PT2093245E - Dispositivo biocompatível de polímeros - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "DISPOSITIVO BIOCOMPATIVEL DE POLÍMEROS"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se geralmente a composições de polímeros sintéticos que formam. redes de polímero interpenetrantes quando administradas aos tecidos. Tais composições são partrcularmente bem adequadas para uso numa variedade de aplicações médicas, quando a força física do material administrado é importante, Por exemplo, as composições da presente invenção, que são destinadas a serem utilizadas para unir os tecidos são suficientemente fortes para fornecer um substituto eficaz de outros meios cirúrgicos de fixação, tais como suturas e agrafos clínicos, 0 uso de composições poliméricas em engenharia dos tecidos é agora amplamente reconhecida, particularmente aquelas que consistem em polímeros sintéticos. Em contraste com muitas composições naturalmente derivadas, as composições de polímeros sintéticas podem ser formuladas para exibir características físicas pré-determinadas, tais como a resistência do gel, bem como características biológicas, tais como a degradabilidade,

Numa variedade de aplicações da engenharia de tecidos, é desejável utilizar composições que podem ser administradas como líquidos, mas, que subsequentemente, formam hidrogéis no local da administração. É mais conveniente utilizar tais composições formadoras de hrdrogel in situ uma vez que as mesmas podem ser administradas como líquidos a partir de uma 1 variedade de dispositivos diferentes, e são rriais adaptáveis para administração em qualquer local, uma vez que elas não sã.o pré-formadas. Têm sido descritos muitos mecanismos diferentes os quais podem ser usados paira promover a formação de hidrogel in situ. Por exemplo, misturas totoact1váveis de pré-polímeros de co-poliéster e de polfetilenogiicoi, solúveis em água, têm sido descritos como criadores de barrearas de hidrogel, bem como matrizes de libertação da fármaco. Numa outra abordagem, foram concebidos copolímeros de bloco de Plu.ron.ic e Po.loxa.mer, os quais são solúveis em água fria, mas formam. hidrogéis insolúveis que aderem aos tecidos à temperatura do corpo (Leach et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 162:1317-1319 (1990)), Cianoacrilatos polimerizáveis também têm sido descritos para uso como adesivos de tecidos (El.iis, et ai,, J. Otolaryngol. 19:68-72 (1990)). Ainda noutra abordagem, foram descritas duas composições de polímeros sintéticos de dois componentes, as quais, quando misturadas conjuntamente, formam ligações eovaienf.es uma com a outra, bem assim como com as superfícies expostas dos tecidos (PC? WO 97/22371). Numa abordagem semelhante envolvendo uma composição de dois componentes, tem sido descrita como uma mistura de proteína e um agente de retieulaçáo bifuncíonal para uso como um adesivo de tecido (Patente dos EUA No, 5.58.3.114),

Noutras aplicações da engenharia de tecidos, não é necessário ou desejado que as composições estejam sob a forma líquida, quando administradas. De facto, pode ser vantajoso, nalgumas circunstâncias, aplicar composições que são implantes sólidos gelatinosos, pastosos, ou mesmo pré-formados, uma vez que estas formas tendem a permanecer no lugar após a administração mais prontamente do que as formulações liquidas.

Para muitas aplicações da engenharia de tecid.os, é importante que as composições sejam capazes de formar uma 2 matriz, após a administração, que seja suf i cientemen te forte para suportar as forças biológicas e físicas, às quais será submetida, durante um período de tempo suficientemente longo para cumprir o seu objestivo pretendido. A força é particularmente importante quando as composições são utilizadas como um substituto parcial ou total das suturas, Além disso, para aplicações em que a aderência aos tecidos é importante, é necessário que as formulações tenham a força adesiva adequada. 0 Cianoacrilato é um adesivo altamente eficaz, que forma urna matriz forte, mas é demasiado tóxico para ser usado internamente e portanto não é aprovado para tais usos. Deste modo, é um objectivo da presente invenção proporcionar composições que formem vedantes clínicos de elevada resistência que não sejam tóxicos. A presente invenção refere-se a um dispositivo de polímero brocompativel para utilização no tratamento de tecidos que compreendem uma esponja de colagénio ou folha impregnada com um pó de polretilenoglicol reactivo, de d.ois componentes, em que o referido pó reactivo compreende ainda um primeiro polretíienoglicol que possui múltiplos grupos nucleofílicos e um segundo polietilenoglicol que possui múltiplos grupos electrofílícos, em que o pó de polietilenoglicol permanece não reactivo até contactar com um tampão de pH elevado.

As modalidades preferidas estão definidas nas reivindicações dependentes.

Um aspecto da presente invenção é a inclusão do intensificador da resistência à tracção, que pode ser composto por uma variedade de compostos capazes de formar uma estrutura com as características apropriadas, como descrito neste documento. Tais compostos incluem, inter alia, Yicryl, lã de vidro, plásticos e fibras. 3

Os grupos funcionais, X e Y podem ser qualquer par de radicais reactivos que formam uma ligação covalente, Z, sob as condições apropriadas, tars como sulfidrilo, succinimidilo, acrilato e amíno, que forma, em qualquer ordem particular, éter, éster ou díssulfureto. A fim de intensificar ou enfraquecer a biodegradaçao da rede interpenetrante de polímero, o núcleo de polímero sintético pode adieionalmente compreender um extensor de cadeia * Por exemplo, metades ácido alía-hidroxi, poli (lactona), poli (orthocarbonato) e poli (fosfoéster) podem servir para aumentar a bi odegradab i1i dade. Além disso, o extensor de cadeia pode ser um substrato da enzima.

Num outro aspecto da presente invenção, a composição compreende ainda componentes opcionais, tais como proteínas, antibióticos, factores de crescimento e agentes hemostáticos.

Numa forma de realização preferida da invenção, o componente opcional está presente sob a forma de uma nanofibra rígida, tal como a formada por colagénio meti lado.

Em ainda outro aspecto da invenção, X e Y são cada um A ou superior para fornecer uma retículaçâo mais eficiente.

Numa formai de realização, a composição da presente invenção compreende um pa.r de óxidos de polialquí leno reactivos, uma nanofibra rígida, tal como colagénio metilado, e um intensifiçador da resistência à tracçâo.

Outros aspectos da presente invenção são descritos neste documento, A Figura 1 mostra a estrutura de polímeros lineares e ramificados com ligações biodegradáveis ("0") e grupos funcionais ("R") ligados aos mesmos. A Figura 2a mostra a estrutura de penta-eritritol tetraquis (propionato de tri mercapto, "PESH-P"), 4 A Figura 2b mostra. a estrutura de acrilato de tetra, penta-eritritol ("PETA"). A Figura 2c ilustra ί e.st.rr tu.i a. d e '1.4 U , c U0 se acopl a. a. CC Hl 02 ou ac rilatos. Ul Figura 3 representa a fori nação d a ligação ent ΓΘ PESH-P e ΡΞ TA, A Figura 4 a mostra a e strutur 0. C e poli óxido de tetr ame ti ie n.O ar d-ilL-i. Π d. ? q u. e acopla a COH102 ou acri raros, Zi Figura jf) ilustra a estrut! ra de poi ipropi1 eno de OZido de di -acriia L- 0 f que acopla a t r ó i 3 0 u gr upos amino A Figura 4 c ilustra a. estrut: rra de po i ipropi1 eno de óx 1 d. O de ar -amino, q u. e acopla a COH102 ou acri raros, r a Figura 5 r apresenta c s resui tad 0 s o o Exemplo "2 Zi Figura. 6 ^ representa o apare lho ut n iizado pau ' 8 0 Γ J 0 nsaios de f a lha de cis alhamento d o Exemp lo 5 . As Figura g Ί e 8 mostram os es Q“! 1 Cl· mas sintéticos cio Exe :np .1. o 6 , A figura 9 r. estrut ura da C0H1Q2 (9a } C 0 rj O f 6 fao j . P, Figura 10 os ttp O s de disposítivc ’ io '· ΙΘ são úte i s pa ra medi r a res.i stênci ò. 3 L. o.' 3 cçã 0 * A Figura 11 mostra a estrut rra de um braço 4-v i n 1-sul.f o 8 cX cie rrvado de PEG. P, digura J. Z representa. a formação de uma. amid 8 Θ um éster de ca rboxi1 ligado a. o con j uga.d.o d.e PeG de succin imid il~ g lutari 1- ΡΞ G ma i s amr no-PEG. 5 A Ficxura ilustra a. formação de um coniucrado de PEG liaa.d.c

ao tioéster de succrnimrdiΙ-PEG e tioI-PEG A Figura 14 mostra as estruturas de HEMA (hidroxi-etil-metacriiato), MMA (metil-metacrilato), mono-2-(acriloxi) etilo succinato e 2-amino-etil metacrilato. A Figura 15 descreve um dispositivo que é útil para testar a uma membrana de coraaénro. resistência ao rebentamento de A Fícaira representa um disposití’ (um modelo de artéria ca rótida pressurizado) que é ú til para te sta r a i resistênc ra 3.0 rebentamento de um d.e f eito de í :end; d. 06 art. :.érí a rer ia rado. A Figurai li íln stra a formação de uma ( Licj aça o t i c Ater a p art J_ '£ reacção de t rol com acrilato. A Figura 18 mo: stra a estrutur a di s TPE :ta 1 ic tilor pr V~i Os +· oxílato de tr. f-acriI ato) . A Figura 19 mos tra a ·; ;s r.rutura de ΊΜΡΕ- - 3 H (t rí-metilol pr opa l 1 \.J Θ to oxilato de tr i -1 i ο I) • A Figura 20 mof rura a estrutur?. ;! de r;i p Γ|Ί _ -SH (t ri-metiiol pr opa tr is (3-mercapt' 3-prop i. onato), A .F .i g' u r a 21 m o s tra a e strutura de ( glice rol ,.-dí .-rnetd icri la to. A Figura 22 mos ti '£ cl cl í astrutura cl (d' poli -hr d I? 0 ixietj .ImetcLcri lat o- co -metacri1 a to de f imi noeti 1 -co- mono- -2- sue; o i na t n dp e t' i ! ãg (a criloxi), A presente invenç ;ã.o reter e-se a c rompos: ições de poli me r U k> S .1. ntéticos que de aco rdo com uma f o rm a t j.0 real i ração, f o rm .am um a rede interp enetrante de pc )i iim sro q mando admi nistrada cl um 6 local de tecido. Dentro de ura período curto (menos de 3 minutos) depois de ter sido administrada, a composição forma, uma rede que se desenvolve com alta resistência ("tracção") coesiva, a qual contempla que a matriz tem uma resistência à de pelo mer ios 10% e mai s orefei uivei mente z U % cia cie r i ]. a to. Numa forma, de reaJ ...izaçã.o p referida, tais redes uma resistêm sia à traccãc ; O JJ Jf) 0 jO x a b0 N / cm2. As composições preteridas são concebidas para se tornar fixas no

.1. o c ai por m.e i os r nec em co n j unt o q: j J 0 Q COi cie dc ercça ou pro co\ r-r-, ' ;7> 01 ·_ ç ormarn re des cc (ou s ít / f a p ress > 3. C 5S cirúrgicos, assim, as composições rorças adesivas >50 mm Hg (6, 6610:,Pa) adesivo e criar um vazamento (LEAK) ) são preferid.as para aplicações quando for desejada uma forte adesão dos tecidos.

Numa outra concretização, a presente invenção refere-se a matrizes pré-formadas sob a forma de folhas secas, que podem ser aplicadas mais rapidamente do que um liquido pulverizado (para cirurgi a. 3.0 β X" t B ) β A. obtenção de forç; mu i t o elevadas, em curtos espaços de tempo de rompimento .empo (30 seg) , pode também permitir a utilização de folhas activas em locais que devem ser ensaiados logo após a aplicação (30 seg. versus 3 min .) .

Ainda noutra concretização, a presente invenção compreende as esponjas de colagénio activadas e folhas, na forma descrita nos Exemplos 4 e 5 abaixo.

As definições seguintes são fornecidas para descrever ainda vários aspectos das formas de realização preferidas da presente invenção. 7 0 termo "Gel" refere-se ao G & L cl d O Cl 3 matéria entre o guido e o sólido. Como tal, --W1 ** s-r u. TU Cfti.J. tem algumas das opriedades de um liquido (isto é, a forn ia é resiliente e 11· do (rsto é, a ma nt er as três ns: ! O T uai) . Por i re ferido como mp os rção leva a " f) Θ geraimente .e geí , exp ; Ύ' 0 3 3 3. que, ou ig ua.l 3. c a ρ ei c eidade '•.Λ 3 S cerern inta .cta. Sr Q ú. 3.: 1G O S U Ί 0 3 as forca coes 1V 3 é deformável) e algumas das propriedades cie um sólido (isto é, forma é suficientemente distinta de forma dimensões sobre uma superfície bid. conseguinte, "tempo de gelificação", também aqui referido como "o tempo de gel", refere-se ao tempo gue uma tornar-se não escoável sob ligeira tensão, exibido como a obtenção de uma resistência de gel, expressa como módulo de elasticidade, G', de maior do c ICbdines / cmz(10 Pa), em menos de 1 minuto. 0 termo "força coesiva" refere-se composições da presente invenção de perrnc i.e., não se romperem, rasgarem, ou partirei a tensões físicas ou condições ambientais, medida aqui como uma função de "resistência à tracção". 0 termo "força adesiva” refere-se à. capa.cida.d.e das composições da presente invenção de serem capazes de permanecerem ligadas aos tecidos no local da administração, quando sujeitas a tensões físicas ou condições ambientais. 0 termo "polímero” refere-se a. uma molécula que consiste 3ΤΓ1 radicai S qu i τ-p ~ <—« c l.ndi viduais, que podem s e r gu L 3 .J. S ou 0- 2. ΐ. Θ rentes, mas são, de pr· eferênc ia os m se s mos, CZ-. 3 cl O uni dOS uns 3.0 bi io Li aros . Tal co mo aqui u tiiizaLdc ), o te srmo ϊϊ po lime ro " 30 f 0 re-se ; a rad.. í ca r s q; u índ .cós in .dividua is que são .111 dos de pont. 3. 3 ]D onta para f o rma r uma molécu .la i i. n ear, be m c 0-p-j 0 radr cais q iuímic! os is ndi . V _L O, U cl J_ S j untos sob a forma ae uma rami ficacãc (por exer ripi f uma e s "muiti -bra çc 1 C1 ?? ou em 'forma de estreia") 0 termo composições da

Diocompativei refere- presenue invenção de a c a a cui. d a d e o. a. s serem aplicadas em tecidos, sem induzir inflamação significativa e fibrose ou outras respostas adversas dos tecidos. 0 termo "polímero sintético" refere-se a polimeros que não são de ocorrência natural e que são produzidos por sintese química ou recombinante. Como tal, as proteínas que ocorrem naturalmente, tais como o coiagénío e polissacáridos de ocorrência natural, tais como ácido hialurónico são especificamente excluídos. Proteínas, tais como colagénio sintético, e hidratos de carbono tais como o á.cído hialurónico sintético, e seus derivados, estão incluídos. 0 termo "polímeros sintéticos activados" refere-se a polímeros sintéticos que foram ou têm sido quimicamente modificados para ter, pelo menos, um grupo funcional (por exemplo, um grupo sulf.id.riio) que é capaz de reagir com um parceiro de reacção correspondente (por exemplo, um grupo sulfidrilo reactivo) para formar uma ligação covalente. 0 termo "multifuncionaimente aotivado”, ou "multifuncional", refere-se a polimeros sintéticos com dois ou mais grupos funcionais (geraimente nucieofilico ou eletrofíiico). Tipos de polimeros sintéticos multifuncionaimente activados incluem polímeros di-funcionaimente activados, tri-funcionalmente activados, tetra-f uncionalrnente activados, e polímeros activados em forma de estrela (que tem quatro ou mais grupos funcionais). 0 termo "vedante clínico" refere-se a composições que se tornam fixas no local por meio de processos mecânicos e/ou químicos para vedar tecid.os conjuntamente que se tenham separado, como resultado de vários estados de doença ou procedimentos cirúrgicos. Por exemplo, vedantes clínicos podem ser usados para preencher os espaços vazios em tecidos duros, para unir tecidos vasculares e outros tecid.os moles, para proporcionar uma barreira mecânica para promover a hemostase, 9 e para. evitar aderências de tecido ao manter uma superficie do tecido sem contactar com. e aderir a outra superfície do tecido, 0 termo "rede interpenetrante de polímero" ("IPK") destina-se a descrever a matriz que é formada a. partir de um polímero reactivo ou. polímeros tais como PEG, ou. monómeros que são polimerizados, a qual exibe um peso molecular infinito, e inclui um co-reagente de um tipo diferente, tal como uma fibra de alta resistên , r* \ ti ri tracca o. aue ; nterpenetra dentro ria rede do polímero PEG pa ra formar c ÍU 3. S redes contínuas at: r?,V6S CÍ0 toda a rede. Ver Soerlina, LH. et. ai,, "Morphol ogy and Mechanical Behar uor of Interpe netr ating Polymer Netwo rks”, in Po1yme r N e c wo r κ r A.J. Chomp drf and S . Newman, eob , Plenum ress, New York, : Síew York (197 1), pgs. 435 -449. 0 x. 0 rino f* 0 d 0 himento” é us ado para se referir a agentes de olume, composto s orgânicos pequenos, polimer os, fibras, esinas, e seroe] .hantes, que são adício Hei dOS cl composições químicas por uma variedade de razões, sendo as mais pertinentes para a presente invenção a de aumentar a força de traccãí

As compos .i7çõ es da presente ii menção são cc jmpo sições de do i s componentes. cada um dos qua is compreende um diferente poli mero sinté tic· o multí-funcionalrm ante activado, tal forma que os polime ros irão reagir um rnin n mifro no local de a. dm i. nrstração, pa ra formar uma TPN , Como tal, el 0 3 podem ser facilmente administrados separadamente.

Tais composições podem ser geralmente representadas pela Fórmula I como se segue: 10

Compostoi-X* ·* Compostô2-ys Composto*-z-Composto* (D Q Compostoi tem múltiplos (m>2) grupos funcionais (X) que reagem com o compost02, o qual tem múltiplos (n>2) grupos funcionais (Y), de tal forma, que, quando os grupos funcionais cie X e Y entram em contacto sob condiç Õ0 s ap: ropr .ldC.8 S , <8 for mada um .cl ligação covaiente Z. Ass rm, os Cí JC Li ( jS func T J- 018 cl J_ S X .o V d aiTLoerr podem ser referidos como "parce i Γ 0 s de rea l o ç a u um d. O outro, Θ podem ser colectivamenfe referi d o s c zom \o um ! ” O fi Τ' de rea. õ'·' r'' 2 c: orno representado na Fórrm y .1. ϋ. I 8 ρ Θ π 8 S ; oa.ra fins de iiu stração / existe apenas uma iigaçãc 3 forma; ia en t Γί s o compost :oi e o composto?. No entanto, quando m+n>5, e as razões adequadas dos dois componentes são utilizadas, como descrito neste documento, os dois compostos formam múltiplas ligações, um com o outro, resultando numa matriz de polímero tridimensional. De preferência, ambos os compostos contêm quatro ou maís grupos funcionais, visto que tal mul.tifunciona.lida.de resulta numa matriz de gel com uma maior força de coesão total, Numa forma de realização particularmente preferida, cada um dos compostos é tetrafuncionalmente activado.

Noutr 8 f o ri i.18. Ο.Θ ΓΘ8.Ι 1Z< :À Ç 8. C 8 G a um, 12 çrr ;pos funciona I. S . par tir da T- pi cl C Ç ão de um primei act ivada c :om um segundo poli mei em O':.;; 6 os gr ijp O s funcionais d0 um par de re acç: ão, e reagem em. ão preferida, os compostos têm, Tais compostos são formados a :o polímero tetrafuncionalmente j tetrafuncionalmente activado, ca.d.a um dos dois compostos são conjunto para formar polímeros funcionalmente activados de "12-braços". Um exemplo de um tal composto de "12-braços" é o dodeca-sulfidrilo-PEG, 50.000 mol, em peso, que é construído a partir de um núcleo tetra-funcional de éster de succinimida PEG, acoplado a quatro moléculas de PEG-sulfidrilo tetra-funcionais (exteriores). Tais polimeros variam em tamanho desde mais de 10.000 mol, em 11 peso para mais que 100*000 mol, em peso, dependendo do peso molecular dos materiais Iniciais do polímero tetra-funcionalmente activado.

Outros tipos de polímeros multifuncionais podem ser facilmente sintetizado usando síntese de rotina. No entanto, deve-se ter cuidado para produzir produtos muiti-braços com comprimentos de braço consistentes para evitar o impedimento estereo dos grupos funcionais, Conseqi lentemente, os polímeros activaoos que sao adequados para utíl i zação na oresente invenção podem ter uma variedade de 8 ΰ Τ.'ΓΓΙδ. 3 Θ confiauracões G'0 Oiné t Γ í. C δ 8 · Núcleo do Polímero

Corno descrito acima, grupos funcionais, X e Y é considerado como sendo maioria das aplicações, cada um do. , O restante o seu "núc é preferível 3 comj; não-; Leo" . . que estos tem múltiplos •eactivo do composto No entanto, para a ambos os compostos tenham o mesmo ou um núcleo de polímero diferente. ΤΤτγ! rm i i τϊιρτϊ'ι h idrofí1ico sintético, ρ a r t i cuIa rme nt e preferido para certas aplicações é um polietíi enoglicol (PEG) tendo um peso moleculc ir dentro da qama de cerca de 100 a cerca de 1 . 0 0 .000 mo 1 , em so, ma i s •0 · ref er ivelmente cerc :a de 1 .000 a cerc :a de 2 > g g 0 0 m /-χ i em pes 0 * Mais preferencial mente ainda, quan .do o núc deo do po rime ro é o polretí ien·: sglicol tem gera .lm esnte um peso mo lecu dar de: ntro da qama de cc- uca de 7.50 0 a c er ca c le 2 0.00 0 mol. em f ;eso. Mais prefer ivelmen te, o poli e t i Iene xgd r col tem um Ό e mole cular de, ap roximad amente i0.000 mol. em peso. óxidos de políalqurleno multifunctionalmente activados, tais como polietilenoglicol, estão disponíveis comercialmente, e são também facilmente preparados utilizando métodos conhecidos, Por exemplo, ver Capítulo 22 de Poly(ethylene 12

Glycol) Cheinistry: Bíotechnical and Bromedical Applications, J. Milton Harris, ed, Plenu.tr! Press, NY (1 992.); e Shearwater Polymers, Inc. Cataiog, Poiyethyiene Glycol Derivatives, Huntsvirle, Alabama (1997-1998). Para utilização como vedante de tecidos, a combinação exemplar de polímeros activados é como se segue: PEG tetrafuncional, pen t ae r i t r i t o1 pol i (etrleno giicol) éter tetra-succinimic iil glutarato (10.000 peso mol.); e PEG tetrafuncional, pentaeritritol poli (etileno qlicol) éter tetra-sulfidrilo (10.000. mol em peso). Em ambos os casos, estes PEGs de ''quatro-braços” são formados por etoxilação de pentaeritritol, em que cada uma da.s quatro cadeias é de, aproxímadamente, 2,500 mol em peso e, em seguida, derivatizados para introduzir os grupos funcionais em cada um dos quatro braços. São também preferidos os compostos semelhantes aos análogos de poli (etilenoglicol) , polirneri zados a partir de dr-glicerol em vez de pentaeritritol.

Outras moléculas radialmente ramificados, tais como glicerol ou lactitol, podem ser utilizada para construir materiais formadores de gel. As estruturas desejadas podem ser imí ca -veis com água CZ'. de ba ixo pes o molecular (35C ) a Ce rca de 12 , o 0L ) mol em pese \ .· / de rm odo a permanecerem lí .quidaí > - SãO 1"- a ΐπ én ί corri". emp 1 a d a s Pi pi p + r mj fura s formadoras de com ΠΊ pes o r nolecu lar ma i s 0 .1. evado o É pre: rerivel que ta.rs cornpc ·, w Ί f'* ' uO J. P„ ões se j cL m mi sei veis em ác jua ou dispe τ s a. v Θ i s em a cf u a para s e rem da água como o meio liquido para compatíveis com a utilização a libertação. A fim de aumentar a força da matriz, é geraimente desejável adicionar á composição um "intensificador de resistência à. tracção”. Tais intensificadores de resistência à tracção compreendem, preferivelmente, fibras d.e alta 13 Ζ'Θ S ΐ S U Θ.Γ.!ϋ 1 cX ò- !'. I-' 8 C Ç S. O , COÍÍl UamS.nnO de 1Π1 C’ΓΟΠ , (Ιθ p _Γ Θ f θ .Γ Θ .Γ.Ι C 1 cX Ο a 40 microns de diâmetro, e 20 a 5000 rnícrons de comprimento, geralmente com temperaturas de transição de vidro bem acima aos ái a,

Intensíficadores de resistência à tracção adequados, para utilização na presente invençã.o incluem, inter alia, fibra.s de colagénio, e fibras de polilactideo e poliglicólido, bem como outros íntensiiícadores de resistência à tracção lanicos intensíficadores da resistência a à tracção inoraânicos. I Jm intensificador da res 1. S L 0 T.L C -Ί. 0. 0 tracção partici ilarmente útil 0 o Vicryl (poliglicóli .do:poiiláct ido, 90:10). É bem conhecida 0 utilização de intens ificadores de resistência à tracção, qi 1 ;7> fazem parte da categoria mais ampla dos "enchimentos". Por exemplo, "gomas de silicone", quando cruzadas com peróxidos, são fracas e caseosas, com resistências à tracção na ordem de apenas 34 N/crrlu Quando adequadamente combinado com enchimentos de reforço, a resistência à tracção destas gomas podem aumentar tanto como 50 vezes. Lichtenwalner, Η.Κ. and Sprung, M.N., in Mark, H.F. ; a B y 1. o -T.' o, . G o / e Bika.l p Q ;\T ?v/| P. Η O Encyclopedia of Poi v rnier Science and yecnno1o Cj" V f V C·1 i « 1 éL· f Çj « 535, John Wiley, New York, 1970. Intensi ficai dores ; de r e ss t e n c i a à tracção adequaaos sao os que possuem uma inerente resistência à tracção elevada e também podem interagir por ligações covaientes ou não-covalentes com a rede de gel polimerizada. O intensificador de elevada resistência à tracção inerente deve liga.r-se ao gel, rpo; mecanica ou cova À. θ Γί .e de tra: sção ; . As re •iveis de poiiçlic òli resistências à trac de suturas o ,g -f. ; / _2 c v, fibras de colágeno é de 5000-10.000 isi/cnr (Hayashi, T., in Biomedical Applic. of Polym, Mater., Tsuruta, T. et ai., Eds., CRC Press, Boca Raton, Fia., 1993). 14 compreende uma ligação

Na presente invenção, a ligação, Z, covalente que é formada quando os grupos funcionais, X e Y, são feitos reagir em conjunto. Os grupos funcionais podem ser sulfidrilo, succinimidilo, acrilato, amino, etc. Por conseguinte, a ligação pode ser um éster, um éter, um dissulfureto, ou semelhante. Outros grupos funcionais, a sua reactivrdade e as ligações formadas a partir dos mesmos, são bem conhecidos na literatura cientifica. Por exemplo, ver Bodanszky, M., Principies of Peptide Synthesis, 2a ed., Páginas 21 a 37, Springer-Verlog, Berlim (1993); e Lundbland, RL, , Chemical Reagents for Proteín Modifications, 2a ed., Capitulo 6, CRC Press, Boca Raton, Florida (1991). Outros exemplos de pares de grupos funcionais incluem, inter alia, sulfidrilo/ acrilato, sulfidrilo/ succinimidilo, amino/ succinimidilo e amino/ acrilato.

Além dos compostos reactivos sulfidrilo, que formam ligações tioéster, vários outros compostos podem ser utilizados os quais formam outros tipos de ligações. Por exemplo, compostos que contêm derivados de imidato de metilo formam ligações imido-tioéster com os grupos sulfidrilo. Aiternativamente, podem ser utilizados grupos reactivos sulfidrilo os quais formam ligações dissulfureto com grupos sulfidrilo, tais corno dissulfureto de orto piridilo, 3-n.itro-2-pirrdenossuifenrlo, ácido 2~ni.tro~5~ti.ocianobenz0.ico, 5,5'-ditio-bis (2 - ácido nitrobenzóico), os derivados de metano-tiossulfato, e dissulfuretos de 2,i-dinitrofenilcisteínilo Em. tais casos, os reagentes auxiliares, tais como o peróxido de hidrogénio ου o éster de di-te.rc-bu.tilo do ácido azodicarboxíIrco, podem ser utilizados para facilitar a formação da ligação dissulfureto. 15

No entanto, urna outra classe de grupos sulfidrilo rea.cti.vos formam ligações tioéter com grupos sulfidrilo. Tais grupos incluem, rnter alia, iodoacetamida, N-etilmaieimida e outras maleimidas, incluindo dextrano maleimidas, mono-bromo-birnano e compostos relacionados, vínilsul tonas, epóxidos, os derivados de 0-metil-isoureia, etil.enoimínas, aziridinas, e 4-(aminossulfonil) - 7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole,

Extensores de cadeia

Os grupos funcionais podem ser directamente ligados ao núcleo composto, ou podem ser índirectamente ligados através de um extensor de cadeia, Tais extensores de cadeia são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, PCT WO 97/22371, que descreve "grupos de ligação" que seriam apropriados para uso como extensores de cadeia nas composições da presente invenção. Extensores de oa.d.eia. são úteis para evitar problemas de impedimento estereo que são por vezes associados com a formação de ligações directas entre moléculas. Alternativamente, extensores de cadeia podem, ser usados para ligar vários compostos muitifuncionaimente activados, em conjunto, para produzir moléculas maiores. Numa forma de realização particularmente preferida, o extensor de cadeia pode também ser usado para alterar as propriedades de degradação das composições após a administração e formação do gel resultante. Por exemplo, podem ser incorporados extensores de cadeia, num ou em ambos os polímeros multifuncionalmente activados para promover a hidrólise, para desencorajar a hidrólise, ou para proporcionar um locai para a degradação enzimática. Extensores de cadeia podem também activar ou suprimir a actividade de grupos sulfidrilo e sulfidrilo- 16 reactivos. Por exemplo, seria esperado que grupos de remoção de electrões dentro de urn ou dois carbonos do grupo sulfidrilo diminuíssem a sua eficácia no acoplamento, devido a uma diminuição de nucleofilicidade. Previa-se que o carbono de ligação dupla e o carbono de carbonilo produzia este efeito. São previstos grupos próximos dos volumosos para cada um dos parceiros para diminuir as taxas de acoplamento, devido ao impedimento estereo. Seria previsto que os grupos de remoção de electrões, adjacentes ao carbonilo reaetívo de glutaril-N-hidroxissuccinimidilo tornassem este carbono de carbonilo ainda, mais reaetívo com o parceiro de sulf idrilo.

Extensores de cadeia podem fornecer locais para a degradação, ou seja, sites hidrolisáveis. Exemplos de extensores de cadeia hidrolisáveis incluem, inter alia, ácidos alfa-hidr:6xí tais como o ácido láctico e á.cido glicólico; poli (lactonas), tais como caprolactona, valerolactona, gama butíi-lactona e ρ-dioxanona; poli(aminoácidos); poli(anidridos) tais corno glutarato e succinato; poli (ortoésteres) ; poli (ortocarbonatos) tal como carbonato de trimetileno, e poli (fosfoésteres). Exemplos de extensores de cadeia não-degradáveis incluem, inter alia, succinimida, ácido propiónico e carboximetilato. Ver, por exemplo, o PCT WO 99/07417. Exemplos de extensores de cadeia enz.im.aticarnente degradáveis incluem Leu-Gly-Pro-Ala, que é degradado pela colagenase, e Gly-Pro-Lys, que é degradado pela plasmina.

Outros princípios gerais que devem ser considerados na concepção das composições da presente invenção são como se seguem: se estão para ser utilizadas estruturas de peso molecular mais elevado, elas têm, de preferência, ligações biodegradáveis, como descrito acima, de forma a que não são gerados fragmentos maiores do que 20.000 mol, em peso, durante a reabsorção no corpo. Além disso, para promover a 17 raiscibí I idade na água e/ou a solubilidade, pode ser desejado adicionar carga eléctrica suficiente ou hidrofilicidade. Tais grupos hidrofílicos podem ser facilmente introduzidos utilizando síntese química conhecida, desde que eles nâo dêem origem a géis que incham ruais do que 3-5 vezes, ou que têm baixa resistência à tracção. Sm particular, os segmentos de polralcoxi podem enfraquecer a resistência do gel.

Além do composto (s) polzmérzco funcionalmente activado (s) composições compostos, componentes adrnin ist rad compostos e do intensíficador de resistência à tracção, as da presente invenção podem, também conter outros que podem ser incluídos num ou em ambos os das composições de dois componentes, ou podem ser os separadamente. Numa forma de realização, estes podem. tornar-se covalentemente incorporados no próprio iPN, tornando-se retrculados com um ou ambos os compostos funcionalmente activados depois de serem misturados entre si. Numa outra forma de realização, tal como seria, o caso se o composto fosse não reactivo com cada um dos compostos funcionalmente activados, o composto pode ser administrado de tal formai que se forna fisicamente ou ionicamente associado com os compostos formadores de matriz após a mistura, e assim tornam-se parte da própria matriz.

Os compostos adicionais que podem ser adicionados são os glicosaminoglicanos e as proteinas. Glicosaminoglicanos adequados incluem, ínter alia, ácido hialurónieo, qu.iti.na, sulfato de condroitina. A, B, ou C, sulfato de qu.erat.ina, queratosulfato e heparina, e seus derivados. Numa outra concretização, podem ser adicionadas proteínas para uma 18 variedade de fias. Por exemplo, o colagénio pode melhorar a biocompatibrlidade da matriz, incluindo a colonização potencial por células, a promoção da cura, etc. 0 colagénio e quaisquer proteínas contendo grupos amino contribuiriam também para a. integridade estruturai da matriz, tornando-se reticulados com a mesma, juntamente com os outros componentes da matriz. Em particular, se forem utilizados ésteres de PEG-succinimidil, as ligações amida formadas com colagénio serão maís estáveis à. degradação hidrolítíca do que as ligações formadas peia reacção de ésteres de succinimidilo e sulf id.ri.los . )S I e UI de colagé :niO ou de placenta humana, ou inante, são ads iquados v Ver d.e coiagénios adequado S Θ ent endido que. quando se é importante aj nstar a da. compos i çâo para. evi tar

As Proteínas adequadas incluem, inter alia, colagénio, fibronectina, gelatina e albumina, bem como fragmentos peptídícos destes. 0 colagénio é part.icularm.ente preferido, o qual se pode encontrar sob a forma de colagénio não frbrilar, microfibriiar ou fibrilar. Os T isolado a partir de cório de bovi: preparados por métodos de AON recc PCT WO 90/05755 para uma descriçõ derrvados de colagénio. Deve se: adiciona colagénio à composição concentração dos outros componentí a precipitação.

Constituintes adicionais que podem ser adicionados à composição incluem antibióticos, factores de crescimento, proteínas hemostáticas (tais como a trombina, a fibrina, fibrinogénio, os factores sanguíneos, etc), células, genes, DMA, etc.

Os componentes da composição opcionais acima mencionados podem ser adicionados às IPNs da presente invenção numa 19 variedade de formas que são bem conhecidos pelos peritos na área, For exemplo, o DNA pode ser adicionado sob a forma de ADN genómrco, olígonucleótidos, poiinucleótidos, dinucleótidos e assim por diante. Da mesma forma, os constituintes proteináceos podem. ser adicionados como polipéptidos, proteínas nativas, proteínas sintéticas, fragmentos de proteína, etc

Uma estrutura particularmente preferida para adição às IPN da presente invenção é uma nanofibra. Muitos dos componentes acima mencionados opcionais, e, especialmente, o colagénio rnetilado, podem ser facilmente formados numa tal estrutura, 0 termo "nanofibra" pretende significar uma fibra que é normalmente inferior a um micron de comprimento. Em alguns casos, estas fibras são tão pequenas que o colagénio nesta forma é considerado como sendo essencia1mente "não fibrilar”. Em qualquer caso, quando incorporado numa IPN consistindo num polímero fiexivei, com uma temperatura de transição vítrea relativamente baixa (menos de zero) , tal como o PEG, uma nanofibra rígida com. uma temperatura de transição vítrea relativamente elevada (acima de 25°C), confere resistência a d i c í o n a. 1.

Embora, o colagénio seja nm bom exemplo de urna nanofibra rígida, porque é formado a partir de três cadeias polipeptídicas, numa tripla hélice mantida junta por ligações de hidrogénio, outros polímeros podem ser igualmente adequados. Por exemplo, os derivados de outros biopolímeros que têm a forma de bastonete, tais como tubulma e queratina podem ser fabricados sob a forma de nanofíbras rígidas. Desde que a estrutura seja um polímero em forma de bastonete, em escala nanométriea, que é compatível com a. água e tem, de preferência, grupos polares e, mais preferencialmente, grupos amino, na sua superfície, a nanofibra rígida pode ser feita de 20 uma variedade de diferentes materials* Ver, por exemplo, Lia, G., et ai. "Diblock Copolymer Nanofibers”, Ma.croitioiecul.es 29:5508-5510 (1996). .Ambos os componentes são libertados no locai como pós, para serem misturados com o tampão no local de administração,

Numa concretização alternativa, ambos os componentes podem ser misturados em conjunto num único meio aquoso no qual são ambos não reactivos, ou seja., tal como num tampão de pH baixo. Depois disso, eles podem ser pulverizados sobre o local do tecido, juntamente com um tampão de pH elevado, após o que irão reagir rapidamente e formar um gel. Ά concentração dos compostos reactivos em cada um dos componentes da composição depende necessariamente um número de factores. Por exemplo, se os componentes da composição são, cada um, PEGs de 4 braços (i.e. composições PEG-PEG) , uma concentração de 20-25%, em peso, em cada um dos dois componentes antes da mistura resulta num gel, após a mistura, com um módulo elástico, G', de cerca de 105-106 dines/ciru, (104 — 10b Pa) , o qual é adequado para utilização como vedante cirúrgico. Utilizando colagénio metilado e PEG succinimidilo de 4 braços, as concentrações de 2-4% e 0,2-0,4%, respectivamente, resultam em géis com forças coesivas que são comparáveis aos géis PEG-PEG de 10-15%. Utilizando albumina como um dos componentes, as concentrações de 30% ou mais atingem uma força, coesiva semelhante. A. concentração adequada do composto, e outros ingredientes opcionais, em cada componente, e, assim, a concentração relativa dos componentes da matriz na matriz de gel finai, pode ser facilmente optimizada para alcançar o tempo de gelificação desejado e força, do gel utilizando experimentação de rotina. Utilizando 21 os PEGs preferidos de quatro braços, acima descritos, o po.Iime.ro sintético está geralmente presente numa concent.raçã.o de 2 a 50% (p/v) , e mais preferivelmente 10-25%. No entanto, para algumas aplicações que requerem matrizes de alta resistência, onde a fluidez das composições não é crucial, é desejável utilizar PEG a concentrações mais elevadas, tais como 50% a 70%, mais preferivelmente 60%.

Os componentes líquidos das composições da presente invenção são, cada um, separadamente, preparados por a.díção do polímero sintético activado (na forma seca ou como uma solução concentrada) , num meio liquido. Os meios líquidos adequados incluem soluções tampão aquosas, tais como fosfato de sódio monobásico/fosfato de sódio dibásico, carbonato de sódio/ bicarbonato de sódio, glutamato ou acetato, a uma concentração de 0,5 a 300m.M, Em geral, o PEG de sulfidrilo reactivo é preparado em água ou num tampão diluído, com um pH entre cerca de 5 a 6. Os tampões com pKs entre cerca de 8 a 10,5 para preparação do componente sulf idr i.io-PEG são úteis para alcançar o tempo de gelificação rápida das composições que contêm misturas de sulfidrilo-PEG/SG-PEG. Estas incluem carbonato, borato e AMPSO (3 - [(1,l-dimetil-2-hidroxietil) amíno] 2-h.idroxí-propa.no-á.cído sulfónico) , Em contraste, usando uma combinação de inale.imid.ilo PEG e sulf idrilo-PEG, é preferível um pH de cerca de 5 a 9 para o meio liquido utilizado para preparar o PEG sulfidrilo. Uma composição particularmente preferida para aplicações hemostáticas, para locais de tecidos com sanqrarnento activo, compreende uma mistura de maleimidilo e PEG succinimidil como o primeiro componente, e PEG sulfidrilo como o segundo componente. Tais composições produzem géis com biodegradabilidade melhorada e tempos de gel superiores quando comparadas com composições com apenas maleimidilo PEG ou succinimicilo PEG sozinho. 22 Ο ρΗ da. solução tampão aquosa, que é usada para cada um dos dois (ou ma.is) componentes da composição deve ser ajustada utilizando optimízação de rotina para atingir um pH finai que é favorável a gelificação rápida, sem causar gelificação instantânea que interfere com o processo de libertação. Por exemplo, tanto o arrd.no PEG como PEG sulfidrilo precisam de um pH básico para melhorar a nucleofiiicidade. Os efeitos do pl-l no ò .em] oo de ge 1 sáo discutidos abaixo nos Ex emp] ,os, ΏίΛώϊ'ΐ eif a ÂiitÇ, ViX nAn b? hr* QSS A Λ do 6θΧ As com :pOS d.ções da presente invenção s 3.0 f o rm.u 1 3 O 3. S P 3. X. cl esib dr resi stê ncra f coesiva superior. isto g -f 0 I .mente significa que ei as ar )ΓΘΰ: sentam , peio menos, 10c ; e de pre ferênc ia 20% da f orç a ! le ru] D tU ra de ϋ /1. cX .Γ.10 3 0.1' "J. .1. cX O O f ¥ f b" upercol a" . Íxempxar íeita a partxs COHl02/206/metilado raais lâ de vidro ou Vicrvl. η\ r~\ r iição de o o l.ag én io meti ia a fo rmu 1 a. Q O Θ s PEC f C 3. u. S co m 0 0 ( JH. 102/COH20 O t de scrit ;o ab ai xo no Exemplo 2, endu rece gr cL ndemen te o gel s ΡΘΪ :mite -lhe XI o sis tir a io inch; SCO em ta mpão sa 1 ino vd L i água. ] Porc pre o g :0i 11 Cl O in cha. ele co nti nua 3. ter re s rstê Γ0 A'1 f a à t x 'a.cç 1 cá O ine rente suf i cien te p ar a. per man .006 Γ 1 r g a do a íCl· r3 0 Y) ] F~; 0 X'\ tos f.1 duros os, t cl o. s c :orno cl 13 G 0 V. idr; --u fios 0.6 Vier yl , ou fios ; de sutura de s 6 O- 3. > A CO mbinação de COí 1102/ COH2 0 6 e Ci oláge no me tr lad o p ode ser co n s i de ra. da como 1 fumm r r Θ d 0 .J Lnterj: uer cet.r rante d.e O J. im.e. Isto ciC 0 ntec 0 porque 0 co] Lagén i o m 61 ria. do e OS r eagent Cl· C; PEG ex i st em como uma L (d oli X C- ci. O hemo ΟΘ nea tra nspar te an tes da ge i if ic aç ão a um pH 4 “ 5 β A capa ci dad 0 OO PEG 0 do C 0 lag énio G6 r o de coe x i s 11 r : em so] Y* ci O em con i ur j. 0 O fc uma. 23 descoberta π .1U η. f_. O -í. 11Θ S p Θ "η 3 G ci * ίϋ O ponto de gel i freação f d.0 S ΘiiC3. G0 3.ciei por elevação do pH) , o COH102 e o COH2G6 reagem 3. "L Z? 3. V Θ S d O 3 seus respectivos grupe >s reactivos para formar ir gações tio-éter. Esta ligação dá origem a um; a rede de pe s o molecular infinito, qu e é uma caracterí . s tica ri η o géu . s cte po 1ímero, 0 C0H1G2 e o COH206 f oram géis sózin hos, m as esses C[<2 is sã o comparativ amente fracos . Quando c ) C ole igénio met .liado o c: t, 3 p X 0 sente, os grupos aminc a no cola génio podem f :ambém ;eag.ir com COHÍ02, formando ligações amida e resultando num ge .1. de t. .1' Θ 8 v d. 8. S de cova lent eiTlGn t Θ a uma red· 7\ cl Cl G Ç cl 0 A Q col s u f ’i cien temente : r obu 3 3 0 Se c G6.i . nâo é s sren fi.br r\ o ao O f este pu .Xg” o p; elev a da resisti §nc a ia G abai xo mostra q LL G f qu pol r mérr cas são s ubst dese η·\χ·Ν au γ) h.o das I: igaç : o e s .et .í i a.d.o, Ί G metilad ie confer el ativamen aro metiiadocria um gel que e a suportar os enchimentos fibrosos, itemente forte para manter o enchimento a fora sob cargas de tracção, e a acçâo nâo é alcançada, A Tabela 12 ando outras moléculas ou partículas são substituídas por colágeno metilado, minui, Assim, o cola/ sendo uma molécula relativamente rígida, resistência melhorada ao hidrogel de PEG diluído. Os polímeros flexíveis, tais como ácido hialurónico, pol.il isina, e quitosano, embora tenham um peso molecular relativamente elevado e criam soluções relativamente viscosas, aparentemente nâo têm a mesma rigidez e são, portanto, menos capazes de absorver tensões de tracção e passar estas tensões para fora do enchimento fibroso. T” G 0 s pol ímeros, o PEG é uma cadeia de al que tem i. ama baix a tempe ratura de transr cao ;.ur a. à. qu a I o polim ero é : flexivel, em vez de Θ r í. gído); o col .agénio meti Iado j- Gjr! uma. C G Π õ ição vítrea ma is e levada (i sto é. o

Relatrvamente vítrea (temperatura como borracha 24 eolagénio metilado perde a sua rigid.ez, torna-se flexível, e;n cerca de 33-35 graus C, temperatura à qual ele "funde" para formar gelatina, uma molécula de cadeia flexivel). Porque se forma uma rede interpenetrante de polímero (IPN) entre um polímero (PEG) de baixa temperatura de transição vítrea e um polímero de alta temperatura de transição vítrea, (eolagénio metilado), o resultado é um reforço do primeiro mediante este último. Se se tenta reforçar PSG com um outro polímero flexivel (tal como o ácido hialuróníco), que também tem uma baixa temperatura de transição de vidro (isto é, é flexível, a temperaturas de interesse), não se consegue alcançar o reforço. (Ver, por exemplo, Sperling, LH, Hueick, V., e

Thomas, DA, "Morphology and mechanical behavior of interpenetrating polyrner networks", rn Polymer Networks, Structural and Mechanical Properties, eds. A.J, Chompff, S. Newman, Pienum Press, NY, 1971, p. 435), A força de ligação reforçada da formulação finai é aparentemente dependente de vários fautores: 1) os reagentes PSG COH102 e COH2G6 ligam-se covalentemente para formar um hidrogel; esse gel também exibe excelente ligação aos tecidos, aparentemente porque o éster de succinimidilo do COH102, que se pode ligar a grupos amino nos tecidos (ver Tabela 14); 2) o eolagénio metilado forma uma rede interpenetrante de polímeros com a rede de gel PEG, reforçando-a; e 3) a passagem das cargas de traeção para os enchimentos fibrosos, tais como fibras polilactide/glicólido ou fibras de vidro. Assim, a adição dos enchimentos fibrosos é fundamental para alcançar o nível frnal desejado de resistência à traeção do gel, É previsto que outros derivados de eolagénio que permanecem solúveis (moleculares, não fibrilar) a um pH de 4-7, possam, também conferir as mesmas propriedades desejadas. Por exemplo, outros ésteres de grupos carboxilo de eolagénio, 25 tais como colagénio etilado, propílado, ou benzilado pode também funcionar como colagénio meti lado. 0 colagénio fibroso é menos desejado; porque forma domínios em forma de esferas, domínios aglomerados no gel e não conferem resistência à tracção melhorada * Os derivados de colagénio que não são solúveis a um pH de A, ou que não podem conter grupos amino livres, reactivos, tais como colagénio succinilado, também não são preferidos, porque não proporcionam as propriedades desejadas. Os polímeros sintéticos que exibem rigidez são quase exciusivamente insolúveis em água, estruturas cristalinas que existiriam como grumos de escala inicron e não formam a rede íntima interpenetrante com o hidrogel de PEG que é necessária.

Ainda outra forma de fornecer as composições da presente invenção consiste em preparar os dois componentes reactivos (ou o único componente reactivo no caso de componentes contendo sulf idrilo que sã.o concebidos para formar ligações dissulfureto), na forma inactiva como pó. Tais composições podem então ser activadas após a aplicação no local de tecido, ou imediatamente antes, mediante a aplicação de um activador. Numa forma de realizaçã.o, o activador é uma solução tampão com um pH que vai activar a composição uma vez misturado com a mesma. Ver Exemplo 7 para uma descrição de uma composição de PEG contendo suI.fid.rilo, que é mantida a um pH baixo até à adminrstração, sendo depois misturada com um tampão de pH elevado, no local de aplicação, para iniciar a gelificação.

Ainda uma outra forma de fornecer as composições consiste em preparar folhas pré-formadas, e aplicar as mesmas como tal no local de administração (ver exemplos). 26

As composições da presente invenção podem ser usa.das numa variedade de diferentes aplicações farmacêuticas. Em geral, as composições aqui descritas podem ser adaptadas para utilização em qualquer aplicação a engenharia de tecidos, em que as matrí zes de ge 1 sint :éticos et ttão acti ..ment :.e a ser ut; Por t íxempio, cl 3 C O! aposições da. pre 3 0 nte .1 V V t ΐ n ç â o s ão úteis como vedante de tec - U Cí O 3 y ii O aumento dt S t€ 2cidc )S, na : separação de t ti CJ1 Q.O it f como agentes hemostá ti cos, na preve mção de ad.erê: ncias ; ^6 teci: dos, no f orneciir i.e n Γ ^ cie ΐ TiOdi f í Ci ações de superfície, e em aplicações de iíbertaçã.o de fármaco/célula/gene. Um perito na arte pode facilmente dete rmínar o p r; 310 C 010 de admi nistração a d equada P 3ΙΓ ci uti 1: rd N r-i r com qualquer composi Ç ã O , t í enc Lo uma :esrstí tncia de ge 1 conh ecida e u m tempo de gel: :ios pr inc ir pio s aqui descritos e nos princip " fd c ; c.ient íf i cos b< em con hec ic los • Uma descrição m ais det alhada ( ie v ária. s clp licaço es esp 0 C 3 f - i. 0 S. s é dada abaixo: A AíÍA £ ivQS £ÍA tio V V i" C vi- At i% , V*v V Ϊ" Ar vi V V vvv V/ ®v v V V ν' Vtv Vã> V· vV vvv VvV> N uma aplicação prefe τ'1 pi r 1C! ’ 3. i 33 composições aqui descri tas podem ser • utilizada -S par '3. situações clínicas que requerem um revest ime; nto ou ca ma d. a d.0 vedação ρ a r a. r m ρ e o i. r a r o g' a. de gases, li quidos ou 3 ó i i c ios 0 métoc lo implica a aplicação de ambos os componente s no tec tido danif 1C30.0 OU 0XCf30 3 V 00.31? I) tecido s ‘3 3 S C O 1 ci.γ' Θ S p 0 \X outros tecidos OU Ο ΓQã o s u nara

interromper ou minrmizar o fluxo de sangue, 2) o tecido do tórax, para parar ou minimizar a fuga de ar, 3) do tracto gastrointestinal ou tecido pancreático para parar ou minimizar o vazamento dos conteúdos fecais ou dos tecido; 4) da bexiga ou uretéres para interromper ou minimizar as fugas de urina, 5) dura mater para interromper ou minimizar as fugas de CSF 27 (fluido cerebroespinal; e 6) o tecido da pele ou da serosa para parar a fuga de fluido seroso.

Estas composições também podem ser utilizadas para adesão de tecidos em conjunto, tais como pequenos vasos, nervos ou de tecido dérmico* 0 material pode ser usado 1) através da sua aplicação à superfície de um tecido e, em seguida, um segundo tecido pode ser rapidamente pressionado contra o primeiro tecido, ou 2), colocando os tecidos numa estreita justaposição e, em seguida, aplicar o material. Além disso, as composições podem ser usadas para. encher os espaços em tecidos moles e duros, os quais são criados por doença ou cirurgia.

Uma aplicação preferida consiste num método de reduzir a formação de aderências após um procedimento cirúrgico num paciente. 0 método implica a aplicação do material no tecido danificado ou órgão, quer por pulverização de ambos os componentes em conjunto ou por aplicação de componentes antenorrnente misturados ou de um implante sólido pré-formado. Os componentes irão reagir em conjunto para formar uma matriz forte sobre a superfície do tecido. Os procedimentos clínicos incluem indicações ginecológicas, neurocirúrgícas, abdominais, cardíacas e ortopédicas.

Uma aplicação preferida consiste num método de aplicação local uma substância biologicamente activa a pacientes. A substância activa pode ser liberta em conjunto com os dois componentes, de tal forma que o material pode formar in situ, ou pode fazer parte de um implante pré-formado. A substância activa pode ser libertada quer por meio de processos de 28 difusão controlada ou pode ser covalentenente ligada aos componentes de tal forma que irá. ser libertada, à. medida, que o hidrogel resultante se degrada.

As substâncias biologicamente activas podem ser qualquer uma de uma variedade de materiais orgânicos e inorgânicos, incluindo proteínas, hidratos de carbono, e ácidos nucleicos. Exemplos específicos incluem enzimas, antibióticos, agentes antineoplásicos, citocinas, anestésicos locais, hormonas, agentes antiangiogénicos, anticorpos, neurotransmissores, fármacos psicoactivos, fármacos que afectam os órgãos reprodutivos, e oligonucleotideos terapêuticos.

Uma aplicação preferida é um método de aplicação de revestimentos para implantes para afsctar as propriedades de superfície de imola: '1 tf. Θ. s ou para aj udar os implante jS a atem. às superfícies de te; srdos Um r revestimento dos componen tf O S pode ser aplicado cL D enxertí ss vasculares, stents p ara minimizar ou impedir a fuga de sangue ou fluido seroso ; parti r de s t. e s d 1. sposi tio 70 S , para reduzir OU pa.ra.r a. fit artif rciars i d d. ]_ CÍ minimi õ1 .t; itivos, 2) cateteres ou. implantes mamário; r a fibrose excessiva, 3) pensos ou rede; a fibrose excessiva e para ajuda: os implantes a aderirem a superfícies dos tecidos.

Uma aplicação preferida das composições consiste em enc apsular o ·-* r Cl S 3 1L 1X1 f libe rtar C 01 \x 1 cl 3 ϋ Li O 0 Γΐ O c f a qual inclui rnat enai a par tir de f on 1 :es \ saturais ou DMA sirv 1.. Θ l. A. Cf G f .υυίλι 3. 3 cl 3 suas re spec tivas f o ma. . S 3. Ώ .ti-sense, rn j.m local. desejado. As céí ui as pó; iem incluir cél ul as estamrnai s mesenqui mais, células 29 epiteliais e células neuroectodérmicas tanto de origem aloqén.ica ou xenogénica

As células podem ser

acrilato, eritritol tetraquis (3-mercapto -propi o r i a L o) , 'PESH-P”, Fiq. 2a), 1 ,08 g, e pen ta-erm t r i t o 1 peso moi 352 (”P EIA”, Fig. 2b) , 1,0 g em conjun .to na pres ença de 5 a 10 ug de um ;ao oxipropileno tri-amina ("1403", Fig. 2c, Jeffamine, Texaco

Chemical Co., Houston , Texas.), que serve como uma base.

Tod 0 S 0. s espéci a.\ o .·>_» reactiva S S â O .1. Iguidas, o rESH- ~P 0 O PETA nãc são misciv s em águ a. Por consegui nte O ΡΞΤ) A é a que cicio a ce rca de 4 0 O „ 2· I d a r a formar um 1í qu i do antes Ci0 C; ,Ο mi s t urar com PESH-P 6 T403 . De π L jí c^· 00 1. a. 5 mi n .utos apó s a mi st d a, depe; ndendo do n ive. .!. d.0 T403, começa a ge li fica i.ção 7\ e .C~\ liga Ç cL 0 forma da entr 0) PESI-I- P e PETA é mostradc a fig » 1 • o ge 1 é deixado a cur ar dura nte várias ( horas, s egu tido ρ ΌΓ uma hor a de hidr cl t, õ. Ç cl 0 f a -3-7 O Em seg uiGSf a resistê. nci; r à cção do gel < d .-í — í\ Ο Γ) a Ge U , o o + /- 0,3 MPa. Quando tal; s géis são xados em solu ção salina fisiológica, pH 6,7, são estávels ante ma is de 40 dias, e ; apenas incham cerca de ii0'6 > Daaos sobre a força de ruptura mostram apenas uma adesão moderada ao pó-de-pele (hide grindate). Isto seria de esperar, uma vez que não há nenhuma ligação química de su.lfid.rilo ou acrilato á proteína utilizando misturas PETA-P/PESH. Em três testes de força de ruptura, foram observadas pressões de ruptura de COTO minHg (2,67 lCh-5,33 10J Pa). 30 £* Métoíins *

JC Vãj, Ai nJC> OsVv rtv Vã* *ãã* JC VVfl **a?r ^JWN/ Ãv V tiol, 10.000 mol. em peso. ("COH206"), penta-eritritol de polietileno glicol éter tetra succínimídil-glutarato, 10.000 mol. em peso. ("C0H.1G2"), e penta-eritritol de polietilenoglrcol éter tetra amino, 10,000 mol. em peso. ("COH204”) foram adquiridos à Shearwater Poiymsrs, Inc. (Huntsville, Alabama.) Cianoacrilato, "Súper Cola", que foi comprado num estabelecimento comercial. Gelatina, 70-100 Bloom, foi adquirido na Sigma (Saint Louis, Mrssouri). Sulfo-etileno-giicoi bis succinimidil succinato ("S-EGS"), dimetil suberimidate ("DMS"), e dissuccinimidil glutarato ("DSG") foram adquiridos à Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, Polietileno glicol ("PEG") 200 mol. em peso. di- acrilato ("PEG-di-acrilato de"); PEG, 1000 mol. em peso. di~ metacrilato ("PEG-di-metacrílato") , e 2-hidroxi-etil metacrilato ("H.E.MA”) foram, adquiridos à Polysciences, Inc., Warrington, Pennsylvania, O polipropileno ("OPP"), 540 mol. em peso. di-acrilato ("PPO-di-acríiato de”); PPO, 230 mol, em peso. bis-2-aminopropil éter ("PPO-di-amino 230"); PPO, 2000 mol. em peso. bi s-2-am.inopropr 1 éter ("PPO-di-amino 2000”}; politetrahidrofurano bis (3-aminopropil) ("PTMO"), 350 mol. em peso, ("PTMO 350"); PTMO, 1.100 mol. em peso. ("PTMO 1100”); PESH-P, 489 mol. em peso.; Mol, PETA 352, em peso;, e potássio meta bissulfito foram adquiridos da Aidricb Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Persuifato de amónio foi adquirido a partir de Biorad, Inc., Richmond Califórnia. Colagénio metilado foi preparado a partir de colagénio purificado de 31 eório de bovino, na ; seqr IΘ .Γ.Ι C."l. cX (Ιθ ΙΓ m. método modificado a partir da Patente dos E ; 3 t 3. C los Unidos No. 1,161,55 3 (Ver Ex< emolo 7) . As estruturas ; de ΊΓ·' rp T\ 4 ( 3 (também denominadas de óxido de politetrametiiene cl -am: ma), PPG di-acrilato e PPO di-amina são mostrados na FIG 4a, 4b e 4c, i resoect ivamente.

Os géis foram preparados como se segue: a, COH102/COH206: 100 mg COH102 foram dissolvidos em 400 uL de 0,5 niM de fosfato de sódio, pH 6,0. 100 mg COH2 0 6 foram dissolvidos em 400 pL de fosfato de sódio 300 mM, pH 7,5. As duas soluções foram misturadas num copo e vertidas para um molde de, aproximadamente, 8 X 0,5 X 0,5 cm. A gelificação ocorreu em 2-3 minutos. A amostra foi deixada à temperatura ambiente até secar. A matriz seca foi removida do molde, e bu.dratada a 37 '"'C durante uma hora antes do teste de resistência, à tracção. :OH1Q2/COH204 em a, excepto nc L.li O · »

* V., V A amostra foi preparada como descrito facto de o CQH204 ser substituído por c. PETA./PESH-P: A amostra, foi preparada como descrito no Exemplo 1. d. Géis de gelatina: 20% de gelatina em tampão de fosfato

de sódio/carbonato sódio , pi i a, o. foi mistr irada com compostos diferentes como ind. rcado ad na j χο (=> rie scrito em a,, assumindo 10-20 moles de r no 1 e s a.rr d.no activo por ir Loie de gelatina, e utilizando : o s niveis estequiomé trreos dO outro composto. e, COHlG2/PPO-di-amino 2000/PEG-di-acriiato: 615 mg COH1G2 foi dissolvido em 323 pL de etanol, e misturado 32 C Ο ΙΓί PPO-di-amino :rilato, tal como descrito em a, 2 4 6 μ ]. de 2000 246 uL de PSG-di f. PETA/PPO-di-amino 230/PPO-di-amino 2000 : SOOpL de PETA, 630 yL PPO~d.i-a.mino 230 e 150uL de PPO~d.i~a.mino 2.000 são misturados em conjunto, como descrito em a. ç, COH102/PTMO: O gel foi preparado como descrito em e, com PTMO 1.100 substituído pelo PPO-di-amino 2.000.

Cianoacriiato: A col .mediatamente endurecida. foi extrudida sobre água

HeMA: 1,3 ml REMA e 64 yL de PEG-dí-acrilato foram dlSS olvido cg em 60 C ; pL de ta mpão de f osfato de sódm o 150 m.M, pH 7, 4-1 f e mi sturou- se com 4 0 jt ;q de o ersultai :.o de arnón Ί O TF á< ’]U 3. 3 100 gL. Zí mistura, f 'oi aque cida. a 60-S0 o urante 4 h o I aS • “ ^ ( ;OH102/ 'C( 3H2Í ) 6 / o ! O J. 3 Cf Θ 3 n .o r neti lado: 2 5 mg de cola génio meti lado, 10 mg de COE [102 , e 100 mg de COH2 0 6 foram diss olvido cg em 1 m! i de r o sf ai to de sodi o 0,5 ml 4, pH 6, 0 .

As extremidades dos géis secos foram fixas e, em seguida, as regiões centrais de todas as amostras foram rehidratadas durante aproximadamente 1 hora em tampão de solução salina fisiológica, pH 6,7, a 37 °C antes do teste. Em seguida, as matrizes foram estendidas até ao ponto de ruptura em um eiho de teste Instron Mc )deio 4202 (Instron, Inc. , Cant. achuseti q 'j rj: : ç i estava e< quipado com uma célula ce : carga N. A c; arga de pico foi registada e convertida em ten ΓΠ3 lá L n. .1. i zando a seccao d .C ó. Π S V 0.3 S 3 i medida da a mostra 33 ponto de ruptura. Os dados foram também representados como tensão versus estirpe, utilizando a expressão estirpe-AL/Ln, em que AL é a extensão, e Lo é o comprimento da amostra original.

Tabela 1

Ma teria 1 HE MA

Medidas da força de tracção Res: à Tracção /3 (n=10) 26 (n=2) 34 36 ín=2) 2 0 37 Çn=3) 10 ín=2) 4 (n=2) u: s/ 8 4 26 6 6 (n-2) 5 •3 5 (n::: 4) 10

Cianoaerilato PETA/PESH-P PETA/PTMO-di-amino 350/1,I0G PE TA/P TMO-d i-am ino 110 0 PETA/PPO-di-amino 230/2,000 PESH-P/PPO-di-acrilato COH102/COH206/colagénio metilado COH102/PPO-di-amino 2000 / PEG-di-acrrlato 200 COH102/PTMO-di-amino COH102/T403 COH2 0 6/PEG-di-acrilato COH/2 0 6/PEG-di-me tacrilato/PEG- diacrilato COH2 0 6/PEG-di“metacrilato Gelatina/DMS Gelatrna/3”EG3 Gelatrua/PETA Gelatina/DSS/T403 COH102/COH206 20% COH102/COH206 10% 34

Adesivos de alta resistência à base de COH102 e COH206 e ama

P™ e G1ÍC-20HS

Sumario: aéis foram investigados como potenciais for mu li ações de su bsti tu 1 ÇclO C ie su tura. Géi: 3 com b cl 06 .η 0 s S- d e penta -eri i t o 1 e XÍb i r: em elev clclcl. força O 0 ΤΠ3 S f: raca í orça. a de s i. V 3 Gé: l. S co TTl b 3 8 0 ru uri: l sue c i n gli cers si PEG com 3 bra co C; exib n i saixa r« esis ;t ência co mas um .cl bOcl força ades IV a . Géi S C om base e τα s Q lução aqi fs " 'i- (rs :/v) CC ÍH102/D 0H2 0 6, íi O s c :u a i s vários ma t .e. r i a i s f:b t 0.1' οΓΠ adiei o Ç"; p, ,G o. t a i s somo 0 c ml agénio i n s O.. i. ú v e J. f h uosa a suturas poliglicólido e lã cie vidro, exibiram ambas: força coesiva e adesiva boas.

Adesivos clínicos de elevada resistência têm interesse como substitutos de suturas no fechamento de incisões C ~· rúrgicas. Em part icular, os géis f ormado s a p >artir de PETA pi 0.Θ PESH-P d· emonstr; aram ter em resist ências à t r ci cj ç ã ij o e rca de 10 X maiore s G ϋ O, li e as f< armadas a part.) cr de ; 20% (ρ /v) de 8 0 luções d· Θ C0H1G2 COH206 Quando géis c ie PE ΤΑ-PESH-P τ n r arn 3 U plementac lo s com polimerc )s fibrosc S 3 OU part iculados f for am Ob servados G éis comi r Θ s i s r o ncra à tr< SCCãO í linda ma is eles • 3.3. cl »

Esta exi ser: i. ência de sc j r 0 v 0 i as p: ;opr :i edades ad.08 ; ivas do PE: EA/PESH. -P Θ géi s r Θ .1 ..aci o na/ dos, bem corno arr ibas 3. 8 pre spri eda< des acÍ0 3 1V cl 3 Θ de tra cçã; s de uma formulação d e COH 102 C0H2 0 & ci b r\ o U '5 (P/v) , 3. Cf uai o C- o r ci o íénio e outros p o lime ros sãc s adiei Ο Π Cl G os„ Também S ã C ! de scr. í f a s as propriedades dos g éis luu ornados a pa .rt i r de um a sv 1 nd n im 1 da q licerol de 3 bra ços ( N 0 E

Corp, Japão) e os reagentes acima. 35

Materiais e métodos: PETA,

PESH-P e tetraqui penta-e mercaptoaoetato) (PESH-A), polietileno, a superfície activada de tamanho de partícula de 180 u, e polibutadieno, epóxl funcionalizado, epóxl E.W. 260, foram adquiridos na Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin. GLYC-20HS (poli-oxietileno éter de glicerilo) succinimid.il succinato 2600 mw) , DEPA-10H (poli-oxietileno-bis-amina 1040 mw) foram obtidos a partir da NOF Corporation, Japão. COH102 e COH206 foram grau reagente de Shearwater Polymers, Huntsviile, Alabama. Polietileno-co- acri lato-succinu.midato (PE-AC-S) foi sintetizado a partir de um. poIietileno~co~a.cri.Iato de etilo (aprox, mol. em peso. 100K com 5% de acrilato) adquirido à Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin. Colagénio insolúvel de Kensey-Nash (Semed F) foi adquirido a partir de Kensey-Nash Corporation, Exton, Pensilvânia. 0 colagénio Matrix, Inc, Fran.kd.xn. Lakes, New Jersey, forneceu um segundo tipo de colagénio insolúvel. As suturas Prolene 7-0 foram fabricados pela Ethicon

Corporation. Folhas de colagénio fibrosas grosseiras foram cortadas a partir do mesmo colagénio cório de bovino fibroso grosseiro, como o utilizado para o ensaio de ru.ptu.ra tal como descrito em Prior, J. J., Wallace, D.G,, Harner, A,, e Powers, 'N., "Um. hemostático puiverizável contendo colagénio fibrilar, trombina bovina e plasma autólogo", Ann. Thor. Surg. 68, 479-185 (1999) , Estas folhas de colagénio serviram, como um modelo de tecido para estudos posteriores. Fibra de colagénio menor foi preparada a partir de colagénio de cório de bovino digerido com pepsina re-precipitado fabricado por Collagen

Inc., Paio Alto, Califórnia. Lã de vidro foi adquirida à VWR Corporation. Suturas de Poli-glicólido, não-revestidos ("Dexon S") foram adquiridas à Davis and Geck. 36 A formação do gel p3.V3. ei. 3 ΙΪΙ.0 0. .1 Ç Ο Θ S ϋθ res rs itência 3 tracção é descrita acima no Exemplo 1 .. íó3.1. 3 t.6 3 E0 3 i jp ruptu V -p. / o aparelho utiliz ado é ; descrito em Wallace, ei i a r , . , Sup 2. 3 » Aproximadamente 1 ml da fórmula t .otal foi p ulv' erizado ou espalhado pela espátula sobre o substrato de de colagénio fibrosa grosseí ra e deixou -a assentar. .ri O r e s s ã o d. a água foi aplicada após a formulação ter atingido d t extura de um sólido de borracha relativamente firme (não ma is pegajoso), e a pressão de ruptura do tampão seio foi registada como mm Hg, Gé.i s d .0 60% de COH.102 e COH.2 0 6 f; 0.Γ8.Π -| -Q reparados COífiO 3 ue: CC )H1 02 foi dissolvid' o em 60% (p/ v) ít:rp tampão S ( fosfat sódio 0, 5 ml p: r-: d Q ο ç·, COH206 for r< "i q •-Λ -c. o 3 O vrdo també ma 60 fosfat .. O cte S O 0 io 300 mM a um pH 7,5 ou 8, 9; ou, em fosfat sódio i: '! mM, carbonato de sódio 1 3 3 mM, pH 9,6 ( "tampa. PC’") . Em alguns casos a proporção acima referida de fosfato e carbonato foram alteradas para dar um pH de 9,44 para tempo estabelecido ma is rápido * 0 pH utilizado em cada caso for de ter mi. nad.o peia taxa de gel Li fica ção d esej ada , Váric )S adi ti .VOS foram a dicionados a uma tal base ae fo rmi 13 3 Ç 3 : s; por exemplo 1 ( Ό colagén io d a Ken sey-Nash e o co . _i_ p, o j én io de : menor tamanho da oram adiei onados a 2 8 mg/i u]. do 02 si fí .nai; 1 a de v i p X' O foi ad.i .ciou 3.0.3 3 25 mg/ml; e sir tUI: 3.3 d.e pol rgl iccf i1do, a 4 0 mo/ml.

Resultados e Discussão:

Os resu. l.tados são discuti dos abaixo e mostrad· os nas Tabelas 2, 3 e i que se seguem. A resistência à tração de >60 K/cm2 é : sonsic ierado "forte". A re :srstência à ruptura de >5 0 mm Hg (6,66 1 0 V .:; e c o n s .r o: e.:: a o: a. " b o ] a adesão". 37

Os géis de PETA e PESH-P mostraram boas resistências à tracção (exemplo 1) , No entanto, quando foram restados para a adesão a um tecido simulado hidratado (folhas de colagénio fibrosas e grosseiras), no teste de ruptura, exibiram fraca adesão (pressão de ruptura <50 mm Hg (6,66 10° Pa) . Como mostrado abaixo na. Tabela 2, a formulação foi então modificada para conter Glyc-20h e DEPA-10H. solúveis em água, ou o par COH102 e COH2 0 6 (que por si só, em meio aquoso, deu uma boa aderência as folhas de colagénio). Estes materiais tiveram boa resistência à tracção (avaliação manual), fitas novamente uma pobre adesão às folhas de colagénio* O gel formado a partir de Glyc-2Gh e ΌΕΡΑ-10Η também tinha fraca, adesão quando a. água não estava presente na fórmula. Um resultado diferente pode ser observado quando estes reagentes são dissolvidos em tampões aquosos, uma vez que são solúveis em água.

No entanto, quando Glyc-20h foi o principal componente, em massa, os géis foram fracos mas exibiram uma boa aderência no teste de ruptura. Usando estas combinações particulares de componentes, pareceu que se podia conseguir tanto uma elevada resistência à tracção ou uma ligação adesiva elevada, mas não ambos.

Tabela 2

Resistência à tracção e resistência à ruptura de géis preparados com NOF de 3 braços glicerol-succinimida

Material Resistência cl Tracção Força de Ruptura (N/cirh) ÇmmHg) PETA 500 mg >gQ 23 (3,06.103Pa) PESH-P 540 ul. 14 03 5|j.l 38

Resistência à tracçãc re si stênci preparados com N OF de 3 braçc “·, C; glicerol Material Re s i s t ênc-í a à Tracçâo (N/c m2) à ruptura de succinimida Força de Ruptu. (mrnHg) G.LYC-2 OHS a 50 mg PETA 500 mg PESHP 54 0 μΐ DEPA-1 OH 9 mg PESH-A 216 μ.1 PETA 240 mg GLYC-20HS 40 mg 14,5 (1, 9 3,10P a ) 11 (1, 10"Pa' PETA 40 0 mcf COH1021 0 0 mg pesh-p aL 44 0 COH.2 0 6 10 0 mg- DEPA-10 H 8 mg- 15 (2.10 "Pa) GLYC-2 OHS 640 rng DEPA-10H mg- 2 5 GLYC-20HS ma 4 0 0 5; 39

Resistência à tracção e resistência à ruptura. de géis preparados com NOF de 3 braços glicerol--succinimida Material Resistência à Tracção Força de Ruptura (N/cm2) (mmHg) PESH-A 36μ1 T403 10 μΐ G.LYC-2 OHS 400 <3Q 166, 194 (22,1.10JPa mg 259 10"Pa) PETA 50 mg PESH-A. 72 μΐ Ϊ4 03 2 0 μΐ GLYC-20HS 200 mg ϊ 4 0 3 1 9 μ 1 PESH-P 18 ]JÍ <-· o ( (7,33,10"Pa) ’a t a. z ado ucoinrmidr 1- or eficaz c le resistênc A. CÍ d géis e de ( 10H101/206 ( Tabe resistência à tracção djj p c um polietiien agi: n como u: ã.o par a os géis d· Ã ste material nã A \ Q , t ai vez porqu é, a. sua rati ;nt e e .1. . Θ V ó. ó. 3. * ,____ _ __ ___________ __________ 3) aumentou a não era um filamento estendido, isto relativamente ao asnecto não era suficientemente elevada

Polietileno-co-acrilato-succinimida ("PE-AC-S") como Inter da Resistência à Tracção ador 40

Ma te rí a i PETA 400 mg PESH-F 432 al T 4 0 3 8 μ I PE-AC-S 20 mg

Resistência à Tracçao (b/cnh) iõ (O mesmo que o controlo sem PE-AC-S) COH102 COH.2 0 6 (60%) colagénio +KN (28 mg/ml) +PE-AC-S (40 mg / ml) (Ma is fraco do que o controlo sem ) A tabela 4 também resume os resultados com COH.102 e COH2 0 6 além do colagénio fibrilar da Kensey-Nash, que exibiram uma resistência à tracçao melhorada superior aos géis a 20% e 60% folhas Prolen força de COH.1 02/206 : sózinhos - Além. disso / ci f OI anulai :;ão de /COH o o í; i colagéni o possu ia uma boa 1 i gaç 2 p, 3.CÍ0 siva 3. S 0iTi COl .agénio. Outros ad itivos, fa -L ct :;mc ) sut de td / -0 e ρό“θ'θ"Ρ >eie íhí; ie grindate) ta: mbé m aumer. itaram a r) n gel em. reli içã.o o.ot > c :ontrolos . Al gun s ench imento s. com; A C :ol agénic ! de i ieq- uena fibr 7') ol iet. 11 e η o; Θ tadi Θ Γι O r não < oxrbem prc Dpriedades d T 0 Slot t incia à polibatac tracçao aumentadas. Finalmente, alguns enchimentos ou suas combinações, tais como a lã de vidro e colagénio insolúvel, ie poli-glicólido, exibiram um aumento ;r stencia à tracçao, superior a ooservao-B mpio 1). Foram a .1.1. m i c a ci a. r o r ís formulações raperfícies de 3. A. 3>fr> de suturas G0 pol Si i fica tivo da re 0 3 0' :C> VO 0 co m ciano acrilato (i co 0'\ t-Τ' Ϊ/ΟΠ Clci d o s rei ativos a r orça de ma s 0 .1. 0 & confirmam Q“! 1 Cl· toc (6 0% ) sãc ; altamente a de SIV po Jl ti anto, seria espe í '£3.0.0 qu o. o o i .L. O u. 3 .m recolhidos ó Θ 3 de COH102/20 de colagénio, e aos tecidos. 41

Corno mostrado na Tabela 4, o hidrogel P-HEMA é descrito em Santin, M,, et ai., Synthesis and. characterrzatron of a new interpenetrated poiy(2-hydrosyethyimethacrylate)-gelatrn composite polymer", Biomaterials 17,1459-1467; e o gelatina-PEG-df-acrilato é descrito em Na.kaya.rna, Y., e Massuda, T., "Photocurable surgical tissue adhesive glues eornposed. of photoreactive gelatin and poiy(ethylene giycoi)diacryiate", J. Biorned, Biornat, Res. (Appl. Biomater.) 43, 511-521 (1999).

Tabela 4

Testes de Resistência à. tracção e de Força de Ruptura

Material Resistência à Tração (N./cmt) Força de Ruptura (mm Hg) COH1G2/2G6 2-12 100-200 (13,3-26, 6.10¾) Phema GEL 20% 3 Hidrogel* Gelatina-PEG-DI- 5-16 151 + 34 (20,1 ± 6, 84.103Pa) ACRILATG ** PETA-PESH-P 50-170 14,23(1, 87.103Pa, 3, 06.103Pa) PETA- PESH-P+ 1.40-200 colagénio KN COH1G2/2Q6 123 ± 39 268,216 (3, 81.10"Pa,28,3.10;:Pa) (60%) ã (N=7) KNcolagénio COH102/206 180 (60%) + KNcolagénio t suturas Prol ene 7 - o COH102/206 1 0, Ί "< 0 -r ^ ; / ‘J (60 %)+pó-de-pele 94 42

COH1Q2/2Q6 (60%) sem enchimento COH102/206 (60%) + colagénio de pequena fibra CGH102/206 (60%) + suturas revestidas de Prolene 7-0 COH 102/206 (60%)+ polietileno + poi i-butadieno COH102/206 í 60%)de polietileno + Poi i-butadieno COH102/206 (60%)+ la de vidro COH102/206 (60%) + colagénio KN+Suturas Dexon S Ά í-7 58 5 8,302 8,21 745 156 (2,08 104Pa) 161 531 376 (5, 01,104Pa) CGH102/206 (60%) + Colagénio

Matriz de colagénio +

Suturas Dexon S A Fig, 5 representa o ensaio de tracção de CQH102/206 (60%) acrescido de 28 mg/ml de colagénio Coilagen Matrox acrescido de 40 mg/rni de peças cortadas suturas de poliglicólido não revestidas Dexon S (4-0). A resistência à tracção medida, foi ma.ror do que 700 N/cirh, e a medição foi 43 interrompida quando a amostra começou escorregam pa.ra fora do dispositivo de teste (declive descendente.) COH10 / COH2 0 & Ρ o' :lem ser díSS olvid·: os em conjunte em eta nof sem rea . C Ç 3.0 . sol uçao de etano 1 pod< e ser ç- ; vaporada a té à 8 ecu.r. • — f dei 2 eando um pó fjo PEG rea cd :.i vo. Quando colocad. o em tam; pão PC yr / 0 H 9, 6, O pó gel: 0 λ. C 3. ί n s t antaneamente, hi 3 P G Gtd 3 n ζ~·, p-. rta for então u sada pa lesenv oiver uma f c ) il G G G td 3 d. V7 cL « AS espc >n j a .s dc s colagénio 0 G s fc )lhas de ec )lag'éni o fibros G S 0 Ο Γ θ'1· ssei ras f obertas co: rn e spon J / f orai a impi :egn.adas ti om sol uçõe 3 C ie e- ta.no 1 de co Hl 02 0 COH2G 6 β Ap O S cl S 0 C G Cf 0 ΤΠ y P G I. 3 foi Γι3 8 de PEG reactivc 3 foram C GO azes de se ligar a uma f 'ol ha de colagénio fibrosa grosseira. Foram observadas forças de ruptura de cerca de 300 mm Hg 4,10'tPa, após 10 min a um pH de

Foram também preparadas folhas adesivas as quais consistiam num suporte de colagénio fibroso grosseiro (prepar ggo como esporn a riu oo.l a pó de i PEG rea c sobre uma seg humedec roa com num our to espaç Gde S 1.1/ 3. à segun ruptura . I vsram 6f66,10 Pa ’ íscrito no Exemplo 3), ao qual foi ligado uma esponja de colagénio. A camada de esponja foi impregnada com o

egunda folha com tampão de pH tais foi f ias foram c olocadas de c :;orag énio frbro S 6. gross C th, '> ? ^ f roi formada uma fo: cte lr mo 3 0 seg unoos, A li gao; lo da adesiva à segunda folha de colagénio foi medida pelo teste de Foram observados forças de ruptura até 500 mm Hg 44

Materiais e métodos

Foram preparadas folhas grosseiras e fibrosas de colagénio, como descrito algures neste documento. As esponjas de colagénio foram fixas à folha de colagénio por extrusão de uma pasta de colagénio fibriiar reconstituído no topo. A pasta de colagénio reconstituído foi preparada por diluição de colagénio Zyderm II fora de prazo (65 mg/ml de proteína, da Coilagen Aesthetics, Inc, , Paio Alto, Califórnia.) com água para atingir uma dispersão de 20 mg/ml. Aproximadamente 7 caí de folha estavam cobertos por ml de pasta. Uma vez que a pasta de colagénio foi extrudida sobre as folhas de colagénio grosseiras fibrosas, o compósito foi congelado e, em seguida, liofilizado. Após a liofilização, uma esponja de colagénio poroso permaneceu aderente à folha de colagénio. Foi adicionada à esponja seca, gota a gota, uma solução de álcool de COH1.02 e COH2G6. O último foi preparado por adição de 200 mg de COH102 e 200 mg COH20 6, cada um para 1, 8 ml de etanol absoluto (seco sobre crivos moleculares) , A dissolução de ambos os compostos de PEG em etanol foi conseguida por aquecimento suave e agitação (até cerca de 40°C), As duas soluções foram então misturadas. Um mi da solução de etanol foi utilizado para cobrir cerca de 10 centímetros" de folha. As folhas de colagénio-esponja, humedecidas com a solução de PEG em etanol foram, em seguida, secas brevemente numa câmara de vácuo. Quando a massa do solvente desapareceu, as folhas foram transferidos para um liofilizador durante várias horas para remover os residuos do solvente. As folhas secas foram armazenadas a -20°C sob árgon seco.

Para testar a ligação a uma segunda folha de colagénio fibrosa e grosseira, foi realizado um teste de ruptura. A folha de teste de colagénio foi humedecida com tampão PC, a um 45 pH 9,6, e f:i . X cl 1i.3 ϋ Θ .1. U i. cl. ϋθ ci mostra . Foi . aplic ado à folha um tampão adiei r-> -r-, gç j (0,1 a 0,2 i mi) . F ir: seguida foi aplicada a. folha da esp onja ie PEG activc ; (prer rarade ) tal c :omo acima; 1,2 x 1,2 cm), c ·;ο:η o lado da espo nja pa ra i>o LIXO so bre a folha de colagénio de teste 5 (tamanho do defei .Ci * /. i mm) . A. o duas folhas foram manual mente mantida no local durar: te 2-3 segundos para assegurar um bom c :ontacto e hi· drataç. ão da folha C tG PEG activo. Em seguida, P, P duas folhas fora: m de rxadas cL incubar à temperatura ambiente, até que foi aplicada a partir de baixo, pressão da água. A pressão necessária para ruptura do tampão foi registada.

Resultados A Tabela 5 mostra que podem o o t. e r.— s e f o r.1 c a. s : de Irgação iro elevadas, a . um. pH o.e 9,6, s e comparadas com as folhas de

controlo sem ingredientes activos. Foram observadas forças de ligação elevadas mesmo em curtos espaços de tempo. A estab 11 rd a de 3 rongo prar :o da. ligação rol examinada qu a 1 i ta ti vamente: um par d.e folhas ligadas for removido do cLp ΒΓΘ lho c í.e tes ti s de ruptura e colocado em 1 0 0 mi de água a 33 °C. 'Λ 11 g t ação estava ainda . Intacta e apar enternente forte, mesmo 30 hor; as ma. rs tarde.

Tabela 5

Forças de Ruptura de folhas de PEG Activo justapostas a. Folhas de Colagénio Fibrosas e Grosseiras

Material Tempo de incuba.ção Força de Ruptura {mm. Hg) (min)

Folha 0,5 5 (6,66.102Pa) (Controlo) 46 'orças de Ruptura de folhas de PEG Activo ju 'olagé nio Fibrosac ; e Grosseiras íateri al Tempo de íncubaçãc (min) ; Força de :olha r 0,5 17 (2,27 ;apostas a Folha .uptura (mm Hg) ΟΘ esporn a (controlo) P E G a c t i v o 4- 0,5 Folha f 360,391 (4, 8.104Pa, 5,21 104Pa) nja PE tí Aí; t í v o + Folha + 276,231(3,68.104 Pa, 3, 08.104Pa A Tabela 6 mostra o efe 11 o da dim. inaição do : oh do tampão de hu .dratação, A força da li q ç ti o era. t dependente c lo pH, e f o i obser varia uma força de liga r'' O mu. r t o mais traça a. um pH de 7 a i y ^ ° No entanto, forças de liga içâo co m pus infe: riores foram me lho radas permitindo rnaís teu ;po (3 a 10 mi nutos) para formação de ligação, que pode ser aceitável para determinadas aplícacoes. 0 modo de fa( Lha não ror sempre evid-í ;nte. Em al guns casos a foi ha de tes- te tornou- S Θ c ies0lo’j aaa o.o grampo de teste, se m da n r r rcar a 1 rc la-v ti O * rd o t Θ S .Ϊ. :esulfados nã o foram re. latados. S e 0. foi .ha de tes t ^ permaneceu firmemente segura, pau ;eceu que a fa lha for ent; :e folha acti va e folha de teste. Em algun s C13. SOS , a J :olh a activa foi levantada e esguicho ;u água d 01' if 1 cio. N OUf] :os C 0 o O S f 0 p à :1. T. βϋθ .-! 0 q 1 1 0 1 1 0 S í:.10 _Γ. p ΘΠ S Cí ci CS.i.Ui a. de teste, mas a sua fonte não era clara, 47

Tabela 6

Forças de Ruptura das folhas de PEG activas justapostas às folhas de colagénro frbros as e grosseiras Material pH* Tempo de incubação (min) Força de Ruptura (mm Hg) PEG activo + 8, 9 0,5 121 (1,61.104Pa) Folha + 8, 9 1,0 191 (2,55,104Pa} Esponja 8, 9 1, 0 191 (2,55,104Pa) 3,0 298 (3,97.104Pa) 7,5 1,0 2 (2,67,104Pa) 7,5 3,0 50 (6,66.103Pa) 7,5 10,0 279 (3,72 , r04Pa) * PH 3,9 tampão fosfato de sódio roí de 300 mM; tampão de pH 7,5 for de 300 mM fosfato de sódio.

Estudos adicionais em folhas adesiva contendo PEG Ativa:

Sumário

Foram preparadas folhas adesivas a partir COH102/COH206, colagénio Zyderm, e coiaçénio da Kensey-Kiash (Sernen F) . Tais folhas mostraram boas forças de ruptura quando ligadas a folhas de colagénio fibrosos e grosseiras.

Foi desenvolvido um teste de ligação de falha por crsalhamento, Neste teste, a força de ligação de folhas adesivas activas de PEG foram comparáveis ao cianoacrilato (5UPERGLUE). Esta experiência descreve a preparação de folhas adesivas a partir de materiais biocompativeis, incluindo o colagénio de Kensey-Nash de grau implantável. Também são aqui 48 referidos os resultados comparativos de várias formulações para urn teste de falha por cisalharnento.

Foram preparadas folhas activas a partir de folhas de colagénio grosseiras fibrosas, colaçénio reconstituído, e COH102 e COH206, como descrito no Exemplo 4.

As folhas activas proveniente do colagénio de Kensey Nash foram preparadas como se segue: colagénio (4g) foi adicionado a 200 ml de água desionizada ajustada a um pH de 2 com HC1. A agitação com um rotor superior foi mantida durante 6 dias. A.s fibras tornaram-se inchadas e dispersas, criando uma massa quase coerente, A pasta for vertida em recipientes de pesagem quadrados com 9 cm de diâmetro de poliestireno com. (cerca, de 15 ml por recipiente para cobrir o fundo). A pasta vertida foi deixada numa incubadora a 3 3 até 37°C para secar. As folhas formadas sobre a superfície dos recipientes de pesagem. Em alguns casos tan.s folhas foram revestidas com colagénio Zyderm (pasta em água a 20 ml/ml), congeladas, e 1 i of i 11 zada s , Tan.s folhas secas, revestidas com uma camada de semelhante a esponja fina de colagénio Zyderm foram então activadas com uma solução de etanol. de COH102 e COH206 {cada componente com. uma concentração de 10% p/v) . Estas foram referidas como "folhas KN acídicas". Um procedimento alternativo utilizou folhas Semed F secas (secas a partir de pasta acídica), revestidas uma vez com folhas de colagénio Zyderm, e incubadas durante 3 horas em água ajustada para um pH de 9-10. Hidróxido de sódio adicional foi adicionado, conforme necessário, para manter a solução e as folhas a um pH de 9-10, As folhas foram recuperados a partir da solução e secas durante a noite a 37 °C. As folhas foram então re-revestidas com colagénio Zyderm a 12 mg/ml, congeladas, liofilizadas, e, finalmente, impregnadas 49 com PEG acurvo em etano.. f p-' CÍ i t i se obter a s amostras secas, cl C t .1 vas, denominadas "folt ias PCN básicas". Eoi desenvolvido um teste d.e i. 3. J. n c. cie císaihamento para folhas activas utilizando os dispositivos descritos na fig. 6. Folhas de colagénio grosseiras de fibrosas, quer activadas com PEG, ou, como normalmente, preparadas para o teste de ruptara, foram cortadas em tamanhos de 1 x 3 cm (denominadas "tiras’") . Abas de plástico ou fita adesiva foram fixas numa extremidade, cobrindo uma área de ura centímetro quadrado da tira. As abas de plástico foram fixas à tira do pó-de-pele (hrde grindate) com cola de cianoacrilato. For perfurado um orifício de aproximadamente 2 mm de diâmetro na aba ou na fita de plástico. Sobre uma área de 1 cm quadrado de uma folha de colagénio foram colocados em, aproximadamente, 300 ul de tampão P C, pH 9,6. Uma folha de PEG activo/col aqéí lio : foi então colocada no pó-de-F ‘ele (hide grindat. e) humedec ido o o e tampão e mantido com uma iev re pressão duram te 30 segunc l'.u * Des' ta forma, a superfície ligado era de 1 centímetro quadrado. Foram então colocaaos ganchos arraves d.os orificios ria. ext.remu.da.d.e oe ca.d.a tira, e as trras ligadas foram suspensas num suporte adequado. Foram então adicionados anilhais metálicas no gancho inferior (peso médio da anilha l,63g), para aumentar gradual da força de císaihamento na superfície ligada. Foi registado o peso necessário cara afastar jerficíe ligada. Foram estudadas as v ariaçc 3es m a n atureza das superfj mies de ligação 0 f ormu iações de 3 igaç: áo, mel u .i n d o 0 1.1 S 0 de t i r a s de contr oi o conte n d o e spon j a de colagéj :i i o r ra súper oficie, m 3. S 11 â O PEG actrv o e tamb ém a ligação Cl cl íti t h r d. íb de pó de· pele (h ide gr ind ate) c :om c :ia . η o a c riiato. Um cor: ; j unt . ív de ;; mostras envoJ .veu a i igação ae uma tira de pó-d.e -pele ( hlt ie gri ndate) não t ratado ; a uma. t i r ' a a' θ v est ida. com · ssponj a g< 2 colagénio ( não contendo PEG act ivo). Ou tre 50 conjunto de amostras for realizado com os mesmos pares de tiras, mas desta. vez uma mistura de COH102/COH206 foi adicionada às tiras apostas e deixada em gel. A mistura de gelificaçâo foi como se segue: 10 mg de CGH102 acrescido mM, ρΗ 6, 0 μΐ Oe tampão to 0 10 mg de COH2 300mM, pH 8,9 lo μΐ de tampão fosfate

Uma tal mistura gelifica em cerca Ce 15 segundos, o que permite tempo suficiente para adicionar a mistura de gel a uma tira, pressionar a segunda tira no topo, e esperar 30 seg para a gelificaçâo ocorrer.

Para a Irgaçã o das tiras com cianoacrírato, a tira de teste foi primeiro humedecida c om tampão PC (200 μΐ para uma área cie 1 centímetro quadrado}, Em seguida, uma sego :nda t . i ra reves tida. com c.ianoacr i lato foi pressionado no t.opo d. a prime J_ 2. cl » Tal como acontece com as folhas de PEG acti _ v a s f foi usada ape nas uma pressão moderada para manter a aposi .cão duran L- 0 O tempo de ligação de 30 seg,

Folhas KN ácidas e folhas KN básicas foram submetidas a um tes '86 (Ίθ . rupti ura; peço. q u a d r; 3do foram cc uma folha de h ide gr i ndate de teste j á mo .1 h a da PC. Folha O Cl '·_ meias KN exibiram f o r ç u s de ruptura (2 e 4 mm Hg) (2, 67,i0"e 6 ,66.102 Pa) . Folhai exr biram ci ί- m. va lore s semelha ntes a O s resulta, d. com . as fo lhas oe cola. génio revestidas (3 24, 286, muito tarxa; (4,32 10\ 3,81.10" e 4,14.104Pa). anrerrores 51

Foi utilizado o método de falha de cisalhamento para comparar a ligação de folhas de colagénio sob várias condições (Tabela 7) . Para as folhas ligadas por COH102/COH2Q6, foram observadas forças de ligação muito fracas. Folhas activas de PEG apresentaram forças de ligação semelhantes às observadas com cianoacrilato. Tabela 7

Falha de cisalhamento de Ligações de Vários Materiais de F o 1 h a s Ma terral. Força de Ruptura da Ligação íg) Folha + F s p o n "i a. (controlo) 55,4, 53,8 (0,54 N, 0,53 N) Folha + COH102 / COH206 14,7, 13,0 (0,14 N, 0,127 N)

Folha. + iCianoacrilato 272 (2,67 N) Folha + PEG a.ctivo >217, >466*(>2,13N, >4,57N*) * Ultimas forças de ligação não determinadas; em ambos os casos a folha de colagénio rasgou, ou a fixação ganchos falhou, não a área ligada. Métodos para a sin tese de alta resistência bio-adesivos 52 copolímero de (PCI,) contendo

Este exemplo descreve a síntese de um polretileno glicol (PEG) e de poli~ca.prolact.ona pendentes grupos N-hidroxi-succinimidilo. 0 PEG di-funcional de peso molecular variável, é escolhido e acoplado a PCL por uma. polimerização de abertura de anel controlada para adicionar PCL de peso molecular fixo e acules 1998, 31, 8691-8705). es eolh id o (He d rick et al, Ma crom Os O T'"! Upí us-OH termi s n o PCL S "L: ccin im i d.i lo (Abuchow S X .1 et al CO 0) . L: Lsina etil éster é adi· 11 near som P E G, Pí 3L de repetic se gmen to de 1 i sina tem um éster n hidr r-> | 1 S 3 ò O para. d. ar urn grupo Ma crom .ol ecule 199 4 4 7 6- Cd. rbox í 1 C "d C onvert ido em giutarj E st β es G uerna O oduziu um aao para aar um polímero e segmentos de lisina. 0 'arboxiio pendente. 0 éster se) , rm seçuiaa, o grup n glutaril-succinimidilo (Abuchowski). cade .i !. a linear com ar upos çoes G θ O" .T.’ 3. d 3. V Θ 1. S (C iu ) y com obute s do polimero pode S Θ Γ grupos solúveis em água (PEG). A aumentada pela adição de longos elementos de PCL, versus elementos de PEG curtos; no entanto, o PEG deve ser suficientemente longo para assegurar a solubilidade em água, uma caceia pendentes, mas linear semelhante com grupos rea.ct.ivos com segmentos de repetição de ΡΜΜΆ (polimetilmetacrilato). 0 PEG di-funcional de peso molecular variável mas seleccionado é activado com 2-bromo-2-metil-propíonrl Br e um segmento controlado de ΡΜΜΆ é cultivado fora 53 de cada extremidade. 0 terminal contém um grupo Br que pode ser convertido, por métodos padrão de qu.imi.ca orgânica, num grupo-OH e ainda derivatizado para glutaril-NHS, feito reagrr com éster de etilo lisina, como no Esquema 1, e, finalmente, o pendente carboxilo etil éster é hidrolisado para carboxilato livre de etilo e derivatizado para NHS glu.ta.rir, de novo para dar um copolimero análogo com diferentes propriedades físicas (eg, PMMA é conhecido por ter elevada força de tracção) . A suficiente funcionalidade PEG pod.e ser fornecida pa.ra a solubilidade em água. Pode ser necessário construir unidades de repetição PEG-PCL-PMMA-1ys, de modo a que o PCL irá fornecer as necessárias ligações biodegradáveis. A construção de tais segmentos tem sido descrita por Hedrick.

Outra abordagem para polímeros reforçados é descrita por Liu, et al., Macroiri.oiecu.ies, 29:5508 (1996). Pode-se sintetizar um bloco de PMMA, que também contém monómeros tais como metacrilato de 2-cinnamoíletí 1 (CEM) . A estrutura que se segue é ilustrativa: Um polimetacrilato dibloco é sintetizado o qual contém um bloco solúvel em água, tal como hidroxietilmetacrilato (HEMA) além de alguns monómeros que contêm carboxi e amino, tais como amino-etil metacrilato (AEM) e mono-2-(acriloxi) etilsuccinate (ARS), mais um bloco insolúvel em água, tal como poli-MMA-co-CEM, Quando este polímero está dentro água ou num meio polar, o bloco de MMA- CEM vai evitar a água e as soc iar-se em domínios separados. Conforme descri, to por Lie, et al é possível alterar a proporção de blocos solúveis em água e insolúveis em água, no polímero, para se obter estruturas de domínio diferentes. Os domínios as s o c í a o. os, que evitam a água pode tomar configurações micel. ares (em forma de esfera), em forma de haste, ou de placa., uma. ve z, que inclui mais e mais do broco insolúvel em água, na cadeia de polímero. Quando são 54 encont rada L S ci s con dr çoes corr β C G as pa ra gerar CEM en 3 τ n rma. de h 3. S' te, retic ula m-se 0 S S Θ tí O compri ment :o d .e onc id e intens: rdac Í0 cLp. ropriados hastes S cl( 0 f. rxsida 3 r O Q J_ Q\ co de p olimero pol i-H .ΕΜ.Ά- ASM . APS i neste cas O f rode: la a has obter Π cl 3 tes em a.i o caia nan ométri ca possuir reacti vos . EÍj G oera- G Θ gue as d ime nsões de tais

Em seguida, as ao grupos amino 3 G nm de diâmetro e centenas a milhares de nanómetros de comprimento. Tais hastes devem também funcionar para reforçaras redes de gel de polímero, tal como colagénio meti lado é pensado para reforçar a rede PEG descrito em outro lugar no presente pedido.

Hedrick descreve como fabricar segmentos PEG-PCL-PMMA de tamanho controlado, mas sem grupos reactivos, e não cadeias

lineares com múltiplos grupos reactivos pendentes, Na.than descre V 0 como acoplar PEG € ϊ 1 isina para dar um po. límero de repeti ca o com CcLíjU-i ί 3. S P ende nte s re. ac rtivas (ma s ; sem iiçaçc '0 3 é.c 1’ (=> re s degrad laveis e nem a a. d. iça. de PCL 0 PMM E para a. força) • Abuch owski d. 3 um r nétodi -G P3..1. 3 IgZ0. glutari 1 - succin im .idii p: EG. A Pa ;nte WO 39/1 ! 417, e as re T 0) 2C ências ai citada Q ^ / descr eve poli me g r q 3 PE Cv “ ρ O -i .i lactido-ac rii ato a ser em polIme Ύ- h ci r Tr\ g ϋ T i j Z v de 11 m D Τ' O C. 0 3 so '00 PMP radi ca rivres , hi St6h material o não de G C .Γ Θ V Γ0ΐΐΐ a ci i ç a o de IA para a. força, n em men< sionam NP : G peir den- 1” £n c Vw V_· n outros gr upo s d .e ligaç cí O covalent e (nâo dirigida I- :·ΟΓ 1 1' 3. Cl 1 - (0 cl í 3 η .ivres) ,

Materiais: 55

Foi preparado Colagénio metilado por uma modificação do procedimento de Miyata et al, Patente Norte .Americana No 4,164,559. Uma. dispersão (3% p/v) de colagénio bovino pepsinizado, reconstituído, em fosfato de sódio 0,02 M, NaCl 0,13 Μ, ρΗ 7,2 (preparado pelo método de McPherson et al.,

Collagen Rei. Res. 5, 119-135, 1985) foi extrudido sobre uma superfície de vidro numa camada fina e secou-se à. temperatura ambiente. HC1 metanólico foi preparado por adição de 104 g de sulfato de sódio anidro e 10,7 ml de HC1 concentrado a Í300 ml de metanol anidro e deixou-se repousar bem. fechado durante 2 dias. O colagénio seco foi cortado em tiras de 1x5 cm e adicionado ao HC1 metanólico (200 ml HCr metanólico: 1 g de colagénio seco) num recipiente selado e agitando-se suavemente a. 20 °C durante 3 dias, O HC1. metanólico for cuidadosamente decantado e o colagénio foi filtrado num funil de vidro silicatado para remover vestigios de metanol. Foi terminada a remoção completa do metanol sob vácuo durante a noite, O colagénio metilado foi re-solubilízado em água destilada, e o ρΗ foi ajustado para 4 a 6. A quantrda.de de água foi calculada para atingir uma concentração final de proteína de cerca de 31 mg/ml. As amostras de colagénio metilado solubilizado, em concentrações de proteína mais baixas foram re-concentradas por lioíilrzação breve para remover a água. O colagénio metilado solubilizado era um material completamente transparente, isento de fibras ou opalescência, possuindo uma consistência viscosa, tipo gel. As preparações que ainda continham componentes de turvação ou insolúveis (devido à metilação incompleta do colagénio), pouco realizaram. em formulações acle sivas, produzindo géis que incharam murto e apresentaram fraca força de ligação. 56 fo. Adesivos sem enchimento

Para 0,5 ml de ade, sivo, 50 mg de pó seco ·. de COH102 (te- C X' 3. gliitari l-succ: mimidi lo Dolíetileno crlicol de 4 í) u. 3 Ç ϋ S f 10K Fig. 9a) e 5 0 mg de pó seco de COH206 (tetra- -tiol polieti i. 0 Π glicol cie 4 braços, 10K; fig. 9b) foram misturados com 400 mg de colagénio me ti lado em 31 mg de proteina/ml, pH 4, Ambos os componente s PEG di ssolvert irn na sola . v cí 0 aquosa de colagé: nio, obtendo-se um f i.urdo tra nsparente, V i s coso. & solução foi espalhada sobre o local do tecido com uma espátula; f luiu muito pouco sob a força da gravidade. Para curar o adesivo, 20-50 μ.Ι de u; :n tampão (quer 134 mM Γ. ϋ S .t. cl X. O de s de sódio 166 mM, pH 8,9; ou tampão PC, pH 9, 6) foi adicionado à superfície. 0 tampão não diiuiu —1 0) fri o ma s foi lentamente embebido em 3 -5 min, e a su: perfíci; a do gel 2—Lc ou visivelmente endurecida, 1 Ara os estudos d. a for f'' Pi de 1: Lgação sob condi ç õ e s h drat ~ cldcl S f o gei e o s ubs trato fc srarn <: Lxada curar durant. e 2 0 mi n s c ^bre a . bancada e, em sequ. ida imer Cu vd s em fosfat o cie s ódro 50 :nM , c .1 o reto de sódi j. 3 0 ri iM, pH í >~7 . -V r-j O ; f i f d. ó ! Ks durant ::e 2 h π ras ou ma lis, G teste da. forç ' 3 ae 11 ga cão foi rea. iízado num ap are) lho de tracção. c. Adesivo coh enchimento O Vicryi é urn copolímero de ácid.o glicólico e ácido láctico (90:10) vendido como uma. rede implantável pela. Ethicon Corporation (Poiyglactin 910; Sommerville, New Jersey).

Foram adicionado, ao colagénio metilado, 19 mg de fios de Vicryi com 1-2 cm de comprimento, que tinham sido d.esfiados da rede de Vicryi implantável, Em alguns casos, foram também usadas fibras de Vicryi tão curtas como 0, 3 cm. Os fios e o gel viscoso foram misturados e, em seguida, foram adicionados 57 os componentes PEG, como descrito acima * A aplicação no local

U3.S

Outros enchimento adicionadas a 0,5 ml QP C i-d-V S colagénio fibroso (colag :éni Corporation) 8 mg; Der lon S (su "4-0’·), 10 partes de 1 cm de amo acima r e f e r .1 do , ϊ c t i v a s gu a ntrd .ades rã de vidro Q mg; / da. Ken sey- Nash i g Ircólido 1 a.ct ido, fU .bras de elas tina (ligamento cervical bovina, 0,25 a 10 mm, Eiastin Products Co,, Inc, Owensville, MO) , 40 mg; fibras de aço inoxidável pol 2. V ± nil ico) ; micro-partícul as de pre par a das a partir de 6 5 :. 35, 4 0-75, 0i 0 0 peso mol, Δ Ί ,-í r AP..:. ip i. rich η rm ]. a s 2- 4 de d iâmetro preparad .as v. | p Hor n s ic Λ/' ' J / P . J , Biotechnol. Pro QT 0 15, (Bekaert Fibre Technologies, Marretta, GA), 14-28 mg (As fibras foram lavadas com água ou com HC1 IN para remover um revestimento álcool polilactido/glicólido, polilactido/glicolido (65:35,

Chemical Co, , rnicro-pa método de Zheng, J„, 763-767 (1999), 25 mg. Ί'ϊ'Λ ΛλΙ a ί*τΛ/ί *í λ 'ΐ Ί OVIlíaO ΆΛ y tf*NUT| 4* yA ffl Α’ΛΤΙ'Ϊ' A O ΰ Jv V Ve* A A Jr y Vw -Am OtVi4vVi« ΰ ΰ ί, riv (i. m Jr UW Xt ϋ (i. 4r V/ 4σΑ vj fcí X X X *G. ti ada s várias mol écuias de ^nico (rooster comb (cr 3 Γ. v Louis, 1M iissouri) , ácido hialurónico Chemical Co polrlisrna (Sigma). Para o ácido de cadeia longa, tais como (cr is ta de guio) , Sigma

Sigma), e hialurónico, a fórmula foi : s. cicio COH102, 50 mg, COH206, 50 mg, Vicryl, 14 mg, e 400 pL de hra luró: nico, 23 (p/v) em ágr ia, pH ustado j; .·' a jí a Λ P? ;l '£ 3. O qui p n o, a. me sn 10 fórmula, co R\ 4 ( 3 0 μ.Γ, < 3 p '1 % 4 g p qu i h O S a. no (p / v) em á gua, pH. A - -5. Para poli] . i s i: "a f CO Hl 02, 40 rnç, COH.2 0 o, .3 0 mg, iis solveu-s íTi em conjunto em ; 5 0 pL de água, ‘ br omm dra‘ t o de I-i Q & il r s ina, 330 K, 40 mg dissolvid 0 S em 60 ui d* s ág- ucl ) cL Δ duas sol uç 00 s foram m. isturadas em un L- O f e 7 mg il0 t '! }'_) rif as de V i. O ry 1 foram aarcionadas. Λ 7 ,rá 1. ém. c l.isso, part 1 cu . .1. a s cte pol 11 ac t í de o / g 1 i. c blido, prepai ' ada ; s como a c i ma f foram t Θ s tadas 58 como um substita fo para o colagén: f. o me 1. .1.1 ado; 16, 5 mg ci particulas foram suspensos em 300 μΐ de água e mistui ' 3. dei 3 com 50 mg de COHI02, 50 mg de COH206, e 14 mg de Vicryl. m os cíéis foram curadc. ;s com um tampão de sobrepo siçâo de pH 9 f 'O f como descrito acima. e. Adesivo sem enchimento e sem colagénio metilado COH102 foi c iissoivnlo em água a 20% (p/v); COH206 foi dissolvido em 20% em tampão de pH 6,9. /' duas so iuções forami raproarnenre mista iraoas e extrudidas no local. Gelrficacão ocorreu em -40 seg,

Ensaios mecânicos: A força de ligação das formulações adesivas foram aplicados a três tipos de tecidos ou substitutos de tecidos ilustrados na fig. 10. Membranas de colagénio (Fig, 10a; parede intestinal; The SausageMaker, Ine., Buffalo, New York) foram lavadas com álcool isopropílico e água, para remover .1 rripure z 3. S G 0 lip.id.os e de sal, e secas, Foi .00 G .1. Z d. d 3. 0 ligação das mc smbranas com i uma sol preposição de 1 - 3 mm e uma largura de 1 cm, por esj; >alhamentc ) do adesivo : sobre a parte superio r das folhas. 0 ε idesivo £ oi deixada a curvar 2 0 min sobre a ί Odi. íUqU a e depois : j Çjopr y c ,G ·; ·; rante 3 0 min a 2 horas o 37 C ant. e s de o a f a. st ar n um aparelho de ensaio In stron modelo 2 02 ( Canton, Massachuse :tts) f usando uma célula de carga de 00N. Li 0 CJ 0 Ç Cl C ; das ar térias caró- tidas de s uínos (10b,

Pelfreeze, Rogers, Arkansas) também foi realizada. numa geometria de ponta a ponta, O corte dos segmentos de artérias carótidas foram confinados (4-6 mm de diâmetro) e espalhados com adesivo; não foram aplicadas suturas de retenção. A 59 incubação e o teste foram os mesmas que os descritos para as membranas de colagénio.

Para a ligação de tiras de couro (10c), pedaços de pele de bezerros sem pelos foram comprados à Spear Products, Inc., Quakertown, Pennsylvania. Os pedaços eram quase uniformes em espessura, 2-3 mm, Foram cortadas tiras de 0,4 cm de largura a partir das porções de pele de animal, usando um bisturi. As tiras cortadas foram confinadas ponta a ponta e ligadas por espalhamento de 0,25 ml de "CT0G3" adesivo ou de algumas gotas de cianoacrilato. A incubação e o teste foram os mesmos que os descritos para as membranas de colagénio, A Tabela 8 abaixo mostra que o COH102/COH206/colagénio metilado, quando cheio de lã de vidro (Fórmula c), foi superior na força de ligação para Fórmulas não preenchidos a e b, quando testado em membranas de colagénio. De facto, a força de ligação era comparável à obtida com um ac lesivo de cianoac rilato comerciai (Tabe la 9' o c Ί. a η o a c x i ± a a o ca i grau médico (De rrnabond ) formou iigaçc íCS ainda mais fortes com membro mas de col agénio (força 5,2 ± 1, a r J para 7 determinações),

Desempenho enchimento Fó rim ] ] a de ligação com e sem fibroso colagénio metilado Força de ligação (Força N) e um n COHl02/2 0 6 (20%) 1,6 i 1,1 3 COHl02/206/ c o .1. a cj Θ ΊΊ A. o ma tj. .i. λ. a cl o 1,7 ± 1,0 4 COHl02/2 0 6/ colagénio metrlado/iã l0 >2,8 ± 0, 6 * 6 v A π r o 60

Desempenho cie ligação com e sem colagénio meti lado e um enchimento fibroso Fórmula Força, de ligação n (Força N) * A membrana de colagénio rasgou, mas a ligação vedante estava ainda intacta

Tabela 9

Força de ligação de cranoacrrlato (Krazy Gire, Elmer's Products) em três diferentes substratos de tecido

Substrato Força de ligação (Força N)

Tiras de couro 10,9, 16,2

Artéria carótida de porcino 2,0, 3,8

Membrana de colagénio 3,0 ± 1,0 (n = 5) A Tabela 10 abaixo apresenta os dados sobre a adição de um enchimento diferente, fios de Vicryl, ao COH102/206/colagénio metilado. Com substratos tais como couro ou artéria carótida, o substrato não se rasgou, e os valores da força de ligação foram representativos da força da própria ligação adesiva. Tipicamente, estas ligações falharam adesivamente, isto é, a permaneceu de ligação novamente ligação do resistência à tracção do próprio gel adesivo intacta e não foi o factor limitativo. As forças observadas na solução salina a 37 °C foram comparáveis às observadas com cianoacrilato para a mesmo conjunto de substratos de tecidos (Tabela 9), 61

Força de ligação de COH102/206/coiagénio metilado com fios de Vicryl como um enchimento em três substratos diferentes de tecidos.

Tempo de Incubação Força de lígaçã o * Substrato (Hrs.) (Forç a N) 6,6, 5, 6 Couro 17 6,3, 5,5 Couro O éL 4.3,2 .2, Suino 30 CG 5, I Artéria caro tida O éL >5, 9, 3, 9 Membrana de colagénio k tiras de couro, 0,5 cm de largura, artéria caróti da sulna, 0,3 - 0,5 cm de diâmetro, membrana de colagénio : parede intestinal, 0,2 mm de espessura, 1 cm dc a largura.

Efeito dos Diferentes Enchimentos A tabela 11 apresenta os resultados de vários materiais de enchimentos enchimento, 0 teste for realizado em tiras de couro, imersas durante 2 horas em soro fisiológico a 37°C. Depreende-se que os materiais filamentosos foram mais eficazes do que as partículas esfercidais. A ligação do enchimento ao gel é muito importante para a melhoria da. força. Os filamentos de colagénio-polietileno-glicol eram cerosos e não aderiam ao gel; assim, apesar das suas elevadas proporções relativas ao aspecto, não foram enchimentos eficazes. 62 treito c CQH1G2/2 G Material

Tabela 11 diferentes enchimentos olagénio metilado 'orça de ligação de

Força de ligação (Forca Nt

Vicryl i/M 7,4 vicryl, lavado com etanoi 7/2, 7,8 vicryl, tratado com etanoi, em seguida, lavou- 8,3, 9,1 se com peróxido de hidrogénio a 30% -2 cm de

Suturas de seda cirúrgicas comprimento, diâmetro 30-50u

Suturas cirúr gica· s de seda desfiad .as a partrr Γ. f i o s de s ·; a da ma is ; frnos, 1 avada; a com cl ororo rmio C o .i.aqe π io f rbroí 5 0 (Semed F, Kens] /-Nash) i . 3 JUStdd o par 3. ti m ph ί 4; u, 5 a mm de comprím ento, ... ΓΛ Ç'\ u de diâmetro Particu las de gelatina. , reticuladas pelo calor, r\ -10 0 μ de diâ! metr c ; poli .gonal Particu las d€ a hi drosi apatrte 0,5 a 1 mm de ί diam. ρ oligon, ai Fiiamen t o de Conj i agado ΟΛ‘3 C ϋ 13. Ç a113 O -polií s t-jL j_ a η o \J * gl i c o .1 conjug a.d.o - 5 0 μ de drâmetr o , 1 c^ttcia comprimento Fibras de aço ino X Í dá V el 8 μ de di; âmetrc , 4 mm 4, »-· f . o. de comprimento

Fibras de elastina 0,25 a. 10 mm de comprimento 1, 1,1

Partículas de poliiactideo/ácido glicolideo, 2-4 u de diâmetro 63 A Tabela 12 mostra que nenhum dos materiais testados deu forças de ligação comparáveis à da fórmula contendo colagénio metilado

Substituição de colagénio metilado por outras moléculas

Material Força de Ligação (Força N) cX ϋ "J. d. o Ir i.alurón ico 12, 1,3 Qui tosai 'Ί O f ' pol ilis: ina a. f l; Par ticir Las polilactídeo/glicólido, 2-4 μ 0,6, 1,1 .ri f_. d. O 0 la. 13 abadxo i no st r; a que, quando o gel foi f ourado a partir de outros tipos de reacções de 1: igação cru I Z d. Q3 t 3. adesão e a força de liga· Ç cl O f oram afectadas quando tes fadas em couros, apó s incubação a . Material 1 fo i formado a partir de cOHzUb e peróxido de nidrogemo, c pae oxida grupos sulfid.rilo adjacentes para uma ligação de dissulfureto. Um gel forma-se rapidamente, e o gel pode ser suplementado com colagénio metilado e Vicryl; no entanto, aipos várias horas em muito fraco; as fora. 0 material partir de COH2Q6 tampão de solução salina, o gel torna-se fibras de Vicryl são facilmente puxadas para 2 utilizou a reacção de grupos sulfidrilo a 64 com a .1 rgaçâo dupla de uma vínll-sulfona de ti iv aços derivado oe PEG (1GK Shearw ate r Polymers; Erg. 11 ) . A p.I resumivel reac V cl 0 f uma adição de tipo Míchaei, formou uma Irga ção tio- éter r;i ars géis tini iam força de tracção ade ;quac ia, m. as fraca adesão ao couro após a incubação em solução salina. Os materiais 3 e 4 continham COH204 (aminoáoidos PEG tetra-funcionais de 4 braços, 1GK, Shearwater Polymers); a funcionalidade amino reagiu presumivelmente com o éster de suocinimidilo do COH102 para formar uma ligação arnida (Fig. 12). Estes géis foram, comparáveis em desempenho aos formados a partir COH102 e COH2G6. (Para uma. reacção adequa.d.a na presença de colagénio metilado, o COH204 teve de ser titulado para pH 2-4 durante a mistura dos reagentes; por adição do tampão de cura, o seu pH for aumentado, permitindo que a reacção do grupo amino). Pareceu que a presença de éster de suocinimidilo era importante para conseguir a mais elevada aderência ao substrato de tecido e para boa resistência à tracção do gel. Também se prevê que outros grupos que reagem com. arnicas, tais como aldeídos (aldeídos conjugados com. PEG multi-braços) , sejam eficazes reagentes formadores de adesrvos.

Tabela 13

For '-•as de Ligação dos vários PEGs funcionalizados Preenchidos

Material Tempo de Forc;a de Incubação Ligação (Hrs.) ( Ϊ1 0ul o 3. In } COH206/Colag énio Metilado/Vicryl/ 17 'J y .2' 2 y U ( /- iJ h202 C0H2 0 6/Yinil de 4 braços/ 2 o 9 i c A. * Z F u. * fona P E G / c o f a o e n i o 65

Forças de Ligação dos vários PEGs funciona] .1zados "P (- [-'j com Fios de Vicryl Material fempo de Έ 'orça Incubação jigação (H r s . ) ( Força N} metilado/fios de Vicryl COH102/206/204/Coiaaénio meti J. S G 0 li 6,4 /Fios de Vicryl COH102/204/Colagénio metilado 4 3,6, 6.4 /fios de Vicrv1 COHi02/206 / 6,6,5.6

Colagénio desnaturado / Fr os de VicrvI rmados i 3. partir de .igações utilrzando usas eir l tampão de .gorosas hidratadas enfraau ecimento da taesiví A Tabela 14 mostra que COHi 0 2, C OH2 0 6, e ta mbém COH2 i cour o que pe rsistem 30 r lc >ngos solo ção s ad. i: na a 3 r-7 O / C. Ta is c simu lam o amf ciente i r-1 vivo o Foi forç a gg lig ação de PO Í 8 GG mar Pens O U " P P O G Ç" : o enfr ' 3. Q uecimç ínto 'ter de gl utari 1-s- mesmo terminal car): >oxi lo do ést er de aaver um éster de carboxilo que se :3. C3 3.06 Í 3 d.G PEG principa1; essa t io-éster ç poc l.e h rdrolisar, de 100 horas de hidratação, força de ligação era devido à hidrólise de ligações de rede de carboxilo- e tio-éster (Fig, 13) . O COH.102 é um éí após a reacção com o suecinimidiio, continua a liga a porção glutarrl 66

Tabela 14 Desempenho de ligação sob tempos de hidratação i( :;ngos Material Tempo de Incubação Força de ligação (Força (h) N) C0H102/2 0 6/2 0d / 2 a w ; 4 Colagénio b 6 /Ç *G / A -*· r me tilado/ 7 0 3, 0 Fios de Vicryl 1 3 7 Ch 7 0 , 2 1 4 0 1 . 1, 0.4 COH102/204/ 4 b o G ; b c 4 Colagénio Metrlado b 4 7 • / 5 / Fios de Vicryl 136 3 f 3, 2/ 234 ' ; — r COH102/206/ b a w ; 5.6 Colagénio 1 Ί 6, • P ; 7 / Metrlado/ Fios de Vicryl 6 9 0 . b .3 , 0 . J ; 4, 93 2, 4, 14 0 3 . 2, 2.9 235 >7 ; i , 3 67 reactivos 7\ r~\ Ta: bela J. '3 *3.p; resent a. a. s forças de 11 ga ção em tiras de couro de der i v ci d O õ de PEG de men or peso mo lecu .lar c orno a cie sivo , Q ° r η o v. amante supl eme rd: . 3.0.0 C 0 m c agi mio me tilado e Vrc ryl. r'' \:i.. PYC-2 OHS é um suc acrn i: rnrdi 1-si UCCÍ; aat C', tri -fun cional de um PSG d e 3 braços, cor rstra ído 3. pa.rt i r d .0 Ϊ j.rn r iúcleo de gli cerc ' -Ϊ- t 2600 mol e; m peso, NO: F Co rpo: ratir -/11 ; % clpcÍ o. 0 COH2 0 1 é um PEG c{^ 4 br aços, tetra- -amin; J F z 000 Pes; o P 4 ! * r d~-·· H hearwa ter Po.l ymer S V Os poliria eros que for am preenc :b.i dos π n m Vic ryl par eciam ter um pe· η Cl· r-j e f e 1 τ' ο na. res: Lst. 0Γ, r·' - d.0 1 igaç ã.o, For am i ít r lizad . d S cl G segui ntes pro] ροής rões: C Ol cigé: ui o Metila do, 500 uL (2 2 mg ,/ml em água 2707 -301 'i) ; GLYC :~2 0H: 3 / 4 8 mg ; COH2 0i, fs 3' Í.J..L.Í ( ie solar ; ã o a 60% ei; 1 ei CJ U c. f c l j us t, G G 3. Pi :i .T.' c i Pi i 1-; 0 com H.C1. 6M ; F.i 0 s d e V icryl, 2 6 mg *

Tabela 15

Análogos de Baixo Peso Molecular para COH102 e COH206 Materiais Tempo de Força de Incubação Ligação (Força (Hrs.) N) GLYC-2 OHS /COH.201 /Colagénio 2 ? 3 í\ 3 Δ — ! í w / U j. Metilado GLYC-2 OHS/COH201/Coiaaénlo 3 Z F 3 f 3/ / 3 Metilado/Fios de Vicryl Testes de Ruptura de Discos ilagenro s j em Defeitos de

Incisão nas Artérias Carôtldas 68 ut r i .1 zac?. a. o em api ícacoes pela sua ca.pac.i . dac Í0 0 3. .1.' 8 a do 3 dois tipos de testes 0 aesempenno aos adesivos j. cirúrgicas é frequentemente medi vedar fuças de fluido. Foram uti de fuças ou de oressâo de fluido: a.

Utilizando o dispositivo ilustrado na. fig. 15, uma camada de coiag· o to io fo. η montado sobr e uma pl ataforma de Ia .tãc e fr xa cio cc )m um se gt mdc ) a n 0 1 de latã. o enr c sscad' o no pr íme. iro • ~>\ pi at afcrin a i n: r 0 r; ! 44 r .1. a t". a o foi p >er f i: irada. e 1 i < ο Ό cd. d. uma 1 r nh a 0 Í1 Cl· ή a. corr sgu; 3. * j Zli ágt ;a fo: i acci r·· p', çg r-\ a por um ê imbolo o ie s Θ Γ i ng a cl 5 ml / m in . T Ima 1 rnh a de deriv ‘ a Ç Cl O cond a um m edii lor d pr es sao . n cama d a de coiagénio cIp teste tamb ém foi per fur ad cl (o Ύ- '1 t I o i o r ie 2 mm O0 drân set ro) Λ V ,ci prepa: ração aciasiv a ( apr ox * f 5 ml) jT i oi api i. d. ca. d. a 11 a cama d ^ cobri n d o a perfi. j.raç ã.o, o a d C.·. C; ívo fc dei _x. a do d curar s min (ou ma is t .emp 0' f 10 e ΠΘ C 0 ssár i 0, P= ara 0 ]f 0C tiiar a cui :a para un ia bo rracha durd ZX} f 0 m 8Θ gu ida., fc )1 í apl i .. C Ά O m pres são ds i ági .-! a v Έ o ; y Cl· ζ· pistada a p T. Θ s sã O Π0 06 S S ci J- .1 B pa ra V omp θ Γ 0 tamp ã.o, .ΐ-* a j- 3. o c i anoacr: i. lat O, 1 1 m pe da ço (4 3 c 4 mm ) d ^ pequi ana ca .mada de c olagé inio foi c 0. 1 O- a à camada inferior perfurada. bHíiftóí f o Ha ^ eS a na 2ly"í~a-rva Pa nAl* i Hís V AnJ^ ÇSS Ar* QS5 Ά> AAi ϋ .A» Λ A Jw v)r^ A A w ifrAAi V». ínS Ar* *A* SpA W> rir .A» VA ϋ 0 modelo d-θ a .8 tél Ϊ a c a. róti' d. a pressur izado é ilust: :Γ a G 0 ri a fig. 16. Uma artéria de porc :ir io (Pel Freeze Biolo gica 1 Q !-b t Roger s, Arkans as) foi 1 igad a a uir ia linha de água e 3.' gua f oi coruiu zída por uma bomba per is tá) I.t. rca. 0 f ira da. l.i .nha t inha um 1 i.rnrt ador de f luxo colo: sado sobr '0 a mesma de modo que ρ o der i arn ser < aplicadas pressões até 10 -J-Λ si, e m ais, so) are a lin h CÍ f atrav és do aum .ento da v eloc idadi da bomba . Primei .ro a ar té r intacta foi colocada no sistema e submetida à. pressão da. água, 69 para assegurar que iria. manter as pressões desejadas, sem fugas. Foram preferidas as secções da artéria desprovidas de ramificações laterais; As ramificações de fuga foram por vezes grampeadas para evitar fugas. incisões de cerca cie 2 mm de comprimento foram cortadas transversalmente na artéria em Q1 atro 1c c a. !. S S O b re uma cl rc: anferê co rtada, em segui· O-Cl. , sim’ alou·· se um ao lrcadas s u ίturas de cont e a c a. c ;. Os ia (Fig. 16) , Na artéria uma anastomose na qual foram sais de corte foram então cola G n •p. COítT pretamente, nuiír ί tente itrv m. pan: a o s V 0 «TÁv F o i apl r f'' , dO um tampão (fo S T. 3. t O ácido c ie í 3ÓdÍO 13 4 m.M 0 carb o n a O d.e s : a d i 0 166 m.M, pH 8, 9) , a o tecido G 3. a.rtér .r a, ρ o a SCO ant es d. a cfp i a Γ' Pi . V-, CA o a O b 3 cola. A m; assa d e cola foi adicionalmente -l V y iga da com af gu .mas gotas deste ΐ tampi âo para cu Ϊ.' 3. X O gei. Af η s um tem h) C j de c mr a 8 ;n i n, a junta colad a foi s ubm β -1. d d. a "p r θ s s et o da águ a v A pressão foi aumentada para incrementos de 1 psi 6,89,10° Pa e mantida a cada pressão durante 1 minuto antes de aumentar ainda mais. A fuga foi classificada como positiva se o gotejamento fosse mais rápido do que 1 gota por 10 segundos. A Tabela 16 mostra as forças de ruptura de COH102/206/Colagénío metilado/Vicryl em orificios de diâmetros variados (em membranas de colagénio com tempos de cura de 8 mm; curadas com tampão de pH 8,9, 0,5 ml de amostra espalhado sobre o orificios com a com. espátula). Um furo com um diâmetro de 5 mm é o maior defeito que se pode prever numa aplicação cirúrgica, uma vez que suturas de contenção seriam usadas para fechar os defeitos maiores, e estimou-se que o maior intervalo entre as tais suturas seria de 5 mm. Mesmo com tais grand.es orificios, o adesivo foi capaz de sustentar pressões próximo ou acima do máximo esperado em pacientes hipertensos, isto é, 4 psi 2,76.104Pa. A entrada de terceiros dados enfatiza a necessidade de ter de um bom gel de cura na interface do gei e no disco de colagénio. A adição do tampão de cura nesta 70

supe r f í. c ief 8 Γ11_'. Θ S Cl d ii.pl icação, me .hora a ligaça. o a. y; p r', p.ra.z Tabela 16 Forç d. G0 Rup tura do coh: 0 2 dOb/co] aqe: m.o medrado/Vdc '-L y · Drâm e í. l o do orif í cio Pr e s s ãO de Ru D tf ra (PSI)* (mm) 2 >b • 0 , 7.4,4.6 ( >2,07 10da, 5,1. 10'k Pa f d 17, 1 Oda} 5 f d 5, 5, 5,3 (2,11.10da, d D Q r ' ° 10' Pa f 3 / 65. i O4Pa) 5 d 0" ( 6,89,10 da} * 1 PSI b 8 N / cm2=== 51 mm Hg /: ρ c I - 2,7 N / CM? === 2 0 Ί rr g Memb rana e n ao pr é-tratf .da com uma cota de tampão pH 8, 9 A I abei d. J_ / aprese nt£ dados S ϋ-ϋ re defeitos de fech ame nt O de grand.es incisões em artérias earótidas (4x2 mm incisões cortadas em. 4-6 mm de diâmetro da artéria.) . A fórmula C0H102/206/coIagénío metiiado/Vicryl era comparável ao cianoacrilato no desempenho. Deve notar-se que os resultados mais pobres são vistos em artérias mais finas que esticam ma.is sob pressão.

Tabela 17

Teste da Força de R uptura em Artérias Cr irótidas de Suinos Ma t e r r a i Pressão de Rupti ra (PSI) Tempo de Cura (m.i.n) COH102/206 / Δ 'd d / Π (2, 96.104± 8 i, o 8 , J. u r a) í n = 0 ) 71

Teste da Força de Ruptura em Artérias Carótidas de Material Pressão de Ruptura (PS1) Suínos Tempo de Cura (min) Colagénio metilado / 8,0 ± 4,0 (5,51.104± 2,75 3 0 Vicryl 104Pa) (n - 3) Cianoacrilato (Elmer's 2,7 1 3, 6 (1 , 8 6.1 0 4 i 8 Products) 2,48.104Pa) (n === 6) Cíanoaorilato 5,5 ± 5,2 (3,78.104± 8 (Dermabond) 3,58.104Pa) (n - 4)

Esta classe de adesivos foi preparada a partir de reagentes líquidos puros (sem adição de tampão aquoso) . A reacção de acoplamento que envolveu a adição de grupos tiol na ligação dupla activada de acrilato é mostrada na fiq. 17. K Tabela 19 abaixo apresenta os dados da força de ligação do par reactivo TPETA (tri-metilol propano etoxilato de tri-acrilato, peso mol. 912, Aldrich Chemical Co. ; fio. 18) e TMPE-SH (tri-met ilol-propa.no etoxilato de tri-tiol, peso mol. 1140 (Fiq. 19), sintetizado a partir de trimetilol propano etoxilato, peso mol, 1100, Aldrich Chemical Co.) para conduzir a reacção, foi necessária uma base para converter o tiol num anião tiolato. Foi utilizado T403, um tri-amino óxido de propileno de 3 braços, 970 mol. em peso (Texaco Chemical Co., Fig. 2c), 0 gel formado era suficientemente forte de tal forma que foi apenas adicionado o Vicryl como fiiler. Não foi adicionado

fu£xcxq£xs.Xí.sss.cIqs com tiol ss êLcril3itQ dís, nXom do enchimentos

72 eolagénio meti lado, (É pouco provável que o colagénio metilado, dissolvido em água, permanecesse em solução com o líquido puro TPETA e TMPE). A formulação era como se segue:

Tabela 18 TPETA/TMPE - 31-1/14 0 3 / Vicryi

Valores Grupos reativos Mmoles

160 mg TPETA 200 mg TMPE-SH 10 ul T4 03 1-2 cm. de comprimento TMPE-SH e ’] ['4 0 3 í :oram misturados e m c :on j unto, seguidos "P eia a.d.í ç 8.0 0.0 Í.IOS '00 Vi cryl, e finalment .0 O PETA foi adiei O j. j. ado e mi sturado com O c ; utros componentes, . mi. stura foi espa Ih cLClci. sobr· e substratc >s de test :e molhadas cc :m : uma espátula. c: omo de sc rito acima. A mi: S l, \X X cl tornou-se vi _ s c O S ;:í em cerca de 3 m in, e era um ge1 : firme em 5 min. Em seguioa, a n ti stur?. 3 de teste foi iu Tiersa em solução salina, co: mo descrito aci ma , após 20 min. C > tempo d( ξ ger era Irvremente controlável pera quantidade de Ti0 3 adicionado, A Tabela 19 mostra que a ligação foi alcançada em todos os três substratos de tecidos, mas a. força de ligação foi menor do que a das formulações de COH102/206. A falha de ligação era sempre adesiva ··· estes géis exibiram elevada resistência à tracção, mas não aderiram bem ao tecido. No entanto, em certas aplicações clínicas, não é necessária uma forte aderência aos tecidos. Esta característica foi partrcularmente evidente na membrana de colagénio. A reacçâo de acoplamento químico, aparentemente, não proporcionou um mecanismo adequado para a 73 ligação covaiente ao tecido, como é o caso com COH102, em que o éster de succinimidilo pode, em princípio, reagir com grupos arino no tecido. Grupos sulfidrilo Irvres nas proteínas de tecido podem reagir com o grupo de acrilato cie ΐ'ΡΕΤΆ, mas esses grupos são relativamente raros em proteínas.

Tabela 19

Tempo d e incubação (Hrs) Força de ligação Substrato* (Força N) o 3.3, 6 . U Couro* 18 3.7,2.9 Couro 1.7,2.0 Suino Ar téria Carótida. 2 0,7,0,5 Colagénio

Força de ligação de TPETA/TMPE-SH/VICRYL/Ti03 em três substratos de tecido.

Membrana *tiras de couro, 0,5 cm de largura, artéria carótida suina, 0,3 - 0,5 cm de diâmetro e membrana de colagénio: invólucro de salsicha, 0,2 mm de espessura, 1 cm de largura. A Tabela 20 mostra que as formulações IPEIA/IMPESH, embora tenham exibido apenas uma modesta de ligação às tiras de couro, durante a imersão longa em solução salina fisiológica a 37 °C, exibem, no entanto, ligações persistentes após a imersão em solução salina. Isto é provavelmente devido à estabilidade relativa da ligação tio-éter, em relação às ligações presentes nos géis de COH102/206. As proporções de material mol. utilizados foram 0.59:0.52:0.031, l5mg para ΤΡΕΤ.Ά: TMPE-SH: T d 0 3: Vicryl, mg/0.39 ml. como um adesivo ligação (Força N)

Desempenho d.e TPE?Ã/TMPE-SH/T4 03/Vicry.l Tempo de Incubação (Hrs) Força de 2 0 ^ ' 3, 6, 0 7 Q d. O o « 7,2.9 b Ò ·-) dl , S, 3,3 2 b 0 ·-) dl , 5, 3,1 /1 C; formulações ade s i v as a gu i descr r t a s c ostumam falhar adesi vam mnte - sua f or ç :a de coesê lo não parece : ser o factor 1. irnzt ant e. Os da.d.os d.iO cl .ixo compar; sm as forças de tracção do própr 7 f' adesivo com outr O S 3. d.8 8 i. V O 8 e hidr •ogéis. Mediç ão das Forças tracção a? >ós 2 horas de imersão em

solução salina a 37 °C 0 í adesivo foi form ado cri í nd.r i.c σ Θ deí xou-se cui nar polr estrr eno, dur ante apro: sim ambr ente. Em segu ida, a amo str 2-21 /O / c. O ~ ° /""< Λ * ri amostra f O f i t a foi 3. Ir .1. X 3 d 3. 3. ca d. a i .ma cian oacri lato. A amostra f ci trac v 8- O Instron, fixo em c; numa forma aproximadamente num recipiente de pesagem de idamente 20 min à temperatura a foi imersa em água para horas removida, da água, enxugada, e a das extremidades com cola. de então montada num testador de tda extremidade pela fita, e 75 estendido na falha. Foi observada, a última resistência à tracção em N/cm% em relação à área da secção transversal da amostra no ponto de ruptura. Em alguns casos curvas tensão- deformação foram calculados usando hL/L0 como a tensão, onde ãL = L-L0f L é o comprimento da amostra no tempo t, e L0 é o comprimento da amostra original. Para preparar uma amostra de controlo constituída apenas por cianoacrilato, o cianoacrilato foi matizado em fígado bovino. Ap;ós cerca de 20 minutos, o cianoacrilato tinha curado para. uma tira. O fígado foi descascado (que é um tecido extremamente frágil), e as partículas de figado residuais foram removidas, For assim obtida uma tira de polímero de cianoacrilato curada, relativamente uniforme e limpa.

Qs dados apresentados na Tabela 21 mostram que os adesivos que contêm um. íntensi ficado r de resistência à. tracção potenciador exibem maior resistência à tracção do que hidrogéis sem tal intensificador. A classe de acrilato-tiol de adesivos (tais como TPT-SH:. Trimetilol propano tris (3-mercaptopropíonato), Fig. 20), contendo Vicryl, tinha resistências à tracção superiores às do cianoacrilato sozinho. Formulações sem. um intensif icador de resistência, à. tracção tinham resistências à tracção de, aproximadamente, 8 a 20 K/cm2. O COH 102/206 (20%) é um hidrogel simples - que tinha uma resistência à tracção muito ma.is baixa do que a formulação correspondente contendo colagénio metilado e Vicryl. As medições foram realizadas após 2 h de imersão em solução salina a 37 °C. 76

Resistência à Tração de Adesivos selecionados

Material Resistência à Tração (N/cirh) . C0H102/206 / Colagénio metilado / V i c r y i 84 1 21 (n = 5) TPETA / TPT-SH / GdMA/Ti 0 3/Vicryl1 310 ± 160 (n = 2) Cianoacrilato (cola Krazy, Elmerfs Products) 200 1 7 (n === 2) COH102/2 0 6 (20%) 7 1 5 (n - 3) Ge1atina-PEG-di-acrilato^ b -1 6 pHEMA3 3 1TPT”SH: trimetilol propano tris (3-mercaptopropionato) (fig. 20), mol. em peso. 400, Aldrich; GdMA: glicexol di- nietacrí lato, Aldrich (Fig. 21). "Nakayaina, Y., e Matsuda, Th, "Photocurable surgical tlssue adhesive glues composed of photoreact ive gelatina and poly(ethyiene glycol diacryiate", J, Riomed. Biomat. Res. (Appl. Biomater.) 48, 511-521 (1399). :,pHEMA: poli hidroximetacrilato; Santin, M., Huang, SJ, lannace, S., Ambrosio, L., NICOLA1S, L., e Peluso, G., "Synthesís and charact.eriza.tion of a new interpenetrated poly (2-hydroxyethylmethacrylate) -gelatin composite polymer'·', Biomaterials 17, 1459-1467,

Copolimeros lineares com grup< >s reativos pendentes. 77 0 objectivo desta experiência foi o de encontrar urn mero para sintetizar polímeros de cadeia linear com grupos reactivos pendentes como mostrado na fig. 1. Um outro objectivo era ser capaz de inserir na cadeia de polímero linear, não apenas os grupos reactivos pendentes, mas também as subun.id.ades monoméricas ou blocos de polímero que poderiam dar tenacidade aos géis formados a partir do polimero. Como tal, esta experiência é uma extensão do Exemplo 6 acima.

Todos os polímeros preparados eram da família dos polí-acnlato/metacrrlato, Seguindo um procedimento delineado em Sun, YM, et al, "Composite poiy(2-bydroxyethyl methacrylate) membranes as rate-controlling barriers for transdermal applications", Biomaterials 18, 527-533, 1997, foram preparados polímeros lineares. Os monómeros incluídos na polunenzação foram HEMA (hid.roxi~etii~meta.cri lato) , ΜΜ.Ά (metacrilato de metilo) , ARS (mono~2 (acriloxi) etíi succinato) , e AEM (2-amino-etil-metacrilato) (Figura 14). A polunenzação para. formar poli-HEMA com cadeias laterais carboxilo e amino foi realizada durante 4 horas a 75 °C, com os seguintes ingredientes: HEMA, 1260 pL; ARS, 240 pL; AEM 34 8mg; azobis-isobutiro-nitrilo, 54 mg ; e etanol seco, 34 ml. A precipitação for realizada com éter de petróleo seco, A polimerização foi iniciada com azobis-isobutiro-nitrilo em etanol seco, com agitação vigorosa. AEM, que é pouco solúvel em etanol, foi primeiro dissolvido em água (50% p/v) , a solução ajustada para um pH de 2-4 com HC1, e adicionado à solução dos outros constituintes em etanol. A reacção completa foi purgada com azoto e conduzida numa garrafa com tampa de rosca num banho de água. Os inibidores de radicais livres em HEMA e MMA foram, removidos pela passagem destes reagentes através de uma coluna de óxido de alumínio 90 (Activo neutro, actividade 1, 70-230 mesh, EM Science, Gibbstown, New Jersey) 78 mesmo antes da adição à mistura, de reacção. Após 4 horas a. 70-80 °C, a solução foi arrefecida, filtrada, para remover ΆΕΜ as partículas, e o polímero foi precipitado -nsolúvel e outr por adíçac ) de 10 ml d( 3 éter de petróleo. Q polimer sobre a s uoerfíc.ie do copo de vidro, e a. S 0 ]. 1 ação gasto foi decantada, 0 polimer o foi seco S o b vác o ''j. j—l o s d r i s > A Tabela 22 mostra que os polímeros aparentemente foram obtidos, e para as duas primeiras amostras na tabela, os géis foram rapidamente formados com COH102, sugerindo a presença de porções AEM na cadeia de polímero. No caso das preparações anteriores de polímero, a quantidade relativa de funcionalidade amino e carboxilo no polímero foi estimada a partir de uma curva de titulação. Aproximadamente 1 subunidade

íEM subun idades A.kS estavam presentes para cada 2 0 unidades de HEMA ao longo da cadeia. Ver figura 23.

Nenhum dos géis de polímero que se formaram foram ma: n tes do aue hidroqéis i 0 .T.Tílci d ϋ S Cri F artir c le CGH102 e soei: aho. Co-poiímeros ea . evados em MI 4A eram ga aedosos e narair 1 — c; rapidamente. Mi ΊΑ foi ora -gi .nalmenfi escolhido pMMA em sí é um polímero resí s tentf insolúv el em água.

Por conseguinte, estas classes de cadeias de polímero com grupos reactivos pendentes são aparentemente não adequadas para utilização na presente invenção. Modificações adicionais da proporção desses monómeros de acrilato/metacrilato ou introdução de outros monómeros da. família do acriiato, podem resultar num polímero com as propriedades desejadas, e tais estudos de optimização podem facilmente ser realizados utilizando os ensinamentos aqui aoresentados. 79

Tabela 22

Propriedades de polímeros sintetizados poli acrilato/metacrilato

Razão

HEMA:MMA

Geiifícação {+ ca -)1

Solúvel (Sim ou Não)

Peso Moi. (Daitons) 100 : 0

Sim 8 8 0 80:20 Não 1300 50:50 Não 4500 1. Aproximadamente 50% (p/v) de soluções ou dispersões de polímero em tampão pH 9, 6 (descrito acima) foram misturadas com uma solução a 50% (p/v) de COH 102 em água. A formação de um gel em segundos a horas for pontuada como " + ". 2. Peso molecular relativo a padrões PMMA, H.PLC em gel PL em tandem, colunas de crivo molecular, em solvente de drmetrl formamida a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min.

Lisboa, 22 de Maio de 2012 80

Claims (6)

1 o Um dispositivo de polímero biocompativel para utilização no tratamento de tecidos compreendendo uma esponja de colagénio ου uma folha impregnada com um. pó de polietilenoglicol reactivo de dois componentes, caracterizado por o referido pó reactivo compreender ainda um primeiro polietilenoglicol possuindo múltiplos grupos nucleofilicos e um segundo polietilenoglicol possuindo múltiplos grupos electrofílicos, e por o pó de polietilenoglicol permanecer não reactivo até contactar com um tampão de pH elevado.

2. Um dispositivo de polímero biocompativel, de acordo com a reivindicação N°,l, caracterizado por o primeiro polietilenoglicol possuir 4 ou mais grupos nucleofilicos e o segundo polietilenoglicol possuir 4 ou mais grupos electrofí1icos.

3. Um dispositivo de polímero biocompativel, de acordo com a reivindicação N°. 1, caracterizado por o referido primeiro polietilenoglicol ser um polietileno tiol glicol tetra funcional (MW 10.000) com a seguinte fórmula HSCH2CH20(CH2CH20)n h£c (OCH2CH2)nOCH2CH2SH CH2 h2c ch2 / \ HSCH2CH20(CH2CH20)n (OCH2CH2)nOCH2CH2SH e o referido segu; dl d.

O pol.ietiienoalícol ser um po] .. i e t i Lenoglicol g-· Lu ta. ri l-suc< cinirnidilo tetra-funcional (MW 10 . 000) com a segu ir ite fó rmula 1 ,Ν-OC(CH2)3CO(CH3CH2qP h2c ° « (OCH2CH2)nOC(CH2)3CO- ch2 c ^ \h2 (OCH2CH2)„OC(CH2)3CO-N II II o o ò' N-OC(CH2)3CO(CH3CH2C% ^ . Um dispositivo de polímero biocompatível, de acordo com a rei vindicação um intensific por um mate: (•Ί r-1 srste em p 0 A. ilactídeo, :onst rtuido grup O C, LJ.0 :ibra .s de ordo com a ader ainda i O grupo ordo com a O 0 mposto ° . 1, caracterizado por compreender ainda or de resistência à tracção il seleccionado de entre o :.e em fibra.s de poligi icói ido, fibras de itídeo, iâ de vidro, e plástico.

5. Um dispositivo de polímero biocompatível, de aeoj reivindicação N°.l, caracterizado por compreender ainda um composto adicional seleccionado de entre consrstindo em giicosaminoglrcanos e proteínas

6. Um dispositivo de polímero biocompatível, de acordo com a rervind.í ca.ção N°,5, caracterizado por adicional ser uma. proteína seleccionada de entre o grupo consistindo em colagénio, fibronectina, gelatrna, albumina, ou fragmentos peptídreos dos mesmos. Jm disposi' tivo de polímero bioco mpatíve i. / C10 acordo com quaIquer uma das reivindice ições M° , 1 a. K°,6, caracterrz ado por ser utrlizad o como um vedante de tecidos, n o aumento dos tecidos, na repa raçaio de tecidos, como um a Lgente hemos tático, pan :? 3 S 0 na. ρ: cevenção de 3 G 0.0 θ Π C .1 3 S de tecidos ou para a r ibertí ação d. e fármacos, cérulas ou genes„ Lisboa, 22 de Maio de 20Í2 2