PT818204E - Preparacao de factor viii recombinante estabilizado isento de albumina com baixo teor de acucar - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE FACTOR VIIIRECOMBINANTE ESTABILIZADO ISENTO DE ALBUMINA COM BAIXO TEOR DE AÇÚCAR”

BASES DA INVENÇÃO

Campo: Esta aplicação é relativa a uma formulação farmacêutica em geral e a uma formulação liofilizada para o rFVIII que é estabilizado na ausência de albumina (isento de albumina) em particular.

Conhecimento científico prévio: O Factor VIII é uma proteína do plasma bem conhecida que é essencial para o processo de coagulação do sangue. Embora o Factor VIII possa ser e correntemente é obtido a partir do plasma humano, têm sido feitos esforços em recentes anos para a manufactura do Factor VIII a partir de fontes recombinantes (rFVIII) para evitar potenciais contaminações associadas aos produtos sanguíneos. Além disso, uma fonte recombinante para o factor VIII proporciona um virtual fornecimento ilimitado do factor de coagulação, assim evitando limitações de fornecimento associadas ao uso de plasma sanguíneo doado como fonte de material.

Como uma das vantagens de um produto de rFVIII é que não é derivado de plasma humano assim evitando potenciais contaminações de uma fonte de plasma humano, tem sido um dos objectivos na manufactura de rFVIII desenvolver uma formulação estável para o rFVIII que possa ser descrita como sendo completamente livre de quaisquer fonte de materiais humanos naturais. Infelizmente, no entanto, o rFVIII é uma proteína instável e, tal como muitas outras proteínas terapêuticas, pode tomar-se instável durante o armazenamento. Para ultrapassar esta instabilidade, tem sido prática comum incluir albumina de soro humano ao produto como estabilizador. A albumina tem sido vista como um bom estabilizador do FVIII e é usada em inúmeros produtos comerciais do mercado. Ao usar a albumina humana como estabilizador do rFVIII, perde-se, todavia, uma das vantagens principais de se ter um produto recombinante (i.e., evitar qualquer fonte de materiais de base humana). Têm sido recentemente descritas algumas formulações para o Factor VIII isentos de albumina tanto em meios de força iónica baixos como altos usando cloreto de sódio, cloreto de cálcio e histidina como ião tampão. Adicionalmente, têm sido usados aminoácidos básicos tal como a lisina e açúcares tais como o manitol, sucrose ou maltose. Para alcançar estabilidade numa formulação do Factor VIII isento de albumina enquanto se retém a isotonicidade imprescindível necessária para uso terapêutico, tem sido usado cerca de 10% de açúcar nessas formulações isentas de albumina. Ver por exemplo a patente E.U 4.877.608 (formulação de força iónica baixa). A patente Europeia 0 314 095 divulga outra formulação isenta de albumina contendo uma força iónica alta e histidina como agente tampão. A patente '608 está relacionada com uma solução líquida e não com um produto liofilizado que deve estar apta a ser submetida a ciclos de congelação-secagem necessários para preparar o produto. A patente Europeia 314 095 inclui uma quantidade relativamente elevada de cloreto de sódio e é usada essencialmente numa formulação líquida.

Outras patentes relacionadas com a formulação do Factor VIII incluem a patente E.U. 5.399.670, que descreve o uso de arginina numa formulação congelada seca contendo albumina. Ver também WO 95/01804 que descreve uma formulação que não inclui sucrose nem glicina e U.S. 4.440.679 e U.S. 4.623.717 (ambas de Femandes et al.) mostrando o uso de açúcares a pelo menos 30% em peso em combinação com aminoácidos para estabilizar o FVIII no estado líquido sob condições de pasteurização (60°C, pelo menos 10 horas).

Além das formulações do Factor VIII referidas existem várias outras patentes relacionadas com a purificação e/ou estabilização do Factor VIII. Estas incluem a patente E.U. 5.288.853 que cobre um processo de manufactura em múltiplos passos incluindo o uso de uma coluna de acoplada com heparina seguida pela adição de glicina para formar um produto de Factor VIII purificado. A patente E.U. 5.399.670 cobre um processo para produzir uma preparação de Factor VIII liofilizado de elevada solubilidade que requer adição de arginina à solução do Factor VIII antes da liofilização. A patente E.U. 5.259.951 cobre um método em múltiplos passos de purificação do Factor VIII a partir do plasma usando colunas de permuta iónica. A patente E.U. 4.758.657 cobre um processo em múltiplos passos para separação do Factor VIII:C a partir do plasma no qual pelo menos um dos passos requer a adsorção do Factor VIII :C numa matriz de interacção hidrofóbica.

Além das patentes referidas, existe uma formulação para o Factor IX (FIX) muito recentemente descrita que parece semelhante à formulação do rFVIII aqui divulgada. Ver resumo 244 por L. Bush et al., Hemophilia, Vol. 2, Anexo 1, p. 64 (Junho, 1996). O FIX é uma proenzima que é convertida numa enzima proteolítica activa. O FVIII serve, por outro lado, como um cofactor juntamente com outros componentes de coagulação para realizar a coagulação do -4- sangue. 0 peso molecular do FVIII é cerca de 340.000 Daltons enquanto que o FIX tem um peso molecular de cerca de 56.000 a 57.000. O FVIII é muito sensível ao processamento proteolítico com concomitante perda de actividade coagulante. É bem sabido que o FVIII é inerentemente mais instável que o FIX e concentrados congelados secos de cada factor mostram diferenças acentuadas na estabilidade por armazenagem a várias temperaturas. Contrariamente ao FVIII, o FIX inclui uma carboxilação gama única dos resíduos de ácido glutâmico 12 N terminais, proporcionando assim uma base possível para estabilidade diferencial. Assim uma formulação para o FIX não sugere necessariamente uma formulação para o FVIII.

Em Pharmaceutical Research, Volume 12, No. 6, páginas 831-837, 1995, é também divulgada uma formulação para antagonista do receptor de interleucina-1 humana recombinante estabilizada semelhante à divulgada acima.

Apesar dos esforços passados e recentes para desenvolver uma preparação de rFVIII estável que possa ser liofilizada com sucesso e posteriormente reconstituída rapidamente em água, até à data tem sido difícil providenciar uma formulação que não só evite o uso de produtos humanos tal como a albumina mas que também encontre os requisitos para uma liofilização apropriada e rápida reconstituição e isotonicidade enquanto ao mesmo tempo providencie rFVIII com um longo período de estabilidade, com uma vida em armazém farmaceuticamente aceitável.

Para nossa surpresa descobrimos agora que tal preparação é possível. No decurso do desenvolvimento desta formulação, descobrimos que a histidina que se pensava e usava no conhecimento científico prévio como um agente tampão, na realidade tinha um efeito destabilizador em formulações isentas de albumina liofilizadas. Nós descobrimos no entanto que os efeitos -5-

destabilizadores da histidina podem ser eficientemente ultrapassados por uma formulação singular de sais, glicina e sucrose, cuja combinação foi descoberta ter um efeito benéfico em estabilizar o rFVIII. Esta mistura também protege o rFVIII através dos múltiplos ciclos de congelação-descongelação durante o processo de liofilização, e providencia uma rápida reconstituição do produto liofilizado com água. A formulação inclui tanto componentes cristalinos como amorfos, ao contrário da maioria das formulações da conhecimento científico prévio que são essencialmente amorfas. A formulação da nossa invenção mantém-se estável no estado líquido durante pelo menos vinte e quatro horas à temperatura ambiente. Os detalhes da nossa formulação e os seus usos são abaixo descritos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A nossa formulação do rFVIII aperfeiçoada é um produto liofilizado isento de albumina farmaceuticamente aceitável que pode ser rapidamente reconstituído em água (em menos de 30 segundos) e é apropriado para tratar a hemofilia. A preparação liofilizada compreende uma singular mistura de sais, aminoácidos e sucrose. O produto é estável à temperatura ambiente e, contrariamente ás formulações do conhecimento científico prévio, incluí um relativamente baixo teor de açúcar. A formulação compreende, quando reconstituída com água, os seguintes ingredientes:

Glicina cerca de 65 a 400 mM, preferencialmente 290 mM,

Histidina até cerca de 50mM, preferencialmente 1 mM até 50 mM, bastante preferencialmente 20 mM, -6-

Sucrose cerca de 15 a 60 mM, preferencialmente 30 mM,

NaCl até cerca de 50 mM, preferencialmente 1 mM até 50

mM, bastante preferencialmente 30 mM

CaCl2 até cerca de 5 mM, preferencialmente 0,1 até 5 mM, bastante preferencialmente 2,5 mM, e rFVTII cerca de 50 a 1500 IU/ml.

Numa formulação liofilizada preferida, a quantidade de água residual deve ser cerca de 1 a 3% em peso, preferencialmente cerca de 1% em peso.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A figura é um gráfico que compara a potência ao longo do tempo a 40°C da formulação desta divulgação tendo um relativamente baixo teor de açúcar (curva de cima) com a formulação conhecida do conhecimento científico prévio contendo um relativamente elevado teor de açúcar ( curva de baixo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O objectivo que levou a esta invenção foi a identificação de uma formulação isenta de albumina que oferecesse estabilidade ao rFVIII (perda de potência mínima ou inferior a cerca de 20%) através de vários passos processuais tais como ultrafiltração/diafiltração, armazenamento congelado a granel, efeitos de congelação-descongelação e liofilização. Além disso, era desejado um produto rapidamente dissolvido com estabilidade no estado líquido reconstituído. -7-

Finalmente, era desejado um produto liofilizado farmaceuticamente aceitável com uma shelf life apropriada que pudesse ser liofilizado com um curto ciclo de congelação-secagem.

As proteínas não cristalizam durante a liofilização. O objectivo de um processo de secagem deve ser a conversão da solução proteica aquosa numa fase amorfa para proteger as proteínas de instabilidade química e/ou conformacional causada por um ambiente cristalino (ou total ausência de água). Assim, é comum incluir quantidades significantes de albumina (até 1%) para proporcionar uma fase amorfa (componente) para estabilizar as proteínas.

Baseado nos objectivos gerais, foi desenvolvida uma formulação tanto com um componente cristalino que permite uma rápida liofilização como com um componente amorfo para estabilizar o rFVIII. Tal como aqui usada a expressão cristalino com um componente amorfo significa que a formulação compreende duas ou mais fases distintas em que pelo menos uma das quais é cristalina e outra das quais é amorfa. Os sólidos podem existir numa forma cristalina ou amorfa. Os materiais cristalinos são caracterizados por terem uma estrutura, composições estequiométricas, e pontos de fusão definidos. Em contraste, os materiais amorfos não têm uma estrutura molecular bem definida e podem ser descritos como líquidos super-arrefecidos com uma viscosidade extremamente elevada tal como uma borracha viscoelástica ou um vidro quebradiço mais rígido. Pensava-se que outros açúcares tais como a maltose, trealose, e maltotriose podiam ser incluídos para contribuir para os componentes amorfos. O manitol pode ser incluído para contribuir para o componente cristalino da formulação. A estratégia empregada para identificar uma formulação do rFVIII isento de albumina farmaceuticamente aceitável foi a seguinte: -8- (a) O material de partida foi rFVIII altamente purificado que foi purificado usando cromatografias ortogonais. Estas são definidas como processos cromatográficos que operam sob modos e princípios distintos e são tipicamente usados em sucessão. Como resultado, a proteína pode ser rapidamente purificada através da aplicação de diferentes métodos de purificação mais eficazes. Isto resultou em Factor VIII que era pelo menos 90% puro (por electroforese em gel) com uma actividade específica superior a 2000 IU/mg proteína. A pureza teórica do rFVIII tem sido assunto de controvérsia mas pensa-se que seja cerca de 3500-5000 IU/mg proteína. (b) A proteína foi formulada por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) e investigada para recuperação através de UF/DF, susceptibilidade a congelação-descongelação, e estabilidade líquida sob diferentes temperaturas de incubação. (c) As potenciais formulações foram posteriormente caracterizadas para o seu comportamento térmico por DSC (calorimetria de varrimento diferencial). Foram determinadas as temperaturas de transição de vidro (Tg'), a temperatura de devitrificação (Td') e a temperatura de fusão eutéctica (Te'). Esta informação foi usada para identificar formulações que pudessem ser rapidamente liofilizadas e foram alvo de investigação posterior. (d) As formulações sonda foram liofilizadas usando um ciclo rápido de congelação-secagem, e efectuaram-se análises de estabilidade sob temperaturas de armazenamento aceleradas e padrão. -9- (e) Foram prontamente identificadas formulações estáveis a partir de amostras armazenadas a 40°C para vários pontos de tempo.

Por análise dos resultados de numerosos estudos que levaram à formulação desta invenção, utilizou-se um programa e uma estratégia de design experimental multi variável para examinar minuciosamente um painel de ingredientes que abrangessem misturas de aminoácidos, sais e açúcares. Os resultados foram analisados usando um programa sofisticado para resolver quaisquer interacções entre os ingredientes, e foi gerada uma análise de resposta-superfície multi-variável dos dados. Para nossa surpresa, foi observado que a histidina (geralmente usada no conhecimento científico prévio) tem na realidade um efeito destabilisador nas formulações de rFVIII. Isto levou à necessidade de examinar de forma crítica os critérios para os vários ingredientes na formulação que nós encontrámos finalmente aceitáveis. EXEMPLO 1 O efeito na estabilidade do rFVIII liofilizado foi investigado pela titulação de várias quantidades de histidina numa mistura de rFVIII contendo 150 mM NaCl, 2,5 mM CaC^ e 165 mM de manitol. Os resultados estão a seguir indicados.

TABELA

Percentagem da potência inicial após duas semanas de armazenamento/40°C na presença de histidina. - 10-

Histidina (mM) % de actividade

inicial em 2 semanas/40°C 5,9% 6,3% 2,5% 1,9% 20 55 75 100

Como pode ser visto nos dados anteriores, o aumento das quantidades de histidina resulta numa diminuição da potência do rFVIII liofilizado reconstituído de um modo dependente da dose. Este resultado sugere que a histidina não desempenha um papel na estabilização do FVIII no estado liofilizado. EXEMPLO 2

Estabilidade do rFVIII em formulações de açúcar elevado e baixo. O Factor VIII recombinante foi preparado em duas formulações. Foi investigada a instabilidade sob condições de armazenamento aceleradas de 40°C. A formulação de açúcar elevado, semelhante à do conhecimento científico prévio, era uma formulação amorfa contendo, por reconstituição com água, 50 mM de cloreto de sódio, 2,5 mM de cloreto de cálcio, 5 mM de histidina, e 10% em peso de maltose. A formulação contendo pouco açúcar desta divulgação era cristalina com um componente amorfo de 1% de sucrose (30 mM sucrose) para estabilizar a proteína. Esta formulação, por reconstituição com WFI, continha 30 mM de - 11 - cloreto de sódio, 2,5 mM de cloreto de cálcio, 20 mM de histidina, 290 mM de glicina e aproximadamente 200 IU/ml de rFVIII. Esta formulação é comparada com a formulação do conhecimento científico prévio na figura onde pode ser visto que a formulação de rFVIII de baixo açúcar desta divulgação é consideravelmente mais estável ao longo do tempo do que o produto estabilizado de açúcar elevado do conhecimento científico prévio.

Lisboa, 2 de Junho de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14

1200 LISBOA

Claims (4)

1. -1 - REIVINDICAÇÕES 1. Uma preparação de rFVIII liofilizado, estável, isento de albumina compreendendo, quando reconstituída em água, 65 a 400 mM de glicina, até 50 mM de histidina, 15 a 60 mM de sucrose, até 50 mM de NaCl, até 5 mM de CaCl2, e 50 a 1500IU rFVIII/ml.
2. 2. Uma preparação de rFVIII liofilizado, estável, isento de albumina compreendendo, quando reconstituída em água, 290 mM de glicina, 20 mM de histidina, 30 mM de sucrose, 30 mM de NaCl, 2,5 mM de CaCl2, e 50 a 1500 IU rFVIII/ml.
3. 3. A preparação liofilizada da reivindicação 1 onde o conteúdo de água residual é 1 a 3% em peso.
4. 4. A preparação liofilizada da reivindicação 2 onde o conteúdo de água residual é 1% em peso. Lisboa, 2 de Junho de 2000

   JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA