PT755446E - Cardiotrofina e suas utilizações - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Cardiotrofina e suas utilizações"

Campo da invenção

Este pedido refere-se a um factor de hipertrofia cardiaca (também conhecido como cardiotrofina) para modular a função cardíaca no tratamento da insuficiência cardíaca e para modular a função neural no tratamento de distúrbios neurológicos.

Antecedentes da invenção A insuficiência cardíaca afecta aproximadamente três milhões de americanos, desenvolvendo-se em cerca de 400 000 em cada ano. É actualmente um dos principais diagnósticos de admissão nos EUA. Avanços recentes no tratamento de doenças cardíacas agudas, incluindo enfarte do miocárdio agudo, estão a resultar numa população cada vez maior que de pacientes irão eventualmente desenvolver insuficiência cardíaca crónica. A terapia actual para a insuficiência cardíaca é essencialmente dirigida para a utilização de inibidores da enzima de conversão de angiotensina (ACE) e diuréticos. Apesar de prolongarem a sobrevivência no quadro de insuficiência cardíaca, os inibidores da ACE parecem retardar a progressão em direcção a uma insuficiência cardíaca de fase terminal e números substanciais de pacientes que tomam inibidores de ACE têm insuficiência cardíaca de classe funcional III. Além disso, os inibidores de ACE parecem ser consistentemente incapazes de aliviar os sintomas em mais de 60% dos pacientes com insuficiência cardíaca e reduzem a mortalidade por insuficiência cardíaca apenas em aproximadamente 15-20%. O transplante de coração é limitado pela disponibilidade de corações dadores. Além disso, com a excepção da digoxina, a administração crónica de agentes inotrópicos positivos não tem resultado numa droga útil sem efeitos secundários adversos concomitantes, tais como arritmogénese aumentada, morte repentina ou outros efeitos secundários prejudiciais relacionados com a sobrevivência. Estas deficiências na 2 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ terapia actual sugerem a necessidade de outras abordagens terapêuticas.

Um grande volume de dados sugere que a hipertrofia patológica do músculo cardíaco no quadro de insuficiência cardíaca pode ser prejudicial, caracterizada por dilatação da câmara ventricular, um aumento na tensão/esforço da parede, um aumento no comprimento versus largura das células do músculo cardíaco e um decréscimo simultâneo do desempenho e função cardíacos. Estudos demonstraram que a activação de hipertrofia fisiológica ou compensatória pode ser benéfica no quadro de insuficiência cardíaca. De facto, os efeitos dos inibidores de ACE têm sido implicados não só na remoção da sobrecarga do coração, mas também na inibição da resposta hipertrófica patológica que se presume estar ligada ao sistema de renina-angiotensina localizado no miocárdio.

Ao nível da biologia molecular, o coração funciona como um sincício de miócitos e células de suporte envolventes, designadas por não-miócitos. Apesar de os não-miócitos serem essencialmente fibroblastos/células do mesênquima, eles também incluem células endoteliais e células do músculo liso. De facto, embora os miócitos constituam a maioria da massa do miocárdio adulto, eles representam apenas cerca de 30% dos números de células totais presentes no coração. Devido à sua relação estreita com os miócitos cardíacos in vivo, os não-miócitos são capazes de influenciar o crescimento e/ou desenvolvimento dos miócitos. Esta interacção pode ser mediada directamente por contacto célula-célula ou indirectamente através da produção de um factor parácrino. Esta associação in vivo é importante, uma vez que tanto os números de não-miócitos como a matriz extracelular com a qual interagem estão aumentados na hipertrofia do miocárdio e em resposta ao dano e enfarte. Estas alterações estão associadas com uma função do miocárdio anormal.

Os miócitos cardíacos são incapazes de se dividir pouco tempo após o nascimento. 0 crescimento posterior ocorre por hipertrofia das células individuais. Têm-se desenvolvido modelos de cultura de células da hipertrofia de miócitos para compreender melhor os mecanismos da hipertrofia de miócitos cardíacos. Simpson et al., Circ. Res., 51: 787-801 (1982); 3 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Chien et al., FASEB J., _5: 3037-3046 (1991). A maioria dos estudos de miócitos cardíacos em cultura é concebida para minimizar a contaminação por não-miócitos. Veja-se, por exemplo, Simpson e Savion, Cir. Cres., 50: 101-116 (1982);

Libby, J. Mol. Cell. Cardiol., 16: 803-811 (1984); Iwaki et al.r J. Biol. Chem., 265: 13809-13817 (1990).

Shubaita et al., J. Biol. Chem., 265: 20555-20562 (1990) documentaram a utilidade de um modelo de cultura para identificar factores de crescimento derivados de péptidos, tais como endotelina-1 que pode activar uma resposta hipertróf ica. Long et al., Cell Requlation, 2_: 1081-1095 (1991) investigaram o efeito de não-miócitos cardíacos no crescimento de miócitos cardíacos em cultura. O crescimento hipertrófico de miócitos foi estimulado em culturas de alta densidade com números aumentados de não-miócitos e em co-culturas com números aumentados de não-miócitos. Foi possível reproduzir este efeito dos não-miócitos no tamanho dos miócitos através de meio isento de soro condicionado por culturas de não-miócitos. A principal actividade promotora do crescimento de miócitos nas culturas era a ligação de heparina. As propriedades deste factor de crescimento foram comparadas com vários factores de crescimento que se sabe estarem presentes no miocárdio, incluindo o factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de necrose tumoral (TNF-α) e factor de crescimento transformante-beta I (TGF-βΙ). Também se verificou que o factor de crescimento de Long et ai. era maior que estes outros factores de crescimento conhecidos e que tem um perfil de eluição em heparina-Sepharose diferente do de todos estes factores de crescimento, excepto PDGF. Além disso, ele não foi neutralizado por um anticorpo específico de PDGF. Os autores propuseram que este define uma relação parácrina importante para o crescimento e desenvolvimento de células do músculo cardíaco. Não só existe a necessidade de uma melhoria na terapia da insuficiência cardíaca, tal como insuficiência cardíaca congestiva, mas também uma necessidade de oferecer um tratamento eficaz para distúrbios neurológicos. Os factores neurotróficos, tais como factores de crescimento do tipo insulina, factor de crescimento nervoso, factor neurotrófico 4 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ derivado de cérebro, neurotrofina-3, -4 e -5 e factor neurotrófico ciliar, foram propostos como meios potenciais para aumentar a sobrevivência neuronal, por exemplo, como um tratamento para doenças neurodegenerativas, tais como esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, AVC, epilepsia, doença de Huntington, doença de Parkinson e neuropatia periférica. Seria desejável proporcionar uma terapia adicional para este fim.

Deste modo, constitui um objecto da presente invenção proporcionar uma terapia melhorada para a prevenção e/ou tratamento da insuficiência cardíaca, tal como insuficiência cardíaca congestiva, em particular a promoção de formas fisiológicas de hipertrofia ou inibição de formas patológicas de hipertrofia e para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios neurológicos, tais como neuropatia periférica.

Constitui outro objecto da presente invenção identificar um novo grupo de polipéptidos factor de hipertrofia cardíaca e seus antagonistas, para utilização nestas terapias.

Constitui ainda outro objecto proporcionar um ácido nucleico que codifica para estes polipéptidos e a utilização deste ácido nucleico para produzir os polipéptidos em cultura de células recombinante.

Constitui ainda outro objecto proporcionar derivados e formas modificadas destes polipéptidos, incluindo variantes de sequências de aminoácidos e seus derivados covalentes.

Constitui outro objecto preparar imunogénios para produzir anticorpos contra estes polipéptidos, bem como obter anticorpos capazes de se ligar a estes.

Constitui ainda outro objecto, proporcionar um novo teste de hipertrofia que pode ser utilizado, por exemplo, na clonagem de expressão e purificação destes polipéptidos, na avaliação de clones isolados a partir da clonagem de expressão e na identificação de antagonistas destes polipéptidos. 5 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Estes e outros objectos da invenção serão evidentes para o perito na arte, tendo em consideração o fascículo como um todo.

Sumário da invenção

Foi desenvolvido um teste de hipertrofia de coração de rato neonatal in vitro que permite a clonagem de expressão e a purificação de proteínas do factor de hipertrofia cardíaca (CHF) aqui descrito. A capacidade de teste de 1000 amostras individuais por semana juntamente com os requisitos de um tamanho de amostra pequeno de 100 μΐ ou menos permitiu uma clonagem de expressão e purificação de proteína que teria sido impossível utilizando os métodos actualmente publicados. Assim, numa concretização, a invenção proporciona um método para testar uma amostra de teste quanto a actividade hipertrófica, compreendendo: (a) plaquear placas de 96 poços com uma suspensão de miócitos, a uma densidade celular de cerca de 7,5 x 104 células por ml em meio de Eagle modificado da Dulbecco (D-MEM)/meio F-12 compreendendo insulina, transferrina e aprotinina; (b) cultivar as células; (c) adicionar a amostra de teste (tal como uma que se suspeita que contém um CHF) às células em cultura; (d) cultivar as células com a amostra de teste; e (e) determinar se a amostra de teste tem actividade hipertrófica.

Além do teste, a invenção proporciona um polipéptido factor de hipertrofia cardíaca (CHF) isolado, excluindo o de rato, que partilha pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência traduzida apresentada na Figura 1 e exibe uma actividade biológica de actividade hipertrófica, inotrópica, anti-arrítmica ou neurotrófica de um polipéptido CHF nativo.

Adicionalmente, o polipéptido CHF pode ser seleccionado do grupo constituído pelo polipéptido que é isolado a partir de um mamífero, o polipéptido que é produzido por meios recombinantes e o polipéptido que é produzido por meios sintéticos. Além disso, este polipéptido CHF pode ser 6 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ seleccionado do grupo constituído pelo polipéptido que é humano e o polipéptido que é não imunogénico num humano.

Noutro aspecto, o polipéptido é o CHF humano maduro com a sequência de CHF traduzida apresentada na Figura 5.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo isolado que é capaz de se ligar a CHF e um método para detectar o CHF in vitro ou in vivo compreendendo contactar o anticorpo com uma amostra ou célula que se suspeita que contém CHF e detectar se ocorreu ligação, tal como por ELISA. 0 anticorpo pode compreender anticorpos monoclonais, quiméricos, humanizados, biespecíficos ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método para purificar CHF compreendendo passar uma mistura de CHF numa coluna na qual estão ligados os anticorpos e recuperar a fracção contendo CHF.

Noutros aspectos, a invenção compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica para CHF, um vector que compreende a molécula de ácido nucleico, de preferência um vector de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico ligada operativamente a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector, uma célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico, incluindo células hospedeiras de mamífero e bacterianas e um método para utilizar uma molécula de ácido nucleico que codifica para CHF, para produzir CHF, compreendendo cultivar uma célula hospedeira que compreende a molécula de ácido nucleico. De preferência, a célula hospedeira é transfectada para expressar o ácido nucleico de CHF e o CHF é recuperado da cultura de células hospedeiras e, se segregado, recuperado do meio de cultura.

Noutros aspectos, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico de enquadramento de leitura aberto apresentada na Figura 1 ou Figura 5. 7 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Ainda noutro aspecto, proporciona-se um método para determinar a presença de uma molécula de ácido nucleico de CHF numa amostra de teste compreendendo contactar a molécula de ácido nucleico de CHF com a amostra de teste e determinar se ocorreu hibridação ou compreendendo hibridar a molécula de ácido nucleico de CHF com um ácido nucleico de amostra de teste e determinar a presença de ácido nucleico de CHF.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método para amplificar uma amostra de teste de ácido nucleico compreendendo iniciar a reacção em cadeia com polimerase de ácido nucleico na amostra de teste com a molécula de ácido nucleico de CHF. A invenção também proporciona a utilização de um polipéptido de CHF no fabrico de um medicamento para tratar um distúrbio neurológico, insuficiência cardíaca ou um distúrbio arrítmico ou inotrópico.

Breve descrição das Figuras

As Figuras IA e 1B mostram a sequência de nucleótidos (cadeias de sentido directo e inverso) (SEQ ID NOS: 1 e 2) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO:3) de um clone de ADN de CHF de ratinho. Os nucleótidos complementares sublinhados na posição 27 mostram o início de outro clone de CHF de ratinho utilizado para obter o clone de comprimento total. A Figura 2 alinha a sequência de aminoácidos traduzida do clone de CHF de ratinho (chf.781) (SEQ ID NO:3) com a sequência de aminoácidos do factor neurotrófico ciliar humano (humcntf) (SEQ ID NO: 4) para mostrar o grau de identidade de sequência. A Figura 3 mostra um gráfico da libertação do péptido natriurético atrial (ANP) para fenilefrina (curva padrão) e transfecções em células 293 num teste de hipertrofia cardíaca neonatal. A Figura 4 mostra um gráfico da sobrevivência de neurónios ganglionares ciliares vivos (medido por contagem de 8 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ células) como uma função quer do factor neurotrófico ciliar (CNTF) padrão (em ng/ml), quer de meio condicionado de 293 transfectadas (em fracção de volume de teste) utilizando um padrão de CNTF (círculos), meio de uma transfecção de ADN de CHF de células 293 (triângulos) e meio de uma transfecção de ADN de controlo de células 293 (quadrados).

As Figuras 5A e 5B mostram a sequência de nucleótidos (cadeias de sentido directo e sentido inverso) (SEQ ID NOS:6 e 7) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 8) de um clone de ADN de CHF humano. A Figura 6 alinha a sequência de aminoácidos traduzida do clone de CHF humano (humctl) (SEQ ID NO:8) com a sequência de aminoácidos traduzida do clone de CHF de ratinho (chf.781) (SEQ ID N0:3) para mostrar o grau de identidade de sequência.

Descrição detalhada das concretizações preferidas I. Definições

Em geral, as palavras ou frases seguintes têm a definição indicada quando utilizadas na descrição, exemplos e reivindicações: "CHF" (ou "factor de hipertrofia cardíaca" ou "cardiotrofina" ou "cardiotrofina-1") é definido aqui como sendo qualquer sequência de polipéptido que possui pelo menos uma propriedade biológica (como definido a seguir) de um polipéptido que ocorre naturalmente compreendendo a sequência de polipéptido da Figura 1 ou o seu equivalente humano apresentado na Figura 5. Não inclui o homólogo de rato de CHF, i.e. CHF de espécies de rato. Esta definição inclui não só o polipéptido isolado de uma fonte de CHF nativa, tal como corpos embrióides de murídeo aqui descritos, ou de outra fonte, tais como outras espécies animais excepto o rato, incluindo humanos, mas também o polipéptido preparado por métodos recombinantes ou sintéticos. Também inclui formas variantes incluindo derivados funcionais, alelos, isoformas e seus análogos. 9 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Um "fragmento de CHF" é uma porção de uma sequência de CHF de tamanho total, madura, que ocorre naturalmente, tendo um ou mais resíduos de aminoácido ou unidades de hidrato de carbono eliminadas. 0(s) resíduo de aminoácido eliminado pode ocorrer em qualquer lugar do polipéptido, incluindo no terminal N ou terminal C, ou internamente. 0 fragmento irá partilhar pelo menos uma propriedade biológica em comum com o CHF. Os fragmentos de CHF terão tipicamente uma sequência consecutiva de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 resíduos de aminoácido que são idênticos às sequências do CHF isolado a partir de um mamífero, incluindo o CHF isolado de corpos embrióides de murídeo ou o CHF humano. "Variantes de CHF" ou "variantes da sequência de CHF" como aqui definido significam CHF biologicamente activos como definido a seguir, que têm menos que 100% de identidade de sequência com o CHF isolado da cultura de células recombinante ou de corpos embrióides de murídeo tendo a sequência deduzida descrita na Figura 1, ou com o equivalente humano descrito na Figura 5. Normalmente, uma variante de CHF biologicamente activa terá uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos com o CHF isolado de corpos embrióides de murídeo ou o CHF humano maduro (veja-se Figuras 1 e 5), de preferência pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% e muito preferencialmente pelo menos cerca de 95%.

Um "CHF quimérico" é um polipéptido que compreende CHF de comprimento total, ou um ou mais seus fragmentos fundidos ou ligados a uma segunda proteína, ou um ou mais seus fragmentos. A quimera irá partilhar pelo menos uma propriedade biológica em comum com CHF. A segunda proteína será tipicamente uma citóquina, factor de crescimento ou hormona, tal como hormona de crescimento, IGF-I ou um factor neurotrófico tal como CNTF, factor de crescimento nervoso (NGF), factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), neurotrofina-5 (NT-5), etc.

"CHF isolado", "CHF altamente purificado" e "CHF substancialmente homogéneo" são utilizados de forma permutável 10 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ e significam um CHF que foi purificado a partir de uma fonte de CHF, ou foi preparado por métodos recombinantes ou sintéticos e é suficientemente isento de outros péptidos ou proteínas (1) para obter pelo menos 15 e de preferência 20 resíduos de aminoácido do terminal N ou de uma sequência de aminoácidos interna, utilizando um sequenciador de copo giratório ou o melhor sequenciador de aminoácido disponível comercialmente, tal como existe no mercado ou como modificado por métodos publicados à data de apresentação deste pedido, ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração com prata. Homogeneidade aqui significa menos do que cerca de 5% de contaminação com outra proteínas fonte. "Propriedade biológica" quando utilizado em conjunção quer com "CHF", quer "CHF isolado" significa ter actividade miocardiotrófica, inotrópica, anti-arrítmica ou neurotrófica, ou ter uma função ou actividade efectora ou antigénica in vivo que é directa ou indirectamente provocada ou realizada por um CHF (quer na sua conformação nativa, quer desnaturada), ou um seu fragmento. As funções efectoras incluem ligação ao receptor e qualquer actividade de ligação ao transportador, agonismo ou antagonismo de CHF, especialmente transdução de um sinal proliferativo incluindo replicação, função reguladora de ADN, modulação da actividade biológica de outros factores de crescimento, activação, desactivação, supra ou sub-regulação de receptores, crescimento ou diferenciação celular e semelhantes. No entanto, as funções efectoras não incluem possuir um epítopo ou sítio antigénico que é capaz de ter reacção cruzada com anticorpos produzidos contra o CHF nativo.

Uma "função antigénica" significa possuir um epítopo ou sítio antigénico que é capaz de ter reacção cruzada com anticorpos produzidos contra o CHF nativo cuja sequência é apresentada na Figura 1, ou outro CHF nativo de mamífero, incluindo o homólogo humano cuja sequência é apresentada na Figura 5. A função antigénica principal de um polipéptido CHF é ligar-se com uma afinidade de pelo menos cerca de 106 1/mol a um anticorpo produzido contra CHF isolado de corpos embrióides de ratinho, ou de um seu homólogo humano. Normalmente, o polipéptido liga-se com uma afinidade de pelo menos cerca de 107 1/mol. Muito preferencialmente, o 11 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ polipéptido CHF antigenicamente activo é um polipéptido que se liga a um anticorpo produzido contra CHF, tendo uma das funções efectoras acima descritas. Os anticorpos utilizados para definir "actividade biológica" são anticorpos policlonais de coelho produzidos formulando o CHF isolado a partir de cultura de células recombinantes ou corpos embrióides em adjuvante de Freund completo, injectando subcutaneamente a formulação e reforçando a resposta imunitária por injecção intraperitoneal da formulação, até o titulo de anticorpo anti-CHF atingir um patamar. "Biologicamente activo" quando utilizado em conjunção ou com "CHF", ou "CHF isolado" significa um polipéptido CHF que exibe actividade hipertrófica, inotrópica, anti-arritmica ou neurotrófica ou partilha uma função efectora de CHF isolado de corpos embrióides de murideo ou é produzido em cultura de células recombinante aqui descrita e que pode (mas não tem que) adicionalmente possuir uma função antigénica. Uma função efectora principal do CHF ou polipéptido CHF aqui descrito é influenciar o crescimento cardíaco ou actividade hipertrófica, tal como medido, e.g., por libertação do péptido natriurético atrial (ANP) ou pelo teste de hipertrofia de miócitos aqui descrito, utilizando um meio de plaqueamento e densidade de plaqueamento específicos e, de preferência, utilizando coloração com violeta de cristal para leitura. A função desejada de um CHF (ou antagonista de CHF) é aumentar formas fisiológicas (benéficas) de hipertrofia e diminuir a hipertrofia patológica. Além disso, é esperado aqui que o CHF apresente uma função anti-arrítmica promovendo um fenótipo electrofisiológico mais normal. Outra função efectora principal do CHF ou polipéptido CHF aqui descrito é estimular a proliferação de neurónios ganglionares ciliares de galinha num teste de actividade de CNTF. 0 CHF antigenicamente activo é definido como um polipéptido que possui uma função antigénica de CHF e que pode (mas não tem que) possuir adicionalmente uma função efectora.

Em concretizações preferidas, o CHF antigenicamente activo é um polipéptido que se liga com uma afinidade de pelo menos cerca de 106 1/mol a um anticorpo capaz de se ligar a CHF. Normalmente, o polipéptido liga-se com uma afinidade de 12 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ pelo menos cerca de 107 1/mol. O anticorpo isolado capaz de se ligar a CHF é um anticorpo que é identificado e separado de um componente do meio natural no qual pode estar presente. Muito preferencialmente, o CHF antigenicamente activo é um polipéptido que se liga a um anticorpo capaz de se ligar a CHF na sua conformação nativa. 0 CHF na sua conformação nativa é CHF tal como encontrado na natureza, que não foi desnaturado por agentes caotrópicos, calor ou outro tratamento que modifica substancialmente a estrutura tridimensional do CHF como determinada, por exemplo, por migração em geles de separação por tamanho não redutores, não desnaturantes. 0 anticorpo utilizado nesta determinação é um anticorpo policlonal de coelho produzido por formulação de CHF nativo a partir de uma espécie que não coelho em adjuvante de Freund completo, injectando subcutaneamente a formulação e reforçando a resposta imunitária por injecção intraperitoneal da formulação até o título de anticorpo anti-CHF atingir um patamar. “Percentagem de identidade de sequência de aminoácidos" em relação à sequência de CHF é aqui definida como a percentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos na sequência de CHF isolada de corpos embrióides de murídeo que têm a sequência de aminoácidos deduzida descrita na Figura 1, ou a sequência de aminoácidos de CHF humano deduzida descrita na Figura 5, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para se obter a percentagem máxima de identidade de sequência e não considerando nenhumas substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Nenhuma das extensões, eliminações ou inserções de terminal N, terminal C ou internas na sequência de CHF deverá ser interpretada como afectando a identidade ou homologia de sequência. Assim, exemplos de polipéptidos CHF biologicamente activos que se considera que têm sequências idênticas incluem prepro-CHF, pro-CHF e CHF maduro. A "micro-sequenciação de CHF" pode ser conseguida por qualquer procedimento convencional adequado, desde que o procedimento seja suficientemente sensível. Num método deste tipo, o polipéptido altamente purificado obtido a partir dos geles de SDS ou de um passo de HPLC final é sequenciado 13 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ directamente por degradação de Edman (fenilisotiocianato) automatizada utilizando um sequenciador de fase gasosa da Applied Biosystems modelo 470A equipado com um analisador de aminoácidos de feniltio-hidantoina (PTH) 120A. Adicionalmente, os fragmentos de CHF preparados por digestão química (e.g. CNBr, hidroxilamina ou 2-nitro-5-tiocianobenzoato) ou enzimática (e.g., tripsina, clostripaína ou protease estafilocócica) seguida de purificação dos fragmentos (e.g. HPLC) podem ser igualmente sequenciados. Os aminoácidos PTH são analisados utilizando o sistema de dados ChromPerfect™ (Justice Innovations, Paio Alto, CA). A interpretação de sequência é realizada num computador VAX 11/785 Digital Equipment Co. como descrito por Henzel et al., J. Chromatography, 404:41-52 (1987). Opcionalmente, podem-se analisar por electroforese alíquotas de fracções de HPLC em SDS-PAGE a 5-20%, fazer a electrotransferência para uma membrana de PVDF (ProBlott, AIB, Foster City, CA) e corar com Coomassie Brilliant Blue. Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262: 10035-10038 (1987). Uma proteína específica identificada pela coloração é excisada da transferência e faz-se a sequenciação de terminal N com o sequenciador de fase gasosa acima descrito. Para sequências de proteína internas, as fracções de HPLC são secas sob vácuo (SpeedVac), ressuspensas em tampões adequados e digeridas com brometo de cianogénio, a enzima específica de Lys, Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) , ou Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) . Após digestão, os péptidos resultantes são sequenciados como uma mistura, ou após resolução por HPLC numa coluna C4 desenvolvida com um gradiente de propanol em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%, antes da sequenciação em fase gasosa. "Ácido nucleico de CHF isolado" é ARN ou ADN contendo mais do que 16 e, de preferência, 20 ou mais bases de nucleótidos sequenciais que codificam para CHF biologicamente activo ou um seu fragmento, é complementar ao ARN ou ADN, ou híbrida com o ARN ou ADN e permanece ligado de forma estável sob condições moderadas a rigorosas. Este ARN ou ADN é isento de pelo menos um ácido nucleico fonte contaminante com o qual está normalmente associado na fonte natural e, de preferência, substancialmente isento de qualquer outro ARN ou ADN de mamífero. A frase "isento de pelo menos um ácido nucleico fonte contaminante com o qual está normalmente associado" 14 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ inclui ο caso em que ο ácido nucleico está presente na célula fonte ou natural, mas está numa localização cromossómica diferente, ou está de outro modo flanqueado por sequências de ácido nucleico que normalmente não se encontram na célula fonte. Um exemplo de ácido nucleico de CHF isolado é ARN ou ADN que codifica para um CHF biologicamente activo que partilha pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente 90% e muito preferencialmente 95% de identidade de sequência com o CHF de murideo ou com o CHF humano. “Sequências de controlo" quando se refere a expressão significa sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência codificante ligada operativamente num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador, um sitio de ligação ao ribossoma e possivelmente outras sequências ainda pouco compreendidas. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores. "Ligado operativamente" quando em relação a ácidos nucleicos, significa que os ácidos nucleicos são colocados numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN de uma pré-sequência ou comando de secreção está ligado operativamente ao ADN para um polipéptido se é expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está ligado operativamente a uma sequência codificante se afecta a transcrição da sequência; ou um sitio de ligação ao ribossoma está ligado operativamente a uma sequência codificante se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Em geral, "ligado operativamente" significa que as sequências de ADN ligadas são contíguas e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em enquadramento de leitura. No entanto, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se estes sítios não existem, utilizam-se adaptadores ou ligantes de oligonucleótidos sintéticos de acordo com a prática convencional. 15 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ "Exógeno" em relação a um elemento significa uma sequência de ácido nucleico que é estranha para a célula, ou homóloga em relação à célula, mas numa posição no ácido nucleico da célula hospedeira em que o elemento normalmente não se encontra. "Célula", "linha celular" e "cultura de células" são utilizados aqui de forma permutável e estas designações incluem toda a progénie de uma célula ou linha celular. Assim, por exemplo, termos como "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula individual principal e culturas derivadas desta, independentemente do número de transferências. Também deve entender-se que toda a progénie pode não ser necessariamente idêntica no conteúdo de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Inclui-se a progénie mutante que tem a mesma função ou actividade biológica que a pesquisada na célula transformada originalmente. Quando se pretendem designações diferentes, isso será óbvio a partir do contexto. "Plasmídeos" são moléculas de ADN circular com replicação autónoma que possuem origens de replicação independentes e são aqui designados pela letra minúscula "p" precedida e/ou seguida de letras maiúsculas e/ou números. Os plasmídeos de partida aqui utilizados ou estão disponíveis comercialmente, estão disponíveis ao público numa base sem restrições ou podem ser construídos a partir destes plasmídeos disponíveis, de acordo com procedimentos publicados. Além disso, são conhecidos na arte outros plasmídeos equivalentes e os mesmos serão evidentes para o perito na arte. "Digestão com enzimas de restrição" quando se refere a ADN significa clivagem catalítica de ligações fosfodiéster internas do ADN com uma enzima que actua apenas em determinados locais ou sítios na sequência de ADN. Estas enzimas são designadas por "endonucleases de restrição". Cada endonuclease de restrição reconhece uma sequência de ADN específica designada por "sítio de restrição" que exibe uma simetria dupla. As várias enzimas de restrição aqui utilizadas estão disponíveis comercialmente e utilizam-se as suas condições reaccionais, cofactores e outros requisitos, tal como estabelecido pelos fornecedores das enzimas. As enzimas 16 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ de restrição são normalmente designadas por abreviaturas compostas por uma letra maiúscula seguida de outras letras que representam o microorganismo a partir do qual cada enzima de restrição foi originalmente obtida e em seguida um número que designa a enzima particular. Em geral, utiliza-se cerca de 1 pg de plasmídeo ou fragmento de ADN com cerca de 1-2 unidades de enzima em cerca de 20 μΐ de solução tampão. As quantidades adequadas de tampões e substrato para enzimas de restrição particulares são especificados pelo fabricante. A incubação durante cerca de 1 hora a 37°C é normalmente utilizada, mas pode variar de acordo com as instruções do fornecedor. Após incubação, a proteína ou polipéptido é removido por extracção com fenol ou clorofórmio e o ácido nucleico digerido é recuperado da fracção aquosa por precipitação com etanol. A digestão com uma enzima de restrição pode ser seguida de hidrólise com fosfatase alcalina bacteriana dos fosfatos 5' terminais, para impedir que as duas extremidades clivadas com enzimas de restrição de um fragmento de ADN "circularizem", ou formem uma laçada fechada que iria impedir a inserção de outro fragmento de ADN no sítio de restrição. Salvo indicação em contrário, a digestão dos plasmídeo não é seguida de desfosforilação do terminal 5'. Os procedimentos e reagentes para a desfosforilação são convencionais, como descrito nas secções 1.56-1.61 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . "Recuperação" ou "isolamento" de um determinado fragmento de ADN a partir de um fragmento digerido com enzimas de restrição significa separação do fragmento digerido em geles de poliacrilamida ou agarose por electroforese, identificação do fragmento de interesse por comparação da sua mobilidade versus a de fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conhecido, remoção da secção de gel contendo o fragmento desejado e separação do gel do ADN. Este procedimento é conhecido em geral. Por exemplo, veja-se Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9_: 6103-6114 (1981) e Goeddel et al., Nucleic

Acids Res., 8_: 4057 (1980). "Análise de Southern" ou "transferência de Southern" é um método pelo qual a presença de sequências de ADN num fragmento de digestão com enzimas de restrição ou composição contendo 17 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ ADN é confirmada por hibridação com um oligonucleótido ou fragmento de ADN marcado, conhecido. A análise Southern envolve tipicamente a separação electroforética de fragmentos de digestão de ADN em geles de agarose, desnaturação do ADN após separação electroforética e transferência do ADN para nitrocelulose, nylon ou outro suporte de membrana adequado para análise com uma sonda marcada radioactivamente, biotinilada ou marcada com enzima, como descrito nas secções 9.3 7-9.52 de Sambrook et al., supra. "Análise de Northern" ou "transferência de Northern" é um método utilizado para identificar sequências de ARN que hibridam com uma sonda conhecida, tal como um oligonucleótido, fragmento de ADN, ADNc ou seu fragmento, ou fragmento de ARN. A sonda é marcada com um radioisótopo tal como 32P, ou por biotinilação, ou com uma enzima. 0 ARN a ser analisado é normalmente separado electroforeticamente num gel de agarose ou poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, nylon, ou outra membrana adequada e hibridado com a sonda, utilizando técnicas convencionais, bem conhecidas na arte, tais como as descritas nas secções 7.39-7.52 de Sambrook et al., supra. "Ligação" é o processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico. Para ligação dos dois fragmentos, as extremidades dos fragmentos deverão ser compatíveis umas com as outras. Nalguns casos, as extremidades serão directamente compatíveis após digestão com endonuclease. No entanto, poderá ser necessário primeiro converter as extremidades alternadas normalmente produzidas após digestão com endonuclease em extremidades rombas, para as tornar compatíveis para ligação. Para tornar as extremidades rombas o ADN é tratado num tampão adequado durante pelo menos 15 minutos a 15°C com cerca de 10 unidades do fragmento Klenow de polimerase I de ADN, ou polimerase de ADN de T4, na presença de quatro desoxirribonucleótido trifosfatos. O ADN é então purificado por extracção com fenolclorofórmio e precipitação com etanol. Os fragmentos de ADN que são para ser ligados uns aos outros são colocados em solução em quantidades mais ou menos equimolares. A solução também irá conter ATP, tampão de ligase e uma ligase tal como ligase de ADN de T4 a cerca de 10 unidades por 0,5 pg de ADN. Se o ADN é para ser ligado num vector, o vector é primeiro linearizado por 18 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ digestão com a endonuclease(s) de restrição. O fragmento linearizado é então tratado com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase intestinal de vitela, para impedir a auto-ligação durante o passo de ligação. "Preparação" de ADN a partir das células significa isolar o ADN de plasmideo de uma cultura das células hospedeiras. Os métodos normalmente utilizados para a preparação de ADN são as preparações de plasmideo em grande e pequena escala descritas nas secções 1.25-1.33 de Sambrook et al., supra. Após preparação do ADN, ele pode ser purificado por métodos bem conhecidos na arte, tais como os descritos na secção 1.40 de Sambrook et al., supra. "Oligonucleótidos" são polidesoxinucleótidos de cadeia simples ou dupla, tamanho pequeno que são quimicamente sintetizados por métodos conhecidos, tais como quimica de fosfotriéster, fosfito ou fosforamidito, utilizando técnicas de fase sólida, tal como descrito em EP266032 publicado em 4 de Maio de 1988 ou por intermediários de desoxinucleósido H-fosfonato, como descrito por Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 (1986) . Outros métodos incluem a reacção em cadeia com polimerase definida a seguir e outros métodos de auto-iniciadores e síntese de oligonucleótidos em suportes sólidos. Todos estes métodos estão descritos em Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl♦, 28: 716-734 (1989). Estes métodos são utilizados quando toda a sequência de ácido nucleico do gene é conhecida ou a sequência do ácido nucleico complementar à cadeia codificante está disponível. Alternativamente, se a sequência de aminoácidos alvo é conhecida, podem-se inferir as sequências de ácido nucleico potenciais utilizando resíduos codificantes conhecidos e preferidos, para cada resíduo de aminoácido. Os oligonucleótidos são então purificados em geles de poliacrilamida. "Reacção em cadeia com polimerase" ou "PCR" refere-se a um procedimento ou técnica em que quantidades mínimas de um pedaço de ácido nucleico específico, ARN e/ou ADN, são amplificadas como descrito na patente US N° 4683195 concedida em 28 de Julho de 1987. Em geral, a informação de sequência a partir das extremidades da região de interesse ou para além desta tem que ser avaliada de modo a se poderem conceber 19 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

iniciadores de oligonucleótidos; estes iniciadores serão idênticos ou semelhantes em sequência a cadeias opostas do modelo a ser amplificado. Os nucleótidos de terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. Pode-se também utilizar PCR para amplificar sequências de ARN específicas, sequências de ADN específicas a partir de ADN genómico total e ADNc transcrito a partir de ARN celular total, sequências de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Veja-se em geral, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR

Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Tal como aqui utilizada, a PCR é considerada um, mas não o único exemplo de um método de reacção em cadeia com polimerase para amplificar uma amostra de teste de ácido nucleico compreendendo a utilização de um ácido nucleico conhecido como iniciador e uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar um pedaço específico de ácido nucleico. "Condições rigorosas" são as que: (1) utilizam força iónica baixa e temperatura elevada para a lavagem, por exemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/NaDodSCq (SDS) a 0,1% a 50°C; ou (2) utilizam durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com NaCl 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C. Outro exemplo é a utilização de formamida a 50%, 5x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5x solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão tratado com ultra-sons (50 pg/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10%, a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2x SSC e SDS a 0,1%. "Condições moderadamente rigorosas" estão descritas em Sambrook et al., supra e incluem a utilização de condições de solução de lavagem e hibridação (e.g. temperatura, força iónica e % de SDS) menos rigorosas que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é uma condição tal como incubação durante a noite a 37°C numa solução compreendendo: formamida a 20%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de 20 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ salmão cortado, desnaturado, 20 mg/ml, seguido de lavagem dos filtros em lx SSC a cerca de 37-50°C. O perito na arte reconhecerá a forma de ajustar a temperatura, força iónica, etc., como necessário para acomodar factores como o tamanho da sonda e semelhantes. "Anticorpos" (Ac) e "imunoglobulinas" (Ig) são glicoproteinas com as mesmas caracteristicas estruturais. Enquanto que os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antigénio específico, as imunoglobulinas incluem quer anticorpos, quer outras moléculas tipo anticorpo que não possuem especificidade para o antigénio. Os polipéptidos do último tipo são, por exemplo, produzidos a níveis baixos pelo sistema linfático e a níveis elevados por mielomas. "Anticorpos e imunoglobulinas nativos" são normalmente glicoproteinas heterotetraméricas de cerca de 150 000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, enquanto que o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfureto intracadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) seguido de um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Pensa-se que resíduos de aminoácido particulares formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 4592-4596 [1985]). O termo "variável" refere-se ao facto de algumas porções dos domínios variáveis diferirem grandemente em sequência entre anticorpos e serem utilizados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente através dos domínios variáveis dos 21 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ anticorpos. Está concentrada em três segmentos designados por regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou regiões hipervariáveis, quer nos domínios variáveis de cadeia leve, quer de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são designadas por sequência esqueleto (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves compreendem cada um, quatro regiões FR que adoptam essencialmente uma configuração em folha-β, ligada por três CDR que formam laçadas ligando e, nalguns casos formando parte, da estrutura em folha-β. As CDR em cada cadeia são mantidas numa proximidade estreita pelas regiões FR, sendo que as CDR da outra cadeia contribuem para a formação do sítio de ligação ao antigénio dos anticorpos (veja-se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, National Institute of Health, Bethesda, MD [1991]). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tal como a participação do anticorpo numa toxicidade celular dependente do anticorpo. A digestão dos anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos; designados por fragmentos "Fab", cada um com um sítio de ligação ao antigénio único e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflecte a capacidade de cristalizar facilmente. 0 tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação com o antigénio e é ainda capaz de reticular o antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação estreita, não covalente. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antigénio na superfície do dímero VH-VL. Em conjunto, as seis CDR conferem ao anticorpo a especificidade de ligação ao antigénio. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antigénio, embora com uma afinidade menor que o sítio de ligação completo. 22 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ Ο fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui utilizada para Fab' em que o(s) resíduo de cisteína dos domínios constantes tem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteinas dobradiça entre eles. Também são conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.

As “cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de quaisquer espécies vertebradas podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, designados por capa (K) e lambda (λ) , com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser distribuídas por diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, igE, IgG e IgM e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), e.g., IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 e IgA-2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados por α, δ e γ e μ, respectivamente. As estruturas e configurações tridimensionais de subunidades das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos monoclonais simples (incluindo anticorpos agonistas e antagonistas) e composições de anticorpos com especificidade poliepitópica. 0 termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e. os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos, excepto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente, que poderão estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais 23 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigénico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpo convencionais (policlonais), que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminados por outras imunoglobulinas.

Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem anticorpos híbridos e recombinantes produzidos por splicing de um domínio variável (incluindo hipervariável) de um anticorpo anti-CHF com um domínio constante (e.g. anticorpos “humanizados"), ou uma cadeia leve com uma cadeia pesada, ou uma cadeia de uma espécie com uma cadeia de outra espécie, ou fusões com proteínas heterólogas, independentemente da espécie de origem ou da designação de classe ou subclasse de imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpo (e.g. Fab, F(ab')2 e Fv) , desde que exibam a actividade biológica desejada. [Veja-se e.g. Cabilly, et ai., patente U.S. N° 4816567; Mage & Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)]

Assim, o modificador "monoclonal" indica que o anticorpo é obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não deve ser entendido como sendo necessária a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a ser utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler e Millstein, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (Cabilly et ai., supra).

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a, ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular, ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto que o restante da(s) cadeia 24 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ é idêntico a, ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que estes exibam a actividade biológica desejada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 [1984]).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g. murídeo) são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao antigénio) que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpos receptores) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como um ratinho, rato ou coelho, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da sequência esqueleto Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor, nem nas sequências CDR ou sequências esqueleto importadas. Estas modificações são feitas para refinar e maximizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo, de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também irá compreender, de forma óptima, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja-se Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). "Não imunogénico num humano" significa que contactando o polipéptido num transportador farmaceuticamente aceitável e numa quantidade terapeuticamente eficaz com o tecido adequado 25 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ de um humano, não é demonstrável nenhum estado de sensibilidade ou resistência ao polipéptido aquando da segunda administração do polipéptido, após um período latente adequado (e.g. 8 a 14 dias). "Distúrbio neurológico" refere-se a um distúrbio dos neurónios, incluindo quer neurónios periféricos, quer neurónios do sistema nervoso central. Exemplos destes distúrbios incluem todas as doenças degenerativas, tais como neuropatias periféricas (motor e sensoriais), esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, AVC, doença de Huntington, epilepsia e doenças oftalmológicas, tais como as que envolvem a retina, e.g. retinopatia diabética, distrofia retinal e degeneração retinal causada por osteopetrose maligna infantil, lipofuscinose ceróide ou colestase, ou causada por fotodegeneração, trauma, axotomia, degeneração neurotóxica-excitatória ou degeneração neuronal isquémica. "Neuropatia periférica" refere-se a um distúrbio que afecta o sistema nervoso periférico, muito frequentemente manifestado como uma, ou uma combinação de disfunção neural motora, sensorial, sensorimotora ou autonômica. A grande variedade de morfologias exibidas por neuropatias periféricas pode ser atribuída de forma única a um número igualmente elevado de causas. Por exemplo, as neuropatias periféricas podem ser adquiridas geneticamente, podem resultar de uma doença sistémica ou podem ser induzidas por um agente tóxico. Exemplos incluem, mas não se limitam a neuropatia sensorimotora distai ou neuropatias autonômicas, tais como motilidade reduzida do tracto gastrointestinal ou atonia da bexiga. Exemplos de neuropatias associadas com doença sistémica incluem a síndrome pós-polio; exemplos de neuropatias hereditárias incluem a doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Refsum, abetalipoproteinemia, doença de Tangier, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença de Fabry e síndrome de Dejerine-Sottas; e exemplos de neuropatias causadas por um agente tóxico incluem as causadas por tratamento com um agente quimioterapêutico, tal como vincristina. 26 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ “Insuficiência cardíaca" refere-se a uma anomalia da função cardíaca em que o coração não bombeia sangue à velocidade necessária para as necessidades dos tecidos metabolizantes. A insuficiência cardíaca inclui uma grande variedade de estados de doença, tais como insuficiência cardíaca congestiva, enfarte do miocárdio e taquiarritmia. "Tratamento" refere-se quer a tratamento terapêutico, quer a medidas profiláticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem os que já têm o distúrbio, bem como os que têm propensão para o distúrbio, ou aqueles em que se pretende prevenir o distúrbio. "Mamífero" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta e animais de zoológico, desporto ou animais de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De preferência, o mamífero é um humano.

Tal como aqui utilizado, "inibidor de ACE" refere-se a drogas inibidoras da enzima de conversão de angiotensina que impedem a conversão de angiotensina I em angiotensina II. Os inibidores de ACE podem ser benéficos na insuficiência cardíaca congestiva ao reduzir a resistência vascular sistémica e aliviar a congestão circulatória. Os inibidores de ACE incluem, mas não se limitam aos concebidos pelas marcas registadas Accupril® (quinapril), Altace® (ramipril), capoten® (captopril), Lotensin® (benazepril), Monopril® (fosinopril), Prinivil® (lisinopril), Vasotec® (enalapril) e Zestril® (lisinopril) . Um exemplo de um inibidor de ACE é o comercializado com a marca registada Capoten®. Genericamente designado por captopril, este inibidor de ACE é designado quimicamente por 1-[(2S)-3-mercapto-2-metilpropionil]-L-prolina. 27 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

II. Modos de levar à prática a invenção 1. Polipéptidos CHF

Os polipéptidos da presente invenção preferidos são polipéptidos CHF substancialmente homogéneos que têm as propriedades biológicas de ser hipertróficos para miócitos e de estimularem o desenvolvimento de neurónios ciliares de galinha num teste de CNTF. Os CHF mais preferidos são isolados de proteína(s) de mamífero isolada tendo actividade hipertrófica, anti-arrítmica, inotrópica e neurológica. Os polipéptidos da presente invenção particularmente preferidos são CHF de ratinho e humano, incluindo seus fragmentos com actividade hipertrófica, anti-arrítmica, inotrópica e neurológica. Opcionalmente, estes CHF de murídeo e humano não possuem glicosilação.

Polipéptidos da presente invenção preferidos, opcionais, são uma variante(s) de CHF substancialmente activa, com uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com o CHF de murídeo da Figura 1, de preferência pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% e muito preferencialmente pelo menos 95% (i.e., 70-100%, 75-100%, 80- 100%, 85-100%, 90-100%, e 95-100% de identidade de sequência, respectivamente) . Alternativamente, a(s) variante de CHF biologicamente activa, preferida, tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% e muito preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de CHF humano da Figura 5 (i.e., 70-100%, 75-100%, 80-100%, 85-100%, 90-100%, e 95-100% de identidade de sequência, respectivamente). O CHF clonado a partir de corpos embrióides de murídeo tem as seguintes características: (1) tem um peso molecular de cerca de 21-23 kD, tal como medido por SDS-PAGE redutora 28 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (2) apresenta actividade positiva no teste de neurónios ciliares de galinha de CNTF e nos testes de hipertrofia de miócitos e hipertrofia de libertação de ANP.

Mais preferencialmente, os polipéptidos CHF são os que são codificados por ADN genómico ou ADNc e que têm a sequência de aminoácidos de CHF de murídeo descrita na Figura 1 ou a sequência de aminoácidos de CHF humano descrita na Figura 5.

Outros polipéptidos CHF da presente invenção biologicamente activos que ocorrem naturalmente incluem prepro-CHF, pro-CHF, pre-CHF, CHF maduro e suas variantes de glicosilação.

Ainda outros polipéptidos preferidos da presente invenção incluem variantes da sequência de CHF e CHF quiméricos. Normalmente, as variantes de sequência de CHF preferidas são variantes de CHF biologicamente activo que têm uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com o CHF humano ou de murídeo, de preferência pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% e muito preferencialmente pelo menos 95%. Um exemplo de variante de CHF preferida é uma variante de CHF do domínio de terminal C em que um ou mais do(s) resíduo de aminoácido básico ou dibásico (e.g. R ou K) é substituído com um resíduo(s) de aminoácido não básico (e.g. hidrófobo, neutro, ácido, aromático, gly, pro e semelhantes).

Outro exemplo de variante de sequência de CHF preferido é uma "quimera de domínio" que consiste dos resíduos de terminal N substituídos com um ou mais, mas não todos, os resíduos de CNTF humano, aproximadamente alinhados como se mostra na Figura 2. Nesta concretização, a quimera de CHF teria resíduos individuais ou blocos de resíduos da sequência de CNTF humana adicionados a, ou substituídos na sequência de CHF em posições correspondentes ao alinhamento apresentado na Figura 2. Por exemplo, um ou mais dos segmentos de CNTF que não são homólogos podem ser substituídos nos segmentos correspondentes de CHF. É contemplado que esta "quimera de domínio CHF-CNTF" terá uma actividade biológica hiperetrófica/anti-arrítmica/inotrópica/neurotrófica, mista. 29 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Outros polipéptidos da presente invenção preferidos incluem fragmentos de CHF com a sequência consecutiva de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, ou 40 resíduos de aminoácidos, de preferência cerca de 10-150 resíduos, que é idêntico à sequência do CHF isolado de corpos embrióides de murídeo, ou à de CHF humano correspondente. Outros fragmentos de CHF preferidos incluem os produzidos como resultado de hidrólise química ou enzimática ou digestão do CHF purificado.

Outro aspecto da invenção é um método para purificar moléculas de CHF compreendendo contactar uma fonte de CHF contendo as moléculas de CHF a ser purificadas, com um receptor ou polipéptido anticorpo imobilizado, sob condições em que as moléculas de CHF a ser purificadas são selectivamente absorvidas no receptor ou polipéptido anticorpo imobilizado, lavar o suporte imobilizado para remover material não adsorvido e eluir as moléculas a ser purificadas do receptor ou polipéptido anticorpo imobilizado ao qual estão adsorvidos, com um tampão de eluição. A fonte que contém o CHF pode ser uma suspensão celular de corpos embrióides.

Alternativamente, a fonte contendo o CHF é uma cultura de células recombinante em que a concentração de CHF quer no meio de cultura, quer em lisados celulares é geralmente maior do que no plasma ou outras fontes naturais. Neste caso, o método de imunoafinidade acima descrito, apesar de ser ainda útil, não é normalmente necessário e podem-se aplicar métodos de purificação de proteínas mais tradicionais, conhecidos na arte. Em resumo, o método de purificação preferido para se obter CHF substancialmente homogéneo compreende: remover restos de partículas, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração; concentrar opcionalmente o conjunto de proteínas com um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente e em seguida purificar o CHF de proteínas e polipéptidos solúveis contaminantes, sendo os procedimentos seguintes exemplo de procedimentos de purificação adequados: por fraccionamento em colunas de imunoafinidade ou troca iónica; precipitação com etanol, HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de troca catiónica tal como DEAE, cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; cromatografia em Toyopearl e MONO-Q ou MONO-S, filtração em gel, utilizando, por exemplo, 30 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Sephadex G-75; cromatografia em colunas que se ligam a CHF e colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG. Um esquema de purificação preferido para ambos, CHF nativo e recombinante, utiliza uma coluna de butil-Toyopearl seguido de uma coluna de MONO-Q e uma coluna C4 de fase inversa como descrito mais à frente.

Noutra concretização preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado capaz de se ligar ao CHF. Um anticorpo anti-CHF isolado, preferido, é monoclonal (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 [1975]; Campbell,

Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdão [1985]; e Huse et al., Science, 246: 1275-1281 [1989]) . Um anticorpo anti-CHF isolado preferido, é um que se liga a CHF com uma afinidade de pelo menos cerca de 106 1/mol. Mais preferencialmente, o anticorpo liga-se com uma afinidade de pelo menos cerca de 107 1/mol. Muito preferencialmente, o anticorpo é produzido contra um CHF que tem uma das funções efectoras acima descritas. 0 anticorpo isolado capaz de se ligar ao CHF pode ser opcionalmente fundido com um segundo polipéptido e o anticorpo ou sua fusão pode ser utilizado para isolar e purificar CHF a partir de uma fonte, como descrito acima para o polipéptido CHF imobilizado. Noutro aspecto preferido desta concretização, a invenção proporciona um método para detectar o CHF in vitro ou in vivo compreendendo contactar o anticorpo com uma amostra, em especial uma amostra de soro, que se suspeita que contém o CHF e detectar se ocorreu ligação. A invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica para CHF ou seus fragmentos, em que a molécula de ácido nucleico pode ser marcada ou não marcada com uma porção detectável e uma molécula de ácido nucleico com uma sequência que é complementar a, ou híbrida sob condições rigorosas ou moderadamente rigorosas com uma molécula de ácido nucleico que tem uma sequência que codifica para um CHF. Um ácido nucleico de CHF preferido é ARN ou ADN que codifica para um CHF biologicamente activo que partilha pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais 31 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ preferencialmente 90% e muito preferencialmente 95% de identidade de sequência com o CHF de murideo ou humano.

Moléculas de ácido nucleico isoladas mais preferidas são sequências de ADN que codificam para CHF biologicamente activo, seleccionadas de entre: (a) ADN baseado na região codificante de um gene de CHF de mamífero (e.g. ADN que compreende a sequência de nucleótidos proporcionada na Figura 1 ou Figura 5, ou seus fragmentos); (b) ADN capaz de hibridar com um ADN de (a) sob condições pelo menos moderadamente rigorosas e (c) ADN que é degenerado em relação a um ADN definido em (a) ou (b) que resulta da degenerescência do código genético. É contemplado que os novos CHF aqui descritos possam ser membros de uma família de ligandos com identidade de sequência adequada para que o seu ADN possa hibridar com o ADN da Figura 1 ou Figura 5 (ou seus fragmentos) sob condições de rigor baixo a moderado. Assim, um outro aspecto da presente invenção inclui ADN que híbrida sob condições de rigor moderado com ADN que codifica para os polipéptidos CHF.

De preferência, a molécula de ácido nucleico é ADNc que codifica para CHF e compreende também um vector replicável no qual o ADNc está ligado operativamente a sequências de controlo reconhecidas por um hospedeiro transformado com o vector. Este aspecto inclui também células hospedeiras transformadas com o vector e um método para utilizar o ADNc para produzir CHF, compreendendo expressar o ADNc que codifica para CHF numa cultura das células hospedeiras transformadas e recuperar o CHF a partir da cultura de células hospedeiras. O CHF preparado deste modo é de preferência substancialmente CHF de murideo ou humano substancialmente homogéneo. A invenção inclui também um método preferido para tratar um mamífero com insuficiência cardíaca, ou um distúrbio arrítmico, inotrópico ou neurológico compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CHF ao mamífero. Opcionalmente, o CHF é administrado em combinação com um inibidor de ACE, tal como captopril, no caso de insuficiência cardíaca congestiva ou com outro factor miocardiotrófico, anti-arrítmico ou inotrópico, no caso de outros tipos de insuficiência cardíaca ou distúrbio cardíaco, ou com uma 32 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ molécula neurotrófica, tal como e.g. IGF-I, CNTF, NGF, NT-3, BDNF, NT-4, NT-5, etc., no caso de um distúrbio neurológico. 2. Preparação de CHF de sequência natural e variantes A maior parte da discussão seguinte refere-se à produção de CHF por cultura de células transformadas com um vector que contém ácido nucleico de CHF e recuperação do polipéptido a partir da cultura de células. Prevê-se também que o CHF da presente invenção possa ser produzido por recombinação homóloga, tal como proporcionado no WO 91/06667 publicado em 16 de Maio de 1991. Em resumo, este método envolve transformar células de mamifero primárias contendo o gene de CHF endógeno (e.g. células humanas se o CHF humano desejado é humano) com uma construção (i.e. vector) compreendendo um gene amplificável (tal como di-hidrofolato-redutase [DHFR] ou outros discutidos a seguir e pelo menos uma região flanqueadora com um comprimento de pelo menos cerca de 150 pb que é homólogo a uma sequência de ADN no locus da região codificante do gene de CHF, para proporcionar amplificação do gene de CHF. O gene amplificável deverá estar num sitio que não interfere com a expressão do gene CHF. A transformação é realizada de um modo tal que a construção se torna homologamente integrada no genoma das células primárias, para definir uma região amplificável.

As células primárias que compreendem a construção são então seleccionadas por meio do gene amplificável ou outro marcador presente na construção. A presença do gene marcador estabelece a presença e integração da construção no genoma hospedeiro. Não é necessário realizar outra selecção das células primárias, uma vez que a selecção será feita no segundo hospedeiro. Se desejado, a ocorrência do fenómeno de recombinação homóloga pode ser determinada utilizando PCR e, ou sequenciando as sequências de ADN amplificadas resultantes, ou determinando o comprimento adequado do fragmento de PCR quando o ADN dos integrantes homólogos correctos está presente e se expandem apenas as células que contêm estes fragmentos. Também se desejado, as células seleccionadas podem ser amplificadas neste ponto provocando estresse nas células com o agente amplificador adequado (tal como metotrexato se o gene amplificável é DHFR) de modo que se obtêm múltiplas cópias do 33 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ gene alvo. De preferência, no entanto, o passo de amplificação não é realizado senão após a segunda transformação descrita a seguir.

Após o passo de selecção, as porções de ADN do genoma suficientemente grandes para incluir toda a região amplificável são isoladas a partir das células primárias seleccionadas. As células hospedeiras de expressão de mamífero secundárias são então transformadas com estas porções de ADN genómico e clonadas e são seleccionados os clones que contêm a região amplificável. A região amplificável é então amplificada por meio de um agente de amplificação, se não tiver já sido amplificada nas células primárias. Por fim, as células hospedeiras de expressão secundárias que compreendem agora múltiplas cópias da região amplificável contendo o CHF são crescidas de modo a expressar o gene e produzir a proteína.

A. Isolamento de ADN que codifica para CHF 0 ADN que codifica para CHF pode ser obtido a partir de qualquer biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se pensa que possui o ARNm de CHF e o expressa a um nível detectável. 0 ARNm é adequadamente preparado, por exemplo, a partir de corpos embrióides diferenciados, de sete dias. 0 gene de CHF pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou por síntese de oligonucleótidos in vitro, como definido acima assumindo que a sequência completa de nucleótidos ou aminoácidos é conhecida.

Pesquisam-se bibliotecas com sondas concebidas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. Para bibliotecas de expressão de ADNc, as sondas adequadas incluem, e.g.: anticorpos monoclonais ou policlonais que reconhecem e se ligam especificamente ao CHF; oligonucleótidos de cerca de 20-80 bases de comprimento que codificam para porções conhecidas ou suspeitas do ADNc de CHF da mesma ou de espécies diferentes; e/ou ADNc complementares ou homólogos ou seus fragmentos que codificam para o mesmo gene ou semelhante. Sondas adequadas para pesquisar bibliotecas de ADN genómico incluem, mas não se limitam a, oligonucleótidos, ADNc ou seus fragmentos que codificam para o mesmo gene ou semelhante e/ou ADN genómicos homólogos ou seus 34 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ fragmentos. A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode ser realizada utilizando procedimentos convencionais, como descrito nos capítulos 10-12 de Sambrook et al.r supra.

Um meio alternativo para isolar o gene que codifica para CHF é utilizar metodologia de PCR como descrito na secção 14 de Sambrook et al., supra. Este método requer a utilização de sondas de oligonucleótidos que irão hibridar com o CHF. A seguir descrevem-se estratégias para a selecção de oligonucleótidos.

Um método preferido para a prática da presente invenção é utilizar sequências de oligonucleótidos cuidadosamente seleccionadas, para pesquisar bibliotecas de ADNc a partir de vários tecidos, de preferência corpos embrióides diferenciados de mamífero e linhas celulares placentares, cardíacas e de cérebro. Mais preferencialmente, as bibliotecas de ADNc embrióides, placentares, cardíacas e cerebrais humanas são pesquisadas com as sondas de oligonucleótidos.

As sequências de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deverão ser de comprimento suficiente e suficientemente não ambíguas para minimizar os falsos positivos. A(s) sequência de nucleótidos efectiva baseia-se normalmente em sequências de nucleótidos conservadas ou altamente homólogas. Os oligonucleótidos podem ser degenerados numa ou mais posições. A utilização de oligonucleótidos degenerados pode ser de importância particular quando uma biblioteca é pesquisada a partir de uma espécie em que não é conhecida uma utilização preferencial de codões. O oligonucleótido deverá ser marcado de modo a poder ser detectado por hibridação com ADN na biblioteca que está a ser pesquisada. O método preferido de marcação é utilizar ATP marcado com 32P com polinucleótido-quinase, como é bem conhecido na arte, para marcar radioactivamente o oligonucleótido. No entanto, podem-se utilizar outros métodos para marcar o oligonucleótido, incluindo, mas não se limitando a, biotinilação ou marcação enzimática. 35 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

De particular interesse é o ácido nucleico de CHF que codifica para um polipéptido de tamanho total. Nalgumas concretizações preferidas, a sequência de ácido nucleico inclui a sequência de sinal de CHF nativo. 0 ácido nucleico que tem toda a sequência codificante de proteína é obtido pesquisando bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas, utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui descrita pela primeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos de alongamento de iniciadores convencionais, como descrito na secção 7.79 de Sambrook et al., supra, para detectar precursores e processar intermediários de ARNm que podem não ter sido transcritos inversamente em ADNc. B. Variantes da sequência de aminoácidos de CHF nativo

As variantes de sequência de aminoácidos de CHF nativo são preparadas introduzindo alterações de nucleótidos adequadas no ADN de CHF nativo, ou por síntese in vitro do polipéptido CHF desejado. Estas variantes incluem, por exemplo, eliminações de, ou inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos apresentada para o CHF de murídeo na Figura 1 e para CHF humano na Figura 5. Faz-se qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição para se obter a construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. Excluem-se do âmbito da presente invenção as variantes de CHF ou sequências de polipéptidos que são o homólogo de rato de CHF. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-tradução do CHF nativo, tais como alteração do número ou posição de sítios de glicosilação. com

Para a concepção de variantes de sequência de aminoácidos de CHF nativo, a localização do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão da(s) característica do CHF a ser modificada. Por exemplo, os antagonistas ou super agonistas de CHF candidatos serão inicialmente seleccionados localizando os sítios que são idênticos ou altamente conservados entre CHF e outros ligandos que se ligam a membros da família do receptor de hormona de crescimento(GH)/citóquina, em especial o CNTF e factor inibidor de leucemia (LIF). Os sítios para mutação podem ser modificados individualmente ou em série, e.g. (1) substituindo primeiro com selecções de aminoácidos 36 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ conservativas e em seguida com selecções mais radicais, dependendo dos resultados alcançados, (2) eliminando o resíduo alvo ou (3) inserindo resíduos da mesma ou de uma classe diferente adjacente ao sítio localizado ou combinações das opções 1-3.

Um método útil para a identificação de alguns resíduos ou regiões do polipéptido CHF nativo que são localizações preferidas para mutagénese é designado por "mutagénese de pesquisa de alanina", como descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, identifica-se um resíduo ou grupo de resíduos alvo (e.g. resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (muito preferencialmente alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o meio ambiente aquoso envolvente, dentro ou fora da célula. Os domínios que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados introduzindo mais ou outras variantes no, ou para os sítios de substituição. Assim, apesar do sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos ser pré-determinado, a natureza da mutação per se não tem que ser pré-determinada. Por exemplo, para optimizar o desempenho de uma mutação num determinado sítio, faz-se mutagénese de pesquisa de alanina ou ao acaso no codão ou região alvo e as variantes de CHF produzidas são pesquisadas quanto à combinação óptima da actividade desejada. Há duas variáveis principais na construção de variantes de sequência de aminoácidos: a localização do sítio de mutação e a natureza da mutação. Estas são variantes da sequência da Figura 1 ou Figura 5 e podem representar alelos que ocorrem naturalmente (que não irão necessitar de manipulação do ADN de CHF nativo) ou formas mutantes pré-determinadas, produzidas por mutação do ADN, para chegar a um alelo ou uma variante não encontrada na natureza. Em geral, a localização e natureza da mutação escolhida dependerá da característica do CHF a ser modificada.

As eliminações da sequência de aminoácidos geralmente são na gama de cerca de 1 a 30 resíduos, mais preferencialmente cerca de 1 a 10 resíduos e tipicamente são contíguas. As 37 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ eliminações contíguas são normalmente feitas em números pares de resíduos, mas eliminações únicas ou em números ímpares estão no âmbito aqui descrito. As eliminações podem ser introduzidas em regiões de homologia baixa entre CHF e outros ligandos que se ligam à família do receptor de GH/citóquina que partilham a maior identidade de sequência com a sequência de aminoácido do CHF humano para modificar a actividade do CHF. As eliminações do CHF em áreas de homologia substancial com um dos sítios de ligação do receptor de outros ligandos que se ligam à família do receptor de GH/citóquina irão mais provavelmente modificar a actividade biológica do CHF de modo mais significativo. 0 número de eliminações consecutivas será seleccionado de modo a preservar a estrutura terciária do CHF no domínio afectado, e.g., folha pregueada beta ou hélice alf a.

As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxilo que variam em comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um resíduo ou múltiplos resíduos de aminoácido. As inserções intra-sequência (i.e. inserções dentro da sequência de CHF maduro) podem variar em geral de cerca de 1 a 10 resíduos, mais preferencialmente de 1 a 5, muito preferencialmente de 1 a 3. As inserções são preferencialmente feitas em números pares de resíduos, mas isso não é necessário. Exemplos de inserções terminais incluem CHF maduro com um resíduo de metionilo no terminal N, um artefacto da produção directa de CHF maduro em cultura de células recombinante, e fusão de uma sequência de sinal de terminal N heteróloga em relação ao terminal N da molécula de CHF madura para facilitar a secreção de CHF maduro a partir de hospedeiros recombinantes. Estas sequências de sinal serão geralmente obtidas a partir de e, desse modo, homólogas em relação à espécie da célula hospedeira pretendida. Sequências adequadas incluem STII ou Ipp para E. coli, factor alfa para levedura e sinais virais, tais como gD de herpes para células de mamífero.

Outras variantes de inserção da molécula de CHF nativa incluem a fusão com o terminal N ou C de CHF nativo de polipéptidos imunogénicos, e.g. polipéptidos bacterianos tais como beta-lactamase ou uma enzima codificada pelo locus de trp 38 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ de Ε. coli, ou proteína de levedura e fusões de terminal C com proteínas que têm uma semivida longa, tais como regiões constantes de imunoglobulina (ou outras regiões de imunoglobulina), albumina ou ferritina, como descrito em WO 89/02922 publicado em 6 de Abril de 1989.

Um terceiro grupo de variantes são variantes de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de CHF nativa removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagénese de substituição incluem sítios identificados como o(s) sítio activo do CHF nativo e sítios em que os aminoácidos encontrados nos análogos conhecidos são substancialmente diferentes em termos de volume, carga ou hidrofobicidade da cadeia lateral, mas em que há também um grau elevado de identidade de sequência no sítio seleccionado dentro de várias espécies de CHF animais, ou em que os aminoácidos encontrados em ligandos conhecidos que se ligam a membros da família do receptor de GH/citóquina e ao CHF novo são substancialmente diferentes em termos de volume, carga ou hidrofobicidade da cadeia lateral, mas em que há também um grau elevado de identidade de sequência no sítio seleccionado dentro de vários análogos animais destes ligandos (e.g. entre todas as moléculas de CNTF animais). Esta análise irá revelar os resíduos que podem estar envolvidos na diferenciação de actividade dos factores hipertróficos, anti-arrítmicos, inotrópicos e neurotróficos cardíacos e, assim, as variações destes sítios podem afectar estas actividades.

Outros sítios de interesse são aqueles em que resíduos particulares do CHF obtido de várias espécies são idênticos entre todas as espécies animais de CHF e outros ligandos que se ligam a moléculas da família do receptor de GH/citóquina, sendo que este grau de conformação sugere uma importância na obtenção de uma actividade biológica comum a estas enzimas. Estes sítios, em especial os que estão dentro de uma sequência de pelo menos três outros sítios identicamente conservados, são substituídos de um modo relativamente conservativo. Estas substituições conservativas de interesse são apresentadas na Tabela 1 sob o título substituições preferidas. Se estas substituições resultam numa alteração na actividade biológica, então introduzem-se alterações mais substanciais, designadas 39 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ por substituições exemplo na Tabela 1, ou como descrito a seguir em relação às classes de aminoácidos, e pesquisam-se os produtos.

Tabela 1

Resíduo Substituições Exemplificativas Substituições

Original Preferidas

Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro pro His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; 3.13.} phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile ;; vai ; met ; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala leu Pro (P) gly gly Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

As modificações substanciais na função ou identidade imunológica do CHF nativo são realizadas seleccionando substituições que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura do esqueleto do polipéptido na área de substituição, por exemplo, como conformação em folha ou hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: 40 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (1) hidrófobo: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe

As substituições não conservativas irão incluir trocar um membro de uma destas classes por outra. Estes resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sitios de substituição conservativa ou, mais preferencialmente, nos sítios remanescentes (não conservativos).

Numa concretização da invenção, é desejável inactivar um ou mais sítios de clivagem de protease que estão presentes na molécula. Estes sítios são identificados por inspecção da sequência de aminoácidos codificada, no caso da tripsina, e.g.f para um resíduo de arginilo ou lisinilo. Quando os sítios de clivagem de protease são identificados eles são tornados inactivos para clivagem proteolítica por substituição do resíduo alvo com outro resíduo, de preferência um resíduo básico, tal como glutamina ou um resíduo hidrófobo, tal como serina; por eliminação do resíduo; ou por inserção de um resíduo de prolilo imediatamente após o resíduo.

Noutra concretização, quaisquer resíduos de metionilo diferentes do resíduo de metionilo de partida da sequência de sinal, ou qualquer resíduo localizado dentro de cerca de três resíduos de terminal N ou C em relação a cada um destes resíduos de metionilo, é substituído por outro resíduo (de preferência de acordo com a tabela 1) ou eliminados. Alternativamente, inserem-se cerca de 1-3 resíduos adjacentes a estes sítios.

Quaisquer resíduos de cisteína não envolvidos na manutenção da conformação adequada de CHF nativo podem também ser substituídos, em geral com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. 41 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

As moléculas de ácido nucleico que codificam para variantes da sequência de aminoácidos de CHF nativo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na arte. Este métodos incluem, mas não se limitam a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida para um local), mutagénese por PCR e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente, ou de uma versão não variante de CHF nativo. A mutagénese mediada por oligonucleótidos é um método preferido para preparar variantes de substituição, eliminação e inserção de ADN de CHF nativo. Esta técnica é bem conhecida na arte, como descrito por Adelman et al., DNA, 2_: 183 (1983) . Em resumo, o ADN de CHF nativo é alterado por hibridação de um oligonucleótido que codifica para a mutação desejada com um modelo de ADN, em que o modelo é uma forma de cadeia simples de um plasmideo ou bacteriófago contendo a sequência de ADN não alterada ou nativa de CHF. Após hibridação, utiliza-se uma polimerase de ADN para sintetizar uma segunda cadeia complementar completa do modelo que irá assim incorporar o iniciador de oligonucleótido e irá codificar para a alteração seleccionada no ADN de CHF nativo.

Em geral, utilizam-se oligonucleótidos de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido óptimo terá de 12 a 15 nucleótidos que são totalmente complementares ao modelo em qualquer dos lados do(s) nucleótido que codifica para a mutação. Isto assegura que o oligonucleótido irá hibridar de forma adequada com a molécula modelo de ADN de cadeia simples. Os oligonucleótidos são facilmente sintetizados utilizando técnicas conhecidas na arte, tais como as descritas por Crea et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75: 5765 (1978). 0 modelo de ADN pode ser produzido pelos vectores que, ou são derivados de vectores do bacteriófago M13 (os vectores Ml3mpl8 e M13mpl9 disponíveis comercialmente são adequados), ou os vectores que contêm uma origem de replicação de fago de cadeia simples, como descrito por Viera et al. Meth. Enzymol., 153: 3 (1987) . Assim, o ADN que é para ser mutado pode ser 42 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ inserido num destes vectores para produzir um modelo de cadeia simples. A produção do modelo de cadeia simples é descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.

Alternativamente, o modelo de ADN de cadeia simples pode ser produzido por desnaturação do ADN plasmidico de cadeia dupla (ou outro), utilizando técnicas convencionais.

Para alteração da sequência de ADN nativa (para produzir variantes da sequência de aminoácidos, por exemplo), o oligonucleótido é hibridado com o modelo de cadeia simples sob condições de hibridação adequadas. Uma enzima de polimerização de ADN, normalmente o fragmento Klenow da polimerase I de ADN, é então adicionado para sintetizar a cadeia complementar do modelo, utilizando o oligonucleótido como um iniciador para a síntese. Forma-se assim uma molécula de heterodúplex de modo que uma cadeia do ADN codifica para a forma mutada do CHF nativo e a outra cadeia (o modelo original) codifica para a sequência não alterada de CHF, nativa. Esta molécula de heterodúplex é então transformada numa célula hospedeira adequada, normalmente um procariota, tal como E. coli JM101. Após estas células serem crescidas, elas são plaqueadas em placas de agarose e pesquisadas utilizando o iniciador de oligonucleótido marcado radioactivamente com 32P para identificar as colónias de bactérias que contêm o ADN mutado. A região mutada é então removida e colocada num vector adequado para a produção de proteína, em geral um vector de expressão do tipo tipicamente utilizado para a transformação de um hospedeiro adequado. 0 método descrito imediatamente acima pode ser modificado de modo que se cria uma molécula de homodúplex em que ambas as cadeias do plasmídeo contêm a(s) mutação. As modificações são como se segue: 0 oligonucleótido de cadeia simples é fundido com o modelo de cadeia simples, como descrito acima. Uma mistura de três desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTTP) é combinada com uma tiodesoxirribocitosina modificada designada por dCTP-(aS) (que pode ser obtida da Amersham Corporation) . Esta mistura é adicionada ao complexo modelo-oligonucleótido. Por adição de ADN polimerase a esta mistura, é produzida uma cadeia de ADN idêntica ao modelo, excepto para 43 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ as bases mutadas. Além disso, esta nova cadeia de ADN irá conter dCTP-(aS) em vez de dCTP, que serve para a proteger da digestão com endonucleases de restrição.

Após a cadeia modelo do heterodúplex de cadeia dupla ser cortada com uma enzima de restrição adequada, a cadeia modelo pode ser digerida com nuclease ExoIII, ou outra nuclease adequada, para além da região que contém o(s) sitio a ser mutado. A reacção é então parada, para se obter uma molécula que é apenas parcialmente de cadeia simples. Forma-se então um homodúplex de ADN de cadeia dupla completo, utilizando polimerase de ADN na presença de todos os quatro desoxirribonucleótido-trifosfatos, ATP e ligase de ADN. Esta molécula homodúplex pode então ser transformada numa célula hospedeira adequada, tal como E. coli JM101, como descrito acima. 0 ADN que codifica para mutantes de CHF nativo com mais do que um aminoácido a ser substituído pode ser produzido por um de vários modos. Se os aminoácidos estão localizados próximo uns dos outros na cadeia de polipéptido, eles podem ser mutados simultaneamente utilizando um oligonucleótido que codifica para todas as substituições de aminoácido desejadas. Se, no entanto, os aminoácidos estão localizados a alguma distância uns dos outros (separados por mais do que cerca de dez aminoácidos), é mais difícil produzir um único oligonucleótido que codifica para todas as alterações desejadas. Em vez disso, pode-se utilizar um de dois métodos alternativos.

No primeiro método, é produzido um oligonucleótido separado para cada aminoácido a ser substituído. Os oligonucleótidos são então fundidos com o ADN modelo de cadeia simples em simultâneo e a segunda cadeia de ADN que é sintetizada a partir do modelo irá codificar para todas as substituições de aminoácido desejadas. 0 método alternativo envolve dois ou mais ciclos de mutagénese para produzir o mutante desejado. 0 primeiro ciclo é como descrito para os mutantes simples: utiliza-se ADN do tipo selvagem para o modelo, um oligonucleótido que codifica para a primeira substituição (ões) de aminoácido desejada é 44 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ fundido com este modelo e produz-se então a molécula de ADN heterodúplex. O segundo ciclo de mutagénese utiliza o ADN mutado produzido no primeiro ciclo de mutagénese como modelo. Assim, este modelo já contém uma ou mais mutações. 0 oligonucleótido que codifica para a(s) substituição de aminoácido desejada, adicional, é então fundido com este modelo e a cadeia de ADN resultante codifica agora para mutações de ambos, o primeiro e segundo ciclos de mutagénese. Este ADN resultante pode ser utilizado como um modelo num terceiro ciclo de mutagénese e assim sucessivamente. A mutagénese de PCR também é adequada para produzir variantes de aminoácidos de CHF nativo. Apesar da discussão seguinte se referir a ADN, entende-se que a técnica também tem aplicação com ARN. A técnica de PCR refere-se em geral ao procedimento seguinte (veja-se Erlich, supra, o capítulo de R. Higuchi, p. 61-70): quando quantidades pequenas de ADN modelo são utilizadas como material de partida numa PCR, os iniciadores que diferem ligeiramente em sequência em relação à região correspondente num ADN modelo podem ser utilizados para produzir quantidades relativamente grandes de um fragmento de ADN específico que difere da sequência modelo apenas nas posições em que os iniciadores diferem do modelo. Para introdução de uma mutação num ADN plasmídico, um dos iniciadores é concebido para se sobrepor na posição da mutação e para conter a mutação; a sequência do outro iniciador deve ser idêntica a uma porção de sequência da cadeia oposta do plasmídeo, mas esta sequência pode localizar-se algures ao longo do ADN plasmídico. É preferido, no entanto, que a sequência do segundo iniciador esteja localizada dentro dos 200 nucleótidos da do primeiro, de modo a que no final toda a região amplificada do ADN ligado pelos iniciadores pode ser facilmente sequenciada. A amplificação por PCR utilizando um par de iniciadores como o agora descrito, resulta numa população de fragmentos de ADN que diferem na posição da mutação especificada pelo iniciador e possivelmente noutras posições, dado que a cópia do modelo é propensa a algum erro.

Se a razão entre modelo e material produto é extremamente baixa, a grande maioria dos fragmentos de ADN produto incorporam a(s) mutação desejada. Este material produto é utilizado para substituir a região correspondente no plasmídeo 45 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ que serviu como modelo de PCR utilizando tecnologia de ADN convencional. As mutações em posições separadas podem ser introduzidas simultaneamente, quer utilizando um segundo iniciador mutante, quer realizando uma segunda PCR com diferentes iniciadores mutantes e ligando os dois fragmentos de PCR resultantes em simultâneo ao fragmento vector, numa ligação de três (ou mais) partes.

Num exemplo específico de mutagénese por PCR, o ADN plasmídico modelo (1 pg) é linearizado por digestão com uma endonuclease de restrição que tem um sítio de reconhecimento único no ADN plasmídico, fora da região a ser amplificada. Deste material, adicionam-se 100 ng a uma mistura de PCR contendo tampão de PCR que contém os quatro desoxinucleótido-trifosfatos e está incluída nos kits GeneAmp® (obtidos da Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT e Emeryville, CA) e 25 pmol de cada iniciador de oligonucleótido para um volume final de 50 μΐ. Sobre a mistura reaccional é colocada uma camada com 35 μΐ de óleo mineral. A mistura reaccional é desnaturada durante cinco minutos a 100°C, colocada brevemente em gelo e em seguida adiciona-se 1 μΐ de polimerase de ADN de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/μΐ, adquirida da Perkin-Elmer

Cetus) por baixo da camada de óleo mineral. A mistura reaccional é então inserida num ciclizador térmico de ADN (adquirido da Perkin-Elmer Cetus) programado como se segue:

2 min. 55°C 30 seg. 72°C, em seguida 19 ciclos do seguinte: 30 seg. 94°C 30 seg. 55°C, e 30 seg. 72°C.

No final do programa, o frasco reaccional é removido do ciclizador térmico e a fase aquosa é transferida para um frasco novo, extraída com fenol/clorofórmio (50:50 vol) e precipitada com etanol e o ADN é recuperado por procedimentos convencionais. Este material é subsequentemente submetido aos tratamentos adequados para inserção num vector.

Outro método para preparar variantes de mutagénese de cassete baseia-se na técnica descrita por Wells et al.r Gene, 3_4:315 (1985) . O material de partida é o plasmídeo (ou outro 46 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ vector) que compreende ο ADN de CHF nativo a ser mutado. O(s) codão no ADN de CHF nativo a ser mutado é identificado. Deve haver um único sitio de endonuclease de restrição de cada lado do sitio(s) de mutação identificado. Se não existir este sitio de restrição, ele pode ser produzido utilizando o método de mutagénese mediada por oligonucleótidos acima descrito, para os introduzir em localizações adequadas no ADN de CHF nativo. Após os sítios de restrição terem sido introduzidos no plasmídeo, o plasmídeo é cortado nestes sítios para o linearizar. Um oligonucleótido de cadeia dupla que codifica para a sequência do ADN entre os sítios de restrição, mas contendo a(s) mutação desejada, é sintetizado utilizando procedimentos convencionais. As duas cadeias são sintetizadas separadamente e em seguida hibridadas uma com a outra, utilizando técnicas convencionais. Este oligonucleótido de cadeia dupla é designado por cassete. Esta cassete é concebida para ter extremidades 3' e 5' que são compatíveis com as extremidades do plasmídeo linearizado de modo a poder ser directamente ligada ao plasmídeo. 0 plasmídeo contém agora a sequência de ADN de CHF mutada a partir do CHF nativo. C. Inserção de ácido nucleico no vector replicável 0 ácido nucleico (e.g. ADNc ou ADN genómico) que codifica para CHF é inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Estão disponíveis muitos vectores e a selecção do vector adequado dependerá 1) do facto de ser utilizado para amplificação de ADN ou para expressão de ADN, 2) do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vector e 3) da célula hospedeira a ser transformada com o vector. Cada vector contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação de ADN ou expressão de ADN) e da célula hospedeira com a qual é compatível. Os componentes do vector geralmente incluem, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. (i) Componente de sequência de sinal

Os CHF da presente invenção podem ser produzidos não só directamente, mas também como uma fusão com um polipéptido heterólogo, de preferência uma sequência de sinal ou outro 47 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ polipéptido com um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduro. Em geral, a seguência de sinal pode ser um componente do vector, ou pode ser uma parte do ADN de CHF que é inserido no vector. A sequência de sinal heteróloga seleccionada deverá ser uma que é reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem e processam a sequência de sinal de CHF nativo, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariota seleccionada, por exemplo, de um grupo constituído pelos comandos de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou enterotoxina II estável ao calor. Para secreção em levedura, a sequência de sinal nativa pode ser substituída por, e.g., o comando de invertase de levedura, comando do factor alfa de levedura (incluindo comandos do factor-α de Saccharomyces e Kluyveromyces, estando o último descrito na patente US N° 5010182 concedida em 23 de Abril de 1991), comando de fosfatase ácida de levedura, comando de amilase salivar de ratinho, comando de carboxipeptidase, comando de BAR1 de levedura, comando de lipase de Humicola lanuginosa, o comando de glucoamilase de C. albicans (EP 362179 publicado em 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de Novembro de 1990. Na expressão de células de mamífero, a sequência de sinal humana nativa (i.e. a pré-sequência de CHF que normalmente dirige a secreção do CHF nativo a partir de células humanas in vivo) é satisfatória, embora outras sequências de sinal de mamífero possam ser adequadas, tais como sequências de sinal de outros CHF de animais, sequências de sinal de um ligando que se liga a outro membro da família do receptor de GH/citóquina e sequências de sinal de polipéptidos segregados da mesma, ou de espécies relacionadas, bem como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simples. O ADN para esta região precursora é ligado em

enquadramento de leitura ao ADN que codifica para o CHF maduro. (ii) Componente de origem de replicação

Ambos os vectores, de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite ao vector replicar-se 48 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Em geral, nos vectores de clonagem, esta seguência é uma gue permite ao vector replicar-se independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou seguências de replicação autónoma. Estas seguências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e virus. A origem de replicação do plasmideo pBR322 é adeguada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmideo 2μ é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV, ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamifero. Em geral, a origem do componente de replicação não é necessária para vectores de expressão de mamifero (a origem de SV40 pode ser tipicamente utilizada apenas porque contém o promotor precoce). A maioria dos vectores de expressão são vectores "vaivém", i.e. eles são capazes de se replicar em pelo menos uma classe de organismos, mas podem ser transfectados noutro organismo para expressão. Por exemplo, um vector é clonado em E. coli e em seguida o mesmo vector é transfectado em células de levedura ou mamifero para expressão, embora não seja capaz de se replicar independentemente do cromossoma da célula hospedeira. 0 ADN pode também ser amplificado por inserção no genoma hospedeiro. Isto é facilmente conseguido utilizando espécies de Bacillus como hospedeiros, por exemplo, incluindo no vector uma sequência de ADN que é complementar a uma sequência encontrada no ADN genómico de Bacillus. A transfecção de Bacillus com este vector resulta na recombinação homóloga com o genoma e inserção do ADN de CHF. No entanto, a recuperação do ADN genómico que codifica para CHF é mais complexa do que a de um vector replicado exogenamente porque é necessária a digestão com enzima de restrição para excisar o ADN de CHF. (iii) Componente de gene de selecção

Os vectores de expressão e clonagem deverão conter um gene de selecção, também designado por gene marcador. Este gene codifica para uma proteina necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescidas num meio de cultura selectivo. As 49 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ células hospedeiras não transformadas com o vector que contém o gene de selecção não irão sobreviver no meio de cultura. Os genes de selecção típicos codificam para proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, e.g., o gene que codifica para D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza uma droga para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e assim sobrevivem ao regime de selecção. Exemplos desta selecção dominante utilizam as drogas neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl♦ Genet., _1: 327 [1982]), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209: 1422 [1980]), ou higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., _5: 410-413 [1985]). Os três exemplos indicados acima utilizam genes bacterianos sob controlo eucariótico para transferir a resistência à droga adequada, G418 ou neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), ou higromicina, respectivamente.

Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para incorporarem o ácido nucleico de CHF, tais como DHFR ou timidina-quinase. Os transformantes de células de mamífero são colocados sob uma pressão de selecção a que apenas os transformantes estão adaptados de forma única para sobreviver, devido a terem incorporado o marcador. A pressão de selecção é imposta cultivando os transformantes sob condições em que a concentração do agente de selecção no meio é sucessivamente alterada, levando desse modo à amplificação de ambos, o gene de selecção e o ADN que codifica para CHF. A amplificação é o processo pelo qual os genes em maior necessidade para a produção de uma proteína crítica para o crescimento estão repetidos, dispostos uns a seguir aos outros dentro dos cromossomas de gerações sucessivas de células recombinantes. São sintetizadas quantidades crescentes de CHF a partir do ADN amplificado. Outros exemplos de genes amplificáveis incluem metalotioneína-I e II, de preferência 50 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ genes de metalotioneína, adenosina desaminase, ornitina-descarboxilase, de primata etc.

Por exemplo, as células transformadas com o gene de selecção de DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira adequada quando se utiliza DHFR do tipo selvagem é a linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em actividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216 (1980) . As células transformadas são então expostas a níveis crescentes de metotrexato. Isto leva à síntese de múltiplas cópias do gene de DHFR e, concomitantemente, a múltiplas cópias de outro ADN compreendendo os vectores de expressão, tais como o ADN que codifica para CHF. Esta técnica de amplificação pode ser utilizada com qualquer outro hospedeiro de outro modo adequado, e.g., ATCC N° CCL61 CHO-K1, não obstante a presença de DHFR endógeno se, por exemplo, se utiliza um gene de DHFR mutante que é altamente resistente a Mtx (EP 117060) .

Alternativamente, as células hospedeiras (em particular hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN que codificam para CHF, proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador seleccionável, tal como aminoglicósido-3-fosfotransferase (APH), podem ser seleccionadas por crescimento celular num meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, e.g., canamicina, neomicina ou G418. Veja-se patente US N° 4965199.

Um gene de selecção adequado para utilização em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al.r Gene, 141 [1979]; ou Tschemper et al., Gene, 10: 157 [1980]). O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não possui a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um 51 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ meio ambiente eficaz para detectar a transformação por crescimento na ausência de triptofano. De igual modo, as estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que possuem o gene Leu2.

Adicionalmente, os vectores derivados do plasmídeo pKDl circular de 1,6 ym podem ser utilizados para transformação de leveduras Kluyveromyces. Bianchi et al., Curr. Genet., 12: 185 (1987). Mais recentemente, foi descrito um sistema de expressão para a produção em grande escala de quimosina de vitela recombinante, para K. lactis. Van den Berg, Bi o/Technology, _8: 135 (1990). Também foram descritos vectores de expressão de múltiplas cópias, estáveis, para a secreção de albumina de soro humano recombinante, madura, por estirpes industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bi o /Technology, 9_: 968-975 (1991) . (iv) Componente de promotor

Os vectores de expressão e clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operativamente ao ácido nucleico de CHF. Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a montante (5') do codão de iniciação de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e tradução de uma sequência de ácido nucleico particular, tal como uma sequência de ácido nucleico de CHF, à qual estão ligados operativamente. Estes promotores são tipicamente de duas classes, indutíveis e constitutivos. Os promotores indutíveis são promotores que iniciam níveis aumentados de transcrição a partir do ADN sob o seu controlo, em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, e.g. a presença ou ausência de um nutriente, ou uma alteração na temperatura. Nesta altura, é bem conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. Estes promotores estão ligados operativamente a ADN que codifica para CHF removendo o promotor do ADN fonte por digestão com enzimas de restrição e inserindo a sequência promotora isolada no vector. Quer a sequência do promotor de CHF nativo, quer muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou expressão do ADN 52 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ de CHF. No entanto, os promotores heterólogos são preferidos, uma vez que eles geralmente permitem uma maior transcrição e niveis mais elevados de CHF produzido de forma recombinante, em comparação com o promotor de CHF nativo.

Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem os sistemas promotores de β-lactamase e lactose (Chang et ai., Nature, 2 75: 615 [1978]; e Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979]), fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8_: 4057 [1980] e EP 36776), e promotores híbridos, tais como o promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8 0: 21-25 [1983]). No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são úteis. As suas sequências de nucleótidos foram publicadas, permitindo assim que um especialista as ligue operativamente a ADN que codifica para CHF (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [1980]) utilizando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer sítios de restrição necessários. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também irão conter uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente ao ADN que codifica para CHF. São conhecidas sequências promotoras para eucariotas. Praticamente todos os genes eucariotas têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio em que a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CXCAAT, em que X pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição de uma cauda poliA à extremidade 3' da sequência codificante. Todas estas sequências são inseridas de forma adequada em vectores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol,

Chem., 255: 2073 [1980]) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 1_: 149 [1968]; e Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978]), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato- 53 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura que são promotores indutíveis com a vantagem adicional da transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo de azoto, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilização na expressão de levedura são também descritos em Hitzeman et al., EP 73657. Os potenciadores de levedura também são utilizados com vantagem com promotores de levedura. A transcrição de CHF a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus como o poliomavírus, poxvírus de aves (UK 2211504 publicado em 5 de Julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma de bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite B e muito preferencialmente vírus de símio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, e.g., o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico e do promotor normalmente associado com a sequência de CHF, desde que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira. Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são obtidos de forma conveniente como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação virai de SV40. Fiers et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan e Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 7398-7402 (1981) . 0 promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é obtido de forma conveniente como um fragmento de restrição HindiII E. Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982). Um sistema para expressar ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma de bovino como um vector é descrito na patente US N° 4419446. Uma modificação deste sistema está descrita na patente US N° 4601978. Veja-se também Gray et al., Nature, 295: 503-508 (1982) sobre a expressão de ADNc que codifica 54 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ para ο interferão imunitário em células de macaco; Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de ADNc de interferão-β em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina-quinase do vírus de herpes simples; Canaani e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 5166-5170 (1982) sobre a expressão do gene do interferão βΐ humano células de ratinho e de coelho cultivadas; e Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 19_: 6777-6781 (1982) sobre a expressão de sequências CAT bacterianas em células de rim de macaco CV-1, fibroblasto de embrião de galinha, células de ovário de hamster chinês, células HeLa e células NIH-3T3 de ratinho, utilizando a repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous como promotor. (v) Componente de elemento potenciador A transcrição de um ADN que codifica para o CHF da presente invenção por eucariotas superiores é muitas vezes aumentada inserindo uma sequência potenciadora no vector. Os potenciadores são elementos de ADN que actuam em cis, normalmente com cerca de 10 a 300 pb que actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. Os potenciadores são relativamente independentes da orientação e posição, tendo sido encontrados 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 993 [1981]) e 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108 [1983]) em relação à unidade de transcrição, dentro de um intrão (Banerji et al., Cell, 33: 729 [1983]), bem como dentro da própria sequência codificante (Osborne et al., Mol. Cell Bio., _4: 1293 [1984]). Muitas sequências potenciadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de célula eucariota. Exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus. Veja-se também Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para activação de promotores eucariotas. O potenciador pode ser organizado por splicing no vector, numa posição 5' ou 3' em relação à sequência codificante de CHF, mas está localizado de preferência num sítio 5' em relação ao promotor. 55 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (vi) Componente de terminação da transcrição

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucariotas (levedura, fungos, insectos, plantas, animais, humanos ou células nucleadas de outros organismos pluricelulares) também irão conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Estas sequências estão normalmente disponíveis das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3' de ADN ou ADNc eucariótico ou virai. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica para CHF. (vii) Construção e análise de vectores A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes acima enumerados utiliza técnicas de ligação convencionais. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de ADN são clivados, adaptados e novamente ligados na forma desejada para produzir os plasmídeos necessários.

Para análise para confirmar as sequências correctas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação são utilizadas para transformar E. coli K12 estirpe 294 (ATCC 31.446) e os transformantes bem sucedidos são seleccionados por resistência a ampicilina ou tetraciclina, como adequado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, analisados por digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciados pelo método de Messing et al.r Nucleic Acids Res., 9_: 309 (1981), ou pelo método de Maxam et al.r Methods in Enzymology, 65: 499 (1980) . (viii) Vectores de expressão transitória São particularmente úteis na prática da presente invenção, vectores de expressão que proporcionam a expressão transitória em células de mamífero do ADN que codifica para CHF. Em geral, a expressão transitória envolve a utilização de um vector de expressão que é capaz de se replicar de forma eficaz numa célula hospedeira, de modo que a célula hospedeira acumula muitas cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetiza níveis elevados de um polipéptido desejado codificado pelo vector de expressão. Sambrook et al., supra, 56 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ ρρ 16.17-16.22. Os sistemas de expressão transitória, compreendendo um vector de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem a identificação positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados, bem como a rápida pesquisa destes polipéptidos quanto a propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas. Assim, os sistemas de expressão transitória são particularmente úteis na invenção para fins de identificação de análogos e variantes de CHF nativo que são CHF biologicamente activo. (ix) Exemplos adequados de vectores de células de vertebrados

Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação para a síntese de CHF em cultura de células de vertebrados recombinante estão descritos em Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117060; e EP 117058. Um plasmídeo particularmente útil para a produção de CHF por cultura de células de mamífero é pRK5 (EP 307247) ou pSVl6B (WO 91/08291 publicado em 13 de Junho de 1991) . O derivado de pRK5, pRK5B (Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 [1991]) é particularmente adequado aqui para esta expressão. D. Selecção e transformação de células hospedeiras

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão dos vectores aqui descritos são as células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores descritas acima. Os procariotas adequados para este fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheni forrais 41P descrito em DD 266710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora sejam adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli DH5a e E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos. A estirpe W3110 é um hospedeiro 57 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ particularmente preferido ou hospedeiro progenitor pois é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN. De preferência, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a estirpe W3110 pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes que codificam para proteínas endógenas do hospedeiro, em que exemplos destes hospedeiros incluem E. coli W3110 estirpe 1A2, que tem o genótipo completo tonAA; E. coli W3110 estirpe 9E4, que tem o genótipo completo tonAA ptr3; E. coli W3110 estirpe 27C7 (ATCC 55.244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoAAElSA (argF-lac) 169 AdegPAompT kanr; E. coli W3110 estirpe 37D6, que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoAAEl5A (argF-lac) 169 AdegPAompT Arbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 estirpe 40B4, que é a estirpe 37D6 com uma mutação de eliminação degP não resistente a canamicina; e uma estirpe de E. coli com protease periplasmática mutante descrita na patente U.S. N° 4946783 concedida em 7 de Agosto de 1990 . Alternativamente, são adequados métodos de clonagem in vitro, e.g., PCR ou outras reacções de polimerase de ácido nucleico.

Além dos procariotas, os micróbios eucariotas, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam para CHF. A Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padeiro comum, é o mais utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucariotas inferiores. No entanto, vários outros géneros, espécies e estirpes estão normalmente disponíveis e são úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290 : 140 [1981]; EP 139383 publicado em 2 de Maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (patente U.S. N° 4943529; Fleer et al., supra) tais como, e.g., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., supra), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28 : 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa (Case et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394538 publicado em 31 Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, 58 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de Janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus, tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [19 83]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984] ) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. , 4_: 475-479 [1985] ) .

As células hospedeiras adequadas para a produção de CHF são derivadas de organismos pluricelulares. Estas células hospedeiras são capazes de actividades de processamento e glicosilação complexas. Em principio, qualquer cultura de células de eucariotas superiores é processável, quer de cultura de vertebrados, quer invertebrados. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insectos. Foram identificadas várias estirpes e variantes de baculovirus e células hospedeiras de insecto permissivas, correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Veja-se, e.g., Luckow et al., Bi o/Technology, 6_: 47-55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; e Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985). Está disponível ao público uma variedade de estirpes virais de transfecção, e.g., a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e estes vírus podem ser utilizados como os vírus aqui descritos de acordo com a invenção, em particular para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

As culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser utilizadas como hospedeiros. Tipicamente, as células de planta são transfectadas por incubação com algumas estirpes da bactéria Agrobacterium tumefaciens, que foi previamente manipulada para conter ADN de CHF. Durante a incubação da cultura de células de planta com A. tumefaciens, o ADN que codifica para CHF é transferido para o hospedeiro de células de planta de um modo tal que é transfectado e, nas condições adequadas, irá expressar o ADN de CHF. Além disso, estão disponíveis sequências reguladoras e de sinal compatíveis com células de 59 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ planta, tais como ο promotor de nopalina-sintetatse e sequências de sinal de poliadenilação. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 (1982). Adicionalmente, os segmentos de ADN isolados da região a montante do gene 780 T-DNA são capazes de activar ou aumentar os niveis de transcrição dos genes expressáveis em plantas, em tecido de planta contendo ADN recombinante. EP 321196 publicado em 21 de Junho de 1989.

No entanto, tem havido um maior interesse em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina nos anos recentes (Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Patterson, editores [1973]). Exemplos de linhas celulares de hospedeiros mamíferos úteis incluem uma linha celular de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); uma linha de rim embrionário de humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 [1977]); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216 [1980]); células de sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim de canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. , 383: 44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transfectadas e preferencialmente transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos da presente invenção e cultivadas em meio nutriente convencional, modificado como adequado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam para as sequências desejadas.

Transfecção refere-se à incorporação de um vector de expressão por uma célula hospedeira quer quaisquer sequências 60 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ codificantes sejam de facto expressas, ou não. São conhecidos do perito na arte numerosos métodos de transfecção, por exemplo, CaP04 e electroporação. Uma transfecção de sucesso é geralmente reconhecida quando ocorre qualquer indicação da operação deste vector dentro da célula hospedeira.

Transformação significa introduzir ADN num organismo de um modo tal que o ADN é replicável, quer como elemento extracromossómico, quer como integrante cromossómico. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas convencionais adequadas para estas células. O tratamento com cálcio utilizando cloreto de cálcio, como descrito na secção 1.82 de Sambrook et al., supra, ou a electroporação são geralmente utilizados para procariotas ou outras células que contêm barreiras de parede celular substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de algumas células de planta, como descrito por Shaw et ai., Gene, 23: 315 (1983) e WO 89/05859 publicado em 29 de Junho de 1989. Adicionalmente, as plantas podem ser transfectadas utilizando tratamento com ultra-sons, como descrito em WO 91/00358 publicado em 10 de Janeiro de 1991.

Para células de mamifero sem estas paredes celulares é preferido o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Na Patente US N° 4399216 de Axel, concedida em 16 de Agosto de 1983, foram descritos aspectos gerais de transformação de sistemas de células hospedeiras de mamifero. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 7_6:3829 (1979). No entanto, podem-se também utilizar outros métodos para introduzir ADN nas células, tal como por micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, e.g., polibreno, poliornitina, etc. Para várias técnicas para transformar células de mamifero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). E. Cultura de células hospedeiras

As células procariotas utilizadas para produzir o polipéptido CHF da presente invenção são cultivadas em meios adequados como descrito, em geral, em Sambrook et al., supra. 61 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

As células hospedeiras de mamífero utilizadas para produzir o CHF da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios de cultura disponíveis comercialmente tais como F-10 de Ham (Sigma), F-12 (Sigma), Meio Mínimo Essencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), meio de Eagle modificado da Dulbecco ([D-MEM], Sigma) e D-MEM/F-12 (Gibco BRL) são adequados para cultura de células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer dos meios descritos, por exemplo, em Ham e Wallace, Methods in Enzymology, 58: 44 (1979); Barnes e Sato, Anal, Biochem., 102: 255 (1980); patentes U.S. Nos 4767704; 4657866; 4927762; 5122469; ou 4560655; patente U.S. Re. N° 30985; WO 90/03430; ou WO 87/00195 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado como necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou factor de crescimento epidérmico [EGF]), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como a droga Gentamycin™) , elementos vestigiários (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) , e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Também se podem incluir quaisquer outros suplementos necessários a concentrações adequadas, que serão conhecidos dos peritos na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para o perito na arte.

Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas de células de mamífero in vitro podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology; A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 19 91) .

As células hospedeiras referidas nesta revelação incluem células em cultura in vitro, bem como células que estão num animal hospedeiro. 62 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ F. Detecção da amplificação/expressão de genes A amplificação e/ou expressão de genes pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, por transferência Southern, transferência Northern, convencionais, para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7_7: 5201-5205 (1980)), dot blot (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda marcada de forma adequada, com base nas sequências aqui proporcionadas.

Podem-se utilizar vários marcadores, muito usualmente radioisótopos, em particular 32P. No entanto, também se podem utilizar outras técnicas, tais como utilizar nucleótidos modificados com biotina para introdução num polinucleótido. A biotina serve então como sitio para a ligação a avidina ou anticorpos, que podem ser marcados com uma grande variedade de marcadores, tais como radionuclidos, substâncias fluorescentes, enzimas, ou semelhantes. Alternativamente, podem-se utilizar anticorpos que podem reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN e dúplices híbridos de ADN-ARN, ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos, por sua vez, podem ser marcados e o teste pode ser realizado estando o dúplex ligado a uma superfície, de modo que por formação do dúplex na superfície se pode determinar a presença de anticorpo ligado ao dúplex. A expressão de genes, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de secções de tecido e teste de cultura de células ou fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Com as técnicas de coloração imuno-histoquímica prepara-se uma amostra celular, tipicamente por desidratação e fixação, seguido de reacção com anticorpos marcados, específicos para o produto de gene acoplado, em que os marcadores são normalmente detectados visualmente, tais como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes e semelhantes. Uma técnica de coloração particularmente sensível, adequada para utilização na presente invenção é descrita por Hsu et al. , Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 (1980) .

Os anticorpos úteis para a coloração imuno-histoquímica e/ou teste de fluidos amostra podem ser ou monoclonais ou 63 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. De forma conveniente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido CHF nativo ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas, como descrito também na secção 4 a seguir.

G. Purificação do polipéptido CHF 0 CHF é preferencialmente recuperado do meio de cultura como um polipéptido segregado, embora também possa ser recuperado de lisados de células hospedeiras quando produzido directamente sem um sinal de secreção.

Quando o CHF é produzido numa célula recombinante que não de origem humana, o CHF é completamente isento de proteínas ou polipéptidos de origem humana. No entanto, é necessário purificar CHF a partir de proteínas ou polipéptidos celulares para obter preparações que são substancialmente homogéneas quanto ao CHF. Como primeiro passo, os restos na forma de partículas, quer de células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração; opcionalmente, a proteína pode ser concentrada com um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, seguido de separação do CHF de outras impurezas por um ou mais passos seleccionados de entre cromatografia de imunoafinidade, fraccionamento em coluna de troca iónica (e.g., em DEAE ou matrizes contendo grupos carboximetilo ou sulfopropilo), cromatografia em Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil-lectina-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, éter Toyopearl, butilo Toyopearl, fenil-Toyopearl, ou proteína A-Sepharose, cromatografia em SDS-PAGE, cromatografia em sílica, cromatofocagem, HPLC de fase inversa (e.g., sílica gel com grupos alifáticos adicionados), filtração em gel utilizando, e.g., cromatografia de crivo molecular ou de exclusão de tamanhos com Sephadex, cromatografia em colunas que se ligam selectivamente a CHF e precipitação com etanol ou sulfato de amónio. Pode-se incluir um inibidor de protease em qualquer dos passos anteriores para inibir a proteólise. Exemplos de inibidores de protease adequados incluem fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina, 64 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ aprotinina, cloridrato de fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzenossulfonilbestatina, quimostatina e benzamidina.

Um esquema de purificação preferido envolve ajustar o meio de cultura condicionado por células transfectadas com o clone relevante para NaCl 1,5M e aplicar a uma coluna de butil-Toyopearl™. A coluna é lavada com cloridrato de Tris[hidroximetil]aminometano (TRIS-HC1), pH 7,5 contendo NaCl e a actividade eluida com TRIS-HC1, pH 7,5, contendo tensioactivo Zwittergent™ 3-10 10 mM. O pico de actividade é ajustado para NaCl 150 mM, pH 8,0 e aplicado a uma coluna MONO-Q Fast Flow. Esta coluna é lavada com TRIS-HC1, pH 8,0 contendo NaCl e octil-glucósido. A actividade é encontrada na fracção não retida. O material activo é então aplicado a uma coluna C4 de fase inversa em TFA a 0,1%, acetonitrilo a 10% e eluido com um gradiente de TFA a 0,1%, até 80%. A actividade fracciona a cerca de 15-30 kDa em colunas de filtração em gel. É esperado que um agente caotrópico, tal como guanidina-HCl seja necessário para a resolução e recuperação.

As variantes de CHF em que foram eliminados, inseridos ou substituídos resíduos são recuperadas do mesmo modo que o CHF nativo, tendo em conta quaisquer alterações substanciais em propriedades ocasionadas pela variação. Por exemplo, a preparação de uma fusão de CHF com outra proteína ou polipéptido, e.g., um antigénio bacteriano ou virai, facilita a purificação; uma coluna de imunoafinidade contendo anticorpo contra o antigénio pode ser utilizada para absorver o polipéptido de fusão. As colunas de imunoafinidade, tal como uma coluna anti-CHF policlonal de coelho podem ser utilizadas para absorver a variante de CHF ligando-a a pelo menos um epítopo imunitário remanescente. Um inibidor de protease, tal como os definidos acima, pode também ser útil para inibir a degradação proteolítica durante a purificação e podem-se incluir antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes fortuitos. Um perito na arte terá em consideração que os métodos de purificação adequados para CHF nativo podem necessitar de modificação para compensar as alterações no carácter de CHF ou as suas variantes, aquando da produção em cultura de células recombinante. 65 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Η. Modificações covalentes de polipéptidos CHF

As modificações covalentes de polipéptidos CHF estão incluídas no âmbito da presente invenção. Quer o CHF nativo, quer variantes da sequência de aminoácidos de CHF nativo podem ser modificados de forma covalente. Um tipo de modificação covalente incluído no âmbito da presente invenção é a preparação de um fraqmento de CHF variante. Os fraqmentos de CHF variantes que têm até cerca de 40 resíduos de aminoácido podem ser convenientemente preparados por síntese química ou por clivaqem enzimática ou química do polipéptido CHF de tamanho total ou variante. Outros tipos de modificações covalentes do CHF ou seus fragmentos são introduzidas na molécula reagindo resíduos de aminoácido alvo do CHF ou seus fragmentos com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos de terminal N ou C.

Os resíduos de cisteínilo mais comuns são reagidos com α-halogenoacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para se obterem derivados carboximetilo ou carboxiamidometilo. Os resíduos de cisteínilo também são derivatizados por reacção com bromotri-fluoroacetona, ácido cx-bromo-β-(5-imidozoí1)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, dissulfureto de 3-nitro-2-piridilo, dissulfureto de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazole.

Os resíduos de histidilo são derivatizados por reacção com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 pois este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidilo. O brometo de para-bromofenacilo também é útil; a reacção é de preferência realizada em cacodilato de sódio 0,1 M, a pH 6,0.

Os resíduos de lisinilo e terminal-amino são reagidos com anidridos succínicos ou outros anidridos de ácido carboxílico. A derivatização com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos residuos de lisinilo. Outros reagentes adequados para derivatização de resíduos contendo α-amino incluem imidoésteres, tais como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboro-hidreto, ácido 66 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ trinitrobenzenossulfónico, O-metilisoureia, 2, 4-pentanodiona e reacção catalisada por transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginilo são modificados por reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre estes fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina requer que a reacção seja realizada em condições alcalinas devido ao pKa elevado do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos da lisina, bem como com o grupo epsilon-amino da arginina.

As modificações específicas de resíduos de tirosilo podem ser feitas com particular interesse introduzindo marcadores espectrais em resíduos de tirosilo por reacção com compostos de diazónio aromáticos, ou tetranitrometano. Mais usualmente, utiliza-se N-acetilimidazole e tetranitrometano para formar espécies de O-acetiltirosilo e derivados 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosilo são iodados utilizando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para utilização em radioimunoensaio, sendo adequado o método de cloramina T descrito acima.

Os grupos laterais carboxilo (aspartilo ou glutamilo) são selectivamente modificados por reacção com carbodiimidas (R-N=C=N-R'), em que R e R' são grupos alquilo diferentes, tais como l-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartilo e glutamilo são convertidos em resíduos de asparaginilo e glutaminilo por reacção com iões amónio. A derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticular o CHF numa matriz ou superfície de suporte insolúvel em água, para utilização no método para purificar anticorpos anti-CHF e vice-versa. Os agentes de reticulação normalmente utilizados incluem, e.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, gluteraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de disuccinimidilo, tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes 67 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ de derivatização tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato originam intermediários fotoactiváveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, as matrizes insolúveis em água reactivas, tais como hidratos de carbono activados com brometo de cianogénio e os substratos reactivos descritos nas patentes US Nos 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537; e 4330440 são utilizados para a imobilização de proteínas.

Os resíduos de glutaminilo e asparaginilo são frequentemente desamidados nos resíduos de glutamilo e aspartilo correspondentes, respectivamente. Estes resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos está no âmbito da presente invenção.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos de serilo ou treonilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 [1983]), acetilação da amina de terminal N e amidação de qualquer grupo carboxilo de terminal C.

Outro tipo de modificação covalente do polipéptido CHF incluído no âmbito da presente invenção compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do polipéptido. O termo alterar significa eliminar uma ou mais porções de hidrato de carbono encontradas no CHF nativo e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no CHF nativo. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N refere-se à ligação da porção de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripéptido asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção de hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências de tripéptido num polipéptido cria um sitio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a O refere-se à 68 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ ligação de um dos glícidos N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, muito usualmente serina ou treonina, embora também se possa utilizar 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de sítios de glicosilação ao polipéptido CHF é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de um modo tal que esta contém uma ou mais das sequências de tripéptido acima descritas (para sítios de glicosilação ligada a N) . A alteração pode também ser feita por adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de treonina na sequência de CHF nativo (para sítios de glicosilação ligados a 0). Para facilidade, a sequência de aminoácidos de CHF nativo é de preferência alterada através de alterações ao nível do ADN, em particular por mutação do ADN que codifica para o polipéptido CHF nativo em bases pré-seleccionadas, de modo que são produzidos codões que se irão traduzir nos aminoácidos desejados. A mutação(ões) de ADN pode ser feita utilizando métodos descritos acima na secção 2B.

Outro meio para aumentar o número de porções de hidrato de carbono no polipéptido CHF é por acoplamento químico ou enzimático de qlicósidos ao polipéptido. Estes procedimentos são vantajosos na medida em que não necessitam da produção do polipéptido numa célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação ligada a N ou 0. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) glícido pode ser ligado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo livres, (c) grupos sulfidrilo livres, tais como os de cisteína, (d) grupos hidroxilo livres, tais como os de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, tais como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos estão descritos na arte, e.g., em WO 87/05330 publicado em 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). A remoção de quaisquer porções de hidrato de carbono presentes no polipéptido CHF pode ser conseguida química ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer exposição do polipéptido ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os glicidos, excepto o glicido ligante 69 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando ao mesmo tempo o polipéptido intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys, 259:52 (1987) e por Edge et al. , Anal. Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de porções de hidrato de carbono em polipéptidos pode ser conseguida utilizando uma variedade de endo- e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987). A glicosilação em sítios de glicosilação potenciais pode ser prevenida utilizando o composto tunicamicina, como descrito por Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3105 (1982). A tunicamicina bloqueia a formação das ligações proteína-N-glicósido.

Outro tipo de modificação covalente de CHF compreende ligar o polipéptido CHF a um de uma variedade de polímeros não proteicos, e.g.r polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, do modo apresentado nas patentes US Nos 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 ou 4179337. 0 CHF também pode ser incluído em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli[metilmetacilato], respectivamente) em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A. Ed. (1980).

As preparações de CHF também são úteis para produzir anticorpos, como padrões em testes de CHF (e.g. por marcação de CHF para utilização como um padrão num radioimunoensaio, imunoensaio ligado a enzima ou teste de receptor radioactivo) em técnicas de purificação por afinidade e em testes de ligação ao receptor do tipo competitivo quando marcado com iodo radioactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de spin e semelhantes. 70 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Uma vez que é muitas vezes difícil prever de antemão as características de um CHF variante, deve ter-se em conta que será necessária alguma pesquisa da variante recuperada, para seleccionar a variante óptima. Pode-se pesquisar quanto a uma actividade hipertrófica, anti-arrítmica, inotrópica ou neurotrófica cardíaca aumentada, posse de actividade antagonista de CHF, níveis de expressão aumentados, estabilidade oxidativa, capacidade de ser segregado com rendimentos elevados e semelhantes. Por exemplo, uma alteração no carácter imunológico da molécula de CHF, tal como afinidade para um determinado anticorpo, é medida por um imunoensaio do tipo competitivo. A variante é testada quanto a alterações na supressão ou aumento das suas actividades hipertróficas, anti-arrítmicas, inotrópicas e neurotróficas, em comparação com as actividades respectivas observadas para o CHF nativo, no mesmo teste (utilizando, por exemplo, os testes de hipertrofia e neurotróficos descritos nos exemplos a seguir). Outras modificações potenciais das propriedades da proteína ou polipéptido, tais como estabilidade redox ou térmica, hidrofobicidade, susceptibilidade à degradação proteolítica ou a tendência para se agregar com transportadores ou em multímeros, são testadas por métodos bem conhecidos na arte.

I. Antagonistas de CHF

Os antagonistas de CHF podem ser preparados utilizando a família de receptores de CHF prevista (a família de receptores de GH/citóquina, incluindo a subfamília do receptor de CNTF, LIF e oncostatina M) . Assim, o receptor pode ser clonado por expressão a partir da família; em seguida produz-se uma forma solúvel do receptor para identificar o domínio extracelular e excisar o domínio transmembranar deste. A forma solúvel do receptor pode então ser utilizada como um antagonista ou o receptor pode ser utilizado para pesquisar moléculas pequenas que iriam antagonizar a actividade de CHF.

Alternativamente, utilizando a sequência de murídeo apresentada na Figura 1 ou a sequência humana apresentada na Figura 5, produzem-se variantes de CHF nativo que actuam como antagonistas. Uma vez que a família do receptor de GH/citóquina é conhecida por ter dois sítios de ligação no ligando, os sítios de ligação ao receptor de CHF podem ser determinados por estudos de ligação e um deles eliminado por técnicas convencionais (eliminação ou substituição radical) de 71 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ modo que a molécula actua como um antagonista. A actividade antagonista pode ser determinada por vários meios, incluindo testes de hipertrofia e neurotróficos descritos aqui. J. Teste de hipertrofia

Utiliza-se de preferência um teste miniaturizado para testar a actividade hipertrófica. Neste teste, o meio utilizado permite que as células sobrevivam a uma densidade de plaqueamento baixa, sem soro. Plaqueando directamente neste meio, os passos de lavagem são eliminados de modo que menos células são removidas. A densidade de plaqueamento é importante: muito poucas células e a sobrevivência é reduzida; muito mais células e os miócitos começam a auto-induzir hipertrofia.

Os passos envolvidos são: (a) plaquear placas de 96 poços com uma suspensão de miócitos a uma densidade celular de cerca de 7,5 x 104 células por ml em meio D-MEM/F-12 suplementado com pelo menos insulina, transferrina e aprotinina; (b) cultivar as células; (c) adicionar uma substância a ser testada (tal como uma que se suspeita que contém um CHF); (d) cultivar as células com a substância; e (e) medir quanto a hipertrofia. 0 meio pode ser suplementado com elementos adicionais, tais como EGF, para assegurar uma maior viabilidade das células, mas estes suplementos não são essenciais. 0 meio D-MEM/F-12 está disponível da Gibco BRL, Gaithersburg, MD e consiste de um dos seguintes meios:

Componente 11320 lx líquido (mg/L) 11321 lx líquido (mg/L) 11330 lx líquido (mg/L) 11331 lx líquido (mg/L) 12400 Pó (mg/L) 12500 Pó (mg/L) AMINOÁCIDOS: L-Alanina 4, 45 4, 45 4, 45 4, 45 4, 45 4, 45 L-Arginina·HC1 147,50 147,50 147,50 147,50 147,50 147,50 L-Asparagina·H20 7, 50 7, 50 7, 50 7, 50 7, 50 7, 50 Ácido L-aspártico 6,65 6,65 6,65 6,65 6,65 6,65 72 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Componente 11320 lx liquido (mg/L) 11321 lx liquido (mg/L) 11330 lx liquido (mg/L) 11331 lx liquido (mg/L) 12400 Pó (mg/L) 12500 Pó (mg/L) L-Cisteína·HC1·Η20 17,56 17,56 17,56 17,56 17,56 17,56 L-Cistina-2HC1 31,29 31,29 31,29 31,29 31,29 31,29 Ácido L-glutâmico 7,35 7,35 7,35 7,35 7,35 7,35 L-Glutamina 365,00 365,00 365,00 365,00 365,00 365,00 Glicina 18, 75 18, 75 18, 75 18, 75 18, 75 18, 75 L-Histidina·HC1·H20 31,48 31,48 31,48 31,48 31,48 31,48 L-Isoleucina 54, 47 54, 47 54, 47 54, 47 54, 47 54, 47 L-Leucina 59,05 59,05 59,05 59,05 59,05 59,05 L-Lisina·HC1 91,25 91,25 91,25 91,25 91,25 91,25 L-Metionina 17,24 17,24 17,24 17,24 17,24 17,24 L-Fenilalanina 35, 48 35, 48 35, 48 35, 48 35, 48 35, 48 L-Prolina 17,25 17,25 17,25 17,25 17,25 17,25 L-Serina 26,25 26,25 26,25 26,25 26,25 26,25 L-Treonina 53,45 53,45 53,45 53,45 53,45 53,45 L-Triptofano 9,02 9,02 9,02 9,02 9,02 9,02 L-Tirosina-2Na·2H20 55, 79 55, 79 55, 79 55, 79 55, 79 55, 79 L-Valina 52,85 52,85 52,85 52,85 52,85 52,85 SAIS INORGÂNICO: CaCl2 anid. 116,60 116,60 116,60 116,60 116,60 116,60 CuS04-5H20 0,0013 0,0013 0,0013 0,0013 0,0013 0,0013 Fe(N03)3 · 9H20 0, 05 0, 05 0, 05 0, 05 0, 05 0, 05 FeS04·7H20 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 KC1 311,80 311,80 311,80 311,80 311,80 311,80 MgCl2 28,64 28,64 28,64 28,64 28,64 28,64 MgS04 48, 84 48, 84 48, 84 48, 84 48, 84 48, 84 NaCl 6999,50 6999,50 6999,50 6999,50 6999,50 6999,50 NaHC03 2438,00 2438,00 2438,00 2438,00 — — NaH2P04·H20 62,50 62,50 62,50 — 62,50 62,50 Na2HP04 71, 02 71, 02 71, 02 — 71, 02 71, 02 ZnS04·7H20 0,432 0,432 0,432 0,432 0,432 0,432 OUTROS COMPONENTES: D-Glucose 3151,00 3151,00 3151,00 3151,00 3151,00 3151,00 HEPES — — 3574,50 3574,50 3574,50 — Na hipoxantina 2,39 2,39 2,39 2,39 2,39 2,39 Ácido linoleico 0,042 0,042 0,042 0,042 0,042 0,042 Ácido lipóico 0, 105 0, 105 0, 105 0, 105 0, 105 0, 105 Vermelho de fenol 8,10 8,10 8,10 8,10 8,10 8,10 Putrescina·2H20 0,081 0,081 0,081 0,081 0,081 0,081 73 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Componente 11320 lx liquido (mg/L) 11321 lx liquido (mg/L) 11330 lx liquido (mg/L) 11331 lx liquido (mg/L) 12400 Pó (mg/L) 12500 Pó (mg/L) Piruvato de sódio 55, 00 55, 00 55, 00 55, 00 55, 00 55, 00 VITAMINAS: Biotina 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 pantotenato de D-Ca 2,24 2,24 2,24 2,24 2,24 2,24 Cloreto de colina 8,98 8,98 8,98 8,98 8,98 8,98 Ácido fólico 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 i-Inositol 12,60 12,60 12,60 12,60 12,60 12,60 Niacinamida 2, 02 2, 02 2,02 2,02 2,02 2, 02 Piridoxal·HC1 2, 00 — 2,00 — 2,00 2, 00 Piridoxina·HC1 0, 031 2, 031 0,031 2, 031 0,031 0, 031 Riboflavina 0,219 0,219 0,219 0,219 0,219 0,219 Tiamina HC1 2, 17 2, 17 2,17 2,17 2,17 2, 17 Timidina 0,365 0,365 0,365 0,365 0,365 0,365 Vitamina B12 0,68 0,68 0,68 0,68 0,68 0,68 Ο teste de hipertrofia preferido compreende: (a) pré-revestir os poços de placas de cultura de 96 poços com um meio contendo soro de vitela, de preferência meio D-MEM/F-12 contendo soro fetal de vitela a 4%, em que de preferência os poços são incubados com o meio durante cerca de oito horas a cerca de 37°C. (b) remover o meio (c) plaquear a suspensão de miócitos nos 60 poços internos a 7,5 x 104 poços por ml em meio D-MEM/F-12 suplementado com insulina, transferrina e aprotinina; (d) cultivar os miócitos durante pelo menos 24 horas; (e) adicionar a substância de teste; (f) cultivar as células com a substância de teste (de preferência durante cerca de 24-72 horas, mais preferencialmente durante cerca de 48 horas); e (g) medir quanto a hipertrofia, de preferência com coloração de violeta de cristal. 74 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

De preferência, ο meio utilizado no passo (c) é um meio isento de soro que também contém penicilina/estreptomicina (pen/estrep) e glutamina. Mais preferencialmente, o meio contém 100 ml de D-MEM/F-12, 100 μΐ de transferrina (10 mg/ml), 20 μΐ de insulina (5 mg/ml), 50 μΐ de aprotinina (2 mg/ml), 1 ml de pen/estrep (JRH Biosciences N° 59602-77P), e 1 ml de L-glutamina (200 mM). A capacidade do teste de 1000 amostras individuais por semana juntamente com o pequeno tamanho de amostra necessário, de 100 μΐ ou inferior permitiu uma clonagem de expressão e purificação de proteína que teria sido impossível de realizar utilizando os métodos actualmente disponíveis.

Outro método para testar a hipertrofia envolve medir a libertação do péptido natriurético atrial (ANP) por meio de um teste que determina a competição para ligação de 125I-ANP de rato para uma proteína de fusão receptor A de ANP de rato-IgG. O método adequado para utilização é semelhante ao utilizado para determinar a gpl20 utilizando uma proteína de fusão CD4-IgG descrita por Chamow et ai., Biochemistry, 29 : 9885-9891 (1990) . K. Teste neurotrófico O teste utilizado para a actividade neurotrófica de gânglios ciliares descrito em Leung, Neuron, 8_: 1045-1053 (1992) é aqui adequado. Em resumo, faz-se a dissecção de gânglios ciliares de embriões de galinha E7-E8 e dissociam-se em tripsina-EDTA (Gibco 15400-013) diluída dez vezes em solução salina tamponada com fosfato, durante 15 minutos a 37°C. Os gânglios são lavados para ficar isentos de tripsina com três lavagens de meio de crescimento (D-MEM com teor elevado de glucose suplementado com soro fetal de bovino a 10%, glutamina 1,5 mM, penicilina 100 pg/ml e estreptomicina 100 pg/ml) e em seguida cuidadosamente triturados em 1 ml de meio de crescimento, numa suspensão de células individuais. Os neurónios são enriquecidos plaqueando esta mistura celular em 5 ml de meio de crescimento numa placa de cultura de tecido de 100-mm, durante 4 horas a 37°C num incubador de cultura de tecido. Durante este tempo, as células não neuronais aderem de preferência à placa e os neurónios podem ser cuidadosamente 75 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ lavados para os remover, no final da incubação. Os neurónios enriquecidos são então plaqueados numa placa de 96 poços previamente revestida com colaqénio. Em cada poço, plaqueiam-se 1000 a 2000 células, num volume final de 100 a 250 μΐ, com diluições do CHF a ser testado. Após uma incubação de 2-4 dias a 37°C, o número de células vivas é determinado por coloração das células vivas utilizando o corante vital metalotioneina (MTT) . Um quinto do volume de MTT 5 mg/ml (Sigma M2128) é adicionado aos poços. Após uma incubação de 2-4-horas a 37°C, as células vivas (cheias com um precipitado púrpura denso) são contadas por microscopia de fase com uma ampliação de 100X.

3. Utilizações e composições terapêuticas e administração de CHF

Pensa-se que o CHF tem utilidade como uma droga para o tratamento de mamíferos (e.g. animais ou humanos) in vivo que têm insuficiência cardíaca, distúrbios arrítmicos ou inotrópicos e/ou neuropatias periféricas e outros distúrbios neurológicos envolvendo neurónios motores ou outros neurónios em que o CNTF está activo.

Por exemplo, o CHF pode ser útil para tratar insuficiência cardíaca congestiva em casos em que os inibidores de ACE não podem ser utilizados, ou não são tão eficazes. 0 CHF é opcionalmente combinado com, ou administrado em conjunção com outros agentes para tratar a insuficiência cardíaca congestiva, incluindo inibidores de ACE. A quantidade eficaz de inibidor de ACE a ser administrada, se utilizado, ficará ao critério do médico ou veterinário. A administração e ajuste da dosagem são feitos para se obter um tratamento óptimo da insuficiência cardíaca congestiva e têm idealmente em conta a utilização de diuréticos ou digitálicos e condições como hipotensão e insuficiência renal. A dose dependerá também de factores como o tipo de inibidor utilizado e o paciente específico a ser tratado. Tipicamente, a quantidade utilizada será a mesma dose que a utilizada se o inibidor de ACE fosse para ser administrado sem CHF. 76 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Assim, por exemplo, uma dose de teste de enalapril é de 5 mg, que é então aumentada para 10-20 mg por dia, uma vez por dia, à medida que o paciente a tolera. Como outro exemplo, o captopril é inicialmente administrado oralmente a pacientes humanos numa dose de teste de 6,25 mg e a dose é então escalonada, de acordo com a tolerância do paciente, para 25 mg, duas vezes por dia (BID) ou três vezes por dia (TID) e pode ser titulada para 50 mg BID ou TID. O nivel de tolerância é estimado determinando se o decréscimo na pressão sanguínea é acompanhado por sinais de hipotensão. Se indicado, a dose pode ser aumentada até 100 mg BID ou TID. O captopril é produzido para administração como ingrediente activo, em combinação com hidroclorotiazida e tem um núcleo com pH estabilizado, com um revestimento entérico ou de libertação controlada que protege o captopril até este atingir o cólon. O captoppril está disponível para administração na forma de comprimidos ou cápsulas. Uma discussão sobre a dosagem, administração, indicações e contra-indicações associadas com o captopril e outros inibidores de ACE pode ser encontrada no Physicians Desk Reference, Medicai Economics Data Production Co., Montvale, NJ. 2314-2320 (1994) . O CHF também é potencialmente útil na produção, maturação e sobrevivência de oligodendrócitos in vitro para protecção de oligodendrócitos contra a morte natural e induzida pelo factor de necrose tumoral, na sobrevivência e diferenciação de astrócitos e a indução do desenvolvimento de astrócitos tipo 2 e na estimulação da produção recombinante do receptor do factor de crescimento nervoso de baixa afinidade e CD-4 pela microglia do sistema nervoso central (SNC) de rato. O CHF também é potencialmente útil por ter um efeito trófico no músculo-esquelético desenervado. Além disso, é esperado que tenha as respostas proliferativas e propriedades de ligação de células hematopoiéticas transfectadas com receptores de baixa afinidade para o factor inibidor de leucemia, oncostatina M e factor neurotrófico ciliar, que regule a expressão de genes de fibrinogénio em hepatócitos, por ligação ao receptor de interleucina-6, que tenha acções tróficas em células de carcinoma embrionário de murídeo, que seja um pirogénio endógeno e que tenha um efeito mitogénico em células de neuroblastoma IMR 32 humanas. 77 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Além disso, é esperado que o CHF aumente a resposta ao factor de crescimento nervoso de neurónios simpáticos de rato em cultura, que mantenha os neurónios motores e os seus músculos alvo em ratos em desenvolvimento, que induza o crescimento de neurónios motores in vivo, que promova a sobrevivência de neurónios corticospinais de rato neonatal in vitro, que previna a degeneração de neurónios dopaminérgicos da substância negra de ratos adultos in vivo, que altere o limiar de sensibilidade de neurónios piramidais do hipocampo ao dano por excitotoxina, que previna a degeneração neuronal e promova a produção de receptores de NGF de baixa afinidade no SNC do rato adulto e que potencie a sobrevivência neuronal em culturas de hipocampo de rato embrionário.

Estas actividades traduzem-se no tratamento de todas as doenças degenerativas pelo CHF, incluindo neuropatias periféricas (motoras e sensoriais), ALS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, AVC, doença de Huntington e doenças oftalmológicas, por exemplo, as que envolvem a retina. 0 CHF pode também ser útil como tratamento auxiliar de distúrbios neurológicos, juntamente com factores neurotróficos como, e.g., CNTF, NGF, BDNF, NT-3, NT-4 e NT-5. 0 ácido nucleico que codifica para CHF pode ser utilizado como um diagnóstico para a tipagem específica de tecido. Por exemplo, procedimentos como a hibridação in situ, transferência Northern e Southern e análise por PCR podem ser utilizados para determinar se o ADN e/ou ARN que codifica para CHF está presente no(s) tipo de célula que está a ser avaliado. 0 polipéptido CHF isolado também pode ser utilizado em testes de diagnóstico quantitativos como um padrão ou controlo contra o qual se podem preparar amostras contendo quantidades desconhecidas de CHF. opcionais

As formulações terapêuticas de CHF para tratamento de insuficiência cardíaca e distúrbios neurológicos são preparadas para armazenamento misturando CHF com o grau de pureza desejado, com transportadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis, 78 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra), na forma de um bolo liofilizado ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de glícidos, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos, tais como Tween, Pluronics ou polietilenoglicol (PEG). O CHF a ser utilizado para administração in vivo deverá ser estéril. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes de ou após liofilização e reconstituição. 0 CHF será normalmente armazenado na forma liofilizada ou em solução.

As composições de CHF terapêuticas são geralmente colocadas num recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou frasco com uma rolha perfurável por meio de uma agulha de injecção hipodérmica. A via de administração de CHF ou anticorpo de CHF é de acordo com métodos conhecidos, e.g. injecção ou infusão pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial ou intralesional, ou por sistemas de libertação controlada, como referido a seguir. O CHF é administrado continuamente por infusão, ou por injecção de um bolus. O anticorpo de CHF é administrado do mesmo modo, ou por administração na corrente sanguínea ou linfa.

Exemplos adequados de preparações de libertação controlada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros 79 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ hidrófobos sólidos contendo a proteína, as quais são na forma de artigos moldados, e.g., películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietilmetacrilato) como descrito por Langer et al., J. Biomed. Mater Res., 15: 167-277 [1981] e Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982] ou poli(álcool vinílico)), poliláctidos (Patente US N° 3773919, EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), etileno-acetato de vinilo não degradável (Langer et al., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tais como Lupron Depot™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133988).

Apesar dos polímeros, tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico, permitirem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, alguns hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo menores. Quando as proteínas encapsuladas permanecem no corpo durante um tempo prolongado, elas podem-se desnaturar ou agregar, como resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem-se delinear estratégias racionais para a estabilização da proteína, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através da interpermuta tiodissulfureto, a estabilização pode ser conseguida modificando resíduos de sulfidrilo, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de humidade, utilizando aditivos adequados, e desenvolvendo composições de matriz de polímeros específicas.

As composições de CHF de libertação controlada também incluem CHF inserido em lipossomas. Os lipossomas contendo CHF são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7 7: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; pedido de patente japonesa 83-118008; patentes U.S. Nos 4485045 e 4544545; e EP 102324. Normalmente, os lipossomas 80 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) em que o teor de lípido é superior a cerca de 30% molar de colesterol, sendo a proporção seleccionada ajustada para a terapia de CHF óptima.

Uma quantidade eficaz de CHF a ser utilizada terapeuticamente dependerá, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, da via de administração e da condição do paciente. Deste modo, será necessário que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração, como necessário para se obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dosagem diária tipica pode ser na gama de cerca de 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal do paciente ou mais, por dia, dependendo dos factores mencionados acima, de preferência cerca de 10 pg/kg/dia a 10 mg/kg/dia. Tipicamente, o clinico irá administrar CHF até se atingir uma dosagem que origina o efeito desejado para o tratamento da disfunção cardíaca ou neural. Por exemplo, a quantidade será uma que aumenta a contractilidade ventricular e diminui a resistência vascular periférica, ou melhora ou trata condições de importância semelhante em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por testes convencionais.

4. Preparaçao de anticorpo de CHF (i) Materiais de partida e métodos

As imunoglobulinas (Ig) e certas variantes das mesmas são conhecidas e muitas foram preparadas em cultura de células recombinante. Por exemplo, veja-se patente U.S. N° 4745055; EP 256654; EP 120694; EP 125023; EP 255694; EP 266663; WO 88/03559; Faulkner et al., Nature, 2 9 8: 286 (1982);

Morrison, J. Immun. , 123: 793 (1979); Koehler et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 2197 (1980); Raso et al., Câncer

Res., 41: 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2_: 239 (1984); Morrison, Science, 229: 1202 (1985); e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851 (1984) . Também são conhecidas cadeias de imunoglobulina reassociadas. Veja-se, por exemplo, patente U.S. N° 4444878; WO 88/03565; e EP 68763 e referências aí citadas. A porção de imunoglobulina nas quimeras da presente invenção pode ser obtida dos subtipos 81 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

IgG-1, IgG-2, IgG-3, ou IgG-4, IgA, IgE, IgD, ou IgM, mas preferencialmente de IgG-1 ou IgG-3. (ii) Anticorpos policlonais

Os anticorpos policlonais contra polipéptidos CHF ou fragmentos de CHF são geralmente produzidos em animais por injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) múltiplas de CHF ou fragmentos de CHF e um adjuvante. Poderá ser útil conjugar o CHF ou um fragmento contendo a sequência de aminoácidos alvo a uma proteína que é imunogénica na espécie a ser imunizada, e.g. hemocianina de lapa buraco de fechadura, albumina do soro, tiroglobulina de bovino ou inibidor de tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoilsulfo-succinimida (conjugação através de resíduos de cisterna), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), gluteraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, em que R e R2 são grupos alquilo diferentes.

Os animais são imunizados contra o polipéptido CHF ou fragmento de CHF, conjugados imunogénicos ou derivados, combinando 1 mg ou 1 pg do péptido ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injectando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês mais tarde, os animais levam um reforço com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado, em adjuvante completo de Freund, por injecção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado quanto a CHF ou título de anticorpo de CHF ou de fragmento de CHF. Os animais levam um reforço até o título atingir um patamar. De preferência, o animal leva um reforço com o conjugado do mesmo CHF ou fragmento de CHF, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser produzidos em cultura de células recombinante, como fusões de proteínas. Além disso, os agentes de agregação, tais como alúmen, são utilizados adequadamente para potenciar a resposta imunitária. (ii) Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e. os 82 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ anticorpos individuais que constituem a população são idênticos, excepto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente que poderão estar presentes em quantidades menores. Assim, o modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.

Por exemplo, os podem ser produzidos descrito por Kohler podem ser produzidos et al., supra). anticorpos monoclonais de CHF da invenção utilizando o método do hibridoma primeiro e Milstein, Nature, 256 : 495 (1975), ou por métodos de ADN recombinantes (Cabilly

No método do hibridoma um ratinho ou outro animal hospedeiro adequado, tal como um hamster, é imunizado como aqui descrito acima para produzir linfócitos que produzem, ou são capazes de produzir anticorpos que se irão ligar especificamente ao CSF ou fragmento de CSF utilizado para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 [Academic Press, (1986)]).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas num meio de cultura adequado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma não fundidas, progenitoras. Por exemplo, se as células de mieloma progenitoras não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT) substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma preferidas são as que se fundem de forma eficaz, suportam uma produção de anticorpo de nível elevado, estável, pelas células que produzem anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio, tal como o meio HAT. De entre estas, as linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murídeo, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11, disponíveis do Salk 83 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia EUA e células SP-2 disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA. O meio de cultura em que as células de hibridoma crescem é testado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra CHF. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação, ou por um teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980) .

Após se identificarem as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos por métodos convencionais (Goding, supra). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, o meio D.MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo como tumores ascíticos, num animal.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser separados adequadamente do meio de cultura, fluido de ascites, ou soro, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxiapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. O ADN que codifica para os anticorpos monoclonais da invenção é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam para as cadeias pesada e leve de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster 84 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de ADN que codifica para o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., _5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992). O ADN também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificante para os domínios constantes de cadeia pesada e leve no lugar das sequências de murídeo homólogas (Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 81: 6851 [1984]) ou ligando de forma covalente à sequência codificante de imunoglobulina toda ou parte da sequência codificante para um polipéptido que não imunoglobulina. Deste modo, preparam-se anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" que têm a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal anti-CHF.

Tipicamente, os domínios constantes de um anticorpos da invenção são substituídos por estes polipéptidos que não imunoglobulina ou os domínios variáveis de um sítio de combinação com o antigénio de um anticorpo da invenção são substituídos por eles, para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação com o antigénio que tem especificidade para um CHF e outro sítio de combinação com o antigénio que tem especificidade para um antigénio diferente.

Os anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintética, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, podem-se construir imunotoxinas utilizando uma reacção de troca de dissulfureto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Para aplicações de diagnóstico, os anticorpos da invenção serão tipicamente marcados com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que é capaz de produzir, quer directa, quer indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal 85 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ como 3Η, 14C, 32Ρ, 35S, ou 125Ι; um composto fluorescente ou quimiluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina, marcadores isotópicos radioactivos, tais como, e.g., 125I, 32P, 14C, ou 3H; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano.

Pode-se utilizar qualquer método conhecido na arte para conjugar separadamente o anticorpo com a porção detectável, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982) .

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em qualquer método de teste conhecido, tal como testes de ligação competitivos, testes sanduíche directos e indirectos e testes de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Os testes de ligação competitiva baseiam-se na capacidade de um padrão marcado (que pode ser um CHF ou uma sua porção imunologicamente reactiva) competir com o analito da amostra de teste (CHF) para a ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de CHF na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, os anticorpos geralmente são insolubilizados antes ou após a competição, de modo que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos podem ser convenientemente separados do padrão e analito que permanecem não ligados.

Os testes sanduíche envolvem a utilização de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogénica ou epítopo diferente da proteína (CHF) a ser detectada. Num teste sanduíche, o analito de amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo que está imobilizado num suporte sólido e em seguida um segundo anticorpo liga-se ao analito, formando assim um complexo de três parte, insolúvel. David e Greene, patente U.S. N° 4376110. O segundo anticorpo pode ser ele próprio marcado com uma porção detectável (teste sanduíche 86 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ directo) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (efeito sanduíche indirecto). Por exemplo, um tipo de teste sanduíche é um teste ELISA, caso em que a porção detectável é uma enzima (e.g. peroxidase de rábano). (iv) Anticorpos humanizados

Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são muitas vezes designados por resíduos de "importação", que são tipicamente retirados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada de acordo com o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo as sequências correspondentes de um anticorpo humano pelas CDR ou sequências de CDR de roedores. Deste modo, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Cabilly et al., supra), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, quer leves, quer pesados, a ser utilizados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o designado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas, conhecidas. A sequência humana que é mais próxima da do roedor é aceite como sequência esqueleto (FR) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. , 196 : 901 [1987]). Outro método utiliza uma sequência esqueleto particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves e pesadas. A mesma sequência esqueleto pode ser utilizada para 87 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8 9: 4285 [1992]; Presta et al., J.

Immnol., 151: 2623 [1993]).

Também é importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências progenitoras e vários produtos humanizados conceptuais, utilizando modelos tridimensionais das sequências progenitoras e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais prováveis estão disponíveis usualmente e são familiares para os peritos na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candidatas, seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e. a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antigénio. Deste modo, os resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências de consenso e de importação, de modo que se obtém a característica do anticorpo desejada, tal como maior afinidade para o(s) antigénio alvo. Em geral, os resíduos CDR estão directa e muito substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antigénio. (v) Anticorpos humanos

Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos pelo método do hibridoma. Foram descritas linhas celulares de mieloma e heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991) . É agora possível produzir animais transgénicos (e.g. ratinhos) que são capazes, por imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi 88 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ descrito que a eliminação homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada (JH) do anticorpo em ratinhos quiméricos e ratinhos mutantes da linha germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série do gene de imunoglobulina da linha germinativa humana neste ratinho mutante da linha germinativa irá resultar na produção de anticorpos humanos, aquando do desafio com antigénios. Veja-se, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in

Immuno., 1_: 33 (1993).

Alternativamente, a tecnologia de apresentação em fagos (McCafferty et al., Nature, 348: 552-553 [1990]) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro a partir de repertórios de genes do domínio variável de imunoglobulina (V) de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpo são clonados em fase, ou num gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Uma vez que a partícula filamentosa contém uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na selecção do gene que codifica para o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula-B. A apresentação em fagos pode ser realizada numa variedade de formatos; para revisão veja-se, e.g. Johnson, Kevin S. e

Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3: 564-571 (1993). Podem-se utilizar várias fontes de segmentos de gene V para apresentação em fagos. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma biblioteca combinatorial ao acaso, pequena de genes V derivados dos baços de ratinhos imunizados. Pode-se construir um repertório de genes V a partir de dadores humanos não imunizados e podem-se isolar anticorpos contra uma série diversa de antigénios (incluindo auto-antigénios), essencialmente de acordo com as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993). 89 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Numa resposta imunitária natural, os genes de anticorpos acumulam mutações a uma taxa elevada (hipermutação somática). Algumas das alterações introduzidas irão conferir uma afinidade mais elevada e as células B que apresentam imunoglobulina de superfície de afinidade elevada são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante o desafio com antigénio subsequente. Este processo natural pode ser mimetizado utilizando a técnica conhecida por "shuffling de cadeias" (Marks et al., Bio/Technol., 10 : 779-783 [1992]). Neste método, a afinidade dos anticorpos humanos "primários" obtidos por apresentação em fagos pode ser melhorada substituindo sequencialmente os genes das regiões V de cadeia pesada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertórios) de genes do domínio V obtidos de dadores não imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades na gama nM. Uma estratégia para produzir repertórios muitos grandes de anticorpos de fagos foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993) . O shuffling de genes também pode ser utilizado para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano tem afinidades e especificidades semelhantes às do anticorpo de roedor de partida. De acordo com este método que também é designado por "imprinting de epítopo", o gene do domínio V de cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpos de roedores obtidos pela técnica de apresentação em fagos é substituído com um repertório de genes do domínio V humano, criando quimeras roedor-humano. A selecção com antigénio resulta no isolamento da variável humana capaz de restaurar um sitio de ligação ao antigénio funcional, i.e. o epítopo governa (imprints) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido de modo a substituir o domínio V de roedor remanescente, obtém-se um anticorpo humano (veja-se PCT WO 93/06213, publicado em 1 de Abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedor por enxerto de CDR, esta técnica proporciona anticorpos completamente humanos que não têm resíduos da sequência esqueleto ou CDR originários de roedor. 90 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (vi). Anticorpos biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para um CHF, a outra é para qualquer outro antigénio e, de preferência, para outro ligando que se liga a um membro da família do receptor de GH/citóquina. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a um CHF e factor neurotrófico, ou dois tipos diferentes de polipéptidos CHF estão no âmbito da presente invenção.

Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes [Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Devido ao sortido ao acaso de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é normalmente realizada por passos de cromatografia de afinidade, é algo complicada e os rendimentos de produto são baixos. Estão descritos processos semelhantes no WO 93/08829, publicado em 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J., K):3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente e mais preferida, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é de preferência com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões dobradiça, CH2 e CH3. É preferido que a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o sítio necessário para ligação à cadeia leve esteja presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam para as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados num 91 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona uma grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido em concretizações em que razões desiguais das três cadeias de polipéptido utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. É, no entanto, possível inserir as sequências codificantes para dois ou todos os três polipéptidos num vector de expressão quando a produção de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados, ou quando as razões não têm nenhuma significado particular. Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, dado que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação.

Para mais detalhes sobre a produção de anticorpos biespecíficos veja-se, por exemplo, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986) . (vii) Anticorpos heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados também estão no âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados de forma covalente. Estes anticorpos foram, por exemplo, propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente US N° 4676980) e para o tratamento da infecção por VIH (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089) . Podem-se produzir anticorpos heteroconjugados utilizando qualquer método de reticulação conveniente. São bem conhecidos na arte agentes de reticulação adequados e estes estão descritos na Patente US N° 4676980, juntamente com várias técnicas de reticulação.

5. Utilizações de anticorpos de CHF

Os anticorpos de CHF são úteis em testes de diagnóstico para CHF, e.g. a sua produção em células, tecidos específicos 92 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ ou soro. Os anticorpos são marcados do mesmo modo que o CHF descrito acima e/ou são imobilizados numa matriz insolúvel. Numa concretização de um teste de ligação ao receptor, uma composição de anticorpo que se liga a todos, ou a uma pluralidade seleccionada de CHF é imobilizada numa matriz insolúvel, a amostra de teste é contactada com a composição de anticorpo imobilizada para adsorver todos os CHF e em seguida os CHF imobilizados são contactados com uma pluralidade de anticorpos específicos para cada CHF, sendo cada um dos anticorpos individualmente identificáveis como específico para um CHF pré-determinado, tal como por marcadores únicos, tais como fluoróforos discretos ou semelhantes. Determinando a presença e/ou quantidade de cada marcador único, a proporção relativa e quantidades de cada CHF podem ser determinadas.

Os anticorpos da presente invenção também são úteis na imunização passiva de pacientes.

Os anticorpos de CHF também são úteis para a purificação por afinidade de CHF, a partir de cultura de células recombinante ou de fontes naturais. Os anticorpos de CHF que não têm reacção cruzada detectável com o CHF de rato podem purificar o CHF isento desta proteína.

Os testes de diagnóstico adequados para CHF e seus anticorpos são bem conhecidos per se. Além dos bioensaios descritos nos exemplos a seguir, em que o CHF candidato é testado para ver se tem actividade hipertrófica, anti-arrítmica, inotrópica ou neurotrófica, as técnicas de imunoensaio competitivo, de sanduíche e impedimento estereoquímica são úteis. Os métodos competitivo e de sanduíche utilizam um passo de separação de fases como uma parte integral do método, enquanto que os testes de impedimento estereoquímico são realizados numa única mistura reaccional. Fundamentalmente, são utilizados os mesmos procedimentos para o teste de CHF e para substâncias que se ligam ao CHF, embora alguns métodos sejam preferencialmente escolhidos, dependendo do peso molecular da substância a testar. Deste modo, a substância a testar é aqui designada por analito, independentemente do seu estado de outro modo como antigénio ou anticorpo e as proteínas que se ligam ao analito 93 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ são denominadas por parceiros de ligação, quer sejam anticorpos, receptores de superfície celular ou antigénios.

Os métodos analíticos para CHF ou seus anticorpos utilizam todos um ou mais dos seguintes reagentes: análogo de analito marcado, análogo de analito imobilizado, parceiro de ligação marcado, parceiro de ligação imobilizado e conjugados estereoquímicos. Os reagentes marcados também são conhecidos como "traçadores". 0 marcador utilizado (e isto também é útil para marcar ácido nucleico de CHF para utilização como uma sonda) é qualquer funcionalidade detectável que não interfere com a ligação do analito e do seu parceiro de ligação. São conhecidos vários marcadores para utilização em imunoensaio, em que exemplos incluem porções que podem ser detectadas directamente, tais como marcadores fluorócromos, quimiluminescentes e radioactivos, bem como porções, tais como enzimas, que devem ser reagidas ou derivatizadas para ser detectadas. Exemplos destes marcadores incluem os radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, e 131I; fluoróforos tais como quelatos terrosos raros ou fluoresceína e seus derivados; rodamina e seus derivados; dansilo; umbeliferona; luciferases, e.g.r luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana (patente U.S. N° 4737456); luciferina; 2,3-di-hidroftalazinodionas; malato-desidrogenase; urease; peroxidase, tal como peroxidase de rábano (HRP); fosfatase alcalina; β-galactosidase; glucoamilase; lisozima; sacárido-oxidases, e.g., glucose-oxidase, galactose-oxidase e glucose-6-fosfato-desidrogenase; oxidases heterocíclicas, tais como uricase e xantina-oxidase, acopladas com uma enzima que utiliza peróxido de hidrogénio para oxidar um precursor corante, tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase; biotina/avidina; marcadores de spin; marcadores bacteriófagos; radicais livres estáveis e semelhantes.

Os peritos na arte conhecerão outros marcadores adequados que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. A ligação destes marcadores a CHF, anticorpos ou seus fragmentos pode ser realizada utilizando técnicas convencionais normalmente conhecidas do perito na arte. Por exemplo, podem-se utilizar agentes de acoplamento tais como dialdeídos, 94 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, benzidina bis-diazotizada e semelhantes, para marcar o polipéptido com os marcadores fluorescentes, quimiluminescentes e enzimáticos acima descritos. Veja-se, por exemplo, patentes U.S. Nos 3940475 (fluorimetria) e 3645090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981) ; Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982) ; 0'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone e H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nova Iorque, Nova Iorque, 1981), pp. 147-166; Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 70: 1-31 (1976); e Schurs et al., Clin. Chim. Acta, 81 : 1-40 (1977). As técnicas de acoplamento mencionadas na última referência são o método do gluteraldeido, o método do periodato, o método da dimaleimida e o método do éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimida.

Na prática da presente invenção, os marcadores enzimáticos são uma concretização preferida. Não há uma enzima única que seja ideal para utilizar como marcador em todos os testes concebíveis. Pelo contrário, deve determinar-se qual a enzima que é adequada para um sistema de teste particular. Critérios importantes para a escolha de enzimas são o número de turnover da enzima pura (o número de moléculas de substrato convertidas em produto por sítio da enzima, por unidade de tempo), pureza da preparação de enzima, sensibilidade de detecção do seu produto, facilidade e velocidade de detecção da reacção enzimática, ausência de factores que interferem ou de actividade tipo enzima no fluido de teste, estabilidade da enzima e seu conjugado, disponibilidade e custo da enzima e do seu conjugado e semelhantes. Incluem-se entre as enzimas utilizadas como marcadores preferidos nos testes da presente invenção a fosfatase alcalina, HRP, beta-galactosidase, urease, glucose-oxidase, glucoamilase, malato-desidrogenase e glucose-6-fosfato-desidrogenase. A urease está entre os marcadores enzimáticos mais preferidos, em particular devido aos indicadores de pH cromogénicos que tornam a sua actividade facilmente detectável a olho nu. 95 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ A imobilização dos reagentes é necessária para alguns métodos de teste. A imobilização inclui separar o parceiro de ligação de qualquer analito que permaneça livre em solução. Isto é convencionalmente realizado ou por insolubilização do parceiro de ligação ou análogo do analito antes do procedimento de teste, tal como por adsorção a uma matriz ou superfície insolúvel em água (Bennich et al., patente U.S. N° 3720760), por acoplamento covalente (por exemplo utilizando reticulação com gluteraldeído) ou por insolubilização do parceiro ou análogo em seguida, e.g., por imunoprecipitação.

Outros métodos de teste, conhecidos como testes competitivos ou sanduíche estão bem estabelecidos e são amplamente utilizados na indústria de diagnóstico comercial.

Os testes competitivos baseiam-se na capacidade de um análogo traçador competir com o analito da amostra de teste para um número limitado de sítios de ligação num parceiro de ligação comum. O parceiro de ligação é geralmente insolubilizado antes ou após a competição e em seguida o traçador e analito ligados ao parceiro de ligação são separados do traçador e analito não ligados. Esta separação é realizada por decantação (quando o parceiro de ligação foi pré-insolubilizado) ou por centrifugação (quando o parceiro de ligação foi precipitado após a reacção competitiva). A quantidade de analito de amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade do traçador ligado, tal como medido pela quantidade de substância marcadora. Preparam-se curvas dose-resposta com quantidades conhecidas de analito e comparam-se com os resultados de teste para determinar quantitativamente a quantidade de analito presente na amostra de teste. Estes testes são designados por sistemas ELISA quando as enzimas são utilizadas como marcadores detectáveis.

Outra espécie de teste competitivo, designado por teste "homogéneo", não necessita de uma separação de fases. Aqui, prepara-se um conjugado de uma enzima com o analito e utiliza-se de um modo tal que quando o anti-analito se liga ao analito a presença do anti-analito modifica a actividade enzimática. Neste caso, o CHF ou os seus fragmentos imunologicamente activos são conjugados por uma ponte orgânica bifuncional com uma enzima, tal como peroxidase. Os conjugados 96 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ são seleccionados para utilização com anti-CHF de modo que a ligação do anti-CHF inibe ou potência a actividade enzimática do marcador. Este método per se é amplamente praticado sob o nome EMIT.

Os conjugados estereoquímicos são utilizados em métodos de impedimento estereoquímico para teste homogéneo. Estes conjugados são sintetizados por ligação covalente de um hapteno de peso molecular baixo a um analito pequeno, de modo que o anticorpo contra o hapteno é substancialmente incapaz de se ligar ao conjugado ao mesmo tempo que o anti-analito. Neste procedimento de teste, o analito presente na amostra de teste irá ligar-se ao anti-analito, permitindo assim que o anti-hapteno se ligue ao conjugado, resultando numa alteração no carácter do hapteno conjugado, e.g., uma alteração na fluorescência quando o hapteno é um fluoróforo.

Os testes sanduíche são particularmente úteis para a determinação de CHF ou anticorpos de CHF. Em testes sanduíche sequenciais utiliza-se um parceiro de ligação imobilizado para adsorver o analito da amostra de teste, a amostra de teste é removida, tal como por lavagem, o analito ligado é utilizado para adsorver o parceiro de ligação marcado e o material ligado é então separado do traçador residual. A quantidade de traçador ligado é directamente proporcional ao analito da amostra de teste. Em testes sanduíche "simultâneos" a amostra de teste não é separada antes de adicionar o parceiro de ligação marcado. Um teste sanduíche sequencial utilizando um anticorpos monoclonal anti-CHF, tal como um anticorpo e um anticorpo anti-CHF policlonal como o outro é útil para testar amostras quanto a actividade de CHF. 0 anteriormente exposto é meramente um exemplo de testes de diagnóstico para CHF e anticorpos. Outros métodos desenvolvidos agora ou depois para a determinação destes analitos estão incluídos no âmbito aqui descrito, incluindo os bioensaios descritos acima.

Os exemplos seguintes são dados a título ilustrativo e não limitativo. As revelações de todas as citações no fascículo são expressamente aqui incorporadas para referência. 97 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

EXEMPLO I

Identificação e actividade in vitro de um CHF A. Teste para material clonado por expressão 0 teste utilizado para a hipertrofia é um teste de hipertrofia de coração de rato neonatal in vitro, descrito em geral como se segue: 1. Preparação da suspensão celular de miócitos A preparação da suspensão celular de miócitos baseia-se em métodos descritos em Chien et al., J. Clin. Invest., 75: 1770-1780 (1985) e Iwaki et al., supra. Os ventrículos dos corações de crias de ratos Sprague-Dawley de 1-2 dias foram removidos e trissectados. Os ventrículos cortados em pedaços pequenos foram digeridos com uma série de tratamentos sequenciais com colagenase. A purificação da suspensão de células individuais resultante num gradiente de Percoll descontínuo resultou numa suspensão de miócitos 95% puros. 2. Plagueamento e cultura dos miócitos

Dois métodos publicados para plaquear e cultivar os miócitos são como se segue: (1) Long et al., supra, plaquearam previamente a suspensão celular durante 30 min em MEM/soro de vitela a 5%. Os miócitos não ligados foram então plaqueados em MEM isento de soro suplementado com insulina, transferrina, BrdU, e albumina de soro bovino em placas de cultura de tecidos de 35 mm a uma densidade de 7,5 x 104 células por ml. (2) Iwaki et al., supra, plaquearam a suspensão de células em D-MEM/199/soro de cavalo a 5%/soro fetal de vitela a 5% em placas de cultura de tecidos de 10-cm, a 3 x 105 células por ml. Após 24 h em cultura, as células foram em seguida lavadas e incubadas em D-MEM/199 isento de soro.

Desenvolveu-se um protocolo diferente de acordo com a presente invenção para plaquear e cultivar estas células, para aumentar a capacidade de teste com um teste miniaturizado. Os poços de placas de cultura de tecidos de 96 poços são pré-revestidos com D-MEM/F12/soro fetal de vitela a 4% durante 8h a 37°C. Este meio é removido e a suspensão celular é plaqueada nos 60 poços internos a 7,5 x 104 células por ml em D-MEM/F-12 suplementado com insulina, transferrina e aprotinina. O meio 98 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ tipicamente contém também um antibiótico, tal como penicilina/estreptomicina e glutamina. Este meio permite que estas células sobrevivam a esta densidade de plaqueamento baixa, sem soro. As substâncias de teste são adicionadas directamente aos poços após as células terem estado em cultura durante 24 horas. 3. Leitura da hipertrofia

Após estimulo com agonistas alfa-adrenérgicos ou endotelina, as células de miocárdio de rato neonatal em cultura apresentam várias caracteristicas da hipertrofia de células de músculo cardíaco in vivo observadas na insuficiência cardíaca congestiva, incluindo um aumento no tamanho celular e um aumento na organização de uma proteína contráctil individual em unidades contrácteis organizadas, Chien et al., FASEB J., supra. Estas alterações podem ser vistas com um microscópio de fase invertida e o grau de hipertrofia é pontuado numa escala arbitrária de 7 a 0, em que 7 são células totalmente hipertrofiadas e 3 são células não estimuladas. Os estados 3 e 7 podem ser vistos em Simpson et al.r Circulation Research, 51: 787-801 (1982), Figura 2, A e B, respectivamente. Para facilitar a leitura microscópica das culturas dos 96 poços e produzir um registo permanente, os miócitos são fixados e corados após o período de teste

adequado com corante de violeta de cristal em metanol. O violeta de cristal é um corante proteico usualmente utilizado para células em cultura.

Adicionalmente, pode-se recolher uma alíquota das placas de 96 poços e monitorizar quanto à expressão de marcadores proteicos da resposta, tal como libertação de ANF ou ANP. B. Clonagem de expressão

Isolou-se ARN poli(A)+ (Aviv e Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69: 1408-1412 [1972]; Cathala et al., DNA, 2: 329-335 [1983]) a partir de corpos embrióides de ratinhos de 7 dias. Os corpos embrióides foram produzidos por diferenciação de células estaminais embrionárias (ES) pluripotentes (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morphol., 8 7: 27-45 [1985]). A linha de células estaminais embrionárias ES-D3 (ATCC No. CRL 1934) foi mantida num estado indiferenciado, num meio contendo LIF (Williams et al., Nature, 336: 684-687 99 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ [1988]). Este meio continha D-MEM (glucose elevada), glutamina a 1%, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, penicilina-estreptomicina, soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 15% e LIF de ratinho 15 ng/ml. Quando estas células foram colocadas numa cultura em suspensão no mesmo meio sem LIF e contendo soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 20% (dia 0), elas agregaram-se e diferenciaram-se em estruturas multicelulares designadas por corpos embrióides. No dia 8 de cultura, formaram-se estruturas tipo coração primordial com batimento, numa fraçcão dos corpos. Os corpos embrióides foram avaliados quanto à produção de actividade de CHF trocando as células ES em diferenciação para meio isento de soro (D-MEM/F-12, glutamina a 1%, penicilina-estreptomicina, contendo albumina de soro bovino a 0,03%) durante uma acumulação de 24 horas. Antes do teste, o meio condicionado foi concentrado 10 vezes com uma membrana de ultrafiltração 3-K (Amicon) e dialisado contra meio de teste. O meio condicionado durante 24 horas, começando no dia 3, originou uma pontuação de hipertrofia de 4,5-5,5 e começando no dia 6 uma pontuação de 5,5-7,5.

Preparou-se uma biblioteca de ADNc no vector de expressão plasmidico, pRK5B (Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 [1991]), de acordo com uma estratégia de iniciação de vector (Strathdee et ai., Nature, 356: 763-767 [1992]). O vector, pRK5B, foi linearizado no sitio NotI, tratado com fosfatase alcalina e ligado com o oligonucleótido de cadeia simples, ocdl.1.3, que tem a sequência: 5'-GCGGCCGCGAGCTCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO: 5) . O produto ligado foi então cortado com BstXI, e o fragmento do vector de 4700-pb foi isolado por electroforese em gel de agarose. O vector foi também purificado por cromatografia de oligo dA. A biblioteca de expressão foi construída utilizando 1 pg do ARN poli (A)+, 5 pg de iniciador de vector e reagentes da

Amersham. Após a síntese da primeira e segunda cadeias e reacções de preenchimento com polimerase de ADN de T4, o material foi dimensionado para inserções maiores que 500 pb por electroforese em gel e circularizado por ligação de extremidades rombas, sem adição de ligantes. As ligações foram utilizadas para transformar E. coli estirpe DH5cx por 100 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ electroporação. A partir de 1 pg de ARN poli (A)+, produziram-se 499 pg de ADNc de cadeia dupla. Ligaram-se 17 nanogramas de ADNc e 3,3 ng foram transformadas para se obterem 780 000 clones, 83% dos guais tinham inserções com um tamanho médio de 1470 pb. O ADN foi isolado de conjuntos de 75-15 000 clones e transfectado em células 293 de rim embrionário humano por transfecção com lipofectamina (Gibco BRL) . Utilizaram-se dois microgramas de ADN para transfectar 200.000 células em placas de 6 poços. As células foram incubadas em 2 ml de meio de teste isento de soro, durante guatro dias. Este meio consistia de 100 ml de D-MEM/F-12, 100 pl de transferrina (10 mg/ml) , 20 pl de insulina (5 mg/ml), 50 pl de aprotinina (2 mg/ml), 1 ml de pen/estrep (JRH Biosciences N° 59602-77P) e 1 ml de L-glutamina (200 mM). A eficiência de transfecção e expressão foram monitorizadas por inclusão de 0,2 pg de ADN para um plasmideo gue expressa uma forma segregada de fosfatase alcalina (Tate et al., FASEB J., 4: 227-231 [1990]).

Testaram-se 100 microlitros de meio de cultura condicionado de cada conjunto transfectado, quanto a hipertrofia, num volume final de 200 pl. Para alguns conjuntos, o meio condicionado foi concentrado 4-5 vezes antes do teste com microconcentradores Centricon 3™ (Amicon). Noventa conjuntos de 10 000-15 000 clones, 359 conjuntos de 1000-5800 clones e 723 conjuntos de 75-700 clones foram transfectados e testados quanto à actividade de hipertrofia. Destes 1172 conjuntos, verificou-se que dois eram positivos. 0 conjunto 437 (um conjunto de 187 clones) e o conjunto 781 (um conjunto de 700 clones) originaram pontuações de 4. Isolou-se um clone puro (designado por pCHF.437.48) do conjunto 437 para nova transfecção de conjuntos positivos contendo menos e menos números de clones, até se obter um único clone. Isolou-se um clone puro do conjunto 781 (designado por pCHF.781) por hibridação de colónias com a inserção do clone pCHF.437.48. A sequência para a inserção do clone pCHF.781 é proporcionada na Figura 1 (SEQ ID NOS: 1, 2 e 3 para as duas cadeias de nucleótidos e sequência de aminoácidos, respectivamente). A sequência da inserção do clone pCHF.437.48 corresponde ao clone 781 que começa na base 27 (sublinhado). 101 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ Ο primeiro enquadramento de leitura aberto do clone pCHF.781 (ver tradução, Figura 1) codifica para uma proteína de 203 aminoácidos (traduzida PM = 21,5 kDa) . Esta proteína contém um resíduo de cisteína, um sítio de glicosilação ligado a N potencial e nenhuma sequência de sinal de secreção de terminal N hidrófoba. A região não traduzida 3' do clone pCHF.781 contém uma repetição de ratinho comum conhecida como bl (pb 895-1015). A hibridação de ARN poli (A)+ do corpo embrióide de 7 dias com uma sonda do clone pCHF.781 mostra uma única banda de -1,4 kb que tem cerca do mesmo tamanho que a inserção dos clones de ADNc. A sequência codificada não é muito semelhante (>35% de identidade de aminoácidos) a nenhuma sequência de proteína conhecida na base de dados Dayhoff. Ela apresenta, no entanto, um nível baixo de semelhança com uma família de proteínas distantemente relacionadas, incluindo CNTF, interleucina-6 (IL-6), interleucina-11 (IL-11), LIF, e oncostatina M (OSM) (Bazan, Neuron, 1_: 197-208 [1991]). O CHF de ratinho tem 24% de identidade de aminoácidos com o LIF de ratinho (Rose e Todaro, WO 93/05169) e 21% de identidade de aminoácidos com o CNTF humano (McDonald et al., Biochim. Biophys. Acta, 1090 : 70-80 [1991]). Veja-se Figura 2 para um alinhamento das sequências de CHF de ratinho e de CNTF humano. O CNTF, IL-6, IL-11, LIF, e OSM utilizam proteínas de sinalização do receptor relacionadas, incluindo gpl30 que são membros da família do receptor de GH/citóquina (Kishimoto et al., Cell, 76: 253-262 [1994]). O CNTF, tal como o CHF, não possui uma sequência de sinal de secreção de terminal N. C. Identidade e actividade do clone

Para demonstrar que o clone pCHF.781 codifica para um CHF, realizaram-se estudos de expressão quer por transfecção de células 293, quer utilizando um sistema de transcrição/tradução de SP6 in vitro acoplado. A marcação com 35S-metionina e cisteína das proteínas produzidas por células 293 transfectadas com pCHF.781 (em comparação com células transfectadas com vector) mostrou que o meio condicionado continha uma proteína marcada de cerca de 21,8 kDa e que o extracto celular apresentava uma proteína de 22,5 kDa. O meio condicionado a partir destas transfecções originou uma pontuação de morfologia de 6, quando testado para hipertrofia 102 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ cardíaca a uma diluição de 1:4 acima. O meio condicionado a marcadas originou uma pontuação uma diluição de 1:1. utilizando o teste descrito partir de transfecções não de morfologia de 5,5-6,5, a

Estes testes também foram positivos para uma segunda medição de hipertrofia cardíaca- libertação de ANP. Veja-se a Figura 3. Este teste foi realizado por determinação da competição para a ligaçao de I-ANP de rato para uma proteína de fusão receptor A de ANP de rato-IgG. Este método é semelhante ao utilizado para a determinação de gpl20 utilizando uma proteína de fusão CD4-IgG (Chamow et ai., Biochemistry, 29: 9885-9891 [1990]). Em resumo, revestiram-se placas de microtítulo com 100 μΐ de anticorpo anti-IgG humana de rato (2 yg/ml), durante a noite a 4°C. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato contendo albumina de soro bovino a 0,5%, os poços foram incubados com 100 μΐ de receptor A de ANP de rato-IgG 3 ng/ml (produzido e purificado de um modo análogo ao receptor A de ANP humano-IgG (Bennett et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-23067 [1991]) durante uma hora a 24°C. Os poços foram lavados e incubados com 50 μΐ de padrão de ANP de rato ou amostra durante uma hora a 24°C. Em seguida adicionaram-se 50 μΐ de 125I-ANP de rato (Amersham) durante uma incubação adicional de uma hora. Os poços foram lavados e contados para determinar a extensão da competição de ligação. As concentrações de ANP nas amostras foram determinadas por comparação com uma curva padrão de ANP de rato. A marcação com 35S-metionina das proteínas produzidas por transcrição/tradução in vitro acoplada a SP6 (materiais da Promega) do clone pCHF.781 mostrou uma proteína marcada de 22,4 kDa. O produto de tradução marcado era activo quando testado para hipertrofia cardíaca a uma diluição de 1:200 (pontuação de morfologia 5-6). Para verificar que a banda marcada de 22,4 kDa era responsável pela actividade de hipertrofia, o produto de tradução marcado foi aplicado a uma coluna C4 de fase inversa (Synchropak RO-4-4000) equilibrada em acetonitrilo a 10%, TFA a 0,1% e eluída com um gradiente de acetonitrilo. Os picos coincidentes de proteína marcada e actividade de hipertrofia eluíram desta coluna a -55% de acetonitrilo. 103 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Foi referida uma actividade de hipertrofia de miócitos cardíacos e parcialmente purificada de fibroblastos cardíacos de rato. Long et al., supra. Para investigar melhor a identidade do CHF, fez-se a cultura dos fibroblastos cardíacos de rato. O meio condicionado destas culturas primárias tem de facto hipertrofia cardíaca no teste de hipertrofia de coração de rato neonatal in vitro, agui descrito. A hibridação de manchas de ARNm de fibroblastos de rato isolados destas culturas apresenta uma banda clara de 1,4 kb guando sondada com um fragmento da região codificante do clone pCHF.781 (a hibridação foi realizada em 5x SSC, formamida a 20% a 42°C com uma lavagem final em 0,2x SSC a 50°C) D. Purificação do factor O meio de cultura condicionado por células transfectadas com o clone pCHF.781 ou um clone humano é ajustado para NaCl 1,5 M e aplicado a uma coluna Butil-650M Toyopearl™. A coluna é lavada com TRIS-HC1 10 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, e a actividade é eluída com TRIS-HC1 10 mM, pH 7,5, Zwittergent™ 3-10 10 mM. 0 pico de actividade é ajustado para NaCl 150 mM, pH 8,0 e aplicado a uma coluna Fast Flow MONO-Q. A coluna é lavada com TRIS-HC1 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, octilglucósido a 0,1% e observa-se actividade na fraçcão não retida. O material activo é então aplicado a uma coluna C4 de fase inversa em TFA a 0,1%, acetonitrilo a 10% e eluída com um gradiente de TFA a 0,1% até 80%. A actividade fracciona a cerca de 15-30 kDa em colunas de filtração em gel. É esperado que um agente caotrópico, tal como guanidina-HCl seja necessário para resolução e recuperação.

EXEMPLO II

Teste para actividade de hipertrofia in vivo A. Ratos normais O CHF purificado do Exemplo I é testado em ratos normais para observar o seu efeito em parâmetros cardiovasculares, tais como pressão sanguínea, frequência cardíaca, resistência vascular sistémica, contractilidade, força do batimento cardíaco, hipertrofia concêntrica ou dilatada, pressão sistólica ventricular esquerda, pressão média ventricular esquerda, pressão diastólica final ventricular esquerda, 104 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ débito cardíaco, índice sistólico, parâmetros histológicos, tamanho ventricular, espessura da parede, etc. B. Modelo de ratinho sobrecarga de pressão O CHF purificado é também testado no modelo de ratinho de sobrecarga de pressão em que a artéria pulmonar é constringida, resultando em insuficiência ventricular direita.

C. Modelo disfuncional de murídeo RV

Pode-se utilizar um modelo de murídeo retroviral para testar o CHF purificado e o dP/dt, fracção de ejecção e podem-se testar volumes com o teste de hipertrofia descrito acima. Neste modelo, a artéria pulmonar do ratinho é constringida de modo a produzir hipertrofia e insuficiência pulmonar. D. Modelo de ratinho transgénico

Os ratinhos transgénico que possuem um gene de fusão promotor de actina muscular-IGF-I apresentam hipertrofia do músculo cardíaco e esquelético, sem evidência de miopatia ou insuficiência cardíaca. Além disso, os ratinhos alvo do gene IGF-I apresentam defeitos na miogénese cardíaca (bem como esquelética) incluindo uma expressão acentuadamente diminuída dos genes da proteína contráctil do músculo ventricular. O CHF purificado é testado nestes dois modelos.

Podem-se desenvolver outros modelos baseados em genética de cardiomiopatia dilatada e disfunção cardíaca, sem necrose, em ratinhos transgénicos e alvo do gene (ratinhos MLC-ras; bandeamento aórtico de ratinhos deficientes para IGF-I, heterozigóticos) . E. Modelo de rato de enfarte pós-miocárdico O CHF purificado também é testado num modelo de rato de enfarte pós-miocárdico, que é preditivo de insuficiência cardíaca congestiva humana na produção de péptido natriurético. Especificamente, ratos Sprague-Dawley macho (Charles River Breeding Laboratories, Inc., oito semanas de idade) são aclimatados às instalações durante pelo menos uma semana antes da cirurgia. Os ratos são alimentados com uma ração para ratos particulada e água ad libitum e colocados num compartimento com luz e temperatura controladas. 105 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ 1. Ligação arterial coronária Ο enfarte do miocárdio é produzido por ligação arterial coronária esquerda, como descrito por Greenen et al.r J. Appl. Physiol., 93: 92-96 (1987) e Buttrick et al., Am. J. Physiol., 260: 11473-11479 (1991). Os ratos são anestesiados com pentobarbital sódico(60 mg/kg, intraperitonealmente), intubados por traqueotomia e ventilados com um respirador (dispositivo Harvard modelo 683). Após toracotomia do lado esquerdo, a artéria coronária esquerda é ligada aproximadamente 2 mm da sua origem com uma sutura de seda 7-0. Os animais operados em falso são submetidos ao mesmo procedimento, excepto que a sutura é passada por baixo da artéria coronária e em seguida removida. Todos os ratos são manuseados de acordo com a "posição da Associação de Cardiologia Americana sobre a utilização de animais de pesquisa" adoptada em 11 de Novembro de 1984 pela Associação Americana do Coração. Quatro a seis semanas após a ligação, o enfarte do miocárdio podia desenvolver-se em insuficiência cardíaca nos ratos.

Em pacientes clínicos, o enfarte do miocárdio ou doença das artérias coronárias é a causa mais comum de insuficiência cardíaca. A insuficiência cardíaca congestiva neste modelo mimetiza razoavelmente a insuficiência cardíaca congestiva na maioria dos pacientes humanos. 2. Electrocardiogramas

Uma semana após a cirurgia, os electrocardiogramas são obtidos sob anestesia ligeira com metofano para documentar o desenvolvimento de enfartes. Os ratos ligados deste estudo são sub-agrupados de acordo com a profundidade e persistência das ondas Q patológicas através das derivações precordiais. Buttrick et al.r supra; Kloner et al., Am. Heart J., 51: 1009-1013 (1983). Isto proporciona uma estimativa grosseira do tamanho do enfarte e assegura que os enfartes grandes e pequenos não estão distribuídos de forma diferencial nos ratos ligados tratados com CHF ou antagonista de CHF e veículo. A confirmação é feita por medição precisa do tamanho do enfarte.

3. Administração de CHF ou antagonista de CHF

Quatro semanas após a cirurgia, o CHF ou antagonista de CHF (10 pg/kg a 10 mg/kg duas vezes por dia, durante 15 dias) 106 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ ou veículo salino é injectado subcutaneamente em ambos, ratos ligados e controlos operados em falso. O peso corporal é medido duas vezes por semana durante o tratamento. O CHF ou antagonista de CHF é administrado em solução salina ou água como veículo. 4. Cateterização

Após um tratamento de 13 dias com CHF, antagonista de CHF ou veículo, os ratos são anestesiados com pentobarbital sódico(50 mg/kg, intraperitonealmente). Implanta-se um cateter (PEIO fundido com PE50) cheio com heparina-solução salina (50 U/ml) na aorta abdominal, através da artéria femoral direita, para medição da pressão arterial e frequência cardíaca. Implanta-se um segundo cateter (PE50) no átrio direito, através da veia jugular direita para medição da pressão atrial direita e para injecção de solução salina. Para medição das pressões ventriculares esquerdas e contractilidade (dP/dt) implanta-se um terceiro cateter (PE50) no ventrículo esquerdo através da artéria carótida direita. Para medição do débito cardíaco por um método de termodiluição insere-se um cateter termistor (Lyons Medicai Instrument Co., Sylmar, CA) no arco aórtico. Os cateteres são exteriorizados na parte de trás do pescoço com o auxílio de um arame de aço inoxidável guiado subcutaneamente e em seguida são fixados. Após implantação dos cateteres todos os ratinhos são colocados em compartimentos individualmente. 5. Medições hemodinâmicas

Um dia após cateterização, o cateter termistor é processado num sistema de microcomputador (Lyons Medicai Instrument Co. ) para determinação do débito cardíaco e os outros três cateteres são ligados a um transdutor de pressão Modelo CP-10 (Century Technology Company, Inglewood, CA) acoplado a um polígrafo Grass Modelo 7 (Grass Instruments, Quincy, MA) . A pressão arterial média (MAP), pressão arterial sistólica (SAP), frequência cardíaca (HR), pressão atrial direita (RAP), pressão sistólica ventricular esquerda (LVSP), pressão média ventricular esquerda (LVMP), pressão diastólica final ventricular esquerda (LVEDP) e máximo ventricular esquerdo (dP/dt) são medidos em ratinhos não restringidos, conscientes. 107 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Para medição do débito cardíaco, injectam-se 0,1 ml de solução salina isotónica à temperatura ambiente como um bolus, através do cateter da veia jugular. A curva de termodiluição é monitorizada por registadores simultrace VR-16 (Honeywell Co., NY) e o débito cardíaco (CO) é obtido digitalmente pelo microcomputador. Volume sistólico (SV)=CO/HR; índice cardíaco (CI)=CO/BW; resistência vascular sistémica (SVR)=MAP/CI.

Após medição destes parâmetros hemodinâmicos, recolhe-se 1 ml de sangue através do cateter arterial. 0 soro é separado e armazenado a -70 °C para medição dos níveis de CHF ou de vários parâmetros bioquímicos, se desejado.

No final das experiências, os ratos são anestesiados com pentobarbital sódico (60 mg/kg) e o coração é parado em diástole com injecção intra-atrial de KC1 (1M). O coração é removido e o átrio e vasos grandes são recortados do ventrículo. O ventrículo é pesado e fixado em formalina tamponada a 10%.

Todos os procedimentos experimentais são aprovados pelo Comité Institutional de cuidados e utilização de animais da Genentech, Inc. antes do início do estudo. 6. Medições do tamanho do enfarte A parede livre ventricular direita é dissecada do ventrículo esquerdo. O ventrículo esquerdo é cortado em quatro fatias transversais, desde o ápice até à base. Cortam-se cinco secções micrométricas e estas são coradas com coloração tricromática de Masson e montadas. As circunferências endocardial e epicardial do ventrículo esquerdo com enfarte e sem enfarte são determinadas com um analisador de imagem digital e planímetro. A circunferência com enfarte e a circunferência ventricular esquerda de todos os quatro pedaços são somadas separadamente para cada uma das superfícies do epicárdio e endocárdio e as somas são expressas como a razão entre circunferência com enfarte e circunferência ventricular esquerda para cada superfície. Faz-se então a média destas duas razões e expressa-se como uma percentagem para o tamanho do enfarte. 108 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ 7. Análise estatística

Os resultados são expressos como média + EPM. Faz-se uma análise de variância (ANOVA) de duas vias e de uma via para determinar as diferenças nos parâmetros entre os grupos. As diferenças significativas são então submetidas a uma análise post-hoc utilizando o método de Newman-Keuls. p< 0,05 é considerado significativo. 8. Resultados Não é esperado que o peso corporal médio antes e após tratamento com CHF ou antagonista de CHF ou veiculo seja diferente entre os grupos experimentais. Não é esperado que o tamanho do enfarte nos ratos ligados seja diferente entre o grupo tratado com veiculo e o grupo tratado com CHF ou antagonista de CHF. É esperado que a administração de CHF ou antagonista de CHF aos ratos ligados nas doses descritas acima resulte numa maior hipertrofia cardíaca por aumento da contractilidade ventricular e diminuição da resistência vascular periférica em relação à observada com os ratos controlos operados em falso e ligados, tratados com veículo. Este resultado esperado iria demonstrar que a administração de CHF ou antagonista de CHF melhora a função cardíaca na insuficiência cardíaca congestiva. Nos ratos operados em falso, no entanto, não é esperado que a administração de CHF ou antagonista de CHF a esta dose altere significativamente a função cardíaca, excepto possivelmente diminuir ligeiramente a pressão arterial e a resistência vascular periférica.

Será razoável esperar que os dados de rato aqui obtidos pudessem ser extrapolados para cavalos, vacas, humanos e outros mamíferos, corrigindo para o peso corporal do mamífero de acordo com procedimentos veterinários e clínicos reconhecidos. Utilizando protocolos e procedimentos convencionais, o veterinário ou clínico será capaz de ajustar as doses, esquema e modo de administração de CHF ou antagonista de CHF para se obterem os efeitos máximos no mamífero a tratar desejado. Pensa-se que os humanos respondem também deste modo. 109 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

EXEMPLO III

Tratamento clínico proposto da cardiomiopatia dilatada A. Intervenção É proposta a auto-administração pelo paciente de CHF ou antagonista de CHF a uma dose inicial de 10-150 μg/kg/dia. A dose será ajustada para baixo devido a efeitos adversos. Se não forem determinados efeitos benéficos nem efeitos adversos limitativos aquando da reavaliação, a dose será ajustada para cima. As doses de medicação concorrente (e.g. captopril como inibidor de ACE e diuréticos) serão ajustadas de acordo com o critério do médico do estudo. Após a dose máxima ser administrada durante 8 semanas, a administração de CHF ou antagonista de CHF é parada e faz-se uma reavaliação após um período de tempo sem tratamento (ou placebo) semelhante. B. Critérios de inclusão

Os pacientes serão considerados para o estudo se satisfizerem os seguintes critérios: cardiomiopatia dilatada (DCM). DCM idiopático ou DCM isquémica sem áreas discretas de acinesia/discinesia do ventrículo esquerdo (LV) em ventriculografia de contraste ou ecocardiografia 2D. Evidência de função sistólica deficiente para incluir quer dimensão diastólica final (EDD) de LV >3,2 cm/m2 BSA ou EDV >82 ml/m2 em ecocardiografia 2D, encurtamento fraccional do LV <28% em ecocardiografia, ou fracção de ejecção (por ventriculografia de contraste ou angiografia de radionuclido) <0,49. - Sintomas. VO2 de classe III da Associação de cardiologia de

Nova Iorque ou de pico de exercício <16 ml/kg/min (ajustado para a idade), estável durante pelo menos um mês sob digoxina, diuréticos e vasodilatadores (inibidores de ACE) . Terapia inibidora de ACE concorrente. "Janelas" ecocardiográficas adequadas para permitir a determinação do volume e massa ventriculares esquerdos. - Capacidade para auto-administrar CHF ou antagonista de CHF de acordo com o esquema de dosagem e garantia de voltar para medições de acompanhamento. 110 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Consentimento do paciente e do médico principal do doente para a sua participação - Ausência de critérios de exclusão. C. Critérios de exclusão

Os paciente deixarão de ser considerados por qualquer dos motivos seguintes: - cardiomiopatia dilatada resultante de doença cardíaca valvular (operável ou não), etiologias tratáveis específicas (incluindo álcool, se a abstinência não tiver sido tentada) ou doença arterial coronária operável. - exercício limitado por dor no peito ou doença vascular periférica obstrutiva. - doença pulmonar obstrutiva crónica diabetes mellitus ou tolerância à glucose deficiente História de síndrome do túnel cárpico ou evidência de sinal de Tinel positivo aquando do exame, história de pedras nos rins osteoartrite sintomática. - incapacidade de consentir ou participar numa ergometria bicíclica em série com monitorização hemodinâmica invasiva (como descrito a seguir) - malignidade activa D. Avaliação do paciente 1) pontos principais de avaliação: linha de base; após dose de CHF ou antagonista de CHF estável, de pico, mantida durante 8 horas; após igual período após descontinuação da droga. - prevê-se que os pacientes permaneçam no hospital durante dois a três dias no início do tratamento activo, com pesos e dados laboratoriais diários, incluindo electrólitos, fósforo, BUN, creatinina e glucose. A seguir eles serão monitorizados no piso do centro de pesquisa clínica diariamente, durante mais dois a três dias. i. Exame físico ii. Pontuação de pontos de sintomas (Kelly et al., Amer.

Heart J., 119: 1111 [1990]). 111 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ iii. Dados laboratoriais: hemograma, electrólitos (incluindo Mg2+ e Ca2+) ; azoto da ureia no sangue; creatinina; fósforo; glucose em jejum e perfil lipídico (colesterol total, HDL-C, LDL-C, triglicéridos) ; testes da função hepática (AST, ALT, fosfatase alcalina, bilirrubina total); proteína total; albumina, ácido úrico e CHF. iv. ecocardiografia 2D, modo-M e doppler, incluindo: dimensões diastólica e sistólica ao nível do músculo papilar; estimativa da fracção de ejecção por planimetria de área de vistas de 2 câmaras e 4 câmaras apicais, volumes sistólico e diastólico estimados pelo método da regra de Simpson e massa ventricular esquerda estimada; determinação doppler do perfil de influxo da válvula mitral (IVRT, pico E, pico A, tempo de desaceleração, duração da onda A) , e perfil do fluxo da veia pulmonar (área de fluxo sistólico, área de fluxo diastólico, duração da inversão de A e velocidade). v. hemodinâmica em repouso e exercício e consumo de oxigénio medido, utilizando ergometria bicíclica com cateteres da artéria pulmonar e arteriais inseridos percutaneamente. 0 nível de esforço perceptível será pontuado na escala de Borg e as medições das pressões sistólica, diastólica e média da artéria pulmonar, bem como as pressões arteriais e pressão de oclusão dos capilares pulmonares serão medidas a cada incremento da carga de trabalho, juntamente com o teor de oxigénio arterial e venoso misto para cálculo do débito cardíaco. vi. determinação da gordura corporal e massa corporal magra, bem como da força e endurance do músculo-esquelético 2) Pontos de avaliação de tempo intermédio: semanalmente i. avaliação física ii. pontuação de pontos de sintomas iii. dados laboratoriais: electrólitos, azoto da ureia no sangue, creatinina, fósforo, glucose em jejum, somatomedina-C e CHF. 112 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ Ε. Benefícios potenciais 1) melhoria da sensação de bem-estar 2) aumento da tolerância ao exercício 3) aumento da força muscular e massa corporal magra 4) diminuição da resistência vascular sistémica 5) aumento do desempenho cardíaco 6) aumento da hipertrofia do miocárdio compensatória.

EXEMPLO IV

Teste para actividade neurotrófica in vitro

Um teste utilizado para actividade neurotrófica de gânglios ciliares foi realizado como descrito em Leung, Neuron, 8_: 1045-1053 (1992). Em resumo, dissecaram-se gânglios ciliares de embriões de galinha E7-E8 e dissociaram-se em tripsina-EDTA (Gibco 15400-013) diluída dez vezes em solução salina tamponada com fosfato durante 15 minutos a 37°C. Os gânglios foram lavados para remover a tripsina com três lavagens de meio de crescimento (D-MEM com glucose elevada suplementado com soro fetal de bovino a 10%, glutamina 1,5 mM, penicilina 100 yg/ml e estreptomicina 100 yg/ml) e em seguida cuidadosamente triturados em 1 ml de meio de crescimento, numa suspensão de células individuais. Os neurónios foram enriquecidos plaqueando esta mistura celular em 5 ml de meio de crescimento numa placa de cultura de tecido de 100 mm durante 4 horas a 37°C, num incubador de cultura de tecido. Durante este tempo, as células não neuronais aderiram preferencialmente à placa e os neurónios foram cuidadosamente lavados para os remover, no final da incubação.

Os neurónios enriquecidos foram então plaqueados numa placa de 96 poços previamente revestida com colagénio. Em cada poço, plaquearam-se 1000 a 2000 células, num volume final de 100 a 250 μΐ, com diluições do meio condicionado das células 293 transfectadas com pCHF.781 do Exemplo I. As células foram também plaqueadas com o meio condicionado de 293 transfectadas, como um controlo e com um padrão de CNTF, como uma comparação. Após uma incubação de 2-4 dias a 3 7°C, o número de células vivas foi determinado corando as células vivas utilizando o corante vital metalotioneína (MTT). Adicionou-se um quinto do volume de MTT 5 mg/ml (Sigma M2128) 113 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ aos poços. Após uma incubação de 2-4 horas a 37°C, as células vivas (cheias com um precipitado púrpura denso) foram contadas por microscopia de fase com uma ampliação de 100X.

Os resultados do teste são apresentados na Figura 4. Pode ver-se que a transfecção de pCHF.781 (triângulos) aumentou a sobrevivência dos neurónios vivos (medido por contagem de células), uma vez que a fracção do volume de teste do meio condicionado de 293 transfectadas aumentou. Isto é semelhante ao padrão para o padrão de CNTF (círculos) e está em contraste com a transfecção de controlo (quadrados) que não apresentava nenhum aumento na sobrevivência como uma função da fracção aumentada do volume de teste de meio condicionado. Isto indica que o CHF é útil como agente neurotrófico, tendo um efeito semelhante ao observado com o CNTF.

EXEMPLO V

Uma fonte de ARNm que codifica para CHF humano (também conhecido como cardiotrofina-1 humana [CT-1]) foi identificada por pesquisa de ARN poli(A)+ a partir de vários tecidos adultos com uma sonda dos clones de ADNc de CHF de ratinho. 0 coração, músculo-esquelético, cólon, ovário e próstata apresentavam uma banda de 1,8 kb por hibridação de manchas com uma sonda de CHF de ratinho de 180 pb (que se estende desde 19 pb a 5' em relação ao ATG de início até ao aminoácido 50) em formamida a 20%, 5 x SSC a 42°C, com uma lavagem final a 0,25X SSC a 52°C. Os clones que codificam para CT-1 humana foram isolados por pesquisa de uma biblioteca de ADNc de coração humano (Clontech) com a mesma sonda e condições (lavagem final a 55°C).

Isolaram-se onze clones a partir de 1 milhão pesquisados. As inserções de EcoRl de vários clones foram subclonadas em vectores plasmídicos e as suas sequências de ADN determinadas. A sequência de ADN do clone h5 (SEQ ID NOS:6 e 7 para as cadeias de sentido directo e inverso, respectivamente) é apresentada na Figura 5 e inclui toda a região codificante. O clone h5 (pBSSK+. hu. CT1. h5) foi depositado em 26 de Julho de 1994 na American Type Culture Collection com o N° da ATCC 75 841. A sequência de ADN de outro clone, designado por h6, 114 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ corresponde à do clone h5 na região de sobreposição. 0 clone h6 começa na base 47 do clone h5 e estende-se 3' em relação ao clone h5 por mais 521 bases. A sequência de proteína codificada de CT-1 humana (SEQ ID NO: 8) é 79% idêntica à sequência de CHF de ratinho (SEQ ID NO: 3), como é evidente a partir da Figura 6, em que o primeiro é designado por "humctl" e o último é designado por "CHF.781".

Para mostrar que a CT-1 humana codificada pelo clone h5 é biologicamente activa, o fragmento EcoRI foi clonado no vector de expressão de mamífero pRK5 (EP 307247) no sítio EcoRI único, para se obter o plasmídeo pRK5.hu.CTI. Este plasmídeo foi transfectado em células 293 humanas e as células foram mantidas em meio isento de soro durante 3-4 dias. Este meio foi então testado quanto a hipertrofia de miócitos cardíacos, como descrito acima para o CHF de ratinho. O meio condicionado de 293 transfectadas era claramente activo neste teste (pontuação de hipertrofia de 5,5 a uma diluição de 1:20).

Depósito de material 0 plasmídeo seguinte foi depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Plasmídeo N° depósito da ATCC Data de depósito pBSSK+.hu.CTl.h5 75 841 26 de Julho de 1994

Este depósito foi feito segundo as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e seus regulamentos (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC nos termos do tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, o que assegura uma disponibilidade permanente e sem restrições da progénie da cultura do depósito ao público, após concessão da patente US pertinente, ou após disponibilização ao público de qualquer pedido de patente US ou estrangeira, de acordo com o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progénie 115 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ a quem ο U.S. Commissioner of Patents and Trademarks determinar que tem direito, de acordo com a 35USC§122 e regras do Commissioner conformes com esta (incluindo 37 CFR §1.14 com referência particular a 886 OG 638). 0 cessionário do presente pedido concordou que se uma cultura do plasmídeo depositado morrer, ou for perdida, ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, o plasmídeo será prontamente substituído após notificação, com outro do mesmo plasmídeo. A disponibilidade do plasmídeo depositado não deve ser entendida como uma licença para praticar a invenção, em contravenção dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo, em acordo com as suas leis sobre patentes. 0 fascículo escrito acima é considerado suficiente para permitir a um perito na arte praticar a invenção. A presente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pela construção depositada, uma vez que a concretização depositada pretende ser apenas uma ilustração de alguns aspectos da invenção e quaisquer construções que sejam funcionalmente equivalentes estão no âmbito da presente invenção. 0 depósito de material não constitui admissão de que a descrição escrita aqui contida é inadequada para a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser entendida como limitando o âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. De facto, várias modificações da invenção em adição às apresentadas e descritas aqui serão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição anterior e estão no âmbito das reivindicações anexas. 116 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Cardiotrofina e suas Utilizações (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 94080 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete de 5,25 polegadas, 360 Kb

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: patin (Genentech) (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/233609 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 25-Abr-1994 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Hasak, Janet E. (B) NÚMERO DE REGISTO: 28,616

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 894P1PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 415/225-1896 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1352 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 117 117 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

GGATAAGCCT GGGGCCAGCA TGAGCCAGAG GGAGGGAAGT CTGGAAGACC SO ACCAGACTGA CTCCTCAATC TCATTCCTAC CCCATTTGGA GGCCAAGATC 100 CGCCAGACAC ACAACCTTGC CCGCCTCCTG ACCAAATATG CAGAACAACT 150 TCTGGAGGAA TACGTGCAGC AACAGGGAGA GCCCTTTGGG CTGCCGGGCT 200 TCTCACCACC GCGGCTGCCG CTGGCCGGCC TGAGTGGCCC GGCTCCGAGC 250 CATGCAGGGC TACCGGTGTC CGAGCGGCTG CGGCAGGATG CAGCCGCCCT 300 GAGTGTGCTG CCCGCGCTGT TGGATGCCGT CCGCCGCCGC CAGGCGGAGC 350 TGAACCCGCG CGCCCCGCGC CTGCTGCGGA GCCTGGAGGA CGCAGCCCGC 400 CAGGTTCGGG CCCTGGGCGC CGCGGTGGAG ACAGTGCTGG CCGCGCTGGG 450 CGCTGCAGCC CGCGGGCCCG GGCCAGAGCC CGTCACCGTC GCCACCCTCT SOO TCACGGCCAA CAGCACTGCA GGCATCTTCT CAGCCAAGGT GCTGGGGTTC 550 CACGTGTGCG GCCTCTATGG CGAGTGGGTG AGCCGCACAG A3GGCGACCT 600 GGGCCAGCTG GTGCCAGGGG GCGTCGCCTG AGAGTGAATA CTTTTTCTTG 650 TAAGCTCGCT CTGTCTCGCC TCTTTGGCTT CAAATTTTCT GTCTCTCCAT 700 CTGTGTCCTG TGTGTTCTTG GGCTGTCCCT ATCTTTCTGC ATTTGTGTGG 750 TGTCTCTCTT CTGCTCTCCT CTCTGCAGGG AGCTTCTTTT TTCCAACAGT 800 TTCTCGTTTT GTCTCTCTCC AGTCTTGAAC ACTTTTGTCT CCGAGAGGTC 850 TCTTTTTGTT TCCTTGTCTC TTGGTTCTTT CTTTGCTTGC TTGCTTGCTT 900 GCTTGCTTGT TGTTGAGACA GGGTCTCACC ATATAGCTCT GGATGGCCTG 950 GAACTTGCTA TGTAGGCCAG GCTGGCCTCC AGCTCATAGA GATCCACTTG 1000 CCTCCGACTC CCAATTTCCC CATCTGTCTC CCTGTGATCC ATATGGGTAT 1050 118 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ GTGTAACCCT TACTTTGTCT CATGGAGGTG ACAATTTTTC TCCCTTCAGT 1100 TTCTTTGTTC TTTACTGACC AGAAAAGTGC CTACTTGTCC CCTGGTGGCA 1150 AGGCCATTCA CCTTAGGACC TTCCCACCAG TTCCTTTGTA GGCAAATCCC 1200 TCCCCCTTTG AGGTCCTTCC CTTTCATACC GCCCTAGGCT GGTCAATGGA 1250 GAGAGAAAGG CAGAAAAACA TCTTTAAAGA GTTTTATTTG AGAATAAATT 1300 AATTTTTGTA AATAAAATGT TTAACAATAA AACTAAACTT TTATGAAAAA 1350 ΑΑ 1352 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν0:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1352 bases (Β) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: CCTATTCGGA CCCCGGTCGT ACTCGGTCTC CCTCCCTTCA GACCTTCTGG 50 TGGTCTGACT GAGGAGTTAG AGTAAGGATG GGGTAAACCT CCGGTTCTAG 100 GCGGTCTGTG TGTTGGAACG GGCGGAGGAC TGGTTTATAC GTCTTGTTGA 150 AGACCTCCTT ATGCACGTCG TTGTCCCTCT CGGGAAACCC GACGGCCCGA 200 AGAGTGGTGG CGCCGACGGC GACCGGCCGG ACTCACCGGG CCGAGGCTCG 250 GTACGTCCCG ATGGCCACAG GCTCGCCGAC GCCGTCCTAC GTCGGCGGGA 300 CXCACACGAC GGGCGCGACA ACCTACGGCA GGCGGCGGCG GTCCGCCTCG 350 ACTTGGGCGC GCGGGGCGCG GACGACGCCT CGGACCTCCT GCGTCGGGCG 400 GTCCAAGCCC GGGACCCGCG GCGCCACCTC TGTCACGACC GGCGCGACCC 450 119 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ GCGACGTCGG GCGCCCGGGC CCGGTCTCGG GCAGTGGCAG CGGTGGGAGA 500 AGTGCCGGTT GTCGTGACGT CÇGTAGAAGA GTCGGTTCCA CGACCCCAAG 550 GTGCACACGC CGGAGATACC GCTCACCCAC TCGGCGTGTC TCCCGCTGGA 600 CCCGGXCGAC CACGGTCCCC CGCAGCGGAC TCTCACTTAT GAAAAAGAAC 650 ATTCGAGCGA GACAGAGCGG AGAAACCGAA GTTTAAAAGA CAGAGAGGTA 700 GACACAGGAC ACACAAGAAC CCGACAGGGA TAGAAAGACG TAAACACACC 750 AGAGAGAGAA GACGAGAGGA GAGACGTCCC TCGAAGAAAA AAGGTTGTCA 800 AAGAGCAAAA CAGAGAGAGG TCAGAACTTG TGAAAACAGA GGCTCTCCAG 850 AGAAAAACAA AGGAACAGAG AACCAAGAAA GAAACGAACG AACGAACGAA 900 CGAACGAACA ACAACTCTGT CCCAGAGTGG TATATCGAGA CCTACCGGAC 950 CTTGAACGAT ACATCCGGTC CGACCGGAGG TCGAGTATCT CTAGGTGAAC 1000 GGAGGCTGAG GGTTAAAGGG GTAGACAGAG GGACACTAGG TATACCCATA 1050 CACATTGGGA ATGAAACAGA GTACCTCCAC TGTTAAAAAG AGGGAAGTCA 1100 AAGAAACAAG AAATGACTGG TCTTTTCACG GAXGAACAGG GGACCACCGT 1150 TCCGGTAAGT GGAATCCTGG AAGGGTGGTC AAGGAAACAT CCGTTTAGGG 1200 AGGGGGAAAC TCCAGGAAGG GAAAGTATGG CGGGATCCGA CCAGTTACCT 1250 CTCTCTTTCC GTCTTTTTGT AGAAATTTCT CAAAATAAAC TCTTATTTAA 1300 TTAAAAACAT TTATTTTACA AATTGTTATT TTGATTTGAA AATACTTTTT 1350 ΤΤ 1352 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 203 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 120 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Met Ser Gin Arg Glu Gly Ser Leu Glu Asp His Gin Thr Asp Ser 1 5 10 15 Ser Ile Ser Phe Leu Pro His Leu Glu Ala Lys Ile Arg Gin Thr 20 25 30 His Asn Leu Ala Arg Leu Leu Thr Lys Tyr Ala Glu Gin Leu Leu 35 40 45 Glu Glu Tyr Vai Gin Gin Gin Gly Glu Pro Phe Gly Leu Pro Gly 50 55 60 Phe Ser Pro Pro Arg Leu Pro Leu Ala Gly Leu Ser Gly Pro Ala 65 70 75 Pro Ser His Ala Gly Leu Pro Vai Ser Glu Arg Leu Arg Gin Asp Θ0 85 90 Ala Ala Ala Leu Ser Vai Leu Pro Ala Leu Leu Asp Ala Vai Arg 95 100 105 Arg Arg Gin Ala Glu Leu Asn Pro Arg Ala Pro Arg Leu Leu Arg 110 115 120 Ser Leu Glu Asp Ala Ala Arg Gin Vai Arg Ala Leu Gly Ala Ala 125 130 135 Vai Glu Thr Vai Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Arg Gly Pro 140 145 150 Gly Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ala Thr Leu Phe Thr Ala Asn Ser 155 160 165 Thr Ala Gly Ile Phe Ser Ala Lys Vai Leu Gly Phe His Vai Cys 170 175 180 Gly Leu Tyr Gly Glu Trp Vai Ser Arg Thr Glu Gly Asp Leu Gly 185 190 195 Gin Leu Vai Pro Gly Gly Vai Ala 200 203 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 200 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 121 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 1 5 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp 20 25 30 Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Vai Lys His Gin Gly Leu Asn 35 40 45 Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Vai Ala Ser 50 55 60 Thr Asp Gin Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gin Glu 65 70 75 Asn Leu Gin Ala Tyr Arg Thr Phe His Vai Leu Leu Ala Arg Leu SO 85 90 Leu Glu Asp Gin Gin Vai His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe 95 100 105 Hls Gin Ala Ile Hls Thr Leu Leu Leu Gin Vai Ala Ala Phe Ala 110 115 120 Tyr Gin Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro 125 130 135 Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Vai Gly Asp Gly Gly 140 145 150 Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Vai Leu Gin Glu Leu· 155 160 165 Ser Gin Trp Thr Vai Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser 170 175 1B0 Ser His Gin Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr V Ile Ala 185 - 190 195 Asn Asn Lys Lys Met 200 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: 50

GCGGCCGCGA GCTCGAATTC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 122 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1018 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: GTGAAGGGAG CCGGGATCAG CCAGGGOCCA GCATGAGCCG GAGGGAGGGA 50 AGTCTGGAAG ACCCCCAGAC TGATTCCTCA GTCTCACTTC TTCCCCACTT 100 GGAGGCCAAG ATCCGTCAGA CACACAGCCT TGCGCACCTC CTCACCAAAT 150 ACGCTGAGCA GCTGCTCCAG GAATATGTGC AGCTCCAGGG AGACCCCTTC 200 GGGCTGCCCA GCTTCTCGCC GCCGCGGCTG CCGGTGGCCG GCCTGAGCGC 250 CCCGGCTCCG AGCCACGCGG GGCTGCCAGT GCACGAGCGG CTGCGGCTGG 300 ACGCGGCGGC GCTGGCCGCG CTGCCCCCGC TGCTGGACGC AGTGTGTCGC 350 CGCCAGGCCG AGCTGAACCC GCGCGCGCCG CGCCTGCTGC GCCGCCTGGA 400 GGACGCGGCG CGCCAGGCCC GGGCCCTGGG CGCCGCCGTG GAGGCCTTGC 450 TGGCCGCGCT GGGCGCCGCC AACCGCGGGC CCCGGGCCGA GCCCCCCGCC 500 GCCACCGCCT CAGCCGCCTC CGCCACCGGG GTCTTCCCCG CCAAGGTGCT 550 GGGGCTCCGC GTTTGCGGCC TCTACCGCGA GTGGCTGAGC CGCACCGAGG 600 GCGACCTGGG CCAGCTGCTG CCCGGGGGCT CGGCCTGAGC GCCGCGGGGC 650 AGCTCGCCCC GCCTCCTCCC GCTGGGTTCC GTCTCTCCTT CCGCTTCTTT 700 GTCTTTCTCT GCCGCTGTCG GTGTCTGTCT GTCTGCTCTT AGCTGTCTCC 750 ATTGCCTCGG CCTTCTTTGC TTTTTGTGGG GGAGAGGGGA GGGGACGGGC 800 123 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ AGGGTCTCTG TCGCCCAGGC TGGGGTGCAG TGGCGCGATC CCAGCACTGC 850 AGCCTCAACC TCCTGGGCTC AAGCCATCCT TCCGCCTCAG CTTCCCCAGC 900 AGCTGGGACT ACAGGCACGC GCCACCACAG CCGGCTAATT ΤΤΤΤΑΤΤΤΑΑ 950 TTTTTTGTAG AGACGAGGTT TCGCCATGTT GCCCAGGCTG GTCTTGAACT 1000 CCGGGGCTCA AGCGATCC 1018 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1018 bases (Β) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: CACTTCCCTC GGCCCTAGTC GGTCCCCGGT CGTACTCGGC CTCCCTCCCT 50 TCAGACCTTC TGGGGGTCTG ACTAAGGAGT CAGAGTGAAG AAGGGGTGAA 100 CCTCCGGTTC TAGGCAGTCT GTGTGTCGGA ACGCGTGGAG GAGTGGTTTA 150 TGCGACTCGT CGACGAGGTC CTTATACACG TCGAGGTCCC TCTGGGGAAG 200 CCCGACGGGT CGAAGAGCGG CGGCGCCGAC GGCCACCGGC CGGACTCGCG 250 GGGCCGAGGC TCGGTGCGCC CCGACGGTCA CGTGCTCGCC GACGCCGACC 300 TGCGCCGCCG CGACCGGCGC GACGGGGGCG ACGACCTGCG TCACACAGCG 350 GCGGTCCGGC TCGACTTGGG CGCGCGCGGC GCGGACGACG CGGCGGACCT 400 CCTGCGCCGC GCGGTCCGGG CCCGGGACCC GCGGCGGCAC CTCCGGAACG 450 ACCGGCGCGA CCCGCGGCGG TTGGCGCCCG GGGCCCGGCT CGGGGGGCGG 500 CGGTGGCGGA GTCGGCGGAG GCGGTGGCCC CAGAAGGGGC GGTTCCACGA 550 124 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ CCCCGAGGCG CAAACGCCGG AGATGGCGCT CACCGACTCG GCGTGGCTCC 600 CGCTGGACCC GGTCGACGAC GGGCCCCCGA GCCGGACTCG CGGCGCCCCG 650 TCGAGCGGGG CGGAGGAGGG CGACCCAAGG CAGAGAGGAA GGCGAAGAAA 700 CAGAAAGAGA CGGCGACAGC CACAGACAGA CAGACGAGAA TCGACAGAGG 750 TAACGGAGCC GGAAGAAACG AAAAACACCC CCTCTCCCCT CCCCTGCCCG 800 TCCCAGAGAC AGCGGGTCCG ACCCCACGTC ACCGCGCTAG GGTCGTGACG 850 TCGGAGTTGG AGGACCCGAG TTCGGTAGGA AGGCGGAGTC GAAGGGGTCG 900 TCGACCCTGA TGTCCGTGCG CGGTGGTGTC GGCCGATTAA ΑΑΑΑΤΑΑΑΤΤ 950 AAAAAACATC TCTGCTCCAA AGCGGTACAA CGGGTCCGAC CAGAACTTGA 1000 GGCCCCGAGT TCGCTAGG 1018 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 201 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

Met Ser Arg Arg Glu Gly Ser Leu Glu Asp Pro Gin Thr Asp Ser 1 5 10 15 ser Vai Ser Leu Leu Pro His Leu Glu Ala Lys Ile Arg Gin Thr 20 25 30 His Ser Leu Ala His Leu Leu Thr Lys Tyr Ala Glu Gin Leu Leu 35 40 45 Gin Glu Tyr Vai Gin Leu Gin Gly Asp Pro Phe Gly Leu Pro Ser 50 55 60 Phe Ser Pro Pro Arg Leu Pro Vai Ala Gly Leu Ser Ala Pro Ala 65 70 75 Pro Ser His Ala Gly Leu Pro Vai His Glu Arg Leu Arg Leu Asp 80 85 90 125 ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ

Ala Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Pro Leu Leu Asp Ala Vai Cys 95 100 105 Arg Arg Gin Ala Glu Leu Asn Pro Arg Ala Pro Arg Leu Leu Arg 110 115 120 Arg Leu Glu Asp Ala Ala Arg Gin Ala Arg Ala Leu Gly Ala Ala 125 130 135 Vai Glu Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Asn Arg Gly Pro 140 145 150 Arg Ala Glu Pro Pro Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ser Ala Thr 155 160 165 Gly Vai Phe Pro Ala Lys Vai Leu Gly Leu Arg Vai Cys Gly Leu 170 175 180 Tyr Arg Glu Trp Leu Ser Arg Thr Glu Gly Asp Leu Gly Gin Leu 185 190 195 Leu Pro Gly Gly Ser Ala 200 201

Lisboa,

Claims (27)

1. ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido factor de hipertrofia cardíaca (CHF) isolado, excluindo o de rato, que partilha pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência traduzida apresentada na Figura 1 e exibe uma actividade biológica de actividade hipertrófica, inotrópica, anti-arrítmica ou neurotrófica de um polipéptido CHF nativo.
2. 2. Polipéptido CHF de acordo com a reivindicação 1, que tem a sequência traduzida apresentada na Figura 1.
3. 3. Polipéptido CHF de acordo com a reivindicação 1 que é CHF humano maduro tendo a sequência traduzida apresentada na Figura 5.
4. 4. Anticorpo isolado que é capaz de se ligar ao polipéptido CHF de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.
5. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, compreendendo um anticorpo monoclonal, quimérico, humanizado ou biespecífico, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.
6. 6. Linha celular de hibridoma que produz o anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5.
7. 7. Método para detectar CHF compreendendo contactar o anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5 com uma amostra ou célula que se suspeita que contém CHF e detectar se ocorreu ligação.
8. 8. Método para purificar moléculas de CHF compreendendo contactar uma fonte de CHF contendo as moléculas de CHF a purificar com o anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5 imobilizado num suporte, sob condições em que as moléculas de CHF a purificar são selectivamente adsorvidas ao anticorpo imobilizado, lavar o suporte para remover o material não adsorvido e eluir com um tampão de eluição as moléculas a purificar do anticorpo ao qual estão adsorvidas. ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ 2/4
9. 9. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica para CHF de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3.
10. 10. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9, compreendendo a sequência de ácido nucleico de enquadramento de leitura aberto apresentada na Figura 1.
11. 11. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9, compreendendo a sequência de ácido nucleico de enquadramento de leitura aberto apresentada na Figura 5.
12. 12. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9 que compreende ainda um promotor ligado operativamente à molécula de ácido nucleico.
13. 13. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9 que é ADN e compreende a sequência de ADN traduzida apresentada na Figura 1. de acordo a sequência com a de ADN
14. 14. Molécula de ácido nucleico reivindicação 9 que é ADN e compreende traduzida apresentada na Figura 5.
15. 15. Molécula de ácido reivindicação 9 que é marcada. nucleico de acordo com
16. 16. Vector com prendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9.
17. 17. Vector de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9, ligada operativamente a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector.
18. 18. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9.
19. 19. Método para utilizar uma molécula de ácido nucleico que codifica para CHF, para realizar a produção de CHF, compreendendo cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18. ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ 3/4
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o CHF é recuperado da célula hospedeira.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o CHF é recuperado do meio de cultura da célula hospedeira.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a célula hospedeira é transfectada com um vector de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico de CHF.
23. 23. Método para determinar a presença de uma molécula de ácido nucleico de CHF numa amostra de teste, compreendendo hibridar a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9 com um ácido nucleico de uma amostra de teste e determinar a presença de ácido nucleico de CHF.
24. 24. Método para amplificar uma amostra de teste de ácido nucleico compreendendo iniciar uma reacção em cadeia com polimerase de ácido nucleico na amostra de teste com a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9.
25. 25. Método para testar uma amostra de teste quanto a actividade hipertrófica, compreendendo: (a) plaquear placas de 96 poços com uma suspensão de miócitos a uma densidade celular de cerca de 7,5 x 104 células por ml em meio D-MEM/F-12 compreendendo insulina, transferrina e aprotinina; (b) cultivar as células; (c) adicionar a amostra de teste às células cultivadas; (d) cultivar as células com a amostra de teste; e (e) medir quanto a hipertrofia
26. 26. Utilização de um polipéptido CHF de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 no fabrico de um medicamento para tratar um distúrbio neurológico, insuficiência cardiaca ou um distúrbio arritmico ou inotrópico.
27. 27. Utilização de acordo com a reivindicação 26, em que o medicamento se destina a administração com um inibidor de ACE, com outro factor miocardiotrófico, anti-arritmico ou ΕΡ Ο 755 446 /ΡΤ 4/4 inotrópico, ou com uma molécula neurotrófica, para tratamento do distúrbio. Lisboa,