KR101911063B1 - 크로메논 유도체 및 이를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 열충격 단밸질 27 (HSP27)억제 활성을 갖는 신규한 크로메논 유도체 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물은 변형된 HSP27 이량체 형성을 유도하여 정상적인 HSP27 다량체의 형성을 감소시킴으로써, HSP27의 샤페론으로서의 기능을 억제한다. 따라서 본 발명은 암의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있으며, 또한 열충격 단백질 90 (HSP90) 및 기타 항암제의 내성을 감소시킬 수 있고, 방사선에 의한 내성도 감소시킬 수 있다.

Description

크로메논 유도체 및 이를 포함하는 항암용 조성물 {Chromenone derivatives and anti-cancer composition comprising thereof}
본 발명은 신규한 크로메논 유도체, 보다 상세하게는 열충격 단백질(Heat shock protein) 27 억제 활성을 갖는 신규한 크로메논 유도체에 관한 것이다.
열충격 단백질(Heat Shock Protein, HSP)은 샤페론 단백질로 다양한 생리적인 요인이나 항암제와 같은 환경적인 요인에 의해 발현이 유도되어 단백질의 변성 및 세포사를 조절하는 것으로 알려져 있다(Garrido, 2006). 활성화된 열충격 단백질은 샤페론으로서 제대로 접히지 않은 단백질을 제대로 접히게 하고 단백질의 변성을 방지하는 역할을 하며 그 외에 다양한 신호 경로에 중요한 역할을 하는 효과기와 어울려 세포 사멸과정 간섭, 면역 조절에 관여, 세포 보호 효과 등의 다양한 기능으로 세포사를 억제하는 효과를 나타낸다(Khalil, 2011).
열충격 단백질 27 (HSP27)은 1980년대에 발견되었다. HeLa세포를 배양할 때, 온도를 증가시키면 27kDa의 알려지지 않은 단백질이 발견되었는데 이 단백질이 HSP27로 세포 내에 편재하며 스트레스에 의해 과다 발현이 유도된다. HSP27은 세포의 생존, 세포의 이동, 암세포의 침습성을 향상시키며 HSP27의 발현이 높은 암세포의 경우 전이가 잘되며 항암치료에 대한 내성이 증가하는 양상을 보이게 된다(Vargas-Roig, 1998). HSP27의 단백질 구조를 살펴보면 α-crystallin domain과 N-terminal의 WDPF domain이 HSP27의 다량체 생성에 중요한 역할을 하게된다(Lambert, 1999). α-Crystallin domain내의 시스테인 잔기는 HSP27의 단량체와 단량체간의 이황화 결합을 형성하여 HSP27의 이량체를 형성하도록 한다(Mymrikov, 2010). HSP27의 세포내 기능은 이러한 다량체 생성 정도와 관련이 있다.
따라서 HSP27의 거대 다량체 형태를 저해함으로써 HSP27이 샤페론 기능을 수행하지 못하도록 한다면 방사선이나 항암제에 대한 내성이 극복될 것이다.
한편, 세포 내에는 HSP27외에도 HSP70, HSP90 등의 다양한 열충격 단백질들이 존재한다. HSP90은 모든 진핵세포에서 발현되는 ATP-dependent chaperone protein으로 HSP90 client protein들은 거의 모든 세포의 생존 과정에 관여하며 client protein중 다수는 세포 성장, 세포의 분열 및 생존 등의 중요한 세포의 역할에 연관이 있다. 이 중 대부분의 과정은 암의 성장에도 관련이 있다. 따라서 HSP90을 표적으로 하면 동시에 다양한 발암의 신호 전달 경로의 혼란을 야기하게 되므로 다양한 발암 신호 전달 경로의 변화가 일어나는 진행암 치료에 특별히 효과가 있다.
그런데 특정 열충격 단백질을 억제하게 되면 그 외의 다른 열충격 단백질들의 발현이 더욱 증가하는 현상이 나타남이 이미 여러 논문 등에서 발표되었고, 현재 임상 시험중인 HSP90 저해제의 가장 큰 부작용이 이러한 다른 열충격 단백질의 발현에 의한 항암효과 실패에 근거한다. 따라서 HSP90 저해제의 부작용을 억제할 수 있는 방안이 필요하다.
이러한 배경 하에, 방사선 치료 내지 항암제에 내성을 가진 암에 대한 신규 항암제 등에 대한 발굴이 절실한 실정이다.
KR 10-2014-0037954 (2014.03.27.) KR 10-2013-0084987 (2013.07.26.)
본 발명의 목적은 열충격 단밸질 27 (HSP27) 억제 활성을 갖는 신규한 크로메논 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 크로메논 유도체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 암, 특히 방사선 내지 항암제에 내성을 가진 암의 치료에 대해 예의 연구한 결과, 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 변형된 열충격 단백질 27 (HSP27) 이량체 형성에 효과를 보이며 암세포 사멸을 유도하고, 방사선 및 항암제의 내성 등을 감소시킴을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
신규한 크로메논 유도체 화합물
상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 되는 염을 제공한다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112017073341853-pat00001
상기 화학식 Ⅰ식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소; 또는 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자와 1 내지 6의 탄소원자로 구성된 헤테로시클릴C1-4알킬이고,
R3는 C1- 10알킬, C3- 10시클로알킬, C6- 14아릴 또는 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자와 1 내지 10의 탄소원자로 구성된 헤테로아릴이고, 여기서 R3의 하나 이상의 수소는 각각 독립적으로 R4로 치환 또는 비치환되고,
R4는 F, Br, Cl, I, OH, OMe, OEt, NH2, NMe2, CN, COOH, COMe, COOMe, CONH2, 또는 C1-4알킬이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 화학식 Ⅰ에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소,
Figure 112017073341853-pat00002
또는
Figure 112017073341853-pat00003
이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 화학식 Ⅰ에서, R3는 C1- 10알킬 또는 C3- 10시클로알킬이다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 화학식 Ⅰ에서, R3는 메틸 또는 페닐이다.
또한, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 화학식 Ⅰ의 화합물은 하기 표 1의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
[표 1]
Figure 112017073341853-pat00004
본 발명에서, 약제학적으로 허용되는 염은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산, 과염소산, 주석산 및 황산 등으로 제조된 무기산염, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등으로 제조된 유기산염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염, 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염 및 트리메틸아민, 트리에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염 등이 있으나, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 변형된 열충격 단백질 27 (HSP27) 이량체의 생성을 유도하여 HSP27 거대 다량체의 생성을 억제함으로써, HSP27의 샤페론 기능을 억제하며, 세포 보호 기능을 감소시키는 효과가 있다. 또한, 열충격 단백질 90 (HSP90) 억제제를 비롯한 항암제 및 방사선 치료에 대한 내성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물의 바람직한 제조방법은 하기 반응식 1과 같으며, 통상의 기술자에게 자명한 수준으로 변형된 제조방법도 이에 포함된다.
[반응식 1]
Figure 112017073341853-pat00005
상기 [반응식 1]에 도시된 바와 같이, 화학식 1-1의 화합물에 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자와 1 내지 6의 탄소원자로 구성된 헤테로시클릴C1 - 4알킬을 반응시켜 화학식 1-2 또는 화학식 1-3의 화합물을 합성할 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물을 하기 반응식 2 와 같은 방법으로 합성 할 수 있으며, 통상의 기술자에게 자명한 수준으로 변형된 제조방법도 이에 포함된다.
[반응식 2]
Figure 112017073341853-pat00006
구체적으로, 상기 [반응식 2]에 도시된 바와 같이, 화학식 2-1의 화합물과 에피클로로히드린 또는 에피티오클로로히드린을 반응시켜 최종 화합물 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 합성할 수 있다.
신규한 크로메논 유도체 화합물을 포함하는 약학적 조성물
또한, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112017073341853-pat00007
상기 화학식 Ⅰ은 앞서 정의한 바와 같다.
상기 약제학적으로 허용가능한 염은 앞서 본 발명의 화학식 I 로 표시되는 화합물의 약제학적으로 허용되는 염에서 기술한 바와 같다.
본 발명의 약학적 조성물은 열충격 단백질 27 (HSP27)의 활성을 억제함으로써 암의 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 열충격 단백질 90 (HSP90)를 비롯한 다른 항암제 치료, 및 방사선 치료 등에 대한 내성을 감소시키는 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 암은 폐암, 유방암, 골육종, 전립선암, 자궁경부암, 난소암, 피부암, 구강암, 식도암, 위암, 췌장암, 대장암, 방광암, 요관암, 간암, 신경교종, 뇌종양, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 또는 형질세포성종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 폐암, 유방암 또는 골육종을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 암은 특히 방사선 내지 항암제에 내성을 가진 암일 수 있다. 상기 방사선 내지 항암제에 내성을 가진 암은 예를 들어, 방사선 조사 내지 항암제 투여에 의한 치료가 수행되었던 폐암, 유방암 등을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 외에 다른 항암제를 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 다른 항암제는 예를 들어, 항암성 항생제, 알킬화제, 튜불린 탈중합 억제제, 백금 복합체, 또는 HSP90 억제제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 HSP90 억제제이다.
상기 다른 항암제는 구체적으로, 탁솔, 트라스투주맙, 제피티닙, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 니트로유레아, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 타목시펜, 또는 카보플라틴 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 탁솔 트라스투주맙, 제피티닙, 또는 시스플라틴이다.
상기 HSP90 억제제는 라디시콜(Radicicol) 유도체, 겔다나마이신(Geldanamycin) 유도체, 노보비오신(Novobiocin) 유도체, 또는 퓨린(Purine)을 기본으로 한 인공적으로 합성된 물질 등일 수 있으며, 구체적으로 가네테스핍(Ganetespib, STA-9090), 루미네스핍(Luminespib, NVP-AUY922), 타네스피마이신(Tanespimycin, 17-AAG), 알베스피마이신(Alvespimycin, 17-DMAG), 엘레스클로몰(Elesclomol, STA-4783), 온날레스핍(Onlaespib, AT13387), BIIB021 (6-클로로-9-((4-메톡시-3,5-디메틸피리딘-2-일)메틸)-9H-퓨린-2-아민), PU-H71 (8-[(6-아이오도-1,3-벤조다이옥솔-5-일)설파닐]-9-[3-(프로판-2-일아미노)프로필]퓨린-6-아민), XL888 (2-(부탄-2-일아미노)-4-N-[(1R,5S)-8-[5-(사이클로프로판카보닐)피리딘-2-일]-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-일]-5-메틸벤젠-1,4-다이카복사마이드), KW-2478 (2-[2-에틸-3,5-다이하이드록시-6-[3-메톡시-4-(2-몰폴린-4-일에톡시)벤조일]페닐]-N,N-비스(2-메톡시에틸)아세타마이드), 또는 SNX-5422 ([4-[2-카바모일-5-[6,6-다이메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-5,7-다이하이드로인다졸-1-일]아닐리노]사이클로헥실] 2-아미노아세테이트)일 수 있으며, 바람직하게는 가네테스핍(Ganetespib, STA-9090), 루미네스핍(Luminespib, NVP-AUY922), 타네스피마이신(Tanespimycin, 17-AAG) 또는 알베스피마이신(Alvespimycin, 17-DMAG)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하고, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물은 변형된 열충격 단백질 27 (HSP27) 이량체 형성을 유도하여 정상적인 HSP27 다량체의 형성을 감소시킴으로써, HSP27의 샤페론으로서의 기능을 억제한다. 따라서 본 발명은 암의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있으며, 또한 HSP90 및 기타 항암제의 내성을 감소시킬 수 있고, 방사선에 의한 내성도 감소시킬 수 있다.
도 1은 cell-free 시스템에서 재조합 단백질에서의 HSP27 이량체 생성능을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 2는 시간 의존적 HSP27 이량체 생성능을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 3은 NCI-H460 세포에서 HSP27 이량체 생성능을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 4는 NCI-H460 세포에서 농도 의존적 HSP27 이량체 생성능을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 5는 NCI-H460 세포에서 농도 의존적 HSP70, HSP0 및 HSF1 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 6은 NCI-H460 세포에 본 발명의 화합물을 각각 17-AAG, 탁솔 또는 시스플라틴과 병용 투여했을 때의 변형된 HSP27 이량체, Cleaved Parp 및 Cleaved caspase-3의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 7은 NCI-H460 세포에 본 발명의 화합물을 각각 17-AAG, 탁솔 또는 시스플라틴과 병용 투여했을 때의 세포사멸률 및 세포생존율을 도식화한 것이다.
도 8은 이종 이식 마우스에서 본 발명의 화합물을 단독 처리 또는 17-AAG와 병용 처리하여 종양에 직접 투여한 경우의 종양부피 변화 및 세포 사멸 수를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 화합물을 단독 처리 또는 탁솔화 병용 처리하여 복강 투여한 경우의 종양부피 변화 및 세포 사멸 수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 화합물을 단독 처리 또는 탁솔과 병용 처리하여 종양에 직접 투여한 경우의 종양부피 변화 및 세포 사멸 수를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명은 화합물이 농도 의존적으로 HER 수용체 및 그 하위 단계의 신호 전달 단백질의 저해 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 12는 본 발명의 화합물을 트라스투주맙과 병용 처리한 경우의 HER2 신호 전달 저해 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 13은 본 발명의 화합물을 트라스투주맙과 병용 처리한 경우의 세포 사멸 유도 단백질 발현 증진 효과 및 세포 사멸 억제 단백질 발현 감소 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 14는 본 발명의 화합물을 트라스투주맙과 병용 처리한 경우의 세포 성장 저해율을 도식화한 것이다.
도 15는 본 발명의 화합물을 트라스투주맙과 병용 처리한 경우의 종양크기, 종양 부피 변화 및 생존율을 도식화한 것이다.
도 16은 본 발명의 화합물을 제피티닙과 병용 처리한 경우의 세포 사멸 유도 단백질 발현 증진 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 17은 본 발명의 화합물을 제피티닙과 병용 처리한 경우의 세포 성장률을 도식화한 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예 등은 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 화합물 1 (5-히드록시-2- 메틸 -7-(티이란-2- 일메톡시 )-4H- 크로멘 -4-온) 및 화합물 2 (2-메틸-5,7-비스(티이란-2-일메톡시)-4H-크로멘-4-온)의 합성
5,7-디히드록시-2-메틸-4H-크로멘-4-온 (0.50 g, 2.60 mmol)와 K2CO3(0.72g,5.20mmol)이 DMF/아세톤(20 mL/10 mL) 용매에 들어있는 혼합물에 에피티오클로로히드린(1.13 g, 10.40 mmol)을 넣고 90℃ 에서 21 시간 교반한 후 실온이 될 때까지 정치하였다. 이 반응 혼합물에 물을 넣고 에틸 아세테이트로 추출하고 유기층을 모아 물과 브라인으로 세척하였다. 유기용매에 무수 MgSO4를 넣어 남은 수분을 제거하고, 용매는 감압하에서 증류 제거하였다 남은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: CH2Cl2→에틸 아세테이트:n-헥세인=1:1)로 정제하여 화합물 1 (상아색 고체, 0.32 g, 46.8 %)과 화합물 2 (오렌지색 고체, 0.08 g, 8.7%)를 얻었다.
화합물 1: R f 0.36 (에틸 아세테이트:n-헥세인=1:3); mp: 152-153 ℃; HPLC: R T 5.91 min (purity: 99.39%); 1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ 2.33 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.63 (dd, J = 6.4, 0.8 Hz, 1H), 3.24-3.30 (m, 1H), 3.97 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 6.33 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 12.70 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3,100 MHz) 20.7, 24.0, 31.0, 73.1, 93.2, 98.6, 105.7, 109.1, 158.3, 162.5, 164.1, 167.1, 182.7 ppm
화합물 2: R f 0.14 (에틸 아세테이트:n-헥세인=1:1); mp: 95-96 ℃; HPLC: R T 4.77min (purity: 99.0%); 1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ 2.27 (s, 3H), 2.34 (dd, J = 5.6, 1.6 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 5.2, 0.8 Hz, 1H), 2.63-2.66 (m, 2H), 3.24-3.30 (m, 1H), 3.38-3.44 (m, 1H), 3.91 (dd, J = 10.0, 7.2 Hz, 1H), 3.99 (dd, J = 10.0, 6.8 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 10.0, 5.6 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 10.0, 4.8 Hz, 1H), 6.00 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 2.4 Hz, 1H); 13C-NMR (CDCl3,100 MHz) 20.0, 23.9, 24.6, 30.9, 31.1, 73.1, 74.2, 94.5, 98.8, 109.9, 112.2, 159.9, 160.2, 162.4, 163.4, 177.4 ppm.
실시예 2: 화합물 3 (5-히드록시-7-( 옥시란 -2- 일메톡시 )-2-페닐-4 H - 크로멘 -4-온) 및 화합물 4 (5,7-비스(옥시란-2-일메톡시)-2-페닐-4 H -크로멘-4-온)의 합성
5,7-디히드록시플라본 (1.00 g, 3.93 mmol)와 K2CO3(1.09 g, 7.86 mmol)이 DMF/아세톤 (12 mL/4 mL) 용매에 들어있는 혼합물에 에피클로로히드린 (1.82 g, 19.65 mmol)을 넣고 90 ℃ 에서 20 시간 교반한 후 실온이 될 때까지 정치하였다. 이 반응 혼합물에 물을 넣고 에틸 아세테이트로 추출하고 유기층을 모아 물과 브라인으로 세척하였다. 유기용매에 무수 MgSO4를 넣어 남은 수분을 제거하고, 용매는 감압하에서 증류 제거하였다 남은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (전개용매: MeOH:CHCl3=3:97→4:96)로 정제하여 화합물 3 (상아색 고체, 0.07 g, 5.7%)과 화합물 4 (상아색 고체, 0.30 g, 20.8%)를 얻었다.
화합물 3: R f 0.24 (에틸 아세테이트:n-헥세인=1:3); HPLC: RT 5.67 min(purity: 100%);1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ2.79 (dd, J = 4.4, 2.4 Hz, 1H), 2.95 (dd, J = 4.4, 4.0 Hz, 1H), 3.37-3.41 (m, 1H), 4.00 (dd, J = 11.2, 6.0 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 11.2, 2.8 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.68 (s, 1H), 7.51-7.56 (m, 3H), 7.87-7.90 (m, 2H), 12.73 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3,100MHz) 44.6, 49.7, 69.2, 93.3, 98.6, 105.9, 106.0, 126.3, 129.1, 131.3, 131.9, 157.8, 162.3, 164.1, 164.3, 182.5 ppm; HRMS-ESI(m/z) [M-H]- C18H15O5 calcd 311.0914, found 311.0918.
화합물 4: R f 0.39 (MeOH:CHCl3=1:24); HPLC: RT 7.72 min (purity: 98.89%); 1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ 2.80 (dd, J = 4.8, 2.8 Hz, 1H), 2.95-2.97 (m, 2H), 3.14-3.16 (m, 1H), 3.38-3.43 (m, 1H), 3.44-3.48 (m, 1H), 6.50 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 7.48-7.52 (m, 3H), 7.85-7.88 (m, 2H); 13C-NMR (CDCl3,100MHz) 44.6, 45.0, 49.8, 50.2, 69.2, 69.3, 94.5, 98.3, 109.1, 110.0, 126.0, 129.0, 131.3, 131.5, 159.7, 159.8, 160.8, 162.6, 177.2 ppm; HRMS-ESI(m/z) [M-H]- C21H19O6 calcd 367.1176, found 367.1183.
실시예 3: 화합물 5 (5-히드록시-2-페닐-7-(티이란-2- 일메톡시 )-4H- 크로멘 -4-온) 및 화합물 6 (2-페닐-5,7-비스(티이란-2-일메톡시)-4H-크로멘-4-온)의 합성
5,7-디히드록시플라본 (0.50 g, 1.97 mmol)와 Cs2CO3 (1.28g, 3.93mmol)이 DMF/아세톤 (5 mL/15 mL) 용매에 들어있는 혼합물에 에피클로로히드린 (0.64 g, 5.91 mmol)을 넣고 80℃ 에서 20 시간 교반한 후 실온이 될 때까지 정치하였다. 이 반응 혼합물에 물을 넣고 에틸 아세테이트로 추출하고 유기층을 모아 물과 brine으로 세척하였다. 유기용매에 무수 MgSO4를 넣어 남은 수분을 제거하고, 용매는 감압하에서 증류 제거하였다 남은 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (전개용매: CH2Cl2→에틸 아세테이트:n-헥세인=2:1)로 정제하여 화합물 5 (노란색 고체, 0.05 g, 8.0%)와 화합물 6 (노란색 고체, 0.08 g, 8.9%)을 얻었다.
화합물 5: R f 0.47 (에틸 아세테이트:n-헥세인=1:3); HPLC: RT 8.30 min (purity: 98.56%); 1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 2.36 (dd, J = 5.2, 1.2 Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 6.4, 1.2 Hz, 1H), 3.27-3.33 (m, 1H), 4.00 (dd, J = 10.4, 6.8 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 10.0, 5.2 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.68 (s, 1H), 7.50-7.56 (m, 3H), 7.87-7.90 (m, 2H), 12.73 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3,100MHz) 23.8, 30.7, 73.0, 93.2, 98.7, 106.0, 126.3, 129.1, 131.3, 131.9, 157.8, 162.3, 164.1, 164.2, 182.5 ppm; 13C-NMR (CDCl3,100 MHz) 44.9, 50.2, 69.3, 112.8, 113.2, 115.6, 121.7, 124.8, 129.6, 129.8, 130.8, 133.1, 145.0, 152.0, 157.2, 192.2 ppm; HRMS-ESI (m/z) [M-H]- C18H15O4S calcd 327.0686, found 327.0688.
화합물 6: R f 0.22 (에틸 아세테이트:n-헥세인=1:1); HPLC: RT 6.23 min (purity: 97.82%); 1H-NMR (CDCl3,400 MHz)δ 2.36 (dd, J = 5.2, 1.2 Hz, 1H), 2.51 (dd, J = 5.2, 1.6 Hz, 1H), 2.64-2.69 (m, 2H), 3.27-3.33 (m, 1H), 3.41-3.47 (m, 1H), 3.95 (dd, J = 10.4, 3.2 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 10.4, 3.2 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 10.0, 5.6 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 10.4, 4.8 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 7.48-7.52 (m, 3H), 7.84-7.87 (m, 2H); 13C-NMR (CDCl3,100 MHz) 23.8, 30.7, 73.0, 93.2, 98.7, 106.0, 126.3, 129.1, 131.3, 131.9, 157.8, 162.3, 164.1, 164.2, 182.5 ppm; 13C-NMR (CDCl3,100 MHz) 23.7, 24.4, 30.7, 31.0, 73.0, 74.0, 94.5, 98.8, 109.1, 110.1, 126.0, 129.0, 131.3, 131.5, 159.7, 160.8, 162.5, 177.2 ppm; HRMS-ESI (m/z) [M-H]- C21H19O4S2 calcd 399.0719, found 399.0723.
<실험예>
실험예 1: 재조합 단백질에서의 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
1-1. 화학식 Ⅰ의 화합물의 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
본 발명의 화학식 Ⅰ의 화합물의 열충격 단백질 27 (HSP27) 변형 이량체 생성능을 확인하고자, HSP27의 설치류 호모로그인 HSP25 Wild type(HSP25WT) 단백질을 사용하였다. HSP25WT는 열충격 단백질 25 (HSP25)를 발현하는 플라스미드를 사용하여 제작하였다.
화합물 1, 화합물 4 및 화합물 6을 HSP25WT 단백질에 각각 50 μM 농도로 3시간 동안 처리하고, 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
웨스턴 블랏을 수행하기 위해 상기 화합물 1, 화합물 4 및 화합물 6을 처리한 HSP25WT 단백질을 1X PBS(0.14 M NaCl, 2.68 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.83mM KH2PO4)로 2회 세척한 후 Radio Immunoprecipitation Polyacrylamide Assay buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA,1% NP-40, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 1mM β-글리세로포스페이트, 1 mM Na3VO4, 4mM NaF)에 용해시켰다. 세포 현탁액을 13000 rpm으로 30분간 원심분리를 수행하여 상층액만을 취하였다.
같은 양의 단백질을 함유하는 샘플을 만들기 위하여, Bradford assay로 단백질 양을 측정하였다. Protein Dye 1 mL에 standard로 1% BSA 용액을 8, 6, 4, 2, 0 μL를 넣고, 상층액 2 μL를 넣어 96-웰 플레이트에 200 μL씩 분주하고, ELISA 리더기에 넣어 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
6X 시료 버퍼(0.35 M Tris(pH6.8), 3% 글리세롤, 1% Sodium Dodecyl Sulfate, 6 mM Dithiothreitol)를 넣어 같은 양의 단백질을 함유하는 샘플을 만들었다. 샘플을 5분간 100 ℃ 물에 담가 끓이고 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분석하였다. 웨스턴 블랏을 위한 일차 항체는 Goat polyclonal anti-HSP27(sc-1049) 및 β-actin(sc-47778)를 사용하였으며, 이차항체는 Donkey anti goat(sc-2020), Goat anti rabbit(sc-2004), Goat anti mouse(sc-2005)를 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 화합물을 처리한 경우 HSP27 이량체의 생성이 증가함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 화합물이 HSP27의 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
1-2. 시간 의존적 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
화합물 1 50 μM을 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12 또는 24시간 처리하였다. 상기 실험예 1-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 HSP27 변형 이량체의 생성 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 화합물의 투여시간에 비례하여, HSP27 이량체의 생성이 증가함을 확인하였다.
실험예 2: 세포에서의 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
2-1. NCI-H460 세포에서의 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
세포에서의 HSP27의 변형 이량체 생성능 정도를 확인하기 위하여 본 발명의 화합물1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6을 각각 비소세포폐암 세포인 NCI-H460에 10 μM 농도로 12시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 10% FBS와 1X Antibiotic-Antimycotic (GIBCO-Invitrogen, Paisley, Scotland, UK)가 포함된 RPMI 1640 (RPMI, GIBCO-Invitrogen, Paisley, Scotland, UK)배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하였다.
웨스턴 블랏을 수행하기 위해 상기 화합물 1 내지 화합물 6을 각각 처리한 세포를 1X PBS(0.14 M NaCl, 2.68 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.83mM KH2PO4)로 2회 세척한 후 Radio Immunoprecipitation Polyacrylamide Assay buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA,1% NP-40, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 1mM β-글리세로포스페이트, 1 mM Na3VO4, 4mM NaF)에 용해시켰다. 세포 현탁액을 13000 rpm으로 30분간 원심분리를 수행하여 상층액만을 취하였다.
같은 양의 단백질을 함유하는 샘플을 만들기 위하여, Bradford assay로 단백질 양을 측정하였다. Protein Dye 1 mL에 standard로 1% BSA 용액을 8, 6, 4, 2, 0 μL를 넣고, 상층액 2 μL를 넣어 96-웰 플레이트에 200 μL씩 분주하고, ELISA 리더기에 넣어 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
6X 시료 버퍼(0.35 M Tris(pH6.8), 3% 글리세롤, 1% Sodium Dodecyl Sulfate, 6 mM Dithiothreitol)를 넣어 같은 양의 단백질을 함유하는 샘플을 만들었다. 샘플을 5분간 100 ℃ 물에 담가 끓이고 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분석하였다. 웨스턴 블랏을 위한 일차 항체는 Goat polyclonal anti-HSP27(sc-1049) 및 β-actin(sc-47778)를 사용하였으며, 이차항체는 Donkey anti goat(sc-2020), Goat anti rabbit(sc-2004), Goat anti mouse(sc-2005)를 사용하였다.
분석 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 화합물을 처리한 경우 HSP27 이량체가 증가하고, HSP27 단량체가 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 화합물이 HSP27의 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
2-2. 농도 의존적 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
농도 의존적 HSP27 변형 이량체 생성을 확인하고자 비소세포폐암 세포인 NCI-H460에 화합물 1을 5, 10, 20 또는 40 μM 농도로 처리하고, 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 세포배양 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 화합물이 투여량이 증가할수록 HSP27 이량체의 양이 증가하고, HSP27 단량체의 양이 감소함을 확인하였다.
실험예 3: HSP70, HSP90 및 HSF1의 발현량에 미치는 영향 확인
HSP70, HSP90 및 열충격 단백질의 발현을 유도시키는 열충격 인자 1 (HSF1) 발현량에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해, 본 발명의 화합물 1을 NCI-H460 세포에 0, 5, 10, 20, 40 μM가 되도록 12시간 처리하고, 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 세포배양 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 화합물 1은 HSP27에 특이적으로 작용하여 HSP27 변형 이량체를 농도 의존적으로 증가시켰으며, 또한 HSF1의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다.
실험예 4: 항암제와의 병용 처리시의 HSP27 변형 이량체 생성능 확인
HSP90의 억제제로 알려진 17-AAG와 항암 치료에 이용되는 항암제인 탁솔과 시스플라틴을 이용하여, 항암제 또는 HSP90 억제제의 투여시 촉진되는 HSP27의 활성을 본 발명의 화합물이 저해할 수 있는지 확인하였다.
NCI-H460 세포에 10 μM 농도로 본 발명의 화합물 1을 처리하고 0.01 μM 탁솔, 2 μM 시스플라틴과 3 μM 17-AAG를 처리한 후 12시간 동안 배양하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 탁솔, 시스플라틴 또는 17-AAG과 본 발명의 화합물 1을 병용 처리한 경우 HSP27 이량체의 생성이 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명 화합물의 투여가 항암제와 HSP90 저해제에 대한 내성 극복에 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 5: 항암제와의 병용 처리시의 세포 사멸 유도 단백질 저해 확인
세포 사멸 유도 단백질인 Cleaved Parp와 Cleaved caspase-3의 발현양을 측정하여 본 발명의 화합물과 항암제의 병용 투여가 세포 사멸에 미치는 영향을 확인하였다.
60mm 세포 배양 디쉬에 3 x 105개의 세포를 분주 후 배양하고, 실험예 4와 같은 각 화합물들을 24시간 병용 처리하여 Cleaved Parp와 Cleaved caspase-3의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 탁솔, 시스플라틴 또는 17-AAG를 단독으로 처리했을 때보다 본 발명의 화합물 1과 병용으로 처리했을 때 세포 사멸 유도 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 6: 항암제와 병용 처리시 세포사멸 효과 확인
본 발명의 화합물의 세포사멸 효과 및 본 발명의 화합물과 다른 항암제와의 병용 투여시의 세포사멸 효과를 확인하기 위하여, MTT 검정을 수행하였다.
NCI-H460 세포에 10 μM 농도로 본 발명의 화합물 1을 처리하고 0.01 μM 탁솔, 2 μM 시스플라틴과 3 μM 17-AAG를 병용처리한 후 24시간 배양하였다.
96 웰 플레이트에 NCI-H460 세포를 같은 양으로 분주하고 플레이트에 잘 붙을 때까지 배양한 후 제시한 농도의 화합물을 처리한 이후 24시간 동안 더 배양한 후 세포의 배지를 제거하고 1X PBS로 세척하고 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT; Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) 시약을 1X PBS에 5 mg/ml 농도로 희석하여 100 μL씩 칸마다 분주한 후 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 정도 배양한 후 세포가 보라색으로 변한 것이 확인되면 상층액을 제거하고 DMSO를 100 μL씩 넣어 생성된 Formazan 결정을 잘 용해시켜주었다. 용해가 끝나나 후 ELISA 리더기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 화합물 1을 단독 처리했을 때보다 다른 항암제와 병용처리 했을 때 세포사멸이 더 높게 나타남을 확인하였다. 상기 결과를 통해서, 본 발명의 화합물이 HSP27을 변형 이량체로 만들어 다량체 생성을 저해함으로써 샤페론 기능을 수행하지 못하게 하여, 항암제에 대한 민감성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
실험예 7: 항암제와 병용 처리시 이종이식 동물모델에서의 항암 효과 확인
7-1. 종양 크기 확인
BALB/C nude mouse에 NCI-H460 세포 이종이식을 수행한 후에, in vivo에서 양상을 확인하였다.
BALB/C nude mouse에 NCI-H460 세포 1x106를 왼쪽 다리 피하에 주사하여 종양을 형성하였으며, 형성된 종양이 100~300mm3에 도달했을 때 아래와 같은 7개 투여군 및 대조군으로 나누어 약물을 투여하였다.
Figure 112017073341853-pat00008
17-AAG는 25 mg/kg의 농도로 100 μl 씩 일주일에 3번 복강 투여하였고, 탁솔은 2 mg/kg 농도로 100 μl씩 일주일에 1번 복강 투여하였고, 본 발명의 화합물 1은 6.8 mg/kg 농도로 일주일에 3회 복강투여 또는 종양에 직접 주사 하였다.
그 결과, 도 8의 (A)에 나타낸 바와 같이, 화합물 1과 17-AAG를 병용 투여한 경우, 각각을 단독으로 투여한 경우보다 종양 크기가 더 많이 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 화합물이 효과적으로 HSP90 억제제의 민감성을 증가시키고, 내성을 감소시킴을 알 수 있다.
또한, 도 9 및 도 10의 (A)에 나타낸 바와 같이, 화합물 1과 탁솔을 병용 투여한 투여군의 경우, 화합물 1과 탁솔을 각각 단독으로 투여한 투여군보다 종양 크기가 크게 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 화합물이 탁솔과 같은 항암제의 민감성 증가 및 내성 감소에 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있다.
7-2. 세포 사멸이 유도된 암 세포수 확인
상기 실험예 6-1의 이종 이식 마우스의 종양을 적출하여 면역조직화학 염색법으로 세포 사멸이 유도된 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 8의 (B)에 나타난 것과 같이, 본 발명의 화합물은 17-AAG에 의해 유도되는 세포 사멸을 증가시키는 경향을 뚜렷하게 확인 할 수 있었다. 또한, 도 9 및 도 10의 (B)에 나타난 것과 같이, 본 발명의 화합물 1은 탁솔에 의해 유도되는 세포사멸을 증가시키는 경향을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 화합물이 HSP90 억제제, 탁솔을 비롯한 항암제의 민감성 증가 및 내성 감소에 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 8: HER 수용체 신호전달 체계의 저해 효과 확인
본 발명의 화합물이 종양의 성장에 관여하는 HER(Human Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR, 인간 표피성장인자 수용체) 및 그 하위 단계의 신호전달 단백질에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
6-웰 플레이트의 한 개 웰 당 3 x 105 개의 BT474 세포를 분주한 후, 10 % FBS와 0.1 % 페니실린-스트렙토마신(penicillin-streptomycin, Hyclone, USA)이 포함된 RPMI 배지 (hyclone, USA)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24시간 배양하고, 본 발명의 화합물 1을 각각 0, 5, 10, 20 μM로 16시간 처리하였다. 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 HER, HER2, p-HER2, HER3, p-HER3, HER4, p-HER4, AKT, p-AKT, MAPK(미토겐활성화 단백질 키나아제), p-MAPK, HSP27 이량체, HSP27 단량체, HSP90 및 GADPH의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 화합물 1에 의해 농도 의존적으로 HSP27 이량체의 양이 증가함에 따라 HER 수용체 및 그 하위 단계의 신호 전달 단백질을 농도 의존적으로 감소시켰다.
실험예 9: 트라스투주맙과 병용 처리시 HER2 수용체 신호전달 체계 저해 효과 확인
HER2 수용체의 세포외 도메인(extracellular domain, ECDs)을 표적으로 하는 재조합 인간화 단클론 항체인 트라스투주맙에 대한 반응성이 높은 세포와 저항성을 갖는 세포를 각각 이용할 경우, 본 발명의 화합물에 의해 트라스투주맙에 대한 내성이 극복될 수 있는지 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
트라스투주맙에 대한 반응성이 높은 BT474 세포주, 이에 3 mg/ml의 트라스투주맙을 16주간 처리하여 구축한 내성 세포 (BT474-내성) 및 트라스투주맙에 대한 내성 환자 유래 세포주 (JIMT-1)를 각각 본 발명의 화합물 1을 10 μM로 처리하고, 10 μg/ml 트라스투주맙을 처리한 후, 12시간 동안 배양하였다. 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여, HER2, p-AKT, p-MAPK, HSP27 이량체, HSP27 딘량체, HSP90 및 GADPH의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙과 본 발명의 화합물 1을 병용 처리한 경우, 모든 세포주에서 트라스투주맙 및 본 발명의 화합물 1을 단독으로 처리했을 때 보다, HER2 수용체 및 그 하위단계 신호 전달 체계가 효과적으로 저해됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 화합물이 트라스투주맙에 대한 내성 극복에 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 10: 트라스투주맙과 병용 처리시 세포 사멸 유도 단백질 증진 효과 확인
세포 사멸 유도 단백질인 Cleaved Parp 및 Cleaved caspase-7과 세포 사멸 억제 단백질인 bcl-2의 발현양을 측정하여 본 발명의 화합물과 트라스투주맙의 병용 투여가 세포 사멸에 미치는 영향을 확인하였다.
BT474, BT474-내성 세포주 및 JIMT-1 세포주 각각에 본 발명의 화합물 1을 10 μM로 처리하고, 10 μg/ml 트라스투주맙을 처리한 후, 12시간 동안 배양하였다. 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여, c-PARP, 프로-카스파아제 7(pro-caspase 7), c-카스파아제 7(c-caspase 7), blc-2 및 α-튜블린의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 모든 세포주에서 트라스투주맙 및 본 발명의 화합물 1을 단독으로 처리한 군 보다 병용 처리한 군에서 세포 사멸 유도 단백질의 발현이 증가하였고, 세포 사멸 억제 단백질의 발현은 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 11: 트라스투주맙과 병용 처리시 세포 성장 저해 효과 확인
본 발명의 화합물과 트라스투주맙의 병용 투여가 세포 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 다음과 같은 WST(Water Soluble Tetrazolium salt) 검정을 수행하였다.
BT474, BT474-내성 세포주, JIMT-1 세포주를 각각 96-웰 플레이트의 한 개 웰 당 1 x 104 개로 분주하여 24시간 배양하였다. 이에 10 μM 농도로 본 발명의 화합물 1을 처리하고 10 μg/ml 트라스투주맙을 병용 처리한 후, 24시간 더 배양하였다. WST 시약을 한 개 웰 당 10 μL처리하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 1시간 정도 배양한 후 ELISA 리더기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 모든 세포주에서 트라스투주맙 및 본 발명의 화합물 1을 단독으로 처리한 군 보다 병용 처리한 군에서 세포 성장 저해율이 더욱 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 12: 트라스투주맙과 병용 처리시 이종이식 동물모델에서의 항암 효과 확인
12-1. 종양 크기 확인
BALB/C 누드 마우스(BALB/C nude mouse)에 BT474 세포 이종이식을 수행한 후에, in vivo에서 양상을 확인하였다.
BALB/C nude mouse에 BT474 세포 1x107을 오른쪽 다리 피하에 주사하여 종양을 형성하였으며, 형성된 종양이 ~100 mm3에 도달했을 때 아래와 같은 3개 투여군 및 대조군으로 나누어 약물을 투여하였다.
Figure 112017073341853-pat00009
트라스투주맙은 1 mg/kg의 농도로 100 μl 씩 일주일에 1번 복강 투여하였고, 본 발명의 화합물 1은 20 mg/kg 농도로 100 μl씩 이틀에 1번 복강 투여하였다.
그 결과, 도 15의 (A)에 나타낸 바와 같이, 화합물 1과 트라스투주맙을 병용 투여한 경우 트라스투주맙 및 본 발명의 화합물 1 각각을 단독으로 투여한 경우보다 종양 크기가 더 많이 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과를 통해 본 발명의 화합물이 트라스투주맙에 대한 반응성을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.
* p < 0.05 vs 대조군,
# p < 0.05 vs 화합물 1,
## p < 0.05 vs 트라스투주맙
12-2. 종양 부피 변화 확인
도 15의 (B)에 나타낸 바와 같이, 화합물 1과 트라스투주맙을 병용 투여한 투여군의 경우, 화합물 1과 트라스투주맙을 각각 단독으로 투여한 투여군과 비교하여 종양 부피의 변화가 가장 적게 일어남을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 화합물이 트라스투주맙에 대한 민감성을 증가시켜 약물 효능을 증진시키는데 효과가 있음을 알 수 있다.
12-3. 생존율 확인
도 15의 (C)에 나타낸 바와 같이, 화합물 1과 트라스투주맙을 각각 단독으로 투여한 투여군이 대조군과 비교하여 생존률이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 화합물 1과 트라스투주맙을 병용 투여한 경우, 화합물 1과 트라스투주맙을 각각 단독으로 투여한 투여군보다 더 높은 생존률을 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 화합물이 트라스투주맙에 대한 치료 효능을 증진시켜 생존률의 개선을 유도하는데 탁월한 효과를 가짐을 알 수 있다.
실험예 13: 제피티닙과 병용 처리시 세포 사멸 유도 단백질 증가 효과 확인
세포 사멸 유도 단백질인 Cleaved Parp와 Cleaved caspase-3의 발현양을 측정하여 본 발명의 화합물과 EGFR(또는 HER1)의 타이로신 인산화 효소 도메인을 표적으로 하는 저해제인 제피티닙의 병용 투여가 세포 사멸에 미치는 영향을 확인하였다.
제피티닙에 민감하게 반응하는 세포주인 HCC827과 PC9 그리고 제피티닙에 내성을 갖는 세포주인 NCI-H1650 각각에 본 발명의 화학식 1을 10 μM로 처리하였다. 또한, 제피티닙을 HCC827 세포주에는 각각 0.05 μM 및 0.01 μM을 처리하고, PC9 세포주에는 각각 1 μM 및 5 μM을 처리하고, NCI-H1650 세포주에는 각각 5 μM 및 10 μM을 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여, EGFR, 절단된 PARP, 절단된 카스파아제 3 및 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 제피티닙에 민감한 세포주와 내성을 갖는 세포주 모두에서 제피티닙을 단독으로 처리했을 때보다 본 발명의 화합물 1과 병용으로 처리했을 때 세포 사멸 유도 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 14: 제피티닙과 병용 처리시 세포 성장 저해 효과 확인
본 발명의 화합물이 제피티닙과 병용 투여시 세포 성장이 저해되는지 확인하기 위하여, MTT 검정을 수행하였다.
제피티닙에 민감하게 반응하는 세포주인 HCC827과 내성을 갖는 세포주인 NCI-H150을 각각 96-웰 플레이트 한 웰 당 1 x 104 개로 분주하여 24 시간 배양하였다. 이에 10 μM 농도로 본 발명의 화합물 1을 처리하고 2 μM 농도로 제피티닙을 병용 처리한 후 24 시간 더 배양하였다. MTT 어세이 시약을 한 웰 당 100 μL 처리하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 1시간 정도 배양한 후 ELISA 리더기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 제피티닙에 민감한 세포주와 내성을 갖는 세포주 모두에서 제피티닙 및 본 발명의 화합물 1을 단독으로 처리했을 때보다 본 발명의 화합물 1과 병용으로 처리했을 때 세포 성장이 더욱 많이 저해되는 것을 확인하였다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 Ⅰ]
    Figure 112018048047512-pat00010

    상기 화학식 Ⅰ식에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소; 또는 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자와 1 내지 6의 탄소원자로 구성된 헤테로시클릴C1-4알킬이고,
    R3는 C1-10알킬, C3-10시클로알킬, 또는 C6-14아릴이고, 여기서 R3의 하나 이상의 수소는 각각 독립적으로 R4로 치환 또는 비치환되고,
    R4는 F, Br, Cl, I, OH, OMe, OEt, NH2, NMe2, CN, COOH, COMe, COOMe, CONH2, 또는 C1-4알킬이며, R3이 C6-14아릴인 경우 R1은 수소가 아니다.
  2. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소,
    Figure 112017073341853-pat00011
    또는
    Figure 112017073341853-pat00012
    인 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서, R3는 C1- 10알킬 또는 C3- 10시클로알킬인 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  4. 제1항에 있어서, R3는 메틸 또는 페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  5. 제1항에 있어서, 다음 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure 112018048047512-pat00031
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 골육종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 항암 활성이 있는 추가적인 유효성분을 더 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추가적인 유효성분은 열충격 단백질 90 (HSP90) 억제제인 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 열충격 단백질 90 (HSP90) 억제제는 17-알릴아미노-17-디메톡시겔다나마이신(17-AAG) 또는 17-디메틸아미노에틸아미노-17-디메톡시겔다나마이신(17-DMAG) 중 어느 하나 이상인 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 추가적인 유효성분은 탁솔, 트라스투주맙, 제피티닙 및 시스플라틴로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 약학적 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 암은 방사선 요법 내성 암 또는 항암제 내성 암인 약학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
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