KR20130137688A - 베타7 인테그린 길항제를 투여하는 방법 - Google Patents

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샤론 오'바이른
에릭 스테파니치
메이나 탕
제니퍼 비시츠
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제넨테크, 인크.
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Abstract

위장 염증성 장애, 예컨대 궤양성 결장염 및 크론병을 비롯한 염증성 장 질환의 치료 방법이 제공된다. 또한, 인테그린 베타7 길항제, 예컨대 항-베타7 항체를 투여하는 방법이 제공된다. 또한, 피하 투여 및 자가-주사 장치를 사용하는 투여를 포함하는 투여 요법을 비롯한 특정한 투여 요법이 제공된다.

Description

베타7 인테그린 길항제를 투여하는 방법 {METHODS OF ADMINISTERING BETA7 INTEGRIN ANTAGONISTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2011년 3월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 61/470,360 및 2011년 10월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 61/550,216을 우선권 주장하며, 이들 둘 다는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2012년 3월 15일에 작성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 P4622R1WO_SequenceListing.txt이고, 그의 크기는 17,964 바이트이다.
분야
위장 염증성 장애, 예컨대 궤양성 결장염 및 크론병을 비롯한 염증성 장 질환의 치료 방법이 제공된다. 또한, 인테그린 베타7 길항제, 예컨대 항-베타7 항체를 투여하는 방법이 제공된다. 또한, 피하 투여 및 자가-주사 장치를 사용하는 투여를 포함하는 투여 요법을 비롯한 특정한 투여 요법이 제공된다.
염증성 장 질환 (IBD)은 위장 (GI) 관의 만성 염증성 자가면역 상태이고, 이는 임상적으로 궤양성 결장염 (UC) 또는 크론병 (CD)으로서 나타난다. CD는 전체 GI관의 임의의 부분에 영향을 미치는 잠재력을 갖는 만성 경벽성 염증성 질환이고, UC는 결장의 점막 염증이다. 상태는 둘 다 임상적으로 일상의 활동에서의 곤란과 함께 빈번한 장 운동, 영양실조 및 탈수를 특징으로 한다. CD는 빈번하게 흡수장애, 협착 및 누공의 발병에 의해 합병되고, 반복적인 수술을 요구할 수 있다. UC는 덜 빈번하게 중증 혈성 설사 및 독성 거대결장증에 의해 합병될 수 있고, 또한 수술을 요구할 수 있다. IBD 상태는 둘 다 GI관의 악성종양에 대한 증가된 위험과 연관된다. IBD의 병인은 복합적이며, 발병기전의 다수의 측면은 명백하지 않은 채로 남아 있다.
코르티코스테로이드를 사용하는 통상의 요법 및 면역조절제 요법 (예를 들어, 아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트)이 부작용 및 불내성과 연관되고, 유지 요법 (스테로이드)에서의 증명된 이익을 보여주지 않았기 때문에, 중등도 내지 중증 IBD의 치료는 치료하는 의사에게 중요한 도전을 제시한다. 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)를 표적화하는 모노클로날 항체, 예컨대 인플릭시맙 (키메라 항체) 및 아달리무맙 (완전 인간 항체)은 현재 CD의 관리에 사용된다. 인플릭시맙은 또한 UC에서 효능을 보여주었고, 사용에 대해 승인받았다. 그러나, CD를 앓는 환자의 대략 10%-20%는 항 TNF 요법에 대한 1차 무반응자이고, CD 환자의 또 다른 ~20%-30%는 시간이 지남에 따라 반응을 상실한다 (문헌 [Schnitzler et al., Gut 58:492-500 (2009)]). 항 TNF와 연관된 다른 유해 사례 (AE)는 결핵을 비롯한 박테리아 감염의 상승된 비율, 및 보다 드물게는 림프종 및 탈수초화를 포함한다 (문헌 [Chang et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220 (2006); Hoentjen et al., World J. Gastroenterol. 15(17):2067 (2009)]). 어떠한 현재 이용가능한 요법도 만성 질환을 앓는 IBD 환자의 20%-30% 초과에서 지속적인 완화를 달성하지 않는다 (문헌 [Hanauer et al., Lancet 359:1541-49 (2002); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)]). 또한, 대부분의 환자는 지속적인 무스테로이드 완화 및 점막 치유, 진정한 질환 변경과 관련된 임상 결과를 달성하지 않는다. 따라서, 만성 사용에 대해 최적화된, IBD에서의 보다 표적화된 요법: 항 TNF 치료제에 전혀 반응하지 않거나 또는 시간이 지남에 따라 반응을 상실하는 환자를 비롯한 환자의 보다 큰 비율에서의 지속적인 완화, 특히 무스테로이드 완화 및 장기 합병증의 예방을 갖는 개선된 안전성 프로파일을 개발할 필요가 있다.
인테그린은 백혈구 부착, 신호전달, 증식 및 이동을 비롯한 다수의 세포 과정, 뿐만 아니라 유전자 조절에서 역할을 하는 알파/베타 이종이량체 세포 표면 당단백질 수용체이다 (문헌 [Hynes, R. O., Cell, 1992, 69:11-25; 및 Hemler, M. E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368]). 이들은 내피, 상피 및 세포외 매트릭스 단백질 상의 특징적인 세포 부착 분자 (CAM)에 특이적으로 결합하는 2개의 이종이량체, 비-공유적으로 상호작용하는 α 및 β 막횡단 서브유닛으로 구성된다. 이 방식으로, 인테그린은 고도로 조절된 방식으로 혈액으로부터 거의 모든 조직 부위로의 동원을 보조하여 정상 조직 및 염증 부위로의 백혈구의 귀소에서 역할을 하는 조직-특이적 세포 부착 수용체로서 기능할 수 있다 (문헌 [von Andrian et al., N Engl J Med 343:1020-34 (2000)]). 면역계에서, 인테그린은 염증 과정 동안 백혈구 트래픽킹, 부착 및 침윤에 관여한다 (문헌 [Nakajima, H. et al., J. Exp. Med., 1994, 179:1145-1154]). 인테그린의 차등 발현은 세포의 부착 특성을 조절하고, 상이한 인테그린은 상이한 염증 반응에 관여한다 (문헌 [Butcher, E. C. et al., Science, 1996, 272:60-66]). 베타7 함유 인테그린 (즉, 알파4베타7 및 알파E베타7)은 주로 단핵구, 림프구, 호산구, 호염기구 및 대식세포 상에서 발현되지만, 호중구 상에서는 발현되지 않는다 (문헌 [Elices, M. J. et al., Cell, 1990, 60:577-584]).
α4β7 인테그린은 장 점막 및 연관된 림프성 조직, 예컨대 소장에서의 파이어스 패치, 대장에서의 림프성 여포, 및 장간막 림프절로의 세포의 이동에 중요한 백혈구-귀소 수용체이다. 소화관에서, 점막 내피에 대한 백혈구 회전 및 정지 부착은 케모카인으로부터의 신호에 의해 개시되고, 점막 어드레신 세포 부착 분자 (MAdCAM)-1-연관된 시알릴 루이스 X를 통해 매개된다. 케모카인 신호전달은 α4β7 인테그린을 낮은 MAdCAM-1 결합 친화도에서 높은 MAdCAM-1 결합 친화도로의 변화를 겪도록 유도한다. 이어서, 백혈구는 혈관 내피를 통한 기저 조직으로의 혈관외유출의 과정을 저지하고 시작한다. 이 혈관외유출 과정은 정상 면역 세포 재순환 상태 및 염증성 상태 둘 다에서 발생하는 것으로 여겨진다 (상기 문헌 [von Andrian et al.]). 침윤물 중 α4β7+ 세포의 개수 및 리간드 MAdCAM-1의 발현은 만성 염증의 부위에서, 예컨대 UC 또는 CD를 앓는 환자의 장관에서 보다 높다 (문헌 [Briskin et al., Am J Pathol 151:97-110 (1997); Souza et al., Gut 45:856-63 (1999)]). α4β7은 MAdCAM-1 및 혈관 세포 부착 분자 (VCAM)-1을 발현하는 고내피 세정맥에 우선적으로 결합하고, 뿐만 아니라 세포외 매트릭스 분자 피브로넥틴 단편 CS-1에 결합한다 (문헌 [Chan et al., J Biol Chem 267:8366-70 (1992); Ruegg et al., J Cell Biol 17:179-89 (1992); Berlin et al., Cell 74:185-95 (1993)]). 소화관 점막 혈관에서 구성적으로 발현되는 MAdCAM-1과 함께, α4β7 인테그린은 백혈구 소화관 향성에서 선택적 역할을 하지만, 말초 조직 또는 CNS로의 백혈구의 귀소에 기여하는 것으로 보이지는 않는다. 대신에, 말초 림프성 트래픽킹은 VCAM-1과의 α4β1 상호작용과 연관되었다 (문헌 [Yednock et al., Nature 356:63-6 (1992); Rice et al., Neurology 64:1336-42 (2005)]).
T 림프구 상에서 독점적으로 발현되고 점막 조직과 연관되는 β7 인테그린 패밀리의 또 다른 구성원은 αEβ7 인테그린이고, 이는 달리 CD103으로 공지되어 있다. αEβ7 인테그린은 상피 세포 상의 E-카드헤린에 선택적으로 결합하고, 상피내 림프구 구획 내 점막 조직에서의 T 세포의 체류에서 역할을 하는 것으로 제안되었다 (문헌 [Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993); Karecla et al. Eur J Immunol 25:852-6 (1995)]). 고유판에서의 αEβ7+ 세포는 스트레스를 받거나 감염된 상피 세포에 대해 세포독성을 나타내는 것으로 보고되었다 (문헌 [Hadley et al., J Immunol 159:3748-56 (1997); Buri et al., J Pathol 206:178-85 (2005)]). αEβ7의 발현은 CD에서 증가되고 (문헌 [Elewaut et al., Acta Gastroenterol Belg 61:288-94 (1998); Oshitani et al., Int J Mol Med 12:715-9 (2003)]), 항-αEβ7 항체 치료는 마우스에서 실험적 결장염을 감쇠시키는 것으로 보고되었고, 이는 IBD의 실험 모델에서의 αEβ7+ 림프구에 대한 역할을 시사한다 (문헌 [Ludviksson et al., J Immunol 162:4975-82 (1999)]).
알파E베타7에 대한 모노클로날 항체의 투여는 보고에 따르면 IL-2 -/- 마우스에서 면역화 유발 결장염을 예방 및 개선하며, 이는 염증성 장 질환의 발병 및 유지가 알파E베타7을 발현하는 고유판 CD4+ 림프구의 결장 국재화에 의존한다는 것을 시사한다 (문헌 [Ludviksson et al., J Immunol. 1999, 162(8):4975-82]). 항-α4 항체 (나탈리주맙)는 보고에 따르면 CD를 앓는 환자의 치료에서 효능을 가지며 (문헌 [Sandborn et al., N Engl J Med 2005;353:1912-25]), 항-α4β7 항체 (MLN-02, MLN0002, 베돌리주맙)는 보고에 따르면 UC를 앓는 환자에서 효과적이다 (문헌 [Feagan et al., N Engl J Med 2005;352:2499-507]). 이들 발견은 치료 표적으로서의 α4β7을 검증하고, α4β7과 MAdCAM-1 사이의 상호작용이 IBD의 발병기전을 매개한다는 발상을 뒷받침한다. 따라서, 베타7 인테그린의 길항제는 IBD를 치료함에 있어 치료제로서 큰 잠재력을 갖는다.
β7 인테그린 서브유닛에 대해 표적화된 인간화 모노클로날 항체가 이전에 기재되었다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2006/026759를 참조한다. 하나의 이러한 항체, rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)은 래트 항-마우스/인간 모노클로날 항체 FIB504로부터 유래된다 (문헌 [Andrew et al. 1994]). 이것은 인간 IgG1-중쇄 및 κ1-경쇄 프레임워크를 포함하도록 조작되었다. 국제 특허 공개 번호 WO2006/026759.
rhuMAb 베타7은 α4β7 (문헌 [Holzmann et al., Cell 56:37-46 (1989); Hu et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:8254-8 (1992)]) 및 αEβ7 (문헌 [Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993)])에 결합하고, 이는 장 점막에서 각각 림프구 하위세트의 트래픽킹 및 체류를 조절한다. 임상 연구는 CD의 치료에 대한 항 α4 항체 (나탈리주맙)의 효능을 입증하였고 (문헌 [Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)]), UC의 치료에서의 항 α4β7 항체 (LDP02/MLN02/MLN0002/베돌리주맙)에 대한 고무적인 결과가 보고되었다 (문헌 [Feagan et al., N Engl J Med 352:2499-507 (2005)]). 이들 발견은 잠재적 치료 표적으로서의 α4β7을 검증하는 것을 돕고, α4β7과 점막 어드레신 세포 부착 분자 1 (MAdCAM 1) 사이의 상호작용이 염증성 장 질환 (IBD)의 발병기전에 기여한다는 가설을 뒷받침한다.
α4에 결합하고 따라서 α4β1 및 α4β7 둘 다에 결합하는 나탈리주맙과 달리, rhuMAb 베타7은 α4β7 및 αEβ7의 β7 서브유닛에 특이적으로 결합하고, α4 또는 β1 인테그린 개별 서브유닛에 결합하지 않는다. 이는 항체가 100 nM만큼 높은 농도에서도 혈관 세포 부착 분자 1 (VCAM 1)에 대한 α4β1+α4β7- 라모스 세포의 부착을 억제하는 능력이 없는 것에 의해 입증되었다. 중요하게, rhuMAb 베타7의 이 특성은 선택성을 나타낸다: α4β1을 발현하지만 β7은 발현하지 않는 T 세포 하위세트는 rhuMAb 베타7에 의해 직접적으로 영향을 받지 않아야 한다.
백혈구 귀소에 대한 rhuMAb 베타7의 소화관-특이적 효과에 대한 뒷받침은 여러 생체내 비임상 연구로부터 비롯된다. CD45RB고CD4+ T 세포로 재구성된 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스 (결장염의 동물 모델)에서, rhuMAb 베타7은 염증성 결장으로의 방사성표지된 림프구 귀소를 차단하였지만 말초 림프성 기관인 비장으로의 귀소는 차단하지 않았다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2006/026759를 참조한다. 또한, 래트-마우스 키메라 항-뮤린 β7 (항 β7, muFIB504)은 다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌염 (EAE)을 앓는 미엘린 염기성 단백질 T 세포 수용체 (MBP-TCR) 트랜스제닉 마우스에서 조직학적 중추 신경계 (CNS) 염증 정도를 감소시키거나 또는 질환 생존을 개선할 수 없었다. 상기 동일 문헌. 추가로, 시노몰구스 원숭이에서의 두 안전성 연구에서, rhuMAb 베타7은 대체로 인간에서의 소화관-귀소 기억/이펙터 T 세포와 표현형적으로 유사한 하위세트인 CD45RA-β7고 말초 혈액 T 세포에서의 현저한 (대략 3- 내지 6배) 증가로 인한 말초 혈액 림프구 개수에서의 중간 정도의 증가를 유도하였다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Accepted Article, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x]을 참조한다. 대조적으로, rhuMAb 베타7은 인간에서의 미접촉 T 세포와 표현형적으로 유사한 하위세트인 CD45RA+β7 중간 말초 혈액 T 세포의 개수에 대해 최소한의 효과를 갖거나 효과를 전혀 갖지 않았고, 인간에서의 말초 귀소 기억/이펙터 T 세포와 표현형적으로 유사한 하위세트인 CD45RA-β7저 말초 혈액 T 세포의 개수에 대해 효과를 전혀 갖지 않았으며, 이는 소화관 귀소 림프구 하위집단에 대한 rhuMAb 베타7의 특이성을 확인시킨다. 국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Accepted Article, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x].
임상 연구가 CD의 치료에 대한 항-α4 항체 (나탈리주맙)의 효능을 입증하였고 (문헌 [Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)]), UC의 치료에서의 항-α4β7 항체 (LDP02/MLN02/MLN0002/베돌리주맙)에 대한 고무적인 결과가 보고된 반면에, 이들 장애의 치료에서의 추가적인 개선에 대한 필요가 남아 있다. 예를 들어, 나탈리주맙 치료는 나탈리주맙 및 면역억제제를 사용하는 병용 치료를 받은 크론병 (및 개별적으로, 다발성 경화증)을 앓는 환자에서의 진행성 다초점성 백질뇌병증 (PML)의 확인된 사례와 연관되었다. PML은 뇌에서의 폴리오마바이러스 (JC 바이러스)의 재활성화 및 활성 바이러스 복제와 연관된 잠재적으로 치명적인 신경계 상태이다. 이것이 발병하면, 어떠한 공지된 개입도 PML을 확실히 예방하거나 또는 PML을 충분히 치료할 수 없다. 베돌리주맙 치료의 1가지 제한은 이것이 정맥내로 투여되며, 이는 환자에게 불편할 수 있고, 또한 바람직하지 않거나 또는 유해한 사례, 예를 들어 주입 부위 반응과 연관될 수 있다는 것이다. 따라서, 위장 염증성 장애, 예컨대 IBD, 예를 들어 궤양성 결장염 및 크론병의 치료에 대한 개선된 치료 접근법, 뿐만 아니라 보다 바람직한 투여 요법이 필요하다.
본원에 기재된 본 발명은 상기 기재된 필요 중 일부를 충족시키며, 다른 이익을 제공한다.
특허 출원 및 공개를 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 임의의 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 방법은, 적어도 부분적으로, 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제, 예컨대 항-베타7 항체, 예컨대 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이 피하로 뿐만 아니라 정맥내로 투여될 수 있다는 발견에 기반한다.
따라서, 한 측면에서, 포유동물 대상체에게 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 위장 염증성 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 포유동물 대상체는 환자이다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 피하로 투여된다. 한 측면에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 모노클로날 항-베타7 항체이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 항-베타7 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며, 여기서
(i) HVR-L1은 아미노산 서열 A1-A11을 포함하고, 여기서 A1-A11은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9), 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체 (서열 26)이고, 여기서 아미노산 A2는 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3은 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A4는 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5는 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6은 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7은 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8은 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9는 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A10은 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11은 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(ii) HVR-L2는 아미노산 서열 B1-B8을 포함하고, 여기서 B1-B8은 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 20) 또는 XaaYASQSIS (서열 21, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄), 또는 서열 2, 20 또는 21의 변이체 (서열 27)이고, 여기서 아미노산 B1은 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 Xaa (여기서, Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4는 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6은 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7은 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(iii) HVR-L3은 아미노산 서열 C1-C9를 포함하고, 여기서 C1-C9는 QQGNSLPNT (서열 3), 또는 서열 3의 변이체 (서열 28)이고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(iv) HVR-H1은 아미노산 서열 D1-D10을 포함하고, 여기서 D1-D10은 GFFITNNYWG (서열 4)이고;
(v) HVR-H2는 아미노산 서열 E1-E17을 포함하고, 여기서 E1-E17은 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5), 또는 서열 5의 변이체 (서열 29)이고, 여기서 아미노산 E2는 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E10은 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12는 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13은 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(vi) HVR-H3은 아미노산 서열 F2-F11을 포함하고, 여기서 F2-F11은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 19)이거나; 또는 아미노산 서열 F1-F11을 포함하고, 여기서 F1-F11은 AMTGSSGYFDF (서열 16), ARTGSSGYFDF (서열 17), 또는 AQTGSSGYFDF (서열 18), 또는 서열 6, 16, 17, 18 또는 19의 변이체 (서열 30)이고, 여기서 아미노산 F2는 R, M, A, E, G, Q, S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 F11은 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 이러한 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1-H3) 서열 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1-L3) 서열을 포함하며, 여기서
(i) HVR-L1은 서열 7, 서열 8 또는 서열 9를 포함하고;
(ii) HVR-L2는 서열 2를 포함하고;
(iii) HVR-L3은 서열 3을 포함하고;
(iv) HVR-H1은 서열 4를 포함하고;
(v) HVR-H2는 서열 5를 포함하고;
(vi) HVR-H3은 서열 6 또는 서열 16 또는 서열 17 또는 서열 19를 포함한다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 항-베타7 항체를 중량-기반 용량으로 피하로 투여하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 0.5 mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 1.5 mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3.0 mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 4.0 mg/kg의 용량으로 투여된다. 한 측면에서, 항-베타7 항체는 시간이 지남에 따라 일정한 간격으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 4주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 6주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 8주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 2개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 6개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 12개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 18개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 24개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 대상체의 평생 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 항-베타7 항체를 균일 용량으로 피하로 투여하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 50 mg 내지 450 mg의 균일 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 균일 용량은 50 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 100 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 150 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 200 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 균일 용량은 350 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 400 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 420 mg이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 균일 용량은 450 mg이다. 한 측면에서, 항-베타7 항체는 시간이 지남에 따라 일정한 간격으로 투여된다. 특정의 이러한 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 4주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 6주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 매 8주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 2개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 6개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 12개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 18개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 24개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 대상체의 평생 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 항-베타7 항체를 균일 용량으로 투여하며, 여기서 투여는 제1 부하 용량의 투여 및 1회 이상의 후속 유지 용량의 투여를 포함하고, 여기서 각각의 부하 용량 및 1회 이상의 유지 용량은 균일 용량으로 투여되는 것인 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체의 부하 용량은 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체의 부하 용량은 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체의 1회 이상의 후속 유지 용량은 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체의 1회 이상의 후속 유지 용량은 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 각각의 부하 용량 및 1회 이상의 후속 유지 용량은 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 각각의 부하 용량 및 1회 이상의 후속 유지 용량은 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 정맥내로 투여되고, 각각의 1회 이상의 후속 유지 용량은 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg 내지 450 mg이고, 유지 용량은 50 mg 내지 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 항-베타7 항체를 부하 용량에 이어서 1회 이상의 유지 용량으로 피하로 투여하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량과 동일한 날에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 1일 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 1주 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 2주 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 4주 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량은 매 2주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량은 매 4주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량은 매 8주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 2주 후에 투여되고, 제2 유지 용량은 제1 유지 용량의 2주 후에 투여되고, 각각의 후속 유지 용량은 매 4주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 2개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 6개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 12개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 18개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 24개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 대상체의 평생 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 인테그린 베타7 길항제를 포함하는 제조품이 제공된다. 특정 실시양태에서, 제조품은 2 mL (150 mg) 인테그린 베타7 길항제를 포함하는 사전충전 시린지 또는 자동주사기 장치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제조품은 1 mL (180 mg) 인테그린 베타7 길항제를 포함하는 사전충전 시린지 또는 자동주사기 장치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 항-베타7 항체 또는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제를 하나 이상의 추가의 화합물과 함께 피하로 투여하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 화합물은 5-아미노살리실산 (5-ASA), 아자티오프린 (AZA), 6-메르캅토퓨린 (6-MP) 및 메토트렉세이트로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 대상체 또는 환자가 이전에 하나 이상의 생물학적 작용제에 실패한 경우에 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제를 피하로 투여하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 작용제는 아달리무맙, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 골리무맙, 세르톨리주맙 페골, 나탈리주맙 및 베돌리주맙으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 항-베타7 항체 또는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 인테그린 베타7 길항제를 자가-주사 장치로 피하로 투여하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 자가-주사 장치는 사전충전 시린지, 미세바늘 장치, 자동주사기 장치 및 무바늘 주사 장치로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 항-베타7 항체 또는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
또 다른 측면에서, 궤양성 결장염 환자에서 완화를 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 제시된 임의의 용량 또는 투여 요법에 따라 항-베타7 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다. 특정 실시양태에서, 환자에서의 완화는 절대적 메이요 클리닉(Mayo Clinic) 점수가 2 이하이고 개별 하위점수가 1 초과가 아닌 경우에 유도된 것으로 결정되며, 이는 또한 임상적 완화로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 환자에서의 완화는 항-베타7 항체를 사용하는 치료의 개시 후 적어도 제10주까지 유도된다. 특정 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 항-베타7 항체를 투여받은 환자는 유도로부터 임상적 완화를 유지하고, 특정 기간 동안 계속 완화 상태에 있으며, 이는 또한 지속적인 완화로 지칭된다. 특정의 이러한 실시양태에서, 지속적인 완화는 완화의 유도 후 8주의 기간, 또는 완화의 유도 후 30주의 기간, 또는 완화의 유도 후 50주의 기간, 또는 완화의 유도 후 54주의 기간 동안이다. 특정 실시양태에서, 상기 제시된 임의의 용량 또는 투여 요법에 따라 항-베타7 항체를 투여받은 환자는 지속적인 무스테로이드 완화를 경험한다. 지속적인 무스테로이드 완화를 경험하는 환자는 완화의 유도 후 제30주에 코르티코스테로이드 사용을 중지하고, 완화의 유도 후 50주 또는 54주 이상 동안 완화를 지속시킨다. 특정 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 항-베타7 항체를 투여받은 환자는 주어진 기간에 걸쳐 급성악화에 대한 감소된 시간 또는 급성악화의 감소된 속도를 경험한다. 특정 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 항-베타7 항체를 투여받은 환자는 점막 치유를 경험한다. 특정 실시양태에서, 점막 치유를 경험하는 환자는 굴곡성 S상결장경검사에 의해 평가시 0 또는 1의 내시경검사 하위점수를 갖는 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)이다.
도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같은 I상 연구에서의 rhuMAb 베타7의 군 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 보여준다. (a) 연구 약물을 IV 투여받은 연구의 단일 상승 용량 단계에 있는 환자에서의 혈청 rhuMAb 베타7; (b) 동일한 용량의 연구 약물을 SC 투여받은 환자와 비교하여 연구 약물을 3.0 mg/kg IV 투여받은 연구의 단일 상승 용량 단계에 있는 환자에서의 혈청 rhuMAb 베타7; (c) 연구의 다중 상승 용량 단계에 있는 환자에서의 혈청 rhuMAb 베타7. 각각의 그래프는 수직축 상에 혈청 rhuMAb 베타7 농도 (μg/mL), 및 수평축 상에 시간 (일)을 보여준다.
도 2는 실시예 1에 기재된 바와 같은 인테그린 베타 7 점유를 보여준다. (a) 코호트 G에서의 각각의 환자로부터의 샘플에서의 점유; 4명의 환자 (V, W, X, Y)는 0.5 mg/kg rhuMAb 베타7을 SC 투여받았고, 한편 1명은 위약 (P6)을 투여받았다; (b) 코호트 H에서의 각각의 환자로부터의 샘플에서의 점유; 3명의 환자 (AA, BA, DA)는 1.5 mg/kg rhuMAb 베타7을 SC 투여받았고, 한편 1명은 위약 (P8)을 투여받았다; (c) 코호트 I에서의 각각의 환자로부터의 샘플에서의 점유; 4명의 환자 (EA, FA, GA, HA)는 3.0 mg/kg rhuMAb 베타7을 SC 투여받았고, 한편 1명은 위약 (P9)를 투여받았다; (d) 코호트 J에서의 각각의 환자로부터의 샘플에서의 점유; 5명의 환자 (IA, JA, KA, LA, MA)는 4.0 mg/kg rhuMAb 베타7을 IV 투여받았고, 한편 1명은 위약 (P10)을 투여받았다. 각각의 그래프는 수직축 상에 점유, 및 수평축 상에 연구 일수를 보여준다. 특정 환자는 연구 동안 급성악화를 가졌고, 이는 각각의 환자에 의해 급성악화가 나타난 날과 함께 괄호 안에 제시되어 있다.
도 3은 실시예 1에 기재된 바와 같은 메이요 클리닉 점수에서의 개별적 변화를 보여준다. (a) 코호트 G (0.5 mg/kg SC); (b) 코호트 H (1.5 mg/kg SC); (c) 코호트 I (3 mg/kg SC); (d) 코호트 J (4 mg/kg IV); (e) 위약. 각각의 그래프에 대해, 메이요 클리닉 점수는 수직축 상에 도시되어 있고, 시간 (일)은 수평축 상에 도시되어 있다. 화살표는 연구 약물 (a-d) 또는 위약 (e)이 투여된 날을 나타낸다.
도 4는 실시예 2에 기재된 바와 같은 예비 I상 약동학적 데이터로부터 유도된 약동학적 모델을 이용하여 시뮬레이션된 혈청 rhuMAb 베타7 농도-시간 프로파일 (중간 수준)을 보여준다. 시뮬레이션된 혈청 rhuMAb 베타7 농도 (μg/mL)는 수직축 상에 있고; 시간 (일)은 수평축 상에 있다.
도 5는 실시예 2에 기재된 바와 같은 집단 시뮬레이션-예측된 정상-상태 노출의 비교 (Cmax 및 AUC0 -84) 및 체중-기반 대 균일 투여에 대한 변동성을 보여준다.
도 6a 및 6b는 하기에 대한 가변 경쇄 및 중쇄의 서열의 정렬을 보여준다: 경쇄 인간 하위군 카파 I 컨센서스 서열 (도 6a, 서열 12), 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 서열 (도 6b, 서열 13), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 경쇄 (도 6a, 서열 10), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 중쇄 (도 6b, 서열 11), 및 인간화 항체 변이체: 인간화 hu504K이식편 가변 경쇄 (도 6a, 서열 14), 인간화 hu504K 이식편 가변 중쇄 (도 6b, 서열 15), 변이체 hu504-5, hu504-16 및 hu504-32 (인간화 hu504K 이식편으로부터의 아미노산 변이가 도 6a에 제시되어 있음) (경쇄) (각각 서열 22-24, 출현 순서대로) 및 변이체 hu504-5, hu504-16 및 hu504-32에 대한 도 6b (중쇄) (서열 25).
도 7은 실시예 2에 기재된 바와 같은 II상 임상 연구에 대한 연구 스키마를 보여준다.
도 8은 실시예 2에 기재된 바와 같은 개방 표지 확장 연구에 진입한 중등도 내지 중증 궤양성 결장염을 앓는 환자에 대한 부분적 메이요 클리닉 점수 (pMCS)를 보여준다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 학술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당업자에게 본원에 사용된 수많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다.
특정 정의
본 명세서를 설명하려는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우에는 언제라도, 단수형으로 사용된 용어는 또한 복수형도 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 하기 기재된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 모순되는 경우에는 하기 기재된 정의가 우선한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "단백질"에 대한 언급은 복수형의 단백질을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물을 포함하는 등이다.
명세서 및 첨부된 특허청구범위에 제공된 범위는 종점 둘 다 및 종점 사이의 모든 점을 포함한다. 따라서, 예를 들어 2.0 내지 3.0의 범위는 2.0, 3.0, 및 2.0과 3.0 사이의 모든 점을 포함한다.
"치료", "치료하는", 및 그의 문법적 변형은 치료할 개체 또는 세포의 자연적인 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리상태의 과정 도중에 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질환의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 예후의 완화 또는 개선을 포함한다.
"치료 요법"은 제2 의약을 부가하거나 부가하지 않으면서, 투여량, 투여 빈도 또는 치료의 지속시간의 조합을 지칭한다.
"유효 치료 요법"은 해당 치료를 받고 있는 환자에게 이로운 반응을 제공하게 될 치료 요법을 지칭한다.
"치료 변형"은 투여량, 투여 빈도, 또는 치료의 지속시간을 변화시키고/거나 제2 의약을 부가하는 것을 포함하여, 치료 요법을 변화시키는 것을 지칭한다.
"환자 반응" 또는 "환자 반응성"은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예컨대 지연 및 완전한 정지; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상의 수에서의 감소; (3) 병변 크기에서의 감소; (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (6) 질환 병변의 퇴행 또는 제거를 일으킬 수 있으나 그래야만 하는 것은 아닌, 자가면역 반응의 감소; (7) 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; (8) 치료 후 질환이 없는 표출 기간에서의 증가; 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서의 사망률의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 환자에 대한 이익을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가될 수 있다. 용어 "반응성"은 완전 반응 (CR) 및 부분 반응 (PR)을 비롯한 측정가능한 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 "완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응하여 염증의 모든 신호의 소멸 또는 완화를 의미한다. 이는 반드시 질환이 치유되었음을 의미하지는 않는다.
"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 반응하여 염증 중증도에서의 50% 이상의 감소를 지칭한다.
인테그린 베타7 길항제를 이용한 치료에 대한 환자의 "유익한 반응" 및 유사한 단어는 항-베타7 인테그린 항체와 같은 길항제를 이용한 치료로부터 또는 이러한 치료의 결과로서, 위장 염증성 장애에 걸릴 위험이 있거나 이러한 장애를 앓고 있는 환자에게 임상적 또는 치료적 이익을 부여하는 것을 지칭한다. 이러한 이익은 길항제 치료로부터 또는 그러한 치료의 결과로서의 세포적 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정적 질환 (진행 또는 재발이 없음), 또는 환자의 후기 재발이 있는 반응을 포함한다.
환자의 반응성이 치료 과정 동안의 시간에 따라 감소되지 않는 경우에, "이러한 환자는 치료에 대한 반응성을 유지하고 있다".
본원에 사용된 용어 "샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특성을 기반으로 하여 특성화되고/거나 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 실체를 함유하는 관심 대상으로부터 얻거나 상기 대상으로부터 유도된 조성물을 의미한다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 그의 변형 표현은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 실체를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심 대상으로부터 얻은 임의의 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 관심 대상체에 대한 조직 또는 대상체의 말초 혈액으로부터 수득할 수 있다.
"베타7 인테그린 길항제" 또는 "베타7 길항제"는 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 베타7 인테그린과 이와 연관된 하나 이상의 분자와의 결합을 차단하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 길항제를 사용하여 베타7 관련 효과의 하나 이상의 측면, 예를 들어 알파4 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파E 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파4베타7 인테그린과 MAdCAM, VCAM-1 또는 피브로넥틴과의 결합, 및 알파E베타7 인테그린과 E-카드헤린과의 결합을 조절할 수 있다. 이들 효과는 베타7 서브유닛 또는 알파4베타7 또는 알파E베타 이량체성 인테그린에 대한 리간드 결합성을 붕괴시키는 것을 포함한, 생물학적으로 관련된 모든 기전에 의해 조절할 수 있고/있거나 알파 인테그린 서브유닛과 베타 인테그린 서브유닛 사이의 회합을 붕괴시켜 이량체성 인테그린의 형성이 억제되도록 함으로써 조절할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 베타7 길항제는 항-베타7 인테그린 항체 (또는 항-베타7 항체)이다. 한 실시양태에서, 항-베타7 인테그린 항체는 인간화 항-베타7 인테그린 항체, 보다 특히 재조합 인간화 모노클로날 항-베타7 항체 (또는 rhuMAb 베타7)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-베타7 항체는 베타7 서브유닛과 알파4 인테그린 서브유닛과의 결합, 알파E 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파4베타7 인테그린과 MAdCAM, VCAM-1 또는 피브로넥틴과의 결합, 및 알파E베타7 인테그린과 E-카드헤린과의 결합을 억제 또는 차단하는 항-인테그린 베타7 길항성 항체이다.
"베타7 서브유닛" 또는 "β7 서브유닛"은 인간 β7 인테그린 서브유닛을 의미한다 (문헌 [Erle et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016]). 베타7 서브유닛은 알파4 인테그린 서브유닛, 예를 들어 인간 .알파.4 서브유닛과 회합한다 (문헌 [Kilger and Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354]). 알파4베타7 인테그린은 보고에 따르면 성숙 림프구의 대부분, 뿐만 아니라 흉선세포, 골수 세포 및 비만 세포의 작은 집단 상에서 발현된다. (문헌 [Kilshaw and Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597; Gurish et al., (1992) 149: 1964-1972; 및 Shaw, S. K. and Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335]). 베타7 서브유닛은 또한 알파E 서브유닛, 예를 들어 인간 알파E 인테그린 서브유닛과 회합한다 (문헌 [Cepek, K. L, et al. (1993) J. Immunol. 150:3459]). 알파E베타7 인테그린은 장내 상피 림프구 (iIEL) 상에서 발현된다 (상기 문헌 [Cepek, K. L. (1993)]).
"알파E 서브유닛" 또는 "알파E 인테그린 서브유닛" 또는 "αE 서브유닛" 또는 "αE 인테그린 서브유닛" 또는 "CD103"은 상피내 림프구 상의 베타7 인테그린과 회합되는 것으로 밝혀진 인테그린 서브유닛을 의미하며, 이 알파E베타7 인테그린은 E-카드헤린을 발현하는 장 상피에 대한 iEL의 결합을 매개한다 (문헌 [Cepek, K. L. et al. (1993) J. Immunol. 150:3459; Shaw, S. K. and Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335]).
"MAdCAM" 또는 "MAdCAM-1"은 본 발명의 문맥에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 짧은 세포질성 꼬리, 막횡단 영역, 및 3개의 이뮤노글로불린-유사 도메인으로 구성된 세포외 서열을 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드인 단백질 점막 어드레신 세포 부착 분자-1을 지칭한다. 뮤린, 인간 및 마카크 MAdCAM-1에 대한 cDNA를 클로닝하였다 (문헌 [Briskin, et al., (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857]).
"VCAM-1" 또는 "혈관 세포 부착 분자-1" 또는 "CD106"은 활성화 내피 상에서 발현되고 내피-백혈구 상호작용, 예컨대 염증 동안 백혈구의 결합 및 이행에 있어서 중요한 알파4베타7 및 알파4베타1의 리간드를 지칭한다.
"CD45"는 단백질 티로신 포스파타제 (PTP) 패밀리의 단백질을 지칭한다. PTP는 세포 성장, 분화, 유사분열 주기 및 종양원성 형질전환을 비롯한 다양한 세포 과정을 조절하는 신호전달 분자인 것으로 공지되어 있다. 이러한 PTP는 세포외 도메인, 단일 막횡단 절편 및 2개의 직렬 세포질내 촉매 도메인을 함유하므로, 수용체 유형 PTP에 속한다. 이러한 유전자는 조혈 세포에서 특이적으로 발현된다. 이러한 PTP는 T- 및 B-세포 항원 수용체 신호전달의 필수적 조절인자인 것으로 밝혀졌다. 이는 항원 수용체 복합체의 성분과의 직접적인 상호작용을 통해 기능하거나, 또는 항원 수용체 신호전달을 위해 요구되는 다양한 Src 패밀리 키나제를 활성화시킴으로써 기능한다. 이러한 PTP는 또한 JAK 키나제를 억제하므로, 시토카인 수용체 신호전달의 조절인자로서 기능한다. 특징적 이소형을 코딩하는 이 유전자의 4종의 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 보고되었다. (문헌 [Tchilian EZ, Beverley PC (2002). "CD45 in memory and disease." Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 50 (2): 85-93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, et al. (2004). "Interleukin-6, CD45 and the src-kinases in myeloma cell proliferation." Leuk. Lymphoma 44 (9):1477-81]).
다양한 이소형의 CD45가 존재한다: CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (ABC). CD45는 또한 고도로 글리코실화되어 있다. CD45R은 가장 긴 단백질이고, T 세포로부터 단리된 경우에 200 kDa으로 이동한다. B 세포는 또한, 분자량이 220 kDa이 되게 하는 보다 무거운 글리코실화를 갖고, 따라서 명칭이 B220 (220 kDa의 B 세포 이소형)인 CD45R을 발현한다. B220 발현은 B 세포에 한정되지 않으며, 또한 활성화된 T 세포 상에서, 수지상 세포 및 다른 항원 제시 세포의 하위세트 상에서 발현될 수 있다. 문헌 [Stanton T, Boxall S, Bennett A, et al. (2004). "CD45 variant alleles: possibly increased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIV seropositive Ugandans." Immunogenetics 56 (2): 107-10].
"소화관-귀소 림프구"는 장 림프절 및 조직으로는 선택적으로 귀소하지만, 말초 림프절 및 조직으로는 귀소하지 않는 특성을 지닌 림프구 하위군을 지칭한다. 이러한 림프구 하위군은 CD4, CD45RA 및 베타7의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수 세포 표면 분자 조합의 독특한 발현 패턴을 특징으로 한다. 전형적으로, 말초 혈액 CD4+ 림프구의 2종 이상의 하위세트는 CD45RA 및 베타7의 마커에 기반하여 CD45RA-β7고 및 CD45RA-β7저 CD4+ 세포로 세분될 수 있다. CD45RA-β7고 CD4+ 세포는 우선적으로 장 림프절 및 조직으로 귀소하고, 반면에 CD45RA-β7저 CD4+ 세포는 우선적으로 말초 림프절 및 조직으로 귀소한다 (문헌 [Rott et al. 1996; Rott et al. 1997; Williams et al. 1998; Rose et al. 1998; Williams and Butcher 1997; Butcher et al. 1999]). 따라서, 소화관-귀소 림프구는 유동 세포측정법 검정에서 CD45RA-β7고 CD4+로서 확인된 특징적 림프구 하위군이다. 이러한 림프구 군을 확인하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 또한 본원의 실시예에 상세히 개시되어 있다.
세포 표면 마커와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 부호 "+"는 세포 표면 마커의 양성 발현을 표시한다. 예를 들어, CD4+ 림프구는 그의 세포 표면 상에 발현된 CD4를 갖는 림프구 군이다.
세포 표면 마커와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 부호 "-"는 세포 표면 마커의 음성 발현을 표시한다. 예를 들어, CD45RA- 림프구는 그의 세포 표면 상에 발현된 CD45RA를 갖지 않는 림프구 군이다.
세포 표면 마커의 발현과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 부호 "저"는 세포 표면 마커가 림프구 상에 비교적 낮은 수준으로 발현되는 것을 표시하는 반면, "고"는 세포 표면 마커가 림프구 상에 비교적 높은 수준으로 발현되는 것을 표시한다. 유동 세포측정법에서, β7고의 강도는 β7저의 강도보다 적어도 약 10배 또는 100배 더 높다. 따라서, 본원의 예시적 실시양태에서 제공된 바와 같이, CD45RA-β7저 CD4+ 및 CD45RA-β7고 CD4+ 림프구는, X-축이 CD45RA의 발현 강도이고 Y-축이 베타7의 발현 강도인 유동 세포측정법 분석의 도트 플롯 또는 히스토그램의 별개의 부분에 위치한다.
"말초-귀소 림프구"는 말초 림프절 및 조직으로 귀소하며, 장 림프절 및 조직으로는 귀소하지 않는 특성을 갖는 림프구 하위군을 지칭한다. 예시적 실시양태에서, 상기 설명된 바와 같이, 말초-귀소 림프구는 유동 세포측정법 검정에서 CD45RA-β7저 CD4+ 세포로서 확인된 특징적 림프구 군이다. 이러한 림프구 군을 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"위장 염증성 장애"는 점막에서 염증 및/또는 궤양화를 유발하는 만성 장애 군이다. 이들 장애는, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 불확정 결장염 및 감염성 결장염), 점막염 (예를 들어, 구강 점막염, 위장 점막염, 비강 점막염 및 직장염), 괴사성 소장결장염 및 식도염을 포함한다.
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 염증 및/또는 궤양화를 유발하는 장의 질환을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 비제한적으로 크론병 및 궤양성 결장염을 포함한다.
"크론병 (CD)" 또는 "궤양성 결장염 (UC)"은 병인이 공지되지 않은 만성 염증성 장 질환이다. 크론병은 궤양성 결장염과는 달리, 장의 어떠한 부분에도 영향을 미칠 수 있다. 크론병의 가장 두드러진 특성은 장 벽에 과립형의 적색을 띤 자주색 부종이 비대해지는 것이다. 염증이 발생함에 따라, 이들 육아종은 종종 자신의 국한성 경계를 상실하고 주위 조직과 통합된다. 설사 및 장 폐쇄가 주요 임상적 특성이다. 궤양성 결장염과 같이, 크론병의 과정은 지속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있지만, 궤양성 결장염과는 달리, 크론병은 병의 원인이 되는 장 절편을 절제함으로써 치유될 수 없다. 크론병에 걸린 대부분의 환자는 몇몇 시점에서는 수술이 필요하지만, 후속 재발이 흔하기 때문에 지속적인 의료 치료가 통상적이다.
크론병은 구강에서부터 항문까지의 모든 소화관 부분에서 발병할 수 있지만, 이는 전형적으로, 회결장, 소장 또는 결장-항문직장 영역에서 나타난다. 조직병리학적으로, 상기 질환은 불연속적인 육아종성, 음와 농양, 열구 및 아프타성 궤양 징후가 나타난다. 염증성 침윤물은 림프구 (T 세포 및 B 세포 둘 다), 형질 세포, 대식세포 및 호중구로 이루어진 혼합 형태이다. IgM- 및 IgG-분비성 형질 세포, 대식세포 및 호중구에서의 불균형적 증가가 있다.
항염증 약물 술파살라진 및 5-아미노살리실산 (5-ASA)은 경도의 활성 결장성 크론병을 치료하는데 유용하고, 이러한 질환의 완화를 유지하기 위해 통상적으로 처방되고 있다. 메트로니다졸 및 시프로플록사신은 술파살라진과 효능 면에서 유사하고, 항문주위 질환을 치료하는데 특히 유용한 것으로 여겨진다. 보다 중증의 경우에는, 코르티코스테로이드가 활성 악화를 치료하기 위해 처방되고, 이는 때때로 완화를 유지시킬 수 있다. 아자티오프린 및 6-메르캅토퓨린은 또한, 코르티코스테로이드를 만성 투여해야 하는 환자에서 사용되었다. 또한, 이들 약물은 장기간 예방에 있어서 일정 역할을 할 수 있는 것으로 제안되었다. 불행하게도, 몇몇 환자에서는 작용이 발생하기 전에 극히 장기간 (6개월까지) 지연될 수 있다. 항설사 약물은 또한, 몇몇 환자에서 증상 완화를 제공할 수 있다. 영양 요법 또는 기본식은 환자의 영양 상태를 개선할 수 있고, 급성 질환의 증상 개선을 유도하지만, 지속적인 임상적 완화는 유도하지 않는다. 항생제는 2차적인 소장 박테리아 과도성장을 치료하고 화농성 합병증을 치료하는데 사용된다.
"궤양성 결장염 (UC)"은 대장에 침범한다. 질환 과정은 연속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있다. 가장 초기 병변은 리베르쿤 음와의 기저부에 농양이 형성되는 염증 침윤이다. 이들 팽창되고 파열된 음와의 유착은 위에 가로놓인 점막을 그의 혈액 공급으로부터 분리시켜 궤양화를 유발하는 경향이 있다. 이러한 질환의 증상은 경련, 하복부통, 직장 출혈, 및 희박한 분변 입자와 함께 혈액, 고름 및 점액으로 주로 이루어진 빈번하고 무른 배설물을 포함한다. 급성, 중증 또 만성, 끊임없는 궤양성 결장염에는 전체 결장절제술이 요구될 수 있다.
UC의 임상적 특성은 고도로 가변적이고, 그 발병은 잠행성이거나 돌연성일 수 있고, 설사, 이급후중 및 재발성 직장 출혈을 포함할 수 있다. 전체 결장의 전격성 병발에 따라, 생명을 위협하는 응급 상황인 독성 거대결장증이 생겨날 수 있다. 장외 징후는 관절염, 괴저 농피증, 포도막염 및 결절성 홍반을 포함한다.
UC에 대한 치료는 경도인 경우에 술파살라진 및 관련 살리실레이트-함유 약물을 포함하고, 중증인 경우에 코르티코스테로이드 약물을 포함한다. 살리실레이트 또는 코르티코스테로이드를 국소 투여하는 것이 종종 유효한데, 특히 상기 질환이 말단부 장에 한정되고 전신 용도와 비교해서 부작용을 감소시키는 것과 연관되는 경우에 유효하다. 철 및 항설사제를 투여하는 것과 같은 지지 조치가 종종 치료에 적용된다. 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트가 종종 또한, 난치성 코르티코스테로이드-의존성 사례에 사용하도록 처방된다.
"유효 투여량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 치료가 바람직한 임의의 단일 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 환자는 인간이다.
본원에서의 "대상체"는 전형적으로 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 예시적인 비-인간 포유동물은 실험실 동물, 가축, 애완동물, 스포츠 동물 및 농장 동물, 예를 들어 마우스, 고양이, 개, 말 및 소를 포함한다. 전형적으로, 대상체는 치료, 예를 들어 위장 염증성 장애의 치료에 적격이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체의 "평생"은 치료를 시작한 후에 대상체의 삶의 나머지를 지칭한다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이중특이적 항체)를 포함하고, 이는 또한 특정의 항체 단편 (본원에 보다 상세히 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 단지 일부만을 포함하는데, 이러한 일부는 바람직하게는, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 이러한 일부와 통상적으로 연관된 기능들 중의 하나 이상의 기능, 전형적으로 대부분 또는 모든 기능을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 항원과 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나의 기능을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열과 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 즉, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대하여 지정된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지정된다.
본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대다수의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용을 위해, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/거나 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 이러한 기술은 인간-유래 조합 라이브러리, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 기술 (예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) 및 Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)] 참조); 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주를 사용하는 기술 (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조); 및 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)에서 모노클로날 항체를 생성하는 기술 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)] 참조)을 포함한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 동물로부터의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 항체이다. 항체의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 폴리펩티드를 95 중량% 초과로, 및 종종 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 적어도 15개 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하는데; VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 대신에, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한 것이다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기는 하기에 나타내어진다.
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초가변 영역은 하기와 같은 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 49-56 또는 50-56 또는 52-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체와 비교해서 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는, 그의 하나 이상의 CDR 내에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 특정 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1996); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 의해 기재되어 있다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 두 수치 사이의 차이가 이러한 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특성 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없다고 간주할 수 있을 정도로 두 수치 (일반적으로, 하나는 본 발명의 항체와 연관된 것이고, 다른 하나는 기준/비교 항체와 연관된 것임) 사이의 충분한 고도의 유사성을 의미한다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 전체 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯한 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 신속하게 결합하고 보다 길게 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 이용될 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 배위를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄로부터의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편으로 지칭되는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상의 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000)]에 개괄적으로 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 아래에 정의된 항체 단편이 아닌, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 의미한다. 이 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
본원에서의 목적을 위한 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체이다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이것의 카르복실-말단까지의 범위로 경계지어진다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에서 이뮤노글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (명백히 본원에 참조로 포함됨)에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 합해야만 하고, 이는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 아미노산 변형을 통해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 특정 실시양태에서 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 적어도 약 80%의 상동성, 또는 그와의 적어도 약 90%의 상동성, 또는 그와의 적어도 약 95%의 상동성을 보유할 것이다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "부류"로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 다음, 연속해서 이러한 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하여 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한, 모계 IgG를 태아에게 전이시키는 것을 담당하고 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)]), 이뮤노글로불린의 생체 항상성을 조절하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 WO00/42072 (Presta, L.) 및 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 영역은 위치 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 또는 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중 1개 이상에서 치환을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합이 개선된 Fc 영역-포함 항체 변이체는 그의 Fc 영역의 위치 307, 380 및 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중 1개, 2개 또는 3개에서 아미노산 치환을 포함한다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthuen in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. HER2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458에 기재되어 있다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (VL)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH)을 포함한다 (VH - VL). 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체와 비교해서 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는, 그의 하나 이상의 초가변 영역 내에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 특정 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 의해 기재되어 있다.
"아미노산 서열 변이체" 항체는 본원에서 주요 종 항체와 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체와 적어도 약 70%의 상동성을 가질 것이거나, 또는 이들은 주요 종 항체와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체의 아미노산 서열 내의 또는 이러한 서열에 인접한 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 부가를 보유한다. 본원에서 아미노산 서열 변이체의 예는 산성 변이체 (예를 들어, 탈아미드화 항체 변이체), 염기성 변이체, 그의 1개 또는 2개의 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부 (예를 들어, VHS-)를 갖는 항체, 그의 1개 또는 2개의 중쇄 상에 C-말단 리신 잔기를 갖는 항체 등을 포함하며, 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변이 조합물을 포함한다. 본원에서 특별히 관심을 갖는 항체 변이체는 1개 또는 2개 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부를 포함하고, 주요 종 항체와 비교해서 다른 아미노산 서열 및/또는 글리코실화 차이를 임의로 추가로 포함하는 항체이다.
"글리코실화 변이체" 항체는 본원에서 그에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 주요 종 항체에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티와 상이한 항체이다. 본원의 글리코실화 변이체의 예는 그의 Fc 영역에 부착된, G0 올리고사카라이드 구조 대신에 G1 또는 G2 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체, 그의 1개 또는 2개의 경쇄에 부착된 1개 또는 2개의 탄수화물 모이어티를 갖는 항체, 항체의 1개 또는 2개의 중쇄에 부착된 탄수화물이 전혀 없는 항체, 및 글리코실화 변경들의 조합물을 포함한다. 항체가 Fc 영역을 갖는 경우에, 올리고사카라이드 구조는, 예를 들어 잔기 299 (298, 잔기의 Eu 넘버링)에서 항체의 1개 또는 2개의 중쇄에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함한다.
용어 "시토카인"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 시토카인에 포함되는 것은 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체화 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자 (LIF 및 kit 리간드 (KL) 포함)이다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
보조 요법에 대해 본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료할 대상체의 면역계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이것은 시토카인 생성을 억제하거나 자가-항원 발현을 하향조절 또는 억제하거나, 또는 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 번호 4,665,077 참조); 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID); 간시클로비르; 타크롤리무스; 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론; 항염증제, 예컨대 시클로옥시게나제 억제제; 5-리폭시게나제 억제제; 또는 류코트리엔 수용체 길항제; 퓨린 길항제, 예컨대 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸 (MMF); 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (미국 특허 번호 4,120,649에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린; 6 메르캅토퓨린; 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 예컨대 솔루-메드롤(SOLU-MEDROL).RTM. 메틸프레드니솔론 나트륨 숙시네이트, 및 덱사메타손; 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 항말라리아제, 예컨대 클로로퀸 및 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 시토카인 또는 시토카인 수용체 항체 또는 길항제, 예컨대 항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체, 항-종양 괴사 인자(TNF)-알파 항체 (인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE).RTM.) 또는 아달리무맙), 항-TNF-알파 이뮤노어드헤신 (에타네르셉트), 항-TNF-베타 항체, 항-인터류킨-2 (IL-2) 항체 및 항-IL-2 수용체 항체, 및 항-인터류킨-6 (IL-6) 수용체 항체 및 길항제; 항-LFA-1 항체, 예컨대 항-CD11a 및 항-CD18 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범-T 항체, 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (1990년 7월 26일에 공개된 WO 90/08187); 스트렙토키나제; 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타); 스트렙토도마제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 클로람부실; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 번호 5,114,721 (Cohen et al.)); T-세포 수용체 단편 (문헌 [Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991)]; WO 90/11294; [Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)]; 및 WO 91/01133); BAFF 길항제, 예컨대 BAFF 또는 BR3 항체 또는 이뮤노어드헤신 및 zTNF4 길항제 (검토를 위해, 문헌 [Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)]을 참조하고, 또한 하기 정의를 참조함); T 세포 헬퍼 신호를 방해하는 생물학적 작용제, 예컨대 항-CD40 수용체 또는 항-CD40 리간드 (CD154), 예컨대 CD40-CD40 리간드에 대한 차단 항체 (예를 들어, 문헌 [Durie etal., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)]) 및 CTLA4-Ig (문헌 [Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)]); 및 T-세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "개선하다" 또는 "개선"은 상태, 질환, 장애 또는 표현형, 예컨대 이상 또는 증상의 감소, 축소 또는 제거를 지칭한다.
질환 또는 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)의 "증상"은 대상체가 경험하고 질환을 나타내는 임의의 병적 현상, 또는 구조, 기능 또는 감각에서 정상을 벗어나는 것이다.
표현 "치료 유효량"은 질환 또는 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 항체의 "치료 유효량"은 특정된 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 항체의 양을 지칭한다. 유사하게, 항체 및 제2 화합물의 조합물의 "치료 유효량"은, 특정된 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 조합물 중 항체의 양 및 제2 화합물의 양을 지칭한다.
용어 2종의 화합물"의 조합"은 화합물이 서로 혼합물로 투여되어야 한다는 것을 의미하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이러한 조합을 사용하는 치료 또는 이러한 조합의 사용은 화합물의 혼합물 또는 화합물의 개별 투여를 포함하며, 동일한 날 또는 상이한 날의 투여를 포함한다. 따라서, 용어 "조합"은 2종 이상의 화합물이 치료를 위해 개별적으로 또는 서로 혼합물로 사용된다는 것을 의미한다. 항체 및 제2 화합물이, 예를 들어 대상체에게 조합되어 투여되는 경우에, 항체는 항체 및 제2 화합물이 대상체에게 개별적으로 투여되든지 혼합물로 투여되든지, 제2 화합물이 또한 대상체 내에 존재하는 시점에 대상체 내에 존재한다. 특정 실시양태에서, 항체 이외의 화합물은 항체 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항체 이외의 화합물은 항체 후에 투여된다.
본원의 목적을 위해, "종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파)"는 문헌 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) 또는 Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNF-알파 분자를 지칭한다.
본원에서 "TNF-알파 억제제"는 일반적으로 TNF-알파에 결합하여 그의 활성을 중화시킴으로써 TNF-알파의 생물학적 기능을 어느 정도 억제하는 작용제이다. 본원에서 구체적으로 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)®), 인플릭시맙 (레미케이드®), 및 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®), 골리무맙 (심포니(SIMPONI)TM) 및 세톨리주맙 페골 (심지아(CIMZIA)®)이다.
"코르티코스테로이드"는 자연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 또는 증가시키는 스테로이드의 일반적 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 자연 발생 물질 중 임의의 하나를 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론 포함), 덱사메타손, 트리암시놀론 및 베타메타손을 포함한다.
용어 "길항제"는 특정한 또는 특정된 단백질의 활성, 예컨대 리간드의 경우에는 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합, 또는 수용체의 경우에는 하나 이상의 리간드에 대한 그의 결합을 중화하거나, 차단하거나, 억제하거나, 없애거나, 감소시키거나, 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 길항제는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 핵산, 생물유기 분자, 펩티드모방체, 약리학적 작용제 및 그의 대사물, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함한다. 길항제는 또한 단백질의 소분자 억제제, 및 단백질에 특이적으로 결합하여 그것이 그의 표적에 결합하는 것을 봉쇄하는 융합 단백질, 수용체 분자 및 유도체, 단백질의 길항제 변이체, 단백질에 대해 지정된 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 단백질에 대한 리보자임을 포함한다.
"자가-주사 장치"는 치료제의 자가-투여, 예를 들어 환자 또는 재택 간병인에 의한 투여를 위한 의료 장치를 지칭한다. 자가-주사 장치는 자동주사기 장치 및 자가-투여를 위해 설계된 다른 장치를 포함한다.
다양한 추가의 용어는 본원에 정의되거나 또는 달리 특성화된다.
조성물 및 방법
A. 베타7 인테그린 길항제
베타7 인테그린 길항제를 투여하는 것에 의해 대상체, 예를 들어 인간에서 위장 염증성 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 잠재적 길항제의 예는 이뮤노글로불린과 베타7 인테그린의 융합물에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 특히 비제한적으로 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일-쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 버전, 뿐만 아니라 인간 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체를 포함한다. 다르게는, 잠재적 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 리간드를 인식하지만 어떠한 영향력도 미치지 않음으로써, 베타7 인테그린의 작용을 경쟁적으로 억제하는 베타7 인테그린의 돌연변이 형태일 수 있다.
또 다른 잠재적 베타7 인테그린 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물인데, 이러한 기술에서는, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자가 표적화 mRNA와 혼성화하고 단백질 해독을 방지함으로써 mRNA의 해독을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이러한 방법은 둘 다 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합에 기반한다. 예를 들어, 본원의 베타7 인테그린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여, 길이가 약 10 내지 40개 염기 쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 상보적이도록 설계되어 (삼중 나선--문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), 베타7 인테그린의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하고, 이러한 mRNA 분자가 베타7 인테그린 단백질로 해독되는 것을 차단한다 (안티센스--문헌 [Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, Fla., 1988)]). 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 또한 세포에 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 PRO 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 할 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우에, 번역-개시 부위로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치 사이가 전형적이다.
다른 잠재적 길항제는 베타7 인테그린의 활성 부위, 리간드 또는 결합 분자 결합 부위에 결합함으로써 베타7 인테그린의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자를 포함한다. 소분자의 예는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 전형적으로 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA에 대한 서열-특이적 혼성화에 이은 엔도뉴클레아제 절단에 의해 작용한다. 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기술에 의해 확인할 수 있다. 추가의 상세한 내용을 위해, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공개 번호 WO 97/33551 (1997년 9월 18일에 공개됨)을 참조한다.
전사 억제에 사용되는 삼중-나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 이것이 후그스틴 염기-쌍형성 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진하도록 설계되는데, 여기서 일반적으로 듀플렉스 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 추가의 상세한 내용을 위해, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 97/33551을 참조한다. 이러한 소분자들은 임의의 하나 이상의 상기 논의된 스크리닝 검정 및/또는 당업자에게 널리 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.
길항제에 대한 스크리닝 검정은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 베타7 인테그린과 결합하거나 이와 복합체를 형성하거나, 또는 그 밖에 상기 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포성 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 설계된다. 이러한 스크리닝 검정은 화학물질 라이브러리의 고처리량 스크리닝이 가능한 검정을 포함하여, 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합할 것이다.
검정은 당업계에 널리 특성화되어 있는 다양한 포맷, 예컨대 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포-기반 검정으로 수행될 수 있다.
B. 항-베타7 인테그린 항체
한 실시양태에서, 베타7 인테그린 길항제는 항-베타7 항체이다. 예시적인 항체는 하기 기재된 바와 같은 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 인간, 이중특이적 및 이종접합체 항체 등을 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 일반적으로 관련 항원 및 아주반트의 다수회의 피하 (SC) 또는 복강내 (IP) 주사에 의해 동물에서 생성할 수 있다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화시킬 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어, 단백질 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 특정 실시양태에서, 동물을 동일 항원의 접합체로 부스팅하지만, 이것은 상이한 단백질에 접합되고/거나 상이한 가교 시약을 통해 접합된 것이다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합물로서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제를 적절하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체를 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기한 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발한다. 다르게는, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후에 림프구를 단리한 후에 적합한 융제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포 (또한, 융합 파트너라 지칭되기도 함)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우에, 하이브리도마를 위한 선택 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).
특정 실시양태에서, 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포에 대해 선택하는 선택 배지에 감수성이 있는 것들이다. 특정 실시양태에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)로부터 입수가능한 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 특정 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐차드 분석으로 결정할 수 있다. 일단 소정의 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 희석 절차를 제한하여 서브클로닝하고 표준 방법으로 배양할 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 예를 들어 하이브리도마 세포를 마우스에게 i.p. 주사함으로써 상기 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스의 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 이용하여 용이하게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포가 이같은 DNA의 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리하는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)]) 뿐만 아니라 쇄 셔플링 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)])에 의해 고친화도 (nM 범위) 인간 항체를 생산하는 것이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 종래 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 융합시켜 변형시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 대체할 수 있거나, 또는 이것이 항체의 1개의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 1개의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
예시적인 항-베타7 항체는 Fib504, Fib 21, 22, 27, 30 (문헌 [Tidswell, M. J Immunol. 1997 Aug 1;159(3):1497-505]) 또는 그의 인간화 유도체이다. Fib504의 인간화 항체는 미국 특허 공개 번호 20060093601 (미국 특허 번호 7,528,236으로 등록됨; 그의 내용은 전문이 참조로 포함됨)에 상세히 개시되어 있다 (또한, 하기 논의 참조).
3. 인간 및 인간화 항체
본 발명의 항-베타7 인테그린 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 본질적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항체가 인간 치료용으로 의도된 경우에 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 그 내에 있는 인간 프레임워크 영역 (FR)을 인간화 항체에 대해 허용한다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크 영역을 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]). 추가로, 항체가 항원에 대해 높은 결합 친화도를 보유하고 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 유입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
다양한 형태의 인간화 항-베타7 인테그린 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)와 임의로 접합된 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있다. 다르게는, 인간화 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG1 항체일 수 있다.
예시적인 인간화 항-베타7 항체는 인테그린 서브유닛 β7에 대한 인간화 모노클로날 항체이고 래트 항-마우스/인간 모노클로날 항체 FIB504로부터 유래된 rhuMAb 베타7을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Andrew et al., 1994 J Immunol 1994;153:3847-61]). 인간 이뮤노글로불린 IgG1 중쇄 및 κ1 경쇄 프레임워크를 포함하도록 조작하였고, 이는 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 생성된다. 상기 항체는 위장관에서의 림프구 하위세트의 트래픽킹 및 체류를 조절하고, 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염 (UC) 및 크론병 (CD)에 관여하는 2개의 인테그린, 즉 α4β7 (문헌 [Holzmann et al. 1989 Cell, 1989;56:37-46; Hu et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:8254-8]) 및 αEβ7 (문헌 [Cepek et al., 1993 J Immunol 1993;150:3459-70])에 결합한다. rhuMAb 베타7은 α4β7과 그의 리간드 (점막 어드레신 세포 부착 분자-1 [MAdCAM-1], 혈관 세포 부착 분자 [VCAM]-1, 및 피브로넥틴) 사이의 세포성 상호작용 뿐만 아니라 αEβ7과 그의 리간드 (E-카드헤린) 사이의 상호작용의 강력한 시험관내 차단제이다. rhuMAb 베타7은 토끼, 시노몰구스 원숭이 및 인간으로부터의 림프구 상의 β7과 유사한 고친화도로 가역적으로 결합한다. 이것은 또한 마우스 β7에 고친화도로 결합한다. rhuMAb 베타7 및 그의 변이체의 아미노산 서열 뿐만 아니라 제조 및 사용은, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20060093601 (미국 특허 번호 7,528,236으로서 등록됨; 그의 내용은 전문이 포함됨)에 상세히 개시되어 있다.
도 6a 및 6b는 하기에 대한 가변 경쇄 및 중쇄의 서열의 정렬을 보여준다: 경쇄 인간 하위군 카파 I 컨센서스 서열 (도 6a, 서열 12), 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 서열 (도 6b, 서열 13), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 경쇄 (도 6a, 서열 10), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 중쇄 (도 6b, 서열 11), 및 인간화 항체 변이체: 인간화 hu504K이식편 가변 경쇄 (도 6a, 서열 14), 인간화 hu504K 이식편 가변 중쇄 (도 6b, 서열 15), 변이체 hu504-5, hu504-16 및 hu504-32 (인간화 hu504K 이식편으로부터의 아미노산 변이는 도 6a (경쇄) (각각 서열 22-24, 출현 순서대로) 및 도 6b (중쇄) (서열 25)에 변이체 hu504-5, hu504-16 및 504-32에 대해 제시되어 있음).
4. 인간 항체
인간화에 대한 대안으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 젠팜(GenPharm) 소유); 미국 특허 번호 5,545,807; 및 WO 97/17852를 참조한다.
다르게는, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]])을 사용하여, 비면역화된 공여체로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인-프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에서 검토된다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991)]에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).
5. 항체 단편
특정 상황에서는, 전체 항체보다는 오히려 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선할 수 있다.
항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 다르게는, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
6. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중-특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 베타7 인테그린의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이러한 다른 항체는 TAT 결합 부위를 또 다른 단백질에 대한 결합 부위와 합할 수 있다. 다르게는, 항-베타7 인테그린 아암을, TAT-발현성 세포에 대한 세포성 방어 메카니즘에 집중하고 국재하도록, 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (Fc.γ.R), 예를 들어 Fc.γRI (CD64), Fc.γRII (CD32) 및 Fc.γ.RIII (CD16)과 결합하는 아암과 합할 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를, TAT를 발현하는 세포에 또한 국재화시킬 수 있다. 이들 항체는 TAT-결합성 아암과, 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항인터페론-.알파., 빈카 알카로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)와 결합하는 아암을 보유하고 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 종래 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현을 기초로 하고, 이때 2개의 쇄는 특이성이 상이하다 (문헌 [Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생산하며, 이 중에서 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 특정 실시양태에서, 융합은 적어도 힌지의 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인에 의한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 세포로 공-형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 바람직한 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 유도하거나 상기 비가 바람직한 쇄 조합의 수율에 유의한 영향을 갖지 않는 경우에는 단일 발현 벡터 내에 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세한 내용을 위해, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 인터페이스는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인터페이스는 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "캐비티"가 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치 않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 본래의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성하는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편은 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 한다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학 커플링 반응을 실시한다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다. 재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합물에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후에 재산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍형성함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
7. 이종접합체 항체
이종접합체 항체도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포의 원치 않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 항체는 가교제를 사용하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.
8. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 전형적으로 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (전형적으로 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 1개 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1임)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 적어도 2개 (전형적으로 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
9. 이펙터 기능 조작
본 발명의 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항-종양 활성이 증진된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조할 수 있다. 다르게는, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력이 증진될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 생체내 혈청 반감기 증가를 담당하는 상기 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
10. 면역접합체
본원의 방법에 사용된 길항제 또는 항체는 또 다른 작용제, 예를 들어 세포독성제, 또는 시토카인에 임의로 접합된다.
접합은 통상적으로, 공유 연결을 통해 달성할 것인데, 그의 정확한 종류는 인테그린 베타7 길항제 또는 항체 폴리펩티드 상의 연결성 부위 및 표적화 분자에 의해 결정될 것이다. 전형적으로, 비-펩티드성 작용제는 화학적 변형에 의해 항체 상으로 도입된 그의 아미노산 측쇄, 탄수화물 쇄 또는 반응성 기를 통해 항-베타7 인테그린 항체와 접합시키는 링커를 부가함으로써 변형시킨다. 예를 들어, 약물은 리신 잔기의 .엡실론.-아미노 기를 통해, 유리 .알파.-아미노 기를 통해, 시스테인 잔기로의 디술피드 교환에 의해, 또는 과아이오딘산을 이용하여 탄수화물 쇄 중의 1,2-디올을 산화시킴으로써 부착시켜, 시프(Schiff)-염기 연쇄를 통해 다양한 친핵체를 함유하는 약물의 부착을 허용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,256,833을 참조한다. 단백질 개질제는 아민-반응성 시약 (예를 들어, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트, 알데히드 및 술포닐 할라이드), 티올-반응성 시약 (예를 들어, 할로아세틸 유도체 및 말레이미드), 및 카르복실산-반응성 및 알데히드-반응성 시약을 포함한다. 인테그린 베타7 길항제 또는 항체 폴리펩티드는 이관능성 가교결합성 시약을 사용함으로써 펩티드성 작용제에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 이종이관능성 시약이 보다 통상적으로 사용되고 있고, 이는 2가지 상이한 반응성 부분 (예를 들어, 아민-반응성 플러스 티올, 아이오도아세트아미드 또는 말레이미드)의 사용을 통해 2가지 상이한 단백질의 제어 커플링을 허용하여 제공하였다. 이러한 연결제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Brinkley] 및 미국 특허 번호 4,671,958을 참조한다. 펩티드성 링커를 또한 이용할 수 있다. 대체 방안에서는, 항-베타7 인테그린 항체 폴리펩티드를, 융합 폴리펩티드의 제조를 통해 펩티드성 모이어티에 연결시킬 수 있다.
추가의 이관능성 단백질 커플링제의 예는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함한다.
11. 이뮤노리포솜
본원에 기재된 항-베타7 인테그린 항체는 또한 이뮤노리포솜으로서 제제화될 수 있다. "리포솜"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한, 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 통상적으로, 리포솜의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 WO97/38731 (1997년 10월 23일에 공개됨)에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법으로 생성될 수 있다. 리포솜을 규정된 공극 크기의 필터를 통해 추출하여 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.
본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합될 수 있다. 임의로, 화학요법제를 리포솜 내에 함유시킨다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.
12. 벡터, 숙주 세포 및 항체 생산을 위한 재조합 방법
또한, 본원에 기재된 항-베타7 항체 또는 폴리펩티드 작용제를 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이러한 항체의 생산을 위한 재조합 기술이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하여, 추가적인 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 5,204,244 (본원에 구체적으로 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 상동 재조합에 의해 항체를 생성할 수 있다. 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써), 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 (예를 들어, 1996년 7월 9일에 등록되고 본원에 구체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,534,615에 기재된 바와 같음).
본원에서 벡터에 DNA를 클로닝하거나 여기서 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적을 위한 적절한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대 디. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적절하다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵성 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항-베타7 인테그린 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 흔하게 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 통상적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화 항-베타7 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스들은, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 상용 절차가 되어 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양물 중에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항-베타7 인테그린 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당하도록 변형시킨 통상적인 영양 배지 중에서 배양한다.
본 발명의 항-베타7 인테그린 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 1 02:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN).TM. 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 이용하는 경우에, 항체는 세포내에서 생산되거나, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 중으로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우에, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해물은 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지 중으로 분비되는 경우에, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 전형적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 .감마.1, .감마.2 또는 .감마.4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 3에 대해 추천된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX.TM. 수지 (문헌 [J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.])가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE).TM. 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체에 따라 이용하기도 한다. 임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH가 약 2.5-4.5인 용리 완충제를 사용하는, 전형적으로 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
C. 제약 제제
본 발명의 치료제, 길항제 또는 항체를 포함하는 치료 제제는, 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여, 수용액, 동결건조되거나 다른 건조된 제제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN).TM., 플루로닉스(PLURONICS).TM. 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한 경우에는 하나 초과의 활성 화합물, 전형적으로 서로 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 이뮤노글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 .감마. 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT).TM. (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 단백질을 보다 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 이뮤노글로불린이 체내에 장시간 동안 잔존하는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기를 변형시키는 것, 산성 용액으로부터 동결건조시키는 것, 수분 함량을 제어하는 것, 적합한 첨가제를 사용하는 것, 및 특정한 중합체 매트릭스 조성물을 개발하는 것에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
D. 투여
의사 투여 치료는 중량-기반 투여를 위해 개별 대상체를 위한 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이거나, 또는 균일 투여를 위해 라벨 상의 지시를 따를 것이다. 인테그린 베타7 길항제와 조합되어 투여되는 상업적으로 입수가능한 제2 치료 화합물 및 다른 화합물에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지시에 따라 이용되거나 또는 숙련된 진료의에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 인테그린 베타7 길항제 및 비-고갈 항체와 조합되어 투여되는 임의의 제2 치료 화합물 또는 다른 화합물의 적절한 투여량은 치료할 위장 염증성 장애의 유형, 예를 들어 IBD, UC, CD, 질환의 중증도 및 경과, 인테그린 베타7 길항제 또는 조합물이 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 인테그린 베타7 길항제 또는 조합물에 대한 환자의 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 인테그린 베타7 길항제 또는 조합물은 환자에게 1회 또는 보다 전형적으로 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 1개월 (4주), 또는 2개월, 3개월, 또는 6개월, 또는 12개월, 또는 18개월, 또는 24개월의 기간 동안, 또는 환자의 평생 동안 장기간으로 매주마다 1회, 또는 매 2주마다 1회, 또는 매 4주마다 1회, 또는 매 6주마다 1회, 또는 매 8주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 치료는 환자에 의해 자가-투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 약 0.5 mg/kg 내지 4.0 mg/kg의 항-베타7 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체의 균일 용량이 환자에게 투여된다. 균일 용량은 중량에 상관없이 모든 환자에게 투여되는 항-베타7 항체의 특정한 양이다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항-베타7 항체 약 50 mg 내지 450 mg의 균일 용량이 환자에게 투여되며, 이는 1회 이상의 개별 주사 또는 주입 또는 투여일 수 있다. 이러한 균일 용량은 정맥내로 또는 피하로 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 균일 용량은 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 400 mg, 또는 420 mg, 또는 450 mg이다.
특정 실시양태에서, 항-베타7 항체의 초기 균일 부하 용량은 1회 이상의 항-베타7 항체의 균일 유지 용량으로 이어진다. 부하 용량은 유지 용량보다 많은 양의 항-베타7 항체이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 약 400 mg 내지 450 mg이고, 유지 용량은 약 50 mg 내지 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이다. 특정 실시양태에서, 유지 용량은 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 400 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 420 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 430 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 100 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 150 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 300 mg이다. 특정 실시양태에서, 부하 용량은 450 mg이고, 유지 용량은 350 mg이다.
특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량과 동일한 날에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 1일 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 1주 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 2주 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 4주 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량은 매 2주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량은 매 4주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량은 매 8주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 유지 용량은 부하 용량의 2주 후에 투여되고, 제2 유지 용량은 제1 유지 용량의 2주 후에 투여되고, 각각의 후속 유지 용량은 매 4주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 2개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 6개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 12개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 18개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 24개월의 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 대상체의 평생 동안 투여된다.
전형적으로, 임상의는 요구되는 생물학적 효과를 제공하는 투여량(들)에 도달할 때까지 본 발명의 항체 (단독 또는 제2 화합물과 조합됨)를 투여할 것이다. 본 발명의 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
인테그린 베타7 길항제는 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 국소, 정맥내, 피하, 복강내, 폐내, 비강내 및/또는 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 경막내 투여가 또한 고려된다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0009444 (Grillo-Lopez) 참조). 또한 인테그린 베타7 길항제는 펄스 주입에 의해, 예를 들어, 항체의 감소하는 용량으로 적합하게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여는 정맥내로 또는 피하로 제공된다. 각각의 노출은 동일하거나 또는 상이한 투여 수단을 이용하여 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-베타7 항체에 대한 각각의 노출은 피하 투여에 의한 것이다. 한 실시양태에서, 항-베타7 항체에 대한 제1 노출, 예를 들어 부하 용량은 정맥내 투여에 의한 것이고, 각각의 후속 노출은 피하 투여에 의한 것이다.
특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는, 예를 들어 자가-주사 장치, 자동주사기 장치, 또는 자가-투여를 위해 설계된 다른 장치를 사용하여 투여된다. 자동주사기 장치를 비롯한 다양한 자가-주사 장치는 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 예시적인 장치는 사전충전 시린지 (예컨대, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로부터의 BD 하이팩 SCF(BD HYPAK SCF)®, 레디필(READYFILL)TM 및 스테리필 SCF(STERIFILL SCF)TM; 백스터(Baxter)로부터의 클리어샷(CLEARSHOT)TM 공중합체 사전충전 시린지; 및 웨스트 파마슈티칼 서비시즈(West Pharmaceutical Services)로부터 입수가능한 다이교 세이코 크리스탈 제니트(Daikyo Seiko CRYSTAL ZENITH)® 사전충전 시린지); 일회용 펜 주사 장치, 예컨대 벡톤 디킨슨으로부터의 BD 펜(BD Pen); 매우 예리한 미세바늘 장치 (예컨대, 벡톤 디킨슨으로부터의 인젝트-이즈(INJECT-EASE)TM 및 미세주입기 장치; 및 발레리타스(Valeritas)로부터 입수가능한 H-패치(H-PATCH)TM) 뿐만 아니라 무바늘 주사 장치 (예컨대, 바이오젝트(Bioject)로부터 입수가능한 바이오젝터(BIOJECTOR)® 및 이젝트(IJECT)®; 및 메드트로닉(Medtronic)으로부터 입수가능한 소프-서터(SOF-SERTER)® 및 패치 장치)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, rhuMAb 베타7은 2 mL (150 mg) rhuMAb 베타7을 포함하는 사전충전 시린지를 포함하는 제조품이다. 특정 실시양태에서, rhuMAb 베타7은 1 mL (180 mg) rhuMAb 베타7을 포함하는 사전충전 시린지를 포함하는 제조품이다.
언급된 바와 같이, 인테그린 베타7 길항제는 단독으로 또는 적어도 제2 치료 화합물과 조합되어 투여될 수 있다. 이들 제2 치료 화합물은 일반적으로 동일한 투여량으로 상기 사용된 투여 경로로 사용되거나, 또는 상기 사용된 투여량의 약 1% 내지 99%로 사용된다. 이러한 제2 화합물이 사용되는 경우에, 이들은 특정 실시양태에서 인테그린 베타7 길항제가 존재하지 않는 경우보다 더 낮은 양으로 사용되어, 그에 의해 유발되는 부작용을 제거하거나 또는 감소시켰다.
또한 언급된 바와 같이 (예를 들어, 하기 참조), IBD, 예를 들어 궤양성 결장염 및 크론병의 치료를 위한 다양한 적합한 제2 치료 화합물은 당업계에 공지되어 있고, 이러한 제2 치료 화합물을 위한 투여량 및 투여 방법도 마찬가지로 기재되어 있다.
인테그린 베타7 길항제 및 임의의 제2 치료 화합물의 투여는 동시에, 예를 들어 단일 조성물로서 또는 동일하거나 상이한 투여 경로를 이용하는 2종 이상의 별개의 조성물로서 수행될 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 투여는 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 조성물의 투여 사이에 수분 내지 수일에서 수주 내지 수개월 범위의 간격이 존재할 수 있다. 예를 들어, 인테그린 베타7 길항제가 먼저 투여되고, 이어서 제2 치료 화합물이 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여, 또는 인테그린 베타7 길항제 이전의 제2 치료 화합물의 투여도 또한 고려된다.
중등도-중증 활성 UC 대상체에 대한 표준 치료는 아미노살리실레이트, 경구 코르티코스테로이드, 6-메르캅토퓨린 (6-MP) 및/또는 아자티오프린의 표준 용량을 이용한 요법을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 인테그린 베타7 길항제, 예를 들어 항-베타7 인테그린 항체를 이용한 요법은 이러한 대상체에 대한 표준 치료를 이용하여 달성된 것 보다 탁월한, 질환 완화 상의 개선 (질환의 신속한 제어 및/또는 연장된 완화), 및/또는 임상적 반응 상의 개선을 가져다 줄 것이다.
한 실시양태에서, 염증성 장 질환 (IBD)을 앓는 인간 대상체에서의 IBD에 대한 본 발명의 치료는 이러한 대상체에게 유효량의 치료제, 예를 들어 항-베타7 인테그린 항체를 투여하는 것을 포함하고, 대상체에게 유효량의 제2 의약, 즉 면역억제제, 통증 제어제, 항설사제, 항생제 또는 그의 조합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
예시적 실시양태에서, 상기 제2 의약은 아미노살리실레이트, 경구 코르티코스테로이드, 6-메르캅토퓨린 (6-MP) 및 아자티오프린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 제2 의약은 또 다른 인테그린 베타7 길항제, 예를 들어 또 다른 항-베타7 인테그린 항체 또는 시토카인에 대한 항체이다.
이들 제2 의약 모두는 서로 병용해서 사용할 수 있거나 또는 그 자체를 제1 의약과 병용해서 사용할 수 있기 때문에, 본원에서 사용된 바와 같은 표현 "제2 의약"은 이것이 각각 제1 의약 이외의 유일한 약물이라는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 제2 의약이 1종의 의약일 필요는 없고, 1종 초과의 이러한 약물로 이루어지거나 이것을 포함할 수 있다.
본원에서의 조합 투여는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공-투여, 및 어느 한 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 일반적으로 둘 다의 (또는 모든) 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는데는 일정 기간이 있다.
제2 의약의 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공-투여 (공동 투여), 및 어느 한 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 일반적으로 둘 다의 (또는 모든) 활성제 (의약)가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는데는 일정 기간이 있다.
E. 치료 요법 설계
약물 개발은 복잡하고 비용이 많이 드는 공정이다. 신규 약물을 시장에 내놓는데 드는 비용은 800백만 달러 내지 1십억 달러인 것으로 추정된다. I상 임상 시험 중인 약물의 10% 미만이 승인 단계에 있다. 약물이 후기 단계에서 실패하는 2가지 주요 이유는 용량-농도 반응과 예상치 못한 안전성 현상 사이의 관계에 관한 이해 부족이다. 이러한 시나리오를 고려해 볼 때, 약물이 생체내에서 어떻게 수행되고 임상적 치료 후보의 성공을 어떻게 도울 것인지를 예측하는데 도움을 주는 가능한 도구를 갖는 것이 중요하다 (문헌 [Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)]).
약동학 (PK)은 약물의 흡수성, 분포도, 대사 및 제거 특성을 특성화한다. 약역학 (PD)은 투여된 약물에 대한 생리학적 및 생물학적 반응을 규정한다. PK/PD 모델링은 이들 2가지 과정 사이의 수학적 및 이론적 연관성을 확립하고, 보다 우수한 약물 작용을 예측하는데 도움을 제공하였다. 시뮬레이션을 통한 컴퓨터-이용 시험 설계 및 통합형 PK/PD 모델링을 많은 약물 개발 프로그램에 도입하고 있고, 그 영향력은 점차적으로 커지고 있다 (문헌 [Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)]).
PK/PD 시험은 전형적으로, 약물 개발 과정의 모든 단계에서 수행한다. 개발은 점차적으로 복잡해지고, 시간 소모적이며 비용이 많이 들기 때문에, 개발 회사들은 시작시 결함이 있는 후보를 없애기 위해 PK/PD 데이터를 보다 잘 이용하고, 임상적으로 성공할 기회가 가장 놓은 후보를 확인하고자 한다 (상기 문헌 [Lakshmi Kamath]).
PK/PD 모델링 접근 방식은 바이오마커 반응, 약물 수준 및 투여 요법 사이의 관계를 결정하는데 유용한 것으로 입증되고 있다. 약물 후보의 PK/PD 프로파일 및 이에 대한 환자의 반응을 예측할 수 있는 능력은 임상 시험의 성공에 있어 중요하다. 분자 생물학 기술에 있어서의 최근의 진보 및 다양한 질환에 대한 표적의 보다 나은 이해력은 바이오마커를 약물의 치료적 효능의 우수한 임상 지표로서 검증해 주었다. 바이오마커 검정은 약물 후보에 대한 생물학적 반응을 확인하는데 도움을 제공하였다. 일단 바이오마커가 임상적으로 검증되면, 시험 시뮬레이션을 효과적으로 모델링할 수 있다. 바이오마커는 언젠가 약물 개발에 있어서의 임상 결과를 대신할 수 있는 대용 상태를 달성할 수 있는 잠재력을 갖는다 (상기 문헌 [Lakshmi Kamath]).
말초 혈액 중의 바이오마커의 양은 인테그린 베타7 길항제를 이용한 치료에 대한 생물학적 반응을 확인하는데 사용될 수 있으므로, 후보 치료의 치료 효능에 대한 우수한 임상적 지표로서 기능할 수 있다.
약물 개발에 있어서 종래 PK/PD 모델링은 약물 용량 농도, 약물 노출 효과, 약물 반감기, 시간에 대한 약물 농도, 및 시간에 대한 약물 효과와 같은 파라미터를 규정한다. 보다 광범위하게 사용하는 경우에, 약물 모델링, 질환 모델링, 시험 모델링, 및 시장 모델링과 같은 정량적 기술이 전체 개발 공정을 뒷받침해줄 수 있는데, 위험을 명쾌히 고려하고 지식을 보다 잘 활용함으로써 보다 우수한 결정을 유도하였다. 다양한 PK/PD 모델링 도구가 약물 개발 연구에 이용가능한데, 예를 들어 파르사이트, 인크.(Pharsight, Inc., 캘리포니아주 마운틴 뷰)에 의해 개발된 윈논린(WinNonlin) 및 지식기반 서버 (Knowledgebase Server) (PKS)가 있다.
상기 기재된 명세서 및 하기 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하는데 충분한 것으로 여겨진다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재 및 하기 실시예로부터 당업자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 특허청구범위의 범주에 속할 것이다.
본 발명의 교시를 구체적 문제 또는 상황에 적용하는 것은 본 발명의 교시의 측면에서 당업자의 능력 내에 있을 것으로 이해된다.
본 발명의 추가의 상세한 내용은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 인용문헌의 개시내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1
궤양성 결장염을 앓는 환자에서 단일-용량, 용량-증량 단계에 이어서 다중용량, 병행-치료 단계로 투여되는 정맥내 및 피하 rhuMAb 베타7의 안전성, 약동학, 약역학 및 면역원성을 평가하기 위한 I상, 다중센터, 무작위, 위약-대조, 이중-맹검 연구
연구의 설명
rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)의 설명
rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)은 인간 IgG1 하위군 III VH, κ 하위군-I VL 컨센서스 서열에 기반한 인간화 모노클로날 항체이며, 인테그린 이종이량체의 β7 서브유닛에 대해 특이적으로 지정된다. 이것은 α4β7 (약 116 pM의 Kd) 및 αEβ7 (약 1800 pM의 Kd)에 고친화도로 결합하는 것으로 나타났다.
이 재조합 항체는 IgG1 항체를 대표하는 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결된 2개의 중쇄 (446개 잔기) 및 2개의 경쇄 (214개 잔기)를 갖는다. 본원에 기재된 연구의 경우에, 이것은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산되었다. 무손상, 비 글리코실화 rhuMAb 베타7분자의 분자 질량은 대략 144 kDa이었다. rhuMAb 베타7의 각각의 중쇄는 Asn297에 1개의 보존된 N 연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 이 부위에 존재하는 올리고사카라이드는 CHO 세포에서 발현된 재조합 항체에서 관찰된 것들을 대표하였으며, 아시알로, 이중안테나 G0 및 G1 글리칸인 우세한 글리코형태를 가졌다. 2개의 G0 글리칸을 함유하고 C 말단 리신 잔기를 전혀 함유하지 않는 가장 보편적인 rhuMAb 베타7 형태의 질량은 대략 147 kDa이었다.
rhuMAb 베타7은 생리학상 허용되는 완충제 중 투명 내지 약간 유백색, 무색 내지 약간 황색의 수용액으로서 제넨테크(Genentech)에 의해 공급되었다.
연구의 전반적 설계
본 최초-인간-대상 I상 연구는 무작위 (용량 코호트 내에서), 이중-맹검, 위약-대조, 단일-용량, 용량-증량 단계에 이어서 무작위 (용량 코호트를 가로질러), 이중-맹검, 위약 대조, 다중용량, 병행-치료 단계로 구성되었다. rhuMAb 베타7을 투여받은 연구의 단일-용량 단계에 참여한 환자는 다중용량 단계에 참여하도록 허용되지 않았다. 그러나, 연구의 단일-용량 단계에서 위약을 투여받은 환자는 다중용량 단계에 참여하도록 허용되었다. 궤양성 결장염을 앓는 48명의 환자가 본 연구에 참여하였다. 환자는 12주 동안 궤양성 결장염의 진단을 갖도록 요구되었다. 연구는 기준선에서 중등도 내지 중증 궤양성 결장염의 진단을 갖고, 외래 환자이고, ≥ 5점의 메이요 클리닉 점수 (MCS)를 갖는 18-70세의 환자에서 수행하였다. MCS에 대한 범위는 0 내지 12이고, 보다 높은 점수는 보다 중증의 질환 활성을 나타낸다 (문헌 [Schroeder et al., N. Engl. J. Med. 317:1625-1629 (1987)]; 또한 하기 표 1 참조). 그의 궤양성 결장염 때문에 전신적으로 편치 않고 입원 또는 수술이 요구되는 환자는 연구에 포함되지 않았다. 또한, 이들이 5-ASA, 면역억제제 (아자티오프린 또는 6-메르캅토퓨린) 또는 스테로이드를 사용하는 표준 요법에 반응하지 않은 중등도 내지 중증 질환을 가졌다는 점에서, 적격의 환자는 연구자에 의해 생물학적 요법에 대한 후보인 것으로 간주되었다.
<표 1> 궤양성 결장염 활성의 평가를 위한 메이요 클리닉 채점 시스템.
Figure pct00002
a 각각의 환자는 대변 빈도의 이상의 정도를 확립하기 위해 그 또는 그녀 자신의 대조군의 역할을 한다.
b 1일 출혈 점수는 그날의 가장 심한 출혈을 나타낸다.
c 의사의 전체적 평가는 3개의 다른 기준, 환자의 복부 불편 및 전반적 행복감의 1일 재수집, 및 다른 관찰, 예컨대 물리적 소견 및 환자의 수행 스테이터스를 확인한다.
연구의 단일-용량 용량-증량 단계의 목적은 UC를 앓는 환자에서 rhuMAb 베타7 투여의 안전성 및 허용성을 평가하는 것이었다. 이 단계에서, 환자를 5개의 상승 용량 코호트 (코호트 A-F; 1.0 mg/kg SC의 용량을 투여받는 본래-계획된 코호트 E가 생략되었지만, 여기서 명칭 A-F는 유지되었음에 주목함)에 순차적으로 등록시키고, 단일 정맥내 (IV) 용량 또는 4개의 용량 수준 (0.3, 1.0, 3.0 또는 10.0 mg/kg) 중 1개의 피하 (SC) 용량으로 처리하였다 (표 2 참조).
코호트당 5명의 환자를 등록에 대해 계획하였다. 각각의 코호트 내에서, 환자를 rhuMAb 베타7 또는 위약을 투여받도록 무작위로 할당하였다. 단일-용량 단계의 경우에, 용량 증량 결정은 IV 경로를 통해 연구 약물을 투여받는 코호트 (코호트 A, B, C 및 D)의 임상 안전성 평가에 기반하였다. 인간에서의 다른 모노클로날 항체의 SC 투여에 의한 이전의 경험에 기반하여, SC 투여 후의 노출은 IV 투여 후에 달성된 노출보다 낮을 것으로 예상하였다.
임의의 잠재적 급성 독성 (예를 들어, 과민 반응, 주입 반응 또는 혈청 질병-유형 반응)은 14-일의 안전성 추적 기간 동안 나타나고 아마도 해결될 것으로 예상하였다. 단일-용량 단계에서의 투여의 완결 후에, 안전성 및 약동학 (PK) 데이터를 다중용량 단계를 시작하기 전에 평가하였다.
다중용량 병행-치료 단계 (코호트 G-J)는 단일-용량 단계의 코호트 F (3.0 mg/kg SC)에서 치료받은 마지막 환자에 대한 투여가 완료된지 대략 10주 후에 시작되었다. 이 10주 동안, PK 및 임상 안전성 데이터를 연구의 단일-용량 단계에 대해 검토하였다. 다중용량 단계에 대한 병행 설계 및 제안된 용량 범위는 단일 용량 단계로부터의 > 10 mg/kg의 최대 허용 용량 (MTD)에 좌우되었고, 시노몰구스 연구에 기반하여 기획된 인간 약동학이 뒷받침된다는 것을 확실히 하기 위해 단일 용량 단계에서의 PK 데이터의 리뷰시 확인되었다 (하기 참조). 다중용량 단계에서 3주기 동안 매 4주마다 IV 투여된 4.0 mg/kg의 최대 용량은 시노몰구스 원숭이 독성학 데이터로부터 결정된 안전 계수 (국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Accepted Article, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x]) 이내였고, 여기서 안전 계수는 인간 등가 용량 (HED)를 기반으로 하여 16배였고, 곡선하 면적 (AUC)에 의해 측정된 노출을 기반으로 하여 21배였다 (하기 참조). 다중용량 단계의 1차 목적은 제안된 용량 범위 (0.5-4 mg/kg)를 가로질러 다중 투여의 안전성을 특성화하는 것, 및 궤양성 결장염을 앓는 환자군에서 반복 투여에 의한 면역원성에 대한 가능성을 평가하는 것이었다. 연구의 이 부분에서, 환자를 4개의 용량 코호트 중 1개에서 rhuMAb 베타7 또는 위약을 투여받도록 무작위로 할당하였다 (표 2 참조). rhuMAb 베타7 또는 위약을 3주기 동안 매 4주마다, 제1, 29 및 57일에 피하로 (0.5 mg/kg, 1.5 mg/kg 또는 3.0 mg/kg) 또는 정맥내로 (4.0 mg/kg) 투여하였다 (표 2 참조). 4.0 mg/kg 수준에서의 노출 안전성의 평가는 균일 투여로의 rhuMAb 베타7의 투여를 고려하기 위해 중요하였다.
유해 사례, 심각한 유해 사례 및 실험실 이상의 발생률 및 성질을 평가하였다. 안전성을 유해 사례에 대한 미국 국립 암 연구소 공통 독성 기준 (NCI CTCAE), v3.0에 따라 등급화된 유해 사례의 발생률에 의해 평가하였다. 환자를 단일-용량 단계 동안 18주 동안 (제127일까지) 및 다중용량 단계 동안 28주 동안 (제197일까지)의 안전성에 대해 추적하였다. 혈액 샘플을 PK, 탐색적 PD 및 항-치료 항체 (ATA) 평가를 위해 수집하였다.
<표 2> 연구 코호트
Figure pct00003
IV = 정맥내; SC = 피하.
a연구 약물을 3주기 동안 매 4주마다 1회, 제1, 29 및 57일에 투여하였다.
용량-제한 독성 (DLT)
DLT를, 연구자 또는 스폰서에 의해 rhuMAb 베타7과 임의의 합리적인 가능한 관계를 갖는 것으로 결정된, 연구의 단일-용량 단계 동안 연구 약물 투여의 14일 이내에 발생하는 임의의 NCI CTCAE 등급 ≥ 3 유해 사례로서 정의하였다. 이 카테고리 내에서, 주입 동안, 또는 주입을 완결시킨 후 24시간 이내에 발생하는 등급 3 주입 관련 독성 (예를 들어, 알레르기 반응/과민증, 열, 통증, 기관지연축, 천명 또는 저산소증)을 DLT로 간주하였다. 궤양성 결장염의 악화는 DLT로 간주하지 않았다.
MTD를, 그 용량 수준 미만에서 rhuMAb 베타7로 치료받은 2명 이상의 환자가 상기 정의된 바와 같은 DLT를 경험하는 용량 수준으로서 정의하였다. 각각의 6개의 단일-용량 코호트에서 1명 이하의 환자가 DLT를 경험한 경우에, MTD를 정의하지 않았고, 최고 시험 용량은 10 mg/kg이다.
연구 설계에 대한 근거
본 연구는 단기간 및 중간 기간에 걸쳐 rhuMAb 베타7의 안전성, 허용성, PK 프로파일, 면역원성 및 탐색적 PD 마커를 평가하였다.
2-단계 설계에 대한 근거
단일-용량 단계를 주로 급성 독성을 평가하기 위해 설계하였다. 잠재적 독성의 이 유형의 예는 SC 투여 후의 과민 반응, 혈청 질병 및 국부 조직 자극을 포함한다. 독성의 이 유형은 그의 투여 경로에 관계없이 임의의 단백질 치료제에 의해 발생할 수 있다. rhuMAb 베타7에 대한 표적이 인간에서의 총 림프구 집단의 작은 비율 (대략 2%-10%)을 차지하는 림프구의 β7고 소화관-귀소 하위집단일지라도 (문헌 [Rott et al., J Immunol 156:3727-36, 1996]), 임의의 주입 반응을 면밀히 모니터링하였다.
다중 용량 투여는 28주의 추적과 함께 rhuMAb 베타7의 반복 SC 및 IV 용량에 의한 독성의 평가를 허용하였다. IBD 집단에서의 면역원성에 대한 가능성을 보다 잘 평가하기 위해, 연구 약물을 다중용량 단계에서 3주기 동안 매 4주마다 1회 환자에게 투여하였다. 또한, 다중용량 약동학, 탐색적 PD 마커 및 생물학적 활성의 증거의 평가는 연구의 다중-용량 단계 동안 가능하게 되었고, II상 연구에 대한 용량 및 용량 간격의 선택을 용이하게 하였다 (하기 참조).
연구 집단에 대한 근거
본 연구에서의 환자는 기준선에서 ≥ 5의 MCS를 갖는 궤양성 결장염을 앓도록 요구되었으며, 이들이 5-ASA 약물, 면역억제제 (아자티오프린 또는 6 메르캅토퓨린) 또는 스테로이드를 사용하는 표준 요법에 대해 부적절한 반응을 나타낸 중등도 내지 중증 질환을 가졌다는 점에서, 연구자에 의해 생물학적 요법에 적격인 것으로 간주되었다. 임상적으로 유의한 기회 감염, 만성 또는 잠재성 감염, 활성 전신 감염 또는 WBC 카운트의 억제의 병력을 갖는 임의의 환자는 연구에 참여하는 것으로부터 제외되었다. 고-용량 코르티코스테로이드 및 면역억제 약물을 사용하는 병용 치료에 의해 도입된 감염에 대한 증가된 취약성의 잠재적 위험을 최소화하는 동안, 이 환자 집단은 이 치료제에 대한 궁극적 표적 집단을 가장 잘 추정하도록 선택되었다.
출발 용량, 용량 범위 및 투여 요법에 대한 근거
I상 용량의 선택은 비임상 안전 계수, 기획된 인간 약동학 및 탐색적 비임상 PD 데이터의 조합에 기반하였다. 다중 투여는 반복 투여의 잠재적 면역원성을 결정하고 rhuMAb 베타7의 누적 노출의 안전성을 평가하기 위해 본 연구에 포함되었다. 제안된 용량 수준 및 빈도는 궤양성 결장염을 앓는 환자에서의 PK 프로파일, 탐색적 PD 프로파일 및 생물학적 활성의 임의의 증거 사이의 관계를 평가하기 위한 기회를 제공하였다. 이는 II상 개념-증명 연구에 대한 적절한 용량 범위 및 용량 빈도의 선택을 용이하게 하였다 (하기 참조).
시노몰구스 원숭이로부터의 rhuMAb 베타7 PK 데이터를 이용하여 β7 수용체의 포화를 결정하였다 (국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Accepted Article, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x]). 1, 3 및 10 mg/kg rhuMAb 베타7의 단일 용량 투여에 따라 수집된 데이터는 3 mg/kg 미만에서의 비선형 약동학을 시사하였으며, 이는 β7 수용체-매개 클리어런스를 완전히 포화시키기 위해 3 mg/kg 이상의 용량이 필요하다는 것을 나타낸다. 따라서, 시노몰구스 원숭이에서의 1 mg/kg의 용량은 비-수용체-포화 용량인 것으로 보였고; 이러한 용량에서의 상응하는 평균 관찰된 최대 혈청 농도는 25.1 μg/mL였다. 시노몰구스 원숭이에서의 1 mg/kg 비-포화 용량에 대한 인간 등가 용량 (HED)은 대략 0.3 mg/kg이고; 이러한 0.3 mg/kg의 제안된 출발 단일 용량은 > 10 μg/mL의 혈청 농도를 생성하는 것으로 예상되지 않을 것이며, 따라서 포화 용량이 아니어야 한다.
인간에서의 제안된 출발 용량, IV 주입에 의해 투여되는 0.3 mg/kg rhuMAb 베타7은 연구 약물 투여의 결과로서의 임의의 급성 반응을 평가하기 위해 선택되었고, 시노몰구스 원숭이에서의 비임상 독성학 연구에 의해 뒷받침되었다 (국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Accepted Article, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x]). 출발 용량을 위한 단일-용량 안전 계수를, 12주 동안 매주 1회 제공되는 용량으로 ≥ 50 mg/kg의 NOAEL (국제 특허 공개 번호 WO2009140684), 기획된 인간 클리어런스 (CL) 및 기획된 인간 중심 구획 부피 (V1)를 기반으로 하여 추정하였다. 안전 계수는 HED를 기반으로 하여 53.7, 노출 (AUC)을 기반으로 하여 76.2, 용량을 기반으로 하여 167, 및 예상된 최대 농도 (Cmax)를 기반으로 하여 175이다 (표 3 참조). 총 3회의 용량에 대한 4 mg/kg IV의 가장 높은 제안된 다중용량 요법에서, 안전 계수는 HED를 기반으로 하여 16.1, AUC를 기반으로 하여 21.1, 용량을 기반으로 하여 50, 및 Cmax를 기반으로 하여 34.4이다 (표 3 참조).
MABEL보다 오히려 NOAEL을 이용하여 0.3 mg/kg의 출발 용량을 선택하는 것에 대한 근거는 여러 인자를 기반으로 한다. 첫째로, α4β7은 어떠한 급성 심각한 유해 사례도 없이 나탈리주맙 및 MLN02 (또한 MLN0002 또는 베돌리주맙으로 지칭됨) 둘 다에 의해 이전에 임상에서 표적화되었기 때문에 (문헌 [Feagan et al., N Engl J Med 352:2499-507 (2005); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)]), 인테그린을 표적화하는 것은 신규하지 않다. 둘째로, rhuMAb 베타7의 작용의 제안된 메카니즘은 소화관으로의 림프구 트래픽킹을 차단하는 것 및 아마도 상피에서의 림프구의 체류를 차단하는 것이다. 이 작용의 메카니즘은 이전의 인테그린 길항제에 의한 급성 유해 사례와 연관된 것으로 나타나지 않았다. 추가로, rhuMAb 베타7은 어떠한 명백한 효능작용 특성을 나타내지도 않았고, 시험관내에서 시토카인 방출을 유도하지도 않았다. 최종적으로, rhuMAb 베타7은 10 μg/mL의 농도까지 시험관내에서 어떠한 항체-의존성 세포 매개 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성 활성도 나타내지 않았다. 또한, 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 완결된 비임상 연구에서 말초 세포 하위세트에서의 변화의 증거가 전혀 없었다. 따라서, 0.3 mg/kg은 궤양성 결장염에서 수행된 이 최초 인간 대상 시험에 대한 합리적 출발 용량인 것으로 간주되었다.
<표 3> rhuMAb 베타7에 대한 단일-용량 및 반복-용량 안전 계수 추정치.
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AUC = 혈청 농도-시간 곡선 하 면적; AUCinf = 시간 0 내지 무한대의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적; CL = 클리어런스; Cmax = 관찰된 최대 농도; HED = 인간 등가 용량; IV = 정맥내; NOAEL = 유해 효과가 전혀 관찰되지 않는 수준.
a최저 단일 용량은 0.3 mg/kg IV이다. 최고 단일 용량은 10 mg/kg IV이다. 최고 반복 용량은 3회의 총 용량 IV에 대해 매 4주마다 4 mg/kg IV이다 (병행 등록).
b안전 계수 = HED/용량h, 여기서 h는 인간이다. 시노몰구스 원숭이 NOAEL의 HED로의 전환은 체중에 기반하였으며, NOAEL을 3.1로 나눔으로써 계산하였다. ≥ 50 mg/kg x 12의 NOAEL을 가정하여, HED는 단일-용량 안전 계수에 대해 16.1 mg/kg 및 반복-용량 안전 계수에 대해 193 mg/kg (16.1 mg/kg x 12)이다.
c안전 계수 = 용량c/용량h, 여기서 c는 시노몰구스 원숭이이고, h는 인간이다. ≥ 50 mg/kg x 12의 NOAEL을 가정하여, 용량c는 단일-용량 안전 계수에 대해 50 mg/kg 및 반복-용량 안전 계수에 대해 600 mg/kg (50 mg/kg x 12)이다.
d안전 계수 = AUCc/AUCh, 여기서 c는 시노몰구스 원숭이이고, h는 인간이다. 단일-용량 안전 계수의 경우에, AUCc는 관계식 AUCc = 용량c/CLc를 이용하여 계산하였다. 2.93 mL/일/kg의 CLc는 시노몰구스 원숭이에서 25 mg/kg의 4회의 매주 용량 후의 평균 CL을 계산함으로써 결정하였다. ≥ 50 mg/kg의 NOAEL을 가정하여, AUCc는 단일-용량 안전 계수에 대해 17065 일·μg/mL였다. 반복-용량 안전 계수의 경우에, 188846 일·μg/mL의 AUCc는 50 mg/kg x 12 IV 용량군에 대해 기하 평균 AUCinf를 계산함으로써 결정하였다. AUCh는 관계식 AUCh = 용량h/(CLh)를 이용하여 추정하였다. CLh의 가장 보존적인 추정치를 이용하여 노출-기반 안전 계수를 계산하였다. CLh는 종 불변-시간 방법 (문헌 [Dedrick 1973])을 이용하여 추정하였다. 0.3 mg/kg 단일 용량, 10 mg/kg 단일 용량, 및 3회의 4 mg/kg 용량의 IV 투여에 대한 추정된 AUCh는 각각 224, 7463 및 8955 일·μg/mL였다.
e안전 계수 = Cmax -c/Cmax -h, 여기서 c는 시노몰구스 원숭이이고, h는 인간이다. Cmax-c는 시노몰구스 원숭이에서 최대 관찰된 농도의 기하 평균이다. ≥ 50 mg/kg의 NOAEL을 가정하여, 50 mg/kg의 단일 IV 투여 후에 관찰된 기하 평균 C0 -c는 1315 μg/mL였다. 50 mg/kg에서의 12회의 IV 용량 후에 관찰된 기하 평균 Cmax -c는 3444 μg/mL였다. Cmax -h는 인간에서 다른 IgG1 항체에 대해 관찰된 것과 유사한 것으로 추정 및 결정되었다. 0.3 mg/kg 단일 용량, 10 mg/kg 단일 용량, 및 3회의 4 mg/kg 용량의 IV 투여에 대한 추정된 Cmax -h는 각각 7.5, 250 및 100 μg/mL였다.
f안전 계수는 용량/V1로서 추정된 예상된 Cmax -h에 기반하며, 이는 총 3회의 용량 동안 매 4주마다 제공된 4 mg/kg의 반복 용량 후에 축적이 전혀 없음을 가정한다.
표적 용량 범위 및 투여 요법의 선택은 1-10 μg/mL의 표적 농도 초과의 정상 상태 최저 수준을 유지하도록 기획된 시뮬레이션된 혈청 rhuMAb 베타7 농도-시간 프로파일을 기반으로 하여 추정하였다. 이 표적 농도는 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서의 rhuMAb 베타7의 생체내 연구로부터의 결과를 기반으로 하며, 이는 1-10 μg/mL의 최저 농도가 순환성 말초 혈액 T-세포 상의 β7 수용체의 점유를 유지하기 위해 필요하였음을 보여주었다. 순환성 말초 혈액 T-세포 상의 β7 수용체의 점유는 I상 연구에서 평가된 탐색적 PD 마커이다. 이 마커가 임상적 활성과 어떻게 관련될 것인지가 알려질 때까지, 1-10 μg/mL 표적 농도의 임상 효능에 대한 관련성도 또한 알려지지 않는다.
예정된 용량-증량 계획은 넓은 범위의 용량 및 노출에 걸쳐 투여될 때 rhuMAb 베타7의 안전성을 평가하는 능력을 최적화할 것으로 예상되었다. 매 4주마다의 IV 투여 후의 연구 약물의 과도하거나 예상치 못한 축적은 예견되지 않았다.
결과 척도
본 연구에 대한 1차 결과 척도는 하기와 같았다: 혈액학, 임상 화학 및 요분석 시험 결과에 기반하여, (1) 유해 사례의 발생률, 성질 및 중증도 (NCI CTCAE, 버전 3.0에 따라 등급화됨); 및 (2) 실험실 이상의 발생률 및 성질.
본 연구에 대한 2차 결과 척도는 열거된 파라미터를 비롯하여, rhuMAb 베타7의 투여 후의 혈청 농도-시간 프로파일로부터 유도된 PK 프로파일 및 파라미터였다: Cmax; 피하로 제공된 약물에 대한 CL 또는 명백한 CL (CL/F); 피하로 제공된 약물에 대한 분포의 부피 (V) 또는 명백한 분포의 부피 (V/F); AUC; 제거 반감기 (t1/2); 용량 비례성; 및 SC 생체이용률. 2차 결과 척도는 또한 각각의 환자에 대해 투여 전후에 다중 시점에 수득된 샘플에 기반하여, rhuMAb 베타7에 대해 지정된 항체의 발생률을 포함한다.
특정의 탐색적 결과 척도를 또한 조사하였다. 이들은 림프구 하위세트의 유동 세포측정법에 의해 측정된 PD 마커에서의 기준선으로부터의 변화 (이는 rhuMAb 베타7에 의한 수용체 점유, 관련 세포 표면 β7 수용체 수준, 및/또는 β7 인테그린을 발현하는 T-세포 하위세트를 포함할 수 있음); 및 변형된 MCS에서의 기준선으로부터의 변화를 포함한다.
연구 집단
중등도 내지 중증 궤양성 결장염을 앓고 ≥ 5의 MCS를 갖는 외래 환자를 연구에 참여하도록 선택하였다. 환자가 그의 질환의 급성 관리를 위해 고-용량 코르티코스테로이드를 투여받은 경우에, 연구 약물 투여 전에 최소 2주 동안 용량을 프레드니손 또는 프레드니손 등가물 ≤ 20 mg/일로 감소시켰다.
연구 동안 언제든지, 그의 궤양성 결장염의 급성악화를 갖는 환자는 스테로이드 (IV, 경구 및/또는 국소)를 사용하는 구조 요법을 갖도록 허용하였다. 5-ASA (경구 또는 국소) 및/또는 면역억제제 (즉, 아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 또는 메토트렉세이트)의 추가 또는 용량에서의 증가를 또한 구조 요법으로서 허용하였다. 항-TNF 작용제 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙), 티사브리(Tysabri)® (나탈리주맙), 시클로스포린, 타크롤리무스 또는 임의의 연구 작용제의 사용을 연구의 과정 동안 구조 요법으로서 허용하지 않았다.
궤양성 결장염 급성악화에 대한 구조 요법을 투여받은 연구의 다중용량 단계에 있는 환자는 연구 약물의 추가의 용량을 투여받지 않았지만, 안전성, PK, 탐색적 PD 및 ATA 평가에 대한 추적을 계속 겪었다.
이전의 기회 감염의 빈도 및 중증도 및 스크리닝에서의 말초 혈액 중 감소된 WBC 카운트의 증거에 기반하여, 의심되는 임상적으로 유의한 면역 억제를 앓는 임의의 환자는 연구에 포함되지 않았다. 환자의 일부가 인플릭시맙을 사용하는 선행 치료를 받았을 수 있기 때문에, 환자는 본 연구에서의 치료를 개시하기 전에 적어도 12주 동안 항-TNF 요법을 중지하도록 요구되었다. 인플릭시맙은 8-9일의 반감기를 가지며; 따라서, 12주 (대략 10 반감기)의 세척 기간은 생물학적으로 확고한 환자 안전성의 약물 클리어런스 및 임의의 rhuMAb 베타7-연관 유해 사례의 공정한 평가에 적당한 것으로 간주되었다.
연구에 참여하기 전에, 환자를 구체적으로 감염, 특히 JC 바이러스 (혈장 JCV DNA에 의해 측정됨), 결장의 시토메갈로바이러스 (CMV) 감염 (결장 생검에 의함), 호흡기 감염, 연충 감염 또는 기생충 감염의 임의의 증거에 대해 스크리닝하였다. 환자는 임의의 활성 감염이 발견된 경우에 제외되었다.
포함 기준
환자는 연구 참가에 적격이기 위해 하기 기준을 충족시켜야 한다: (1) 서면 사전 동의를 제공할 수 있고 그럴 의향이 있음; (2) 18-70세; (3) 생식 능력을 갖는 남성 및 여성: 연구 시작으로부터 연구 약물의 최종 용량의 최소 4개월 (대략 5 반감기) 후까지 믿을 만한 피임 방법 (예를 들어, 호르몬 피임제, 패치, 질 고리, 자궁내 장치 또는 물리적 장벽)을 이용할 의향이 있음; (4) 스크리닝에서 MCS ≥ 5점을 갖는 중등도 내지 중증 궤양성 결장염의 진단 (상기 참조); (5) 스크리닝 전의 6개월 이내에 임상적으로 유의한 이상이 없는 흉부 X선; (6) 이들이 5-ASA 약물, 면역억제제 (아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 또는 메토트렉세이트) 또는 스테로이드를 사용하는 표준 요법에 대한 부적절한 반응을 나타낸 중등도 내지 중증 질환을 갖는다는 점에서, 연구자의 의견으로 생물학적 요법을 투여받기에 적격임. 미국에서, MD 단계에 참여하고 있는 환자는 면역억제제 및 항-TNF 요법 둘 다에 대해 부적절한 반응 또는 불내성을 나타내어야 함; (7) ≥ 12주의 스크리닝 시점에서의 질환 지속시간 (의사에 의한 첫번째 진단 후); (8) 고-용량 코르티코스테로이드 투여중인 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 2주 동안 프레드니손 또는 프레드니손 등가물 ≤ 20 mg/일로 감소된 용량을 가져야 함. 국소 코르티코스테로이드 및 국소 5 ASA 제제는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 1주 동안 중단되어야 함; (9) 경구 5-ASA 투여중인 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 4주 동안 안정한 용량을 투여중이거나 또는 중지하여야 함; (10) 이전에 항-TNF 요법을 투여받은 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 12주 동안 요법을 중지하여야 함; (11) 단일-용량 단계를 위한 면역억제제 요법: 미국에서: 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하는 시점에 면역억제제 요법 (즉, 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린 또는 메토트렉세이트)을 중지하여야 함. 미국 외에서: 연구자의 판단으로, 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하는 시점에 면역억제제 요법 (즉, 아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 또는 메토트렉세이트)을 중지할 수 있거나, 또는 이들 요법을 연구 동안 안정한 용량으로 계속 투여받을 수 있음; (12) 다중-용량 단계를 위한 면역억제제 요법: 미국에서: 연구자의 판단으로, 환자는 제1일에 연구 약물을 처음 투여하는 시점에 면역억제제 요법 (아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 또는 메토트렉세이트)을 중지할 수 있거나, 또는 이들 요법을 연구 동안 6주 (제43일)까지 안정한 용량으로 계속 투여받을 수 있음. 그러나, 제43일에 모든 환자는 연구의 MD 단계의 나머지 (제197일까지) 동안 이들의 면역억제제 요법을 중지하여야 함. 또한, 스테로이드를 투여받고 있는 환자의 경우에, 임상적 반응을 달성한 환자에서 제57일에, 또는 임상적 반응이 달성될 때 후속 방문에서 감량을 시작하여야 함. 임상적 반응은 연구자에 의해 판단될 것이며, 제43일 굴곡성 S상결장경검사를 고려할 것임. 미국 외에서: 연구자의 판단으로, 환자는 제1일에 연구 약물을 처음 투여하는 시점에 면역억제제 요법 (아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 또는 메토트렉세이트)을 중지할 수 있거나, 또는 이들 요법을 연구 동안 안정한 용량으로 계속 투여받을 수 있음.
배제 기준
하기 기준 중 임의의 것을 충족시킨 환자는 연구 참가로부터 제외되었다. UC와 관련된 배제 기준은 다음을 포함하였다: (1) 궤양성 결장염의 중증도로 인한 입원 요구; (2) 중등도 내지 중증 빈혈 (헤모글로빈 < 10 g/dL); (3) 연구자의 판단으로, 연구의 과정 동안 프레드니손 또는 프레드니손 등가물 > 20 mg/일을 사용하는 치료를 요구할 가능성이 있는 궤양성 결장염의 임의의 징후.
전반적 건강과 관련된 배제 기준은 다음을 포함하였다: (1) 임신 또는 수유; (2) 말초 정맥 접근성의 결핍; (3) 연구자의 의견으로, 연구 프로토콜을 준수할 능력이 없음; (4) 스크리닝에서의 충란 또는 기생충에 대한 양성 대변 시험, 병원체에 대한 양성 대변 배양물, 또는 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)에 대한 양성 대변 독소 검정; (5) 유의한 제어되지 않는 질환, 예컨대 신경계, 심장, 폐, 신장, 간, 내분비 또는 GI 장애; (6) 유의한 스크리닝 ECG 이상, 예컨대 급성 심근경색, 완전한 좌측 다발 갈래 차단, 2급 심장 차단 또는 완전 심장 차단의 증거; (7) 부족하게 제어된 당뇨병 (글리코실화 헤모글로빈 [HbA1c] > 8.0%); (8) 연구의 과정 동안 프레드니손 또는 프레드니손 등가물 > 20 mg/일을 사용하는 치료를 요구할 수 있는 궤양성 결장염 이외의 상태 (예를 들어, 천식); (9) 피부의 완전히 절제된 기저 세포 암종 또는 편평 세포 암종을 제외한 악성종양의 병력; (10) 손상된 신장 기능 (크레아티닌 > 1.5 x 정상 상한치 [ULN]); (11) 손상된 간 기능 (트랜스아미나제 > 2.5 x ULN, 또는 연구자에 의해 임상적으로 유의한 것으로 판단된 합성 기능 시험에서의 이상).
감염에 대한 위험 인자와 관련된 배제 기준은 다음을 포함하였다: (1) 선천성 면역 결핍; (2) 실험실 정상 하한치 미만의 혈청 이뮤노글로불린 IgA 및 IgG (IgG 하위부류 2 및 3 포함); (3) 혈청 JCV DNA에 대한 양성 시험; (4) HIV 또는 B형 또는 C형 간염의 활성 또는 이전 감염을 나타내는 항체에 대한 양성 시험; (5) 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 (EBV)에 대한 음성 IgG 역가의 존재 하의 양성 IgM 항체 역가; (6) CMV에 대해 양성인 장 점막 생검; (7) 잠재성 미코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis) 감염에 대한 양성 스크리닝 시험, 정제된 단백질 유도체 (PPD) 피부 검사 또는 실험실 검정, 예컨대 콴티페론(QuantiFERON)®-TB 골드 (QFT-G, 또는 등가의 혈액 시험)는 허용되는 스크리닝 검정임. QFT-G (또는 등가의 혈액 시험)는 바실루스 칼메트-게랭(Bacille Calmette-Guerin) (BCG)으로 이전에 예방접종된 환자에서 이용되어야 함. 음성 PPD 시험이 스크리닝 전 3개월 이내에 문서화된 경우에, 이는 반복될 필요가 없음; (8) 중증 전신 박테리아, 진균 또는 기생충 감염의 병력 (연간 2회 초과의 입원 또는 연간 2회 초과의 IV 항생제 과정); (9) 연구 치료의 개시 전 6개월 이내의 침습성 진균 감염, 예컨대 칸디다(Candida) 또는 아스페르길루스의 병력 (아구창 또는 다른 표재성 진균 감염 제외); (10) 연구 치료의 개시 전 12주 이내의 중증 헤르페스 (단순 유형 1, 단순 유형 2, 또는 조스터) 감염 또는 재활성화의 병력, 또는 헤르페스의 빈번한 재발 (연간 2회 초과); (11) 연구 치료의 개시 전 12주 이내의 임의의 다른 기회 감염의 병력; (12) PML의 병력; (13) 감염의 임의의 현재 또는 최근 (연구 치료의 개시 전 4주 이내) 신호 또는 증상; (14) 연구 치료의 개시 전 4주 이내에 경구 항생제를 투여받거나, 또는 연구 치료의 개시 전 8주 이내에 IV 항생제를 투여받음; (15) 스크리닝 전 4주 이내에 살아있는 약독화된 백신을 투여받음; (16) 스크리닝 전 4주 이내에 입원함.
의약과 관련된 배제 기준은 다음을 포함하였다: (1) 스크리닝 전 12주 이내에 (또는 연구용 제품의 5 반감기 이내에, 어느 쪽이든 보다 큰 쪽으로) 임의의 연구용 치료를 받음; (2) 본 연구의 SD 단계를 완결시켰지만, rhuMAb 베타7을 투여받지 않은 (즉, 위약을 투여받음) 환자는 MD 단계에 참여하는 것으로부터 제외되지 않을 것임; (3) 스크리닝 전 12주 이내에 임의의 생물학적 요법을 투여받음; (4) 혈소판감소증 (혈소판 카운트 < 75,000/μL), 호중구감소증 (절대적 호중구 카운트 < 1500/μL), 또는 림프구감소증 (절대적 림프구 카운트 < 800/μL); (5) 연구 치료의 개시 전 3개월 이내에 시클로스포린 또는 타크롤리무스 (FK506)를 투여받음.
검정 방법
JCV DNA 평가
환자를 JCV DNA 디텍트R(DetectR)™ 정량적 검정 (#8145)을 이용하여 기준선에서, 이어서 연구 동안 매 4주마다 JCV DNA 시험하였고, 양성 시험을 80 카피/mL 이상으로서 분류하였다. 정량적 JCV DNA 검정 (JCV DNA 울트라콴트(Ultraquant)™ 정량적 검정 [#8147])을 연구 동안 JCV DNA-양성이 된 환자에 대해 수행하였다. 본 검정은 80 카피/mL의 보다 낮은 검출 한계를 갖는다.
약동학적 및 항-치료 항체 (ATA) 평가
혈청 샘플을 rhuMAb 베타7의 약동학의 결정 및 특성화를 위해, 그리고 ATA의 평가를 위해 모든 환자로부터 수득하였다. 임상 샘플에 대한 rhuMAb 베타7 및 ATA의 혈청 수준을 하기 기재된 시험 프로그램의 일부로서 면역측정 방법에 의해 검사하였다.
ATA에 대한 시험 프로그램은 ATA 시험에 대한 전반적 가이드라인을 따랐다 (문헌 [Mire-Sluis et al. J Immunol Methods 289:1-16 (2004)]). ATA에 대한 시험 프로그램은 2개의 단계를 가졌다: 스크리닝 단계 및 특성화 단계. 스크리닝 단계는 혈청 샘플의 초기 스크리닝 시험, 초기 스크리닝에서 양성으로 시험된 것들에 대한 확인성 시험, 및 확인된 양성 샘플의 적정을 가졌다. 양성 혈청을 가능한 향후 사용을 위해 저장하였다. 스크리닝 단계 검정을 검증하였다. rhuMAb 베타7의 높은 혈청 수준이 ATA의 검출을 방해할 것으로 예상하였기 때문에, 워시아웃 샘플을 rhuMAb 베타7의 최종 용량의 투여 후에, 약물 수준이 검정을 방해할 것으로 예상된 수준 미만으로 떨어질 것으로 예상되었을 때 수득하였다.
약동학적 검정
비색 검출 시스템을 이용하는 샌드위치 ELISA를 인간 혈청에서 rhuMAb 베타7 (PRO145223)을 정량화하기 위해 검증하였다. 마이크로타이터 플레이트를 rhuMAb 베타7을 포획하기 위해 1.0 μg/mL의 항-rhuMAb 베타7 항체로 코팅하였다. 희석된 샘플, 표준물 및 대조군을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 후속적으로, 비오티닐화 항-rhuMAb 베타7 및 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 스트렙타비딘을 검출을 위해 첨가하고, 인큐베이션하였다. 퍼옥시다제 기질 (테트라메틸 벤지딘)을 첨가하여 색상을 발현시키고, 반응을 1 M 인산을 첨가함으로써 중지시켰다. 플레이트를 검출 흡광도에 대해 450 nm에서, 그리고 참조 흡광도에 대해 620 또는 630 nm에서 판독하였다. 본 검정의 최소 정량화가능 농도는 12.5 ng/mL였다.
항-치료 항체 검정
항체 가교 전기화학발광 검정 (ECLA)을 인간 혈청에서 PRO145223 (rhuMAb 베타7)에 대한 항체를 검출하기 위해 검증하였다. 검정은 직접 PRO145223에 대한 항체를 포획하기 위해 비오틴에 접합된 PRO145223 및 술포-태그에 접합된 PRO145223을 사용하였다. 2 μg/mL의 비오티닐화 rhuMAb 베타7 접합체 및 2 μg/mL의 술포-태그 rhuMAb 베타7 접합체를 96-웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트 (코닝(Corning))에 첨가하였다. 후속적으로, 희석된 샘플 및 대조군을 마이크로플레이트에 첨가하고, 밤새 접합체와 공동-인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 코팅된 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)® (MSD; 메릴랜드주 게이더스버그) 플레이트를 또한 2℃-8℃에서 밤새 검정 희석물로 차단하였다. 이어서, 폴리프로필렌 플레이트로부터의 샘플을 차단된 MSD 플레이트로 옮기고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, MSD 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하였다. MSD 2x 판독 완충제 T를 MSD 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 6000 판독기 상에서 판독하였다. 항체 역가 값을 로그 역가 데이터 축소 프로그램에 의해 결정하였다.
검정 검증 동안, 최소 보고가능 역가는 다음인 것으로 결정되었다: Log10(최소 희석) = 1.30 역가 단위.
약역학적 평가
말초 혈액 샘플을 환자로부터 얻고, 탐색적 PD 마커를 표준 유동 세포측정법 방법을 이용하는 말초 혈액 림프구 하위세트의 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 실시간으로 측정하였다. 데이터를 모든 샘플을 측정한 후에 각각의 코호트에 대해 분석하였다.
PE (피코에리트린) 접합된 항-베타7 항체 (비-경쟁적 항체)와 함께 투여-전 및 투여-후에 이용가능한 유리 부위를 검출하기 위해 PE 접합된 rhuMAb베타7 (경쟁적 항체)을 사용하여 베타7 점유 및 발현을 평가하는 베타7 검정을 설계하였으며, 이는 rhuMAb베타7의 존재에 의해 억제되지 않았고, 투여 동안 총 베타7 발현의 평가를 제공하였다.
간략하게, 100mL 나트륨 헤파린 항응고화된 전혈을 얼음 상의 적절하게 라벨링된 염색 튜브에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 적절한 항체 칵테일을 함유하는 칵테일을 적절한 튜브에 첨가하고, 얼음 상에서 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 2% 정상 소 혈청을 함유하는 포스페이트-완충 염수로 세척한 다음, 1% 파라포름알데히드 중에 최종적으로 재현탁시키고, 벡톤 디킨슨 팩스칼리버(FACSCalibur) 유동 세포측정기 상에서 수득할 때까지 2-8℃에 보관하였다. 튜브를 50,000개 총 사건의 중지 카운트로 수득하였다.
결과
단일 용량 단계 및 다중용량 단계 둘 다에 대한 환자 기준선 특성을 하기 2개의 표에 나타내었다.
<표 4> SAD 단계에 대한 환자 기준선 특성.
Figure pct00005
<표 5> MAD 단계에 대한 환자 기준선 특성.
Figure pct00006
상기 나타낸 바와 같이, 이러한 I상 연구의 1차 결과 척도는 안전성 및 허용성이었다. 단일 용량 단계의 경우에, 본 발명자들은 어떠한 용량 제한 독성 및 어떠한 주입 또는 주사 부위 반응도 관찰하지 않았다. 7명의 환자는 단일-용량 단계에서 심각한 유해 사례를 경험하였다 (6명은 rhuMAb 베타7을 투여받고, 1명은 위약을 투여받음). UC의 악화에 대한 긴급 결장절제술을 겪은 적극 치료를 받는 2명의 환자에서 손상된 상처 치유와 관련된 2건의 심각한 유해 사례가 있었지만, 유의한 혼란 인자가 있었다. 연구의 다중 용량 단계에서 어떠한 임상적으로 유의한 주사 부위 반응도 없었다. 연구의 다중용량 단계에서 1건의 심각한 유해 사례가 있었다.
I상 연구에서 시험된 용량 (단일 및 다중)에서 rhuMAb 베타7에 대해 확인된 어떠한 관련된 안전성 신호도 없었다. DLT에 대한 프로토콜-정의된 기준은 어떠한 용량 코호트에서도 충족되지 않았다. AE의 전반적 발생률은 일반적으로 코호트 사이에 비슷하였고, AE의 발생률에서의 용량-의존성 증가를 향한 어떠한 명백한 경향도 없었다. AE의 대부분은 NCI CTCAE 등급 1 또는 2였다. I상 연구에서 rhuMAb 베타7을 투여받은 7명의 환자는 보고된 SAE를 가졌다: 6명은 SD 단계에 있었고, 1명은 MD 단계에 있었다. 연구의 SD 단계에서 감염 관련 사례의 발생률에서 어떠한 명백한 용량-관련 증가도 없었다. 연구의 두 단계에서 어떠한 심각한 주입 또는 주사-관련 AE도 보고되지 않았다. 위약 (SD 및 MD 단계 둘 다에서 20%의 환자)과 비교하여 rhuMAb 베타7-치료된 환자 (SD 단계에서 45%의 환자 및 MD 단계에서 55.6%의 환자) 중에서 연구 약물 투여 후 24시간 이내에 보고된 AE의 증가된 발생률이 있는 것으로 보였다. 그러나, 연구 약물 투여 후 24시간 이내에 발생하는 모든 AE는 NCI CTCAE 등급 1 또는 2였다.
각각의 환자로부터의 혈액 샘플을 연구 전반에 걸쳐 특정 시점에 수집하고, 혈청 rhuMAb 베타7 농도를 측정하여 PK를 평가하였다. 표준 비-구획 (NCA) PK 방법 및 컴퓨터 소프트웨어 윈논린 프로 버전 5.1.1 (파르사이트)의 사용을 통해 이용가능한 혈청 농도-시간 데이터에 대해 PK 평가를 수행하였다. 실제 혈액 샘플링 시간을 이용하였다. 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1a는 연구의 SAD 단계에 대한 결과를 보여주고, 도 1b는 3.0 mg/kg SC와 비교하여 3.0 mg/kg IV로 투여된 rhuMAb 베타7의 단일 용량의 PK 프로파일을 보여주고, 도 1c는 연구의 MAD 단계에 대한 결과를 보여준다.
도 1a에 제공된 데이터의 분석은 혈청 rhuMAb-베타7 농도가 초기 빠른 분포 단계에 이어서 느린 제거 단계를 갖는 2단계 성향을 나타냈다는 것을 보여준다. IV 투여시, Cmax는 용량-비례 방식으로 증가하였고, 평균은 0.3-mg/kg 용량군에 대해 9.33 μg/mL 및 10-mg/kg 용량군에 대해 239 μg/mL였다. 유사하게, 농도-시간 곡선 하 군 평균 면적 (AUC0 - inf)은 76.9 내지 2500 일 x μg/mL 범위였고, 용량 범위를 가로질러 유사한 용량-정규화된 AUC 값에 의해 증명된 바와 같이 대략적으로 용량 비례였다. 말단 제거 반감기는 대략 2주 (~14일)였다. 보다 낮은 용량 (0.3 mg/kg 및 1 mg/kg)의 PK 프로파일은, 아마도 보다 낮은 농도에서의 표적-매개 클리어런스의 기여 때문에 비선형 PK의 경미한 경향을 시사한다.
도 1b에 제공된 데이터의 분석은 SC 코호트의 제거가 일반적으로 IV 코호트와 일치하였음을 보여준다. 단일 3 mg/kg SC 용량 코호트의 AUC0 - inf 값을 단일 3 mg/kg IV 용량 코호트로부터의 AUC0 - inf와 비교하는 예비 평가는 66-67%의 대략적 생체이용률을 추정하였다.
도 1c에 제공된 데이터의 분석은 단일-용량 PK 데이터와 일치하게, rhuMAb 베타7 혈청 노출이 일반적으로 용량 비례였다는 것을 보여준다. 매 4주마다 1회의 투여 스케줄은 시간이 지남에 따라 최소 또는 중간 약물 축적을 일으켰다. 4 mg/kg IV 코호트의 최고 용량은 각각 제1 및 최종 용량 후에 117 ± 31 및 136 ± 24 μg/mL의 평균 (± 표준 편차) Cmax를 가졌다. 단일-용량 동역학과 유사하게, 다중용량 코호트에서의 말단 제거 반감기는 대략 2주였다.
예비 집단 PK 평가를 논멤 VI(NONMEM VI) (이콘(ICON))을 이용하여 모든 단일 용량 코호트로부터의 데이터에 대해 수행하였다. 공변량으로서 체중 (BW)에 대해 클리어런스 (CL) 또는 분포의 중심 부피 (V1)에 대한 개체내 가변성 (IIV)을 플롯팅함으로써 단일변량 탐색적 분석을 수행하였다. rhuMAb 베타7의 CL 또는 V1은 본 평가에서 BW와 관련된 것으로 보이지 않았으며, 이는 균일 투여가 BW 기반 투여를 대체할 수 있음을 시사하였다.
요약하면, 상기 기재된 분석은 용량 < 3 mg/kg에서 비-선형 PK의 경미한 경향을 갖는 일반적 선형 약동학을 나타낸다. 3 및 10 mg/kg의 단일 IV 용량 후의 제거 반감기는 대략 2주 (~14일)였고, SC 생체이용률은 대략 66-67%였다.
항-치료 항체 (ATA) 분석의 결과는 0.3 mg/kg IV를 투여받은 SAD 코호트 내의 1명의 환자가 제29일까지 ATA에 대해 양성이었고, 제127일까지 양성으로 남았다는 것을 밝혀내었다. 이 ATA 양성은 PK에 영향을 미치지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
인테그린 베타7의 점유를 다양한 시점에 각각의 환자로부터의 샘플에서 측정하였다. 연구의 SAD 단계의 경우에, 점유는 1-10 μg/mL로 유지되었다 (데이터는 제시되지 않음). 도 2는 연구의 MAD 단계로부터의 점유 분석의 결과를 보여준다. 데이터는 0.5 mg/kg SC만큼 낮은 매월 투여 상에서 유지되는 완전 점유를 갖는 베타7 수용체 포화의 지속시간에서의 용량 관계를 시사한다.
본 발명자들은 또한 가능한 임상적 활성의 증거에 대한 데이터를 분석하였다. 조사된 하나의 파라미터는 메이요 클리닉 점수 (MCS)에서의 개별적 변화이다. 이들 결과를 도 3에 도시하였다. 다중용량 단계에 있는 모든 환자의 경우에, 평균 (± sd) 기준선 MCS는 9.3 ± 1.9였다. 임상적 반응을 3점의 MCS에서의 감소 플러스 기준선으로부터의 30% 감소 및 직장 출혈에서의 ≥ 1점 감소 또는 0/1의 절대적 출혈 점수로서 정의하였다. 도 3a-e에 도시된 바와 같이, 제71일에, rhuMAb 베타7로 치료된 12/18의 환자 및 위약으로 치료된 4/5의 환자는 이들 기준에 의해 임상적 반응을 나타내었다. 또한, 임상적 완화는 절대적 MCS가 2 이하이고 개별 하위점수가 1 초과가 아닌 것으로서 정의하였다. 도 3a-e는 rhuMAb 베타7로 치료된 3/18의 환자 및 위약으로 치료된 1/5의 환자가 이들 기준에 의해 임상적 완화를 나타내었음을 보여준다. 주목할 만한 것은, 임상적 활성은 스테로이드 투여중인 rhuMAb 베타7-치료된 환자에서 관찰되었고, 임상적 활성은 코호트 H 및 I에서 보다 지속적이었다.
실시예 2
중등도 내지 중증 궤양성 결장염을 앓는 환자에서 rhuMAb 베타7의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 II상 무작위 이중-맹검 위약-대조 연구 및 개방 표지 확장 연구
연구 설계
연구의 설명
본 II상 연구는 중등도 내지 중증 UC를 앓는 환자에서 위약과 비교하여 2개의 rhuMAb 베타7 용량 수준을 가로질러 효능 및 안전성을 평가하기 위한 무작위, 이중-맹검, 위약-대조 다중센터 연구이다. 이 표적 환자 집단은 상기 기재된 I상 연구에서 연구된 것과 동일하다. 1차 효능 종점은 제10주 (연구 약물의 최종 용량이 투여된지 2주 후)에 평가될 것이며, 2차 효능 종점은 제6주에 평가될 것이다.
환자는 제0, 4 및 8주에 rhuMAb 베타7 100 mg SC (균일 용량), 및 제0주에 420 mg SC (균일 부하 용량)에 이어서 제2, 4 및 8주에 300 mg SC, 또는 매칭되는 위약 SC의 용량 범위를 가로질러 1:1:1 비로 무작위화될 것이다. 연구 스키마를 도 7에 도시하였다. 연구는 0-35일의 스크리닝 기간, 10주의 이중-맹검 치료 기간, 18주의 안전성 추적 기간, 및 17개월 (무작위화 후 2년)의 진행성 다초점성 백질뇌병증 (PML) 추적 기간으로 나뉠 것이다.
적격이기 위해, 환자는 미국 위장병 학회 (ACG) 실시 가이드라인에 따라 진단된 최소 12주의 UC 지속시간을 가져야 한다 (즉, 특정 경우에 ≥ 5의 MCS 또는 특정 경우에 ≥ 6의 MCS (≥ 2의 내시경검사 하위점수 포함)에 의해 증명된 중등도 내지 중증 질환의 증거; ≥ 1의 직장 출혈 하위점수 (표 1 참조); 및 항문 피부선으로부터 최소 25 cm의 질환 활성의 내시경검사 증거와 함께, 조직병리학 보고에 의해 확증된 임상 및 내시경검사 증거).
무작위화 전에, 환자는 UC에 대한 병용 의약의 안정한 용량을 투여중이어야 한다. 경구 5-아미노살리실산 (5-ASA) 및 면역억제제 (아자티오프린 [AZA], 6-메르캅토퓨린 [6-MP] 또는 메토트렉세이트) 용량은 제1일의 무작위화 전에 적어도 4주 동안 안정하게 유지되어야 한다. 국소 5-ASA 또는 코르티코스테로이드를 투여받고 있는 환자는 제1일의 무작위화 2주 전에 중지하여야 한다. 경구 코르티코스테로이드 용량은 제1일의 무작위화 전에 2주 동안 안정하게 유지되어야 한다. 고-용량 스테로이드를 투여받는 환자는 제1일의 무작위화 전에 2주 동안 ≤ 20 mg/일로 감소된 용량을 가져야 한다. 연구 치료 기간 동안 경구 코르티코스테로이드를 투여받는 환자의 경우에, 스테로이드의 감량은 제10주에 2주 동안 1주일에 5-mg 프레드니손 또는 프레드니손 등가물의 속도로, 및 이어서 중지까지 1주일에 2.5 mg 프레드니손 또는 프레드니손 등가물의 속도로 시작되어야 한다. 경구 면역억제제 (경구 코르티코스테로이드 이외의 것)를 투여받는 환자의 경우에, 면역억제제의 감량은 제8주에 시작되어야 하고, 환자는 제10주까지 면역억제제를 완전히 중지하여야 한다. 이전에 항-TNF 요법을 투여받은 환자는 제1일의 연구 약물을 투여받기 위한 무작위화 전에 최소 8주 동안 요법을 중지하여야 한다. 환자가 연구 동안 임의의 시점에 지속되거나 또는 증가하는 질환 활성을 경험하는 경우에, 스테로이드 또는 면역억제제 용량에서의 증가 형태의 구조 요법을 연구자의 임상적 판단에 따라 증가시키거나 개시할 수 있다. 구조 요법을 요구하는 환자는 연구에 남도록 허용될 것이지만, 연구 치료를 중지할 것이고, 데이터 분석 동안 치료 실패를 경험한 것으로서 분류될 것이다.
환자는 이들이 하나 이상의 항-TNF 작용제를 비롯한 통상의 요법에 반응하는데 실패했는지의 여부를 결정하기 위해 평가될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항-TNF 작용제 및 면역억제제에 대한 반응의 상실 및/또는 불내성은 하기를 의미한다. 항-TNF 작용제와 관련하여, 반응의 상실 및/또는 불내성은 활성 질환의 증상이 (a) 인플릭시맙: 5 mg/kg IV, 6주에 걸쳐 3회의 용량 (제8주에 평가함); (b) 아달리무맙: 제0주에 1회의 160-mg SC 용량, 이어서 제2주에 1회의 80-mg 용량, 및 이어서 제4 및 6주에 40 mg (제8주에 평가함) 중 하나 이상을 사용하는 선행 치료에도 불구하고 지속되는 것; 또는 이전 반응 후의 정기적으로 예정된 유지 투여 동안 재발하는 활성 증상 (반응하고, 반응을 상실하지 않은 환자에 의한 치료의 선택적 중지는 자격이 없음); 또는 하나 이상의 항-TNF 항체에 대한 불내성의 병력 (주입-관련 반응 또는 주사-부위 반응, 감염, 울혈성 심부전, 탈수초화를 포함하지만 배타적이거나 이에 제한되지는 않음)을 의미한다. 면역억제제와 관련하여, 반응의 상실 및/또는 불내성은 활성 질환의 증상이 아자티오프린 (≥ 1.5 mg/kg) 또는 등가 용량의 6-메르캅토퓨린 mg/kg (≥ 0.75 mg/kg) 또는 메토트렉세이트, 적어도 8주 동안 1주일에 25 mg SC/근육내 (또는 제시된 바와 같이) 중 하나 이상을 사용하는 선행 치료에도 불구하고 지속되는 것; 또는 하나 이상의 면역억제제의 불내성의 병력 (췌장염, 약물 열, 발진, 오심/구토, 간 기능 검사 상승, 티오퓨린 S-메틸트랜스퍼라제 유전자 돌연변이, 감염을 포함하지만 배타적이지는 않음)을 의미한다.
연구 치료에 대한 무작위화는 코르티코스테로이드를 사용하는 병용 치료 (예/아니오), 면역억제제를 사용하는 병용 치료 (예/아니오), 선행 항-TNF 노출 (예/아니오) (미국에서 무작위화된 환자 제외) 및 연구 위치에 의해 계층화될 것이다.
UC 질환 활성은 스크리닝 (및 이것이 기준선 MCS로 간주될 것임), 제6주 (제4주에서의 투여 2주 후) 및 제10주 (연구 약물의 최종 용량 2주 후)에서의 MCS를 이용하여 평가될 것이다. 결장의 생검은 이들 동일한 시점에 수행된 굴곡성 S상결장경검사 동안 수득될 것이다. 부분적 MCS는 또한 연구 전반에 걸쳐 수집될 것이다. 환자 보고된 결과 (PRO)는 또한 짧은 염증성 장 질환 설문지 (SIBDQ) 및 MCS를 이용하여 평가될 것이며, 이는 제1일 및 제6 및 10주에 환자에 의해 완결될 것이다. 또한, 질환 활성, 1일 증상 및 UC의 충격은 스크리닝으로부터 (대략 제1일 7일 전에서 제1일까지) 및 제6 및 10주에서의 연구 방문 적어도 7일 전에서 연구 방문까지 환자에 의해 매일 완결된 환자 다이어리에서 수집될 것이다. 혈청 및 분변 샘플은 또한 바이오마커 분석을 위해 수득될 것이다. 대변은 바이오마커의 측정을 위해 스크리닝 및 제6, 10 및 28주에 수득될 것이다. 측정될 예시적인 바이오마커는 리포칼린, 칼프로텍틴 및 락토페린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 혈청 및 혈장은 탐색적 바이오마커의 측정을 위해 스크리닝에서, 제1일에, 및 제4, 6, 10, 16 및 28주에 수득될 것이다.
본 연구에 대한 1차 효능 종점은 임상적 완화를 달성하는 환자의 비율이고, 제10주까지 MCS에서의 2 이하로의 절대적 감소 및 개별 하위점수가 1점을 초과하지 않는 것으로서 정의된다. 추가의 2차 종점은 연구 결과 척도에 열거되어 있다.
개방 표지 확장 연구
본 연구는 상기 기재된 II상 연구에 등록되었고 개방 표지 확장 (OLE) 연구에 참가하기 위한 적격성 기준을 충족시키는 중등도 내지 중증 UC를 앓는 환자에서의 rhuMAb 베타7의 안전성 및 허용성을 평가하기 위한 OLE 시험일 것이다. 본 연구는 대략 120명의 환자를 등록시킬 것이다.
본 OLE 연구에서의 모든 환자는 매 4주마다 300 mg SC의 용량으로 rhuMAb 베타7을 사용하는 치료를 받을 것이다. 연구는 104주의 개방-표지 치료 기간, 치료-후 12-주 안전성 추적, 및 rhuMAb 베타7의 최종 용량 후 104주의 확장된 진행성 다초점성 백질뇌병증 (PML) 모니터링 기간으로 나뉠 것이다.
상기 기재된 II상 연구에 참여하는 모든 환자 (위약 또는 활성)는 이들이 하기 기준 중 임의의 것을 만족시키는 경우에 본 OLE 연구에 진입할 수 있다:
· 10주까지의 II상 연구에서 임상적 반응이 수득되지 않음; 환자는 제10주 후에서 제28주까지 (제28주 포함) 임의의 시점에 진입할 수 있음; 임상적 반응은 II상 연구에서 정의된 바와 같음: MCS에서의 적어도 3-점 감소 및 기준선으로부터의 30% 감소 및 직장 출혈 하위점수에서의 ≥ 1-점 감소 또는 0 또는 1의 절대적 직장 출혈 점수.
· II상 연구에서 제10주에 임상적 반응 (상기 정의된 바와 같음)을 가졌지만, 제10주 내지 제28주 사이에 UC의 급성악화를 가짐; UC의 급성악화는 II상 연구에서 정의된 바와 같음: 3일의 연속 직장 출혈과 함께 부분적 MCS에서의 2-점 증가, 및 굴곡성 S상결장경검사 상에서의 2의 내시경검사 점수.
· 추적의 제28주까지 II상 연구가 완결됨.
미국에서의 환자는 또한 병용 면역억제 요법을 OLE 연구에 참가하기 전에 중지하여야 하며, OLE 연구에의 등록 24주 이내에 경구 코르티코스테로이드를 완전히 감량시켜야 한다.
연구 설계에 대한 근거
용량 근거
제안된 요법에 대한 근거가 하기 요약되어 있다.
II상 연구에서 SC 투여되도록 제안된 균일 용량-100, 300 및 420 mg-은 80 kg의 중앙값 체중 환자의 경우에 각각 1.25, 3.75 및 5.25 mg/kg과 등가이다. II상 연구에 대해 선택된 용량은 Ib상 연구 (상기 기재된 다중용량 단계)에서의 예비 임상적 활성을 나타낸 관찰된 노출 수준을 제공할 것으로 예상된다. 또한, 예비 I상 PK 데이터를 사용하는 시뮬레이션에 의해 예측된 혈청 rhuMAb 베타7-시간 프로파일에 예시된 바와 같이 (도 4), 제안된 100- 및 420/300-mg 용량 아암은 노출에서의 개체내 가변성 (IIV)을 설명한 후, 대략 4.4배의 용량 범위 및 명백한 노출 분리를 제공한다. 추가로, 100 mg 용량 아암은 모든 환자에서 1-10 μg/mL (수용체 점유를 위해 요구되는 최소 최저 농도)의 정상 상태 최저 농도에 도달할 것으로 예상되며, 420/300 mg 용량 아암은 > 90%의 환자에서 10 μg/mL 초과의 정상-상태 최저 농도 수준을 제공할 것으로 예상된다. 이 용량 아암에서 420 mg의 제1 부하 용량 및 300 mg의 추가의 제2주 용량은 초기의 보다 높은 약물 노출이 임상적 반응의 보다 급속한 발생을 유도할 것인지의 여부를 조사하기 위한 치료 과정에 앞서 rhuMAb 베타7 노출을 극대화시키도록 의도된다. I상 다중 용량 4 mg/kg IV 코호트로부터의 관찰된 군 평균 노출 데이터와 비교하여, 제안된 고-용량 아암에 대한 처음 2 또는 4주 (제0-14일 또는 제0-28일) 이내의 예측된 노출은 2.5 (Cmax 기반) 또는 1.3-2.2 (AUC 기반)의 안전역을 갖는다 (표 6).
<표 6> I상 다중 용량 IV 코호트 노출과 비교하여 제안된 고용량 아암에 대한 안전역.
Figure pct00007
균일 용량을 하기 고찰을 기반으로 하여 제안하고 정당화시켰다. 첫째로, 클리어런스 (CL) 또는 분포의 중심 부피 (V1) (예비적 기본 집단 IV PK 모델로부터 수득됨)에 대한 개체내 가변성 (IIV)을 공변량으로서의 중량에 대해 플롯팅하는 단일변량 탐색적 분석을 수행하였다. CL의 IIV 또는 V1의 IIV 대 중량의 플롯은 체중에 대한 CL 또는 V1의 의존성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 둘째로, 가변성을 균일 용량 (300 mg) 또는 등가의 체중-기반 용량 (3.75 mg/kg)을 투여받는 환자에 대한 집단 PK 모델-예측된 정상 상태 최대 혈청 농도 (Cmax . ss) 및 제0일 내지 제84일의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC0 -84)에서 비교하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 중앙값 Cmax . ss 및 AUC0 -84는 균일 및 체중-기반 용량 사이에 유사하였다. 도 5에 시뮬레이션되고 도시된 용량 시나리오는 3.75 mg/kg의 체중 기반 용량 및 300 mg의 균일 용량이었다. 도 5는 또한 노출의 IIV가 체중-기반 용량 시나리오와 비교하여 균일-용량 시나리오에서 유사하거나 약간 더 작다는 것을 보여준다.
요약하면, 제0, 4 및 8주에서의 100 mg SC, 및 제0주에서의 420 mg SC에 이어서 제2, 4 및 8주에서의 300 mg SC의 제안된 II상 투여 요법은 통합된 임상 및 PK/PD 데이터를 기반으로 하며, 안전성 및 용량 범위를 만족시킬 필요의 균형을 맞출 뿐만 아니라, 임상적 활성을 잠재적으로 증명한다. 균일 용량은 rhuMAb 베타7의 공지된 PK 특성 및 본원에 기재된 바와 같은 노출 가변성 평가의 결과에 의해 뒷받침되고 정당화된다.
결과 척도
1차 효능 결과 척도
1차 효능 결과 척도는 제10주에서의 임상적 완화이다. 임상적 완화는 MCS ≤ 2 및 개별 하위점수가 1점을 초과하지 않는 것에 의해 정의된다 (표 1 참조).
2차 효능 결과 척도
본 연구에 대한 2차 효능 결과 척도는 (1) 제6주 및 제10주에서의 임상적 반응 (여기서, 임상적 반응은 MCS에서의 적어도 3-점 감소 및 기준선으로부터의 30% 감소 및 직장 출혈 하위점수에서의 ≥ 1-점 감소 또는 0 또는 1의 절대적 직장 출혈 점수에 의해 정의됨); (2) 제6주에서의 임상적 완화 (상기 정의됨); 및 (3) 제6주 및 제10주에서의 0의 내시경검사 점수 및 직장 출혈 점수에 대한 지표이다.
탐색적 결과 척도
본 연구에 대한 탐색적 결과 척도는 반응 또는 완화를 달성한 환자에서 UC의 급성악화까지의 시간이다. 상기 결과 척도의 경우에, 급성악화는 3일의 연속 직장 출혈을 동반하는 부분적 MCS에서의 2점 증가, 및 굴곡성 S상결장경검사 상에서의 2의 내시경검사 점수로서 정의된다.
안전성 결과 척도
rhuMAb 베타7의 안전성과 허용성은 하기 척도를 이용하여 평가될 것이다: (1) 유해 사례에 대한 미국 국립 암 연구소 공통 용어 기준 (NCI CTCAE) 버전 4.0에 따라 등급화된 유해 사례 및 심각한 유해 사례의 발생률; (2) 활력 징후 및 안전성 실험실 척도에서의 임상적으로 유의한 변화; (3) 유해 사례(들)로 인한 중지; (4) 주사-부위 반응 및 과민증의 발생률 및 성질; (5) 감염성 합병증의 발생률; 및 (6) ATA의 발생률에 의해 측정된 면역원성.
약동학적 결과 척도
약동학적 결과 척도는 하기를 포함한다: (1) 제1 및 최종 용량 후의 Cmax; (2) 제1 및 최종 용량 후의 최대 농도까지의 시간 (Tmax); (3) 최종 용량 후의 용량 간격 내의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC); (4) 시점 0으로부터 마지막 검출가능한 관찰까지 (AUClast) 또는 무한대까지 (AUCinf)의 AUC; (5) 명백한 클리어런스 (CL/F); (6) 명백한 분포의 부피 (V/F); 및 (7) 제거 반감기 (t1 /2).
포함 기준
환자는 연구 참가에 적격이기 위해 하기 기준을 충족시켜야 한다: (1) 서면 사전 동의를 제공할 수 있고 그럴 의향이 있음; (2) 18-75세; (3) 생식 능력을 갖는 남성 및 여성은 연구 시작으로부터 연구 약물의 최종 용량의 최소 4개월 (대략 5 반감기) 후까지 고도로 효과적인 피임 방법 (예를 들어, 호르몬 피임제 [경구 또는 패치], 질 고리, 자궁내 장치, 물리적 장벽 또는 정관절제된 파트너)을 이용할 의향이 있어야 함; (4) 특정 경우에 ≥ 5의 MCS 또는 특정 경우에 ≥ 6의 MCS (≥ 2의 내시경검사 하위점수 포함); ≥ 1의 직장 출혈 하위점수 (표 1 참조) 및 항문 피부선으로부터 최소 25 cm의 질환 활성을 갖는 중등도 내지 중증 UC 외래 환자의 진단; (5) ≥ 12주의 스크리닝 시점에서의 질환 지속시간 (즉, ACG 가이드라인에 따른 의사에 의한 첫번째 진단 후); (6) 코르티코스테로이드를 투여받고 있는 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 2주 동안 프레드니손 또는 프레드니손 등가물 20 mg/일 이하의 안정한 용량을 투여중이어야 함; (7) 국소 코르티코스테로이드 및 국소 5 ASA 제제는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 2주 동안 중단되어야 함; (8) 경구 5-ASA 투여중인 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 적어도 4주 동안 안정한 용량을 투여중이어야 함; (9) AZA, 6-MP 또는 메토트렉세이트의 형태로 면역억제제를 투여받고 있는 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 4주 동안 안정한 용량을 투여중이어야 함. 메토트렉세이트를 투여받는 환자는 또한 금기가 없는 경우에 1 mg/일 폴산 (또는 등가물) 보충물을 투여받도록 권고되어야 함; (10) 프로바이오틱스 (예를 들어, 쿨투렐레, 사카로미세스 보울라르디이(Saccharomyces boulardii))를 투여중인 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 2주 동안 안정한 용량을 투여중이어야 함; (11) 항설사제 (예를 들어, 로페라미드, 아트로핀을 함유하는 디페녹실레이트)를 투여중인 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 2주 동안 안정한 용량을 투여중이어야 함; (12) 이전에 항-TNF 요법을 투여받은 환자는 제1일에 연구 약물을 투여하기 전에 최소 8주 동안 요법을 중지하여야 함; (13) 시클로스포린 또는 타크롤리무스 (FK506)로 선행 치료된 환자는 제1일의 연구 약물의 개시 전에 최소 4주 동안 요법을 중지하여야 함; (14) 튜브 섭식, 규정된 식단 또는 비경구 영양법/영양으로 선행 치료된 환자는 제1일의 연구 약물의 개시 3주 전에 이들을 중지하여야 함; (15) 중등도 내지 중증 UC의 진단을 갖는 환자는 면역억제제 (예를 들어, AZA, 6-MP 또는 메토트렉세이트) 및 하나 이상의 항-TNF 작용제에 비반응성이거나 또는 불내성일 필요가 있음.
배제 기준
하기 기준 중 임의의 것을 충족시키는 환자는 연구 참가로부터 제외될 것이다. UC와 관련된 배제 기준은 다음을 포함한다: (1) 광범위한 결장 절제술 또는 대부분 또는 전체 결장절제술; (2) 회장조루술 또는 결장조루술의 존재; (3) 중등도 내지 중증 빈혈 (헤모글로빈 < 9 g/dL); (4) 결장 점막 이형성증의 병력 또는 증거.
전반적 건강과 관련된 배제 기준은 다음을 포함한다: (1) 임신 또는 수유; (2) 말초 정맥 접근성의 결핍; (3) 연구자의 의견으로, 연구 프로토콜을 준수할 능력이 없음; (4) 유의한 제어되지 않는 동반-이환율, 예컨대 신경계, 심장, 폐, 신장, 간, 내분비 또는 위장 (GI) 장애; (5) 유의한 스크리닝 ECG 이상, 예컨대 급성 심근경색, 완전한 좌측 다발 갈래 차단, 2급 심장 차단 또는 완전 심장 차단의 증거; (6) 부족하게 제어된 당뇨병 (글리코실화 헤모글로빈 [HbA1c] > 8.0%); (7) 활성 알콜 남용; (8) 연구의 과정 동안 프레드니손 또는 프레드니손 등가물 > 20 mg/일을 사용하는 치료를 요구할 수 있는 UC 이외의 상태 (예를 들어, 중등도 내지 중증 천식); (9) 피부의 완전히 절제된 기저 세포 암종 또는 편평 세포 암종을 제외한 악성종양의 병력; (10) 손상된 신장 기능 (혈청 크레아티닌 > 1.5 x 정상 상한치 [ULN]); (11) 원발성 경화성 담관염의 진단의 부재 하의 손상된 간 기능 (혈청 트랜스아미나제 > 2.5 x ULN, 알칼리성 포스파타제 > 2.5 x ULN, 총 빌리루빈 > 1.5 x ULN, 또는 연구자에 의해 임상적으로 유의한 것으로 판단된 합성 간 기능 시험에서의 이상). 환자가 원발성 경화성 담관염의 진단을 갖는 경우에, 혈청 트랜스아미나제 > 3 x ULN, 알칼리성 포스파타제 > 3 xULN, 총 빌리루빈 > 2.5 x ULN, 또는 연구자에 의해 임상적으로 유의한 것으로 판단된 합성 간 기능 시험에서의 이상; (12) 스크리닝 전 4주 이내에 입원함 (선택적 이유 이외의 이유로); (13) 혈소판감소증 (혈소판 카운트 < 75,000/μL); (14) 기준선 신경계 검사 상에서의 유의한 이상 (미니-정신 상태 검사 (MMSE) 및 PML 평가에서의 기준선 이상 포함).
감염에 대한 위험 인자와 관련된 배제 기준은 다음을 포함한다: (1) 선천성 면역 결핍; (2) HIV에 의한 활성 또는 이전의 감염 또는 B형 간염 (HBV) 또는 C형 간염 (HCV)을 나타내는 항체에 대한 양성 시험; (3) 엡스타인 바르 바이러스에 대한 음성 IgG 역가의 존재 하의 양성 IgM 항체 역가; (4) 스크리닝에서의 알 또는 기생충에 대한 양성 대변 시험, 병원체에 대한 양성 대변 배양물, 또는 클로스트리디움 디피실레에 대한 양성 대변 독소 검정; (5) 스크리닝에서의 시토메갈로바이러스 (CMV)에 대해 양성인 장 점막 생검; (6) 잠재성 미코박테리움 투베르쿨로시스 (TB) 감염에 대한 양성 스크리닝 시험; (7) 정제된 단백질 유도체 (PPD) 피부 검사 또는 실험실 검정, 예컨대 콴티페론®-TB 골드 (QFT-G) 및 등가의 혈액 시험은 허용되는 스크리닝 검정임; (8) QFT-G (또는 등가의 혈액 시험)는 바실루스 칼메트-게랭 (BCG)으로 이전에 예방접종된 환자에서 이용되어야 함; (9) 음성 PPD 시험이 스크리닝 전 3개월 이내에 문서화된 경우에, 이는 반복될 필요가 없음; (10) 적절하고 문서화된 요법 과정을 투여받은 잠재성 TB 감염의 병력을 갖는 환자는 스크리닝 시험 및 스크리닝 전 3개월 이내에 수행된 흉부 X선이 현재의 활성 감염의 어떠한 증거도 밝혀내지 못한 경우에 포함될 수 있음. 그 경우에, TB 스크리닝 시험은 요구되지 않을 것임; (11) 연구 치료의 개시 전 12주 이내의 임의의 기회 감염의 병력; (12) 탈수초성 질환 또는 PML의 병력; (13) 감염의 임의의 현재 또는 최근 (연구 치료의 개시 전 4주 이내) 신호 또는 증상; (14) 연구 치료의 개시 전 4주 이내에 경구 항생제를 투여받거나, 또는 연구 치료의 개시 전 8주 이내에 IV 항생제를 투여받음; (15) 연구 치료의 개시 전 4주 이내에 살아있는 약독화된 백신을 투여받음; (16) 호중구감소증 (절대적 호중구 카운트 < 1500/μL) 또는 림프구감소증 (절대적 림프구 카운트 < 500/μL).
UC에 대한 병용 의약과 관련된 배제 기준은 다음을 포함한다: (1) 연구 치료의 개시 전 12주 이내에 (또는 연구용 제품의 5 반감기 이내에, 어느 쪽이든 보다 큰 쪽으로) 임의의 연구용 치료를 받음; (2) 리툭시맙에 대한 선행 노출 (이전 6개월 내에); (3) rhuMAb 베타7에 대한 선행 노출; (4) 키메라, 인간 또는 인간화 항체 또는 융합 단백질에 대한 심각한 알레르기성 및 아나필락시스성 반응의 병력.
연구 치료
시험 약물 및 위약
rhuMAb 베타7 약물 제품 및 위약은 제넨테크에 의해 제조된다. 이들은 투명 내지 약간 유백색, 무색 내지 약간 황색의 수용액이다. 용액은 둘 다 IV 및 SC 투여에 대해 의도된 멸균 및 보존제-무함유 액체이다.
투여량 및 투여
환자는 또한 (1) 제0주에서 rhuMAb 베타7 100 mg에 이어서 제2주에서 위약 및 제4 및 8주에서 rhuMAb 베타7 100 mg; 또는 (2) 제0주에서 rhuMAb 베타7 420 mg에 이어서 제2, 4 및 8주에 300 mg; 또는 (3) 제0, 2, 4 및 8주에 위약을 투여받도록 무작위로 할당 (1:1:1)될 것이다.
모든 용량은 SC로 전달될 것이다. 주사는 복부에 투여될 것이다. 복부가 주사에 이용가능하지 않은 경우에, 환자는 대퇴부로 SC 용량을 투여받을 수 있다. 각각의 환자는 투여될 특정한 용량을 위해 필요한 1회 이상의 주사를 투여받을 것이다.
검정 방법
항-치료 항체 검정
혈청 샘플은 ATA의 평가를 위해 모든 환자로부터 수득될 것이다. 혈청 ATA 샘플은 검증된 항체-가교 전기화학발광 검정을 이용하여 분석될 것이다. 필요한 경우에 PK 샘플을 사용하여 ATA 반응을 평가할 수 있다. 검정은 ATA 시험에 대한 전반적 가이드라인을 따를 것이다 (문헌 [Mire-Sluis et al. J Immunol Methods 289:1-16 (2004)]). 검정 방법은 상기 상세히 기재되어 있다.
약동학적 검정
혈청 샘플은 rhuMAb 베타7의 PK의 결정 및 특성화를 위해 모든 환자로부터 수득될 것이다. 혈청 PK 샘플은 12.5 ng/mL의 최소 정량화가능 농도를 갖는 검증된 가교 ELISA를 이용하여 분석될 것이다. 검정 방법은 상기 상세히 기재되어 있다.
약역학적 검정
전혈 및/또는 혈청 샘플은 유동 세포측정법, qRT PCR 및/또는 ELISA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 탐색적 PD 바이오마커 분석을 위한 검증된 방법을 이용하여 분석될 것이다. 검정에 대한 추가의 상세한 내용은 상기 기재되어 있다. 그러나, II상 연구의 경우에, 상이한 경쟁적 항-베타7 항체, FIB504 (이것은 rhuMAb 베타7과 동일한 에피토프에 결합함)가 rhuMab베타7 대신에 사용될 것이다.
효능 분석
1차 효능 종점
1차 종점은 완화의 유지이다. 완화의 유지는 주어진 시간에, 예를 들어 6개월, 1년 또는 2년에 임상적 완화에 있는 환자의 비율을 지칭한다. 각각의 rhuMAb 베타7 아암 및 위약 사이의 차이는 만텔-헨젤(Mantel-Haenszel) 시험 통계를 이용하여 평가될 것이고, 코르티코스테로이드를 사용하는 병용 치료, 면역억제제를 사용하는 병용 치료, 및 선행 항-TNF 노출에 의해 계층화될 것이다. 추가로, 치료군 사이의 차이는 1차 효능 종점에 대한 80% 신뢰 구간을 구축함으로써 평가될 것이다. 기술적 개요 통계는 각각의 치료군에 대해 제공될 것이다.
지속적인 완화가 또한 평가될 수 있다. 지속적인 완화는 한번 유도된 완화를 가지면 시간이 지남에 따라 완화상태로 남는 환자의 수이다. 이는 완화가 유도된 시간으로부터 다음 급성악화까지의 개별적 환자 경험이다. 이는 환자가 완화를 유지하기 위해 UC에 대한 병용 의약의 증가를 요구하지 않는다는 것을 의미한다.
2차 효능 종점
본 연구에 대한 2차 효능 종점은 하기와 같다: (1) 제6주 및 제10주에 임상적 반응을 갖는 환자의 비율 (여기서, 임상적 반응은 MCS에서의 적어도 3-점 감소 및 기준선으로부터의 30% 감소 및 직장 출혈 하위점수에서의 ≥ 1-점 감소 또는 0 또는 1의 절대적 직장 출혈 점수에 의해 정의됨); (2) 제6주에 임상적 완화 (상기 정의됨)에 있는 환자의 비율; 및 (3) 0의 내시경검사 점수 및 직장 출혈 점수를 달성하는 환자의 비율.
2차 효능 종점은 1차 효능 결과 척도와 동일한 방식 (상기 기재됨)으로 분석될 것이다.
안전성 분석
안전성은 유해 사례를 보고하고, 임상 실험실 평가를 수행하고, ATA를 측정함으로써 면역원성을 평가함으로써 평가될 것이다. 환자는 실제로 받은 치료에 따라 분석될 것이다.
유해 사례는 사전 동의가 제공된 시점으로부터 환자가 연구를 완결시키거나 또는 조기에 중지할 때까지 보고될 것이다. 유해 사례의 개별 요약은 스크리닝 기간, 10-주 치료 기간 및 18-주 추적 기간 동안 제공될 것이다. 유해 사례는 치료군에 의해 요약될 것이다.
임상 실험실 데이터 (혈청 화학, 격차를 갖는 전혈 카운트 및 혈소판 카운트를 포함하는 혈액학적 평가, 및 요분석 값)는 기술 통계학을 이용하여 치료군에 의해 요약될 것이다.
모든 환자는 안전성 분석에 포함될 것이다.
약동학적 및 약역학적 분석
제1 및 최종 용량 후의 Cmax, 제1 및 최종 용량 후의 Tmax, 마지막 투여 간격 내의 AUC (AUC57 -85) 및 시점 0으로부터 마지막 검출가능한 관찰까지 (AUClast) 또는 무한대까지 (AUCinf)의 AUC, CL/F, V/F 및 t1 /2가 비-구획 또는 집단 PK 방법을 이용하여 모든 환자에 대해 추정될 것이다. 개별 및 평균 혈청 rhuMAb 베타7 농도-시간 프로파일의 플롯이 생성될 것이다. 혈청 rhuMAb 베타7 농도 및 PK 파라미터가 환자 및 투여 요법에 의해 열거될 것이며, 기술 통계학에 의해 요약될 것이다.
본 연구로부터의 PK 데이터는 집단 PK 분석을 수행하기 위해 I상 연구로부터의 데이터와 조합될 수 있다. PK 파라미터의 집단 전형적 값은 환자내 및 환자간 분산의 추정치 및 무작위 오차의 추정치와 함께 전체 연구 집단에 대해 추정될 것이다. 개별 환자 파라미터 추정치는 사후 분석 절차를 이용하여 계산될 것이다. 유망한 분석 계획이 생성될 것이며, 집단 PK 분석은 임상 연구 보고로부터 분리된 보고에 나타내어질 것이다. 집단 PK 분석은 이 환자 집단에서 rhuMAb 베타7의 PK에 영향을 미치는 기준선 공변량을 확인하기 위한 탐색적 분석을 포함할 수 있다. 검사할 기준선 공변량은 인구통계 및 다른 환자 특성, 예컨대 질환 중증도 및 선택된 실험실 척도를 포함할 것이다. 데이터는 적절한 기술 통계학을 이용하여 요약될 것이다.
노출-임상적 반응 관계의 평가는 탐색적일 것이며, rhuMAb 베타7 노출 (Cmax, Cmin 또는 AUC) 및 임상적 종점 (예컨대, MCS) 사이의 상관관계가 평가될 수 있다.
PD 바이오마커 목표와 관련된 모든 분석은 탐색적일 것이다. 결과는 절대적 값 및/또는 기준선으로부터의 변화로서 요약될 것이다. 추가의 PK 및 PD 분석은 적절하게 수행될 것이다.
개방 표지 확장 연구의 예비 결과
개방 표지 확장 연구에서의 처음 16명의 환자 (이들은 모두 항-TNF 작용제에 반응하는데 실패하였음)를 부분적 메이요 클리닉 점수 (pMCS)를 이용하여 평가하였다. pMCS는 전체 메이요 클리닉 점수의 3개의 성분을 포함하였고, 이는 다음과 같았다: 환자가 각각의 날에 배설하는 대변 횟수, 각각의 날에 환자에 의해 경험된 직장 출혈의 양; 및 이전의 2개의 성분에 기반하지만 또한 환자가 앓는 임의의 복통 및 환자가 그의 UC와 관련하여 일반적으로 얼마나 양호하게 느끼는지를 고려하는, 의사의 환자 질환의 전체적 평가. 각각의 16명의 환자에 대한 예비 결과를 도 8에 도시하였다.
도 8에서 볼 수 있듯이, 16명 중 13명의 환자는 pMCS에서 적어도 1점의 개선을 나타내었다. 16명 중 11명의 환자는 pMCS에서 2점의 개선을 나타내었다. 또한, 환자 중 6명은 12-16주 동안 치료되었고, 이들 중 3-4명은 시간이 지남에 따라 개선을 나타내었다. 따라서, 예비적일지라도, 이들 데이터는 항-TNF 요법에 불응성인 중등도 내지 중증 UC를 앓는 환자에서의 rhuMAb 베타7의 임상적 활성의 증거를 제공한다.
요약하면, rhuMAb 베타7은 장 점막에서 각각 림프구 하위세트의 트래픽킹 및 체류를 조절하는 α4β7 및αEβ7 수용체에 결합한다. 임상 연구는 CD의 치료에 대한 항-α4 항체 (나탈리주맙)의 효능을 입증하였고, UC의 치료에서 항-α4β7 항체 (LDP02/MLN02/MLN0002/베돌리주맙)에 대해 고무적인 결과가 관찰되었다. 이들 발견은 치료 표적으로서의 α4β7을 검증하며, α4β7 및 MAdCAM 1 사이의 상호작용이 IBD의 발병기전에 기여한다는 가설을 뒷받침한다. αEβ7을 표적화하는 것의 잠재적인 부가적 치료 효과 뿐만 아니라, 장 점막으로의 림프구 트래픽킹의 차단에 대한 rhuMAb 베타7의 특이성은 IBD에서 상기 항체의 임상 개발을 추구할 강력한 이유이다. rhuMAb 베타7의 잠재적 이익은 메이요 클리닉 점수에 의해 측정시 UC를 앓는 환자에서의 질환 중증도에서의 감소를 포함할 수 있고, 또한 메이요 클리닉 점수에 의해 측정시 완화의 유도를 또한 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> METHODS OF ADMINISTERING BETA7 INTEGRIN ANTAGONISTS <130> P4622R1-WO <140> <141> <150> 61/550,216 <151> 2011-10-21 <150> 61/470,360 <151> 2011-03-31 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide 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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Val Glu Leu 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ser Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 11 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn 20 25 30 Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn 20 25 30 Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Ala Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ala Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ala Gln Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Arg Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <400> 21 Xaa Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 22 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn 20 25 30 Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Ala, Gly, Ser, Thr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Gly, Ile, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Glu, Val, Gln, Ala, Asp, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Tyr, Ala, Asp, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Pro, Arg, Thr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Val, Arg, Ile, Ala, Gly, Lys, Leu, Met or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Asp, Val, Ser, Ala, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Asp, Gly, Asn, Glu, Thr, Pro or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Leu, Tyr, Ile or Met <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Leu, Ala, Ile, Met or Val <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> His, Tyr, Phe or Ser <400> 26 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Gln or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser, Asp, Leu or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ile, Val, Glu or Lys <220> <223> see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 27 Xaa Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Asn, Val, Trp, Tyr, Arg, Ser, Thr, Ala, Phe, His, Ile, Leu or Met <400> 28 Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Xaa Thr 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Tyr, Phe, Val or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Asn, Thr, Ala or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Pro, His, Asp or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Ser or Gly <400> 29 Gly Xaa Ile Ser Tyr Xaa Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Arg, Met, Ala, Glu, Gly, Gln or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Phe or Tyr <400> 30 Ala Xaa Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Xaa 1 5 10

Claims (79)

  1. 환자에게 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인테그린 베타7 길항제를 피하로 투여하는 것인, 환자에서 위장 염증성 장애를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 모노클로날 항-베타7 항체인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항-베타7 항체를 0.5 mg/kg, 또는 1.5 mg/kg, 또는 3.0 mg/kg, 또는 4.0 mg/kg의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항-베타7 항체를 매 4주마다 1회 투여하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항-베타7 항체를 2개월, 또는 3개월, 또는 6개월, 또는 12개월, 또는 18개월, 또는 24개월의 기간 동안, 또는 환자의 평생 동안 투여하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 위장 염증성 장애가 염증성 장 질환인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 크론병인 방법.
  9. 제2항에 있어서, 항-베타7 항체가 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항-베타7 항체가 항체 단편인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 항-베타7 항체가 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며, 여기서
    (i) HVR-L1은 아미노산 서열 A1-A11을 포함하고, 여기서 A1-A11은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9), 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체 (서열 26)이고, 여기서 아미노산 A2는 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3은 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A4는 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5는 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6은 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7은 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8은 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9는 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A10은 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11은 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) HVR-L2는 아미노산 서열 B1-B8을 포함하고, 여기서 B1-B8은 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 20) 또는 XaaYASQSIS (서열 21, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄), 또는 서열 2, 20 또는 21의 변이체 (서열 27)이고, 여기서 아미노산 B1은 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 Xaa (여기서, Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4는 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6은 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7은 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iii) HVR-L3은 아미노산 서열 C1-C9를 포함하고, 여기서 C1-C9는 QQGNSLPNT (서열 3), 또는 서열 3의 변이체 (서열 28)이고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iv) HVR-H1은 아미노산 서열 D1-D10을 포함하고, 여기서 D1-D10은 GFFITNNYWG (서열 4)이고;
    (v) HVR-H2는 아미노산 서열 E1-E17을 포함하고, 여기서 E1-E17은 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5), 또는 서열 5의 변이체 (서열 29)이고, 여기서 아미노산 E2는 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E10은 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12는 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13은 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (vi) HVR-H3은 아미노산 서열 F2-F11을 포함하고, 여기서 F2-F11은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 19)이거나; 또는 아미노산 서열 F1-F11을 포함하고, 여기서 F1-F11은 AMTGSSGYFDF (서열 16), ARTGSSGYFDF (서열 17), 또는 AQTGSSGYFDF (서열 18), 또는 서열 6, 16, 17, 18 또는 19의 변이체 (서열 30)이고, 여기서 아미노산 F2는 R, M, A, E, G, Q, S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 F11은 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
    방법.
  12. 제11항에 있어서, 항-베타7 항체가 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1-H3) 서열 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1-L3) 서열을 포함하며, 여기서
    (i) HVR-L1은 서열 7, 서열 8 또는 서열 9를 포함하고;
    (ii) HVR-L2는 서열 2를 포함하고;
    (iii) HVR-L3은 서열 3을 포함하고;
    (iv) HVR-H1은 서열 4를 포함하고;
    (v) HVR-H2는 서열 5를 포함하고;
    (vi) HVR-H3은 서열 6 또는 서열 16 또는 서열 17 또는 서열 19를 포함하는 것인
    방법.
  13. 환자에게 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인테그린 베타7 길항제를 균일 용량으로 피하로 투여하는 것인, 환자에서 위장 염증성 장애를 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 모노클로날 항-베타7 항체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항-베타7 항체를 50 mg 내지 450 mg의 균일 용량으로 투여하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 균일 용량이 50 mg인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 균일 용량이 100 mg인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 균일 용량이 150 mg인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 균일 용량이 200 mg인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 균일 용량이 300 mg인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 균일 용량이 350 mg인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 균일 용량이 400 mg인 방법.
  23. 제15항에 있어서, 균일 용량이 420 mg인 방법.
  24. 제15항에 있어서, 균일 용량이 450 mg인 방법.
  25. 제15항에 있어서, 항-베타7 항체를 매주마다 1회, 또는 매 2주마다 1회, 또는 매 4주마다 1회, 또는 매 6주마다 1회, 또는 매 8주마다 1회 투여하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항-베타7 항체를 2개월, 또는 3개월, 또는 6개월, 또는 12개월, 또는 18개월, 또는 24개월의 기간 동안, 또는 환자의 평생 동안 투여하는 것인 방법.
  27. 제13항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  28. 제13항에 있어서, 위장 염증성 장애가 염증성 장 질환인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 크론병인 방법.
  30. 제14항에 있어서, 항-베타7 항체가 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항-베타7 항체가 항체 단편인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 항-베타7 항체가 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며, 여기서
    (i) HVR-L1은 아미노산 서열 A1-A11을 포함하고, 여기서 A1-A11은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9), 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체 (서열 26)이고, 여기서 아미노산 A2는 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3은 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A4는 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5는 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6은 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7은 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8은 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9는 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A10은 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11은 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) HVR-L2는 아미노산 서열 B1-B8을 포함하고, 여기서 B1-B8은 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 20) 또는 XaaYASQSIS (서열 21, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄), 또는 서열 2, 20 또는 21의 변이체 (서열 27)이고, 여기서 아미노산 B1은 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 Xaa (여기서, Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4는 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6은 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7은 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iii) HVR-L3은 아미노산 서열 C1-C9를 포함하고, 여기서 C1-C9는 QQGNSLPNT (서열 3), 또는 서열 3의 변이체 (서열 28)이고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iv) HVR-H1은 아미노산 서열 D1-D10을 포함하고, 여기서 D1-D10은 GFFITNNYWG (서열 4)이고;
    (v) HVR-H2는 아미노산 서열 E1-E17을 포함하고, 여기서 E1-E17은 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5), 또는 서열 5의 변이체 (서열 29)이고, 여기서 아미노산 E2는 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E10은 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12는 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13은 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (vi) HVR-H3은 아미노산 서열 F2-F11을 포함하고, 여기서 F2-F11은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 19)이거나; 또는 아미노산 서열 F1-F11을 포함하고, 여기서 F1-F11은 AMTGSSGYFDF (서열 16), ARTGSSGYFDF (서열 17), 또는 AQTGSSGYFDF (서열 18), 또는 서열 6, 16, 17, 18 또는 19의 변이체 (서열 30)이고, 여기서 아미노산 F2는 R, M, A, E, G, Q, S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 F11은 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
    방법.
  33. 제32항에 있어서, 항-베타7 항체가 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1-H3) 서열 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1-L3) 서열을 포함하며, 여기서
    (i) HVR-L1은 서열 7, 서열 8 또는 서열 9를 포함하고;
    (ii) HVR-L2는 서열 2를 포함하고;
    (iii) HVR-L3은 서열 3을 포함하고;
    (iv) HVR-H1은 서열 4를 포함하고;
    (v) HVR-H2는 서열 5를 포함하고;
    (vi) HVR-H3은 서열 6 또는 서열 16 또는 서열 17 또는 서열 19를 포함하는 것인
    방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-베타7 항체를 매 4주마다 100 mg의 균일 용량으로 투여하며, 여기서 환자가 궤양성 결장염을 앓고, 여기서 환자가 시간이 지남에 따라 점막 치유 또는 급성악화의 감소된 속도를 경험하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 항-베타7 항체를 매 4주마다 300 mg의 균일 용량으로 투여하며, 여기서 환자가 궤양성 결장염을 앓고, 여기서 환자가 시간이 지남에 따라 점막 치유 또는 급성악화의 감소된 속도를 경험하는 것인 방법.
  36. 환자에게 치료 유효량의 인테그린 베타7 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 투여는 제1 부하 용량의 투여 및 1회 이상의 후속 유지 용량의 투여를 포함하고, 여기서 각각의 부하 용량 및 1회 이상의 유지 용량을 균일 용량으로 피하로 투여하는 것인, 환자에서 위장 염증성 장애를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 모노클로날 항-베타7 항체인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 부하 용량이 400 mg 내지 450 mg이고, 유지 용량이 50 mg 내지 350 mg인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 유지 용량이 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 350 mg인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg이고, 유지 용량이 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 350 mg인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 부하 용량이 420 mg이고, 유지 용량이 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 350 mg인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 부하 용량이 430 mg이고, 유지 용량이 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 350 mg인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 부하 용량이 450 mg이고, 유지 용량이 50 mg, 또는 100 mg, 또는 150 mg, 또는 200 mg, 또는 300 mg, 또는 350 mg인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이고, 유지 용량이 50 mg인 방법.
  46. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이고, 유지 용량이 100 mg인 방법.
  47. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이고, 유지 용량이 150 mg인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이고, 유지 용량이 200 mg인 방법.
  49. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이고, 유지 용량이 300 mg인 방법.
  50. 제38항에 있어서, 부하 용량이 400 mg, 또는 420 mg, 또는 430 mg, 또는 450 mg이고, 유지 용량이 350 mg인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 부하 용량이 420 mg인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 부하 용량이 450 mg인 방법.
  53. 제38항에 있어서, 제1 유지 용량을 부하 용량의 1일, 또는 1주, 또는 2주, 또는 4주 후에 투여하는 것인 방법.
  54. 제38항에 있어서, 제1 유지 용량을 부하 용량과 동일한 날에 투여하는 것인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 제2 및 각각의 후속 유지 용량을 매 2주마다, 또는 매 4주마다, 매 8주마다 투여하는 것인 방법.
  56. 제38항에 있어서, 제1 유지 용량을 부하 용량의 2주 후에 투여하고, 제2 유지 용량을 제1 유지 용량의 2주 후에 투여하고, 각각의 후속 유지 용량을 매 4주마다 투여하는 것인 방법.
  57. 제38항에 있어서, 항-베타7 항체를 2개월, 또는 3개월, 또는 6개월, 또는 12개월, 또는 18개월, 또는 24개월의 기간 동안, 또는 환자의 평생 동안 투여하는 것인 방법.
  58. 제36항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  59. 제36항에 있어서, 위장 염증성 장애가 염증성 장 질환인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 크론병인 방법.
  61. 제37항에 있어서, 항-베타7 항체가 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 항-베타7 항체가 항체 단편인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 항-베타7 항체가 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며, 여기서
    (i) HVR-L1은 아미노산 서열 A1-A11을 포함하고, 여기서 A1-A11은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9), 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체 (서열 26)이고, 여기서 아미노산 A2는 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3은 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A4는 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5는 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6은 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7은 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8은 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9는 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A10은 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11은 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) HVR-L2는 아미노산 서열 B1-B8을 포함하고, 여기서 B1-B8은 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 20) 또는 XaaYASQSIS (서열 21, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄), 또는 서열 2, 20 또는 21의 변이체 (서열 27)이고, 여기서 아미노산 B1은 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 Xaa (여기서, Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4는 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6은 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7은 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iii) HVR-L3은 아미노산 서열 C1-C9를 포함하고, 여기서 C1-C9는 QQGNSLPNT (서열 3), 또는 서열 3의 변이체 (서열 28)이고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iv) HVR-H1은 아미노산 서열 D1-D10을 포함하고, 여기서 D1-D10은 GFFITNNYWG (서열 4)이고;
    (v) HVR-H2는 아미노산 서열 E1-E17을 포함하고, 여기서 E1-E17은 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5), 또는 서열 5의 변이체 (서열 29)이고, 여기서 아미노산 E2는 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E10은 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12는 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13은 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (vi) HVR-H3은 아미노산 서열 F2-F11을 포함하고, 여기서 F2-F11은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 19)이거나; 또는 아미노산 서열 F1-F11을 포함하고, 여기서 F1-F11은 AMTGSSGYFDF (서열 16), ARTGSSGYFDF (서열 17), 또는 AQTGSSGYFDF (서열 18), 또는 서열 6, 16, 17, 18 또는 19의 변이체 (서열 30)이고, 여기서 아미노산 F2는 R, M, A, E, G, Q, S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 F11은 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
    방법.
  64. 제63항에 있어서, 항-베타7 항체가 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1-H3) 서열 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1-L3) 서열을 포함하며, 여기서
    (i) HVR-L1은 서열 7, 서열 8 또는 서열 9를 포함하고;
    (ii) HVR-L2는 서열 2를 포함하고;
    (iii) HVR-L3은 서열 3을 포함하고;
    (iv) HVR-H1은 서열 4를 포함하고;
    (v) HVR-H2는 서열 5를 포함하고;
    (vi) HVR-H3은 서열 6 또는 서열 16 또는 서열 17 또는 서열 19를 포함하는 것인
    방법.
  65. 제1항 내지 제54항 및 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제를 5-아미노살리실산 (5-ASA), 아자티오프린 (AZA), 6-메르캅토퓨린 (6-MP) 및 메토트렉세이트로부터 선택된 하나 이상의 추가의 화합물과 함께 투여하는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제54항 및 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전에 하나 이상의 생물학적 작용제에 실패한 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 생물학적 작용제가 아달리무맙, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 골리무맙, 세르톨리주맙 페골, 나탈리주맙 및 베돌리주맙으로부터 선택되는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제54항 및 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제를 자가-주사 장치로 투여하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 자가-주사 장치가 사전충전 시린지, 미세바늘 장치, 자동주사기 장치 및 무바늘 주사 장치로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 인테그린 베타7 길항제의 액체 제제를 포함하는 사전충전 시린지를 포함하며, 여기서 제제의 부피는 2 mL이고, 인테그린 베타7 길항제의 양은 150 mg인 제조품.
  71. 제70항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 에트롤리주맙인 제조품.
  72. 인테그린 베타7 길항제의 액체 제제를 포함하는 사전충전 시린지를 포함하며, 여기서 제제의 부피는 1 mL이고, 인테그린 베타7 길항제의 양은 180 mg인 제조품.
  73. 제72항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 에트롤리주맙인 제조품.
  74. 궤양성 결장염을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 에트롤리주맙을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 에트롤리주맙을 매 4주마다 100 mg 또는 300 mg의 균일 용량으로 피하로 투여하는 것인, 궤양성 결장염을 앓고 있는 환자에서 완화를 유도하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 메이요 클리닉(Mayo Clinic) 점수 및 메이요 클리닉 하위점수를 결정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 환자가 2 이하의 절대적 메이요 클리닉 점수를 갖고 1 초과의 개별 하위점수는 갖지 않는 것으로 결정되는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 완화가 에트롤리주맙의 제1 투여 후 적어도 제10주까지 유도되는 것인 방법.
  77. 궤양성 결장염을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 에트롤리주맙을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 에트롤리주맙을 매 4주마다 100 mg 또는 300 mg의 균일 용량으로 피하로 투여하고, 여기서 완화는 완화의 유도 후 8주의 기간, 또는 완화의 유도 후 30주의 기간, 또는 완화의 유도 후 50주의 기간, 또는 완화의 유도 후 54주 이상의 기간 동안 유지되는 것인, 궤양성 결장염을 앓고 있는 환자에서 지속적인 완화를 유도하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 완화가 무스테로이드 완화인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 무스테로이드 완화가 완화의 유도 후 20주 동안, 또는 완화의 유도 후 24주 이상 동안인 방법.
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