PT804191E - Uso de inibidores do receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancros - Google Patents

Uso de inibidores do receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancros Download PDF

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PT804191E
PT804191E PT95907382T PT95907382T PT804191E PT 804191 E PT804191 E PT 804191E PT 95907382 T PT95907382 T PT 95907382T PT 95907382 T PT95907382 T PT 95907382T PT 804191 E PT804191 E PT 804191E
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Klaus Peter Hirth
Elaina Mann
Laura Kay Shawver
Gyorgy Keri
Istvan Szekely
Tamas Bajor
Janis Haimichael
Laszlo Orfi
Alex Levitzki
Aviv Gazit
Reiner Lammers
Fairooz F Kabbinavar
Dennis J Slamon
Cho Peng Tang
Donna Pruess Schwartz
Axel Ullrich
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Yissum Res Dev Co
Biosignal Ltd
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Description

DESCRIÇÃO “USO DE INIBIDORES DO RECEPTOR DO FACTOR MITOGÉNICO DE PLAQUETAS NO FABRICO DE UM MEDICAMENTO PARA O TRATAMENTO DE CANCRO” A presente invenção diz respeito a composições farmacêuticos para administração parenteral contendo (4-trifluorometil)-anilida do ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico (AIO) ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável e uso das ditas substâncias para administração parenteral no tratamento de tumores sólidos caracterizados por uma inadequada actividade do receptor do factor mitogénio derivado das plaquetas ( PDGF-R). O receptor do factor de mitogénio derivado das plaquetas (PDGF-R) é um receptor transmembranar da tirosina quinase. A ligação do ligando ao receptor resulta na dimerização de dois receptores que lideram geralmente a fosforilação intermolecular de cada receptor, vulgarmente referida como a autofosforilação ou a transfosforilação, e na activação do complexo receptor. O PDGF sendo um ligante para o PDGF-R, é uma proteína dimérica com duas cadeias polipeptídicas ligadas por pontes de dissulfureto. Cada polipéptido é ou um polipeptido de cadeia A ou um polipéptido de cadeia B. Assim, o PDGF tanto pode ter ou duas cadeias A ou duas B ou uma cadeira A e uma cadeira B. O PDGF-R consiste em duas isozimas α e β. Ambos os receptores contendo α e β têm sido associados com actividade mitogénica, enquanto só o receptor contendo β tem sido associado com a quimiotaxia e a reorganização da actina (Heldin, C-H, EMBO Journal 11:4251-4259, 1992).
De acordo com Plate e col., Laboraíory Investigation 4:529-534,1992: PDGF é um potente factor de crescimento para as células do mesênquima e da neuroectoderme. As células endoteliais têm sido consideradas não reactivas com o PDGF, mas um estudo recente mostrou que o PDGF pode ter um papel importante na angiogénese durante o desenvolvimento da placenta. Além disso, foi demonstrado que o PDGFR-b é expresso nas células endoteliais nos tecidos inflamatórios e tumores gliais . Isto sugere que o PDGF pode desempenhar um papel significativo nas funções vasculares sob condições patológicas. (Citações omitidas).
Heldin, acima citado, descreve a relação entre PDGF e o seu receptor, e discute o papel do PDGF no cancro, notando que alguns cancros não produzem PDGF e têm necroses centrais . Heldin afirma:
Os efeitos adversos do PDGF em certas doenças, como se discutiu acima, tornam os antagonistas do PDGF altamente desejáveis. Nós e outros fizemos recentemente várias abordagens para desenvolver tais antagonistas. Os anticorpos contra PDGF demonstraram ser úteis não só na inibição da estimulação da autocrina em células SSV transformadas mas também no processo ateroesclerótico que ocorre após desendotelialização das artérias carótidas dos ratos. Além disso, a forma solúvel do receptor PDGF tem-se mostrado capaz de ligar e inactivar PDGF e podia assim ser potencialmente útil para inibir a acção do PDGF in vivo.
Outra abordagem seria conceber ou descobrir agentes que competissem como antagonistas do PDGF na ligação ao receptor. De maneira a identificar péptidos que interferem com a ligação do PDGF, temos sistematicamente feito de péptidos derivados da sequência com a cadeia B. Foi encontrado um peptido que inibia a ligação de PDGF e a autofosforilação dos receptores tanto α como β. Contudo o péptido mostrou certa toxicidade celular, vão ser necessários trabalhos de desenvolvimento mais aprofundados antes que estes péptidos antagonistas se tomem úteis para estudos in vivo. Foram descritos compostos de baixo peso molecular que interferem com a ligação ao receptor,por exemplo a suramina. Contudo a suramina não é suficientemente específica para ser clinicamente útil como antagonista do PDGF. Recentemente, descobrimos que um outro composto de baixo peso molecular, a neomicina, em altas concentrações inibe a ligação do PDGF-BB ao receptor a, mas que não inibe a ligação ao receptor β. Este composto representa assim um antagonista que distingue os dois tipos de receptores; contudo, a sua baixa potência torna-o inadequado para uso in vivo. Espera-se que os estudos feitos com a suramina e a neomicina ajudarão na futura concepção de antagonistas do receptor PDGF mais potentes e específicos. A concepção de tais antagonistas será muito facilitada pela esclarecimento da estrutura tridimensional do complexo receptor-PDGF. A actividade com antagonista do PDGF poderá também ser conseguida pela inibição da dimerização do receptor PDGF. Admitimos por hipótese que o PDGF monomérico possa falhar na indução da dimerização do receptor e possa assim ter actividade antagonística. Uma vez que a redução do PDGF resulta em perda de ligação do receptor, nós tentamos identificar as ligações de dissulfureto entre as cadeias a fim de modificar estes radicais e assim evitar a dimerizaçãodo ligando. Isto tornou-se difícil devido à alta densidade de radicais de cisteína no PDGF. A abordagem que finalmente teve sucesso envolveu a redução parcial da molécula de PDGF usando uma concentração de ditiotreitol que apenas reduziu as ligações dissulfureto entre as cadeias e deixou intactas as ligações dentro das cadeias. Por este processo, o segundo e o quarto radicais de cisteína do terminal-N verificamos a formar as duas ligações entre cadeias do PDGF. A análise dum mutante da cadeia B do PDGF em que estes dois radicais cisteína foram transformados em radicais serina revelou que se reteve a actividade de ligação do receptor. Será ele um antagonista do receptor? A resposta é não; de facto, o PDGF monomérico induziu tanto a dimerização do receptor como a autofosforilação. Este resultado pode indicar que a dimerização do receptor induzida pelo PDGF não é só uma maneira de formar uma ponte entre duas moléculas receptoras: a dimerização pode também envolver uma mudança conformacional induzida pelo ligando dos domínios extracelulares dos receptores que promove as interacções entre receptores. Uma maneira possível de atingir um efeito antagonista, que nós estamos presentemente a explorar, é combinar uma cadeia nativa do PDGF com uma cadeia modificada que não se ligue a receptores PDGF mas pode activamente evitar dimerização dos receptores, (Citações omitidas). y
ÍVr · '» •i PCT/US92/03736 de Spada A. P., e coi, com o titulo “Bis Mono- and Bicyclic Aryl and Heteroaryl Compouds Which Inhibit EGF and/or PDGF Receptor Tyrosine Kinase“. menciona o uso de certos compostos bis mono e bicíclicos arílicos.
Segundo Spada:
De acordo com a presente invenção proporciona-se um método de inibição da proliferação anormal de células num doentes sofrendo de uma doença caracterizada por este tipo de proliferação, compreendendo a administração de EGF e/ou receptor de PDGF numa quantidade efícazmente inibidora de um composto bis arílico e mono- e/ou bicíclico e/ou heteroarílico apresentando actividade inibidora da proteína tirosina quinase em que cada grupo de arilo e/ou heteroarilo é um sistema de anel contendo 0-4 heteroátomos, sendo o dito composto opcionalmente substituído ou polissubstituido. A presente invenção refere-se (4 trifluorometil)-anilida do ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico (AIO) e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis, os quais podem inibir a actividade do receptor do factor de mitogénio derivado das plaquetas (PDGF-R), de preferência, podendo estes compostos inibir a actividade doutros membros da superfamília PDFG-R como também ser selectivos para os membros da super família PDGF-R. A superfamília PDGF-R inclui o PDGF-R e o PDGF-R aparentado às quinases Flt, e KDR. Os compostos em destaque são activos em culturas de células para reduzir a actividade do PDGF-R e de preferência um ou mais dos PDGF-R aparentados às quinases. O composto AIO em destaque (ver fig. la) e a sua capacidade para inibir o crescimento de células tumorais in vivo é descrito abaixo. Seguindo o presente pedido de patente como guia podem ser obtidos outros compostos capazes de inibir PDGF-R e preferencialmente Flt e/ou KDR. Tais compostos são preferivelmente usados para tratar doentes sofrendo de tumores sólidos caracterizados por inadequada actividade do PDGF-R. A proliferação de células indesejadas pode resultar da actividade inadequada do PDGF-R ocorrendo em diferentes tipos de células, incluindo células cancerosas ou células que
f envolvem uma célula cancerosa células (estromais), células endoteliais e do músculo liso. Por exemplo, um aumento da actividade do PDGF-R de células endoteliais adjacentes às células cancerosas pode levar a um aumento da vascularização do tumor, e desse modo facilitar o crescimento das células cancerosas. Assim, uma actividade inadequada do PDGF-R pode contribuir para um descontrole na proliferação de células de modos diferentes, tais como através do aumento da produção de factores mitogénicas, causando o crescimento aberrante de uma célula e aumentando a formação e disseminação de vasos sanguíneos nos tumores sólidos sustentando desta maneira o crescimento tumoral.
Outros membros da superfamília PDGF-R também envolvidos como suporte do crescimento tumoral. Os membros da superfamília PDGF-R possuem um domínio da quinase contendo no mínimo 45% de similaridade sequencial com o domínio da quinase do α ou β PDGF-R. O factor mitogénico do endotélio vascular (VEGF) activa pelo menos os receptores da tirosina quinase, Flk-1 ou os seus homólogos humanos KDR e Flt-1. Ambos estes receptores são expressos nas células endoteliais e parecem ser importantes na angiogénese, Plate e col., Nature 359:845-848, 1992; Shweiki e col. Nature 359:843-845, 1992; Millauer e col., Cell 72:835-846, 1993; Plate e col.. Câncer Res., 53:5822-5827, 1993; Waltenberger e col., Journal of Biological Chemistry 43:26988-26995, 1994. A vascularização é essencial para o crescimento de tumores sólidos e pensa-se que seja regulada por factores das células tumorais que têm efeitos quimiotácticos e/ou mitogénicos nas células endoteliais. PDGF-R, KDR e Flt-1, estão todos envolvidos na formação dos vasos sanguíneos e na disseminação ou alimento de tumores sólidos. Eliminando actividades quer do PDGF-R quer de um ou mais aparentados com a tirosina quinase, tanto o crescimento celular aberrante como o alimento de tal crscimento pode ser inibido.
Os usos e as formulações são desenhados para inibir a proliferação indesejada de células alterando a actividade do PDGF-R, e preferencialmente alterando também a actividade de Flt e/ou KDR. Sem estar ligado a qualquer teoria, a inibição da proliferação indesejada de células pode ser conseguida pela alteração da actividade de PDGF-R (por exemplo, pela inibição da fosforilação da tirosina do PDGF-R, pela inibição do Jé·
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substrato ou da ligação da proteína adaptadora ao receptor, ou pela inibição de outros assinaláveis consequentes), ou seja inibindo a actividade do PDGF-R. Contudo, salvo afirmação em contrário, os usos e formulações reivindicados não são limitados por esta teoria particular.
Portanto, a presente invenção diz respeito às formas de realização definidas nas reivindicações. De acordo com isso a presente invenção diz respeito ao uso de (4-triflurometilj-anilida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxíiico ou o seu sal farmaceuticamente aceitável na preparação de medicamentos de administração parenteral para tratamento de tumores sólidos caracterizados pela actividade inadequada do PDGF-R. Numa forma de realização preferida, o uso é para o tratamento de cancro intra-axial do cérebro Numa outra forma de realização, o uso é para o tratamento do cancro do ovário. Noutra, o uso é para o tratamento do cancro do cólon. Noutra, o uso é para o tratamento do cancro da próstata. Noutra, o dito uso é para o tratamento do cancro do pulmão. Noutra forma de realização ainda o uso é para o tratamento do glioma. Além disso, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para admnistração parenteral contendo 4-trifluorometil)-anilida de ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico ou o seu sal farmaceuticamente aceitável e um veículo fisiologicamente aceitável compreendendo uma solução de 3% em p/v de álcool benzílico, 8% em p/v de polissorbato 80 e 65% em p/v de polietilenoglicol (PM= 300) em etanol absoluto, diluído a 1:1 numa solução aquosa a 5% de dextrose. As formas de realização da invenção envolvem a etapa de administração ao doente de uma quantidade terapeuticamente eficaz por meio de uma formulação contendo qualquer dos referidos compostos ou do princípio activo formado quando colocado sob condições fisiológicas (por exemplo, numa pró-droga estruturalmente activa como descrita acima). A administração dum determinado composto é conseguida fornecendo esse composto ao doente ou então fornecendo-lhe a pró-droga desse composto que forma o composto particular in vivo. “Doenças proliferativas celulares" refere-se a doenças em que ocorrem proliferações não desejadas de uma ou mais sub populações de células em organismos multicelulares com um resultado nefasto (por exemplo, desconforto ou diminuição da esperança de
vida) para esse mesmo organismo. A doença proliferativa das células pode ocorrer em animais ou pessoas. Esta doença inclui cancro, doença proliferativa dos vasos sanguíneos, e perturbações fibróticas. A “actividade inadequada do PDGF-R" refere-se a:
1) expressão de PDGF-R em células que normalmente não expressam PDGF-R
2) expressão de PDGF por células que normalmente não expressam PDGF 3) aumento da expressão de PDGF-R levando à indesejável proliferação celular 4) aumento de expressão de PDGF levando à indesejável proliferação celular ou 5) mutações que conduzem à activação constitutiva de PDGF-R. A existência de níveis ou actividades inadequados ou anormais de PDGF-R ou de PDGF são bem conhecidos nesta área.
As composições podem ser usadas para tratar as doenças da proliferação celular administrando uma dose terapeuticamente eficaz ao doente (por exemplo pode ser uma pessoa ou um animal que tem uma doença proliferativa celular). Os compostos podem também ser usados em estudos in vitro para conhecer o mecanismo de acção dos próprios PDGF-R ou do PDGF.
No caso do tratamento do cancro a “dose terapeuticamente eficaz“ será a dose suficiente para se obter um ou mais dos seguintes resultados: reduzir o tamanho do cancro, inibir as metástases do cancro, inibir o crescimento do cancro, parar o crescimento do cancro, aliviar o desconforto devido ao cancro ou prolongar a vida do doente infligida pelo cancro.
No caso do tratamento da doença da proliferação celular a “dose terapeuticamente eficaz“ tal como no cancro será a dose suficiente para se conseguir uma ou mais destes resultados: diminuir o crescimento das células que causam a doença, aliviar o desconforto devido a esta situação ou prolongar a vida do doente com esta enfermidade.
A inibição “significativa^ da actividade do receptor da tirosina quinase refere-se a uma CI50 menor ou igual a 75 μΜ usando um ou mais ensaios descritos nos exemplos infra. De preferência 0 composto pode inibir a actividade do PDGF-R com uma CI50 menor ou igual a 50 μΜ, mas é preferível que seja menor ou igual a 10 μΜ ou melhor ainda se for menor ou igual a 1 μΜ. Os valores mais baixos de CI50 são preferidos porque a CI50 fornece uma indicação sobre a eficácia in vivo do composto. Os outros factores conhecidos nesta técnica tais como 0 tempo de semivida do composto, biodistribuição e toxicidade devem ser também considerados para 0 uso terapêutico. Tais factores podem permitir a um composto ter uma maior eficácia in vivo com uma CI50 mais baixa do que um composto com uma CI50 mais alta. A inibição selectiva da superfamilia de PDGF-R é conseguida por uma inibição significativa da actividade do PDGF-R, embora tendo um efeito mínimo no EGF-R (por exemplo uma CI50 para a fosforilação da tirosina maior do que 100 μΜ sobre EGF-R). De qualquer maneira, pelo menos um ou outro membro da superfamilia do PDGF-R é significativamente inibido. O composto referido na forma de realização da invenção é 0 A. 10 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. O composto é de preferência usado em formulações farmacêuticas formadas pela mistura de um ou mais compostos acima referidos com um veículo fisiológicamente aceitável.
Um veículo fisiologicamente aceitável é uma formulação á qual 0 componente pode ser adicionado para se dissolver ou por outro lado facilitar a administração do composto. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem água, solução salina, soro fisiológico tamponado, ciclodextrinas e PBTE:D5W. Compostos hidrofóbicos tais como A10 são de preferência administrados usando um veículo como PBTE-D5W. Um factor importante na escolha de um veículo apropriado é escolher um veículo no qual 0 composto permaneça activo ou a combinação do veículo com 0 veículo produz um composto activo. O composto pode também ser administrado duma forma continua
usando uma formulação de libertação lenta ou uma bomba para manter um doente um nível do fármaco constante ou variável.
Um outro aspecto da presente invenção é o tratamento de um doente terapêutica combinada que sofre de cancro resultante de uma inadequada actividade do PDGF-R A usando terapia de combinação. A terapia de combinação efectua-se usando um ou niais agentes descritos na presente memória com agentes anticancro convencionais. O método usado consiste na administração ao doente com cancro duma composição que contenha um agente inibidor da actividade do PDGF-R numa dose terapêuticamente eficaz e um agente citotóxico. O agente citotóxico preferido é VP-16 ou cisplatina. iVlais preferivelmente, agente citotóxicoé a cisplatina e o cancro é cancro do pulmão.
Um outro aspecto desta invenção refere-se ao tratamento de um doente com doença proliferativa celular caracterizado por a inadequada actividade do PDGF-R usando PDGF-R modificado ou ácido nucleico codificando PDGF-R modificado. PDGF-R “modificado" refere-se a um PDGF-R no qual um ou mais aminoácidos estão alterados ou omitidos. Tal como ilustrado abaixo, um ácido nucleico que codifica um PDGF-R modificado (isto é, incompleto) em que a falta dum domínio da quinase, pode inibir o crescimento dum tumor in vivo . O PDGF-R modificado pode ser administrado como uma proteína, ou como ácido nucleico recombinante que codifica a proteína e expressa esta proteína dentro duma célula.
Num outro aspecto, a invenção salienta novas composições incluindo um dos compostos aqui mencionados e como veículo PBTE:D5W no qual o composto em questão é solúvel.
Outras características e vantagem desta invenção serão óbvias a partir da descrição que se segue das suas formas de realização preferidas e das reivindicações. A Figura 1 mostra a fórmula estrutural de AIO e do seu metabólito BI 1 .
A Figura 2 trataram-se células NIH3T3, que sobre expressam o receptor humano PDGF-b (A) ou o receptor humano EGF (B) com AIO conforme indicado. A
. 10- £ - ιν percentagem de células na fase S do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. A Figura 3. Em duas experiências separadas, células C6 (lxlO3 células em 4 μ!) foram implantados em cérebros de ratinhos BALB/c, nu/nu AIO foi administrado IP em 100 μΐ de PBTE:D5W nas doses indicadas todos os dias, começando um dia após o implante. V= controlo do veículo, n=número de animais por grupo, 8 a 12 (Exp. N° 1), ou 5 (Exp. N° 2 ). * P< 0,00001 ;** p < 0,002; *** P < 0,02 comparado com o veículo controle. A Figura 4. Em duas experiências separadas, implantaram-se células C6 (5x 104células em 20 μΐ [Exp. N° 1] ou 5μ1 [Exp. N° 2]) no cérebro de ratos atímicos. Foi administrado IP em 500 μΐ de PBTE nas doses indicadas todos os dias começando no dia a seguir à implantação. V= controlo do veículo, n=7 a 8 de animais por grupo, * P = 0,0002 ; ** P = 0,0003 comparado com o controlo do veículo.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção destaca as utilizações e composições para o tratamento das perturbações da proliferação celular caracterizadas pela actividade inadequada de PDGF-R. O presente pedido demonstra a capacidade de compostos inibir de forma significativa a actividade de Flt-1 e/ou PDGF-R, e fornece exemplos de tais compostos úteis no tratamento de doenças proliferativas, como o cancro. Os compostos aqui descritos podem-se usar no tratamento de outras perturbações proliferativas associadas com expressão inadequada de PDGF-R, por exemplo, doenças proliferativas dos vasos sanguíneos, e doenças fibróticas caracterizadas por actividade inadequada do PDGF-R. Usando a presente divulgação como guia, os especialistas no assunto podem definir quais os compostos aqui descritos que são uteis para tratar uma determinada doença proliferativa.
Um sitio alvo único, a presença de actividade de PDGF-R1 inadequada para um grande número de doenças, fora dos muitos alvos propostos na técnica junto com compostos
capazes de inibir a actividade do PDGF-R e de preferência Flt e/ou actividade de KDR, são descritos pelo presente pedido de patente. A actividade do PDGF-R juntamente com as actividades do KDR e/ou Flt são inibidas de preferência por um único composto, tal como AIO. Combinações de compostos ou tipos de tratamentos podem também ser usados para atingir diferentes PDGF-R relacionados com a tirosina quinase. Exemplos de tais combinações incluem o uso de compostos inibidores da actividade de PDGF-R juntamente com um composto inibidor de KDR, e o uso do ácido nucleico PDGF-R para inibir a produção de PDGF-R juntamente com um composto inibidor de KDR. A capacidade de AIO, mostrada na figura 1, versões truncadas de PDGF-R e outros compostos, em inibir o crescimento de tumores em animais ilustra a eficiência e a eficácia destes compostos. Tais estudos em animais apoiam a eficiência dos compostos demonstrando que estes podem ser eficazes em animais apesar de vários problemas que estão inerentemente associados com o uso de compostos em animais no tratamento de uma doença particular. Os problemas inerentes incluem o animal possuindo uma população de células heterogénea, várias considerações farmacológicas tais como biodisponibilidade do composto, o seu tempo de semivida e a folga do composto. Estes problemas inerentes evitam com frequência que o composto exerça um efeito fisiológico.
Abaixo são fornecidos exemplos que ilustram a capacidade do composto designado por AIO (ver Fig. 1) em inibir cancros in vivo. Usando a presente revelação como guia, um especialista na matéria pode recorrer aos usos e formulações destacados para obter compostos inibidores adicionais e atingir outras perturbações proliferativas de células caracterizadas por uma actividade inadequada do PDGF-R .
I. Superfamília PDGF-R A. Actividade do PDGF-R A união do ligando ao PDGF-R provoca a formação de dímeros receptores e alterações alostéricas que activam os domínios da quinase intracelular e resulta numa 12 transfosforilação e/ou autofosforilação do receptor nos radicais de tirosina. O receptor de fosforilação do receptor estimula, uma associação física do receptor activado com as moléculas alvo. Algumas das moléculas alvo são por seu turno fosforiladas, o que transmite o sinal para o citoplasma. Outras moléculas alvo não são fosforiladas, mas auxiliam na transmissão do sinal actuando como moléculas adaptadoras para proteínas transdutoras de sinal secundário. As moléculas transdutoras de sinal secundário geradas por receptores activados tem como resultados uma cascata de sinais que regulam as funções celulares tais como a divisão celular. (Ver Fry M.J. e col., Protein Science 2:1785-1797. 1993).
Assim, um aumento da actividade de PDGF-R caracteriza-se por um aumento em uma ou mais actividades que podem ocorrer após a união do ligando ao PDGF-R: (1) fosforilação ou autofosforilação do PDGF-R, (2) fosforilação de um substrato do PDGF-R (por exemplo, PL 3-quinase, RasGAP, PLCg, ver Fry acima), (3) activação de uma molécula adaptadora e (4) divisão celular aumentada. Estas actividades podem ser medidas utilizando técnicas descritas abaixo e conhecidas na técnica. Por exemplo, a autofosforilação de PDGF-R pode ser medida como está descrito nos exemplos abaixo, usando um anticorpo antifosfotirosina, e pode ser avaliada, tal como descrito a seguir, medindo a incorporação de JPI-timidina no DNA. Preferencialmente, o aumento da actividade de PDGF-R está associado com um aumento da quantidade de PDGF-R fosforilado e a síntese de DNA.
B. Quinases Relacionadas com PDGF-R
As quinases Flt-1 e KDR relacionadas com PDGF-R, podem ser activadas por VEGF. VEGF é uma glicoproteína monodimérica com estrutura homóloga à do PDGF. Isolaram-se quatro diferentes variedades de união de VEGF. Rosenthal e col., Growth Factors, 4:53-59, 1990; Conn, e col., Proc. Natl. Acod. Sei. (USA), 87:1323-1327, 1990; Houck e col., Mol.
Endocrínol., 5:1806-1814, 1991; duas são formas segregadas e duas mantêm-se associadas à célula. VEGF verificou-se ser regulada para cima pela hipóxia e actuar especificamente sobre as células endoteliais. Plate e col., Nature, 359:845-848, 1992; Shweike, e col., Nature, 359:843 - 845, 1992. A actividade da KDR é caracterizada pelo aumento de uma ou mais actividades que podem ocorrer ao mesmo tempo que a ligação de VEGF: (1) fosforilação ou autofosforilação de KDR, (2) fosforilação do substrato de KDR, (3) activação da molécula adaptadora, e (4) aumento da divisão celular. A actividade de Flt-1 é caracterizada pelo aumento de uma ou mais actividades que podem ocorrer ao mesmo tempo que a ligação de VEGF: (1) fosforilação ou autofosforilação de Flt-1, (2) fosforilação do substrato de Flt-1, (3) activação de uma molécula adaptadora, e (4) aumento da divisão celular.
II. COMPOSTOS CARACTERIZADOS A. A1Q e Respectivos Sais Farmacêuticamente Aceitáveis
As utilizações e composições da presente invenção estão relacionados com AIO ou a um seu sal farmaceuticamente aceitáveis. III. Perturbações da Proliferação Celular
As composições e métodos descritos são concebidos para inibir as doenças ligadas à proliferação celular pela inibição da actividade do PDGF-R. Como foi discutido acima, as doenças proliferativas resultam duma proliferação indejejada da célula de um ou mais subconjuntos de células em organismos multicelulares com consequências nefastas para o organismo. A actividade inadequada do PDGF pode estimular o descontrolo da proliferação celular. As duas possibilidades, que podem estimular uma proliferação celular indesejado de um determinado tipo de célula,e que são devidas ao inadequado PDGF ou à actividade do PDGF-R, resultam na estimulação directa do crescimento duma determinada célula ou pelo aumento da vascularização duma determinada área, tal como o tecido tumoral, facilitando deste modo o crescimento do tecido. O uso da presente invenção será facilitado se de identificar em primeiro lugar a alteração da proliferação celular como sendo exercida pelo PDGF-R. Uma vez feita essa identificação, os doentes que sofrem deste tipo de perturbações podem ser identificados 14 pela análise dos seus sintomas, por procedimentos bem conhecidos pelos médicos. Estes doentes podem ser então tratados como descrito na presente memória. A determinação se a perturbação de proliferação de células é ou não provocada por PDGF-R pode ser realizada determinando em primeiro lugar, o nível de actividade de PDGF-R. que ocorre na célula ou numa localização particular do organismo. Por exemplo, no caso de células cancerosas, compara-se o nível de uma ou mais actividades de PDGF-R das células com cancro não causado pela actividade do PDGF-R (ou seja, com células A 431 como abaixo se descreve) com os das que tenham cancro devido à actividade de PDGF-R (ou seja, com células do glioblastoma T98G como abaixo se descrevem). Se as células tiverem um nível de actividade do PDGF-R mais alto do que as que têm cancro não pelo PDGF-R, de preferência igual ou maior do que as que têm cancro derivado pelo PDGF-R, então elas são candidatas a serem tratadas com os inibidores do PDGF-R. No caso de perturbações proliferativas de células provenientes devido a uma indesejável proliferação de células não cancerosas, o nível da actividade de PDGF-R é comparado com o que se encontra na população geral (isto é, o nível geral médio encontrado nas pessoas ou animais excluindo os que sofrem de uma doença proliferação celular). Se a perturbação de proliferação de células indesejadas for caracterizado por um nível mais alto de PDGF-R do que os da população geral então essa perturbação candidato a ser tratado usando os inibidores de PDGF-R descritos.
As doenças proliferativas das células incluem cancros, perturbações proliferativas de vasos sanguíneos e perturbações fibróticas. Estas perturbações não são necessariamente independentes. Por exemplo, perturbações fibróticas podem ser relacionadas ou sobrepor-se a perturbações dos vasos sanguíneos. Por exemplo a arteiosclerose (a qual é aqui caracterizada como distúrbio dos vasos sanguíneos) é consequência duma formação anormal do tecido fibroso).
Uma célula cancerosa refere-se a vários tipos de neoplasmas malignos, a maior parte dos quais invadem os tecidos circundantes, e podem-se metastizar para diferentes sítios, como definido por Stedman’s Medicai Dictionary 25a Edição (Plensyl ed. 1990). Exemplos de cancros que podem ser tratados pela presente invenção incluem os cancros ( cerebrais intra-axiais, cancros do ovário, cancro do cólon, cancros da próstata, cancros do pulmão, sarcoma de Kaposi e cancros de pele, os quais têm uma inadequada actividade do PDGF-R. Estes tipos de cancro podem ser mais tarde caracterizados. Por exemplo os cancros cerebrais intra-axiais incluem glioblastoma multiforme, astrocitoma anaplástico, astrocitoma, ependimoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, meningioma, sarcoma, hemangioblastoma e pinealoma. A formação e disseminação dos vasos sanguíneos, a vasculogénese e a angiogénese respectivamente, têm um papel importante na variedade dos processos fisiológicos tais como o desenvolvimento embrionário, a cura de feridas e a regeneração dos órgãos. Eles também têm importância no desenvolvimento dos cancros. As doenças dos vasos sanguíneos estão relacionadas com as doenças angiogénicas e vasculinogénicas geralmente resultantes da proliferação anormal dos vasos sanguíneos. Exemplos de tais doenças incluem a restenose, retinopatias e arterioesclerose.
As lesões avançadas de arterioesclerose resultam duma excessiva resposta inflamatória à agressão exercida pela parede da artéria sobre o músculo liso e endotélio. (Ross R., Nature 362:801-809). Parte da resposta parece ser mediada pela secreção do PDGF-BB e activação do PDGF-R nas células do endotélio e músculo liso. Tanto a migração como a proliferação celular têm um papel importante na formação de lesões escleróticas.
As doenças fibróticas relacionam-se com a formação anormal da matriz extracelular. Exemplos de doenças fibróticas são a cirrose hepática e a doença da proliferação celular mesanguial. A cirrose hepática é caracterizada pelo aumento dos constituintes da matriz extracelular resultando daí a formação de uma lesão hepática. A cirrose hepática pode causar doenças tais como a cirrose do fígado. O aumento da matriz extracelular numa lesão hepática pode também ser causada por uma infecção virai tal como a da hepatite. Os lipócitos parecem ter também um papel importante na cirrose hepática, podendo a sua proliferação ser estimulada pela activação inadequada do PDGF-R.
As doenças da proliferação das células mesanguiais correspondem a uma anormal proliferação destas células. Estes distúrbios levam ao aparecimento de doenças renais tais como a glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefroesclerose maligna, síndroma da microangiopatia trombótica, rejeição dos transplantes e glomerulopatias. O PDGF tem sido implicado na manutenção da proliferação das células mesanguiais. (Floege, J e col., Kidney International 43 S:47-54 1993).
Conforme foi dito acima, outras doenças podem ser identificadas por técnicas padrão e pela determinação da eficácia de acção dos compostos aqui descritos. A_.
Cancro do ovário
Um aspecto desta invenção relaciona-se com o tratamento do cancro do ovário. O cancro do epitélio do ovário corresponde aproximadamente a 90% de todos os tumores do ovário e continua a ser de uma malignidade altamente letal. Aproximadamente 19 000 novos casos de cancro do ovário são diagnosticados anualmente nos Estados Unidos, e 12 000 destas mulheres morrem de cancro (Rodriguez e col., em DeVita, Hellman, Rosenberg (eds ) Biologic Therapy of Câncer, JB Lippincott, 1991). O tratamento do cancro avançado do ovário inclui geralmente cirurgia citorredutiva seguida de combinação de quimioterapia com agentes alquilantes tais como a cisplatina e ciclofosfamida. Contudo, a sobrevivência a longo prazo de doentes com cancro avançado do ovário é extremamente baixa, no intervalo de 10% - 20%, principalmente por causa da elevada incidência de tumores metastáticos através da cavidade peritoneal, e, em alguns casos, dos nódulos da linfa. Além disso, a quimioterapia com cisplatina é portadora potencial de toxicidade renal e neuropatia progressiva. A presente invenção revela uma relação patológica entre a expressão do receptor PDGF e o cancro do epitélio do ovário e proporciona composições e métodos de inibição da actividade inadequada de PDGF-R nas células epiteliais cancerígenas do ovário inibindo a proliferação da doença.
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Os métodos para tratar o cancro do ovário compreendem a administração de uma composição que iniba a actividade inadequada de PDGF-R nas células cancerosas do ovário, suportando as células do estroma (por exemplo, a estrutura na qual um tumor ou uma lesão metastática cresce, incluindo mas não estando limitado ao tecido envolvente e às células endoteliais vasculares) e/ou em associação às células endoteliais vasculares.
Os cancros do ovário susceptíveis de serem tratados com os compostos aqui descritos incluem carcinoma epitelial do ovário, metástases do tumor do ovário, e outras células do ovário que receptores do PDGF expressamos. Como descrito abaixo as composições que inibem a actividade do PDGF-R inibem também a proliferação de células cancerosas do ovário in vitro e inibem o crescimento de tumores do ovário in vivo. Mais especificamente, o uso das composições da invenção resulta numa inibição quase completa do crescimento do tumor do ovário em ratinhos xenoenxertados com células cancerosas do ovário humano, sem citotoxicidade significativa ou mortalidade, proporcionando portanto um excelente efeito terapêutico.
Consequentemente, como exemplo das formas de realização da invenção, é administrado AIO a uma doente diagnosticada com cancro do ovário, através de qualquer via de administração e em qualquer forma de veículo conveniente, daí resultando que o AIO se põe em contacto com as células cancerosas do ovário positivas ao receptor PDGF e/ou com as células em volta do estroma. Em face de codifusão do cancro do ovário se localizar por toda a cavidade peritoneal, um método de administração preferido, particularmente em casos avançados, é por injecção intravenosa ou intraperitoneal de uma formulação farmacêutica de AIO não tóxica. A preparação e o uso de formulações terapeuticamente eficazes para tratamento do cancro ovárico são descritas em detalhe nas secções que se seguem e por meio dos exemplos, infra. Adicionalmente às composições especificamente divulgadas aqui, o invento proporciona a identificação de outras composições as quais, devido ao seu efeito inibidor da actividade do PDGF-R podem ser úteis na inibição da proliferação de neoplasmas do ovário. As composições candidatas podem ser identificadas pela sua capacidade em inibir a autofosforilação do receptor do PDGF utilizando qualquer teste .18 1 "Λ adequado, tal como o da inibição da autofosforilação in vitro ELISA e teste de inibição da tirosina quinase. As formulações candidatas podem ser avaliadas na sua eficácia terapêutica testando a sua capacidade de inibição do crescimento de células cancerosas do ovário e, idealmente testando a inibição de tumores xenoenxertados in vivo. Os procedimentos descritos nos exemplos, infra, ou procedimentos similares, podem ser utilizados para a condução de tais testes. B . Glioma
Um outro aspecto da invenção diz respeito ao tratamento de tumores cerebrais primários intra-axiais da família do glioma, incluindo, mas não se limitando a astrocitomas e glioblastomas. O glioblastoma multiforme é o mais comum e mais maligno tumor de origem astrocítica em seres humanos adultos e é responsável por mais de metade de todos os tumores primários cerebrais (ver, por exemplo, Cecil Textbook of Medicine, Wyngaarden, Smith, Bennet, (eds) WB Saunders, 1992, p. 2220).
Os gliomas têm a propriedade comum de estarem envolvidos directamente na invasão do tecido cerebral, são fundamentalmente malignos e são inevitavelmente fatais. Os doentes com glioblastoma têm um tempo de sobrevivência média de menos de um ano mesmo quando tratados agressivamente em combinações da cirurgia com a quimioterapia e a radioterapia. Infelizmente a intervenção cirúrgica com sucesso é extremamente rara face à dificuldade ou impossibilidade de definir os limites microscópicos de um glioma dentro do tecido cerebral normal. Do mesmo modo, a quimioterapia com agentes alquilantes satisfez com muito pouco sucesso, e só 10% de doentes com glioma responderam significativamente. A terapêutica com radiação demonstrou algum valor no controlo do crescimento de gliomas, mas resulta com frequência em dano neurológico substancial. A terapêutica com interferon-β em combinação com radioterapia e quimioterapia, satisfez com algum sucesso (DeVita, Hellman, Rosemberg (eds) Biologic Therapy of Câncer, JB Lippincott, 1991). A invenção revela uma relação patológica entre a expressão do receptor PDGF e o glioma e fornece formulações e métodos para inibição da actividade de PDGF em células de glioma para inibir a propagação da doença. Os métodos para o tratamento de 19 ί gliomas compreendem a administração de formulações que inibem a actividade de PDGF-R expressa nas células de glioma e/ou nas células endoteliais vasculares próximas. Em particular, muitas das formulações especificamente aqui reveladas são altamente activas na autofosforilação dos receptores de PDGF em células de glioma humano in vitro. Várias destas composições inibem o crescimento das células de glioma, e uma destas, o AIO, inibe também o crescimento de várias culturas de células extraídas do glioma. Além disso, o AIO suprime fortemente o crescimento de gliomas xenoenxertados no ratinho; em alguns animais, foi inibido o crescimento tumoral em mais de 95% face aos controles não tratados.
Consequentemente, como exemplo das formas de realização da invenção AIO é administrado a doentes com glioma através de qualquer via de administração e em qualquer veículo adequado o que resultará pôr o AIO em contacto não só com as células de glioma positivas aos receptores PDGF mas também com as células endoteliais vasculares próximas. As vias de administração preferidas podem ser a intravenosa e a intrarterial. Além disso pode ser particularmente eficaz a tecnologia recentemente desenvolvida do micro-catéter na disponibilização de formulações do invento directamente no local do glioma, conseguindo assim um contacto imediato com o cancro localizado e com as células endoteliais próximas e possivelmente minimizar a toxicidade potencial associada com uma libertação intrarterial mais afastada. A preparação e o uso de composições terapeuticamente eficazes para o tratamento de gliomas são descritas em detalhe nas secções que se seguem e por meio dos exemplos, infra. Além das formulações especificamente divulgadas nesta descrição a invenção proporciona a identificação de outras formulações as quais, devido ao seu efeito inibidor na actividade do receptor do PDGF podem ser úteis na inibição da proliferação de vários tumores axiais. As composições candidatas podem ser identificadas pela sua capacidade em inibir a actividade dos receptores de PDGF utilizando qualquer teste adequado, tal como testes in vitro de inibição da autofosforilação por ELISA e inibição da tirosina quinase. '20
As composições candidatas podem ser avaliadas quanto à sua eficácia terapêutica testando a inibição do crescimento das células de glioma e, idealmente, testando a inibição de tumores xenoenxertados in vivo.
IV. AIO A presente invenção descreve várias composições que podem ser utilizadas para inibir a actividade PDGF-R e assim inibir as doenças proliferativas das células. O uso de AIO para inibir o crescimento tumoral em animais demonstra a capacidade destas composições de funcionarem in vivo apesar de várias considerações farmacológicas que se esperam impedir que a composição exerça o seu efeito. Tal inibição in vivo é ilustrada através dos exemplos abaixo descritos. AIO é também conhecido como leflunomida, HWA 486 ou (4-trifluorometil)-anilida do ácido 5-metilisoxazol-4-carboxílico. Várias publicações têm discutido diferentes possíveis usos de AIO. De acordo com os resumos de Kommerer F-J, e col., U.S. Pat. N°. 4.284.786 (1981) e Kommerer F-J, e col., U.S. Pat. N°. 4.351.841 (1982), ο AIO “tem acção antirreumática, antiflogística, antipirética, analgésica e pode ser usado para o tratamento de esclerose múltipla. ”De acordo com Talmadge J.E., e Twardzik D.R. Agents and Actions 35S: 135-141 (1991), “a hipótese que foi sugerida é a de que os mecanismos da actividade da Leflunomida podem ser o da inibição de uma citoquina quinase específica da citocina. ”Robertson S.M. e Lang L.S., Pedido de Patente Europeia 0 413 329 A2 (publicada em 1991) que diz respeito ao ácido 5-metilisoxazol-4-carboxílico que abarca a leflunomida, afirmam: A presente invenção está dirigido a métodos de tratamento de doenças oculares de etiologia imunológica com anilidas derivadas do ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico e do ácido hidroxietilidenociano-acético. Em adição os compostos são úteis para o tratamento de manifestações oculares associadas com doenças sistémicas de etiologia imunológica. Os compostos mostram actividade imunossupressiva, anti-inflamatória e antialérgica moderada e são úteis no tratamento de doenças dos olhos tais corno a uveíte (incluindo nódulos reumatóides), retinite, alergia (queratoconjuntivite vemal e conjuntivite alérgica ou papilar gigante) e a secura ocular (síndroma de Sjogren). Para além disso, estes compostos são úteis para prolongar a sobrevida dos enxertos da córnea ou outro tecido ocular sendo também úteis como adjuvantes cirúrgicos em doentes com defícite atópico ou imunológico. O Bartlett R.R. e col., uIsoxazole-4-Carboxamides and Hydroxyalkylidene-Cyanoacetamides, Drugs Containing These Compounds and Use of Such Drugs14 PCT/EP90/01800, comenta:
Derivados de isoxazol-4-carboxamida e de hidroxialquilideno-cianoacetamida são adequados para o tratamento do cancro. Estes compostos podem ser preparados pelos métodos básicos da técnica anterior. Alguns deles são novos e adequados para o tratamento de doenças reumáticas.
Bartlett R.R. e col., Agents and Actions 32:10-21 (1991), comenta que «(1) tem sido demonstrado que a leflunomida é muito eficiente na prevenção e cura de varias doenças autoimunes em animais». Bartlett também comenta que: ..., nós pudemos demonstrar que a fosforilação da tirosina do substrato péptico RR-SRC e a autofosforilação do receptor do factor mitogénico epidérmico (EGF) são, dependendo das doses, inibidos pela leflunomida.
Matter e col., FEBS 334:161-164 (Nov. 1993) (não admitido por ser da técnica anterior) descreve o uso do melabólito activo da leflunomida para inibir o crescimento das células EGF-dependentes, incluindo as células A431. Matter também comenta : O factor mitrogénico derivado das plaquetas dependente da fosforilação da tirosina era também inibido por A77 1726 em células intactas em concentrações semelhantes às da fosforilação das EGF-dependentes descrita na fig. 3 (dados não v •'vnon-.tradi·'.;.
Estudos sobre uma formulação desta invenção, AIO, descrevem mais completamente e a título dos exemplos infra estabelece-se a sua potência contra as células cancerosas do cérebro, pulmão, próstata, ovário, pele e cólon, caracterizadas pela inadequada ΙΑ-—' actividade do PDGF-R melhor do que pela actividade da EGF. Como foi ilustrado nos exemplos descritos abaixo AIO inibe a actividade do PDGF-R enquanto tem pouco ou nenhum efeito sobre os receptores EGF ou sobre a fosforilação do HER2. Em conclusão, embora AIO iniba o crescimento dos tumores caracterizados pela actividade inadequada do PDGF-R, AIO não inibe significativamente o crescimento das células do xenoenxerto que expressam o receptor EGF (células epidermóides A431). Estes resultados surpreendem quando vistos segundo Bartiett e col., supra, Agents and actions, nos quais a leflunomida mostrou inibir a autofosforilação do receptor do EGF e a proliferação celular, e Matter e col., supra no qual o metabolito activo da leflunomida inibiu o crescimento das células A431. A presente invenção demonstra a capacidade do AIO a inibir a actividade inadequada do PDGF-R e a indesejável proliferação celular, in vivo, tal como ocorre no cancro caracterizado pela actividade inadequada do PDGF-R. Como foi ilustrado nos exemplos descritos abaixo, AIO pode ser usado para inibir selectivamente a actividade inadequada do PDGF-R.
Um composto é considerado para efectuar a fosforilação se a sua capacidade de inibir a fosforilação dum receptor (por exemplo a CI50 como descrito abaixo ) é menor do que 0 seu efeito citotóxico (isto é, a DL50 como descrito abaixo). A inibição da fosforilação de diferentes receptores tais como PDGF-R, EGF-R, ou HER2 está dependente de condições, tais como a da concentração dos fármacos. Por “inibição selectiva“ entende-se que um composto pode ser usado numa concentração determinada para inibir a fosforilação do PDGF-R e tem com a mesma concentração apenas um ligeiro ou mesmo nenhum efeito na fosforilação do EGF-R e/ou no receptor HER2.
De preferência, compostos como o AIO podem inibir o PDGF-R embora tendo um ligeiro ou mesmo nenhum efeito na fosforilação do EGF-R e/ou do HER2. Por “ligeiro ou nenhum efeito” na actividade do EGF-R, ou HER2, significa-se que a actividade do receptor não é afectada mais do que 35%, de preferência não mais de 20%,sendo 0 mais desejável não mais de 10%.
As tirosina quinases são importantes em muitos processos biológicos incluindo o crescimento celular, diferenciação, agregação, quimiotaxia, libertação de citoquinas e contracção muscular. Muitos destes acontecimentos são mediados através de diferentes receptores da tirosina quinase. Além disso, os diferentes receptores da tirosina quinase podem ser importantes para uma determinada função biológica nos diferentes tipos de células. Através do desenvolvimento de inibidores selectivos de PDGF-R é diminuído o possível efeito tóxico do composto. V. PDGF-R modificados
As doenças proliferativas celulares que se caracterizam por uma actividade inadequada do PDGF-R podem também ser inibidas usando um PDGF-R modificado. Ueno H., e col., Science 252:844-252 (1991) descreve ácidos nucleicos codificando PDGF-R trumcados para inibir a fosforilação do PDGF-R in vitro. De acordo com Ueno:
Quando receptores truncados foram expressos em excesso comparados com receptores do tipo nativo, verificava-se que a estimulação da autofosforilação pelo PDGF-R, a associação do fosfatidilinositol-3 quinase com o receptor e a mobilização do cálcio estavam bloqueadas.
Ueno não demonstrou que a inibição da actividade do PDGF-R por uma proteína modificada pudesse inibir a proliferação celular indesejada.
Tal inibição in vivo da proliferação celular indesejada é ilustrada por exemplos descritos abaixo usando ácido nucleico codificando PDGF-R que tem um codão de interrupção justamente na parte de cima do domínio da primeira tirosina quinase. O ácido nucleico é usado para introduzir a proteína modificada dentro da célula. Por exemplo, o ácido nucleico codificando PDGF-R truncado é colocado dentro dum vector retroviral usando as técnicas padronizadas de DNA recombinante. O vector então infecta a célula quando o seu ácido nucleico é finalmente transferido para a proteína produzindo um PDGF-R truncado. Outro método para introduzir a proteína modificada dentro da célula inclui a preparação in vitro e fazer a introdução da proteína na célula através dum vector do tipo liposoma. 24
0 PDGF-R modificado deve ser construído de modo a interferir com a fosforilação intermolecular que ocorre entre receptores dimerizados. Isto pode ser realizado de várias maneiras, tais como : 1) tornar incompleto o PDGF-R, dando preferência à eliminação dum domínio da tirosina quinase, sendo mais preferível eliminar ambos os domínios da tirosina quinase, 2) efectuar mutações que inibam a capacidade catalítica do domínio catalítico do PDGF-R tal como a mutação da lisina 602 para arginina evitando a ligação do ATP. Destes métodos dá-se mais preferência àquele em que se torna truncada o receptor do que à mutação dos radicais da tirosina. O uso do ácido nucleíco codificando o PDGF-R truncado para inibir o crescimento de tumores em animais demonstra a capacidade destes receptores de operarem in vivo, apesar de se esperar que varias considerações farmacológicas impeçam que o composto exerça os seus efeitos. Portanto a presente invenção demonstra que o uso do ácido nucleico codificando receptores PDGF-R incompletos não é limitada à inibição do PDGF-R em cultura de células. Além disso, o ácido nucleico codificando PDFG-R pode ser usado célula para inibir a inadequada actividade do PDGF-R em células animais, podendo também inibir o crescimento de tumores em células de animais e ter aplicação noutras doenças relacionadas com o PDGF-R. VI. Administração de Compostos Bem caracterizados
Os compostos desta invenção podem ser administrados sozinhos ao paciente ou em uma composição farmacêuticas contendo o principio activo e o suporte ou veículo. Os compostos podem ser preparados como sais farmaceuticamente aceitáveis (isto é, sais não tóxicos que não impedem que o composto exerça o seu efeito).
Os sais farmaceuticamente aceitáveis são os sais que resultam da adição de ácidos tais como hidrocloreto, sulfato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartarato, metanosulfonato, ciclo-hexilsulfamato e quinato. Ver, por exemplo, supra .PCT/US92/03736 ). Tais sais podem ser derivados usando ácidos tais como ácido clorídrico, ácido sulfurico, ácido fosfórico e ácido sulfâmico, ácido acético, ácido cítrico e ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanossulfónico, ácido 25 etanosulfonico, ácido sulfonico, ácido p-toluenossulfonico, ácido cicio-hexilssulfamico e ácido químico.
Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados por técnicas padronizadas. Por exemplo, o composto com a forma de base livre é primeiro dissolvido num solvente conveniente, tal como numa solução aquosa ou hidroalcoolica contendo o ácido apropriado. O sal é então isolado por evaporação da solução. Um outro exemplo será preparar o sal fazendo reagir a base livre e o ácido num solvente orgânico.
Excipientes ou veículos podem ser usados para facilitar a administração do composto, por exemplo, para aumentar a sua solubilidade. Exemplos de excipientes e veículos são o carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares ou tipos de amido, derivados da celulose, gelatina, óleos vegetais, polietilenoglicois e solventes fisiologicamente compatíveis. As comnosiçde? l:ánv;acèv.iícas podem se;· administradas por diferentes vias incluindo a intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, oral, tópica ou transmucosal. AIO é hidrofóbico e por isso não é muito solúvel em água. Doses eficazes de AIO podem ser obtidas usando AIO em combinação com PBTE:D5W. PBTE consiste numa solução de 3% em p/v de álcool benzílico, 8% em p/v de polissorbato 80 e 65% em p/v de polietilenoglicol (PM = 300 daltons ) em álcool absoluto. PBTE:D5W consiste no PBTE diluído 1:1 numa solução aquosa de 5% de dextrose. A solubilidade de AIO em PBTE é cerca de 60 mg/ml e a solubilidade de AIO em PBTE:D5W é cerca de 5 mg/ml. A solubilidade dos outros compostos descritos na presente memória podem ser obtidos através de técnicas padronizadas.
Um outro meio para ultrapassar o problema da hidrofobicidade passa pelo uso de frequentes e pequenas doses diárias em vez de poucas e maiores doses diárias. Por exemplo a composição pode ser administrada em intervalos de tempo curtos, sendo preferível que a sua administração se faça com uma bomba para controlar o tempo do intervalo ou possa atingir uma administração contínua. As bombas adequadas estão tf «SS-,-ΐ.
JÁ disponíveis no comércio (por exemplo, a bomba ALZET vendida por AlÈa Corporation, e a bomba PCA ambulatória vendida por Bard MedSistems).
Em alternativa podem ser usados pró-fármacos que aumentem a solubilidade. Os pró-fármacos podem transformar-se em fármacos activos sob as condições fisiológicas. Por exemplo, Patterson e col., J. Med, Chem., 35:507-510 (1992) descreve A12 (3-carboxi-5-metil-N-[4-(trifluorometil)fenil]-4-isoxazol carboxamida) que, tal como AIO pode actuar como pró-fármaco para BI 1. A dosagem apropriada depende de vários factores tais como o tipo de doença a ser tratada, a composição particular que está a usar-se, e o tamanho e a condição fisiológica do paciente. Para o tratamento de cancro, a dose diária de AIO estimada está entre 1 e 2000 mg/dia, de preferência 1 a 250 mg/dia, sendo o mais desejável 10 a 150 mg/dia. Os fármacos podem ser libertados menos frequentemente dando níveis plasmáticos medianamente activos o que é suficiente para manter a eficácia terapêutica.
Um factor que pode influenciar a dosagem do fármaco é o peso. Os fármacos devem ser administrados num intervalo de doses variando entre 0,02 e 25 mg/Kg/dia, de preferência 0,02 a 15 mg/Kg/dia,sendo o mais desejável 0,2 a 15 mg/Kg/dia. Alternativamente os fármacos podem ser administrados de 0,5 a 1200 mg/m2/dia, de preferência 0,5 a 150 mg/m2/dia, sendo o mais desejável de 5 a 100 mg/m2/dia. O nível médio no plasma deve ser de 50 a 5000 mg/ml. Os níveis no plasma podem ser reduzidos se as concentrações farmacológicamente eficazes do fármaco forem atingidas no local de interesse. VIL Administração de PDGF-R Modificado
Os mutantes PDGF-R podem ser administrados como ácido nucleico expressando a proteína, utilizando técnicas padrão algumas das quais são descritas abaixo. Os veículos de fornecimento incluem liposomas e outras composições farmacêuticas. O ácido nucleico codificando o PDGF-R modificado pode ser igualmente introduzido numa célula utilizando técnicas padrão tais como a retroviral e moléculas iónicas aos pares. Nos casos em que a técnica se desenrola ex vivo fora da célula é então colocada no
paciente. A administração da proteína é facilitada pelo uso de um excipiente ou veículo como descrito acima. A via de libertação específica de qualquer agente seleccionado depende do uso do agente (tais considerações são igualmente aplicadas para a administração dos compostos referenciados). Geralmente, um programa de fornecimento específico para cada agente baseia-se no conhecimento desse agente no que respeita à localização intracelular, seguida de demonstração de eficácia. Em alternativa, pode ser seguida a libertação destas mesmas células num órgão ou tecido de um animal,. Estudos de compreensão incluem ensaios de avaliação para determinar por exemplo o ácido nucleico celular ou a proteína conhecida, indiferentemente da libertação do veículo ou da estratégia. Tais testes determinam também a localização intracelular seguindo o conhecido agente e estabelecendo finalmente as exigências para manter as concentrações constantes dentro do interior da célula que contém as sequências marcadas (núcleo e/ou citoplasma). A eficácia e a toxicidade podem ser testadas. A toxicidade não só inclui a viabilidade da célula como também a sua função. Geralmente as dosagens da proteína modificada e ácido nucleico são as mesmas que se descrevem abaixo para os compostos referenciados.
Os veículos de fornecimento dos fármacos são eficazes tanto para as administrações tópica como sistémica. Eles podem ser concebidos para servir como um reservatório de libertação ou iíburui; o seu conteúdo directamente para a célula marcada. Uma vantagem de usar veículos de fármacos que os libertem directamente é que se sabe com certeza que múltiplas moléculas são fornecidaspor cada dose tomada. Tais veículos aumentam a semivida de circulação dos fármacos, que doutra maneira seriam rapidamente removidas pelo sistema sanguíneo. Alguns exemplos de veículos que caem dentro desta categoria são liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis, e microesferas bioadesivas. As bombas podem também serem usadas com este fim.
De toda esta categoria de sistemas de fornecimento, os liposomas são os preferidos. Os liposomas aumentam a estabilidade intracelular, aumentam a eficácia da dose tomada, e V 28 f melhoram a actividade biológica. Os liposomas são vesículas esféricas ocas constituídaspor lípidos colocados de maneira semelhante aos lípidos que compõem a membrana da célula. Eles têm um espaço interno aquoso que atrai os compostos solúveis na água e variam em tamanho de 0.05 alguns micra de diâmetro. Os anticorpos podem ser ligados aos liposomas para marcar determinadas células. A administração tópica de mutantes de PDGF-R e dos compostos propostos é vantajosa desde que permita uma concentração localizada no sítio da administração com um mínimo de absorção sistémica. Isto simplifica a estratégia do fornecimento do agente ao local da doença e reduz a extensão da caracterização toxicológicas. Além disso a quantidade de material utilizado é bastante menor do que o exigido para outras vias de administração. O fornecimento eficiente necessita que o ácido nucleico entre na membrana celular ou no citoplasma das células caracterizadas por uma actividade inadequada de PDGF-R e expressem a proteína.
Os agentes podem ser também administrados sistemicamente. A absorção sistémica consiste numa acumulação de fármacos na corrente sanguínea seguida de uma distribuição a todo o corpo. As vias de administração que permitem uma absorção sistémica incluem: a intravenosa, a subcutânea, a intraperitonial, a intranasal, a intratecal e a oftálmica. Cada uma destas vias de administração facilita o acesso da fármaco ao tecido doente. A administração subcutânea escoa o fármaco para os nódulos linfáticos localizados que a introduzem através da rede linfática na circulação. Foi demonstrado que a velocidade de entrada na circulação é função do peso molecular ou tamanho. VIII . Exemplos
Referem-se em baixo exemplos ilustrativos dos diferentes aspectos e forma de realização da presente invenção. Estes exemplos não têm a intenção de limitar de forma nenhuma a descoberta descrita. Mais propriamente, eles ilustram a metodologia pela qual os fármacos com a fórmula descrita podem ser rapidamente identificados por procedimentos de rotina para assegurar da actividade desejada. Isto é, compostos 29 29
obedecendo à fórmula aqui reivindicada podem ser escolhidos para determinar os^que têm a actividade mais apropriada antes da administração a um animal ou ser humano. Outros compostos podem também ser separados para determinação do uso adequado nos métodos deste invento.
Em apêndice abaixo figura uma descrição de alguns procedimentos usados nos exemplos seguintes.
Apêndice 1 _L Linhas de Células A linhas de células foram adquiridas ATCC, salvo indicação em contrário. As células UI240 e U 1242 foram obtidas do Dr. Joseph Schlessinger (Universidade de Nova Iorque) e as células SF763 e SF767 foram obtidas do Dr. Michael Berens (Barrow Neurological Institute). SF767T, SF763T, U118T, e SKOV3T são sublinhas de células SF767, SF763, UI 18 e SKOV3, respectivamente. Derivaram da implantação de células parenterais SC em BALB/c, ratinhos nu/nu. Os tumores que exibiram características de crescimento desejáveis foram seccionados e finamente cortados para uma placa de Petri esterilizada. Adicionaram-se dois a cinco ml de meio apropriado à pasta fluida e os bocados do tumor foram adicionalmente batidos separadamente por meios mecânicos. A suspensão resultante foi colocada em frascos de cultura de tecidos e alimentados com o meio de cultura apropriado suplementado com 100 unidades/ml de Penicilina G sódica e 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY). O meio foi mudado todos os dois a três dias. Após três a cinco passagens, os suplementos antibióticos foram removidos e as células mantidas em meio isento de antibiótico.
Os fibroblastos de ratinho NIH3T3 expressando à superfície o receptor EGF, Flk-1, receptor IGF-1 ou o receptor PDGF-β foram construídos usando vectores retrovirais. As células MCF7/HER2, sobreexpressando genes HER2, derivaram do uso de construções retrovirais com base em MCF7. t 2. Cultura de Células
Todos os meios de cultura de células, glutamina, e soro de feto de bovino foram adquiridos em Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) salvo outros especificados. Todas as células cresceram numa atmosfera húmida de 90-95% de ar e 5-10% C02 a 35°C. As linhas de células foram subculdvadas por norma duas vezes por semana e apresentavam-se negativas a micoplasma de acordo com a determinação pelo método Mycotec (Gibco).
As células C6 foram mantidas em Ham's FIO suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e 2 mM de glutamina (GLN). As células T98G foram cultivadas em MEM com 10% de FBS, 2 mM de GLN, 1 mM de piruvato de sódio (NaPyr) e aminoácidos não essenciais (NEAA). As células SKOV3T foram cultivadas em DMEM, 10% de FBS e 2mM de GLN.
Os fibroblastos de rato NIH3T3 construídos para expressarem Flk-1 ou o receptor EGF foram mantidos em DMEM contendo 10% de soro de vitelo (CS) e 2 mM de GLN. As células NIH3T3 projectados para expressarem IGF-1 ou receptores de insulina foram mantidas em DMEM contendo 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células HL60 foram mantidas em RPMI 1640 com 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células T47D e BT474 foram mantidas em RPMI 1640 com 10% de FBS, GMS-G e 2 mM de GLN.
As células DU 145 cresceram em DMEM F12 com 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células A172, A431, UI 18MG e RAG cresceram em DMEM com 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células L1210 cresceram em DMEM com 10% de soro de cavalo e 2 mM de GLN. As células Cl300 cresceram em DMEM com 10% de FBS inactivado pelo calor, 2 mM de GLN e 50 mM de β-mercaptoetanol. As células T98G, U138MG, U87MG, U373MG, U1240, U1242, Calu-3, Calu-6, SF767, SF767T, SF763, SF763T, SK-N-MC e SK-N-SH, cresceram em MEM com 10% de FBS, NEAA, 1 mM de NaPyr e 2 mM de GLN. As células MDA MB 361 e MDA MB 468 cresceram em LI5 com 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células PC-3 cresceram em HAM'S F12 com 7% de FBS e 2 mM de GLN. As célulasA549 cresceram em HAM'S F12 com 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células ZR75-30 cresceram em RPMI 1640 com 10 de FBS e 2 mM de GLN elmMde NaPyr. As células MCF7, MCF7/HER2, A375, BT549, 9L, C8Í-61, ZR 75-1 e as células K562 cresceram em RPMI 1640 com 10% de FBS e 2 mM de GLN. As células Ovcar cresceram em RPMI 1640 com 20% de FBS. 2 mM de GLN e 10 mg/ml de insulina. As células DIB e T27A cresceram em RPMI 1640 com 10% de FBS inactivado pelo calor. 2 mM de GLN e 50 mM β-mercaptoetanol. As células 7TD1 cresceram no mesmo meio suplementado com 50 unidades/ml de de recombinante de murino IL-6. As células Colo 320DM, WEHI-164.13 e HBL100 cresceram em RPMI 1640 com 10% de FBS inactivado pelo calor e 2 mM de GLN. As células SKBR3 cresceram em meio de McCoy's 5A com 15% de FBS e 2 mM de GLN. As células PA-1 cresceram em MEM com 10% de FBS inactivado pelo calor, 2 mM de GLN e NEAA. As células Neuro 2A cresceram em MEM com 10% de FBS inactivado pelo calor, 2 mM de GLN, NEAA, NaPyr e 50 mM de β-mercaptoetanol.
Apêndice 2 1. Fosforilação do Receptor A inibição da actividade do receptor da tirosina quinase pelo A10 foi estudada por ensaios de mancha de Western e ELISA. Para a mancha de Western, as células foram colocadas em 2 ml de meio de crescimento em placas de 6 a alvéolos (500.000 células por alvéolo) e deixadas durante a noite para se fixarem. O meio foi substituído com 2 ml de MCDB 105 (Fábrica de cultura de células UCSF) suplementado com 1% de FBS. As placas foram então incubadas durante a noite a 37° C, em atmosfera de CO?. Para testar os efeitos dos compostos na autofosforilação do receptor, mediado pelo ligante, as células foram expostas a A10 ou DMSO durante 1 hora a 37°C antes da estimulação da actividade do receptor da tirosina quinase pelo ligante. Após uma incubação de 7 min à temperatura ambiente com o ligante, as placas foram colocadas em gelo e lavadas três vezes com 1 ml de PBS gelado mais lmM de ortovanadato. A lise foi realizada pipetando células em 0,5 ml de tampão contendo 50 mM de vanadato de sódio (NaaVCU), 10 mM de pirofosfato, 1 mM de pirofosfato, 1 mM de PMSF, 10 mg/ml de aprotinina, e 10 mg/ml de leupeptina. Uma alíquota de 300 μΐ de cada lisado foi imediatamente adicionada a 4x 100μ1 de amostra tampão de Laemmli (0,2 mM Tris pH 6,9, 20% de glicerol, 7% de SDS, 5 mM de EDTA, 5% de β-mercaptoetanol) contendo inibidores da fosfatase, 2 mM Na3VC>4 e 10 mM de pirofosfato. As amostras foram 32 32
levadas à ebulição por 5 min, congeladas em etanol gelado seco e guardadas a -*-80°C. As proteínas foram redissolvidas pelo SDS-PAGE (Bio-Rad Miniprotean II) e transferidas para membrana de nitrocelulose (Schleicher & Schuell) a 120 volts por 1 hora à temperatura ambiente em tampão contendo 25 mM Tris pH 8,3, 20% de metanol, 0,2 M de glicina, 0,1% de SDS. A integridade da membrana transportadora de proteína foi observada corando com 1% de Ponceau S em 5% de ácido acético durante 5 min. Após descoloração em vários enxaguamentos de água destilada, a membrana foi embebida durante a noite em tampão bloqueante contendo 5% de leite em solução fisiológica salina componada com Tris salino, e 0,05% de Tween 20. A fosfotirosina foi detectada por incubação da membrana (1 hora à temperatura ambiente) com um antissoro antifosfotirosina diluído em tampão bloqueante a 1:3000. Para as células C6, o conteúdo em receptor PDGF-β nos lisados foi confirmado pela passagem com dupla amostra pelo Western Blotting usando um anticorpo específico para o receptor de PDGF-β (UBI). Os anticorpos foram visualisados usando reagente ECL da Amersham e por exposição a película Fuji RX.
Para os ensaios de ELISA, as células cresceram até 80-90% de confluência em meio de crescimento e semearam-se em placas de 96 alvéolos para cultura de tecidos em 0,5% de soro a 25.000 a 30.000 células por alvéolos. Após incubação durante toda a noite em meio contendo 0,5% de soro, as células foram mudadas para meio isento de soro e tratadas com o composto em teste por 2 horas num incubador a 37°C em atmosfera de C02 a 5%. As células foram então estimuladas com o ligante por 5-10 min seguidos de lise com HNTG (20 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 5 mM de EDTA, 5 mM de NasVO^ 0,2% de Triton X-100 e 2 mM de NaPyr). Os lisados das células (0,5 mg/alvéolos em PBS) foram transferidos para placas ELISA previamente revestidas com anticorpos específicos dos receptores os quais haviam sido neutralizados com 5% de leite em TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl e 0,1% Triton X-100), à temperatura ambiente durante 30 min. Os lisados foram incubados com agitação durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com TBST por quatro vezes e depois incubadas com anticorpo policlonal anti-fosfotirosina à temperatura ambiente por 30 min. O excesso de anticorpo anti-fosfotirosina foi removido por lavagem da placa quatro vezes com TBST. Adicionou-se à placa de ELISA anticorpo IgG anti-
/ r coelho de cabra por 30 min à temperatura ambiente, seguido de lavagem por quatro vezes com TBST. Juntou-se às placas de ELISA, ABTS (100 mM ácido cítrico, 250 mM de Na2HPC>4 e 0,5 mg/ml de 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) mais ELOo (1,2 ml a 30% de ELO? para 10 ml ABTS) para iniciar o desenvolvimento da cor. Cerca de 15 a 30 min após a adição de ABTS registou-se a absorvância em 410 nm a um comprimento de onda de referência de 630 nm. A linha das células usadas nos testes ELISA incluíam U1242 (receptor PDGF-β), células HL-60 (receptor GMCSF/JAK-2), ou células NIE13T3 expressando à superfície o receptor EGF, Flk-1, o receptor IGF-1 ou o receptor da insulina. Os valores de CI50 foram calculados comparando a inibição da fosforilação da tirosina pelo fármaco na ausência ou presença do ligante apropriado.
2. Síntese do DNA
Os efeitos do A10 na síntese do DNA dependente do PDGF foi determinada medindo a JH-timidina incorporada no DNA das células. As condições para o ensaio foram essencialmente as descritas por Pollack, e col. J. Neurosurg., 73:106-112, 1990, com algumas modificações. As células T98G em fase logarítmica de crescimento foram transferidas para placas de 96 alvéolos na concentração de 20.000 células por 200 μΐ de meio de crescimento contendo soro. Após um período de fixação de uma noite, as monocamadas foram lavadas duas vezes com 200 μΐ de meio MCDB 105 e as células foram cultivadas durante 24 horas em 200 μΐ de meio MCDB 105 isento de soro. O meio foi substituído nos alvéolos só por meio fresco (MCDB 105 mais .5 μg/ml de insulina), meio contendo só PDGF-BB, ou meio contendo PDGF-BB em combinação com várias concentrações de A10. As placas foram incubadas a 37°C em atmosfera de C02 por aproximadamente 18 horas. A cada alvéolo foi adicionado 3EI-timidina (Amersham, 5 Ci/mmol) para atingir uma concentração final de 5 pCi/ml e as placas voltaram para 0 incubador a 37°C. 4 horas depois, o meio foi removido, as placas colocadas no gelo, e foram lavadas duas vezes com 200 μΐ de PBS gelado, por alvéolo. A radioactividade incorporada no DNA foi separada da 3H-timidina não incorporada por precipitação com 100 μΐ de TCA arrefecido no gelo durante 10 min. Após duas lavagens com TCA gelado, o precipitado foi solubilizado (1% SDS em 100 ml 10 mM base Tris) e transferido para frascos de contagem de cintilação líquida. Juntaram-se seis ml do cocktail (Ready Safe Beckman) e mediu-se a radioactividade com um contádor de cintilação de líquido,, modelo LS6000SC. 3. Análise do Ciclo da Célula
Fibroblastos NIH3T3 de ratinho sobre-expressando o receptor PDGF-β humano foram semeados em DMEM suplementado com 10% CS e 2 mM GLN. As células cresceram cerca de 80% de confluência e depois foram tratadas por uma noite em meio isento de soro (DMEM, 2 mM de GLN, 2 mM de NEAA, 2 mM de NaPyr, e 2 mM HEPES). As células foram incubadas por 20 horas na presença de PDGF-BB a 100 ng/ml e com várias concentrações de A10 (0,1, 1, 10, 25 ou 100 mM). As células foram então recolhidas, coradas e analisadas por citometria de fluxo para doseamento de DNA. 4. Testes de Crescimento
Foi testada a capacidade do A10 inibir o crescimento de células tumorais dependente de fixação, usando o doseamento colorimétrico descrito por Skehan, e col., J. Natl. Câncer Inst., 82:1107-1112, 1990. O teste mede o conteúdo de proteína das células fixadas pelo ácido usando o corante de ligação de ião contrário sulforodamina B (SRB, Sigma). O A10 foi solubilizado em DMSO (meio graduado para cultura de células Sigma) e diluído no meio de crescimento apropriado na concentração dupla do teor final desejado. Em ensaios usando as células C6, A10 (100 μΐ) foi adicionado em placas de 96 alvéolos revestidas de uma película de células (2000 células/alvéolo em 100 μΐ). Para outras linhas de células doutra linhagem (2000 as células/alvéolo em 100 μΐ) foram introduzidas nos alvéolos imediatamente depois da distribuição da solução dos reagentes. Depois de quatro dias (37°C, 5% de CO2) as películas foram lavadas 3 vezes com PBS e fixadas com 200 μΐ de TCA a 10% arrefecido em gelo (Fisher Scientific), e guardadas a 4°C por 60 min. O TCA foi removido e as películas foram lavadas 5 vezes com água da torneira e deixadas a secar completamente à temperatura ambiente sobre papel absorvente. As proteínas celulares foram coradas por 10 min. com 100 μΐ de SRB a 0.4 % dissolvido em 1% de ácido acético. Depois de 5 lavagens em água da torneira, a película corada foi solubilizada em 10 mM de base Tris (100 μΐ por alvéolo) e lido por absorção a 570 nm num aparelho leitor de placas da Dynatech MR5000. Os resultados da inibição do crescimento são expressos em % da absorvância detectada nos alvéolos de controle os quais foram tratados só com 0,4 de DMSO. Os controles DMSO não estavam diferentes das células que cresceram num meio de crescimento normal. Os valores de IC50 foram calculados usando quatro parâmetros numa curva de funções equiparadas. Para o teste de ensaio de crescimento de células tumorais de fixação independente, as células (3000 a 5000 por cápsula) suspensas em meio de ensaio com 0,4% de agarose (DMEM que contém 10% de FCS) com e sem A10 foram colocadas em placas de 35 mm revestidos por uma base sólida de agarose (0,8 % de agarose). Depois de 3 a 4 semanas de incubação a 37°C, foram quantificadas as colónias maiores que 50 pm usando um contador Omncon 3800 Tumor Colony.
Apêndice 3 1 . Ensaios de Crescimento para Linhas de Células Tumorais
Para a maior parte das linha de células tumorais, a inibição do crescimento das células por A10 foi avaliado usando o ensaio SRB como foi descrito no apêndice 2. Para as células K562, DIB, L1210, 7TD1, T27A e Colo320DM o ensaio utilizado foi o de MTT Hansen e col., J. Immunol. Methods, 119:203-210, 1989). Em resumo, utilizando placas de 96 alvéolos foram colocados em cada uma, 50 ml de meio de crescimento contendo várias concentrações de A10 e 50 ml de suspensão de células (2000 células). As células foram incubadas a 37°C por 4 dias em atmosfera húmida com 7 % de CO2. No final, foram adicionados 15 ml de MTT (5 mg/ml em PBS, Sigma) a cada alvéolo. As placas foram incubadas a 37°C por 4 dias seguindo-se a adição de 100 ml duma solução de solubilização ( 20% p/v de SDS em N.N-dimetilformamida a 50% com pH 4,7) em cada alvéolo. As placas foram incubadas toda a noite num contentor selado com atmosfera húmida. Foi determinada a absorvância ao comprimento de onda de 570 nm tendo como referência o comprimento de onda de 630 nm usando 0 leitor de placas ELISA. 2. Ensaio de Crescimento para Tumores Primários A efeito de A10 sobre o crescimento de tumores primários foi examinado com Oncotech, Inc. (Irvine, CA). Patologistas de instituições de referência, imediatamente após a cirurgia de tumores aceitáveis, colocaram estes em meio para transporte e enviaram-nos durante a noite para Oncotech. Logo que o tumor foi recebido, uma parte foi fixada em formalina para ser seccionada e 0 restante foi separado em tecidos ,--------36 'Λ
S t necróticos, conectivos e adiposos. Todas as manipulações do tumor foram feitas assepticamente. A parte restante do tumor foi colocada numa cápsula de Petri que continha 5 ml de meio (RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 Ul/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina e L-glutamina) e desagregado mecanicamente com tesoura em fragmentos de 2 mm ou menores. A pasta resultante foi misturada com meio contendo 0,003 % de DNase (2650 unidades Kunitz/ml) e 0,14 % de colagénio tipo 1 (enzimas da Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), e colocada em frascos de 50 ml com agitação e incubados durante 90 min. a 37°C uma atmosfera húmida com 5 % de CO2. Uma porção da suspensão das células foi usada para a preparação de lâminas para a centrífuga Cytospin e foi examinada relativamente ao manchamento do tecidos com hematoxilina e eosina, por um médico patologista para confirmar 0 diagnóstico e determinar a quantidade de células tumorais e a sua viabilidade.
Após a dispersão enzimática para formar uma suspensão próxima de células únicas, as células tumorais foram filtradas através de rede de nylon, lavadas em meio, suspensas em agarose macia (0,12 %) e colocadas, aproximadamente, 20.000 células por alvéolo sobre uma camada inferior de agarose (0,4%) em placas de 24 alvéolos. As células foram incubadas segundo as condições normais de cultura por 5 dias na presença ou ausência de A10. As células foram pulsadas com 3H-timidina (Amersham, 5 mCi por alvéolo) durante as ultimas 48 horas do período de cultura. A seguir ao período de marcação apropriado, as placas com a cultura de tecidos foram aquecidas a 60°C para fundir a agarose, as células colhidas com uma micro-ceifadora para filtros de fibra de vidro (PCI) e a radioactividade determinada. A percentagem de inibição (PCI) foi determinada usando a fórmula: PCI = 1 - (CPM do grupo de tratamento Π CPM do grupo de controlo). A avaliação do crescimento do grupo de controle foi determinada em quadruplicado, enquanto o crescimento do grupo de tratamento foi determinado em triplicado.
Apêndice 4 1. Animais
Ratinhos fêmea atímicos (BALB/c, nu/nu), ratinhos BALB/c e ratos Wistar e Fisher 344 foram adquiridos nos Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Ratinhos fêmea A/J foram
obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ratos DA foram conseguidas B&K Universal, Inc. (Fremont, CA). Ratos atímicas R/Nu, ratinhos DBA/2N e BALB/c foram provenientes de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Ratinhos fêmea C57BL/6 foram obtidos de Taconic (Germantown, NY). Todos os animais foram mantidos sob condições de higiene ambiente em gaiolas micrò-isoladoras com cama seca - Alpha. Receberam ração estéril para roedores e água à descrição. 2. Modelo de Xenoenxerto Subcutâneo
As linhas de células foram desenvolvidas em meio apropriado (veja-se Apêndice 1). As células foram colhidas na ,ou próximo da confluência, com Tripsina-EDTA a 0,05% e centrifugadas a 450 x g por 10 min. As células sedimentadas foram suspensas de novo em PBS ou meio estéril (sem FBS) numa concentração determinada e implantadas no flanco posterior do ratinho. O crescimento tumoral foi medido ao longo de 3 a 6 semanas usando palma com nónio. O volume dos tumores foi calculado como sendo o produto do comprimento x espessura x altura, salvo outra indicação. Os valores de P foram calculados usando o teste-t de Student. Ο AIO foi disponibilizado em 50-100 μΐ de veículo (DMSO, PBTE, PBTE6C:D5W ou PBTE:D5W) por injecção IP em diferentes concentrações. 39
foram observados diariamente para tomar conhecimento da ocorrência de formação de ascites. Os animais foram sacrificados individualmente sempre que apresentavam um ganho de peso de 40%, ou quando o peso do tumor IP causasse demasiada "stress" e dor ao animal. 5. ímuno-histoquimica
Secções de tecido de 5 pm, congelados e fixados em acetona, de tumores xenoenxertados e não tratados derivados do homem, ratos ou células de tumores de murinos foram analisados por imuno-histoquimica usando anticorpos altamente específicos aos receptores. Em resumo, os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 10% de soro normal de cabra, antes da aplicação do anticorpo primário. Foram usadas concentrações adequadas de anticorpo para atingir a sensibilidade e especificidade desejadas (receptor PDGF-b anti-humano de coelho a 1:400 e F1K anti-ratinho de coelho a 5,5 pg/ml). Secções de tecidos conhecidos contendo a proteína que interessa são usados como controle positivo. Os controles negativos adequados são os soros de IgG de coelho e IgG anti-pinto de rato, isotipos dos anticorpos primários com a mesma concentração da proteína. O processo indirecto com três etapas foi o método de detecção usado e consiste na ligação do anticorpo primário a um segundo anticorpo marcado com biotina (IgG anti-coelho de cabra a 1:500) seguida pela estreptavidina conjugada com a peroxidase de rábano. O substrato/cromogénio utilizado foi 0,05% de diaminobenzidina / 0,03% de H2O2. As secções de tecido foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas através de graduações crescentes de etanol, clarificadas em substituto de xileno. e cobertos com Permount para observação microscópica. Foi utilizado um sistema de gradação de + até +++ para identificar a intensidade total da expressão, com + = baixo, ++ = moderado, +++ = intensidade elevada. Foi observada uma reacção específica de coloração tanto para células tumorais (T) ou células endoteliais vasculares (V) ou ambas.
Apêndice 5 1. Testes Imunológicos In Vitro '42 r f>i a em metanol. Os tecidos e as amostras de órgãos foram homogeneizados de acordo còm a relação de peso de 1:5 (p/v) em 50mM Tris-HCl, com pH = 7,4, a 20.000 rot./min, usando um homogeneizador de tecidos (Brinkmann Polytron Model PT3000). Depois da adição dum padrão interno, o homogeneizado foi acidulado com HC1 e então extraído com acetonitrilo. A fracção de acetonitrilo foi depois extraída com igual volume de éter dietilico. A fracção etérea foi evaporada até à secura numa centrífuga com vácuo e aquecimento e depois redissolvida com metanol.
As amostras para a analise HPLC foram injectadas num Hewlett Packard Hypersil com colunas de cartucho de 5-pm Cl8 (100x4.6 mm). A fase volátil foi o metanol: 35 miM de PO4H2K (pH=4.5) 55:45 contendo 4mM de trietilamina. O débito do fluxo foi 1,2 ml/min. Os compostos foram monitorizados por absorção UV com 254 nm usando um Hewlett-Packard com um detector de díodos em linha (HP Model 1090). As concentrações de plasma e tecidos foram determinadas a partir de curvas padrão usando uma área de picos para a quantificação. As curvas padrão para 0 plasma e tecidos foram preparadas com homogeneizados de plasma e tecidos de ratos livres de fármacos e após contacto com quantidades conhecidas deAlOeBll.Os resultados foram corrigidos por comparação com 0 padrão interno. O padrão interno usado foi (4-trifluorometil)-anilida ácido 5-metil-pirazole-4-carboxílico.
Apêndice 7 1. Efeitos do A10 sobre 0 Peso Corporal
Ratinhos atímicos (BALB/ c, nu/nu, do sexo feminino, com 4-5 semanas de vida) receberam A10 por administração IP (20 mg/Kg/dia) em 100 μΐ de PBTE.D5W, todos os dias e durante 101 dias. Os animais que representam o controle do veículo receberam por administração IP 100 μΐ de PBTE:D5W (1:1, v/v) todos os dias durante 101 dias e 0 grupo de controle de animais sem tratamento não receberam qualquer tratamento. Cada grupo tem 8 animais. Foram tomados os pesos ao dia 0 (1 dia antes da administração do fármaco) e duas vezes por semana até terminar a experiência. A percentagem de alteração de peso foi calculada tomando o peso de cada determinação comparado com o peso do dia 0. ,43 .. ./ 2. Determinação de DL^n
Grupos de 5 a 10 ratinhos atímicos (BALB/c, nu/nu, do sexo feminino), ou ratinhos BALB/c (machos ou fêmeas) foram tratados com AIO IP em 50 μΐ de PBTE, 100 μΐ de PBTE, ou 50 μΐ de DMSO. Numa das experiências, grupos de 5 ratinhas BALB/c receberam Decadron (fosfato de sódio de dexametasona injectável, 1,5 mg/Kg) por administração IP uma vez por dia durante sete dias antes da administração de uma dose única de A10. Numa experiência adicional, grupos de 5 ratinhas BALB/c receberam Dilantin (fenitoina sódica injectável, 20 mg /kg) por administração IP uma vez por dia e durante sete dias antes de uma dose única de A10. Todos os animais foram obseservados entre os 7 e os 14 dias depois da última dose administrada. A DL5o foi calculada num gráfico de % de mortalidade versus doses (log M) usando uma equação com quatro parâmetros.
Exemplo 1: Inibição da Autofosforilação do PDGF-R pelo A10
Este exemplo ilustra a capacidade do A10 inibir a autofosforilação do PDGF-R em células C6 de glioma de rato. As células C6 de glioma de rato ( 5x105) foram colocadas em meio MCDB 105 contendo 5% de FCS numa placa de 6 alvéolos e incubadas a 37°C durante 24 horas. As células foram novamente colocadas em meio com 1% de FCS por mais 24 horas. As células foram tratadas com A10 na concentração de 50, 100 ou 200 mM por 1 hora a 37°C e a seguir com 20 ng/ml de PDGF-BB por 10 min a 37°C. A seguir as células foram lisadas em 50 mM de Tris-HCl (pH = 7,4) contendo 2 mM de EDTA, 10% de glicerol, 1% de NP-40, 1 mM de ortovanadato de Na+, 10 mM de pirofosfato, l mM de PMSF, 10 mg/ml de aprotinina e 10 mg/ml de leupeptina.
As proteínas foram então separadas por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (PAGE). As proteínas contendo tirosina fosforilada foram identificadas pelo teste de Western blot com um anticorpo anti-fosfotirosina. O nível de tirosina fosforilada foi determinado quantificando o teor de anti-fosfotirosina ligada. Essa quantificação foi conseguida através da área de integração dos picos utilizando um densitómetro Dynamics Computing (modelo 300S), e software Image Quant v3.0 (Molecule Dynamics). Os valores foram expressos como relativos à intensidade dos picos (fosforilação de um receptor a dividir pela quantidade total de tirosina fosforilada).0 PDGF-BB estimulou a autofosforilação do PDGF-R, enquanto o AIO inibiu tal estimulação. O aumento das concentrações de AIO resultou na redução da fosforilação do receptor estimulado pelo PDGF. Numa concentração de 200 mM AIO reduziu a fosforilação do PDGF-R abaixo da que ocorre na ausência da estimulação do PDGF-BB.
Exemplo 2: Inibição Selectiva da Autofosforilação do PDGF-R pelo AIO Ο AIO inibe a autofosforilação do PDGF-R em células de glioblastoma T98G humanas, embora tendo um pequeno ou até mesmo nenhum efeito sobre a autofosforilação do receptor de EGF. As células T98G foram colocadas em meio MCDB105 contendo 2% de FBS e incubadas por 24 horas a 37°C. O meio foi aspirado e depois substituído por MDCB105 e as células tratadas por uma hora com 200, 500, ou 1.000 mM de A10. As células foram tratadas com diferentes concentrações de A10 (0, 200, 500 e 1.000 mM) e na presença e na ausência do ligando. As células foram então tratadas com ligando por 10 minutos (20 ng/ml PDGF-BB ou 50 ng/ml EGF). As células foram lisadas e o nível do receptor fosforilado foi quantificado como descrito no Exemplo 1. Ο A10 inibiu a autofosforilação do PDGF-R pelo PDGF, mas teve pequeno ou mesmo nenhum efeito na capacidade do EGF estimular a autofosforilação do EGF-R.
Exemplo 3: Inibição da Fosforilação do PDGF-R por Vários Compostos Este exemplo ilustra a capacidade do A10 em inibir a fosforilação do receptor estimulado pelo PDGF. As células UI242 MG foram colocadas em placa de 96 alvéolos numa concentração de 5x104 células/alvéolo em meio de cultura contendo 0,5% de FBS. As células foram incubadas por 24 horas. Depois foram então tratadas com um composto particular durante 2 horas seguido da adição de 100 ng/ml de PDGF-BB e incubação por 10 minutos.
As células foram lisadas em 0,2 M HEPES, 0,15 M de NaCl, 10% V/V de glicerol, 0,04% de Triton X-100, 5 mM de EDTA, 5 mM de vanadato de Na+ e 2 mM de pirofosíato de Na+. Os lisados das células foram depois distribuídos numa placa ELISA
revestida de anticorpo anti-PDGF receptor (Genzyme). Antes da adição do lisado, as placas ELISA foram revestidas com 0.5 mg de anticorpo/alvéolo em 150 ml de PBS por 18 horas a 4°C. O lisado foi incubado nas placas revestidas durante 1 hora e depois lavado quatro vezes em TB ST (35 mM Tris-HCl de pH 7,0 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100). Adicionou-se anticorpo antifosfotirosina (100 ml em PBS) e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. Os alvéolos foram então lavados quatro vezes em TBST, a cada alvéolo juntou-se um anticorpo secundário conjugado com POD (TAGO) e os alvéolos tratados foram incubados por 30 minutos à temperatura ambiente. Os alvéolos foram depois lavados por quatro vezes TBST, e a cada um foi adicionada solução ABTS/H202 e depois incubados durante dois minutos. Mediu-se então a absorvância em 410 nm. A citotoxicidade do A10 foi igualmente determinada. As células foram colocadas como descrito acima. No seguimento da incubação com o fármaco, a sobrevivência celular foi medida por doseamento MTT como descrito por Mossman, J. Immunol. Métodos 65:55-63 (1983); Decker e Lohmann-Matthes, J. Immunol. Métodos 115:61 (1988).
Os resultados são mostrados na Tabela IX. Os valores de IC50 (isto é a dose necessária para atingir 50% de inibição) foi determinada com 0 teste ELISA de despiste. Os valores de DL50 (isto é a dose do qual resulta 50% de toxicidade) foi determinada usando um teste MTT ou LDH.
Os valores de CI50 para inibir a fosforilação do receptor PDGF estimulado nas células de U1242 variam de 0,4 a > 500 mM. Tal como se vê na Tabela IX, 0 A10 inibiu a fosforilação do receptor PDGF estimulado. A inibição da fosforilação do receptor não foi devida a efeitos não específicos na viabilidade celular tal como mostrado pela elevada LD50. Assim 0 AIO é um bom candidato ao tratamento das doenças proliferativas pela inibição da actividade de PDGF-R. /
Tabela IX
Composto ELISA Citotoxicidade P-TYR LDH MTT UI 242 UI 242 UI 242 CI50 (mM) DL50 (mM) DL50 (mM) A10 65 > 500 700
Exemplo 4: AIO inibe a síntese do DNA PDGF-estimulado e a Progressão do Ciclo das Células.
Este exemplo ilustra a capacidade do AIO em inibir a síntese do DNA estimulada por PDGF-BB e a progressão do ciclo das células O efeito do AIO na síntese do DNA em células T98G na ausência ou presença de PDGF-BB foi determinado pela medição da incorporação de JH-timidina no DNA. A percentagem de células na fase S do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo.
As células foram cultivadas tal como descrito nos apêndices acima. As condições do ensaio foram essencialmente as descritas por Pollack e col., J. Neurocir. 73:106-112 (1990 ) com algumas modificações. As células (C6 de rato ou T98G humana) na fase logarítmica de crescimento foram transferidas para placas de 96 alvéolos na concentração de 2x104 células em 200 ml de meio MCDB contendo 2% de FBS. Depois de passar uma noite num período de aderência o meio foi substituído por meio de ensaio isento de soro (MCDB 105 com 5 mg/ml de insulina) e as células foram a incubar durante 18-24 horas.
Os estudos de síntese de DNA foram iniciados com a adição de 50 ng/ml de PDGF-BB sozinho ou em combinação com várias concentrações de A10. O efeito de base na incorporação de JH-timidina foi determinado na ausência de PDGF. As placas foram incubadas durante aproximadamente 18 horas a 37°C. A 3H-timidina (Amersham, 5 Ci/mmol) foi adicionada a cada célula de modo a obter uma concentração fmal.de 5 Ci/ml, as placas voltaram para incubar a 37°C, após 4 horas o meio foi removido e as placas foram postas no gelo. Cada célula foi lavada então duas vezes com 200 ml de
I 47 ,ί PBS arrefecido no gelo. A radioactividade retida no DNA foi separada da JH-timidi'na não incorporada por precipitação com 100 ml de TCA gelado por 10 min. Após duas lavagens com TCA arrefecido em gelo, o precipitado foi solubilizado (1% de SDS em 100 ml de Tris-base a 20mM) e transferido para os frascos de contagem de cintilação liquida. Seis ml de cocktail (Ready Safe, Beckman) foi adicionado e a radioactividade quantificada num contador de cintilação liquida Beckman modelo LS6000 SC. A10 faz diminuir a síntese de DNA estimulada por PDGF em ambos os tipos de células, contudo foi observado um efeito maior em células de glioblastoma T98G humanas do que em células C6 de glioma de ratos. Para confirmar estes resultados, foi examinado o efeito do A10 no PDGF-estimulado entrado no ciclo da célula em fase S. Foi parado o crescimento (por privação de soro) das células NIH3T3, preparadas para sobre-expressar o receptor PDGF-b seguido de tratamento com ligante PDGF na presença ou ausência de A10. As células foram analisadas no teor de DNA por citometria de fluxo. Os resultados destas análises estão resumidos na Fig. 2. O tratamento com PDGF resultou num aumento significativo de células a residir na fase S (62%) comparado com o número de células não tratadas com PDGF (11%). Contudo, as células tratadas com A10 mostraram uma diminuição, da dose de dependência, do número de células progredindo na fase S do ciclo, da célula em resposta ao PDGF, indicando que a mitose estimulada por PDGF- foi bloqueada pelo A10.
Estes resultados contrastam com os resultados de uma experiência semelhante na qual o A10 numa concentração de 100 mM não foi capaz de inibir a mitose das células NIH3T3 estimuladas pelo EGF, sobre-expressando o receptor EGF humano (Figura 2). Estes resultados confirmam a selectividade do A10 para a sinalização mediada pelo PDGF.
Exemplo 5: Eficácia In vitro A eficácia do A10 como inibidor directo de crescimento foi determinada na linha de células tumorais, e tumores primários isolados de doentes. Os efeitos do A10 na linha de células tumorais foram determinados expondo as células a uma escala de concentrações do fármaco e quantificando a densidade das células após 4 dias seguindo f os procedimentos descritos no Apêndice 3. A Tabela XI fornece os resultados dos testes das diferentes linhas celulares.
Tabela XI
Efeitos do AIO sobre o Crescimento de Vários Tipos de Tumores
Tipo de tumor Linhagem celular IC50 (μΜ)
Glioma SF763T 0,8 SF763T 3 UI 242 19 A172 32 T98G 62 U87MG 78 SF767 87 SF763 110 U373MG 115 U118MG 150 UI240 250 U138MG >400
Ovário SKOV3T 40 PA/1 40 SKOV3 > 100
Ovcar3 > 100
Mama BT474 > 100
Tipo de tumor Linhagem celular IC50 ( μΜ ) MCF77HER2 116 MD A MB 468 150 T47D 195 MDAMB 361 200 MCF7 288 ZR75-30 300 ZR75-1 355 HBL100 >400 BT549 > 400 SKBR3 > 400
Pulmão Calu-6 70 A549 118
Calu-3 > 400
Próstata PC3 46 DU145 > 100
Melanoma A375 25 C81-61 40
Colon Colo 320 DM 34
Epidermóide A431 34
Leucemia K562 26
Os valores de CI50 para AIO variam de 0.8 μΜ até > 400 μΜ.
Foram testados in vitro os efeitos de AIO sobre crescimento de células de tumor primário isoladas de seis doentes com glioblastoma multiforme (GBM) e seis doentes com carcinoma do ovário. Foram recolhidas amostras em doentes não tratados previamente e com diagnóstico recente e avaliados como descrito no exemplo 13, Apêndice 3.
Foi observada para ambos os tumores uma correlação positiva entre a inibição do crescimento do tumor por AIO e a expressão PDGF-R. Quando a concentração de AIO aumentou (de 0 a 400 mM) diminuiu o crescimento das células tumorais para ambos os tumores. A inibição do crescimento era dependente da dose para ambos os tipos de tumor e variou entre as células tumorais. Os valores de CI50 variaram de 39 μΜ a 198 μΜ para os tumores GBM e de 20 mM A 140 mM para os tumores do ovário.
Exemplo 6: Estudos de eficácia In vivo Usando A10 e BI 1
Este exemplo resume várias experiências ilustrando a capacidade do A10 em inibir 0 crescimento de diferentes tumores in vivo. A primeira série de experiências está orientada para os efeitos das diferentes formulações e regimes de tratamento. A segunda série de experiências observa os efeitos do A10 numa variedade de diferentes tumores.
Diferentes Formulações e Regimes de Tratamento
As células C6 e SKOV-3 (T) cresceram em cultura, tal como descrito acima em “crescimento da célula” e foram implantadas no flanco posterior de um ratinho fêmea Balb/c nu/nu na concentração de 3x106 células (para a experiência C6), ou na de lxlO7 células (para as experiências de SKOV-3) em 100 ml de PBS no dia 0. As células humanas do glioblastoma U87MG, UI 18Mg ou U373MG obtidas a partir de ATCC ou A4312 foram também implantadas em ratinhos atímicos. Tanto aos ratinhos com tumores implantados, como aos sem tumores implantados foi administrado A10 por injecção intraperitoneal no volume de 50 ml de DMSO, 100 ml de PBTE:D5W ou 100 ml de PBTE começando no dia 1, salvo outra indicação. Os tumores foram medidos 50 \ usando um compasso com um nónio e o volume do tumor foi calculado através do produto do comprimento x largura x altura.
Num dos conjuntos de experiências os ratinhos foram implantados com A431, células C6 de glioma de rato, células de tumores do ovário SKVO-3 (T) e tratados com 15 mg/Kg/dia de AIO (DMSO). O crescimento dos tumores progrediu logaritmicamente nos não-tratados e nos de controlo com DMSO. Em contraste, o crescimento dos tumores progrediu só ligeiramente (por exemplo uma inibição maior do que 90% no crescimento dos tumores após 20 dias quando comparado com o do controle) em animais tratados com AIO e com implantes de células C6 de glioma de rato ou células de tumor do ovário SKVO-3 (T). Ο AIO teve pequeno efeito no crescimento do tumor A431 (por exemplo não mais de 25%). O crescimento tumoral em ratinhos implantados com células C6 de glioma de rato foi inibido com 15 mg/Kg/dia de Bll (DMSO) na mesma extensão que ratinhos implantados com 15 mg/Kg/dia de AIO (DMSO).
Numa outra série de experiências foram tratados com AIO ratinhos implantados com células C6 de glioma. A Tabela XII resume a capacidade do AIO para inibir células C6 de glioma de rato em ratinhos atímicos seguindo diferentes regimes de tratamento. A percentagem de inibição calcula-se dividindo o tamanho do tumor proveniente de animais tratados com AIO, pelo tamanho do tumor de animais tratados com o meio de controle. Os diferentes regimes de tratamento resultaram na inibição de 51 % a mais de 95%.
Tabela XII
Estudos de Regime de Dosagem de AIO Dose Regime % de Inibição 20 mg/Kg (PBTE:D5W) diário > 95% 20 mg/Kg (DMSO) 2 dias 77% 20 mg/Kg (DMSO) 4 dias 60% 30 mg/Kg (DMSO) 2 dias 91% 30 mg/Kg (DMSO) 3 dias 87% 40 mg/Kg (PBTE) 2 dias > 95% 60 mg/Kg (PBTE) Semanal 51% 100 mg/Kg (PBTE) Semanal 63%
Em outra série de experiências foi observado o efeito de diferentes regimes de dosagens de AIO em células C6 de glioma. O AIO foi administrado IP em doses diferentes usando regimes diferentes começando um dia após implantação. A dose total de AIO administrada aos animais foi comparada com a percentagem de inibição. Este estudo mostrou que doses elevadas de AIO administradas com menor frequência possuem eficácia antitumoral equivalente aquela que é verificada com doses mais baixas administradas diariamente, desde que a dose total administrada seja igual. Por exemplo, pode ser atingida 95% de inibição do crescimento tumoral pela administração de AIO a ratinhos a 20 mg/Kg todos os dias, 40 mg/Kg cada dois dias, ou 80 mg/Kg cada quatro dias. As células C6 (3 x 106 células) foram implantadas SC nos flancos traseiros de ratinhos BALB/c nu/nu.
Numa outra série de experiências foi determinado o efeito de diferentes doses de AIO em glioblastoma. A tabela XIII apresenta os valores ilustrando a capacidade do AIO em inibir células de glioblastoma in vivo.
Tabela XIII
Linha de células Dose (mg/Kg) % de Inibição U87 5 52 10 58 15 66 20 92 UI 18 15 57 U373 15 54 SF763T 20 89 SF767T 20 70 A percentagem de inibição refere-sè ao tamanho do tumor em animais tratados versus tamanho do tumor em animais não tratados. A Tabela XIV compara a eficácia de diferentes formulações de AIO in vivo (ratinhos implantados com células C6). Formulações de PBTE, PBTE:D5W e DMSO mostraram equivalência na inibição de crescimento tumoral in vivo.
Tabela XIV
Eficácia em função de formulação Dose Formulação % de Inibição 15 mg/Kg/dia DMSO 90% 20 mg/Kg/dia DMSO 95% 15 mg/Kg/dia PBTE 92% 20 mg/Kg/dia PBTE > 95% 40 mg/Kg/ 2dias PBTE > 95% 20 mg/Kg PBTE:D5W > 95% O efeito do AIO na mortalidade animal, usando formulações de DMSO, PBTE, ou PBTE:D5W é apresentado na Tabela XV (ratinhos implantados com células C6). As formulações PBTE:D5W reduziram significativamente a taxa de mortalidade comparadas com formulações DMSO e PBTE.
Tabela XV
Efeitos do AIO sobre mortalidade
Dose Tratamentos Mortalidade N 20 mg/Kg/dia (DMSO) 21 54% 26 20 mg/Kg/dia (PBTE:D5W) 27-100 0% 80 25 mg/Kg/dia (PBTE:D5W) 67 0% 8 20 mg/Kg/dia (PBTE) 20-48 8% 12 30 mg/Kg/dia (PBTE) 48 50% 4 40 mg/Kg/dia (PBTE) 48 75% 4
Inibição de Diferentes Tipos de Tumor por AIO.
Esta secção descreve experiências que comparam a capacidade de AIO inibir o crescimento de diferentes tipos de tumores. Num primeiro conjunto de experiências, a capacidade de AIO inibir células tumorais do ovário, melanoma, próstata, pulmão e mama, estabeleceu-se quando xenoenxertos SC foram examinados usando ao procedimentos descritos nos apêndices. Num segundo conjunto de experiências, os efeitos do AIO no crescimento de células leucémicas murínicos num modelo sintético, foram testadas usando o procedimento descrito nos apêndices acima mencionados. A Tabela XVI resume os resultados dos estudos usando xenoenxertos SC. Em doses variando entre 12 e 20 mg/Kg/dia, AIO inibe efectivamente o crescimento de gliomas, SKOV3T (ovário humano), PA-1 (ovário humano), A375 (melanoma humano), PC-3 (próstata humana), Calu-6 (pulmão humano), e DIB e L1210 (leucemias de murino). Contudo AIO falhou significativamente na inibição do crescimento dos xenoenxertos de A549 (pulmão humano), de MCF7 (mama humana) e de A431 (epidermoide humano). (
Tabela XVI
Efeito do AIO sobre o crescimento Tumoral
Tipo de Tumor Linha Celular Estirpe Dose Mg/Kg/dia % de Inibição (dia) ** P < * * * glioma C6* nu/nu 20 >95 (21) 0,00001 C6* nu/nu 20 84(18) 0,00001 9L* nu/nu 20 83 (20) 0,00001 U87MG nu/nu 15 75 (28) 0,0092 U118T nu/nu 15 57 (47) 0,0027 U373MG nu/nu 15 54 (37) 0,0477 SF763T nu/nu 20 85 (22) 0,00001 SF767T nu/nu 20 70 (22) 0,00001 Ovárico SKOV3T nu/nu 15 94 (21) 0,0014 PA-1 nu/nu 20 53 (36) 0,04 Melanoma A375 nu/nu 20 53 (31) 0,03 A375 SCID 11 15 35(31) 0,002 Próstata PC-3 nu/nu 20 71 (45) 0,01 PC-3 SCID" 12 47 (36) 0,001 Pulmão Calu-6 nu/nu 20 64 (28) 0,0001 A549 SCID ^ 15 19 (48) NS Leucemia DIB* DBA/2 20 95 (22) 0,00001 L1210* DBA/2 20 75 (18) 0,04 Epidérmico A431 nu/nu 15 40(15) SS Mamário MCF7 SÕD1 15 8(27) ss
Tabela XVI. Células tumorais foram implantadas SC nas estirpes indicadas de ratinhos. Foi iniciado o tratamento diário com o veículo ou com AIO no dia a seguir do implante, com as seguintes excepções: | = dia 4, ¥ = dia 9, £ = dia 15, SI = dia 29, J = dia 8. *D1B e L1210 são células tumorais de murino, C6 e 9L são células tumorais de rato, todas as outras são células tumorais humanas. ** Os resultados são apresentados como sendo a percentagem de inibição do crescimento do tumor no dia indicado quando comparado / ( com o controle do veículo; n = 8 a 10 ratinhos/grupo excepto DIB e L1210 onde n = 4 ratinhos/grupo. *** Valores P foram calculados pelo t-teste de Student SS = sem significado.
No segundo conjunto de experências, foi detectado que ο AIO aumentava significativamente a sobrevivência dos animais portadores do xenoenxerto IP SKOV3T e dos ratinhos portadores do isoenxerto 7DT1. Na primeira experiência as células SKOV3T (2x106) foram implantadas na cavidade IP de ratinhos BALB/c, nu/nu. AIO foi administrado IP em 50 μΐ de DMSO na posologia de 15 mg/Kg/dia durante 21 dias, começando no dia seguinte à implantação, sendo monitorizada a sobrevivência dos ratinhos (8 animais por tratamento e grupo de controle). Todos os animais no grupo de controle morreram ao fim de 27 dias, enquanto que um dos animais tratados com AIO morreu ao fim de 28 dias e 40% dos restantes estavam vivos depois dos 32 dias.
Numa outra experiência, as células 7TD1 (hibridoma de células B) foram implantadas IP em ratinhos C57BL/6 imunocompetentes singénicos, tendo sido tratados durante 30 dias com A10 na posologia de 15 mg/Kg/dia (8 animais por tratamento e grupo de controle). A10 foi administrado IP em 50 μΐ de DMSO um dia após a implantação. A dosagem terminou no dia 30, e a sobrevivência dos ratinhos foi observada por mais 50 dias. Todos os animais do grupo de controle morreram por volta do dia 9, enquanto que 3 dos 8 animais do grupo com tratamento sobreviveu para além dos 80 dias.
Exemplo 7 : Cancros Caracterizados por uma Inadequada Actividade do PDGF-R Este exemplo ilustra a capacidade que ο A10 tem para inibir os cancros caracterizados por terem uma inadequada actividade do PDGF-R, tendo, no entanto, pouco ou nenhum efeito nos que não se caracterizam por este motivo. A expressão PDGF-R foi quantificada através do teste de mancha de Western. O ensaio de SRB calcula o crescimento celular pela determinação da proteína total da célula usando a Sulforodamina-B (Skehan, T e col, J. Natl Câncer Inst. 82:1107-1112 - 1990 ). O ensaio em Agar mole (EAM) foi realizado semeando células de colónias densas numa camada base de meio de agar semisólido na qual foram quantificadas as colónias em número e tamanho, ao fim de duas ou três semanas através dum contador de colónias
tumorais Omnicon 3800 automatizado. Os valores SRB e EAM são expressos em CI50 em mM. A inibição in vivo foi determinada em ratinhos atímicos xenoenxertados. Os resultados são mostrados na Tabela XVII.
Tabela XVII EXPRESSÃO DO RECEPTOR vs. INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO Linha de células Expressão de PDGF-R SRB SAA In vivo C6 +-r 0,3 0,4 95% SF767 - 100 ND 18% SF767T +-Γ Λ 0,5-2 70% SF763 - >100 ND 35% SF763T ++ ND ND 89% SKOV-3 - >100 6,3 ND SKOV-3T -f+ 50 0,3 95%
Tal como se viu na Tabela XVII a inibição do crescimento é mais forte em células que expressam elevados níveis de PDGF-R, estabelecendo uma clara ligação entre a actividade do receptor e a proliferação de células cancerosas.
Exemplo 8: Inibição In vivo Post Implante usando AIO
Este exemplo descreve os efeitos do AIO quando administrado a ratinhos um número de dias após a implantação de cancro. Numa experiência, ratinhos SCID contendo linhas de células prostáticas PC-3 foram tratados com AIO com início 15 dias após o transplante do tumor. O tratamento semanal compreendeu 12mg/Kg/dia de AIO (PBTE:D5W) durante cinco dias e dois dias sem tratamento. Os ratinhos foram tratados durante três semanas. Numa outra experiência os ratinhos que continham melanoma A375 foram tratados da mesma forma que os implantados com PC-3 excepto o ter sido usado AIO a 15 mg/Kg/dia e 0 tratamento começou 9 dias após o implante do tumor.
Em ambos os casos, o crescimento tumoral foi inibido pelo AIO. O crescimento do tumor PC-3 foi inibido em cerca de 50% após três semanas. Assim, este exemplo para ι ι
além disso ilustra a utilidade do AIO em inibir o crescimento tumoral mostrando a sua capacidade em inibir tumores que tiniram estado a crescer num hospedeiro antes do tratamento (Cf. Exemplo 6 onde o tratamento do tumor começou um dia após o transplante).
Exemplo 9: Efeito do AIO sobre o Crescimento do Tumor Cerebral O efeito do AIO sobre o crescimento tumoral em modelos de tumor cerebral foi examinado numa série de experiências.
Em duas experiências separadas foi administrado o AIO a ratinhos atímicos a seguir à implantação cerebral (IC) de células C6, a média de tempo de sobrevivência dos animais tratados com AIO foi signifícativamente aumentada comparada com os controlos. Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 3.
Noutra experiência, na qual o AIO foi administrado a ratinhos atímicos seguido de implantação IC de células U87MG, a média de animais sobreviventes tratados com AIO foi de 65 dias comparado com a média de 60 dias de sobrevivência em animais controle, um aumento que não foi significativo. (p=0,15). A eficácia do AIO foi igualmente testada num modelo IC em ratos atímicas. Tal como mostrado na Figura 4. ο AIO teve um ligeiro mas significativo efeito na sobrevivência de ratos atímicos a seguir a uma implantação IC de células tumorais C6.
Exemplo 10: Estudos de Imunologia
Foram examinados os efeitos do AIO em vários parâmetros de função imune normal, incluindo proliferação de linfócitos, geração de células de efeito citotóxico, produção de linfocina e secreção de imunoglobulina. Estes estudos envolveram tratamento in vivo de ratos e ratinhos com AIO, seguidos de análises in vitro da função imune. São descritos no Apêndice 5, um resumo detalhado dos métodos usados nos estudos imunológicos. 58
Foram tratados ratinhos Naive BALB/c com 15 mg/Kg/dia de AIO ou veículo (PBTE:D5W) durante 7 e 21 dias. Os animais foram sacrificados e as células do baço foram testadas in vitro nas respostas a ConA (um mitogénio da célula T), LPS (mitogénio de célula-B independente de célula T), e aloantigénios (células de baço C3H/HeJ) como descritas no Apêndice 5. As IL-2, IL-6, teor de Ig e proliferação celular foram medidos após 48 h (mitogénios) ou 72 h (aloantigénios). Os resultados foram resumidos na Tabela XVIII.
Tabela XVIII
Efeitos do AIO na Função de Imunidade Normal em Ratinhos Naive
Estímulo Produção de IL-2 Produção de IL-6 Produção de Ig Levantamento de Ή-timidina d7 d21 d7 d21 d7 d21 d7 d21 ConA 0 0 ++ 0 0 0 0 0 LPS 0 0 0 0 T +/- 0 0 Alio 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabela XVIII. Foram tratados ratinhos do sexo feminino BALB/c com AIO durante 7 ã 21 dias. As células do baço foram removidas e estimulados in vitro com mitogénios ou aloantigénios. A proliferação celular, produção de citocinas e a produção de Ig foram ensaiadas como descritos nos apêndices 5. Os resultados são apresentados fazendo a comparação entre os animais tratados com o fármaco e os tratados com o veículo (PBTE:D5W). 0 = sem alteração; +/- = aumento ligeiro em alguns animais; + = aumento moderado em todos os animais; ++ = aumento forte em todos os animais.
Dois parâmetros parecem ser afectados pelo tratamento com AIO: a produção de IL6 induzida pela Con-A era mais alta nos animais tratados com AIO do que no grupo controle ao dia 7, mas esta diferença desaparecia ao dia 21. A produção de Ig induzida pelo LPS era ligeiramente mais alta no grupo AIO do que no controle em 7 dias de tratamento seguido, mas esta diferença não era tão evidente em 3 ou 4 ratinhos tratados com o fármaco durante 21 dias. Estes valores indicam que os efeitos de AIO na produção de IL6 e Ig pelos esplenocitos foram transitórios mesmo com administração continua de AIO.
Efeitos da Administração in vivo de AIO sobre a Função Imunológica de Ratinhos durante a Imunização Primária O efeito de AIO causado em ratinhos que respondem a uma imunização primária activa foi também examinado. Ratinhos BALB/c foram imunizados SC com 50 pg de hemocianina de lapa (KLH) suspensa em adjuvante de Freund completo (CFA); ratinhos controle foram sujeitos a uma imunização simulada com uma emulsão de tampão de fosfato salino (PBS) em CFA. Começando no dia 1, os ratinhos foram divididos em três grupos de tratamento: não tratados, só com o veículo (PBTE:D5W) ou tratados com 20 mg/kg/dia de AIO. No dia 14, todos os ratinhos foram sacrificados, e as células do baço foram testadas. Adicionalmente, as respostas imunes a KLH e ao toxóide do tétano foram medidos como se descreve no Apêndice 5. A produção de citocinas (IL-2 e IL-6) pelos esplenocitos não foi significativamente afectada pelo veículo isolado ou com o fármaco como se resume na tabela XIX. Contudo, o tratamento com AIO foi associado com uma ligeira inibição da resposta proliferativa das células do baço depois da reestimulação com o antigénio imunizante (KLH) in vitro. Tabela XIX. Efeitos semelhantes foram detectados quando as células do baço foram estimuladas com LPS ou células alogénicas (Tabela XIX).
Tabela XIX
Efeitos de AIO na Função Imune Normal de Ratinhos Respondendo a uma Imunização Primária.
Estímulo Produção de IL-2 Produção de IL-6 Produção de Ig Levantamento de 3H KLH 0 0 0 - ConA 0 0 0 0 LPS 0 0 0 - Alio 0 0 0 -
Tabela XIX. Os ratinhos BALB/c foram imunizados com KLH, depois divididos em três grupos de tratamento; a dosagem começou no dia 1 e continuou até ao dia 14 pós-imunização. As células do baço de ratinhos não tratados, tratados com o veículo ou tratados com AIO, assim como os não imunizados do grupo controle (normal) foram cultivadas com os mitogénios ou aloantigenios indicados. A proliferação celular, a produção de citoquinas e a produção de imunoglobulinas foram testadas conforme a descrição no apêndice 5. Os resultados são apresentados fazendo a comparação das respostas dos animais tratados com fármaco com as do grupo de controle tratado com veículo (PBTE:D5W). 0 = sem alteração; - = diminuição ligeira em todos os animais.
Efeitos da Administração in vivo de AIO sobre a Função Imune em Ratinhos Portadores de Tumores
Os ratinhos BALB/c receberam SC implantes de células de fibrossarcoma WEHI-164.13 singénicas no dia 0. No dia 1, os ratinhos foram divididos em três grupos de tratamento: não tratados, tratamento diário só com veículo (PBTE.D5W), ou tratamento diário com 20 mg/Kg/dia de AIO. No dia 17, os animais foram sacrificados e os seus baços foram removidos. As células do baço foram testadas in vitro para respostas a aloantigénios e mitogénio. O tratamento com AIO não afectou a proliferação, a secreção de citocinas ou a de imunoglobulinas das células do baço estimuladas com aloantigénios ou mitogénios com está resumido na Tabela XX.
As células do baço foram também testadas relativamente a produção dos linfócitos T citotóxicos específicos a WEHI-164.13 (CTL) em cultura de células tumorais de mistura de linfócitos. As células do baço de animais não tratados portadores de tumor manifestaram uma vigorosa resposta de CTL (44% de lise específica a E:T=50:1). A resposta foi inibida quase completamente em animais que receberam só o veículo (13% de lise específica). O veículo tem um conteúdo em etanol de -15% e o etanol é conhecido pelo efeito transitório sobre a produção e a actividade dos linfócitos CTL (Walia, e col., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 192:177-200,1989). O tratamento com AIO aumentou a resposta CTL (78% de lise específica) comparada com a dos animais tratados com o veículo; a resposta CTL das células do baço dos 61
/ ratinhos tratados com AIO foi também mais alta do que a dos animais de controle (não tratados . Portanto, isto mostra que em ratinhos modelo imunocompetentes, a dosagem com A10 supera o efeito inibitório do veículo na produção de CTL.
Tabela XX
Efeitos do AIO na Função Imune Normal em Ratinhos Portadores de Tumor Primário
| Estímulo Produção Produção Produção Actividade de I.L-2 de IL-6 de Ig de CTL Tumor 0 0 0 ++ ConA 0 0 0 NT LPS 0 0 0 NT Alio 0 0 0 NT
Tabela XX. Os ratinhos portadores de tumores foram tratados com veículo ou AIO, ou deixados sem tratamento, durante 17 dias pós-implantação. Os ratinhos foram sacrificados e as células do baço cultivadas com os mitogenios, os aloantigenios e as células tumorais WEHI-164.13 tratadas com mitomicina C, indicados. A proliferação celular, a produção de citoquinas, a produção de imunoglobulinas e actividade de CTL foram testadas como se descreve no apêndice 5. Os resultados são apresentados comparando as respostas dos animais tratados com as do controle tratados só com o veículo (PBTE:D5W). 0 = sem alteração; ++ = forte aumento em todos os animais; NT = não testado.
Efeitos da Administração in vivo de AIO na Função Imune de Ratos Ratos Wistar receberam implantes SC de células C6 no dia 0. Começando no dia 1, e depois disso diariamente, os ratos receberam doses IP do veículo (PBTE:D5W) ou 8,4mg/Kg/dia de AIO (equivalente a 20 mg/Kg/dia de AIO nos ratinhos). O grupo controle não foi tratado depois da implantação do tumor. No dia 21, os animais foram sacrificados e o os baços removidos para análises in vitro. Os esplenocitos foram estimulados com ConA, LPS, e aloantigénio (células de baço do rato DA) como nos estudos murínicos. Η
/
Depois dos parâmetros medidos, só a proliferação celular na resposta de linfócitos mistos singénicos (MLR) pareceu ser afectada pelo tratamento com AIO como está sumarizado na tabela XXI. A MLR singénica dos não tratados, tratados com veículo ou dos animais portadores de tumores foi muito mais alta que a dos animais não portadores de tumores. Esta resposta proliferativa foi reduzida num dos quatro animais portadores de tumor tratados com AIO para um nível semelhante ao dos controles dos não portadores de tumores. A resposta alogénica não foi reduzida.
As células do baço dos ratos Wistar foram também testadas para a produção de CTL específico C6 em MLTC e os resultados resumidos na tabela XXI. As células do baço de animais não tratados portadores de tumor mostrou uma forte resposta de CTL (35% de lise específica com E:T= 100:1) enquanto que as células dos ratos controle não portadores de tumor mostrou uma resposta fraca (13% de lise específica com E:T= 100:1). À semelhança do que aconteceu nos estudos com ratinhos BALB/c, o veículo inibiu a produção de CTL ao T dia de cultura. Contudo em contraste com os estudos de murinos, ο AIO não superou o efeito inibitório do veículo em ratos imunocompetentes.
Tabela XXI
Efeitos do AIO na Função Imune Normal de Ratos Portadores dum Tumor Primário I Estímulo Produção Produção Levantamento Actividade j de IL-2 de IL-6 de JH-timídina de CTL ; Tumor 0 0 0 ++ ConA 0 0 0 NT LPS 0 0 0 NT Syn 0 0 +/- NT Alio 0 0 0 NT |
Tabela XXI. Ratos Wistar receberam implantes SC de células C6, seguidos de tratamento diário com o veículo ou com AIO; animais portadores de tumor, animais normais não tratados, animais não portadores de tumor foram incluídos neste estudo. No 63
dia 21, os animais foram sacrificados e as suas células do baço foram estimuladas c&m os mitogénios indicados (ConA e LPS), células tumorais C6 tratadas com mitomicina C. singenicas (Sin) ou alogenicas (Alo). A proliferação celular, a produção de citoquinas e actividade CTL foram testadas como se descreveu no apêndice 5. Os resultados são apresentados comparando as respostas dos animais tratados com o fármaco e dos do controle que foram tratados com o veículo (PBTE:D5W). 0 = sem alteração; +/- = diminuição em alguns animais tratados com fármaco para níveis detectados em animais normais (não portadores de tumor, não tratados); NT = não testado.
Os resultados destes estudos imunológicos indicam que AIO não afecta negativamente a resposta imune normal de roedores imunocompetentes ou imunodeficientes durante ou a seguir à dosagem in vivo. Além disso, a eficácia do fármaco quando testado contra a linhagem das células tumorais de murino em hospedeiros imunocompe-tentes sinérgicos indica que AIO não prejudica a imunidade anti tumoral.
Exemplo 11: Farmacologia do AIO Várias propriedades farmacológicas do AIO foram estudadas em ratinhos e ratos incluindo o seu metabolismo e a sua semivida no plasma e nos tecidos cerebrais. Uma descrição detalhada dos métodos utilizados nos estudos farmacológicos do AIO encontram-se no Apêndice 6. Em suma, o perfil farmacocinético do AIO foi estudado em conjunto com estudos de toxicidade formal do composto em ratos e macacos.
Metabolismo do AIO O anel de isoxazol do AIO sofre um rearranjo intramolecular para 2-ciano-3-hidroxi-N-[4-(trifluorometil)fenil]-2-butenamida (B11). O metabolismo de AIO em Bll foi investigado ex vivo em plasma fresco heparinizado de humanos ou ratos. A conversão de AIO para Bll foi monitorizada usando HPLC de fase reversível como descrito no Apêndice 6. A 25°C (temperatura ambiente), o AIO sofreu conversão completa para Bll durante 21 h em plasma humano. Uma experiência semelhante foi feita utilizando plasma de rato com incubação a 37°C; O AIO foi completamente convertido em Bll após uma incubação de 2 horas. A conversão de AIO em BI 1 não ocorre em plasma de seres humanos ou de ratos, inactivado pelo calor (15 min a 60°C). Adicionalmente
ambos o Bll e o AIO foram incubados juntos com plasma humano fresco e as concentrações monitorizadas. Não foi detectado AIO após 21 li; apenas o Bll estava presente. O metabolito, Bll, parece ser equipotente ao AIO em ensaios de crescimento in vitro bem como ser equipotente na inibição da síntese do DNA estimulado por PDGF e na progressão do ciclo da célula estimulada por PDGF. O Bll é também equipotente na inibição do crescimento de tumores C6 in vivo. Estes resultados sugerem que o Bll é um metabolito activo do AIO. O uso do AIO no tratamento de perturbações proliferativas da célula é preferido porque é mais conveniente do que o B11 para a formulação duma solução IV.
Farmacocinéticas do AIO e BI 1 in vivo A farmacocinética do AIO e seu metabolito (Bll) foram investigadas in vivo após administração intraperitoneal (IP) de AIO a ratinhos e ratos. Quando ratinhos atímicos (BALB/c, nu/nu, fêmeas) receberam AIO (120 mg/m2, 40 mg/Kg), o fármaco foi convertido em Bll 3 h depois da dose, enquanto a concentração do composto aparentado estava abaixo dos limites de detecção na circulação sistémica. O Bll foi detectado no plasma por mais de 48 h e teve uma t lA de 16 h e uma Tmax de 3h. A área sob a curva das concentrações tempos (AUC) para o Bll foi calculada ser de 2773 μg.h/ml. O débito de libertação (CL) foi calculado ser de 0,29 ml/h assumindo 100% de biodisponibilidade e a média do tempo de entrada zero. O volume de distribuição (VD) foi calculado ser de 6,7 ml. Nos cérebros destes ratinhos, o BI 1 exibiu uma t Ά de 14 h e uma Tmax de 3 h.
Farmacocinética do AIO e BI 1 em Ratinhos e Ratos após Administração IP
Ratinhos atímicos Ratinhos BALB/c Ratos Wistar 40 mg/kg 120 mg/m2 dose única 75 mg/kg 225 mg/m2 dose única 75 mg/kg 225 mg/m2 1 semana x 4 40 mg/kg 120 mg/m2 dose única 80 mg/kg 560 mg/m2 dose única Plasma T /2 (h) BI 1 16 15,5 16,9 14,9 6 A10 <1,5 < 1 < 1 ND <2 : Tinax (h) BI 1 -> J J 6 A10 <0,5 ND ND ND <2 Cmax BI 1 111 T 14 249 T 26 190 T 12 208 T 34 260 j A10 ND ND ND ND 5,0 | ! AUC μg.h/ml 2773 5660 5012 4444 6417 CL ML/h 0,29 0,27 0,30 0,18 0,26 VD (ml) 6,7 6,4 8,2 3,1 5,3 Cérebro T % (h) BI 1 14 NT NT 2 6 A10 < 1,5 NT NT < 1 20 Tmax (h) BI 1 j NT NT 1 6 A10 1,0 NT NT LO 7
Tabela XXII. Ratinhos atímicos fêmea (BALB/c, nu/nu; quatro por grupo) foram tratados IP com AIO tal como indicado. Ratinhos BALB/c (fêmeas, quatro por grupo) foram tratados IP com 120 mg/m" (40 mg/kg) de AIO. Os ratos Wistar (fêmeas, uma por cada intervalo de tempo de ensaio) foram tratados IP com 560 mg/ m2 (80 mg/kg) de AIO. As amostras de cérebro e plasma foram preparadas e analisadas por HPLC tal como descrito no Apêndice 6. Todos os resultados foram calculados pelo método da padronização interna. NT = não testado, ND = não detectado. O perfil farmacocinético foi também determinado em ratinhos atímicos para calcular a dose de AIO na DLjo. A administração intraperitoneal de AIO na concentração de 225 Λ mg/ m (75 mg/kg) resultou na detecção de BI 1 no plasma por mais de 48 h (o último ponto analisado) com um t ‘Λ de 15,5 h e um T max de 3 h (Tabela XXII). A AUC foi calculada ser de 5660 μg.h/ml. A CL foi calculado ser de 0,27 ml/h, assumindo 100%
/' . O VD foi calculado ser 'de de biodisponibilidade e a média de tempo de entrada zero 6,4 ml. O perfil farmacocinético do AIO na LDio (75 mg/Kg) foi também estudado em ratinhos após quatro tratamentos IP dados uma vez cada 7 dias. O BI 1 foi detectado no plasma durante 48 h após a última dose e teve uma t /2 de 16,9 h e T max de 3 h (Tabela XXII). A AUC para Bll foi calculada ser de 5012 pg.h/ml. A CL foi calculado ser de 0,3 ml/h, assumindo 100% de biodisponibilidade e média de tempo de entrada zero. O VD foi calculado ser de 8,2 ml. O perfil farmacocinético do AIO foi determinado em ratinhos BALB/c. Os ratinhos BALB/c receberam uma dose única IP de AIO (120 mg/m2, 40 mg/Kg). O A10 foi completamente convertido em Bll e não foi detectado ao fim de 1 hora depois da administração do fármaco. Bll foi detectado no plasma para além de 48 horas (a última vez que foi analisado) e tinha um t 1/2 de 14,9 h. e um T max de 3 h com está resumido na Tabela XXII. A AUC foi calculada ser de 4444 pg.h /ml. O Cl foi calculado ser de 0,18 ml/hr, assumindo uma biodisponibilidade de 100% e a média do tempo de entrada zero. O VD foi calculado ser de 3,1 ml. Nos cérebros destes ratos, Bll mostrou um t /2 de 2 h e um T max de 1 h (Tabela XXII).
Quando os ratos (Wistar, fêmea) receberam uma dose única IP de A10 (560 mg/m2, 80 mg/Kg) o fármaco foi convertido em Bll ao fim de duas horas, o primeiro tempo de análise. Contudo, o A10 foi detectado para além de 8 h após a dose. Como se encontra resumido na Tabela XXII, o A10 tinha um t '/2 de < 2 h e um T max de < 2 h. O BI 1 foi detectado para além de 24 h após a dose, e tinha um t m de 6 h e um T max de 6 hr. A AUC foi calculada ser igual a 6417 pug.h /ml. O CL foi calculado ser de 0,26 ml/h, assumindo uma biodisponibilidade de 100% com um tempo de entrada de zero. O VD foi calculado ser de 5,3 ml. Nos cérebros destes ratos, Bll mostrou um t ‘/2 de 6 h e um T max de 6 h enquanto o A10 mostrou um t lA de 20 h e um T max de 7 h (Tabela XXII). 67
Níveis no plasma in vivo '
Os níveis de Bll no plasma in vivo foram determinados em ratinhos atímicos quer depois duma dose única quer depois de doses de AIO repetidas diariamente estando os resultados resumidos na Tabela XXII. Três horas (no T max) depois da administração da dose única de AIO (20 mg/Kg), a concentração de BI 1 foi determinada ser de 51,2 ± 7.3 pg/ml (limites 38,8 - 55,2 pg/ml) enquanto AIO não foi detectado. Os níveis estáveis de B11 no plasma foram também determinados em ratinhos atímicos depois de repetidas administrações (20 mg/Kg/dia) de AIO com 24 h de intervalo (8 administrações ). O nível estável máximo de Bll no plasma foi 79,7 ±11,2 pg /ml (limites 65,2 - 94,6 pg/ml), e o nível mínimo ou baixo foi 33,6 ± 7,3 pg/ml (limites 23,4 - 45,8 pg/ml). O nível de B11 no plasma depois de atingir a estabilidade ( nível máximo estável) foi 64% maior do que a seguir à dose única (Tabela XXIII).
Tabela XXIII Níveis de B11 no Plasma
Concentrações de BI 1 (pg/ml) Dosagem de A10 Dose única Dose múltipla % de aumento 20 mg/Kg 51,2 ±7,3 79,7 ± 11,2 64 40 mg/Kg 110,9 ± 15,3 161,1 ±27,8 69 ;
Tabela XXIII. Os níveis de Bll no plasma foram determinados a seguir a administrações diárias únicas ou múltiplas de 20 ou 40 mg/Kg/dia de AIO em ratinhos atímicos. Todos os resultados são a média de 4 animais. A concentração de B11 no plasma ao T max foi também determinada a seguir a uma dose única de 40 mg/Kg de A10. A concentração de BI 1 foi de 110,9 ± 15,3 pg/ml (limites 93,5 - 131,3 pg/ml) enquanto que ο A10 não foi detectado. Os níveis estáveis de BI 1 no plasma foram também determinados em ratinhos atímicos depois de repetidas administrações (40 mg/Kg) de A10 com 24 h de intervalo (6 administrações). O nível máximo estável de Bll foi 161,1 ± 27,8 pg/ml (limites 119,9 - 204,1 pg/ml) e o nível mínimo ou baixo foi 38,2 ± 21,7 pg/ml (limites 13,5 -66,9 pg/ml). O nível de plasma de B11 depois de atingir a estabilidade foi 69% maior do que a seguir ao das doses 68
únicas (Tabela XXIII). Estes resultados demonstram que Bll acumula no plasma depois de doses múltiplas diárias de AIO.
Além dos níveis de plasma, foram determinadas, no tecido cerebral, as concentrações de AIO e Bll, após a administração de AIO a ratos e ratinhos. Os resultados estão resumidos na Tabela XXIV. Os níveis de AIO e BI 1 diferiram entre ambas as espécies e estirpes. O nível mais elevado de Bll no cérebro foi detectado em ratinhos atímicos, seguido pelos ratinhos BALB/c e ratos Wistar . Duas e quatro horas após a dose, havia respectivamente 11 e 6,5 vezes mais Bll nos cérebros de ratinhos atímicos comparativamente com ratos Wistar. Duas horas após a dose, havia 2 vezes mais AIO nos cérebros de ratinhos atímicos quando comparados com os ratos Wistar. Quatro horas após a dose, aproximadamente, quantidades equivalentes de AIO foram detectadas nos cérebros de ratinhos atímicos por comparação com os ratos Wistar.
Tabela XXIV
Comparação de Níveis de AIO e BI 1 em Tecido Cerebral
Concentração de Bll e AIO em tecido cerebral (ng / mg) Ratinhos atímicos Ratinhos BALB/c Ratos Wistar Tempo Após a dose Bll AIO Bll AIO Bll AIO 2 h 21,9 6 12,7 19,9 6 13,5 3,5 6 2,8* 9,1 6 13,5* 1,9 6 1,5 8,9 6 4,8 4 h 21,3 6 19,3 1,8 6 1,6 10,7 6 3,7 3,8 6 2,9 3,3 6 1,5 2,1 6 3,2
Tabela XXIV. Os níveis de Bll e AIO no tecido cerebral foram determinados como descrito no Apêndice 6. * Determinado às 2,5 horas após a dose. n = 4 animais.
Estes estudos farmacológicos demonstram que o AIO é metabolisado em Bll tanto em ratinhos como em ratos. Além disso, o AIO e o Bll podem ser detectados tanto em plasma como em tecido cerebral. Contudo, parece haver uma diferença em ambos tanto nas farmacocinéticas como na distribuição do AIO e BI 1 no plasma e no cérebro entre as duas espécies examinadas.
Exemplo 12: Estudos Toxico lógicos Preliminares Usando AIO '
Os estudos toxicológicos preliminares do AIO incluíram o teste do efeito do AIO sobre as células do sangue, peso do corpo, determinações da LD50. Para determinar 0 efeito de potenciais medicações auxiliares na LD50 do AIO foram também realizadas experiências de combinação. Pode-se encontrar no Apêndice 7 uma descrição detalhada dos métodos utilizados. Os estudos farmacológicos e toxicológicos mostram que o AIO pode ser administrado a animais sob condição de que tem poucos ou nenhuns efeitos adversos no animal, em particular quando são usadas formulações com PBTE:D5W. Outras formulações convenientes podem ser obtidas por alguém, experimentado na técnica, usando este pedido como um guia.
Efeito do AIO em Células de Sangue
Muitas terapêuticas do cancro são citotóxicas por natureza e têm profundos efeitos nas células do sangue resultando em citopenia. Foram examinados os efeitos do AIO no número de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e na percentagem de linfócitos em células polimorfonucleares. O AIO na concentração de 15 mg/kg/dia não revela efeitos diferenciais no sangue por um período de 21 dias de libertação de fármaco em DMSO, PBTE ou PBTE:D5W (1:1). A libertação do fármaco em PBTE:D5W na concentração de 20 ou 25 mg/kg/dia não afecta 0 número de GV, GB ou percentagem de linfócitos:neutrófilos. Contudo, a libertação de fármaco em apenas PBTE na concentração de 30 mg/kg/dia mostrou um ligeiro decréscimo nos valores de GB após 2-3 semanas de tratamento. Animais tratados com 40mg/kg/dia mostraram ambos, anemia e leucopenia após várias semanas de tratamento quando lhes deram AIO em apenas PBTE. Não se observaram efeitos nas células do sangue quando se administrou 0 AIO em PBTE:D5W mesmo depois de 100 dias de tratamento.
Efeitos do AIO sobre o Peso Corporal
Foi observado durante um período de 100 dias, 0 efeito da administração diária de A10 (20 mg/kg/dia) sobre o peso corporal. Comparativamente com os controlos A10 teve um efeito inicial em ganho de peso. Contudo, após várias semanas, os animais ganharam 70 Λ » !*'. ·1 ' > -i peso a uma taxa semelhante à de animais não tratados ou tratados com o veículo. ;Ao longo do período de tratamento, não se observaram mortes. Além disso não houve efeitos nos diferenciais do sangue e não houve efeitos observáveis na histopatologia de órgãos principais, incluindo coração, fígado, pulmão, rins, baço, coluna, estômago, nódulos linfáticos mesentéricos, intestino delgado e grosso e pâncreas.
Determinação da DLsn A dose letal de AIO para 50% de animais (DL50) foi determinada tanto para ratinhos atímicos (BALB/c, nu/nu, fêmeas) como para ratinhos BALB/c (machos e fêmeas) usando um número de regimes doseados. Tal como mostrado na Tabela XXV, a DL50 do AIO varia entre 83 e 145 mg/kg.
Os efeitos do Dilantin~ (fenitoina sódica para injectável), um agente anti-convulsivante, e Decadron1 (fosfato de dexametasona sódica para injectável), um agente anti-inflamatório, na DL50 do AIO foram igualmente determinados (Tabela XXV). A DL50 para 0 AIO seguida de um pré-tratamento dos animais com Decadron1 ou Dilantin1 foi respectivamente de 94 e 144 mg/kg.
Tabela XXV
Determinação da DLsodo AIO nos Ratinhos
Dose / Regime Espécie, sexo LD50 (mg/kg) Dose simples Atímico f 145 Cada 4 dias x 4 Atímico f 75 Cada 7 dias x 4 Atímico f 100 Dose simples BALB/c, f 83 Dose simples BALB/c, m 107 Dose única com pré-tratamento de y Decadron^ BALB/c, f 94 Dose única com pré-tratamento de Dilantin2 BALB/c, f 144
Tabela XXV. Administrou-se Decadron2· a 1,5 mg/kg/dia por 7 dias antes da administração de uma dose única de AIO. Administrou-se Dilantin2· a 20 mg/kg/dia por 7 dias antes da administração de uma dose única de AIO. A LD5q foi calculada de um
lote de mortalidade em % versus dose (Iog M) usando uma equação logística de quatro parâmetros. f=fêmea, m=macho, n=5 animais por grupo.
Exemplo 13: Inibição de tumor ln vivo por um receptor PDGF-R Modificado Este exemplo ilustra o uso de ácidos nucleicos codificando um receptor PDGF-β truncado para inibir in vivo o crescimento de tumores. Foram infectadas células C6 de glioma de rato com retrovírus transportando um gene modificador para o receptor PDGF-β humano. Foram triados sete clones da selecção G418 para expressarem o receptor incompleto por manchamento de Western blot, com um anticorpo que reconhece o domínio extracelular do receptor humano mas que não tem reacção cruzada com o receptor de rato do tipo natural. Dois clones, HiMut.l e HiMut.2, expressam elevados níveis de uma proteína com o mesmo peso molecular previsto pora o receptor ao qual falta a maioria da região intracelular. Vários clones expressavam baixos níveis de receptor cortado; LoMut.l foi escolhido para futuros ensaios. O Himut. 1 expressava PDGF-R 8.3 vezes mais alto que o LoMut.l. O Himut.2 expressava PDGF-R 9.4 vezes mais alto que o LoMut.l. O isolamento e a caracterização dos clones que contêm os receptores modificados foram realizado como descrito abaixo.
Cultura de células. Todos os meios de cultura, como o soro bovino fetal (FBS) e os produtos químicos foram adquiridos da Gibco BRL. As células C6 de glioma de rato cresceram em meio de Hanfs F-10 suplementado com 5% de soro bovino fetal e 2mM de glutamina. As células COS foram cultivadas em 10% de soro bovino fetal e 2mM de glutamina em meio Eagle modificado com meio de Dulbecco (DMEM).
Expressão do receptor PDGF-β mutante. Um codão de interrupção foi introduzido no gene, por mutagénese direccionada ao local, para o receptor PDGF-β humano directamente a montante a partir do primeiro domínio da tirosina quinase. O gene mutante foi clonado, sob control, num vector da cópia do terminal do vírus do sarcoma murino (Muller, A.J., e col., Mol. Cell. Biol. 11:1785-1792, 1991). Quatro mg de cada um desse vector e do vector contendo os genes necessários para o acondicionamento do vírus retroviral (Muller, supra) foram cotransfectados para as células COS (2x105 células/placa de 60mm) pela precipitação de fosfato de cálcio. (Chen, C. A. e H. 72
Okayama, BioTech. 6:632-638. 1988). As células foram lavadas com PBS 'e realimentadas no dia seguinte e recolhidas em meio condicionado nos dias 4-6 após a transferência. As células C6 (2x103 células/placa de 60mm) foram infectadas com diluições do meio condicionado contendo 6mg/ml de Polibreno (Sigma). Dois dias mais tarde as células foram seleccionadas com 800mg/ml de G418 (Gibco) e as colónias retiradas quando se distinguiram. As células do controle vector foram preparadas pelo mesmo método mas com um vector com ausência de um gene segundo o LTR.
Co-imunoprecipitação de receptores incompletos e de tipo natural. As células controle do vector e as células que expressam altos níveis de receptor PDGF-β modificado (HiMut.l) foram semeadas cada uma delas com a concentração de 3x105 células/alvéolo em placas de 6 alvéolos. No dia seguinte, o meio foi mudado para 0,5 ml de FBS a 3% em cys-met DMEM (ICN) contendo lOOmCi/ml Tranj5S-label (ICN). As células foram incubadas a 37°C por 16h. Foram lavadas duas vezes com tampão ligante (0,1% de BSA, 10 mg/ml de CaCli-SP^O, 10 mg/ml de MgSCU. 7H2O, 10 mg/ml de aprotinina e 0,2 mM de PMSF em PBS), e foi adicionado a cada alvéolo 0,5 ml de tampão ligante ou 0,5 ml de PDGF-BB na concentração de 20 mg/ml (Collaborative Research Inc) em tampão ligante. As células foram incubadas a 4°C por 4 h, lavadas duas vezes com PBS e lisadas com 0,5ml de Triton X-100 a 1% em HNTG (20mM de HEPES (pH 7,5), 150 mM de NaCl, Triton X-100, 10% de glicerol, lOmg/ml de cada uma de aprotonina, de leupeptina e de pepstatina, e 0,2 mM de PMSF). O PDGF-BB foi incluído no tampão de lise das células que havia sido tratado com PDGF. Os lisados foram centrifugados a 100.000 xg durante 30 min a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos e preclarificados com Proteína agarose-A (Vector Laboratories). Foi adicionado SDS para uma concentração final de 0,1% a 2% em amostras tratadas com PDGF por cada linhagem de células.
Amostras em duplicado foram imunoprecipitadas quer com o anticorpo que reconhece o terminal C do receptor de rato do tipo nativo (receptor anti-PDGF-β UBI) quer com o receptor modificado humano (receptor anti-PDGF-β Genzyme). O IgG anti-ratinho de coelho foi usado como anticorpo secundário para as amostras incubadas com o anti-receptor Genzyme. Os complexos foram precipitados com Proteína agarose-A e lavados 73
5 vezes com Triton X-100 a 0,1% em HNTG. As proteínas foram separadas por electroforese em gel poliacrilamida-SDS, a 7,5% no gele, sob condições redutoras. Os geles foram fixados, tratados com Amplify (Amersham) e expostos a uma película de raios-X durante 3 dias.
Manchamento de Western. Cada linha de células foi colocada em múltiplos alvéolos a 5x105 células/alvéolo em placas de 6 alvéolos. No dia seguinte foram alimentadas com 1% de FBS em MCDB 105 (UCSF Cell Culture Facility) e incubadas por 24h em atmosfera com 0% de CO2. Foi adicionado a cada um dos alvéolos de cada clone PDGF-AA ou -BB (Collaborative Research Inc.) até à concentração final desejada. Depois da incubação por sete min. à temperatura ambiente, as células foram lavadas com PBS e lisadas com 50 mM de Tris-HCl (pH-7,4), 1% de Nonidete P-40 ,10% de glicerol, 2 mM de EDTA, 10 mM de pirofosfato de sódio, 10 mg/ml de cada uma de aprotinina e leupeptina, 1 mM de PMSF e 1 mM de ortovanadato de sódio. Volumes iguais de cada lisado foram desenvolvidos em geles múltiplos de poliacrilamida-SDS a 7,5% e transferidos para a nitrocelulose (Schleicher & Schuell). As membranas foram paralisadas com leite magro instantâneo a 5% em tampão-Tris salino/0,05% de Tween 20 (TBST-T). As membranas em duplicado foram incubadas quer com anti-fosfotirosina policlonal 1:3000 quer com receptor anti-PDGF-β (UBI) 1:1000 em tampão de paragem. O segundo anticorpo foi a IgG (Sigma) anti-coelho de cabra conjugada com a peroxidase de rábano a 1:1000. Para detectar 0 receptor incompleto, foi utilisado um anticorpo monoclonal diluído a 1:500 contra 0 domínio extra celular do receptor PDGF-β humano (Genzyme). O segundo anticorpo usado foi uma IgG (ICN) anti-ratinho de coelho conjugada com peroxidase a 1:1000. ECL (Amersham) foi usada para a detecção de todas as manchas. As respectivas áreas das bandas foram determinadas com um densitómetro molecular de dispositivo computarisado. Os níveis de base da fosforilação foram subtraídos de cada ponto.
Crescimento aderente de linha de células. Para determinar as densidades de crescimento, cada linha de células foi semeada na concentração de 104 células/alvéolo em 5 placas de 24 alvéolos com amostras em triplicado em meio de Ham's/F-10 com 1% ou 5% de FBS. O meio foi mudado todos os três dias. Cada 2 dias, as células duma
placa eram tripsinadas e contadas num contador Coulter. Para determinar a eficácia da clonagem, foram colocadas 100 células de cada linhagem em três placas de 10 cm em meio de Ham7F-10 com 1% ou 5% de FBS. O meio foi mudado todos os três dias durante cerca de 12 dias. As colónias foram fixadas, coradas com azul de metileno e registadas.
Crescimento de linha de células de fixação independente (teste de agar macio). Preparou-se uma camada base em placas de 35 mm com 0,8% de agarose SeaPlaque (FMC BioProducts), 1% de FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e aminoácidos não essenciais. As células foram suspensas em 0,4% de agarose contendo os outros componentes listados acima e a concentração desejada de PDGF-BB (Collaborative Research Labs). A suspensão foi colocada na camada base com 3000 células/placa. Foram incubadas por 2 semanas numa câmara húmida com 5% de CO2. As colónias foram contadas visualmente ou com um contador de colónias tumorais Omnicom 3800™ automatizado.
Crescimento de linha de células em ratinhos pelados. As células foram espandidas em frascos rolantes, tripsinadas e ressuspensas em PBS. Foram contadas e o volume ajustado a 3xl07 células/ml. Por cada linhagem de células, foram injectados por via subcutânea 4 a 8 ratinhos atímicos pelados (Simonsen Labs) com 100 ml (3x106 células). Os volumes dos tumores foram medidos com compasso duas vezes por semana durante 18 a 21 dias.
Manchamento imuno-histoqaímico de secções de tumores. Os tumores foram retirados dos ratinhos e congelados em OCT (Miles Lab). Foram cortadas secções com 5 mm de espessura e fixadas com acetona. As secções foram bloqueadas com soro normal de cabra a 10% antes da incubação com 20 mg/ml do receptor PDGF-β anti-humano biotinilado (anti-corpo Genzyme, biotililado por amostras moleculares). Foram usadas para a detecção estreptavidina peroxidase conjugada (Caltag) a 1:100 e diaminobenzidina (Sigma) com H2O2. Para o controle negativo foi usado um anti-corpo monoclonal biotinilado contra uma proteína não relacionada na mesma concentração da
proteína do receptor anti-PDGF-β. Foi utilizada a hematoxilina de Harris num contador de manchas (Anatech).
Usando o sistema de expressão retroviral descrito acima, um receptor PDGF-β truncado foi introduzido em células Có de glioma de rato. Em clones resistentes a G418 que expressam os receptores modificados, a fosforilação da tirosina induzida pelo PDGF-BB nos receptores do tipo nativo foi significativamente reduzida. Além disso, estas células cresceram numa densidade mais baixa e formaram em cultura colónias mais pequenas que as células Có parenterais. A capacidade de crescimento das células que expressam o receptor foi significativamente prejudicada nos ratinhos pelados. Depois de 21 dias, o volume dos tumores de HiMut.l e HiMut.2 eram apenas 12-16 % do tamanho dos tumores das células parenterais. Os tumores das células parenterais e das células de controlo do vector eram essencialmente iguais indicando que as células de controlo do vector da selecção G418 não foram afectada na sua capacidade de crescimento em ratinhos pelados. Os tumores derivados de HiMut.l deram manchas imunológicas muito escuras em pelo menos 10% das células. Os tumores derivados de HiMut.2 originaram manchas em 45-85% das células. A presença do receptor PDGF-β truncado das secções lisadas do tumor também foi confirmada pela técnica da mancha Western. Portanto, o receptor incompleto PDGF-β estava expresso in vivo para além de 21 dias e tinha que estar presente em pelo menos 10% das células para ser inibitório. Estes estudos demonstram a utilidade do domínio dos mutantes negativos do PDGF-R para inibir o crescimento de tumores caracterizados por actividade inadequada do PDGF-R in vivo .
Exemplo 14 : Terapêutica combinada
Foram feitos estudos para observar sobre o efeito no crescimento dos tumores quando são usados inibidores de PDGF-R em combinação com fármacos citotóxicos conhecidos, correntemente usados no tratamento do cancro. Em experiências separadas foram implantadas subcutaneamente células CALU-6 e MCF-7/Her2 em ratinhos 76
CJ
Vi ff ·-·· pelados. Numa das experiências os ratinhos foram tratados só com AIO, noutra só com'· cisplatina e noutra combinando a cisplatina e o AIO. Foram dados 5 mg/Kg de AIO intraperitonealmente duas vezes por semana. A cisplatina foi dada numa dose única de 5 mg/Kg intraperitonealmente no segundo dia. A combinação do AIO com cisplatina resultou melhor na inibição do crescimento do tumor das células MCF-7/Her2 implantadas em ratinhos, do que só com cisplatina ou no tratamento, mas não aumentou a supressão do tumor comparada com AIO sozinho. Contudo, nos ratinhos com células CALU-6 implantadas, a combinação de AIO com a cisplatina resultou numa supressão significativa do crescimento do tumor comparada com AIO sozinho, só cisplatina ou no tratamento.
Numa segunda experiência com células CALU-6 os ratinhos foram tratados só com AIO, só com cisplatina ou só com VP-16 (10 mg/Kg nos dias 4, 7 e 10) e ou em combinação da cisplatina com VP-16 ou com AIO, cisplatina e VP-16. A combinação de AIO, cisplatina e VP-16 resultou melhor na supressão do crescimento do tumor do que só com o fármaco ou com a combinação da cisplatina e VP-16.
Exemplo 15 : Síntese química AIO AIO pode ser preparado como no Pedido de Patente Europeia 0 013 376 A2.
Em alternativa AIO pode ser preparado com se segue:
Etapa 1 : Preparação do sal de (4-trifluorometil)anilina do ácido acetoacético.
Uma mistura de 4-trifluorometilanilina (16,lg, 0,1 mol), 2,2,6-trimetil-4H-l,3-dioxin-4-ona (95 % de pureza; 14,97 g, 0,1 mol) e xileno (20 ml) foi aquecida a refluxo a 30 min em banho pré-aquecido a 150°C. A solução escura resultante foi arrefecida à temperatura ambiente para cristalizar o produto. Os cristais foram filtrados e recolhidos. Foi obtido mais material das soluções mãe (a solução remanescente depois da cristalização inicial e filtração). A produção da anilida bruta foi de 17,75 g (75%), tendo um ponto de fusão de 153-154°C.
Etapa 2 : Preparação da 2-Etoximetilenoacetoacetil-(4-trifluorometil)anilina
Acetoacetil-(4-trifluorometil)anilina (14,11 g, 57,6 mmol), trietoximetano (9,43 g, 63,4 ramol) e anidrido acético (16,30 ml, 173 mmol) foram misturados em conjunto e aquecidos a refluxo durante 90 min. A solução escura resultante foi evaporada até à secura. O resíduo foi ressuspenso em benzeno/isooctano e o produto foi cristalizado. Foi obtido mais material da solução mãe. A produção do produto puro foi de 11,93 g (72%), com um ponto de fusão de 120-122°C.
Etapa 3 : Preparação de AIO 2-Etoximetilenoacetoacetil-(4-trifluorometil)anilina (3,01 g, 10,4 mmol) em etanol (6 ml) foi lentamente adicionada a uma solução de hidrocloreto de hidroxilamina arrefecida em gelo (0,77 g, 11,0 mmol) em NaOH 2M (5,5 ml). A mistura foi aquecida a refluxo durante uma hora, arrefecida à temperatura ambiente e evaporada até à secura. O resíduo foi ressuspenso e disperso entre acetato de etilo e água. A camada orgânica foi separada, extraída com água, seca pelo sulfato de sódio e o solvente foi evaporado. O resíduo foi ressuspenso em tolueno e cristalizado para produzir um resíduo sólido (2,45 g, 87%) de A10 tendo um ponto de fusão de 166-167°C.
Lisboa. 3
AGO
Dra. Maria SilvEna Ffcrreira

Claims (8)

  1. i ί; i
    / REIVINDICA ÇOES 1. Utilização de (4-trifluorometil) do ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico-anilina ou o seu sal farmaceuticamente aceitável no fabrico de um medicamento para administração parenteral para o tratamento de um tumor sólido caracterizado por actividade inadequada do PDGF-R .
  2. 2. Utilização de acordo com a reiviondicação 1, para o tratamento do cancro cerebral intraxial.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para o tratamento do cancro do ovário
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para o tratamento do cancro do colon
  5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para o tratamento do cancro da próstata
  6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para o tratamento do cancro do pulmão
  7. 7. Utilização de acordo com reivindicação 1 para o tratamento do glioma
  8. 8. Uma composição farmacêutica para administração parenteral compreendendo a (4- trifluorometil)anilida do ácido 5-metil-isoxazol-4-carboxílico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um veículo fisio logicamente aceitável compreendendo uma solução a 3% em p/v de álcool benzílico, a 8% de p/v de polissorbato 80 e a 65% de p/v de polietilenoglicol (MM=300) em etanol absoluto, diluída a 1:1 numa solução de 5% de dextrose em água. 3 AGO. 2000 Lisboa,
    íelc-s. 213 a Ferreira
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