SK282207B6 - Stabilizovaný prípravok s rekombinantným faktorom viii bez albumínu s malým obsahom cukru - Google Patents

Abstract

Stabilizovaný prípravok s rekombinantným faktorom VIII (rFVIII) bez albumínu v lyofilizovanej forme, ktorý je tvorený tak kryštalickými, ako aj amorfnými komponentmi a obsahuje, ak je rekonštituovaný s vodou, približne 65 až 400 mM glycínu, až do 50 mM histidínu, 15 až 60 mM sacharózy, až do 50 mM chloridu sodného, až do 5 mM chloridu vápenatého a 50 až 1500 medzinárodných jednotiek rFVIII na mililiter. Veľmi výhodný prípravok obsahuje, po rekonštitúcii s vodou, približne 290 mM glycínu, 20 mM histidínu, 30 mM sacharózy, 30 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého a 50 až 1 500 medzinárodných jednotiek rFVIII na mililiter. Zvyškový obsah vody v lyofilizovanom prípravku je približne od 1 do 3 % hmotnostných, výhodne približne 1 % hmotnostné.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa všeobecne týka farmaceutických prostriedkov a obzvlášť lyofilizovaného prostriedku pre rFVIII, ktorý je stabilizovaný bez albumínu.

Doterajší stav techniky

Faktor VIII je dobre známy proteín plazmy, ktorý je podstatný pre proces zrážania krvi. Hoci faktor VIII môže byť a v súčasnosti sa získava z ľudskej plazmy, v minulých rokoch sa vyvinulo úsilie pripraviť faktor VIII z rekombinantných zdrojov (rFVIII) v snahe vyhnúť sa potenciálnym kontamináciám spojeným s krvnými produktmi. Okrem toho rekombinantný zdroj faktora VIII poskytuje skutočne neobmedzenú dodávku koagulačného faktora, čím sa vyhne dodávkovým limitom spojeným s používaním krvnej plazmy od darcov ako zdroja materiálu.

Pretože jedna z výhod rFVIII produktu spočíva v tom, že nie je odvodený od ľudskej plazmy, a tak sa vyhýba potenciálnej kontaminácii zo zdroja ľudskej plazmy, je cieľom pri príprave rFVIII vyvinúť stabilizovaný prípravok pre rFVIII, ktorý sa môže opísať ako celkom zbavený akýchkoľvek surovín z ľudského zdroja. Ale na nešťastie rFVIII je labilný proteín a ako mnohé iné terapeutické proteíny sa môže stať nestabilným počas uskladnenia. Na prekonanie tejto nestability je všeobecnou praxou zavádzať ľudský senový albumín do produktu ako stabilizátor. Albumín bol zistený ako dobrý stabilizátor rFVIII a používa sa v rade obchodne dostupných produktov na trhu. Pri použití ľudského albumínu ako stabilizátora rFVIII sa však stráca jedna z výhod, ktoré má rekombinantný produkt na prvom mieste (to znamená, že sa nevyhne akémukoľvek zdroju materiálu na ľudskom základe).

Nedávno boli opísané prípravky pre faktor VIII bez albumínu tak v prostriedkoch s nízkou, ako aj vysokou iónovou silou prostredia, používajúce chlorid sodný, chlorid vápenatý a histidín ako pufrovacie ióny. Okrem toho sa používajú bázické aminokyseliny, ako je lyzín a cukry, ako je manitol, sacharóza a maltóza. Na dosiahnutie stability v prípravkoch faktora VIII bez albumínu, hoci sa udržiava nevyhnutná izotonicita potrebná na terapeutické použitie, používa sa približne 10 % cukru, pozri US patent č. 4 877 608 (prípravok s nízkou iónovou silou). Európsky patentový spis č. 0 314 095 opisuje iný prípravok bez albumínu, ktorý má vysokú iónovú silu a obsahuje histidín ako pufrovací prípravok.

US patent č. 4 877 608 sa týka kvapalného roztoku, nie teda lyofilizovaného produktu, ktorý musí byť schopný podrobiť sa cyklom vymrazovacieho sušenia, ktoré sú nevyhnutné na prípravu produktu. Európsky patentový spis č. 0 314 095 zahrnuje relatívne vysoké množstvo chloridu sodného a predovšetkým sa používa v kvapalnom prípravku.

Medzi iné patenty, týkajúce sa prípravkov pre faktor VIII, sa zahrnuje US patent č. 5 399 670, ktoiý opisuje použitie arginínu v lyofilizovanom prípravku obsahujúcom albumín, WO 95/01804, ktorý opisuje prípravok neobsahujúci cukor alebo glycín a US patenty č. 4 440 679 a 4 623 717 (v obidvoch prípadoch pôvodca Femandes a kol.), ktoré ukazujú použitie aspoň 30 % hmotnostných cukrov v kombinácii s aminokyselinami na stabilizáciu FVIII v kvapalnom stave za podmienok pasterizácie (teplota 60 °C, trvanie aspoň 10 hodín).

Okrem uvedených prípravkov pre faktor VIII je rad iných patentov, ktoré sa týkajú čistenia a/alebo stabilizácie faktora VIII. Medzi ne sa zahrnuje US patent č. 5 288 853, ktorý chráni viacstupňový spôsob prípravy zahrnujúcej použitie kolóny spriahnutej s heparínom, s nasledujúcim pridaním glycínu za vzniku vyčisteného produktu faktora VIII.

US patent č. 5 399 670 pokrýva spôsob prípravy lyofilizovaného prípravku pre faktor VIII so zvýšenou rozpustnosťou, ktorý vyžaduje pridanie arginínu k roztoku faktora VIII pred lyofilizáciou.

US patent č. 5 259 951 pokrýva viacstupňový spôsob čistenia faktora VIII z plazmy s použitím ionexových kolón.

US patent č. 4 758 657 chráni viacstupňový spôsob oddeľovania faktora VIII:C z plazmy, pri ktorom aspoň jeden zo stupňov vyžaduje adsorpciu faktora VIII:C na hydrofóbnej interakčnej základnej hmote.

Okrem uvedených patentov, celkom nedávno bol opísaný prípravok pre faktor IX (FIX), ktorý sa zdá byť podobný uvedenému prípravku pre rFVIII, pozri Abstract 244, L. Bush a kol., Hemophillia, zv. 2, doplnok 1, str. 64 (jún 1996). FIX je proenzým, ktorý je konvertovaný na aktívny proteolytický enzým. Naproti tomu FVIII slúži ako kofaktor spoločne s inými koagulačnými komponentmi pri účinnej koagulácii krvi. Molekulová hmotnosť FVIII je približne 340 000 daltonov, zatiaľ čo FIX má molekulovú hmotnosť približne 56 000 až 57 000 daltonov. FVIII je veľmi citlivý k proteolytickému spracovaniu so sprievodným poklesom koagulačnej aktivity. Je dobre známe, že faktor VIII je vnútorne stabilnejší ako FIX a koncentráty každého faktora sušené vymrazovaním dokladajú zreteľné rozdiely v stabilite pri skladovaní za rôznych teplôt. Na rozdiel od FVIII zahrnuje FIX jedinečnú f-karboxyláciu 12 N koncových zvyškov kyseliny glutámovej, čo poskytuje možný základ pre odlišnú stabilitu. Tak prípravok pre FIX by nemusel nevyhnutne podnietiť prípravok pre FVIII.

Vo Pharmaceutical Research, zv. 12, str. 831 až 837 (1995) sa tiež uvádza prípravok pre antagonistu stabilizovaného rekombinantného receptora ľudského interleukínu1, podobného uvedenému prípravku.

Napriek minulej a nedávnej snahe vyvinúť stabilizovaný rFVIII prípravok, ktoiý môže byť úspešne lyofilizovaný a neskôr rekonštituovaný rýchlo vo vode, až do dnešného dňa bolo ťažké dosiahnuť prípravok, ktorý sa nielen vyhýba použitiu ľudských produktov, ako je albumín, ale ktorý tiež spĺňa požiadavky na vlastnú lyofilizáciu, rýchlu rekonštitúciu a izotonicitu, zatiaľ čo súčasne poskytuje rFVIII, ktorý má dlhodobú stabilitu, s farmaceutický prijateľnou lehotou skladovania.

S prekvapením sa zistilo, že takýto prípravok je možný. V priebehu vývoja tohto prípravku sa zistilo, že histidín, ktorý bol uvádzaný a používaný podľa doterajšieho stavu techniky ako pufrovací prípravok, v skutočnosti má destabilizujúci účinok na lyofilizované prípravky zbavené albumínu.

Autori tohto vynálezu však zistili, že destabilizujúce účinky histidínu sa môžu účinne prekonať novým prípravkom s obsahom solí, glycínu a sacharózy, pri ktorého kombinácii bolo zistené, že nemá priaznivý účinok pri stabilizácii rFVIII. Táto zmes tiež chráni rFVIII proti násobným cyklom zmrazovania a roztápania počas lyofilizačného procesu a poskytuje rýchlu rekonštitúciu lyofilizovaného produktu s vodou. Prípravok zahrnuje tak kryštalické, ako aj amorfné zložky, na rozdiel od väčšiny prípravkov podľa doterajšieho stavu techniky, ktoré sú v podstate amorfné. Prípravky podľa tohto vynálezu zostávajú stabilné v kvapalnom stave počas aspoň 24 hodín za teploty miestnosti.

SK 282207 Β6

Podrobnosti o tomto prípravku a jeho použití sa opisujú ďalej.

Podstata vynálezu

Zlepšený rFVIII prípravok podľa tohto vynálezu je farmaceutický prijateľný lyofilizovaný produkt bez albumínu, ktorý sa môže rýchlo rekonštituovať vo vode (počas 30 sekúnd) a je vhodný na ošetrovanie hemofílie. Lyofilizovaný prípravok obsahuje novú zmes solí, aminokyselín a sacharózy. Produkt je stabilizovaný za teploty miestnosti a na rozdiel od prípravkov podľa doterajšieho stavu techniky obsahuje relatívne nízky obsah cukru.

Prípravok obsahuje ďalej uvedené komponenty, ak je rekonštruovaný vo vode: glycín približne od 65 do 400 mM, výhodne 290 mM, histidín až do približne 50 mM, výhodne od 1 do mM, veľmi výhodne 20 mM, sacharóza približne od 15 do 60 mM, výhodne 30 mM,

NaCl až do približne 50 mM, výhodne od 1 do mM, veľmi výhodne 30 mM,

CaCl₂ až do približne 5 mM, výhodne od 0,1 do mM, veľmi výhodne 2,5 mM, a rFVIII približne od 50 do 1 500 medzinárodných jednotiek na ml.

Vo výhodnom lyofilizovanom prípravku má byť množstvo zostatkovej vody približne od 1 do 3 % hmotnostných, výhodne zhruba 1 % hmotnostné.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku je graf, ktorý porovnáva pôsobivosť prostriedku podľa tohto vynálezu za teploty 40 °C v závislosti od času, pri relatívne malom obsahu cukru (horná krivka) s prípravkom opísaným v doterajšom stave techniky, ktorý má vysoký obsah cukru (dolná krivka).

Ďalej sa podáva podrobný opis vynálezu.

Predmetom vedúcim k tomuto vynálezu je prípravok bez albumínu, ktorý poskytuje stabilitu rFVIII (strata pôsobivosti je minimálna alebo menšia ako približne 20 %) v priebehu rôznych stupňov procesu, ako je ultrafiltrácia a diafiltrácia, skladovanie vo vymrazenom objeme, cykly zmrazovania a roztápania a lyofilizácia. Okrem toho je žiaduce rýchle rozpustenie produktu so stabilitou v rekonštituovanom kvapalnom stave. Konečne je žiaduci farmaceutický prijateľný lyofilizovaný produkt s príslušným skladovacím časom, ktorý môže byť lyofilizovaný s krátkym cyklom sušenia zmrazovaním.

Proteíny nekryštalizujú počas lyofilizácie. Cieľom sušiaceho procesu má byť konvertovanie vodného roztoku proteínu a amorfnej fázy, kvôli ochrane proteínu od chemickej a/alebo konformačnej nestability spôsobenej kryštalickým prostredím (alebo celkovou stratou vody). Tak je bežné zahrnovať významné množstvá albumínu (až do 1 %), aby sa dostala amorfná fáza (komponent) na stabilizáciu proteínov.

Na základe celkového cieľa vynálezu bol vyvinutý prípravok tak s kryštalickým komponentom dovoľujúcim rýchlu lyofilizáciu, ako aj s amorfným komponentom na stabilizáciu rFVIII. Pokiaľ sa tu používa výraz kryštalický a amorfný komponent znamená to, že prípravok obsahuje aspoň dve oddelené fázy, z ktorých aspoň jedna je kryštalická a jedna je amorfná. Tuhé látky sa môžu vyskytovať v kryštalickej alebo amorfnej forme. Kryštalické materiály sú charakterizované ako materiály, ktoré majú konečnú štruktúru, stechiometrické zloženie a teplotu topenia. Naproti tomu amorfné materiály nemajú jasne definovanú molekulárnu štruktúru a môžu byť opísané ako veľmi schladená kvapalina s mimoriadne vysokou viskozitou, ako je viskoelastický „kaučuk“ alebo ešte viac tuhé lámavé sklo. Uvádza sa, že iné cukry, ako je maltóza, trehalóza a maltotrióza, môžu prispievať k amorfnému komponentu. Manitol môže byť zahrnutý ako látka prispievajúca ku kryštalickému komponentu prípravku.

Stratégia používaná na určenie farmaceutický prijateľného rFVIII prostriedku zbaveného albumínu je táto:

a) Východiskovým materiálom je vysoko čistý rFVIII, ktorý sa vyčistil s použitím ortogonálnej chromatografie. Táto ortogonálna chromatografia je definovaná ako chromatografický proces, ktorý sa vykonáva rôznymi postupmi a na rôznom základe a je zvyčajne používaný v rade za sebou. Výsledkom je, že proteín sa môže rýchlo vyčistiť aplikáciou rozdielnych oveľa účinnejších metód čistenia. To spôsobuje pri faktore VIII, že má aspoň 90 % čistotu (gélovou elektroforézou) so špecifickými aktivitami väčšími ako 2000 medzinárodných jednotiek na mg proteínu. Teoretická čistota rFVIII je kontroverzným predmetom, ale predpokladá sa približne od 3500 do 5000medzinárodných jednotiek na mg proteínu.

b) Proteín sa spracováva ultrafiltráciou a/alebo diafiltráciou (UF/DF) a podrobí stanoveniu výťažku po ultrafiltrácii a/alebo diafiltrácii, citlivosti na zmrazovanie a rozmrazovanie a stability kvapaliny za rozdielnych teplôt inkubácie.

c) Potenciálne prípravky sú ďalej charakterizované svojím termálnym správaním pomocou diferenčnej skenovacej kalorimetrie (DSC), teploty skelného prechodu (T), devitrifikačnej teploty (Td) a eutektickej teploty topenia (Te). Tieto údaje sa používajú na identifikáciu prípravkov, ktoré by mohli byť rýchlo lyofilizované a na ktoré sa zameria ďalšie skúmanie.

d) Vhodné prípravky sa lyofilizujú s použitím rýchleho cyklu sušenia vymrazovaním a analýza stability sa vykonáva za štandardných teplôt a teplôt urýchleného skladovania.

e) Stabilné prípravky sa rýchlo zistia zo vzoriek uskladnených za teploty 40 °C pre rôzne časové okamihy.

Pri analýze výsledkov radu štúdií, ktoré vedú k prípravku podľa tohto vynálezu, sa používa stratégia multivariabilnej experimentálnej vzorky a program na sériové triedenie skupiny komponentov, ktoré zahrnujú zmesi aminokyselín, solí a cukrov. Výsledky sa analyzujú s použitím sofistického programu na vyjadrenie akýchkoľvek interakcií medzi komponentmi a vytvára sa multivariabilná plošná analýza ozvy. S prekvapením sa zistilo, že histidín (všeobecne používaný podľa doterajšieho stavu techniky) skutočne má destabilizujúci účinok na rFVIII prípravky. To vedie k potrebe kriticky preskúšať kritériá na rôzne komponenty prípravku, ktoré autori pokladali za nakoniec prijateľné.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Účinok na stabilitu lyofilizovaného rFVIII sa stanoví titráciou rôznych množstiev histidínu v rFVIII zmesi, ktorá obsahuje 150 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého a 165 mM manitolu. Výsledky sú uvedené ďalej.

Tabuľka

Percento inhibície pôsobivosti po 2 týždňoch skladovania za teploty 40 °C v prítomnosti histidínu

Histidín (mM)	% počiatočnej aktivity po 2 týždňoch za teploty 40 °C
20	5,9 %
55	6,3 %
75	2,5 %
100	1,9%

Ako môže byť zrejmé z uvedených údajov, zvýšené množstvá histidínu spôsobujú pokles pôsobivosti rekonštituovaného lyofilizovaného rFVIII pri spôsobe závislom od dávky. Tento výsledok svedčí o tom, že histidín nemá úlohu pri stabilizácii FVIII v lyofilizovanom stave.

Príklad 2

Stabilita rFVIII v prípravkoch s vysokým a nízkym obsahom cukru

Rekombinantný faktor VIII sa pripraví v dvoch prípravkoch. Nestabilita sa stanovuje za podmienok urýchleného skladovania pri teplote 40 °C.

Prípravok s vysokým obsahom cukru, ktorý je podobný ako v doterajšom stave techniky, je prípravok amorfného charakteru, ktorý po rekonštitúcii s vodou obsahuje 50 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého, 5 mM histidínu a 10 % hmotnostných maltózy.

Prípravok s nízkym obsahom cukru podľa tohto vynálezu je kryštalický, s amorfným komponentom 1 % sacharózy (30 mM sacharózy), na stabilizáciu proteínu. Tento prípravok, po rekonštitúcii s vodou zbavenou iónov (WFI), obsahuje 30 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého, 20 mM histidínu, 290 mM glycínu a približne 200 medzinárodných jednotiek rFVIII na mililiter. Tento prípravok je porovnateľný s prípravkom podľa doterajšieho stavu techniky na obrázku, z čoho môže byť zrejmé, že rFVIII prípravok s nízkym obsahom cukru podľa tohto vynálezu je značne stabilnejší v priebehu času ako stabilizovaný produkt s vysokým obsahom cukru podľa doterajšieho stavu techniky.

Na základe uvedeného zistenia prevláda názor, že rad úprav môže vykonať odborník v odbore. Preto sa uvažuje o tom, že uvedené príklady sa majú vysvetliť iba ako ilustrácia a že rozsah tohto vynálezu má byť obmedzený iba pripojenými patentovými nárokmi.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Stabilizovaný lyofilizovaný prípravok s rekombinantným faktorom VIII bez albumínu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje, ak je rekonštruovaný s vodou, približne

   65 až 400 mM glycínu, až do 50 mM histidínu, 15 až 60 mM sacharózy, až do 50 mM chloridu sodného, až do 5 mM chloridu vápenatého a 50 až 1500 medzinárodných jednotiek rFVIII na mililiter.
2. 2. Stabilizovaný lyofilizovaný prípravok s rekombinantným faktorom VIII zbavený albumínu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje, ak je rekonštituovaný s vodou, približne

   290 mM glycínu, 20 mM histidínu, 30 mM sacharózy, 30 mM chloridu sodného,

   2,5 mM chloridu vápenatého a

   50 až 1500 medzinárodných jednotiek rFVIII na mililiter.
3. 3. Lyofilizovaný prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zvyškový obsah vody je od približne 1 do 3 % hmotnostných.
4. 4. Lyofilizovaný prípravok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že zvyškový obsah vody je približne 1 % hmotnostné.