PT736004E

PT736004E - (2,4-dissulfofenil)-n-terc-butil-nitrona seus sais e sua utilizacao como agentes farmaceuticos capturadores de radicais livres

Info

Publication number: PT736004E
Application number: PT95907224T
Authority: PT
Inventors: John M Carney
Original assignee: Oklahoma Med Res Found; Univ Kentucky Res Found
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2000-09-29
Also published as: PL185189B1; EP0736004B1; NZ279025A; US5475032A; WO1995017876A3; TW299315B; CN1070176C; HK1001768A1; US5488145A; US5780510A; HU9601739D0; MY114178A; KR100370522B1; ATE192736T1; NO962637D0; HRP950358A2; CZ177596A3; SK78896A3; FI962589A; BR9408378A

Description

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DESCRIÇÃO “(2,4-DISSULPOFENIL)-N-TERC-BUTIL-NITRONA, SEUS SAIS E SUA UTILIZAÇÃO COMO AGENTES FARMACÊUTICOS CAPTURADORES DE RADICAIS LIVRES”

Antecedentes da Invenção A presente invenção refere-se a um composto particular derivado de nitrona e aos seus sais e descreve a sua utilização vantajosa como agentes farmacêuticos derivados de nitrona e capturadores de radicais livres.

Informação Subjacente 0 composto g-fenil-terc-butil-nitrona de fórmula 0“

ou “PBN” foi identificado na década de 70 como reagente analítico útil quando utilizado em conjunto com os métodos de ressonância do spin (momento total) do electrão (“RSE”) para auxiliar a efectuar a detecção de radicais livres. Descobriu-se que o composto PBN reage com determinados radicais livres e gera uma espécie química que revela um espectro de RSE característico, o que faz com que seja possivel determinar a presença ou a ausência de radicais livres.

Nos últimos anos da década de 70 e nos primeiros anos da década de 80 a comunidade médica começou a prestar atenção ao papel desempenhado pelos radicais livres em doenças tais como ataques cardíacos, colapsos e não só. O composto PBN passou a ser utilizado mais insistentemente in vitro para a obtenção de provas analíticas da presença de radicais livre em tais casos. Depois passou a ser administrado in vivo em modelos com animais, mais uma vez como substância analítica em experiências para a observação da existência 1

de radicais livres durante simulações de isquémia e não só. Em meados da década de 80 formulou-se a hipótese dos primeiros efeitos terapêuticos possíveis do composto PBN, quando experiências efectuadas com animais com isquémia traumática grave demonstraram que era mais provável a sobrevivência dos animais tratados com o composto PBN do que a dos animais de contraprova.

Em 2 de Maio de 1991 foi publicado o pedido de patente de invenção PCT com o n° WO-91-05552. Este pedido de patente de invenção, que corresponde parcialmente às recém-concedidas patentes de invenção norte-americanas n— 5 825 032 e 5 036 097, descreve o composto PBN e uma família de derivados de PBN que satisfazem à fórmula estrutural H O-

0 O / -CH=N \

II

em que o símbolo R representa H z-c- ou Z; ou

Y e o símbolo n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 5, ou

0 II

e o símbolo Y representa um grupo terc-butilo ou um grupo terc-butilo hidroxilado ou acetilado ou um grupo fenilo substituído. Foi proposta a utilização destes compostos como agentes farmacêuticos para tratar as sequelas de colapsos e de outras doenças pressupostamente associadas a lesões induzidas pelos radicais livres.

Em 1992 foi apresentado um segundo pedido de patente de invenção PCT versando sobre o composto PNB, seus compostos congéneres e sua utilização médica. Este pedido de patente de invenção, com base no anterior pedido de patente de invenção norte-americano com o número de série 716 952 {apresentado a 18 de Junho de 1991), foi publicado em 23 de Dezembro de 1992 com o número WO 92/22290. Esta publicação 2

de 1992 divulgou dois resultados extremamente abrangentes e gerais. Em primeiro lugar, procurou descrever o máximo número possível de doenças associadas aos radicais livres. Tais estados patológicos vão desde doenças do SNC (incluindo colapsos, senescência, hemicrânias, etc.) até às doenças dos órgãos periféricos (incluindo a ateroscle-rose, pústulas de acamados, ferimentos e esforço muscular excessivo) e ainda a exposição à radiação UV, isto para mencionar apenas alguns tópicos. Em segundo lugar, proporcionou uma listagem tão exaustiva quanto possível de potenciais agentes neutralizadores do momento total do electrão (“spin”) .

Para além de um conjunto de materiais de tipo não PBN, este pedido de patente de invenção alargou bastante a definição de compostos de PBN potencialmente úteis, de forma a incluir o composto PBN e os seus derivados de fórmula estrutural

H

O" em que o símbolo X representa um grupo fenilo, imidazolilo, fenotia-

zinilo ou , o símbolo n representa um inteiro entre 1 e 5 e de preferência entre 1 e 3; o símbolo R2 representa independentemente (pode variar dentro da molécula) um átomo de halogéneo ou um grupo alquilo, oxialquilo, alcenilo, oxialcenilo, OH, NH2, NHZ, NZ2, NO, ou

A

II

A A

Y A A 11

-NH-C-Z -0—c-z

II c-z

A

3 -S03H, -OSO3H, SH, -S{alquilo), -S(alcenilo) e haloalquilo, incluindo especificamente -CF3; o símbolo A representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; e o símbolo Z representa um grupo cíclico ou um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada possuindo entre 1 e 6 átomos de carbono; e o símbolo Y representa um grupo terc-butilo que pode ser hi-droxilado ou acetilado em uma ou várias posições; um grupo fenilo

ou um grupo de fórmula estrutural

Nessa época ficou estabelecido que o composto PBN era o de máxima preferência, afirmando-se então que não tinha nenhum efeito mensurável sobre as células normais ou não danificadas, tendo ficado ainda esclarecido que havia diversos derivados que também eram úteis, incluindo os derivados hidroxilados, em especial os compostos 2-, 3- ou 4-hidroxifenil-t-butil-nitrona e fenil-(mono-, di- ou tri--hidroxi)-terc-butil-nitrona; os ésteres de PBN, em especial os ésteres libertadores de 2-, 3- ou 4-hidroxifenil-t-butil-nitrona, tais como os derivados acetoxilados; os compostos 2-, 3- ou 4-carbo-xifenil-t-butil-nitrona; fenil-hidroxibutil-nitrona; os derivados al-coxilados, em especial os derivados alcoxilados libertadores de 2-, 3- ou 4-hidroxi-fenil-t-butil-nitrona, por exemplo, os derivados de PBN de radicais 2-, 3- ou 4-metoxifenilo; e os derivados acetamida, em especial os derivados acetamida libertadores de 2-, 3- ou 4-amino-fenil-t-butil-nitrona; difenil-nitrona (PPN) e os análogos dos derivados de difenil-nitrona; e N-terc-butil-α-(2-sulfofenil)-nitrona.

Campo da Invenção

Descobriu-se agora que há um derivado particular de PBN, e seus sais, que possui propriedades farmacológicas inopinadamente superiores. Embora este derivado de PBN de radical 2,4-dissulfo pertença à grande família de materiais genericamente descritos na publicação WO 92/022290, não vem aí descrito de forma concreta. Também não vêm aí descritas as suas propriedades vantajosas anunciadas. 4 <ί

Previa-se que o composto da presente invenção, com os seus dois grupos sulfonato, tivesse melhor solubilidade em água, mas também se previa que tivesse piores propriedades de transporte através da barreira sangue/cérebro devido ao seu carácter lipofóbico. No entanto, quando o composto da presente invenção foi produzido e testado in vivo verificoU-se a existência de um aumento imprevisível de eficácia, comparativamente com o composto PBN. Este aumento de eficácia teve lugar conjuntamente com um aumento de potência, comparativamente com o composto PBN. Em contraste directo com este notável aumento de potência e de eficácia verificou-se também a existência de uma extraordinária e fortemente significativa diminuição de toxicidade, comparativamente com o composto PBN.

Estes resultados eram iirprevisíveis, atendendo a que a potência terapêutica, conforme descrito na literatura geral sobre relações entre estrutura/actividade dentro de famílias específicas de compostos, co-varia normalmente com a toxicidade. Assim, os compostos de maior. afinidade entre si mantêm as suas taxas de relacionamento entre potência terapêutica e toxicidade. Pelo contrário, o composto da presente invenção afasta-se desta relação presumível, na medida em que a sua potência aumentou e a sua toxicidade diminuiu, comparativamente com análogos estreitamente afins.

Assim sendo, de acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção proporciona o composto de formula estrutural 0

S03H e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas administráveis por via parentérica, v. g. pelas vias intravenosa e oral, as quais incorporam este composto, ou um seu sal, como ingrediente activo.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção descreve a utilização do composto anteriormente referido para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que padeça de uma doença à 5

qual esteja associada uma lesão oxidativa aguda do sistema nervoso central, por exemplo, conforme sucede com um paciente que tenha sido vitima de um colapso, caso em que uma composição farmacêutica que incorpore este composto ou um seu sal é administrada por via pa-rentérica, v.g. por via intravenosa.

De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção descreve a utilização do composto referido anteriormente para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que padeça de uma doença caracterizada por um stress oxidativo lento e prolongado do sistema nervoso central e por uma perda progressiva das funções do sistema nervoso central. Neste tratamento administra-se uma composição farmacêutica que incorpore este composto, ou um seu sal, por via paren-térica, v. g. por via intravenosa, ou de preferência por via oral.

De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção descreve a utilização do composto referido anteriormente para a preparação de um medicamento para reduzir ou melhorar os efeitos secundários resultantes de lesões oxidativas produzidas num paciente sujeito a terapia de cancro. Neste tratamento administra-se uma composição farmacêutica que incorpore este composto por via parentérica, v.g. por via intravenosa, ou oral.

Descrição minuciosa da invenção A presente memória descritiva está organizada segundo as secções a seguir enumeradas.

Descrição abreviada dos desenhos.

Os compostos e os seus sais.

Preparação do composto.

Composições farmacêuticas.

Doenças tratadas e regimes de tratamento.

Exemplos.

Descrição abreviada dos desenhos

Na presente memória descritiva far-se-á referência aos desenhos anexos em que: 6 r

a figura 1 é um fluxograma das reacções utilizadas para a preparação do composto; as figuras 2 (A, B e C) e 3 (A, B, C e D) são dois conjuntos de gráficos que ilustram a variação indesejável da capacidade reguladora da temperatura do corpo de um animal, que tem lugar em função do nivel de dosagem com um agente capturador de radicais livres derivado de nitrona e de acordo com a técnica anterior, contrapondo isto com a inexistência de tal efeito tóxico indesejado quando se utiliza o composto da invenção. A figura 4 (A, B, C e D) ilustra um conjunto de quatro gráficos que demonstram a superioridade do composto da invenção comparativamente com um composto de nitrona estreitamente afim, pertencente à técnica anterior, para o tratamento de estados patológicos de neu-rodegeneração gradual (tal como a doença de Alzheimer), conforme ilustrado pela sua capacidade relativa para interferir com a inacti-vação de enzimas essenciais em solução de proteínas β-amilóides. A figura 5 é um gráfico que ilustra a eficácia do composto da invenção para reduzir o volume final do enfarte observado a seguir a uma oclusão da artéria cerebral média dos ratos. A figura 6 (A, B e C) corresponde a gráficos que ilustram a capacidade do. composto da invenção para reduzir os efeitos secundários em animais que receberam doses excessivas de agentes contra o cancro. O composto e os sais O composto da presente invenção é a substância a-(2,4-dissul-fofenil)-N-terc-butil-nitrona. Este composto também recebe aqui a designação informal de “2,4-dissulfo-PBN” ou “2,4-dissulfonato de PBN”. Esta substância existe numa forma ácida

so3h 7 J- .. í

no estado sólido e também em solução em condições de baixo valor de pH. Esta substância também existe para valores superiores do pH, na forma de um sal ionizado que pode ser representado pelas fórmulas estruturais seguintes cr

em que o símbolo X representa um catião aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Mais vulgarmente o catião é um material mono-valente seleccionado entre sódio, potássio ou amónio, mas também pode ser um catião multivalente combinado com um anião monovalente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, cálcio com um anião cloreto, brometo, iodeto, hidroxilo, nitrato, sulfonato, acetato, tar-tarato, oxalato, succinato, palmoato e outros que tais; magnésio com tais aniões; zinco com tais aniões ou quejandos. Se estas combinações de um catião polivalente e de um anião monovalente estiverem ilustradas nas fórmulas estruturais da presente memória descritiva, o anião monovalente é identificado pelo símbolo “Y”.

Entre estas substâncias, o ácido livre e os sais simples de sódio, potássio ou amónio são as mais preferíveis, sendo também preferíveis, mas um pouco menos, os sais de cálcio e de magnésio.

Preparação do Composto

Conforme pormenorizado na figura 1 e demonstrado no exemplo 1, é possível preparar o composto da presente invenção por meio de uma sequência de reacção em dois passos. No primeiro passo, converte-se nitrato de butilo terciário, comercialmente disponível, (2-metil-2--nitropropano) , na correspondente amina N-hidroxilada, utilizando para tal um catalisador adequado, tal como um catalisador de ácido 8 , i- .. t:

acético/zinco activado ou um catalisador de amálgama de mercúrio/ /alumínio. Esta reacção pode durar entre 0,5 e 12 horas e em especial pode durar sensivelmente cerca de 2 a 6 horas a. uma temperatura compreendida aproximadamente entre 15°C e 100°C num meio de reacção líquido, tal como uma mistura de álcool/água, no caso de se utilizar o catalisador de zinco, ou então numa mistura de éter/água, no caso de se utilizar o catalisador de amálgama de alumínio. No segundo passo a hidroxilamina recentemente formada vai reagir com o ácido 4-formil-l,3-benzeno-dissulfónico, normalmente com um excesso ligeiro da amina que estiver a ser utilizada. Esta reacção pode ter lugar em condições de temperatura semelhantes. De um modo geral, esta reacção fica completa num período compreendido entre 10 horas e 24 horas. O produto assim formado é o ácido livre e caracteriza-se pelo facto de possuir um peso molecular de 89 g/mole. É um material pulveriforme branco que se decompõe ao ser aquecido. Caracteriza-se também por uma solubilidade em água superior a 1 g/mL e pelo seu espectro de ΚΜΝ-'Ή em D20 seguinte: 8,048 ppm (dd, 8,4, 1,7 Hz); 8,836 ppm (d, 8,4 Hz); 8,839 ppm (d, 1,7 Hz); 8,774 ppm (s) .

Os diversos sais podem ser obtidos facilmente, misturando o ácido livre em meio aquoso com dois equivalentes de uma base adequada, por exemplo, KOH para se obter o sal de potássio, e não só.

Composições farmacêuticas O composto (incluindo os seus sais) pode ser formulado em composições farmacêuticas adequadas para administração oral ou paren-térica, v.g. por injecção intravenosa ou intramuscular.

As composições para administração oral podem assumir a forma de soluções ou suspensões no estado líquido, pós, comprimidos, cápsulas e não só. Em tais composições, o 2,4-dissulfonato de PBN, ou um seu sal, constitui normalmente um componente em menor quantidade (digamos que entre 0,1% e 50% em peso), sendo a parte restante constituída por diversos veículos ou substâncias portadoras e adjuvantes de fabrico que são úteis para a formação da forma de dosagem pretendida. Uma composição no estado líquido pode conter veículos 9 Γ <t

adequados, aquosos ou não aquosos, com agentes tampão, auxiliares de administração da suspensão, corantes, aromatizantes e outros que tais. Uma forna no estado sólido por conter, por exemplo, qualquer dos ingredientes ou dos compostos de natureza idêntica a seguir enumerados: um aglutinante, por exemplo, celulose microcristalina, goma de alcatira ou gelatina; um excipiente, por exemplo, amido ou lactose; um agente desintegrador tal como o ácido alginico, ‘Primogel’ ou amido de milho; um agente lubrificante, tal como o estearato de magnésio; um agente para facilitar o deslizamento, tal como o dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante, tal como a sacarose ou a sacarina; ou ainda um agente aromatizante, tal como hortelã--pimenta, açúcar, salicilato de metilo ou aroma de laranja.

No caso das composições injectáveis, estas têm por base vulgarmente solutos salinos estéreis injectáveis ou solutos salinos tamponados com fosfato ou outros veículos injectáveis conhecidos na especialidade. Mais uma vez se afirma que a nitrona activa constitui normalmente um componente em menor quantidade, estando esta compreendida frequentemente entre cerca de 0,05% e cerca de 10% em peso e sendo a parte restante constituída pelo veículo ínjectável e outras substâncias que tais.

Casos tratados e regimes de tratamento

Os casos tratados com a substância 2,4-dissulfo-PBN são classificados geralmente em três grupos. 0 primeiro caso compreende as doenças associadas aos danos oxidativos intensos e agudos de uma região dos sistema nervoso central. Como exemplos de tais casos refere-se os colapsos, os estados de saúde associados aos colapsos, concussão e hemorragias subaracnóideias. Nestes casos, o composto é administrado de modo a que o fármaco entre na corrente sanguínea do paciente tão rápida e directamente quanto possível. Significa isto que se recomenda geralmente a administração intravenosa.

Os níveis de dosagem por via intravenosa para tratar estes casos vão desde cerca de 0,1 mg/kg/hora até um valor pelo menos de 10 mg/kg/hora para períodos compreendidos entre cerca de 1 hora e 10 y

Γ\ cerca de 120 horas e em especial compreendidos entre 24 horas e 96 horas. Também é possível efectuar a administração por meio de um bolus (ampola grande) de reforço prévio, variando entre cerca de 10 mg e cerca de 500 mg, para que sejam alcançados níveis estacionários adequados.

Embora seja preferível a administração intravenosa, também é possível praticar outras formas de administração parentérica, por exemplo, a injecção intramuscular. Neste caso, são utilizados níveis de dosagem idênticos. Uma vantagem imprevisível e fundamental do composto 2,4-dissulfo-PBN reside no facto de poder ser administrado em níveis muitíssimo superiores ao do próprio composto. Conforme se demostrará nos exemplos, comprovou-se que era possível administrar doses até 1000 mg/kg/hora e superiores, ou doses por meio de bolus, para administração intravenosa, compreendidas entre 10 mg/kg e 2500 mg/kg, com o composto 2,4-disSulfo-PBN, ou com um dos seus sais, ao passo que com o próprio composto PBN pode ocorrer a morte ou toxicidade aguda com tais doses. Com o composto 2,4-dissulfo-PBN observa-se uma continuidade positiva inesperada da curva de tipo dose/resposta para estes níveis elevados de dosagem, o que permite concluir sem ambiguidades que um intenso e forte doseamento imediatamente após um colapso ou qualquer outro tipo de trauma pode vir a ter, em muitos casos, um impacto positivo importante na recuperação do paciente. O segundo grupo de casos que respondem favoravelmente ao tratamento com 2,4-dissulfo-PBN é constituído pelos estados patológicos caracterizados por um stress oxidativo lento e prolongado do sistema nervoso central e perda progressiva e gradual das funções do sistema nervoso central. Tais estados patológicos compreendem a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a demência multienfarte, a retinopatia e não só. Cada um destes estados patológicos caracteriza-se por uma perda progressiva de actividade. O composto 2,4-dissulfo-PBN ou os seus sais, quando administrados por via oral ou parentérica, v. g., por via intravenosa, podem atenuar e quase certamente inverter a perda de actividade. No 11 i 4

caso de se pretender recorrer à administração parentérica, v. g. por via intravenosa, são utilizados geralmente níveis idênticos aos utilizados nos casos agudos, mas no limite inferior dos intervalos de variação. Em tais casos, o regime de tratamento pode prolongar-se durante muitos meses ou anos, pelo que a administração por via oral é preferível por razões de conveniência e de tolerância por parte do paciente. No caso da administração oral são prescritas entre uma e três doses orais por dia, cada uma delas variando entre cerca de 0,02 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, estando as doses preferidas compreendidas entre cerca de 0,04 mg/kg e cerca de 5,0 mg/kg.

Como é evidente, é possível administrar o composto 2,4-dissulfo--PBN como único ingrediente activo ou é possível administrá-lo em combinação cm outros agentes. Isto conduz a uma terceira aplicação deste composto.

Um terceiro conjunto de casos que respondem ao tratamento com o composto 2,4-dissulfo-PBN é constituído pelos efeitos secundários observados em pacientes com lesões oxidativas produzidas pela terapia do cancro (doenças neoplásicas). A terapia que produz os danos oxi-dativos (e consequentemente os efeitos secundários) compreende a terapia com radiação (v. g. a radiação gama) e a terapia com agentes quimioterapêuticos que provocam lesões oxidativas. Como exemplos de tais agentes refere-se os antibióticos seleccionados entre daunorru-bicina, doxorrubicina e bleomicina; procarbazina; mostardas azotadas, tais como ifosfamida, melfalano e clorambucil; agentes de alquilação; antimetabolitos; hormonas e antagonistas. A administração do composto 2,4-dissulfo-PBN pode ter o efeito de reduzir o desconforto do paciente durante estas terapias. Além disso, a administração do composto da presente invenção pode aumentar a capacidade dos pacientes para tolerarem estas terapias. É frequente os efeitos secundários das terapias obrigarem a interrompê-las ou impedirem a administração de doses elevadas óptimas ou as frequências rápidas do exercício da tais terapias. Em alguns casos estes efeitos secundários são devastadoramente destrutivos e provocam colapsos cardíacos e outras perdas importantes de actividade. Comprovou-se 12 , ·ί· <.

em animais laboratoriais que o composto da presente invenção pode aumentar a tolerância do paciente a tais tratamentos antineoplásicos.

Nesta terapia, o composto da presente invenção pode ser administrado antes, durante ou após a aplicação de radiações ou de quimioterapia. A administração pode ser parentérica ou oral ou pode ser efectuada por qualquer método que permita que o composto 2,4--dissulfo-PBN entre na corrente sanguínea do paciente.

Observou-se a existência de uma relação positiva de tipo dose/resposta. Posto isto, e tendo em conta a gravidade dos efeitos secundários e as vantagens de se proporcionar a máxima protecção possível ou melhor conforto, pode ser desejável administrar, em alguns casos, grandes quantidades de 2,4-dissulfo-PBN, tais como as indicadas anteriormente para os casos de lesões oxidativas intensas e agudas do SNC. Noutros casos, tais como os referidos a propósito de terapia de doenças neuronais progressivas, é possível utilizar doses mais baixas.

Os exemplos a seguir descritos são representativos de regimes de administração: no caso de monoterapia (apenas adriamicina), as duas combinações de doses representativas são de 10-600 mg de composto I por metro quadrado mais 60 mg de adriamicina por metro quadrado de superfície especifica, tendo lugar o doseamento com adriamicina cada sete ou vinte e um dias. O composto I pode ser administrado antes da adriamicina, por exemplo, até 60 minutos antes, no mesmo momento ou depois, por exemplo, várias horas após e nos dias subsequentes. A dose pediátrica é normalmente inferior para os dois fármacos. É possível utilizar doses mais elevadas para o tratamento de tumores resistentes a multidoses.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Síntese de 2,4-dissulfofenil-N-t-butil-nitrona (Composto “I” nos exemplos subsequentes). Este processo preferido de síntese baseia-se nos trabalhos de R.H. Hinton e E.G. Janzen (J.Org. Chem. 57:2646- 13

r A

-2651, 1992). Conforme se observa na figura 1, este processo implica a condensação de um aldeído com uma hidroxilamina. A hidroxilamina é instável e é preparada no próprio dia em que irá ser utilizada, utilizando como catalisador zinco activado. A síntese decorre do modo seguinte:

Produtos químicos necessários previamente 1. etanol a 95% 2. 2-metil-2-nitropropano 3. zinco em pó 4. ácido acético glacial 5. éter dietílico 6. solução saturada de cloreto de sódio 7. sulfato de magnésio no estado sólido e anidro 8. ácido 4-formil-l,3-benzeno-sulfónico (PM 310,21 g/mol), sob a forma de sal dissódico no seu estado hidratado 9. metanol 10. diclorometano

Procedimento A. Preparação de N-t-butil-hidroxilamina 1. Utilizou-se um balão de fundo redondo com três bocas e com a capacidade de 500 mL equipado com vareta de agitação magnética, adaptador para termómetro, termómetro e funil de adição. 2. Introduziu-se no balão etanol a 95% (350 mL) e arrefeceu-se para 10°C em banho de gelo. 3. Introduziu-se no balão, separadamente, 2-metil-2-ni-tropropano (6,18 g, 0,060 mol) e zinco em pó (5,89 g, 0,090 mol). 4. Verteu-se no funil de adição ácido acético glacial (10,8 g, 0,180 mol) e deixou-se gotejar com um ritmo e com uma agitação vigorosa de tal modo que se manteve a temperatura a baixo de 15°C. 14 7

5. Removeu-se ο banho de gelo e agitou-se a mistura durante 3 horas à temperatura ambiente. 6. Extraiu-se o solvente da mistura, ficando apenas t--butil-hidroxilamina, o zinco em pó e água. 7. Juntou-se diclorometano (50 mL) e filtrou-se a mistura através de um funil de Buchner. 8. Lavou-se com diclorometano (2 x 25 mL) a massa de acetato de zinco que ficou no papel de filtro. 9. Separou-se a água do filtrado, utilizando um funil de separação, e secou-se a camada orgânica sobre sulfato de magnésio. 10. Removeu-se o sulfato de magnésio por filtração através de papel de filtro pregueado e depois eliminou-se o diclorometano por evaporação rotativa. 11. O produto obtido (rendimento a 100% = 5,34 g), que é um líquido viscoso, foi dissolvido em metanol (50 mL) para utilização na fase B. B. Preparação de 2,4-dissulfofenil-N-t-butil-nitrona 1. Utilizou-se um balão de fundo redondo com três bocas e com a capacidade de 250 mL equipado com vareta de agitação, um tubo para dispersão de gás, um funil de adição e um condensador de Friedrichs arrefecido com água a recircular à temperatura do gelo fundente. 2. Introduziu-se nesse balão 200 mL de metanol, ácido 4-formil-l,3-benzeno-dissulfónico (9,31 g, 30 mmol) e N-t-butil-hidroxilamina (25 mL da solução de metanol obtida na fase A, correspondendo ao valor teórico de 30 mmol). 3. Aqueceu-se a mistura de reacção ao refluxo, com uma camisa térmica, ao mesmo tempo que se fazia borbulhar azoto na mistura de reacção, sob agitação. 4. Manteve-se a mistura ao refluxo durante 2 horas. 5. Juntou-se a parte restante da hidroxilamina obtida na fase A. 15 t. 6. A reacção prosseguiu ao refluxo enquanto se fazia borbulhar azoto, pelo menos durante 18 horas, mas não mais do que 24 horas. 7. A mistura de reacção quente foi então filtrada através de um funil de Buchner e o sólido obtido foi lavado com metanol quente. 8. Eliminou-se o metanol por evaporação rotativa, até se obter um óleo amarelo viscoso. 9. Acrescentou-se a mistura quente de etanol:acetona a 1:1 (200 mL) e aqueceu-se a mistura até dissolver o óleo. 10. Deixou-se a solução arrefecer até ocorrer a cristalização do produto. 11. Recolheu-se o produto através do funil de Buchner e secou-se in vácuo de um dia para o outro. 12. A reacção proporciona tipicamente um rendimento de 75% na obtenção do composto I sob a forma de um pó branco.

Exemplo 2 Síntese alternativa de 2,4-dissulfo-fenil-N-t-butil-nitrona (Composto I) . Este método havia sido já desenvolvido e foi utilizado para a preparação de amostras do composto utilizado em diversas experiências indicadas nos exemplos da presente memória descritiva. O produto obtido neste exemplo é em tudo idêntico ao produto do Exemplo 1. Este método de síntese é o que a seguir se descreve.

Substâncias químicas necessárias previamente 1. uma folha de alumínio cortada em cinco tiras com 5 cm de largura e enroladas de modo a formarem um cilindro com um diâmetro de cerca de 1 cm 2. cloreto de mercúrio (II) (9,68 g em 476 mL de água) 3. etanol 4. éter (6 L) 5. água purificada 16 . ·>,

6. 2-metil-2-nitropropano 7. hidróxido de sódio 2M (80 g em 1 L de água) 8. sulfato de magnésio no estado sólido e anidro 9. ácido 4-formil-l,3-benzeno-sulfónico (PM 310,21 g/mol).

Procedimento A. Preparação de N-t-butil-hidroxilamina 1. Os cilindros de fita de alumínio foram mergulhados numa solução de HgCl2 durante 15-30 segundos e depois foram mergulhados em etanol e finalmente mergulhados em éter, tendo sido então colocados num balão de 5 L que continha 500 mL de éter dietílico e 21,4 mL de água 2. Montou-se no balão um funil de gotejamento com a capacidade de 250 mL, para equilibrar a pressão, um dispositivo mecânico de agitação, uma válvula de admissão de azoto e um condensador de Friedrichs arrefecido com água a recircular à temperatura de fusão do gelo. 3. Agitou-se a mistura durante 10 minutos. 4. Acrescentou-se 2-metil-2-nitropropano (71,68 g, 75,5 mL), utilizando para tal o funil de gotejamento, a um ritmo tal que permitiu manter um refluxo vigoroso. NOTA: É necessário que a adição fique completa em menos de 20 minutos, senão o rendimento cai de forma significativa. 5. À medida que a adição prosseguiu, acrescentou-se o éter em porções de 500 mL. A finalidade disto consistiu em manter uma concentração do produto tão alta quanto possível, sem que ocorresse a formação de um gel. É possível juntar até 2 litros de éter sem que haja efeitos prejudiciais sobre o rendimento. 6. Itoa vez completada a dição de 2-metil-2-nitropropano, agitou-se a mistura de reacção durante mais 30 minutos. 17 4

7. A solução cinzenta resultante foi então filtrada por aspiração em três lotes para se lhe remover os sais de alumínio. 8. Lavou-se com 1 L de éter cada porção de massa filtrada. 9. Qualquer das camadas combinadas foi lavada com 300 mL de NaOH 2M que depois foi seca sobre MgSOj e concentrada ín vácuo para proporcionar vim sólido branco macio. 10. A substância sólida obtida funde a uma temperatura mesmo acima da temperatura ambiente, mas foi possível secá-la ainda mais numa mufla hipobárica (durante não mais do que alguns minutos) para proporcionar entre 38 e 45 g de vim produto sólido. 11. Este produto sólido pode ser utilizado tal qual ou pode ser purificado por recristalização a partir de pentano. 12. Peso molecular = 80 g/mol. B. Preparação de 2,4-dissulfofenil-N-t-butil-nitrona 1. Utilizou-se vim balão de 250 mL equipado com vareta de agitação e com um condensador de Friedrichs arrefecido com água a recircular à temperatura do gelo fundente. 2. Introduziu-se no balão 71,8 mL de metanol, 14,5 g de ácido 4-formil-l,3-benzeno-dissulfónico (46,7 mmol, 1 eq.) e 5,0 g de N-t-butil-hidroxilamina (56,2 mmol, 1,2 eq.). 3. Manteve-se a mistura ao refluxo de vim dia para o outro 4. Transferiu-se o produto de reacção para um balão de fundo redondo e evaporou-se rotativamente, até à secura. 5. Amassou-se o resíduo sólido com éter e decantou-se o éter (amarelo). 18

6. Repetiu-se o passo 5. 7. 0 produto obtido (“Composto I”) recristalizou a partir de metanol, a seguir a uma filtração do metanol quente, para se lhe remover as substâncias precipitadas insolúveis, tendo a recristalização ocorrido duas vezes a partir de metanol.

Exemplo 3

Foram feitas várias experiências para se comparar in vivo a eficácia do composto 2,4-dissulfo-PBN (“Composto I”), do composto PBN e de dois compostos de monossulfato de PBN, enquanto agentes que conferem protecção contra a perda de neurónios a seguir a uma isquémia cerebral e a lesões por reperfusão. 0 procedimento experimental é o que foi descrito por W. Chevion no artigo intitulado “Oxygen free radical involvement in ischemia and reperfusion injury to brain, Neuroscience Letters, 88 (1988), 233. Nestas experiências administrou-se um composto que se pretendia estudar a grupos de seis gerbilos que receberam uma dose por via i.p. 30 minutos antes de uma oclusão bilateral das carótidas com a duração de 5 minutos. Mediu-se a densidade dos núcleos neuronais num campo de 100 pm. Foram utilizadas duas contraprovas: animais de contraprova que não receberam nenhum dos compostos que se pretendia estudar e animais de contraprova que não receberam nenhum dos compostos que se pretendia estudar nem tinham isquémia cerebral. Conforme ilustrado no quadro 1, o composto da presente invenção revelou vantagens invulgares quando comparado com os compostos da técnica anterior. Em primeiro lugar, verifica-se que para níveis de dosagem fracos, por exemplo, da ordem de 3,2 mg/kg, o composto I é 2-3 vezes mais potente em termos de prevenção das perdas neuronais. Para níveis mais elevados verifica-se que o composto I é capaz de proporcionar uma protecção completa contra as perdas neuronais, uma vez que os cérebros estudados apresentaram densidades neuronais idênticas às dos animais de contraprova não isquémicos. Os compostos da técnica anterior, para tais níveis de dosagem, ou são tóxicos ou proporcionam 19 i , Λ

graus de protecção significativamente mais baixos. Estes resultados traduzem um nítido aumento de potência, em termos de protecção neu-ronal, do composto I comparativamente com o PBN e com dois análogos estreitamente afins e permitem concluir que houve uma diminuição inesperada de toxicidade comparativamente com o composto PBN. QUADRO 1 Núcleos neuronais / canvpo de 100 ym PBN 2-sulfo 3-sulfo Compt. I Animal não isquémico de 4,21 4,21 4,21 4,21 contraprova (0,43) (0,43) (0,43) (0,43) Animal isquémico de 0,58 0,58 0,58 0,58 contraprova (0,28) (0,28) (0,28) (0,28) 3,2 mg/kg 0,43 0,73 0,35 1,43 (0,18) (0,34) (0,21) (0,31) 10 mg/kg 1,13 0, 68 0,81 2,57 (0,39) (0,31) (0,40) (0,25) 32 mg/kg 1,83 0,73 1,63 3,53 (0,21) (0,31) (0,35) (0,41) 50 mg/kg 3,11 1,01 1, 63 4,11 (0,29) (0,61) (0,35) (0,43) 100 mg/kg 3, 68 0,93 1,93 4,18 (0,71) (0,53) (0,39) (0,49) 320 mg/kg 3,78 1,11 1,78 4,23 (0,43) (0,41) (0,40) (0,39) 1000 mg/kg Tóxico 0,98 1,58 4,11 3200 mg/kg Tóxico (0,43) (0,38) (0,41) 4,18

Exemplo 4

Procedeu-se à realização de iam conjunto de experiências em que o composto I foi comparado com o composto PBN e com dois análogos 20 /7 de sulfonato num tratamento pós-isquémia. Utilizou-se o método geral descrito no exemplo 1, mas os compostos estudados foram administrados sob a forma de uma dose única por via i.p. 30 minutos após a re-perfusão a seguir a uma isquémia com a duração de 5 minutos. Os resultados estão agrupados no quadro 2. O quadro 2 permite concluir, mais uma vez, que o composto da presente invenção é mais potente para doses baixas e mais potente e menos tóxico para doses elevadas. Mais uma vez se conclui também que a toxicidade interfere com a capacidade dos compostos da técnica anterior, impedindo-os de serem utilizados em doses elevadas equivalentes aos níveis a que o composto da presente invenção proporciona uma terapia extraordinariamente eficaz. QUADRO 2 Núcleos neuronais / campo de 100 pm PBN 2-sulfo 3-sulfo Compt. I Animal não isquémico de 4,18 (-» 00 00 rH 4,18 contraprova (0,59) (0,59) (0,59) (0,59) Animal isquémico de 0,85 0,85 0,85 0,85 contraprova (0,19) (0,19) (0,19) (0,19) 32 mg/kg 1,09 ND ND 1, 83 (0,31) (0,41) 50 mg/kg 1,85 0, 68 0,73 2,73 (0,49) (0,31) (0,34) (0,39) 100 mg/kg 2,11 0,78 1,09 3,41 (0,51) (0,23) (0,48) (0,37) 320 mg/kg 2,25 0,81 0,93 3,55 (0,43) (0,31) (0,48) 1000 mg/kg Tóxico ND ND 3, 68 (0,39) 21 ¢- *

Exemplo 5

Neste exemplo compara-se o composto I com o composto PBN para se determinar a eficácia relativa em termos de protecção das perdas neuronais, quando administrado por via i.v. 60 minutos após o inicio da reperfusão a seguir a uma isquémia com a duração de 5 minutos nos gerbilos, tendo sido utilizado para tal o método de ensaio geral descrito no Exemplo 1. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 3 e permitem concluir que o composto I proporciona um beneficio terapêutico significativamente maior no protocolo de tratamento clínico a seguir a lesões cerebrais. QUADRO 3 N=6 por grupo mg/kg (dose única) 0, 0 0,5 1,0 10 Soluto salino, sem • 4,11 - - - isquémia (0,28) Soluto salino, com 0, 93 - - - isquémia (0,17) PBN - 0,83 1,07 1,23 (0,23) (0,29) (0,31) Composto I - 1,25 1,75 2,43 (01,9) (0,28) (0,31) Nem o composto PBN nem o composto I tiveram qualquer efeito sobre a densidade neuronal nos gerbilos de contraprova sem lesões cerebrais.

Exemplo 6

As lesões cerebrais podem manifestar-se através de alterações do comportamento. Nesta experiência foram testados seis gerbilos jovens adultos (com a idade de 3 a 4 meses) para se determinar a sua capacidade para executarem um teste num labirinto de 8 caminhos, 22 τ' r

decorridas 24 horas após um fenómeno isquémico, conforme descrito no Exemplo 1. Comparativamente com os animais não isquémicos, cometeram muito mais erros quando não foram tratados. Administrou-se o composto PBN e o composto I a determinados animais do estudo. Conforme resumidamente se indica no quadro 4, os gerbilos tratados com doses elevadas de composto I praticaram níveis de erro indistinguíveis dos praticados pelos animais não isquémicos. O composto PBN foi menos eficaz. Isto demonstra que o composto I pode conferir protecção contra a perda de memória recente temporal/espacial a seguir aos erros isquémicos (após 24 horas) num ensaio em labirinto radial de 8 caminhos em que foram experimentados gerbilos jovens a seguir a uma isquémia com a duração de 5 minutos. QUADRO 4 N=6 por grupo mg/kg/hr durante 24 horas 0,0 1,0 32 50 100 animais de 4,1 - - - contraprova (0,38) pós-isquémia 37, 6 - - - (4,85) PBN - 29, 8 18,19 6,23 5, 83 (7,27) (5,83) (0,71) (0,49) Composto I - 14, 63 7,19 4,28 4,11 (3,81) (0,81) (0,29) (0,19)

Exemplo 7

Neste exemplo determinou-se a capacidade do composto da presente invenção para reduzir o volume do enfarte a seguir a um fenómeno isquémico. Conforme ilustrado minuciosamente no quadro 5, verificou--se que tanto o composto PBN como o composto I eram eficazes em doses reduzidas, mas em doses elevadas o composto I proporcionou a melhor protecção e o composto PBN revelou ser tóxico. 0 quadro 5 mostra o volume do enfarte observado quando o composto de estudo foi admi- 23 7 . »

nistrado por via i.v. 60 minutos após a oclusão da região cerebral média e prosseguiu durante 24 horas, em murganhos da estirpe C57BL/6J. QUADRO 5

Volume do enfarte em mm3 Pós-tratamento (mg/kg/hr) 0,0 1,0 10 100 Animais de contraprova sem 0 - - - isquémia Soluto salino, isquémia 23 _ (2) PBN - 17, 7 13, 8 Tóxico (2,8) (2,3) Composto I - 16,8 12,7 8,3 (1,7) (3,93) (0,71)

Exemplo 8

Neste estudo fez-se a comparação do composto I e do composto PBN em termos da sua capacidade para conferirem protecção contra a letalidade (percentagem de sobrevivos) em gerbilos adultos (com a idade de 18 a 24 meses, n=12 por grupo), no caso de isquémia com uma duração de 10 minutos, quando a administração foi efectuada 30 minutos antes da isquémia. Conforme se observa no quadro 6, o composto I é superior em todos os niveis de dosagem e proporcionou uma protecção completa para níveis elevados, ao passo que o composto PBN é apenas parcialmente eficaz.

Pré-tratamento QUADRO 6 0,0 10 32 100 320 (mg/kg) Soluto salino 11 _ _r _ PBN 42 50 75 92 Composto I 50 75 100 100 24

Exemplo 9

Uma vantagem importante do composto da presente invenção, quando comparado com o composto PBN já conhecido, é o seu notável nivel exíguo de toxicidade. Conforme se observa no quadro 7, determinou-se a letalidade aguda em murganhos da estirpe C57BL/6L, com base nas quantidades variáveis de doses singulares de nitrona, administradas por via i.p.. O composto PBN revelou uma toxicidade significativa para níveis de dosagem de 560 mg/kg. O composto I não revelou nenhuma toxicidade para doses quase vinte vezes maiores. QUADRO 7 mg/kg % sobrevivos 320 560 1000 3000 10000 n = 20 murganhos PBN 100 25 0 0 0 Composto I 100 100 100 100 100

Exemplo 10

Outro efeito sistémico indesejável que foi observado in vivo com capturadores de radicais nitrona foi uma diminuição da temperatura do corpo. Esta toxicidade pode ter graves consequências para a saúde e também pode complicar o diagnóstico de outras doenças. Conforme indicado nas figuras 2 e 4, administrou-se o composto da presente invenção a murganhos e gerbilos, segundo níveis elevados da ordem de 1000 mg/kg, sem que tivesse havido nenhuma diminuição sensível da temperatura. Pelo contrário, o composto PBN, já conhecido, induziu uma diminuição de 8°C na temperatura corporal para doses da ordem de 500 mg/kg.

Exemplo 11

Testou-se o composto da presente invenção para se determinar a sua eficácia no tratamento de estados patológicos caracterizados por um stress oxidativo lento e prolongado no sistema nervoso central e pela perda gradual e progressiva de actividade do sistema nervoso 25

central, testando a sua eficácia num modelo de estudo da doença de Alzheimer (“DA”).Este modelo assenta no seguinte: estudos recentes demonstraram que associadamente à idade há um aumento da oxidação das proteínas e da perda de actividades enzimáticas no cérebro de indivíduos idosos; tanto as culturas teciduais de fibroblastos retirados de indivíduos idosos como as culturas de eritrócitos retirados de indivíduos de diversas idades revelaram a existência de um aumento exponencial do teor em carbonilo nas proteínas (constitui uma medida da oxidação das proteínas) e uma diminuição das actividades das enzimas marcadoras; a oxidação das proteínas do cérebro aumenta progressivamente ao longo do período de vida de cada indivíduo.

Também foi estudada em diversos modelos diferentes a função do péptido precursor amilóide anormal, nos fenómenos de transformação e no metabolismo na DA. Estudos realizados in vitro com culturas neuronais do hipocampo embriónico e também neuronais/gliais demonstraram que a substância βΑΡ (1-40) produz cítotoxicidade ao longo de um período prolongado de co-incubação. Quando este péptido foi administrado por infusão nos cérebros dos ratos produziu-lhes lesões.

Alguns dos fragmentos de compostos da substância βΑΡ que foram estudados também são neurotóxicos [v. g. βΑΡ (25-35)]. Presume-se que a neurotoxicidade seja mediada, simultaneamente através dos receptores do glutamato e também através de mecanismos de tipo diferente dos receptores do glutamato. Estudos de culturas neuronais, efectuados por microscopia confocal, demonstraram que a exposição á substância βΑΡ (1-40) tem como resultado um stress oxidativo [diclorofluoresceína e maior quantidade de cálcio intracelular livre Fura-2].

Comprovou-se que os fragmentos de βΑΡ podem inactivar directamente a glutamina-sintetase (GS) e a creatina-cinase (CK) em extractos de tecidos e nas células gliais e nos neurónios de hipocampo criados em cultura (ver A e B na figura 4) . Os desenhos A e B da figura 4 ilustram a inactivação da glutamina-sintetase e da creatina-cinase em função da dose de AP (25-35) . Procedeu-se à preparação das 26 f , *'

fracções citossólicas do neocórtex dos gerbilos e fez-se a determinação das actividades enzimáticas. As amostras foram incubadas na presença de concentrações diferentes do péptido durante 10 minutos antes da experiência. Os símbolos a cheio representam os efeitos do fragmento 25-35 que ocorre naturalmente. Os círculos em branco indicam que a sequência reversa (35-25) não teve nenhum efeito sobre a actividade enzimática. Os triângulos em branco indicam que a sequência desordenada de aminoácidos também não teve nenhum efeito sobre as actividades enzimáticas, comparativamente com o efeito do fragmento 25-35. Cada ponto obtido é o valor médio ± D.P. de 5 observações. As fontes celulares de radicais livres derivadas de βΑΡ e outras constituem um determinante importante do início e da evolução da DA. Conforme se demonstra em C e D na figura 4, tanto o composto I como o composto PBN revelam possuir capacidade para protegerem a GS e a CK contra os efeitos dos fragmentos de βΑΡ. Os desenhos C e D da figura 4 ilustram os efeitos protectores da co-incubação das fracções citossólicas com βΑΡ (25-35) (0,4 mg/mL) em combinação com concentrações diferentes do composto PBN (círculos em branco) ou de composto I (círculos a cheio). Cada ponto obtido é o valor médio ± D.P. de 3 observações. Conforme se vê nos desenhos C e D, o composto I proporciona uma protecção completa e eventualmente pode mesmo ser capaz de inverter os efeitos da oxidação. Pelo contrário, a eficácia do composto PBN é bastante limitada, uma vez que tende assimptoti-camente para um nível de protecção bastante incompleta.

Exemplo 12

Foram feitas experiências para demonstrar melhor a eficácia do composto da presente invenção no que diz respeito à sua capacidade para impedir os danos, causados por colapsos, no sistema nervoso central.

Resultados da isquémia focal dos ratos

Efectuou-se um conjunto de dois estudos para se determinar a eficácia do composto I num modelo de isquémia focal do rato. Neste 27

modelo foram utilizados ratos da estirpe Sprague Dawley (200 - 300 g) que experimentaram uma oclusão permanente da artéria cerebral média (OACM), para lhes induzir um colapso focal. Administrou-se-lhes o composto I após a oclusão permanente, em primeiro lugar sob a forma de bolus (ampola grande) para administração intraperitonial (i.p.) e depois por infusão continua por via intravenosa (i.v.) durante o período restante até às 24 horas após o colapso. As doses de composto I utilizadas foram de 100 mg/kg, i.p., e depois 4,2 mg/kg/hr, i.v., ou então 10 mg/kg, i.p. e depois 0,42 mg/kg/hr, i.v..

Os ratos foram sacrificados três dias após o colapso, tendo os tecidos sido tratados histologicamente com o recurso a técnicas de contraste com trifenil-tetrazólio e tendo sido determinado quantitativamente o volume do enfarte e a área da necrose celular total com recurso à análise de imagens. Os resultados destas experiências estão representados graficamente na figura 5 e demonstram que o composto I proporciona uma protecção significativa de aproximadamente 70% nos dois estudos.

Comparação com os resultados indicados na literatura.

Recentemente foram apresentados dados semelhantes para o composto PBN, NÃO pertencente à presente invenção, por Caio e Phillis (Brain Research 664: 267-272, 1994). Nos estudos efectuados por estes investigadores os ratos experimentaram uma oclusão permanente da artéria cerebral média (OACM) e uma oclusão da artéria carótida comum. O composto PBN foi-lhes administrado por via i.p. à razão de 100 mg/kg em momentos diversos após o colapso. Os ratos foram sacrificados dois dias após o colapso e determinou-se quantitativamente o volume do enfarte, recorrendo à técnica de contrastação com trifenil-tetrazólio.

Quando o composto PBN foi administrado decorridas 0,5, 5, 17, 29 e 41 horas após o colapso, ou decorridas 5, 17, 29 e 41 horas após o colapso, o volume do enfarte foi reduzido em cada caso aproximadamente 50%. A dose cumulativa de PBN administrada para se conseguir uma protecção de 50% é no mínimo 4 vezes superior à quantidade 28

duas estirpes de murganhos. As doses de composto I até 300 mg/kg, sem tratamento com a adriamicina, não tiveram nenhum efeito sobre a sobrevivência nestas duas estirpes de murganhos. O pré^tratamento com o composto I, à razão de 30 ou 100 mg/kg, originou desvios relacionados com a dose na. curva que traduz o efeito da dose de adriamicina com a letalidade. A figura 6 ilustra os resultados obtidos com os murganhos da estirpe DBA/2J. Uma dose de composto I, correspondente a 100 mg/kg, produziu um desvio 5 vezes maior para direita (no sentido da menor letalidade). Assim sendo, a combinação do composto I com a adriamicina teve como consequência um aumento nítido da dose máxima tolerada. Estas doses superiores estão no intervalo em que seria possível aniquilar eficientemente os tumores multirresistentes aos fármacos.

Testes Comparativos 0 pré-tratamento com PBN teve como resultado um ligeiro desvio para a direita na curva que traduz os efeitos em função das doses de adriamicina. Embora a dose do composto I possa ser aumentada até 300 mg/kg em combinação com adriamicina, comprovou-se que havia um limite superior para esta combinação com o composto PBN. Uma dose de composto PBN à razão de 100 mg/kg produziu uma ligeira sedação e à razão se 300 mg/kg proporcionou uma nítida sedação e uma certa toxicidade combinada (letalidade de 10-20%). A combinação de composto I/adriamicina não produziu nenhuma toxicidade combinada para doses do composto I até 300 mg/kg.

Exemplo 14

Testes para comprovar a segurança

Procedeu-se à realização de testes com o composto I e com composto PBN para verificar a sua toxicidade aguda em ratos da estirpe Sprague Dawley (machos com 200-300 g) . Os compostos foram administrados à razão de 1000 mg/kg por via i.p. a grupos de 6 ratos. Ao fim de 3 dias avaliou-se a letalidade. O composto I não provocou nenhuma letalidade, ao passo que o composto PBN foi letal para 5 dos 6 ratos 30 utilizados neste teste. Estes dados confirmam os que foram obtidos com os gerbilos, o que permite concluir que o composto I é muito mais seguro do que o composto PBN.

Lisboa, 21 de Junho de 2000

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula estrutural CT HSO

CH=N (ch3)3 S03H
2. Sal de 0"

aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
3. Sal de acordo com a reivindicação 2, o qual possui a fórmula estrutural

(CH3)3 em que o substituinte X é seleccionado entre o grupo constituído por Na, K, NH4, Ca, Mg, CaY e MgY, em que o símbolo Y representa um anião monovalente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
4. Composição farmacêutica que incorpora o composto da reivindicação 1 num veículo injectável por via parentérica e aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
5. Composição farmacêutica que incorpora o sal de uma qualquer das reivindicações 2 ou 3 num veículo injectável por via parentérica e aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 1
6. Composição farmacêutica que incorpora o composto da reivindicação 1 num veiculo administrável por via oral e aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
7. Composição farmacêutica que incorpora um sal de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3 num veiculo administrável por via oral e aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
8. Utilização da composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 ou 5 para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que tenha tido um colapso, consistindo essa utilização em administrar por via parentérica ao referido paciente uma quantidade eficaz, para tratar um colapso, a um ritmo que seja pelo menos de 0,2 mg/kg/hora.
9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a composição é administrada por via intravenosa.
10. Utilização da composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 ou 7 para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que tenha tido um colapso, consistindo tal utilização em administrar por via oral ao referido paciente uma quantidade eficaz para tratar um colapso.
11. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 ou 5 para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que padeça de uma doença de perda progressiva da actividade do sistema nervoso central, consistindo essa utilização em administrar por via parentérica ao referido paciente uma quantidade eficaz para tratar a perda progressiva da actividade do sistema nervoso central.
12. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a composição é administrada por via intravenosa. 2
13. Utilização da composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 ou 7 para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que padeça de uma doença de perda progressiva da actividade do sistema nervoso central, consistindo tal utilização em administrar por via oral ao referido paciente uma quantidade eficaz, para tratar a perda progressiva de actividade do sistema nervoso central, a um ritmo que seja pelo menos de cerca de 0,1 mg/kg/dia.
14. Utilização da composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 ou 7 para a preparação de um medicamento para mitigar os efeitos secundários provocados num paciente por um tratamento de doenças antineoplásicas que origine lesões oxidativas, consistindo tal utilização em administrar por via oral ao referido paciente uma quantidade eficaz para mitigar os efeitos secundários.
15. Utilização da coirgoosição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 ou 5 para a preparação de vim medicamento para mitigar os efeitos secundários provocados num paciente por um tratamento de doenças antineoplásicas que provoque lesões oxidativas, consistindo tal utilização em administrar por via parentérica ao referido paciente uma quantidade eficaz para mitigar os efeitos secundários.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a composição é administrada por via intravenosa. /
17. Utilização do composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3 para a preparação de um medicamento para tratar pacientes que tenham tido um colapso ou que padeçam de uma doença de perda progressiva da actividade do sistema nervoso central ou para mitigar os efeitos secundários provocados por um tratamento de doenças antineoplásicas que gere lesões oxidativas . 3
18. Utilização da composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 ou 5 para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que tenha tido uma concussão, consistindo tal tratamento em administrar por via parentérica ao referido paciente uma quantidade eficaz para tratar a concussão.
19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que a composição é administrada por via intravenosa.
20. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a quantidade eficaz para tratar a concussão está compreendida entre 0,1 mg/ /kg/hr e 10 mg/kg/hr.
21. Utilização da composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 ou 7 para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que tenha tido uma concussão, consistindo tal utilização em administrar por via oral ao referido paciente uma quantidade eficaz para tratar a concussão. Lisboa, 21 de Junho de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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