión a través de los poros. La velocidad de liberación más elevada a un contenido superior de paclitaxel era probablemente una consecuencia de una red de poros más extensiva en la matriz polímera.
Las microesferas de paclitaxel con un contenido de 5% han mostrado que liberan suficiente fármaco para producir una inhibición extensiva de la angiogénesis cuando se colocan en la CAM. La inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos dio lugar a una zona avascular, como se muestra en la Figura 53C.
Ejemplo 31 Elaboración de microesferas de PLGA
Se elaboraron microesferas a partir de copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico (PLGA).
A. Método
Se elaboraron microesferas en los intervalos de tamaños de 0,5 a 10 \mum, 10-20 \mum y 30-100 \mum usando métodos estándar (el polímero se disolvió en diclorometano y se emulsión en una solución de poli(alcohol vinílico) con agitación, como se describió previamente en los métodos de elaboración de microesferas de PCL o PDLLA). Se usaron diversas relaciones de PDLLA a GA como los polímeros son pesos moleculares diferentes (dados como viscosidad intrínseca (I.V.)).
B. Resultado
Se elaboraron microesferas satisfactoriamente a partir de los siguientes polímeros de partida:
PLLA : GA I.V.
50 \hskip0,4cm : 50 0,74
50 \hskip0,4cm : 50 0,78
50 \hskip0,4cm : 50 1,06
65 \hskip0,4cm : 35 0,55
75 \hskip0,4cm : 25 0,55
85 \hskip0,4cm : 15 0,56
Se incorporó satisfactoriamente paclitaxel con contenidos de 10% o 20% en todas estas microesferas. Los ejemplos de las distribuciones de tamaños para un polímero de partida (85:15, IV = 0,56) se proporcionan en las Figuras 54-57. Los experimentos de liberación de paclitaxel se realizaron usando microesferas de diversos tamaños y diversas composiciones. Las velocidades de liberación se muestran en las Figuras 58-61.
Ejemplo 32 Encapsulación de paclitaxel en microcápsulas de nilón
Los agentes terapéuticos pueden ser encapsulados también en una amplia diversidad de vehículos que se pueden formar en una forma o dispositivo seleccionados. Por ejemplo, como se describe más en detalle con posterioridad, el paclitaxel puede ser incorporado en microcápsulas de nilón que pueden ser formuladas en forma de válvulas cardíacas artificiales, injertos vasculares, redes quirúrgicas o suturas.
A. Preparación de microcápsulas con contenido de paclitaxel
El paclitaxel se encapsuló en microcápsulas de nilón usando las técnicas de polimerización interfacial. Brevemente, 100 mg de paclitaxel y 100 mg de Pluronic F-127 se disolvieron en 1 ml de DCM y se añadieron 0,4 ml (aproximadamente 500 mg) de cloruro de adipoilo (ADC). Esta solución fue homogeneizada en solución de PVA al 2% usando un homogeneizador Plytron (ajuste a 1) durante 15 segundos. Se añadió gota a gota una solución de 1,6-hexanodiamina (HMD) en 5 ml de agua destilada mientras se homogeneizaba. La mezcla fue homogeneizada durante 10 segundos adicionales después de la adición de la solución de HMD. La mezcla fue transferida a un vaso de precipitado y agitada con un agitador magnético durante 3 horas. La mezcla fue centrifugada, recogida y se volvió a poner en suspensión en 1 ml de agua destilada.
B. Eficacia de la encapsulación/contenido de paclitaxel
Aproximadamente 0,5 ml de la suspensión fueron filtrados y las microesferas se secaron. Se pesaron aproximadamente 2,5 mg de las microcápsulas y se pusieron en suspensión en 10 ml de acetonitrilo durante 24 horas. La materia sobrenadante se analizó en cuanto a paclitaxel y el resultado se expresó como un porcentaje de paclitaxel. Los estudios preliminares han mostrado que el paclitaxel podría ser encapsulado en microcápsulas de nilón con un contenido elevado (hasta 60%) y una eficacia de encapsulación elevada (mayor que 80%).
C. Estudios de liberación de paclitaxel
Se pusieron en suspensión aproximadamente 2,5 mg de microesferas de paclitaxel-nilón en 50 ml de agua que contenía cloruro de sodio y urea 1 M cada uno y se analizaron periódicamente. La liberación de paclitaxel desde las microcápsulas fue rápida con más de 95% del fármaco liberado después de 72 horas (Figura 62).
Ejemplo 33 Microesferas bioadhesivas A. Preparación de microesferas bioadhesivas
Se prepararon microesferas a partir de 100 g/mol de PLLA con un intervalo de diámetros de partículas de 10-60 \mum. Las microesferas fueron incubadas en una solución de hidróxido de sodio para producir grupos de ácido carboxílico en la superficie por hidrólisis del poliéster. La reacción fue caracterizada con respecto a la concentración de hidróxido de sodio y el tiempo de incubación midiendo la carga superficial. La reacción alcanzó la compleción después de 45 minutos de incubación en hidróxido de sodio 0,1 M. A continuación del tratamiento básico, las microesferas fueron revestidas con dimetilaminopropilcarbodiimida (DE, un agente reticulante, poniendo en suspensión las microesferas en una solución alcohólica de DEC y permitiendo que la mezcla se secara en forma de un polvo dispersable. La relación en peso de microesferas a DEC fue 9:1. Después de que las microesferas se secaron, fueron dispersadas con agitación en una solución al 2% p/v de poli(ácido acrílico) (PAA) y la DEC se dejó que reaccionara con el PAA para producir una red insoluble en agua de PAA reticulado sobre la superficie de las microesferas. Se usó microscopía electrónica de exploración para confirmar la presencia de PAA sobre la superficie de las microesferas.
Una calorimetría de exploración diferencial de las microesferas antes y después del tratamiento con la base puso de manifiesto que no se observaron cambios en las propiedades térmicas volumétricas (T_{g}, punto de fusión y grado de cristalinidad) por SEM.
B. Velocidades de liberación de paclitaxel in vitro
Se elaboraron microesferas con contenido de paclitaxel (contenidos de 10% y 30% p/p) con el mismo intervalo de tamaños de diámetros de las partículas y perfiles de liberación in vitro durante 10 días de liberación en PBS. La liberación fue proporcional al contenido de fármaco, con 400 \mug de paclitaxel liberado a partir de 5 mg de microesferas con contenido de 30% en 10 días y 150 \mug liberados a partir de microesferas con contenido de 10% en el mismo período. La eficacia de encapsulación fue de aproximadamente 80%. Las microesferas con contenido de paclitaxel fueron incubadas en hidróxido de sodio 0,1 M durante 45 minutos y el potencial zeta fue medido antes y después de la incubación en hidróxido de sodio. El cambio superficial de las microesferas con contenido de paclitaxel fue inferior al de las microesferas sin paclitaxel tanto antes como después del tratamiento con la base.
C. Preparación y evaluación in vitro de PLLA revestido con poli-lisina o fibronectina
Se prepararon microesferas de PLLA que contenían 1% de negro de sudan al 1% (para colorear las microesferas). Estas esferas se pusieron en suspensión en una solución al 2% (p/volumen) de poli-lisina (sigma Chemical - Hidrobromell form) o fibronectina (Sigma) durante 10 minutos. Las microesferas fueron lavadas en tampón una vez y se colocaron en la superficie interna de vejigas recientemente preparadas de ratas. Las vejigas se dejaron durante 10 minutos y seguidamente se lavaron tres veces en tampón. Estaban presentes microesferas residuales (unidas) sobre la pared de la vejiga después del procedimiento, por lo tanto, se mostró que se había producido una bioadhesión (Figuras 63A y 63B) para microesferas revestidas tanto con fibronectina como con poli-l-lisina.
Ejemplo 34 (Ejemplo de referencia)
Evaluación del rechazo crónico en modelo de animal
Una forma acelerada de aterosclerosis se desarrolla en la mayoría de los receptores de trasplantes cardíacos y limita la supervivencia de los injertos a largo plazo. El modelo de rechazo crónico de trasplante cardíaco en rata heterotópica Lewis-F344 es un modelo experimental útil porque produce lesiones ateroscleróticas en etapas en aloinjertos que sobreviven a medio y largo plazo. Las ventajas del modelo Lewis-F344 son que: (i) la incidencia y la gravedad de las lesiones ateroscleróticas en injertos que sobreviven a largo plazo es bastante elevada; y (ii) una etapa inflamatoria del desarrollo de la lesión es fácilmente reconocida ya que el sistema no requiere inmunosupresión.
Ratas Lewis machos adultas sirven como donantes y ratas F-344 como receptores. Se trasplantan veinte aloinjertos cardíacos abdominales heterotrópicos haciendo una incisión abdominal larga de línea media en receptores anestesiados para exponer la aorta y la vena cava inferior. Los dos vasos se separan uno de otro y del tejido conectivo circundante y se colocan pequeñas pinzas de compresión en los vasos. Se hacen incisiones longitudinales (2 a 3 mm) en cada vaso en el sitio de anastomosis.
El abdomen de la rata donante anestesiada se abre para la inyección de 300 unidades de heparina acuosa en la vena cava inferior. La pared toráxica se abrió para exponer el corazón. Las venas cavas fueron ligadas, seguidamente se hizo una transección de la aorta ascendente y la arteria pulmonar principal, dejando los orígenes de los vasos de 2 a 3 mm de longitud unidos al corazón. Las venas cavas distantes de las ligaduras se dividieron y la ligadura se colocó alrededor de la masa de la aurícula izquierda y las venas pulmonares. Los vasos en el lado del pulmón de las ligaduras se dividieron y el corazón fue extirpado.
El corazón donante se coloca en la cavidad abdominal del receptor y las aortas se suturan conjuntamente en el sitio de incisión en el vaso receptor. Análogamente, la arteria pulmonar se conecta al sitio de incisión de la vena cava inferior de una manera similar. Las pinzas de compresión de los vasos se liberan (vena cava próxima, cava distal y aorta y aorta próxima) para minimizar la hemorragia desde los orificios de la aguja.
A continuación del trasplante, se inyecta paclitaxel (36%) en pasta de policaprolactona (PCL) (n = 10) o pasta de PCL sola (n = 10) a través del epicardio sobre una longitud de la superficie externa de una arteria coronaria en 10 ratas, de forma que el área de la arteria incluida en el miocardio permanezca sin tratar.
Todos los receptores reciben una única inyección intramuscular de penicilina G (100.000 unidades) en el momento del injerto. Los aloinjertos van seguidos por una palpitación diaria y su función se valora en una escala de 1 a 4, representando 4 un latido cardíaco normal y 0 la ausencia de actividad mecánica. Cinco ratas de cada grupo son sacrificadas a los 14 días y las cinco finales a los 28 días. Las ratas son observadas en cuanto a la pérdida de peso y otras señales de enfermedad sistémica. Después de 14 ó 28 días, los animales son anestesiados y el corazón es expuesto en la forma del experimento inicial. Las arterias coronarias revestidas y sin revestir son aisladas, fijadas en formaldehído tamponado al 10% y examinadas en cuanto a la histología.
El experimento inicial puede ser modificado para el uso de una película de paclitaxel/EVA o desviaciones quirúrgicas revestidas en las arterias coronarias a continuación del trasplante. La película de EVA es aplicada a la superficie extraluminal de la arteria coronaria de una forma similar a lo que antecede, mientras que las pinzas quirúrgicas revestidas se colocan de forma intraluminal.
Además, estas investigaciones se pueden extender adicionalmente para que incluyan otros trasplantes de órganos así como trasplantes de injertos (por ejemplo, venas o piel).
Ejemplo 35 Evaluación de paclitaxel y otros agentes estabilizantes de microtúbulos en cuanto al tratamiento de pólipos nasales
Se usan cultivos de células epiteliales y/o cultivos de tejidos de pólipos nasales para evaluar la eficacia de las formulaciones que contienen paclitaxel u otros agentes en el tratamiento de pólipos nasales. Esta aproximación se basa en la premisa de que las células epiteliales liberan citoquinas y contribuyen a la inflamación crónica detectada en la poliposis nasal, así como en rinitis y asma y que una medicación de liberación prolongada evitará la eosinofilia e inhibirá la expresión de genes de citoquinas.
Las fomulaciones de paclitaxel que incluyen soluciones (el uso de ciclodextrinas) o suspensiones que contienen paclitaxel encapsulado en polímeros microadhesivos para ser usados como pulverizaciones nasales y/o el paclitaxel micro-encapsulado en polímeros mucoadhesivos se usaron como insuflaciones. Estas formulaciones se usan en los estudios detallados con posterioridad.
A. Efecto de paclitaxel in vitro
Manejo de tejidos - Se obtuvieron muestras de mucosa nasal normal (NM) de pacientes sin manifestaciones clínicas de rinitis y un ensayo prick negativo durante la cirugía de reconstrucción nasal. Las muestras de pólipos nasales (NP) se obtuvieron de pacientes con ensayo positivo y negativo de puntura de la piel que habían experimentado polipectomía nasal. Las muestras nasales se colocan en medio F12 de Ham complementado con 100 Ui/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 2 \mug/ml de anfotericina B y fueron inmediatamente transportadas al laboratorio.
Cultivo de células epiteliales - Se aislaron células epiteliales nasales de NM y NP mediante digestión con proteasas como sigue. Las muestras de tejidos se aclaran 2-3 veces con F12 de Ham complementado con 100 Ui/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 2 \mug/ml de anfotericina B y seguidamente se incubaron en una proteasa al 0,1% de tipo XIV en F12 de Ham a 4ºC durante una noche. Después de incubar, se añade FBS al 10% para neutralizar la actividad de la proteasa y las células epiteliales se separan por agitación suave. Las suspensiones celulares se filtran a través de un tamiz de disociación celular de malla 60 y se centrifugan a 500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento celular se vuelve a poner en suspensión seguidamente en medio de cultivo F12 de Ham hormonalmente definido (HD de Ham) que contiene los siguientes reactivos: 100 Ui/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B, 150 \mug/ml de glutamina, 5 \mug/ml de transferina, 5 \mug/ml de insulina, 25 ng/ml de factor decrecimiento epidérmico, 15 \mug/ml de complemento de crecimiento de células endoteliales, triyodotrionina 200 pM e hidrocortisona 100 nM. Las suspensiones celulares (10^{5} células/pocillo) se disponen seguidamente en placas en pocillos revestidos con colágeno en 2 ml de HD de Ham y se cultivan en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2} a 37ºC. El medio de cultivo se cambia al cabo de un día y posteriormente en días alternados. La confluencia de células en monocapas se consigue después de 6-10 días de cultivo.
Generación de medios acondicionados epiteliales humanos (HECM) - Cuando los cultivos de células epiteliales alcanzaron la confluencia, el HD de Ham se cambió por medio RPMI 1640 (Irvin, Escocia) complementado con 100 Ui/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B, 150 \mug/ml de glutamina y tampón Hepes 25 mM (RPMI al 10%). El HECM que se genera después de 48 horas de incubación con RPMI (10%) es recogido de los cultivos, centrifugado a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT), esterilizado por filtración a través de filtros de 0,22 \mum y almacenado a -70ºC hasta su uso.
Supervivencia de eosinófilos y efecto de paclitaxel - Se aíslan eosinófilos de sangre periférica y se determina el efecto de HECM tanto de NM como de NP sobre la supervivencia de eosinófilos de dos formas diferentes: análisis en el transcurso del tiempo y de respuesta a la dosis. En los experimentos en el transcurso del tiempo, los eosinófilos a una concentración de aproximadamente 250.000/ml se incuban en seis cultivos de tejidos con o sin 50% de HECM (testigo negativo) y el índice de supervivencia se valora en los días 2, 4, 6 y 8. Otros experimentos se realizan con 1 a 50% de HECM. En los experimentos en los que se ensayó el efecto de los fármacos (por ejemplo, paclitaxel) sobre la supervivencia de eosinófilos inducida por HECM, el fármaco (paclitaxel) de 0,1 nM a 10 \muM es incubado con eosinófilos a 37ºC durante 1 hora antes de la adición de HECM. En cada experimento, se valoraron siempre pocillos testigos negativos (medios de cultivos solamente) y testigos positivos (medios de cultivo con HECM). Para investigar si los fármacos tenían algún efecto tóxico, la viabilidad de los eosinófilos incubados con el fármaco (diversas concentraciones) se compara con los eosinófilos cultivados con RPMI al 10% solo durante un período de
24 horas.
B. Efecto de paclitaxel sobre la expresión génica de citoquinas y liberación a partir de células epiteliales
Células epiteliales obtenidas de pólipos nasales y mucosa nasal normal se cultivan hasta la confluencia, y medios acondicionados con células epiteliales humanas generadas con o sin paclitaxel (u otros agentes) y materias sobrenadantes se miden mediante ELISA. La expresión génica de citoquinas se investiga por reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) como se describe por Mullol et al., Clinical and Experimental Allergy 25:607-615, 1995.
Los resultados muestran si el paclitaxel modula la expresión génica de citoquinas como un medio de inhibir la supervivencia de eosinófilos. La principal desventaja de usar cultivos de células primarias es que tarda 10 días para que las células alcancen la confluencia, disociando las funciones celulares del medio local así como los efectos sistémicos, que habrían conducido a la enfermedad en primer lugar. Sin embargo, esto es un excelente modelo in vitro/ex vivo para estudiar los factores de crecimiento que regulan la función y proliferación de células estructurales (por ejemplo, células epiteliales) y dilucidar así algunos aspectos de la inflamación de la mucosa.
C. Liberación inmunológica de mediadores químicos a partir de pólipos nasales humanos
Mediación por paclitaxel y otros agentes - Los pólipos se obtienen en el momento de la resección y se lavan 5 veces con Tampón de Tyrode fragmentado con tijeras finas en reproducciones de aproximadamente 200 mg de peso en húmedo. Las reproducciones se pusieron en suspensión en 3 ml de tampón que contenía diversas concentraciones de paclitaxel a 37ºC y fueron estimuladas (5 minutos después) con 0,2 \mug/ml de antígeno E. Después de 15 minutos de incubación con el antígeno, las materias difundidas se retiran de los tejidos hervidos en tampón de nueva aportación durante 10 minutos para extraer la histamina residual. La histamina y el SRS-A liberados se ensayan usando
HPLC.
Ejemplo 36 Administración perivascular de agentes que interrumpen la función de los microtúbulos
Se han realizado estudios para evaluar la eficacia de una pasta quirúrgica con contenido de paclitaxel-campotecina (PCL) y/o una película de EVA como un tratamiento perivascular para la restenosis.
A. Materiales y métodos
Ratas WISTAR que pesaban 250 a 300 g fueron anestesiadas mediante la inyección intramuscular de Innovar (0,33 mg/kg). Una vez sedada, fueron seguidamente colocadas bajo anestesia de Halothane. Después de que se estableció la anestesia general, la piel sobre la zona del cuello fue afeitada, la pieza fue fijada y limpiada con betadina. Se hizo una incisión vertical sobre la arteria carótida izquierda y fue expuesta la arteria carótida externa. Se colocaron dos ligaduras alrededor de la arteria carótida externa y se hizo una arteriotomía transversal. Seguidamente se introdujo un catéter-balón French Fogarty número 2 en la arteria carótida y se hizo pasar en el interior de la arteria carótida común izquierda y el balón fue inflado con solución salina. El endotelio fue denudado haciendo pasar el balón inflado hacia arriba y abajo de la arteria carótida tres veces. El catéter fue seguidamente retirado y la ligadura fue atada en la arteria carótida externa izquierda.
Las ratas se dispusieron al azar en grupos de 10 para recibir ningún tratamiento, polímero solo (película de EVA o pasta de PCL) o polímero más 20% de paclitaxel. La mezcla polímera (2,5 mg) se colocó de una manera circunferencial alrededor de la arteria carótida. La herida fue seguidamente cerrada. Se sacrificaron cinco ratas de cada grupo a los 14 y las 5 finales a los 28 días. Mientras tanto, las ratas fueron observadas en cuanto a la pérdida de peso u otras indicaciones de enfermedad sistémica. Después de 14 ó 28 días, los animales fueron anestesiados y la arteria carótica izquierda fue aislada, fijada con formaldehído tamponado al 10% y examinadas histológicamente.
Como un estudio preliminar, dos ratas fueron tratadas con una película de EVA con contenido de 10% de campotecina durante 14 días para valorar la eficacia de la campotecina en este modelo de enfermedad.
B. Resultados
Los resultados de estos estudios pusieron de manifiesto que los polímeros con contenido de paclitaxel (20%) evitaron completamente la restenosis, mientras que los animales testigos y los animales que recibieron polímero solo desarrollaron entre 28% y 55% de compromiso luminal a los 14 y 28 días después de la herida con el balón (Figuras 76A y 76B).
Hubo una inhibición absoluta de la hiperplasia íntima cuando el paclitaxel estuvo en contacto con la pared del vaso. Sin embargo, el efecto fue muy local, según se puso de manifiesto por el efecto irregular del paclitaxel cuando hubo una incapacidad para mantener el fármaco adyacente a la pared del vaso (Figuras 77A y 77B).
Los datos preliminares han mostrado que la película de EVA con contenido de campotecina era eficaz para evitar la respuesta restenoica en este modelo de animal de la enfermedad. La campotecina inhibió completamente la hiperplasia íntima en los dos animales ensayados.
Ejemplo 37 (Ejemplo de referencia)
Efectos de paclitaxel en un modelo de animal de adhesiones quirúrgicas
Se examina el uso de una película de EVA con contenido de paclitaxel para reducir la formación de adhesiones en el modelo de cuello uterino de conejo.
Se anestesiaron conejos blancos hembras de Nueva Zelanda y se realizó una laparotomía a través de una incisión de línea media. Los cuellos uterinos fueron expuestos y un segmento de 5 cm de largo de cada uno fue descarnado usando un bisturí. Esta abrasión es suficiente para retirar la serosa, dando lugar a una hemorragia punteada. Los conejos se asignan al azar a los grupos testigo o tratados con paclitaxel y a períodos de evaluación post-operatorios de dos, cuatro y ocho semanas. En el grupo tratado con paclitaxel, cada cuello uterino es completamente cubierto con una película de EVA con contenido de paclitaxel a continuación de la abrasión. La capa músculo-peritoneal se cierra con suturas y la capa cutánea con grapas para la piel.
Los animales fueron evaluados en cuanto a la formación de adhesiones dos, cuatro u ocho semanas después de la cirugía. Los animales fueron eutanizados humanamente y se realizaron necropsias. Los cuellos uterinos fueron examinados groseramente e histológicamente usando técnicas microscópicas estándar. Groseramente, las adhesiones fueron graduadas usando un sistema de puntuación estándar que está basado en el hecho de que 5 cm del cuello uterino están traumatizados; por tanto, el alcance de la formación de adhesiones se determina midiendo la longitud del área que contiene adhesiones. Se usa el siguiente sistema de gradución: 0 = sin adhesiones, 1 = adhesión en un 25% del área, 2 = adhesión en un 50% del área y 3 = adhesión total incluída. La gravedad de las adhesiones se mide como sigue. 0 = sin resistencia a la separación, 0,5 = alguna resistencia (es necesaria una fuerza moderada) y 1 = se requiere una disección nítida. El grado total es aditivo, con un intervalo de las puntuaciones de las adhesiones de 0-4 que representa tanto el alcance como la gravedad.
Ejemplo 38 ( Ejemplo de referencia)
Efecto de paclitaxel en un modelo de animal de lupus sistémico eritematoso
La eficacia del paclitaxel en el lupus sistémico eritematoso se determina tratando ratones hembras NZB/NZW F_{1} (B/W) con paclitaxel micelar. Esta cepa de ratones desarrolla una enfermedad similar al SLE humano. En un mes de edad, estos ratones tienen un nivel elevado de células B de vaso que segregan espontáneamente inmunoglobulina, en comparación con los ratones normales. Se producen niveles elevados de anticuerpo anti-ssDNA a los dos meses de edad. A los cinco meses de edad, se acumula inmunoglobulina a lo largo de las paredes capilares gromerulares. Evoluciona una glomerulonefritis grave y a los 9 meses de edad, un 50% de los ratones B/W están
muertos.
A. Materiales y métodos
Se adquieren ratones hembras B/W de la empresa The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me, EE.UU.). Ratones B/W de cinco meses de edad se asignan al azar a los grupos de tratamiento y testigo. Los grupos de tratamiento reciben un paclitaxel micelar continuo de dosis baja (2,0 mg/kg; 3 veces por semana, total de 10 inyecciones) o paclitaxel micelar por "impulsos" a dosis elevada (20 mg/kg; 4 veces, una vez a la semana). El grupo testigo recibe micelas testigos.
A intervalos de tiempo predeterminados, los ratones B/W tratados con paclitaxel y los testigos sin tratar de edad comparable son sacrificados, sus bazos se extirpan asépticamente y se preparan suspensiones celulares únicas para recuentos de linfocitos. Para identificar las subpoblaciones de linfocitos de bazo, se realiza un análisis por fluorescencia. El número de células/millones de células B de bazo que segregan espontáneamente inmunoglobulina (IgG, IgM, inmunoglobulina total) o anticuerpo anti-ssDNA se determina usando un ensayo ELISA.
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A partir de lo que antecede, se apreciará que, aunque han sido descritas realizaciones específicas de la invención en la presente memoria descriptiva para fines de ilustración, se pueden hacer diversas modificaciones sin desviarse del alcance de la invención. Consecuentemente, la invención no está limitada más que por las reivindicaciones anejas.

Claims (24)

1. Uso de un agente anti-microtúbulos para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio, en el que el medicamento está adaptado para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del agente anti-microtúbulos, de forma que sea tratada o prevenida dicha enfermedad inflamatoria del tracto respiratorio.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho agente anti-microtúbulos es un taxano.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho agente anti-microtúbulos es paclitaxel.
4. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho agente anti-microtúbulos es docetaxel.
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente anti-microtúbulos va a ser administrado por vía nasal, intranasal, sistémica, por inhalación, por vía tópica o en las cavidades de los senos.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio es asma.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el agente anti-microtúbulos va a ser administrado por inhalación, preferentemente mediante un inhalador de dosis medida, nebulizador, a través de un tubo endotraqueal o por inhalación de micropartículas.
8. Uso según la reivindicación 6, en el que el agente microtúbulos va a ser administrado por vía sistémica, preferentemente intravenosa, mediante inyección subcutánea o intramuscular o mediante una preparación oral.
9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio es una enfermedad de obstrucción pulmonar crónica.
10. Uso según la reivindicación 9 en el que el paclitaxel va a ser administrado mediante inhalación a una dosis de 1 a 50 mg/m^{2}.
11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el paclitaxel va a ser administrado por vía sistémica a una dosis de 10 a 50 mg/m^{2} cada 1 a 4 semanas.
12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el paclitaxel va a ser administrado por vía sistémica a una dosis de 50 a 250 mg/m^{2}.
13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio es una enfermedad inflamatoria pulmonar crónica.
14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente anti-microtúbulos es formulado junto con una pulverización.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que el compuesto o composición es un vehículo polímero.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que el polímero es un copolímero de ácido láctico y ácido glicólico.
17. Uso según la reivindicación 15, en el que el polímero comprende policaprolactona.
18. Uso según la reivindicación 15, en el que el polímero comprende poli(ácido láctico).
19. Uso según la reivindicación 15, en el que el polímero es un copolímero de poli(ácido láctico) y poli-caprolactona.
20. Uso según la reivindicación 15, en el que el polímero comprende poli(etileno-acetato de vinilo).
21. Uso según la reivindicación 15, en el que el polímero comprende miristato de isopropilo.
22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente anti-microtúbulos está contenido o adaptado para ser liberado en un dispositivo o implante quirúrgico o médico, preferentemente una espiral, sutura, catéter de alojamiento interno o prótesis.
23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la administración del agente anti-microtúbulos trata a previene un pólipo nasal.
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24. Uso según la reivindicación 23, en el que el agente anti-microtúbulos es formulado junto con otro compuesto o composición, preferentemente un ungüento, crema, loción, gel o pulverización.
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