PL186950B1 - Stabilizowany, nie zawierający albuminy, liofilizowany preparat rFVIII - Google Patents

Abstract

1. Stabilizowany, nie zawierajacy albuminy, liofilizowany preparat rFVIII, znamienny tym, ze zawiera po odtworzeniu woda 65 - 400 mM glicyny, do 50 mM histydyny, 15- 60 mM sa- charozy, do 50 mM NaCl, do 5 mM CaCl2 oraz 50-1500 IU rFVIII/ml. 2. Stabilizowany, nie zawierajacy albuminy, liofilizowany preparat rFVIII, znamienny tym, ze zawiera po odtworzeniu woda 290 mM glicyny, 20 mM histydyny, 30 mM sacha- rozy, 30 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 oraz 50-1500 IU rFVIII/ml. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne, a zwłaszcza liofilizowany preparat rFVIII stabilizowany bez udziału albuminy (nie zawierający albuminy).

Czynnik VIII jest dobrze znanym białkiem plazmowym odgrywającym zasadniczą rolę w procesie krzepnięcia krwi. Jakkolwiek czynnik VIII może być i jest obecnie otrzymywany z ludzkiej plazmy, w ostatnich latach podjęto próby wytwarzania czynnika VIII ze źródeł rekombinantowych (rFVIII), aby uniknąć potencjalnych zanieczyszczeń związanych ze składnikami krwi. Na dodatek rekombinantowe źródło czynnika VIII zapewnia praktycznie nieograniczoną dostawę czynnika krzepliwości, dzięki czemu unika się ograniczeń związanych z plazmą krwi od dawców jako materiałem źródłowym.

W związku z tym, że jedną z zalet produktu rFVIII jest to, że nie pochodzi on z ludzkiej plazmy i w związku z tym nie zawiera potencjalnych zanieczyszczeń pochodzących z ludzkiej plazmy, jako cel przy wytwarzaniu rFVIII postawiono sobie opracowanie trwałego preparatu rFVIII, który można określić jako całkowicie wolny od jakichkolwiek materiałów pochodzenia ludzkiego. Jednakże rFVIII jest białkiem labilnym i podobnie jak wiele innych białek terapeutycznych, może wykazywać niestabilność przy przechowywaniu. Aby wyeliminować tą niestabilność, zazwyczaj stosuje się ludzką albuminę surowiczą do ochrony jako stabilizator. Stwierdzono, że albumina jest dobrym stabilizatorem rFVIII i stosowana jest w licznych produktach handlowych dostępnych na rynku. Jednakże stosując ludzką albuminę jako stabilizator rFVIII traci się jedną z najważniejszych zalet produktu rekombinantowego (czyli wyeliminowanie jakichkolwiek materiałów pochodzenia ludzkiego).

Ostatnio opisano nie zawierające albuminy preparaty czynnika VIII w ośrodkach o niskiej i wysokiej siie jonowej, z ci^l<^^l^u sodu, wapnia i histydyny jako jonu buforującego. Ponadto, zastosowano zasadowe aminokwasy takie jak lizyna, oraz cukry takie jak mannitol, sacharoza lub maltoza. W celu zapewnienia stabilności preparatu czynnika VIII nić zawierającego albuminy, przy równoczesnym zachowaniu niezbędnej izotoniczności wymaganej w zastosowaniach terapeutycznych, w takich preparatach nie zawierających albuminy zastosowano około 10%o cukru. Patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 877 608 (preparat o niskiej sile jonowej). W opisie patentowym europejskim nr 0 314 095 ujawniono inny preparat nie zawierający albuminy o wysokiej sile jonowej, zawierający histydynęjako środek buforujący.

Opis nr 4 877 608 dotyczy ciekłego roztworu, a nie produktu liofilizowanego, w przypadku którego musi istnieć możliwość poddania preparatu cyklom suszenia sublimacyjnego w celu uzyskania produktu. Preparat według opisu patentowego europejskiego nr 314 095

186 950 zawiera stosunkowo dużą ilość chlorku sodowego i jest stosowany przede wszystkim jako preparat ciekły.

Do innych opisów patentowych dotyczących preparatów czynnika VIII należy opis Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 399 670, w którym ujawniono zastosowanie argininy w zawierającym albuminę preparacie suszonym sublimacyjnie. Patrz także opis WO 95/01804, w którym ujawniono preparat nie zawierający sacharozy ani glicyny, a także opisy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 440 679 i 4 623 717 (Fernandes i inni), w których ujawniono zastosowanie co najmniej 30% wagowych cukrów w kombinacji z aminokwasami do stabilizowania FVIII w stanie ciekłym w warunkach pasteryzacji (60°C, co najmniej 10 godzin).

Oprócz powyższych opisów dotyczących preparatów czynnika VIII istnieje szereg innych opisów patentowych dotyczących oczyszczania i/lub stabilizacji czynnika VIII. Należy do nich opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 288 853 dotyczący wielostopniowego sposobu wytwarzania obejmującego zastosowanie kolumny ze sprzężoną heparyną, a następnie dodawanie glicyny w celu uzyskania produktu w postaci oczyszczonego czynnika VIH.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 399 670 dotyczy sposobu wytwarzania liofilizowanego preparatu czynnika VIII o zwiększonej rozpuszczalności, co wymaga dodawania argininy do roztworu czynnika VIII przed liofilizacją.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 259 951 dotyczy wielostopniowego sposobu oczyszczania czynnika VIII z plazmy z wykorzystaniem kolumn jonitowych.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 758 657 dotyczy wielostopniowego sposobu wydzielania czynnika VIII:C z plazmy, zgodnie z którym co najmniej jeden z etapów wymaga adsorpcji czynnika VIII:C na hydrofobowej matrycy.

Oprócz powyższych opisów patentowych ostatnio opisano preparat czynnika IX (FIX) bardzo podobny do preparatu rFVIII według wynalazku. Patrz Abstrakt 244, L. Bush i inni, Haemophilia, 2, Supplement 1, 64 (czerwiec 1996). FIX jest proenzymem, który przekształcany jest w aktywny enzym proteolityczny. Natomiast FVIII służy jako kofaktor wraz z innymi składnikami koagulacyjnymi przy krzepnięciu krwi. Ciężar cząsteczkowy FVIII wynosi około 340 000 daltonów, natomiast ciężar cząsteczkowy FIX wynosi około 56 000-57 000 daltonów. FVIII jest bardzo wrażliwy na obróbkę proteolityczną z równoczesną utratą aktywności koagulacyjnej. Wiadomo, że czynnik VIII jest z natury bardziej nietrwały niż FIX, a suszone sublimacyjnie koncentraty każdego z tych czynników wykazują znaczne różnice w, stabilności przy przechowywaniu w różnych temperaturach. W przeciwieństwie do FVIII, FEX zawiera unikatowe γ-karboksylowanie reszty kwasu glutaminowego w pozycji 12 od końca N, co być może decyduje o odmiennej stabilności. W związku z tym skład preparatu FIX nie musi sugerować składu preparatu FVHI.

W Pharmaceutical Research, 12, 831-837, 1995, również ujawniono preparat stabilizowanego rekombinantowego antagonisty receptora ludzkiej interleukiny-2 o składzie podobnym do ujawnionego poniżej.

Pomimo wcześniejszych i obecnych usiłowań opracowania stabilnego preparatu rFVIII, który możnaby z powodzeniem liofilizować, a następnie szybko odtwarzać w wodzie, dotychczas trudno było uzyskać preparat, który nie tylko nie zawiera produktów pochodzenia ludzkiego, takich jak albumina, ale również spełnia wymagania odnośnie prawidłowej liofilizacji i odtwarzania oraz izotoniczności, przy równoczesnym zapewnieniu długotrwałej stabilności rFVIII o farmaceutycznie dopuszczalnej trwałości.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że wytworzenie takiego preparatu jest możliwe. Przy opracowywaniu preparatu stwierdzono, że histydyna, ujawniona i zastosowana w znanych rozwiązaniach jako środek buforujący, w rzeczywistości wywiera działanie destabilizujące na liofilizowane preparaty nie zawierające albuminy. Jednakże stwierdzono, że działanie destabilizujące histydyny można skutecznie wyeliminować stosując nowy preparat zawierający sole, glicynę i sacharozę w kombinacji, która, jak stwierdzono, wywiera korzystny wpływ na stabilizacje rFVIII. Mieszanka taka chroni również rFVIII podczas szeregu cykli zamrażanieodmrażanie w procesie liofilizacji, oraz zapewnia szybkie odtwarzanie liofilizowanego produktu wodą. Preparat zawiera zarówno krystaliczne jak i bezpostaciowe składniki w przeciwieństwie do znanych preparatów, które są zasadniczo bezpostaciowe. Preparat według

186 950 wynalazku zachowuje stabilność w stanie ciekłym przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej. Szczegóły preparatu i jego zastosowanie opisano poniżej.

Ulepszony preparat rFVIII stanowi farmaceutycznie dopuszczalny, nie zawierający albuminy liofilizowany produkt, który można szybko odtwarzać wodą (w ciągu 30 s), przydatny w leczeniu hemofilii. Liofilizowany preparat zawiera nową mieszaninę soli, aminokwasów i cukrów. Produkt jest stabilny w temperaturze pokojowej i w przeciwieństwie do znanych preparatów zawiera stosunkowo niewiele cukru.

Preparat po odtworzeniu wodą zawiera następujące składniki: glicyna około 65-400 mM, korzystnie 290 mM histydyna do około 50 mM, korzystnie 1-50 mM, bardzo korzystnie 20 mM sacharoza około 15-60 mM, korzystnie 30 mM

NaCl do około 50 mM, korzystnie 1-50 mM, bardzo korzystnie 30 mM,

CaCh do około 5 mM, korzystnie 0,1-5 mM, bardzo korzystnie 2,5 mM, oraz rFVIII około 50-1500 UJ/ml

W korzystnym liofilizowanym preparacie resztkowa zawartość wody powinna wynosić około 1-3% wagowe, korzystnie około 1% wagowy.

Na rysunku pokazano wykres aktywności w funkcji czasu w 40°C preparatu według wynalazku o stosunkowo niskiej zawartości cukru (górna krzywa) oraz znanego preparatu o stosunkowo wysokiej zawartości cukru (dolna krzywa).

Celem, który doprowadził do wynalazku, było zidentyfikowanie nie zawierającego albuminy preparatu, który zapewnia stabilność rFVIII (spadek aktywności minimalny lub wynoszący poniżej 20%) w różnych etapach procesu takich jak ultrafiltracja/diafiltracja, przechowywanie zamrożonej masy, zamrażanie i odmrażanie oraz liofilizacja. Na dodatek pożądane było uzyskanie szybko rozpuszczającego się produktu o stabilności w odtworzonym stanie ciekłym. Ponadto pożądany był farmaceutycznie dopuszczalny liofilizowany produkt o odpowiedniej trwałości, który możnaby liofilizować przy krótkim cyklu zamrażanieodmrażanie.

Białka nie krystalizują podczas liofilizacji. Celem suszenia powinno być przekształcenie wodnego roztworu białka w fazę bezpostaciową, tak aby chronić białka przed chemiczną i/lub konformacyjną niestabilnością powodowaną przez krystaliczne otoczenie (lub całkowity brak wody). W związku z tym powszechnie dodaje się znaczące ilości albuminy (do 1%), aby zapewnić powstanie fazy bezpostaciowej (składnika bezpostaciowego) stabilizującej białka.

Na podstawie ogólnych przesłanek opracowano preparat zawierający zarówno składnik krystaliczny ułatwiający szybką liofilizację oraz składnik bezpostaciowy stabilizujący rFVIII. W użytym znaczeniu określenie składniki krystaliczny z bezpostaciowym oznacza, że preparat zawiera dwie lub więcej odrębnych faz, z których co najmniej jedna jest krystaliczną i jedna jest bezpostaciowa. Substancja stała może występować w postaci krystalicznej lub bezpostaciowej. Materiały krystaliczne charakteryzują się określoną strukturą, składem stechiometrycznym i temperaturami topnienia. Natomiast materiał bezpostaciowy nie wykazują wyraźnie określonej struktury cząsteczkowej i może być opisany jako przechłodzona ciecz o wyjątkowo wysokiej lepkości, taka jak lepkosprężysty „kauczuk” lub jeszcze sztywniejsze, kruche szkło. Uważa się, że inne cukry, takie jak maltoza, trehaloza i maltotrioza, mogą wchodzić w skład bezpostaciowego składnika. Mannitol może wchodzić w skład krystalicznego składnika preparatu.

Strategia zastosowana do identyfikacji farmaceutycznie dopuszczalnego, nie zawierającego albuminy preparatu rFVIII, była następująca:

a) Wyjściowy mweriał stanowtłrFVIIIo wISokim stopniu cnstości, oczyszczony z wykorzystaniem chromatografii ortogonalnych. Określa się je jako procesy chromatograAczne realizowane w różnych układach i z wykorzystaniem różnych zasad, przy czym zazwyczaj realizuje się je kolejno. W efekcie białko można szybko oczyścić stosując różne, bardziej skuteczne sposoby oczyszczania. Uzyskano w ten sposób czynnik VIII o czystości ponad 90% (na podstawie elektroforezy na żelu), o aktywności właściwej ponad 2000 IU/mg białka. Teoretyczna czystość rFVIII jest przedmiotem sporów, z tym że uważa się iż wynosi ona około 3500-5000 IU/mg białka.

186 950

b) Białko poddano preparowaniu metodą ultrafiltracji/diafiitracji (UF/DF) sprawdzając jego odzysk w UF/DF, podatność na zamrażanie-odmrażanie oraz stabilność w stanie ciekłym w różnych temperaturach inkubacji.

c) Wybrane preparaty scharakteryzowano pod względem ich właściwości termicznych metodą DSC (kalorymetrii różnicowej). Oznaczono temperatury zeszklenia (Tg'), temperatury odszklenia (Td') i temperaturę topnienia eutektyku (Te'). Informacje te wykorzystano do identyfikacji preparatów, które możnaby szybko liofilizować, stanowiących cele do dalszych badań.

d) Wybrane preparaty liofilizowano w szybkim cyklu suszenia sublimacyjnego, po czym zbadano stabilność w temperaturach standardowych i w warunkach przyspieszonych.

e) Trwałe preparaty łatwo zidentyfikowano spośród próbek przechowywanych w 40°C przez różne okresy czasu.

Analizując wyniki licznych badań, które doprowadziły do preparatu według wynalazku, zastosowano strategię wielozmiennego planowania doświadczeń oraz program do wyselekcjonowania zestawu składników, który stanowił mieszaniny aminokwasów, soli i cukrów. Wyniki analizowano z wykorzystaniem nowoczesnego, skomplikowanego programu w celu ustalenia ewentualnych oddziaływań pomiędzy składnikami generując analizę wielozmiennej powierzchni odpowiedzi danych. Ku zaskoczeniu okazało się, że histydyna (powszechnie stosowana w znanych preparatach) w rzeczywistości wywiera destabilizujący wpływ na preparaty rFVIII. Doprowadziło to do konieczności krytycznego zanalizowania kryteriów doboru różnych składników w preparacie, który ostatecznie został zaakceptowany.

Przykład I. Zbadano stabilność liofilizowanego rFVIII dodając różne ilości histydyny do mieszaniny rFVIII zawierającej 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCh oraz 165 mM mannitol. Wyniki przedstawiono poniżej.

Tabela 1

Procent wyjściowej aktywności po przechowywaniu przez 2 tygodnie w 40°C w obecności histydyny

Histydyna (mM)	% wyjściowej aktywności po 2 tygodniach w 40°C
20	5,9%
55	6,3%
75	2,5%
100	1,9%

Jak to można stwierdzić na podstawie powyższych danych, zwiększenie ilości histydyny powoduje spadek aktywności odtworzonego liofilizowanego rFVIH w sposób zależny od dawki. Wynik ten sugeruje, że histydyna nie odgrywa roli w stabilizowaniu rFVIII w stanie liofilizowanym.

Przykład II. Stabilność rFVIII w preparatach o wysokiej i niskiej zawartości cukru.

Wykonano 2 preparaty rekombinantowego czynnika VIII. Zbadano ich niestabilność w warunkach przyspieszonego starzenia w 40°C.

Preparat o wysokiej zawartości cukru, podobny do znanego preparatu, stanowił preparat bezpostaciowy zawierający po odtworzeniu wodą 50 mM chlorek sodowy, 2,5 mM chlorek wapnia, 5 mM histydynę i l0% wagowych maltozy.

Preparat według wynalazku o niskiej zawartości cukru był preparatem krystalicznym ze składnikiem bezpostaciowym w postaci 1%o sacharozy (30 mM sacharoza) w celu stabilizowania białka. Preparat ten po odtworzeniu wodą zawierał 30 mM chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku wapnia, 20 mM histydyny, 290 mM glicyny i około 200 IU/ml rFVIII. Preparat ten porównano ze znanym preparatem na rysunku, z którego wynika, że preparat według wynalazku rFVIII o niskiej zawartości cukru jest znacznie bardziej stabilny w czasie niż znany produkt o wysokiej zawartości cukru.

Uważa się, że w oparciu o powyższe ujawnienie dla specjalisty oczywiste staną się różne warianty. Z tego względu należy zdawać sobie sprawę, że powyższe przykłady podano

186 950 jedynie w celu zilustrowania wynalazku, oraz że zakres wynalazku ograniczony jest jedynie poniższymi zastrzeżeniami.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Stabilizowany, nie zawierający albuminy, liofilizowany preparat rFVIII, znamienny tym, że zawiera po odtworzeniu wodą 65 - 400 mM glicyny, do 50 mM histydyny, 15- 60 mM sacharozy, do 50 mM NaCl, do 5 mM CaCb oraz 50-1500 IU rFVIII/ml.
2. 2. Stabilizowany, nie zawierający albuminy, liofilizowany preparat rFVIH, znamienny tym, że zawiera po odtworzeniu wodą 290 mM glicyny, 20 mM histydyny, 30 mM sacharozy, 30 mM NaCl, 2,5 mM CaCb oraz 50-1500 IU rFVIII/ml.
3. 3. Liofilizowany preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że resztkowa zawartość wody wynosi około 1-3% wagowe.
4. 4. Liofilizowany preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że resztkowa zawartość wody wynosi około 1%o wagowy.