HU221167B1

HU221167B1 - N-tert-butyl alfa-(2,4-disulfo)-phenyl nitrone and its pharmaceutically acceptable salts, their use and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU221167B1
Application number: HU9601739A
Authority: HU
Inventors: John M Carney
Original assignee: Oklahoma Med Res Found; Univ Kentucky Res Found
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2002-08-28
Also published as: HUT76788A; CA2179521C; PL185189B1; SG64903A1; WO1995017876A3; US5508305A; KR100370522B1; MY114178A; AU1552795A; ATE192736T1; DK0736004T3; NO306457B1; NO962637D0; BR1100626A; SK282403B6; US5475032A; NO962637L; CZ289629B6; HRP950358A2; CA2179521A1

Abstract

A találmány tárgyát az (I) képletű N-terc-butil-?-(2,4-diszulfo-fenil)-nitron, sói, az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények ésalkalmazásuk e gyógyszerkészítmények előállítására képezi. Ezek orálisvagy parenterális, például intravénás bevitel mellett alkalmazhatókolyan betegek esetében, akik a központi idegrendszer akut (ez fordulelő szélütés esetén) vagy fokozatos oxidációs károsodásábanszenvednek; ez utóbbi a központi idegrendszeri funk- ciók folyamatosleépülésében nyilvánul meg. A vegyületek ugyancsak felhasználhatókoxidatív károsodást okozó terápiák mellékhatásainak csökkentésérealkalmas gyógyszerkészítmények előállítására. ŕ

Description

A találmány egy meghatározott nitronszármazékra, az N-terc-butil-a-(2,4-diszulfo-fenil)-nitronra, ennek sóira és a vegyületek előnyösen szabadgyök-befogó szerként (FRTA) való gyógyászati alkalmazására vonatkozik.

Az (a) képletű α-fenil-terc-butil-nitront (PBN) az 1970-es években azonosították mint olyan hasznos analitikai reagenst, amely szabad gyökök kimutatására alkalmazható az elektronspin-rezonancia (ESR) területén. Azt találták ugyanis, hogy a PBN reagál egyes szabad gyökökkel és eközben jellegzetes ESR-spektrumot szolgáltató vegyület keletkezik. Ily módon lehetségessé válik szabad gyökök jelenlétének vagy hiányának megállapítása.

Az 1970-es évek végén és az 1980-as évek elején az orvostársadalom érdeklődésének előterébe került az a kérdés, hogy milyen szerepet játszanak a szabad gyökök egyes betegségekben, mint amilyen a szívroham, szélütés stb. Ezen vizsgálatok keretében növekvő mértékben kezdték in vitro alkalmazni a PBN-t szabad gyökök jelenlétével kapcsolatos analitikai bizonyítékok szerzésére. Később e vegyületet állatmodellben in vivő is alkalmazták analitikai segédeszközként szabad gyökök megfigyelésére irányuló kísérletekben ischaemiás rohamok stimulálása során és hasonló célokra. Az 1980-as évek közepén figyelték meg a PBN első lehetséges terápiás hatását súlyos ischaemiás rohamok stimulálása során és hasonló célokra.

Az 1980-as évek közepén figyelték meg a PBN első lehetséges terápiás hatását súlyos ischaemiás traumával kapcsolatos állatmodellben, amikor kimutatták, hogy a PBN-nel kezelt állatok túlélési esélye valószínűbb volt, mint a kontrollállatoké.

A WO 91/05552 számú, 1991.05.02-án közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben, amely részben megfelel az 5,825,032 és az 5,036,097 számú amerikai szabadalmi leírásnak, a PBN-t és a (b) általános képletű PBN-származékok egy csoportját írják le, amelyben X jelentése fend- vagy (c) általános képletű csoport, és ez utóbbiban

R jelentése H, Z-C(O)-, Z vagy (d) vagy (e) általános képletű csoport,

Y jelentése terc-butil-, hidroxilezett vagy acetilezett terc-butil- vagy helyettesített fenilcsoport és n értéke 1 -5-ig terjedő egész szám.

Javasolták e vegyületek gyógyszerként való alkalmazását a szélütés következményei és más, a szabad gyökök károsító hatásával összefüggésbe hozott állapotok kezelésére.

A PBN és rokon vegyületei, valamint ezek gyógyászati alkalmazása tárgyában nyújtották be, amerikai elsőbbséggel (1991.06.18., 716,952) a WO 92/22290 számú, 1992.12.23-án közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentést. Ebben két, rendkívül átfogó és általános leírást közöltek. Az első a lehetséges maximális számú olyan betegség ismertetését kísérelte meg, amely szabad gyökökkel összefüggésbe volt hozható. Ezek köre, hogy csak néhányat említsünk, központi idegrendszeri megbetegedésektől (például szélütés, öregedés, migrén stb.) a perifériális szervi betegségeken át (ilyen például az ateroszklerózis, felfekvések, sebek, izom-túlerőltetés) az UV sugárzásnak való kitételig terjed. A második a lehetséges maximális számú szabadgyök-„csapda” (ST) típusú vegyület felsorolására irányult.

A nem PBN jellegű anyagok teljes tartományának kijelölésén kívül ez a bejelentés nagymértékben kiterjesztette a potenciálisan használható PBN-vegyületek fogalmát, amely magában foglalná a PBN-t és ennek (b) általános képletű származékait, ahol

X jelentése fend-, imidazold-, fenotiazind- vagy (f) általános képletű csoport, amelyben n értéke 1-5, előnyösen 1-3, az R² csoportok jelentése a molekulán belül egymástól függetlenül halogénatom, alkil-, oxi-alkd-, alkenil-, -oxi-alkend-, -OH, -NH₂, -NHZ, -NZ₂, -NO csoport, a (g) képletcsoport egy tagja, -SO₃H, -OSO₃H, -SH, -S-alkil, S-alkenilvagy halo-alkil-csoport, különösen -CF₃;

A jelentése oxigén- vagy kénatom,

Z jelentése 1-6 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkil- vagy gyűrűs csoport és

Y jelentése egy vagy több helyen hidroxilezett vagy acetilezett terc-butil-csoport, fend- vagy (f) általános képletű csoport.

Abban az időben a PBN-t tartották a leginkább kitüntetett vegyületnek, megállapítván, hogy az nem gyakorol mérhető hatást a normális vagy ép sejtekre, és számos származékát is hasznosnak tartották; ezek például a következők:

- hidroxiszármazékok, különösen a 2-, 3- vagy 4-hidroxi-fenil-terc-butd-nitron és a fenil-/mono, di- vagy trihidroxi/-terc-butil-nitron;

- PBN-észterek, különösen azok, amelyekből 2-, 3vagy 4-hidroxi-fenil-terc-butil-nitron szabadul fel, így az acetoxiszármazék;

- a 2-, 3- vagy 4-karboxi-fenil-terc-butil-nitron;

- fenil-(hidroxi-butil)-nitron;

- alkoxiszármazékok, különösen azok, amelyekből 2-, 3- vagy 4-hidroxi-fenil-terc-butil-nitron szabadul fel, így a PBN 2-, 3- vagy 4-metoxi-fenil-származékai;

- acetamidszármazékok, különösen azok, amelyekből 2-, 3- vagy 4-hidroxi-fenil-terc-butd-nitron szabadul fel, így a 2-, 3- vagy 4-amino-fenil-terc-butil-nitron;

- difenil-nitron (PPN) és az analóg difenil-nitron-származékok;

- N-terc-butil-a-(4-nitro-fenil)-nitron és

- N-terc-butil-a-(2-szulfo-fenil)-nitron.

Azt találtuk, hogy egy adott PBN-származék és sói meglepő módon értékesebb farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek. Bár ez a származék, a 2,4-diszulfoPBN az előbbiekben említett WO 92/022290 számú közzétételi iratban általánosságban leírt anyagok nagy családjába tartozik, ott közelebbről nem tárgyalják és előnyös tulajdonságait sem mutatják be.

A találmány szerinti, két szulfocsoportot tartalmazó vegyülettel kapcsolatban az volt várható, hogy fokozott vízoldékonyságot mutat, de az is várható volt, hogy a vér-agy barrieren való áthatolása, a lipofób jelleg következtében, gyenge lesz. A találmány szerinti vegyület azonban, előállítása után, az in vivő vizsgálatok során a PBN-hez viszonyítva váratlan hatásnövekedést muta2

HU 221 167 Bl tott. Ez a hatásnövekedés a PBN-hez viszonyított potenciálnövekedés mellett ment végbe. Ezzel a kifejezett hatékonyság- és potenciálnövekedéssel szemben a PBN-hez viszonyítva feltűnő és szignifikáns toxicitáscsökkenés volt megállapítható.

Ezek az eredmények váratlanok, mivel a vegyületek egy-egy meghatározott családján belül a szerkezet/hatásösszefüggésre vonatkozó általános irodalom szerint a terápiás potenciál jellemző módon együtt változik a toxicitással. így a rokon vegyületek többsége esetében a terápiás potenciál/toxicitás arány állandó. Ezzel ellentétben a találmány szerinti vegyület a várttól eltérően viselkedik: a szorosan vett analógokhoz képest ugyanis potenciálja növekszik és toxicitása csökken.

A találmány egyik tárgyát ennek megfelelően az (1) képletű PBN-diszulfonil-származék és gyógyászatilag elfogadható sói képezik.

A találmány egy második tárgyaként parenterálisan - például intravénásán - és orálisan beadható gyógyszerkészítmények jelölhetők meg, amelyek hatóanyagként ezt a vegyületet vagy annak egy sóját tartalmazzák.

Harmadik vonatkozásában a találmány az említett vegyület vagy annak egy sója alkalmazására vonatkozik, különösen a következő indikációs területek esetében hatásos gyógyszerkészítmények előállítására: a központi idegrendszert ért akut oxidatív károsodás következményein alapuló kór (szélütés); a központi idegrendszert érő elhúzódó, alacsony szintű oxidatív stressz által jellemzett betegség (a központi idegrendszeri funkciók folyamatos leépülése); a rákterápia által a betegben előidézett oxidatív károsodás mellékhatásainak csökkentése vagy enyhítése.

A találmány szerinti vegyületet vagy sóját tartalmazó gyógyszerkészítményt parenterálisan, például intravénásán vagy előnyösen orálisan adagoljuk.

A következőkben ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra a vegyület előállítására alkalmazott reakciók folyamatábrája.

A 2. ábra (A, B és C) és a 3. ábra (A, B, C és D) két diagramsort mutat be; ezek egyrészt az állati test hőszabályozó képességében végbemenő nemkívánatos változást szemléltetik a technika állása szerinti nitron mint gyökbefogó szer dózisszintje függvényében, másrészt az ilyen nemkívánatos toxikus hatás hiányát a találmány szerinti vegyület esetében.

A 4. ábra (A, B, C és D) négy grafikonja a találmány szerinti vegyület előnyös voltát mutatja be a vele közeli rokonságban álló, a technika állása szerinti nitronszármazékkal összehasonlítva fokozatos idegrendszeri leépülés (például Alzheimer-kór) kezelésében. Ezt a vegyületek relatív interferálóképessége alapján ítélhetjük meg, amelyet ezek az oldatban jelen levő kulcsenzimek β-amiloid-proteinjének inaktiválása terén kifejtenek.

Az 5. ábra a találmány szerinti vegyület hatékonyságát mutatja be patkányokban a középagyi artéria elzáródását követő infarktus végtérfogata csökkentésében.

A 6. ábra (A, B és C) diagramjai a találmány szerinti vegyület azon képességét jellemzik, hogy ez állatokban csökkenti a nagy dózisban alkalmazott rákellenes szerek mellékhatásait.

A találmány szerinti vegyület a 2,4-diszulfonil-a-fenil-terc-butil-nitron (2,4-diszulfo-PBN vagy PBN-2,4diszulfonát). Ez alacsony pH mellett az (Γ) savas alakban szilárd anyagként fordul elő. Magasabb pH-η a (II) vagy (III) ionizált só alakban is létezik; e képletekben X gyógyászati szempontból elfogadható kationt jelent. Ez a kation a leggyakoribb esetben egy vegyértékű, amilyen a nátrium-, kálium- vagy ammóniumion, de lehet egy gyógyászati szempontból elfogadható egyértékű anionnal kombinált többértékű kation is, például kalciumion, klorid, bromid, jodid, hidroxi-, nitrát, szulfonát, acetát, tartarát, oxalát, szukcinát, palmoát vagy hasonló anionnal kombinálva, vagy magnézium ugyanezen anionokkal kombinálva; cink ilyen anionokkal kombinálva stb.

Ezen vegyületek közül kitüntetett a szabad sav és az egyszerű nátrium-, kálium- és ammóniumsó; a kalcium- és a magnéziumsók ugyancsak fontosak, de valamivel kevésbé.

A vegyület előállítása

Mint az 1. ábrán részletezzük és az 1. példában bemutatjuk, a találmány szerinti vegyületet egy kétlépéses reakcióval állíthatjuk elő. Az első lépésben a kereskedelemben kapható terc-butil-nitrátot (2-metil-2-nitro-propánt) a megfelelő hidroxil-aminná alakítjuk át egy alkalmas katalizátor, így aktivált cink/ecetsav katalizátor vagy alumínium/higany amalgámkatalizátor felhasználásával. Ezt a reakciót 0,5-12 óra alatt - különösen körülbelül 2-6 óra alatt - hajtjuk végre körülbelül 15-100 °C-on folyékony reakcióközegben, mégpedig a cinkkatalizátor esetében vizes alkoholos közegben és az alumínium-amalgám katalizátor esetében vizes éteres közegben.

A második lépésben a frissen képződött hidroxilamint 4-formil-benzol-l,3-diszulfonsavval reagáltatjuk; ennek során általában kis aminfelesleget alkalmazunk. A reakciót az előbbiekhez hasonló hőmérsékleti feltételek között hajthatjuk végre. Ez a reakció általában 10-24 óra alatt lezajlik.

Az így kapott termék a szabad sav, amelyet molekulatömegével - 89 g - jellemezhetünk. Ez fehér porszerű anyag, amely hevítés hatására elbomlik. Vízben való oldhatósága 1 g/ml-nél nagyobb.

'H-NMR-spektrum D₂O-ban: D₂O 8,048 ppm (dd, 8,4, 1,7 Hz); 8,836 ppm (d, 8,4 Hz); 8,839 ppm (d, 1,7 Hz); 8,774 ppm (s).

A különböző sókat egyszerűen előállíthatjuk oly módon, hogy a szabad savat vizes közegben két egyenértéknyi megfelelő bázissal - például a káliumsó esetében KOH-dal stb. - keverjük össze.

Gyógyszerkészítmények

A vegyületet - ideértve sóit - orális vagy parenterális (például intravénás vagy intramuszkuláris injekció alakjában történő) bevitelre alkalmas gyógyszerkészítményekké készíthetjük ki.

Az orális bevitelre szolgáló készítmények folyékony oldatok vagy szuszpenziók, porok, tabletták, kapszulák stb. alakjában állíthatók elő. Ezekben a készítmé3

HU 221 167 Β1 nyékben a PBN-2,4-diszulfonát vagy sója rendszerint a kisebb mennyiségben jelen levő komponens (O,l-körülbelül 50 tömeg%), míg a fennmaradó hányadot különböző vivőanyagok vagy hordozók és a keresett adagolási forma előállítására alkalmas feldolgozási segédanyagok teszik ki. A folyékony formák megfelelő vizes vagy nemvizes vivőanyagot, puffereket, szuszpendálóés diszpergálószereket, színezékeket, ízanyagokat stb. tartalmazhatnak.

A szilárd alakok például a következő komponenseket vagy hasonló jellegű vegyületeket tartalmazhatnak:

- kötőanyag, például mikrokristályos cellulóz, tragantgumi vagy zselatin;

- hígító, például keményítő vagy laktóz;

- szétesést elősegítő szer, például alginsav, Primogel vagy kukoricakeményítő;

- kenőanyag, például kolloid szilícium-dioxid;

- édesítőszer, például szacharóz vagy szacharin;

- ízanyag, így menta, cukor, metil-szalicilát vagy narancs ízesítő.

Az injektálható készítmények általában injektálható steril sóoldatok, foszfátpufferes sóoldatok vagy más, a szakember által ismert injektálható hordozók felhasználásával készülnek. Az aktív nitron ebben az esetben is a kisebb mennyiségben jelen levő komponens (gyakran körülbelül 0,05-10 tömeg%), míg a fennmaradó hányadot az injektálható vivőanyag stb. teszi ki.

Gyógyásza// hatás és alkalmazási útmutatók

A 2,4-diszulfo-PBN általában három csoportba sorolható betegségek ellen hatásos. Az első csoport olyan betegségeket foglal magában, amelyek a központi idegrendszer valamelyik tartományát ért akut intenzív oxidációs károsodással függnek össze. Példák az ilyen betegségekre: szélütés; szélütéssel összefüggő betegségek; agyrázkódás és arachnoidea alatti vérzés. Ezen állapotok esetében a vegyületet oly módon visszük be, hogy a gyógyszer a lehető leggyorsabban és legközvetlenebbül jusson be a beteg vérkeringésébe. Ez rendszerint intravénás bevitelt jelent.

Az említett betegségek kezelésére szolgáló intravénás dózisszint körülbelül 0,1 mg/kg/óra - min. 10 mg/kg/óra, mindig körülbelül 1-körülbelül 120 órán és különösen 24-96 órán át. Megfelelően stabil szintek elérése érdekében előzetesen egy, körülbelül 10-körülbelül 500 mg hatóanyagot tartalmazó bolus is beadható.

Bár kitüntetett az intravénás bevitel, más parenterális beviteli módok, például az intramuszkuláris injekció ugyancsak használhatók. Ebben az esetben az előbbiekhez hasonló dózisszinteket alkalmazunk. A 2,4-diszulfo-PBN váratlan és lényeges előnye, hogy jóval magasabb szintek elérését teszi lehetővé, mint maga a PBN. Mint a példákban bemutatjuk, 1000 mg/kg/óra értékig terjedő vagy magasabb dózisok és 10-2500 mg/kg intravénás bolusadagok is elérhetők a 2,4-diszulfo-PBNnel vagy sóival, míg a PBN esetében ilyen dózisok halált vagy akut toxicitást eredményeznek. A 2,4-diszulfo-PBN esetében a dózis/válasz görbe ezekben a magas dózistartományokban váratlan módon pozitív folyamatosságot mutat, amiből egyértelműen következik, hogy a szélütés vagy más trauma után azonnal nagy adagokban történő intenzív bevitel számos esetben nagyobb pozitív hatással járhat a gyógyulásra. A 2,4-diszulfoPBN-nel végzett kezelésre kedvezően reagáló betegségek második csoportját azok alkotják, amelyeket a központi idegrendszerre kifejtett tartós alacsony szintű oxidatív stressz és a központi idegrendszeri funkciók fokozatos folyamatos leépülése jellemez. Ilyen betegség az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), a többszörös infarktussal összefüggő elmeelborulás, retinopátia stb. Mindegyik ilyen betegségre a fokozatos funkcióvesztés jellemző. A 2,4diszulfo-PBN és sói orális vagy parenterális, például intravénás bevitel mellett lassíthatják és esetleg visszafordítják a funkcióvesztést. Ha parenterális, például intravénás bevitel látszik megfelelőnek, általában az akut állapotok esetében alkalmazottakhoz hasonló szintek alkalmazhatók, de ezek inkább a dózistartomány alsó végéről választhatók ki.

Ezekben az esetekben a kezelés több hónapot vagy évet vehet igénybe, így a beteg kényelme és a tolerancia érdekében kitüntetett az orális adagolás. Ebben az esetben napi 1-3 adagot vihetünk be orálisan, alkalmanként körülbelül 0,02-körülbelül 50 mg/kg mennyiségben; a kitüntetett dózis körülbelül 0,04-körülbelül 5,0 mg/kg.

A 2,4-diszulfo-PBN természetesen egyedüli hatóanyagként alkalmazható vagy más hatóanyagokkal kombinálva is bevihető. Ez az eset a vegyület harmadik alkalmazási módját képviseli. A 2,4-diszulfo-PBN-nel való kezelésre reagáló harmadik csoportot azok a betegségek alkotják, amelyekre a rákterápia (neoplasztikus betegségek terápiája) mint oxidatív károsodás által kiváltott mellékhatások jellemzők. Az oxidatív károsodást - és így a mellékhatásokat - előidéző terápia jelenthet sugárterápiát (például gamma-besugárzást) és oxidatív károsodást eredményező kemoterápiás szerekkel végzett kezelést. Ilyen szer lehet például egy antibiotikum, amilyen a daunorubicin, a doxorubicin vagy a bleomicin; a prokarbazin; a nitrogénmustár-származékok, így az ifoszfamid, melfalán vagy a klorambucil; alkilezőszerek; antimetabolitok; hormonok és antagonistáik.

A 2,4-diszulfo-PBN bevitele azzal az eredménnyel járhat, hogy az ilyen kezelések alatt csökken a betegek komforthiányérzete. A találmány szerinti vegyület bevitele ezenkívül fokozhatja a betegek e kezelések tolerálására irányuló képességét. A terápiák mellékhatásai gyakran a kezelés leállítását kényszeríthetik ki vagy megakadályozzák az optimális magas dózisok bevitelét, illetőleg a kezelés gyakori alkalmazását. Egyes esetekben ezek a mellékhatások rendkívül károsnak bizonyulnak és szívbetegséghez és más jelentősebb fünkcióvesztéshez vezetnek. Állatkísérletekben megfigyelték, hogy a találmány szerinti vegyület javíthatja a beteg ilyen antineoplasztikus kezelésekkel szembeni toleranciáját.

Ezen terápia esetében a találmány szerinti vegyületet beadhatjuk a besugárzás vagy a kemoterápia előtt, alatt vagy után. A bevitel történhet parenterálisan vagy

HU 221 167 Β1 orálisan, vagy bármely más módon, amely lehetővé teszi, hogy a PBN-2,4-diszulfonát belépjen a beteg vérkeringésébe.

Azt állapítottuk meg, hogy a dózis/válasz viszony pozitív. Ennek következtében, és tekintettel a mellékhatások súlyosságára, valamint a maximális lehetséges védelem vagy javulás biztosításának előnyeire, egyes esetekben kívánatos lehet nagy mennyiségű 2,4-diszulfo-PBN bevitele, a központi idegrendszer akut intenzív oxidációs károsodásával kapcsolatban az előbbiekben leírtak szerint. Más esetekben alacsonyabb dózisok alkalmazhatók, például a fokozatosan előrehaladó idegrendszeri betegségek terápiájára vonatkozóan leírtak szerint.

A következőkben példákat említünk jellegzetes beviteli módokra. Monoterápia (egyedül adriamicin) esetében két tipikus dóziskombináció a 10-600 mg (I) vegyület/m²+60 mg adriamicin/m², mindemellett az adriamicint 7. vagy 21. naponként adagoljuk. Az (1) vegyületet beadagolhatjuk az adriamicin előtt (például max. 60 perccel előbb), azzal együtt vagy után, például egy órával később és a következő napon. Mindkét gyógyszer esetében jellemzően alacsonyabb a gyermekgyógyászatban alkalmazott dózis. Ismételten kezelt rezisztens tumorok esetében nagyobb dózisok alkalmazhatók.

A következő táblázatokban „hr” jelentése: óra.

PÉLDÁK

1. példa

Az a-(2,4-diszulfo-fenil)-N-terc-butil-nitron - a következőkben (I) vegyület - előállítása.

Ez a kitüntetett szintézis R. H. Hinton és E. G. Janzen (J. Org. Chem. 57, p. 2646-2651,1992) munkáján alapul. Mint az 1. ábrán bemutatjuk, a reakció egy aldehid és egy hidroxil-amin kondenzációjából áll. A hidroxil-amin labilis, ezért frissen állítjuk elő a felhasználás napján, aktivált cinkkatalizátor alkalmazásával.

A szintézis menete a következő:

Szükséges vegyszerek

1. 95%-os etanol

2. 2-metil-2-nitro-propán

3. cinkpor

4. jégecet

5. dietil-éter

6. telített nátrium-klorid-oldat

7. vízmentes szilárd magnézium-szulfát

8.4-formil-benzol-l,3-diszulfonsav (MT 310,21), dinátrium-só-hidrát

9. metanol

10. diklór-metán Eljárás

A) Az N-terc-butil-hidroxil-amin előállítása

1. Veszünk egy 500 ml-es háromnyakú, mágneses keverőrúddal, hőmérséklet-szabályozóval, hőmérővel és adagolótölcsérrel ellátott gömblombikot.

2. Beadagolunk a lombikba 350 ml 95%-os etanolt és jégfürdőben 10 °C-ra hűtjük le.

3. Egyszerre hozzáadunk 6,18 g (0,060 mól) 2-metil-2-nitro-propánt és 5,89 g (0,090 mól) cinkport.

4. Az adagolótölcsérbe bemérünk 10,8 g (0,180 mól) jégecetet és csepegtetve adagoljuk olyan sebességgel, hogy erőteljes keverés mellett a hőmérsékletet 15 °C alatt tartsuk.

5. A jégfurdőt eltávolítjuk és az elegyet szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük.

6. Az oldószert desztillációval eltávolítjuk a keverékből; ekkor terc-butil-hidroxil-amin, cink-acetát és víz marad vissza.

7. Hozzáadunk 50 ml diklór-metánt és a keveréket Büchner-tölcséren szűrjük.

8. A szűrőpapíron visszamaradt cink-acetátot 2 χ 25 ml diklór-metánnal mossuk.

9. A szűrletből választótölcsérben eltávolítjuk a vizet és a szerves réteget magnézium-szulfát fölött szárítjuk.

10. A magnézium-szulfátot redős szűrőn való szűréssel eltávolítjuk, majd a diklór-metánt forgóbepárlóban desztillációval eltávolítjuk.

11. A terméket - 5,34 g, 100%, viszkózus folyadék - 50 ml metanolban oldjuk és ezt az oldatot a B) részben használjuk fel.

B) A 2,4-diszulfo-fenil-N-terc-butil-nitron előállítása

1. Háromnyakú, 250 ml-es gömblombikot keverőrúddal, gázeloszlató csővel, adagolótölcsérrel és egy Friedrich-kondenzátorral látunk el, amelyet cirkuláló jeges vízzel hűtünk.

2. A lombikba bemérünk 200 ml metanolt, 9,31 g (30 mmol) 4-formil-benzol-l,3-diszulfonsavat és Nterc-butil-hidroxil-amint (30 mmol; 25 ml, az A) rész szerint előállított metanolos oldat).

3. A reakcióelegyet fűtőköpeny segítségével a visszafolyatás hőmérsékletére melegítjük fel, miközben keverés mellett nitrogént buborékoltatunk át.

4. A keveréket 2 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk.

5. Hozzáadjuk az A) rész szerint előállított hidroxilamin fennmaradó hányadát.

Legalább 18, de maximum 24 órán át folytatjuk a visszafolyató hűtő alatt való forralást és a nitrogén átbuborékoltatását. A forró reakcióelegyet Büchner-tölcséren szűrjük és a szilárd anyagot forró metanollal mossuk.

8. A metanolt forgóbepárlóban desztillációval eltávolítjuk és így sárga, viszkózus olajat kapunk.

9. 200 ml forró 1:1 etanol: aceton elegyet adagolunk és a keveréket az olaj feloldására melegítjük.

10. Az oldatot a termék kristályosítására lehűtjük.

11. A terméket Büchner-tölcséren gyűjtjük össze és egy éjjelen át vákuumban szárítjuk.

12. A reakció kitermelése általában 75% (I) vegyület, amely fehér por alakú.

2. példa

Az a-(2,4-diszulfo-fenil)-N-terc-butil-nitron - (I) vegyület - előállítása egy másik módszerrel.

Ezt a korábban kifejlesztett módszert alkalmaztuk több, a példákban leírt kísérletek során alkalmazott vegyületminta előállítására. Ennek a példának a terméke minden vonatkozásban azonos az 1. példa termékével. A szintézismódszer a következő:

HU 221 167 Β1

Szükséges vegyszerek

1. 5 cm széles csíkokra vágott és körülbelül 1 cm átmérőjű hengerré összecsavart alumíniumfólia

2. higany(II)-klorid-oldat: 9,68 g 476 ml vízben

3. etanol

4. 6 liter éter

5. tiszta víz

6. 2-metil-2-nitro-propán

7. 2M nátrium-hidroxid-oldat (80 mg 1 liter vízben)

8. vízmentes szilárd magnézium-szulfát

9. 4-formil-benzol-1,3-diszulfonsav (MT 310,21) Eljárás

A) Az N-terc-butil-hidroxil-amin előállítása

1. Az alumíniumfólia hengereket 15-30 másodpercig HgCl₂-oldatba helyezzük, majd etanolba és ezután éterbe merítjük, végül egy 5 literes lombikba helyezzük, amely 500 ml dietil-étert és 21,4 ml vizet tartalmaz.

2. A lombikot 250 ml-es nyomáskiegyenlítő csepegtetőtölcsérrel, mechanikus keverővei, nitrogénbevezetővel és egy Friedrich-hűtővel látjuk el, amelyet recirkuláltatott jeges vízzel hűtünk.

3. A keveréket 10 percen át keverjük.

4. A csepegtetőtölcséren át 71,68 g (75,5 ml) 2-metil-2-nitro-propánt adagolunk olyan sebességgel, hogy erőteljes visszafolyatást tartsunk fenn.

Megjegyzés: Az adagolást 20 percnél rövidebb idő alatt be kell fejezni, különben jelentősen csökken a kitermelés.

5. Az adagolás közben 500 ml-es részletekben étert adunk a reakcióelegyhez. Ez annak érdekében történik, hogy a termék lehetséges legmagasabb koncentrációját tartsuk fenn, gél képződése nélkül. Maximum 2 liter éter hozzáadása nem fejt ki káros hatást a kitermelésre.

6. A 2-metil-2-nitro-propán hozzáadásának befejezése után a reakcióelegyet további 30 percen át keverjük.

7. A kapott szürke színű szuszpenziót 3 részletben szívatással szűrjük az alumíniumsók eltávolítására.

8. A szűrőlepényeket 1-1 liter éterrel mossuk.

9. Az egyesített éteres rétegeket 300 ml 2M NaOHdal mossuk, majd MgSO₄ fölött szárítjuk és vákuumban betöményítjük; így fehér színű puha, szilárd anyagot kapunk.

10. A szilárd anyag valamivel szobahőmérséklet felett megolvad, de vákuumszekrényben (maximum néhány percen át) tovább száríthatjuk. 38-45 g szilárd anyag marad vissza.

11. A szilárd anyagot mint olyat felhasználhatjuk vagy pentánból átkristályosítva tisztíthatjuk.

12. Molekulatömeg 89.

B) Az a-(2,4-diszulfo-fenil)-N-terc-butil-nitron előállítása

1. 250 ml-es gömblombikot keverőrúddal és Friedrich-kondenzátorral látunk el, amely utóbbit recirkuláltatott jeges vízzel hűtjük.

2. A lombikba bemérünk 71,8 ml metanolt, 14,5 g (46,7 mmol, 1 egyenértéknyi) 4-formil-benzol-1,3-diszulfonsavat és 5,0 g (56,2 mmol, 1,2 egyenértéknyi) N-terc-butil-hidroxil-amint.

3. A keveréket egy éjjelen át visszafolyató hűtő alatt forraljuk.

4. A reakcióterméket gömblombikba visszük át és rotációs bepárlón szárazra pároljuk.

5. A szilárd anyagot éterrel mossuk és a (sárga) étert dekantáljuk.

6. Megismételjük az 5. lépést.

7. A terméket (I. vegyület) metanolból kristályosítjuk, majd a forró metanolos oldatot szűrjük az oldhatatlan csapadék eltávolítására és a terméket kétszer átkristályosítjuk metanolból.

3. példa

Kísérletsorozatot végeztünk a 2,4-diszulfo-PBN (I) vegyület - és két PBN-monoszulfonát-származék in vivő hatékonyságának összehasonlítására az agyi ischaemiát és reperfüziós sérülést követő neuronvesztés elleni védőhatás szempontjából. A vizsgálati módszert W. Cao et al. írja le (Neuroscience Letters, 88, p. 233, 1988; Oxygen free radical involvement in ischemia and reperfusion injury to brain). A kísérletek során a vizsgálandó vegyületet 6 versenyegérből álló csoportoknak adtuk be ip. egyszeri dózisként 30 perccel egy 5 perces bilaterális karotiszelzáródást megelőzően. Egy 100 mikronos körzetben mértük a neuronnukleuszok sűrűségét. Két kontrollt alkalmaztunk; ezek egyike nem kapott vizsgálandó vegyületet és a második nem kapott vizsgálandó vegyületet és nem szenvedett agyi ischaemiában. Mint az 1. táblázatban bemutatjuk, a találmány szerinti vegyület a technika állása szerinti vegyületekhez képest váratlan előnyöket mutatott. Mindenekelőtt megállapítható, hogy alacsony dózisszinteken - például 3,2 mg/kg esetében - az (I) vegyület 2-3-szor hatásosabb a neuronveszteség megelőzésében. Magas dózisszinteken az látható, hogy az (I) vegyület képes teljes védelmet nyújtani a neuronvesztés ellen, ugyanis a vizsgált agyszövetek neuronsűrűsége azonosnak mutatkozott a nem ischaemiás kontrollokéval. A technika állása szerinti vegyületek ezeken a dózisszinteken vagy toxikusak, vagy jóval alacsonyabb fokú védelmet nyújtanak. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy az (I) vegyület potenciálja a neuronvédelem tekintetében egyértelműen magasabb, mint a PBN-é és ennek két közeli szerkezetű analógjáé, emellett toxicitása a PBN-éhez képest nem várt módon csökkent.

1. táblázat

	Neuronscjtmag/100 mikron látómező
PBN	2- szulfo	3- szulfo	dl vegyület
Nem ischae-	4,21	4,21	4,21	4,21
miás kontroll	(,43)	(,43)	(,43)	(,43)
Ischaemiás	0,58	0,58	0,58	0,58
kontroll	(,28)	(,28)	(,28)	(,28)
3,2 mg/kg	0,43	0,73	0,35	1,43
(,18)	(,34)	(,21)	(,31)

HU 221 167 Β1

1. táblázat (folytatás)

	Neuronsejtmag/100 mikron látómező
PBN	2- szulfo	3- szulfo	(1) vegyület
10 mg/kg	1,13	0,68	0,81	2,57
(,39)	(.31)	(,40)	(,25)
32 mg/kg	1,83	0,73	1,63	3 53
(,21)	(,31)	(,35)	(,41)
50 mg/kg	3,11	1,01	1,63	4 11
(,29)	(,61)	(,35)	(,43)
100 mg/kg	3,68 (,71)	0,93 (,53)	1,93 (,39)	4,18 (,49)
320 mg/kg	3,78 (,43)	1,11 (,41)	1,78 (,40)	4,23 (,39)
1000 mg/kg	toxikus	0,98	1,58	4,11
(,43)	(,38)	(.41)
320 mg/kg	toxikus			4,18

4. példa

Kísérletsorozatot végeztünk az (I) vegyület, a PBN és két szulfonátanalóg in vivő hatékonyságának összehasonlítására az ischaemia utáni kezelés esetében. Az 1. példában említett általános módszert alkalmaztuk, de a vizsgálandó vegyületeket ip. egyszeri dózisként vittük be 30 perccel az 5 perces ischaemiát követő reperfúzió után. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. A 2. táblázatból látható, hogy a találmány szerinti vegyület ebben az esetben is hatékonyabb alacsony dózisokban és hatékonyabb, egyidejűleg kevésbé toxikus magasabb dózisokban. A toxicitás ebben a kísérletben is megakadályozza a technika állása szerinti vegyületek nagy dózisokban való alkalmazását, míg a találmány szerinti vegyület ezeken a szinteken figyelemreméltóan hatékony terápiát tesz lehetővé.

2. táblázat

	Ncuronsejtmag/100 mikron látómező
PBN	2- szulfo	3- szulfo	(I) vegyület
Nem ischae-	4,18	4,18	4,18	4,18
miás kontroll	(,59)	(,59)	(,59)	(,59)
Ischaemiás	0,85	0,85	0,85	0,85
kontroll	(49)	(,19)	(49)	(49)
32 mg/kg	1,09 (,31)			1,83 (,41)
50 mg/kg	3,85 (,49)	0,68 (,31)	0,73 (,34)	2,73 (,39)
100 mg/kg	2,11	0,78	1,09	3,41
(,51)	(,23)	(.48)	(,37)

	Neuronscjtmag/100 mikron látómező
PBN	2- szulfo	3- szulfo	(I) vegyület
320 mg/kg	2,25 (,43)	0,81 (,31)	0,93	3,55 (,48)
1000 mg/kg	toxikus			3,68 (39)

5. példa

Az I. vegyületet PBN-nel hasonlítottuk össze a relatív hatékonyság meghatározására a neuronvesztés elleni védelem területén, versenyegerekben, az 1. példában leírt általános vizsgálati módszer alkalmazásával az 5 perces ischaemiát követő reperfúzió megindulása után 60 perccel történő iv. bevitel mellett. Az eredményeket a 3. táblázatban összegezzük. Ebből látható, hogy az (I) vegyület az agysérülést követő klinikai kezelésben szignifikánsan nagyobb terápiás hatékonyságot mutat.

3. táblázat

N = 6 csoportonként	mg/kg egyszeri dózis
0,0	0,5	1,0	10
Sóoldat, ischaemia nélkül	4,11 (,28)	-	-	-
Sóoldat, ischaemia	0,93 (47)	-	-	-
PBN	-	0,83 (,23)	1,07 (,29)	1,23 (,31)
(I) vegyület	-	1,25 (49)	IZ) 00 r- cm	2,43 (,31)

Sem a PBN, sem az (I) vegyület nem befolyásolta a neuronsűrűséget az agysérülés nélküli kontrollállatokban.

6. példa

Az agysérülés viselkedésbeli változásokban is megnyilvánul. Ebben a kísérletben fiatal (3 -4 hónapos) felnőtt versenyegereket vizsgáltunk a tájékozódási képesség meghatározására 8 elágazásos labirintustesztben, 24 órával az 1. példában leírt ischaemiás esemény után. Ezek, abban az esetben, ha kezelést nem alkalmaztunk, a nem ischaemiás állatokhoz képest sokkal több hibát követtek el. Néhány vizsgálati állatnak PBN-t és (I) vegyületet adagoltunk. Mint ezt a 4. táblázatban részletezzük, a nagy dózisban (I) vegyülettel kezelt versenyegerek hibaszintje nem különböztethető meg a nem ischaemiás állatokétól. A PBN kevésbé hatékony. Ez arra mutat, hogy az (I) vegyület képes védelmet nyújtani az időre/térre vonatkozó rövid idejű memóriavesztés ellen (24 órával az ischaemiát követően), ami a 8 elágazásos labirintustesztben elkövetett hibákat illeti fiatal versenyegerekben, 5 perces ischaemia után.

HU 221 167 Β1

4. táblázat

N=6 csoportonként	mg/kg/hr 24 órán át
0,0	1,0	32	50	100
Kontroll	4,1 (,38)	-	...	-	-
Ischaemia után	LM 4^ ¹ OO Oh ί L/i	-	-	-	-
PBN	-	29,8 (7,27)	18,19 (5,83)	6,23 (,71)	5,83 (,49)
(I) vegyület	-	14,63 (3,81)	7,19 (,81)	4,28 (,29)	4,11 (,19)

7. példa

Meghatároztuk a találmány szerinti vegyület egy ischaemiás esemény utáni infarktus térfogatának csökkentésére irányuló képességét. Mint az 5. táblázatból látható, azt figyeltük meg, hogy míg a PBN és az (I) vegyület alacsony dózisokban egyaránt hatékony, magas dózisokban az (I) vegyület biztosította a legjobb védelmet és a PBN toxikus volt. Az 5. táblázat azt az infarktustérfogatot mutatja be, amelyet akkor figyeltünk meg, amikor a vizsgálandó vegyületet iv. 60 perccel a középagyi elzáródás után vittük be és a kezelést 24 órán át folytattuk C57BL/6J egérben.

5. táblázat

	Infarktustcrfogat (mm³)
Utókezelés (mg/kg/hr)	0,0	1,0	10	100
Kontroll, ischaemia nélkül	0	-	-
Sóoldat, ischaemia	23 (2)	-	-
PBN	-	oo --J	13,8 (2,3)	toxikus
(I) vegyület	-	16,8 (1,7)	12,7 (3,93)	8,3 (,71)

8. példa

Ebben a vizsgálatban az (I) vegyületet és a PBN-t hasonlítottuk össze azon képesség tekintetében (túlélők, %), hogy a letalitás elleni védelmet nyújtsanak idősebb (18-24 hónapos, 12-es csoportokban kezelt) versenyegereknek a 10 perces ischaemia hatása ellen, 30 perccel az ischaemiát megelőzően alkalmazva. Mint a 6. táblázatból látható, az (I) vegyület mindegyik dózisszinten hatékonyabb és magas szinteken teljes védelmet biztosít, míg a PBN csak részben hatásos.

6. táblázat

Előkezelés (mg/kg)	0,0	10	32	100	320
Sóoldat	11	-	-	-	-
PBN	-	42	50	75	92
(I) vegyület	-	50	75	100	100

9. példa

A találmány szerinti vegyület egyik jelentős előnye a technika állása szerinti PBN-hez képest a szignifikánsan csökkent toxicitás. Mint a 7. táblázatban bemutatjuk, az akut letalitást határoztuk meg C57BL/6L egerekben a nitron különböző koncentrációjú ip. egyszeri dózisait alkalmazva. A PBN jelentős toxicitást mutat 560 mg/kg dózisszinten. Az (I) vegyület közel húszszor ekkora dózisokban sem mutat toxicitást.

7. táblázat

	mg/kg
Túlélés (%) n=20 egér	320	560	1000	3000	10000
PBN	100	25	0	0	0
(I) vegyület	100	100	100	100	100

10. példa

A nitron gyökfogók in vivő megfigyelt másik nem kívánt szisztémás hatása a testhőmérséklet csökkentése. Ez a toxikus jelenség komoly következményekkel járhat az egészségre és nehezítheti diagnózis felállítását más betegségek vonatkozásában. Mint a 2. és a 4. ábrán bemutatjuk, a találmány szerinti vegyületet egereknek és versenyegereknek adagoltuk magas dózisban - 1000 mg/kg - anélkül, hogy mérhető hőmérsékletcsökkenés lépett volna fel. Ezzel szemben a technika állása szerinti vegyület, a PBN a testhőmérséklet 8 °C-ig teijedő csökkenését idézte elő mindössze 500 mg/kg dózisban.

11. példa

Vizsgáltuk a találmány szerinti vegyületet annak meghatározására is, hogy ez milyen hatékony azon betegségek kezelésében, amelyeket a központi idegrendszerre kifejtett tartós alacsony szintű oxidációs stressz és a központi idegrendszeri funkciók fokozatos folyamatos leépülése jellemez. A hatékonyságot az Alzheimerkór (AD) egyik modelljében tanulmányoztuk. Ez a modell a következő felismerésen alapul. Újabb vizsgálatok arra mutattak, hogy korosabb egyének agyszöveteiben a korral összefüggő proteinoxidáció-fokozódás és enzimakti vitás-csökkenés lép fel. Korosabb egyének fibroblaszt-szövettenyészeteiben és különböző korú egyének vörösvérsejtjeiben egyaránt a protein-karbonil-tartalom exponenciális növekedése (ez a proteinoxidáció mértéke) és a markerenzimek aktivitásának csökkenése fi8

HU 221 167 Bl gyelhető meg. Az egyén élettartama során fokozatosan növekszik az agyban a proteinoxidáció.

Számos különböző modellben vizsgálták az ADben megfigyelhető abnormális amiloid fehérje (AP)ermelést és metabolizmust. Embrió agyalapi neuron és neuron/glia tenyészetekben végzett in vitro vizsgálatok arra mutattak, hogy βΑΡ(1-40) hosszabb időtartamú koinkubálás után citotoxicitást eredményez. Ha ezt a pepiidet patkányagyba infundáljuk, sérülések keletkeznek. A βΑΡ egyes feltételezett lebomlási termékei például a βΑΡ (24-35) - szintén neurotoxikusak. Úgy tűnik, hogy a neurotoxicitás keletkezésében glutamátreceptor és nemglutamát receptor 005699-115 mechanizmusoknak egyaránt szerepük van. Neurontenyészetek konfokális mikroszkópos vizsgálata kimutatta, hogy a βAP(l-40)-nek való kitétel oxidatív stresszt idéz elő (diklór-fluoreszcein és megnövekedett intracelluláris szabadkalcium-szint).

Kimutatták, hogy a βΑΡ-fragmentumok szövetkivonatokban és agyalapi neuron- és gliatenyészetekben közvetlenül képesek inaktiválni a glutaminszintetázt (GS) és a kreatinkinázt (CK) (4. ábra, A. és B.). Ezek a görbék a glutaminszintetáz és a kreatinkináz AP(25-35) hatására végbemenő dózisfüggő inaktiválódását mutatják be. Versenyegér-neokortexből citoszolfrakciókat készítettünk és meghatároztuk ezek enzimaktivitását. A mintákat a vizsgálat előtt 10 percen át különböző peptidkoncentrációk jelenlétében inkubáltuk. A kitöltött jelek a természetben előforduló 25-35 fragmentum hatását tüntetik fel. Az üres körök azt jelzik, hogy a fordított (32-25) szekvencia nem befolyásolja az enzimaktivitást. Az üres háromszögek azt jelölik, hogy a szabályostól eltérő aminosavszekvencia a (25-35) fragmentumhoz viszonyítva ugyancsak nem befolyásolja az enzimaktivitást. Mindegyik pont 5 megfigyelés középértéke (+/- standard hiba). A βΑΡ-eredetű és a más sejtforrásokból származó szabad gyökök meghatározó szerepet játszanak az AD fellépésében és előrehaladásában.

Mint a 4. ábra C és D görbéi mutatják, az (I) vegyület és a PBN egyaránt képesnek mutatkozik a GS és a CK βΑΡ fragmentumok hatása elleni védelmére. A 4. ábra C és D görbéje az abban az esetben megfigyelhető védő hatást mutatja be, amikor citoszolfrakciókat 0,4 mg/ml PAP(25-35)-tel és különböző koncentrációjú PBN-nel (üres körök), illetve (I) vegyülettel (kitöltött körök) együtt inkubálunk. Mindegyik pont 3 megfigyelés középértéke (+/- standard hiba). Mint a C és D görbéből látható, az (I) vegyület teljes védelmet nyújt és ténylegesen még az oxidáció hatásainak megfordítására is képes lehet. Ezzel szemben a PBN hatékonysága limitált, ugyanis a görbe lényegében elégtelen védelmi szintnél aszimptotikus viselkedést mutat.

12. példa

További kísérleteket végeztünk a találmány szerinti vegyület szélütés által okozott központi idegrendszeri károsodás megelőzésében való hatékonysága kimutatására.

Eredmények patkány-fokálisischaemia esetében.

Több vizsgálatot végeztünk az (I) vegyület hatékonyságának meghatározására patkány fokális ischaemíamodelljében. A metodika szerint 200-300 g tömegű Sprague-Dawley-patkányokban tartós középagyi artériaelzáródást (MCAO) idéztünk elő a fokális szélütés kiváltására. Az (I) vegyületet a permanens elzáródás bekövetkezése után adtuk be először intraperitoneális (ip.) boluszdózisban, majd folyamatos intravénás (iv.) infúzió alakjában maximum 24 órán át a szélütést követően. Az (I) vegyület alkalmazott dózisai: 100 mg/kg ip. és 4,2 mg/kg/óra iv. vagy 10 mg/kg ip. és 0,42 mg/kg/óra iv.

A patkányokat 3 nappal a szélütés után leöltük, a szövetet hisztológiailag feldolgoztuk - trifenil-tetrazóliumfestési eljárások alkalmazásával -, majd a képelemzés segítségével kvantitative meghatároztuk az infarktustérfogatot és a teljes sejtnekrózis területét. A vizsgálatok eredményeit grafikusan az 5. ábrán mutatjuk be. Ezek arra mutatnak, hogy az (I) vegyület mindkét vizsgálatban - az előbbiekben megadott dózisokban - szignifikáns - körülbelül 70%-os - védelmet nyújtott. Összehasonlítás az irodalomban közölt eredményekkel

Hasonló adatokat közölt a közelmúltban Cao és Phillis (Brain Research 664, p. 267-272, 1994) nem a találmány szerinti vegyületre, hanem a PBN-re vonatkozóan. Vizsgálataik során patkányokban állandó középagyi artériaelzáródást (MCAO) és szokásos karotiszartéria-elzáródást idéztek elő. A szélütés után különböző időpontokban 100 mg/kg dózisban ip. PBN-t vittek be. 2 nappal a szélütést követően a patkányokat leölték és trifenil-tetrazóliumos festéssel kvantitative meghatározták az infarktustérfogatot.

Amikor a PBN-t 0,5; 5; 17; 29 és 41 órával a szélütés után vagy 5; 17; 29 és 41 órával a szélütést követően adták be, az infarktustérfogat mindegyik esetben körülbelül 50%-kal csökkent. Az 50%-os védelem eléréséhez bevitt PBN kumulatív dózisa minimum négyszerese az (I) vegyület 70%-os védelem eléréséhez szükséges mennyiségének. Az (I) vegyület tehát a PBN-hez képest sokkal hatásosabb, ami patkányok MCAO fokális ischaemiamodellben való védelmét illeti.

13. példa

Ebben a példában a találmány szerinti (I) vegyületet értékeltük azon képességének meghatározására, hogy enyhíti a rákellenes terápia oxidációs eredetű mellékhatásait. Vizsgálatok adriamicinnel

Az adriamicin elterjedten alkalmazott rákellenes szer. Ismert róla, hogy nagyon hatékony, de ugyancsak köztudott, hogy oxidatív károsodás előidézésére hajlamos, és így jelentős mellékhatásokat mutat. Ezen mellékhatások körébe tartozik a magas dózisokban kiváltott komoly szívkárosodás. A mellékhatások gyakran korlátozták ennek a szemek az alkalmazását vagy az alkalmazható dózisszinteket olyan értékekre csökkentették, amelyek alacsonyabbak a maximális antineoplasztikus hatás eléréséhez megkívántaknál.

Kísérleteket végeztünk annak kimutatására, hogy a találmány szerinti vegyület hatásos a rákellenes szerek

HU 221 167 Β1

- például az adriamicin - mellékhatásainak csökkentésében és lehetővé teszi magasabb adriamicinszintek tolerálását állatokban.

35-40 grammos C57BL/6J és DBA/2J hím egerekben vizsgáltuk az adriamicin akut letális hatását és az akut letalitás megelőzését az (I) vegyület különböző dózisaival végzett kezeléssel. Az adriamicin beadása előtt 30 perccel az egereknek ip. sóoldatot vagy (I) vegyületet injektáltunk. Az adriamicin akut letalitása a 10-30 mg/kg tartományba esik. Azt találtuk, hogy ezekben a vizsgálatokban az adriamicin LD₅₀-értéke mindkét egértörzs esetében 25 mg/kg. Az (I) vegyület 300 mg/kg-ig terjedő dózisokban - adriamicines kezelés nélkül - nem befolyásolta a két egértörzsben a túlélést.

A 30, illetve 100 mg/kg (I) vegyülettel végzett előkezelés dózisfüggő eltolódásokat idézett elő az adriamicin letalitás/dózis függvényen. A 6. ábra mutatja be a DBA/2J egerekkel kapott eredményeket. 100 mg/kg-os (I) vegyületdózis ötszörös jobbra (a csökkent letalitás irányába) való eltolódást idézett elő. Az (I) vegyület és az adriamicin kombinálása tehát a maximális tolerált dózis jelentős növekedését eredményezte. Ezek a magasabb dózisok abba a tartományba esnek, amelyben ténylegesen elpusztíthatok a több gyógyszernek ellenálló daganatok.

Összehasonlító vizsgálatok

A PBN-nel végzett előkezelés enyhe jobbra tolódást okozott az adriamicin dózis/hatás görbéjén. Míg az (I) vegyület dózisa adriamicinnel kombinálva 300 mg/kg-ra volt növelhető, a PBN esetében ennek a kombinációnak van egy felső határa. 100 mg/kg-os PBN dózis enyhe nyugtató hatást mutat, 300 mg/kg esetében pedig jelentős szedálás és kombinált toxicitás (10-20%-os letalitás) volt megfigyelhető. Az (I) vegyület-adriamicin kombináció 300 mg/kg-ig terjedő (I) vegyület dózis mellett nem mutatott kombinált toxicitást.

14. példa

A biztonságosság vizsgálata

Vizsgáltuk az (I) vegyület és a PBN akut toxicitását 200-300 g-os hím Sprague-Dawley-patkányokban. A vegyületeket 1000 mg/kg-os dózisban ip. adtuk be patkányok csoportjainak. 3 nap elteltével meghatároztuk a letalitást. Az (I) vegyület nem bizonyult letálisnak, míg a PBN az ebben a tesztben felhasznált 6 patkány közül 5-re letálisnak mutatkozott. Ezek az adatok alátámasztják a versenyegerekre vonatkozóan kapott adatokat, nevezetesen azt, hogy az (I) vegyület nagyobb biztonsággal alkalmazható, mint a PBN.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Az (I) képletű N-terc-butil-a-2-(2,4-diszulfo-fenil)-nitron és gyógyászatilag elfogadható sói.
2. Az 1. igénypont szerinti (III) képletű gyógyászatilag elfogadható só, amely képletben

X jelentése Na, K, -NH₄, Ca, Mg, CaY vagy MgY, és Y jelentése egy gyógyászatilag elfogadható egyértékű anion.
3. Gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt.
4. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt, orális adagolási formában kikészítve.
5. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt, parenterális adagolási formában kikészítve.
6. Az 1. igénypont szerinti vegyület vagy gyógyászatilag elfogadható sója alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására.
7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás a szélütés elleni gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy azt parenterális adagolási formában készítjük ki.
8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás a szélütés elleni gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy azt intravénás adagolási formában készítjük ki.
9. A 6. igénypont szerinti alkalmazás a központi idegrendszeri funkciók folyamatos csökkenése elleni gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy azt orális vagy parenterális adagolási formában készítjük ki.
10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás a központi idegrendszeri funkciók folyamatos csökkenése elleni gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy azt intravénás adagolási formában készítjük ki.
11. A 6. igénypont szerinti alkalmazás az antineoplasztikus terápia oxidatív károsodást okozó mellékhatásai elleni gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy azt orális vagy parenterális adagolási formában készítjük ki.
12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás az antineoplasztikus terápia oxidatív károsodást okozó mellékhatásai elleni gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy azt intravénás adagolási formában készítjük ki.