PT2292663E - Anticorpos monoclonais humanos antagonistas específicos de light humano - Google Patents

Anticorpos monoclonais humanos antagonistas específicos de light humano Download PDF

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Steven W Granger
Shinichiro Kato
Carl F Ware
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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Jolla Inst Allergy Immunolog
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Description

1
DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais humanos antagonistas específicos de LIGHT humano"
INTRODUÇÃO São proporcionados neste documento anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido LIGHT humano (hLIGHT) (do tipo de uma linfotoxina, exibe expressão induzivel e compete com do a glicoproteina D de HSV para HVEM, um receptor expresso por linfócitos T), um fragmento de hLIGHT ou outro epítopo de hLIGHT. Em algumas concretizações os anticorpos são anticorpos completamente humanos, preferivelmente anticorpos monoclonais integralmente humanos, que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um anticorpo hLIGHT ou a um epítopo de hLIGHT. Também se proporcionam os ácidos nucleicos isolados codificando para anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo hLIGHT. A invenção proporciona ainda vectores e células hospedeiras que incluam ácidos nucleicos codificando para anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo hLIGHT, bem como métodos para fabricar anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um 2 fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo hLIGHT. Proporcionam-se também métodos de utilizar os anticorpos anti-hLIGHT que se proporcionam neste documento para inibir a actividade biológica de hLIGHT e/ou para tratar ou de outra forma gerir uma doença mediada por hLIGHT num paciente.
ESTADO DA TÉCNICA 0 LIGHT, (do tipo de uma linfotoxina, exibe expressão induzivel e compete com do a glicoproteína D de HSV para HVEM, um receptor expresso por linfócitos T), é um alvo potencial para citoquinas, que tem sido implicado nos processos das doenças inflamatórias crónicas auto-imunes (Mauri et al. 1998 Immunity 8, 21-30) . Sendo um membro da superfamilia de ligandos do TNF (TNFSF), o LIGHT também é conhecido como TNFSF14 ou como CD258. O LIGHT é expresso à superfície de células T por activação, de uma forma apertadamente regulada, aparecendo nas primeiras 4 horas, atingindo um valor máximo às 12-24 horas e desaparecendo pelas 48 horas (Castellano et al., 2002 J. Biol. Chem. 277, 42841-51). No entanto, o LIGHT também está presente a teores detectáveis, constitutivamente, à superfície das células dendríticas imaturas (Tamada et al., 2000, J. Immunol. 164, 4105- -10) e nas células T e nas células assassinas naturais (NK) do tubo digestivo (Cohavy et al., 2005, J . Immunol. 174, 646-53). 0 LIGHT media os seus efeitos biológicos ligando-se a três receptores da superfamilia do TNF, incluindo o receptor β de linfotoxina 3 (ΙΙιΤβΚ) (Crowe et al., 1994, Science, 264, 707-10, Browning et al., 1997, J. Immunol. 159, 3288-98), o mediador de entrada do vírus herpes (HVEM) (Montgomery et al., 1996, Cell, 87(3), 427-36), e o receptor armadilha 3 (DcR3) (Yu et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 13733-6).
Os murganhos tratados com uma proteína de fusão inibidora LT3R-Fc apresentavam uma diminuição dos sintomas inflamatórios no modelo de colite de transferência com células T CD4+CD45RBhigh, uma patologia mediada por células T CD4+ (Mackay et al., 1998, Gastroenterology, 115, 1464-75). Também se demonstrou que a expressão específica constitutiva de LIGHT em células T leva a uma inflamação intestinal severa com uma patologia semelhante à auto-imune, parecida com doença inflamatória dos intestinos em seres humanos (IBD) (Wang et ai., 2005, J. Immunol. 174, 8173-82, Shaikh et al., 2001, J. Immunol. 167, 6330-7, Wang et al., 2001, J. Immunol. 167, 5099-105, Wang et al. 2004, J. Clin. Invest. 113, 826-35). Os linfócitos que expressam LIGHT podem induzir sintomas do tipo dos de IBD (por exemplo, com perfis de citoquinas da doença de Crohn humana, úlceras fissurantes, ileíte, e aumentos dos teores em IFN-γ e em TNF no cólon) quando se transferem células dos nodos linfáticos provenientes de animais transgénicos com LIGHT para RAG-/- (Wang et al., 2005, J. Immunol. 174, 8173-82). Na doença humana, observaram-se aumentos da expressão de LIGHT em pacientes dom doença de Crohn active (Cohavy et al., 2005, J. Immunol. 174, 646-53, Wang et al., 2005, J. Immunol. 174, 8173-82, Wang et ai., 2004, J. Clin. 4
Invest. 113, 826-35, Cohavy et al., 2004, J. Immunol. 173, 251-8). Demonstrou-se também um teor elevado em LIGHT nas células T dos intestinos dos pacientes com IBD (Cohavy et al., 2004, J. Immunol. 173, 251-8). Existem dados genéticos que suportam um papel para o LIGHT na IBD (Granger et al., 2001, J. Immunol. 167, 5122-8); (Rioux et al., 2000, Am. J. Hum. Genet. 66, 1863-70; Low et al., 2004, Inflamm. Bowel Dis. 10, 173-81; Bonen e Cho, 2003, Gastroenterology 124, 521-36).
Além disto, demonstrou-se que está envolvida uma sinalização com CCL20-CCR6 na IBD, e que o LIGHT induz a secreção de CCL20 na linha de células do epitélio do cólon humano, HT29.14s. Em estudos em seres humanos, verificou-se que as células epiteliais do cólon são uma fonte principal de CCL20 nos pacientes com IBD e que a expressão de CCL20 é mais elevada nos pacientes humanos com IBD (Kwon et al., 2002, Gut 51, 818-26; (Kaser et al., 2004, J. Clin. Immunol. 24, 74-85).
Também foi implicado o hLIGHT na doença dos hospedeiros contra o enxerto (GVHD). Por exemplo, demonstrou-se que o LIGHT proporciona uma actividade co-estimuladora potente em células T, incrementando a proliferação bem como a produção de citoquinas Thl independente do caminho B7-CD28 (veja-se, por exemplo, Tamada et al., 2000, J. Immunol. 164, 4105-4110). Bloqueando a co-estimulação por LIGHT-HVEM, quer com anticorpos monoclonais anti-HVEM, quer com HVEM-Ig, ou 5 ainda com proteína de fusão LTpR, inibem-se as reacções alogénicas de células T (veja-se, por exemplo, Tamada et al, . 2000, J. Immunol. 164, 4105-4110, Harrop et al., 1998, J. Immunol. 161, 1786) . Além disto, a administração in vivo de LTPR-Ig ou de anticorpos anti-LIGHT de murinos, inibe as reacções de linfócitos T citotóxicos(CTL) contra o hospedeiro num modelo de GVHD aguda em murinos (Tamada et al., 2000, Nat. Med. 6, 283-289).
Embora observações tais como as que se descreveram acima indiquem um papel do LIGHT das patologias inflamatórias, tais como IBD ou GVHD, até à data ainda não foram produzidos nenhuns anticorpos humanos contra o LIGHT humano, nem se demonstrou que nenhuns anticorpos humanos anti-hLIGHT nem nenhuns anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT fossem antagonistas da actividade biológica do hLIGHT. No WO 03/089.575 descrevem-se anticorpos anti-LIGHT do ponto de vista teórico, mas não são produzidos nem testados, de facto, nenhuns anticorpos. Deste modo, existe uma necessidade contínua de se identificarem terapias, tais como terapias anti-LIGHT, úteis para o tratamento de doenças inflamatórias em seres humanos. Não de deve interpretar a partir da citação ou da descrição de uma referência bibliográfica neste documento, que ela integre o estado da técnica anterior, em relação à invenção presente.
DESCRIÇÃO RESUMIDA A invenção está contida nas reivindicações. 6
Em especial, proporcionam-se neste documento: [1] um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo de hLIGHT, incluindo o anticorpo A. (a) uma região VH de um anticorpo produzida por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) uma região VL de um anticorpo produzida pelo hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819, ou B. um anticorpo isolado que se ligue especificamente a um epitopo de hLIGHT, anticorpo este que inclua: (a) regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de VH de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819.
[2] 0 anticorpo de [1], em que o anticorpo isolado seja um anticorpo produzido pelo hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7819. 7 [3] 0 anticorpo de [1], em que o anticorpo inclua: (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável da cadeia leve (VL) com a sequência de aminoácidos de qualquer uma de entre as SEQ ID Nos:90, 91 ou 92.
[4] 0 anticorpo de [1], em que o anticorpo inclua: (a) uma região variável da cadeia pesada incluindo: (1) uma CDR1 de VH com a SEQ ID NO:20; (2) uma CDR2 de VH com a SEQ ID NO:21; e (3) uma CDR3 de VH com a SEQ ID NO:22; e (b) uma região variável da cadeia pesada leve seleccionada de entre o conjunto constituído por: (1) uma CDR1 de VL com a SEQ ID NO: 93, uma CDR2 de VL com a SEQ ID NO: 96 e uma CDR3 de VL com a SEQ ID NO:99; 8 (2) uma CDR1 de VL com a SEQ ID NO: 9 4, uma CDR2 de VL com a f SEQ ID N097 e uma CDR3 de VL com a SEQ ID NO:100; e (3) uma CDR1 de VL com a SEQ ID NO: 95, uma CDR2 de VL com a SEQID NO: 98 e uma CDR3 de VL com a SEQ ID NO:101.
[5] O anticorpo de qualquer uma das [1] — [4], em que o anticorpo inclua um domínio constante de IqG.
[6] O anticorpo de qualquer uma das [1] — [5], em que o anticorpo inclua um domínio constante de IgGl ou de IgG4.
[7] O anticorpo de qualquer uma das [1]—[6], em que o anticorpo seja um anticorpo completamente humano, ou em que o anticorpo seja um anticorpo quimérico ou humanizado, ou em que o anticorpo seja um anticorpo seja um fragmento que se ligue a um antigénio, ou em que o anticorpo seja um fragmento, Fab, F(ab')2, um Fv (sFv) de cadeia singela, um diacorpo, um triacorpo, ou um minicorpo.
[8] O anticorpo de qualquer uma das [1] — [7], em que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal ou um anticorpo recombinante. 9 [9] Uma composição incluindo o anticorpo de qualquer uma das [1] a [8].
[10] Uma molécula isolada de ácido nucleico (i) incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifique para (a) uma sequência de aminoácidos da VH de um anticorpo produzido por um hibridoma depositado com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) uma sequência de aminoácidos da VL de um anticorpo produzido por um hibridoma depositado com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819, ou (ii) incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifique para (a) CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819, ou (iii) incluindo ou sendo constituído por uma sequência de ácidos nucleicos que codifique para um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o N° de Acessão na ATCC PTA-7819, ou 10 (iv) incluindo (a) uma sequência representada na SEQ ID NO: 44; e (b) uma sequência representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:104, 105 ou 106.
[11] Um vector incluindo a molécula de ácido nucleico de [10].
[12] Uma célula hospedeira incluindo o vector de [11].
[13] Um método de produzir o anticorpo de qualquer uma das [1] a [8], incluindo este método cultivar-se a célula hospedeira de [12] em condições que promovam a produção do anticorpo.
[14] Um hibridoma que produza um anticorpo tal como o reivindicado em qualquer uma das [1] a [8] .
[15] O hibridoma de [14], tendo este hibridoma o N° de acessão na ATCC PTA-7819.
[16] um estojo incluindo o anticorpo de qualquer uma das [1] a [8] ou a composição de [9] . 11
Proporcionam-se neste documento anticorpos, tais como anticorpos completamente humanos, que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. Também se proporcionam ácido nucleicos isolados codificando para anticorpos, tais como anticorpos completamente humanos, que se liguem imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. Proporcionam-se ainda vectores e células hospedeiras que incluam ácidos nucleicos codificando para anticorpos, tais como anticorpos completamente humanos, que se liguem imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a epítopos de hLIGHT. Proporcionam-se também métodos de fabricar anticorpos, tais como anticorpos completamente humanos, que se liguem imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. Também se proporciona neste documento um método de tratar uma doença mediada por hLIGHT, que inclui administrar-se um anticorpo, tal como um anticorpo completamente humano, que se ligue imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. Em concretizações preferidas, os anticorpos anti-hLIGHT proporcionados neste documento são anticorpos antagonistas que melhoram, neutralizam ou de outra forma inibem a actividade biológica de hLIGHT in vivo (por exemplo, a produção ou a secreção mediadas por hLIGHT de CCL20, de IL-8 ou de RANTES, em células que expressem um 12 ligando de hLIGHT, tal como um receptor de hLIGHT, (por exemplo, HVEM, ΗΤβΙΙ e/ou DcR3)) . Um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo de comprimento inteiro ou um fragmento de anticorpo que se ligue a um antigénio. Os anticorpos da invenção também são úteis para detectar hLIGHT, bem como para melhorar, neutralizar ou de outra forma inibir a actividade de hLIGHT, por exemplo, num sujeito humano que sofra de uma patologia na qual a actividade de hLIGHT seja nociva. ou um
Deste modo, proporciona-se neste documento um anticorpo isolado que se liga se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície ou solúvel), um fragmento de polipéptido hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT. 0 anticorpo pode ligar-se imunoespecificamente a (a) um epítopo trimérico (ou nativo) de hLIGHT, (b) um epítopo monomérico (ou desnaturado) de hLIGHT, (c) tanto a um epítopo trimérico de hLIGHT como a um epítopo monomérico de hLIGHT, (d) um epítopo trimérico de hLIGHT mas não a um epítopo monomérico de hLIGHT, ou (e) um epítopo monomérico de hLIGHT mas não a um epítopo trimérico de hLIGHT. Preferivelmente, o anticorpo liga-se imunoespecificamente a um epítopo trimérico de hLIGHT mas não a um epítopo humano monomérico de hLIGHT. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo El, um anticorpo E13, um anticorpo E63, um anticorpo F19, anticorpo F23. 13
Depositaram-se os hibridomas que produzem os diversos anticorpos El, E13, E63, F19 e F23 nas condições do tratado de Budapeste, junto da American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) a 12 de Julho de 2006 (Nos. de Acessão na ATCC PTA-7729 (hibridoma 124 El) e PTA-7728 (hibridoma 124 F23), respectivamente) , a 17 de agosto de 2006 (Nos. de Acessão na ATCC PTA-7818 (hibridoma 124 E63) e PTA-7819 (hibridoma 124 F19) e a 23 de Agosto de 2006 (N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (hibridoma 124 E13) . Também se podem referir os anticorpos produzidos pelos hibridomas 124 El, 124 E13, 124 E63, 124 F19 e 124 F23 neste documento como, respectivamente, El, E13, E63, F19, F23, e/ou pelos Nos. de Acessão na ATCC, respectivamente PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, e PTA-7728.
Estes anticorpos, hibridomas, métodos de fabricar estes anticorpos, e métodos de utilizar estes anticorpos estão todos incluídos na descrição presente.
Um anticorpo da descrição presente pode ser um que esteja competitivamente bloqueado (por exemplo, de um modo dependente da dose) por um anticorpo El, um anticorpo E13, e/ou um anticorpo E63, por ligação a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), um fragmento de hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT. O anticorpo pode ser competitivamente bloqueado (por exemplo, de um modo dependente da dose) por um anticorpo F19 e/ou por um anticorpo F23 para ligação a um 14 polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), um fragmento de hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT. 0 anticorpo pode ser competitivamente bloqueado (por exemplo, de um modo dependente da dose) por um anticorpo El, um anticorpo E13 e/ou um anticorpo E63, mas não é competitivamente bloqueado (por exemplo, de um modo dependente da dose) por um anticorpo F19 e/ou por um anticorpo F23, para ligação a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), um fragmento de hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT. 0 anticorpo pode ser competitivamente bloqueado (por exemplo, de um modo dependente da dose) por um anticorpo F19 e/ou por um anticorpo F23, mas não é competitivamente bloqueado (por exemplo, de um modo dependente da dose) por um anticorpo El, por um anticorpo E13 e/ou por um anticorpo E63, para ligação a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), um fragmento de hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT. Proporcionam-se exemplos de testes de bloqueio competitivo nos Exemplos deste documento.
Também se proporcionam neste documento anticorpos, ou fragmentos de anticorpo que se liguem a antigénio, que se liguem imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), a um fragmento de polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. 0 anticorpo ou o fragmento que se ligue a um antigénio pode incluir uma cadeia VH, uma cadeia VL, um domínio VH, um domínio VL, 15 CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL, e/ou CDR3 de VL, dos El, E13, E63, F19 ou F23. 0 anticorpo ou o seu fragmento que se ligue a um antigénio podem incluir menos do que seis CDR. 0 anticorpo ou o seu fragmento que se ligue a um antigénio podem incluir ou ser constituídos por uma, duas, três, quatro, ou cinco CDR seleccionadas de entre o conjunto constituído pelas CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL, e/ou CDR3 de VL. 0 anticorpo ou o seu fragmento que se ligue a um antigénio podem incluir ou ser constituídos por uma, duas, três, quatro, ou cinco CDR seleccionadas de entre o conjunto constituído pelas CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL, e/ou CDR3 de VL de El, E13, E63, F19 ou de F23.
Também se proporcionam neste documento composições farmacêuticas incluindo um anticorpo anti-hLIGHT da descrição presente, tal como El, E13, E63, F19 ou F23 .
Um anticorpo descrito neste documento pode ser um anticorpo completamente humano, um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo antagonista, ou uma qualquer combinação destes. 0 anticorpo pode ser um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio, que se ligue imunoespecificamente a 16 hLIGHT. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo antagonista. 0 anticorpo pode competir (por exemplo, de um modo dependente da dose) com HVEM, ΕΤβϊ1, DcR3, ou com as suas proteínas de fusão (por exemplo, Fc:HVEM, Fc:LTPR ou Fc:DcR3), para uma ligação a um polipéptido hLIGHT, tal como polipéptido hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. Proporcionam-se exemplos de testes de bloqueio nos Exemplos neste documento.
Proporcionam-se neste documento ácidos nucleicos isolados codificando para anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. Em determinadas concretizações, o ácido nucleico codifica para uma cadeia VH, para uma cadeia VL, um domínio VH, um domínio VL, a CDR1 de VH, a CDR2 de VH, a CDR3 de VH, a CDR1 de VL, a CDR2 de VL, e/ou a CDR3 de VL, de El, E13, E63, Fl9 ou de F23.
Proporcionam-se neste documento vectores e células hospedeiras incluindo ácidos nucleicos que codificam para anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. 17
Proporcionam-se neste documento métodos de fabrico de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT. 0 anticorpo pode ligar-se imunoespecificamente a uma variante com um polimorfismo de um único nucleótido (SNP) de um polipéptido hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L e/ou 214K-32L. Também se proporcionam neste documento hibridomas que produzem anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, ou a um seu variante SNP. 0 hibridoma pode ser o hibridoma que produz El, E13, E63, F19 ou F23.
Proporcionam-se neste documento métodos de tratar ou de por outra forma aliviar um ou mais sintomas de uma doença mediada por hLIGHT num sujeito (por exemplo, um sujeito humano), que incluem administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície ou solúvel), em que a actividade de hLIGHT é inibida pelo anticorpo. A doença mediada por hLIGHT pode ser uma IBD, tal como a doença de Crohn ou a colite ulcerosa. A doença mediada por hLIGHT pode ser GVHD.
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, ΗΤβϊΙ e/ou DcR3, num sujeito (por exemplo, um sujeito humano), que incluem administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a um 18 polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel).
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou para inibir a actividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, num sujeito (por exemplo, um sujeito humano), que incluem administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular) , em que a actividade biológica do hLIGHT seja diminuída ou inibida pelo anticorpo. São proporcionados neste documento métodos para diminuir ou para inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, LTpR e/ou a DcR3 numa célula possuindo hLIGHT expresso na superfície da célula, levando a célula a um contacto com uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT (por exemplo, a um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel), tal como um polipéptido hLIGHT, um fragmento de polipéptido hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT.
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou para inibir a actividade biológica do hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou de RANTES, numa célula que possua um receptor de hLIGHT expresso à superfície da célula (tal como, HVEM, LTpR e/ou Dc3R), levando a célula ao contacto com uma quantidade eficaz de 19 um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT (por exemplo, a um hLIGHT expresso à superfície celular ou solúvel, ou uma sua variante SNP), em que a actividade biológica do hLIGHT seja diminuída ou inibida pelo anticorpo.
Proporciona-se neste documento um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT, em que o referido anticorpo também inclua um marcador detectável. Em algumas concretizações, os anticorpos anti-hLIGHT que incluem um marcador detectável são utilizados num método para a detecção de hLIGHT numa amostra, incluindo o método referido levar-se a amostra a um contacto com o anticorpo anti-hLIGHT. Em concretizações específicas, a amostra inclui uma célula que expressa hLIGHT à superfície da célula.
Proporcionam-se neste documento estojos que incluem um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de polipéptido hLIGHT, ou a um epítopo de hLIGHT.
TERMINOLOGIA A não ser aonde se defina algo em contrário, todos os termos científicos e técnicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que é habitualmente utilizado e entendido por um indivíduo com conhecimentos 20 médios da técnica. No caso de existirem diversas definições para um termo neste documento, prevalecem as contidas nesta secção a não ser aonde se definir algo em contrário. O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa não diferindo em mais de 20 %, preferivelmente não mais de 10 %, e mais preferivelmente de 5 % (ou 1 %, ou menos), de um determinado valor ou gama.
Tal como se utiliza neste documento, "administrar" ou "administração" refere-se ao acto de injectar ou proceder fisicamente à administração por outra via, de uma substância tal como existe fora do corpo (por exemplo, um anticorpo anti-hLIGHT que se proporciona neste documento), a um paciente, tal como através da via mucosal, intradérmica, endovenosa, intramuscular e/ou por qualquer outro método de veiculação física descrito neste documento ou conhecido na técnica. Quando se está a tratar uma doença, ou um seu sintoma, a administração da substância ocorre tipicamente depois do início da doença ou dos seus sintomas. Quando se está a evitar uma doença, ou os seus sintomas, a administração da substância ocorre tipicamente antes do início da doença ou dos seus sintomas.
No contexto de um polipéptido, o termo "análogo", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um polipéptido que possui uma função semelhante ou idêntica à de um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um anticorpo anti-hLIGHT, mas que não inclui 21 necessariamente uma sequência de aminoácidos semelhante ou idêntica à sequência de aminoácidos de um polipéptido hLIGHT, de um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou de um anticorpo anti-hLIGHT, ou possui uma estrutura semelhante ou idêntica à de um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um anticorpo anti-hLIGHT. Um polipéptido que tenha uma sequência de aminoácidos semelhante refere-se a um polipéptido que satisfaça pelo menos uma das seguintes: (a) um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos que seja idêntica em pelo menos 30 o o r em pelo menos 35 o, o r em pelo menos 40 o o r em pelo menos 45 o o r em pelo menos 50 o. o r em pelo menos 55 o o r em pelo menos 60 o o r em pelo menos 65 o, o r em pelo menos 70 o o r em pelo menos 75 Q, o r em pelo menos 80 o, o r em pelo menos 85 %, e preferivelmente em pelo menos 90 %, mais preferivelmente em pelo menos 95 %, ou de preferência em pelo menos 99 %, à sequência de aminoácidos de um polipéptido hLIGHT (por exemplo, a SEQ ID NO:52), a de um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a de um anticorpo anti-hLIGHT descritos neste documento; (b) um polipéptido codificado por uma sequência de nucleótidos que hibridiza sob condições severas a uma sequência de nucleótidos codificando para um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um anticorpo anti-hLIGHT (ou uma sua região VH ou VL) descrito neste documento, com pelo menos 5 resíduos de aminoácido, com pelo menos 10 resíduos de aminoácido, com pelo menos 15 resíduos de aminoácido, com pelo menos 20 resíduos de aminoácido, com pelo menos 25 resíduos de aminoácido, com pelo menos 40 resíduos de 22 aminoácido, com pelo menos 50 resíduos de aminoácido, com pelo menos 60 resíduos de aminoácido, com pelo menos 70 resíduos de aminoácido, com pelo menos 80 resíduos de aminoácido, com pelo menos 90 resíduos de aminoácido, com pelo menos 100 resíduos de aminoácido, com pelo menos 125 resíduos de aminoácido, ou com pelo menos 150 resíduos de aminoácido (veja-se, por exemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY); e (c) um polipéptido codificado por uma seguência de nucleótidos gue seja idêntica em pelo menos 30 o o r em pelo menos 35 %, em pelo menos 40 Q, r em pelo menos 45 % , em pelo menos 50 %, em pelo menos 55 o, 0 r em pelo menos 60 % , em pelo menos 65 %, em pelo menos 70 o, o r em pelo menos 75 % , em pelo menos 80 %, em pelo menos 85 0, 0 r e preferivelmente em pelo menos 90 Q, o r mais preferivelmente em pelo menos 95 %, ou de preferência em pelo menos 99 %, à sequência de nucleótidos codificando para o polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um anticorpo anti-hLIGHT (ou uma sua região VH ou VL) descritos neste documento. Um polipéptido com uma estrutura semelhante à de um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um anticorpo anti-hLIGHT, tal como se descreve neste documento, refere-se a um polipéptido que apresente uma estrutura secundária, terciária ou quaternária semelhantes às de um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um hLIGHT, ou um anticorpo anti-hLIGHT descritos neste documento. A estrutura de um 23 polipéptido pode ser determinada por métodos conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo mas não se limitando a, cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear, e microscopia electrónica cristalográfica.
Para se determinar a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de ácidos nucleicos, alinham-se as sequências para optimizar os objectivos da comparação (por exemplo, podem introduzir-se intervalos na sequência da primeira sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos para um alinhamento óptimo com uma segunda sequência de aminoácidos ou de nucleótidos). Comparam-se então os resíduos de aminoácidos ou de ácidos nucleicos em posições correspondentes. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou pelo mesmo nucleótido presente na posição correspondente da segunda sequência, as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, a % de identidade = número de posições idênticas sobreponíveis/número total de posições X 100 %) . As duas sequências podem ter o mesmo comprimento.
Também se pode conseguir a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico) utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, não limitativo, de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 2264-2268, modificado tal como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 5873-5877. Um algoritmo deste tipo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. Podem levar-se a cabo pesquisas de nucleótidos BLAST com os parâmetros do programa NBLAST de nucleótidos ajustados para, por exemplo, classificação=100, comprimento de palavra=12, para se obterem sequências de nucleótidos homólogas a moléculas de ácidos nucleicos descritos neste documento. Podem levar-se a cabo as pesquisas de proteínas com BLAST com os parâmetros do programa XBLAST ajustados, por exemplo, para classificação=50, comprimento de palavra=3 para se obterem sequências de aminoácidos homólogas às de uma molécula de proteína descrita neste documento. Para se obterem alinhamentos incluindo ausências, para efeito de comparação, Pode utilizar-se o Gapped BLAST tal como se descreve em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Em alternativa, pode utilizar-se o PSI BLAST para levar a cabo uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Td.). Quando se utilizarem os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI Blast, podem utilizar-se os parâmetros por defeito para os programas respectivos (por exemplo, de XBLAST e de NBLAST) (veja-se, por exemplo, o National Center for Biotechnology Information (NCBI) na internet, ncbi.nlm.nih.gov). Outro exemplo preferido, não limitativo, de um algoritmo matemático utilizado para a 25 comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Um algoritmo deste tipo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de programas de alinhamento de sequências GCG. Quando se utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, pode utilizar-se uma tabela PAM120 de pesos de residuos, uma multa por comprimento das ausências de 12, e uma multa por ausência de 4.
Pode determinar-se a percentagem de identidade entre duas sequências utilizando técnicas semelhantes às descritas acima, permitindo ou não a existência de ausências (intervalos). Quando se calcula a percentagem de identidade, só se contam tipicamente as sobreposições exactas.
Tal como se utiliza neste documento, um "antagonista" ou "inibidor" de hLIGHT refere-se a uma molécula que é capaz de inibir ou de outra forma diminuir uma ou mais das actividades biológicas de hLIGHT, tal como numa célula que expresse hLIGHT ou numa célula que expresse um ligando de hLIGHT, tal como um receptor de hLIGHT. Por exemplo, os anticorpos descritos neste documento podem ser anticorpos antagonistas que inibem ou de outra forma diminuem a secreção de CCL20, IL-8 e/ou RANTES numa célula que possua um receptor de hLIGHT expresso à superfície da célula (por exemplo, HVEM, LTPR e/ou DcR3) quando o anticorpo referido entra em contacto com a célula referida. Um antagonista de hLIGHT (por exemplo, um anticorpo 26 antagonista da invenção) pode, por exemplo, actuar inibindo ou de outra forma diminuindo a activação e/ou os caminhos de activação celular nas células que expressem um receptor de hLIGHT, inibindo deste modo uma actividade biológica mediada por hLIGHT da célula, em relação à actividade biológica mediada por hLIGHT na ausência do antagonista. Em determinadas concretizações, os anticorpos proporcionados neste documento são completamente humanos, anticorpo antagonistas anti-hLIGHT, preferivelmente anticorpos completamente humanos, monoclonais, antagonistas anti-hLIGHT . 0 termo "anticorpo" e o termo "imunoglobulina" ou o termo "Ig" podem ser utilizados de modo intercambiável neste documento. Os termos "anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT" "anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT" e "anticorpos anti-hLIGHT", e termos análogos, são também utilizados a titulo intercambiável neste documento e referem anticorpos e seus fragmentos, que se ligam especificamente a um polipéptido hLIGHT, tal como um antigénio hLIGHT ou um epitopo. Um anticorpo ou um seu fragmento que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT pode exibir reactividade cruzada com antigénio relacionados. Preferivelmente, um anticorpo ou um seu fragmento que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT não exibe reactividade cruzada com outros antigénios. Um anticorpo ou um seu fragmento que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT pode ser 27 identificado, por exemplo, por imunoensaios, com o BIAcore, ou por outras técnicas conhecidas dos indivíduos especializados. Um anticorpo ou um seu fragmento liga-se imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, quando se liga a um antigénio hLIGHT com uma afinidade maior do que a qualquer antigénio com reactividade cruzada, tal como se pode determinar utilizando técnicas experimentais, tais como radioimunoensaios (RIA) e ensaios com imuno-sorventes ligados a enzimas (ELISA). Tipicamente uma reacção selectiva ou específica terá pelo menos duas vezes o sinal da linha de base ou ruído, e mais tipicamente mais do que 10 vezes a linha de base. Veja-se, por exemplo, em Paul, editor, 1989, Fundamental Immunology, Segunda Edição, Raven Press, Nova Iorque, páginas 332-336, uma descrição acerca da especificidade de anticorpos.
Incluem-se nos anticorpos da especificação presente, sem que se limitem a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de um modo recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos bi-específicos) , anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, Fv de cadeia singela (scFv) (por exemplo, incluindo os monoespecíficos, os biespecíficos, etc.), anticorpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv ligados por dissulfureto (sdFv), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) , fragmentos de qualquer um dos acima que se liguem a epítopos. Em especial, os anticorpos da especificação presente incluem moléculas de imunoglobulina e porções 28 imunologicamente activas das moléculas de imunoglobulina, isto é, domínio que se ligam a antigénios ou moléculas que contenham um local de ligação a antigénio que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT (por exemplo, uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDR) de um anticorpo anti-hLIGHT). Os anticorpos da especificação presente podem ser um tipo qualquer (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , de uma classe qualquer (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), ou de uma subclasse qualquer (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Preferivelmente, os anticorpos de hLIGHT são completamente humanos, tais como anticorpos monoclonais completamente humanos para hLIGHT. Os anticorpos descritos neste documento podem ser anticorpos IgG, ou uma classe destes (por exemplo, IgGl ou IgG4 humanos) ou uma sua subclasse. 0 termo "domínio que se liga a um antigénio", o termo "região que se liga a um antigénio", o termo "fragmento que se liga a um antigénio", e termos semelhantes, referem a parte de um anticorpo que inclui os aminoácidos que interactuam com um antigénio e que conferem ao agente de ligação a sua especificidade e a sua afinidade para o antigénio (por exemplo, as regiões de determinação de complementaridade (CDR)). A região de ligação a antigénio pode ser derivada de qualquer espécie animal, por exemplo roedores (por exemplo, coelho, rato ou cobaia) e seres humanos. Preferivelmente, a região de ligação a antigénio terá uma origem humana. 29
Tal como se utiliza neste documento, o termo "composição" pretende incluir um produto contendo os ingredientes especificados (por exemplo, um anticorpo tal como se descreve neste documento) , opcionalmente nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulte, directa ou indirectamente, da combinação dos ingredientes especificados, opcionalmente nas quantidades especificadas. 0 termo "região constante" ou "domínio constante" refere-se à porção com o terminal carboxilo da cadeia leve e da cadeia pesada, que não está directamente envolvida na ligação do anticorpo ao antigénio, mas que exibe diversos tipos de funções efectivadoras, tais como por interacção com o receptor Fc. Os termos referem-se à parte da molécula de imunoglobulina que apresenta uma sequência de aminoácidos mais conservada, em relação à outra parte da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o local de ligação ao antigénio. 0 domínio constante contém os domínios CHI, CH2 e CH3 da cadeia pesada e o domínio CHL da cadeia leve.
No contexto de um polipéptido, o termo "derivado", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um polipéptido no qual se inclui uma sequência de aminoácidos de um polipéptido hLIGHT, de um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT que tenha sido 30 alterado através da introdução de substituições, ausências ou adições de aminoácidos. O termo "derivado", tal como se utiliza neste documento, também se refere a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT que tenha sido quimicamente modificado, por exemplo, através da ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipéptido. Por exemplo, mas sem quaisquer efeitos limitativos, um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um anticorpo hLIGHT pode ser quimicamente modificado, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização com grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou a outra proteína, etc. Os derivatizados são modificados de um modo que são diferentes do ou dos polipéptidos de ocorrência natural, ou de partida, quer pelo tipo, quer pela localização das moléculas que se lhes ligam. Também se incluem nos derivados os que resultam por eliminação de um ou mais grupos químicos que se encontram naturalmente presentes no péptido ou no polipéptido. Um derivado de um polipéptido hLIGHT, de um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou de um anticorpo hLIGHT, pode ser quimicamente modificado levando a cabo modificações químicas utilizando técnicas conhecidas dos especialistas, incluindo, mas não se limitando a, clivagem química específica, acetilação, formulação, síntese metabólica da tunicamicina, etc. Além disto, um derivado de um polipéptido hLIGHT, de um fragmento de um polipéptido 31 hLIGHT, ou de um anticorpo hLIGHT, pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um derivado de polipéptido possui uma função semelhante à de um polipéptido hLIGHT, de um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou de um anticorpo hLIGHT descrito neste documento. 0 termo "quantidade eficaz", tal como se utiliza neste documento refere-se à quantidade de uma terapia (por exemplo, um anticorpo ou uma composição farmacêutica proporcionados neste documento), que seja suficiente para diminuir e/ou melhorar, a severidade e/ou a duração de uma determinada doença e/ou de um sintoma com ela relacionado. Este termo também inclui uma quantidade necessária para diminuir ou para melhorar o avanço ou a progressão de uma determinada doença, a diminuição ou a melhoria de recaidas, do desenvolvimento ou do inicio de uma determinada doença, e/ou a melhoria ou o aumento do ou dos efeitos terapêuticos ou profilácticos de outra terapia (por exemplo, uma terapia diferente do anticorpo anti-hLIGHT proporcionado neste documento). A quantidade eficaz de um anticorpo descrito neste documento pode ser de entre cerca de 0,1 mg/kg (mg de anticorpo por kg de peso do sujeito) e cerca de 100 mg/kg. Em determinadas concretizações, uma quantidade eficaz de um anticorpo proporcionado ao paciente é de cerca de 0,1 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 15 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 25 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 35 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 45 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de 32 cerca de 70 mg/kg, de cerca de 80 mg/kg de cerca de 90 mg/kg ou de cerca de 100 mg/kg (ou um valor adentro desta gama). "Quantidade eficaz", tal como se utiliza neste documento, também pode referir-se à quantidade de um anticorpo tal como descrito neste documento para se conseguir um resultado determinado (por exemplo, a inibição de uma actividade biológica de hLIGHT numa célula, tal como a inibição da secreção de CCL20, IL-8 ou RANTES por essa célula) . O termo "epítopo", tal como se utiliza neste documento, refere-se a uma região localizada da superfície de um antigénio, tal como um polipéptido hLIGHT ou um fragmento de um polipéptido hLIGHT, que seja capaz de se ligar a uma ou mais regiões de ligação a antigénio de um anticorpo, e que possua actividade antigénica ou imunogénica num animal, preferivelmente num mamífero, e de preferência num ser humano, que seja capaz de originar uma reacção imunológica. Um epítopo com actividade imunogénica é uma parte de um polipéptido que origina uma reacção a um anticorpo, num animal . Um epítopo com actividade antigénica é uma parte de um polipéptido à qual se liga imunoespecificamente um anticorpo, tal como se pode determinar por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, recorrendo aos imunoensaios descritos neste documento. Os epítopos antigénicos não têm necessariamente que ser imunogénicos. Os epítopos são em geral constituídos por agrupamentos de moléculas, quimicamente activos, na superfície, tais como aminoácidos 33 ou cadeias laterais de açúcares, e possuem caracteristicas estruturais tridimensionais bem como caracteristicas especificas de carga. Uma região de um polipéptido que contribua para um epítopo pode incluir aminoácidos contíguos do polipéptido, ou o epítopo pode ser montado a partir de duas ou mais regiões não contíguas do polipéptido. 0 epítopo pode ou nao ser uma entidade tridimensional presente à superfície do antigénio. Um epítopo de hLIGHT pode ser uma entidade tridimensional superficial de um polipéptido hLIGHT (por exemplo, numa forma trimérica de um polipéptido hLIGHT). Um epítopo de hLIGHT pode ser uma entidade linear de um polipéptido hLIGHT (por exemplo, na forma trimérica ou na forma monomérica do polipéptido hLIGHT). Os anticorpos proporcionados neste documento podem ligar-se imunoespecificamente a um epítopo da forma monomérica (desnaturada) do hLIGHT, a um epítopo da forma trimérica (nativa) do hLIGHT, ou tanto à forma monomérica (desnaturada) como à forma trimérica (nativa) do hLIGHT. Os anticorpos proporcionados neste documento podem ligar-se imunoespecificamente a um epítopo da forma trimérica do hLIGHT mas não se ligar imunoespecificamente à forma monomérica do hLIGHT. 0 termo "excipientes", tal como se utiliza neste documento, refere-se a substâncias inertes que são habitualmente utilizadas a título de diluente, veículo, conservante, aglomerante, ou agente estabilizador para fármacos, e nele se incluem, sem que se limitem a estes, 34 proteínas (por exemplo, albumina de soro, etc.), aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos gordos e fosfolípidos (por exemplo, sulfonatos de alquilo, caprilato, etc.), tensioactivos (por exemplo, SDS, polissorbato, tensioactivos não iónicos, etc.), sacáridos (por exemplo, sacarose, maltose, trehalose, etc.) e polióis (por exemplo, manitol, sorbitol, etc.). Veja-se, também, o Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
No contexto de um péptido ou de um polipéptido, o termo "fragmento", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um péptido ou a um polipéptido que inclua menos do que o comprimento total da sequência de aminoácidos. Um fragmento como este pode provir, por exemplo, de um corte no terminal amino, de um corte no terminal carboxilato, e/ou de uma eliminação de um ou mais resíduos de aminoácidos no interior da sequência de aminoácidos. Os fragmentos podem, por exemplo, resultar de emendas alternativas no ARN ou de actividade de proteases in vivo. Nos fragmentos de hLIGHT descritos neste documento podem incluir-se polipéptidos contendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 40 resíduos de aminoácidos 35 contíguos, com pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, com pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, ou com pelo menos 25o resíduos de aminoácidos contíguos, da sequência de aminoácidos de um polipéptido hLIGHT ou de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT. Um fragmento de um polipéptido hLIGHT ou de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT pode reter pelo menos 1, pelo menos 2, ou pelo menos 3 funções do polipéptido ou do anticorpo.
Os termos "anticorpo completamente humano" ou "anticorpo humano" são utilizados de modo intercambiável neste documento e referem um anticorpo que inclui uma região variável humana e, de preferência, uma região constante humana. Os termos podem referir um anticorpo que inclui uma região variável e uma região constante, ambas com origem humana. Anticorpos anti-hLIGHT "completamente humanos" também podem incluir anticorpos que se ligam A polipéptidoS hLIGHT e que são codificados por sequências de ácido nucleico que ocorrem naturalmente como variantes somáticas da sequência de ácido nucleico de imunoglobulina 36 na linha de gérmen. Os anticorpos anti-hLIGHT proporcionados neste documento podem ser anticorpos completamente humanos. 0 termo "anticorpo completamente humano" inclui anticorpos que tenham regiões variável e constante correspondentes às sequências da linha de gérmen de imunoglobulina humana, tal como descritas por Kabat et al. (Veja-se Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação do NIH N°. 91-3242). Proporcionam-se métodos exemplificativos para produzir anticorpos completamente humanos, por exemplo, nos Exemplos neste documento, mas pode utilizar-se qualquer método conhecido na técnica. A frase "anticorpo recombinante humano" inclui anticorpos humanos que sejam preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de uma combinação de anticorpos recombinantes humanos, anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um murganho ou uma vaca) que seja transgénico e/ou transcromossómico no que toca aos genes da imunoglobulina humana (veja-se, por exemplo, Taylor, L. D. et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295), ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros métodos que envolvam emendas com sequências de genes de imunoglobulina humana noutras sequências de ADN. Estes anticorpos recombinantes humanos 37 podem ter regiões, variável e constante, derivadas da linha de gérmen humano quanto às sequências para a imunoglobulina (Veja-se Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação do NIH N°. 91-3242). No entanto, estes anticorpos recombinantes humanos podem ser submetidos a uma mutagénese in vitro (ou, quando se utilizar um animal transgénico quanto às sequências de Ig humana, mutagénese somática in vivo), e portanto as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências de VH e de VL na linha de gérmen humano, podem não existir naturalmente no conjunto das linhas de gérmen de anticorpos humanos in vivo. 0 termo "proteína de fusão", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um polipéptido que inclua uma sequência de aminoácidos de um anticorpo e uma sequência de aminoácidos de um polipéptido ou de uma proteína heterólogos (isto é, um polipéptido ou proteína que não faça normalmente parte do anticorpo (por exemplo, um anticorpo contra um antigénio que não seja anti-hLIGHT)). 0 termo "fusão", quando utilizado em relação a hLIGHT ou a um anticorpo anti-hLIGHT, refere-se à ligação de um péptido ou polipéptido, ou de um seu fragmento, variante e/ou derivado, a um péptido ou polipéptido heterólogo. Preferivelmente, a proteína de fusão mantém a actividade biológica do hLIGHT ou do anticorpo anti-hLIGHT. A proteína 38 de fusão pode conter um domínio VH, um domínio VL, uma CDR de VH (uma, duas ou três CDR de VH) , e/ou uma CDR de VL (uma, duas ou três CDR de VL) , do anticorpo hLIGHT, em que a proteína de fusão se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT. 0 termo "cadeia pesada", quando utilizado em relação a um anticorpo, refere-se a cinco tipos distintos, denominados alfa (a), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) e miu (μ) , com base na sequência de aminoácidos do domínio constante da cadeia pesada. São bem conhecidos três tipos diferentes de cadeias pesadas que originam cinco classes de anticorpos, respect ivamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, , incluindo quatro subclasses de IgG, nomeadamente IgGl, IgGl, IgG3 e IgG4. Preferivelmente, a cadeia pesada será uma cadeia pesada humana. 0 termo "hospedeiro", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um animal, preferivelmente um mamífero, e de preferência a um ser humano. 0 termo "célula hospedeira", tal como se utiliza neste documento, refere-se à célula específica sujeitada a uma transfecção com uma molécula de ácido nucleico, e às descendentes de uma tal célula. As descendentes de uma tal célula podem não ser idênticas à célula original transfectada com a molécula de ácido nucleico, devido a mutações ou a influências ambientais que possam ocorrer ao 39 longo de gerações sucessivas ou à integração da molécula de ácido nucleico no genoma da célula hospedeira. 0 termo "agente imunomodulador", e as variações deste termo incluindo, mas não se limitando a, agentes imunomoduladores, tal como se utilizam neste documento, referem-se a um agente que modula o sistema imunológico de um hospedeiro. Um agente imunomodulador pode ser um agente imunossupressor. Um agente imunomodulador pode ser um agente imunoestimulador. Um agente imunomodulador utilizado nas terapias de combinação da especificação presente não inclui um anticorpo anti-hLIGHT nem um seu fragmento de ligação a um antigénio. Incluem-se nos agentes imunomoduladores, sem que eles se limitem a estes, moléculas pequenas, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas inorgânicas, agentes miméticos, e moléculas orgânicas.
Tal como se utiliza neste documento, o termo "em combinação com", no contexto da administração de outras terapias, refere-se à utilização de mais do que uma terapia. A utilização do termo "em combinação com" não restringe a ordem pela qual as terapias são administradas a um sujeito com uma infecção. Uma primeira terapia pode ser administrada antes (por exemplo, 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas), ao mesmo tempo, ou depois (por 40 exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas) da administração de uma segunda terapia a um sujeito que tenha tido, ou tenha, ou seja susceptível de contrair uma doença mediada por hLIGHT. Qualquer terapia adicional pode ser administrada por qualquer ordem, com as terapias adicionais. Os anticorpos descritos neste documento podem ser administrados em combinação com a uma ou mais terapias (por exemplo, terapias que não sejam os anticorpos descritos neste documento que são administrados em conjunto para evitar, tratar, gerir, e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT. Podem administrar-se exemplos não limitativos de terapias que se podem administrar em combinação com o anticorpo descrito neste documento, incluindo agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos, ou agentes imunomoduladores, ou quaisquer outros agentes listados na Farmacopeia dos E.U.A e/ou no Physician's Desk
Referência. O termo "sal inorgânico", tal como se utiliza neste documento, refere-se a quaisquer compostos não contendo nenhum carbono resultante da substituição de uma parte ou da totalidade dos hidrogénios ácidos, ou dos ácidos por metais, ou de um metal ou um grupo actuando como um metal, e que são amiúde utilizados a titulo de compostos 41 de ajustamento da tonicidade nas composições farmacêuticas e nas preparações de materiais biológicos. Os sais inorgânicos mais comuns são NaCl, KC1, NaH2P04, etc.
Um anticorpo "isolado" ou "purificado" é substancialmente isento de material celular ou de outras proteínas contaminantes da célula ou provenientes dos tecidos dos quais seja derivado o anticorpo, ou substancialmente isento de precursores químicos ou de outros produtos químicos, quando quimicamente sintetizados. A expressão "substancialmente isento de material celular" inclui preparações de um anticorpo nas quais o anticorpo esteja separado de componentes celulares das células das quais ele é isolado ou produzido recombinantemente. Assim, incluem-se num anticorpo substancialmente isento de material celular, as preparações de anticorpo possuindo menos do que cerca de 30 %, 20 %, 10 %, ou 5 % (em peso seco) de proteína heteróloga (também referida neste documento como uma "proteína de contaminação"). Quando o anticorpo for produzido de um modo recombinante, ele será também preferivelmente substancialmente isento de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20 %, 10 %, ou 5 % do volume da preparação proteica. Quando o anticorpo for produzido por síntese química, ele será preferivelmente substancialmente isento de precursores químicos ou de outros produtos químicos, isto é, ele foi separado dos precursores químicos ou de outros produtos químicos envolvidos na síntese da proteína. Estas preparações de anticorpo conterão portanto menos do 42 que cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (em peso seco) dos precursores químicos ou de outros compostos diferentes do anticorpo de interesse. Preferivelmente os anticorpos da especificação presente são isolados ou purificados.
Uma molécula "isolada" de ácido nucleico é uma que haja sido separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Além disto, uma molécula de ácido nucleico "isolada", tal como uma molécula de cADN, pode ser substancialmente isenta de outro material celular, ou de meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente isenta de precursores químicos ou de outros produtos químicos, quando obtida por síntese química. Uma molécula de ácido nucleico codificando para um anticorpo da especificação presente pode ser isolada ou purificada. O termo "LIGHT humano", "hLIGHT" ou "polipéptido hLIGHT", e termos semelhantes, referem-se aos polipéptidos ("polipéptidos", "péptidos" e "proteínas", e são utilizados intercambiavelmente neste documento) que incluem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52 e polipéptidos relacionados, incluindo as suas variantes SNP. Incluem-se nos polipéptidos relacionados as variantes alélicas (por exemplo, variantes SNP); as variantes emendadas; os fragmentos; os derivados; as variantes de substituição, de remoção, e de inserção; os polipéptidos de fusão; e homólogos inter-espécies, preferivelmente, que mantenham a 43 actividade de hLIGHT e/ou sejam suficientes para gerarem uma reacção imunológica anti-hLIGHT. Incluem-se nos exemplos não sinónimos de variantes SNP, sem que eles se limitem a estes, os polipéptido hLIGHT incluindo 214E-32S (um ácido glutâmico na posição 214 e uma serina na posição 32 de um polipéptido hLIGHT (por exemplo, o polipéptido hLIGHT representado na SEQ ID NO:52)), 214K-32S, 214E-32L e 214E-32L. Também se incluem formas solúveis de hLIGHT que sejam suficientes para gerar uma reacção imunológica anti-hLIGHT (veja-se, por exemplo, a SEQ ID NO: 53 e a SEQ ID NO:54). Tal como os especialistas da técnica o entenderão, um anticorpo anti-hLIGHT da especificação presente pode ligar-se a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de polipéptido, a um antigénio, e/ou a um epitopo, sendo um epitopo parte do antigénio maior, que é parte do fragmento de polipéptido maior, que seja por sua vez, parte do polipéptido maior. 0 hLIGHT pode existir numa forma trimérica (nativa) ou monomérica (desnaturada).
Os termos "numeração de Kabat" e outros termos semelhantes, são reconhecidos na técnica e referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (isto é, são hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo, ou numa sua parte de ligação a um antigénio (Kabat et al. (1971) Ann. N. Y. Acad. Sei. 190: 382-391, e Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação do NIH N° . 91- 44 3242) . Para a região variável da cadeia pesada, a região hipervariável enquadra tipicamente as posições dos aminoácidos 31 a 35 para a CDR1, as posições dos aminoácidos 50 a 65 para a CDR2, e as posições dos aminoácidos 95 a 102 para a CDR3. Para a região variável da cadeia leve, região hipervariável enquadra tipicamente as posições dos aminoácidos 24 a 34 para a CDR1, as posições dos aminoácidos 50 a 56 para a CDR2, e as posições dos aminoácidos 89 a 97 para a CDR3. O termo "cadeia leve", quando utilizado em relação a um anticorpo, refere-se a dois tipos distintos, denominados kapa (k) ou lambda (λ) , com base na sequência de aminoácidos dos dominios constantes. As sequências de aminoácidos da cadeia leve são bem conhecidas na técnica. Preferivelmente, a cadeia leve é uma cadeia leve humana.
Tal como se utilizam neste documento, os termos "gerir", "gerindo", e "gestão" referem-se aos efeitos benéficos que um sujeito possa obter de uma terapia ('por exemplo, um agente profiláctico ou terapêutico) , que não confiram uma cura da infecção. Pode ser administrada a um sujeito uma terapia, ou mais, (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos, tais como um anticorpo tal como descrito neste documento) para "gerir" uma doença mediada por hLIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD) , um ou mais dos seus sintomas, de modo a evitar a progressão ou uma piora da doença. 45 0 termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população homogénea ou substancialmente homogénea de anticorpos, e cada anticorpo monoclonal reconhecerá tipicamente um único epítopo no antigénio. Em concretizações preferidas, um "anticorpo monoclonal", tal como se utiliza neste documento, é um anticorpo produzido por um único hibridoma ou outra célula, em que o anticorpo se liga imunoespecificamente apenas a um epitopo de hLIGHT tal como determinado, por exemplo, por ELISA ou por outro ensaio envolvendo ligação a antigénio ou ligação competitiva que seja conhecido na técnica, ou que conste dos Exemplos proporcionados neste documento. 0 termo "monoclonal" não se limita a nenhum método específico para se fabricar o anticorpo. Por exemplo, os anticorpos monoclonais tais como são descritos neste documento podem ser feitos pelo método do hibridoma tal como descrito em Kohler et al.; Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser isolados de bibliotecas de fagos utilizando as técnicas tais como descritas neste documento, por exemplo. Outros métodos para a preparação de linhas clonais de células e de anticorpos monoclonais expressos por elas, são bem conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, o Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a Edição, Ausubel et al., editores, John Wiley and Sons, New York). Outros métodos exemplares de produção de outros anticorpos monoclonais são proporcionados nos Exemplos, neste documento. 46 0 termo "de ocorrência natural" ou "nativo", quando se utiliza em ligação com materiais biológicos tais como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospedeiras, e outros semelhantes, refere-se aos que existem na natureza e não foram manipulados por um ser humano. 0 termo "aceitável do ponto de vista farmacêutico", tal como se utiliza neste documento, significa meios aprovados por uma agência reguladora Federal ou o governo de um Estado, ou listados na Farmacopeia dos E.U.A., na Farmacopeia Europeia ou noutra Farmacopeia reconhecida em geral, para utilização em animais, e mais em particular em seres humanos. "Anticorpos policlonais", tal como se utiliza neste documento, refere-se a uma população de anticorpos gerada numa reacção imunológica a uma proteína que tenha muitos epítopos, e que portanto inclua uma variedade de anticorpos diferentes dirigidos contra ela e contra epítopos diferentes na proteína. Os métodos para produzir anticorpos policlonais são conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, o Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a edição, Ausubel et al., editores, John Wiley and Sons, New York).
Tal como se utiliza neste documento, o termo "polinucleótido", "nucleótido", "ácido nucleico" "molécula de ácido nucleico" e outros termos semelhantes são utilizados de forma intercambiável, e neles se inclui ADN, ARN, mARN e outros semelhantes.
Tal como se utilizam neste documento, os termos "evita", "evitando", e "prevenção" referem-se à inibição parcial ou total do desenvolvimento, recorrência, inicio ou disseminação de uma doença mediada por hLIGHT e/ou de sintomas com ela relacionados, resultando da administração de uma terapia ou de uma combinação de terapias proporcionadas neste documento (por exemplo, uma combinação de agentes profilácticos ou terapêuticos, tais como um anticorpo descrito neste documento).
Tal como se utiliza neste documento, o termo "agente profilático" refere-se a qualquer agente que consiga inibir total ou parcialmente o desenvolvimento, a recorrência, o despoletar ou a disseminação de uma doença mediada por hLIGHT e/ou de sintomas com ela relacionados, num sujeito. 0 termo "agente profilático" pode referir-se a um anticorpo tal como se descreve neste documento. O termo "agente profilático" pode referir um agente que não seja um anticorpo tal como descrito neste documento. Preferivelmente, um agente profiláctico é um agente que se saiba ser útil para, ou que esteja correntemente em utilização para evitar uma doença mediada por hLIGHT e/ou um sintoma relacionado com ela, ou para impedir o despoletar, o desenvolvimento, a progressão e/ou a severidade de uma doença mediada por hLIGHT e/ou de m sintoma com ela relacionado. 0 agente profiláctico pode ser 48 um anticorpo anti-hLIGHT completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT completamente humano.
Um "titulo sorológico eficaz do ponto de vista profilático" pode ser o titulo no soro, de um sujeito, preferivelmente um ser humano, que iniba total ou parcialmente o desenvolvimento, a recorrência, o despoletar ou a disseminação de uma doença mediada por hLIGHT e/ou de sintomas com ela relacionados, no sujeito referido. 0 termo "antigénio hLIGHT" refere-se à porção de um polipéptido hLIGHT a que um anticorpo se liga imunoespecificamente. Um antigénio hLIGHT também se refere a um análogo ou derivado de um polipéptido hLIGHT ou de um seu fragmento, ao qual se liga imunoespecif icamente um anticorpo. Um antigénio hLIGHT pode ser um antigénio hLIGHT monomérico ou um antigénio hLIGHT trimérico. Uma região de um polipéptido hLIGHT que contribua para um epitopo pode incluir aminoácidos contíguos do polipéptido, ou pode ser montada a partir de duas ou mais regiões não contíguas do polipéptido. 0 epitopo pode ser, ou não, uma estrutura tridimensional existindo à superfície do antigénio. Uma região localizada da superfície de um antigénio hLIGHT que seja capaz de originar uma reacção imunológica, é um epitopo hLIGHT. 0 epitopo pode ser, ou não, uma estrutura tridimensional existindo à superfície do antigénio.
Uma "doença mediada por hLIGHT" e uma "patologia mediada por hLIGHT" são termos utilizados de modo 49 intercambiável e referem-se a qualquer doença que seja completa ou parcialmente provocada por ou que seja o resultado de hLIGHT. 0 hLIGHT pode estar expresso de forma aberrante (por exemplo, altamente) à superfície de uma célula. 0 hLIGHT pode estar aberrantemente regulado em alta num determinado tipo de célula. A ligação de hLIGHT a um ligando de hLIGHT pode provocar uma sinalização celular normal, aberrante ou excessiva. Em determinadas concretizações, o ligando de hLIGHT é um receptor de hLIGHT (por exemplo, HVEM, ίΤβΗ, ou DCR3), por exemplo, que está expresso à superfície de uma célula, tal como uma célula epitelial do cólon. A doença mediada por hLIGHT pode ser uma doença inflamatória dos intestinos (IBD), tal como a doença de Crohn (CD) ou a colite ulcerosa (UC). Noutras concretizações, a doença mediada por hLIGHT pode ser a doença de hospedeiro em relação a transplante (GVHD).
Um "ligando de hLIGHT" refere-se a uma molécula que se liga ou de outra forma interactua com hLIGHT. Preferivelmente o ligando de hLIGHT é um receptor de hLIGHT.
Os termos "receptor de hLIGHT" ou "receptor que se liga a hLIGHT" são utilizados de modo intercambiável neste documento e referem um polipéptido receptor que se liga a hLIGHT. 0 receptor de hLIGHT pode ser HVEM, FcPR ou DcR3. 0 receptor hLIGHT pode estar expresso à superfície de uma célula, tal como uma célula epitelial do cólon. 50 O termo "sacárido", tal como se utiliza neste documento, refere-se a uma classe de moléculas que são derivados dos álcoois polihidricos. Os sacáridos são habitualmente referidos como hidratos de carbono e podem conter diferentes quantidades de unidades de açúcar (sacárido), por exemplo, monossacáridos, dissacáridos e polissacáridos. O termo "título sorológico", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um título médio no soro numa população de pelo menos 10, preferivelmente de pelo menos 20, e de preferência de pelo menos 40 sujeitos e até cerca de 100, 1.000 ou mais.
Tal como se utiliza neste documento, o termo "efeitos colaterais" inclui efeitos indesejáveis e adversos de uma terapia (por exemplo, com um agente profiláctico ou terapêutico). Os efeitos indesejáveis não são necessariamente adversos. Um efeito adverso de uma terapia (por exemplo, com um agente profilático ou terapêutico) pode ser nocivo ou desconfortável ou arriscado. Incluem-se nos exemplos dos efeitos colaterais, a diarreia, a tosse, a gastroenterite, pieira, náuseas, vómitos, anorexia, dores abdominais, febre, dor, perda de massa corporal, desidratação, alopecia, dispneia, insónia, tonturas, mucosite, efeitos nos nervos e músculos, fadiga, boca seca, e perda de apetite, irritações de pele ou inchaços no local de administração, sintomas do tipo dos da gripe tais como febre, arrepios e fadiga, problemas no tracto digestivo e 51 reacções alérgicas. Existem numerosos efeitos indesejáveis sentidos pelos pacientes e que são conhecidos na técnica. Muitos deles estão descritos no Physician's Desk Reference (60a edição, 2006) . O termo "molécula pequena", e termos análogos, incluem, mas não se limitam a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compostos orgânicos ou inorgânicos (isto é, incluindo compostos heterorgânicos e/ou organometálicos) com uma massa molecular inferior a cerca de 10.000 gramas por mole, compostos orgânicos ou inorgânicos com uma massa molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mole, compostos orgânicos ou inorgânicos com uma massa molecular inferior a cerca de 1.000 gramas por mole, compostos orgânicos ou inorgânicos com uma massa molecular inferior a cerca de 500 gramas por mole, e sais, ésteres, e outras formas aceitáveis do ponto de vista terapêutico de tais compostos.
Os termos "estabilidade" e "estável", tal como se utilizam neste documento no contexto de uma formulação liquida incluindo um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, referem-se à resistência do anticorpo na formulação aos fenómenos térmicos e químicos de desdobragem, agregação, degradação ou fragmentação, em determinadas condições de fabrico, preparação, transporte e armazenagem. As formulações 52 "estáveis" da especificação presente mantêm uma actividade biológica maior ou igual a 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou 99,5 o 0 em determinadas condições de fabrico, preparação, transporte e armazenagem. Pode avaliar-se a estabilidade do anticorpo pelos seus graus de agregação, degradação ou fragmentação, recorrendo a métodos que são conhecidos dos especialistas da técnica, incluindo mas não se limitando a Electroforese Capilar sobre Gel reduzido (rCGE), Electroforese sobre Gel de Dodecilsulfato de Sódio/Poliacrilamida (SDS-PAGE) e HPSEC, em comparação com um anticorpo de referência. Pode avaliar-se a estabilidade global de uma formulação que inclui um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT por diversos ensaios imunológicos incluindo, por exemplo, ELISA e radioimunoensaio, utilizando o epítopo especifico de hLIGHT.
Tal como se utilizam neste documento, os termos "sujeito" e "paciente" são utilizados de modo intercambiável. Tal como se utiliza neste documento, um sujeito é preferivelmente um mamífero tal como um não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cães, ratos, etc.) ou um primata (por exemplo, macacos e seres humanos), de preferência um ser humano. 0 sujeito pode ser um mamífero, preferivelmente um ser humano, com uma doença mediada por hLIGHT. 0 sujeito pode ser um mamífero, preferivelmente um ser humano, em risco de desenvolver uma doença mediada por hLIGHT. 53
Tal como se utiliza neste documento "substancialmente todo/a" refere-se a pelo menos cerca de 60 %, a pelo menos cerca de 70 %, a pelo menos cerca de 75 %, a pelo menos cerca de 80 %, a pelo menos cerca de 85 %, a pelo menos cerca de 90 %, a pelo menos cerca de 95 %, a pelo menos cerca de 98 %, a pelo menos cerca de 99 %, ou a cerca de 100 %. O termo "substancialmente isento de tensioactivo", tal como se utiliza neste documento, refere-se a uma formulação de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, contendo a referida formulação menos do que 0,0005 %, menos do que 0, 0003 %, ou menos do que 0, 0001 % de tensioactivos e/ou menos do que 0,0005 %, menos do que 0,0003 %, ou menos do que 0,0001 % de tensioactivos. O termo "substancialmente isento de sal", tal como se utiliza neste documento, refere-se a uma formulação de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a um antigénio hLIGHT, contendo a formulação referida menos do que 0,0005 %, menos do que 0,0003 %, ou menos do que 0,0001 % de sais inorgânicos. O termo "tensioactivo", tal como se utiliza neste documento, refere-se a substâncias orgânicas com estruturas anfipáticas; nomeadamente, elas são constituídas por grupos com tendências de dissolução opostas, tipicamente uma cadeia de hidrocarboneto solúvel em óleo e um grupo iónico solúvel em água. Podem classificar-se os tensioactivos, 54 consoante a carga da espécie tensioactiva, em tensioactivos aniónicos, catiónicos, e não iónicos. Os tensioactivos são amiúde utilizados como agentes molhantes, emulsionantes, solubilizantes, e de dispersão, para diversas composições farmacêuticas e preparações de materiais biológicos.
Tal como se utiliza neste documento, o termo "marcador" refere-se a qualquer tipo de espécie que esteja ligada a, por exemplo, um polipéptido e/ou um polinucleótido que codifique para um hLIGHT ou um anticorpo de hLIGHT, ou um seu fragmento que se ligue a um ou antigénio. Por exemplo, um polinucleótido que codifique para hLIGHT, um anticorpo de hLIGHT ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio, pode conter uma ou mais sequências codificando para um marcador que codifiquem para, por exemplo, uma espécie detectável ou uma espécie que ajude na purificação por afinidade. Quando traduzidos, o marcador e o anticorpo podem assumir a forma de uma proteína de fusão. 0 termo "detectável" ou "detecção", relativamente a um marcador, refere-se a qualquer marcador que se consiga visualizar, ou cuja presença seja de outra forma capaz de ser determinada e/ou quantificada (por exemplo, por quantificação). Um exemplo não limitativo de um marcador detectável é um marcador fluorescente.
Tal como se utiliza neste documento, o termo "agente terapêutico" refere-se a qualquer agente que se possa utilizar no tratamento, na gestão ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT e/ou de um sintoma 55 relacionado com ela. 0 termo "agente terapêutico" pode referir-se a um anticorpo tal como descrito neste documento. 0 termo "agente terapêutico" pode referir-se a um agente que não seja um anticorpo tal como se descreve neste documento. Preferivelmente, um agente terapêutico é um agente que se sabe ser útil para, ou que tenha sido ou esteja a ser, utilizado para o tratamento ou a melhoria de uma doença mediada por hLIGHT ou de um ou mais sintomas com ela relacionados. 0 agente terapêutico pode ser um anticorpo anti-hLIGHT completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT completamente humano. A combinação de terapias (por exemplo, a utilização de agentes profiláticos ou terapêuticos) é aquela que seja mais eficaz do que os efeitos aditivos de quaisquer dois ou mais terapias. Por exemplo, um efeito de sinergia de uma combinação de agentes profiláticos e/ou terapêuticos permite a utilização de menores dosagens de um ou mais dos agentes e/ou uma administração menos frequente dos agentes referidos a um sujeito com uma doença mediada por hLIGHT. A capacidade de utilizar menores dosagens das terapias profiláticas ou terapêuticas e/ou de administrar as terapias referidas com menor frequência diminui a toxicidade associada à administração das terapias referidas a um sujeito sem diminuir a eficácia das terapias referidas na prevenção, na gestão, no tratamento ou na melhoria de um a doença mediada por hLIGHT. Além disto, pode obter-se um efeito de sinergia numa eficácia melhorada de terapias na prevenção, ou na gestão, no tratamento ou na melhoria de 56 uma doença mediada por hLIGHT. Por último, um efeito de sinergia de uma combinação de terapias (por exemplo, de agentes profiláticos ou terapêuticos) pode evitar ou diminuir os efeitos colaterais adversos ou indesejáveis associados à utilização de qualquer uma das terapias por si só.
Na descrição presente, um "titulo sorológico eficaz do ponto de vista terapêutico" pode ser o titulo no soro do sujeito, preferivelmente um ser humano, que diminui a severidade, a duração e/ou os sintomas associados a uma doença mediada por hLIGHT no sujeito referido.
Tal como se utiliza neste documento, o termo "terapia" refere-se a qualquer protocolo, método e/ou agente que se possa utilizar na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD). Os termos "terapias" e "terapia" podem referir uma terapia biológica, uma terapia de apoio, e/ou outras terapias úteis na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT conhecida de um especialista da técnica, tal como o pessoal médico.
Tal como se utilizam neste documento, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando", referem-se à diminuição ou melhoria, da progressão, severidade, e/ou duração de uma doença mediada por hLIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD) resultando da administração de uma ou mais 57 terapias (incluindo, mas não se limitando a, a administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como um anticorpo como se descreve neste documento). Estes termos referem-se à diminuição ou à inibição da ligação entre hLIGHT e HVEM, à diminuição ou à inibição da ligação entre hLIGHT a LTPR, à diminuição ou à inibição da ligação entre hLIGHT e DcR3, à diminuição ou à inibição da produção ou secreção de CCL20 por parte de uma célula que expresse o receptor de hLIGHT num sujeito, à diminuição ou à inibição da produção ou secreção de IL-8 por parte de uma célula que expresse o receptor de hLIGHT num sujeito, à diminuição ou à inibição da produção ou secreção de RANTES por parte de uma célula que expresse o receptor de hLIGHT num sujeito, e/ou à diminuição ou à inibição de um ou mais sintomas associados a uma doença mediada por hLIGHT, tal como uma IBD ou uma GVHD. Um agente profilático pode ser um anticorpo anti-hLIGHT completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT completamente humano. 0 termo "região variável" ou "dominio variável" refere-se à parte das cadeias leve e pesada, tipicamente na proximidade dos seus terminais amino, com cerca de 120 a 130 aminoácidos na cadeia pesada e com cerca de 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve, que diferem extensivamente quanto à sua sequência, entre anticorpos, e que são utilizados na ligação e na especificação de cada anticorpo em particular, para o seu antigénio em particular. A variabilidade da sequência está concentrada nestas regiões 58 denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDR), enquanto as regiões mais fortemente conservadas no domínio variável são denominadas regiões do quadro (FR). As CDR das cadeias leve e pesada são as principalmente responsáveis pela interacção do anticorpo com o antigénio. A numeração das posições dos aminoácido os que se utiliza neste documento é de acordo com o índice EU, tal como em Kabat et al. (1991), Sequences of proteins of immunological interest, (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5a Edição ("Kabat et al."). Preferivelmente a região variável é uma região variável humana. 0 termo "variante", quando utilizado em relação a hLIGHT ou a um anticorpo de hLIGHT, refere-se a um péptido ou a um polipéptido incluindo uma ou mais (tal como, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 25, entre cerca de 1 e cerca de 20, e preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 15, mais preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 10, e de preferência entre cerca de 1 e cerca de 5) alterações na sequência de aminoácidos que podem ser substituições, eliminações, e/ou adições, quando se compara com uma sequência não modificada ou nativa. Por exemplo, uma variante de hLIGHT pode resultar de uma ou mais tal como, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 25, entre cerca de 1 e cerca de 20, e preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 15, mais preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 10, e de preferência entre cerca de 1 e cerca de 5) alterações na sequência de aminoácidos de hLIGHT nativo. Também a 59 título de exemplo, uma variante de um anticorpo anti-hLIGHT pode resultar de uma ou mais tal como, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 25, entre cerca de 1 e cerca de 20, e preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 15, mais preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 10, e de preferência entre cerca de 1 e cerca de 5) alterações na sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-hLIGHT nativo ou não modificado previamente. As variantes podem ser de ocorrência natural, tais como variantes alélicas ou de emenda, ou podem ser construídas artificialmente. As variantes de polipéptidos podem ser preparadas das moléculas de ácido nucleico correspondentes que codificam para as variantes referidas. Preferivelmente a variante de hLIGHT ou a variante de anticorpo hLIGHT mantêm respectivamente actividade funcional, respectivamente, de hLIGHT ou de anticorpo anti-hLIGHT. Uma variante de um anticorpo hLIGHT pode ligar-se imunoespecificamente a hLIGHT e/ou ser antagonista da actividade de hLIGHT. A variante pode ser codificada através de uma variante com único polimorfismo de um nucleótido (SNP) relativamente à de hLIGHT. Um exemplo de uma variante SNP de hLIGHT codifica quer para um ácido glutâmico (E) , quer para uma lisina (K), na posição do aminoácido 214. Outro exemplo de uma variante SNP de hLIGHT codifica quer para uma serina (S), quer para uma leucina (L) na posição do aminoácido 32.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 60 A FIG. 1A-1B representa uma análise por citometria de fluxo de um hLIGHT expresso endogenamente com anticorpos anti-hLIGHT humanos. (A) Activou-se a linha de células T humanas 1123.D7 com PMA e com inonomicina de um dia para o outro e contrastou-se para o marcador de activação CD69 em combinação com diversos anticorpos anti- hLIGHT. Separaram-se as células positivas para CD69 e analisaram-se quanto à contrastação de hLIGHT (linha a negrito) em comparaçao com IgGl humana anti-gripe, de controlo (linha a tracejado) ou com a contrastação de células não activadas 1123.D7 com anticorpos anti-hLIGHT (linha a cinzento). Detectou-se a ligação com um anticorpo secundário, IgG-APC de cabra anti-humano. (B) A contrastação da linha de células T humanas activadas II-23.D7 com anticorpos anti-hLIGHT humanos é saturável. Marcaram-se as células 11-23.D7 com anticorpos anti-hLIGHT humanos a diversas concentrações, e detectaram-se com IgG-APC anti-humano. Mostram-se as representações gráficas dos dados de mésias geométricas da intensidade da fluorescência em conjunto com uma regressão não linear. A FIG. 2A—2B representa a contrastação de hLIGHT recombinante na linha de células EL4-hLIGHT com anticorpos anti-hLIGHT humanos. Na (A) e na (B), utilizaram-se quantidades conhecidas de anticorpos anti-hLIGHT para contrastar células EL4-hLIGHT, detectando-se com IgG-APC anti-humano e analisando-se por citometria de fluxo. Determinou-se a intensidade média geométrica da fluorescência (MFI) e aplicou-se uma regressão não linear. 61
Em todas as experiências utilizou-se a titulo de controlo negativo a proteína M2 anti-gripe. Os dados obtidos nesta análise estão representados na FIG. 3. A FIG. 3 representa características de anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT. A FIG. 4 representa o bloqueio cruzado de anticorpos por ELISA. Esta análise define dois grupos, com base na competição para a ligação a hLIGHT, por ELISA. Revestiram-se os anticorpos individuais sobre os poços de uma placa com 96 poços. Incubou-se previamente FLAG-hLIGHT solúvel com anticorpos anti-hLIGHT e depois adicionou-se aos poços revestidos. A ligação do FLAG-hLIGHT ao anticorpo revestido era detectada com IgG-HRP anti-FLAG. Determinou-se a percentagem de inibição utilizando a DO de cada amostra e a fórmula seguinte: % de inibição= (max - amostra/max) x 100. A FIG. 5A-5B representa o bloqueio da ligação de HVEM:Fc humano a hLIGHT nativo à superfície celular, por anticorpos monoclonais anti-hLIGHT humanos. Em (A) e em (B) , incubaram-se quantidades conhecidas e diferentes de anticorpos com células EL4-hLIGHT, adicionou-se HVEM:F c biotinilado humano a uma concentração inferior à de saturação e detectou-se com SA-APC. Tal como se ilustra em (A), utilizou-se o anticorpo M2 humano anti-gripe a título de controlo. 62 A FIG. 6A-6B representa o bloqueio da ligação de LTPR:Fc humano a hLIGHT nativo à superficie celular por anticorpos monoclonais anti-hLIGHT humanos. Em (A)-(B), incubaram-se diversas quantidades conhecidas de anticorpos com células EL4-hLIGHT, adicionou-se a uma concentração inferior à de saturação LTPR:Fc humano marcado com polyHis e detectou-se com anti-His-APC. Tal como se ilustra em (A), utilizou-se a titulo de controlo o anticorpo M2 humano anti-gripe. A FIG. 7 representa a secreção de CCL20 mediada por hLIGHT em células epiteliais do cólon humano. Adicionou-se hLIGHT recombinante solúvel ao meio de crescimento de células HT29.14s, a concentrações crescentes. Separaram-se os meios de crescimento no dia 3 após o tratamento e determinaram-se os teores em CCL20 por ELISA. As barras de erro indicam dois tratamentos independentes.
A FIG. 8 representa a secreção mediada por hLIGHT de IL-8 e de RANTES, por células epiteliais do cólon humano. Adicionaram-se ao meio de crescimento de células HT29.14s, hLIGHT recombinante solúvel, TNF, LTa^ e FLAG-BAP (a título de controlo negativo). Recolheram-se meios de crescimento nos dias 1, 2 e 3 após o tratamento. Determinaram-se os teores em IL-8 e em RANTES por ELISA. Utilizou-se fosfatase alcalina bacteriana marcada com FLAG 63 (FLAG-BAP), uma proteína irrelevante marcada, como controlo negativo. A FIG. 9A-9B mostra que os anticorpos anti-hLIGHT humanos inibem a secreção de CCL20 mediada por hLIGHT por parte de células epiteliais de cólon humano. (A) Incubou-se previamente hLIGHT (a 1 pg/mL) recombinante solúvel com anticorpos anti-hLIGHT, e adicionou-se ao meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheram-se os meios de crescimento de dois poços por cada tratamento, no dia 3. Determinaram-se os teores em CCL20 por ELISA. Incluíram-se como controlos meio por si só, hLIGHT solúvel por si só, hLIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-gripe e cada um dos anticorpos anti-hLIGHT por si sós, (B) representa os dados de análise por regressão não linear relativos ao painel A. A FIG. 10A-10B mostra que os anticorpos humanos anti-hLIGHT inibem a secreção de RANTES mediada por hLIGHT expresso à superfície de células epiteliais do cólon humano. (A) Incubaram-se previamente células EL4-hLIGHT fixadas com anticorpos anti-hLIGHT e adicionou-se ao meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheram-se meios de crescimento de dois poços por tratamento no dia 3. Determinaram-se os teores em RANTES por ELISA. Incluíram-se como controlos meio por si só, células EL4-hLIGHT por si sós, hLIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-gripe e cada um dos anticorpos anti-hLIGHT por si sós, (B) 64 representa os dados de análise por regressão não linear de (A) . A FIG. 11 denota os resultados de uma experiência de bloqueio competitivo para a ligação a hLIGHT. A FIG. 12 representa a actividade de bloqueio de anticorpos em relação à ligação de HVEM:Fc a células 293 hLIGHT. Testaram-se quanto à sua capacidade de bloquear a ligação de HVEM:Fc a células 293 hLIGHT os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT El, E13, F19, mAb de R&D, e anticorpos policlonais de cabra anti-hLIGHT comercialmente disponíveis (R&D Systems), bem como anticorpos policlonais de coelho anti-hLIGHT (eBioscience). A FIG. 13 representa a actividade de bloqueio de anticorpos face à ligação de ΗΤβΗ:Γο a células 293 hLIGHT. Testaram-se quanto à sua capacidade de bloquear a ligação entre LTPR:Fc e células 293 expressando hLIGHT os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT El and E13, os mAb da R&D, e os anticorpos policlonais comercialmente disponíveis, de cabra anti-hLIGHT (R&D Systems), e de coelho anti-hLIGHT (eBioscience). A FIG. 14 representa a actividade de bloqueio de anticorpos em relação a (A) LTPR:Fc e a (B) HVEM:Fc, na sua ligação a células 293 hLIGHT, e é uma representação gráfica dos dados ilustrados nas FIGS. 12 e 13. 65 A FIG. 15A-15B representa a ligação dos diversos anticorpos anti-hLIGHT a hLIGHT nativo ou desnaturado solúvel. Cinco microgramas de LIGHT humano solúvel foram quer fervidos numa amostra de tampão 2 x SDS (desnaturados), quer não foram tratados (nativos), e prepararam-se diluições em série de ambos a 1:6. Colocaram-se pontos de 5 μΐ das diversas diluições dos hLIGHT em simultâneo, sobre membranas hidratadas de 0,2 pm em PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando uma pipeta multicanal 8. Deixaram-se os pontos secar ao ar e voltaram a hidratar-se, bloquearam-se (1 x TBST (soro salino tamponizado com Tris e Tween-20) +2,5 % de leite magro + 0,02 % de azida de sódio). Sondou-se cada um dos pontos com 5 pg/mL de cada um dos anticorpos primários. Lavaram-se os pontos por três vezes com lx TBST e em seguida com anticorpos secundários biotinilados (Biotin-Goat aHuman (Vector Labs, Burlingame, CA) , Biotin-Goat CC mouse (Jackson labs, Bar Harbor, ME) , Biotin-Mouse α goat (Sigma-Aldrich corp., St. Louis, MO)) a 5 pg/ml. Lavaram-se os pontos 3x com lx TBST e em seguida com super SA-HRP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Utilizou-se quimioluminescência para a detecção com o estojo ECL de detecção (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e visualizou-se o sinal por exposição a uma pelicula de imagiologia X-OMAT AR (Kodak, Rochester, New York). (A) Resultados da transferência dos pontos utilizando os anticorpos humano anti-hLIGHT El, E13, E63, F19, F23, ou dois anticorpos monoclonais murinos anti-hLIGHT comercialmente disponíveis junto da R&D Systems ("R&D mouse mAb") e da Abnova ("Abnova mouse mAb"). Utilizou-se um 66 anticorpo anti-M2 (antigénio irrelevante) a titulo de controlo negativo. (B) Resultados da transferência dos pontos utilizando uma preparação de anticorpo policlonal comercial de cabra anti-hLIGHT (R&D Systems "R&D goat pAb") ou duas preparações de anticorpos policlonais comerciais de coelho anti-hLIGHT (eBioscience ("eBioscience rabbit pAb") e Peprotech ("Peprotech rabbit pAb")). A FIG. 16 representa a ligação de diversos anticorpos anti-hLIGHT a hLIGHT nativo ou desnaturado solúvel, e resume os dados apresentados na FIG. 15 sob uma forma tabular. A FIG.17 mostra que os anticorpos humanos anti-LIGHT da especificação presente inibem a secreção de CCL20 mediada por LIGHT de células epiteliais do cólon humano, enquanto os anticorpos comercialmente disponíveis, de murganho anti-hLIGHT não a inibem. Incubou-se previamente LIGHT recombinante solúvel humano (a 1 pg/mL) cornos anticorpos anti-LIGHT e adicionou-se ao meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheram-se os meios de crescimento de dois poços por cada tratamento, no dia 3. Determinaram-se os teores em CCL20 por ELISA. Incluíram-se como controlos, meio por si só, LIGHT solúvel por si só, LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-gripe, anticorpo B12 anti-LIGHT não bloqueante e cada um dos anticorpos anti-LIGHT por si sós. EI e F19 são representativos dos diferentes grupos epitópicos de bloqueio cruzado. 67 A FIG. 18 mostra que os anticorpos anti-LIGHT humanos da especificação presente inibem a secreção de RANTES mediada por LIGHT por parte de células epiteliais do cólon humano, enquanto os anticorpos comercialmente disponíveis de murganho anti-hLIGHT não a inibem. Incubou-se previamente LIGHT recombinante solúvel humano (a 1 pg/mL) com anticorpos anti-LIGHT e adicionou-se ao meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheram-se os meios de crescimento de dois poços por cada tratamento no dia 3. Determinaram-se os teores em RANTES por ELISA. Incluíram-se a título de controlos, meio por si só, LIGHT solúvel por si só, LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-gripe, anticorpo nao bloqueante B12 anti-LIGHT cada um dos anticorpos anti-LIGHT por si sós. EI e F19 são representativos dos diferentes grupos epitópicos de bloqueio cruzado.
As FIGS. 19A-19B representam uma análise por citometria da ligação a um hLIGHT expresso à superfície das células por anticorpos humanos (A) EI ou (B) F19 anti- hLIGHT, em comparação com as suas partes respectivas kapa recombinantes de cadeia singela do anticorpo. Incubaram-se células 293 expressando hLIGHT de forma estável com quantidades crescentes dos anticorpos anti-LIGHT indicados na legenda. Detectou-se a ligação com um anticorpo secundário IgG-APC de cabra anti-humano. Purificaram-se os anticorpos quer a partir de culturas de hibridomas, quer a partir de células 293F transfectadas transientemente com vectores de expressão de mamíferos codificando para os 68 diferentes cADN de cadeias kapa emparelhados com o gene da cadeia pesada. Mostram-se representações gráficas dos dados da intensidade média geométrica de fluorescência em conjunto com uma regressão não linear. A FIG. 20 representa o bloqueio cruzado por anticorpos através de ELISA, comparando anticorpos de cadeia singela kapa com os correspondentes que o originaram. Esta análise define dois grupos com base na competição pela ligaçao a hLIGHT , por ELISA. Revestiram i-se os anticorpos individuais sobre os poços de uma placa com 96 poços. Incubou-se previamente FLAG-hLIGHT com anticorpos solúveis anti-hLIGHT e depois adicionou-se aos poços revestidos. A ligação de FLAG-hLIGHT ao anticorpo revestido foi detectada com IgG-HRP anti-FLAG. A percentagem de inibição foi determinada utilizando a DO de cada amostra na fórmula seguinte: % de inibição = (max - amostra/max) x 100.
As FIGS. 21A-21B representam o bloqueio da ligação de (A) HVEM:F c humano ou (B) LTβR:Fc humano, a hLIGHT nativo à superfície celular, por anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT e pelas suas correspondentes cadeia singelas kapa recombinantes. Incubaram-se quantidades conhecidas e diferentes dos anticorpos com células EL4-hLIGHT, com HVEM:Fc biotinilado humano ou com LT βΕ:Fc humano marcado com polyHis adicionado a uma concentração inferior à de saturação, e depois 69 detectou-se com SA-APC ou com anti-His-APC. Purificaram-se os anticorpos a partir quer de culturas de hibridoma, quer de células 293F transfectadas transientemente com vectores de expressão de mamíferos codificando para os cADN das diferentes cadeias kapa emparelhados com o qene da cadeia pesada. A FIG. 22 representa a inibição da secreção de CCL20 mediada por hLIGHT de células epiteliais do cólon humano, por cadeias sinqelas kapa recombinantes de anticorpos anti-LIGHT, em comparação com as resultantes dos anticorpos parentes produzidos por hibridoma. Fez-se uma incubação prévia de LIGHT recombinante solúvel humano (a 1 yg/mL) com anticorpos anti-LIGHT, e adicionou-se a meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheram-se os meios de crescimento de dois poços por cada tratamento no dia 3. Determinaram-se os teores em CCL20 por ELISA. Incluíram-se como controlos meio por si só, LIGHT solúvel por si só (SHL), LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-gripe, ou cada anticorpo na ausência de LIGHT solúvel. Os anticorpos referidos como "Elk2" incluem El-kapa (B) e "F19k2" inclui F19 kapa (B). A FIG. 23 mostra que os anticorpos anti-LIGHT da especificação presente inibem a secreção de CCL20 por células epiteliais do cólon humano mediada por LIGHT, enquanto os anticorpos comercialmente disponíveis de murganho anti-hLIGHT ou não a inibem (Abnova)m ou apenas a inibem quando em concentrações excessivamente elevadas (a 70 100 pg/mL) (R&D). Fez-se uma incubação précia de LIGHT recombinante solúvel humano (a 1 pg/mL) com anticorpos anti-LIGHT e adicionou-se ao meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheram-se os meios de crescimento de dois poços por cada tratamento, no dia 3. Determinaram-se os teores em CCL20 por ELISA. Incluíram-se como controlos, meio por si só, LIGHT solúvel por si só (SHL), LIGHT solúvel incubado com anticorpo irrelevante, M2 anti-gripe, albumina de soro anti humana, ou cada um dos anticorpos na ausência de LIGHT solúvel. EI e F19 são representativos dos diferentes grupos epitópicos de bloqueio cruzado.
As FIGS. 24Ά-24Β representam a frequência alélica de determinados variantes de hLIGHT não sinónimos com polimorfismos de um só nucleótido (SNP) (A) codificando para um ácido glutâmico (E) ou para uma lisina (K) na posição de aminoácido 214; ou (B) codificando para uma leucina (L) ou serina (S) na posição de aminoácido 32, através de diversas populações de etnias diferentes. A FIG. 25A-25D. As FIGS. 25A-25C representam uma titulação da dose da contrastação de linhas de células que expressam variantes SNP não sinónimos de LIGHT humano, com os anticorpos humanos anti-hLIGHT, 124F23 e 124Elkapa(B). Utilizaram-se diversas quantidades bem determinadas de anticorpos anti-hLIGHT para contrastar células EL4-hLIGHT expressando quer o variante SNP (A) 214E-32S (B) 214K-32S, ou (C) 214E-32L, detectando-se com IgG-APC anti-humano e analisou-se por citometria de fluxo. (D) representa uma 71 titulação de dose do bloqueio mediado por anticorpo anti-LIGHT humano, da ligação de HVEM:Fc humano (quadrados) ou de LTPR:Fc humano (triângulos), à variante SNP expressa à superfície celular 214K-32S de LIGHT, levado a cabo tal como na FIG. 5. Para (A)-(D), determinou-se a intensidades média geométrica da fluorescência (MFI) e aplicou-se uma análise de regressão não linear.
As FIGS. 26A-26B representam uma análise por citometria de fluxo de linhas de células que expressam variantes não sinónimos SNP, com anticorpos anti-hLIGHT humanos. (A) A linha celular SNP, EL4-LIGHT 214E e (B) a linha celular EL4 SNP 214K, foram contrastadas com uma concentração (10 yg/mL) de cada um dos anticorpos anti-hLIGHT. Detectou-se a ligação com o anticorpo secundário, IgG-APC de cabra anti-humano. Utilizou-se a titulo de controlo negativo IgG humano de controlo isotipico. A FIG. 27 representa a inibição por parte de anticorpos anti-hLIGHT humanos, da secreção de RANTES pela variante SNP de hLIGHT expressa à superfície, de células epiteliais do cólon humano. Incubaram-se previamente hLIGHT recombinante solúvel (SHL) (a 1 yg/mL) ou 5xl05 células variantes SNP, EL4-hLIGHT 214K ou 214E, com anticorpos anti-hLIGHT, e adicionou-se ao meio de crescimento de células HT29.14s. Recolheu-se o meio de crescimento de dois poços para cada tratamento, no dia 3. Determinaram-se os
teores em RANTES por ELISA. Incluíram-se como controlos, meio por si só, células EL4-hLIGHT por si sós, hLIGHT 72 solúvel por si só e cada um dos anticorpos anti-hLIGHT por si sós. A FIG. 28 ilustra uma representação esquemática do modelo xenogénico agudo de GVHD. Injecta-se em murganhos SCID um anticorpo IL2í^ (ΤΜ-βΙ) no dia -2 para eliminar as células NK. No dia -1, administra-se aos murganhos 2,5 Gy de irradiação subletal. No dia 0, administram-se aos murganhos 10 milhões de PBMC humanas por injecção intraperitoneal, seguida imediatamente por uma injecção endovenosa de anticorpo LIGHT anti-humano ou de um anticorpo de controlo negativo. Pesam-se os murganhos a intervalos de 3-4 dias, e no dia 12, sacrificam-se os murganhos e avaliam-se patologias importantes. Retiram-se os baços para análise por citometria de fluxo, retiram-se os cegos para a histologia, e recolhe-se soro para análises d citoquinas e de anticorpos. A FIG. 29 representa as classificações das patologias importantes observadas no modelo da doença aguda xenogénica GVHD em murganhos. Representam-se as classificações patológicas nos animais sem injecção de anticorpo monoclonal (círculos), os injectados com anticorpo monoclonal 124F23 anti-hLIGHT (triângulos) e os de controlo, injectados com anticorpos monoclonais humanos IgGl (quadrados). Atribuem-se classificações de 0, 1, 2, ou 3 (respectivamente para ausência, leve, moderada, ou severa) em cada uma das três categorias de diarreia, 73 inflamaçao peritoneal/áscitos, e inflamação intestinal (classificação máxima total de 9). A FIG. 30 representa as classificações histopatológicas observadas no modelo de doença GVHD aguda xenogénica em murganhos. Representam-se as classificações para ausência de injecção de anticorpo (círculos), injecção de anticorpo 124F23 anti-hLIGHT (triângulos) e de anticorpo de controlo hlgGl (quadrados). Atribuem-se classificações de 0, 1, 2, ou 3 (respectivamente para ausência, leve, moderada, ou severa) em cada uma das quatro categorias: severidade da inflamação, extensão da inflamação, lesões nas vilosidades/atrofia, e percentagem de envolvimento (classificação máxima total de 12).
As FIGS. 31A—31B representam secções representativas histológicas contrastadas com hematoxilina e com eosina (H&E), dos cegos dos murganhos no estudo de GVHD. (A) Secção de um cego de murganho tratado com anticorpo monoclonal anti-LIGHT MAb e (B) de um murganho de controlo tratado com IgG humano. A involução da submucosa indica áscitos, as setas a tracejado indicam regiões de sangue e a seta traço contínuo indica uma região de infiltrado de linfócitos. A FIG. 32 representa os números totais de células T no baço de murganhos no estudo xenogénico de GVHD. Os asteriscos indicam valores do teste t de Student inferiores 74 a 0,05 para as comparações entre os animais tratados com anticorpos monoclonais anti-LIGHT e os controlos.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA
Proporcionam-se neste documento anticorpos que se ligam imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT, a um fragmento do polipéptido hLIGHT, ou a um epitopo de hLIGHT. Também se proporcionam ácidos nucleicos isolados codificando para anticorpos que se ligam imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT, a um fragmento do polipéptido hLIGHT, ou a um epitopo de hLIGHT. Proporcionam-se além disto vectores e células hospedeiras que incluam ácidos nucleicos codificando para anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento do polipéptido hLIGHT, ou a um epitopo de hLIGHT. Proporcionam-se também métodos de fabricar anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epitopo de hLIGHT. Também se proporciona neste documento um método de tratar ou de gerir uma doença mediada por hLIGHT, que inclui administrar-se um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT, a um fragmento do polipéptido hLIGHT, ou a um epitopo de hLIGHT.
ANTICORPOS 75
Incluem-se nos anticorpos da invenção presente, sem que eles a estes se limitem, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de modo recombinante, anticorpos multiespecificos (incluindo anticorpos biespecificos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, Fv de cadeia singela (scFv) (por exemplo, incluindo os monoespecificos, os biespecificos, etc.), anticorpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv ligados por dissulfureto (sdFv), anticorpos anti-idiotipicos (anti-Id) , e fragmentos de qualquer um dos anteriores que se liguem a um epitopo.
Em especial, os anticorpos proporcionados neste documento incluem moléculas de imunoglobulina e partes imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contenham um local de ligação a antigénio que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT. As moléculas de imunoglobulina proporcionadas neste documento podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), de qualquer classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Um anticorpo proporcionado neste documento pode ser um anticorpo IgG, preferivelmente um IgGl ou IgG4.
Incluem-se nas variantes e nos derivados de anticorpos os fragmentos de anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um epitopo. 76
Incluem-se nos fragmentos preferidos os fragmentos Fab (um fragmento de anticorpo que contém o domínio de ligação a antigénio e que inclui uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada em ponte por intermédio de uma ligação dissulfureto); Fab' (um fragmento de anticorpo contendo um único domínio anti-ligação que inclui um Fab e mais uma porção da cadeia pesada através da região charneira); F(ab')2 (duas moléculas Fab' ligadas por ligações dissulfureto entre cadeias nas regiões da charneira das cadeias pesadas; as moléculas Fab' podem estar dirigidas contra o mesmo epítopo ou epítopos diferentes); um Fab biespecífico (uma molécula Fab que possua dois domínios de ligação a antigénio, cada um dos quais pode estar dirigido para um epítopo diferente); uma cadeia Fab singela incluindo uma região variável, também denominado, um sFv (a região variável que determina a ligação ao antigénio, de uma cadeia singela, e a cadeia pesada de um anticorpo, ligadas uma à outra por uma cadeia com 10-25 aminoácidos) ; um Fv ligado por dissulfuretos, ou um dsFv (a região variável que determina a ligação ao antigénio, de uma cadeia singela, e a cadeia pesada de um anticorpo, ligadas uma à outra por uma ligação dissulfureto) ; uma VH camelizada (a região variável que determina a ligação ao antigénio, de uma cadeia pesada de um anticorpo, em que alguns aminoácidos na interface de VH sejam os que existem na cadeia pesada de anticorpos de camelo com ocorrência natural); um sFv biespecífico (uma molécula de sFv ou de dsFv com dois domínios de ligação a antigénio, cada um dos quais pode ser dirigido contra um epítopo diferente); um 77 diacorpo (um sFv dimerizado formado quando o domínio VH de um primeiro sFv é montado com um domínio VL de um segundo sFv e o domínio VL do primeiro sFv se monta com o domínio VH do segundo sFv; as duas regiões do diacorpo que se ligam a antigénio podem estar dirigidas ao mesmo ou a diferentes epítopos); e um triacorpo (um sFv trimerizado, formado de uma maneira semelhante a um diacorpo, mas no qual são ciados três domínios de ligação a antigénio num só complexo; os três domínios de ligação a antigénio podem estar dirigidos ao mesmo ou a diferentes epítopos). Incluem-se também nos derivados dos anticorpos uma ou mais sequências de CDR de um local de combinação de anticorpo. As sequências CDR podem estar ligadas conjunto como um andaime, quando estiverem presentes duas ou mais sequências CDR. 0 anticorpo a utilizar tal como se descreve neste documento pode incluir um Fv de cadeia singela (um "scFv") . Os scFv são fragmentos de anticorpo que incluem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Em geral, o polipéptido scFv inclui também um agente polipeptídico de ligação entre os domínios VH e VL, que permite ao scFv enformar-se na estrutura pretendida para ligação a antigénio. Veja-se uma revisão acerca de scFv em Pluckthun, 'The Pharmacology of Monoclonal Antibodies', volume 113, Rosenburg e Moore editores, Springer-Verlag, New York, págs. 269-315 (1994).
Os anticorpos da especificação presente podem ser de uma origem animal qualquer, incluindo aves e mamíferos 78 (por exemplo, humanos, murinos, de burro, de carneiro, de coelho, de cabra, de cobaia, de camelo, de cavalo, ou de frango). Os anticorpos da especificação presente podem ser de origem humana ou serem anticorpos monoclonais humanizados. Tal como se utiliza neste documento, os anticorpos "humanos" incluem anticorpos que tenham a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de murganhos que expressem anticorpos de genes humanos.
Preferivelmente, os anticorpos da especificação presente são anticorpos completamente humanos, tais como anticorpos completamente humanos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT, a um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou a um epitopo de hLIGHT. Estes anticorpos completamente humanos seriam vantajosos em relação a anticorpos completamente murinos (ou a anticorpos completa ou parcialmente de espécies não humanas), a anticorpos humanizados, ou a anticorpos quiméricos, para minimizarem o desenvolvimento de efeitos colaterais indesejáveis ou desnecessários, tais como as reacções imunológicas dirigidas contra anticorpos não completamente humanos (por exemplo, anticorpos anti-hLIGHT derivados de outras espécies) quando são administrados ao sujeito.
Os anticorpos da especificação presente podem ser monoespecificos, biespecíficos, triespecíficos ou 79 apresentar uma multiespecificidade superior. Os anticorpos multiespecificos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipéptido hLIGHT, ou podem ser específicos tanto para um polipéptido hLIGHT como para um epítopo heterólogo, tal como um polipéptido heterólogo ou material sólido de suporte. Preferivelmente, os anticorpos proporcionados neste documento são monoespecíficos para um determinado epítopo de um polipéptido hLIGHT e não se ligam imunoespecificamente a outros epítopos.
Preferivelmente, os anticorpos das composições incluem os anticorpos e os métodos de utilização dos anticorpos da especificação presente, incluindo os anticorpos El, E13, E63, F19 ou F23 (Nos. de Acessão na ATCC respectivamente de PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728). Também se proporcionam neste documento hibridomas que produzem os anticorpos El, E13, E63, F19 ou F23 (Nos. de Acessão na ATCC respectivamente de PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728) e/ou outros anticorpos monoclonais anti-hLIGHT descritos neste documento.
Em determinadas concretizações, proporciona-se neste documento um anticorpo isolado que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT por parte do anticorpo está competitivamente bloqueada (por exemplo, de um modo dependente da dose) por: (a) um anticorpo El, um anticorpo E13, ou um anticorpo E63, ou por (b) um anticorpo F19 ou um 80 anticorpo F23; com a limitação de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não esteja bloqueada por ambos os: (a) o anticorpo EI e o anticorpo F19, (b) o anticorpo EI e o anticorpo F23, (c) o anticorpo E13 e o anticorpo F19, (d) o anticorpo E13 e o anticorpo F23, (e) o anticorpo E63 e o anticorpo F19, ou (f) o anticorpo E63 e o anticorpo F23. O anticorpo pode ser ou não um anticorpo completamente humano. Preferivelmente o anticorpo será um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT completamente humano, e ainda mais preferivelmente o anticorpo será um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT antagonista completamente humano. São proporcionados nos Exemplos neste documento testes de bloqueio competitivo que se podem utilizar.
Proporciona-se neste documento um anticorpo isolado, preferivelmente um anticorpo completamente humano, que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada (por exemplo, de um modo dependente da dose) por: (a) um anticorpo El, um anticorpo E13, ou um anticorpo E63, ou por (b) um anticorpo F19 ou um anticorpo F23. O anticorpo pode ser ou não um anticorpo completamente humano. Preferivelmente, o anticorpo será um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT completamente humano, e ainda mais preferivelmente será um anticorpo monoclonal anti-hLIGHT completamente humano, antagonista. São proporcionados nos Exemplos neste documento métodos de bloqueio competitivo que se podem utilizar. 81
Os anticorpos proporcionados neste documento podem competir (por exemplo de um modo dependente da dose) com HVEM, LT3R e/ou DcR3 (ou com as suas proteínas de fusão) para a ligação a hLIGHT expresso à superfície. Os anticorpos proporcionados neste documento podem competir (por exemplo, de um modo dependente da dose) com HVEM, L^R e/ou DcR3 (ou com as suas proteínas de fusão) para a ligação a hLIGHT solúvel. São proporcionados nos Exemplos neste documento métodos de bloqueio competitivo que se podem utilizar. 0 anticorpo pode inibir parcial ou completamente a ligação de HVEM, LT βΡ e/ou DcR3 a um hLIGHT expresso à superfície de células, tal como hLIGHT. 0 anticorpo pode inibir parcial ou completamente a ligação de HVEM, ΕΤβΕ e/ou DcR3 a um hLIGHT solúvel. Os anticorpos proporcionados neste documento podem inibir parcial ou completamente a secreção de CCL20, IL-8, e/ou RANTES a partir de uma célula possuindo um ligando de hLIGHT expresso à sua superfície, tal como um receptor de hLIGHT (por exemplo, HVEM, LT3R e/ou DcR3). A célula que expressa o receptor de hLIGHT pode ser uma célula epitelial do cólon.
Os anticorpos da especificação presente incluem aqueles anticorpos e fragmentos que se ligam a antigénios dos anticorpos seguintes: um anticorpo EI (N° de Acessão na ATCC PTA-7729) , um anticorpo E13 (N° de Acessão na ATCC PTA-7842) , ou um anticorpo E63 (N° de Acessão na ATCC PTA-7818), um anticorpo F19 (N° de Acessão na ATCC PTA-7819) ou um anticorpo F23 (N° de Acessão na ATCC PTA-7728), os da 82
Secção de Exemplos, e de outros locais na especificação. Um anticorpo da especificação presente pode ser um anticorpo Ei, E13, E63, F19, ou F23. Um anticorpo da especificação presente inclui um fragmento que se liga a um antigénio (por exemplo, um fragmento Fab) de El, E13, E63, F19, ou de F23.
Preferivelmente, os anticorpos da especificação presente são anticorpos monoclonais completamente humanos, tais como os anticorpos monoclonais antagonistas completamente humanos, que se ligam imunoespecificamente a hLIGHT.
Os anticorpos proporcionados neste documento podem ligar-se a um epitopo de hLIGHT que assuma uma forma tridimensional característica à superfície de um polipéptido hLIGHT (por exemplo, numa forma trimérica de um polipéptido hLIGHT). Uma região de um polipéptido hLIGHT que contribua para um epitopo pode ser constituída por aminoácidos contíguos do polipéptido ou o epitopo pode resultar da montagem de duas ou mais regiões não contíguas do polipéptido. Pode estar presente um epitopo de hLIGHT (a) na forma trimérica ("um epitopo trimérico de hLIGHT") de hLIGHT, (b) na forma monomérica ("um epitopo monomérico de hLIGHT") de hLIGHT, (c) tanto na forma trimérica como na forma monomérica de hLIGHT, (d) na forma trimérica mas não na forma monomérica de hLIGHT, ou (e) na forma monomérica, mas não na forma trimérica de hLIGHT. 83
Por exemplo, o epítopo pode só estar presente ou disponível para ligação na forma trimérica (nativa), mas não estar presente ou disponível para ligação na forma monomérica (desnaturada) de um anticorpo anti-hLIGHT. 0 epítopo de hLIGHT pode ser uma característica linear no polipéptido hLIGHT (por exemplo, numa forma trimérica ou numa forma monomérica do polipéptido hLIGHT). Os anticorpos proporcionados neste documento podem ligar-se imunoespecificamente a (a) um epítopo da forma monomérica de hLIGHT, (b) um epítopo da forma trimérica de hLIGHT, (c) um epítopo da forma monomérica mas não da forma trimérica de hLIGHT, (d) um epítopo da forma trimétrica mas não da forma monomérica de hLIGHT, ou (e) tanto à forma monomérica como à forma trimérica de hLIGHT. Preferivelmente, os anticorpos proporcionados neste documento ligam-se imunoespecificamente a um epítopo da forma trimérica de hLIGHT mas não se ligam imunoespecificamente a um epítopo na forma monomérica de hLIGHT. A especificação presente proporciona um ou mais anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos uma cadeia VH e/ou uma cadeia VL, que tenham respectivamente as sequências de aminoácidos de uma cadeia VH e/ou de uma cadeia VL, de um anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com os Nos. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728. 84 A descrição presente proporciona um ou mais anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos um domínio VH e/ou um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um domínio VH e/ou de um domínio VL do anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com os Nos. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728. A especificação presente proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos uma, duas, três ou mais CDR com as sequências de aminoácidos de uma, duas, três ou mais CDR do anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com os Noa, de acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728. A descrição presente proporciona um ou mais anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos uma combinação de CDR de VH e/ou CDR de VL com as sequências de aminoácidos de CDR de VH e/ou de CDR de VL de El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com os Nos. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728. A especificação presente proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, 85 incluindo os referidos anticorpos uma cadeia VH e/ou uma cadeia VL com uma sequência de aminoácidos, respectivamente, de uma cadeia VH e/ou de uma cadeia VL, de um anticorpo que liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT por parte do anticorpo seja competitivamente bloqueada, de um modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, E13, ou E63, (b) um anticorpo F19 ou F23; com a limitação de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada pelo conjunto de: (a) os anticorpos El e F19, (b) os anticorpos El e F23, (c) os anticorpos E13 e F19, (d) os anticorpos E13 e F23, (e) os anticorpos E63 e F19, ou (f) os anticorpos E63 e F23. A especificação presente também proporciona anticorpos completamente humanos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos uma cadeia VH e/ou uma cadeia VL que tenham uma sequência de aminoácidos de, respectivamente, uma cadeia VH e/ou uma cadeia VL, de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT por parte do anticorpo seja competitivamente bloqueada de um modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, um anticorpo E13, ou um anticorpo E63, ou (b) um anticorpo F19 ou um anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo completamente humano é um anticorpo monoclonal completamente humano e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT. 86 A especificação presente também proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os referidos anticorpos um domínio de VH e/ou um domínio de VL, que tenham respectivamente a sequência de aminoácidos de um domínio de VH e/ou de um domínio de VL, de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT por parte do anticorpo seja bloqueada competitivamente num modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, E13, ou E63, ou (b) um anticorpo F 19 ou F23; com a limitação de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada pelo conjunto de: (a) os anticorpos El e F19, (b) os anticorpos El e F23, (c) os anticorpos E13 e F19, (d) os anticorpos E13 e F23, (e) os anticorpos E63 e F19, ou (f) os anticorpos E63 e F23. A descrição presente também proporciona anticorpos completamente humanos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos um domínio de VH e/ou um domínio de VL com uma sequência de aminoácidos respectivamente de um domínio de VH e/ou de um domínio de VL, de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT por parte do anticorpo seja bloqueada competitivamente de um modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, um anticorpo E13, ou um anticorpo E63, ou (b) um anticorpo F19 ou um anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo completamente humano é um 87 anticorpo monoclonal completamente humano e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT. A descrição presente também proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos uma, duas ou três CDR da VH (isto é, a CDR1 de VH, a CDR2 de VH, e/ou a CDR3 de VH), tendo uma sequência de aminoácidos de, respectivamente, uma, duas ou três CDR da VH, de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT, em que a ligação ao epitopo de hLIGHT por parte do anticorpo seja bloqueada competitivamente de um modo dependente da dose por: (a) um anticorpo El, E13, ou E63, ou (b) um anticorpo F19 ou F23; com a limitação de que a ligação ao epitopo de hLIGHT não seja bloqueada pelo conjunto de: (a) os anticorpos El e F19, (b) os anticorpos El e F23, (c) os anticorpos E13 e F19, (d) os anticorpos E13 e F23, (e) os anticorpos E63 e F19, ou (f) os anticorpos E63 e F23. A especificação presente também proporciona anticorpos completamente humanos que se ligam imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT, contendo uma, duas ou três CDR da VH (isto é, a CDR1 da VH, a CDR2 da VH, e/ou a CDR3 da VH) , tendo uma sequência de aminoácidos respectivamente de uma, duas ou três CDR da VH de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT, em que a ligação ao epitopo de hLIGHT por parte do anticorpo seja bloqueada competitivamente de um modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, um anticorpo E13, ou um anticorpo E63, ou (b) um anticorpo F 19 ou um anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo completamente humano é um anticorpo monoclonal completamente humano e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT. A especificação presente proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os referido anticorpos uma, duas ou três CDR da VL (isto é, a CDR1 da VL, a CDR2 da VL, e/ou a CDR3 da VL) , tendo uma sequência de aminoácidos, respectivamente, de uma, duas ou três CDR da VL, de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT em que a ligação do anticorpo ao epítopo de hLIGHT seja bloqueada competitivamente de um modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, E13, ou E63, ou (b) um anticorpo F19 ou F23; com a limitação de que a ligação do anticorpo ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada pelo conjunto de: (a) anticorpos El e F19, (b) anticorpos El e F23, (c) anticorpos E13 e F19, (d) anticorpos E13 e F23, (e) anticorpos E63 e F19, ou (f) anticorpos E63 e F23. A especificação presente também proporciona anticorpos completamente humanos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, contendo uma, duas ou três CDR da VL (isto é, a CDRl da VL, a CDR2 da VL, e/ou a CDR3 da VL) , tendo uma sequência de aminoácidos, respectivamente, de uma, duas ou três CDR da VL, de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de 89 hLIGHT, em que a ligação do anticorpo ao epítopo de hLIGHT seja bloqueada competitivamente de um modo dependente da dose, por: (a) um anticorpo El, E13, ou E63, ou (b) um anticorpo F19 ou F23. Preferivelmente, o anticorpo completamente humano é um anticorpo monoclonal completamente humano e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT. A especificação presente também proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo estes anticorpos uma, duas ou três CDR da VH (isto é, a CDR1 da VH, a CDR2 da VH, e/ou a CDR3 da VH) , tendo uma sequência de aminoácidos, respectivamente, de qualquer uma das CDR da VH (isto é, da CDR1 da VH, da CDR2 da VH, e/ou da CDR3 da VH) de El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo um dos Nos. de Acessão na PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728; ou qualquer combinação de todos estes.
Os anticorpos descritos neste documento que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT podem incluir um domínio VH tendo a sequência de aminoácidos do domínio VH representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5 e/ou a um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos do domínio VL representada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 8 2, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, ou 10.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT pode incluir 90 (a) um domínio VH possuindo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:l e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:82, 6 ou 83; (b) um domínio VH tendo a sequência
de aminoácidos representada na SEQ ID NO:2 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 7; (c) um domínio VH tendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 3 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:8; (d) um domínio VH tendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 4 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos: 90, 9, 91 ou 92; ou (e) um domínio VH tendo a sequência de
aminoácidos representada na SEQ ID NO: 5 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:10. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Os anticorpos descritos neste documento que se ligam imunoespecificamente a um epítopo hLIGHT podem incluir um domínio VH com a sequência de aminoácidos do domínio VH de uma anticorpo com os Nos. de Acessão na PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) e/ou um domínio VL com a sequência de aminoácidos do domínio VL de um anticorpo com os Nos. de acessão na ATCC PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23). 91
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo hLIGHT pode incluir (a) um dominio VH com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7729 (El) e um dominio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7729 (El); (b) um dominio VH com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13) e um dominio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC N° PTA-7842 (E13); (c) um dominio VH com l a sequência de aminoácidos de um anticorpo com O N° de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63) e um dominio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com O N° de Acessão na ATCC N° PTA-7818 (E63) ; (d) um domínio VH com i a sequência de aminoácidos de um anticorpo com O N° de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19) e um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com O N° de Acessão na ATCC N° PTA-7819 (F19); ou (e) um domínio VH com a sequência de aminoácidos > de um i anticorpo com O N° de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23) e um dominio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com 0 N° de
Acessão na ATCC N° PTA-7728 (F23). Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR1 da VH com a sequência de aminoácidos da 92 CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR2 da VH com a sequência de aminoácidos da CDR2 da VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 ou 5. Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR3 da VH com a sequência de aminoácidos da CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR1 da VH e/ou uma CDR2 da VH e/ou uma CDR3 da VH seleccionadas independentemente de entre a CDR1 da VH, a CDR2 da VH, a CDR3 da VH, tal como representadas em qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. A especificação presente também proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos uma ou mais CDR da VL (isto é, a CDR1 da VL, a CDR2 da VL, e/ou a CDR3 da VL) , com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR da VL (isto é, da CDR1 da VL, da CDR2 da VL e/ou da CDR3 da VL) de El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com um dos Nos. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23); ou uma qualquer combinação destes.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT inclui (1) um 93 domínio de VH contendo (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respect ivamente nas SEQ ID Nos:ll, 12 e/ou 13, (b) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos respectivamente representadas nas SEQ ID Nos:14, 15 e/ou 16, (c) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos: 17, 18, e/ou 19, (d) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:20, 21 e/ou 22, ou (e) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:23, 24 e/ou 24, e/ou (2) um domínio VL contendo (a) uma CDR1 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:84, 26 ou 85; uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:86, 27, ou 87; e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:88, 28, ou 89, (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:29, 30 e/ou 31, (c) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:32, 33 e/ou 34, (d) uma CDR1 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:93, 35, 94, ou 95; uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 97, ou 94 98; e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 97, ou 98, ou (e) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:38, 39 e/ou 40. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT pode incluir (1) um domínio de VH contendo (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Na. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El), (b) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Na. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH , e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Na. de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Na. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19), ou (e) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Na. de Acessão 95 na ATCC PTA-7728 (F23), e/ou (2) um domínio VL contendo (a) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com um N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El), (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com um N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com um N°. de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com um N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19), ou (e) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com um N°. de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23). Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT pode incluir (1) (a) um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respect ivamente nas SEQ ID Nos:ll, 12 e/ou 13, e (b) um domínio VL com uma CDR1 de VL com a sequência 96 de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:84, 2 6 ou 85; uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:86, 27, ou 87; e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:88, 28, ou 89; (2) (a) um dominio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:14, 15 e/ou 16, e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respect ivamente nas SEQ ID Nos:29, 30 e/ou 31; (3) (a) um dominio VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:17, 18, e/ou 19, e (b) um domínio VL com uma CDRl da VL, uma CDR2 da VL, e/ou uma CDR3 da VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:32, 33 e/ou 34; (4) (a) um domínio de VH com uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:20, 21 e/ou 22, e (b) um domínio VL com uma CDRl de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:93, 35, 94, ou 95; uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 9 7, ou 98; e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 97, ou 98; ou (5) (a) um domínio VH com uma CDRl de VH,
uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID 97
Nos:23, 24 e/ou 24, e (b) um domínio com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:38, 39 e/ou 40. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT pode incluir (1) (a) um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El), e (b) um domínio VL com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7729 (El); (2) (a) um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13) e (b) um domínio VL com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13); (3) (a) um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC 98 ΡΤΑ-7818 (Ε63) e (b) um domínio VL com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63); (4) (a) um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19) e uma VL com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com uma sequência de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL, e/ou CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19); ou (5) (a) um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos da CDR1 de VH, da CDR2 de VH, e/ou da CDR3 de VH de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23) e (b) um domínio VL com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL, e/ou CDR3 de VL de um anticorpo com o N° de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23) . Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR1 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR1 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID Nos: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou 99 PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) . Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR2 de VL de qualquer uma das regiões de VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou a de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23). Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR3 de VL de qualquer uma das regiões de VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) . Os anticorpos da especificação presente podem incluir uma CDR1 de VL e/ou uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL seleccionadas independentemente de entre a CDR1 de VL, a CDR2 de VL, a CDR3 de VL, tal como representadas em qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID Nos: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23).
Os anticorpos da especificação presente podem incluir (1) um dominio VH ou uma cadeia com uma ou mais de entre (a) uma CDR1 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo 100 produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), (b) uma CDR2 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR2 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), ou (c) uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23); e/ou (2) um dominio ou uma cadeia VL com uma ou mais de entre (a) uma CDR1 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR1 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), (b) uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR2 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), e/ou (c) uma
CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR3 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID 101
Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23). - 1 -
Tabela 1: Sequências das regiões CDR dos anticorpos El, E13 , E63, F19, e F23 (SEQ ID Nos). Kd VH CDRl de CDR2 de VH CDR3 de VH VL CDRl de VI CDR2 de CDR3 de VL VH 1 ! VL — ---------------------------------------------------------i — -------------------------------------------------^------------------------------ -----------------------------------------í El 1 (SEQ 1 RFNMN YISSSSYTIYYADSVKG SIAAFDY (SEQ j (SEQ RASQGISSALA jDASSLES QQFNSYRI j | ID |(SEQ ID (SEQ ID NO:12) ID NO:13) j ID (SEQ ID |(SEQ ID (SEQ ID j |N0:1) 1 NO:11) i NO:82, c* NO:84) j NO:86) NO:88) 0 i 83) í ! j RASQSVSSSYLT j GASSRAT QQYGSSMYT J ; ! (SEQ ID !(SEQ ID (SEQ ID NO:26*) NO:27*) NO:28*) J ; J \ RASQSVSSSYLA j GASNRAT QQYGSSPWT I j (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID | NO:85) NO:87) NO:89) E13 (SEQ | NAfflS RIKSKIDGGTTDYAAPVKG AMAGAFGF (SEQ j (SEQ RASQSVSSSYLA GASSRAT QQYGSSPMYT | ID i(SEQ ID (SEQ ID NO: 15) ID NO:16) ID (SEQ ID |(SEQ ID (SEQ ID | (N0:2) | N0:14) J NO: 7) NO:29) NO:30 NO:31) rtsssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss\ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss E63: (SEQ SGGYYWS j YIYYSGSTNYNPSLKS ,ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss^s\ WITMFRGVGFDP (SEQ RASQSIGSSLH |YASQSFS HQSSSLPLT :j ID j (SEQ ID (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19) ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID | |NO:3) NO:17) NO: 8) NO:32) | NO:33 NO:34) F19| (SEQ GYNWH EITHSGSTNYNPSLKS EIAVAGTGYYGMDV | (SEQ RVSQGISSYLN jSASNLQS QRTJNAPPT j ID |(SEQ ID (SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22) ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID | j NO: : N0:20) j NO:90, NO:93) NO:96) NO:99) ! D | 9*, | | ) | \ 91, ! ; \ i 92) _ 2
Ab VH CDRldej CDR2 de VH CDR3 de VH VL CDR1 de VL CDR2 de CDR3 de VL VH VL j j j j ! 1 RASRGINSAFA j DASSLES i QQFNSYPLI (SEQ ID j (SEQ ID ( (SEQ ID : : ! | NO:35*) |NO:36*)! NO:37*) ; :j :j j 1 í RMSQGISSYLA |mSTLQS | QQYYSFPYT : : \ \ \ (SEQ ID |(SEQ ID ( (SEQ ID | NO:94) j NO:97) | NO:100) .............1.....................|.............................|...................................................................................................................................| RASQGVSSYLA Idasnraií qqrsnwhp ; :j :j j 1 j i SEQ ID |(SEQ ID! (SEQ ID : : ! | NO:95) NO:98) | NO:101) jF23: (SEQ 1 GYYWN jEINQYNPSLKS (SEQ ID|EIAIADKGYYGLDV| | (SEQ RASQGISSALA jDASSLESi QQFNSYPLI | ID |(SEQ ID | NO:24) |(SEQ ID NO:25) | I ID (SEQ ID I(SEQ ID ( SEQ ID |NO:5) N0:23) j NO:10) NO:38) j NO:39) j NQ:40) * Sequências preferidas em EI e F19 para VL e para CDR1-3 de VL, 1 A especificação presente também proporciona anticorpos incluindo uma ou mais CDR de VH e uma ou mais CDR de VL listadas na Tabela I. Em especial, a especificação presente proporciona um anticorpo incluindo uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23) e uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos:88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24) e
uma CDRl de VL (SEQ ID Nos co 26, 85, 29,32,35 ou 38); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 2 7, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39) ; uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40) ; uma CDR3 de VH (SEQ ID Νοε 1:13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23) ; uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS:13, 16, 19, 2 2 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : OO C\l OO OO CO Q£> 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40) ; uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18 , 21 ou 24) e uma CDRl de VL (SEQ ID Nos : 84, 26, 85, OO CM 32 , 35 ou 38); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos CM \—1 15, OO \—1 21 ou 24) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 27, CO > 30, 33, 96, 36, 97, 98 , ou 39); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 1—1 \—1 14, 17, 20, ou 23) , 2 uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, LD i—1 18, 21 ou 24] ) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32 , 35 ou 38) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97 , 98, . ou 39) ; uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18 , 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 8 8, 28, 89, 31, 34, , 99, 37, 100, 101 ou 40) ; ' uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23) , uma CDRl de VL (SEQ ID N0S :8 4, 26, 85, 29, 32, 35 i ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos :86, 27, 87, 30, 33, 96 , 36, , 97 , 98, ou 39); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: :11, 14, 17, 20, ou 23) , uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32 , 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36 , 97, 98, ou 39) ; uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15 ,18, 21 ou 24), uma CDRl de VL (SEQ ID N°s : 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40) ; uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16 , 19, . 22 ou 25), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: 8 4 , 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86 , 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, kO co ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13,16,19 , 22 ou 25), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos : 8 4 , 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 3 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: 11, \—1 17, 20, ou 23) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 8 4 ,26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25 ) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: i—1 i—1 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos:88, 28, 89, 31, 34, 99, 7, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, , 15, 18 , 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos:86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos:ll, 14, , 17 , 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Ν' os: 12 , 15 , 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos:88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38 ) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, , 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40);
uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL 4 (SEQ ID Nos 00 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36,97 , 98 r ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS : 12, 15, 18, 21 ou 24) uma CDR3 de VH (SEQ ID N°s; 13, : 16, 9 , 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL(SEQ ID Nos : 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37 , 100, 101 ou 40 ) ; uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25) , uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 8 6, 27, 87, 30, 33, 96, 36 , 97, 98, ou 39) e uma CDR3
de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40) ; uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15 , 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 2 7, 8 7, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 3 9 ); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23) , uma CDR2 de VH
(SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID
Nos: 13, \—1 19, 22 ou 25) , uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ OO co co O S Q 1—1 INJ CO co Q£> 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40 ); uma CDRl de VH
(SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID
Nos: 12, 15, 18,21 ou 24) , uma CDRl de VL (SEQ ID 00 co O 26, 85, 29, 32 , 3 5 ou 38) , uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 8 6, 27, 00 30, 33 , 96, 36 , 97, , 98 , ou 39), e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) f uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) r uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97,98, ou 39) , e uma 5 CDR3 de VL (SEQ ID Nos:88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15 , 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25 ) , uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38 ) , uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, r 36, 97, 98 , ou 39) , e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); ou uma qualquer combinação de todas estas CDR de VH (SEQ ID Nos: 11-25) com CDR de VL (SEQ ID Nos:26-40) listadas na Tabela I. As CDR correspondentes da VH e da VL do N° de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), também podem ser utilizadas em qualquer uma das combinações listadas acima. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT. A especificação presente também proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, incluindo estes anticorpos derivados dos domínios de VH, CDR de VH, domínios de VL, e CDR de VL descritas neste documento, que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT. A especificação presente também proporciona anticorpos incluindo derivados de El, E13, E63, F19, e/ou F23, em que os referidos anticorpos se liguem imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT. Podem utilizar-se técnicas padrão, que são do conhecimento dos peritos na técnica, para introduzir mutações na sequência de nucleótidos que codifica para a 6 molécula da especificação presente, incluindo, por exemplo, mutagénese dirigida ao local e mutagénese mediada por PCR que origina substituições de aminoácidos. Preferivelmente, incluem-se nos derivados menos do que 25 substituições de aminoácidos, menos do que 20 substituições de aminoácidos, menos do que 15 substituições de aminoácidos, menos do que 10 substituições de aminoácidos, menos do que 5 substituições de aminoácidos, menos do que 4 substituições de aminoácidos, menos do que 3 substituições de aminoácidos, ou menos do que 2 substituições de aminoácidos, em relação à molécula original.
Preferivelmente os derivados possuem substituições de aminoácidos que sejam conservadoras, e de um ou mais residuos de aminoácidos que se preveja serem não essenciais. Uma "substituição conservadora de um aminoácido" é uma em que o resíduo de aminoácido seja substituído por outro resíduo de aminoácido, que possua uma cadeia lateral com uma carga semelhante. Foram definidas na técnica famílias de resíduos de aminoácidos portadoras de cargas semelhantes. Incluem-se nestas famílias aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por 7 exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em alternativa, podem introduzir-se mutações aleatoriamente ao longo da totalidade ou de parte da sequência de codificação, tal como mutagénese saturante, e despistarem-se nos mutantes obtidos quanto a uma actividade biológica para se identificarem mutantes que mantêm a actividade biológica. Depois da mutagénese, pode expressar-se a proteína codificada e determinar-se a actividade da proteína.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT pode conter uma sequência de aminoácidos que seja idêntica em pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 99 %, à sequência de aminoácidos de El, E13, E63, F19, e/ou F23, ou a um seu fragmento que se ligue a um antigénio, tal como um domínio VH, um domínio VL, uma cadeia da VH, ou uma cadeia da VL. Numa concretização, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT inclui uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT pode incluir uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID Nos: 8 2, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10. Um anticorpo descrito neste documento que se pode ligar imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT inclui uma sequência de aminoácidos de uma CDR da VH e/ou de uma CDR da VL que seja pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácidos da CDR de VH descrita nas SEQ ID Nos:ll, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 (CDR de VH) e/ou a uma sequência de aminoácidos de CDR de VL descrita nas SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39, ou 40.
O anticorpo descrito neste documento pode ser um anticorpo completamente humano anti-humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano. Podem produzir-se anticorpos completamente humanos por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Inclui-se nos métodos exemplificativos a imunização com um antigénio hLIGHT 9 (qualquer polipéptido hLIGHT capaz de originar uma reacção imunológica, e opcionalmente conjugado a um veiculo) em animais transgénicos (por exemplo, murganhos) que sejam capazes de produzir uma série de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina; vejam-se, por exemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei., 90: 2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362: 255 258 (1993); Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol., 7: 33. Podem encontrar-se outros métodos de produzir anticorpos completamente humanos anti-hLIGHT nos Exemplos proporcionados neste documento.
Em alternativa, podem gerar-se anticorpos completamente humanos por intermédio de um despiste in vitro de bibliotecas de apresentação de fagos; vejam-se, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Já se encontram descritas diversas bibliotecas de apresentação de fagos e elas podem ser facilmente preparadas por um especialista da técnica. As bibliotecas podem conter uma série de sequências de anticorpos humanos, taos como fragmentos humanos Fab, Fv, e scFv, que podem ser ensaiados contra um alvo adequado.
Preferivelmente, os anticorpos utilizados de acordo com os métodos da especificação presente apresentam uma elevada afinidade para um polipéptido hLIGHT, ou para um fragmento do polipéptido ou para um seu epítopo. Os anticorpos utilizados de acordo com os métodos da 10 especificação presente apresentam uma maior afinidade para um antigénio hLIGHT do que os anticorpos já conhecidos (por exemplo, os anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis descritos noutra parte deste documento). Os anticorpos utilizados de acordo com os métodos da especificação presente podem exibir uma afinidade 2 a 10 vezes maior (ou mais) para um antigénio hLIGHT do que um anticorpo anti-hLIGHT já conhecido, tal como se avaliam pelas técnicas descritas neste documento ou as conhecidas de um especialista da técnica (por exemplo, um ensaio BIAcore) . Pode avaliar-se a afinidade dos anticorpos utilizando um ensaio BIAcore.
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT pode incluir uma sequência de aminoácidos de um domínio de VH e/ou uma sequência de aminoácidos de um domínio de VL codificado por uma sequência de nucleótidos que se hibridize (1) ao complemento de uma sequência de nucleótidos codificada por um dos domínios de VH e/ou de VL representados nas SEQ ID Nos: 41, 42, 43, 44 ou 45 (de VH) e/ou nas SEQ ID Nos:102, 46, 103, 47, 48, 104, 49, 105, 106, ou 50 (de VL) ou (2) ao complemento de uma sequência de nucleótidos codificada por qualquer um dos domínios de VH ou de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma que tenha o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) em condições limitativas (por exemplo, uma hibridização a ADN ligado a um filtro em cloreto de sódio/citrato de sódio 6 x (SSC), a cerca de 11 45°C, seguida por uma ou mais lavagens com 0,2xSSC/0,l % SDS a cerca de 50-65°C) sob condições fortemente limitativas (por exemplo, hibridização a ácido nucleico ligado a papel de filtro em 6xSSC a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens com 0,1 x SSC/0,2 % SDS a cerca de 68°C), ou em condições de hibridização limitativas que são do conhecimento dos especialistas da técnica (veja-se, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., editores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Volume I, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., New York, nas páginas 6.3.1-6.3.6 e 2.10.3).
Um anticorpo descrito neste documento que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT pode incluir uma sequência de aminoácidos de uma CDR da VH ou uma sequência de aminoácidos de uma CDR da VL, codificadas por uma sequência de nucleótidos que se hibridize com o complemento de uma sequência de nucleótidos que codifique para qualquer uma das CDR de VH /ou de VL representadas nas SEQ ID
Nos: : 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, k·. 00 i—1 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 (as CRD da VH) e/ou SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28 , 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98 , 99, 37 , 10 ( D, 1C '1, 3 8, 39, ou 40 (as CDR . da VL) ou (b) o complemento de uma sequência de ácido nucleico codificando para uma das CDR de VH e/ou uma das CDR de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), em condições limitativas (por exemplo, hibridização com ADN ligado a 12 papel de filtro em 6X SSC a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC/0,1 % SDS a cerca de 50-65°C), em condições fortemente limitativas (por exemplo, hibridização com ADN ligado a papel de filtro em 6X SSC a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens com 0,1 X SSC/0,2 % SDS a cerca de 68°C), ou noutras condições limitativas de hibridização que sejam conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., editores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., New York, nas páginas 6.3.1-6.3.6 e 2.10.3)
Incluem-se nos anticorpos da especificação presente os anticorpos que sejam quimicamente modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Por exemplo, mas não a titulo de limitação, incluem-se nos derivados de anticorpo os anticorpos que tenham sido quimicamente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização com grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolitica, ligação a um ligando celular ou a outra proteína, etc. Pode levar-se a cabo qualquer uma de entre numerosas modificações químicas recorrendo a técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a uma clivagem química específica, acetilação, formulação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o anticorpo pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. 13 A especificação presente também proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT que inclua uma região de quadro conhecida dos entendidos na técnica (por exemplo, um fragmento humano ou não humano). A região do quadro pode, por exemplo, ocorrer naturalmente ou pertencer a regiões consensuais do quadro. De preferência, a região do quadro de um anticorpo da especificação presente é humana (veja-se, por exemplo, em Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479, uma lista das regiões quadro humanas. Veja-se também Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5a edição. A especificação presente proporciona anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos a sequência de aminoácidos de uma ou mais das CDR de El, E13, E63, F19, e/ou F23 (isto é, as SEQ ID Nos:ll, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 (CDR da VH) ou as SEQ ID Nos : 8 4, 26, 85, 00 27, 87, OO 00 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97 , 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39, ou 40 (CDR da VL), ou 0 anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728, e regiões do quadro humano com uma ou mais substituições de aminoácidos em um, dois, três ou mais dos seguintes resíduos: (a) resíduos raros no quadro que difiram entre o quadro do anticorpo murino (isto é, o quadro do anticorpo do doador) e o anticorpo humano 14 (isto é, o quadro do anticorpo aceitador); (b) resíduos da zona de Venier quando difiram entre a do quadro do anticorpo do doador e quadro do anticorpo do aceitador; (c) resíduos de empacotamento entre cadeias na interface VH/VL que difiram entre o quadro do anticorpo do doador e quadro do anticorpo do aceitador; (d) resíduos canónicos que diferem entre as sequências do quadro do anticorpo do doador e as do quadro do anticorpo do aceitador, em especial as regiões do quadro cruciais para a definição da classe canónica das ansas da CDR do anticorpo murino; (e) resíduos que sejam adjacentes a uma CDR; (g) resíduos capazes de interactuar com o antigénio; (h) resíduos capazes de interactuar com a CDR; e (i) resíduos de contacto entre o domínio VH e o domínio VL. Os anticorpos descritos neste documento que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT podem incluir as regiões do quadro humano com uma ou mais substituições de aminoácidos em um, dois, três ou mais dos resíduos identificados acima, são anticorpos antagonistas de hLIGHT. A especificação presente inclui anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos a sequência de aminoácidos do domínio VH e/ou do domínio VL ou de um fragmento que se ligue a um seu antigénio, de um anticorpo produzido pelo hibridoma que tenha o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728), ou de um anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23, com mutações (por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos) nas regiões do 15 quadro. Os anticorpos descritos neste documento que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT podem incluir as sequências de aminoácidos do domínio VH e/ou do domínio VL ou um seu fragmento que se liga a um antigénio, de El, E13, E63, F19, e/ou F23, com uma ou mais substituições de aminoácidos nas regiões do quadro dos domínios VH e/ou VL. A especificação presente também inclui anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, incluindo os anticorpos referidos a sequência de aminoácidos do domínio VH e/ou do domínio VL de um anticorpo produzido pelo hibridoma com o N° de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728, ou de um anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23, tendo mutações (por exemplo, uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos), nas regiões hipervariável e do quadro. Preferivelmente, as substituições de aminoácidos nas regiões hipervariável e do quadro melhoram a ligação do anticorpo a um antigénio hLIGHT.
Os anticorpos proporcionados neste documento podem diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, LT£R e/ou DcR3, e/ou diminuir ou inibir uma actividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, num sujeito (por exemplo, um sujeito humano). Os anticorpos proporcionados neste documento, tais como anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT, podem diminuir ou inibir a ligação de um hLIGHT solúvel ou expresso à superfície da 16 célula a HVEM ou a ΙιΤβϊΐ, e/ou diminui ou inibe a secreção de CCL20 e/ou RANTES depois de um contacto com um hLIGHT solúvel ou expresso à superfície, num sujeito. 0 hLIGHT pode ser uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. A actividade de bloqueio de um anticorpo proporcionado neste documento, da ligação de hLIGHT a HVEM, ΗΤβΚ e/ou DCR3, pode ser detectada utilizando um ensaio tal como se descreve em qualquer um dos Exemplos 1-4. A inibição da actividade biológica de células que expressam um receptor de hLIGHT, por parte de um anticorpo contra hLIGHT proporcionado neste documento, pode ser detectada utilizando um ensaio tal como o descrito em qualquer um dos Exemplos 1-4.
Os anticorpos proporcionados neste documento podem diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, ΗΤβΡ e/ou DcR3 e/ou diminuir ou inibir uma actividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, numa célula possuindo um receptor de hLIGHT expresso à sua superfície (tal como HVEM, ΗΤβΗ e/ou Dc3R) . Os anticorpos proporcionados neste documento podem diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, ΗΤβΗ e/ou DcR3 e/ou diminuir ou inibir uma actividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20 e/ou RANTES, numa célula possuindo um receptor de hLIGHT expresso à sua superfície, após um contacto com um hLIGHT solúvel ou expresso à superfície da célula. Em algumas concretizações, o hLIGHT é uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. 0 bloqueio por um anticorpo proporcionado neste 17 documento, da actividade de ligação de hLIGHT a HVEM, Ll^R e/ou DCR3, pode ser detectada utilizando um ensaio tal como o descrito em qualquer um dos Exemplos 1-4. Pode detectar-se a inibição da actividade biológica de células que expressem um receptor de hLIGHT, por parte de um anticorpo da hLIGHT proporcionado neste documento, recorrendo a um ensaio tal como os descritos em qualquer um dos Exemplos 1-4. A especificação presente também proporciona proteínas de fusão incluindo um anticorpo proporcionado neste documento que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT e um polipéptido heterólogo. Em algumas concretizações, o polipéptido heterólogo com o qual o anticorpo está fundido é útil para alvejar o anticorpo a células com o hLIGHT expresso à superfície celular. A especificação presente também proporciona painéis de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT. A especificação presente proporciona painéis de anticorpos com constantes de velocidade de associação distintas e com constantes de velocidade de dissociação distintas, com diferentes afinidades para o antigénio hLIGHT, e/ou diferentes especificidades para um antigénio hLIGHT. A especificação presente proporciona painéis com cerca de 10, preferivelmente cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 18 500, cerca de 550, cerca de 600, cerca de 650, cerca de 700, cerca de 750, cerca de 800, cerca de 850, cerca de 900, cerca de 950, ou cerca de 1000 anticorpos, ou mais. Podem utilizar -se os painéis de anticorpos, por exemplo, em placas de 96 poços ou em placas de 384 poços, tais como para ensaios do tipo dos ELISA.
CONJUGADOS DE ANTICORPOS COM PROTEÍNAS DE FUSÃO
Os anticorpos da especificação presente podem ser conjugados ou fundidos de modo recombinante com um agente de diagnóstico, detectável ou terapêutico, ou com qualquer outra molécula. Os anticorpos conjugados ou fundidos de modo recombinante podem ser úteis, por exemplo, para monitorizar ou para prognosticar o despoletar, o desenvolvimento, a progressão e/ou a severidade de uma doença mediada por hLIGHT, como parte de um processo de avaliação clinica, tal como na determinação da eficácia de uma terapia especifica.
Pode conseguir-se um tal diagnóstico e detecção, por exemplo, acoplando o anticorpo a substância detectáveis incluindo, mas não se limitando a, diversos enzimas, tais como, mas não se limitando a, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, mas não se limitando a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não se limitando a, umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, 19 rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como, mas não se limitando a, luminol; materiais bioluminescentes, tais como mas não se limitando a, luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioactivos, tais como mas não se limitando a, iodo (131I, 125 T -L r 123I, e 1211) , carbono (14C) , enxofre (35S) , tritio (3H) , indio (115ln, 113In, 112In, e 111 In,), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti ) , gálio (68Ga, 67Ga) , paládio ( 103Pd) , molibdénio (99Mo) , xénon (133Xe) , flúor (1S F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re , 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 32Gd, 169Yb, 51Cr , 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Sn; e metais emissores de positrões mediante diversas tomografias de emissão de positrões, e os iões metálicos paramagnéticos não radioactivos. A especificação presente também inclui utilizações dos anticorpos descritos neste documento conjugados ou fundidos de forma recombinante com uma espécie terapêutica (uma ou mais espécies terapêuticas). Pode conjugar-se ou fundir-se de forma recombinante o anticorpo com uma espécie terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um ião metálico radioactivo, por exemplo, de entre os emissores alfa. Inclui-se nas citotoxinas ou agentes citotóxicos, qualquer agente que seja nocivo para as células. Incluem-se nas espécies terapêuticas, mas não se limitam a, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 20 citarabina, 5-fluoro-uracilo, descarbazina); os agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina II) (DDP) , além de cis-platina) ; as antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina); antibióticos (por exemplo, d-actinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)); moléculas de auristatina (por exemplo, auristatina PHE, briostatina 1, e solastatina 10; veja-se Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45: 3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12: 735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15: 367-72 (1999); hormonas (por exemplo, glucocorticóides, progestinas, androgénios, e estrogénios), inibidores de enzimas de reparação de ADN (por exemplo, etoposido ou topotecano), inibidores de quinase (por exemplo, composto ST1571, mesilato de imatinibe (Kantarjian et al., Clin. Câncer Res. 8(7): 2167-76 (2002)); agentes citotóxicos (por exemplo, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucorticóides, procaína, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina e os seus análogos ou homólogos e 21 aqueles compostos descritos nas ; Patentes U.S. Nos. 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, 5.587.459); inibidores de farnesil transferase (por exemplo, R115777, BMS-214662, e os descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos: 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188, 6.342.765, 6.342-487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6 .051.582, 6 .051.574, e 6.040.305); inibidores de topoisomerase (por exemplo, camptotecina; irinotecano; SN-38; topotecano; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951Í; IST-622; rubitecano; pirazoloacridina; XR-5000; saintopina; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506; e rebecamicina); bulgareína; aglomerantes do sulco menor do ADN tais como o corante da Hoescht 33342 e o corante da epiberberina; bisfosfonatos clodronato, neridronato,
Hoechst 33258; coralina; (por exemplo, tiludronato, olpandronato, nitidina; beta-lapachona alendronato, etidronato, risedronato, fagaronina; BC-4-1; cimadronato, ibandronato, piridronato, 22 pamidronato, zolendronato), inibidores de HMG-CoA reductase, (por exemplo, lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lupitor, rosuvastatina e atorvastatina); oligonucleótidos de sentido reverso (por exemplo, os descritos nas Patente U.S. Nos. 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033, e 5.618.709); inibidores de adenosina desaminase (por exemplo, fosfato de fludarabina e 2-clorodesoxiadenosina) ; ibritumomabe tiuxetano (Zevalin®) ; tositumomabe (Bexxar®) ) e os seus sais, solvatos, clatratos e precursores de fármacos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.
Além disto, um anticorpo da especificação presente pode ser conjugado ou fundido de forma recombinante com uma espécie terapêutica ou com uma espécie farmacológica que modifica uma determinada reacção biológica. As espécies terapêuticas ou as espécies de fármacos não devem ser interpretadas como sendo agentes químicos terapêuticos clássicos. Por exemplo, a espécie farmacológica pode ser uma proteína, um péptido, ou um polipéptido que possua uma actividade biológica pretendida. Podem incluir-se nessas proteínas, por exemplo, uma toxina tal como a abrina, a ricina A, exotoxinas de pseudomonas, toxina da cólera, ou toxina da difteria; uma proteína tal como factor de necrose tumoral, interferão γ, interferão a, factor de crescimento de nervos, factor de crescimento derivado de plaquetas, activante do plasminogénio tecidular, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-γ, TNF-γ, 23 ΑΙΜ I (veja-se a Publicação Internacional de PCT N°. WO 97/33.899), ΑΙΜ II (veja-se a Publicação Internacional de PCT N°. WO 97/34.911), Ligando Fas (Takahashi et al.r 1994, J. Immunol., 6: 1567-1574), e VEGF (veja-se a Publicação Internacional de PCT N°. WO 99/23.105), um agente anti-angiogénico, por exemplo, angiostatina, endostatina ou uma componente do caminho de coagulação (por exemplo, factor tecidular); ou um modificante da reacção biológica tal como, por exemplo, uma linfoquina (por exemplo, interferão gama, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-5 ("IL-5"), interleuquina-6 ("IL-6"), interleuquina-7 ("IL-7"), interleuquina 9 ("IL-9"), interleuquina-10 ("IL-10"), interleuquina-12 ("IL-12"), interleuquina-15 ("IL-15"), interleuquina-23 ("IL-23"), factor estimulante de colónias de macrófagos em granulócitos ("GM-CSF"), e factor estimulante de colónias de granulócitos ("G-CSF")), ou um factor de crescimento (por exemplo, hormona de crescimento ("GH")), ou um agente de coagulação (por exemplo, cálcio, vitamina K, factores tecidulares, tais como mas não se limitando a, factor de Hageman (factor XII), quininogénio de elevada massa molecular (HMWK), precalicreína (PK), factores de coagulação proteicos II (protrombina), factor V, Xlla, VIII, XlIIa, XI, Xla, IX, IXa, X, fosfolípidos, e fibrina monomérica). A especificação presente inclui anticorpos descritos neste documento fundidos de forma recombinante ou quimicamente conjugados (conjugações covalentes ou não 24 covalentes) com uma proteína ou um polipéptido heterólogos (ou um seu fragmento, preferivelmente a um polipéptido com cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100 aminoácidos), para gerar proteínas de fusão. Em especial, a especificação presente proporciona proteínas de fusão que incluem um fragmento que se liga a um antigénio, de um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento F(ab)2^ um domínio VH, uma CDR da VH, um domínio VL ou uma CDR da VL) e uma proteína ou polipéptido ou um péptido heterólogos. A proteína ou polipéptido ou um péptido heterólogos com os quais o anticorpo pode estar fundido é útil para se alvejar o anticorpo a um tipo de célula específico, tal como uma célula que expresse hLIGHT ou um receptor de hLIGHT. Por exemplo, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um receptor superficial de uma célula expresso num tipo de célula em particular (por exemplo, uma célula imunológica) pode ser fundido ou conjugado com um anticorpo modificado da especificação presente.
Uma proteína de fusão ou conjugada da especificação presente inclui qualquer um dos anticorpos descritos neste documento e um polipéptido heterólogo. Uma proteína de fusão ou conjugada da especificação presente pode incluir um anticorpo El, E13, E63, F19, ou F23, ou um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, 25 Ε13, Ε63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo. Uma proteína de fusão ou conjugada da especificação presente pode incluir um fragmento que se ligue a um antigénio, de El, E13, E63, F19, ou F23, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo. Uma proteína de fusão ou conjugada da especificação presente pode incluir um domínio VH com a sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios VH representados nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5, ou um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. De Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e/ou um domínio da VL com a sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios VL representados pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10, ou o anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo. Uma proteína de fusão ou conjugada da especificação presente pode incluir uma ou mais CDR de VH com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR de VH representadas nas SEQ ID Nos:ll, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo. Uma proteína de fusão ou conjugada da especificação presente pode incluir uma ou mais CDR de VL com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR de VL representadas nas 26 SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39, ou 40, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo. Uma proteína conjugada ou de fusão da especificação presente pode incluir pelo menos um domínio VH e pelo menos um domínio VL representados respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5 e nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. De Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo. Uma proteína conjugada ou de fusão da especificação presente pode incluir pelo menos uma CDR da VH CDR e pelo menos uma CDR da VL, representadas respectivamente nas SEQ ID Nos: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 e nas SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100 , 101, 38, 39, ou i 40, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de
Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), e um polipéptido heterólogo.
Além disto, um anticorpo da especificação presente pode ser conjugado com espécies terapêuticas tais como um ião de um metal radioactivo, tais como metais emissores alfa como o 213Bi ou quelantes macrocíclicos úteis 27 para se conjugarem com iões de metais radioactivos, incluindo mas não se limitando a, 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, com polipéptidos. 0 quelante macrociclico pode ser o ácido 1,4,7,lO-tetra-azaciclododecano-Ν,Ν',N",N"'-tetra-acético (DOTA) que se pode ligar ao anticorpo através de uma molécula de ligação. Estas moléculas de ligação são bem conhecidas na técnica e estão descritas em Denardo et al., 1998, Clin. Câncer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4): 553-7; e em Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943-50.
Além disto, os anticorpos da especificação presente podem estar fundidos com sequências marcadoras, tais como péptidos, para facilitar a purificação.
Preferivelmente a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido de hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado no vector pQE (QIAGEN, Inc.) , entre outros, muitos dos quais se encontram comercialmente disponíveis. Tal como se descreve em Gentz et ai., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 821-824, por exemplo, a hexa-histidina proporciona uma purificação conveniente da proteina de fusão. Outros marcadores peptídicos úteis para a purificação incluem, mas não se limitam a, o marcador hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina, da gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767), e o marcador "FLAG". São bem conhecidos métodos para fundir ou para conjugar espécies terapêuticas (incluindo polipéptidos) com 28 anticorpos, veja-se, por exemplo, Arnon et ai., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (editores), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et ai., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Edição), Robinson et al. (editores), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (editores), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (editores), págs. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; Patentes U.S. Nos. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.723.125, 5.783.181, 5.908.626, 5.844.095, e 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; EP 394.827; Publicações de PCT WO 91/06.570, WO 96/04.388, WO 96/22.024, WO 97/34.631, e WO 99/04.813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 11337-11341, 1992.
Podem gerar-se proteínas de fusão, por exemplo, recorrendo às técnicas de baralhar genes, baralhar motivos, baralhar exões, e/ou baralhar codões (colectivamente referidas como "baralhar ADN"). Pode empregar-se o baralhar 29 de ADN para alterar as actividades dos anticorpos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos com afinidades maiores e menores velocidades de dissociação). Vejam-se, em geral, as Patentes U.S. Nos. 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, e 5.837.458; Patten et ai., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82,- Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308- 313. Os anticorpos, ou os anticorpos codificados, podem ser alterados quando se submetem a mutagéneses aleatórias por PCR com tendência para erros, inserção aleatória de nucleótidos ou outros métodos, antes da recombinação. Um polinucleótido que codifica para um anticorpo da especificação pode ser recombinado com uma ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.
Um anticorpo da especificação presente também pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo, tal como se descreve na Patente U.S. N°. 4.676.980.
Deve seleccionar-se a espécie terapêutica ou fármaco que se conjuga ou funde de modo recombinante com um anticorpo da especificação presente, que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, de modo a conseguir o ou os efeitos profilácticos ou terapêuticos pretendidos. O anticorpo pode ser um anticorpo modificado. Um médico ou outro elemento do pessoal de saúde deve levar 30 em consideração quanto se segue, ao decidir acerca de qual a espécie terapêutica ou fármaco que vai conjugar ou fundir de modo recombinante com um anticorpo da invenção: a natureza da doença, a severidade da doença, e o estado do sujeito.
Os anticorpos da especificação presente também podem ser ligados a suportes sólidos, que são especialmente úteis para imunoensaios ou para a purificação do antigénio alvo. Incluem-se nestes suportes sólidos, mas não se limitam a estes, vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
Podem preparar-se para armazenagem formulações terapêuticas contendo um ou mais anticorpos proporcionados neste documento, misturando o anticorpo que tenha o grau de pureza pretendido com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), sob a forma de formulações liofilizadas ou a de soluções aquosas. Os veículos, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os destinatários às dosagens e concentrações empregues, e neles se incluem tampões tais como os de fosfato, citrato, e de ouros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; 31 cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol) ; polipéptidos com pequena massa molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tis como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn com proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).
Os anticorpos proporcionados neste documento podem também, por exemplo, ser formulados em lipossomas. Preparam-se os lipossomas contendo a molécula de interesse pelos métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030; e nas Patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Estão descritos lipossomas com maiores períodos de circulação na Patente U.S. N°. 5.013.556.
Podem gerar-se imunolipossomas especialmente úteis recorrendo ao método de evaporação em fase reversa 32 com uma composição lipídica contendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Extrudem-se os lipossomas através de fieiras com dimensões de poro definidas para se obterem lipossomas com o diâmetro pretendido. Podem conjugar-se fragmentos Fab' de um anticorpo proporcionado neste documento com os lipossomas, tal como se descreve em Martin et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 286-288, através de uma reacção de permuta de dissulfureto. Um agente quimioterapêutico (tal como a Doxorrubicina) pode estar opcionalmente contido no lipossoma; veja-se Gabizon et al., (1989) J. National Câncer Inst. 81(19): 1484.
As formulações, tais como as descritas neste documento, também podem conter mais do que um composto activo, consoante seja necessário para a indicação específica que se esteja a tratar. As formulações podem incluir um anticorpo da especificação presente e um ou mais compostos activos com actividades complementares, que não se afectem uns aos outros de modo adverso. Estas moléculas estrão adequadamente presentes em combinação, em quantidades que sejam eficazes para os objectivos pretendidos. Por exemplo, um anticorpo da especificação presente pode ser combinado com um ou mais outros agentes terapêuticos. Pode então administrar-se este tipo de terapia combinada ao paciente em série ou em simultâneo ou sequencialmente. 33
Também se pode armadilhar um anticorpo da especificação presente em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação, ou por polimerização interfacial, por exemplo, respectivamente de hidroximetilcelulose ou de gelatina-microcápsula e uma cápsula em poli-(metacrilato de metilo), em sistemas de veiculação coloidais de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas no Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
As formulações que se podem utilizar para administração in vivo podem ser estéreis. Isto consegue-se facilmente por filtração através de, por exemplo, membranas de filtração estéreis.
Também se podem preparar preparações com libertação prolongada. Incluem-se nos exemplos adequados de preparações com libertação prolongada as matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, matrizes estas que assumem a forma de artigos com formas, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Incluem-se nos exemplos de matrizes para libertação prolongada poliésteres, hidrogeles (por exemplo, poli-(metacrilato de 2-hidroxietilo), ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Patente U.S. N°. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico com L-glutamato de etilo, de etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros degradáveis 34 de ácido láctico com ácido glicólico tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis constituídas por copolímero de ácido láctico com ácido glicólico e acetato de leuprolido), e poli-(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Enquanto os copolímeros tais como os de etileno com acetato de vinilo e os de ácido láctico com ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais do que 100 dias, determinados hidrogeles libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante muito tempo, eles podem desnaturar-se ou agregar-se em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda da actividade biológica e em possíveis alterações da sua imunogenicidade. Podem criar-se estratégias racionais para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, caso se venha a revelar que o mecanismo de agregação envolve a formação de uma ligação S--S intermolecular por permuta tio-dissulfureto, pode conseguir-se a estabilização modificando os resíduos sulfidrilo, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o conteúdo em humidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições específicas para as matrizes poliméricas.
As composições farmacêuticas proporcionadas neste documento contêm quantidades eficazes do ponto de vista terapêutico de um ou mais dos anticorpos proporcionados neste documento, e opcionalmente um ou mais agentes adicionais, profilácticos ou terapêuticos, num veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Estas composições 35 farmacêuticas são adequadas para a prevenção, o tratamento, a gestão ou a melhoria de uma doença mediada por hLIGHT, tal como a doença inflamatória dos intestinos, ou de um ou mais dos seus sintomas.
Incluem-se nos veiculos farmacêuticos adequados para administração dos compostos que se proporcionam neste documento, quaisquer desses veiculos que sejam conhecidos dos especialistas da técnica como sendo adequados para o modo de administração pretendido.
Além disto, podem formular-se os anticorpos da especificação presente a titulo de único agente activo do ponto de vista farmacêutico na composição, ou ele pode ser combinado com outros ingredientes activos (tais como um ou mais agentes adicionais, profilácticos ou terapêuticos).
As composições podem conter um ou mais anticorpos da especificação presente. Numa concretização, formulam-se os anticorpos em preparações farmacêuticas adequadas, tais como soluções, suspensões, comprimidos, comprimidos dispersáveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação prolongada ou elixires, para uma administração por via oral ou em soluções ou suspensões estéreis para uma administração parentérica, bem como na preparação de pachos transdérmicos e em inaladores de pós secos. Podem formular-se os anticorpos descritos acima em composições farmacêuticas, utilizando técnicas e procedimentos bem 36 conhecidos (veja-se, por exemplo, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4a Edição, pág. 126).
Nas composições, as concentrações eficazes de um ou mais anticorpos ou dos seus derivados são misturadas com um veículo farmacêutico adequado. As concentrações dos compostos nas composições são eficazes para veicular uma quantidade, após administração, que trate, evite, ou melhore uma doença mediada por hLIGHT ou um seu sintoma.
Podem formular-se as composições para administração de uma única dosagem. Para se formular uma composição, a fracção ponderai do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou de outra forma misturada com um veículo seleccionado, a uma concentração eficaz, de tal modo que o estado que se tratar seja aliviado, evitado, ou melhore um ou mais dos sintomas respectivos.
Inclui-se um anticorpo da especificação presente num veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico numa quantidade eficaz suficiente para desempenhar um efeito útil do ponto de vista terapêutico na ausência de efeitos colaterais indesejáveis para o paciente que se tratar. Pode determinar-se empiricamente a concentração eficaz do ponto de vista terapêutico testando os compostos em sistemas in vitro e in vivo utilizando métodos de rotina e depois extrapolar-se em termos de dosagens para seres humanos. 37 A concentração de anticorpo na composição farmacêutica dependerá, por exemplo, das caracteristicas fisico-quimicas do anticorpo, do horário da dosagem, e da quantidade administrada, bem como de outros factores conhecidos dos especialistas da técnica.
Uma dosagem eficaz do ponto de vista terapêutico pode produz ir uma concentração de anticorpo no soro de entre cerca de 0,1 ng/mL e cerca de 50-100 pg/mL. As composições farmacêuticas, noutra concretização, proporcionam uma dosagem de entre cerca de 0,001 mg e cerca de 2.000 mg de anticorpo por quilograma de massa corporal e por dia. Podem preparar-se formas de unidade de dosagem farmacêutica para proporcionar entre cerca de 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg, e cerca de 500 mg, 1.000 mg ou 2.000 mg, e numa concretização entre cerca de 10 mg e cerca de 500 mg do anticorpo e/ou uma combinação de outros ingredientes essenciais opcionais por forma de unidade de dosagem.
Pode administrar-se o anticorpo de uma só vez, ou pode repartir-se em diversas doses mais pequenas para serem administradas a intervalos de tempo. Entende-se que a dosagem exacta e a duração do tratamento é uma função da doença que se está a tratar e pode ser determinada empiricamente utilizando protocolos de teste ou por extrapolação a partir de dados de testes in vivo ou in vitro. Deve anotar-se que as concentrações e os valores das dosagens também podem variar com a severidade do estado que se pretende aliviar. Deve também entender-se que para 38 qualquer sujeito em particular, se podem ajustar os regimes de dosagem específicos ao longo do tempo de acordo com as necessidades individuais e a opinião profissional do indivíduo que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as gamas de concentração constantes deste documento figuram apenas a título de exemplo e não se pretende que limitem o âmbito nem a prática das composições reivindicadas.
Por mistura ou adição do anticorpo, a mistura resultante pode ser uma solução, uma suspensão, uma emulsão ou outras semelhantes. A forma da mistura resultante depende de diversos factores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no veículo ou agente de transporte seleccionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, patologia ou estado que se trata e pode ser determinada empiricamente.
As composições farmacêuticas são proporcionadas para administração a seres humanos e a animais, em formas de unidade de dosagem, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parentéricas estéreis, e soluções ou suspensões orais, bem como em emulsões óleo-água contendo quantidades adequadas dos compostos ou seus derivados aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. 0 anticorpo descrito neste documento pode ser formulado e administrado sob uma forma de unidade de dosagem ou sob formas de múltipla dosagem. As formas de 39 unidade de dosagem tais como se utilizam neste documento referem-se a unidades fisicamente discretas adequadas para sujeitos humanos e animais e individualmente embaladas tal como se sabe na técnica. Cada unidade de dose contém uma quantidade previamente determinada do anticorpo, suficiente para produzir o efeito terapêutico pretendido, em associação com o veiculo ou diluente farmacêutico necessário. Incluem-se nos exemplos de formas de unidade de dose ampolas e seringas bem como comprimidos ou cápsulas individualmente embalados. Podem administrar-se as formas de unidade de dose em fracções ou múltiplos delas. Uma forma de dose múltipla é uma série de formas de unidade de dosagem idênticas embaladas num mesmo contentor, para serem administradas por formas de unidade de dose segregadas. Incluem-se nos exemplos de formas de dose múltipla frascos, ou comprimidos ou cápsulas, ou contentores com volumes definidos. Portanto, a forma de doses múltiplas é um múltiplo das de unidade de dose, que não estejam segregadas por meio de embalagem.
Preferivelmente um ou mais dos anticorpos anti-hLIGHT da especificação presente estarão numa formulação farmacêutica líquida. As composições liquidas farmacêuticas administráveis podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo, dispersando, ou misturando de uma outra forma um composto activo tal como se definiu acima com adjuvantes farmacêuticos opcionais, num veiculo, tal como, por exemplo, água, soro salino, dextrose aquosa, glicerol, glicóis, etanol, e outros semelhantes, para deste modo 40 formar uma solução ou uma suspensão. Caso tal se pretenda, a composição farmacêutica que se pretende administrar também pode conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes de tamponização do pH e outros semelhantes, por exemplo, acetato, citrato sódico, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, trietanolamina, acetato de sódio, oleato de trietanolamina, e outros agentes deste tipo. São conhecidos métodos de preparação actuais destas formas de dosagem, ou eles serão aparentes, aos especializados nesta técnica; por exemplo, veja-se Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
Podem preparar-se formas de dosagem ou composições contendo anticorpo na gama de entre 0,005 % e 100 %, sendo o restante constituído por veículo não tóxico, os especialistas da técnica conhecem os métodos de preparação destas composições.
As formas de dosagem farmacêutica oral são quer sólidos, geles ou líquidos. As formas de dosagem sólidas são comprimidos, cápsulas, grânulos, e pós a granel, incluem-se nos tipos de comprimidos orais, os sujeitos a uma compressão, as pastilhas mastigáveis e os comprimidos que podem ter revestimento entérico, revestimento com açúcar ou revestimento com película. As cápsulas podem ser 41 cápsulas em gelatina, dura ou mole, enquanto os grânulos e os pós podem ser proporcionados sob formas não efervescente ou efervescente, com a combinação dos outros ingredientes que são do conhecimento dos especialistas.
As formulações podem ser formas de dosagem sólidas. As formulações podem ser cápsulas ou comprimidos. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos ou outros semelhantes podem conter um ou mais dos ingredientes seguintes, ou compostos com uma natureza semelhante: um aglomerante; um lubrificante; um diluente; um agente de escorregamento; um agente desintegrante; um corante; um agente edulcorante; um agente de sabor; um agente molhante; um revestimento emético; e um revestimento pelicular. Incluem-se nos exemplos de aglomerantes a celulose microcristalina, a goma de tragacanto, uma solução de glucose, mucilagem de goma-arábica, solução de gelatina, melaços, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarose e pasta de amido. Incluem-se nos lubrificantes o talco, o amido, o estearato de magnésio ou de cálcio, licopódio e ácido esteárico. Incluem-se nos diluentes por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulino, sal, manitol e fosfato dicálcico. Incluem-se nos agentes de escorregamento, mas não se limitam a, dióxido de silício coloidal. Incluem-se nos agentes desintegrantes a croscarmelose sódica, o amidoglicolato de sódio, o ácido algínico, o amido de milho, o amido de batata, a bentonite, a metilcelulose, o agar e a carboximetilcelulose. Incluem-se nos corantes, por exemplo, qualquer um dos corantes 42 solúveis em água certificados FD e C, as suas misturas; e corantes FD e C insolúveis em água suspensos em hidrato de alumina. Incluem-se nos agentes edulcorantes a sacarose, a lactose, o manitol e agentes edulcorantes artificiais tais como a sacarina, e qualquer um de entre os diversos sabores secos por atomização. Incluem-se nos sabores os sabores naturais extraídos de plantas tais como frutos e as sintéticas de compostos que originam uma sensação agradável, tal como, mas não se limitando a, hortelã-pimenta e salicilato de metilo. Incluem-se nos agentes molhantes o monoestearato de propilenoglicol, o mono-oleato de sorbitan, o monolaurato de dietilenoglicol e o éter polioxietileno-laurílico. Incluem-se nos revestimentos eméticos os ácidos gordos, as gorduras, as ceras, shellac, shellac amoniacal e os ftalatos acetatos de celulose. Incluem-se nos revestimentos peliculares a hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose sódica, polietilenoglicol 4.000 e ftalato acetato de celulose.
Podem proporcionar-se os anticorpos da especificação presente numa composição que os protege do meio ácido do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada dentro de um revestimento entérico cuja integridade se mantém no estômago e que liberta o seu conteúdo no intestino. Também se pode formular a composição em combinação com um antiácido, ou com outro ingrediente deste tipo. 43
Quando a forma de unidade de dosagem for uma cápsula, ela pode conter, para além do material do tipo acima, um veiculo líquido tal como um óleo gordo. Além disto, as formas de unidade de dosagem podem conter diversos outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos com açúcar e com outros agentes entéricos. Os compostos também podem ser administrados sob a forma de uma componente de um elixir, de uma suspensão, de um xarope, de uma bolacha, de uma aspersão, de uma goma de mascar, ou outras semelhantes. Um xarope pode conter, para além dos compostos activos, sacarose a título de agente edulcorante e determinados conservantes, pigmentos e corantes e sabores.
Também se pode misturar o anticorpo com outros materiais activos que não comprometam a acção pretendida, ou com materiais que suplementem a acção pretendida, tais como antiácidos, bloqueadores H2, e diuréticos. 0 ingrediente activo é um anticorpo ou um seu derivado activo do ponto de vista farmacêutico, tal como se descreve neste documento. Podem incluir-se concentrações maiores, de até cerca de 98 % em peso, do ingrediente activo.
As formulações de comprimidos e de cápsulas podem ser revestidas pelos especialistas na técnica para modificar ou para apoiar a dissolução do ingrediente activo. Deste modo, por exemplo, eles podem ser revestidos com um revestimento convencional entericamente digerível, 44 tal como salicilato de fenilo, ceras e ftalato acetato de celulose.
Preferivelmente as formulações são formas de dosagem líquidas. As formas de dosagem oral líquidas incluem soluções, emulsões, ou suspensões aquosas, soluções e/ou suspensões reconstituídas a partir de grânulos não efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas a partir de grânulos efervescentes. Incluem-se nas soluções aquosas, por exemplo, elixires e xaropes. As emulsões são quer de água em óleo, quer de óleo em água.
Os elixires são preparações límpidas, adoçadas, hidroalcoólicas. Incluem-se nos veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico que se utilizam nos elixires, os solventes. Os xaropes são soluções aquosas concentradas de um açúcar, por exemplo sacarose, e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema com duas fases, no qual um líquido se encontra dispersos sob a forma de pequenos glóbulos no seio de outro líquido. Os veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico que se utilizam nas emulsões são líquidos não aquosos, agentes emulsionantes e conservantes. As suspensões recorrem a agentes de suspensão e a conservantes, aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Incluem-se nas substâncias aceitáveis do ponto de vista farmacêutico utilizadas nos grânulos não efervescentes, para serem reconstituídos a uma forma de dosagem líquida, diluentes, edulcorantes e agentes molhantes. Incluem-se nas substâncias aceitáveis do ponto 45 de vista farmacêutico utilizadas nos grânulos efervescentes, para serem reconstituídos a uma forma de dosagem líquida, ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Utilizam-se agentes corantes e sabores em todas as formas de dosagem acima.
Incluem-se nos solventes glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope. Incluem-se nos exemplos de conservantes glicerina, metilparabeno e propilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio e álcool. Incluem-se nos exemplos dos líquidos não aquosos utilizados nas emulsões óleo mineral e óleo de semente de algodão. Incluem-se nos exemplos de agentes emulsionantes a gelatina, a goma-arábica, a goma de tragacanto, a bentonite, e tensioactivos tais como o mono-oleato de pololioxietileno-sorbitan. Incluem-se nos agentes de suspensão a carboximetilcelulose sódica, a pectina, a goma de tragacanto, Veegum e a goma-arábica. Incluem-se nos agentes edulcorantes a sacarose, os xaropes, a glicerina e agentes edulcorantes artificiais tais como a sacarina. Incluem-se nos agentes molhantes o monoestearato de propilenoglicol, mono-oleato de sorbitan, o monolaurato de dietilenoglicol e o éter laurel-polioxietilénico. Incluem-se nos ácidos orgânicos os ácidos cítrico e tartárico. Incluem-se nas fontes de dióxido de carbono o bicarbonato de sódio e o carbonato de sódio, incluem-se nos agentes corantes quaisquer dos corantes aprovados e certificados, solúveis em água, FD & C, bem como as suas misturas. Incluem-se nos agentes de sabor os sabores naturais extraídos de plantes e frutos, e as 46 misturas sintéticas de compostos que originam uma sensação de sabor agradável.
Para uma forma de dosagem sólida, a solução ou a suspensão, por exemplo em carbonato de propileno, óleos vegetais ou triacilgliceróis, pode ser encapsulada numa cápsula em gelatina. Estas soluções, bem como a sua preparação e encapsulação, estão descritas nas Patentes U.S. Nos. 4.328.245; 4.409.239; e 4.410.545. Para uma forma de dosagem líquida, a solução, por exemplo num polietilenoglicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um veículo líquido aceitável do ponto de vista farmacêutico, por exemplo água, para se conseguir quantificar facilmente para administração.
Em alternativa, podem preparar-se formulações orais líquidas ou semi-sólidas dissolvendo ou dispersando o composto activo ou o sal em óleos vegetais, glicóis, triacilgliceróis, ésteres de propilenoglicol (por exemplo, carbonato de propileno) e outros veículos desse tipo, e encapsulando estas soluções ou suspensões em cápsulas de gelatina dura ou mole. Incluem-se nas outras formulações úteis as constantes das Patentes U.S. Nos. RE28.819 e 4.358.603. Em resumo, incluem-se nessas formulações sem que elas se limitem a estas, as que contêm um composto proporcionado neste documento, um monoalquilenoglicol ou polialquilenoglicol dialquilados, incluindo, mas não se limitando a, 1,2-dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, éter dimetílico do polietilenoglicol 350, éter dimetílico do polietilenoglicol 550, éter dimetílico do polietilenoglicol 750, em que 350, 550 e 750 se referem à massa molecular média aproximada do polietilenoglicol, e um ou mais antioxidantes, tais como hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisole butilado (BHA), gaiato de propilo, vitamina E, hidroquinona, hidroxicoumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, ácido málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiónico e os seus ésteres, e os ditiocarbamatos.
Outras formulações incluem, mas não se limitam a, soluções aquosas alcoólicas incluindo um acetal aceitável do ponto de vista farmacêutico acetal. Os álcoois utilizados nestas formulações são quaisquer solventes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico misciveis com a água e contendo um ou mais grupos hidroxilo, incluindo, mas não se limitando a, propilenoglicol e etanol. Incluem-se nos acetais, mas não se limitam a, di(alquilo inferior)acetais de alquilaldeídos inferiores tais como o dietilacetal do acetaldeído.
Pode caracterizar-se a administração parentérica por uma injecção, pelas vias subcutânea, intramuscular ou endovenosa, que também está contemplada neste documento. Podem preparar-se os injectáveis por formas convencionais, quer como soluções, quer como suspensões líquidas, forma sólidas adequadas para uma solução ou uma suspensão num líquido antes da injecção, ou como emulsões. Os injectáveis, soluções e emulsões também contêm um ou mais 48 excipientes. São excipientes adequados, por exemplo, água, soro salino, dextrose, glicerol ou etanol. Além disto, caso tal se pretenda, as composições farmacêuticas a administrar também podem conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponizantes do pH, estabilizadores, agentes solubilizantes, e outros agentes deste tipo, tais como por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas. A implantação de um sistema de libertação lenta ou de libertação prolongada, de tal modo que se mantenha um teor constante de dosagem (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N° . 3.710.795) também está contemplada neste documento. Em suma, dispersa-se um composto proporcionado neste documento numa matriz sólida interna, por exemplo, em poli(metacrilato de metilo), polimetacrilato de butilo), poli(cloreto de vinilo) plastificado ou não plastificado, nylon plastificado, poli(tereftalato de etileno) plastificado, borracha natural, poli-isopreno, poli-isobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno com acetato de vinilo, borrachas de silicone, polidimetil-siloxanos, copolimeros de silicone com carbonato, polímeros hidrofílicos tais como hidrogeles de ésteres de ácido acrílico e metacrílico, colagénio, poli(álcool vinílico) com ligações cruzadas e poli(acetato de vinilo) com ligações cruzadas e parcialmente hidrolisado, isto é, envolto por uma membrana polimérica 49 exterior, por exemplo, em polietileno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno com acrilato de etilo, copolímeros de etileno com acetato de vinilo, borrachas de silicone, polidimetilsiloxanos, borracha de neopreno, polietileno clorado, poli(cloreto de vinilo), copolímeros de cloreto de vinilo com acetato de vinilo, cloreto de vinilideno, etileno e propileno, ionómero de poli(tereftalato de etileno), borracha butílica, borrachas de epicloridrina, copolímeros de etileno com álcool vinílico, terpolímeros de etileno, acetato de vinilo e álcool vinílico, e copolímeros de etileno com viniloxietanol, que seja insolúvel nos fluidos corporais. 0 anticorpo difunde através da membrana polimérica exterior num passo que controla a velocidade de libertação. A quantidade de anticorpo contida nestas composições parentéricas depende fortemente da sua natureza específica, bem como da actividade do composto e das necessidades do sujeito.
As preparações para administração parentérica incluem soluções estéreis prontas a injectar, produtos sólidos estéreis secos e solúveis, tais como pós liofilizados, prontos a combinar com um solvente imediatamente antes da utilização, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injecção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes da utilização e emulsões estéreis. As soluções podem ser quer aquosas, quer nao aquosas. 50
Quando são administrados por via endovenosa, incluem-se nos veículos adequados o soro salino fisiológico ou o soro salino tamponizado com fosfato (PBS), e soluções contendo agentes espessantes e de dissolução, tais como glucose, polietilenoglicol, e polipropilenoglicol, e misturas destes.
Os veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico utilizados nas preparações parentéricas, os veículos aquosos, os veículos não aquosos, os agentes antimicrobianos, os agentes de isotonicidade, os tampões, os antioxidantes, os anestésicos locais, os agentes de suspensão e de dispersão, os agentes emulsionantes, os agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.
Incluem-se nos exemplos de veículos aquosos Cloreto de Sódio para Injecção, Ringer para Injecção, Dextrose Isotónica para Injecção, Água Estéril para Injecção, Dextrose e Ringer Lactado para Injecção. Incluem-se nos veículos parentéricos não aquosos os óleos fixados com origem vegetal, óleo de sementes de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Podem adicionar-se agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas às preparações parentéricas embaladas em contentores de múltiplas doses, que incluem fenóis ou cresóis, compostos de mercúrio, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres p-metílico e p- 51 propílico de ácido p-hidroxibenzóico, timerosal, cloreto de benzalcónio e cloreto de benzetónio. Incluem-se nos agentes isotónicos o cloreto de sódio e a dextrose. Incluem-se nos tampões os de fosfato e os de citrato. Inclui-se nos antioxidantes o bissulfato de sódio. Inclui-se nos anestésicos locais o cloridrato de procaína. Incluem-se nos agentes de suspensão e de dispersão a carboximetilcelulose sódica, a hidroxipropilmetilcelulose e a polivinilpirrolidona. Inclui-se nos agentes emulsionantes o Polissorbato 80 (TWEEN® 80). Nos agentes sequestrantes ou quelantes de iões metálicos inclui-se o EDTA. Incluem-se também nos veículos farmacêuticos o álcool etílico, o polietilenoglicol e o propilenoglicol, no que toca a veículos miscíveis com a água; e o hidróxido de sódio, o ácido clorídrico, o ácido cítrico ou o ácido láctico para ajuste do pH. A concentração do composto activo do ponto de vista farmacêutico é ajustada de modo a que uma injecção proporcione uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico pretendido. A dose exacta depende da idade, da massa corporal e do estado do paciente ou do animal, consoante se sabe na técnica.
As preparações parentéricas de unidade de dose podem ser embaladas numa ampola, num frasco ou numa seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parentérica podem ser estéreis, tal como se sabe e pratica na técnica. 52 A título ilustrativo, a infusão endovenosa ou intra-arterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto activo é um modo eficaz de administração. Outra concretização é uma solução ou suspensão estéril, aquosa ou oleosa, contendo um material activo, injectada consoante seja necessário para produzir o efeito farmacológico pretendido.
Os injectáveis são concebidos para administração local e sistémica. Numa concretização, formula-se uma dosagem eficaz do ponto de vista terapêutico de modo a conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 %, em peso, e até 90 %, em peso ou mais, em determinadas concretizações mais do que 1 %, em peso, do composto activo aos tecidos tratados. O anticorpo pode ser suspenso em forma micronizada, ou sob outra forma adequada. A forma da mistura resultante depende de uma série de factores, incluindo o modo de administração a que se destina e a solubilidade do composto no veículo seleccionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas do estado, e pode ser empiricamente determinada.
As formulações farmacêuticas podem ser pós liofilizados, que podem ser reconstituídos para uma administração sob a forma de soluções, suspensões emulsões 53 ou outras misturas. Elas também podem ser reconstituídas e formuladas como sólidos e como geles. 0 pó liofilizado é preparado dissolvendo um anticorpo proporcionado neste documento, ou um seu derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico, num solvente adequado. 0 pó liofilizado pode ser estéril. 0 solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outra componente farmacológica do pó ou da solução reconstituída, preparado a partir do pó. Incluem-se nos excipientes que se podem utilizar, mas não se limitam a, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glucose, sacarose ou outro agente adequado. 0 solvente também pode conter um tampão, tal como citrato, fosfato de sódio ou de potássio ou outro tampão conhecidos dos especialistas da técnica a, numa concretização, um pH aproximadamente neutro. Uma filtração esterilizante subsequente da solução, seguida por uma liofilização em condições padronizadas conhecidas dos especialistas da técnica proporciona a formulação pretendida. Numa concretização, a solução resultante será distribuída por frascos para liofilização. Cada frasco conterá uma única dosagem ou diversas dosagens do composto. 0 pó liofilizado pode ser armazenado em condições apropriadas, tais como a entre cerca de 4°C e a temperatura ambiente.
Uma reconstituição deste pó liofilizado com água para injecção proporciona uma formulação para utilização em administração parentérica. Para a reconstituição, o pó 54 liofilizado é adicionado a água estéril ou a outro veiculo adequado. A quantidade exacta depende do composto seleccionado. Essa quantidade pode ser determinada empiricamente.
As misturas tópicas são preparadas tal como descrito para a administração local e sistémica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsões ou outras semelhantes, e pode ser formulada sob a forma de cremes, geles, unguentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, aspersões, supositórios, pensos, pachos dérmicos ou quaisquer outras formulações adequadas para uma administração tópica.
Os anticorpos da especificação presente podem ser formulados como aerossóis para aplicação tópica, tal como para inalação (vejam-se, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.044.126, 4.414.209, e 4.364.923, que descrevem aerossóis para veicular um esteróide útil para o tratamento de doenças inflamatórias, em especial a asma). Estas formulações para administração no tracto respiratório podem assumir a forma de um aerossol ou a de uma solução para um nebulizador, ou a de um pó extremamente fino para insuflações, por si só ou em combinação com um veículo inerte tal como a lactose. Num tal caso, as partículas da formulação terão, numa concretização, diâmetros inferiores a 50 mícron, noutra concretização inferiores a 10 mícron. 55
Os compostos podem ser formulados para aplicação local ou tópica, tal como uma aplicação tópica sobre a pele e as membranas mucosas, tal como nos olhos, sob a forma de geles, cremes, e loções para aplicação nos olhos ou para aplicação intracisternal ou intraespinal. Uma aplicação tópica está contemplada para veiculação transdérmica, e também para administração nos olhos ou nas mucosas, ou para terapias de inalação. Também se podem administrar soluções nasais do composto activo por si só ou em combinação com outros excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.
Estas soluções, em especial as destinadas a uma utilização oftálmica, podem ser formuladas como soluções isotónicas a 0,01 % - 10 %, com um pH de cerca de 5-7, usando sais apropriados.
Também são contempladas neste documento outras vias de administração, tais como os pachos transdérmicos, incluindo dispositivos iontoforéticos e electroforéticos, e a administração rectal.
Os pachos transdérmicos, incluindo dispositivos iontoforéticos e electroforéticos, são bem conhecidos dos especialistas da técnica. Por exemplo, descrevem-se pachos destes nas Patentes U.S. Nos. 6.267.983, 6.261.595, 6.256.533, 6.167.301, 6.024.975, 6.010.715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433, e 5.860.957. 56
Por exemplo, as formas de dosagem farmacêutica para administração rectal são supositórios rectais, cápsulas e comprimidos para efeitos sistémicos. Utilizam-se supositórios rectais neste documento o que significa corpos sólidos para inserção no recto, os quais fundem e amolecem à temperatura do corpo, libertando um ou mais ingredientes activos farmacologicamente ou do ponto de vista terapêutico. Aa substâncias aceitáveis do ponto de vista farmacêutico utilizadas nos supositórios rectais são bases ou veículos e agentes para aumentar o ponto de fusão. Incluem-se nos exemplos de bases a manteiga de cacau (óleo de theobroma), glicerina-gelatina, carbowax (polioxietilenoglicol) e misturas adequadas de monoacilgliceróis, dicilgliceróis e triacilgliceróis de ácidos gordos. Podem utilizar-se combinações das diversas bases. Incluem-se nos agentes para aumentar o ponto de fusão dos supositórios o espermacete e ceras. Podem preparar-se supositórios rectais quer pelo método de compressão, quer por moldagem. 0 peso de um supositório rectal, numa concretização, é de entre cerca de 2 e 3 g.
Os comprimidos e as cápsulas para administração rectal podem ser fabricados utilizando as mesmas substâncias aceitáveis do ponto de vista farmacêutico e pelos mesmos métodos que para as formulações para administração oral.
Os anticorpos e outras composições proporcionadas neste documento também podem ser formulados de modo a 57 alvejarem um determinado tecido, receptor, ou outra área do corpo do sujeito que se pretenda tratar. Os especialistas da técnica conhecem bem muitos outros métodos de alvejamento. Todos estes métodos de alvejamento estão contemplados neste documento para utilização com as composições em apreço. Podem encontrar-se exemplos não limitativos dos métodos de alvejamento, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 e 5.709.874. Em algumas concretizações, os anticorpos anti-hLIGHT da especificação presente estão alvejados (ou são de oura forma administrados) ao cólon, tal como num paciente que tenha ou esteja em risco de contrair uma IBD.
As suspensões lipossomais, incluindo lipossomas alvejando tecidos, tais como lipossomas alvejando tumores, também podem ser adequadas como veiculos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Elas podem ser preparadas seguindo métodos conhecidos dos especialistas da técnica. Por exemplo, podem preparar-se formulações em lipossomas tal como se descreve na Patente U.S. N°. 4.522.811. Em suma, podem formar-se lipossomas tais como vesículas multilamelares (MLVj secando fosfatidilcolina de ovo e fosfatidilserina do cérebro (a uma razão molar de 7:3) no interior de um balão. Adiciona-se uma solução de um composto proporcionado neste documento em soro salino tamponizado com fosfato isenta de catiões divalentes (PBS) 58 e agita-se o balão até a película lipídica se ter dispersado. As vesículas resultantes são lavadas para remover composto não encapsulado, preparam-se pastilhas por centrifugação, e depois voltam a suspender-se em PBS.
MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO E DOSEAMENTO A especificação presente proporciona também composições que incluem um ou mais anticorpos descritos neste documento, para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT (ou de um seu sintoma).
Proporcionam-se neste documento composições incluindo um ou mais anticorpos da especificação presente, para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT, tal como uma IBD (por exemplo, colite ulcerosa ou doença de Crohn), ou de um seu sintoma. Os sintomas das IBD podem variar entre os ligeiros, e dependem em geral de qual a parte do tracto intestinal envolvida. Incluem-se nos exemplos de sintomas de IBD cólicas abdominais e dores, diarreia sangrenta, urgência severa em permitir movimentação dos intestinos, febre, pera do apetite, perda de massa corporal, anemia, fadiga, e/ou feridas nas partes inferiores das pernas, nos tornozelos, nas coxas, e nos braços. Incluem-se nos exemplos das complicações intestinais da IBD hemorragias fortes nas úlceras, perfuração ou ruptura do intestino, estenoses e obstruções, fístulas (passagem anormal) e 59 doença perianal, megacólon tóxico (por exemplo, dilatação aguda não obstrutiva do cólon), e/ou lesões malignas (por exemplo, cancro do cólon ou do intestino delgado). Incluem-se nos exemplos das complicações das IBD a artrite, doenças da pele, inflamação ocular, patologias do fígado e rins, e/ou perdas ósseas. Qualquer combinação destes sintomas pode ser evitada, gerida, tratada, e/ou melhorada utilizando as composições e os métodos descritos neste documento. São proporcionadas neste documento composições que incluem um ou mais anticorpos da especificação presente para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT, tal como a GVHD, ou de um seu sintoma. A GVHD ocorre em geral depois de transplantações alogénicas ou emparelhadas mas não relacionadas de medula óssea (BMT). A GVHD descrita neste documento pode ser GVHD aguda. Os sintomas da GVHD aguda podem acontecer rapidamente e podem ser ligeiros ou severos. Em determinados casos, desenvolve-se uma GVHD aguda nos três meses depois do transplante, tal como quando as contagens sanguíneas recuperam a seguir ao transplante. Em alguns casos, a GVHD aguda afecta a pele, o tracto gastrointestinal (GI) e/ou o fígado. Por exemplo, em alguns pacientes, uma GVHD aguda na pele começa por uma irritação da pele, por exemplo, nas palmas das mãos do paciente, nas solas dos pés, ou nos ombros. No entanto, esta irritação 60 pode espraiar-se, e pode causar comichão e dores e/ou bolhas e perda de pele. Uma GVHD aguda no fígado pode afectar as funções hepáticas normais, tais como os enzimas do fígado, e pode por sua vez provocar icterícia. Uma GVHD aguda no fígado pode também provocar o aumento de volume do abdómen do paciente, com dores, caso o fígado aumente de volume. Por último, os sintomas de uma GVHD intestinal aguda (ou de uma GVHD do sistema digestivo) podem incluir diarreia, mucosidades ou sangue nas fezes, cólicas ou dores abdominais, indigestão, náuseas e/ou perda do apetite. Incluem-se nos outros sintomas gerais de GVHD aguda a anemia, febres ligeiras, e/ou um aumento da susceptibilidade a infecções. Qualquer combinação destes sintomas da GVHD pode ser evitada, gerida, tratada, e/ou melhorada utilizando as composições e os métodos proporcionados neste documento. A GVHD descrita neste documento pode ser crónica. A GVHD crónica pode ocorrer a entre cerca de três meses e cerca de um ano ou mais, a partir da transplantação. A GVHD crónica pode ser ligeira ou severa, e inclui em geral sintomas similares aos da GVHD aguda. A GVHD crónica pode afectar a pele e o sistema digestivo, incluindo o fígado, mas também pode envolver outros órgãos e o sistema imunológico (por exemplo, tornando o paciente mais susceptível a infecções) e/ou tecidos conjuntivos. Incluem-se nos sintomas da GVHD crónica da pele uma erupção, pele seca, pele esticada, comichão na pele, escurecimento da cor da pele, espessamento da pele, e/ou pode afectar o cabelo 61 (por exemplo, perda de cabelo, que se pode tornar cinzento) ou as unhas (por exemplo, unhas duras ou quebradiças). A GVHD crónica intestinal pode afectar o sistema digestivo, a boca, o esófaqo, o revestimento interno do estômago, e/ou o revestimento dos intestinos, e podem incluir-se nos sintomas a diarreia, boca seca ou dorida, dores ao engolir, uma pequena absorção dos nutrientes por parte do estômago, inchaços, cólicas estomacais. Uma GVHD crónica do fígado pode provocar lesões e cicatrizes hepáticas (cirrose). Uma GVHD crónica dos olhos pode afectar as glândulas lacrimais, provocando secagem dos olhos, a sensação de arder e dores, ou a tolerância à luz forte. Uma GVHD crónica do pulmão pode causar falta de ar, pieira, tosse persistente, e/ou aumento da susceptibilidade a infecções no tórax. Uma GVHD crónica afecta os tendões (por exemplo, inflamação) que ligam os músculos aos ossos, provocando dificuldade em endireitar ou dobrar os braços ou as pernas. Qualquer combinação destes sintomas da GVHD crónica pode ser evitada, gerida, tratada, e/ou melhorada utilizando as composições e os métodos proporcionados neste documento.
Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, co tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23. Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, 62 PTA-7819, ou ΡΤΑ-7728 (EI, Ε13, Ε63, F19 ou F23) . Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um fragmento que se ligue a um antigénio, de um anticorpo El, E13, E63, F19, e/ou F23. Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um fragmento que se ligue a um antigénio, de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos contendo um ou mais domínios VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios de VH representados nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23). Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos contendo uma ou mais CDRl de VH representadas nas SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23 (isto é, as CDRl de VH representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com uma N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou 63 F23). Uma composição descrita neste documento para utilização na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR2 de VH contendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 de VH representadas pelas SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21, ou 24 (isto é, as CDR2 de VH da VH representada respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23). Preferivelmente, a composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT inclui um ou mais anticorpos que contenham uma ou
mais CDR3 de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 de VH representadas nas SEQ ID Nos : 13, 16 , 19, 22 , ou 25 (isto é, as CDR3 de VH da VH representada respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou a de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA- 7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) .
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo um ou mais domínios VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios VL representados nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10, ou de um 64 anticorpo produzido num hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR1 de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRl de VL representadas nas SEQ ID N+: 84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95, ou 38 (isto é, as CDRl de VL das VL representadas respectivamente nas SEQ ID Nos: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23). Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR2 de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 de VL representadas nas SEQ ID Nos:86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39 (isto é, as CDR2 da VL respectivamente das VL representadas pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10); ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Preferivelmente a composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou 65 mais CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VL representadas pelas SEQ ID Nos: 88, 28, Ο'ϊ 00 31, 34, 99, 37, 100, 101, ou 40 (isto é, as CDR3 da VL de uma das VL representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10); ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC. PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo um ou mais domínios VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios VH representados pelas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e um ou mais domínios VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios VL representados pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10, ou de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou 66 mais CDR1 de VH com uma sequência de aminoácidos de
qualquer uma das CDR1 da VH representadas pelas SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23 (isto é, as CDR1 da VH das VH representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais das CDRl da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRl da VL representadas nas SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95, ou 38 (isto é, as CDRl da VL das VL representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDRl da VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRl da VH representadas pelas SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23 (isto é, as CDRl da VH das representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais das CDR2 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 de VL representadas pelas SEQ ID Nos:86, 27,
87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39 (isto é, as CDR2 da VL das VL representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:82, 67 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10) . A Uma composição tal
como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR1 de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR1 de VH representadas pelas SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23 (isto
é, as CDRl da VH das VH representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VL representadas pelas SEQ ID Nos:88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101, ou 40 (isto é, as CDR3 da VL das VL representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR2 da VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 de VH representada pelas SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21, ou 24 (isto é, uma CDR2 da VH das VH representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com 68 o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais CDR1 de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR1 de VL representadas pelas SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95, ou 38 (isto é, das CDR1 da VL das VL representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23). Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR2 da VH com uma sequência de aminoácidos de
qualquer uma das CDR2 de VH representadas pelas SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21, ou 24 (isto é, as CDR2 da VH das VH representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA- 7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais CDR2 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 da VL representadas pelas SEQ ID Nos:86, 27, 87,
30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39 (isto é, as CDR2 da VL das VL representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no 69 tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR2 de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 da VH representadas nas SEQ ID Nos : 12, 15,18, 21, ou 24 (isto é, as CDR2 da VH, das VH representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 das VL representadas nas SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101, ou 40 (isto é, as CDR3 da VL das VL representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR3 da VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VH representadas nas SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22, ou 25 (isto é, as CDR3 da VH das VH representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA- 70
7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais CDR1 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR1 da VL representadas nas SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95, ou 38 (isto é, as CDR1 da VL das VL representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10, ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos incluindo uma ou mais CDR3 da VH representadas nas SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22, oi 25 (isto é, as CDR3 da VH das VH representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5) , ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais reqiões CDR2 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR2 da VL representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39 (isto é, as CDR2 da VL das VL representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um ou mais anticorpos 71 incluindo uma ou mais CDR3 da VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VH representadas nas SEQ ID Nos:13, 16, 19, 22, ou 25 (isto é, as CDR3 da VH das VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23), e uma ou mais CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR3 da VL representadas respect ivamente nas SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101, ou 40 (isto é, as CDR3 da VL das VL representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10), ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um domínio VH com a sequência de aminoácidos do domínio VH representado em qualquer uma das SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5 e/ou um domínio VL com a sequência de aminoácidos do domínio VL representado em qualquer uma das SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, ou 10.
Uma composição tal como é descrita neste na gestão, no documento para utilização na prevenção 72 tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (a) um domínio VH com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID N°:l e um domínio VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:82, 6 ou 83; (b) um domínio VH com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID N°:2 e um domínio VL com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID N°:7; (c) um domínio VH com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:3 e um domínio VL com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:8; (d) um domínio VH com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:4 e um domínio VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:90, 9, 91 ou 92; ou (e) um domínio VH com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:5 e um domínio VL com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID N°:10. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua um domínio VH com a sequência de aminoácidos do domínio VH de um anticorpo com o N°. de 73
Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) e/ou um domínio VL com a sequência de aminoácidos do domínio VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (a) um dominio VH com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El) e um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El); (b) um domínio VH com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13) e um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13); (c) um domínio VH com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63) e um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63); (d) um domínio VH com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19) e um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19); ou (e) um domínio VH com a sequência de 74 aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23) e um domínio VL com a sequência de aminoácidos de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23). Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR1 de VH com a sequência de aminoácidos da CDR1 de VH de qualquer uma das regiões da VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR2 de VH com a sequência de aminoácidos da CDR2 da VH de qualquer uma das regiões de VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 de VH de qualquer 75 uma das regiões de VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5. Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR1 de VH e/ou uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH independentemente seleccionadas de entre uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, tais como representadas em qualquer uma das regiões de VH representadas pelas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 ou 5.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma ou mais CDR de VL (isto é, CDRl de VL, CDR2 de VL, e/ou CDR3 de VL) com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR da VL (isto é, a CDRl da VL, a CDR2 da VL e/ou a CDR3 da VL) de El, E13, E63, F19, e/ou F23; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23); ou qualquer combinação destas.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por 76 hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (1) um domínio VH que tenha (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH respectivamente com as sequências de aminoácidos representadas nas SEQ ID Nos :11, 12 e/ou 13, (b) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH respectivamente com as sequências de aminoácidos representadas nas SEQ ID Nos: 14, 15 e/ou 16, (c) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH respectivamente com as sequências de aminoácidos representadas nas SEQ ID Nos: 17, 18, e/ou 19, (d) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH respectivamente com as sequências de aminoácidos representadas nas SEQ ID Nos:20, 21 e/ou 22, ou (e) uma
CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH respectivamente com as sequências de aminoácidos representadas nas SEQ ID Nos:23, 24 e/ou 24, e/ou (2) um domínio VL que tenha (a) uma CDR1 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:84, 26 ou 85; uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:86, 27, ou 87; e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:88, 28, ou 89, (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:29, 30 e/ou 31, (c) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:32, 33 e/ou 34, (d) uma CDR1 de VL com a sequência de aminoácidos 77 representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:93, 35, 94, ou 95; uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 97, ou 98; e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 97, ou 98, ou (e) uma CDRl de VL, uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente pelas SEQ ID Nos:38, 39 e/ou 40.
Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (1) um domínio de VH com (a) uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos da CDRl de VH, da CDR2 de VH, e/ou da CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El), (b) uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos de uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13), (c) uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos de uma CDRl de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63), (d) uma CDRl de VH, uma 78 CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos de uma CDRlde VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19), ou (e) a uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com as sequências de aminoácidos de uma CDRlde VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23), e/ou (2) um dominio VL, contendo (a) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729 (El), (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19), ou (e) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23). Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT. 79
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (1) (a) um domínio da VH com uma
CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:ll, 12 e/ou 13, e (b) um domínio da VL com uma CDR1 da VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:84, 2 6 ou 85; uma CDR2 da VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:86, 27, ou 87; e/ou uma CDR3 da VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:88, 28, ou 89; (2) (a) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:14, 15 e/ou 16, e (b) uma CDR1 da VL, uma CDR2 da VL, e/ou uma CDR3 da VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:29, 30 e/ou 31; (3) (a) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:17, 18, e/ou 19, e (b) uma CDR1 da VL, uma CDR2 da VL, e/ou uma CDR3 da VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:32, 33 e/ou 34; (4) (a) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de
aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID 80
Nos:20, 21 e/ou 22, e (b) um domínio da VL com uma CDR1 da VL com a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:93, 35, 94, ou 95; uma CDR2 da VL com uma sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 96, 36, 97, ou 98; e/ou uma CDR3 da VL com uma sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID Nos:96, 36, 97, ou 98; ou (5) (a) um domínio da VH com uma CDRl da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:23, 24 e/ou 24, e (b) uma CDRl da VL, uma CDR2 da VL, e/ou uma CDR3 da VL com as sequências de aminoácidos representadas respectivamente nas SEQ ID Nos:38, 39 e/ou 40. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (1) (a) um domínio da VH com uma CDRl da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos de uma CDRl de VH, CDR2 de VH, e/ou de uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El), and (b) um domínio com uma CDRl de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos de uma CDRl de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma 81 CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729 (El); (2) (a) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e/ou de uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13) e (b) um domínio com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7842 (E13); (3) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e/ou de uma CDR3 de VH de um
anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7818 (E63) e (b) um domínio com uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC (E63); (4) (a) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e/ou de uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19) e (b) um domínio com uma
CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7819 (F19); ou (5) (a) um domínio da VH com uma CDR1 da VH, uma CDR2 da VH, e/ou uma CDR3 da VH, com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e/ou de uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23) e (b) um domínio com uma 82 CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL com as sequências de aminoácidos de uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e/ou uma CDR3 de VL de um anticorpo com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23); um domínio VH com uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, e/ou uma CDR3 de VH de um anticorpo com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7728 (F23). Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDRl de VL com a sequência de aminoácidos da CDRl de VL de qualquer uma das regiões da VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23). Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR2 de VL de qualquer 83 uma das regiões da VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR3 de VL de qualquer uma das regiões da VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) . Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR1 de VL e/ou uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL seleccionadas independentemente de entre as CDRl de VL, as CDR2 de VL, as CDR3 de VL representadas em qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23) . 84
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua (1) um dominio de VH ou uma cadeia com uma ou mais de entre (a) uma CDR1 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDRl de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA- 7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), (b) uma CDR2 de VH com a sequência de aminoácidos de uma CDR2 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas pelas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), ou (c) uma CDR3 de VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID Nos:l, 2, 3, 4 ou 5; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23); e/ou (2) um dominio VL ou cadeia com uma ou mais de entre (a) uma CDRl de VL com a sequência de aminoácidos da CDRl de VL de qualquer uma das regiões VL representadas pelas SEQ ID Nos:82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, 85 PTA-7819, ou ΡΤΑ-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23), (b) uma CDR2 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR2 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas pelas SEQ ID Nos: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E 13, E63, F 19 ou F23), e/ou (c) ) uma CDR3 de VL com a sequência de aminoácidos da CDR3 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas pelas SEQ ID Nos: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92, ou 10; ou as de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (respectivamente El, E13, E63, F19 ou F23).
Uma composição tal como é descrita neste documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT pode incluir um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epitopo de hLIGHT , em que o anticorpo referido inclua uma ou mais CDR de VH e uma ou mais CDR de VL listadas na Tabela I. Em especial, a
especificação presente proporciona uma composição documento para utilização na prevenção, na gestão, no tratamento e/ou na melhoria de uma doença mediada por hLIGHT que inclua um anticorpo que se liga imunoespecificamente to um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo referido inclua uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos :11, i—1 17, 20, ou 23 ) e uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 8 4, 26, in 00 29, 32, 35 ou 38 ); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: co > 86 27, 87, 30 , 33 , 96 u 3 6, 97, 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 8 8, 2 8, 89, 31, 34, 99, . 37 , 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 84 , 26 , 85 , 29 , 32, 35 ou 38); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 2 7, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos : 88, 28, 89, 31, 34, 99 , 37, 100, 101 ou 40); uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23); uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13 , 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 2 7, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ oo 00 co O s Q 1—1 28, 89, 31, 34, 99 , 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos:84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos:ll, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2
de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL
(SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VL
(SEQ ID Nos OO 26, LD OO 29, 32, 35 ou 38) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, oo \—1 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ 87
ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID N0S; 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos: :11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100 , 101 ou 40) ; uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 . de VL (SEQ ID Nos : :84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID
Nos :86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 8 8, 28, 89, 31, 34, 99 , 37, 100, 101 ou 40); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS; 13, \—1 19, 22 ou 25) , uma CDR1 de VL (SEQ ID £ O co co 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, CO 30, 33, 96, 36, 97, 00 σ') ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25 >) , uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos: 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3
de VL (SEQ ID Nos : 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, , 101 ou 40) ; uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos : 11 , 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18 , 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 . de VL (SEQ ID Nos: 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) ; uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, , 17, 20, ou 23 ), uma CDR2 de VH (SEQ ID
Nos : 12, 5, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16 i—1 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 8 6 , 2 7, Γ ΟΟ 30 33, 96, 36, 97, CO ou 39); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 11 88 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40) ; uma CDR1 de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23) , uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos : 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 27, 87, 00 o 33, 96, 36, 97, co ou 39); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos :11, 14, 17 , 20, ou 23) , uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS:12, 15,18,21 ou 24) , uma CDRl de VL (SEQ ID Nos : 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Ν' os : 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20 , ou 23) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos : 8 4, . 26, 85,29,32,35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos : 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 , ou 39) ; uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: :11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR3
de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma VL CDR3 (SEQ ID Nos: 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3
de VH (SEQ ID Nos: 13, \—1 19, 22 ou 25) , uma CDRl de VL (SEQ ID Nos :84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos :86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) , uma CDRl de VL (SEQ ID Nos : 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma . CDR3 de VL (SEQ ID N 03:8 8, 28, 89, 31, 34, 99 , 37, 100, 101 ou 40) ; uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25) , uma CDR2 de VL (SEQ 89 ID Nos : 86 , 27, 00 30, 33, . 96 , 36 , 97, 98, ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, CO QO 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos: 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDRl de VL (SEQ ID OO CQ O 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID !Z! o Cb co 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de
VH (SEQ ID Nos: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ
ID N os: 13 , 16, 19, 22 ou 25), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: OO 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99 , 37, 100 , 101 ou 40); uma CDRl de VH (SEQ ID Nos : 11, 14, 17, 20, ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID
Nos : 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos : 8 4, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39) , e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDRl de VH (SEQ ID NOS:11, i—1 17, 20, ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: 84, 26, 85, 29, 32 , 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33 , 96 , 36, 97, 98, ou 39), e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 8 8, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID Nos:12, 15, 18, 21 ou 24) , uma CDR3 de VH (SEQ ID Nos : 13, 16, 19, 22 ou LO C\l uma CDRl de VL (SEQ ID Nos: 84, , 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) , uma CDR2 de VL (SEQ ID Nos: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39), e uma CDR3 de VL (SEQ ID Nos: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); ou qualquer uma das combinações
das CDR de VH (SEQ ID Nos:ll-25) com as CDR da VL (SEQ ID 90
Nos:26-40) listadas na Tabela I. As CDR da VH e as CDR da VL correspondentes dos N° . de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19, ou F23), também podem ser utilizadas em qualquer uma das combinações listadas acima. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal completamente humano, e/ou um anticorpo antagonista de hLIGHT.
Tal como se descreve com mais pormenor noutro local deste documento, a composição da especificação presente pode ser utilizada quer por si só, quer em combinação com outros compostos ou composições. Além disto, os anticorpos podem também ser fundidos de modo recombinante com um polipéptido heterólogo no seu terminal N ou no C, ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) com polipéptidos ou com outras composições. Por exemplo, podem fundir-se ou conjugar-se de modo recombinante os anticorpos da especificação presente, com moléculas úteis a titulo de marcadores em ensaios de detecção, e com moléculas efectivadoras tais como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos, ou toxinas. Vejam-se, por exemplo, as publicações de PCT WO 92/08.495; WO 91/14.438; WO 89/12.624; e a Patentes U.S. N°. 5.314.995; e a EP 396.387.
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou para inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, ΕΤβΡ e/ou DcR3 num sujeito (por exemplo, um sujeito humano), 91 incluindo administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície de uma célula, ou solúvel) . 0 hLIGHT pode ser uma variante SNP do hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. Uma actividade biológica do hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, também pode ser inibida ou diminuída no sujeito.
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou para inibir a actividade biológica de hLIGHT, tal como na secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, num sujeito (por exemplo, um sujeito humano), que incluem administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipéptido hLIGHT (por exemplo, um HLIGHT expresso à superfície celular), em que a actividade biológica do hLIGHT seja diminuída ou inibida pelo anticorpo. 0 hLIGHT pode ser uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L.
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou para inibir a ligação do hLIGHT a HVEM, ΗΤβΗ e/ou DcR3 numa célula portadora de hLIGHT expresso à sua superfície, levando a célula ao contacto com uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular ou solúvel), tal como um polipéptido hLIGHT, um fragmento de um polipéptido hLIGHT, ou um epítopo de hLIGHT. 0 hLIGHT pode ser uma variante SNP de 92 hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. Também pode ser diminuída ou inibida na célula uma actividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES.
Proporcionam-se neste documento métodos para diminuir ou para inibir uma actividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, numa célula possuindo um receptor de hLIGHT expresso à sua superfície (tal como, HVEM, ΗΤβΗ e/ou Dc3R), levando a célula ao contacto com uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao polipéptido hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expresso à superfície celular, ou solúvel) em que a actividade biológica de hLIGHT seja diminuída ou inibida pelo anticorpo. 0 hLIGHT pode ser uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L.
Podem utilizar-se os anticorpos da especificação presente, por exemplo, para purificar, detectar, e alvejar antigénios de hLIGHT, tanto em métodos de diagnóstico in vitro como terapêuticos in vivo. Por exemplo, os anticorpos modificados podem ser utilizados em imunoensaios para determinar qualitativa e quantitativamente os teores em hLIGHT em amostras biológicas. Veja-se, por exemplo, Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1988). 93 A especificação presente também proporciona métodos para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT pela administração a um sujeito de uma quantidade eficaz de um anticorpo, ou de uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo da especificação presente. Um anticorpo descrito neste documento pode ser substancialmente purificado (isto é, tornado substancialmente isento de substâncias que limitem o seu efeito ou que produzam efeitos colaterais indesejáveis). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano, tal como um anticorpo monoclonal antagonista completamente humano. 0 sujeito a que se administra uma terapia é preferivelmente um mamífero tal como um não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cães, ratos, etc.) ou um primata (por exemplo, um macaco, tal como um macaco cynomolgous, ou um ser humano) . Preferivelmente, o sujeito é um ser humano. Preferivelmente, o sujeito é uma criança humana ou uma criança humana de parto prematuro. 0 sujeito pode ser um humano com uma doença mediada por hLIGHT. São conhecidos diversos sistemas de transporte que se podem utilizar para administrar um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da especificação presente), incluindo, mas não se limitando a, encapsulação em lipossomas, em micropartícuias, em microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o anticorpo, endocitose mediada pelo receptor (veja-se, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), 94 construção de um ácido nucleico como parte de um vector, retroviral ou outro, etc. Incluem-se nos métodos de administrar um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da especificação presente), ou uma composição farmacêutica , mas não se limitam a estes, uma administração parentérica (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, endovenosa e subcutânea), epidural, e mucosal (por exemplo, pela via intranasal e pela oral). Um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da especificação presente), ou uma composição farmacêutica podem ser administrados por via intranasal, intramuscular, endovenosa, ou subcutânea. Os agentes profiláticos ou terapêuticos, ou as composições, podem ser administrados por qualguer via conveniente, por exemplo por infusão ou por injecção de um bolus, por absorção através dos revestimentos dérmicos ou mucocutâneos (por exemplo, pela mucosa oral, pela mucosa intranasal, pela mucosa rectal e intestinal, etc.) e podem ser administrados em conjunto com outros agentes biologicamente activos. A administração pode ser sistémica ou local. Além disto, pode também empregar-se uma administração pulmonar, por exemplo, utilizando um inalador ou um nebulizador, e uma formulação com um agente aerossolizante. Vejam-se, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e as Publicações de PCT Nos. WO 92/19.244, WO 97/32.572, WO 97/44.013, WO 98/31.346, e WO 99/66.903. 95
Pode pretender-se administrar um agente profilático ou terapêutico, ou uma composição farmacêutica da especificação presente localmente, na área que necessita de tratamento. Isto pode ser conseguido, por exemplo, mas de um modo não limitativo, por infusão local, por administração tópica (por exemplo, com um aspersor intranasal), por injecção, ou por intermédio de um implante, sendo o implante referido num material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tal como membranas elásticas, ou fibras. Preferivelmente, quando se administra um anticorpo da especificação presente, deve tomar-se cuidado para se utilizarem materiais aos quais o anticorpo não venha a ser absorvido.
Pode transportar-se um agente profilático ou terapêutico, ou uma composição da especificação presente, numa vesícula, em especial em lipossomas (veja-se Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler (editores), Liss, New York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; veja-se em geral ibid.).
Pode transportar-se um agente profilático ou terapêutico, ou uma composição da especificação presente num sistema para libertação controlada ou prolongada. Numa concretização, pode utilizar-se uma bomba para se conseguir uma libertação controlada ou prolongada (veja-se Langer, acima; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; 96
Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Podem utilizar-se materiais poliméricos para se conseguir uma libertação controlada ou prolongada de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da especificação presente) ou de uma composição da especificação presente (veja-se por exemplo, Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (editores), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Bali (editores), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; veja-se também Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105); Patente U.S. N° . 5.679.377; Patente U.S. N°. 5.916.597; Patente U.S. N° . 5.912.015; Patente U.S. N° . 5.989.463; Patente U.S. N°. 5.128.326; Publicação de PCT N° . WO 99/15.154; e Publicação de PCT N° . WO 99/20.253. Incluem-se nos exemplos de polímeros utilizados em formulações para libertação prolongada, mas eles não se limitam a estes, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) , poli(metacrilato de metilo) , poli(ácido acrílico), poli(etileno com acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianidridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etilenoglicol), polilactidos (PLA), poli(lactidos com glicólidos) (PLGA), e poliortoésteres. Preferivelmente, o polímero utilizado numa formulação para libertação prolongada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, 97 estável durante a armazenagem, estéril, e biodegradável. Pode colocar-se um sistema de libertação prolongada tal como se descreve neste documento na proximidade do alvo terapêutico, isto é, as passagens nasais ou os pulmões, sendo deste modo necessária apenas uma fracção da dose sistémica (veja-se, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, acima, 2, págs. 115-138 (1984)). Estão descritos sistemas de libertação controlada na revisão de Langer (1990, Science 249: 1527-1533) . Pode utilizar-se qualquer técnica do conhecimento dos especialistas para se produzirem formulações de libertação controlada que incluam um ou mais anticorpos da especificação presente. Veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N°. 4.526.938, a publicação de PCT WO 91/05.548, a publicação de PCT WO 96/20.698, Ning et ai., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Câncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397, Cleek
et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF
Antibody for Cardiovascular Application", Proc. Int'l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24: 853-854, e Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized
Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 24: 759-760.
Quando a composição da especificação presente for de um ácido nucleico codificando para um agente profilático 98 ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da especificação presente), pode administrar-se o ácido nucleico in vivo para promover a expressão do seu agente profilático ou terapêutico codificado, construindo-o como parte de um vector de expressão apropriado para o ácido nucleico, e administrando-o de modo a que se torne intracelular, por exemplo, utilizando um vector retroviral (veja-se a patente U.S. N° . 4.980.286), ou por injecção directa, ou utilizando um bombardeamento com micropartículas (por exemplo, uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou revestindo-o com lipidos ou receptores da superfície celular ou agentes transfectantes, ou administrando-o em ligação com um péptido do tipo " homeobox" que se sabe entra no núcleo (veja-se, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1864-1868), etc. Em alternativa, pode introduzir-se um ácido nucleico intracelularmente e incorporar-se no ADN da célula hospedeira para ser expresso por recombinação homóloga.
Uma composição da especificação presente pode conter um, dois ou mais anticorpos da especificação presente. Uma composição da especificação presente pode conter um, dois ou mais anticorpos tal como descritos neste documento e um agente profilático ou terapêutico que não seja um anticorpo descrito neste documento. Preferivelmente, sabe-se que os agentes são úteis para, ou estão correntemente em utilização para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT. Além 99 dos agente profiláticos ou terapêuticos, as composiçoes da especificação presente também podem conter um veiculo.
As composições da especificação presente podem incluir composições de fármacos a granel úteis no fabrico de composições farmacêuticas (por exemplo, composições que sejam adequadas para a administração a um sujeito ou paciente), que se possam utilizar na preparação de formas de dosagem unitárias. Uma composição da especificação presente pode ser uma composição farmacêutica. Estas composições contêm uma quantidade eficaz do ponto de vista profilático ou terapêutico de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos (por exemplo, um anticorpo da especificação presente ou outro agente profilático ou terapêutico), e um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Preferivelmente, formulam-se as composições farmacêuticas de modo a serem adequadas para a via de administração a um sujeito. 0 termo "veiculo" pode referir um diluente, um adjuvante (por exemplo, o adjuvante de Freund (completo ou incompleto) ) , um excipiente, ou um veiculo com o qual é administrado o terapêutico. Estes veiculos farmacêuticos podem ser liquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os com origem no petróleo, em animais, em vegetais ou sintéticos, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e outros adequados. A água é um veiculo preferido quando se administra a composição por via endovenosa. Também se podem empregar 100 soluções salinas e solução aquosa de dextrose e solução em glicerol como veículos líquidos, em especial para soluções injectáveis. Incluem-se nos excipientes farmacêuticos adequados o amido, a glucose, a lactose, a sacarose, a gelatina, malte, arroz, farinha, giz, silicagel, estearato de sódio, monoestearato de glicerilo, talco, cloreto de sódio, leite magro em pó, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e outros semelhantes. A composição, caso tal se pretenda, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes e emulsionantes, ou agentes de tamponização do pH. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações com libertação prolongada e outras semelhantes. Podem incluir-se numa formulação oral veículos padrão tais como graus de pureza farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Estão descritos exemplos de veículos farmacêuticos adequados no Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Estas composições conterão uma quantidade eficaz do ponto de vista profilático ou terapêutico do anticorpo, preferivelmente sob uma forma purificada, em conjunto com uma quantidade adequada do veículo para se proporcionar a forma para uma administração apropriada ao paciente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração.
Preferivelmente formula-se a composição de acordo com processos de rotina, como uma composição farmacêutica adaptada a uma administração endovenosa a seres humanos. 101
Tipicamente, as composições para administração endovenosa são soluções num tampão aquoso isotónico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como a lignocaina, para diminuir a dor no local de injecção. Estas composições, no entanto, podem ser administradas por uma via diferente da endovenosa.
Em geral, os ingredientes das composições da especificação presente são fornecidos quer em separado, quer misturados em conjunto, em formas de unidade de dosagem, por exemplo, sob a forma de um pó liofilizado seco ou a de um concentrado isento de água num contentor hermeticamente selado, tal como uma ampola ou uma saqueta, que indica a quantidade de agente activo. Quando a composição se destina a ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada em conjunto com um frasco para infusão contendo água ou soro salino estéreis de grau de pureza para utilização farmacêutica. Quando a composição é administrada por injecção, pode proporcionar-se uma ampola com água ou soro salino esterilizados para injecção, de modo a que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. A especificação presente também proporciona um anticorpo descrito neste documento que esteja embalado num contentor hermeticamente selado tal como uma ampola ou uma saqueta indicando a quantidade do anticorpo. Pode fornecer-se o anticorpo sob a forma de um pó seco liofilizado ou a 102 de um concentrado isento de água num contentor hermeticamente selado, e pode reconstituir-se, por exemplo, com água ou com soro salino, até à concentração adequada para administração a um sujeito. Preferivelmente, o anticorpo é fornecido sob a forma de um pó seco liofilizado num contentor hermeticamente selado, a uma dosagem unitária de pelo menos 0,1 mg, pelo menos 0,5 mg, pelo menos 1 mg, pelo menos 2 mg, ou pelo menos 3 mg, e mais preferivelmente de pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 60 mg, pelo menos 75 mg, pelo menos 80 mg, pelo menos 85 mg, pelo menos 90 mg, pelo menos 95 mg, ou pelo menos 100 mg. Pode armazenar-se o anticorpo liofilizado a entre 2 e 8°C no seu contentor original e pode administrar-se o anticorpo após a sua reconstituição, nas primeiras 12 horas, preferivelmente nas primeiras 6 horas, nas primeira 5 horas, nas primeira 3 horas, ou na primeira hora. Um anticorpo descrito neste documento pode ser fornecido sob a forma de um liquido num contentor hermeticamente selado indicando a quantidade e a concentração do anticorpo. Preferivelmente, a forma liquida do anticorpo é fornecida num contentor hermeticamente selado a pelo menos 0,1 mg/mL, pelo menos 0,5 mg/mL, ou pelo menos 1 mg/mL, e mais preferivelmente a pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/mL, pelo menos 25 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 60 mg/mL, pelo menos 70 mg/mL, pelo menos 80 mg/mL, pelo menos 90 mg/mL, ou pelo menos 100 mg/mL. 103
Podem formular-se as composições da especificação presente sob as formas neutra ou as de sal. Incluem-se nos sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico os formados com aniões tais como os derivados do ácido clorídrico, do ácido fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., o os formados com catiões tais como os derivados dos hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, férrico, de isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.
Pode determinar-se a quantidade de um agente profiláctico ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da especificação presente), ou de uma composição descrita neste documento que serão eficazes na prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT, por técnicas clínicas padrão.
Deste modo, podem administrar-se gamas de dosagem de um anticorpo ou de uma composição que originem títulos sorológicos de entre cerca de 0,1 pg/mL e cerca de 450 pg/mL, em algumas concretizações de pelo menos 0,1 pg/mL, pelo menos 0,2 pg/mL, pelo menos 0,4 pg/mL, pelo menos 0,5 pg/mL, pelo menos 0,6 pg/mL, pelo menos 0,8 pg/mL, pelo menos 1 pg/mL, pelo menos 1,5 pg/mL, and preferivelmente pelo menos 2 pg/mL, pelo menos 5 pg/mL, pelo menos 10 pg/mL, pelo menos 15 pg/mL, pelo menos 20 pg/mL, pelo menos 25 pg/mL, pelo menos 30 pg/mL, pelo menos 35 pg/mL, pelo menos 40 pg/mL, pelo menos 50 pg/mL, pelo menos 75 pg/mL, 104 pelo menos 100 pg/mL, pelo menos 125 pg/mL, pelo menos 150 pg/mL, pelo menos 200 pg/mL, pelo menos 250 pg/mL, pelo menos 300 pg/mL, pelo menos 350 pg/mL, pelo menos 400 pg/mL, ou pelo menos 450 pg/mL a um ser humano para a prevenção, gestão, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada por hLIGHT. Além disto, podem conduzir-se ensaios in vitro opcionalmente, para identificar as gamas de dosagem óptimas. O valor exacto da dose a empregar na formulação também dependerá da via de administração, e da gravidade de uma doença mediada por hLIGHT, e deve ser decidido de acordo com o critério de um médico assistente e com as circunstâncias de cada paciente.
Podem extrapolar-se os valores das doses a partir de curvas de dose reacção derivadas de experiências in vitro ou de testes em sistemas de modelos em animais.
Para os anticorpos da especificação presente, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente de entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg da massa corporal do paciente. Em algumas concretizações, a dosagem administrada ao paciente é de entre cerca de 1 mg/kg e cerca de 75 mg/kg da massa corporal do paciente. Preferivelmente, a dosagem administrada a um paciente é de entre 1 mg/kg e 20 mg/kg da massa corporal do paciente, mais preferivelmente 1 mg/kg a 5 mg/kg da massa corporal do paciente. Em geral, os anticorpos humanos têm vidas médias mais longas dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies, devido à reacção imunológica aos polipéptidos estranhos. 105
Deste modo, são necessárias menores dosagens de anticorpos humanos e uma administração menos frequente é em geral possível. Além disto, a dosagem e a frequência de administração dos anticorpos da especificação presente pode ser diminuída aumentando a absorção dos anticorpos e a sua penetração nos tecidos recorrendo a modificações tais como, por exemplo, a lipidação.
Podem administrar-se cerca de 100 mg/kg ou menos, cerca de 75 mg/kg ou menos, cerca de 50 mg/kg ou menos, cerca de 25 mg/kg ou menos, cerca de 10 mg/kg ou menos, cerca de 5 mg/kg ou menos, cerca de 1 mg/kg ou menos, cerca de 0,5 mg/kg ou menos, ou cerca de 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo da especificação presente, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou, preferivelmente, 1 vez, para se gerir uma doença mediada por hLIGHT. Um anticorpo da especificação presente pode ser administrado cerca de 1-12 vezes, sendo que as doses podem ser administradas consoante necessário, por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, bimensalmente, trimensalmente, etc., tal como seja determinado por um médico. Uma dose inferior (por exemplo, 1-15 mg/kg) pode ser administrada mais frequentemente (por exemplo, 3-6 vezes). Uma dose maior (por exemplo, 25-100 mg/kg) pode ser administrada menos frequentemente (por exemplo, 1-3 vezes). No entanto, tal como será aparente aos conhecedores da técnica, são facilmente determináveis outras quantidades e outras periodicidades de doseamento. 106
Podem administrar-se a um sujeito cerca de 100 mg/kg, cerca de 75 mg/kg ou menos, cerca de 50 mg/kg ou menos, cerca de 25 mg/kg ou menos, cerca de 10 mg/kg ou menos, cerca de 5 mg/kg ou menos, cerca de 1 mg/kg ou menos, cerca de 0,5 mg/kg ou menos, cerca de 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo da especificação presente numa formulação com libertação prolongada, preferivelmente a um ser humano, para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT. Pode administrar-se a um sujeito, preferivelmente a um ser humano, um bolus de um anticorpo da especificação presente que não esteja numa formulação com libertação prolongada, contendo cerca de 100 mg/kg, cerca de 75 mg/kg ou menos, cerca de 50 mg/kg ou menos, cerca de 25 mg/kg ou menos, cerca de 10 mg/kg ou menos, cerca de 5 mg/kg ou menos, cerca de 1 mg/kg ou menos, cerca de 0,5 mg/kg ou menos, ou cerca de 0,1 mg/kg ou menos do anticorpo da especificação presente, para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT, e ao fim de um determinado período de tempo, administrar-se ao sujeito referido (por exemplo, por via intranasal ou intramuscular) duas, três ou quatro vezes (preferivelmente uma vez), um anticorpo da especificação presente numa formulação de libertação prolongada, contendo cerca de 100 mg/kg, cerca de 75 mg/kg ou menos, cerca de 50 mg/kg ou menos, cerca de 25 mg/kg ou menos, cerca de 10 mg/kg ou menos, cerca de 5 mg/kg ou menos, cerca de 1 mg/kg ou menos, cerca de 0,5 mg/kg ou menos, ou cerca de 0,1 mg/kg ou menos da referida formulação. O período de tempo 107 referido pode ser de entre 1 e 5 dias, de uma semana, de duas semanas, ou de um mês.
Pode administrar-se uma dose única de um anticorpo da especificação presente a um paciente para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze vezes, treze, catorze, quinze, dezasseis, dezassete, dezoito, dezanove, vinte, vinte e uma, vinte e duas, vinte e : três, vinte e quatro, vinte e cinco ou vinte e seis vezes a intervalos quinzenais (po r exemplo, de 14 em 14 dias), ao longo de um ano, em que a dose seja seleccionada de entre o conjunto constituído por cerca de 0, 1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de ! 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg , ou uma combinação destas (isto é, cada dose quinzenal pode ser ou não idêntica).
Pode administrar-se uma dose única de um anticorpo da especificação presente a um paciente para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, ou doze vezes a intervalos de cerca de um mês (por exemplo, de cerca de 30 dias), ao longo de um ano, em 108 que a dose seja seleccionada de entre o conjunto constituído cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, ou uma combinação destas (isto é, cada dose mensal pode ser ou não idêntica).
Pode administrar-se uma dose única de um anticorpo da especificação presente a um paciente para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT, duas, três, quatro, cinco, ou seis vezes a intervalos aproximadamente bimensais (por exemplo, de 60 em 60 dias), ao longo de um ano, em que a dose seja seleccionada de entre o conjunto constituído cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 > mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, ou uma ( combinação destas (isto é, cada dose bimensal pode ser ou não idêntica). 109
Pode administrar-se uma dose única de um anticorpo da especificação presente a um paciente para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT, duas, três, ou quatro vezes a intervalos aproximadamente bimensais (por exemplo, de 90 em 90 dias), ao longo de um ano, em que a dose seja seleccionada de entre o conjunto constituído cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, ou uma combinação destas (isto é, cada dose trimensal pode ser ou não idêntica). A via de administração de uma dose de um anticorpo da especificação presente a um paciente pode ser intranasal, intramuscular, endovenosa, ou uma combinação destas, mas também são aceitáveis outras vias descritas neste documento. Pode administrar-se cada uma das doses pela mesma via de administração, ou não. Pode administrar-se um anticorpo da especificação presente recorrendo a múltiplas vias de administração, em simultâneo ou subsequentemente para as outras doses do mesmo anticorpo, ou de outro anticorpo da especificação presente. 110
Podem administrar-se os anticorpos da especificação presente a titulo profiláctico ou terapêutico a um sujeito. Podem administrar-se os anticorpos da especificação presente a título profiláctico ou terapêutico a um sujeito para evitar, diminuir ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT ou um seu sintoma.
TERAPIA GENÉTICA
Administram-se ácidos nucleicos incluindo sequências codificando para anticorpos tais como os descritos neste documento ou seus derivados funcionais, para evitar, gerir, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT através de uma terapia genética. A terapia genética designa uma terapia levada a cabo através da administração a um sujeito de um ácido nucleico expresso ou expressável. Os ácidos nucleicos podem produzir o anticorpo que eles codificam, e o anticorpo media um efeito profiláctico ou terapêutico.
Pode utilizar-se qualquer um dos métodos de terapia genética disponíveis na técnica de acordo com a especificação presente. Descrevem-se adiante métodos exemplificativos.
Pode encontrar-se uma revisão geral dos métodos da terapia genética em Goldspiel et al., 1993, Clinicai Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573- 111 596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; e em Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215. Estão descritos os métodos habitualmente conhecidos na técnica de ADN recombinante e que se podem utilizar em Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e em Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
Preferivelmente a composição da especificação presente inclui ácidos nucleicos codificando para um anticorpo da especificação presente, fazendo os ácidos nucleicos referidos parte de um vector de expressão que expressa o anticorpo ou as suas proteínas quiméricas ou as suas cadeias leve ou pesada, num hospedeiro apropriado. Em especial, estes ácidos nucleicos têm promotores, preferivelmente promotores heterólogos, ligados operacionalmente à região codificante para o anticorpo, sendo o promotor referido induzível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico do tecido. Noutra concretização específica, são utilizadas moléculas de ácido nas quais as sequências de codificação do anticorpo e quaisquer outras sequências pretendidas estejam flanqueadas por regiões que promovam a recombinação homóloga num local pretendido do genoma, proporcionando deste modo uma expressão intracromossómica dos ácidos nucleicos que codificam para o anticorpo (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438) . A molécula de anticorpo expressa pode ser a de um 112 anticorpo de cadeia singela; em alternativa, as sequências de ácido nucleico podem incluir sequências que codificam tanto para a cadeia leve como para a pesada, ou para seus fragmentos, do anticorpo. 0 transporte dos ácidos nucleicos para dentro de um sujeito pode ser quer directo, caso no qual o sujeito é directamente exposto ao ácido nucleico ou a vectores que transportam o ácido nucleico, quer indirecto, caso em que se transformam primeiro células com os ácidos nucleicos in vitro, e depois se transplantam no sujeito. Estas duas metodologias são conhecidas, respectivamente, por terapia genética in vivo ou ex vivo.
Podem administrar-se directamente as sequências de ácido nucleico in vivo, em que as sequências estão expressas para produzirem o produto codificado. Isto pode ser conseguido por uma de entre muitas maneiras conhecidas na técnica, por exemplo, construindo-os como parte de um vector apropriado de expressão de ácido nucleico e administrando o vector de modo a que as sequências se tornem intracelulares, por exemplo, por infecção utilizando retrovirais defeituosos ou atenuados, ou outros vectores virais (veja-se a Patente U.S. N° . 4.980.286), ou por injecção directa de ADN nu, ou utilizando um bombardeamento com microparticulas (por exemplo, uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou revestindo com lipidos ou com receptores da superfície celular ou agentes transfectantes, por encapsulação em lipossomas, micropartículas, ou 113 microcápsulas, ou administrando-os em ligação com um péptido que se saiba penetrar no núcleo, administrando-o em ligação com um ligando sujeito a endocitose mediada pelo receptor (veja-se, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) (que se pode utilizar para alvejar tipos de células que expressem especificamente os receptores), etc. Podem formar-se complexos de ácido nucleico com ligando nos quais o ligando inclua um péptido virai fusogénico para quebrar endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação dos lisossomas. Pode alvejar-se o ácido nucleico in vivo para absorção especifica e expressão em células, alvejando um receptor bem determinado (vejam-se, por exemplo, as publicações de PCT WO 92/06.180; WO 92/22.635; WO 92/20.316; W0 93/14.188, WO 93/20.221) . Em alternativa, pode introduzir-se o ácido nucleico intracelularmente e incorporar-se no ADN da célula hospedeira para expressão, por recombinação homóloga (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
Podem utilizar-se vectores virais que contenham sequências de aminoácidos codificando para um anticorpo da especificação presente. Por exemplo, pode utilizar-se um vector retroviral (veja-se Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Estes vectores retrovirais contêm as componentes necessárias para a embalagem correcta do genoma virai e a sua integração no ADN da célula hospedeira. Podem clonar-se as sequências de ácido nucleico que codificam para o anticorpo a utilizar na terapia 114 genética em um ou mais vectores, o que facilita o transporte do gene para dentro de um sujeito. Podem encontrar-se mais detalhes acerca de vectores retrovirais em Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302, em que se descreve a utilização de um vector retroviral para fazer a entrega do gene mdr 1 a células estaminais hematopoiéticas para tornar essas células estaminais mais resistentes a uma quimioterapia. Outras referências nas quais se ilustra a utilização de vectores retrovirais na terapia genética são: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Klein et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons e Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; e Grossman e Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3: 110-114.
Os adenovirus são outros vectores virais que se podem utilizar em terapia genética. Os adenovirus são veículos especialmente atraentes para transportar genes para epitélios respiratórios. Os adenovirus infectam naturalmente os epitélios respiratórios nos quais provocam uma doença ligeira. Outros alvos dos sistemas de entrega baseados em adenovirus são o fígado, o sistema nervoso central, as células endoteliais, e o músculo. Os adenovirus têm a vantagem de serem capazes de infectar células que não se dividem. Kozarsky e Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 apresentam uma revisão de terapia genética baseada em adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demonstraram a utilização de vectores de adenovirus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Podem encontrar- 115 se outros casos de utilização de adenovirus em terapia genética em Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234; na Publicação de PCT WO 94/12.649; e em Wang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783. Numa concretização preferida, são utilizados vectores de adenovirus.
Também foram propostos vírus adeno-associados (AAV) para utilização em terapia genética (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300; e na Patente U.S. N°. 5.436.146).
Outra metodologia em terapia genética envolve transferir um gene para células que estejam em cultura de tecidos, por métodos tais como electroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, ou infecção virai. Em geral, o método de transferência inclui a transferência de um marcador seleccionável para as células. Colocam-se então as células sob selecção para se isolarem aquelas células que o absorveram e expressa-se o gene transferido. Estas células são então administradas a um sujeito.
Pode introduzir-se o ácido nucleico numa célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Uma tal introdução pode ser levada a cabo por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não se limitando a, transfecção, electroporação, 116 microinjecção, infecção com um vector virai ou com um bacteriófago contendo as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência de gene mediada por cromossoma, transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. São conhecidas na técnica diversos processos para se introduzirem genes exteriores em células (vejam-se, por exemplo, Loeffler e Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Clin. Pharma. Ther. 29: 69-92 (1985)) e eles podem ser utilizados de acordo com a especificação presente, desde que as funções de desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células destinatárias não sejam comprometidas. A metodologia deverá proporcionar uma transferência estável do ácido nucleico para a célula, de modo a que o ácido nucleico seja expressável pela célula e preferivelmente herdável e expressável pela prole.
Pode veicular-se as células recombinantes obtidas a um sujeito por diversos métodos conhecidos na técnica. Administram-se células sanguíneas recombinantes (por exemplo, células estaminais hematopoiéticas ou células progenitoras) preferivelmente por via endovenosa. A quantidade de células que se encara utilizar depende do efeito pretendido, do estado do paciente, etc., e pode ser determinada por indivíduos com conhecimentos da técnica.
As células nas quais se pode introduzir um ácido nucleico para se levar a cabo terapia genética incluem 117 qualquer tipo de célula viável que se pretenda, e esteja disponível, incluindo mas não se limitando a células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células do sangue tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; diversas células estaminais ou progenitoras, em especial células estaminais hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, tal como se podem obter da medula óssea, do sangue do cordão umbilical, do sangue periférico, do fígado fetal, etc. A célula utilizada para a terapia genética pode ser autóloga em relação ao sujeito.
Quando se utilizam células recombinantes na terapia genética, podem introduzir-se sequências de ácido nucleico codificando para um anticorpo da especificação presente nas células de tal modo que elas sejam expressáveis pelas células e pelas suas descendentes, administrando-se então as células recombinantes in vivo para se obterem efeitos terapêuticos. Podem utilizar-se células estaminais ou progenitoras. Podem utilizar-se potencialmente quaisquer células estaminais e/ou progenitoras que se consigam isolar e manter in vitro, de acordo com esta concretização da especificação presente (vejam-se por exemplo, a Publicação de PCT WO 94/08.598; Stemple e Anderson, 1992, Cell 71: 973-985; Rheinwald, 118 1980, Meth. Cell Βίο. 21A:2 29; e Pittelkow e Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771). 0 ácido nucleico que se introduz com o objectivo de terapia genética pode incluir um promotor induzível ligado operacionalmente com a região de codificação, de tal modo que a expressão do ácido nucleico seja controlável quando se controlar a presença ou a ausência do indutor apropriado para a transcrição.
UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS EM DIAGNÓSTICO
Podem utilizar-se anticorpos marcados da especificação presente e os seus derivados e análogos, que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT, com objectivos de diagnóstico para detectar, diagnosticar, ou monitorizar uma doença mediada por hLIGHT. A especificação presente proporciona métodos para a detecção de uma doença mediada por hLIGHT que incluem: (a) ensaiar-se a expressão de um antigénio hLIGHT em células ou numa amostra de tecido de um sujeito, utilizando um ou mais anticorpos da especificação presente que se ligam imunoespecificamente ao antigénio hLIGHT; e (b) comparar-se o teor em antigénio hLIGHT com um teor de controlo, por exemplo, os teores em amostras de tecido normal (por exemplo, de um paciente que não sofra de uma doença mediada por hLIGHT, ou do mesmo paciente antes do inicio da doença), em que um aumento do teor determinado de antigénio hLIGHT em comparação com o 119 teor de controlo do antigénio hLIGHT é indicativo de uma doença mediada por hLIGHT. A especificação presente proporciona um ensaio de diagnóstico para diagnosticar uma doença mediada por hLIGHT, que inclui: (a) ensaiar-se o teor num antigénio hLIGHT em células ou numa amostra de um tecido de um indivíduo, utilizando um ou mais anticorpos da especificação presente que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT; e (b) compararem-se os teores de antigénio hLIGHT com um teor de controlo, por exemplo, os teores em amostras de tecido normal, em que um aumento do antigénio hLIGHT determinado em comparação com o teor do antigénio hLIGHT no controlo é indicativo de uma doença mediada por hLIGHT. Um diagnóstico mais definitivo de uma doença mediada por hLIGHT pode permitir aos profissionais de saúde empregarem medidas preventivas ou tratamento agressivo mais cedo, evitando deste modo o desenvolvimento de uma maior progressão da doença mediada por hLIGHT.
Podem utilizar-se os anticorpos da especificação presente para determinar os teores em antigénio hLIGHT numa amostra biológica utilizando métodos imunohistológicos clássicos tal como se descrevem neste documento ou como são do conhecimento dos especialistas da técnica (por exemplo, vejam-se Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; e Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Incluem-se noutros métodos baseados em anticorpos para detectar a expressão genética de proteina os 120 imunoensaios, tal como o ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). São conhecidos na técnica marcadores adequados para ensaios de anticorpos e neles se incluem enzimas marcadores, tais como a glucose oxidase; radioisótopos, tais como de iodo (125I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H) , índio (121In), e tecnécio (99Tc); marcadores luminescentes, tais como o luminol; e marcadores fluorescentes, tais como a fluoresceína e a rodamina, bem como a biotina.
Um aspecto da especificação presente é a detecção e o diagnóstico de uma doença mediada por hLIGHT num ser humano. O diagnóstico pode incluir: a) administrar-se (por exemplo, por via parentérica, subcutânea, ou intraperitoneal) a um sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo marcado que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT; b) esperar durante um intervalo de tempo após a administração para permitir que o anticorpo marcado se concentre preferencialmente em locais do sujeito aonde esteja expresso o antigénio hLIGHT (e para a molécula marcada depois de se desligar, ser eliminada até ao nível de base); c) determinar o nível de base; e d) detectar o anticorpo marcado no sujeito, de tal modo que a detecção do anticorpo marcado acima do valore de base indica que o sujeito é portador de uma doença mediada por hLIGHT. Pode determinar-se o nível de base por diversos métodos, incluindo comparar-se a quantidade de molécula marcada detectada com um valor padrão previamente determinado para um determinado sistema. 121
Entender-se-á na técnica que as dimensões do sujeito e o sistema de imagiologia utilizado determinarão a quantidade de espécie alvo da imagiologia que é necessária para originar imagens para diagnóstico. No caso de uma espécie que seja um radioisótopo, para um sujeito humano, a quantidade de radioactividade que se injecta será normalmente de entre cerca de 5 e 20 milicuries de 99Tc. O anticorpo marcado acumular-se-á então preferencialmente nos locais das células que contenham a proteína específica. Descreve-se a imagiologia in vivo de tumores em S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Capítulo 13 no Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Câncer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, editores, Masson Publishing Inc. (1982) .
Dependendo de diversas variáveis, incluindo o tipo de marcador utilizado e o modo de administração, o intervalo de tempo a seguir à administração para permitir que o anticorpo marcado se acumule preferencialmente em determinados locais do sujeito, e o intervalo de tempo para o anticorpo marcado não ligado ser eliminado até ao nível de base é de entre 6 e 48 horas ou de entre 6 e 24 horas ou de entre 6 e 12 horas. O intervalo de tempo a seguir à administração pode ser de 5 a 20 dias ou de 5 a 10 dias.
Pode levar-se a cabo a monitorização de uma doença mediada por hLIGHT repetindo o método de diagnóstico 122 de uma doença mediada por hLIGHT, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial, etc.
Pode detectar-se no sujeito a presença da molécula marcada utilizando métodos conhecidos na técnica para imagiologia in vivo. Estes métodos dependem do tipo de marcador utilizado. Os técnicos experientes serão capazes de determinar o método apropriado para detectar um marcador especifico. Incluem-se nos métodos e nos dispositivos que se podem utilizar nos métodos de diagnóstico da especificação presente, mas não se limitam a estes, a tomografia computadorizada (CT), varrimentos do corpo inteiro tais como na tomografia de emissão do positrão (PET), imagiologia por ressonância magnética (MRI), e sonografia.
Pode marcar-se a molécula com um radioisótopo e detectar-se no paciente utilizando um instrumento cirúrgico que responda à radiação (Thurston et al., Patente U.S. N°. 5.441.050). Pode marcar-se a molécula com um composto fluorescente e detectar-se no paciente utilizando um instrumento de varrimento sensível à fluorescência. Pode marcar-se a molécula com um metal emissor de positrão e detectar-se no paciente utilizando a tomografia de emissão do positrão. Pode marcar-se a molécula com um marcador paramagnético e detectar-se num paciente utilizando imagiologia de ressonância magnética (MRI). 123
MÉTODOS DE PRODUZIR ANTICORPOS
Podem produzir-se anticorpos da especificação presente que se ligam imunoespecificamente a um antigénio por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica para a síntese de anticorpos, em especial, por síntese química ou preferivelmente, por técnicas de expressão recombinantes. A prática da especificação presente emprega, a não ser aonde se indicar algo em contrário, técnicas convencionais da biologia molecular, da microbiologia, da análise genética, de ADN recombinante, de química orgânica, de bioquímica, PCR, de síntese de oligonucleótidos e sua modificação, de hibridização de ácido nucleico, e de domínios relacionados com estes e adentro dos conhecimentos da técnica. Estas técnicas encontram-se descritas nas suas referências citadas neste documento e estão completamente explicadas na literatura. Vejam-se, por exemplo, Maniatis et ai. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 e os seus suplementos anuais); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 e os seus suplementos anuais); Gait (editor) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (editor) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL 124
Press; Birren et ai. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Os anticorpos policlonais que se ligam imunoespecificamente a um antigénio podem ser produzidos por diversos procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, pode administrar-se um antigénio humano a diversos animais hospedeiros, incluindo, mas não se limitando a, coelhos, murganhos, ratos, etc. para se induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antigénio. Podem utilizar-se diversos adjuvantes para aumentar a reacção imunológica, dependendo da espécie de hospedeiro, e neles se incluem mas não se limitam a, o de Freund (completo e incompleto), geles minerais tais como de hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas tais como a lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianinas, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Estes adjuvantes também são bem conhecidos na técnica.
Podem preparar-se anticorpos monoclonais utilizando diversas metodologias conhecidas na técnica, incluindo a utilização de um hibridoma, a recombinante, e as tecnologias de apresentação de fagos, ou uma combinação delas. Por exemplo, podem produzir-se anticorpos monoclonais utilizando técnicas de hibridoma incluindo as bem conhecidas e que são ensinadas, por exemplo, em Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring 125
Harbor Laboratory Press, 2a edição 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). 0 termo "anticorpo monoclonal", tal como se utiliza neste documento, não se limita a anticorpos produzidos por tecnologias de hibridoma. São descritos outros métodos exemplificativos de produzir anticorpos monoclonais noutros locais deste documento, tais como por exemplo, a utilização do murganho KM™. Nos Exemplos neste documento são proporcionados métodos exemplificativos adicionais de produzir anticorpos monoclonais.
Os métodos para produzir e para despistar anticorpos específicos recorrendo à tecnologia de hibridoma são de rotina e bem conhecidos na técnica. Em suma, podem imunizar-se murganhos com um antigénio hLIGHT e quando se detecta uma reacção imunológica, por exemplo, detectam-se anticorpos específicos contra o antigénio hLIGHT no soro do murganho, recolhe-se o baço do murganho e isolam-se os esplenócitos. Fundem-se então os esplenócitos por técnicas bem conhecidas com quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo células da linha de células SP20 disponível junto da ATCC. Seleccionam-se os hibridomas e clonam-se por diluição limitada.
Além disto, pode utilizar-se uma técnica de RIMMS (locais múltiplos de imunização repetitivos) para imunizar um animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16: 381-9. Ensaiam-se então os clones de hibridoma por métodos bem 126 conhecidos na técnica para detectar células que segregam anticorpos capazes de se ligar a um polipéptido da especificação presente. Pode gerar-se fluido de áscitos, que em geral contém teores elevados em anticorpos, imunizando murganhos com clones de hibridomas positivos. deste modo, a especificação presente proporciona métodos para gerar anticorpos a partir de culturas de células hibridoma que segregam um anticorpo modificado da especificação presente em que, preferivelmente, o hibridoma é gerado fundido esplenócitos isolados de um murganho imunizado com um antigénio de hLIGHT com células de mieloma, e depois despistando nos hibridomas resultantes a fusão de clones de hibridoma que segreguem um anticorpo capaz de se ligar a um antigénio hLIGHT.
Podem gerar-se fragmentos de anticorpo que reconhecem antigénio hLIGHT específicos por qualquer uma das técnicas conhecidas dos especialistas. Por exemplo, podem produzir-se os fragmentos Fab e F(ab'>2 da especificação presente por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2)· Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o dominio CHI da cadeia pesada. Além disto, os anticorpos da especificação presente também podem ser gerados utilizando diversos métodos de apresentação de fagos conhecidos na técnica. 127
Por exemplo, também se podem gerar anticorpos utilizando diversos métodos de apresentação de fagos. Nos métodos de apresentação de fagos, apresentam-se domínios funcionais de anticorpo à superfície das partículas de fago que transportam as sequências de polinucleótido que os codificam. Em especial, amplificam-se as sequências de ADN que codificam para os domínios VH e VL a partir de bibliotecas de cADN animais (por exemplo, bibliotecas de cADN humanos ou murinos de tecidos afectados) . Os ADN que codifica para os domínios VH e VL são recombinados em conjunto com um agente de ligação scFv, por PCR, e clonados num vector fagemídeo. Electropora-se o vector em E. coli e infecta-se o E. coli com fago ajudante. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 e os domínios VH e VL são em geral fundidos quer ao gene III, quer ao gene VIII do fago. Podem seleccionar-se ou identificar-se fagos que expressem um domínio de ligação a antigénio que se liga a um antigénio específico, usando o antigénio, por exemplo, utilizando o antigénio marcado ou antigénio ligado ou capturado sobre uma superfície sólida ou de uma pérola. Incluem-se nos exemplos de métodos de apresentação de fagos que se podem utilizar para se produzirem os anticorpos da especificação presente, os descritos em Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; Pedido de 128
PCT N°. PCT/GB91/01.134; Publicações Internacionais Nos. WO 90/02. 809, WO 91 /10.73 7, . WO 92/01 .047, WO 92/] L8.619 , WO 93/11. 236, WO 95/: 15.982 r WO 95/2 0.4( 01, e WO 97/13 .8 44; e as Patentes U.S • Nos. 5 .698. 426, 5.223 . 409, 5.403. 484, 5.580. 717, 5 . , 427 .908, 5.750 . 753, 5.821 .047, 5.571. 698, 5.427. 908, 5 . 516 , .637, 5 . 780 . 225, 5.658. 727, 5. 733.743 e 5.969.108.
Tal como se descreve nas referências acima, depois da selecção de fagos, as regiões de codificação do anticorpo provenientes do fago podem ser isoladas para se gerarem anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou quaisquer outros fragmentos que se liguem a antigénio, e expressar-se em qualquer hospedeiro que se pretenda, incluindo células de mamíferos, células de insecto, células de planta, de levedura, e de bactérias, por exemplo, tal como se descreve adiante. Também se podem utilizar técnicas para produzir recombinantemente os fragmentos Fab, Fab' and F(ab')2 utilizando métodos conhecidos na técnica tais como os descritos na publicação de PCT N°. WO 92/22.324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; e em Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043.
Para gerar anticorpos inteiros, podem utilizar-se iniciadores de PCR incluindo sequência nucleotídicas de VH ou VL, um local de restrição, e uma sequência flanqueante para proteger o local de restrição utilizado para amplificar as sequências de VH ou der VL em clones scFv. 129
Utilizando as metodologias de clonagem conhecidas dos especialistas da técnica, podem clonar-se os domínios VH amplificados por PCR em vectores que expressem uma região constante de VH, por exemplo, a região constante humana gama 4, e podem clonar-se os domínios VL amplificados por PCR em vectores que expressem uma região constante de VL, por exemplo, as regiões constantes humanas kapa ou lambda. Podem também clonar-se os domínios VH e VL num vector que expresse as regiões constantes necessárias. Os vectores de conversão da cadeia pesada e os vectores de conversão da cadeia leve são então co-transfectados em linhas de células para se gerarem linhas de células estáveis ou temporárias que expressam anticorpos de comprimento inteiro, por exemplo, IgG, utilizando metodologias do conhecimento dos especialistas da técnica.
Para algumas utilizações, incluindo a utilização in vivo dos anticorpos em seres humanos e em ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos humanos ou quiméricos. São especialmente desejáveis anticorpos completamente humanos para o tratamento terapêutico de sujeitos humanos. Podem fabricar-se anticorpos humanos por uma série de processos conhecidos na técnica, incluindo os métodos de apresentação de fagos descritos acima, utilizando bibliotecas de anticorpos derivados de sequências de imunoglobulina humana. Vejam-se também as Patentes U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e as Publicações Internacionais Nos. WO 98/46.645, WO 98/50.433, 130 WO 98/24.893, WO 98/16.654, WO 96/34.096, WO 96/33.735, e WO 91/10.741.
Preferivelmente, produzem-se anticorpos humanos. Podem produzir-se anticorpos humanos e/ou anticorpos completamente humanos utilizando qualquer dos métodos conhecidos na técnica, incluindo os dos Exemplos proporcionados neste documento. Por exemplo, recorrendo a murganhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas funcionais endógenas, mas que conseguem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, podem introduzir-se aleatoriamente complexos de genes de cadeias leve e pesada de imunoglobulina humana, ou por recombinação homóloga, em células estaminais embriónicas de murganhos. Em alternativa, podem introduzir-se a região variável humana, a região constante humana, e a região de diversidade humana em células estaminais embriónicas de murganho, além dos genes das cadeias leve e pesada humanas. Em separado ou em simultâneo com a introdução dos locais de imunoglobulina humana por recombinação homóloga, podem tornar-se não funcionais os genes de imunoglobulina do murganho. Em especial, a eliminação homozigótica da região JH evita a produção endógena de anticorpos. Expandem-se então as células estaminais embriónicas modificadas e microinjectam-se em blastoquistos para se produzirem murganhos quiméricos. Reproduzem-se então os murganhos quiméricos para se produzirem descendentes homozigóticos que expressam anticorpos humanos. Imunizam-se os murganhos transgénicos da maneira normal com um antigénio 131 seleccionado, por exemplo, a totalidade ou uma parte de um polipéptido da especificação presente. Obtêm-se anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio a partir dos murganhos transgénicos imunizados, utilizando tecnologia convencional de hibridoma. Os transgenes humanos de imunoglobulina alojados nos murganhos transgénicos sofrem transposições durante a diferenciação das células B, e subsequentemente sofrem alteração de classe e mutação somática. Deste modo, utilizando uma técnica deste tipo, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE com utilidade terapêutica. Pode consultar-se uma visão geral desta técnica de produção de anticorpos humanos, em Lonberg e Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Para uma descrição pormenorizada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos, e protocolos para produzir estes anticorpos, vejam-se, por exemplo, as publicações de PCT Nos. WO 98/24.893, WO 96/34.096, e WO 96/33.735; bem como as Patentes U.S. Nos. 5.413.923, 5.625.126, 5.633,425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318, e 5.939.598. São pormenorizados outros métodos nos Exemplos neste documento. Além disto, empresas tais como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San Jose, CA) podem ser contratadas para proporcionarem anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio seleccionado, utilizando uma tecnologia semelhante à que se descreveu acima.
Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes partes do anticorpo são derivadas de diferentes 132 moléculas de imunoglobulina. São conhecidos na técnica métodos para produzir anticorpos quiméricos. Veja-se, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; e as Patentes U.S. Nos. 5.807.715, 4:816.567, 4.816.397, e 6.331.415. classe de
Um anticorpo humanizado é um anticorpo ou uma sua variante ou fragmento que é capaz de se ligar a um antigénio previamente determinado, e que inclui uma região do quadro que possui substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma CDR que tem substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado inclui substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv),em que a totalidade ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões do quadro são as de um sequência de consenso de uma imunoglobulina humana. Preferivelmente, um anticorpo humanizado também inclui pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Normalmente, o anticorpo conterá tanto a cadeia leve como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CHI, charneira, CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. O anticorpo humanizado pode ser seleccionado de uma qualquer 133 imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, de um isotipo qualquer, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Habitualmente o domínio constante é um domínio constante de fixação de complemento em que se pretende que o anticorpo humanizado exiba actividade citotóxica, e a classe é tipicamente IgGl. Quando não for desejável a referida actividade citotóxica, o domínio constante pode ser da classe IgG2. Incluem-se nos exemplos de domínios constantes da VL e da VH que se podem utilizar na especificação presente, mas não se limitam a, C-kapa e C-gama-1 (nGlm) descritos em Johnson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176, 1215-1224 e os descritos na Patente U.S. N° . 5.824.307. O anticorpo humanizado pode incluir sequências provenientes de mais do que uma classe ou isotipo, e a selecção dos domínios constantes específicos para se optimizar as funções efectivadoras pretendidas está ao alcance dos indivíduos com conhecimentos médios da técnica. As regiões do quadro e CDR de um anticorpo humanizado não precisam de corresponder exactamente às sequências dos parentes, por exemplo, a CDR do doador ou quadro de consenso podem sofrer mutagénese por substituição, inserção ou eliminação de pelo menos um resíduo de tal modo que a CDR ou o resíduo do quadro naquele local não corresponda nem ao do anticorpo de consenso nem ao do importado. Estas mutações, no entanto, não serão extensivas. Em geral, pelo menos 75 % dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão aos das sequências FR e CDR dos progenitores, mais amiúde 90 %, e de preferência mais do que 95 %. Podem produzir-se anticorpos humanizados utilizando uma série de metodologias 134 conhecidas na técnica, incluindo mas não se limitando a, enxertia de CDR (Patente Europeia N°. EP 239.400; Publicação Internacional N°. WO 91/09.967; e Patentes U.S. Nos. 5.225.539, 5.530.101, e 5.585.089), folheados ou novas superfícies (Patentes Europeias Nos. EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489- 498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969-973), cadeia baralhada (Patente U.S. N°. 5.565.332), e as técnicas descritas em, por exemplo, Pat. U.S. N° . 6.407.213, Pat. U.S. N° . 5.766.886, WO 93/17.105, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119-25 (2002), Caídas et al., Protein Eng. 13(5): 353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3): 267-79 (2000),
Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10): 895-904 (1996), Couto et al., Câncer Res. 55(23 Suplem) : 5973s-5977s (1995),
Couto et al., Câncer Res. 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2): 409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3): 959-73 (1994). Veja-se também a Publicação de Patente U.S. N°. US 2005/0042664 Al (de 24 de Fevereiro de 2005). Amiúde, os resíduos do quadro nas regiões do quadro serão substituídos pelos resíduos correspondente do doador da CDR para alterar, preferivelmente para melhorar, a ligação ao antigénio. Estas substituições no quadro são identificadas por método bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelização das interacções dos resíduos da CDR e do quadro para se identificarem resíduos do quadro que são importantes para a ligação a antigénios e por comparação entre sequências para identificar resíduos não 135 habituais no quadro em posições especificas. (Veja-se, por exemplo, Queen et al., Patente U.S. N°. 5.585.089; e Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323).
Os anticorpos com um único domínio, por exemplo, anticorpos que não possuam as cadeias leves, podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica. Veja-se Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231: 25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4): 277302; Patente U.S. N°. 6.005.079; e Publicações Internacionais Nos. WO 94/04.678, WO 94/25.591, e WO 01/44.301.
Além disto, os anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "mimetizam" um antigénio, utilizando técnicas bem conhecidas dos especialistas. (Veja-se, por exemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444; e Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438).
POLINUCLEÓTIDOS CODIICANDO PARA UM ANTICORPO A especificação presente proporciona polinucleótidos incluindo uma sequência de nucleótidos codificando para um anticorpo da especificação presente que se liga imunoespecificamente a um epítopo de hLIGHT. A especificação presente também inclui polinucleótidos que hibridizam em condições extremamente rigorosas, em 136 condições de hibridização de rigor intermédio ou inferior, por exemplo, tal como as definidas acima, com polinucleótidos que codificam para um anticorpo modificado da especificação presente.
Podem obter-se os polinucleótidos, e determinar-se a sequência de nucleótidos dos polinucleótidos, por qualquer método conhecido na técnica. Uma vez que as sequências de aminoácidos de El, E13, E63, F19 e F23 são conhecidas (vejam-se, por exemplo, as SEQ ID Nos:41, 42, 43, 44, 45, 102, 46, 103, 47, 48, 104, 49, 105, 106, e 50; e respectivamente os Nos. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728), podem determinar-se as sequências nucleotidicas codificando para estes anticorpos e versões modificadas destes anticorpos utilizando métodos bem conhecidos na técnica, isto é, montarem-se os codões que se sabe codificarem para aminoácidos específicos de um tal modo que se gere um ácido nucleico que codifique para o anticorpo. Pode montar-se um tal polinucleótido codificando para o anticorpo a partir de oligonucleótidos obtidos por síntese química (por exemplo, tal como descrito em Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242), que, em suma, envolve a síntese de oligonucleótidos sobreponíveis contendo porções da sequência codificante para o anticorpo, de seus fragmentos, ou variantes, recozendo e ligando esses oligonucleótidos, e em seguida por amplificação dos oligonucleótidos ligados por PCR. 137
Em alternativa, pode gerar-se um polinucleótido codificando para um anticorpo da especificação presente a partir de um ácido nucleico de uma fonte apropriada (por exemplo, um hibridoma com um N°. de Acessão na ATCC PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819, ou PTA-7728 (El, E13, E63, F19 ou F23) . Quando não estiver disponível um clone contendo um ácido nucleico codificando para um anticorpo específico, mas a sequência da molécula do anticorpo for conhecida, pode sintetizar-se quimicamente um ácido nucleico codificando para a imunoglobulina ou obter-se a partir de uma fonte adequada (por exemplo, gerado a partir de um cADN de uma biblioteca de anticorpos, ou um ácido nucleico, preferivelmente isolado a partir de ARN poli A+, de qualquer tecido ou de células que expressem o anticorpo, tais como células de hibridoma seleccionadas de modo a expressarem um anticorpo da especificação presente) por amplificação utilizando PCR com iniciadores sintéticos hibridizáveis aos terminais 3' e 5' da sequência, ou por clonagem utilizando uma sonda de oligonucleótido específica para a sequência genética particular que se pretende identificar, por exemplo, um clone de cADN de uma biblioteca de cADN que codifique para o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser então clonados a vectores de clonagem replicáveis utilizando qualquer método bem conhecido na técnica.
As moléculas de ácido nucleico da especificação presente podem incluir ou ser constituídas por uma sequência de ácido nucleico tal como a representada em 138 qualquer uma das SEQ ID Nos:41, 42, 43, 44, 45 (codificando para uma VH) e/ou SEQ ID Nos:102, 46, 103, 47, 48, 104, 49, 105, 106, ou 50 (codificando para uma VL) , ou qualquer combinação destas (por exemplo, tal como uma sequência de nucleótido codificando para um anticorpo da especificação presente, um anticorpo de comprimento inteiro, uma cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo, ou um anticorpo de cadeia singela da especificação presente).
EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE UM ANTICORPO A expressão recombinante de um anticorpo da especificação presente (por exemplo, um anticorpo de comprimento inteiro, uma cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo, ou um anticorpo de cadeia singela da especificação presente) que se liga imunoespecificamente a um antigénio hLIGHT obriga à construção de um vector de expressão contendo um polinucleótido que codifica para o anticorpo. Uma vez obtido um polinucleótido que codifica para uma molécula do anticorpo, de uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo, ou de um seu fragmento (preferivelmente, mas não necessariamente, contendo o domínio variável da cadeia pesada e/ou da leve) da especificação presente, pode produzir-se o vector para a produção da molécula do anticorpo por tecnologia de ADN recombinante utilizando técnicas bem conhecidas. Deste modo, são descritos neste documento métodos para preparar uma proteína expressando um polinucleótido contendo uma sequência nucleotídica que expressa um anticorpo. Podem 139 utilizar-se métodos que são bem conhecidos dos especialistas da técnica para construir vectores de expressão contendo sequências de codificação para anticorpos e sinais de controlo apropriados para a transcrição e a tradução. Incluem-se nestes métodos, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação qenética in vivo. A especificação presente, deste modo, proporciona vectores replicáveis incluindo uma sequência de nucleótidos codificando para uma molécula de anticorpo tal como descrita neste documento, para uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, para um dominio variável de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou para um seu fragmento, ou para uma CDR de uma cadeia pesada ou leve, ligada operacionalmente a um promotor. Podem incluir-se nestes vectores a sequência de nucleótidos codificando para a região constante da molécula de anticorpo (vejam-se, por exemplo, as Publicações Internacionais Nos. WO 86/05.807 e WO 89/01.036; e a Patente U.S. N°. 5.122.464) e pode clonar-se o dominio variável do anticorpo num tal vector para expressão da cadeia pesada completa, da cadeia leve completa, ou tanto da cadeia pesada como a cadeia leve.
Transfere-se o vector de expressão para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e cultivam-se então as células transfectadas por técnicas convencionais para se produzir um anticorpo da especificação presente. Deste modo, a especificação presente inclui células hospedeiras contendo um polinucleótido que codifica para um 140 anticorpo descrito neste documento ou para seus fragmentos, ou para uma sua cadeia pesada ou leve, ou para seus fragmentos, ou para um anticorpo com cadeia singela tal como se descreve neste documento, ligada operacionalmente a um promotor heterólogo. Para a expressão de anticorpos com dupla cadeia, podem co-expressar-se vectores codificando para as cadeias pesada e leve na célula hospedeira, expressando-se a molécula inteira de imunoglobulina, tal como se pormenoriza adiante.
Pode utilizar-se uma série de sistemas hospedeiro-vector de expressão para expressar as moléculas de anticorpo da especificação presente (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N°. 5.807.715). Estes sistemas hospedeiro-vector de expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação com interesse podem ser produzidas, e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de nucleótidos de codificação apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da especificação presente in situ. Eles incluem mas não se limitam a micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformados com o ADN do bacteriófago recombinante, ADN plasmídico ou ADN cosmídico de vectores de expressão contendo sequências de codificação para o anticorpo; leveduras (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas com vectores de expressão recombinantes de leveduras contendo sequências codificando para anticorpos; sistemas de células de 141 insectos infectadas com vectores de expressão recombinantes de vírus (por exemplo, baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão recombinantes de vírus (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão plasmídicos recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO, e 3T3) contendo construções de expressão recombinantes que incluem promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, o promotor metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7,5K de vírus vaccinia). Preferivelmente, são utilizadas células bacterianas tais como Escherichia coli, e mais preferivelmente, células eucarióticas, em particular para a expressão de moléculas recombinantes do anticorpo inteiro, na expressão de uma molécula recombinante de anticorpo. Por exemplo, as células de mamífero tais como as células de ovário de hamster Chinês (CHO), em conjunto com um vector tal como o elemento promotor principal intermediário de genes do citomegalovírus humano, constituem um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Preferivelmente, produzem-se os anticorpos da especificação presente em células CHO. A expressão de sequências de nucleótidos codificando para anticorpos da especificação presente que se ligam imunoespecificamente a um antigénio 142 hLIGHT pode ser regulada por um promotor constitutivo, por um promotor induzivel ou por um promotor especifico.
Em sistemas bacterianos, podem seleccionar-se vantajosamente diversos vectores de expressão dependendo da utilização a que se destinam para a molécula de anticorpo que se está a expressar. Por exemplo, quando há que produzir uma quantidade grande de um tal anticorpo, para gerar composições farmacêuticas com a molécula de anticorpo, podem ser pretendidos vectores que dirijam a expressão de teores elevados de produtos de proteína de fusão que sejam facilmente purificados. Incluem-se nestes vectores, mas não se limitam a estes, o vector de expressão de E. coli, pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), no qual a sequência de codificação pode ser ligada individualmente no vector no quadro com a região de codificação lac Z, de modo que se produza uma proteína de fusão; os vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); e outros semelhantes. Também se podem utilizar vectores pGEX para expressar polipéptidos estranhos como proteínas de fusão com glutationa 5-transferase (GST). Em geral, estas proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação a pérolas com uma matriz de glutationa em agarose, seguindo-se uma eluição na presença de glutationa livre. Os vectores pGEX são concebidos de modo a incluírem locais de trombina ou de 143 factor Xa para clivagem por protease, de modo que o produto genético alvo possa ser libertado da espécie GST.
Num sistema de insecto, utiliza-se vírus de poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expressar genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. Pode clonar-se individualmente a sequência de codificação do anticorpo em regiões não essenciais (por exemplo o gene poliedrina) do vírus e colocar-se sob controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor de poliedrina).
Em células hospedeiras de mamíferos, podem utilizar-se diversos sistemas de expressão baseados em vírus. Nos casos em que se utiliza um adenovírus a título de vector de expressão, pode ligar-se a sequência de codificação de interesse a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, a sequência do promotor tardio e do líder tripartido. Este gene quimérico pode ser então inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. Por inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, na região EI ou na E3) resultará um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula do anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, veja-se Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 355-359). Podem também ser necessários sinais específicos de iniciação para uma tradução eficaz das sequências de codificação para anticorpo inseridas. Estes sinais incluem 144 o codão de iniciação ATG e as sequências adjacentes. Além disto, o codão de iniciação tem que estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação pretendida para assegurar a tradução completa do que se inseriu. Estes sinais exógenos de controlo de tradução e codões de iniciação podem ter uma série de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser incrementada por inclusão dos elementos apropriados de aumento da transcrição, terminadores da transcrição, etc. (veja-se, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
Além disto, pode escolher-se uma estirpe de células hospedeiras que module a expressão das sequências inseridas, ou que modifique e processe o produto genético do modo especificamente pretendido. Estas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos proteicos pode ser importante para função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem características e mecanismos específicos próprios para o processamento após a tradução e para a modificação de proteínas e de produtos genéticos. -Podem seleccionar-se linhas de células apropriadas ou sistemas hospedeiros que assegurem as modificações e processamento correctos da proteína estranha que se expressou. Com esta finalidade, podem utilizar-se células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular que assegura um processamento adequado do transcrito primário, uma glicosilação, e a fosforilação do produto genético. Incluem-se nestas célula 145 hospedeiras de mamíferos, sem que a estas elas se limitem, as células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47, NSO (uma célula de mieloma murina que não produz endogenamente nenhumas cadeias de imunoglobulina), CRL7030 e HsS78Bst. Preferivelmente, produzem-se os anticorpos monoclonais completamente humanos anti-hLIGHT da especificação presente em células de mamíferos, tal como em células CHO.
Para uma produção a longo termo e com rendimento elevado, de proteínas recombinantes, prefere-se uma expressão estável. Por exemplo, podem criar-se por engenharia genética linhas de células que expressem estavelmente a molécula de anticorpo. De preferência a utilizarem-se vectores de expressão que contenham origens de replicação virais, podem transformar-se as células hospedeiras com ADN controlado pelos elementos apropriados de controlo da expressão (por exemplo, promotor, incrementador, sequências, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um marcador seleccionável. Após a introdução do ADN estranho, as células de engenharia genética podem ser cultivadas durante 1-2 dias em meios enriquecidos, e depois é alterado o seu meio para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite às células que integrem de um modo estável o plasmídeo nos seus cromossomas e que cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos a linhas de células. Este método pode ser vantajosamente 146 utilizado para criar linhas de células que expressam a molécula de anticorpo. Estas linhas de células de engenharia genética podem ser especialmente úteis no despiste e na avaliação de composições que interactuam directa ou indirectamente com a molécula de anticorpo.
Podem utilizar-se diversos sistemas de selecção, incluindo mas não se limitando a, os genes da timidina quinase do vírus herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), a hipoxantina-guanina fosfo-ribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48: 202), e a adenina fosfo-ribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 8-17) podem ser empregues respectivamente em células tk-, hgprt- ou aprt-. Além disto, pode utilizar-se a resistência antimetabolito como base de selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sei. USA 77: 357; O' Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-2 15); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147) . Podem aplicar-se em rotina métodos que são conhecidos na tecnologia de ADN recombinante para seleccionar o clone 147 recombinante pretendido, e estes métodos estão descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13 de, Dracopoli et al. (editores), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1.
Os teores de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação do vector (veja-se uma revisão em Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema de vector expressando o anticorpo é amplificável, um aumento do teor em inibidor presente na cultura das células hospedeiras aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
Pode co-transfectar-se a célula hospedeira com dois vectores de expressão da especificação presente, codificando o primeiro vector para um polipéptido derivado da cadeia pesada e codificando o segundo vector para um polipéptido derivado da cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis idênticos que permitem uma expressão igual dos polipéptidos das cadeias pesada e leve. 148
Em alternativa, pode utilizar-se um único vector que codifica, e é capaz de expressar, tanto polipéptidos da cadeia pesada como da leve. Nestas situações, deve colocar-se a cadeia leve antes da cadeia pesada para se evitar um excesso da cadeia pesada tóxica livre (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; e Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 2197-2199). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem incluir cADN ou ADN genómico.
Quando uma molécula de anticorpo da especificação presente haja sido produzida por expressão recombinante, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, de permuta iónica, de afinidade, em especial por afinidade para com o antigénio especifico após a Proteína A, e por cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica-padrão para a purificação de proteínas. Além disto, podem fundir-se os anticorpos da especificação presente com sequência polipeptídicas heterólogas descritas neste documento ou de outra forma conhecidas na técnica para facilitar a purificação.
ESTOJOS A especificação presente também proporciona uma embalagem ou estojo farmacêuticos incluindo um ou mais contentores contendo um ou mais dos ingredientes das 149 composições farmacêuticas da especificação presente, tal como um ou mais anticorpos proporcionados neste documento. Pode opcionalmente associar-se aos contentores uma informação escrita sob a forma prescrita por uma agência governamental gue regula o fabrico, a utilização ou a comercialização de produtos farmacêuticos ou biológicos, texto este gue exprime a aprovação por parte da agência, do fabrico, utilização ou comercialização com o propósito de administração a seres humanos. A especificação presente proporciona estojos gue podem ser utilizados nos métodos acima. Numa concretização, um estojo inclui um anticorpo descrito neste documento, preferivelmente um anticorpo purificado, em um ou mais contentores. Numa concretização particular, os estojos da especificação presente contêm um antigénio hLIGHT substancialmente isolado, a titulo de controlo. Preferivelmente, os estojos da especificação presente também contêm um anticorpo de controlo que não reage com o antigénio de hLIGHT. Noutra concretização particular, os estojos da especificação presente contêm um meio para detectar a ligação entre um anticorpo modificado e um antigénio de hLIGHT (por exemplo, o anticorpo pode estar conjugado com um substrato detectável, tal como um composto fluorescente, um substrato enzimático, um composto radioactivo ou um composto luminescente, ou pode conjugar-se um segundo anticorpo que reconheça o primeiro anticorpo, a um substrato detectável). 0 estojo pode incluir um antigénio hLIGHT produzido recombinantemente ou 150 quimicamente sintetizado. O antigénio hLIGHT proporcionado no estojo também pode estar ligado a um suporte sólido. O meio de detecção no estojo mencionado acima pode incluir um suporte sólido ao qual está ligado o antigénio hLIGHT. Um tal estojo também pode incluir um anticorpo anti-humano não ligado, marcado, como repórter. A ligação do anticorpo ao antigénio hLIGHT pode ser detectada ligando o referido anticorpo repórter marcado.
Os exemplos que se seguem são incluídos a título de ilustração, e não constituem nenhuma limitação.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 ~ GERAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANOS ΑΝΤΙ—
hLIGHT
Neste exemplo descreve-se a geração de anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT utilizando murganhos transcromossómicos (murganhos KM™) (WO 02/143.478, WO 02/092.812, Ishida e Lonberg, IBC's llth Antibody Engineering Meeting. Resumo (2000); e Kataoka, S. IBC's 13th Antibody Engineering Meeting. Resumo (2002)) imunizados com hLIGHT recombinante solúvel. Os anticorpos que se descrevem neste exemplo contrastam especificamente linhas de células estavelmente transfectadas com hLIGHT, (EL4-hLIGHT e HEK 293-hLIGHT) e não as linhas de células de que estas provêm. De igual modo, eles ligam-se após activação a hLIGHT expresso endogenamente à superfície do 151 hibridoma de células T humanas (11-23.D7) (Ware et al. 1986 Lymphokine Res. 5, 313-24). Em conjunto, estes dados indicam que os anticorpos se ligam imunoespecificamente a hLIGHT. Os anticorpos isolados reconhecem um de dois epitopos do hLIGHT, tal como se determinou por experiências de bloqueio cruzado, como se descrevem adiante. Além disto, os anticorpos eram capazes de bloquear a ligação de hLIGHT expresso à superfície celular a formas solúveis de fusão receptor-Fc, tanto do HVEM como do LTPR humanos. 0 hLIGHT solúvel induz a secreção das quimioquinas CCL20 e RANTES a partir da linha de células epiteliais do cólon humano HT29.14s (ATCC HTB-38) de um modo dependente da dose. A incubação de hLIGHT solúvel com anticorpos anti-hLIGHT bloqueia a secreção de tanto CCL20 como RANTES mediada por hLIGHT, a partir das células HT29.14s. Além disto, uma incubação prévia de hLIGHT expresso à superfície celular (EL4-hLIGHT) com estes anticorpos anti-hLIGHT bloqueia a secreção de quimioquina induzida por hLIGHT ligado à membrana, em células HT29. Em conjunto, estes resultados ilustram características funcionais e estruturais dos anticorpos monoclonais completamente humanos anti-hLIGHT e proporcionam corroborações da sua utilidade no tratamento das doenças mediadas por hLIGHT.
MATERIAIS E MÉTODOS
Preparaçao de antigénios: 0 antigénio utilizado
para imunizações na geraçao de anticorpos anti-hLIGHT completamente humanos era uma versão solúvel de hLIGHT 152 truncado de modo a conter apenas a região extracelular, a partir da glicina na posição de aminoácido 66 e até à valina 240, e contém um epitopo FLAG marcador no terminal amino da proteína (SEQ ID NO:54). A produção desta molécula havia sido reportada anteriormente (Rooney et al. 2000 J. Biol. Chem. 275, 14307-15). Já foi clonado o ácido nucleico (SEQ ID N0:51) codificando para sequência de aminoácidos de hLIGHT de comprimento inteiro (SEQ ID NO:52), a partir de hibridomas de células T activadas 1123.D7 T, por PCR de transcriptase reversa (Mauri et al. 1998, Immunity, 8, 21-30). A linha de células 11-23 (um subclone de D7) é um hibridoma de células T CD4+ humanas (Ware et al. 1986, Lymphokine Res., 5, 313-24) . Subclonou-se o produto de PCR de hLIGHT no vector de expressão de mamíferos pcDNA3.1 (+) para se criar pcDNA3.1-hLIGHT. O domínio extracelular (codificando para Gly66 a Val240) foi amplificado por PCR a partir de pcDNA3-hLIGHT, utilizando os seguintes iniciadores com locais de restrição incorporados: directo, 5'-GTAGGAGAGATGGTCACCCGCCT-3' (SEQ ID NO:80). reverso, 5'-GGAACGCGAATTCCCACGTGTCAGACCCATGTCCAAT-3' (SEQ ID N0:81).
Digeriu-se o produto do hLIGHT amplificado por PCR com EcoRI e ligou-se aos locais SnaBl e EcoRI de pCDNA3.1-VCAM-FLAG, que codifica para a sequência líder VCAM1, seguida pelo epitopo FLAG para a produção de 153 proteína segregada marcada no terminal N com FLAG (SEQ ID NO:52) .
Para se produzir uma linha de células estável destinada à produção de hLIGHT solúvel, transfectaram-se células HEK293 utilizando o método do fosfato de cálcio, e seleccionaram-se clones estáveis com G418 (Invitrogen, Corp.), despistando-se a produção de hLIGHT por ELISA. Purificou-se o hLIGHT solúvel a partir dos sobrenadantes da cultura de células cultivadas em DMEM contendo 1,0 % de soro fetal de bovino (Hyclone Laboratories, Logan, UT) . Purificou-se o hLIGHT solúvel por cromatografia de afinidade com anticorpo anti-FLAG (M2) acoplado a pérolas de agarose. Eluiu-se o hLIGHT solúvel da coluna utilizando glicina 20 mM, 150 mM em NaCl, pH 3,0, e neutralizou-se o pH imediatamente à saída, por recolha em Tris 50 mM, pH 7,4. Determinou-se a concentração proteica através da absorvência a 280 nm.
Sequência nucleotidica de um hLIGHT, a partir do codão de iniciação (ATG) até à paragem (TGA) (SEQ ID NO:51) : 154 SSOT!?CRST5 M^C^&SíS CSRt&tCtÇ:* tfíísíOASíaK 'SOTSSCMÍMS CÍMC£S&S&· CÃSRrCS?SC·^ SSSÍfGSCOTQ SSTSSSTCTQ 'iSv ^s&sícss^ w^cc-siníc· arsscssst'? cct^c^cas ííís s»wcasa cbcctsbcts rc&ssccjoc *®2&sesT®í s««
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Sequência de aminoácidos de um hLIGHT de comprimento inteiro com 240 aa (SEQ ID NO:52):
«£cSV¥*$$v rvvt^n'^ ra&^s$*>»fc vrc&VA*Vfi4. 'SJa.li.UISfcfi L^-^âsànt-O :P k^sq&r&p* ^vs^wa-n#· xt$ ÀrL&SLSVs^ smWfKMV TVXVSKV^^S S^~»UFL&S ^XTH^LVKST FSmí^U.!; !§«? *sas$«»8«* rnsu^ge mmr*mg ssao^Lsass wspf:i!i?
Sequência nucleotídica de um hLIGHT solúvel marcado com FLAG (mostram-se a sequência líder VCAM, e em seguida a sequência de codificação para FLAG em negrito) (SEQ ID NO:53) _i£. |cne?t^ n*
SvtOX»;0> SApxxxx·. cKEK®®^" ^í^sc'~^ srrrtart^ isc s&scí&ãsst· c«»ass®ix aawscaac? cmx&®£C(* ?*e cr&txmz ?(S»no6cr «$sso$«s» nccs*»?^ §s;cTíA®m as^sx^ss jec
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Sequência de aminoácidos de um hLIGHT solúvel marcado com FLAG, 183 aa (FLAG em negrito) (SEQ ID NO:54): ΑδΥ'ί’ίξΥ^ íASti Í^Vi' £LLVS^3?t SRWSSSÍHf* f?3SSEtiQ3VV %tEÃtSS'-m R'?LSSRÍ,VaS. SSSTS®·; W (2;*§
Transduziram-se estavelmente células EL4 (ATCC TIB-39) com um retrovirus contendo o cADN codificando para hLIGHT de comprimento inteiro, para se gerar a linha de células EL4-hLIGHT.
Preparação da proteína de fusão com Fc: Foram anteriormente descritas a clonagem, expressão, e a purificação das proteínas de fusão com o receptor solúveis contendo a região Fc de IgGl humano e os domínios de ligação a ligandos de LTPR humana e de HVEM humana (Rooney et al. 2000, Methods Enzymol., 322, 345-63). Em suma, isolaram-se as regiões extracelulares de HVEM e ΕΤβΕ recorrendo a reacções de polimerase em cadeia, utilizando iniciadores com locais de restrição por endonuclease incorporados neles, e ligaram-se no quadro, no vector de baculovírus pVL1392 (Pharmingen) contendo a Fc de IgGl humana. Infectaram-se células de insecto Trichoplusia ni High-Five BTI-TN-5bl-4 (Tn5) (Invitrogen Corp.) com os baculovírus recombinantes ΕΤβΡ:Γο ou HVEM:Fc, para a produção proteica (veja-se a purificação de anticorpos e proteínas) . 156
Murganhos: Obtiveram-se murganhos trans-cromossómicos humanos KM™ (WO 02/43.478, WO 02/092.812, Ishida e Lonberg, IBC's llth Antibody Engineering Meeting. Resumo (2000); e Kataoka, S. IBC's 13th Antibody Engineering Meeting. Resumo (2002)), contendo fragmentos de cromossomas humanos codificando para a região da imunoglobulina humana, junto da Kirin Brewery Co., Ltd., Japão, e alojaram-se nas instalações para animais da Gemini Science (La Jolla, CA) . Está descrita uma visão geral da tecnologia de produção de anticorpos humanos em Lonberg e Huszar 1995, Int. Ver. Immunol. 13, 65-93. Estão descritos animais transgénicos com um ou mais genes de imunoglobulina humana (kapa ou lambda), que não expressam imunoglobulinas endógenas, por exemplo na, Patente U.S. N°. 5.939.598. Estão descritos métodos adicionais para a produção de anticorpos humanos e de anticorpos monoclonais humanos (vejam-se, por exemplo, WO 98/24.893; WO 92/01.047; WO 96/34.096; WO 96/33.735; Patentes U.S. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598). Está descrito o desenvolvimento de bovinos que transportam genes de imunoglobulina humana, vacas TC, em Ishida e Lonberg (veja-se Ishida, 2000, llth Antibody Engineering Meeting, Kuroiwa et al. 2004, Nat. Genet. 36, 775-80, Kuroiwa et al. 2002, Nat. Biotechnol. 20, 889-94).
Imunização: Misturou-se proteína recombinante hLIGHT solúvel marcada com FLAG com um volume igual de adjuvante completo de Freund (CFA, Sigma), e preparou-se 157 uma emulsão. Imunizaram-se murganhos com 10 a 50 pg de proteína por via subcutânea (s.c.) com um reforço também s.c. de 10 a 20 pg da proteína emulsionada em adjuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma) a intervalos de 2-3 semanas, fazendo-se 2 a 3 destes reforços. Administrou-se uma injecção endovenosa (i.v.) final de 20 pg de hLIGHT solúvel marcado com FLAG sem adjuvante 3 dias antes da fusão. de CO2.
Produção de hibridomas: Seleccionaram-se para a produção dos anticorpos monoclonais os murganhos que apresentavam no soro os mais elevados títulos em anticorpo anti-hLIGHT específico para IgG, tal como se determinou por ELISA de hLIGHT e de FACS utilizando células EL4 transduzidas com hLIGHT em relação a células de origem EL4. Recolheram-se os baços e fundiram-se suspensões de células singelas com a linha de células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC, Manassas, VA) a uma razão de 5:1 com 50 % de polietilenoglicol (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Plaquearam-se as fusões em placas de 96 poços com fundos planos, a uma densidade óptima (neste caso lxl06/mL) , em meio DMEM-10 completo (Meio Eagle Modificado da Dulbecco com 10 % de soro fetal de bovino (FBS, Invitrogen, Corp.), 1 % de aminoácidos não essenciais, 2 mM em L-glutamina, com 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina (todos da BioWhittaker, Walkersville, MD) , suplemento HAT (Sigma), and 10 % de Factor de Clonagem de Hibridomas (HCF, Biovaris, San Diego, CA)), prosseguindo a cultura a 37°C numa incubadora assegurando 10 % 158
Despistaram-se em cerca de 2.800 poços de duas fusões, por ELISA, os anticorpos específicos para hLIGHT contendo kapa. Confirmaram-se os anticorpos IgG humanos anti-hLIGHT por uma análise por citometria de fluxo utilizando células hLIGHT-EL4 em relação ás células EL4 progenitoras. Também se testou nos poços positivos uma actividade bloqueadora de receptores recorrendo a uma incubação prévia de meios de cultura para extinção de hibridomas em bruto com células EL4-hLIGHT, e contrastando com soluções hemi-saturantes de HVEM:Fc ou de ΕΤβϊ1:Εο. Expandiram-se os poços positivos e submeteram-se a 3 - 5 processos de clonagem por diluição limitativa para se obterem os anticorpos monoclonais.
Purificação de anticorpos e de proteínas: Para a purificação dos anticorpos, fizeram-se culturas de hibridomas em frascos de 2 litros capazes de rolar, a entre 350 mL e 1 L por frasco, ou num sistema Integra de 1 L (INTEGRA Bioscience, Inc., Ijamsville, MD), com meio de hibridoma-SFM (Invitrogen, Corp.) suplementado com soro fetal bovino extremamente pobre em IgG (Invitrogen, Corp.). A produção de proteínas recombinantes humanas e murinas ΕΤβΚ:Εο e HVEM:Fc foi anteriormente reportada (Rooney et al. 2000 Meth. Enzymol. 322: 345-63), e elas foram geradas infectando 1 litro de uma suspensão de células Tn5 durante 4 dias. Tanto os anticorpos monoclonais humanos como as proteínas de fusão com Fc foram purificados a partir dos meios de cultura utilizando gel Fast Flow de Proteína A recombinante-Sepharose (Amersham Biosciences). 159
Em primeiro lugar concentrou-se o meio acondicionado gerado em frascos capazes de rolar, utilizando um sistema de filtração tangencial Ultrasette (Pall Corp., East Hills, NY). Filtrou-se o meio acondicionado com uma unidade filtrante para operação em vazio, de 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA) , e carregou-se sobre uma coluna de gel Fast Flow de Proteína A recombinante-Sepharose (Amersham Biosciences) com dimensões apropriadas à quantidade de anticorpo humano no meio. Lavou-se completamente a coluna com 20 volumes de coluna de PBS, eluindo-se o anticorpo com Gly-HCl 0,1 M, pH 3,6, 0,15 M em NaCl, e neutralizando com Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Analisaram-se as fracções por SDS-PAGE e juntaram-se as diversas fracções positivas, concentrando-se num concentrador a centrífugo (Vivaspin, 50,000 MWCO: Sartorius, Gettingen, Alemanha).
Utilizaram-se colunas de dessalinização Sephadex G-25, (NAP, Amersham Biosciences), pata permuta de tampões, para PBS, pH 7,4. Por último, esterilizou-se o anticorpo por filtração utilizando filtros seringa com diâmetro de poro de 0,22 pm e determinou-se a concentração em anticorpo pelo método de Lowry. Determinou-se o conteúdo em pirogénios utilizando o ensaio de Lisado de Amebócito Limulus (LAL) (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . 0 limite de detecção deste ensaio é de 0,06 EU/mg. Quando o resultado do teste era negativo, consideravam-se as amostras isentas de endotoxinas. 160
Quantificação de IgG humano por ELISA: Para se determinar a quantidade de anticorpo humano presente nos sobrenadantes e nas quantidades purificadas, utilizou-se o protocolo seguinte. Revestiu-se anticorpo especifico de cabra anti-FcY humano (Jackon Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) sobre placas de 96 poços (Nunc, Denmark) em tampão carbonato, a 0,5 pg/poço, durante 1 hora a 37°C. Bloquearam-se então as placas com Super Block (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos, seguindo-se a adição das amostras às placas. Geraram-se curvas padrão utilizando IgG total humano (Sigma) ou Igl ou Ig4 humanos purificados (Kirin Brewery Co., Ltd). Incubaram-se as placas durante 1 hora a 37°C, lavaram-se com PBS/1 % de BSA/0,1 % de Tween 20 (Sigma), e detectou-se o anticorpo ligado com anticorpo especifico de cabra anti-FcY humano conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP, Jackson Immunoresearch Laboratorie, West Grove, PA) durante 1 hora a 37°C. Adicionou-se o substrato TMB (Sigma) durante 10 minutos e terminou-se a reacção com H2S04 (LabChem, Pittsburgh, PA) . Mediu-se a DO a 450 nm num leitor de microplacas.
Cultura de células de mamíferos: Manteve-se a linha de células 11-23 humanas (subclone de D7), uma linha de células T CD4+ (Ware et al. 1986, Lymphokine Res. 5, 313-24), em RPMI 1640 contendo 10 % de FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT) e 100 U/mL de penicilina/100 pg/mL de estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY) . A linha de células HT29.14s humanas, a linha de células EL4-hLIGHT e a linga d células 293-hLIGHT foram todas mantidas 161 em DMEM contendo 10 % de FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT). Todas as culturas de células de mamíferos foram feitas numa incubadora humidificada sob 5 % de CO2 a 37°C. ELISA de detecção de anticorpos anti-hLIGHT: Determinaram-se por ELISA os títulos em anticorpos, a sua especificidade, e a sua produção por hibridomas. Em suma, revestiram-se placas de 96 poços com fundo plano com 50 pL de hLIGHT solúvel marcado com FLAG a 5 pg/mL em tampão de carbonate (pH 9,4) de um dia para o outro a 4°C ou a 37°C durante 1 hora. Depois de se lavarem duas vezes com PBS/0,1 % de Tween 20, bloquearam-se as placas com PBS/1 % de BSA/0,1 % de Tween 20 a 37°C durante 1 hora. Diluiu-se o soro, o sobrenadante, ou o anticorpo purificado em tampão de bloqueio, adicionou-se aos poços, e incubaram-se as placas durante 1 hora a 37°C. Lavaram-se as placas 4 vezes com PBS/0,1 % de Tween 20 e adicionou-se-lhes o anticorpo de detecção de kapa, de carneiro anti-humano conjugado com peroxidase (The Binding Site, Birmingham, UK) a uma diluição de 1:2.000. Depois de uma incubação durante 1 hora a 37°C, lavaram-se as placas e adicionou-se o substrato TMB (Sigma), incubando-se à temperatura ambiente durante entre 10 e 30 minutos. Parou-se a reacção com H2S04 (LabChem) e mediu-se a densidade óptica a 450 nm com um leitor de microplacas.
Citometria de fluxo: Determinaram-se com análise por citometria de fluxo os títulos em anticorpos, a especificidade, e as afinidades de ligação relativas 162 utilizando linhas de células EL4 estáveis a hLIGHT ou uma linha de células T 1123.D7 activada com PMA (a 40 ng/mL) de 6-15 h + inonomicina (a 500 ng/mL) . Lavaram-se as células uma vez com tampão de contraste: PBS + 2 % de FBS + 0,01 % de NaN3 + EDTA 10 mM, e voltaram a suspender-se em soro, sobrenadante, ou anticorpos purificados, num volume de 50 pL. Incubaram-se as células com os anticorpos sobre gelo durante 20 minutos, lavaram-se duas vezes com tampão de contraste e depois voltaram a suspender-se num anticorpo secundário de cabra anti-IgG humano marcado com APC (APC de Burro anti-humano, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) . Depois de uma incubação de 20 minutos sobre gelo, lavaram-se as células mais uma vez e fixaram-se durante 10 minutos com paraformaldeído a 1 % ou submeteram-se a uma lavagem final, depois voltaram a suspender-se as células em tampão de contraste e mediram-se as amostras utilizando citómetros de fluxo FACScan ou FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, Paio Alto, CA). Analisaram-se os dados utilizando o programa CELLQUEST (Becton Dickinson Biosciences) ou o programa FLOW JO (TreeStar, Inc., San Carlos, CA). de BSA/Tween 20.
Ensaios de blogueio cruzado do anticorpo anti-hLIGHT: Utilizou-se um protocolo ELISA para se determinar se os anticorpos se ligam ao mesmo epítopo de hLIGHT. Revestiram-se placas NUNC de 96 poços com fundo plano para ELISA, com anticorpos anti-hLIGHT humanos em tampão de carbonato a 2 pg/mL durante 1 hora a 37°C. Lavaram-se as placas e depois bloquearam-se com PBS/1 % 163
Incubaram-se previamente os anticorpos anti-hLIGHT humanos com hLIGHT solúvel recombinante humano marcado com FLAG durante 30 minutos a 4°C. Adicionaram-se as combinações de anticorpo-proteína hLIGHT à placa e incubou-se durante 1 hora a 4°C. Depois de 3 lavagens, detectou-se o hLIGHT ligado com Ig M2 de murganho marcado anti-epítopo de FLAG (Sigma) conjugado com peroxidase. A percentagem de inibição foi determinada utilizando a DO das diversas amostras na fórmula seguinte: % de inibição = (max - amostra/max)*100.
Análise citoguinas humanas. Quantificou-se um painel de 8 citoquinas humanas nos meios de crescimento de células HT29.14s tratadas, utilizando tecnologia multiplex e seguindo as instruções do fornecedor (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Levou-se a cabo a detecção de CCL20 nos meios de cultura de células HT29.14s por ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN) recorrendo às instruções do fornecedor.
Ensaio in vitro do bloqueio mediado por anticorpos da ligação de LIGHT expresso à superfície a proteínas de fusão solúveis receptor-Fc. Incubaram-se células le5 EL4 hLIGHT com uma série de concentrações de cada anticorpo durante 30 minutos a 4°C. Adicionaram-se então quantidades sub-saturantes de HVEM:Fc-biotina (a 3 pg/mL) ou de ΤΤβΗιΓο-Ηίε (a 3 pg/mL) (Alexis Biochemicals) às células, e incubou-se durante 30 minutos a 4°C. Lavaram- 164 se então as células 2 x com 200 pL de tampão FACS (1 x PBS 2 % de FBS + 0,02 % de azida) . Detectaram-se HVEM:Fc-biotina ou LT3R:Fc-His fazendo uma incubação durante 30 minutos com quer SA-APC a 2,5 pg/mL, quer anti-His-HRP, respectivamente. Analisaram-se então as células em citómetros de fluxo FACScaliber (Becton Dickinson). Separaram-se as células mortas da representação das dispersas em frente em relação às dispersas lateralmente e determinou-se a média geométrica para cada histograma utilizando o programa FLOWJO (TreeStar, San Carlos, CA, USA) .
Isolamento de genes do anticorpo anti-hLIGHT humano. Recolheram-se células de hibridoma de culturas (124E63, 124F23, 124E1, 124E13 e 124F19), que produzem respectivamente os anticorpos E63 (IgG3), F23 (IgG4), EI (IgGl), E13 (IgGl) e F19 (IgGl), por centrifugação. Purificou-se o seu ARN total utilizando o estojo RNEASY (QIAGEN Inc., Valência, CA) seguindo as instruções do fabricante. Utilizou-se os estojo SMART RACE de Amplificação de cADN (Clontech Co., Ltd., Paio Alto, CA) para uma clonagem do cADN codificando para a região variável dos genes de imunoglobulina a partir do ARN total da célula de hibridoma. Em suma, preparou-se o cADN da primeira cadeia com transcriptase reversa a partir de 2 micrograma de ARN. Utilizou-se este cADN como matriz para uma reacção de polimerase em cadeia (PCR) para amplificar a região variável e uma parte da região constante das cadeias pesada e leve (respectivamente VH e VL). Os iniciadores 3' 165 utilizados para a amplificação dos genes da cadeia pesada e leve nas reacções 5' de RACE foram respect ivamente HH-2 (SEQ ID NO:64) (região constante da cadeia H) e HK-2 (SEQ ID NO:65) (região constante da cadeia L) . As sequências amplificadas também continham as sequências líder. A reacção prosseguiu como se segue: 2,5 unidades de polimerase PFU ULTRA ADN (Stratagene, La Jolla, CA); 0,2 μΜ de Iniciador 3' (para a cadeia H: IgGlp, para a cadeia L: hk5, Tabela 2); IX Mistura Iniciadora Universal A para o terminal 5' (esta Mistura Iniciadora Universal A está incluída no estojo SMART RACE); 200 μΜ de mistura de dNTP; 1 mM de MgCl2; Tampão Puff Ultra (a concentração final é lx); e matriz para cADN. O programa de termociclização era constituído por 5 ciclos de: 94°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos, 5 ciclos de: 94°C x 30 segundos, 70°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos, 25 ciclos de: 94°C x 30 segundos, 68°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos, seguindo-se uma extensão a 72°C x 7 minutos. Separaram-se os fragmentos amplificados de ADN por electroforese sobre gel de agarose, e purificaram-se com um estojo QIAQUICK de extracção de gel (Qiagen Co., Ltd., Alemanha). Integraram-se os fragmentos purificados de ADN de VH e de LV num vector de PCR 4 Blunt-TOPO utilizando o estojo de clonagem PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) , e transformou-se cada uma das construções plasmídicas em E. coli, clonando-se em seguida. Analisaram-se as sequências de nucleótidos de cada inserção (HV e LV) nos plasmídeos construídos utilizando os iniciadores 166 específicos do vector universal M13F (SEQ ID NO:58) e M13R (SEQ ID NO:59). Com base na sequência obtida para VH e VL, conceberam-se oligonucleótidos iniciadores para amplificar as respectivas VH e VL (veja-se a Tabela 2).
Subclonaram-se por PCR os cADN codificando para as VH e as VK de E63, F23, EI e F19 recorrendo aos vectores PCR4 Blunt-TOPO, no vector de expressão de IgGl. Uma vez que ο E13 era um hibridoma do subtipo de IgGl com uma cadeia kapa singela (veja-se adiante), não houve necessidade de subclonar o cADN de E13 num vector IgGl para as análises ulteriores.
Em primeiro lugar, conceberam-se iniciador oligonucleotídicos contendo locais de restrição 5'-SalI e 3'-NheI reconhecidos por enzimas para amplificar a região variável da cadeia pesada (VH) por PCR. Por exemplo, no caso de E63VH, levou-se a cabo PCR utilizando como matriz ADN de mini-prep de pTopoE63VH, E63HF85 (SEQ ID NO: 60) e E63HR38 (SEQ ID NO:61) como iniciadores (veja-se a Tabela 2) com polimerase de ADN PFU ULTRA. Depois de uma digestão com Nhel e Sall, subclonou-se o produto de PCR no vector de expressão de IgGl (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, N5KG1-Val Lark (um vector modificado de N5KG1 (Patente U.S. N°. 6.001.358)) que havia sido previamente digerido com Nhel e Sall (fragmento de ADN com 8,9 quilobases). Analisou-se a existência da VH por digestão de restrição. 167
Em seguida conceberam-se os oligonucleótidos iniciadores contendo locais de reconhecimento por enzimas de restrição 5' BglII e 3' BsiWI para amplificar a região variável da cadeia leve (VL) por PCR. Por exemplo, a seguir à subclonagem do E63VH descrita acima, inseriu-se o E63VL no vector N5KG1-Val Lark-VH digerindo o vector de ADN com BglII e BsiWI. Isolou-se então o fragmento de ADN com 9,1 kb. À semelhança da construção de VH, concebeu-se um conjunto de iniciadores para a PCR de VL de modo a conterem os locais de restrição para 5'BglI e 3'BsiWI. Utilizaram-se estes iniciadores, E63LF84 (SEQ ID NO:62) e E63LR43 (SEQ ID NO:63), para amplificar VL a partir do ADN plasmídico mini-prep de pTopoE63VL. Digeriu-se o produto de PCR com BglII e BsiWI e isolou-se por electroforese sobre gel de agarose e purificação de gel. Este fragmento, contendo E63VL, foi ligado ao vector preparado com 9,1 kb com ligase de ADN T4 e utilizado para transformar células ToplO (Invitrogen) . Seleccionaram-se os transformante positivos de E. coli. Este vector de expressão, pGlK112E63, foi purificado, e confirmaram-se as presenças das regiões, tanto de E63VL como de E63VH, por análise de restrição.
Levou-se a cabo a geração de vectores para produzir anticorpos recombinantes F23G1, E1G1 e F19G1 essencialmente da mesma maneira que para o E63G1. A amplificação do F23VH por PCR foi levada a cabo partindo de F23HF86 (SEQ ID NO:66) e de F23HR55 (SEQ ID NO: 6 7) . Os iniciadores para amplificação de F23VL foram F23LF36 (SEQ ID NO: 6 8) e F23LR43 (SEQ ID NO:69). Levou-se a cabo a 168 amplificação por PCR de E1VH partindo de ElHFSalI (SEQ ID NO:70) e de ElHRNhel (SEQ ID N0:71). Levou-se a cabo a amplificação por PCR de E1VL kapa(A), E1VL kapa(B) e E1VL kapa(C) partindo de ElKF2+3BglII (SEQ ID NO:74) emparelhado com quer E1KR2BSÍWI (SEQ ID NO:75), quer ElKR3BsiWI (SEQ ID NO: 76). Levou-se a cabo a amplificação por PCR de F19VH partindo de F19HFSalI (SEQ ID NO:72) e de F19HRNheI (SEQ ID NO: 73) . Levou-se a cabo a amplificação por PCR de F19L kapa(A) e de F19L kapa(B) partindo de F19KRl+2BsiWI (SEQ ID NO:77) e de F19KFl+2+3BglII (SEQ ID NO:79). Levou-se a cabo a amplificação por PCR de F19L kapa(C) partindo de F19KR3BsiWI (SEQ ID NO:78) e de F19KFl+2+3BglII (SEQ ID NO:79). Os vectores resultantes, pKLGl/F23, pKLGl/El e pKLGl/F19 are também foram confirmados por análise usando uma digestão enzima de restrição e uma sequenciação. Não s e amplificou por PCR o F19L kapa(D) devido a uma deslocação do quadro de leitura, que se detectou por análise de sequência, da qual resultava um segmento do terminal C do anticorpo.
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia pesada de E63 (VH) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:43) : 169 vreaMÇftgg míssrrcrr í^Aomss? cç^tcco^ «$ •©ppsp^se <ps^^ : ^®%%φ$*.··· %m ι®»ΐετ >si^fsm««€ ác^^í^s sã?c-sss&3 m eCSSSMSSm. ímKi&TCtG® taiatctatt Ae&at^M&s CAccmsmt 24# ã &# £TSÍA3CT$fc GCTíT^QAC S^?S3K3&C &Ci3G-"CGT^ ÃTTAGTGttjC CMATOSàr? ACTATCTYTC GGG5?VS?rrSG 6?TTG3ã€CS TC^ICCACP GAACCOT&TíT CÃCÇSTCtGÍ
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Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia leve kapa de E63 (VL) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:48) :
MtTC&K&f CACAAÍT>ÍA7 tÊSSfiTGté' i^CTtTSGG T*€CASÇCfC SÃdGGSiG&A m Atmnscmk ctcAGirerss à^ctttcas tctSfGAdtc cma&sa&sa ASftACCAfs iso ACCtStmSt CCAPimSM CmSSTAPI' f^ftACAC? SStACP&SCA íPA&ÕS&ÍSAf i«G ÇÃPtítCtAt APCTCCtC?.·? OTOTATGCT TCGCAGTCC? ÇCICAStGST CCCCTCS&ÍSG 240 rrCAGTGStxA <rrt£ATcrts s&íy&s&T-rsc aocctçaçça t-wâspct m
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Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia pesada de F23 (VH) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ id NO:45) : 170 ÃtSSftCCTCt tOC&C&ASAS· CATW&CAC CT^®5TTCt TCCT^CTDC-T SST$GÇACiC“ §0 CCfôÃãÃtSSG TCSTÔTCCCS· SGTSCAOSfA tASCAOTOSS SOSOASGACT GSTSAAGCrf 12¾ fessí^sct Tcrecctsfcc cssescTâtc tAtosnos&f όοττο&ΰτοο rrASTACnsç lâc AAC^SSKTCC &SCA£SC££Í AS&SAMSGO ΟΫββΑΒΤΟΐϊΑ TTSSGS&Mt SAATC&G?&C S40 AflíC-fiCSteO™ ?£&ASaS$£3 AiSrcACSATA ÍCAat&SÃGA COTfiCRASAA CCAâtT^rcc ooo Of&AMCSSA CKÍTCTSIÍGRC OSCCGCGOAC AeSStTSfSt ATTACTOTSC SASASASATA %êb §cKm&cm hf^mm^vh ctassôttps aaf?a'£-so Gcc^-sac cacsstcmx ^m: «TctectCA -«st
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia leve kapa de F23 (VL) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:50) : àltsKAt&A oô6ro;xcec "CÂtcictrs ococttcrsc tectcrascr íeawssTscf g.o ASATGTOÍCA ?01ÂCr.'SA£ CSAfiTÍKCA TXCtCCCTSt CTGO.TCTST «SGASACAOA 1¾¾ orcAíCATCA crrsctssse :-Ac-tcAS5tc A“T^tcAt,TS cwas®e?5 ise «AACCAGQSA WMàCTCCrA* ÍSTírOt&Mt CCASCTtOGA «Sí^KCSSlC M:0 COATÇSAGvT 7CAGC®SCfiS 7«$ΑΤ070«£ ACÃGATTÍCA CfCtC^CGA? CA«CAS0C?3 |g@
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Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia pesada de EI (VH) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:41) : -Ètè^àrssè §®ei8*«c?« ccrmecn· sntxzpzrt tAsAAset» <xaot«n*ac fe? G?$CAÒCTSG T?5^AtTCT50 QS^SaCTtC SfACMtXtS StÒíiSTCtCf SAOAWCTíX 120 USTOCAGCCS 5TOSR.TTSAC Cm»S7AiSA ÍSTMCAtt» AC^SOSTCS!* «SAfSSCTSPER í*f· GSKfiAOsSfcEK ««GftOTÔâOT tmTAfAtf AttftOwVrà OTtAÍAtCAT ATACÍ&ÍSêÁ 2^0 á^*cr«*eA aosoccsatt «awxwcrcc *«*s*cwu« cçwwwicpç ò&» CÃMWASPA «CCmOAOA CfâftO&AOKSS «CTGTfctKrt ACtSKSCOAO G&ST4?AC>CA 340 otAoertrto act*c*®osg ccAf^sAese ctsgtcmcs iskctca
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável #1 da cadeia leve kapa de EI (VL) (a partir do 171 codao de iniciaçao (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:102): sssiS&sçác m mmmnm tmmmzm mm&rtçtm: im mmmxm mÈmmsm iss AMCCASG-GA AACCTCCTÃA SCTtCTGAf£ f ÃfG&7SSO ;θάΐ«® ítóã«Se f ss&tcT^-ss c?cfcÃC-e^t o^^odM s§o CA0ccm*iA« m^Twemz mm·fMmm mmmmm m& pp^ítsg&s $?cm& 4l|::
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável #2 da cadeia leve kapa de E1 (VL) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:46) : stsswosc a&oeeksct tctsttcctc cnct^ct eec^coh» rAc&rosâ*.·; m
S&M?τδτδΐ fS&CG£Â3TG TCCAQ3CACC CTSTCT'"TGT CTGCAGS5C-A MGfc&CfcCC i£íí CTCTCCT-KA. CGCCSACrCA GAGTGTtftSC ÍCCACATACT TMCCtSSm >X&3tÃ*3AAA 1S<J GC?GSCCftC-3 Ct£CSft»3CT GSTCATÍtAT GGrGdArSGR GGAGSSCCSi." TGÇSftTCCÇà C-A3A5GT;£& CCGGCASTGS G2trSSG/Cft GACCTCACTC TuACCÃTCAS CASAC7GG&S 3Sg CCrGMÇK.ní TTQCAGTGm TÍÀCTGTCÂG CAGTATSGTA C-CJGAftTGtA CACTfTTÇâSÇ 5&ÍJ CAStssmdSà A>5ct3GASAr çmr «o
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável #3 da cadeia leve kapa de EI (VL) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:103): atgèaaaègí: cAôqsoyser ?rrcirrc7c crGcr^crG? ggc*ccs*sa thocKCúG* m GMATIÈSSiS? 2G&ÇCG&GTC TCGÍíGSCftCC CTGTÍTTTGT CTGÇ&GGCSrv MGACCC&CC 3.Ê& Ç^KÍÃCk G5%:CAG7CA GAGT^mSC A3C?<D:nA:lT 7A303TS3TA SSASDSSíAA 1S& ííT^r^aQs ccrr&rcrAT ArAGSGSSÃt rsss&rrGís 2:«δ. ãr-i? AjsTTCS STSsSSEftí&ft èACTVCAvVi IGAC^StGAiS GMÁCtGGAS à0& r^tsM^rt wtmrcas gcíçasc-s^s sAessfosss .:s^. CíAAtS«s.GSA AS»3-í«CÍAA? SM? *2$ 172
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia pesada de E13 (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:42) : scasstísk
^ssmcíCTCC ΧΪ3 ?m5C*iSCCf íC8x&a?ÃAC ssems&tsx csssíkjt-scg cc&scctcca 2.80 gs%i&^c tí^ecstítM^ ?*ssc*5c»e cca?swu«» vua<Tta^'krercMim· *tawrr«»ft í^5Ámsí8 aàs
Ttfeeiíbs^ 'ítsmrtxàT® t^s^cRàs» no KÇOSCt&^S £5^§ 3Stó>3CSfC-S ϊ«ίίό2Ί'^Τ£· CTCA «20
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia leve kapa de F13 (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ id NO:4 7) :
IgjwaM&ccc ««ossawK»' «esattecse aaem&t&t o&stezc&mk ταομμ»®®» is s.^M-mf㧠««essaste íssssefôftfcee es$te*s*af eecs&8es®& n^mâcencc tw ttcwttum t&mçs&tçA aasmrsmç ms&mrass T^sççiwm szwcm*p& im ec»«aws ewe&ssç? cryaww »ami «cfc«sssa*e vmakwaoi. **o «to ©toc*st®§ mcm&mk matame Ttcm^wm QMwmm -se© síiswô» tnoem* rshofôtcm ^tcàaccm emftctm Μβ $3C£ÀMÉâft GÊMâC^SSà ®«Wtm 42t>
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável da cadeia pesada de F19 (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:44): 173 173 CStCCtSSfS c^&ssscre· cttcmtsít. sçôijaÃ&Rfc CATAtCftSWA: OSACACSSC? CCMAT&MT CtíGTXCAS €.¾ CSSASACCCt GTcgcTtAcc 12 a AKaSASCCG ccAGcrcccA asa Sa&stacgaa TTAGAACwCG s*a &3AACCSGT7 CTfCCTSAAG MQ «TSTSCCASA GATTGTAÇTS a$a SSACCÍCSS? CA-SCtfCTÇ.C «s.a íSSS DS do cADN da re
At-SMfrOCv TSÍOSTTCT: &g;ãslík.k: rcjcacT^r^r atsgtosssç
SGSSASSSGT 75®a5TSGAT TCCC?'>.ASA STCSaSTC&C CTStóC?^ tgasssscsc GC?8S7AS5S SCTACSACSS rck
Sequência
gÇS&CfcSÇ^C TíSAjAOCCT?
TftCftACTSSiC AOTCAT&Gfy
S&TACSTSíA ^cxATTÃCt TS'3S3C£AAS de nucleótidos variável #1 da cadeia leve kapa de F19 (VL) (a partir do codao de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:104): incteivtKc teAi-.rnr-rs sius^kctí* rícrítcs-;? cça&A-sr^c sçs x«r3S?g»cã tsctcessst· ctscatctssSJSCSMÍS&ííS» jjs
GtCwsMCA íiA^ACí.::" arnrv.im?G çtwcssíimí ífc
.AW?“«mG» ÍA:S'?:>i'TA?. SCfCCTSAaC TAtAStaÇAT #SW‘ÍT8£A «fCWSA»TÇ S4S :c»tTK«t t<ASts®ciMí tc>»>yc*©&« Μ*&»τη«ΐι evcrcMcm oiasftscGwsi ms •íaívcís-mg hrsrrasMS τταϊτ»ο«3ϊ cascssacts Acaftíecssç Tçccssrm: sea SSCSSAS^íA GAtrcass. 0φ·
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável #2 da cadeia leve kapa de F19 (VL) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:49):
AtgsAçstSR etg?ccccc-c tcasctscts qsgítttctsc tsctctgsct oss&qstgcc §s tg&fçrgecà çcçÂçnrGAC ccastctccr Ksrrecssr ctscatctst assac-rcaSa s.ao- GTCACCAÍCA COTS0CSG6C AAG^CGSSBC STrftACASJTS CTrfTGCGTG GTATCW3C3W3 i 8&
AASeCASSSA M5CTCCTAA S£TCCTG£T£ TRTSATeCO· CdASTTTSSA AASTHSGSSTC l^Sf CCAÍOASCÍ TCACCGGCAS TGSMCTSS® ACA«A?ÍTCA CTCTCACCAf CÀGCAÊSCTG 3Ô0 CASCCnSAAS ATTmBCAAC ÍTftJTACTG? CRAGAGTTT& ATÃSSTAÇOO· TÇTCRGTTTÇ 3£â-SCCSSASKSA CÇAASSTÍS&A SATSAAA -<2S cADN da região (VL) (a partir do
Sequência de nucleótidos do variável #3 da cadeia leve kapa de F19 174 codao de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:105): 930TO5OC6C ÍCASCíCCTS «StOCKCTSC TSCTCT5SCT CCCaOSfSCC '.A&Jtf8?ST€& KKsQATSÂC CCASTCTCCA JCCTíÃSTC? CTGCATCTAC *S3A«U3!SSR 1.2¾
StCACCSa iSS%$fÇÃ^ç Mmsos.ptf :Stfl^£0)§ilíj AAAOiAOGSA ::?iíyâ^£S2ír^·:: £3p^^Ç^i®^3FG: TATOGIGCM ÇClCmOím i®*© zc&*cwssi lammm Mmstmm $&mmTim cmfmm uso :^RSfSfW®: ^fffWC·.»#»
Sequência de nucleótidos do cADN da região variável #4 da cadeia leve kapa de F19 (VL) (a partir do codão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) (SEQ ID NO:106): ATgmvvvtc e^sto-GÃS-er? tcroTscotc ctxtactít o^etocc&Sà tacoaocsss. $« 5;,Μΐηητςτ TS^tACASTI ttCAOCCACC CIOTdPOt&I Ctt€A6SS&A AStA«téADt 126 çretdmo.o sssccAgte^ sgg?orrv:m or.nomríAO ccts-stAceA ocaçmacc? ioo e&ceAaeorc «rttssctce? caktatsai oíatccaâca ®m ««rtCAPR se^Taoecí itr.&rrcK& cc»e*Bees soo: «aftAfamrrc c^mrOott cro?c^&6 «mioisACi ôíXAitccsr sessee^ss m& «ACO*««1« OA-SVTtíAM «20;
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de E63 (sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:3): vjsuuw^tsç tQbgfSi^d, ^,ϊνίνίε^ι civsGGàv-v. ts ^3¾¾¾¾ s?£ FFGKSLOTG YiyySGSW tfPèiXS&VTr OVOCS^r-S t^fSSVTAAO .TAVíyÇASWl lâ:0 tM^SVGFO* WQpSTLVTVS $> :|$j0t 175
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve kapa de E63 (sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:8):
Se&ÃSfô&ISS s® ss^ifês&Efts (mmxatâs sswsMroeÈ «BK» *m
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de F23 (sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID N0:5): 6¾ 15Ç IMETLUífSA *fíiise£K'Kf: tids-p- «passam «tÂSKGYYOJ, D¥KSS5?rvr vss OOKdAsttKP sstuiítcm1 Ysesrs^Ytif svDTssofQfs wassvrAW» tawwsiwsi
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve kapa de F23 (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:10): tffiKEmOU. SU&LV&S*». KSAIÇLTQâ* Sffi-S*á¥30P VTXtCSASQS XâSMAKtOS §§ VMXMUtl ÍWSSUISS1? PSRFSSSCSG 70Γ?;*Π3$Ι< QBEWftTVYO %m íklStKV^lF wè
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de EI (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:1): mcjjSSíOsws· WFSSsrdts cwsgfefI®.:.rw«a<vR^t' s® : SStGS;W!Í£¥S g S SSYTlkm DSWStktíS M&SKKStSL OíffiíSLiíCiÊ;# &V rNARSlÁ i M-
Ito 176
Sequência de aminoácidos da região variável #1 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa (A)) (sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:82): «tyytsstesã. «moídos** msjwvot* vtrtewtôos isskakvsô «§/ (KÍSawaLZ YtaSSK£$3V PSBfSSSSSCs .TSPTL-TZSSJ» Q&s&íwrew
Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #2 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa (B))
(sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:6) :
«smct&rt XMmAxm§ smaros^sT ^LSjpesaM1 tsc&fcscsvs ^YtfwsQôK
SfcSSIfcfeSS' MW8&G&M &ffX»®ÍS8M ?80ifcViní«$! «STÊSI&HftfS SÊS «emfiiK isft
Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #3 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa (C))
(sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:83) : ί£££&&ά&£3& ϊεβ8»μ®8 «misses? rnseosf»? is**fc8gâ^§ ssvyseifôsfê so esgiim&s* sfcssjsfcsei? s&jsisssses αρκι,η®^ MttfMnnçg <&8SS**r?§ its SSSIWSJJ: iwê
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de E13 (sequência lider (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:2): wgtífsssass, vK&scstRts c^strr^í .s.sm§s?®0£s? íg sísaEtirass tssKSfiSSW Kwwws»n? ssR»esK»fl& 8?*w¥STf,& SS2»V5tf££ 5,60 177
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve kapa de E13 (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:7): 'jtmm&jan. cm-Tospef ifp&sqsvs slmwoo* «JMísmTcip· ssrfsgsí&kt ΒΓΚΛχδχι#. Q^lgftsrrrF iss s^smiÈíKfi iâõ
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de F19 (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID N0:4): wm vwuswfçLsc wosi*s«ss. zimmmm mmm&f m TBsssrsmp ssassiimgtr lssvtmstã imtsftmv 12$ W&WS&W S· lig:
Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #1 da cadeia leve kapa de F19 (F19kapa (A)) (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:90) :
memvw&s&e, jscsíowjêf qn-rmcic· j kpskvpsou ?s?xs'ssc$$ ^^ε^ατϊυ^ qsmsxFxr s$<s?*v£sk
Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #2 da cadeia leve kapa de F19 (Fl9kapa (B)) (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:9) : 178 : «smvpftstt eux&fcMs* wsneitôsp âsts*s^s&ft vtítcM&m íssafíaíysq m ;:.;^í»mu Ysíissfcssf? r§RE^sssfsg. rsrr&f xs.st :w$àmt$tç ^bs^xp^t?; mi .^ssmm iso
Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #3 da cadeia leve kapa de F19 (F19kapa (C)) (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:92) : su.simissa SLtSiàstasR v?iscs«saâ issxLSsmso sa RK55&PSUJ VàÃSlOSSSV PSSFSGSSSS Ttmxisct StSDFÃTfXC OQmfPYTF uz 49¾
Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #4 de F19 kapa (F19 kapa (D)) (sequência líder (a negrito) e região variável) (SEQ ID NO:92):
HSAS&QHvF C.C!'AF;LU,rY SSÔSOS lusswtís 'imNiVQQftf A3s.EA.Ts.tm RS^á$Sr& m.rí s §&l;r ttómmrCQQ 98^PVB$fc p ISO 180
Tabela 2: Iniciadores de ADN sintetizados SEQ ID NO: Nome ^Sequência de 5' para 3' | Comprimentoj 55 RACEUPS5’ j CTAATACGACTCACTATAGGGC :22-mero 56 lgG1p j T CTT GT CCACCTT GGT GTT GCTGGGCTT GT G i 31 -mero \ 57 HK5 jAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC Í30-mero \ 58 M13F l GTAAAACGACGGCCAGTG ;18-mero I 59 M13R jCAGGAAACAGCTATGAC i17-mero j 60 E63HF85 jAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTC 141-mero \ 61 E63HR38 Igagagagagagctagctgaggagacggtgaccagggt !37-mero 62 E63LF84 Iagagagagagatctctcaccatgtcgccatcacaactcattg |42-mero 63 E63LR43 IAGAGAGAGAGCGTACGTTT G AT CT CCACCTT GGT CCCT CC Í40-mero \ 179 SEQ NO: id | Nome í Sequência de 5' para 3' í Comprimento 64 j HH-2 i GCT GGAGGGCACGGT CACCACGCT G Í25-mero 65 HK-2 | GTT GAAGCT CTTT GT GACGGGCGAGC Í26-mero 66 ;F23HF86 | AGAGAGAG AGGT CG ACCACCAT GGACCT CCT GCACAAG AAC í 41-mero 67 ÍF23HR55 jAGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGT ;34-mero 68 !F23LF36 jAGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC |42-mero 69 j F23LR43 jAGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC :40-mero 70 IE1 HFSall jAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGGCTGTGCTGG í 41-mero 71 j E1 HRNhel jAGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGC !37-mero 72 F19HFSall iAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTC ! 41-mero 73 !F19HRNhel |AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT :37-mero 74 j E1 KF2+3Bglll Íagagagagagatctctcaccatggaaaccccagcgcagcttc |42-mero 75 |E1KR2BsiWI Iagagagagagcgtacgtttgatctccagcttggtcccctg |40-mero 76 E1KR3BsiWI Jagagagagagcgtacgtttgatttccaccttggtcccttg Í40-mero 77 F19KR1+2BsiWI |agagagagagcgtacgtttgatctccaccttggtccctcc Í40-mero 78 ! F19KR3BsiWI |agagagagagcgtacgtttgatctccagcttggtcccctg :40-mero 79 F19KF1+2+3Bglll jAGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC |42-mero 0 murganho KM™ está descrito, por exemplo, , em Fishwild et al. 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Lonberg et al. 2005 Nat. Biotechnol. 9:1117-1125; Tomizuka et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 722-7; Tomizuka 1997,
Nat. Genet. 16: 133-43. Devido à natureza do murganho KM™ (por exemplo, foram integrados mais do que um gene da cadeia kapa no genoma murino quando se gerou a estirpe mutante em kapa) , é possível haver mais do que um cADN de cadeia leve kapa expresso a partir de um hibridoma clonal. Para se determinar se é este o caso, sequencia-se no mínimo o cADN de dez clones. Nos casos em que se isolar mais do que um cADN da cadeia leve kapa de um anticorpo (por exemplo, EI e F19), são geradas diversas construções 180 contendo os diversos pares de cADN da cadeia pesada combinado com cada um dos cADN das cadeias kapa. Transfectam-se estas construções de expressão para células 293F utilizando o 293FECTIN (Invitrogen, San Diego, CA). Testam-se então os sobrenadantes das culturas ao fim de setenta e duas horas quanto à actividade dos anticorpos para se identificar ou os pares correctos de cadeia pesada e cadeias leves que se liga(m) imunoespecificamente a hLIGHT (por exemplo, por transferência Western, ELISA ou outro método semelhante). É favor consultar o Exemplo 3 adiante acerca de um exemplo de um método para caracterizar anticorpos (por exemplo, EI e F19) que possuam múltiplas cadeias kapa.
Produção de anticorpo recombinante humano anti-hLIGHT a partir de células 293F: Mantiveram-se culturas de células 293F em meio de expressão Freestyle 293 enquanto se agitou a ~120 rpm/minuto numa incubadora humidificada sob 8 % de C02 a 37°C. Para uma expressão transiente de anticorpos recombinantes, transfectam-se 3 xlO7 células 293F com 30 pg de cada plasmideo codificando para as versões recombinantes de IgGl de qualquer um dos anticorpos E63 F23 anti-hLIGHT, utilizando 293-fectina (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. Deixam-se crescer os transfectantes em suspensão em 30 mL de meio de expressão FREESTYLE 293 durante 5 dias nas condições normais de crescimento. Separa-se o meio de crescimento e removeram-se as células por centrifugação a uma velocidade de 300 g, seguida por uma filtração através de um filtro de 181 0,22 μιη. Determina-se a concentração em anticorpo presente neste material não purificado por ELISA para hlgG e utiliza-se em ensaios in vitro para avaliar as propriedades funcionais dos anticorpos de cada subclasse.
RESULTADOS
Imunizaram-se murganhos KM™ com hLIGHT solúvel recombinante marcado com FLAG em CFA/IFA. Diversos de entre os murganhos criaram anticorpos anti-hLIGHT específicos, sendo a gama de títulos específicos para IgG humanos hLIGHT medida por ELISA e análise de contrastação FACS de células hLIGHT-EL4. Fundiram-se os esplenócitos dos que mais fortemente reagiram com células de mieloma para gerar hibridomas produzindo anti-hLIGHT humanos. Determinou-se a produção dos anticorpos anti-hLIGHT pelos hibridomas individuais neste despiste inicial por ELISA anti-hLIGHT. Neste despiste, o anticorpo anti-FLAG tinha sido revestido sobre a placa para capturar hLIGHT recombinante marcado com FLAG, num esforço bem-sucedido para mascarar o epítopo FLAG e evitar o isolamento de hibridomas produzindo anticorpos anti-FLAG. Utilizou-se meio dos clones positivos no ELISA num despiste secundário, por citometria de fluxo, contrastando a linha de células hLIGHT-EL4 para confirmar a identificação de anticorpos que se ligam imunoespecificamente à forma nativa de hLIGHT.
Testaram-se os hibridomas positivos em relação à sua actividade antagonista colocando em série as 182 capacidades dos anticorpos produzidos pelo hibridoma para bloquear a ligação de HVEM:F c e de LTPR:Fc a células hLIGHT-EL4. Normalizou-se esta actividade de bloqueio à concentração em anticorpos determinada por ELISA de IgG humano. Clonaram-se os 15 melhores candidatos por diluição limitativa para se obterem hibridomas monoclonais, congelando-se os restantes. Produziram-se purificações em pequena escala a partir de culturas de extinção (<1 mg) para estes 15 anticorpos, para uma caracterização mais pormenorizada e para os colocar em série de acordo com os seguintes critérios: afinidade de ligação relativa a hLIGHT, capacidade de bloquear a ligação de HVEM:Fc e de Ll^R:Fc humanos a células hLIGHT-EL4, bloqueio cruzado uns dos outros, e a capacidade de bloquear a secreção de quimioquinas por parte de hLIGHT solúvel e expresso à superfície de células, da linha de células epiteliais do cólon HT29.14s. Com base nestes estudos apresentam-se as propriedades dos 5 melhores candidatos seleccionados (El, E13, E63, F23 e F19) na FIG. 3.
Os anticorpos monoclonais El, E13, E63, F23 e F19 anti-hLIGHT ligaram-se todos eles à linha de células T activadas humanas (1123.D7) e à linha expressando hLIGHT de forma estável hLIGHT-EL4, mas não às células EL4 de origem nem às 1123.D7 não activadas (FIG. IA) . A ligação destes anticorpos humanos anti-hLIGHT chegou à saturação (FIG. 1B) . Determinou-se a afinidade funcional no estado estacionário para cada um dos anticorpos titulando a quantidade de anticorpo necessária para marcar as células 183 hLIGHT-EL4 (FIGS. 2A e 2B). Levou-se a cabo uma análise de regressão não linear para determinar a quantificação da afinidade de ligação funcional ou EC50 para cada candidato (FIG. 3). Observou-se uma gama de afinidades funcionais. Um valor pequeno de EC50 bem como um elevado teor de contaste (intensidade média de fluorescência (MFI)) à saturação eram ambos considerados ideais durante durante o processo de e de selecção.
Testaram-se os anticorpos por ELISA para se determinar se competem uns com os outros para ligação a hLIGHT solúvel (FIG. 4). Identificaram-se dois grupos epitópicos de hLIGHT nesta análise. Os "anticorpos E" (El, E13, e E63) bloqueiam em cruzado uns com os outros, e os "anticorpos F" (F19 e F23) bloqueiam-se em cruzado. No entanto, os "anticorpos E" não conseguiam bloquear em cruzado os "anticorpos F" e vice-versa. Tal como se esperava, todos os anticorpos se bloqueavam a eles próprios neste ensaio.
Mostra-se a capacidade dos El, E13, E63, F23 e F19 para bloquear a ligação das proteínas de fusão humanas HVEM:Fc e ΗΤβ]3.:Νο a hLIGHT expresso à superfície celular utilizando um ensaio de citometria de fluxo nas FIGS. 5A e 5B, e nas FIGS. 6A e 6B, respectivamente. Nestas experiências, adicionaram-se quantidades diferentes e conhecidas de cada anticorpo a uma linha de células EL4-hLIGHT e em seguida adicionou-se uma quantidade inferior à de saturação da proteína de fusão do receptor. Detectaram- 184 se as proteínas de fusão do receptor quer com anticorpos anti-His para L^R:Fc marcada com His, quer com estreptavidina-PE para HVEM:Fc biotinilada. Tal como se mostra, cada um dos anticorpos bloqueava quer a proteína de fusão com receptor desse ligar a hLIGHT, em contraste com o controlo, anticorpo anti-gripe M2 completamente humano que não tinha qualquer efeito sobre a ligação de qualquer das fusões Fc-receptor. Nas diversas experiências, todos os anticorpos bloqueavam a ligação ao receptor de um modo dependente da dose, permitindo uma análise por regressão não linear para determinar a dose IC50 (FIG. 3). Levaram-se em consideração estes valores quando se classificaram em série os candidatos potenciais.
Para provar directamente que os anticorpos antagonistas da invenção bloqueiam a sinalização mediada por hLIGHT, estabeleceu-se um ensaio para medir a sinalização mediada por hLIGHT in vitro. Para este propósito, tratou-se e linha de células epiteliais do cólon HT29.14s, que expressa tanto LTPR como HVEM, com diversas quantidades conhecidas de hLIGHT solúvel e analisaram-se os meios de cultura quanto à presença de citoquinas segregadas ao longo de um período de tempo de diversos dias. Utilizando testes ELISA habituais e análise multiplex de um conjunto de suspensões, determinou-se que o hLIGHT induz CCL20, IL-8 e RANTES de um modo dependente da dose (FIG. 7 e FIGS. 8A e 8B). A FIG. 7 representa uma titulação da dose de hLIGHT solúvel colhido no dia 3. Utilizou-se TNF recombinante como controlo positivo para a indução de 185 quimioquinas através dos receptores de TNF, e a linfotoxina (ΙϋΤοίιβ2) como controlo positivo para a sinalização através de LT3R. Utilizou-se fosfatase alcalina bacteriana marcada com FLAG (FLAG-BAP) a titulo de controlo proteico negativo irrelevante. Tal como se esperava, os teores em quimioquinas produzidas levando ao contacto a células com o hLIGHT eram equivalentes aos induzidos por ΗΤαβ, enquanto o TNF era mais eficaz na indução de CCL20 e de IL-8, mas induzia teores semelhantes de RANTES. Este ensaio de reacção celular é utilizado para quantificar a sinalização do hLIGHT e para avaliar a capacidade dos anticorpos da especificação presente para bloquear eventos de sinalização mediados por hLIGHT in vitro.
No ensaio de indução de CCL20 mediada por hLIGHT em células HT29.14s, incubaram-se previamente diferentes quantidades conhecidas de anticorpos anti-hLIGHT com uma quantidade constante do hLIGHT solúvel recombinante, e depois adicionou-se a células HT29.14s (FIG. 9). Determinaram-se os teores em quimioquinas no dia 3 ou no após o tratamento e comparou-se com os teores induzidos por hLIGHT solúvel por si só, ou por hLIGHT solúvel previamente incubado com anticorpo irrelevante completamente humano, M2 anti-gripe, proteína utilizada a título de controlo de isotipo. Nestes ensaios, os anticorpos da invenção testados neste documento bloqueavam a indução de CCL20 mediada por hLIGHT solúvel, de um modo dependente da dose. Em alguns casos, conseguiram obter-se valores de IC50 por análise de regressão não linear. 186
Sem pretender depender de uma qualquer teoria ou de um qualquer mecanismo, crê-se que a sinalização iniciada pela ligação de hLIGHT à superfície celular, aos seus receptores conhecidos em outras células, possa ser crítica para exercer actividade co-estimuladora das células T, através de interacções com HVEM, ou o aumento de secreção de quimioquinas através de LT3R expresso em células com origem no estroma ou epiteliais nos intestinos, no baço ou nos nodos linfáticos. A indução de CCL20 nos intestinos parece ser mais regulada pela expressão dos ligandos ΕΤβϊΙ nas células que entram em contacto com células epiteliais, do que por factores solúveis (Rumbo et al. 2004 Gastroenterology, 127, 213-23). Desenvolveu-se portanto um ensaio para a determinação da importância da sinalização por hLIGHT na superfície celular da capacidade dos anticorpos para bloquear hLIGHT da superfície celular. Neste ensaio, utilizaram-se células hLIGHT-EL4 fixadas com formalina para induzir quimioquinas, incubando-as com células HT29.14s de um modo semelhante ao utilizado no ensaio com hLIGHT solúvel. Estas células induziam CCL20 e RANTES a teores equivalentes aos obtidos com hLIGHT solúvel. Depois de se incubarem previamente quantidades diferentes e conhecidas anticorpos anti-hLIGHT com células hLIGHT-EL4 fixadas, a indução de RANTES ficava bloqueada até aos teores observados quando não se adicionavam células expressando hLIGHT (FIG. 10). Em experiências idênticas observou-se um bloqueio idêntico de CCL20. Tomados conjunto, estes dados indicam que os anticorpos 187 especificação presente conseguem bloquear a sinalizaçao de hLIGHT, tanto solúvel como ligado à membrana, in vitro.
EXEMPLO 2 ~ CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE MURGANHO ΑΝΤΙ-HUMANO COMERCIALMENTE DISPONÍVEIS
Bloqueio cruzado com anticorpos. Levaram-se a cabo experiências de bloqueio cruzado tais como as descritas no Exemplo 1, recorrendo a anticorpos monoclonais de murganho anti-hLIGHT disponíveis junto da R&D Systems ("mAb de murganho da R&D") e da Abnova ("mAb de murganho da Abnova"), bem como aos anticorpos monoclonais anti-hLIGHT humanos identificados no Exemplo 1, para se determinar qual era o epítopo de hLIGHT ao qual os anticorpos se ligavam. Apresentam-se os resultados na FIG. 11.
Os resultados mostram que o mAb de murganho da R&D se liga ao mesmo epítopo que os anticorpos monoclonais El, E13, e E63 humanos ("anticorpos E humanos"), bem como ao mesmo epítopo ao qual se ligam os anticorpos monoclonais humanos F19 e F23 ("anticorpos F humanos"). Deste modo, em contraste como os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT E & F identificados no Exemplo 1, que se verificou ligarem-se imunoespecificamente a apenas um de entre dois epítopos distintos, o mAb de murganho da R&D liga-se a ambos os grupos epitópicos de hLIGHT. Isto é, os anticorpos E humanos e os anticorpos F humanos identificados no Exemplo 1 não se bloqueiam em cruzado uns aos outros. Os 188 anticorpos E humanos bloqueavam em cruzado outros anticorpos E humanos e os anticorpos F humanos bloqueavam em cruzado outros anticorpos F humanos; e tanto os anticorpos E humanos como os anticorpos F humanos eram capazes de bloquear em cruzado os anticorpos de murganho da R&D. De forma semelhante, o mAb de murganho da R&D bloqueava em cruzado tanto os anticorpos E humanos como os anticorpos F humanos.
Os resultados também mostram que o mAb de murganho da Abnova não se liga a nenhum epitopo ao qual se ligam tanto os anticorpos E humanos como os anticorpos F humanos. Isto é, o mAb de murganho da Abnova não é bloqueado em cruzado por nenhum dos anticorpos humanos El, E13, E63, F19 ou F23, nem o mAb de murganho da Abnova era capaz de bloquear em cruzado nenhum dos anticorpos humanos El, E13, E63, F19 ou F23.
Actividade de bloqueio dos anticorpos em relação à ligação entre HVEM:Fc e células 293 hLIGHT. Testaram-se os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT El, E13 e F19, o mAb de murganhos da R&D, anticorpos policlonais comercialmente disponíveis de cabra anti-hLIGHT (R&D Systems), e anticorpos policlonais de coelho anti-hLIGHT (eBioscience), quanto à sua capacidade de bloquear a ligação de HVEM:F c a células 293 expressando hLIGHT, tal como se descreveu no Exemplo 1. Mostram-se os resultados na FIG. 12 e na FIG. 14B. Todos estes quatro anticorpos monoclonais eram capazes de inibir a ligação de um modo 189 dependente da dose, tal como se determinou por análise FACS. Os anticorpos policlonais de cabra da R&D também eram capazes de inibir a ligação ao HVEM:Fc, enquanto o anticorpo policlonal da eBioscience não o era.
Actividade de bloqueio de anticorpos em relação á ligação entre LTPRiFc e células 293 hLIGHT. Testaram-se os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT El e E13, o mAb de murganhos da R&D, anticorpos policlonais comercialmente disponíveis de cabra anti-hLIGHT (R&D Systems), e anticorpos policlonais de coelho anti-hLIGHT (eBioscience), quanto à sua capacidade de bloquear a ligação de LT(3R:Fc a células 293 expressando hLIGHT tal como se descreveu no Exemplo 1. Mostram-se os resultados nas FIG. 13 e FIG. 14B. Todos estes quatro anticorpos monoclonais eram capazes de inibir a ligação de um modo dependente da dose, tal como se determinou por análise FACS. Os anticorpos policlonais de cabra da R&D também eram capazes de inibir a ligação ao LT3R:Fc, enquanto o anticorpo policlonal de coelho da eBioscience não o era.
Ligação a hLIGHT nativo e desnaturado. Cinco microgramas de hLIGHT solúvel humana foram quer fervidos em amostras de tampão 2 x SDS (desnaturados), quer não tratados (nativo), e depois ambos foram diluídos em série em decrementos de 6 x. Colocaram-se em simultâneo 5 pL de cada uma das diluições de hLIGHT sobre membranas hidratadas de 0,2 pm em PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando uma multipipeta com 8 canais. Deixaram-se secar as manchas e 190 voltaram a hidratar-se, bloquearam-se (com 1 x TBST (soro salino tamponizado com Tris e Tween-20) + 2,5 % de leite magro + 0,02 % de azida de sódio) . Sondou-se cada uma das manchas com 5 pg/mL de cada um dos anticorpos primários (veja-se adiante). Lavaram-se as manchas 3 x com lx TBST e em seguida trataram-se com Ab biotinilados secundários (Biotina-Cabra α-Humano (Vector Labs, Burlingame, CA), Biotina-Cabra α murganho (Jackson labs, Bar Harbor, ME) , Biotina-Murganho α cabra (Sigma-Aldrich corp., St. Louis, MO)), a 5 pg/mL. Lavaram-se as manchas 3x com lx TBST e em seguida com super SA-HRP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Utilizou-se a quimioluminescência para a detecção utilizando o estojo de detecção ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e visualizou-se o sinal por exposição numa película X-OMAT AR (Kodak, Rochester, New York)
Os anticorpos primários testados foram os anticorpos El, E13, E63, F19, F23 humanos anti-hLIGHT (veja-se o Exemplo 1), anticorpos monoclonais de murganho anti-hLIGHT comercialmente disponíveis junto da R&D Systems ("mAb de murganho da R&D") e os da Abnova ("mAb de murganho Abnova"), uma preparação de anticorpo policlonal de cabra anti-hLIGHT (R&D Systems "pAb de cabra da R&D") e duas preparações de anticorpos policlonais de coelho anti-hLIGHT (da eBioscience ("pAb de coelho da eBioscience") e da Peprotech ("pAb de coelho da Peprotech")).
Mostram-se os resultados na FIG. 15 e na FIG. 16. Os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT "anticorpos 191 E" da especificação presente (El, E13 e E63) testados neste ensaio, ligam-se imunoespecificamente tanto às formas nativas como às desnaturadas do hLIGHT solúvel (FIG. 15A e FIG. 16). 0 anticorpo E63 liga-se imunoespecificamente a menores concentrações em hLIGHT nativo (o limite inferior de detecção é de 3,9 ng de hLIGHT nativo) do que a hLIGHT desnaturado (o limite inferior de detecção é de 139 ng de hLIGHT desnaturado). 0 anticorpo El também se liga imunoespecificamente a menores concentrações de hLIGHT nativo (o limite inferior de detecção é de 23 ng de hLIGHT nativo) em comparação com hLIGHT desnaturado (o limite inferior de detecção é de 139 ng de hLIGHT desnaturado). O anticorpo E13 liga-se imunoespecificamente tanto à forma nativa como à desnaturada de hLIGHT sendo o limite inferior de detecção de 0,64 ng para ambas as formas de hLIGHT.
Em contraste com os anticorpos monoclonais E humanos anti-hLIGHT, os anticorpos monoclonais F humanos anti-hLIGHT da especificação presente (F19 e F23), testados neste ensaio, ligam-se imunoespecificamente à forma nativa de hLIGHT solúvel (o limite inferior de detecção é de 23 ng de hLIGHT nativo), mas não à forma desnaturada, mesmo às concentrações mais elevadas (>5.000 ng) de hLIGHT desnaturado (FIG. 15A e FIG. 16).
Testou-se cada um dos anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis de murganho anti-hLIGHT (mAb de murganho da R&D e mAb de murganho da Abnova) que se ligaram imunoespecificamente tanto às formas nativa como 192 desnaturada de hLIGHT solúvel. 0 mAb de murganho da R&D liga-se imunoespecificamente a menores concentrações em hLIGHT nativo (o limite inferior de detecção é de 23 ng de hLIGHT nativo) em comparação com hLIGHT desnaturado (o limite inferior de detecção é de 139 ng de hLIGHT desnaturado). 0 mAb de murganho da Abnova liga-se imunoespecificamente a concentrações aproximadamente iguais tanto da forma nativa como da desnaturada de hLIGHT solúvel (o limite inferior de detecção é de 0,64 ng de hLIGHT nativo ou desnaturado, respectivamente).
As três preparações comercialmente disponíveis de anticorpos policlonais anti-hLIGHT (pAb de cabra da R&D, Ab de coelho da eBioscience, e pAb de coelho da Peprotech) ligavam-se todas tanto à forma nativa como à desnaturada de hLIGHT solúvel. O pAb de cabra da R&D liga-se imunoespecificamente a concentrações ligeiramente inferiores de hLIGHT nativo (o limite inferior de detecção é de 0,04 ng de hLIGHT nativo) em comparação com hLIGHT desnaturado (o limite inferior de detecção é de 0,13 ng de hLIGHT desnaturado). O Ab de coelho da eBioscience também se liga imunoespecificamente a concentrações ligeiramente inferiores de hLIGHT nativo (o limite inferior de detecção é de 0,4 ng de hLIGHT nativo) em comparação com hLIGHT desnaturado (o limite inferior de detecção é de 1,2 ng de hLIGHT desnaturado). De um modo semelhante, o pAb de coelho da Peprotech também se liga imunoespecificamente a concentrações ligeiramente menores de hLIGHT nativo (o limite inferior de detecção é de 0,04 ng de hLIGHT nativo) 193 em comparação com hLIGHT desnaturado (o limite inferior de detecção é de 0,13 ng de hLIGHT desnaturado).
Inibição da actividade biológica de células que expressam um receptor de hLIGHT. Também se fizeram experiências tal como as descritas no Exemplo 1 para determinar se os anticorpos monoclonais de murganho anti-hLIGHT comercialmente disponíveis eram capazes de bloquear competitivamente o hLIGHT solúvel em ligar-se a LThR e HVEM expressos à superfície de células HT29.14s. Os resultados estão apresentados na FIG. 17 (CCL20) e na FIG. 18 (RANTES), e mostram que nem o mAb de murganho da R&D nem o mAb de murganho da Abnova mouse mAb eram capazes de inibir a produção de quimioquinas CCL20 ou RANTES mediadas por LIGHT, por estas células, enquanto ο E13 humano e o F23 humano eram mAb capazes de diminuir a secreção de quimioquinas até aos seus níveis de ruído. EXEMPLO 3 - CARACTERIZAÇÃO DAS CADEIAS ΚΑΡΑ DE ANTICORPOS ΑΝΤΙ—hLIGHT HUMANOS F19 E El
Utilizaram-se os processos descritos no Exemplo 1 para encontrar um par preferido das cadeia kapa-cadeia pesada dos anticorpos produzidos pelos hibridomas El e F19. Com base nos resultados destas experiências, mostrou-se que a El kapa(B) (SEQ NO:6) é a cadeia kapa leve dos anticorpos hLIGHT produzidos pelo hibridoma El, e que a F19kapa(B) (SEQ NO: 9) é a cadeia kapa leve preferida dos anticorpos hLIGHT produzidos pelo hibridoma de F19. 194
Geraram-se anticorpos recombinantes com cadeia singela kapa por transfecção transiente de vectores de expressão de mamíferos contendo os genes da cadeia pesada acoplados com cada um dos genes individuais da cadeia kapa que existiam na células de hibridoma de origem. Testou-se então este material em paralelo com os anticorpos purificados gerados dos hibridomas de origem respectivos.
Levaram-se a cabo ensaios de ligação a anticorpos tal como se descreveram no Exemplo 1. 0 par cadeia kapa-cadeia pesada que incluía a El kapa(B) ou a F19kapa(B) contrastavam especificamente linhas de células estavelmente transfectadas com hLIGHT, (HEK 293-hLIGHT) a um grau equivalente em comparação com as tratadas com os anticorpos produzidos pelo hibridoma de origem respectivo (FIG. 19).
Levaram-se a cabo experiências por ELISA de bloqueio cruzado tal como as indicadas no Exemplo 1, e os resultados indicavam que estes anticorpos recombinantes reconhecem os mesmos epítopos no hLIGHT que os anticorpos provenientes dos seus hibridomas de origem (Figura 20).
Testaram-se também os anticorpos recombinantes com uma cadeia kapa singela tal como se descreveu no Exemplo 1, para se determinar a sua capacidade de bloqueio da ligação entre hLIGHT expresso à superfície das células a formas solúveis de fusão receptor-Fc tanto de HVEM como de 195 Ι^βί! humanos (FIG. 21) . Os teores do bloqueio não eram idênticos aos conseguidos com os anticorpos de origem.
Por último, the recombinante testaram-se os anticorpos com kapa singela quanto à sua capacidade de inibir a secreção de CCL20 mediada por LIGHT a partir de células epiteliais do cólon HT29, tal como se descreveu nos Exemplos I e 2 (FIG. 22 e FIG. 23) . Nestas experiências, a incubação de hLIGHT solúvel com anticorpos anti-hLIGHT bloqueia a secreção de CCL20 mediada por hLIGHT por parte das células HT29.14s, à semelhança do que acontece com os hibridomas de origem.
Além disto, os recombinantes com cadeia kapa singela também mantêm a especificidade dos anticorpos produzidos pelo hibridoma de origem na avaliação através de transferências pontuais, de LIGHT nativo em relação ao desnaturado (dados não presentes).
Em conjunto, estes resultados indicam que Elkapa(B) (SEQ ID NO:6) é a cadeia leve kapa preferida para utilização em combinação com a cadeia pesada de EI (SEQ ID N0:1), e que a F19kapa(B) (SEQ ID N0:9) é a cadeia kapa leve preferida para utilização em conjunto com a cadeia pesada de F19 (SEQ ID N0:4).
EXEMPLO 4 - LIGAÇÃO DE ANTICORPOS E BLOQUEIO MEDIADO POR ANTICORPOS DA LIGAÇÃO DE HVEM:FC E DE LTgRiFC 196
BINDING A VARIANTES COM POLIMORFISMO DE UM ÚNICO NUCLEÓTIDO (SNP) DE LIGHT
Existem pelo menos duas variantes não sinónimas de polimorfismos de um único single nucleótido para o LIGHT humano (FIG. 24) . Uma variante SNP codifica quer para um ácido glutâmico (E) ou para uma lisina (K) na posição de aminoácido 214, e a outra variante SNP codifica quer para uma serina (S), quer para uma leucina (L) na posição de aminoácido. Tal como se ilustra nas FIGS. 24A-24B, a frequência alélica de cada uma das variantes SNP no que toca a uma população com diversas etnicidades, varia. Deste modo, os anticorpos hLIGHT que se ligam a uma determinada variante de SNP podem ser mais eficazes no tratamento ou na prevenção de uma doença mediada por hLIGHT, ou de um seu sintoma, nas populações étnicas que apresentam uma maior incidência dessa variante SNP.
Neste exemplo, mostrou-se que os anticorpos hLIGHT proporcionados neste documento se ligavam a
variantes não sinónimas de SNP de hLIGHT SNP que estão presentes nos hLIGHT extracelulares e de dominios do citoplasma . A ligação destes anticorpos a variantes SNP também se correlacionava com a capacidade do anticorpo para bloquear efectivamente a ligação de HVEM:Fc e de LT(3R:Fc à variante SNP de hLIGHT, bloqueando também eficazmente a actividade biológica de células expressando um receptor de hLIGHT. 197
Ligação a anticorpos. Levaram-se a cabo titulações de dose dos anticorpos F23 e EI kapa(B) tal como no Exemplo 1 para se determinar se estes anticorpos se ligam a variantes SNP de hLIGHT expressas à superfície. Utilizou-se uma linha de células EL4 nestas experiências, que foi preparada essencialmente tal como se descreveu no Exemplo 1, e que expressava à superfície estavelmente a variante SNP de hLIGHT respectiva. Tal como se ilustra respectivamente nas FIGS 25A e 25C,os anticorpos F23 e Elkapa(B) ligavam-se tanto às variantes SNP 214E-32S como às 214E-32L. No entanto, tal como se mostra na FIG. 25B, só o anticorpo F23, e não o anticorpo Elkapa(B), reconhecia a variante SNP 214K-32S.
Os anticorpos F23 (um IgGl), F19, E63 e Elkapa(B) foram também testados para determinar se havia uma diferença entre s capacidades dos "anticorpos F" e as dos "anticorpos E" no reconhecimento de qualquer uma das formas de uma variante SNP. Tal como se ilustra nas FIG. 26A e 26B, os anticorpos F23 e F19 ligam-se tanto à forma SNP 214E como à 214K de hLIGHT. No entanto, os anticorpos E63 e Elkapa(B) só se ligam à forma predominante de SNP de LIGHT 214E, e não à 214K (FIGS. 26A e 26B).
Actividade de bloqueio por anticorpos da ligação de HVEMiFc e de LTgRrFc, com a SNP de LIGHT, variante 214K-32S. Uma vez que o anticorpo F23 se ligava tanto à forma predominante (214E) como à forma menos predominante (214K) das variantes de LIGHT, determinou-se em seguida se o 198 anticorpo F23 conseguia bloquear a ligação de HVEM:Fc ou de ΕΤβΚ:Ρο. 0 bloqueio mediado por anticorpos em relação às proteínas de fusão com receptor foi evado a cabo tal como no Exemplo 1. Em suma, incubou-se a linha de células EL4-214K-32S com quantidades crescentes de anticorpos anti-LIGHT seguindo-se a adição quer de HVEM:Fc, quer de LTPR:Fc. os efeitos desta incubação prévia sobre a ligação ao receptor foram avaliados pela detecção quer de HVEM:Fc, quer de LTPR:Fc, tal como no Exemplo 1. Tal como se ilustra na FIG. 25D, o anticorpo F23 bloqueou eficazmente tanto a ligação de HVEM:Fc como a de ΕΤβΕ:Γο à variante LIGHT 214K-32S.
Inibição da actividade biológica de células expressando um receptor LIGHT mediada por variantes SNP de LIGHT à superfície celular. Este estudo foi levado a cabo para determinar se os anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT que se havia previamente mostrado ligarem-se tanto às variantes SNP 214K como 214E de hLIGHT eram ambas capazes de bloquear eficazmente a secreção de RANTES em células humanas do epitélio do cólon, HT29.14s, que expressam tanto ΗΤβΗ como HVEM, quer por hLIGHT 214E expresso à superfície das células, quer pela variante SNP 214K, ou por variantes SNP de hLIGHT solúvel. No ensaio de indução de RANTES por LIGHT expresso na superfície celular em HT29.14s, incubaram-se previamente quantidades variadas e conhecidas de anticorpos anti-hLIGHT com um número constante de células que expressam variantes SNP de hLIGHT (214K ou 214E) . Determinaram-se os teores no dia 3 após o 199 tratamento e compararam-se aos teores induzidos por hLIGHT solúvel por si só, os das células expressando hLIGHT por si só ou das células previamente incubadas com um IgG irrelevante humano, como proteína de controlo de isotipo.
Nestes ensaios, os anticorpos proporcionados neste documento (F19 e F23) bloqueavam a indução de RANTES mediada tanto por hLIGHT solúvel como por ambas as variantes SNP de hLIGHT expressas à superfície das células (214E ou 214K), de um modo dependente da dose. O anticorpo monoclonal anti-hLIGHT de murganho comercialmente disponível junto da R&D Systems (o mAb de murganho da R&D, tal como no Exemplo 1) não era capaz de bloquear a secreção de quimioquinas mediada por hLIGHT, quer solúvel, quer expresso à superfície celular, independentemente da variante SNP . Os controlos positivos para ambas as variantes SNP de hLIGHT expressas à superfície e para hLIGHT recombinante solúvel induziam teores equivalentes de RANTES, e uma incubação prévia do controlo negativo, IgG de controlo do isotipo quer com as variantes de hLIGHT expressas à superfície, quer com o recombinante solúvel, não diminuíam os teores em RANTES de modo significativo.
Discussão. Dos mais de trinta polimorfismos de um só nucleótido (SNP) no local genómico de hLIGHT, existem pelo menos dois hLIGHT não sinónimos que têm dados de frequência associados a eles (FIG. 24). Um codifica para um ácido glutâmico (~0,9) ou para uma lisina (0,1) na posição de aminoácido 214 do hLIGHT e reside na região extracelular 200 do hLIGHT. O outro codifica quer para uma serina (0,99) ou uma leucina (0,011) no resíduo de aminoácido 32 e reside na região citoplásmica do hLIGHT. 0 local genómico de hLIGHT reside numa região cromossómica, chl9pl3.3, que contém um local de susceptibilidade à doença inflamatória do intestino (Rioux et al. (2000) Am. J. Hum. Genet. 66: 1863-70), e sugere portanto que uma SNP pode correlacionar com a frequência da doença IBD. Tinha portanto interesse determinar se os anticorpos antagonistas anti-hLIGHT proporcionados neste documento eram capazes de reconhecer variantes SNP não sinónimas de hLIGHT.
Neste exemplo, testou-se a capacidade dos anticorpos anti-hLIGHT para se ligarem às variantes SNP de hLIGHT SNP estavelmente expressas à superfície de linhas de células EL4. Tal como se ilustra nas FIGS 25A e 25B, a F23 liga-se a ambas as variantes SNP 214E e 214K, enquanto a Elkapa(B) apenas se liga à forma predominante 214E. e igual modo, o F23 bloqueia quer a ligação de quer HVEM:Fc, quer LTpR:Fc a estas células (FIG. 25D). Tal como se esperava, a SNP citoplásmica não parece afectar a ligação de qualquer um dos anticorpos (FIG. 25C). Quando se testaram os "anticorpos E" e os "anticorpos F", só os anticorpos F eram capazes de se ligar tanto a variantes SNP 214K como a 214E (FIGS. 26A e 26B). O anticorpo comercial de murganho da R&D também era capaz de se ligar a ambas as variantes SNP (dados não incluídos). 201
Além do bloqueio pelos anticorpos anti-hLIGHT de versões solúveis dos receptores variantes SNP de LIGHT in vitro, também era inibida a indução de quimioquinas mediada por SNP de hLIGHT da superfície celular pelos anticorpos anti-hLIGHT da especificação presente. Neste ensaio, fixaram-se com formalina linhas de células EL4 expressando variantes SNP de hLIGHT, quer 214E, quer 214K, e utilizaram-se para tratar a linha de células epiteliais do cólon HT29. Tal como se ilustra na FIG. 27, estas linhas de células por si sós induziam teores em RANTES semelhantes aos obtidos utilizando 1 pg de LIGHT solúvel. Testaram-se os "anticorpos F" anti-hLIGHT fazendo uma incubação prévia das linhas de células expressando hLIGHT com quantidades crescentes de anticorpo, e comparou-se com controlos do isotipo ou com o mAb de murganho da R&D comercialmente disponível. Tanto F23 como F19kapa(B) inibiam a secreção de RANTES mediada por qualquer uma linhas de células expressando qualquer uma das variantes SNP. No entanto, o mAb de murganho da R&D e o controlo negativo de isotipo humano não inibiam a secreção de RANTES por nenhuma das variantes SNP de LIGHT. Isto acontecia apesar do facto de que este mAb de murganho da R&D era capaz de se ligar a ambas as variantes SNP. Estes resultados não só demonstram que os anticorpos F23 e F19kapa(B) desta descrição bloqueiam quer a sinalização pelas variantes SNP de LIGHT, mas além disto exibem superioridade em relação ao mAb comercial de murganho da R&D. 202
EXEMPLO 5 ~ ESTUDO DA EFICÁCIA IN VIVO DE 124F23 NO MODELO DA DOENÇA AGUDA XENOGÉNICA DO HOSPEDEIRO EM RELAÇÃO AO TRANSPLANTE
Neste exemplo, avaliou-se a eficácia in vivo de um anticorpo anti-hLIGHT proporcionado neste documento num modelo murino de doença aguda xenogénica de hospedeiro em relação a transplante (GVHD). Mostrou-se que o anticorpo F23 diminuia neste modelo a patologia global em conjunto (diarreia, inflamação peritoneal e áscitos, e inflamação intestinal) bem como a histopatologia (severidade da inflamação, extensão da inflamação, lesões nas vilosidades/atrofia, e percentagem de envolvimento), bem como trazia uma diminuição do número total de células T no baço.
Purificação de PBMC humanas a partir de sangue inteiro: Recolheu-se sangue inteiro de doadores saudáveis com idades de entre 18 e 50 anos, no programa normal de doação de sangue no Scripps Green Hospital (La Jolla, CA), e adicionou-se-lhe heparina para evitar a coagulação. Não se especificou nenhuma raça, etnia, nem género. Diluiu-se o sangue em PBS e depois colocou-se uma camada inferior de FICOLL-PLAQUE Plus (Amersham Biosciences) . Separaram-se as células mononucleares do soro e das plaquetas por centrifugação a 1.800 RPM sem o travão. Recolheu-se então a interface contendo as PBMC, e lavou-se duas vezes com PBS. 203
Modelo de Doença Aguda de Hospedeiro em Relação ao transplantes In Vivo: Utilizou-se um modelo de doença aguda xenogénica de hospedeiro em relação ao transplante para testar o potencial terapêutico do anticorpo F23 (124F23G1) humano anti-LIGHT humano in vivo (Watanabe et al. 2006, Clin. Immunol. 120, 247-59), essencialmente tal como se delineia na FIG. 28. Em suma, injectou-se em murganhos macho com imunodeficiência combinada severa (SCID), de 5-10 semanas de idade, no dia -2, 20 pg de cadeia do anticorpo de rato anti-murganho IL2 receptor-beta (IL2F^) (ΤΜβ1, Tanaka et al. 1993, J. Exp. Med. 178, 1103) para esvaziar o conteúdo em células assassinas naturais endógenas de murino. No dia seguinte (dia -1), administraram-se aos animais 2,5 Gy de irradiação inferior à letal utilizando uma fonte de césio, para permitir a migração das células humanas para o tracto intestinal. No dia seguinte (dia 0) administraram-se aos murganhos 10 milhões de células humanas mononucleares de sangue periférico no total, em PBS, por injecção intraperitoneal, seguida imediatamente por uma injecção endovenosa de anticorpo humano anti-LIGHT humano (124F23G1) ou de anticorpo de controlo negativo, ou anticorpo hFgGl (anti-dinitrofenol (anti-DNP), Kirin Brewery Co. Ltd.), a uma dose de 100 pg em 100 pL de PBS. As células T humanas expandem e induzem uma doença de hospedeiro em relação ao transplante e os seus sintomas, resultando em, por exemplo, perda de peso, hematúria, hidroperitoneu, infiltrados de células inflamatórias no figado e no tracto intestinal, e eventualmente na morte. A doença é sobretudo mediada por 204
The células T humanas como a transferência de células T por si sós induz sintomas semelhantes. Determinou-se a massa corporal a cada 3-4 dias, e administrou-se aos murganhos semanalmente o anticorpo anti-IL2Rp. No dia 12 sacrificaram-se os murganhos e analisou-se a sua patologia em geral e sintomas da doença, recolheram-se os baços para análise por citometria de fluxo e os cegos para histologia, e recolheu-se o soro para análise de citoquinas humanas e de anticorpos (Watanabe et al. 2006, Clin. Immunol. 120, 247-59).
Análise funcional in vivo de anticorpos monoclonais humanos anti-LIGHT humano. Classificou-se a patologia em geral observada no dia 12 como se segue: diarreia (0 ou 1), hemorragias intestinais e na cavidade peritoneal, e peritonite (cada uma delas classificada como 0, 1, 2 ou 3 significando respectivamente ausência, ligeira, moderada, ou severa) . A soma de todos os sintomas da doença foi utilizado para determinar a classificação global da patologia. Tal como se ilustra na FIG. 29, os murganhos que haviam recebido o anticorpo de controlo ou apenas as PBMC (sem injecção de anticorpo) manifestavam todos sintomas de GVHD, com classificações mais elevadas da patologia do que os murganhos a que se havia administrado o anticorpo 124F23G1 anti-LIGHT.
Levou-se a cabo uma análise histopatológica de secções H&E do cego, e classificaram-se como se segue: severidade da inflamação, extensão da inflamação, lesões 205 nas vilosidades/atrofia e percentagem de envolvimento (cada uma classificada como 0, 1, 2 ou 3 correspondendo respectivamente a nenhuma, ligeira, moderada, ou severa). A classificação final era a soma de todas as categorias, sendo no máximo de 12 para cada murganho. Tal como se ilustra na FIG. 30, os murganhos a que se havia administrado o anticorpo de controlo ou apenas PBMC (sem injecção de anticorpo) apresentavam histopatologia semelhantes, enquanto os murganhos injectados com o anticorpo 124F23G1 não apresentavam sinais histológicos da doença. Ilustra-se um exemplo da histologia do cego observada nos animais tratados com anti-LIGHT na FIG. 31A, que mostra uma estrutura uniforme das vilosidades, da submucosa e da camada muscular, bem como uma ausência de áscitos ou de sangue. Em contraste, a histologia do cego de um animal tratado com anticorpo de controlo apresenta marcas típicas proeminentes da doença, incluindo uma submucosa cheia de áscitos, sinais de hemorragia intestinal indicados por agregados de eritrócitos e infiltrados proeminentes de linfócitos (FIG. 31B).
As análises dos baços estavam de acordo com a patologia geral e com a histopatologia. Estavam presentes células T humanas nos baços dos murganhos tratados com os anticorpos de controlo, mas o número de células T humanas nos animais tratados com 124F23G1 eram significativamente menores do que os números de células T nos animais de controlo (FIG. 32). 206
Em estudos de seguimento, podem utilizar-se tanto versões dos anticorpos anti-hLIGHT que esvaziam células T (IgGl) e/ou que não as esvaziam (IgG4PE), para avaliar o mecanismo da melhoria da doença, vendo se as células T estão a ser bloqueadas pelo anticorpo ou, em vez disso, sofrem apoptose.
Discussão: A doença aguda de hospedeiro contra o transplante (GVHD) é uma complicação principal associada ao transplante de células estaminais hematopoiéticas. A GVHD é em geral definida como o ataque geral contra os tecidos do hospedeiro pelas células T doadoras. A seguir ao transplante, a imunossupressão sistémica é o método corrente para evitar a GVHD, no entanto ela pode levar a infecções com patogénicos oportunistas e a uma recaída da leucemia. Portanto, o bloqueio dos sinais co-estimuladores das células T é uma das alternativas mais prometedoras em relação aos imunossupressores. Publicações recentes indicam que a co-estimulação das células T por LIGHT-HVEM desempenha um papel patogénico crucial na GVHD (Xu et al. (2007) 109: 4097-4104). Deste modo, os anticorpos antagonistas anti-LIGHT podem ter eficácia terapêutica na GVHD. A eficácia in vivo demonstrada no modelo de GVHD aguda xenogénica demonstra este potencial.
Apresenta-se um modelo de GVHD aguda xenogénica no qual se injectam PBMC humanas em murganhos SCID irradiados com uma dose inferior à letal, dos quais foram eliminadas as células NK (FIG. 28). Neste modelo, a 207 irradiação inicia as lesões intestinais e as células T mediam a inflamação intestinal da doença. Os animais mostram sinais severos da doença em cerca de 12 dias depois da injecção de PBMC. Os sinais típicos da doença incluem inflamação intestinal manifestada por hemorragias, áscitos e atrofia das vilosidades. Num estudo inicial, o tratamento dos murganhos com 100 microgramas de anticorpo anti-LIGHT (124F23G1) diminui a patologia geral observada no intestino (FIG. 29) . De igual modo esta diminuição foi corroborada por uma análise mais refinada por histopatologia do cego, no qual um tratamento com anticorpo anti-LIGHT levava a uma ausência de doença detectável(FIG. 30). A FIG. 31 A ilustra uma secção H&E contrastada representativa do cego de um animal tratado com anti-LIGHT. Em contraste, o cego de um animal tratado com anticorpo de controlo mostra os sinais típicos de uma inflamação severa do intestino, incluindo manchas vermelhas de células indicativas de hemorragias, uma submucosa cheia com fluido, e infiltrado linfocítico (FIG, 31B). Neste modelo, as células T humanas transferidas são as principais responsáveis pela indução da doença e os números de células T no baço tendem a correlacionar-se com a severidade da doença. Um tratamento com anticorpos anti-LIGHT diminui significativamente os números totais de células T humanas no baço (FIG. 32). Deste modo, tomados em conjunto, estes dados indicam que os anticorpos anti-LIGHT mostram eficácia in vivo neste modelo, diminuindo significativamente os sinais de doença em relação ao controlo negativo. 208 EXEMPLO 6 ~ ANÁLISE POR CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X DA INTERACÇÃO ENTRE LIGHT HUMANO/ΑΝΤΙCORPO ANTI-LIGHT HUMANO (F23)
Utiliza-se o anticorpo F23G1 (ou um seu fragmento Fab) para avaliar a natureza do reconhecimento preferencial do hLIGHT nativo trimérico. Uma análise estrutural permite a identificação dos resíduos de aminoácidos específicos de contacto entre o anticorpo anti-hLIGHT e a molécula de hLIGHT para se definir melhora o epítopo conformacional reconhecido pelo anticorpo. Leva-se a cabo a cristalização dos complexos de LIGHT-Fab de anti-LIGHT por métodos padrão de gota quieta difusão de vapor (veja-se, por exemplo, McRee, 1993, em: Practical Protein Crystallography (Academic Press, San Diego, CA) nas págs. 1-23; Rhodes, 1993, em: Crystallography Made Crystal Clear (Academic Press, San Diego, CA) nas págs. 8-10, 29-38. Analisam-se os cristais utilizando um SINCROTRÃO, e analisam-se os dados utilizando o conjunto de programas CCP4 (Science & Technology Facilities Council, Computational Science and Engineering Department), que é um conjunto de programas bem diversos que cobrem a maior parte dos cálculos necessários para a cristalografia macromolecular. Tal como será entendidos pelos especialistas da técnica, podem utilizar-se de forma semelhante outros anticorpos hLIGHT proporcionados neste documento para se determinar a ligação ao epítopo de hLIGHT e os resíduos de aminoácido de contacto. 209
EXF.MPLO 7 - ESTUDO DE EFICÁCIA IN VIVO DO 124F23 NO MODELO DA DOENÇA COLITE
Modelo da colite por transferência de células T humanas. Analogamente ao modelo de transferência de CD4+/CD45Rbhi na colite do murganho descrito em Morrissey et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 237, injectam-se murganhos RAG-/- com células T humanas néscias (CD45RA+CD45RO-). Neste modelo, cruzou-se de retorno um estirpe HLA transgénica (C57BL/6NTac-(KO)Abb-[Tg]DR-4) correspondente ao tipo HLA de um doador humano, com uma linha de base RAG-/- (B6.129S6-Rag2tmlFwaN12) , para permitir a apresentação de antigénios entre os ACP do murganho destinatário e as células T humanas do doador. Eta interacção é necessária para o reconhecimento da microflora intestinal por parte das células T, que se pensa ser responsável pela activação e migração das células T para o intestino. Os animais denotam perda de peso e caquexia, em conjunto com inflamação intestinal que não existe nos murganhos RAG-/-.
Em determinados grupos, administra-se um anticorpo humano anti-hLIGHT (por exemplo, F23) a uma dose de 100 yg (ou, por exemplo, de entre 2 yg e 500 yg) por animal, por injecção endovenosa em simultâneo com a administração de células T humanas do doador. Em determinados grupos, administra-se o anticorpo humano a diversas intervalos ao longo do tempo antes e/ou depois da administração das células T humanas do doador. Uma vez que os anticorpos anti-LIGHT se ligam a LIGHT expresso à 210 superfície de células T activadas, evitam-se os sintomas da doença e/ou tratam-se. Nos estudos de seguimento, podem utilizar-se versões tanto eliminando as células T (IgGl) e/ou não as eliminando (IgG4PE), dos anticorpos anti-hLIGHT para avaliar o mecanismo das melhorias da doença. Por exemplo, os anticorpos anti-LIGHT IgG4 são capazes de bloquear a co-estimulação das células T e a sobrevivência.
EXEMPLO 8 ~ MODELO DA DOENÇA IBP EM MURGANHOS COM INSERÇÃO DE LIGHT HUMANO EM LOCAL ESPECÍFICO
Tal como se descreve noutra parte deste documento, o LIGHT já foi implicado na patologia da doença IBD (vejam-se, por exemplo, Wang et al. 2005 J. Immunol. 174:8173-82; Wang et al. 2004 J. Clin. Invest. 113: 826-35; Cohavy et al. 2005 J. Immunol. 174: 646-53). Neste exemplo, cria-se um modelo de IBD num murganho com inserção de hLIGHT em local específico, e administram-se anticorpos monoclonais humanos anti-hLIGHT da especificação presente ao animal para avaliar a eficácia in vivo destes anticorpos no tratamento da IBD. Uma vez que se mostrou anteriormente que estes anticorpos bloqueiam a ligação ao receptor de hLIGHT, bloqueando a actividade biológica de hLIGHT (vejam-se, por exemplo, os Exemplos 1-4), e tratam GVHD (Exemplo 5), espera-se que os anticorpos hLIGHT da especificação presente também sejam eficazes no tratamento da IBD.
Geração dos murganhos com inserção dirigida de hLIGHT. Geram-se murganhos cujo gene para LIGHT não é 211 funcional e que também têm uma inserção alvejada do gene de hLIGHT, utilizando métodos padrão de alvejamento de genes por recombinação homóloga. Em suma, produzem-se por electroporação células ES de murganho alvejando uma construção do gene a células ES de tipo selvagem. Uma recombinação homóloga entre o genoma das células ES duas regiões de homologia no vector alvejante que flanqueiam o gene LIGHT humano resulta na substituição do gene de LIGHT do murganho pelo gene de LIGHT humano. Implanta-se então um blastoquisto em fêmeas pseudo-grávidas, levando à geração de murganhos quiméricos. Por melhoramento produzem-se os animais homólogos com LIGHT humano inserido no local pretendido.
Modelos da doença humana IBP. Utilizam-se os animais transgénicos com inserção localizada de hLIGHT em modelos estabelecidos da IBD. Um modelo estabelecido da IBD inclui a administração de sulfato de dextrana sódico (DSS) na água de beber (veja-se, por exemplo, Mãhler et al. 1998, Am. J. Physiol. 274, 544-51) . Em suma, induz-se a colite experimental por administração de DDS a 3,5 % (peso/volume) (com massa molecular de 36.100-45.000; TbD Consultancy, Uppsala, Suécia) em água de beber acidificada ad libitum durante 5. Para-se então a administração da DDS, e os murganhos recebem apenas água de beber acidificada durante 16 dias até se fazer a sua necropsia no dia 21. Esta dose induz uma colite moderada a severa minimizado no entanto a mortalidade, embora se possam utilizar outras doses. Recolhe-se então o intestino grosso, e separa-se o cego do 212 cólon. Fixam-se então os tecidos pelos métodos habituais e contrasta-se com H&E para se determinar a severidade da inflamação e das lesões. Avaliam-se nos murganhos a patologia, a histopatologia, a síndrome de caquexia e/ou a morte.
Um segundo modelo estabelecido da IBD inclui uma administração rectal de ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) (veja-se, por exemplo, Neurath, et al. 1995, J. Exp. Med. 182, 1281-90). Em suma, para induzir a colite, anestesiam-se os murganhos durante um período breve com metofano, e insere-se cuidadosamente no cólon um cateter 3.5F, de tal modo que a extremidade esteja a cerca de 4 cm de distância do ânus. Para induzir a colite, inserem-se 0,5 mg do reagente hapteno TNBS (Sigma, St. Louis, MO) em etanol a 50 % (para quebrar a barreira instestinal) no lúmen do cólon pelo cateter que é prolongamento de uma seringa de 1 mL. Nas experiências de controlo, os murganhos recebem apenas etanol a 50 %. O volume total da injecção é de 100 pL para ambos os grupos, permitindo que o TNBS ou o etanol atinja a totalidade do cólon, incluindo o cego e o apêndice. Mantêm-se então os animais numa posição vertical durante 30 segundos e devolvem-se às suas jaulas., ou o modelo de CD4+/CD45Rbhi da colite do murganho (veja-se, por exemplo, Morrissey, et al. 1993, J. Exp- Med. 178, 237-44). Podem então utilizar-se anticorpos anti-LIGHT para o tratamento ou a prevenção da doença estabelecida, por exemplo em doses de 2-500 pg por animal, essencialmente tal como se descreveu acima. Recolhe-se então o intestino 213 grosso, e separa-se o cego do cólon. Em diversas alturas ao longo do tempo em seguida, remove-se o intestino e depois leva-se a cabo pelos processos habituais a fixação dos tecidos e a contrastação H&E para se determinar a severidade da inflamação e das lesões. Avaliam-se nos murganhos a patologia, a histopatologia, a sindrome de caquexia e/ou a morte.
Um terceiro modelo estabelecido da IBD é o modelo da colite do murganho por transferência de CD4+/CD45RBhi (veja-se, por exemplo, Morrissey, et al. 1993, J. Exp. Med. 178, 237-44) . Em suma, separam-se células T CD4 + purificadas de nodos linfáticos de acordo com a sua expressão de CD45RB e injectam-se nos murganhos transformados por inserção localizada de hLIGHT. Leva-se a cabo pelos processos habituais a fixação dos tecidos e a contrastação H&E para se determinar a severidade da inflamação e das lesões. Avaliam-se nos murganhos a patologia, a histopatologia, a sindrome de caquexia e/ou a morte.
Podem utilizar-se anticorpos anti-LIGHT (por exemplo, doses de 2-500 pg por animal) com qualquer modelo de IBD, tais como os descritos acima, para avaliar a eficácia no tratamento e na prevenção da IBD, essencialmente tal como se descreveu acima. Uma vez que se descreveu anteriormente que os anticorpos bloqueiam a ligação do hLIGHT ao receptor, bloqueando a actividade biológica do hLIGHT (vejam-se, por exemplo, os Exemplos 1- 214 4), e que tratam GVHD (Exemplo 5), espera-se que os anticorpos hLIGHT da especificação presente também sejam eficazes para tratar a IBD.
As concretizações da invenção presente descritas acima pretendem ser meramente exemplificativas, e os especialistas da técnica reconhecerão, ou serão capazes de se aperceber utilizando não mais do que experimentação rotineira, numerosos equivalentes aos processos específicos descritos neste documento. Além disto, tal como se utilizam nesta especificação e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem formas plurais a não ser que o contudo dite claramente o contrário. Deste modo, por exemplo, uma referência a "um anticorpo" inclui uma mistura de dois ou mais dos referidos anticorpos, e outras semelhantes.
Nas reivindicações que se seguem incluem-se outras concretizações. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS tal como na divisionária <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. La Jolla Institute for Allergy & Immunology <120> Anticorpos Monoclonais Humanos Antagonistas
Específicos para LIGHT <130> 7505-049-228 <140> 215 <141> <150> 60/840.774 <151> 2006-08-28 <150> 60/897.875 <151> 2007-01-25 <16 0> 106 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0
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<210> 48 <211> 378 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> cADN da região variável da cadeia leve kapa de E63 <400> 48 .íV-fjicac-Cit •CâCiaccçat tggactteig «íigtgcTija axftcxt-cc gg&mtcag a í: r: t qcccráç} cca iitcagas Cã 5; tggtsgt m^sKxccài .agtc-ixcxcsi caasfESTgCT gs:çgat.{ít:-g§ gs.tagatrct caHtxâKte ccaíí.agaers: acciígçcgg agst.carsa
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<210> 50 <211> 387 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> cADN da região variável da cadeia leve kapa de F23 <400> 50 àtiqíiiStíUÇà CíâSCtteta yggcxtxçijt V^çUT.açsC·!; £y càggt gv.: δΟ
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<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência nucleotídica de um hLIGHT <400> 51 a? cíjíssao·:· tícacgaggt Í5<: í.iCtríT-J-f «is ffCÇ.dfif f iffl «C'Cttcct$a àccascacec 9$ί.·*βί:«ί*8«. J!3í.v';c.'.IQ« gacaasK-g-cc tcíi-í íBssTX.gísçq fJt-sVvâagiígiiÍ taíSA(JÍí§Cg gcr.tga ggggcíSt.ag aí f.f-fcrfiic·" acLi$gc;í.5.ita S^totccí ig gtg-g.í.q-wjgí tçigrccíiac; gCÍTÍf aqTS WítCtGgaai wís·· cm gHí-.r.;t .-.fjfi M-gCCÍ s «í ttâí<:?eg<ií ^cagctçgcf cs*«cocs«;a acao-t^ag oeg^Nsí·
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<210> 52 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> um hLIGHT de comprimento inteiro <400> 52 240
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<210> 54 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens 241 <22 0> <223> hLIGHT solúvel marcado com FLAG (183 aa) <400> 54 t Lys A<-p .«•St) **P \ip yyS •δ ! Ί' A-yt νδϊ T^p ΛΠ$: uo« :>rG· .1 V- io 15 CU fíí> A. 5 a íVt y t><r' fm L&tK 11« Gih oU ΑΓΗ 20 25 ?-5*í S vs. 3 ASM fres Ai Si ATa Plj s sly AÍÂ ASíV 13 .$$ íi-^ Tftp Y i- ^ P \^íy PTO Í.K3J Tr?s ΤίΐΓ c*5n Λ;8*ί δ 5 ’/ I.ÇLi A ·: ΐ K:‘ V, SC· Arg Çí.vV tei? te ^15 Ai a i.m V'Í "i Vai Vj.p *. ys ^0 73 S-δ' ãTs V*y Tyf T >r Tyr Tyr 55 r :.ys> V.rif? ζΐη n>· KUy v'51. m 3! )è *0 3$ Gõy s W i.eu Ga t Λ’ A-5.il jSiíjC* rh-r Thr rt-i.s í>5 y LSU Tvr- kys APCt G'iu X05 !Ú αϊη Thr Pr® r>r ^rc 'Stèií L-e.43 ÍS3ú. Ltítí tea V 3.! S-et" S'ifí SrÈP us USt >25 pro Cys íDy A'iâ ÚL-N-jr. $** *r\v ΛΆΪ 13 rrs *S& UQ 13 S Aú Gly V Ol· 1 vai.' ?$ $1 w a" a «'y Glct iVv V Và ^ Và5 v»1 ISO :iv.< 160 vss.l k-Φΰ wl.U :&rg í.e*í V«5. s A PÇ !.$*; Arg >*y rbr Apg Ί.*ί" ’±M I7£i 17 5 Tyr irtVv A !.^ ís®t vã i <210> 55
<211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador RACEUPS5' <400> 55 ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 56 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial 242 <22 0> <223> iniciador IgGlp <400> 56 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31
<210> 57 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador HK5 <400> 57 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30
<210> 58 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador M13F <400> 58 gtaaaacgac ggccagtg 18 <210> 59 243
<211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador M13R <40 0> 59 caggaaacag ctatgac 17 <210> 60 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador E63HF85 <40 0> 60 agagagagag gtcgaccacc atgaaacacc tgtggttctt c 41 <210> 61 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador E63HR38 244 <400> 61 gagagagaga gctagctgag gagacggtga ccagggt 37 <210> 62 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador E63LF84 <40 0> 62 agagagagag atctctcacc atgtcgccat cacaactcat tg 42 <210> 63 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador E63LR43 <40 0> 63 agagagagag cgtacgtttg atctccacct tggtccctcc 40 <210> 64 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial 245 <22 0> <223> iniciador HH-2 <40 0> 64 gctggagggc acggtcacca cgctg 25 <210> 65 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador HK-2 <40 0> 65 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc 26 <210> 66 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F23HF86 <40 0> 66 41 agagagagag gtcgaccacc atggacctcc tgcacaagaa c 246 <210> 67 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F23HR55 <40 0> 67 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccgt 34 <210> 68 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F23LF36 <40 0> 68 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtccccgc tc 42 <210> 69 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F23LR43 247 < 4 Ο Ο > 6 9 agagagagag cgtacgtttg atctccacct tggtccctcc 40
<210> 70 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador ElHFSalI <40 0> 70 agagagagag gtcgaccacc atggagttgg ggctgtgctg g 41 <210> 71 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador ElHRNhel <40 0> 71 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggc 37 <210> 72 <211> 41
<212> ADN 248
<213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F19HFsalI <40 0> 72 agagagagag gtcgaccacc atgaaacacc tgtggttctt c 41
<210> 73 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F19HRNheI <40 0> 73 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccgtggt 37 <210> 74 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador ElKF2+3BglII <40 0> 74 agagagagag atctctcacc atggaaaccc cagcgcagct tc 42 249 <210> 75 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador ElKR2BsiwI <40 0> 75 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg 40 <210> 76 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador ElKR3BsiwI <40 0> 76 agagagagag cgtacgtttg atttccacct tggtcccttg 40 <210> 77 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 250 <223> iniciador F19KRl+2BsiWI <400> 77 agagagagag cgtacgtttg atctccacct tggtccctcc 40
<210> 78 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador F19KR3BsiWI <400> 78 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg 40
<210> 79 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>
<223> iniciador F19KFl+2+3BglII <400> 79 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtccccgc tc 42 <210> 80 <211> 23 251 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador do sentido directo <40 0> 80 gtaggagaga tggtcacccg cct 23 <210> 81 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador do sentido reverso <40 0> 81 ggaacgcgaa ttcccacgtg tcagacccat gtccaat 37 <210> 82 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> região variável #1 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa(A) ) 252 <400> 82 •λ m+ Ar q Λ PTÍ? Ais <V<n: lOBUs L«?V ao L&tí Lfctf L«U Sv*SU 5.5 LSV ssí j·' a CyS ΑΊ * ΙΛ& Çtft 28 im :>>r £ΐϊ* $:&?ν S*í!' S»!' AÍ Ã âôf V.a-1 Μβ 4·ίνζ5 40 * V.SÍ Th- 11S Ttir cys >:S Arç Al a s«f- •S !γ £ Ί <5 λ la 3*Ô:tí Vríí r' ÇU'> cor .60 LVS- ϊ^ίΌ Sly 5.ys •Í55 Lvít isu ' 70 1 W- A$.£ Aí A *$;<}:' t.-iÇV 0 1 si. hk" Gly v-sl so T.*:s &·;! Sly •Ca ! y scf Thr A&í> Th v >.eu S5 Ϊ X"* SSf í. «u. Gin Pré Gl SJ Aí. Ai FV A* o τ>ίγ Tyr Tyr £ys xw •ÈS 1 A èUí-. AS ST $>vr Arq 5¾ r L&U L£U 5.2 ΛΪΛ 4 í" 3 •Cdv .FT8 {r: TPD A*S &ef <210> 83
<211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos do cADN da região variável #3 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa(C)) <400> 83 OUí Thr prs Alfc s· <3 írf v eií tea Fhs (v í: ví 10 Ukí T·?'® Lííi: IS Í>PÇ; AS.» Th- tây. 20 ile1 vs.l Í.Ç.ii Thf- 25 •ϊ,ί'·^ fr& .¾] V Thr m í. ^er T-í-y :i$r Trg -¾ 'S <3l V T^í' At> í,8ii ·;>,,.^.- Arg- Ala AS f^ys %«r Vfi 1 Ap:f· SÓ rvr i Λυ Aía r j ' ϊ·χ> Tyr Glf< Gin ί,ν‘5 titi Ato C^y' θ·1^ Ala p-ro 05 ÂTÇ K,m 5 >*·!£ m TV? K; . ΰΊ, aI js 58!· ASA A?ig 75 AlS- Thr £ ^:'f, m &£.£ Arq f*s ÇÍ y s$ •sçr S«í> C.!y Thr 00 A^íJ PÍH? Táir Iffli 9S S??' Ar§· Ι.“ύϋ Olu 100 r-ro fil* p h* ΑΊοΙ ΐθδ va1 Tv.r !>Γ í>'5 X' >.<A 116 Tyr $ly $«r ν«|· ? ^ "Tris Th^ Ph* 120 Oiti TMr kVS. ν'-δΐ 171 s-.y vf
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<210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> CDR1 da região variável #3 da cadeia leve de (EI kapa(C)) <400> 85 .;V: a tyk.
<210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR2 da região variável #1 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa(A)) <400> 86 254 ABp *.!& W ssr Leis δΉ; Ssr <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR2 da região variável #3 da cadeia leve de El
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<210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR2 da região variável #4 da cadeia leve de F19 (F19 kapa(D)) <400> 98 .····&? a';ã Sèr ãsíí a';* liir
<210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR3 da região variável #1 da cadeia leve de F19 (F19 kapa(A)) 260 <40 0> 99 < Thr As« Ãl» Pra tíil <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 da região variável #3 da cadeia leve de F19 (F19 kapa(C)) <400> 100 QIr s'>”! tyr Ts?r Ser m> T?r Tfcr <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR3 da região variável #4 da cadeia leve de F19 (F19 kapa(D)) <40 0> 101 ►àlís iSi n '..Ar® Sei' ASB 'Trp Hls P:"0 <210> 102 <211> 386 261
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> cADN da região variável #1 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa(A)) <40 0> 102 «TcKtscacga- -g^ssccasc xssect-cctç. sggsfcctsc tgctctçgct. cccaewcc «Λ·,, sgàcgtgcta tf.cagtt.93c tcagtctcfs tcctccctgt cc^catctgt sgggtjíiesg* S20 gtcaccatcs cttgccçggc aagtcagqgc jttagicagtg ctctagcctç gtatcagcag Ι8Φ .&saCL&a§§g& àSgt'Vce.ta& gcttctgSCí. xat^atgcr.t. <.-.e.s-afff.gg;s Sa.gtgtfg^cc. Í4S tcaccssggi tr.igcggrig <>«>τΑίΐο;-.; λf.;s5s<;;:?.<;> cccíceccâí c&ccJoííte ?*!' .caaectttfEMi attttgcsac. ttKt*c«gc t»s.c»gttta .atígtmcts· talactrçts 360. gí acyygisc cãisgc' ί&ΐ*
<210> 103 <211> 384 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> cADN da região variável #3 da cadeia leve kapa de EI (EI kapa(C)) <40 0> 103 cctcfccctc rrgcT3c,tci, tí C.i'ígc.3C c. Ctft CCL ·. tf. í. gaçrgtrcagc sgcasctart í.Oívi.V tà í ίί^ίΚν' Cc* çtrtgggac.-.a gàcct.c«c.tc t < a «s T c ag <. 3¾t a tgg c s CST&S ........ asesgaeacxc cagçgcagcx qaÃÃttgcg* íjàoscastc Xtct^crtaca ssqççaat ε» cí.cggfc*^« ?.teíc*§fj<.t gAtaggtc ca ggcsgtgg íctg&agatt ttgcA-gtgtií caa-g^gàres. ajíjvg-gsa v <210> 104 sgosccsaga «ccacc®®* «S ctCLSiiijgna 4ao«igCCiC.c. 1?0 **®cct®8*a ccãgcaaaa* iSO t^gíIaUa?.4C T.c:al.càs:i:.aí; E.iga ç.t.'g§ag i06 gcctstxgtg gacgttcçÍjÊ ϊ£Ό
<211> 387 <212> ADN <213> Homo sapiens 262 <22 0> <223> cADN da região variável #1 da cadeia leve kapa de F19 (F19 kapa(A)) <40 0> 104 .st«£S3Catga g^T.ecccip: «tcaecatÊ*,· >ettaecq$gt &agVViV;-i j Ctàlticg^t tCájjlGíKaç í.ííçícíqssg atQTrgcw txagctGetg: -«Mctrctísac xgcxcDcagx rxcao^ttjce: «0 ceo^xctcco ?ètT;íçc”§t ctgt.íítttgt AsçiàgiicÍsa S.ÍG gàgF:aa>j$c: atí-aciisav amtwxvta ^xàtfetjcao ISO gít-c.cvgãsv tsta^vscat ccesTrcgeâ «•vfgtsãiHs: ?40 :.vÇ.íí!. ‘.t.q·;:.; t. :.LS CtCtXíf.ÈV f..'JÍ.JC.ã-tlV.f. :.-:.1 30tf; ííauscêèi' taacQgaçft *cs*T$t;cct 'χα^ΐτίν;. ^6í> m-rcaas .it?
<210> 105 <211> 387 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> ADN da região variável #3 da cadeia leve kapa de F19 (F19 kapa(C)) <40 0> 105 ,íçç<a'«^^ g^rx^Ly, v<o.g'V ,«g ççKffwtTÇí, t^çSKtgçcc tco^stçtc 60 iiiístír:*!.·.. i Xí-^ví3it*.'.'. ct*íjtí-tt£a tr.cttsctct vxcs.-v.tSi; aggagacsçfa .320 iitc.otf.Mw: «jçí«*ΐ u&gcc^&gc <κ.ί*««3« am*gt<» & ocstcapía» $M' o^í àaetcscts» actcct<j«t« T3TgtcEgçait ccaçstsgs* .asgttgjggtt·. ^0' <r.3Tca*tsrçt ccãatçgtãg tgo*?c«yS3«í acàqaistto* Gtessscsst sâ§<t^cctg 500 «jnftttsjÁaq a%ttt<co«c ti£tt*;tôt e.a»c«3tair atãgtttcsç ^cs&ácfEtc· ..ϊδδ ggc<.ag§g§s csasg: V:g8. aiU'a..a 3.S? <210> 106 <211> 380 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> 263<223> cADN da região variável #4 da cadeia leve kapa de F19 (F19 kapa(D)) <40 0> 106 g-gcisggcví. fxagjogçs-jíEf s§a cataste ceaggetcce· çcsíixííçísuí caçxtiatta U;: ί^.-Λ E.U.&ãã ;rr^-frv.; irxg'Tijr vcí g.jricçc.^a nac:;aci"Ç[f,s Ui «cesgccacc ctgsctttst ®;x&g«g$a .aagagcca.cc 120 giggtç* tagi,- açídaíttãs tct$gs:ãèb( gcâ^juactí i$C> catccat§»«- geacce&aca gggçcactgç çacçccagce 1*0 t$og*c«g»< ttíActcíía cc&vc&gcag cctagasect JvO ctoccaecac..sujcascaacx ggwtcccot tcgoicaaog 360 ...... ' ' ' ' aso
Lisboa, 24 de Outubro de 2013.

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo inclua A. (a) uma VH de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) uma VL de um anticorpo produzido pelo hibridoma com o N° . de Acessão na ATCC PTA-7819, ou B. (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819.
2. 0 anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo isolado seja um anticorpo produzido pelo hibridoma com o N°. de acessão na ATCC PTA-7819.
3. 0 anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo inclua: 2 (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável da cadeia leve (VL) com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 9 0, 91 ou 92.
4. 0 anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo inclua: (a) uma região variável da cadeia pesada incluindo: (1) uma CDR1 de VH com a SEQ ID NO: 20; (2) uma CDR2 da VH com a SEQ ID NO: 21; (3) uma CDR3 da VH com a SEQ ID NO: 22; e (b) uma região variável da cadeia leve que inclua uma VL seleccionada de entre o conjunto constituído por: (1) uma CDR1 da VL com a SEQ ID NO: 93, uma CDR2 da VL com a SEQ ID NO: 96 e uma CDR3 da VL com a SEQ ID NO:99; 3 (2) uma CDR1 da VL com a SEQ ID NO: 9 4, uma CDR2 da VL com a SEQ ID N097 e uma CDR3 da VL com a SEQ ID NO:100; e (3) uma CDR1 da VL com a SEQ ID NO: 95, uma CDR2 da VL com a SEQ ID NO: 98 e uma CDR3 da VL com a SEQ ID NO:101.
5. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o anticorpo inclua um domínio constante de IgG.
6. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o anticorpo inclua um domínio constante de IgGl ou de IgG4.
7. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o anticorpo seja um anticorpo completamente humano, ou em que o anticorpo seja um anticorpo quimérico ou humanizado, ou em que o anticorpo seja um fragmento que se liga a antigénio, ou em que o anticorpo seja um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um Fv de cadeia singela (sFv), um diacorpo, um triacorpo, ou um minicorpo.
8. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal ou um anticorpo recombinante. 4
9. Uma composição que inclua o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Uma molécula isolada de ácido nucleico (i) incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifique para (a) uma sequência de aminoácidos da VH de um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) uma sequência de aminoácidos da VL de um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819, ou (ii) incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifique para (a) uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819; e (b) uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819, ou (iii) incluindo ou sendo constituído por uma sequência de ácido nucleico que codifique para um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o N° . de Acessão na ATCC PTA-7819, 5 (iv) incluindo (a) uma sequência representada na SEQ ID NO: 44; e (b) uma sequência representada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 104, 105 ou 106.
11. Um vector incluindo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 10.
12. Uma célula hospedeira que inclua o vector da reivindicação 11.
13. Um método de produzir o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, incluindo este método cultivar-se a célula hospedeira da reivindicação 12 sob condições que promovam a produção do anticorpo.
14. Um hibridoma que produza um anticorpo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
15. O hibridoma da reivindicação 14, o hibridoma com o N°. de Acessão na ATCC PTA-7819.
16. Um estojo que inclua o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a composição da reivindicação 9. Lisboa, 24 de Outubro de 2013.
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