PL203124B1

PL203124B1 - Pochodne glukopiranozyloksypirazolu, kompozycja farmaceutyczna je zawierająca i związki pośrednie

Info

Publication number: PL203124B1
Application number: PL364800A
Authority: PL
Inventors: Hideki Fujikura; Toshihiro Nishimura; Kenji Katsuno; Masahiro Hiratochi; Akira Iyobe; Minoru Fujioka; Masayuki Isaji
Original assignee: Kissei Pharmaceutical
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2009-08-31
Also published as: WO2001016147A1; BR0013667A; EP1213296B1; SK2872002A3; IL148384A0; EP1213296A1; CZ2002665A3; NZ517439A; NO20020968L; ATE264337T1; CN1145635C; AU6727500A; AU782330B2; TW579378B; CZ303372B6; KR20020033781A; KR100591585B1; IL148384A; CN1377363A; DE60009929T2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pochodne glukopiranozyloksypirazolu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które są użyteczne jako leki, kompozycja farmaceutyczna je zawierająca i związki pośrednie.

Cukrzyca jest jedną z chorób związanych ze stylem życia, a jej tło stanowią zmiany nawyków żywieniowych i brak ćwiczeń fizycznych. Tym samym, u pacjentów chorych na cukrzycę jako terapię wprowadza się dietę i ćwiczenia. Ponadto, w sytuacji, gdy dostateczna ich kontrola i ciągłe podawanie są trudne, wprowadza się podawanie leku. Obecnie, jako środki przeciwcukrzycowe stosuje się biguanidy, sulfonylomoczniki i substancje wzmacniające wrażliwość na insulinę. Jednakże, biguanidy i sulfonylomoczniki mają czasem skutki uboczne, takie jak, odpowiednio, kwasica mlekowa i hipoglikemia. W przypadku stosowania substancji wzmacniających wrażliwość na insulinę, zaobserwowano czasami skutki uboczne, takie jak obrzęk, dotyczy to również postępującej otyłości. Tak więc, w celu rozwiązania tych problemów, opracowano środki przeciwcukrzycowe o nowym mechanizmie działania.

Ostatnio, zaobserwowano rozwój nowego rodzaju środków przeciwcukrzycowych, które stymulowały wydalanie glukozy z moczem i obniżały poziom glukozy we krwi, chroniąc nerki przed reabsorpcją nadmiaru glukozy (J. Klin. Invest., Vo. 79, str. 1510-1515 (1987)). Ponadto stwierdzono, że SGLT2 (pompa sodowo/glukozowa 2) występuje w segmencie S1 proksymalnej cewki nerkowej i uczestniczy głównie w reabsorpcji glukozy filtrowanej przez kłębuszek nerkowy (J. Clin. Invest., Vol. 93, str. 397-404 (1994)). Zgodnie z tym, hamowanie aktywności ludzkiej SGLT2 zapobiega reabsorpcji nadmiaru glukozy w nerkach, a w konsekwencji stymuluje wydalanie nadmiaru glukozy z moczem i normalizuje poziom glukozy w nerkach. Tak wię c, pożądany jest szybki rozwój ś rodków przeciwcukrzycowych, które przejawiają silną aktywność hamującą ludzką SFLT2 i hamują nowy mechanizm działania. Jednocześnie, odkąd środki takie stymulują wydalanie nadmiaru glukozy z moczem, a w konsekwencji wzrasta gromadzenie glukozy w organizmie, oczekuje się, że zapobiegają one i łagodzą skutki otyłości.

Jako związki mające ugrupowanie pirazolowe, opisano związek WAY-123783, który zmniejsza ilości wydalanej glukozy u normalnych myszy. Jednakże, skutków takich nie opisano w odniesieniu do ludzi (J. Med. Chem., vol. 39, str. 3920-3928 (1996)).

Tworząc podstawy obecnego wynalazku, twórcy zbadali dokładnie związki mające silną aktywność hamującą ludzką SGLT2.

Przedmiotem wynalazku są pochodne glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze

w którym

R¹ oznacza atom wodoru lub grupę C1-C6 alkilową, jeden z Q¹ i T¹ oznacza grupę o wzorze:

OH podczas gdy inny oznacza grupę C1-C6 alkilową lub grupę fluorowco(C1-C6 alkilową), R² oznacza atom wodoru, grupę C1-C6 alkilową, C1-C6 alkoksylową, C1-C6 alkilotio, fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluorowca lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

W pochodnej glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze

PL 203 124 B1

R¹¹ oznacza atom wodoru albo prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, jeden z Q¹¹ i T¹¹ oznacza grupę o wzorze

podczas gdy inny oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, a R²¹ oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 4 atomach węgla, prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkoksylową o 1 do 3 atomach węgla albo prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilotio o 1 do 3 atomach węgla, lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

W pochodnej glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze i T¹² oznacza grupę o wzorze

izopropoksylową lub grupę metylotio, lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako składnik aktywny pochodne glukopiranozyloksypirazolu określone wyżej lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku ma zastosowanie jako inhibitor ludzkiej SGLT2, jako środek do zapobiegania lub leczenia cukrzycy oraz jako środek do zapobiegania lub leczenia otyłości. Następnym przedmiotem wynalazku jest pochodna glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze

w którym

2 2 R¹ oznacza atom wodoru lub grupę C1-C6 alkilową, jeden z Q² i T² oznacza grupę 2,3,4,6-tetrao-acetylo- -D-glukopiranozyloksylową, podczas gdy inny oznacza grupę C1-C6 alkilową, lub grupą fluorowco(C1-C6 alkilową), a R² oznacza atom wodoru, grupę C1-C6 alkilową, grupę C1-C6 alkoksylową, grupę C1-C6 alkilotio, grupę fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluorowca, lub jej sól oraz grupę C1-C6 alkilotio, grupę fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluorowca, lub jej sól oraz pochodna glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze

PL 203 124 B1 ₂ w którym R oznacza grupę C1-C6 alkilową, grupę C1-C6 alkoksylową, grupę C1-C6 alkilotio, grupę fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluoroca, a R³ oznacza grupę C1-C6 alkilową, lub jej sól.

W związkach o ogólnym wzorze (I), określenie „C1-C6 grupa alkilowa” oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 6 atomach węgla, taką jak grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, izobutylowa, sec-butylowa, tert-butylowa, pentylowa, izopentylowa, neopentylowa, tert-pentylowa, heksylowa lub tym podobne, określenie „C1-C6 grupa alkoksylowa” oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkoksylową o 1 do 6 atomach węgla, taką jak grupa metoksylowa, etoksylowa, propoksylowa, izopropoksylowa, butoksylowa, izobutoksylowa, sec-butoksylowa, tert-butoksylowa, pentyloksylowa, izopentyloksylowa, neopentyloksylowa, tertpentyloksylowa, heksyloksylowa lub podobne, a określenie „C1-C6 grupa alkilotio” oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilotio o 1 do 6 atomach węgla, taką jak grupa metylotio, etylotio, propylotio, izopropylotio, butylotio, izobutylotio, sec-butylotio, tert-butylotio, pentylotio, izopentylotio, neopentylotio, tert-pentylotio, heksylotio lub tym podobne. Określenie „atom fluorowca” oznacza atomy fluoru, chloru, bromu lub jodu, określenie „grupa fluorowco(C1-C6 alkilowa)” oznacza C1-C6 grupę alkilową podstawioną różnymi lub tymi samymi 1 do 3 atomami fluorowca o wyżej podanych znaczeniach.

Jako podstawnik R¹, korzystne są: atom wodoru lub prostołańcuchowa lub rozgałęziona grupa alkilowa o 1 do 3 atomach węgla, ale bardziej korzystne są: atom wodoru, grupa etylowa, propylowa lub izopropylowa. Jako podstawnik R², korzystne są: prostołańcuchowa lub rozgałęziona grupa alkilowa o 1 do 4 atomach węgla, prostołańcuchowa lub rozgałęziona grupa alkoksylowa o 1 do 3 atomach węgla albo prostołańcuchowa lub rozgałęziona grupa alkilotio o 1 do 3 atomach węgla, ale bardziej korzystne są: grupa etylowa, etoksylowa, izopropoksylowa lub metylotio. Jako podstawniki Q¹ i T¹, korzystnie jeden z nich oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, a bardziej korzystnie jeden z nich oznacza grupę metylową.

Przykładowo, związki według wynalazku o ogólnym wzorze (I) można wytworzyć następującym sposobem:

gdzie X i Y oznaczają grupę opuszczającą, taką jak atom fluorowca, grupy mesyloksylową lub tosyloksylową, R³ oznacza niższą grupę alkilową lub grupę fluorowco(niższą alkilową), R⁴ oznacza grupę metylową lub etylową, R⁵ oznacza niższą grupę alkilową, jeden z Q² i T² oznacza grupę 2,3,4,6-tetraO-acetylo-p-D-glukopiranozyloksylową, zaś drugi oznacza niższą grupę alkilową lub grupę fluorowco(niższą alkilową), a R¹, R², Q¹ i T¹ mają wyżej podane znaczenia.

Sposób 1

Związek o ogólnym wzorze (IV) można wytworzyć przez kondensację pochodnej benzylu o ogólnym wzorze (II) z ketooctanem o ogólnym wzorze (III) w obecnoś ci zasady, takiej jak wodorek sodu lub tert-butanolan potasu w obojętnym rozpuszczalniku. Jako obojętny rozpuszczalnik stosowany w reakcji, można wymienić 1,2-dimetoksyetan, tetrahydrofuran, N,N-dimetyloformamid, ich mieszaninę lub inne rozpuszczalniki. Temperaturą reakcji jest zwykle temperatura od temperatury pokojowej do temperatury wrzenia, a czas trwania reakcji wynosi zwykle od 1 godziny do 1 dnia, w zależności od stosowanego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji.

PL 203 124 B1

Sposób 2

Pochodną pirazolonu o ogólnym wzorze (V) można wytworzyć przez kondensację związku o ogólnym wzorze (IV) z hydrazyn ą lub monohydratu hydrazyny w oboję tnym rozpuszczalniku. Jako obojętny rozpuszczalnik stosowany w reakcji, można wymienić toluen, tetrahydrofuran, chloroform, lub mieszaninę tych rozpuszczalników i podobnych. Temperaturą reakcji jest zwykle temperatura od pokojowej do temperatury wrzenia, a czas trwania reakcji wynosi zwykle od 1 godziny do 1 dnia, w zależności od stosowanego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji. Otrzymaną pochodną pirazolonu o ogólnym wzorze (V) można również zastosować do sposobu 3 po przekształceniu w jej sól w znany sposób.

Sposób 3 (1) W przypadku pochodnych pirazolonu o ogólnym wzorze (V), w którym R³ oznacza niższą grupę alkilową, odpowiedni związek o ogólnym wzorze (VII) można wytworzyć przez poddanie odpowiedniej pochodnej pirazolonu o ogólnym wzorze (V) glikozydacji przy użyciu acetobromo-a-D-glukozy w obecności zasady takiej, jak węglan srebra w obojętnym rozpuszczalniku, i poddanie otrzymanego związku N-alkilowaniu przy użyciu środka alkilującego o ogólnym wzorze (VI) w obecności zasady, takiej jak węglan potasu w obojętnym rozpuszczalniku, jak wymaga tego sytuacja. Jako rozpuszczalnik reakcji glikozydacji, można wymienić tetrahydrofuran i podobne. Temperaturą reakcji jest zwykle temperatura od temperatury pokojowej do temperatury wrzenia, a czas trwania reakcji wynosi zwykle od 1 godziny do 1 dnia, w zależności od stosowanego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji. Jako rozpuszczalnik stosowany w reakcji N-alkilowania, można wymienić acetonitryl, N,N-dimetyloformamid, tetrahydrofuran, mieszaninę tych rozpuszczalników i tym podobnych. Temperaturą reakcji jest zwykle temperatura od temperatury pokojowej do temperatury wrzenia, a czas trwania reakcji wynosi zwykle od 1 godziny do 1 dnia, w zależności od stosowanego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji.

(2) W przypadku pochodnych pirazolonu o ogólnym wzorze (V), w którym R³ oznacza fluorowco(niższą grupę alkilową), odpowiedni związek o ogólnym wzorze (VII) można wytworzyć przez poddanie odpowiadającej pochodnej pirazolonu o ogólnym wzorze (V) glukozydacji przy użyciu acetobromo-a-D-glukozy w obecności zasady takiej, jak węglan potasu w obojętnym rozpuszczalniku, i poddanie otrzymanego związku N-alkilowaniu przy użyciu środka alkilującego o ogólnym wzorze (VI) w obecności zasady, takiej jak węglan potasu w obojętnym rozpuszczalniku, jak wymaga tego sytuacja. Jako rozpuszczalnik reakcji glikozydacji, można wymienić acetonitryl, tetrahydrofuran i podobne. Temperaturą reakcji jest zwykle temperatura od pokojowej do temperatury wrzenia, a czas trwania reakcji wynosi zwykle od 1 godziny do 1 dnia, w zależności od stosowanego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji. Jako rozpuszczalnik stosowany w reakcji N-alkilowania, można wymienić acetonitryl, N,N-dimetyloformamid, tetrahydrofuran i mieszaniny tych rozpuszczalników i podobnych. Temperaturą reakcji jest zwykle temperatura od pokojowej do temperatury wrzenia, a czas trwania reakcji wynosi zwykle od 1 godziny do 1 dnia, w zależności od stosowanego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji.

Otrzymane związki o ogólnym wzorze (VII) można również stosować w sposobie 4 po przekształceniu w ich sól w zwykły sposób.

Sposób 4

Związek o wzorze (I) według wynalazku można wytworzyć przez poddanie związku o ogólnym wzorze (V) hydrolizie alkalicznej. Jako rozpuszczalnik stosowany w tej reakcji, można wymienić metanol, etanol, tetrahydrofuran, wodę, mieszaniny tych rozpuszczalników i tym podobnych, a jako zasadę stosowaną można wymienić wodorek sodu, etanolan sodu i podobne. Temperatura reakcji zwykle wynosi od 0°C do temperatury pokojowej, a czas reakcji zwykle wynosi od 30 minut do 6 godzin, w zależności od użytego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji.

Związki o ogólnym wzorze (I), w którym podstawnik R¹ oznacza niższą grupę alkilową mogą być wytwarzane następującym sposobem:

PL 203 124 B1 gdzie Q¹, R², R⁵, T¹ i X mają wyżej podane znaczenia.

Sposób 5

Związek o ogólnym wzorze (Ib) według wynalazku można wytworzyć przez poddanie związku o ogólnym wzorze (la) według wynalazku N-alkilowaniu przy użyciu ś rodka N-alkilującego o ogólnym wzorze (VI) w obecności zasady, takiej jak węglan potasu lub węglan cezu, i czasami katalitycznej ilości jodku sodowego w obojętnym rozpuszczalniku. Jako obojętny rozpuszczalnik stosowany w reakcji, można wymienić N,N-dimetyloformamid, dimetoksyetan, sulfotlenek dimetylu, tetrahydrofuran, etanol, mieszaniny tych rozpuszczalników i tym podobnych. Temperatura reakcji zwykle wynosi od pokojowej do temperatury wrzenia, a czas reakcji zwykle wynosi od 10 minut do 1 dnia, w zależności od użytego materiału wyjściowego, rozpuszczalnika i temperatury reakcji.

Użytecznymi związkami o ogólnym wzorze (VII) i ich solami, które stosuje się w wyżej wymienionym sposobie wytwarzania są związki stanowiące związki pośrednie związków o wzorze ogólnym (I) według wynalazku. W związkach o ogólnym wzorze (VII), jak również w związkach o ogólnym wzorze (I) według wynalazku, korzystnie każdy z podstawników Q² i T² oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, a bardziej korzystnie, każdy z nich oznacza grupę metylową.

W zwią zku o ogólnym wzorze (V), jako materiał y wyjś ciowe, stosuje się trzy nastę pują ce tautomery, w zależności od zmiany warunków reakcji:

w których R² i R³ mają wyżej podane znaczenia. Związkami o ogólnym wzorze (V) i ich solami, użytecznymi w wyżej wymienionym sposobie wytwarzania, są związki stanowiące związki pośrednie związków o wzorze ogólnym (I) według wynalazku. W związkach o ogólnym wzorze (V), jak również w związkach o ogólnym wzorze (I) według wynalazku, korzystnie podstawnik R³ oznacza prostołańcuchową grupę lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, a bardziej korzystnie podstawnik R³ oznacza grupę metylową.

Związki o ogólnym wzorze (I) według wynalazku otrzymane wyżej wymienionymi sposobami, można wyodrębnić i oczyścić za pomocą konwencjonalnych środków oczyszczających, takich jak rekrystalizacja frakcyjna, oczyszczania metodą chromatografii i ekstrakcja rozpuszczalnikiem.

Pochodne glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze (I) według wynalazku można przekształcić w ich farmaceutycznie dopuszczalne sole w zwykły sposób. Przykładami takich soli są sole addycyjne z kwasami mineralnymi, takimi jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, jodowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy i podobne, sole addycyjne z kwasami organicznymi, takimi jak kwas mrówkowy, octowy, metanosulfonowy, benzenosulfonowy, p-toluenosulfonowy, propionowy, cytrynowy, bursztynowy, winowy, fumarowy, masłowy, szczawiowy, malonowy, maleinowy, mlekowy, jabłkowy, węglowy, glutaminowy, asparaginowy i podobne, oraz sole z zasadami nieorganicznymi, takimi jak sól sodowa, sól potasowa i podobne.

Związki o ogólnym wzorze (I) według wynalazku obejmują ich solwaty z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozpuszczalnikami, takie jak etanol i wodę.

Związki o ogólnym wzorze (I) według wynalazku wykazują doskonałą aktywność hamującą ludzką SGLT2 i są niezwykle użyteczne jako środki do zapobiegania lub leczenia cukrzycy, powikłań cukrzycowych, otyłości i podobnych. Przykładowo, w następujących testach na działanie hamujące

PL 203 124 B1 aktywność ludzkiej SGLT2, według wynalazku wykazały silną aktywność hamującą ludzką SGLT2. Z drugiej strony, ponieważ związek WAY-123783 wykazuje niesłychanie słabą aktywność hamując ą ludzką SGLT2, nie należy oczekiwać, aby miał on wystarczające działanie jako inhibitor ludzkiej SGLT2.

Gdy kompozycję farmaceutyczną według wynalazku stosuje się w praktyce, stosuje się rozmaite formy podawania w zależności od ich stosowania. Jako przykłady form podawania można wymienić proszek, granulki, mikrogranulki, suche syropy, tabletki, kapsułki, preparaty do wstrzykiwania, roztwory, maści, czopki, okłady i podobne, które można podawać doustnie lub pozajelitowo.

Te kompozycje farmaceutyczne można wytworzyć przez zmieszanie z/lub rozcieńczanie i rozpuszczenie odpowiednich dodatkowych substancji farmaceutycznych, takich jak substancje pomocnicze, czynniki ułatwiające rozpadanie, środki wiążące, smarujące, bufory, środki regulujące izotoniczność, antyseptyczne, nawilżające, środki emulgujące, dyspergujące, stabilizujące, rozpuszczające i podobne, wytwarzają c mieszaniny zgodnie z konwencjonalnym sposobem.

Gdy kompozycje farmaceutyczne według wynalazku stosuje się w praktyce, dawki związku o ogólnym wzorze (I) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli jako składnika aktywnego, są wł aściwie dobrane w zależności od wieku, płci, ciężaru ciała i stopnia symptomów i leczenia każdego pacjenta, które wynoszą w zakresie od około 0,1 do 1,000 mg na dzień na osobę dorosłą w przypadku podawania doustnego i w zakresie około od 0,1 do 300 mg na dzień na osobę dorosłą w przypadku podawania pozajelitowego, a dzienna dawka może być podzielona na kilka dawek na dzień i odpowiednio podawana.

P r z y k ł a d y

Następujące przykłady odniesienia, przykłady i testy ilustrują obecny wynalazek, nie ograniczając go.

P r z y k ł a d 1

1.2- dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Do roztworu 4-izopropoksybenzyloalkoholu (0,34 g) w tetrahydrofuranie (6 mL) dodano trietyloaminę (0,28 mL) i chlorek metanosulfonylu (0,16 mL) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Otrzymany nierozpuszczalny produkt usunięto przez filtrację. Otrzymany roztwór metanosulfonianu 4-izopropoksybenzylu w tetrahydrofuranie dodano do zawiesiny wodorku sodu (60%, 81 mg) i acetooctanu metylu (0,20 mL) w 1,2-dimetoksyetanie (10 mL) i mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez noc. Mieszaninę reakcyjną wlano do nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i otrzymaną mieszaninę ekstrahowano eterem dietylu. Warstwę organiczną przemyto solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w toluenie (5 mL). Do roztworu dodano bezwodną hydrazynę (0,19 mL) i mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent:dichlorometan/metanol - 10/1), otrzymując 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on (95 mg).

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,22 (6H, d, J=6,0 Hz), 1,99 (3H, s), 3,45 (2H, s), 4,40-4,60 (1H, m), 6,65-6,80 (2H, m), 6,957,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 2

1.2- dihydro-5-metylo-4-[(4-propylofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-propylobenzylowy zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

0,75-0,95 (3H, m), 1,45-1,65 (2H, m), 1,99 (3H, s), 2,40-2,55 (2H, m), 3,32 (2H, s), 6,95-7,10 (4H, m).

P r z y k ł a d 3

1.2- dihydro-4-[(4-izobutylofenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-izobutylobenzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

0,83 (6H, d, J=6,6 Hz), 1,70-1,85 (1H, m), 1,99 (3H, s), 2,30-2,45 (2H, m), 3,50 (2H, s), 6,907,10 (4H, m).

PL 203 124 B1

P r z y k ł a d 4

1.2- dihydro-5-metylo-4-[(4-propoksyfenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując zamiast alkoholu 4-propoksybenzylowego, alkohol 4-izopropoksybenzylowy.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

0,95 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,60-1,75 (2H, m), 1,98 (3H, s), 3,46 (2H, s), 3,75-3,90 (2H, m), 6,706,85 (2H, m), 6,95-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 5

4-[(4-etoksyfenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-etoksybenzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowy.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,20-1,35 (3H, m), 1,98 (3H, s), 3,46 (2H, s), 3,85-4,05 (2H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 6,95-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 6

1.2- dihydro-5-metylo-4-[(4-trifluorometylofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-trifluorometylobenzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

2,02 (3H, s), 3,64 (2H, s), 7,30-7,45 (2H, m), 7,55-7,70 (2H, m).

P r z y k ł a d 7

4-[(4-tert-butylofenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-tert-butylobenzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,24 (9H, s), 2,01 (3H, s), 3,49 (2H, s), 7,00-7,15 (2H, m), 7,15-7,30 (2H, m).

P r z y k ł a d 8

4- [(4-butoksyfenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-butoksybenzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

0,91 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1, 30-1,50 (2H, m), 1,55-1,75 (2H, m), 1,98 (3H, s), 3,46 (2H, s), 3,803,95 (2H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 6,95-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 9

1.2- dihydro-5-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-(metylotio)benzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,99 (3H, s), 2,42 (3H, s), 3,50 (2H, s), 7,05-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 10

5- etylo-1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1 stosując alkohol 4-(metylotio)benzylowy, zamiast alkoholu 4-izopropoksybenzylowego i stosując 3-oksopentanonian metylu zamiast acetooctanu metylu.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,02 (3H, t, J = 7,6 Hz), 2,39 (2H, q, J=7,6 Hz), 2,42 (3H, s), 3,51 (2H, s), 7,05-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 11

1.2- dihydro-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Do zawiesiny wodorku sodu (60%, 40 mg) w 1,2-dimetoksyetanie (1 mL) dodano acetooctan metylu (0,11 mL), chlorek 4-izopropylobenzylu (0,17 g) i katalityczną ilość jodku sodu i mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez noc. Mieszaninę reakcyjną wlano do nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i mieszaninę ekstrahowano eterem dietylowym. Warstwę organiczną przemyto solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w toluenie (1 mL). Do roztworu dodano bezwodną hydrazynę (0,094 mL) i mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu

PL 203 124 B1 krzemionkowym (eluent:dichlorometan/metanol = 10/1), otrzymując 1,2-dihydro-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on (0,12 g).

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,16 (6H, d, J = 6,9 Hz), 2,01 (3H, s), 2,70-2,90 (1H, m), 3,49 (2H, s), 6,95-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 12

4-[(4-etylofenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 11 stosując chlorek 4-etylobenzylu, zamiast chlorku 4-izopropylobenzylu.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,13 (3H, t, J = 7,6 Hz), 2,00 (3H, s), 2,45-2,60 (2H, m), 3,49 (2H, s), 7,00-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 13

1.2- dihydro-5-metylo-4-[(4-metylofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 11 stosując bromek 4-metylobenzylu, zamiast chlorku 4-izopropylobenzylu.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1.98 (3H, s), 2,23 (3H, s), 3,48 (2H, s), 6,95-7,10 (4H, m).

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 1

4-benzylo-1,2-dihydro-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 11 stosując trifluoroacetooctan etylu zamiast acetooctanu metylu i stosując bromek benzylu zamiast chlorku 4-izopropylobenzylu.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

3,73 (2H, s), 7,05-7,35 (5H, m), 12,50-13,10 (1H, brs).

P r z y k ł a d 14

1.2- dihydro-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 11 stosując bromek 4-metoksybenzylu, zamiast chlorku 4-izopropylobenzylu.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1.99 (3H, s), 3,47 (2H, s), 3,69 (3H, s), 6,75-6,85 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m), 8,70-11,70 (2H, br).

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 2

4-benzylo-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 11 stosując bromek benzylu, zamiast chlorku 4-izopropylobenzylu.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

2,00 (3H, s), 3,54 (2H, s), 7,05-7,30 (5H, s).

P r z y k ł a d 15

4- [(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Do zawiesiny 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu (46 mg), acetobromo-a-D-glukozy (99 mg) i sit molekularnych 4A w tetrahydrofuranie (3 mL) dodano węglan srebra (66 mg) i mieszaninę mieszano w cieniu w temperaturze 65°C przez noc. Mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na aminopropylowym żelu krzemionkowym (eluent:tetrahydrofuran). W wyniku dalszego oczyszczania metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym (rozwijający rozpuszczalnik:octan etylu/heksan = 2/1) otrzymano 4-[(4-izopropoksyfenylo)-metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-O-acetylo-3-D-glukopiraznozyloksy)-1H-pirazolu (42 mg).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,25-1,35 (6H, m), 1,88 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,10 (3H, s), 3,45-3,65 (2H, m), 3,80-3,90 (1H, m), 4,13 (1H, d, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 4,40-4,55 (1H, m), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 6,95-7,05 (2H, m).

P r z y k ł a d 16

5- metylo-4-[(4-propylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-5-metylo-4-[(4-propylofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on.

PL 203 124 B1 ¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

0,91 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,50-1,65 (2H, m), 1,86 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,05 (3H, s),

2,10 (3H, s), 2,45-2,55 (2H, m), 3,55 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,63 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m),

4,13 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,30 (1H, dd, J = 3,9, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 7,00-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 17

4- [(4-izobutylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-4-[(4-izobutylofenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

0,87 (6H, d, J = 6,6 Hz), 1,70-1,85 (1H, m), 1,87 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s),

2,10 (3H, s), 2,40 (2H, d, J = 7,2 Hz), 3,56 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,63 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 4,14 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,95-7,10 (4H, m).

P r z y k ł a d 18

5- metylo-4-[(4-propoksyfenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pi-razol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-5-metylo-4-[(4-propoksyfenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylu)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,01 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,70-1,85 (2H, m), 1,89 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s),

2,10 (3H, s), 3,53 (1H, d, J = 15,7 Hz), 3,59 (1H, d, J = 15,7 Hz), 3,80-3,95 (3H, m), 4,14 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 6,95-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 19

4- [(4-etoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 4-[(4-etoksyfenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,38 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,89 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,10 (3H, s), 3,53 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,59 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 3,98 (2H, q, J = 7,0 Hz), 4,13 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4), 5,15-5,30 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 6,95-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 20

5- metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-trifluorometylofenylo)metylo]-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-5-metylo-4-[(4-trifluorometylofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,85 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,14 (3H, s), 3,65 (1H, d, J = 15,9 Hz), 3,71 (1H, d, J = 15,9 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 4,14 (1H, dd, J = 2,4, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,40 (3H, m), 5,55-5,65 (1H, m), 7,20-7,30 (2H, m), 7,45-7,55 (2H, m).

P r z y k ł a d 21

4-[(4-tert-butylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 4-[(4-tert-butylofenylo)-metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-2-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,27 (9H, s), 1,84 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,14 (3H, s), 3,56 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,64 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 4,13 (1H, dd, J=2,3, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,30 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 7,00-7,10 (2H, m), 7,20-7,30 (2H, m).

PL 203 124 B1

P r z y k ł a d 22

4- [(4-butoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 4-[(4-butoksyfenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

0,96 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,40-1,55 (2H, m), 1,65-1,80 (2H, m), 1,88 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,10 (3H, s), 3,52 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,59 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 3,91 (2H, t, J = 6,5 Hz), 4,13 (1H, dd, J=2,3, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,155,30 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 6,95-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 23

5- metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2dihydro-5-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,88 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,12 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,50-3,65 (2H, m), 3,80-3,90 (1H, m), 4,13 (1H, dd, J = 2,4, 12,4 Hz), 4,31 (1H, dd, J = 4,1, 12,4 Hz), 5,15-5,30 (3H, m), 5,55-5,65 (1H, m), 7,00-7,10 (2H, m), 7,10-7,20 (2H, m), 8,65-8,85 (1H, brs).

P r z y k ł a d 24

5-etylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 5-etylo-1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,13 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,88 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,44 (3H, s), 2,452,55 (2H, m), 3,50-3,70 (2H, m), 3,80-3,90 (1H, m), 4,05-4,20 (1H, m), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,55-5,65 (1H, m), 7,00-7,10 (2H, m), 7,10-7,20 (2H, m), 8,80-9,20 (1H, brs).

P r z y k ł a d 25

4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on.

¹H-NMR (500 MHz, CDCI3) δ ppm:

1,20 (6H, d, J = 6,9 Hz), 1,85 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,13 (3H, s), 2,752,90 (1H, m), 3,56 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,63 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 4,05-4,20 (1H, m), 4,31 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 7,00-7,15 (4H, m), 8,709,30 (1H, brs).

P r z y k ł a d 26

4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Do roztworu 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)-metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu (2,0 g) w acetonitrylu (100 mL) dodano acetobromo-a-D-glukozę (3,1 g) i węglan potasu (1,1 g) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę i otrzymaną mieszaninę ekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu i solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent:heksan/octan etylu = 1/1), otrzymując 4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol (2,0 g).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,91 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,09 (3H, s), 2,45 (3H, s), 3,73 (2H, s), 3,75-3,90 (1H, m), 4,15-4,35 (2H, m), 5,15-5,65 (4H, m), 7,00-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 27

4-benzylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 26 stosując 4-benzylo-1,2-dihydro-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu.

PL 203 124 B1 ¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,89 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,70-3,90 (3H, m), 4,15-4,30 (2H, m), 5,10-5,50 (4H, m), 7,10-7,30 (5H, m).

P r z y k ł a d 28

4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 26 stosując 1,2-dihydro-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,93 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,09 (3H, s), 3,65-3,75 (2H, m), 3,77 (3H, s), 3,75-3,90 (1H, m), 4,15-4,35 (2H, m), 5,10-5,45 (4H, m), 6,75-6,85 (2H, m), 7,00-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 29

4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1.89 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,10 (3H, s), 3,45-3,65 (2H, m), 3,76 (3H, s), 3,80-3,90 (1H, m), 4,11 (1H, dd, J = 2,2, 12,4 Hz), 4,30 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 30

4-benzylo-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 4-benzylo-1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,86 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,11 (3H, s), 3,59 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,66 (1H, d, J = 15,8 Hz), 3,80-3,90 (1H, m), 4,11 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,30 (1H, dd, J = 4,09, 12,4 Hz), 5,15-5,30 (3H, m), 5,50-5,65 (1H, m), 7,05-7,30 (5H, m), 8,75-9,55 (1H, brs).

P r z y k ł a d 31

4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-1,5-dimetylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-pirazol

Zawiesinę 4-[(4-metoksyfenylo)metylo-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu (18 mg), węglanu potasu (14 mg) i jodometanu (4,7 mg) w acetonitrylu (2 mL) mieszano w temperaturze 75°C przez noc. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez celite^® i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (rozwijający rozpuszczalnik:benzen/aceton=2/1), otrzymując 4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-1,5-dimetylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-pirazol (4 mg).

¹H-NMR (500 MHz, CDCI3) δ ppm:

1.90 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,07 (3H, s), 3,45-3,60 (2H, m), 3,60 (3H, s), 3,76 (3H, s), 3,80-3,90 (1H, m), 4,13 (1H, dd, J = 2,4, 12,4 Hz), 4,29 (1H, dd, J = 4,1, 12,4 Hz), 5,15-5,30 (3H, m), 5,50-5,60 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 32

1-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-tri-fluorometylopirazol

Zawiesinę 4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-tri -fluorometylo-1H-pirazolu (30 mg), węglanu potasu (8,0 mg) i jodometanu (8,2 mg) w tetrahydrofuranie (1 mL) mieszano w temperaturze 75°C przez noc. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez celite^®i rozpuszczalnik usunięto z przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (rozwijający rozpuszczalnik:dichlorometan//octan etylu=5/1), otrzymując 1-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylopirazol (13 mg).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,89 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,65-3,95 (6H, m), 4,14 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,29 (1H, dd, J = 4,3, 12,4 Hz), 5,15-5,35 (3H, m), 5,50-5,65 (1H, m), 7,007,20 (4H, m).

PL 203 124 B1

P r z y k ł a d 33

1-etylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylopirazgl

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 32 stosując jodoetan zamiast jodometanu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

1,40 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,90 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,72 (2H, s), 3,80-3,90 (1H, m), 4,05-4,20 (3H, m), 4,27 (1H, dd, J = 4,5, 12,4 Hz), 5,10-5,35 (3H, m), 5,555,65 (1H, m), 7,00-7,10 (2H, m), 7,10-7,20 (2H, m).

P r z y k ł a d 34

4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-1-propylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 32 stosując jodopropan zamiast jodometanu.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm:

0,92 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,75-1,90 (2H, m), 1,89 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,72 (2H, s), 3,80-3,90 (1H, m), 3,90-4,05 (2H, m), 4,12 (1H, dd, J = 2,3, 12,4 Hz), 4,27 (1H, dd, J = 4,5, 12,4 Hz), 5,10-5,35 (3H, m), 5,55-5,65 (1H, m), 7,00-7,10 (2H, m), 7,10-7,20 (2H, m).

P r z y k ł a d 35

3-(-e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazol

Do roztworu 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu (61 mg) w etanolu (3 mL) dodano roztwór 1N wodnego wodorku sodu (0,53 mL) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą ekstrakcji w fazie stałej na kolumnie ODS (przemywający rozpuszczalnik: woda destylowana, eluent: metanol), otrzymując 3-(e-Dglukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)-metylo]-5-metylo-1H-pirazol (39 mg).

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,26 (6H, d, J = 5,9 Hz), 2,05 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,75-3,90 (1H, m), 4,45-4,60 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,00-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 36

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-4-[(4-propylofenylo)-metylo]-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 5-metylo-4-[(4-propylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,91 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,50-1,65 (2H, m), 2,05 (3H, s), 2,45-2,60 (2H, m), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,83 (1H, d, J = 11,9 Hz), 5,00-5,10 (1H, m), 7,00-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 37

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izobutylofenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-izobutylofenylo)-metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,87 (6H, d, J = 6,6 Hz), 1,70-1,90 (1H, m), 2,04 (3H, s), 2,41 (2H, d, J = 7,1 Hz), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,90 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,95-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 38

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-4-[(4-propoksyfenylo)metylo]-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 5-metylo-4-[(4-propoksyfenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,02 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,65-1,80 (2H, m), 2,05 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,60-3,75 (3H, m), 3,80-3,90 (3H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m).

PL 203 124 B1

P r z y k ł a d 39

4- [(4-etoksyfenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-etoksyfenylo)-metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1 H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,34 (3H, t, J = 7,0 Hz), 2,05 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,60-3,75 (3H, m), 3,80-3,90 (1H, m),

3,97 (2H, q, J = 7,0 Hz), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 40

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-4-[(4-trifluorometylofenylo)metylo]-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-β-D-glukopiranozvloksv)-4-[(4-trifluorometylofenvlo)-metylo]-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksvfenvlo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-β-D-glukopiranozvloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,08 (3H, s), 3,20-3,40 (4H, m), 3,67 (1H, dd, J = 5,0, 11,9 Hz), 3,75-3,90 (3H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 7,30-7,45 (2H, m), 7,45-7,60 (2H, m).

P r z y k ł a d 41 l-Jil-tert-butylofenyl^^ietyloJ^^e-D-fllukopiranozyloksyl-S-metylol^-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-tert-butylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1 H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksvfenvlo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetvlo-β-D-glukopiranozvloksv)-1H-pirazolu.

^lH-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

l,28 (9H, s), 2,06 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,60-3,90 (4H, m), 5,00-5,l0 (lH, m), 7,05-7,l5 (2H, m), 7,20-7,30 (2H, m).

P r z y k ł a d 42 m-butoksyfenylowetylome-D-glukOpiranozyloksy-Smetylo-lHipiiazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-butoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-(e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

^lH-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,97 (3H, t, J = 7,4 Hz), l,40-l,55 (2H, m), l,65-l,80 (2H, m), 2,05 (3H, s), 3,30-3,45 (4H, m), 3,60-3,75 (3H, m), 3,83 (lH, d, J = l2,0 Hz), 3,9l (2H, t, J = 6,4 Hz), 5,00-5,l0 (lH, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,05-7,l5 (2H, m).

P r z y k ł a d 43

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 5-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-lH-pirazolu.

^lH-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,06 (3H, s), 2,42 (3H, s), 3,20-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,80-3,90 (lH, m), 5,00-5,l0 (lH, m), 7,05-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 44

5- etylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metylotiofenylo)-metylo]-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 5-etylo-4-[(metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1 H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

^lH-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

l,06 (3H, t, J = 7,6 Hz), 2,42 (3H, s), 2,47 (2H, q, J = 7,6 Hz), 3,25-3,45 (4H, m), 3,60-3,80 (3H, m), 3,80-3,90 (lH, m), 5,00-5,l0 (lH, m), 7,l0-7,20 (4H, m).

PL 203 124 B1

P r z y k ł a d 45

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-izopropylofenylo)-metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1 H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,20 (6H, d, J = 6,9 Hz), 2,05 (3H, s), 2,75-2,90 (1H, m), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,90 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 7,00-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 46

3- (e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)-metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,42 (3H, s), 3,25-3,50 (4H, m), 3,69 (1H, dd, J = 4,9, 12,0 Hz), 3,75-3,90 (3H, m), 4,90-5,10 (1H, m), 7,10-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 47

4- benzylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-benzylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

3,25-3,45 (4H, m), 3,67 (1H, dd, J = 5,3, 12,0 Hz), 3,80-3,95 (3H, m), 4,97 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,05-7,25 (5H, m).

P r z y k ł a d 48

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-trifluorometylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-metoksyfenylo)-metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

3,25-3,45 (4H, m), 3,67 (1H, d, J = 5,4, 12,1 Hz), 3,73 (3H, s), 3,75-3,90 (3H, m), 4,90-5,00 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 49

3- (e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1 H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2.04 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,73 (3H, s), 3,80-3,90 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,75-6,85 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 50

4- benzylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-1H-pirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-benzylo-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1 H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2.05 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,60-3,90 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 7,05-7,25 (5H, m).

P r z y k ł a d 51

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-1,5-dimetylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-1,5-dimetylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

PL 203 124 B1 ¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,06 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,70 (6H, m), 3,73 (3H, s), 3,75-3,90 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 52

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-1-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 1-metylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylopirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,42 (3H, s), 3,30-3,50 (4H, m), 3,69 (1H, dd, J = 4,7, 12,0 Hz), 3,75-3,90 (6H, m), 5,25-5,35 (1H, m), 7,05-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 53

1-etylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 1-etylo-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylopirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-(e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,38 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,42 (3H, s), 3,30-3,50 (4H, m), 3,60-3,75 (1H, m), 3,75-3,90 (1H, m), 4,14 (2H, q, J = 7,1 Hz), 5,25-5,35 (1H, m), 7,05-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 54

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-1-propylo-5-trifluorometylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-metylotiofenylo)-metylo]-1-propylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylopirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,90 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,75-1,90 (2H, m), 2,42 (3H, s), 3,30-3,50 (4H, m), 3,69 (1H, dd, J = 4,9, 12,0 Hz), 3,75-3,90 (3H, m), 4,00-4,10 (2H, m), 5,25-5,35 (1H, m), 7,05-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 55

3- (e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-4-[(4-metylofenylo)-metylo]-1H-pirazol

5-metylo-4-[(4-metylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 1,2-dihydro-5-metylo-4-[(4-metylofenylo)metylo]-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu. Następnie, związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 5-metylo-4-[(4-metylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,04 (3H, s), 2,26 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,90 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,95-7,15 (4H, m) .

P r z y k ł a d 56

4- [(4-etylofenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-1H-pirazol

4-[(4-etylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 15 stosując 4-[(4-etylofenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-metylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3H-pirazol-3-onu. Następnie, związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-etylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,18 (3H, t, J = 7,6 Hz), 2,04 (3H, s), 2,57 (2H, q, J = 7,6 Hz), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,90 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,95-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d 57

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metylofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-1H-pirazol

PL 203 124 B1

4-[(4-metylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-(3-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 26 stosując 1,2-dihydro-4-[(4-metylofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu. Następnie, związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35, stosując 4-[(4-metylofenylometylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-p-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

2,25 (3H, s), 3,20-3,45 (4H, m), 3,55-3,70 (1H, m), 3,70-3,90 (3H, m), 4,80-4,95 (1H, m), 6,907,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 58

4-[(4-etylofenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol

4-[(4-etylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo1H-pirazol wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 26 stosując 4-[(4-etylofenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu. Następnie, związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-etylofenylo)metylo]-3-(2,3,4, 6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,18 (3H, t, J = 7,6 Hz), 2,50-2,60 (2H, m), 3,15-3,40 (4H, m), 3,55-3,65 (1H, m), 3,70-3,90 (3H, m), 4,80-4,95 (1H, m), 6,95-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 59

3- (e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-1H-pirazol

4- [(4-izopropylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 26 stosując 1,2-dihydro-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu. Następnie, związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,20 (6H, d, J = 6,9 Hz), 2,75-2,85 (1H, m), 3,15-3,40 (4H, m), 3,55-3,65 (1H, m), 3,70-3,90 (3H, m), 4,80-4,95 (1H, m), 7,00-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 60

4-[(4-chlorofenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol

4-[(4-chlorofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 26 stosując 4-[(4-chlorofenylo)metylo]-1,2-dihydro-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-on, zamiast 1,2-dihydro-4-[(4-metylotiofenylo)metylo]-5-trifluorometylo-3H-pirazol-3-onu. Następnie, związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 35 stosując 4-[(4-chlorofenylo)metylo]-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksy)-5-trifluorometylo-1H-pirazol, zamiast 4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(2,3,4,6-tetra-0-acetylo-3-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

3,20-3,40 (4H, m), 3,55-3,70 (1H, m), 3,75-3,90 (3H, m), 4,80-4,95 (1H, m), 7,10-7,25 (4H, m).

P r z y k ł a d 61

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1-propylopirazol

Do zawiesiny 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu (50 mg) i węglanu cezu (0,20 g) w N,N-dimetyloformamidzie (1 mL) dodano jodopropan (0,036 mL) w temperaturze 50°C i mieszaninę mieszano przez noc. Do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę i otrzymaną mieszaninę oczyszczono metodą ekstrakcji w fazie stałej na kolumnie ODS (przemywający rozpuszczalnik: woda destylowana, eluent: metanol). Otrzymany semi-purified materiał oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent:dichlorometan/metanol=8/1), otrzymując 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1-propylopirazol (28 mg).

PL 203 124 B1 ¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,26 (6H, d, J = 6,0 Hz), 1,65-1,80 (2H, m), 2,07 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,75-3,95 (3H, m), 4,40-4,60 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 62

1-etylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropylofenylo)metylo]-5-metylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując jodoetan zamiast jodopropanu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,26 (6H, d, J = 6,0 Hz), 1,29 (3H, t, J = 7,2 Hz), 2,08 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,75-3,90 (1H, m), 3,96 (2H, q, J = 7,2 Hz), 4,40-4,60 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 63

1-etylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)-metylo]-5-metylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 3-(β-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazol, zamiast 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu i stosując jodoetan zamiast jodopropanu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,29 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,07 (3H, s), 3,20-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (6H, m), 3,82 (1H, dd, J = 2,0, 12,0 Hz), 3,90-4,05 (2H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 64

3- (e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1-propylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 3-(β-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-metoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazol, zamiast 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,87 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,65-1,80 (2H, m), 2,07 (3H, s), 3,35-3,45 (4H, m), 3,60-3,75 (3H, m), 3,73 (3H, s), 3,75-3,85 (1H, m), 3,85-3,95 (2H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,00-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 65

1-etylo-4-[(4-etoksyfenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 4-[(4-etoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu i stosując jodoetan zamiast jodopropanu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,28 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,34 (3H, t, J = 7,2 Hz), 2,07 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,75-3,85 (1H, m), 3,90-4,00 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,85 (2H, m), 7,00-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 66

4- [(4-etoksyfenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-1-propylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 4-[(4-etoksyfenylo)metylo]-5-metylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,87 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,34 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,65-1,80 (2H, m), 2,07 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,81 (1H, dd, J = 2,1, 12,1 Hz), 3,85-4,05 (4H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,706,85 (2H, m), 7,00-7,15 (2H, m).

P r z y k ł a d 67

1-etylo-4-[(4-etylofenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 4-[(4-etylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu i stosując jodoetan, zamiast jodopropanu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,17 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,28 (3H, t, J = 7,2 Hz), 2,06 (3H, s), 2,56 (2H, q, J = 7,6 Hz), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,75-3,85 (1H, m), 3,90-4,00 (2H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 7,00-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 68

4-[(4-etylofenylo)metylo]-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-5-metylo-1-propylopirazol

PL 203 124 B1

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 4-[(4-etylofenylo)metylo]-5-metylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-1H-pirazol, zamiast 3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylo-1H-pirazolu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,87 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,17 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,65-1,80 (2H, m), 2,06 (3H, s), 2,56 (2H, q, J=7,6 Hz), 3,25-3,45 (4H, m), 3,60-3,95 (6H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 7,00-7,15 (4H, m).

P r z y k ł a d 69

1-butylo-3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-5-metylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując bromobutan zamiast jodopropanu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

0,92 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,20-1,40 (8H, m), 1,60-1,75 (2H, m), 2,07 (3H, s), 3,25-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,81 (1H, dd, J=2,1, 12,0 Hz), 3,91 (2H, t, J=7,2 Hz), 4,45-4,55 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d 70

3-(e-D-glukopiranozyloksy)-4-[(4-izopropoksyfenylo)metylo]-1-izopropylo-5-metylopirazol

Związek tytułowy wytworzono w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 61 stosując 2-bromopropan zamiast jodopropanu.

¹H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm:

1,26 (6H, d, J = 6,0 Hz), 1,30-1,40 (6H, m), 2,08 (3H, s), 3,15-3,45 (4H, m), 3,55-3,75 (3H, m), 3,78 (1H, dd, J=2,3, 12,0 Hz), 4,35-4,45 (1H, m), 4,45-4,55 (1H, m), 5,00-5,10 (1H, m), 6,70-6,80 (2H, m), 7,00-7,10 (2H, m).

P r z y k ł a d t e s t o w y 1

Badanie efektu hamowania na aktywność ludzkiej SGLT2

1) Konstrukcja plazmidowego wektora wyrażającego ludzką SGLT2

Wytwarzanie biblioteki cDNA do amplifikowania prowadzono przez odwrotną transkrypcję całkowitego RNA pochodzącego z ludzkiej nerki (gen Ori) oligo dT jako starterem, przy użyciu układu do preamplifikacji SUPER SCRIPT (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES). Fragment DNA kodujący ludzką SGLT2 amplifikowano przez reakcję PCR, w której zastosowano jako matrycę bibliotekę cDNA z ludzkiej nerki opisaną wyżej, a jako starter zastosowano następujące oligonukleotydy 0702F i 0712R, przedstawione jako sekwencje 1 i 2, odpowiednio. Fragment amplifikowanego DNA ligowano do pCR (Invitrogen), wektora do klonowania, zgodnie z metodą standardową dla tego zestawu. Escherichia coli HB101 transformowano zwykłym sposobem, a następnie przeprowadzono selekcję transformantów w pożywce agarowej LB, zawierającej 50 μl/mL kanamycyny. Po ekstrakcji plazmidu DNA i oczyszczeniu od jednego z transformantów, prowadzono amplikację fragmentu DNA kodującego ludzką SGLT2 metodą reakcji PCR, w której jako startery zastosowano następujące oligonukleotydy, jako sekwencje 3 i 4, odpowiednio. Fragment amplifikowanego DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi, Xho I i Hind III, a następnie oczyszczono zestaw oczyszczania Wizard (Promega). Ten oczyszczony fragment DNA wstawiono do odpowiadających miejsc restrykcyjnych pcDNA3.1(-) Myc/His-B (Invitrogen), wektor do wyrażania białek funkcyjnych. Escherichia coli HB101 transformowano zwykłym sposobem, a następnie przeprowadzono selekcję transformanta w pożywce agarowej LB, zawierającej 50 μq/mL ampicyliny. Po ekstrakcji DNA plazmidu i oczyszczeniu z tego transformanta, analizowano podstawową sekwencję fragmentu DNA wprowadzoną do miejsc klonowania wektora, pcDNA3.1 (-)Myc/His. w porównaniu z ludzką SGLT2, opisaną przez Wells i in. (Am. J. Physiol., Vol. 263, str. 459-465 (1992)), klon ten miał pojedynczą substytucję zasady (ATC, które koduje izoleucynę-433 zastąpiono GTC). Następnie, otrzymano klon, w którym izoleucynę-433 zastąpiono waliną. Ten plazmidowy wektor wyrażający ludzką SGLT2, w którym peptyd przedstawiono jako sekwencję 5, był sfuzowany z końcem karboksylowym reszty alaninowej, oznaczono jako KL29.

Sekwencja nr 1 ATGGAGGAGCACACAGAGGC

Sekwencja nr 2 GGCATAGAAGCCCCAGAGGA

Sekwencja nr 3 AACCTCGAGATGGAGGAGCACACAGAGGC

Sekwencja nr 4 AACAAGCTTGGCATAGAAGCCCCAGAGGA

Sekwencja nr 5 KLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH

2) Wytwarzanie komórek wyrażających przejściową ludzką SGLT2

KL29, plazmid wyrażający ludzką SGLT2, transfekowano w komórkach COS-7 (RIKEN CELL BANK RCB539) przez elektroporację. Elektroporację prowadzono stosując urządzenie GENE PUL20

PL 203 124 B1

SER II (Bio-Rad Laboratories) w warunkach: 0,290 kV, 975 pF, 2 x 10⁶ komórki COS-7 i 20 μg KL29 w 500 pl pożywki OPTI-MEM I (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES) w 0,4 ml pojemniku typu kuwety. Po transferze genu, komórki zebrano przez odwirowanie i zawieszono w pożywce OPTI-MEM I (1 mL/kuwetę). Do każdej 96-studzienkowej płytki dodano 125 pl tej zawiesiny komórkowej. Po hodowaniu przez noc w temperaturze 37°C w warunkach 5% CO2, do każdej studzienki dodano 125 pl pożywki DMEM, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (Sanko Jyunyaku), 100 jednostek/ml soli sodowej penicyliny G (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES), 100 pg/mL siarczanu streptomycyny (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES). Komórki hodowano aż do następnego dnia, a następnie stosowano do pomiaru aktywności hamującej wobec wychwytu metylo-a-D-glukopiranozydu.

3) Pomiar aktywności hamującej wobec wychwytu metylo-a-D-glukopiranozydu

Badane związki rozpuszczono w sulfotlenku dimetylu i rozcieńczono buforem do wychwytu (pH

7,4 bufor zawierający 140 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapna, 1 mM chlorku magnezu, 5 mM metylo-a-D-glukopiranozydu, 10 mM kwasu 2-[4(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego i 5 mM tris(hydroksymetylo)aminoetanu), przy czym jako próbkę do badań pomiaru aktywności hamującej aktywność hamującą, stosowano każdy rozcieńczalnik. Po usunięciu z pożywki komórek COS-7 wyrażających przejściową ludzką SGLT2, do każdej studzienki dodano 200 pl buforu do obróbki wstępnej (7,4 pH bufor zawierający 140 mM chlorku choliny, 2 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego i 5 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu), i komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut. Po usunięciu bufora do obróbki wstępnej, dodano ponownie 200 pl tego samego bufora, a komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut. Bufor do pomiaru przygotowano dodając 7 pl metylo-a-D-(U-14C)glukopiranozydu (Amersham Pharmacia Biotech) do 525 pL przygotowanej próbki do badań. Do badań kontrolnych przygotowano bufor bez badanego związku. Do oceny wychwytu podstawowego w nieobecności badanego związku i sodu, w podobny sposób wytworzono bufor do badań podstawowego wychwytu, zawierający 140 mM chlorku choliny zamiast chlorku sodu. Po usunięciu bufora do badań wstępnych, do każdej studzienki dodano 75 pl każdego z buforów do badań, a komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po usunięciu bufora do pomiaru, do każdej studzienki dodano 200 pl bufora do przemywania (pH 7,4 bufor zawierający 140 mM chlorku choliny, 2 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM metylo-a-D-glukopiranozydu, 10 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo[etanosulfonowego i 5 mM trie(hydroksymetylo)aminometano), i bufor natychmiast usunięto. Po dwóch dodatkowych przemyciach, komórki solubilizowano przez dodanie do każdej studzienki 75 pL 0,2 N wodorku sodu do każdej studzienki. Lizaty komórkowe przeniesiono do urządzenia PicoPlate (Packard), po czym do każdej studzienki dodano 150 pL MicroScint-40 (Packard) i mierzono radioaktywność stosując licznik scyntylacyjny z mikropłytką TopCount (Packard). Różnicę w wychwycie otrzymano jako 100% wartości przez podzielenie radioaktywności podstawowego wychwytu przez radioaktywne badanie kontrolne, a następnie z krzywych stężenie-zahamowanie metodą najmniejszego kwadratu, obliczono stężenia, przy których zostało zahamowane 50% wychwytu.

T a b l i c a 1

Związek badany	Wartość IC50 (nM)
1	2
Przykład 35	181
Przykład 36	441
Przykład 37	346
Przykład 38	702
Przykład 39	185
Przykład 43	84
Przykład 44	509
Przykład 45	441

PL 203 124 B1 cd. tablicy l

1	2
Przykład 46	679
Przykład 48	415
Przykład 49	383
Przykład 52	835
Przykład 55	280
Przykład 56	190
Przykład 58	634
WAY-123783	>100000

P r z y k ł a d b a d a w c z y 2

Badanie działania ułatwiającego wydalanie glukozy z moczem

Sposób A)

Jako zwierzęta do badań stosowano głodzone szczury SD (5-cio tygodniowe samce SLC, 120-150 g). Związek badany (25,40 mg) zawieszono w 762 μl etanolu i rozpuszczono przez dodanie 3,048 mL glikolu polietylenowego 400 i 3,8l mL soli fizjologicznej, a następnie wytworzono roztwór 3,3 mg/mL. Część tego roztworu rozcieńczono rozpuszczalnikiem (sól fizjologiczna: glikol polietylenowy 400: etanol = 5:4:1), a następnie wytworzono roztwór o stężeniu 3.3.1 lub 0,33 (mg/mL). Każdy z roztworów podano podskórnie szczurom w dawce 3 mL/kg (10,3 i 1 mg/kg). W badaniu kontrolnym podskórnie podano tylko rozpuszczalnik (sól fizjologiczna: glikol polietylenowy 400: etanol=5:4:1) w dawce 3 mL/kg. Natychmiast po podaniu podskórnym, doustnie podano 200 g/L roztworu glukozy w dawce 10 mL/kg (2 g/kg). Do podania podskórnego stosowano igłę 26G i strzykawkę 1 mL. Do podania doustnego stosowano szczurom sondę żołądkową i strzykawkę 2,5 mL. Ilość zwierząt w grupie wynosiła 3. Po zakończeniu podawania, pobranie prowadzono w klatce metabolicznej. Czas pobierania próbek moczu wynosił 4 godziny po podaniu glukozy. Po zakończeniu pobierania zapisano objętość moczu i zmierzono stężenie glukozy w moczu. Stężenie glukozy zmierzono stosując zestaw do badań laboratoryjnych: Glucose B-Test WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Z objętości moczu i stężenia glukozy w moczu, obliczono ilość glukozy wydalanej z moczem w czasie 4 godzin na 1 zwierzę.

Sposób B)

Jako zwierzęta do badań stosowano głodzone szczury SD (5-cio tygodniowe samce SLC, 120-150 g). Związek badany (25,40 mg) zawieszono w 762 μl etanolu i rozpuszczono przez dodanie 3,048 mL glikolu polietylenowego 400 i 3,81 mL soli fizjologicznej, a następnie wytworzono roztwór 3,3 mg/mL. Część tego roztworu rozcieńczono rozpuszczalnikiem (sól fizjologiczna: glikol polietylenowy 400: etanol = 5:4:1), a następnie wytworzono roztwór o stężeniu 3.3.1 lub 0,33 (mg/mL). Każdy z roztworów podano podskórnie szczurom w dawce 3 mL/kg (10,3 i 1 mg/kg). W badaniu kontrolnym podskórnie podano tylko rozpuszczalnik (sól fizjologiczna: glikol polietylenowy 400: etanol=5:4:1) w dawce 3 mL/kg. Natychmiast po podaniu podskórnym, doustnie podano 200 g/L roztworu glukozy w dawce 10 mL/kg (2 g/kg). Do podania podskórnego stosowano igłę 26G i strzykawkę 1 mL. Do podania doustnego stosowano szczurom sondę żołądkową i strzykawkę 2,5 mL. Ilość zwierząt w grupie wynosiła 3. Po zakończeniu podawania, pobranie prowadzono w klatce metabolicznej. Czas pobierania próbek moczu wynosił 4 godziny po podaniu glukozy. Po zakończeniu pobierania zapisano objętość moczu i zmierzono stężenie glukozy w moczu. Stężenie glukozy zmierzono stosując zestaw do badań laboratoryjnych: Glucose B-Test WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Z objętości moczu i stężenia glukozy w moczu, obliczono ilość glukozy wydalanej z moczem w czasie 4 godzin na 1 zwierzę.

PL 203 124 B1

T a b l i c a 2

Badany związek	Sposób	Dawka (mg/kg)	Ilość glukozy wydalanej z moczem (mg)
Przykład 35	B	0,1	16
1	74
10	188
Przykład 45	A	1	22,1
3	83,2
10	153,3
B	0,1	2
1	45
10	132

P r z y k ł a d b a d a w c z y 3

Badanie ostrej toksyczności

Sposób A)

Do badanego związku dodano 0,5% roztworu soli sodowej karboksymetylocelulozy i wytworzono 100 mg/mL zawiesiny. Jako zwierzęta do badań, stosowano 6-7 tygodniowe samce myszy głodzone przez 4 godziny (Clea Japan, 28-33 g, 5 zwierząt w każdej grupie). Badaną zawiesinę wyżej opisaną podano doustnie zwierzętom do badań w dawce 10 mL/1 g (1000 mg/kg), a następnie przez 24 godziny prowadzono obserwacje.

Sposób B)

Do badanego związku dodano rozpuszczalnik (sól fizjologiczna: glikol polietylenowy 400:etanol = 5:4:1) i otrzymano 200 mg/mL zawiesiny. Jako zwierzęta do badań stosowano 5-tygodniowe samce myszy ICR głodzone przez 4 godziny (Clea Japan, 26-33 g, 5 zwierząt w każdej grupie). Badaną zawiesinę opisaną wyżej podano podskórnie zwierzętom do badań opisanym wyżej w dawce 3 mL/kg (600 mg/kg), a następnie obserwację prowadzono 24 godziny po podaniu.

Wyniki przedstawiono w Tablicy 3.

T a b l i c a 3

Badany związek	Sposób	Liczba zgonów
Przykład 35	B	0/5
Przykład 45	A	0/5

Przydatność przemysłowa

Pochodne glukopiranozyloksybenzylobenzenu o ogólnym wzorze (I) według wynalazku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole mają aktywność hamującą ludzką SGLT2 i wykazują doskonałe działanie hipoglikemiczne przez wydalanie nadmiaru glukozy z moczem, hamując tym samym reabsorpcję glukozy w nerkach. Tak więc, dostarczono środki do zapobiegania lub leczenia cukrzycy, powikłań cukrzycowych, otyłości i podobnych zawierające pochodną glukopiranozyloksybenzylobenzenu o ogólnym wzorze (I) według wynalazku lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Ponadto, związki o powyższych ogólnych wzorach (V) i (VII) i ich sole są ważnymi związkami pośrednimi w wytwarzaniu związków o ogólnym wzorze (I) i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. A zatem, stosując te związki można łatwo wytworzyć związki o ogólnym wzorze (I) i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Claims

1. Pochodna glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze w którym

CL .0^-

HO' 'Y''0H OH podczas gdy inny oznacza grupę C1-C6 alkilową lub grupę fluorowco(C1-C6 alkilową), R² oznacza atom wodoru, grupę C1-C6 alkilową, C1-C6 alkoksylową, C1-C6 alkilotio, fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluorowca lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Pochodna glukopiranozyloksypirazolu według zastrz. 1 o ogólnym wzorze w którym R¹¹ oznacza atom wodoru albo prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, jeden z Q¹¹ i T¹¹ oznacza grupę o wzorze podczas gdy inny oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 3 atomach węgla, a R²¹ oznacza prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 do 4 atomach węgla, prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkoksylową o 1 do 3 atomach węgla albo prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkilotio o 1 do 3 atomach węgla, lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

3. Pochodna glukopiranozyloksypirazolu według zastrz. 1 o ogólnym wzorze w którym R¹² oznacza atom wodoru, grupę etylową, grupę propylową lub grupę izopropylową, jeden z Q¹² i T¹² oznacza grupę o wzorze

PL 203 124 B1 podczas gdy inny oznacza grupę metylową, a R²² oznacza grupę etylową, grupę etoksylową, grupę izopropoksylową lub grupę metylotio, lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

4. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera pochodną glukopiranozyloksypirazolu określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, do zastosowania jako inhibitor ludzkiej SGLT2.

6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4 do zastosowania jako środek do zapobiegania lub leczenia cukrzycy.

7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4 do zastosowania jako środek do zapobiegania lub leczenia otyłości.

8. Pochodna glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze w którym

1 2 2

R¹ oznacza atom wodoru lub grupę C1-C6 alkilową, jeden z Q² i T² oznacza grupę 2,3,4,6-tetra0-acetylo-e-D-glukopiranozyloksylową, podczas gdy inny oznacza grupę C-C₆ alkilową, lub grupę fluorowco(C1-C6 alkilową), a R² oznacza atom wodoru, grupę C1-C6 alkilową, grupę C1-C6 alkoksylową, grupę C1-C6 alkilotio, grupę fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluorowca, lub jej sól.

9. Pochodna glukopiranozyloksypirazolu o ogólnym wzorze w którym R^2' oznacza grupę C1-C6 alkilową, grupę C1-C6 alkoksylową, grupę C1-C6 alkilotio, grupę fluorowco(C1-C6 alkilową) lub atom fluorowca, a R^3' oznacza grupę C1-C6 alkilową, lub jej sól.