SK282403B6

SK282403B6 - 2,4-Disulfonyl-alfa-fenyl-terc-butylnitrón alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Info

Publication number: SK282403B6
Application number: SK788-96A
Authority: SK
Inventors: John M. Carney
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation; University Of Kentucky Research Foundation
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2002-01-07
Also published as: DE69424441T2; US5475032A; NO962637L; BR1100626A; DE69424441D1; HU221167B1; KR100370522B1; GR3034134T3; NZ279025A; CZ177596A3; ATE192736T1; NO962637D0; UA45964C2; US5780510A; ES2145264T3; MY114178A; PT736004E; US5488145A; US5508305A; JP2001010953A

Abstract

Je opísaný 2,4-disulfonyl-alfa-fenyl-terc-butylnitrón vzorca (I) alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ vzorca (II) a vzorca (III), kde X znamená sodík, draslík, amónium, vápnik, horčík, skupinu CaY a MGY, kde Y je farmaceuticky prijateľný jednomocný anión. Ďalej je opísaný farmaceutický prostriedok s ich obsahom na terapiu stavov akútneho intenzívneho oxidačného poškodenia centrálneho nervového systému na orálne alebo parenterálne podanie a ich použitie na výrobu liečiva na liečenie mŕtvice, stavu progresívnej straty funkcie centrálneho nervového systému a na zmiernenie vedľajších účinkov vyvolaných u pacienta oxidačným poškodením spôsobeným antineoplastickou liečbou ochorenia.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka nitrónovej zlúčeniny a jej soli, farmaceutického prostriedku s ich obsahom a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Alfa-fenyl-íerc-butylnitrón

ΟΙ

-C=N-C(CH₃)₃) alebo „PBN“ bol identifikovaný v 70. rokoch ako vhodné farmaceutické činidlo na použitie v spojení s elektrónovou spinovou rezonanciou („ESR“) na detekciu voľných radikálov. PBN sa ukázal ako reagujúci s určitými voľnými radikálmi a generujúci chemické druhy, poskytujúci charakteristické ESR spektrum a tým umožňujúci stanoviť prítomnosť alebo neprítomnosť voľných radikálov.

V neskorších 70. rokoch a skorých 80. rokoch sa lekárska komunita zamerala na úlohu, ktorú hrajú voľne radikály v chorobách, ako sú srdcové záchvaty, mŕtvica a podobne. PBN bol používaný stále viac in vitro na analytické zistenie prítomnosti voľných radikálov v týchto prípadoch. Bol tiež podávaný in vivo vo zvieracích modeloch, znova v analytickej súvislosti na umožnenie sledovania voľných radikálov v priebehu simulácie ischémie a podobne.

V polovici 80. rokov boli uvedené prvé zmienky o možných terapeutických účinkoch PBN, keď sa pri testoch na zvieratách s ťažkou traumatickou ischémiou ukázalo, že PBN-ošetrené zvieratá skôr prežívajú ako kontrolné.

2. mája 1991 bola publikovaná PCT patentová prihláška WO-91-05552. Táto patentová prihláška, ktorá sčasti zodpovedá teraz vydaným US patentom č. 5825032 a 5036097, opisuje PBN a rodinu derivátov PBN definovaných vzorcom

C=N+____ kde

X je fenyl alebo

n

II kde R je H, z-calebo Z; alebo

a n je celé číslo od 1 do 5 alebo o

alebo a Y je terc-butyl alebo hydroxylátovaný acetylatovaný íerc-butyl alebo substituovaný fenyl. Tieto zlúčeniny boli navrhnuté ako farmaceutické činidlá na liečbu stavov po mŕtvici a iných stavov, o ktorých sa uvádza, že súvisia s poškodením voľnými radikálmi.

V roku 1992 bola podaná druhá PCT patentová prihláška riadená na PBN a príbuzné zlúčeniny a ich použitie v medicíne. Táto prihláška založená na US patentovej prihláške č. 716952 (podanej 18.júna 1991) bola publikovaná

23. decembra 1992 ako WO 92/22290. Táto publikácia z roku 1992 poskytuje dva široké a všeobecné opisy. Najprv je robený pokus o opis mnohých chorobných stavov ako je to len možné, ktoré boli spojené s voľnými radikálmi. Tieto zasahujú od stavov CNS ( zahŕňajúcich mŕtvicu, starnutie, migrénu atď.), cez choroby periférnych orgánov (zahŕňajúcich artériosklerózu, preležaniny, rany a nadmernú svalovú námahu) cez vystavenie UV žiareniu, ale len s niekoľkými málo zdôrazneniami. A potom je uvádzaný zoznam mnohých potenciálnych spinových pohlcovačov.

Navyše k celému rozsahu ne-PBN materiálov táto prihláška rozširuje definíciu potenciálne použiteľných PBN zlúčenín na zahŕňajúce PBN a jeho deriváty vzorca

x Y

(R²)

X je fenyl, imidazolyl, fenotiazinyl alebo n je 1-5, výhodne 1-3;

R² je nezávisle (môže sa meniť v molekule) halogén, alkyl, oxyalkyl, alkenyl, oxyalkenyl, OH, NH₂, NHZ, NZ₂, NO,

		A	A
___.0 ---CH=N⁺C^ ,		1	II

A	A		A
II	1		II
---NH-C---Z ,
	—z , —

alebo

A

II

-O—c—z

-SO₃H, -OSOjH, SH, -S(alkyl), -S(alkenyl) a halogénalkyl, najmä zahrňujúci -CF₃;

A = 0 alebo S; a

Z je Ci až C₆ priama, rozvetvená, alkylová alebo cyklická skupina a

Y je terc-butylskupina, ktorá môže byť hydroxylátovaná alebo acetylátovaná v jednej alebo vo viacerých polohách; fenyl alebo skupina (^R2)n —

PBN je označovaný ako v súčasnosti najpreferovanejšia zlúčenina, o ktorej sa uvádza, že nemá žiadny merateľný vplyv na normálne alebo nepoškodené bunky a ako použiteľných je uvádzaných taktiež veľa derivátov, najmä 2-, 3alebo 4-hydroxyfenyl ŕerc-butylnitrón a fenyl (mono, dialebo trihydroxy) ŕerc-butylnitrón; PBN estery, najmä estery, ktoré uvolňujú 2-, 3- alebo 4-hydroxyfenyl-ŕerc-butylnitrón, ako je acetoxyderivát; 2-, 3-, alebo 4-karboxyfenyl íerc-butylnitrón; fenylhydroxybutylnitrón; alkoxylové deriváty, najmä alkoxylové deriváty, ktoré uvoľňujú

2- , 3- alebo 4-hydroxyfenyl-íerc-butylnitrón, napríklad 2-,

3- alebo 4-metoxyfenylderiváty PBN; a acetamidové deriváty, najmä acetamidové deriváty, ktoré uvoľňujú 2-, 3- alebo 4-aminofenyl-íerc-butylnitrón; difenylnitrón (PPN) a analógy difenylnitrónových derivátov; N-íerc-butyl-a-(4

-nitrofenyl)nitrón; a N-/erc-butyl-a-(2-sulfonylfenyl)nitrón.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je 2,4-disulfonyl-d-fenyl-tero -butylnitrón vzorca (I) o

so₃h (i) alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ vzorca (II)

Výhodná je farmaceutický prijateľná soľ 2,4-disulfonyl-a-fenyl-terc-butylnitrónu vzorca (III) o-

kde X znamená sodík, draslík, amónium, vápnik, horčík, skupinu CaY a MgY, kde Y je farmaceutický prijateľný jednomocný anión.

Teraz sa s prekvapením zistilo, že určitý PBN derivát a jeho soli majú neočakávane vynikajúce farmakologické vlastnosti. Aj keď tento derivát, 2,4-disulfonyl PBN patrí do širokej rodiny látok všeobecne opísaných uvedenom patentovom spise číslo WO 92/022290, nie je v tomto spise špecificky opísaný a ani jeho výhodné vlastnosti nebolo možné predpokladať.

O zlúčenine podľa vynálezu s dvoma sulfonátovými skupinami sa predpokladalo, že má zlepšenú rozpustnosť vo vode, ale tiež sa predpokladalo, že má zlý transport cez bariéru krv/mozog vzhľadom na svoj lipofilný charakter. Ale keď bola predložená zlúčenina vyrobená a testovaná in vivo, mala neočakávané zvýšenie účinnosti v porovnaní s PBN. Toto zvýšenie účinnosti sa objavuje spolu so zvýšením potencie v porovnaní s PBN. V priamom kontraste s týmto výrazným zvýšením potencie a účinnosti tu bolo značné a vysoko významné zníženie toxicity v porovnaní s PBN.

Tieto výsledky sa nedali očakávať, pretože vo všeobecnej literatúre sa vzťahy štruktúra/aktivita v špecificky definovanej rodine zlúčenín terapeutickej účinnosti typicky spoločne mení s toxicitou. Najbližšie príbuzné zlúčeniny udržujú svoj pomer terapeutickej účinnosti k toxicite. Naopak zlúčenina podľa vynálezu sa odchyľuje od tohto očakávaného vzťahu, keď sa jej účinnosť zvyšuje a jej toxicita sa znižuje vzhľadom na blízko príbuzné analógy.

V druhom aspekte poskytuje vynález parenterálne, napr. intravenózne a orálne podávateľné farmaceutické prípravky, obsahujúce túto zlúčeninu alebo jej soľ ako účinnú zložku.

V ďalšom aspekte poskytuje vynález použitie zlúčeniny podľa vynálezu na výrobu liečiva na liečenie mŕtvice na parenterálne a intravenózne podávanie, pričom dávková forma obsahuje najmenej asi 0,2 mg/kg/h, ako aj na orálne podávanie.

V ďalšom aspekte poskytuje vynález použitie zlúčeniny podľa vynálezu na výrobu liečiva na liečenie stavu progresívnej straty funkcie centrálneho nervového systému na parenterálne a intravenózne podávanie, ako aj na orálne podávanie, pričom dávková forma na orálne podávanie obsahuje najmenej asi 0,1 mg/kg/deň.

V ďalšom aspekte poskytuje vynález použitie zlúčeniny podľa vynálezu na výrobu liečiva na zmiernenie vedľajších účinkov vyvolaných u pacienta oxidačným poškodením spôsobeným antineoplastickou liečbou ochorenia na orálne, parenterálne a intravenózne podávanie.

Podrobný opis vynálezu

Podrobný opis vynálezu je členený do nasledujúcich sekcií:

zlúčenina a soli, príprava zlúčeniny, farmaceutické prípravky, použitie zlúčenín podľa vynálezu, stručný opis obrázkov, príklady.

Zlúčenina a soli

Zlúčenina podľa tohto vynálezu je 2,4-disulfonyl-a-fenyl-íerc-butyl-nitrón. Je tu tiež označovaná ako „2,4-disulfonyl PBN“ alebo „PBN 2,4-disulfonát“. Existuje v kyslej forme o

I

C (CH₃) ₃

SO₃H alebo ako pevná v roztoku v podmienkach nízkeho pH. Existuje tiež pri vyššom pH v ionizovanej soľnej forme, ktorá môže byť znázornená ako

o^-

kde X je farmaceutický prijateľný katión. Najbežnejšie je tento katión jednomocný ako sodný, draselný alebo amónny, ale môže to tiež byť viacmocný katión v kombinácii s farmaceutický prijateľným jednomocným aniónom, napríklad vápenatý s chloridovým, bromidovým, jodidovým, hydroxylovým nitrátovým, sulfonátovým, acetátovým, vínanovým, oxalátovým, sukcinátovým, palmoátovým alebo podobným aniónom; horečnatý s uvedenými aniónmi; zinočnatý s týmito aniónmi alebo podobne. Ak sú tieto kombinácie viacmocného katiónu a jednomocného aniónu uvedené v štruktúrnom vzorci, je tu jednomocný anión označený ako „Y“.

Z týchto materiálov sú najviac výhodné voľná kyselina a jednoduché sodné, draselné alebo amónne soli s tým, že o niečo menej sú výhodné vápenaté a horečnaté soli.

Príprava zlúčeniny

Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť pripravená dvojstupňovým reakčným postupom. V prvom stupni sa obchodne dostupný terc-butylnitrát (2-metyl-2-nitropropán)

SK 282403 Β6 prevedie na zodpovedajúci n-hydroxylamín s použitím vhodného katalyzátora, ako je katalyzátor aktivovaný zinok/kyselina octová alebo katalyzátor hlinik/amalgám ortuti. Táto reakcia môže byť uskutočnená za 0,5 až 12 hodín a najmä za asi 2 až 6 hodín, pri teplote asi 15 až 100 °C v kvapalnom reakčnom médiu, ako je zmes alkohol/voda a v prípade katalyzátora na báze zinku alebo zmesi éter/voda v prípade katalyzátora hliníkového amalgám.

V druhom stupni sa čerstvo pripravený hydroxylamín nechá reagovať so 4-formyl-l,3-benzéndisulfónovou kyselinou, typicky sa použije slabý prebytok amínu. Táto reakcia môže byť uskutočnená v podobných reakčných podmienkach. Obvykle je táto reakcia ukončená za 10 až 24 hodín.

Vzniknutým produktom je voľná kyselina a je charakterizovaná molekulovou hmotnosťou 89 g/mol. Je to biely prášok, ktorý sa pri zahrievaní rozkladá. Rozpustnosť vo vode má väčšiu ako 1 gram/ml a ’H NMR spektrum v D₂O 8,048 ppm (dd, 8,4, 1,7 Hz); 8,836 ppm (d, 8,4 Hz); 8,839 ppm (d, 1,7 Hz); 8,774 ppm (s).

Rôzne soli môžu byť ľahko pripravené zmiešaním voľnej kyseliny vo vodnom médiu s dvoma ekvivalentmi vhodnej zásady, napríklad KOH na draselnú soľ a podobne.

Príprava zlúčeniny podľa vynálezu je doložená v príklade 1.

Schematické znázornenie sledu reakcií použitých na prípravu zlúčeniny podľa vynálezu:

CHj

0₂N- C-CHj chj

2-Methyl-2-nitrppro'pon

ZnP^ch hoh kys.octoví

H CHj I I HO-N-C-CH·,

I ^JCHj t -Sulýlhydroxylamín

l-Forroyl- 1.3-benzenauifónovtí kyselín*

H CHj I I

HO-N-C-CHj

CHj

2,4-Oísutfcnyl «tere—butylnitron

WeOH, reflux

Farmaceutické prípravky

Zlúčenina (vrátane svojich solí) môže byť formulovaná do farmaceutických prípravkov vhodných na orálne alebo parenterálne, napr. intravenózne alebo intramuskuláme injekčné podanie.

Prípravky na orálne podanie môžu mať formu kvapalných roztokov alebo suspenzií, práškov, tabliet, kapsúl alebo podobne. V takých prípravkoch je obvykle PBN 2,4-disulfonát alebo jeho soľ minoritnou zložkou (0,1 až 50 % hmotn.) a zvyšok tvoria rôzne vehikulá alebo nosiče a činidlá napomáhajúce vytvoreniu požadovanej dávkovej formy. Kvapalná forma môže zahrňovať vodné alebo nevodné vehikulum s puframi, suspendačnými činidlami, farbivami, príchuťami a podobne.

Pevná forma môže napríklad zahrňovať akúkoľvek z nasledujúcich zložiek alebo zlúčenín podobného charakteru: spojivo, ako je mikrokryštalická celulóza, tragantovú gumu alebo želatínu; prísadu, ako je škrob alebo laktóza, dezintegračné činidlo, ako je alginová kyselina. Primogél alebo kukuričný škrob; lubrikant, ako je stearát horečnatý; glidant, ako je koloidný oxid kremičitý; sladidlo, ako je sacharóza alebo sacharín; alebo príchuťové činidlo, ako je pepermint, cukor, metylsalycilát alebo pomarančová príchuť.

V prípade injektovateľných prípravkov môžu byť tieto bežne na báze injektovateľného sterilného fyziologického roztoku alebo fosfátom pufrovaného salinického roztoku alebo iných ijektovateľných nosičov, ktoré sú známe v odbore. Znova je aktívny nitrón typicky minoritnou zložkou, často od asi 0,05 do 10 % hmotn. a zvyšok tvorí injektovateľný nosič a podobne.

Použitie zlúčenín podľa vynálezu

Stavy liečené 2,4-sulfonyl PBN všeobecne patria do troch skupín. Prvá zahŕňa stavy zahŕňajúce akútne intenzívne oxidačné poškodenia oblasti centrálneho nervového systému. Príklady týchto stavov zahŕňajú mŕtvicu, stavy spojené s mŕtvicou, zmätenosť a subarachnoidnú hemorageu. V tejto súprave sa zlúčenina podáva v takom liečive, z ktorého prechádza do pacientovho krvného prúdu tak rýchlo a priamo, ako je to možné. Obvykle to znamená intravenózne podanie.

Intravenózne dávkové hladiny na liečbu týchto stavov sa pohybujú od asi 0,1 mg/kg/h do aspoň 10 mg/kg/h, všetky počas asi 1 až 120 hodín a obvykle 24 až 96 hodín. Môže byť tiež podaný na začiatku bolus od asi 10 do asi 500 mg na dosiahnutie zodpovedajúcich stálych hladín.

I keď je preferované intravenózne podanie, môžu byť tiež použité iné formy parenterálneho podania, ako je intramuskuláma injekcia. V tomto prípade sú doporučované podobné dávkové hladiny. Neočakávanou a kľúčovou výhodou 2,4-disulfonyl PBN je, že môže byť podávaný v omnoho väčších hladinách, ako sú možné pri samotnom PBN. Ako bolo ukázané v príkladoch, boli dávky až 1000 mg/kg/h a vyššie alebo intravenózne bolusové dávky od 10 do 2500 mg/kg demonštrované ako možné s 2,4-disulfonyl PBN alebo jeho soľami, zatiaľ čo samotný PBN v takýchto dávkach usmrcuje alebo vyvoláva akútnu toxicitu. S 2,4-disulfonyl PBN je tu neočakávane pozitívne pokračovanie krivky dávka/reakcia v týchto vysokých dávkových hladinách s jasným posolstvom, že intenzívne vysoké dávkovanie bezprostredne po mŕtvici alebo inej traume môže v mnohých prípadoch poskytnúť hlavný pozitívny príspevok na uzdravenie.

Druhá skupina stavov, ktoré výborne odpovedajú na

2,4-disulfonyl PBN liečbu, sú stavy charakterizované predĺženým oxidačným stresom nízkeho stupňa centrálneho nervového systému a postupnou stratou funkcie centrálneho nervového systému. Tieto stavy zahŕňajú Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, amyotrofhú laterálnu sklerózu (ALS), multiinfarktovú demenciu, retinopatiu a podobne. Každý z týchto stavov je charakterizovaný progresívnou stratou funkcie. 2,4-Disulfonyl PBN alebo jeho soli, ak sú podávané orálne alebo parenterálne, napr. intravenózne, môžu pomaly a možno reverzne strácať funkciu. Ak je požadované parenterálne, napr. intravenózne podanie, môžu byť použité hladiny podobne ako pri akútnych stavoch, ale všeobecne skôr na spodnej hranici rozsahu.

V týchto prípadoch môže liečebný režim zahŕňať mnoho mesiacov alebo rokov, takže je výhodné orálne dávkovanie z dôvodov pacientovej spokojnosti a tolerancie. Pri orálnom dávkovaní sa podáva jedna až tri orálne dávky na deň, každá od asi 0,02 do asi 50 mg/kg, s výhodnými dávkami asi 0,04 až asi 5,0 mg/kg.

Tretia súprava stavov, ktoré odpovedajú na liečbu s

2,4-disulfonyl PBN sú vedľajšie účinky, ktoré vznikajú u pacientov z oxidačného poškodenia vzniknutého rakovinovou (neoplastická choroba) terapiou. Terapia, ktorá produkuje oxidačné poškodenie (a tým vedľajšie účinky) zahŕňa radiačnú (napr. gama ožarovanie) terapiu a terapiu s oxidačným poškodením spôsobeným chemoterapeutickými či

SK 282403 Β6 nidlami. Príklady týchto činidiel zahŕňajú antibiotiká, ako je daunorubicín, doxorubicín a bleomycín; prokarbazín; dusíkaté horčiny, ako je ifosfamid, melpalan a chlorambucil; alkylačné činidlá; antimetaboiity; hormóny a antagonisty.

Podania 2,4-disulfonyl PBN môžu spôsobiť zníženie pacientovho nepohodlia v priebehu týchto terapií. Navyše podanie zlúčeniny podľa tohto vynálezu môže zvýšiť pacientovu schopnosť tolerovať tieto terapie. Často vedľajšie účinky terapií zosilňujú nepríjemnosť týchto terapií alebo bránia podaniu optimálne vysokých dávok alebo rýchlym frekvenciám týchto terapií. V niektorých prípadoch sú tieto vedľajšie účinky ničivé a vedú k srdcovému zlyhaniu a strate iných hlavných funkcií. V testoch na zvieratách bolo pozorované, že zlúčenina podľa vynálezu môže zlepšiť pacientovu toleranciu k týmto antineoplastickým liečbam chorôb.

V tejto terapii môže byť zlúčenina podľa vynálezu podávaná pred podaním, v priebehu alebo po podaní ožarovania alebo chemoterapie. Podanie môže byť parenterálne alebo orálne alebo akoukoľvek inou metódou, ktorá umožní

2,4-disulfonátu PBN vstúpiť do pacientovho krvného prúdu.

Bol pozorovaný pozitívny vzťah dávka-reakcia. S prihliadnutím k nebezpečnosti vedľajších účinkov a k výhodám poskytnutia maximálnej možnej ochrany alebo zmiernenia, je žiaduce v niektorých prípadoch podávať väčšie množstvá 2,4-disulfonyl PBN ako sú tie, ktoré sú opísané hore pre stavy akútneho intenzívneho oxidačného CNS poškodenia. V iných prípadoch, ako je terapia progresívnej neuronálnej choroby, môžu byť použité nižšie dávky.

Ďalej sú uvedené príklady reprezentatívnych režimov podávania: V monoterapii (samotný adriamycín) sú dávkované dve reprezentatívne dávkové kombinácie 10 až 600 mg zlúčeniny I na štvorcový meter plochy, plus 60 mg adriamycínu na štvorcový meter povrchu s dávkovaním adriamycínu každých sedem alebo dvadsaťjeden dní. Zlúčenina I môže byť podávaná pred adriamycínom, napríklad až 60 minút pred ním, súčasne alebo po ňom, ako je hodinu po a nasledujúce dni. Pediatrická dávka je typicky nižšia pre obidve liečivá. Vyššie dávky môžu byť použité na liečbu multidávkových rezistentných tumorov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

V tomto opise sú odkazy na pripojené obrázky, kde obr. 1 (A, B a C) a 2 (A, B, C a D) sú dve súpravy grafov ilustrujúcich nežiaducu zmenu v schopnosti termoregulácie živočíšneho tela (obr. 1 - myš, obr. 2 - dospelý gerbil (Y)), ktorá sa objavuje ako funkcia hladiny dávky s nitrónovým činidlom, zachytávajúcim radikály, podľa stavu techniky a na rozdiel k tomu stratu takého nežiaduceho toxického účinku so zlúčeninou podľa vynálezu, obr. 3 (A, B, C a D) je súprava štyroch grafov znázorňujúcich, ako je zlúčenina podľa vynálezu vynikajúca vzhľadom na blízko príbuznú nitrónovú zlúčeninu podľa stavu techniky pri liečbe postupujúcich neurodegeneratívnych stavov (ako je Alzheimerova choroba), ako ilustruje jej schopnosť interferovať s beta amyloidovou proteínovou inaktiváciou kľúčových enzýmov v roztoku; obr. 3A sa týka aktivity glutamín syntetázy, obr. 3B sa týka aktivity kreatín kinázy, obr. 3C sa týka aktivity glutamín syntetázy, obr. 3D sa týka aktivity kreatín kinázy, obr. 4 je graf ilustrujúci účinnosť zlúčeniny podľa vynálezu pri znížení okamžitého infarktového objemu pozorovaného po oklúzii strednej cerebrálnej artérie krýs, obr. 5 (A, B a C) znázorňuje akútnu letalitu u DBA/2J myši; grafy ilustrujú schopnosť zlúčeniny podľa vynálezu redukovať vedľajšie účinky vysokých dávok protirakovinových činidiel na zvieratách.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Syntéza 2,4-disulfonylfenyl-N-rerc-butylnitrónu (zlúčenina „I“ v nasledujúcich príkladoch). Táto preferovaná syntéza je založená na práci R.H.Hintona a E.GJanzena (J.Org.Che. 57:2646-2651, 1992). Uvedená syntéza zahŕňa kondenzáciu aldehydu s hydroxylamínom. Hydroxylamín je nestabilný a v deň použitia sa pripravuje čerstvý s použitím aktivovaného zinkového katalyzátora. Syntéza sa uskutočňuje nasledovne:

Potrebné chemikálie:

1. 95 % etanol

2. 2-metyl-2-nitropropán

3. zinkový prach

4. ľadová kyselina octová

5. dietyléter

6. nasýtený chlorid sodný

7. síran horečnatý, bezvodý pevný

8. kyselina 4-formyl-l,3-benzénsulfónová (mol. hmotn. 310,21 g/mol), dvojsodná soľ, hydrát

9. metanol

10. dichlórmetán

Postup

A. Príprava N-íerc-butylhydroxylamínu

1. 500 ml trojhrdlová banka sa vybaví magnetickou miešacou tyčinkou, teplomerovým adaptérom, teplomerom a prikvapkácím lievikom.

2. 95 % etanol (350 ml) sa vloži do banky a ochladí sa na 10 °C na ľadovom kúpeli.

3. Naraz sa pridajú vždy 2-metyl-2-nitropropán (6,18 g, 0,060 mol) a prach zinku (5,89 g, 0,090 mol) 0,90 mol).

4. Do prikvapkácieho lievika sa umiestni ľadová kyselina octová (10,8 g, 0,180 mol) a prikvapkáva sa takou rýchlosťou za intenzívneho miešania, že sa teplota udržuje podl5°C.

5. Ľadový kúpeľ sa odstráni a zmes sa mieša pri teplote miestnosti 3 hodiny.

6. Rozpúšťadlo sa oddestiluje zo zmesi, zostane terc-butylhydroxylamín, octan zinočnatý a voda.

7. Pridá sa dichlórmetán (50 ml) a zmes sa filtruje cez Biichnerov lievik.

8. Koláč octanu zinočnatého na filtračnom papieri sa premyje 2 x 25 ml dichlórmetánu.

9. Voda sa oddelí od filtrátu v oddeľovacom lieviku a organická vrstva sa suší nad síranom horečnatým.

10. Síran horečnatý sa odstráni filtráciou cez prepláchnutý filtračný papier, potom sa dichlórmetán odstráni na rotačnej odparke.

11. Produkt (100 % výťažok = 5,34 g), viskózna kvapalina, sa rozpustí v metanole (50 ml) pred použitím v časti B.

B. Príprava 2,4-disulfonylťenyl-N-íerc-butylnitrónu

1. 3-hrdlová 250 ml banka s guľatým dnom sa vybaví magnetickou tyčinkou, trubičkou na dispergáciu plynu, prikvapkávacím lievikom a Friedrichsonovým chladičom chladeným recirkulujúcou vodou.

2. Do banky sa vloží 200 ml metanolu, kyselina 4-formyl-l,3-benzéndisulfónová (9,31 g, 30 mmol) a N-terc

SK 282403 Β6

-butylhydroxylamin (25 ml metanolového roztoku z časti A, teoreticky 30 mmol).

3. Reakcia sa zahrieva pod refluxom vyhrievacím plášťom za prebublávania reakčnej zmesi dusíkom za miešania.

4. Zmes sa 2 hodiny refluxuje.

5. Pridá sa zvyšok hydroxylamínu z časti A.

6. V refluxovaní sa pokračuje za prebublávania dusíkom aspoň 18 hodín, ale nie viac ako 24 hodín.

7. Horúca reakčná zmes sa filtruje na Btichnerovom lieviku a pevné látky sa premyjú horúcim metanolom.

8. Metanol sa odstráni na rotačnej odparke a získa sa žltý, viskózny olej.

9. Pridá sa horúci 1 : 1 etanol: acetón (200 ml) a zmes sa zahrieva na rozpustenie oleja.

10. Roztok sa ochladí kvôli kryštalizácii produktu.

11. Produkt sa oddelí na Btichnerovom lieviku a suší sa vo vákuu cez noc.

12. Reakcia typicky poskytne 75 % výťažok zlúčeniny I, biely prášok.

Príklad 2

Alternatívna syntéza 2,4-disulfonylfenyl-N-tórc-butylnitrónu (zlúčenina I). Toto je najnovšia vyvinutá metóda, ktorá bola použitá na prípravu vzoriek zlúčeniny použitej v niekoľkých pokusoch uvedených v príkladoch. Produkt z tohto príkladu je vo všetkom zhodný s produktom z príkladu 1. Metóda syntézy je nasledujúca :

Potrebné chemikálie:

1. hliníková fólia narezaná do 5 cm širokých prúžkov a stočená do valca s priemerom asi 1 cm,

2. chlorid ortuťnatý (9,68 g v 476 ml vody),

3. etanol,

4. éter (61),

5. čistá voda,

6. 2-metyl-2-nitropropán,

7. hydroxid sodný, 2M (80 g v 11 vody),

8. síran horečnatý, bezvodý pevný,

9. kyselina 4-formyl-l,3-benzénsulfónová (mol.hmotn. 310,21 g/mol).

Postup

A. Príprava N-Zerc-butylhydroxylamínu

1. Valčeky hliníkovej fólie sa ponoria do roztoku HgCl₂ na 15 až 30 sekúnd, potom sa ponoria do etanolu, potom do éteru a potom sa umiestnia do 5 1 banky obsahujúcej 500 ml dietyléteru a 21,4 ml vody.

2. Banka sa vybaví 250 ml tlak vyrovnávajúcim lievikom, mechanickým miešadlom, prívodom dusíka a Fridrichsovým chladičom chladeným recirkulujúcou ľadovou vodou.

3. Zmes sa mieša 10 minút.

4. Pridá sa 2-metyl-2-nitropropán (71,68 g, 75,5 ml) s použitím prikvapkávacieho lievika takou rýchlosťou, že sa udržuje intenzívny reflux.

Poznámka: Prídavok musí byť ukončený za menej ako 20 minút, inak výťažok významne klesá.

5. Ako prebieha adícia, pridáva sa po 500 ml podieloch éter. Takto sa postupuje na udržovanie koncentrácie produktu tak vysokej, ako je to možné bez tvorby gélu. Môžu byť pridané až 2 1 éteru bez negatívneho vplyvu na výťažok.

6. Po ukončení pridávania 2-metyl-2-nitropropánu sa reakčná zmes mieša ďalších 30 minút.

7. Výsledná sivá suspenzia sa na trikrát odsaje kvôli odstráneniu solí hliníka.

8. Každý filtračný koláč sa premyje 1 1 éteru.

9. Obidve éterové frakcie sa premyjú 300 ml 2M NaOH, potom sa sušia (MgSO₄) a zahustením vo vákuu sa získa hebká biela pevná látka.

10. Pevná látka sa topí práve pri teplote miestnosti, ale mohla byť ďalej sušená vo vákuovej sušiarni ( nie viac ako niekoľko minút), získa sa 38 až 45 g pevnej látky.

11. Pevná látka sa môže použiť samotná alebo byť čistená rekryštalizáciou z pentánu.

12. Molekulová hmotnosť - 89 g/mol.

B. Príprava 2,4-disulfonylfenyl-N-ŕere-butylnitrónu

1. 250 ml banka sa vybaví miešacou tyčinkou a Fridrichsovým chladičom chladeným recirkulujúcou ľadovou vodou.

2. Do banky sa vloží 71,8 ml metanolu, 14,5 g kyseliny

4-formyl-l,3-benzéndisulfónovej (46,7 mmol, 1 ekv.) a 5,0 g N-ŕerc-butylhydroxylamínu (56,2 mmol, 1,2 ekv.).

3. Zmes sa cez noc refluxuje.

4. Reakčný produkt sa prevedie do banky s guľatým dnom a odparí sa dosucha.

5. Pevný zvyšok sa rozotrie s éterom, éter sa zleje (žltý)-

6. Opakuje sa stupeň 5.

7. Produkt („zlúčenina I“) sa kryštalizuje z metanolu a potom sa filtruje z horúceho metanolu a odstráni sa nerozpustená zrazenina a rekryštalizuje sa dvakrát z metanolu.

Príklad 3

Boli uskutočnené série pokusov na porovnanie in vivo účinnosti 2,4-disulfonyl PBN („zlúčenina I“), PBN a dvoch monosulfonátových zlúčenín ako činidiel na ochranu proti neurónovej strate po mozgovej ischémii a reperfúznom poškodení. Postup testu je rovnaký ako uvádza W.Cao, J.M.Camey, A.Duchon, R.A.Floyd a M.Chevion v Oxygen free radical involvement in ischemia and reperfusion injury to brain, Neuroscience Letters, 88 (1988), 233. V pokusoch bola testovaná zlúčenina podávaná skupinám šiestich gerbilov ako jediná dávka 30 min. pred 5 min. bilaterálnej oklúzii karotídy. Bola meraná hustota neuronálnych jadier v 100 mikrometroch. Boli uskutočnené dve kontroly - kontroly, bez testovanej zlúčeniny a bez testovanej zlúčeniny a poškodenia mozgu. Ako je uvedené v tabuľke 1, zlúčenina podľa vynálezu má neočakávané výhody v porovnaní so zlúčeninami podľa stavu techniky. Za prvé je zrejmé, že pri nízkych dávkových hladinách ako je 3,2 mg/kg je zlúčenina I 2-3 krát účinnejšia pri prevencii neuronálnej straty. Pri vysokých dávkových hladinách je zrejmé, že zlúčenina I je schopná dosiahnuť úplnú ochranu pred neuronálnou stratou, pretože testované mozgy majú neuronálnu hustotu zhodnú s neischemickými kontrolami. Zlúčeniny podľa stavu techniky sú buď pri týchto dávkach toxické alebo majú významne nižšie stupne ochrany. Tieto výsledky ukazujú jasné zníženie účinku na neurálnu ochranu pre zlúčeninu I v porovnaní s PBN a dvoma blízko príbuznými analógmi a neočakávané zníženie toxicity v porovnaní s PBN.

SK 282403 Β6

Tabuľka 1

	NeuronuKleárne	jadrá/100	mikrometrová	oblasť
	PBN 2	-SUlfO	4-sulfo	zlúč.I
neischenická	4.21	4.21	4.21	4.21
kontrola	í-43)	(.43)	(.43)	(-43)
ischemická kontrola	0.58	0.58	0.58	0.58
	(.28)	(.28)	(.28)	(.28)
3.2 mg/kg	0.43	0.73	0.35	1.43
	( .18)	(.34)	(.21)	(.31)
10 mg/kg	1.13	0.68	O.BL	2.57
	(.39)	(.31)	(.40)	(.25)
32 mg/kg	1.B3	0.73	1.63	3.53
	(21)	(.31)	(.35)	(.41)
50 mg/kg	3.11 (.29)	1.01 (.61)	1.63 (.35)	4.11 (.43)
100 ng/kg	3.68 (.71)	0.93 (.53)	1.93 (.39)	4.18 (.49)
320 »g/kg	3.78 (.43)	1.11 (.41)	1.78 (.40)	4.23 (.39)
1000 mg/kg	toxický	0.98 (.43)	1.58 (.38)	4.11 (.41)
3200 mg/kg	toxický	-		4.18

Príklad 4

Boli vykonané série pokusov, v ktorých bola zlúčenina I porovnávaná s PBN a dvoma sulfonátovými analógmi v post-ischemickom ošetrení. Bola použitá všeobecná metóda opísaná v príklade 1, ale testované zlúčeniny boli podávané

i.p. ako jediná dávka 30 min. po rcperfuzii po 5 min. ischémie. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2. Tabuľka 2 ukazuje, že zlúčenina podľa vynálezu je opäť účinnejšia pri nízkych dávkach a účinnejšia a menej toxická pri vysokých dávkach. Tiež opäť toxicita interferuje so schopnosťou zlúčenín podľa stavu techniky použiť vysoké dávky, pri ktorých hladina zlúčeniny podľa vynálezu poskytuje dramaticky účinnú terapiu.

Tabuľka 2

Neoronálne jadrá/100 mikrometrová oblasť

	PBN	2-sulfo	3-Sulfo	2100.1
neischemická	4,18	4,18	4,18	4,18
kontrola	(0.59)	(0.59)	(0.59)	(0.59)
ischemická kontrola	0,85 (0.19)	0,85 (0.19)	0,85 (0.19)	0,85 (0.19)
32 ng/kg	1,09 (0.32)	ND	ND	1,83 (0.41)
50 ng/kg	1,85 (0.49)	0,68 (0.31)	0,73 (0.34)	2,73 (0.39)
100 ng/kg	2,11 (0.51)	0,78 (0.23)	1,90 (0.48)	3,41 (0.37)
320 ng/kg	2,25 (0.43)	0,81 (0.31)	0,93	3,55 (0.48)
1000 ng/kg	toxický	ND	ND	3,68

dy opísanej v príklade 1. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 3 a ilustrujú, že zlúčenina I je významne vyšším terapeutickým prínosom v klinických pokusoch uskutočnených po poškodení mozgu.

Tabuľka 3

6 na skupinu	ng/kg	jediná dávka
	0,0	0,5	1,0	10
fyziologický roztok.	4,11	-	-	-
žiadna ischénia	(0,28)
fyziologický roztok.	0,93	-	-	-
žiadna ischénia	(0,17)
PBN	-	0,83	1,07	1,23
		(0,23)	(0,29)	(0,31)
zlúčenina I	-	1,25	1,75	2,43
		(0,19)	(0,28)	(0,31)

Tak PBN, ako aj zlúčenina I mali vplyv na neuronálnu hustotu u kontrolných gerbilov bez poškodenia mozgu.

Príklad 6

Mozgové poškodenie sa môže samé prejavovať zmenami v správaní. V tomto pokuse boli testované mladé dospelé (3-4 mesiace) gerbily na stanovenie ich schopnosti uskutočňovať test v 8-ramennom bludisku 24 hodín po ischemickej príhode opísanej v príklade 1. V porovnaní s neischemickými zvieratami, sa dopúšťajú mnohých chýb, ak neboli ošetrené. PBN a zlúčenina I boli podávané niektoiým testovaným zvieratám. Ako je uvedené v tabuľke 4, gerbily ošetrené vysokými dávkami zlúčeniny I mali hladiny chýb, ktoré sa nelíšili od neischemických zvierat. PBN bol menej účinný. Toto ukazuje, že zlúčenina I môže chrániť pred stratou časovo/priestorovej krátkodobej pamäti po ischémii (24 hod.po) v chybách v 8-ramennom radiálnom bludiskovom teste u mladých gerbilov po 5 min. ischémii.

Tabuľka 4

N-6 na skupinu	ng/kg/h	po 24 hod.
	0,0	1,0	32	50	100
kontrola	4,1 (0,38)				-
postischenická	37,6 (4,85)
PBN		29.8 ( 7,27)	18,19 (5,83)	6,23 (0,71)	5,83 (0,49)
zlúčenina I	-	14,63	7,19	4,28	4,11
	(	3,81)	(0,81)	(0,29)	(0,19)

Príklad 7

Bola schopnosť zlúčeniny podľa vynálezu redukovať objem infarktu po ischemickej príhode. Ako je uvedené v tabuľke 5, bolo pozorované, že zatiaľ čo PBN a zlúčenina 1 sú obidve účinné v nízkych dávkach, poskytuje zlúčenina I pri vysokých dávkach najlepšiu ochranu a PBN je toxický. Tabuľka 5 ukazuje objem infarktu pozorovaný pri podaní testovanej zlúčeniny i.v. po miernej cerebrálnej oklúzii a pokračovanie po 24 hodinách u C57BL/6J myši.

Príklad 5

Zlúčenina I je porovnávaná s PBN na stanovenie relatívnej účinnosti na ochranu pred neuronálnou stratou, ak je podávaná i.v. 60 min. po reperfúzii začínajúcej 5 min. po ischémii u gerbilov s použitím všeobecnej testovacej metó7

SK 282403 Β6

Tabuľka 5 objen Infarktu v mm³

post ošetrenie (mg/kg/h)	0,0	1,0	10 100
kontrola, žiadna ischémia	0	-	-
fyziologický roztok, ischémia	23	-	-
	(2)
PBN	-	17,7	13,8 toxický
		(2,8)	(2,3)
zlúčenina I	-	16,8	12,7	8,3
		(1,7)	(3,93)	(0,71)

Príklad 8

V tejto štúdii boli porovnávané zlúčenina I a PBN pokiaľ ide o schopnosť ochrániť pred letalitou (% prežitia) u starých gerbilov (18 až 24 mesiacov, n=12/skupina) po 10 minútovej ischémii, ak sú podávané 30 minút pred ischémiou. Ako je uvedené v tabuľke 6, zlúčenina I je vynikajúca vo všetkých hladinách dávok a dosahuje úplnú ochranu pri vysokých hladinách, zatiaľ čo PBN je bez zvláštneho účinku.

Tabuľka 6 predbežné ošetrenie (ng/kg) salinický roztok

PBN

0,0	10	32	100	320
11	-	-	-	-
-	42	50	75	92

75

100 100 zlúčenina i

Príklad 9

Dôležitou výhodou zlúčeniny podľa vynálezu v porovnaní so zlúčeninou podľa stavu techniky, PBN, je významne znížená toxicita. Ako je podrobne uvedené v tabuľke 7, bola stanovená akútna letalita u C57BL/6L myši na základe meniacich sa veľkostí jedinej i.p. dávky nitrónu. PBN má významnú toxicitu pri dávke 560 mg/kg. Zlúčenina I nemá žiadnu toxicitu pri dávkach dvadsaťkrát vyšších.

Tabuľka 7

	ng/kg
% prežitia	320	560	1000	3000	10000
n= 20 myší
PBN	100	25	0	0	0
zlúčenina I	100	100	100	100	100

Príklad 10

Ďalším nežiaducim vedľajším účinkom, ktorý bol pozorovaný in vivo s nitrónovým lapačom radikálov, je zníženie telesnej teploty. Táto toxicita môže mať nebezpečné zdravotné následky a môže tiež komplikovať diagnózu iných stavov. Ako je podrobne uvedené na obr. 1 a 3, bola zlúčenina podľa vynálezu podávaná myšiam a gerbilom v hladinách takých vysokých, ako je 1000 mg/kg s nemerateľným znížením teploty. Naopak zlúčenina podľa stavu techniky, PBN poskytla 8 °C zníženie telesnej teploty v dávke iba 500 mg/kg.

Prlkladll

Zlúčenina podľa vynálezu bola testovaná na stanovenie jej účinnosti pri liečbe stavov charakterizovaných protrahovaným oxidačným stresom nízkeho stupňa v centrálnom nervovom systéme a postupnou progresívnou stratou funkcie testovaním jej účinnosti v modeli Alzheimerovej choroby („AD“). Tento model má nasledujúci základ: Štúdie z posledného času demonštrujú, že existuje s vekom spoje né zvýšenie v oxidácii proteínu a stratou enzýmových aktivít v mozgu starých indivíduí. Tkanivové kultúry fibroblastov od starých jednotlivcov a červené krvinky rôzne staré obe majú exponenciálne zvýšenie obsahu proteínového karbonylu (meranie proteínovej oxidácie) a zníženie v markeri enzýmových aktivít. Oxidácia mozgového proteínu progresívne stúpa v priebehu dĺžky života jednotlivca.

Úloha opracovania abnormálneho amyloidného prekurzorového peptidu a metabolizmus v AD boli taktiež uskutočnené v mnohých rôznych modeloch. In vitro štúdie s použitím embryonických hipokampálnych neuronálnych a neuronál/gliových kultúr demonštrujú, že BAP 1-40 produkuje cytotoxicitu v priebehu predĺženej periódy ko-inkubácie. Pri infúzii peptidu do krysích mozgov vznikajú lézie. Niektoré z predpokladaných fragmentov rozkladu BAP sú tiež neurotoxické (napr. βΑΡ (25-35)). Neurotoxicita sa javí byť sprostredkovaná tak mechanizmom glutamátových receptorov, ako aj neglutamátových receptorov. Konfokálne mikroskopické štúdie neuronálnych kultúr demonštrovali, že vystavenie BAP (1-40) vedie k oxidačnému stresu (dichlórfluóresceín a zvýšený intracelulámy voľný vápnik Fura-2).

Bolo demonštrované, že BAP fragmenty môžu priamo inaktivovať glutamín syntetázu (GS) a kreatín kinázu (CK) v tkanivových extraktoch a v kultivovaných hipokampálnych neurónoch a gliách (pozri A a B na obr. 3). A a B na obr. 3 predstavujú od dávky závislú inaktiváciu glutamín syntetázy a kreatín kinázy pôsobením AP (25-35). Boli pripravené cytozolické frakcie z neokortexu gerbilov a boli stanovené enzýmové aktivity. Vzorky boli inkubované v prítomnosti rôznych koncentrácii peptidu 10 minút pred esejou. Plné symboly predstavujú účinky prirodzene sa vyskytujúceho 25-35 fragmentu. Prázdne krúžky znamenajú, že reverzná sekvencia (32-25) nemá žiadny vplyv na enzýmovú aktivitu. Prázdne trojuholníky znamenajú, že divoká aminokyselinová sekvencia nemá žiadny vplyv na enzýmové aktivity v porovnaní s účinkom 25-35. Každý bod predstavuje priemer (+/- s.e.) z 5 stanovení. BAP príbuzný a iné celuláme zdroje voľných radikálov sú dôležitým determinantom začiatku progresie AD.

Ako je doložené na obr. 3 C a D, zlúčenina I a PBN každý má schopnosť brániť GS a CK proti účinkom BAB fragmentov. A a D na obr. 3 predstavuje chrániace účinky ko-inkubácie cytozolických frakcií s BAP 25-35 (0,4 mg/ml) v kombinácii s rôznymi koncentráciami PBN (prázdne krúžky) alebo zlúčeninou I (plné krúžky). Každý bod je priemer (a/- s.e.) z 3 stanovení. Ako je z C a D zrejmé, poskytuje zlúčenina I plnú ochranu a v skutočnosti by mohla byť schopná zvrátiť účinky oxidácie. Naopak PBN účinnosť je veľmi obmedzená, pretože je asymptoticky nastavená v podstate pri neúplnej hladine ochrany.

Príklad 12

Boli uskutočnené pokusy na ďalšiu demonštráciu účinnosti zlúčeniny podľa vynálezu pri prevencii poškodenia centrálneho nervového systému spôsobeného mŕtvicou.

Výsledky krysej fekálnej ischémie

Bolo uskutočnených niekoľko štúdií na stanovenie účinnosti zlúčeniny I v modeli krysej fekálnej ischémie. V tomto modeli boli krysy Sprague Dawley (200 až 300 g) podrobené permanentnej miernej cerebrálnej arteriálnej oklúzii (MCAO) na vyvolanie fekálnej mŕtvice. Zlúčenina I bola podaná po permanentnej oklúzii najprv ako intraperitoneálna (i.p.) bolusová dávka a potom intravenózne (i.v.) kontinuálnou infúziou v priebehu zostávajúceho času do 24 hodín po mŕtvici. Použité dávky zlúčeniny I boli buď

SK 282403 Β6

100 mg/kg i.p., potom 4,2 mg/kg/h, i.v. alebo 10 mg/kg i.p. a potom 0,42 mg/kg/h i.v.

Krysy boli usmrtené 3 dni po mŕtvici, tkanivá boli spracované histologický s použitím techniky trifenyltetrazoliového vyfarbovania a s použitím zobrazovacej analýzy bol stanovený objem infarktu, plocha celkovej bunkovej nekrózy. Výsledky týchto pokusov sú znázornené graficky na obr. 4 a demonštrujú, že zlúčenina I poskytuje významnú ochranu, približne 70 % v obidvoch štúdiách.

Porovnanie s výsledkami z literatúry.

Podobné údaje boli uvádzané v poslednom čase pre zlúčeninu nie podľa tohto vynálezu, PBN, Cao-om a Phillis-om (Brain Research 664 : 267-272, 1994). V týchto štúdiách boli krysy podrobené permanentnej strednej cerebrálncj arteriálnej oklúzii (MCAO) a bežnej oklúzii artérie carotis. PBN bol podávaný i.p. v dávke 100 mg/kg v rôznych časoch po mŕtvici. Krysy boli usmrtené 2 dni po mŕtvici a objem infarktu bol kvantifikovaný použitím trifenyltetrazoliového vyfarbenia.

Pri podaní PBN 0,5, 5, 17, 29 a 41 hodín po mŕtvici alebo 5,17,29 a 41 hodín po mŕtvici bol objem infarktu znížený v každom prípade približne na 50 %. Kumulatívna dávka podávaného PBN na dosiahnutie 50 % ochrany je minimálne štvornásobok množstva zlúčeniny I vyžadovanej na 70 % ochranu. Zlúčenina I je celkom vynikajúca vzhľadom na PBN v poskytnutí ochrany v modele krysej MCAO fokálnej ischémie.

Príklad 13

V tomto príklade bola zlúčenina podľa vynálezu (zlúčenina I) hodnotená na stanovenie jej schopnosti zmierniť oxidáciou spôsobené vedľajšie účinky protirakovinovej terapie.

Adriamycínové štúdie

Adriamycín je rozsiahle používaným protirakovinovým činidlom. Je známe, že je veľmi účinný, ale je tiež známe, že má nebezpečné vedľajšie účinky vznikajúce z jeho sklonu pôsobiť oxidačné poškodenie. Tieto vedľajšie účinky zahŕňajú vyvolanie nebezpečných hladín srdcového poškodenia pri vysokých dávkových hladinách. Tieto vedľajšie účinky často obmedzujú použitie tohto činidla alebo obmedzujú dávkové hladiny, ktoré môžu byť použité na hladiny, ktoré sú pod hladinami potrebnými pre maximálnu antineoplastickú účinnosť.

Boli uskutočnené pokusy na demonštráciu, že zlúčenina podľa vynálezu je účinná pri znížení vedľajších účinkov protirakovinových činidiel, ako je adriamycín a umožňuje, aby boli vyššie dávkové hladiny adriamycínu tolerované živočíchmi.

Boli testované C57BL/6J a DBA/2J samcov myší (35-40 g) na akútne letálne účinky adriamycínu a prevenciu akútnej letality pri predbežnom ošetrení dávkami zlúčeniny I. Myšiam bol injektovaný buď fyziologický roztok alebo zlúčenina I 30 minút pred podaním adriamycínu. Všetky injekcie boli intraperitoneálne. Akútna letalita adriamycínu bola v rozsahu 10 až 30 mg/kg. LD_J0 pre adriamycín v týchto testoch bola zistená 25 mg/kg u obidvoch kmeňov myší. Dávky zlúčeniny I až 300 mg/kg bez ošetrenia adriamycínom nemali žiadny vplyv na prežitie u dvoch kmeňov myší.

Predbežné ošetrenie s 30 a 100 mg/kg zlúčeninou I produkuje s dávkou spojené posuny v krivke dávkovej adriamycínovej letality. Obr. 5 predstavuje výsledky získané s použitím DBA/2J myši. Dávka 100 mg/kg zlúčeniny I produkuje 5-násobný posun doprava (v smere redukovanej letality). Kombinácia zlúčeniny I s adriamycínom vedie k významnému zvýšeniu maximálnej tolerovanej dávky. Tieto vyššie dávky sú v rozsahu, ktoré by mohlo účinne potláčať tumory odolné proti mnohým liečivám.

Porovnávacie testy

Predbežné ošetrenie s PBN vedie k slabému posunu doprava v krivke dávka adriamycínu-účinok. Zatiaľ čo dávka zlúčeniny I by mohla byť zvýšená na 300 mg/kg v kombinácii s adriamycínom, je tu horná hranica pre túto kombináciu s PBN. Dávka PBN 100 mg/kg produkuje slabé upokojenie a 300 mg/kg poskytuje významné upokojenie a určitú kombinovanú toxicitu (10 až 20 % letalita). Zlúčenina I/adriamycín neprodukuje žiadnu kombinovanú toxicitu v dávkach zlúčeniny I až 300 mg/kg.

Príklad 14

Testy bezpečnosti

Zlúčenina I a PBN boli testované na svoju akútnu toxicitu na samcoch krýs Sprague Dawley (200 - 300 g). Zlúčeniny boli podávané v dávke 1000 mg/kg i.p. skupinám 6 krýs. Po 3 dňoch bola hodnotená letalita. Zlúčenina I nepôsobí žiadnu letalitu, zatiaľ čo PBN bol letálny pre 5 zo 6 krýs použitých v tomto teste. Tieto údaje potvrdzujú údaje z gerbilov, že zlúčenina I je bezpečnejšia ako PBN.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 2,4-Disulfonyl-d-fenyl-terc-butylnitrón vzorca (I) o

ho_jS~_^___chJ__c(cH3)3

S0₃H alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ vzorca (II).
2. Farmaceutický prijateľná soľ 2,4-disulfonyl-a-fenyl· zerc-butylnitrónu podľa nároku 1 vzorca (III) kde X znamená sodík, draslík, amónium, vápnik, horčík, skupinu CaY a MgY, kde Y je farmaceutický prijateľný jednomocný anión.
3. Farmaceutický prostriedok na terapiu stavov akútneho intenzívneho oxidačného poškodenia centrálneho nervového systému, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 2,4-disulfonyl-a-fenyl-rerc-butylnitrón vzorca (I) alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ vzorca (II) podľa nároku 1 alebo ich zmes a farmaceutický prijateľný nosič na parenterálne vstrekovanie.
4. Farmaceutický prostriedok na terapiu stavov akútneho intenzívneho oxidačného poškodenia centrálneho nervového systému, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľnú soľ 2,4-disulfonyl-a-fenyl-terc-butylnitrónu všeobecného vzorca (III) podľa nároku 2 a farmaceutický prijateľný nosič na parenterálne vstrekovanie.
5. Farmaceutický prostriedok na terapiu stavov akútneho intenzívneho oxidačného poškodenia centrálneho nervového systému, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 2,4-disulfonyl-a-fenyl-/erc-butylnitrón vzorca (I) alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ vzorca (II) podľa nároku 1 alebo ich zmes a farmaceutický prijateľný nosič na orálne podanie.
6. Farmaceutický prostriedok na terapiu stavov akútneho intenzívneho oxidačného poškodenia centrálneho nervového systému, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľnú soľ 2,4-disulfonyl-a-fenyl-terc-butylnitrónu všeobecného vzorca (III) podľa nároku 2 a farmaceutický prijateľný nosič na orálne podanie.
7. Použitie 2,4-disulfonyl-a-fenyl-íerc-butylnitrónu podľa nároku 1 alebo 2 na výrobu liečiva na liečenie mŕtvice na parenterálne a intravenózne podávanie, pričom dávková forma obsahuje najmenej 0,2 mg/kg/h.
8. Použitie 2,4-disulfonyl-a-fenyl-terc-butylnitrónu podľa nároku 1 alebo 2 na výrobu liečiva na liečenie mŕtvice na orálne podávanie.
9. Použitie 2,4-disulfonyl-a-fenyl-íerc-butylnitrónu podľa nároku 1 alebo 2 na výrobu liečiva na liečenie stavu progresívnej straty funkcie centrálneho nervového systému na parenterálne a intravenózne podávanie.
10. Použitie 2,4-disulfonyl-a-fenyl-rerc-butylnitrónu podľa nároku 1 alebo 2 na výrobu liečiva na liečenie stavu progresívnej straty funkcie centrálneho nervového systému na orálne podávanie, pričom dávková forma obsahuje najmenej 0,1 mg/kg/deň.
11. Použitie 2,4-disulfonyl-a-fenyl-ŕerc-butylnitrónu podľa nároku 1 alebo 2 na výrobu liečiva na zmiernenie vedľajších účinkov vyvolaných u pacienta oxidačným poškodením spôsobeným antineoplastickou liečbou ochorenia na orálne, parenterálne a intravenózne podávanie.