CZ219497A3 - Stabilizovaný přípravek s rekombinantním faktorem VIII prostý albuminu s malým obsahem cukru - Google Patents

Description

Tento vynález se obecně týká farmaceutických prostředků a obzvláště lyofilizovaného prostředku pro rFVIII, který je stabilizován bez albuminu (prostý albuminu).

Dosavadní stav techniky

Faktor VIII je dobře známý protein plazmy, který je podstatný pro proces srážení krvi. Třebaže faktor VIII může být a v současné době je získáván z lidské plazmy, v minulých letech bylo vyvinuto úsilí připravit faktor VIII z rekombinantních zdrojů (rFVIII), ve snaze vyhnout se potenciálním kontaminacím spojeným s krevními produkty. Kromě toho rekombinantní zdroj faktoru VIII poskytuje skutečně neomezenou dodávku koagulačního faktoru, čímž se vyhne dodávkovým limitům spojeným s používáním krevní plazmy od dárců jako zdroji materiálu.

Protože jedna z výhod rFVIII produktu spočívá v tom, že není odvozen od lidské plazmy a tak se vyhýbá potenciální kontaminaci ze zdroje lidské plazmy, je cílem při přípravě rFVIII vyvinout stabilizovaný přípravek pro rFVIII, který se může popsat jako zcela prostý jakýchkoli surovin z lidského zdroje. Avšak na neštěstí rFVIII je labilní protein a jako mnohé jiné terapeutické proteiny se může stát nestabilní během uskladnění. K překonání této nestability je obecnou praxí zavádět lidský senový albumin do produktu jako stabilizátor. Albumin byl zjištěn jako dobrý stabilizátor

FVIII a používá se v řadě obchodně dostupných produktů na trhu. Při použití lidského albuminu jako st rFVIII se však ztrácí jedna z výhod, které má rekombinantní produkt na prvním místě (to znamená, že se nevyhne jakémukoli zdroji materiálu na lidském základě).

Nedávno byly popsány přípravky pro faktor VIII prosté albuminu jak v prostředcích s nízkou, tak vysokou ionovou sílou prostředí, používající chloridu sodného, chloridu vápenatého a histidinu jako pufrovacích ionů. Kromě toho se používají bázické aminokyseliny, jako je lysin a cukry, jako je mannitol, sacharóza a maltóza. K dosažení stability v přípravcích faktoru VIII prostých albuminu, třebaže se udržuje nezbytná isotonicita potřebná pro terapeutické použití, používá se přibližně 10 % cukru, viz US patent č.

877 608 (přípravek s nízkou ionovou sílou). Evropský patentový spis ó. 0 314 095 popisuje jiný přípravek prostý albuminu, který má vysokou ionovou sílu a obsahuje histidin jako pufrovací přípravek.

US patent č. 4 877 608 se týká kapalného roztoku, nikoli tedy lyofilizovaného produktu, který musí být schopen podrobit se cyklům vymražovacího sušení, jež jsou nezbytné k přípravě produktu. Evropský patentový spis č. 0 314 095 zahrnuje relativně vysoké množství chloridu sodného a především se používá v kapalném přípravku.

Mezi jiné patenty, týkající se přípravků pro faktor VIII, se zahrnuje US patent č. 5 399 670, který popisuje použití argininu v lyofilizovaném přípravku obsahujícím albumin, WO 95/01804, který popisuje přípravek neobsahující cukr nebo glycin, a US patenty č. 4 440 679 a 4 623 717 (v obou případech původce Fernandes a kol.), které ukazují • ·

použití alespoň 30 % hmotnostních cukrů v kombinaci s aminokyselinami ke stabilizaci FVIII v kapalném stavu za podmínek pasterizace (teplota 60 °C, trvání alespoň 10 hodin).

Kromě přípravků pro faktor VIII uvedených výše je řada jiných patentů, které se týkají čištění a/nebo stabilizace faktoru VIII. Mezi ně se zahrnuje US patent č. 5 288 853, který chrání vícestupňový způsob přípravy zahrnující použití s heparinem spřažené kolony, s následujícím přidáním glycinu za vzniku vyčištěného produktu faktoru VIII.

US patent č. 5 399 670 kryje způsob přípravy lyofilizovaného přípravku pro faktor VIII o zvýšené rozpustnosti, který vyžaduje přidání argininu k roztoku faktoru VIII před lyofilizací.

US patent č. 5 259 951 kryje vícestupňový způsob čištění faktoru VIII z plazmy za použití ionoměničových kolon.

US patent č. 4 758 657 chrání vícestupňový způsob oddělování faktoru VIII:C z plazmy, při kterém alespoň jeden ze stupňů vyžaduje adsorpci faktoru VIII:C na hydrofóbní interakční základní hmotě.

Kromě patentů uvedených výše, zcela nedávno byl popsán přípravek pro faktor IX (FIX), který se zdá být podobný přípravku pro rFVIII uvedenému výše, viz Abstract 244, L.

Bush a kol., Hemophillia, sv. 2, doplněk 1, str. 64 (červen 1996). FIX je proenzym, který je konvertován na aktivní proteolytický enzym. Naproti tomu FVIII slouží jako kofaktor společně s jinými koagulačními komponentami při účinné • ·

• · •······· ·· ··

koagulaci krve. Molekulová hmotnost FVIII je přibližně 340 000 daltonů, zatímco FIX má molekulovou hmotnost přibližně 56 000 až 57 000 daltonů. FVIII je velmi citlivý k proteolytickému zpracování s průvodním poklesem koagulační aktivity. Je dobře známo, že faktor VIII je vnitřně stabilnější než FIX a koncentráty každého faktoru sušené vymražováním dokládají zřetelné rozdíly ve stabilitě při skladování za různých teplot. Na rozdíl od FVIII zahrnuje FIX jedinečnou τ-karboxylaci 12 N koncových zbytků kyseliny glutamové, co poskytuje možný základ pro odlišnou stabilitu. Tak přípravek pro FIX by nemusel nevyhnutelně podnítit přípravek pro FVIII.

Ve Pharmaceutical Research, sv. 12, str. 831 až 837 (1995) se také uvádí přípravek pro antagonistu stabilizovaného rekombinantního receptoru lidského interleukinu-1, podobného přípravku uvedenému výše.

Navzdory minulému a nedávnému úsilí vyvinout stabilizovaný rFVIII přípravek, který může být úspěšně lyofilizován a později rekonstituován rychle ve vodě, až do dnešního dne je obtížné dosáhnout přípravku, který se nejen vyhýbá použití lidských produktů, jako je albumin, ale který také splňuje požadavky na vlastní lyofilizaci, rychlou rekonstituci a isotonicitu, zatímco současně poskytuje rFVIII, který má dlouhodobou stabilitu, s farmaceuticky přijatelnou dobou skladování.

S překvapením nyní bylo zjištěno, že takový přípravek je možný. V průběhu vývoje tohoto přípravku bylo nalezeno, že histidin, který byl uváděn a používán podle dosavadního stavu techniky jako pufrovací přípravek, ve skutečnosti má destabilizuj ící účinek na lyofilizované přípravky prosté albuminu.

• ·

Původci tohoto vynálezu vsak zjistili, že destabilizující účinky histidinu se mohou účinně překonat novým přípravkem s obsahem solí, glycinu a sacharózy, u jejichž kombinace bylo zjištěno, že má příznivý účinek při stabilizaci rFVIII. Tato směs také chrání rFVIII proti násobným cyklům zmrazování a roztávání během lyofilizačního procesu a poskytuje rychlou rekonstituci lyofilizovaného produktu s vodou. Přípravek zahrnuje jak krystalické, tak amorfní složky, na rozdíl od většiny přípravků podle dosavadního stavu techniky, které jsou v podstatě amorfní. Přípravky podle tohoto vynálezu zůstávají stabilní v kapalném stavu po dobu alespoň 24 hodin za teploty místnosti. Podrobnosti o tomto přípravku a jeho použití se popisují dále.

Podstata vynálezu

Zlepšený rFVIII přípravek podle tohoto vynálezu je farmaceuticky přijatelný lyofilizovaný produkt prostý albuminu, který se může rychle rekonstituovat ve vodě (během 30 sekund) a je vhodný pro ošetřování hemofilie. Lyofilizovaný přípravek obsahuje novou směs solí, aminokyselin a sacharózy. Produkt je stabilizovaný za teploty místnosti a na rozdíl od přípravků podle dosavadního stavu techniky, zahrnuje relativně nízký obsah cukru.

Přípravek obsahuje dále uvedené komponenty, pokud je rekonstituován ve vodě:

glycin přibližně od 65 do 400 mM, výhodně 290 mM, histidin až do přibližně 50 mM, výhodně od 1 do 50 mM, velmi výhodně 20 mM, • · · sacharóza přibližně od 15 do 60 mM, výhodně 30 mM,

NaCl až do přibližně 50 mM, výhodně od 1 do 50 mM, velmi výhodně 30 mM,

CaCl₂ až do přibližně 5 mM, výhodně od 0,1 do 5 mM, velmi výhodně 2,5 mM, a rFVIII přibližně od 50 do 1500 mezinárodních jednotek na ml.

Ve výhodném lyofilizovaném přípravku má být množství zůstatkové vody přibližně od 1 do 3 % hmotnostních, výhodně zhruba 1 % hmotnostní.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. je graf, který srovnává působivost prostředku podle tohoto vynálezu za teploty 40 °C v závislosti na čase, při relativně malém obsahu cukru (horní křivka) s přípravkem popsaným v dosavadním stavu techniky, který má vysoký obsah cukru (dolní křivka).

Dále se podává podrobný popis vynálezu.

Předmětem vedoucím k tomuto vynálezu je přípravek prostý albuminu, který poskytuje stabilitu rFVIII (ztráta působivosti je minimální nebo menší než přibližně 20 %) v průběhu různých stupňů procesu, jako je ultrafiltrace a diafiltrace, skladování ve vymraženém objemu, cykly zmražování a roztávání a lyofilizace. Kromě toho je žádoucí rychlé rozpouštění produktu se stabilitou v rekonstituovaném kapalném stavu. Konečně je žádoucí farmaceuticky přijatelný • · · ·

lyofilizovaný produkt s příslušným skladovacím časem, který může být lyofilizován s krátkým cyklem sušení zmražováním.

Proteiny nekrystalují během lyofilizace. Cílem sušicího procesu má být konvertování vodného roztoku proteinu na amorfní fázi, k ochraně proteinu od chemické a/nebo konformační nestability způsobené krystalickým prostředím (nebo celkovou ztrátou vody). Tak je běžné zahrnovat významná množství albuminu (až do 1 %), aby se dostala amorfní fáze (komponenta) ke stabilizaci proteinů.

Na základě celkového cíle vynálezu byl vyvinut přípravek jak s krystalickou komponentou dovolující rychlou lyofilizaci, tak s amorfní komponentou ke stabilizaci rFVIII. Pokud se zde používá výrazu krystalická a amorfní komponenta, znamená to, že přípravek obsahuje alespoň dvě oddělené fáze, z nichž alespoň jedna je krystalická a jedna je amorfní. Tuhé látky se mohou vyskytovat v krystalické nebo amorfní formě. Krystalické materiály jsou charakterizovány jako materiály, které mají konečnou strukturu, stechiometrické složení a teplotu tání. Naproti tomu amorfní materiály nemají jasně definovanou molekulární strukturu a mohou být popsány jako velmi zchlazená kapalina s mimořádně vysokou viskozitou, jako je viskoelastický kaučuk nebo ještě více tuhé lámavé sklo. Uvádí se, že jiné cukry, jako je maltóza, trehalóza a maltotrióza, mohou přispívat k amorfní komponentě. Mannitol může být zahrnut jako látka přispívající ke krystalické komponentě přípravku.

Strategie používaná k určení farmaceuticky přijatelného rFVIII prostředku prostého albuminu je tato:

a)

Výchozím materiálem je vysoce čistý rFVIII, který se • · · · ···· ···· vyčistil za použití ortogonální chromatografie. Tato ortogonální chromatografie je definována jako chromatografický proces, který se provádí různými postupy a na různém základě a je obvykle používán v řadě za sebou. Výsledkem je, že protein se může rychle vyčistit aplikací rozdílných mnohem účinnějších metod čištění. To způsobuje u faktoru VIII, že má alespoň 90% čistotu (gelovou elektroforézou) se specifickými aktivitami většími než 2000 mezinárodních jednotek na mg proteinu. Teoretická čistota rFVIII je kontraverzním předmětem, ale předpokládá se přibližně od 3500 do 5000 mezinárodních jednotek na mg proteinu.

b) Protein se zpracovává ultrafiltrací a/nebo diafiltrací (UF/DF) a podrobí stanovení výtěžku po ultrafiltraci a/nebo diafiltraci, citlivosti ke zmražování a rozmražování a stability kapaliny za rozdílných teplot inkubace.

c) Potenciální přípravky jsou dále charakterizovány svým termálním chováním pomocí diferenční skanovací kalorimetrie (DSC), teploty skelného přechodu (Tg), devitrifikační teploty (Td) a eutektické teploty tání (Te). Tyto údaje se používají pro identifikaci přípravků, které by mohly být rychle lyofilizovány a na které je zaměřeno další zkoumání.

d) Vhodné přípravky se lyofilizují za použití rychlého cyklu sušení vymražováním a analýza stability se provádí za standardních teplot a teplot urychleného skladování.

e) Stabilní přípravky se rychle zjistí ze vzorků • · · · ·· ·· > · · ·

I · · · ···· ···· uskladněných za teploty 40 °C pro různé časové okamžiky.

Při analýze výsledků řady studií, které vedou k přípravku podle tohoto vynálezu, se používá strategie multivarlabilního experimentálního vzorku a programu k sériovému třídění skupiny komponent, které zahrnují směsi aminokyselin, solí a cukrů. Výsledky se analyzují za použití sofistického programu k vyjádření jakýchkoli interakcí mezi komponentami a vytváří se multivariabilní plošná analýza odezvy. S překvapením se zjistilo, že histidin (obecně používaný podle dosavadního stavu techniky) skutečně má destabilizující účinek na rFVIII přípravky. To vede k potřebě kriticky přezkoušet měřítka na různé komponenty přípravku, které původci nalezli jako nakonec přijatelné.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinek na stabilitu lyofilizovaného rFVIII se stanoví titrací různých množství histidinu v rFVIII směsi, která obsahuje 150 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého a 165 mM mannitolu. Výsledky jsou uvedeny dále.

·· ·· * · · · ·· ·· • · · ¹ • · · • · · ·⁴ • · ·· ··

Tabulka

Procento inhibice působivosti po 2 týdnech skladování za teploty 40 °C v přítomnosti histidinu

Histidin (mM) % počáteční aktivity po 2 týdnech za teploty 40 °C

20	5,9	%
55	6,3	%
75	2,5	%
100	1,9	%

Jak může být zřejmé z výše uvedených údajů, zvýšená množství histidinu způsobují pokles působivosti rekonstituovaného lyofilizovaného rFVIII při způsobu závislém na dávce. Tento výsledek svědčí o tom, že histidin nemá úlohu při stabilizaci FVIII v lyofilizovaném stavu.

Příklad 2

Stabilita rFVIII v přípravcích s vysokým a nízkým obsahem cukru.

Rekombinantní faktor VIII se připraví ve dvou přípravcích. Nestabilita se stanovuje za podmínek urychleného skladování při teplotě 40 °C.

Přípravek s vysokým obsahem cukru, který je podobný jako v dosavadním stavu techniky, je přípravek amorfního charakteru, který po rekonstituci s vodou obsahuje 50 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého, 5 mM histidinu • ·

- 11 a 10 % hmotnostních maltózy.

Přípravek s nízkým obsahem cukru podle tohoto vynálezu je krystalický, s amorfní komponentou 1 % sacharózy (30 mM sacharózy) , ke stabilizaci proteinu. Tento přípravek, po rekonstituci s vodou prostou ionů (WFI), obsahuje 30 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého, 20 mM histidinu, 290 mM glycinu a přibližně 200 mezinárodních jednotek rFVIII na mililitr. Tento přípravek se srovnává s přípravkem podle dosavadního stavu techniky na obr., z čehož může být zřejmé, že rFVIII přípravek s nízkým obsahem cukru podle tohoto vynálezu je značně stabilnější v průběhu času než stabilizovaný produkt s vysokým obsahem cukru podle dosavadního stavu techniky.

Na základě výše uvedeného zjištění panuje názor, že řadu úprav může provést odborník v oboru. Proto se uvažuje s tím, že výše uvedené příklady se mají vyložit pouze jako ilustrace a že rozsah tohoto vynálezu má být omezen toliko připojenými patentovými nároky.

Claims (4)

1. Stabilizovaný lyofilizovaný přípravek s rekombinantním faktorem VIII prostý albuminu, vyznačuj ící se tím, že obsahuje, pokud je rekonstituován s vodou, přibližně

65 až 400 mM glycinu, až do 50 mM histidinu,

15 až 60 mM sacharózy, až do 50 mM chloridu sodného, až do 5 mM chloridu vápenatého a

50 až 1500 mezinárodních jednotek rFVIII na mililitr.

2. Stabilizovaný lyofilizovaný přípravek s rekombinantním faktorem VIII prostý albuminu, vyznačuj ící se tím, že obsahuje, pokud je rekonstituován s vodou, přibližně

290 mM glycinu,

20 mM histidinu,

30 mM sacharózy,

30 mM chloridu sodného,

2,5 mM chloridu vápenatého a

50 až 1500 mezinárodních jednotek rFVIII na mililitr.

3. Lyofilizovaný přípravek podle nároku 1, v y znáčů j í c í se tím, že zbytkový obsah vody činí od přibližně 1 do 3 % hmotnostních.

4. Lyofilizovaný přípravek podle nároku 2, v y z n a čující se tím, že zbytkový obsah vody činí přibližně 1 % hmotnostní.