KR100933559B1

KR100933559B1 - ３Ｈ-퀴나졸린-４-온 유도체를 함유하는 Ｈｓｐ９０ 억제제및 이를 이용한 항암제

Info

Publication number: KR100933559B1
Application number: KR1020070098765A
Authority: KR
Inventors: 한지숙; 박황서; 김윤정
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-10-01
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2009-12-23
Also published as: KR20090033634A

Abstract

본 발명은 Hsp90 억제제로 새롭게 분리한 3H-퀴나졸린-4-온 유도체에 관한 것으로, 항암제로 제공될 수 있다.

암, 억제제, ３Ｈ-퀴나졸린-４-온, Ｈｓｐ９０

Description

３Ｈ-퀴나졸린-４-온 유도체를 함유하는 Ｈｓｐ９０ 억제제 및 이를 이용한 항암제{Hsp90 inhibitors containing 3H-quinazolin-4-one derivatives and anti-cancer drugs using the Hsp90 inhibitors}

본 발명은 Hsp90 억제제 및 이를 이용한 항암제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 3H-퀴나졸린-4-온의 유도체를 함유하는 Hsp90 억제제 및 이를 이용한 항암제에 관한 것이다.

Hsp90는 진핵세포에서 가장 많이 존재하는 분자 샤페론들 중 하나로서, 클라이언트 단백질이라 불리는 준안정 상태 단백질의 접힘, 안정화, 활성화 및 단백질 복합체의 형성에 중요한 역할을 하고 있다. Hsp90 클라이언트 단백질들에는 Her2/ErbB2, Akt, Raf-1, Hif-1α, 호르몬 수용체, 서바이빈(survivin), p53 돌연변이 및 hTERT 와 같은 종양 유발 단백질들이 포함되어 있다.

Hsp90의 저해는 프로테아좀(proteasome)을 통한 상기 종양 유발 클라이언트 단백질들의 분해를 유도하는데, 이와 같은 특성으로 말미암아 Hsp90는 항암제 개발을 위한 새로운 타겟으로 급부상하고 있다.

Hsp90 억제제에 관한 특허의 일 예로는 대한민국 특허공개번호 제10-2007-0045290호(공개일자 2007년 05월 02일)에 '증식성 질환의 치료 및 상기 질환의 치료용 제약 제제의 제조에 있어서 벤조이미다졸론 화합물 및 그 염의 용도에 관한 것으로, 벤조이미다졸론 화합물을 포함하는 제약 제제, 신규한 벤조이미다졸론 화합물 및 신규한 벤조이미다졸론 화합물의 제조 방법'이 있다.

한편, N-말단 ATPase 도메인에서 ATP 결합과 가수분해에 의한 Hsp90의 형태적 변화는 Hsp90의 샤페론 기능을 위해 필수적이다. 현재까지 알려진 Hsp90 억제제들의 대부분은 N-말단 ATP 결합부위에 결합함으로써 Hsp90 ATPase 활성을 억제한다. 이러한 종류의 Hsp90 억제제들에는 겔다나마이신(geldanamycin, GA)과 라디시콜(radicicol), GA로부터 유래한 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin; 17-AAG)과 17-다이메칠아미노에칠아미노-17-데메톡시겔다나마이신(17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin;17-DMAG), 퓨린 골격 유도체인 PU3과 PU24FCl, 파이라졸스(pyrazoles), 그리고 서바이빈-Hsp90 복합체의 펩티도미메틱(peptidomimetic) 억제제인 쉐펠딘(shepherdin) 등이 있다.

한편, 노보바이오신(novobiocin)과 시스플라인(cisplain)은 Hsp90 C-말단에 존재하리라 생각되는 두번째 ATP 결합 부위에 결합하여 Hsp90를 억제한다. 종양세포에 존재하는 Hsp90는 보통세포보다 높은 ATPase 활성을 띄며 Hsp90 억제제들과 높은 결합력을 가지게 되어, Hsp90 억제제들이 종양세포에 특이적으로 작용할 수 있게 된다. Hsp90 억제제들의 항암 활성은 다양한 시험관내(in vitro)와 세포 내(in vivo) 모델 시스템에서 검증되었으며, 17-AAG는 다양한 암에 대한 임상실험에서 치료제로서 희망적인 결과를 보여주고 있다.

그러나, 17-AAG는 제형, 잠재적 독성, 그리고 낮은 수용해도와 같은 문제가 있기 때문에, 향상된 제약성질과 효능을 가지는 Hsp90 억제제의 지속적인 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명은 Hsp90에 대한 억제제로서 신규의 화합물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

X₁은 H이고, Y₁은 2-(4-클로로페닐)에티닐(2-(4-chlorophenyl)ethenyl), 2-아미노-1-(3-클로로-4-메틸페닐)-4,5-다이하이드로-4-옥소-1H-파이롤-3-일(2-amino-1-(3-chloro-4-methylphenyl)-4,5-dihydro-4-oxo-1H-pyrrol-3-yl), [2-[(2-푸라닐메틸)아미노]-2-옥소에틸]티오([2-[(2-furanylmethyl)amino]-2-oxoethyl]thio), [2-[(4-아세틸페닐)아미노]-2-옥소에틸]티오([2-[(4-acetylphenyl)amino]-2-oxoethyl]thio) 및 [[4-(메톡시카르보닐)페닐]메틸]티오([[4-(methoxycarbonyl)phenyl]methyl]thio) 중 하나이며;

X₁은 메틸(methyl)이고, Y₁은 2-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)에티닐(2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethenyl)이며;

X₁은 2-하이드록시에틸(2-hydroxyethyl)이고, Y₁은 2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에티닐(2-[4-(dimethylamino)phenyl]ethenyl)이며;

X₁은 4-메톡시사이클로헥사-2,6-다이이녹시 에틸(4-methoxycyclohexa-2,6-dienoxy ethyl)이고, Y₁은 4-메톡시페닐(4-methoxyphenyl)이며;

X₁은 1-나프타레닐(1-naphthalenyl)이고, Y₁은 2-(2-하이드록시페닐)에티닐(2-(2-hydroxyphenyl)ethenyl)이며;

X₁은 페닐(phenyl)이고, Y₁은 2-(2-하이드록시페닐)에티닐(2-(2-hydroxyphenyl)ethenyl), 2-(2-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐(2-(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl), 2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl), [2-(4-모르포리닐)-2-옥소에틸]티오([2-(4-morpholinyl)-2-oxoethyl]thio) 및 [(4-니트로페닐)메틸]티오([(4-nitrophenyl)methyl]thio) 중 하나이며;

X₁은 4-파이리디닐메틸(4-pyridinylmethyl)이고, Y₁은 2-(4-니트로페닐)에티닐(2-(4-nitrophenyl)ethenyl)이며;

X₁은 2-파이리다이닐메틸(2-pyridinylmethyl)이고, Y₁은 2-(4-플루오로페닐)에티닐(2-(4-fluorophenyl)ethenyl) 및 (이소인돌-1,3-다이오닐)에틸((isoindol- 1,3-dionyl)ethyl) 중 하나인,

상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 Hsp90 억제제를 제공하고,

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

X₂는 메톡시(methoxy)이고, Y₂는 2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에티닐(2-(2-methyl-1H-indol-3-yl)ethenyl) 및 (2-파이리다이닐티오)메틸((2-pyridinylthio)methyl) 중 하나이며;

X₂는 하이드록시(hydroxy)이고, Y₂는 2-(2-푸라닐)에티닐(2-(2-furanyl)ethenyl) 및 2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl) 중 하나이며;

X₂는 클로로(chloro)이고, Y₂는 2-(3-파이리다이닐)에티닐(2-(3-pyridinyl)ethenyl) 및 (2-파이리다이닐티오)메틸((2-pyridinylthio)methyl) 중 하나인,

상기 화학식 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 Hsp90 억제제를 제공하고,

[화학식 3]

상기 화학식 3에서,

X₃는 메톡시(methoxy)이고, Y₃는 2-[2-(다이메틸아미노)페닐]에티닐(2-[2-(dimethylamino)phenyl]ethenyl), 2-(4-하이드록시페닐)에티닐(2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl), 2-(4-니트로페닐)에티닐(2-(4-nitrophenyl)ethenyl), 및 2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl) 중 하나이며;

X₃는 하이드록시(hydroxy)이고, Y₃는 2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에티닐(2-[4-(dimethylamino)phenyl]ethenyl) 및 2-페닐에티닐(2-phenylethenyl) 중 하나이며;

X₃는 메틸(methyl)이고, Y₃는 [(1,2-다이하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일아이딘)메틸([(1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl)인,

상기 화학식 3의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 Hsp90 억제제를 제공하고,

[화학식 4]

상기 화학식 4에서,

X₄는 메톡시(methoxy)이고, Y₄는 2-(2-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐(2-(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethenyl), 2-(4-하이드록시페닐)에티닐(2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl), (1H-벤지미다졸-2-일메틸)티오((1H-benzimidazol-2-ylmethyl)thio), [2-(4-모르포리닐)-2-옥소에틸]티오([2-(4-morpholinyl)-2-oxoethyl]thio), [2-[[4-(다이메틸아미노)페닐]아미노]-2-옥소에틸]티오([2-[[4-(dimethylamino)phenyl]amino]-2-oxoethyl]thio) 및 [(1,2-다이하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일아이딘)메틸([(1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl) 중 하나이며;

X₄는 에톡시(ethoxy)이고, Y₄는 [(3-플루오로페닐)메틸]티오([(3-fluorophenyl)methyl]thio) 및 (2-아미노-2-옥소에틸)티오((2-amino-2- oxoethyl)thio) 중 하나이며;

X₄는 니트로(nitro)이고, Y₄는 2-(4-플루오로페닐)에티닐(2-(4-fluorophenyl)ethenyl)이며;

X₄는 메틸(methyl)이고, Y₄는 [2-(1,3-벤조다이옥솔-5-일아미노)-2-옥소에틸]티오([2-(1,3-benzodioxol-5-ylamino)-2-oxoethyl]thio), (2-아미노-2-옥소에틸)티오((2-amino-2-oxoethyl)thio) 및 [2-옥소-2-(1-피퍼리다이닐)에틸]티오([2-oxo-2-(1-piperidinyl)ethyl]thio) 중 하나이며;

X₄는 클로로(chloro)이고, Y₄는 [2-[(4-메틸페닐)아미노]-2-옥소에틸]티오([2-[(4-methylphenyl)amino]-2-oxoethyl]thio), [2-(2,3-다이하이드로-1H-인돌-1-일)-2-옥소에틸]티오([2-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-2-oxoethyl]thio), [1-[(6-인다조리닐)카르바모일]메틸]티오([1-[(6-indazolinyl)carbamoyl]methyl]thio) 및 [2-(1,3-벤조다이옥솔-5-일-2-옥소에틸]티오([2-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2-oxoethyl]thio) 중 하나이며;

X₄는 플루오로(fluoro)이고, Y₄는 (이소인돌-1,3-다이오닐)에틸((isoindol-1,3-dionyl)ethyl)이며;

X₄는 카르복실(carboxyl)이고, Y₄는 2-(2-하이드록시페닐)에티닐(2-(2-hydroxyphenyl)ethenyl)인,

상기 화학식 4의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으 로 함유하는 것을 특징으로 하는 Hsp90 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기에 기재된 화합물들을 중 어느 하나의 Hsp90 억제제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에서는 85,000개의 화학물질들을 대상으로 도킹 시뮬레이션을 통한 가상 스크리닝을 수행하여 300개의 화학물질들을 우선 선별하였다. 이 300개 중에서 285개의 화학물질들을 대상으로 효모 Hsp90를 이용한 ATPase 활성 조사를 통해 Hsp90 억제제를 선별하고자 하였다.

Hsp90 ATPase 활성은 말라카이트 그린(malachite green) 시약을 사용하여 방출되는 무기인산을 색의 변화로 검출하는 방법을 통해 96-웰 플레이트에서 측정하였다. 그 결과, 3H-퀴나졸린4-온 유도체인 본 발명의 48개의 화합물에서 50 μM의 첨가 농도(일부 화합물은 40 μM)에서 Hsp90의 활성이 65% 이하(35% 이상의 억제 효능을 의미함)로 나타났다.

한편, 실시예 중 21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물을 대상으로 하여 세포내(in vivo) 억제 효능을 테스트하였다. MCF-7 유방암 세포주에서의 Her2 분해효과를 조사하였는데, Hsp90 클라이언트 단백질 중 하나인 Her2 단백질의 분해와 함께 Hsp70의 유도를 관찰함으로써 Hsp90 억제 활성을 조사한 것이다. MCF-7 세포에서 각각의 화학물질을 30 μM의 농도로 24시간 동안 처리하였고, Her2와 Hsp70의 발현수준들을 웨스턴 블랏팅 방법으로 조사하였다. 대조군(겔다나마이신)과 비교했을 때, 21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물 처리군에서 Her2 단백질 수준이 50% 이상 감소하고, Hsp70의 발현이 유도됨을 확인하였다.

또한, 세포의 성장 저해를 측정하였는데, 21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물들이 25.4~35.6 μM 농도 사이의 GI₅₀ 값을 나타내어 효과적으로 MCF-7 세포들의 성장을 저해함이 확인되었고, 이는 겔다나마이신의 GI₅₀ (9.6 μM) 보다 2.6~3.7배 정도밖에 높지 않은 수치이다.

한편, 본 발명은 본 발명의 48개 화합물 중 하나를 포함하는 암 치료용 (더 넓은 의미로는 예방용) 약제, 즉 항암제를 제공한다.

본 발명의 항암제는 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 또는 제약상 허용가능한 이들의 염을 유의한 양만큼 함유하고, 1종 이상의 무기 또는 유기의 고체 또는 액상의 제약상 허용가능한 담체를 포함하거나 혼합하는 혼합물이다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 포유동물(특히, 인간)에게 경구 또는 비경구(예를 들어, 근육 내 또는 정맥 내 주사)로 투여할 수 있다. 활성 성분의 투여량은 포유동물의 종, 체중, 연령 및 개개의 상태에 따라 달라진다.

본 발명의 화합물 또는 제약상 허용가능한 이들의 염을 포유동물, 예를 들어 대략 70 kg 체중의 인간에게 투여할 때, 1인당 1일 투여량은 바람직하게는 대략 3 mg 내지 대략 10 g, 더욱 바람직하게는 대략 10 mg 내지 대략 1.5 g, 가장 바람직 하게는 약 100 mg 내지 약 1000 mg이다. 투여횟수는 바람직하게 동일량을 2~3회로 나누어 하루에 투여하는 것이 좋다. 일반적으로 어린이에게는 성인 투여량의 절반을 적용한다.

본 발명의 항암제는 활성 성분(본 발명의 화합물)을 대략 1％ 내지 대략 95％, 바람직하게는 대략 20％ 내지 대략 90％ 포함한다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 앰플, 바이알, 좌제, 당제, 정제 또는 캡슐제 형태 등과 같은 단위 투여 형태일 수 있다.

본 발명의 항암제는 공지된 방식인 통상적인 용해, 동결건조, 혼합, 과립화 또는 당제화 공정 등을 통해 제조될 수 있고, 시판되는 것을 구입해서 사용할 수도 있다.

본 발명의 항암제는 부형제(예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 가용화제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충액)를 포함할 수 있다. 또한, 점도 증가 물질(예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴)을 포함할 수도 있다.

본 발명의 주사 형태 항암제는 멸균 조건하에서 통상적인 방식으로 제조될 수 있으며, 상기 조성물을 앰플 또는 바이알에 도입하고 용기를 밀폐할 때에도 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 경구 투여용 항암제로서 정제는 활성 성분을 고체 담체와 배합하고, 필요하다면 생성된 혼합물을 과립화하며, 필요에 따라서는 적절한 부형제를 첨가한 후에 상기 혼합물을 가공하여 제조할 수 있다. 적합한 담체로는 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분 등을 사용한 전분페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸 전분, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등이 있다. 적합한 부형제로는 유동성 조절제(flow conditioner) 및 윤활제(예를 들어, 규산, 활석, 스테아르산 또는 그의 염-예를 들어 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼슘 또는 폴리에틸렌 글리콜-) 등이 있다.

본 발명의 경구 투여용 항암제로서 캡슐제는 젤라틴으로 제조된 건조-충전된 캡슐제 및 젤라틴과 가소제(예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨)로 제조된 연질 밀봉된 것을 사용할 수 있다. 건조-충전된 캡슐제에는 과립 형태의 활성 성분에 충전제(예로서, 락토오스), 결합제 (예로서, 전분) , 유동화제 (예로서, 활석 또는 스테아르산마그네슘) 또는 안정화제가 함께 첨가될 수 있다. 연질 캡슐제에서 활성 성분은 적합한 오일성 부형제(예로서, 지방 오일, 파라핀 오일 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜) 중에 용해되거나 현탁되는 것이 바람직하고, 안정화제 또는 항균제가 첨가될 수도 있다.

이상 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 3H-퀴나졸린-4-온 유도체는 Hsp90 단백질에 대한 억제능이 있음이 확인되었는 바, 본 발명은 항암제로서 사용될 수 있으므로 의약산업에서 매우 유용한 것이다.

상기 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

한편, 하기의 실시예 1~4에서는 본 발명에서 선별한 화합물의 ATPase 활성억제능을 측정하였는데, 그 방법은 하기와 같았다.

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Hsp90 단백질을 코딩하는 HSC82 ORF를 PCR에 의해 증폭하여 pET23b 플라스미드의 NdeI과 XhoI 위치에 클로닝하였다. 이 플라스미드로 대장균(E. coli) BL21 star(DE3)pLysS를 형질전환시킨 후, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피와 Mono Q 5/50 GL을 이용하여 C-말단에 6개의 히스-태그(His-tag)를 가지고 있는 효모 Hsp90 단백질을 FPLC로 정제하였다. Hsp90 ATPase 활성은 말라카이트 그린(malachite green) 시약을 사용하여 방출되는 무기인산을 색의 변화로 검출하는 방법을 통해 96-웰 플레이트에서 측정하였다.

효모 Hsp90(0.6 μM, 최종농도)를 반응버퍼[1mM ATP, 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 0.4 % DMSO]에 첨가하고, 0.4% DMSO에 녹인 본 발명의 화합물(하기 실시예1~4에서 샘플번호 1~48로 표시)을 40μM 농도로 첨가하였을 때(21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물은 50μM 처리), 변화된 활성을 조사하였다. 반응혼합물을 3시간 동안 37℃에서 배양한 후, 말라카이트 그린(bioassay system co.) 시약을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이 후 37℃에서 10분 동안 배양 하고, 마이크로플레이트 리더(thermo labsystem co.)를 사용하여 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 무처리군의 흡광도와 비교함으로써, Hsp90의 저해도를 '활성(%)'으로 하기의 실시예 1~4에서 표시하였다(하기의 실시예 1~5에 표시된 수치들은 모두 유의성이 인정되는 데이터 값들이다)

한편, ATPase 억제 화합물로 알려진 양성 대조군, 겔다나마이신은 2.3μM 처리시 50%의 활성을 나타냈다.

실시예 1: 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체의 ATPase 활성 측정

[화학식 1]

샘플	X₁	Y₁	활성(%)
1	H	2-(4-클로로페닐)에티닐	50.16
2		2-아미노-1-(3-클로로-4-메틸페닐)-4,5-다이하이드로-4-옥소-1H-파이롤-3-일	58.31
3		[2-[(2-푸라닐메틸)아미노]-2-옥소에틸]티오	55.80
4		[2-[(4-아세틸페닐)아미노]-2-옥소에틸]티오	59.56
5		[[4-(메톡시카르보닐)페닐]메틸]티오	57.68
6	메틸	2-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)에티닐	52.04
7	2-하이드록시에틸	2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에티닐	58.93
8	4-메톡시사이클로헥사-2,6-다이이녹시 에틸	4-메톡시페닐	49.22
9	1-나프타레닐	2-(2-하이드록시페닐)에티닐	37.00
10	페닐	2-(2-하이드록시페닐)에티닐	56.11
11		2-(2-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐	55.80
12		2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐	56.74
13		[2-(4-모르포리닐)-2-옥소에틸]티오	54.86
14		[(4-니트로페닐)메틸]티오	59.87
15	4-파이리디닐메틸	2-(4-니트로페닐)에티닐	50.16
16	2-파이리다이닐메틸	2-(4-플루오로페닐)에티닐	54.86
17	2-파이리다이닐메틸	(이소인돌-1,3-다이오닐)에틸	15.6

실시예 2: 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 유도체의 ATPase 활성 측정

[화학식 2]

샘플	X₂	Y₂	활성(%)
18	메톡시	2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에티닐	53.29
19	메톡시	(2-파이리다이닐티오)메틸	47.65
20	하이드록시	2-(2-푸라닐)에티닐	60.50
21	하이드록시	2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐	25.10
22	클로로	2-(3-파이리다이닐)에티닐	59.25
23	클로로	(2-파이리다이닐티오)메틸	55.49

주) 21번 샘플은 50μM 처리군

실시예 3: 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 유도체의 ATPase 활성 측정

[화학식 3]

샘플	X₃	Y₃	활성(%)
24	메톡시	2-[2-(다이메틸아미노)페닐]에티닐	55.17
25		2-(4-하이드록시페닐)에티닐	55.49
26		2-(4-니트로페닐)에티닐	55.49
27		2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐	59.87
28	하이드록시	2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에티닐	58.31
29	하이드록시	2-페닐에티닐	60.50
30	메틸	[(1,2-다이하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일아이딘)메틸	59.87

실시예 4: 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 유도체의 ATPase 활성 측정

[화학식 4]

샘플	X₄	Y₄	활성(%)
31	메톡시	2-(2-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐	21.30
32		2-(4-하이드록시페닐)에티닐	53.92
33		(1H-벤지미다졸-2-일메틸)티오	50.78
34		[2-(4-모르포리닐)-2-옥소에틸]티오	53.61
35		[2-[[4-(다이메틸아미노)페닐]아미노]-2-옥소에틸]티오	51.10
36		[(1,2-다이하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일아이딘)메틸	60.50
37	에톡시	[(3-플루오로페닐)메틸]티오	22.30
38	에톡시	(2-아미노-2-옥소에틸)티오	47.02
39	니트로	2-(4-플루오로페닐)에티닐	46.71
40	메틸	[2-(1,3-벤조다이옥솔-5-일아미노)-2-옥소에틸]티오	53.92
41		(2-아미노-2-옥소에틸)티오	58.31
42		[2-옥소-2-(1-피퍼리다이닐)에틸]티오	55.17
43	클로로	[2-[(4-메틸페닐)아미노]-2-옥소에틸]티오	55.80
44		[2-(2,3-다이하이드로-1H-인돌-1-일)-2-옥소에틸]티오	57.05
45		[1-[(6-인다조리닐)카르바모일]메틸]티오	59.87
46		[2-(1,3-벤조다이옥솔-5-일-2-옥소에틸]티오	52.66
47	플루오로	(이소인돌-1,3-다이오닐)에틸	52.66
48	카르복실	2-(2-하이드록시페닐)에티닐	30.30

주) 31번, 48번 샘플은 50μM 처리군

실시예 5: 상기 실시예 1~4에 기재된 화합물 중 21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물의 세포내 ( in vivo ) 효능 검정

21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물을 대상으로 하여 MCF-7 유방암 세포주에서 Her2 분해효과를 조사하였다. Hsp90 클라이언트 단백질 중 하나인 Her2 단백질의 분해와 함께 Hsp70의 유도를 관찰함으로써 Hsp90 억제능을 조사한 것이다. 열 충격전사인자(Hsf1)는 Hsp90에 의해 그 활성이 억제되므로, Hsp70를 포함하는 Hsf1 타겟 유전자들은 겔다나마이신을 비롯한 Hsp90 억제제들에 의해 발현이 유도되는데 본 실시예에서는 Hsp70의 발현 정도도 조사하였다.

MCF-7 세포에 각각의 화학물(21번, 31번, 48번)을 30 μM의 농도로 24시간 동안 처리하였고, Her2와 Hsp70의 발현수준들은 웨스턴 블랏팅 방법으로 조사하였다. 먼저, MCF-7 세포들을 5ⅹ10⁵cells/well의 농도로 6-웰 플레이트에 접종하고 하루 동안 세포들을 바닥에 부착시켰다. 그 다음날, 0.4 % DMSO에 녹인 화합물들을 세포에 처리하고, 대조군으로 같은 양의 0.4 % DMSO를 세포에 처리하였다. 24시간 배양 후, 세포들을 TNES 버퍼 [Tris-HCl (50 mM; pH 7.4), NP40 (1 %), EDTA (2 mM), NaCl (100 mM), phenylmethylsulfonyl fluoride (1 mM), protease inhibitor cocktail solution (1 %, sigma)]에 용해시킨 후, 세포 추출물들을 Hsp70 (Stressgen Bioreagents), Her2(Santa Cruz Biotechnology) 및 튜불린(tubulin; Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체를 사용함으로써 Her2, Hsp70, 튜불린의 발현수준을 분석하였다.

양성 대조군(겔다나마이신)과 비교했을 때, Her2 단백질 수준이 50% 이상 감소하고, Hsp70의 발현이 유도되었다(도 1: 도 1에서 1a는 21번 화합물, 1b는 31번 화합물, 1c는 48번 화합물). 이들 3 개 화합물들은 Her2가 분해되어 감소되는 효과가 모두 유사하게 나타났다.

한편, 세포의 성장 저해를 측정하기 위하여 설포르호다민 B(sulforhodamine B; SRB)를 이용한 방법을 사용하였다. 96-웰 플레이트에서 자란 MCF-7 세포들에 다양한 농도의 겔다나마이신(양성 대조군), 21번 화합물, 31번 화합물 및 48번 화합물을 4일 동안 처리하였다. 세포들을 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 고정한 후, 30분 동안 1 % 아세트산(acetic acid)에 녹아 있는 0.4 % SRB(Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 단백질에 결합된 염색약을 트리스 베이스(Tris base; 10 mM; pH 10.5)에 녹인 후, 마이크로플레이트 리더를 통해 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. GI₅₀은 무처리 음성 대조군에 비해 50%까지 세포 성장이 저해되는 농도로 계산되었다(표 5).

화합물	겔다나마이신	21번 화합물	31번 화합물	48번 화합물
GI₅₀ (μM)^a	9.6	25.4	27.5	35.6
^a n=2 에 의한 수치

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 21번 화합물, 31번 화합물, 48번 화합물들은 25.4~35.6 μM 농도 사이의 GI₅₀ 값을 나타내었으며, 효과적으로 MCF-7 세포들의 성장을 저해했다. 이는 겔다나마이신의 GI₅₀ (9.6 μM) 보다 2.6~3.7배 정도밖에 높지않은 수치이다.

제형예 1: 정제

하기 조성의 정제를 통상적인 방법으로 제조하였다.

	mg
활성성분으로 상기 48번의 화합물	100
분말상 락토오스	95
백색 옥수수 전분	35
폴리바이닐피롤리돈	8
Na 카복시메틸스타치	10
스테아르산마그네슘	2
정제 총 중량	250

제형예 2: 캡슐

하기 조성의 캡슐을 통상적인 방법으로 제조하였다.

	mg
활성성분으로 상기 48번의 화합물	50
결정질 락토오스	60
미세결정질 셀룰로오스	34
활석	5
스테아르산마그네슘	1
캡슐 충전 총 중량	150

제형예 3: 주사액

하기 조성의 주사액을 일반적인 방법으로 제조하였다.

활성성분으로 상기 실시예 48번의 화합물	1.0 mg
1N HCl	30.0 ㎕
아세트산	0.5 mg
NaCl	8.0 mg
페놀	10.0 mg
1N NaOH	pH 5까지 적당량
H₂O	1 mL까지 적당량

도 1은 Hsp90 억제제의 Her2 분해와 Hsp70 유도 효과를 나타낸다. 도 1에서는, 표시된 농도의 겔다나마이신(GA; 양성 대조군), 0.4% DMSO에 녹인 21번 화합물(1a), 31번 화합물(1b), 48번 화합물(1c) 및 무처리 음성 대조군으로 0.4% DMSO(C)를 MCF-7 세포에 24시간 동안 처리한 후, Her2 와 Hsp70의 발현 정도를 웨스턴 블랏팅을 통해 분석하였다. 튜불린(Tubulin)은 정량적 분석을 위한 대조군으로 사용한 것이다.

Claims

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하기 화학식 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제

상기 화학식 2에서,

X₂는 하이드록시이고, Y₂는 2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐이다.
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하기 화학식 4의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제

상기 화학식 4에서,

X₄는 메톡시이고, Y₄는 2-(2-하이드록시-3-메톡시페닐)에티닐이며;

X₄는 카르복실이고, Y₄는 2-(2-하이드록시페닐)에티닐이다.
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