PL185949B1

PL185949B1 - Nowe związki kryptoficynowe, sposób wytwarzania nowych związków kryptoficynowych, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie

Info

Publication number: PL185949B1
Application number: PL96322507A
Authority: PL
Inventors: Richard E. Moore; Marcus A. Tius; Russell A. Barrow; Jian Liang; Thomas H. Corbett; Frederick A. Valeriote; Thomas K. Hemscheidt; Trimurtulu Golakoti
Original assignee: Univ Hawaii; Univ Wayne State
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2003-09-30
Also published as: NO974105D0; AP737A; CN1183726A; JP4181632B2; ATE279935T1; HK1009747A1; EP0830136B1; BG63289B1; EP0830136A1; MD2196B2; HU225041B1; HUP9801880A2; WO1996040184A1; CZ278197A3; DE69633667T2; EP0830136A4; NO326685B1; RO118931B1; FI973591A0; TJ347B

Abstract

1. Zw iazki kryptoficynow e, przedstaw ione w zorem strukturalnym: w którym: A r oznacza grupe fenylowa lub grupe tienylowa, które sa niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi majacymi 1 do 5 atomów w egla lub atomami halogenu; R1 oznacza halogen, grupe SH, grupe aminowa, monoalkiloaminowa, dialkioammowa, tnalkiloamoniowa, alkilotiolowa. dialkilosuifoniowa. gdzie alkil ma 1 do 5 atomów wegla, siarczanow a lub fosforanowa: R: oznacza grupe OH lub SH; lub R 1 i R2 moga wziete razem tworzyc pierscien epoksydowy pierscien azyrydynowy, pierscien episiarczkowy. pierscien siarczanowy lub pierscien monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów wegla: lub R1 i R2 m oga wziete razem tworzyc podwójne wiazanie miedzy C 1 8 a C 19. 41 Sposób wytwarzania zwiazku kryptoficynowego, przedstawionego wzorem strukturalnym. w którym: Ar oznacza grupe fenylowa lub grupe tienylowa, które sa niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi majacymi 1 do 5 atomów w egla lub atomami halogenu; R1 oznacza halogen, grupe SH. grupe am inowa monoalkiloaminowa, dialkiloaminowa trialkiloamoniowa. alkilotiolowa. dialkilosuifoniowa, gdzie alkil ma I do 5 atomów wegla, siarczanow a lub fosforanowa; 42 Kompozycja farmaceutyczna do hamowania proliferacji hiperproliferacyjnych komórek ssaczych. znamienna tym, ze zawiera skuteczna ilosc zwiazku o wzorze strukturalnym: w którym. A r oznacza grupe fenylowa lub grupe tienylow a które sa niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi majacymi 1 do 5 atomów wegla lub atomami halogenu: 44. Zastosowanie zwiazku kryptoficynowego o wzorze strukturalnym w którym: Ar oznacza grupe fenylowa lub grupe tienylowa, które sa niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi majacymi 1 do 5 atomów w egla lub atomami halogenu. R 1 oznacza, halogen, grupe SH. grupe aminowa, monoalkiloaminowa, dialkiloaminowa, tnalkiloamoniowa. alkilotiolowa. dialkilosuifoniowa. gdzie alkil ma 1 do 5 atomów wegla, siarczanowa lub fosforanowa: PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe, syntetyczne związki kryptoficynowe, sposób wytwarzania nowych związków kryptoficynowych, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie. Nowe związki kryptoficynowe mają zastosowanie w zapobieganiu i leczeniu chorób spowodowanych przez proliferujące komórki, w szczególności chorób nowotworowych.

Choroby nowotworowe, charakteryzujące się proliferacją komórek nie poddaną normalnej kontroli wzrostu komórek, są poważną przyczyną zgonów ludzi. Doświadczenia kliniczne w chemioterapii wykazały, że do leczenia tych chorób potrzebne są nowe i bardziej skuteczne leki. Doświadczenia takie wskazują także, że leki rozrywające układ mikrotubul cytoszkieletu mogą być skuteczne w hamowaniu proliferacji komórek nowotworowych.

Układ mikrotubul w komórkach eukariotycznych jest głównym składnikiem cytoszkieletu i znajduje się w stanie dynamicznym łączenia i rozłączania, to jest heterodimery tubuliny ulegają polimeryzacji z wytworzeniem mikrotubul, a mikrotubule depolimeryzacji do ich składników. Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w regulacji architektury, metabolizmu i podziału komórek. Stan dynamiczny mikrotubul jest krytyczny dla ich normalnego funkcjonowania. W odniesieniu do podziału komórek tubulina jest polimeryzowana do mikrotubul, które tworzą wrzecionko mitotyczne. Następnie, po spełnieniu swojego zadania, przez wrzecionko mitotyczne, mikrotubule są depolimeryzowane. Zatem, czynniki, które przerywają polimeryzacje lub depolimeryzację mikrotubul i przez to hamują mitozę, stanowią jedne z najbardziej skutecznych środków chemioterapeutycznych w zastosowaniach klinicznych.

185 949

Takie środki lub trucizny anty-mitotyczne mogą być sklasyfikowane w trzech grupach na podstawie ich molekularnego mechanizmu działania. Pierwszą grupę stanowią środki, takie jak kolchicyna i kolcemid, które hamują tworzenie mikrotubul przez sekwestrację tubuliny. Drugą grupę stanowią środki, w tym winkrystyna i winblastyna, które indukują tworzenie parakrystalicznych agregatów tubuliny. Winkrystyna i winblastyna są dobrze znanymi lekami przeciwnowotworowymi. Ich działanie polegające na rozrywaniu mikrotubul wrzecionka mitotycznego preferencyjnie hamuje komórki hiperproliferacyjne. Trzecią grupę stanowią związki, takie jak taksol, które promują polimeryzację tubuliny, stabilizując w ten sposób struktury mikrotubul.

Jednakże posiadanie samej tylko czynności środka antymitotycznego nie gwarantuje skuteczności przeciwko komórkom guza i z pewnością nie gwarantuje skuteczności przeciwko komórkom guza wykazującym fenotyp oporności lękowej. Alkaloidy barwinka, takie jak winkrystyna i winblastyna, są skuteczne przeciwko komórkom i guzom nowotworowym, jednak nie posiadają czynności przeciwko niektórym komórkom i guzom opornym na leki. Jedną z podstaw rozwijania się oporności na leki (DR) lub oporności wielolekowej (MDR) komórki nowotworowej jest nadekspresja glikoproteiny P. Związki będące słabymi substratami dla transportu glikoproteiny P powinny być użyteczne dla zapobiegania takim fenotypom DR lub MDR.

Zgodnie z tym wykazywanie przez wiele komórek guza fenotypu DR lub MDR oraz udowodniony klinicznie sposób działania środków przeciwko komórkom nowotworowym stwarza konieczność rozwoju środków antytubulowych cytotoksycznych dla komórek nowotworowych nieopomych na leki jak również cytotoksycznych dla komórek nowotworowych z fenotypem oporności lękowej. Do środków obiecujących pod tym względem należy klasa związków znana jako kryptoficyny.

Kryptoficyny są silnymi przeciwrakowymi i przeciwgrzybiczymi depsipeptydami z alg błękitno-zielonych (cyjano-bakterie), należących do Nosto-caceae. Pierwsza kiyptoficyna, Kryptoficyna 1, został wyizolowana zNostoc sp. ATCC 53789 pochodzenia glebowego i okazała się bardzo aktywna przeciwko grzybom, zwłaszcza szczepom Cryptococcus (R. E. Schwartz i współpr., I. Ind. Microbiol. 1990, 5: 113-124). Kryptoficynę 1 wyizolowano także z Nostoc sp. GSV 224 pochodzenia glebowego, razem z 24 innymi dodatkowymi analogami kryptoficyny jako mniej istotnymi składnikami alg. Okazała się ona bardzo aktywna przeciwko transplantowanym podskórnie guzom litym u myszy (G. Trimurtulu i współpr., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116:4729-4737; R. Barrow i współpr., J. Am. Chem. Soc., 1995, 117-24792490). Dwa z analogów z Nostoc sp. GSV 224, Kryptoficyny 3 i 5, opisano poprzednio jako półsyntetyczne analogi Kryptoficyny 1 (D. F. Sesin opis patentowy USA 4845085, udzielony 4 lipca 1989; D. F. Sesin i współpr., opis patentowy USA 4868208, udzielony 19 września 1989). Kryptoficyny wykazywały znaczną cytotoksyczność selektywną w stosunku do guza w teście Corbetta i były jednakowo cytotoksyczne w stosunku do komórek wrażliwych na leki i komórek opornych na leki. Okazało się, że Kryptoficyna 1 ma taki sam sposób działania jak winblastyna, ale różni się od tego leku tym, że nieodwracalnie hamuje łączenie się mikrotubul (C. D. Smith i współpr., cancer Res. 1994, 54: 3779-3784). Jedną z kryptoficyn z Nostoc sp. GSV 224, Kryptoficynę 24, wyizolowano z gąbek morskich i nazwano arenastatyna (M. Kobayashi i współpr., Tetrahedron Lett. 1994, 35: 7969-72; M. Kobayashi i współpr., Tennen Yuki kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 1994, 36, 104-110).

dodatkowe związki kryptoficynowe, tutaj oznaczone jako kryptoficyny 2, 4, 6, 7, 1619, 21, 23, 24, 26, 28-31, 40, 43, 45, 49, 50 i 54 ujawniono w zgłoszeniach patentowych USA o nr kolejnych 08/172632, zgłoszonym 21 grudnia. 1993 108/249955, zgłoszonym 27 maja 1994, oraz w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US94/14740, zgłoszonym 21 grudnia 1994. Związki te są albo metabolitami izolowanymi ze szczepu Nostoc sp. albo są produktami półsyntetycznymi otrzymanymi z takich metabolitów. W tych zgłoszeniach patentowych ujawniono także charakterystykę wybranych związków kryptoficynowych jako czynników anty-mikrotubulowych o czynności klinicznej w stosunku do szerokiej gamy guzów implantowanych myszom, w tym guzów DR i MDR.

Pewne związki o strukturze kryptoficyny występujące w naturze znane są z publikacji w Cancer Res. vol. 54, 15 July 1994, str. 3779-3784; Chem. Pharm. Buli., vol. 42, nr 10, stro185 949 ny 2196-2198; i J. Am. Chem. Soc., vol. 116, nr 11, 1994, str. 4729-4737,. Są to kryptoficyna (publikacja pierwsza) oraz arenastatyna A, jej 7,8-epoksy stereoizomer oraz odpowiadająca pochodna 7,8-nienasycona (publikacja druga).

Wzory strukturalne powyższych kryptoficyn, nie objętych zakresem mniejszego wynalazku, przedstawiono poniżej.

KRYPTOFICYNA 1

KRYPTOFICYNA 5

185 949

KRYPTOFICYNA 13

KRYPTO FI CYNA 15

KRYPTOFICYNA 4

185 949

KRYPTOFICYNA 6

KRYPTOFICYNA 7

KRYPTOFICYNA 8

KRYPTOFICYNA 9

185 949

KRYPTOFICYNA 10

KRYPTO FICYNA 12

KRYPTOFICYNA 14

KRYPTOFICYNA 16

185 949

KRYPTOFICYNA 21

185 949

KRYPTOFICYNA 32

185 949

KRYPTOFICYNA 33

KRYPTOFICYNA 34

KRYPTOFICYNA 37

KRYPTOFICYNA 38

185 949

KRYPTOFICYNA 48

185 949

Odnośnie sposobów wytwarzania kryptoficyn, nie jest znany obecnie żaden sposób syntezy totalnej. Związki kryptoficynowe obecnie wytwarza się na drodze izolacji z alg błękitno-zielonych lub są one półsyntetycznymi odmianami takich wytwarzanych naturalnie związków. Brak sposobu totalnej syntezy sprawia, że trudne jest wytworzenie kryptoficyn stereospecyficznych, co może maksymalizować efektywność i zwiększać trwałość związku. Na przykład badania wykazały, że kryptoficyny mające nietknięty pierścień makrocykliczny są bardziej aktywne. Zgodnie z tym, pożądany byłby sposób syntezy totalnej, pozwalający na wytwarzanie kryptoficyn z pierścieniem makrocyklicznym, które są bardziej trwałe niż kryptoficyny występujące naturalnie. Niniejszy wynalazek rozwiązuje te problemy.

Przedmiotem wynalazku są nowe związki kryptoficynowe, a także sposób wytwarzania kryptoficyn na drodze syntezy totalnej. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kryptoficyn w kompozycjach farmaceutycznych do hamowania proliferacji komórek ssaczych i do leczenia chorób spowodowanych proliferacją komórek, szczególnie nowotworów.

Krótki opis figur rysunku

Figura 1 przedstawia ogólną strukturę wybranych związków kryptoficynowych według wynalazku i system numeracji dla jednostek hydroksykwasów A i D i jednostek aminokwasów B i C w wybranych wykonaniach.

Figury 2A i B obrazują graficznie wpływ związków kryptoficynowych i winblastyny na proliferację komórek Jurkat i progresję cyklu komórkowego. Komórki Jurkat inkubowano we wskazanych stężeniach związków kryptoficynowych (A) lub winblastyny (B) przez 24 godziny. Dla każdej próbki oznaczano w sposób opisany w części eksperymentalnej liczbę komórek żywotnych (|) i indeks mitotyczny (?). Wartości reprezentują średnią ± odchylenie standardowe (sd) dla potrójnych próbek w jednym z trzech podobnych eksperymentów.

Figura 3 obrazuje graficznie odwracalność wpływu winblastyny, kryptoficyn i taksolu na wzrost komórek. Komórki SKOV3 traktowano 0,1 nM winblastyny (?), 0,1 nM kryptoficyny (|) lub InM taksolu (®) w czasie t = 0. Te stężenia hamowały wzrost komórek o 50% dla każdego ze związków. Po 24 godzinach komórki przemywano i inkubowano przez wskazany czas w pożywce pozbawionej leku. Gęstość komórek oznaczano metodą wybarwiania sulforodaminą B (SRB) w sposób opisany w części eksperymentalnej i wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe (sd) dla absorbancji przy 560 nm dla potrójnych próbek w jednym z trzech eksperymentów.

Figura 4 przedstawia izobologramy dla kombinacji efektów winblastyny i kryptoficyn na proliferację komórek. Komórki SKOV3 traktowano winblastyną (0-600 pM) i/lub kryptoficynami (1-100 pM) przez 48 godzin. Następnie oznaczano liczbę komórek przez wybarwianie SRB, jak opisano w części eksperymentalnej, a wartości IC50 (|) i oznaczano linię addytywności (—) dla kombinacji winblastyny i związków kryptoficynowych.

Figura 5 przedstawia pierwszy schemat syntezy kryptoficyn według wynalazku.

Figura 6 przedstawia schemat wytwarzania jednostki A hydroksykwasu.

Figura 7 przedstawia schemat wytwarzania podjednostki kryptoficyny, zawierającej jednostkę hydroksykwasu A i aminokwasu B.

Figura 8 przedstawia schemat wytwarzania podjednostki kryptoficyny, zawierającej podjednostkę aminokwasu C i hydroksykwasu D.

Figura 9 przedstawia pierwszy schemat syntezy wybranych kryptoficyn według wynalazku.

Figura 10 przedstawia drugi schemat syntezy wybranych kryptoficyn według wynalazku.

Figura 11 przedstawia schemat syntezy podjednostki kryptoficyny zawierającej hydroksykwas D.

Figura 12 przedstawia trzeci schemat syntezy wybranych kryptoficyn według wynalazku.

Figura 13 przedstawia czwarty schemat syntezy wybranych kryptoficyn według wynalazku.

Figura 14 przedstawia piąty schemat syntezy wybranych kryptoficyn według wynalazku.

185 949

Dokładny opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe związki kryptoficynowe, przedstawione następującym wzorem strukturalnym:

w którym:

Ar oznacza grupę fenylową lub grupę tienylową które są niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla lub atomami halogenu;

Ri oznacza halogen, grupę SH, grupę aminową monoalkiloaminową dialkiloaminową trialkiloamoniową alkilotiolową dialkilosulfoniową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węglą siarczanową lub fosforanową

R₂ oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć pierścień epoksydowy, pierścień azyrydynowy, pierścień episiarczkowy, pierścień siarczanowy lub pierścień monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; lub Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Ci8 a C19;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a C14;

Re oznacza grupę benzylową hydroksybenzylową alkoksybenzylową halo-genohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

R7, Rg, R9 i Rio oznaczają niezależnie od siebie H lub grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla; i

Y i X niezależnie od siebie oznaczają. O, NH lub grupę alkiloaminową gdzie ilkil ma 1 do 5 atomów węgla;

z wyłączeniem związków, w których co najmniej jeden z R7 i Rg oznacza Η, X i Y oba oznaczają. O, a Ar oznacza fenyl.

W korzystnej postaci związku kryptoficynowego Rg oznacza grupę etylową propylową izopropylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową. W innej korzystnej postaci tego związku R7 oznacza grupę etylową propylową izopropylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową. W następnej korzystnej postaci R7 oznacza H, Rg oznacza metyl, R3 oznacza metyl, a X i Y nie oznaczająjednocześnie O.

W innej korzystnej postaci związku kryptoficynowego R3 oznacza grupę etylową propylową izopropylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową W jeszcze innej korzystnej postaci tego związku R9 oznacza grupę metylową etylową propylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową. W następnej korzystnej postaci Rio oznacza grupę metylową etylową propylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową

Przedmiotem wynalazku są następnie związki kryptoficynowe w których co najmniej jedna z grup przyłączonych do C₂, Cg, C9, Ci o i Cu ma stereochemię R. W następnej odmianie wynalazku co najmniej jedna z grup przyłączonych do C₂, Cg, C9, Cio i Ci 1 ma stereochemię S.

185 949

Jedną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cis a C19; R3, R7 i Rg oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 aCi4; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksy-benzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, aX i Y oznaczają, tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 51, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 51

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R_3; R7 i Rg oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; R^oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają, tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 52, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 52

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R₃, R7 i Rg oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 53, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 53

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri oznacza S-chloro, R₂ oznacza R-hydroksyl, R₃, R7 i R₈ oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; R^ oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza, wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 55, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 55

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, R] i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R₃, R7 i R₈ oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru, R^ oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 57, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 57

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri oznacza S-chloro, R₂ oznacza R-hydroksyl, R₃, R7 i R₈ oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 oznaczają, atomy wodoru, Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 58, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 58

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-episiarczkowy; R3, R7 i Rg oznaczają grupy metylowe, R4 i R₅ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 61, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 61

Następnąz postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-metoksyfenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci 3 aCi4; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 81, jest następujący.

KRYPTO FICYNA 81

Następnąz postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza metyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksy-benzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, aX i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 82, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 82

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza metyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy, R₃ i R₇oznaczają grupy metylowe, R4 i R₅ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; IG oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, R₈ i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 90, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 90

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza metyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy, R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C]₃ a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, R₈ i R,o oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 91, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 91

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Rj i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-azyrydynowy; R₃, R₇i R₈ oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cj₃a C14; IG oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 97, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 97

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-fluorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig a Ci9; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a Ci4; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksy-benzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 110, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 110

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig aCig; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R₅ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksy-benzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczajątlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 111, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 111

Następnąz postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w któiym Ar oznacza 2-tienyl, R| i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksy-benzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 112, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 112

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-fluorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C,₄; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 115, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 115

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-fluorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C]₄; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 116, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 116

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a Ci₄; R^ oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 117, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 117

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 118, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 118

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza 2-tienyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R₃i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃a C14; R^ oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 119, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 119

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza 2-tienyl, Rj i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 120, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 120

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cu a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Ri₀ oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 121, jest następujący.

KRYPTO FICYNA 121

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R₇oznaczają grupy metylowe, R4 i R₅ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 122, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 122

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3 i R₇oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a Cj₄; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 123, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 123

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cis a Ci9; R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; R$ oznacza 3-chloro-4-metoksy-benzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 124, jest następujący.

KRYPTO FICYNA 124

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, R] i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 125, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 125

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 126, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 126

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza fenyl, Ri oznacza S-chloro, R2 oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 127, jest następujący.

KRYPTO FI CYNA 127

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-tolil, Rj oznacza S-chloro, R2 oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 128, jest następujący.

KRYPTO FICYNA 128

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri oznacza R-chloro, R2 oznacza S-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci3 a C14; Rs oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 130, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 130

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri oznacza R-chloro, R2 oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; R^ oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 131, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 131

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri oznacza S-chloro, R2 oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 132, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 132

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri oznacza R-chloro, R2 oznacza S-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 133, jest następujący.

KRYPTOFICYNA 133

185 949

Następną z postaci związku kryptoficynowego według wynalazku jest związek, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, R_t oznacza R-chloro, R₂ oznacza R-hydroksyl, R₃ i R₇oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci₃ a C14; Rć oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen. Wzór strukturalny tego związku, Kryptoficyny 134, jest następujący.

OH HN.

KRYPTOFICYNA 134

Stosowane tu określenia mająnastępujące znaczenia, jeśli nie wskazano wyraźnie inaczej.

„Niższy β-aminokwas” oznacza dowolny β-aminokwas mający trzy do ośmiu węgli i liniowy lub nieliniowy łańcuch węglowodorowy; na przykład kwas 3-amino-2-metylopropionowy.

„Zestryfikowany niższy β-aminokwas” oznacza dowolny β-aminokwas mający trzy do ośmiu węgli, w którym atom węgla grupy karboksylowej jest podstawiony grupą metylową na przykład ester metylowy kwasu 3-amino-2-metylopropionowego.

„Niższa grupa alkanoiloksylowa” oznacza grupę alkanoiloksylową mającą jeden do siedmiu węgli i liniowy lub nieliniowy łańcuch węglowodorowy.

„Niższa grupa α-hydroksyalkanoiloksylowa” oznacza grupę a-hydroksyalkanoiloksylową mającą dwa do siedmiu węgli i liniowy lub nieliniowy łańcuch węglowodorowy; na przykład kwas 2-hydroksy-4-metylowalerianowy.

„Niższa grupa alkoksylowa” oznacza dowolną grupę alkilową mającą jeden do pięciu węgli, przyłączoną do atomu tlenu.

Grupa alkilowa mająca jeden do pięciu węgli obejmuje grupy mające liniowy lub nieliniowy łańcuch węglowodorowy, w tym na przykład grupy metylową etylową propylową izopropylową butylową izobutylową tert-butylową sek-butylową metylowane grupy butylowe, grupę pentylowąi tert-pentylową.

„Allilowo podstawiony alken” oznacza dowolny alken, który zawiera podstawnik alkilowy.

„Pierścień epoksydowy” oznacza trójczłonowy pierścień, którego szkielet składa się z dwóch węgli i atomu tlenu.

„Pierścień azyrydynowy” oznacza trój członowy pierścień, którego szkielet składa się z dwóch węgli i atomu azotu.

„Pierścień episiarczkowy” oznacza trójczłonowy pierścień, którego szkielet składa się z dwóch węgli i atomu siarki.

„Pierścień siarczanowy” oznacza pięcioczłonowy pierścień składający się ze szkieletu węgjel-węgiel-tlen-siarka-tlen, z dwoma dodatkowymi atomami tlenu przyłączonymi do atomu siarki.

„Pierścień monoalkilofosforanowy” oznacza pięcioczłonowy pierścień składający się ze szkieletu węgiel-węgiel-tlen-fosfor-tlen, z dwoma dodatkowymi atomami tlenu, z których jeden jest podstawiony niższą grupą alkilową przyłączonymi do atomu fosforu.

„Halogen” odnosi się do pierwiastków z układu okresowego, znanych historycznie jako fluorowce. Sposoby halogenowania obejmują addycję halogenowodorów, podstawienie w wyższej temperaturze, fotohalogenowanie, etc., a sposoby takie są znane specjalistom^1,2.

Jak jest widoczne z wzorów strukturalnych, związki kryptoficynowe mają grupy, które są podatne na modyfikację chemiczną. Związki według wynalazku obejmują te kryptoficyny,

185 949 które wykazują czynność przeciwnowotworową. Na przykład, pochodne według wynalazku obejmują związki mające tlen epoksydowy lub grupę hydroksylową na C-7 i C-8 jednostki A lub grupę kwasu leucynowego jednostki B z fig. 1. Takie pochodne nowych i poprzednio ujawnionych związków, które wykazują pożądaną czynność przeciwnowotworową są objęte zakresem zastrzeżeń. Ponadto, zależność między strukturą związków kryptoficynowych a czynnościąprzeciwnowotworowąprzedstawiono poniżej w części eksperymentalnej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania powyższych związków kryptoficynowych, jak również związków poprzednio znanych kryptoficyn, na drodze syntezy totalnej.

Nowe metabolity kryptoficyn, jak również metabolity poprzednio ujawnione, mogą być wytwarzane za pomocą sposobu według wynalazku.

Sposób wytwarzania związku kryptoficynowego według wynalazku obejmuje następujące etapy: selekcji allilowo podstawionego E-alkenu; przegrupowania allilowo podstawionego E-alkenu na drodze stereospecyficznego przegrupowania Wittiga; konwersji tego związku do pierwszego δ-aminokwasu lub δ-hydroksykwasu; sprzęgania pierwszego kwasu z drugim α-aminokwasem z wytworzeniem pierwszej podjednostki; sprzęgania trzeciego β-aminokwasu z czwartym α-hydroksykwasem lub α-aminokwasem z wytworzeniem drugiej podjednostki; i sprzęgania pierwszej podjednostki z drugąpodjednostkąz wytworzeniem kryptoficyny.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób wytwarzania związku kryptoficynowego, przedstawionego wzorem strukturalnym:

w którym:

Ri oznacza halogen, grupę SH, grupę aminową monoalkiloaminową dialkiloaminową trialkiloamoniową alkilotiolową dialkilosulfoniową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla, siarczanową lub fosforanową

R₂ oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć pierścień epoksydowy, pierścień azyrydynowy, pierścień episiarczkowy, pierścień siarczanowy lub pierścień monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Cis a C|₉;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają. H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a Ci₄;

Re oznacza grupę benzylową hydroksybenzylową alkoksybenzylową halogenohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

Y i X niezależnie od siebie oznaczają O, NH lub grupę alkiloaminową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla;

185 949 polega na tym, że obejmuje następujące etapy:

- przegrupowania allilowo podstawionego E-alkenu o wzorze:

w którym X i R3 mają znaczenia podane powyżej, na drodze stereospecyficznego przegrupowania Wittiga;

- konwersji tak otrzymanego związku do pierwszego δ-aminokwasu lub 5-hydroksykwasu mającego następujący wzór strukturalny:

w którym Ar, X i R3 mają znaczenia podane powyżej,

- sprzęgania powyższego pierwszego δ-aminokwasu lub δ-hydroksykwasu z drugim α-aminokwasem z wytworzeniem pierwszej podjednostki o następującym wzorze strukturalnym:

w którym X, Ar, R3 i R$ mają znaczenia podane powyżej, a P oznacza grupę zabezpieczającą;

- sprzęgania trzeciego β-aminokwasu z czwartym α-hydroksykwasem lub a-aminokwasem z wytworzeniem drugiej podjednostki o następującym wzorze strukturalnym: i z^0H

O

*9 ^R1Ó Ry

NHP r₈ w którym R7, Rg, R9 i Rio mają znaczenia takie jak podane powyżej, a P oznacza grupę zabezpieczającą; i

- sprzęgania pierwszej podjednostki z drugą podjednostką z wytworzeniem związku kryptoficynowego o wzorze strukturalnym

185 949 w którym X, Ar, R₃, Re, R7, Rs, R9 i Rio mają znaczenia takie jak podane powyżej;

i w razie potrzeby, przekształcenie w znany sposób jednego lub obu wiązań podwójnych węgiel-węgiel powyższego związku kryptoficynowego do związku kryptoficynowego o poniższym wzorze strukturalnym:

X^O HN^^Re rJT t r₇ r₈ w którym X, Ar, Rj, R₂, R₃, R4, R5, Re, R7, R₈, R₉ i Rio mają znaczenia takie jak podane powyżej.

Sposób wytwarzania związków kryptoficynowych jest przedstawiony na schemacie 1 na figurze 5. Substancją wyjściową jest 3E-alken (a) podstawiony przy C-2 grupą XH w konfiguracji S, gdzie X oznacza tlen lub NH. Jako tanie źródło substratu (a) służą L-alanina i kwas L-mlekowy. Kluczowym etapem syntezy jest stereoselektywne [2,3] przegrupowanie Wittiga (D.J-S. Tsai iwspółpr., J. Org. Chem. 1984, 49:1842-1843; K. Mikami i współpr., Tetrahedron 1984, 25:2303-2308; N. Sayo i współpr., Chem. Lett. 1984, 259-262) eteru propargilowego a (b) do (3R,4R)-3-(XH-podstawionego)-4-alkilohept-5(E)-en-l-ynu (c), gdzie X oznacza tlen lub zabezpieczony azot (na przykład grupą t-butylodimetylo-sililoaminową). Związek c może być następnie przekształcony do δ-hydroksy- lub aminokwasowej jednostki A prekursora kryptoficyny, (5S,6R)-5-(XP-podstawionego)-6-alkilo-8-arylo-okta-2E,7Edienoesanu (d), gdzie P oznacza odpowiednią grupę zabezpieczającą przy użyciu sposobów znanych specjalistom.

Jedną ze strategii syntezy kryptoficyny, która składa się z δ-hydroksy lub aminokwasowej jednostki A, α-aminokwasowej jednostki B, β-aminokwasowej jednostki C oraz z a-hydroksy lub aminokwasowej jednostki D, jest złożenie makrocyklu z dwóch prekursorów ugrupowań cząsteczki kryptoficyny, na przykład prekursora A-B (e) zawierającego δ-hydro-ksy lub aminokwasową jednostkę A i α-aminokwasową jednostkę B oraz prekursora C-D (ή zawierającego βaminokwasową jednostkę C oraz α-hydroksy lub aminokwasowąjednostkę D.

W sposobie opisanym tutaj, kryptoficyna zostaje utworzona z prekursorów A-B i C-D w dwu etapach poprzez (1) połączenie fragmentów końcowych jednostek A iD w prekursorach A-B i C-D co prowadzi do powstania acyklicznej pochodnej pośredniej C-D-A-B, a następnie (2) połączenie fragmentów końcowych jednostek B i C, co prowadzi do powstania produktu cyklicznego.

Podczas syntezy Kryptoficyny 51 opisanej w części doświadczalnej, tworzy się wiązanie estrowe pomiędzy grupą δ-hydroksylową jednostki A ugrupowania A-B oraz grupą kwasu karboksylowego jednostki D we fragmencie C-D, co prowadzi do utworzenia acyklicznej pochodnej pośredniej C-D-A-B, a następnie tworzone jest wiązanie amidowe pomiędzy grupą karboksylową jednostki B w ugrupowaniu A-B a grupą β-aminową jednostki C w ugrupowaniu C-D. Związek K jest prekursorem ugrupowania A-B, związek P jest prekursorem ugrupowania C-D, a związek R jest acyklicznym prekursorem C-D-A-B Kryptoficyny 51. Związki K i P mają grupy ochronne na grupie kwasu karboksylowego jednostki B oraz grupie β-aminowej jednostki C, aby ograniczyć tworzenie się wiązania estrowego pomiędzy jednostkami A i D podczas etapu 1. Te grupy ochronne są następnie usuwane z pochodnej pośredniej

185 949

C-D-A-B, tak że w etapie 2 może zachodzić tworzenie się wiązania amidowego pomiędzy jednostkami B i C.

Synteza (5S,6R)-5-t-butylodimetylosililoksy-6-metylo-8-fenylookta-2E,7E-dienoesanu metylu (G), jednostki A prekursora Kryptoficyny 51, przedstawiona jest na schemacie 2 (figura 6). Materiał wyjściowy, (S)-trans-3-penten-2-ol (A), przygotowano poprzez enzymatyczny rozdział racematu. W reakcji A z chlorkiem propargilu i zasadą w warunkach przeniesienia fazowego utworzył się eter propargilowy B z wydajnością 86%. Działanie na B butylołitem w temp. -90°C doprowadziło do utworzenia alkoholu C z wydajnością 71%. Pożądany 3R,4R-anti związek C był jedynym produktem tworzącym się w reakcji przegrupowania Wittiga. Po zabezpieczeniu grupy hydroksylowej C jako eteru tert-butyldimetylosililowego (lub eter tertbutyldimetylosililu), hydroborowanie wiązania potrójnego (H.C. Brown, Organie Synthesis via Boranes, Wiley, 1975) doprowadziło do otrzymania aldehydu D z C z wydajnością 73%. Następnie D został przekształcony do formy trans α,β-nienasyconego estru E za pomocą reakcji Homera-Emmonsa z wydajnością 90%. Wybiórcza ozonoliza podwójnego wiązania C6-C7 w D dała aldehyd F z wydajnością 83%. W końcu, reakcja Wittiga pomiędzy F i chlorkiem benzylotrifenylofosfoniowym w obecności butylolitu dała produkt G z wydajnością 80%. Wydajność od etapu G do A wyniosła 26%.

Połączenie jednostki A prekursora G z D-3-(3-chloro-4-metoksyfenylo)alaninową jednostką B z wytworzeniem prekursora A-B (K) przedstawiono na schemacie 3 (figura 7). Hydroliza metylowej grupy estrowej w G za pomocą wodorotlenku litu w acetonie pozwoliła uzyskać kwas karboksylowy H z wydajnością 95%. Połączenie H z trichloroetylowym estrem I z wytworzeniem J może być przeprowadzone z wydajnością 65% poprzez traktowanie roztworu H w Ν,Ν-dimetyloformamidzie (DMF) za pomocą małego nadmiaru pentafluorofenylodifenylofosfmianu (FDPP), równomolowej ilości soli trifluorooctanowej I a następnie 3 równoważnikami diizopropyloetylaminy (DIEA) w 25°C (S. Chen i wsp., Tetrahedron Lett. 1991, 32:6711-6714). Następnie, fluorodesililacja J prowadzi do uzyskania K z wydajnością 95%.

Zawierający grupę ochronną aminokwas I otrzymano z D-tyrozyny w pięciu etapach. Najpierw D-tyrozynę chlorowano za pomocą chlorku sulfurylu w lodowatym kwasie octowym (R. Zeynek, Hoppe-Seyler's Z. f. PhysioL Chemie 1926, 144:147-254). Następnie, otrzymano N-(tert-butoksykarbonylo)-3-(3-chloro-4-hydroksyfenylo)-D-alaninę z wydajnością 94% przez traktowanie zawiesiny aminokwasu w 50% wodnym dioksanie za pomocą dwuwęglanu di-tert-butylu w obecności trietyloaminy. Otrzymany produkt poddano dimetyłacji za pomocą siarczanu dimetylu w obecności węglanu potasu we wrzącym acetonie, a wydajność procesu wynosiła 84%. Ester metylowy został następnie zmydlony za pomocą wodorotlenku sodu w wodnym dioksanie i otrzymano N-(tert-butoksykarbonylo)-3-(3-chloro-4-metoksyfenylo)-D-alaninę z wydajnością 86%. Ekspozycja aminokwasu z grupą zabezpieczającą BOĆ na działanie trichloroetanolu, pirydyny i DĆC w dichlorometanie pozwoliła otrzymać ester trichloroetylowy I z wydajnością 65%. Traktowanie tego materiału za pomocą kwasu trójfluorooctowego doprowadziło do otrzymania soli trójfluorooctanowej I z wydajnością ilościową. Synteza kwasu(2S)-2-[3'(tert-butoksykarbonylo)amino-2',2'-dimetylopropanoilooksy]-4-metylopentanowego (P), prekursora C-D, przedstawiona jest na schemacie 4 (figura 8). Punktem wyjścia dla syntezy jednostki C z fragmentu P był aminoalkohol L. Zabezpieczenie grupy aminowej w L przez działanie za pomocą dwuwęglanu di-tert-butylu w obecności trój etyloaminy (93% wydajności) a następnie przez utlenianie pierwszorzędowego alkoholu za pomocą czterotlenku rutenu (P.H.J. Carlsen i wsp., J. Org. Chem. 1981, 46:3936-3938) dało kwas karboksylowy (wydajność 66%). Kwas L-leucynowy przekształcono do estru allilowego N z wydajnością 93% w warunkach katalizy przeniesienia fazowego poprzez jego ekspozycję na działanie mieszaniny bromku allilu w dichlorometanie i wodnego roztworu wodorowęglanu sodu zawierającego chlorek tetra-n-butyloamonu (S. Friedrich-Bochnitschek i wsp., J. Org. Chem. 1989, 54:751-756). Reakcję połączenia M zN przeprowadzono za pomocą 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) i dicykloheksanokarbodiimidu (DCC) w dichlorometanie, otrzymując O z wydajnością 75%. Odszczepienie estru allilowego w O zostało przeprowadzone w THF zawierającym morfolinę i katalityczną tetrakis-(trifenylfosfino)platynę i otrzymano P z wydajnością 95% (P.D. Jeffrey i wsp., J. Org. Chem. 1982, 47:587-590).

185 949

Połączenie prekursora A-B (K) i prekursora C-D (P) zostało przeprowadzone jak pokazano na schemacie 5 (figura 9). Traktowanie K i P za pomocą DCC/DMAP w dichlorometanie pozwoliło otrzymać całkowicie zabezpieczoną pochodną C-D-A-B (Q) z wydajnością 84%. Redukcyjne odszczepienie grupy estru trichloroetylowego w Q zostało przeprowadzone przez zastosowanie pyłu cynkowego w kwasie octowym. Grupa zabezpieczająca BOC została następnie usunięta za pomocą kwasu trójfluorooctowego i otrzymano R w postaci soli trójfluorooctanowej z 91% wydajnością w odniesieniu do Q. Makrolaktamizacja R za pomocą FDPP prowadzi do otrzymania Kryptoficyny 51 z wydajnością 61% (J. Dudash, Jr. i wsp., Synth. Commun. 1993, 23:349-356). Całkowita wydajność począwszy od S-trans-3-penten-2-ol (A) wynosiła 7%.

Kryptoficyna 51 służyła jako prekursor Kryptoficyny 52, R,R-epoksydu, i Kryptoficyny 53, S,S-epoksydu. Z kolei Kryptoficyna 52 służyła jako perkursor Kryptoficyny 55, 18R,19S-chlorohydryny, i Kryptoficyny 57, analogu 13,14-dihydro. Kryptoficyna 57 służyła jako prekursor Kryptoficyny 58. Kryptoficyna 53 służyła jako prekursor Kryptoficyny 61 przy zastosowaniu metody opisanej przez T.H. Chan i J.R. Finkenbine, J. Am. Chem. Soc. 1972, 94:2880-2882 oraz Kryptoficyny 97 stosując metodę podaną przez Y. Ittah i wsp., J. Org. Chem. 1978, 43:4271-4273.

Do syntezy kryptoficyn, które mają grupy Ar inne niż fenyl, prekursory jednostki A o ogólnej strukturze d (schemat 1, R₃ = Me) można wytworzyć za pomocą reakcji Wittiga pomiędzy aldehydem F (schemat 2; grupa zabezpieczająca TBS) lub S (schemat 6; grupa zabezpieczająca TBPS) a odpowiednim chlorkiem arylotrifenylofosfonianowym w obecności butylolitu. Kryptoficynę 81 otrzymano z prekursora d (Ar = p-metoksyfenyl, R₃ = Me) jak pokazano na schematach 6 i 7 (figury 10 i 11).

Grupa Ar może być także wprowadzona do nowej kryptoficyny w późniejszym etapie syntezy. Prekursor D (Ar = R₃ = Me) przekształcono najpierw do Kryptoficyny 82 przez połączenie odpowiednich prekursorów A-B (e) i C-D (f) jak pokazano na schemacie 8 (figura 12). Selektywna ozonoliza Kryptoficyny 82 lub utlenianie kwasem nadjodowym odpowiadających epoksydów Kryptoficyn 90 i 91 prowadzi do otrzymania aldehydu, Kryptoficyny 108. Reakcja Wittiga Kryptoficyny 108 z odpowiednim chlorkiem arylotrifenylofosfoniowym w obecności butylolitu daje nową kryptoficynę (schemat 9; figura 13). Stosując tę procedurę otrzymano Kryptoficynę 110 (Ar = p-fluorofenyl), Kryptoficynę 111 (Ar = p-tolil), Kryptoficynę 112 (Ar = 2-tienyl) i Kryptoficynę 124 (Ar = p-chlorofenyl). Kryptoficyna 110 służyła jako prekursor epoksydowych Kryptoficyn 115 i 116. Kryptoficyna 111 służyła jako prekursor epoksydowych Kryptoficyn 117 i 118 oraz chlorohydrynowych Kryptoficyn 128, 130 i 131. Kryptoficyna 112 służyła jako prekursor epoksydowych Kryptoficyn 119 i 120. Kryptoficyna 124 służyła jako prekursor epoksydowych Kryptoficyn 125 i 126 oraz chlorohydrynowych Kryptoficyn 132, 133 i 134.

Inną strategią przy syntezie kryptoficyny jest złożenie makrocyklu z trzech prekursorów, na przykład prekursora A-B (e) zawierającego δ-hydroksy lub aminokwasową jednostkę A, prekursora zawierającego δ-hydroksy lub aminokwasową jednostkę D oraz prekursora zawierającego β-aminokwasowąjednostkę C. W metodzie opisanej tutaj, kryptoficyna jest składana z prekursorów A-B, C i D w trzech etapach poprzez (1) połączenie fragmentów końcowych jednostek A i D w prekursorach A-B i D z wytworzeniem acyklicznej pośredniej pochodnej D-A-B, (2) połączenie końców jednostek D i C w prekursorach D-A-B i C z wytworzeniem acyklicznej pośredniej pochodnej C-D-A-B, i (3) połączenie końców jednostek B i C z wytworzeniem produktu cyklicznego.

Przy syntezie Kryptoficyny 121 opisanej w części eksperymentalnej, wiązanie estrowe utworzone zostaje pomiędzy grupą δ-hydroksylową jednostki A w reszcie A-B i grupą kwasu karboksylowego jednostki D we fragmencie D z utworzeniem pochodnej acyklicznej D-A-B. Następnie pomiędzy grupą kwasu karboksylowego jednostki C i grupą α-aminową jednostki D we fragmencie D-A-B jest tworzone wiązanie amidowe. Na końcu tworzy się wiązanie amidowe pomiędzy grupą kwasu karboksylowego jednostki B w reszcie A-B i β-aminową grupą jednostki C w reszcie C-D. Związek K jest prekursorem reszty A-B, bezwodnik BOC-L-leucynyjest prekursorem jednostki D i związek AL jest prekursorem jednostki C. Związek

185 949

AK jest acyklicznym prekursorem C-D-A-B Kryptoficyny 121 (schemat 10; figura 14). Związki K i bezwodnik BOC-L-leucyny mają grupy zabezpieczające przy grupie kwasu karboksylowego jednostki B i grupie α-aminowej jednostki D, aby ograniczyć tworzenie się wiązania estrowego pomiędzy jednostkami A i D w etapie 1. Grupa zabezpieczająca jest usuwana z grupy δ-aminowej jednostki D w pochodnej D-A-B tak, że tworzenie amidu może zachodzić pomiędzy grupą aminową w jednostce B i kwasem karboksylowym C w etapie 2. Te grupy zabezpieczające są usuwane z pochodnej C-D-A-B tak, że w etapie 2 pomiędzy jednostkami B i C może zachodzić tworzenie amidu.

Nowe związki kryptoficynowe według wynalazku mają pierścienie epoksydowe, które są otwierane przez nukleofile z inną szybkością aniżeli epoksydowy pierścień w Kryptoficynie 1, albo też mają chlorohydrynowe grupy funkcyjne, które tworzą pierścienie epoksydowe z innymi szybkościami niż gdy chlorohydrynowa grupa funkcyjna Kryptoficyny 8 jest przekształcana do pierścienia epoksydowego Kryptoficyny 1. Epoksydowy pierścień Kryptoficyny 1 albo chlorohydrynowa grupa funkcyjna (zamaskowany pierścień epoksydowy) Kryptoficyny 8 są zasadnicze dla optimum czynności in vivo. Jeśli tlen z epoksydu zostanie usunięty (tak jak to jest w Kryptoficynie 3) lub gdy pierścień epoksydowy zostanie zhydrolizowany do diolu (tak jak to jest w Kryptoficynie 15) wówczas czynność przeciwnowotworowa jest znacznie zmniejszona. Kryptoficyna 1 wykazuje znaczną toksyczność dla zwierząt w porównaniu z Kryptoficyną 8. Jest to odzwierciedlone wskaźnikiem T/C (w większości >0%) i logarytmem współczynnika śmiertelności log kill (w większości <2,0) dla Kryptoficyny 1 w porównaniu ze wskaźnikami dla Kryptoficyny 8 (w większości wartości T/C 0%, a wartości logarytmu współczynnika śmiertelności >2,8). Kryptoficyna 25, odpowiedni analog bromohydrynowy), wykazuje T/C i wartości logarytmu śmiertelności, które są porównywalne z tymi dla Kryptoficyny 1. Ta uderzająca różnica w aktywności in vivo sugeruje, że bromohydrynowa Kryptoficyna 25 jest przekształcana in vivo szybciej do Kryptoficyny 1 aniżeli Kryptoficyna 8. To sugeruje dalej, że mniej toksyczna Kryptoficyna 8 może mieć więcej czasu do kumulowania się w miejscu guza zanim ulegnie przekształceniu do aktywnej postaci Kryptoficyny 1. Grupa epoksydowa Kryptoficyny 1 prawdopodobnie wiąże się kowalencyjnie z jej receptorem docelowym na komórce rakowej. Nowe kryptoficyny według wynalazku mogą potencjalnie posiadać lepszą aktywność in vivo aniżeli Kryptoficyna 1 i Kryptoficyna 8 poprzez wykazywanie bardziej korzystnych szybkości tworzenia in vivo epoksydu z odpowiednich chlorohydrynowych pro-leków i poprzez kowalentne wiązanie do receptora docelowego na komórce rakowej.

Związki według wynalazku są bardziej odporne na hydrolizę i solwolizę aniżeli Kryptoficyny 1 i 21. Wiązanie estrowe łączące jednostki C iD w Kryptoficynie 1 jest relatywnie wrażliwe na hydrolizę w warunkach umiarkowanie zasadowych, jego rozszczepienie w pH 11 do hydroksykwasu zachodzi z półokresem 0,83 godziny. Wiązanie estrowe reszty C-D Kryptoficyny 21, która nie ma grupy metylowej na C-2 w jednostce C, rozrywa się szybciej z półokresem 0,25 godziny. Wiązanie estrowe w C-D jest także wrażliwe na solwolizę. Kiedy w procedurze izolacji stosuje się metanol, toficyna 21 jest dużo bardziej podatna na metanolizę aniżeli Kryptoficyna 1. Kryptoficyna 1 wykazuje czynność przeciwnowotworową podczas gdy Kryptoficyna 21 jest nieaktywna prawdopodobnie z tego powodu, że wiązanie estrowe C-D Kryptoficyny 21 ulega hydrolizie in vivo szybciej niż wiązanie estrowe C-D Kryptoficyny 1. Hydroliza wiązania estrowego C-D może także po części wyjaśniać zmniejszoną czynność Kryptoficyny in νϊνο 1 po dootrzewnowym i podskórnym podaniu leku. Wiązanie estrowe C-D kryptoficyn posiadających dwie grupy metylowe na C-2 w jednostce C-2, tak jak to występuje w Kryptoficynie 52, jest stabilne w pH 11.

Związki według wynalazku oraz poprzednio ujawnione związki kryptoficynowe mogą być wykorzystane terapeurycznie jako środki przeciwnowotworowe do leczenia chorób nowotworowych. Użyty tu termin „nowotworowy” odnosi się do nowotworu, który wykazuje nienormalnie duży przyrost taki, jaki następuje na wskutek proliferacji komórek nie poddających się zwykłym czynnikom limitującym wzrost. Jak to jest użyte tutaj, „czynnikiem przeciwnowotworowym” jest każdy związek, kompozycja, mieszanina lub mieszanka, która hamuje, eliminuje, zwalnia lub odmienia nowotworowy fenotyp komórki.

185 949

Zatem przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do hamowania proliferacji hiperproliferacyjnych komórek ssaczych, zawierająca skuteczną ilość związku o wzorze strukturalnym:

w którym:

Ar oznacza grupę fenylową lub grupę tienylową, które są niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla lub atomami halogenu;

R₂ oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Cb a C19;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a Cją

Ró oznacza grupę benzylową hydroksybenzylową alkoksybenzylową halogenohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

z wyłączeniem związków, w których co najmniej jeden z R7 i Rg oznacza H,

X i Y oba oznaczają O, a Ar oznacza fenyl, oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

W szczególnym wykonaniu kompozycja dodatkowo zawiera co najmniej jeden środek przeciwnowotworowy.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku kryptoficynowego o wzorze strukturalnym:

185 949

w którym:

R₂ oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Cis a C19;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a C14;

R6 oznacza grupę benzylową hydroksybenzylową alkoksybenzylową halogenohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

z wyłączeniem związków, w których co najmniej jeden z R7 i Rg oznacza H,

X i Y oba oznaczają O, a Ar oznacza fenyl, do wytwarzania leku do hamowania proliferacji komórek ssaczych i leczenia chorób spowodowanych przez proliferujące komórki ssacze.

W szczególności zastosowanie obejmuje hamowanie hiperproliferacyjnych komórek ssaczych.

W szczególności komórkami są komórki ludzkie.

Zastosowanie obejmuje wytwarzanie leku zawierającego dodatkowo co najmniej jeden dodatkowy środek przeciwnowotworowy.

Zastosowanie jest szczególnie korzystne w przypadku gdy choroba charakteryzuje się tworzeniem nowotworów.

W szczególności choroba jest wybrana z grupy składającej się z raka sutką małokomórkowego raka płuc, niemałokomórkowego raka płuc, raka okrężnicy, białaczki, czemiaką gruczolakoraka trzustki, raka ośrodkowego układu nerwowego (OUN), raka jajniką raka prostaty, mięsaka tkanki miękkiej lub kości, raka głowy i szyi, raka gastrycznego, w tym raka trzustki i przełyku, raka żołądką szpiczaką raka pęcherzą raka nerek, raka układu neuroendokrynologicznego, w tym raka tarczycy i choroby Hodgkin'a oraz nowotworowej choroby Hodgkin'a.

185 949

W jednym z wariantów zastosowania lek jest przeznaczony do podawania w połączeniu z co najmniej jedną dodatkową terapią skierowaną na poprawą choroby.

Obecnie do leczenia raka stosowane są chemioterapia, chirurgia, radioterapią terapia za pomocą modyfikatorów biologicznych oraz immunoterapia. Każdy sposób terapii posiada specyficzne, wskazania, które są znane osobom praktykującym w tej dziedzinie, i każdy z osobna sposób lub wszystkie mogą być zastosowane w usiłowaniu osiągnięcia całkowitego zniszczenia komórek nowotworowych. Niniejszy wynalazek dotyczy chemioterapii wykorzystującej jedną lub więcej kryptoficyn. Ponadto wynalazek dotyczy także złożonej chemioterapii i chemioterapii z wykorzystaniem kryptoficyn w połączeniu z innymi czynnikami przeciwnowotworowymi, jako że chemioterapia złożona jest w istocie bardziej skuteczna aniżeli zastosowanie pojedynczych czynników przeciwnowotworowych. Przeto, dalszy aspekt obecnego wynalazku obejmuje kompozycje zawierające terapeutycznie skuteczną ilość co najmniej jednego, nowego związku kryptoficynowego według wynalazku, łącznie z jego nietoksycznymi solami, co ma służyć wyżej wymienionym korzyściom terapeutycznym. Kompozycje te mogą także być stosowane razem z fizjologicznie tolerowalnym płynem, żelem lub stałymi nośnikami, rozpuszczalnikami, adjuwantami lub rozczynnikami. Takie nośniki, rozpuszczalniki, adjuwanty i rozczynniki są opisane w United States Pharmacopeia Vol. ΧΧΠ oraz w National Formulary Vol. XVH, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989).

Kompozycja farmaceutyczna użyta do leczenia choroby nowotworowej może dodatkowo zawierać co najmniej jeden związek kryptoficynowy i co najmniej jeden dodatkowy czynnik przeciwnowotworowy.

Czynnikami przeciwnowotworowymi, które mogą być zastosowane w połączeniu z kryptoficyną są te, które podano w The Merck Index, wydanie 11, Merck & Co., Inc. (1989) str. Ther 16-17. W innym wykonaniu wynalazku, czynnikami przeciwnowotworowymi mogą być antymetabolity, które obejmują między innymi takie związki jak metotreksat, 5-fluoro-uracyl, 6-merkaptopuryna, arabinozyd cytozyny, hydroksymocznik, oraz 2-chloro-dezoksyadenozyna. W innym wykonaniu obecnego wynalazku, możliwymi do zastosowania czynnikami przeciwnowotworowymi są czynniki alkilujące, które obejmują takie związki jak cyklofosfamid, melphalan, busulfan, paraplatyna, chlorambucil oraz azotowy kwas musztardowy. W dalszym wykonaniu obecnego wynalazku, czynnikami przeciwnowotworowymi są roślinne alkaloidy, które obejmują takie związki jak winkrystyna, winblastyną taksol oraz etopozyd. W dalszym wykonaniu obecnego wynalazku, możliwymi do zastosowania czynnikami przeciwnowotworowymi są antybiotyki, które mogą obejmować takie związki jak doksorubicyna (adriamycyna), daunorubicyną mitomycyna C oraz bleomycyna. W dalszym wykonaniu obecnego wynalazku, możliwymi do zastosowania czynnikami przeciwnowotworowymi są hormony, które obejmują związki nie tylko takie jak kalusteron, diomostawolon, propionian, epitiostanol, mepitistan, testolakton, tamoksyfen, fosforan poliestradiolu, octan megesterolu, flutamid, nilutamid oraz triotan. W innym wykonaniu obecnego wynalazku, możliwymi do zastosowania czynnikami przeciwnowotworowymi są enzymy, które obejmują takie związki jak Lasparaginaza lub pochodne aminokrydyny, jak amsakryna. Inne jeszcze czynniki przeciwnowotworowe obejmują te wymienione w Skeel, Roland T., „Antineoplastic Drugs and Biologie Response Modifier: Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agents”, Handbook of Cancer Chemotherapy (3 Wydanie), Little Brown & Co.(1991).

Związki kryptoficynowe i kompozycje według wynalazku mogą być aplikowane ssakom w praktyce weterynaryjnej, takim jak zwierzęta domowe, oraz użyte w klinice u ludzi w sposób podobny dla innych czynników terapeutycznych. Ogólnie, dawka potrzebna dla terapeutycznej skuteczności będzie się zmieniać w zależności od sposobu zastosowania i drogi aplikacji a także w zależności od szczególnych wymogów dla każdego z biorców leku. Zazwyczaj dawki będą się wahały od około 0,001 do 1000 mg/kg, najczęściej 0,01 do 10 mg/kg wagi ciała biorcy. Alternatywnie, dawki z tych zakresów mogą być podawane w postaci ciągłej infuzji przez dłuższy okres czasu zwykle przekraczający 24 godziny aż do czasu, gdy osiągnięty będzie pożądany efekt terapeutyczny. Rzeczywiście, dawka leku a także sposób jego aplikacji musi zostać wybrana na podstawie: względnej skuteczności, względnej tok

185 949 syczności, charakterystyki wzrostu guza oraz wpływu kryptoficyn na cykl komórkowy, farmakokinetyki leku, wieku, płci, warunków fizycznych pacjenta i wcześniejszego leczenia.

Związki kryptoficynowe z lub bez dodatkowych czynników przeciwnowotworowych mogą być formułowane jako terapeutyczne kompozycje w postaci naturalnej lub w postaci soli. Farmaceutycznie akceptowalne nietoksyczne sole obejmują sole zasadowe (tworzone na bazie wolnych grup karboksylowych lub innych grup anionowych), które mogą być wytworzone za pomocą nieorganicznych zasad takich jak na przykład wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia lub żelaza lub takich organicznych zasad jak izopropylamina, trimetyloamina, 2-etyloamino etanol, histydyna, prokaina i temu podobne. Sole te mogą także być utworzone przez dodanie kwasu z wolnymi grupami kationowymi i mogą generalnie być wytworzone za pomocą kwasów nieorganicznych jak na przykład kwas solny lub fosforowy lub za pomocą kwasów organicznych takich jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i tym podobne. Dodatkowymi rozczynnikami, które mogą być zastosowane w wynalazku są te osiągalne dla każdego obeznanego w dziedzinie jak na przykład te wymienione w United States Pharmacopeia Vol. ΧΧΠ oraz w National Formulary Vol. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989).

Stosowność poszczególnych nośników do zastosowania w danej terapeutycznej kompozycji zależy od zalecanego sposobu aplikacji. Na przykład, kompozycje przeciwnowotworowe mogą być formułowane do podania drogą doustną. Kompozycje takie są zwykle przygotowywane albo w postaci płynnego roztworu lub zawiesin lub też w postaciach stałych. Receptury do podania doustnego zawierają zwykle takie zazwyczaj wykorzystywane substancje dodatkowe jak czynniki wiążące, wypełniacze, nośniki, konserwanty, stabilizatory, emulgatory, bufory i rozczynniki, jak na przykład farmaceutycznej czystości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu i temu podobne. Takie kompozycje przyjmują postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu leku, lub proszków i zwykle zawierają l%-95% aktywnego składnika, korzystnie 2%-70%.

Kompozycje według obecnego wynalazku mogą także być przygotowane w postaci do iniekcji, jako płynne roztwory, zawiesiny lub emulsje; albo w postaci stałej nadającej się do przeprowadzenia w płynny roztwór lub zawiesinę przed podaniem na drodze iniekcji. Takie postaci do iniekcji mogą być podane podskórnie, dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, dokomorowo lub do opłucnej. Składnik lub składniki czynne są często mieszane z rozpuszczalnikami lub rozczynnikami, które są fizjologicznie tolerowane i kompatybilne ze składnikiem (składnikami) czynnym. Odpowiednimi rozpuszczalnikami lub rozczynnikami są na przykład woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol i temu podobne, lub ich mieszaniny. W dodatku, jeśli zachodzi potrzeba, kompozycje mogą zawierać małe ilości substancji pomocniczych takich jak czynniki zwilżające lub emulgujące, stabilizujące lub czynniki utrzymujące pH.

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania związków kryptoficynowych do hamowania proliferacji komórek ssaków na drodze kontaktu tych komórek ze składnikiem kryptoficynowym, który jest w ilości wystarczającej do zahamowania proliferacji komórki ssaka. Korzystną postacią jest sposób hamowania proliferacji hiperproliferacyjnych komórek ssaków. Dla celów tego wynalazku, „hiperproliferacyjne komórki ssaków” zdefiniowano jako te komórki ssaków, które nie posiadają charakterystyki ograniczenia wzrostu np. zaprogramowanej śmierci komórkowej (apoptoza). Dalsza korzystna postać dotyczy przypadku kiedy komórką ssaka jest komórka ludzka. Wynalazek dalej dotyczy kontaktu komórki ssaka z co najmniej jednym związkiem kryptoficynowym i co najmniej jednym, dodatkowym czynnikiem przeciwno wotworowym. Typy czynników przeciwnowotworowych możliwych do zastosowania są takie same jak te opisane tu powyżej.

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania związków kryptoficynowych objętych strukturą ogólną do hamowania proliferacji komórek hiperproliferacyjnych wykazujących fenotyp lekoopomości, w tym oporności wielolekowej, na drodze kontaktu takiej komórki ze związkiem kryptoficynowym, który jest w ilości wystarczającej do hamowania proliferacji komórek hiperproliferacyjnych. Korzystna postać dotyczy przypadku, kiedy komórką ssaka jest komórka ludzka. Wynalazek dalej dotyczy kontaktu komórki ssaka ze związkiem kryptoficynowym i co

185 949 najmniej jednym, dodatkowym czynnikiem przeciwnowotworowym. Typy czynników przeciwnowotworowych możliwych do zastosowania są takie same jak te opisane tutaj powyżej.

Związki według wynalazku znajdują zastosowanie do łagodzenia stanów patologicznych spowodowanych przez hiperproliferujące komórki ssaka, jak na przykład nowotwory, poprzez podanie organizmowi efektywnej ilości kompozycji farmaceutycznej opisanej tutaj powyżej w celu zahamowania proliferacji komórek hiperproliferujących. Użyty tu termin „stany patologiczne” dotyczy każdej patologii spowodowanej przez proliferację komórek ssaka, które nie poddają się zwykłym czynnikom regulującym wzrost komórkowy. Taka proliferacja komórek może zachodzić z powodu nowotworzenia łącznie z procesem nowotworzenia odnoszącym się do: raka sutka, małokomórkowego raka płuc, niemałokomórkowego raka płuc, raka jelita grubego i odbytu, białaczki, czerniaka, raka ośrodkowego układu nerwowego (OUN), raka jajnika, prostata, mięsaka tkanki miękkiej lub kości, raka głowy i szyi, raka żołądka łącznie z przełykiem i trzustką raka żołądka, szpiczaka, raka trzustki, pęcherza, raka nerki, rak neuroendokrynnego, który obejmuje raka tarczycy i gruczołów limfatycznych, raka typu non-Hodgkin's i Hodgkin's. W dalszej postaci wynalazku, komórkami nowotworowymi są komórki ludzkie. Obecny wynalazek dotyczy sposobu łagodzenia takich stanów patologicznych z wykorzystaniem kryptoficyny w połączeniu z innymi rodzajami terapii a także z innymi czynnikami przeciwnowotworowymi. Takie rodzaje terapii i ich adekwatność dla różnych stanów nowotworowych można znaleść w Cancer Principles and Practice of Oncology, Wydanie 4, Wydawcy: DeYita, V., Hellman, S., i Rosenberg, S., Lippincott Co.(1993).

Związki kryptoficynowe mają silne działanie rozrywające strukturę mikrotubuli w komórkach hodowlanych. W dodatku, i w odróżnieniu od alkaloidów uzyskiwanych z barwinka, związki kryptoficynowe wydają się być słabym substratem dla układu usuwającego lek, którym jest tzw. pompa P-glikoproteinowa. Kryptoficyna 1 jest główną cytotoksyną u alg błękit-no-zielonych (cyjanobakteria) z gatunku Nostoc sp. oznaczonego symbolem GSV 224 i wykazuje doskonałą czynność przeciwko rakom implantowanym myszom. Ten cykliczny didepsypeptyd został wcześniej wyizolowany z Nostoc sp. ATCC numer dostępu 53789, jako czynnik przeciwgrzybiczy a jego ogólna struktura została wówczas opisana. Względna i absolutna stereochemia tego potencjalnie ważnego leku została obecnie ustalona przez zastosowanie połączenia metod chemicznych i spektralnych. Dwadzieścia cztery inne związki kryptoficynowe, Kryptoficyny 2-7, 16-19, 21, 23, 24, 26, 28-31, 40, 43, 45, 49, 50 i 54 zostały także wyizolowane z GSV 224 a ich pełne struktury i właściwości cytotoksyczne zostały oznaczone. Opisano, zarówno chemicznie jak i farmakologicznie, kilka pochodnych i kilka produktów degradacji.

Następujące przykłady służą do zilustrowania niektórych korzystnych postaci i aspektów obecnego wynalazku. Nie ograniczają one zakresu wynalazku.

Część doświadczalna

W poniższej części eksperymentalnej wszystkie masy są podane w gramach (g), miligramach (mg), mikrogramach (pg), nanogramach (ng), pikogramach (pg), molach (mol) lub milimolach (mmol), wszystkie stężenia są wyrażone w postaci procentów objętościowych (%), w postaci stężeń molowych (M), milimolowych (mM), mikromolowych (pM), nanomolowych (nM), pikomolowych (pM) lub normalnych (N), wszystkie objętości podano w litrach (1), mililitrach (ml) lub mikrolitrach (pl) a pomiary liniowe wyrażono w milimetrach chyba, że podano w danym miejscu inaczej.

Następujące przykłady demonstrują syntezę związków kryptoficynowych jak również ich zastosowanie jako czynników terapeutycznych według obecnego wynalazku.

Podczas testowania ekstraktów z ponad gatunków 1000 alg błękitno-zielonych (cjanobakteria) pod względem czynności przeciwnowotworowej, lipofilny ekstrakt z Nostoc sp. GSV 224 okazał się silnie cytotoksyczny, wykazując maksymalne stężenie hamujące (MICs) 0,24 ng/ml względem KB, ludzkiej linii komórkowej raka jamy nosowogardłowęj, oraz 6 ng/mL względem LoVo, ludzkiej linii komórkowej raka adenokarcinoma okrężnicy i odbytu. Co ważniejsze, ekstrakt ten wykazywał znaczącą selektywność cytotoksyczną w teście Corcetta^4,5. Chromatografia na fazach odwróconych ekstraktu z alg, monitorowana za pomocą testu biologicznego, pozwoliła uzyskać frakcję, w której była głównie Kryptoficyna 1, silny

185 949 fungicyd, który wcześniej został wyizolowany zNostac sp. ATCC 53789 przez badaczy z firmy Merck , i który jest bardzo aktywny wobec linii Cryptococcus.

Kryptoficyna 1 odpowiada za większość cytotoksycznej aktywności obecnej w nieoczyszczonym ekstrakcie z Nostoc sp. GSV 224, zaś oczyszczony związek wykazuje wartości IC50 3 i 5 pg/mL wobec odpowiednio KB i LoVo. W teście Corbetta Kryptoficyna 1 wykazywała silną selektywność rakową i tę samą cytotoksyczność wobec lekoopomych i nie-lekoopomych komórek rakowych. Test immunofluorescencyjny wykazał, że Kryptoficyna 1 oddziaływuje z komórką docelową podobnie jak winblastyna ale różni się tym od niej, że ma dłuższy czas działania i nie tworzy parakrystalicznych strątów. We wstępnych doświadczeniach in vivo, Kryptoficyna wykazywała bardzo obiecującą aktywność wobec raków implantowanych myszom.

W Nostoc sp. GSV 224 obecne były niewielkie ilości kilku innych związków kryptoficynowych. Dwadzieścia jeden z nich można było wyizolować w wystarczających ilościach do określenia ich struktury i oceny in vivo właściwości przeciwrakowych przez zastosowanie ekstrakcji alg za pomocą mieszaniny dichlorometan/acetonitryl 1:5 i za pomocą chromatografii ekstraktu na fazach odwróconych. Kryptoficyny 2, 3, 4, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 40, 43, 45, 49, 50 oraz 54 towarzyszyły Kryptoficynie 1 we frakcji wyeluowanej z kolumny z fazami odwróconymi za pomocą mieszaniny acetonitryl/woda 65:35. Kryptoficyny 2, 3,4, 5, 6 i 7 były jedynymi związkami wykrytymi, podczas gdy algi ekstrahowano metanolem a chromatografia z odwróconymi fazami przeprowadzona była przy użyciu mieszaniny metanol/woda. Kryptoficyny 2, 3, 4, 5 i 6 eluowano za pomocą mieszaniny metanol/woda 1:3, zaś Kryptoficyna 7 została znaleziona we wcześniejszej, mniej cytotoksycznej frakcji eluującej się mieszaniną metanol/woda 1:3. Acykliczne Kryptoficyny 5,6 i 7 wydają się być artefaktami wytwarzanymi przez rozkład Kryptoficyny 1 podczas procesu izolacji.

Kryptoficyny 3 i 5 wydają się być identyczne z półsyntetycznymi fungicydowymi związkami otrzymanymi z Kryptoficyny 1 przez badaczy w firmie Merck^8,9. Kryptoficyna 3 została otrzymana poprzez traktowanie Kryptoficyny 1 za pomocą układu cynk-miedź albo za pomocą tetrajodku difosforu⁸. Kryptoficynę 5 otrzymano przez metanolizę Kryptoficyny l⁹.

Przykład 1. Badanie struktury

Badanie struktur nowych związków zostało przeprowadzone w nieskomplikowany sposób używając metodologii znanej dobrze tym, którzy są obeznani w tej dziedzinie. Dane spektroskopii masowej były zgodne ze składami molekularnymi. Dane z protonowego i węglowego NMR otrzymane z widm COSY, HMQC, HMBC i NOESY pozwoliły ustalić ogólne struktury tych związków typu depsypeptydowego. Obecność różnych hydroksy i aminokwasowych jednostek w każdym związku była potwierdzona za pomocą chromatografii gazowej i spektralnej analizy masowej. Kompletne struktury łącznie z kompletnymi danymi stereochemicznymi zostały określone stosując połączenie metod chemicznej degradacji i specjalnych technik analitycznych dla odpowiednich pochodnych kryptoficynowych związków.

Przykład 2. Zależności aktywność - struktura (SAR)

W celu ustalenia cech strukturalnych cech Kryptoficyny 1 potrzebnych do optymalnej czynności, wszystkie związki opisane tutaj zostały zbadane pod względem cytotoksyczności wobec linii komórkowych KB (ludzki rak jamy gardłowonosowej), LoVo (ludzki rak okrężnicy) oraz SKOV3 (ludzki rak jajnika). Wartości ICso podane są w tabelach 1 i 2. Porównanie cytotoksyczności wykazuje, że dla optimum cytotoksyczności niezbędne są w Kryptoficynie 1: nieuszkodzony pierścień makrolidu, grupy epoksy i metylowe oraz podwójne wiązanie w jednostce kwasu 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenowego (patrz, jednostka A na figurze 1), grupy chloro i O-metylowe w jednostce 3-(3-chloro-4-metoksyfenylo)alanina (jednostka B), grupa metylowa w jednostce kwasu 3-amino-2-metylo-propionowego (jednostka C) oraz grupa izobutylowa w jednostce kwasu leucynowego (jednostka D). Duża cytotoksyczność Kryptoficyny 8 jest najprawdopodobniej spowodowana grupą czynną chlorochydrynową która działa jako zamaskowany epoksyd.

Najbardziej aktywne związki zostały również zbadane w aspekcie selektywnej cytotoksyczności wobec czterech różnych typów komórek a mianowicie: mysia białaczka (L1210 lub 0388), lity mysi rak (adenokarcinoma okrężnicy 38, adenokarcinoma przewodu trzustkowego 03, adenokarcinoma sutka M16/M17, ludzki lity rak (okrężnica CX-1, HCT8, HI 16; płuca

185 949

Η125; sutek ΜΧ-1, MCF-7) oraz małej złośliwości linię fibroblastów (LML), za pomocą testu Corbetta , zmodyfikowany test dyfuzji płytkowej jaki stosowany jest powszechnie w testach bakteryjnych i grzybiczych. Pokazane w tabeli 1 wyniki wskazują że Kryptoficyny 1-5 i 8 nie były selektywne wobec litych guzów ani wobec białaczki ale raczej tak samo aktywne wobec linii komórek rakowych łącznie z liniami lekoopomymi jak Ml7. Żaden ze związków nie wykazywał strefy hamowania dla żadnej linii komórkowej litych guzów, która wynosiłaby 250 jednostek strefowych, tzn. 7,5 mm, więcej niż dla strefy hamowania dla linii komórkowej białaczki. Kryptoficyny 1-5 i 8 wykazywały jednakowoż dużo większe strefy hamowania (400 jednostek strefowych) wobec wszystkich rakowych linii komórkowych w porównaniu ze strefą hamowania wobec fibroblastycznej linii LML. Diagnostycznie linia LML okazuje się wykazywać behawior bardziej podobny do normalnych komórek niż do komórek rakowych w odniesieniu do klinicznie użytecznych czynników cytotoksycznych (patrz, dane z testu Corbetta dla 5-fluorouracylu, etopozydu itaxolu, w tabeli 1). Jako, że różnicowe cytotoksyczności wynosiły > 250 jednostek strefowych, Kryptoficyny 1-5 i 8 wykazywały selekrywność rakową. Związki te przeto zostały kandydatami do testowania in vivo.

Kryptoficyna 1 jest aktywna wobec szerokiego spektrum mysich i ludzkich raków implantowanych myszom łącznie z tymi, które są lekoopome (tabela 3). Wykazuje ona doskonałą aktywność wobec pięciu wczesnych raków mysich, a mianowicie adenokarcinomy okrężnicy #38 i #51, wrażliwych i nie wrażliwych na taksol raków sutka #16/C/RP, oraz adenokarcinomy przewodu trzustkowego #03, oraz dwu wczesnych ludzkich raków testowanych na myszach SCID, a mianowicie raki ΜΧ-1 piersi ΪΗ125 płuc, które wykazują wartości współczynnika ciężar raka T/C (ciężar raka u nieleczonych zwierząt/ciężar raka zwierząt leczonych) mniejsze niż 10%.

Wartości wskaźnika T/C mniejsze niż 42% uważa się jako aktywne według standardów NCI; wartości T/C mniejsze niż 10% uważa się za doskonale aktywne i posiadające potencjalną aktywność kliniczną według standardów NCI⁴. Dwa spośród testów wykazywały wartości wskaźnika „gross log kill” 2,0. Wskaźnik „gross log kill” zdefiniowany jest jako TC/3,2Td gdzie T jest to mediana czasu wyrażona w dniach dla raków w grupie leczonej potrzebnego do osiągnięcia ciężaru guza 750 mg, C jest to mediana czasu wyrażona w dniach dla raków w grupie kontrolnej potrzebnego do osiągnięcia ciężaru guza 750 mg, zaś Td jest to czas potrzebny do podwojenia objętości raka. Wartości wskaźnika „gross log kill” > 2,8, 2,02,8, 1,3-1,9, 0,5-0,8 i < 0,5 przy czasie podawania leku 5-20 dni zostały oznaczone kolejno ++++, +++, ++, + oraz - (nieaktywny). Oszacowanie aktywności na +++ do ++++, co jest wskaźnikiem aktywności klinicznej, jest konieczne by spowodować częściową lub całkowitą regresję większości transplantowanych myszom litych raków o ciężarze 100 - 300 mg.

Kryptoficyna 8 jest także aktywna wobec szerokiego spektrum raków implantowanym myszom (tabela 4). Wykazuje one doskonałą aktywność wobec wszystkich raków testowanych dotąd i wykazuje wartości współczynnika T/C <10% i, co najważniejsze, oceny aktywności według wskaźnika „ gross log kill” od +++ do ++++ oraz pewien stopień uleczeń.

Dobrą aktywność in vivo obserwowano także dla Kryptoficyny 35 podczas jednej próby, która została jak dotąd przeprowadzona.

Letalna toksyczność obserwowana była podczas testowania Kryptoficyn 1 i 8 i była ona związana z leukopenią która występuje zwykle przy stosowaniu w klinice leków przeciwrakowych.

Przykład 4. Dane spektralne dla Kryptoficyn 1 -7

Czcionka italic w danych spektralnych odnosi się do jednostek A-D na fig. 1.

Kryptoficyna 1

[a]_D +33,8° (MeOH, c 1,83); UV λ^ε) 208(42, 400), 218(33, 700), 228(23, 800), 2802, 210); CD[0]₂₀₂+l 5,900, [0]₂₀₆+64,900, [0]₂i₄+26,900, [0^+46,300, [0]₂₃₇+l 0,500. IR (CHC1₃) ν,™ 3425, 2963, 1751, 1719, 1677, 1502, 1259 cm.-¹. EIMS m/z (wzgl.intensywność) 654/656(20/9), 412/414(33/12), 280/282(31/12), 227(80), 195/197 (92/44), 91 (100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 654,2665 (wyliczone dla C₃5H4₃C1N₂O₈, błąd 4,3 mmu).

*H NMR(CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylooktenowy (A) 5,74(2dt; 15,5

185 949 i 0,9), 6,68(3ddd; 15,5, 9,6 i 5,2), 2,45(4ddd; 14,2, 11,1 i 9,6), 2,55(4, brdd; 14,2 i 5,2), 5,16(5ddd; 11,1,4,9 i 1,9), 1,80(6, m), l,14(6-Me, d; 7,1), 2,92(7, dd; 7,5 i 2,0), 3,69(8, d; 2,0), 7,25(10/14, m), 7,34-7,39(11/12/13, m); kwas leucynowy (D) 4,83(2, dd; 6,8 i 3,3), 1,70(3, m), 1,36(3, m), 1,74(4, m), 0,86(5, d; 6,6), 0,85(4-Me, d; 6,6); kwas 3-amino-2metylopropionowy C 2,71(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,1), 3,30(3, ddd; 13,4, 5,8 i 3,8), 3,48(3, ddd; 13,4, 6,3 i 5,8), 6,93(3-NH, brt; 5,8); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,80(2, ddd; 8,7, 7,3 i 5,4), 5,61(2-NH, d; 8,7), 3,03(3, dd; 14,4 i 7,3), 3,13(3, dd; 14,4 i 5,4), 7,21(5, d; 2,1), 3,87(7-OCH₃, s), 6,83(8, g; 8,5), 7,07(9, dd; 8,5 i 2,1).

¹³C NMR(CDC1₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,3(1), 125,3(2), 141,0(3), 36,7(4), 76,2(5), 40,6(6), 13,5(6-Me), 63,0(7), 59,0(8), 136,7(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,5 (12); D 170,7(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,5(4), 22,9(5), 21,3(4-Me); C 175,6(1), 38,2(2), 14,1(2Me), 41,1(3); B170,9(l), 53,6(2), 35,0(3), 129,7(4), 131,0(5), 122,4(6), 154,0(7), 56,1(7OCH₃), 112,2(8), 128,4(9).

Kryptoficyna 2

[a]_D +20,4° (MeOH, c 0,54); UV Z,_max(s) 206(43,800), 218(37,500), 232(22,900), 278(2,410); CD[0]₂₀₃+54,100, [θ]₂₎₂+16,500, [θ]₂₂₅+53,600, [θ]₂₃₆ -14,000. IR (CHC1₃) v_max3423, 3029, 296L 1741, 1724, 1678, 1512, 1258 cm’¹. EIMS m/z (wzgl.intensywność, przypisanie) 620(11,M⁺), 431(3), 378(8), 377(6), 311(11), 246(10), 244(8), 227(14), 195(17), 161(84, CH₃O-C₆H₄-CH=CH=CO ), 121(79,CH₃O-C₆H4-CH₂ ⁺), 91(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 620,3094 (wyliczone dla błąd 0,3 mmu); 161,0605 (wyliczone dla CipH9O₂, błąd -0,2 mmu); 121,0658 (wyliczony dla CsHgO, błąd -0,4 mmu).

Ή NMR(CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgła, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenowy (A) 5,71(2, dd; 15,5 i 1,3), 6,70(3, ddd; 15,4, 10,2 i 5,0), 2,45(4, m), 2,55(4, m), 5,18(5, ddd; 11,3, 4,8 i 2,0), l,79(6,m), l,14(6-Me, d; 7,0), 2,92(7, dd; 7,7 i 2,0), 3,86(8, d; 2,0), 7,24(10/14, m), 7,347,39(11/12/13, m); kwas leucynowy (D) 4,82(2, dd; 10,1 i 3,7), 1,70(3, m), 1,33(3, m), 1,70(4, m), 0,86 (5, d; 6,4), 0,84 (4-Me, d; 6,4); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,68(2, m), 1,23(2-Me, d; 7,3), 3,39(3-H₂, m), 7,02(3-NH, brt; 6,0); O-metylotyrozyna (B)4,79 (2, ddd;8,l, 7,0 i 5,7), 5,55(2-NH, g; 8,1), 3,07(3, dd; 14,5 i 7,0), 3,13(3, dd; 14,5 i 5,7), 7,10(5/9, d; 8,6) 6,81 (6/8, d; 8,6), 3,78 (7-OCH₃, s).

^l3C NMR (CDCl₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,1(1), 125,1(2), 141,1(3), 36,7(4), 76,0(5), 40,7(6), 13,6(6-Me), 63,0(7), 59,0(8), 136,7(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,5(12); D 170,6(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,5(4), 21,3(5), 22,9(4-Me); C 176,0(1), 38,1(2), 14,2 (2-Me), 40,7(3); B 171,1(1), 53,9(2), 35,3(3), 131,0(4), 130,2 (5/9), 114,1(6/8), 158,6(7), 55,2(7-OCH₃).

Kryptoficyna 3

[a]_D +20,3° (MeOH, c 1,13); UV λ^ε) 206(51, 700), 218(31, 200), 230(22, 900), 246(18, 800), 280(3, 230); CD[0]₂₀₅+50,000, [θ]₂ι₂-390, [θ]₂₁₈-47,200, [θ]₂₃₃-1ΟΟ, [θ]₂₅ι+33,400, [θ)₂71+4,310.

IR (CHC1₃) v_max3417, 2926, 1742, 1721, 1676, 1499, 1336 cm¹. EIMS m/z (wzgl. intensywność) 638/640(2/0,7, M+), 412/414(63/19), 280/282(15/5), 227(100), 195(63), 91(98); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 638,2764 (obliczone dla C₃5H4₃C1N₂O7, błąd -0,5 mmu), 412,1516 (obliczone dla C₂oH₂7C1N06, błąd 1,1 mmu), 227, 1293 (obliczone dla C15H17NO, błąd 1.0 mmu).

NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,77(2, d; 15,5), 6,68(3, ddd; 15,5, 9,5 i 5,3), 2,37(4, m), 2,54 (4, m), 5,01(5, ddd; 11,4, 6 i 1,5), 2,56(6, m), 1,14(6Me, d; 7,0), 6,01(7, dd; 15,8 i 8,8), 6,41(8, d; 15,8), 7,28-7,34(10/11/13/14, m), 7,23(12, m); kwas leucynowy (D) 4,84(2, dd; 10,1 i 3,6), 1,62(3, m), 1,36(3, m), 1,62(4, m), 0,77(5, d; 6,5), 0,73(4-Me, d; 6,3); kwas 3-amino-2-metylo-propionowy (C) 2,71(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,3), 3,28(3, dt; 13,5 i 7,0), 3,50(3, ddd; 13,5, 4,9 i 4), 6,93(3-NH, brt; 6,3); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,82(2, m), 5,64(2-NH, d; 8,8), 3,05(3, dd; 14,5 i 7,0), 3,13(3, dd; 14,4 i 5,5), 7,22(5, d; 2,2), 3,87(7-OCH3, s), 6,84(8, d; 8,5), 7,08(9, dd; 8,5 i 2,2).

185 949 ^,3C NMR (CDCI3): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,4(1), 125,2(2), 141,4(3), 36,5(4), 77,1(5), 42,3(6), 17,3(6-Me), 130,7(7), 130,0(8), 136,7(9), 126,1 (10/14), 128,6(11/13), 128,4(12); D 170,1(1), 71,6(2), 39,5(3), 24,5(4), 21,2(5), 22,7(4-Me); C 175,6(1), 38,3(2), 14,0(2-Me), 41,2(3); B 170,9(1), 53,5(2), 35,1(3), 129,8 (4), 131,0(5), 122,4(6), 154(7), 56,1(7-OCH₃), 112,2(8), 127,6(9).

Kryptoficyna 4

[a]_D +20,3° (MeOH, c 1,13); UV Z_max(c) 206(41,800), 228(25,000), 240(21,200), 248(22,500), 280(3,000), 290(1,230); CD[6]₂o5+63,9OO, [0]₂ii+,040, [0]₂i₈ -71,900, [0]₂₂₉11,700, [01234-130, [0]₂₅₂+47,5OO, [0]₂₇o+5,4OO. IR (CHCI3) v_inax 3410, 2962, 2917, 1741, 1718, 1678, 1511, 1251 cm-¹. EIMS m/z (wzgl. intensywność) 604(2, M+), 378(74), 246(11), 227(46), 161(100), 91(96); wysoka rozdzielczość EIMS m/s 604,3127 (obliczona dla C₃5H44Ń₂O7, błąd 2,2 mmu), 378,1910 (obliczone dla C_2oHi₂NOć, błąd 0,7 mmu), 227,1293 (obliczone dla C15H17NO, 1,7 mmu błąd), 161,0605 (obliczone dla (CioH₉Ó₂, błąd -0,2 mmu).

*NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,74(2, dd; 15,3 i 1,2), 6,71(3, ddd; 15,3, 10,3 i 5,0), 2,37(4, m), 2,53(4, m), 5,03(5, ddd; 11,2, 6,4 i 2,0), 2,55(6, m), l,13(6-Me, d; 6,8), 6,01(7, dd; 15,8 i 8,8), 6,40(8, d; 15,8), 7,28-7,37(10/11/13/14, m), 7,22(12, m); kwas leucynowy (D) 4,84(2, dd; 10,1 i 3,6), 1,65(3, m), 1,34(3, m), 1,65(4, m), 0,75(5, d; 6,5), 0,72(4-Me, d; 6,3); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,69(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,5), 3,39(3-H2, m), 7,03(3-NH, brt; 6,0); O-metylotyrozyna (B) 4,79(2, m), 5,61(2-NH, d; 7,8, 3,08(3, dd; 14,5 i 7,0), 3,13(3, dd; 14,5 i 5,3), 7,11(5/9, d; 8,8), 6,81(6/8, d; 8,8), 3,78(7-OCH₃, s).

¹³C NMR (CDC1₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,3(1), 125,1(2), 141,5(3), 36,5(4), 77,1(5), 42,3(6), 17,3(6-Me), 130,1(7), 131,8(8), 136,7(9), 126,2(10/14), 128,7(11/13), 127,6(12); D170,8(l), 71,6(2) 39,5(3), 24,5(4), 21,2(5), 22,7(4-Me); C 175,9(1), 38,2(2), 14,2(2-Me), 40,9(3); B 171,2(1), 53,8(2), 35,3(3), 131,0(4), 130,2 (5/9), 114,1(6/8), 158,6(7), 55,2(7-OCH₃).

Kryptoficyna 5

[a]_D+36,0° (MeOH, c 1,13); UV We) 206(45,600), 218 (37,700), 280(3,790), 286(3,480), 325(2,080); CD[0]_2O3+7,71O, [0]_2o6+29,000, [0]₂]₈+21,4OO, [0]₂₂₂+59,8OO, [0]₂₃₄+12,800, [0]₂₄i+l 3,700. IR (CHC1₃) v_max 3426, 2956, 1728, 1672, 1502, 1259 cm-¹. EIMS m/z(wzgl. intensywność) 686/688 (0,1510,05), 655/657(1/0,3), 654/656(1,5/0,5), 311/313(75/27), 195(66), 155(54), 121(51),91(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/s 686,2983 (obliczona dla C₃6Ha₇C1N₂O₉, błąd -1,3 mmu),

NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,87(2, d; 15,3), 6,72(3, dt; 15,3 i 6,8), 2,60(4, m), 2,52(4, ddd; 15,2, 7,8 i 6,8), 5,11(5, ddd; 12,3, 7,8 i 7,1), 1,87(6, m), l,12(6-Me, d; 7,1), 2,91(7, dd; 7,3 i 2,1), 3,70(8, d; 2,1), 7,24(10/14, brd; 7,4), 7,297,36(11/12/13, m); kwas leucynowy (D) 4,09(2, m), 2,86(2-OH, brd, 6,1), 1,83(3, m), l,42(3,m), 1,86(4, m), 0,90(5, d; 6,6), 0,87(4-Me, d; 6,8); kwas 3-amino-2-metylopropionowy C 3,64 (I-OCH3, s), 2,60(2, m), l,07(2-Me, d; 7,3), 3,27(3, ddd; 13,5, 8,0 i 5,5), 3,39(3, m), 6,32(3-NH, t; 5,4); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,59(2, dt; 6 i 7,5), 6,30(2-NH, d; 7,5), 2,95(3, dd; 13,6 i 7,5), 3,0(3, dd; 13,6 i 6,0), 7,2(5, d; 2,1), 3,86(7-OCH₃, s), 6,84(8, d; 8,5), 7,05(9, dd, 8,5; 2,1).

¹³C NMR (CDC1₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 164,8(1), 126,5(2), 139,2(3), 34,4(4), 75,5 (5), 39,2(6), 12,9(6-Me), 63,3(7), 58,7(8), 136,8(9), 125,7(10/14), 128,6(11/13), 128,4(12); D 175,1(1), 69,2(2), 43,2(3), 24,3(4), 21,2(5), 23,2(4-Me); C 175,4(1), 51,9(1OMe), 39,1(2), 14,7(2-Me), 41,6(3); B 170,6(1), 54,6(2), 37,4(3), 129,5(4), 131,0 (5),122,4(6), 154,1(7), 56,l(7-OMe), 112,2(8), 128,4(9).

Kryptoficyna 6

[a]_D+17,l° (MeOH, c 1,1); UV λ™χ(ε) 206(40,000), 218(30,100), 228(21,400), 282(2,430); CD[0]_2O3+37,7OO, [Θ]₂ιο-5,43Ο, [θ]₂ι₃-1,260, [0]₂₂i+24, 100, [θ]₂₃₂+8,480, [0]_24O+13 400, [0]₂₅₄+79O. IR (CHC1₃) v_max 3425, 3006, 2956, 1726, 1672, 1641, 1502, 1462, 1259 cm'¹.

185 949

FABMS (tioglicerol) m/z, (intensywność wzgl.) 573/575(13/6)[M-H2O]⁺, 217(26), 91(100).

Ή NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węglą krotność; J w Hz) kwas 5,7,8-trihydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktanowy (A) 5,92(2, dt; 15,0 i 1,5), 6,94(3, dt; 15 i 7,5), 2,51(4, m), 2,64(4, m), 3,97(5, ddd; 9,3, 6,5 i 4,5), 2,03(6, m), l,10(6-Me, d; 6,5), 3,70(7, dd; 9,0 i 7,5), 4,64(8, d; 7,5), 7,33-7,39(10/11/13/14, m), 7,28(12, tt; 6,5 i 2,0); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,60(2, td; 8,0 i 6,0), 6,09(2-NH, brd; 8,0), 2,96(3, dd; 13,8 i 8,0), 3,02(3, d; 13,8 i 6,0), 7,22(5, d; 2,0),3,86(7-OCH₃, s), 6,84(8, d; 8,5), 7,07(9, dd; 8,5 i 2,0); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 3,63 (I-OCH3, s), 2,58(2, m), l,07(2-Me, d; 7,0), 3,24(3, ddd; 13,8,8 i 6,5), 3,41(3, ddd; 13,8,6,5 i 4,8), 6,21(3-NH, brt; 6,5).

¹³C NMR (CDCI3): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,2(1), 125,6 (2), 141,3(3), 36,9(4), 82,5(5), 46,3(6), 14,3(6-Me), 85,1(7), 84,8(8), 140,9(9), 125,8(10/14), 128,6(11/13), 127,8(12); B 170,6(1), 54,5(2), 37,3(3), 129,6(4), 131,0(5), 122,5(6), 154,1(7), 56,1(7-OCH₃), 112,2(8), 128,5(9) C 52,0(1-OCH₃), 175,4(1), 39,2(2), 14,7(2-Me), 41,6(3).

Kryptoficyna 16

[a]_D +41,3° (MeOH, c 5,2); UV X_max(a) 242(4963), 280(2430), 286(2212); IR (neat) Vmax 3402, 3270, 2960, 1748, 1724, 1676, 1514, 1466, 1343, 1239, 1177 cm’¹, EIMS m/z (intensywność wzgl.) 640/642(66/27), 398/400(47/16), 265(55),227(93), 181(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 640,25676 (wyliczone dla C^H^ClNaOg, błąd -1,6 mmu).

*H NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węglą krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenowy (A) 5,74(2, d; 16), 6,67(3, ddd; 15,3, 9,7 i 5,5), 2,45(4, dt; 14,3 i 10,4), 2,55(4, brdd; 14,3 i 5,3), 5,15(5, ddd; 11,2,4,8 i 1,8), 1,8(6, m), l,14(6-Me, d; 7,0), 2,92(7,dd;7,5 i 2,0), 3,69(8, dd; 2,0), 7,24-7,26 (10/14, m), 7,33-7,39(11/12/13, m); 3-chloro-4-hydroksyfenyloalanina(B) 4,8 (2, m), 5,64 (2-NH, d; 8,8), 3,03 (3, dd; 14,5 i 7,0), 3,11(3, dd; 14,4 i 5,6), 7,17(5, d; 2,2), 5,61(7-OH, s), 6,91(8, d; 8,3), 7,0(9, dd; 8,3 i 2,2); kwas 3-amino-2-metylopropionowy C 2,71(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,3), 3,28(3, dt; 13,6 i 6,8), 3,49(3, ddd; 13,6, 5 i 4,1), 6,92(3-NH, br t; 6,1); kwas leucynowy (D) 4,83(2, dd; 10,1 i 3,3), 1,36(3, m), 1,67-1,75(3, m), 1,76-1,75(4, m), 0,85(5, d; 7,5), 0,86(4-Me, d; 6,8).

¹³C NMR (CDC1₃) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,3(1), 125,3(2), 141,0(3), 36,7(4), 76,2(5), 40,6(6), 13,5(6-Me), 63,0(7), 59,0(8), 136,8(9), 125,6(10/14), 128,7 (11/13), 128,6(12); B 170,9(1), 53,6(2), 35,1(3), 129,9(4), 129,6(5), 120,0(6), 150,4(7), 116,5(8), 129,2(9); C 175,6(1), 38,3(2), 14,l(2-Me), 41,1(3); D 170,8(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,6(4), 21,3(5), 22,9(4-Me).

Kryptoficyna 17

[a]_D +27,0° (CHCI3, c 0,37); UV X_max(8) 248(14740), 268 (8100), 278(3400),

284(2840); IR (neat) v_max3412, 2958, 1750, 1723, 1668, 1504, 1463, 1290, 1177, 751 cm’¹, EIMS m/z (intensywność wzgl.) 624/626(10/3), 398/400(95/35), 284(100), 149(95); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 624,26161 (wyliczone dla C₃4H4iClN2O7, błąd -1,4 mmu).

'Η NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,77(2, d; 15,4), 6,67(3, ddd; 15,4, 9,5 i 5,3), 2,37(4, m), 4,99(5, ddd; 11,2, 6,3 i 1,6), 2,54(6, m), l,14(6-Me, d; 6,7), 6,01(7, dd; 15,7 i 8,7), 6,41(8, d; 15,9), 7,28-7,34(10/11/13/14, m), 7,23(12, m); 3chloro-4-hydroksyfenyloalanina (B) 4,82(2, m), 5,63(2-NH, d; 8,7), 3,12(3, dd; 14,7 i 5,6), 3,03(3', dd; 14,7 i 7,1), 7,18(5, d; 2,0), 5,47(7-OH, br, s),6,91(8, d; 8,3), 7,02(9, dd; 8,3 i 2,0); kwas 3-amino-2-metylopropionowy C 2,71(2, m), l,21(2-Me, d, 6,9), 3,25(3 ,m), 3,52(3', m), 6,89(3-NH, brt; 6,1); kwas leucynowy (D) 4,84 2, dd; 9,6 i 3,1), 1,62(3, m), 1,36(3', m), 1,62 (4, m). 0,77 (5, d', 6,5), 0,73(4-Me, d; 6,5);

³C NMR (CDC1₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,4(1), 125,3(2), 141,3(3), 36,5(4), 77,1(5), 42,3(6), 17,3(6-Me), 130,0(7), 129,9(8), 136,7(9), 126,2(10/14), 128,6(11/13), 127,6(12); B 170,9(1), 53,5(2), 35,1(3), 129,6(4), 131,9(5), 126,2(6), 150,3(7), 116,3(8), 127,6(9); C 175,9(1), 38,4(2), 13,9(2-Me), 41,3(3); D 170,9(1), 71,6(2), 39,5(3), 24,5(4), 21,2(5), 22,7(4-Me).

185 949

Kryptoficyna 18

[a]_D +54,9° (MeOH, c 0,93); UV λ^ε) 250(20518), 284 (3857); IR (neat) v_max3411, 3271, 2966, 1746, 1728, 1668, 1505, 1463, 1258, 1178, cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 638/640 (4,5/1,1), 412/414(59/19), 280(17), 227(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 638,272934 (wyliczone dla C₃5H4₃Ć1N₂O₇, błąd 2,9 mmu).

*H NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,76(2, d; 15,5), 6,65(3, ddd; 15,4, 9,2 i 6,2), 2,38-2,47(, m), 5,08(5, ddd; 10,6,4,9 i 2,2), 2,58(6, m), 1,15(6Me, d; 6,8), 6,07(7, dd; 15,9 i 8,5), 6,43(8, d; 15,9), 7,21-7,35(10/11/12/13/14, m); 3-chloro4-metoksyfenyloalanina (B) 4,83(2, m), 3,05(3, dd; 14,5 i 7,1), 5,65(2-NH, d; 8,7) 3,14(3, dd; 14,4 i 5,5), 7,21(5, d; 2,4), 3,86(7-OCH₃, s), 6,83(8, d; 8,3), 7,08(9, dd; 8,3 i 2,2); kwas 3amino-2-metylopropionowy (C) 2,73(2, m), 1,23(2-Me, d; 7,2), 3,23(3, dt; 13,5 i 6,8), 3,56(3, ddd; 13,5, 5,7 i 4,0), 6,85(3-NH, dd; 7,1 i 6,2); kwas leucynowy (D) 4,8(2, d; 4,6), 1,86 -1,89 (3, m). 0,94(3-Me, d; 7,0), 1,20-1,26(4, m), 1,39-1,44(4, m), 0,77(5, d; 7,4).

ⁱ³CNMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,5(1), 125,2(2), 141,5(3), 36,4(4), 77,7(5), 41,9(6), 17,l(6-Me), 129,8(7), 131,9(8), 136,8(9), 128,6(10/14), 126,2(11/13), 127,6(12); B 170,0(1), 53,5(2), 35,1(3), 129,9(4), 131,1(5), 122,4(6), 153,9(7), 56,1(7-OCH₃), 112,2(8), 128,5(9); C 175,3(1), 38,6(2), 14,0(2-Me),41,4(3); D 169,5(1), 76,6(2), 36,2(3), 15,5(3-Me), 24,2(4), 14,0(5).

Kryptoficyna 19

[a]_D +62,6° (MeOH, c 0,67); UV(MeOH) λ^ε) 204(44900), 230(17000), 248(15600), 280(2500); IR (neat) v_mmax 3413, 3272, 2966, 1745, 1726, 1672, 1504, 1258, 1199, 1178, 1066, 692 cm¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 624/626(3,0/1,4), 398/400(58/21), 280/282(15/5), 227(100), 195/197(57/22); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 624,2585 (wyliczone dla C₃4H4iClN₂O₇, 1,8 mmu błąd).

'Η NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,76(2, d; 15,2), 6,64(3, ddd; 15,4, 9,1 i 6,2), 2,38(4, m), 2,47(4, m), 5,04(5, ddd; 7,1, 5,1 i 1,8), 2,57(6, m), l,15(6-Me, d; 6,9), 6,05(7, dd; 15,8 i 8,5), 6,43(8, d; 15,8), 7,27-7,35(10/11/13/14, m), 7,23(12, m); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,84(2, m), 5,67(2-NH, d; 8,9) 3,04(3, dd; 14,3 i 7,1), 3,14(3, dd; 14,3 i 5,3), 7,22(5, d; 2,0), 3,86(7-OCH₃, s), 6,83(8, d; 8,2), 7,08(9, dd; 8,2 i 2,0), kwas 3-amino-2-metylopropionowy C 2,75(2, m), 1,23(2-Me, d; 7,1), 3,19(3, m), 3,59(3, m), 6,80(3-NH, brt; 6,7); 2-hydroksyizowalerianowy (D) 4,73(2, d; 4,2), 2,09(3, m), 0,84(4, d; 6,9), 0,95(3-Me, d; 6,9).

¹³C NMR (CDC1₃) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,5(1), 125,3(2), 141,3(3), 36,3(4), 77,7(5), 42,0(6), 17,l(6-Me), 129,9(7), 131,0(8), 136,8(9), 126,1(10/14), 128,6(11/13), 127,6(12); B 171,0(1), 53,4(2), 35,1(3), 130,0(4), 131,1(5), 122,4(6), 153,9(7), 56,l(7-OMe), 112,2(8), 128,5(9); C 175,1(1), 38,7(2), 13,9(2-Me), 41,5(3), D 169,6(1), 76,9(2), 29,8(3), 19,0(4), 16,7(3-Me).

Kryptoficyna 21

[a]_D +40,2° (CHC1₃, c 0,72); UV λ^ε) 240(6700), 280(2400), 288(2100); IR (neat) Vmax 3403, 3279, 2957, 1731, 1673, 1503, 1464, 1409, 1372, 1258, 1174, 1065, 1023, 889 cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 640/642(10/4), 612(5),478(15), 398(40), 266(33), 227(76), 195(95), 155(100), 127(90); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 640,2550 (wyliczone dla C₃₄H4iClN₂O₈, błąd 0,2 mmu).

Ή NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylooktanowy (A) 5,73(2, d; 15,4), 6,68(3, ddd; 15,0, 9,9 i 4,9), 2,45(4, m), 2,56 (4, m), 5,19(5, ddd; 11,2, 5,1 i 1,5), 1,80(6, m), l,14(6-Me, d; 7,1), 2,92(7, dd; 7,5 i 2,0), 3,68(8, d; 1,8), 7,25(10/14, m), 7,33-7,38(11/12/13, m); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,74(2, ddd; 8,2, 6,8 i 6,2), 5,68(2-NH, d; 8,6), 2,98(3, dd; 14,3 i 7,7), 3,14(3, dd; 14,3 i 5,6), 7,21(5, d; 2,0), 3,86(7-OMe, s), 6,83(8, d; 8,4), 7,07(9, dd; 8,4 i 2,0); kwas 3-aminopropionowy (C) 2,56 (2,m), 3,51(3, m), 3,45(3, m), 6,90(3-NH, brt; 5,8); kwas leucynowy (D) 4,89(2, dd; 10,0 i 3,3), 1,67(3, m), l,31(3,m), 1,67(4, m), 0,84(5, d; 6,4), 0,83(4-Me, d; 6,4);

185 949 ¹³C NMR (CDC1₃) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,5(1), 125,3 (2), 141,0(3), 36,2(4), 75,9(5), 40,6(6), 13,5(6-Me) 63,0(7), 59,0(8), 136,7(9), 125,5(10/14), 128,7(11/13), 128,5(12); B 170,7(1), 53,9(2), 35,0(3), 129,8(4), 130,9(5), 122,4(6), 153,9(7), 56,l(7-OMe), 112,2(8), 128,3(9); C 172,6(1), 32,4(2), 34,4(3), D 170,5(1), 71,2(2), 39,5(3), 24,4(4), 22,8(5), 21,2(4-Me).

Kryptoficyna 23

[a]_D +47° (MeOH, c 1,55); UV λ^ε) 240(4571), 282(2174), 290(2177); IR (neat) v_max3284, 2960, 1747,1724,1653,1540, 1490,1339, 1272, 1174, cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 674/675/678(47/35/8), 432/434/436(11/5/2), 299/301/303(39/30/7), 227 (64), 215/217/219(31/20/80, 141(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 674,21643 (wyliczone dla C34H4CI2N2O8, błąd 0,3 mmu);

NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węglą krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenowy (A) 5,77(2, d; 15,4), 6,65(3, ddd; 15,4, 9,3 i 6,0), 2,47(4, dt; 14,2 i 10,2), 2,55(4, br dd; 14,2 i 5,6), 5,13(5, ddd; 11,0, 4,6 i 1,6), 1,81(6, m), l,15(6-Me, d; 6,9), 2,93(7, dd; 7,6 i 2,0), 3,7(8, d; 2,0), 7,227,26(10/14, m), 7,32-7,39(11/12/13, m); 3,5-dwuchloro-4-hydroksyfenyloalanina (B) 4,81 (2, m), 5,69(2-NH, d; 8,6), 3,11(3, dd; 14,5 i 5,6), 3,5(3, dd; 14,3 i 7,0), 7,13(5/9, s), 5,78(7-OH, s); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,73(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,1), 3,19(3, dt; 13,4 i 6,9), 3,58(3, ddd; 13,6, 5,8 i 4,1), 6,82(3-NH, brt; 5,9); kwas leucynowy (D) 4,84(2, dd; 9,9 i 3,2), 1,38(3, m), 1,68-1,75(3, m), 1,68-1,75(4, m), 0,86(4-Me, d; 6,7), 0,87(5, d; 6,7).

¹³C NMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,4(1), 125,4(2), 140,9(3),36,7(4), 76,3(5), 40,6(6), 13,5(6-Me), 63,0(7), 58,9(8), 136,7(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,6(12); B 170,7(1),53,3(2), 35,0(3), 130,3(4), 129,0(5/9), 121,0(6/8), 146,7(7); C 175,3(1), 38,4(2), 13,9(2-Me), 41,5(3);D 170,8(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,6(4), 21,3(4-Me), 22,9(5).

Kryptoficyna 24

[a]_D +48,8° (CHCI3, c 0,63); UV λ^ε) 228(19006), 242 (8249), 274(2351); IR (neat) Vmax 3400, 3284, 2959, 1732, 1678, 1652, 1514, 1248, 1178 cm'¹ i; EIMS m/z (intensywność wzgl., przypisanie) 606(2, M⁺), 364(7), 161(55,CH₃O-C6H₄-CH=CH=CO+), 121(100,CH₃OCćH₄-CH₂+), 91(68); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 606,2954 (wyliczone dla C^H^NaOs, błąd -1,3 mmu).

Ή NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenowy (A) 5,70(2, d; 15,2 i 1,3), 6,70(3, ddd; 15,2, 10,3 i 4,7), 2,43(4, dt; 14,3 i 10,9), 2,56(4, m), 5,20(5, ddd; 11,3, 5,1 i 2,0), 1,79(6, m), l,14(6-Me, d; 7,0), 2,92(7, dd; 7,5 i 2,0), 3,68(8, d; 2,0), 7,23-7,38 (10/11/12/13/14, m); O-metylotyrozyna (B) 4,73(2, m), 5,58(2-NH, d; 8,3), 3,03(3, dd; 14,4 i 7,5), 3,14(3, dd; 14,5 i 5,7), 7,11(5/9, d; 8,6), 6,81(6/8, d; 8,6), 3,78(7-OMe, s); kwas 3aminopropionowy (C) 2,55(2-H2, m), 3,42(3, m), 3,53(3, m), 6,97(3-NH, br t; 5,7); kwas leucynowy (D) 4,89(2, dd; 9,9 i 3,5), 1,29(3, m), 1,62-1,70(3/4, m), 0,83(5, d; 5,9), 0,84(4-Me, ^d; ³C NMR (CDC1₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 165,4(1), 125,3(2), 141,0(3), 36,7(4), 75,9(5), 40,6(6), 13,4(6-Me), 63,0(7), 59,0(8), 136,7(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,5(12); B 170,7 lub 170,6(1), 54,1(2), 35,2(3), 128,5(4), 130,2(5/9), 114,1(6/8), 158,6(7), 55,2(7-OMe); (C) 172,8(1), 32,5(2), 34,2(3); (D) 170,6 lub 170,7(1), 71,2(2), 39,5(3), 24,4(4), 21,3(5), 22,8(4-Me).

Kryptoficyna 26

[a]_D +28,2° (CHC1₃, c 1,31); UV λ^ε) 254(14615), 284(2949); IR (neat) v_max 3299, 2960, 1732, 1644, 1504, 1258, 1209, cm- ; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 656/658(0,5/0,1, M+), 638/640(1,7/1,0), 525/527(3,7/1,8), 412/414(10/4), 280/282(12/11), 227(20), 195(48), 131(68); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 656,2836 (wyliczone dla CjsIUsCl^Og, błąd 2,8 mmu). 638,27,12 (wyliczone dla CjćH^CI^O?, błąd 4,7 mmu);

H NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 3,5-dwuhydroksy-6-metylo-8-fenylo-7-oktanowy (A) 2,46(2, d; 14,8 i 7,8), 2,58(2, dd; 14,8 i 3,0), 5,46(3, m), l,86-l,90(4H2, m), 3,61(5, m), 2,37(6, m), 1,14(6Me, d; 6,8), 6,06(7, dd; 16 i 8,7), 6,47(8, d; 16) 7,37(10/14, br d; 7,9), 7,32(11/13, br t; 7,6),

185 949

7,22-7,28(12, m), 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,73(2, br dt; 6,4 i 8,1), 6,14(2-NH, d; 8,6), 2,84(3, dd; 14,4 i 8), 3,18(3, dd; 14,4 i 6,3), 7,21(5, d; 2,2), 3,85(7-OMe, s), 6,82(8, d; 8,6), 7,08(9, dd; 8,6 i 2,2) kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,87 (2, m), l,19(2Me, d; 7,0), 3,01(3, ddd; 13,4, 10,6 i 4,9), 3,73(3, ddd; 13,4, 8,2 i 4,7), 6,72(3-NH, br dd; 7,3 i 5,2); kwas leucynowy (D) 4,95(2, dd; 9,7 i 4,2) 1,62-1,72(3, m), 1,79-1,84(3, m), 1,62-1,72(4, m), 0,90(4, Me, d; 6,4), 0,95(5, d; 6,4).

¹³C NMR (CDC1₃): jednostka δ (pozycja węgla) A 170,0(1), 41,5(2), 71,4(3), 37,3(4), 71,9 lub 71,8(5), 43,6(6), 16,6(6-Me), 130,8(7), 132,5(8), 136,8(9), 126,2(10/14), 128,6(11/13), 127,6(12); B 170,9(1), 53,2(2), 34,7(3), 130,3(4), 131,1(5), 122,2(6), 153,8(7), 56,l(7-OMe), 112,2(8), 128,5(9); C 174,3(1), 40,1(2), 14,4(2-Me), 42,5(3); D 170,7(1), 71,8 i 71,9(2), 38,9(3), 24,6(4), 21,6(4-Me), 22,9(5).

Kryptoficyna 28

[a]_D+65,6° (MeOH, c 0,93); UV(MeOH) X_max(s) 204(48000), 230(19300), 248(18700), 280(3400); IR (neat) v_ma2 3413, 3270, 2958, 1745, 1726, 1665, 1504, 1258, 1197, 1175, . 1066, 694 cm-¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 624/626(3,0/1,3), 412/414(70/24), 280/282(13/6), 213(100), 195/197 (86/40); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 624,2626 (wyliczone dla C34H41CIN2O7, błąd -2,4mmu);

*H NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,7(2, d; 15,6), 6,71(3, ddd; 15,6, 9,95,4), 2,40(4, m), 2,53(4, m), 5,17(5, m), 2,53(6-H2, br t; 6,7), 6,07(7, dt; 15,8 i 7,4), 6,44(8,d; 15,8), 7,27-738(10/11/13/14, m), 7,22(12,m); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,82(2, m), 5,72(2-NH, d; 8,5), 3,04(3, dd; 14,5 i 7,2), 3,14(3, dd; 14,5 i 5,4), 7,22(5, d; 2,0), 3,87(7-OMe, s), 6,84(8, d; 8,5), 7,08(9, dd; 8,5 i 2,0); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,72 (2, m), 1,21 (2-Me, d; 7,2), 3,29 (3, dt; 13,5 i 7,0), 3,49 (3, ddd; 13,5, 4,9 i 3,8), 6,97, (3NH, br t; 5,6); kwas leucynowy (D) 4,82(2, m), 1,40(3, m), 1,62(3, m), 1,62(4, m), 0,76(4-Me, d; 6,3),0,74(5, d; 6,3);

¹³C NMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,4(1), 125,2(2), 141,2(3), 38,5(4), 73,5(5), 38,6(6), 124,1(7), 133,8(8), 136,7(9), 126,1(10/14), 128,6(11/13), 127,6(12); B 170,9(1), 53,6(2), 35,1(3), 129,8(4), 131,0(5), 122,4(6), 154,0(7), 156,l(7-OMe), 112,3(8), 128,4(9); C 175,6(1), 38,3(2), 14,0(2-Me), 41,2(3), D 170,9(1), 71,6(2), 39,6(3), 24,5(4), 21,5 (4-Me, 22,6(5).

Kryptoficyna 29

[a]_D+22,2° (CHCfi, c 1,13); UV λ_ΜΧ(ε) 250(17000), 284(3300); IR (neat) 3415, 3272, 2960, 1744, 1734, 1674, 1504, 1259, 1197, 1174, 1067, 694 cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 624/626(2,6/1,1), 398/400(44/15), 227(100), 195/197(50/16), 155/157(59/20), 131(63), 91(95); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 624,2607 (wyliczone dla C34H41CIN2O7, błąd Δ-0,5 mmu);

'Η NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węglą krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,75(2, dd; 15,3 i 1,1), 6,69(3, ddd; 15,3, 10,1 i 5,3), 2,36(4, m), 2,54 (4, m), 5,03(5, ddd; 11,0, 6,4 i 1,8), 2,56(6, m), l,14(6-Me,d; 6,8), 6,1(7, dd; 15,8 i 8,8), 6,41(8, d; 15,8), 7,28 7,31(10/11/13/14, m), 7,22(12, m); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,76(2, m), 5,67(2-NH, d; 8,6), 3,0(3, dd; 14,4 i 10,2), 3,14(3,dd; 14,4 i 5,9), 7,22(5, d; 2,2), 3,87(7-OMe, s), 6,83(8, d; 8,4), 7,08(9, dd; 8,4 i 2,2); kwas 3-aminopropionowy (C) 2,55(2-¾ m), 3,44(3, m), 3,55(3, m), 6,89(3ΝΉ, br t; 5,7), kwas leucynowy (D) 4,90(2, dd; 9,9 i 3,5), 1,34(3, ddd; 15,4, 10,3 i 3,5), 1,63(3, m), 1,63(4, m), 0,76(4-Me, d; 6,4), 0,72(5, d; 6,4);

¹³C NMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,6(1), 125,2(2), 141,5(3), 36,4(4), 77,1(5), 42,3(6), 17,3(6-Me), 130,1(7), 131,8(8), 136,7(9), 126,2(10/14), 128,6(11/13), 127,6(12); B 170,9(1), 53,8(2), 34,9(3), 129,9(4), 131,0(5), 122,4(6), 153,9(7), 56,1(7-Ome), 112,2(8), 128,4(9); C 172,6 (1), 32,4(2), 34,5(3); B 170,4(1), 71,5(2), 39,7(3), 24,4(4), 21,2(4Me), 22,6(5).

Kryptoficyna 30

[a]_D -12,3° (CHCI3, c 1,53); UV X_max(E) 254(17200), 284(3600); IR (neat) v_max 3414, 3306, 2961, 1738, 1729, 1660, 1504, 1258, 1205, 1183, 1066, 695 cm'¹; EIMS m/z (inten

185 949 sywność wzgl.) 656/658(1,0/0,3), 638/640(3,0/1,0), 525/527(3,8/1,3), 412/414(10,5/3,6), 280/282(10,3/3,8), 227(29), 195/197(48/17), 155/157(74/21), 131(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 656,2852 (wyliczone dla C35H45CIN2O8, błąd 1,3 mmu).

'h NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 3,5-dwuhydroksy-6-metylo-8-fenylo-7-oktenowy (A) 2,25(2, dd; 16,0 i 9,6), 2,64(2, brd; 16,0), 3,89(3, m), 2,51(3-OH, d; 6,4), 1,77(4, ddd; 14,3, 9,8 i 2,1), 1,88 (4, ddd; 14,3, 11,3 i 3,8), 4,88(5, ddd; 11,3, 6,2 i 2,1), 2,53(6, m), l,10(6-Me, d; 6,8), 5,99(7, dd; 15,9 i 9,0), 6,40(8, d; 15,9), 7,28-7,33(10/11/13/14, m), 7,23(12, m); 3-chloro-4metoksyfenyloalanina (B) 4,60(2, m), 6,61 (2-NH, d; 8,1), 3,09(3, dd; 14,2 i 5,6), 3,15(3, dd; 14,2 i 7,3), 7,22 (5, d; 2,1), 3,86(7-OMe, s), 6,83(8, d; 8,3), 7,07(9, dd; 8,3 i 2,1): kwas 3amino-2-metylopropionowy (C) 2,67(2, m), l,21(2-Me, d; 7,3), 3,26(3, ddd; 13,6, 7,3 i 6,4), 3,63(3, ddd; 13,6, 6,2 i 3,9), 6,75(3-NH, br t; 6,3); kwas leucynowy (D) 4,83(2, dd; 9,6, 4,1), 1,42(3, m), 1,64(3, m), 1,64(4, m), 0,79(4-Me, d; 6,4), 0,76(5, d; 6,4);

^I3C NMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 171,6(1), 42,4(2), 66,0(3), 41,3(4), 76,0(5), 42,0(6), 17,3(6-Me), 130,0(7), 131,9(8), 136,7(9), 126,1(10/14), 128,6(11/13), 127,6(12); B 170,8(1), 54,3(2), 35,1(3), 130,1(4), 131,1(5), 122,2(6), 153,8(7), 56,1 (7-0me), 112,1(8), 128,7(9); C 175,6(1), 39,7(2), 13,8(2-Me), 41,5(3), D 171,9(1), 72,1(2), 39,1(3), 24,6(4), 21,4(4-Me), 22,7(5).

Kryptoficyna 31

[a]_D +50,6° (MeOH, c 1,13); UV λ^ε) 242(3800), 284(700); IR (neat) 3412, 3272, 2961, 1745, 1725,1678, 1537, 1481, 1270, 1196, 1176, 1000, 698 cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 688/690/692(1,2/1,0/0,4), 446/448/450(7,9/6,7/3,1), 314/316/318(17/11/3), 91(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 688,2336 (wyliczone dla C35H42CIN2O8, błąd 1,8mmu).

’H NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenowy (A) 5,78(2, d; 15,5), 6,66(3, ddd; 15,5, 9,4 i 6,0), 2,47(4, ddd; 14,1, 10,8 i 9,4), 2,56(4, m), 5,14(5, ddd; 10,8, 4,7 i 1,7), 1,82(6, m), l,15(6-Me, d; 7,1), 2,93(7, dd; 7,5 i 1,9), 3,70(8, d; 1,9), 7,247,26(10/14, m), 7,34-7,39(11/12/13, m), 3,5-dwuchloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,83(2, m), 5,68(2-NH, d; 9,0), 3,0(3, dd; 14,4 i 7,3), 3,14(3, dd; 14,4 i 5,6), 7,16(5/9, s), 3,87(7OMe, s); kwas 3-amino-2-metylopropionowy C 2,74(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,1), 3,20(3, M), 3,58(3, ddd; 13,5, 5,6 i 4,1), 6,82(3-NH, br t; 5,6); kwas leucynowy (D) 4,83(2, m), 1,38(3, m), 1,72(3, m), 1,72(4, m), 0,87(4Me, d; 6,8), 0,86(5, d; 6,8);

¹³NMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,4(1), 125,4(2), 141,0(3), 36,7(4), 76,3(5), 40,6(6), 13,5(6-Me), 63,0(7), 58,9(8), 136,7(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,6(12); B 170,2(1), 53,3(2), 35,2(3), 129,3(4), 129,6(5/9), 134,5(6/8), 151,2(7), 60,6(7OMe); C 175,3(1), 38,3(2), 13,9(2-CH₃), 41,5(3), D 170,2(1), 71,3(2), 39,3(3), 24,6(4), 22,9(4-Me), 21,3(5).

Kiyptoficyna 40

[a]_D +41,6° (CHC1₃, c 0,31); UV Z_max(s) 242(4974), 266(3911), 274(3666), 286(2359), 328(511); IR (neat) ν™_χ3415, 2959, 1748, 1723, 1667, 1505, 1463, 1289, 1176, cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 640/642(5/2), 280/282(7/3), 213(13), 195/197(51/17), 155(29), 141(32)121(28), 91(100), 69(47); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 640,2570 (wyliczone dla C₃₄H₄iC1N₂O₈, błąd -1,8 mmu);

Ή NMR (CDC1₃): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-8-fenylo-2-oktenowy (A) 5,77(2, d; 15,1), 6,72(3, ddd; 15,1, 9,7 i 4,9), 2,42(4, m), 2,58(4, m), 5,35(5, m), 1,89(6, ddd; 12,9, 8,1 i 5,0), 2,13(6, ddd; 12,9, 9,3 i 5,0), 2,98(7, ddd; 6,7, 4,5 i-1,9), 3,64(8, d; 1,9), 7,31-7,39(10/11/13/14, m), 7,22(12, m); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,83(2, m), 5,64(2-NH, d; 8,6), 3,03(3, dd; 14,3 i 7,5), 3,14(3, dd; 14,3 i 5,4), 7,21(5, d; 2,0), 3,87(7-Ome, s), 6,84(8, d; 8,3), 7,08(9, dd; 8,3 i 2,0); kwas 3-amino-2-metylopropionowy C 2,72(2, m), 1,23(2-Me, d; 7,3), 3,31(3, dt; 13,8 i 6,9), 3,50(3, ddd; 13,6, 5,7 i 3,9), 6,96(3-NH, br t; 6,0), kwas leucynowy (D) 4,85(2, dd; 6,7, 3,4), 1,42(3, m), 1,72(3, m), 1,72(4, m), 0,86(4-Me, d, 3,7), 0,87(5, d, 3,7);

185 949 ¹³C NMR (CDC1₃) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,3(1), 125,2(2), 140,9(3), 39,0(4), 72,0(5), 37,3(6), 59,0(7), 58,7(8), 140,9(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,5(12); B 170,9(1), 53,6(2), 35,1(3), 129,8(4), 131,0(5), 122,5(6), 157,0(7), 56,1 (7-OMe), 112,3(8), 128,4 (9); c 175,6(1), 38,3(2), 14,l(2-Me), 41,1(3); D 170,9(1), 71,4(2), 39,4(3), 24,5(4), 21,5(4-Me), 22,8(5).

Kryptoficyna 45

[a]_D +72,0°(MeOH, c 0,12);UV X_max(s) 250(25500), 284(5300); IR (neat) v_max 3407, 3239, 2958, 1743, 1727, 1667, 1538, 1469, 1242, 1196, 1177, 694 cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 658/660/662(2,1/1,4/0,3), 483(7,6) 432/434/436 (9,5/6,4/1,8),

300/302/304(8,0/5,5/1,2, 227(100)91 (87); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 658,2207 (wyliczone dla C34H40CI2N2O7, błąd 0,6 mmu).

*Η NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,80(2, d; 14,7), 6,66(3, ddd; 14,7,8,5 i 5,5), 2,38(4, m), 2,53(4, m), 4,97(5, br dd; 10,4 i 6,2), 2,57(6, m), l,14(6-Me,d;6,7), 6,01 (7,dd; 15,9 i 8,7), 6,42(8,d; 15,9), 7,28-7,34(10/11/13/14, m), 7,22(12; m); 3,5-dwuchloro-4-hydroksyfenyloalanina (B) 4,82(2, m), 5,73(2-NH, br d; 8,7), 3,02(3, dd;14,3 i 6,2), 3,10(3, dd;14,3 i 5,2), 7,14(5/9, s), 5,79(7-OH, s); kwas 3-amino-2metylopropionowy (C) 2,73(2, m), l,21(2-Me, d; 7,0), 3,17(3, m), 3,60(3, m), 6,81(3NH, br t;6,7); kwas leucynowy (D) 4,84(2, dd; 10,0 i 3,2), 1,83(3, ddd; 14,9), 10,2 i 3,2) 1,65(3, m), 1,65(4, m), 0,78(4-Me, d; 6,5), 0,73(5, d; 6,5);

¹³C NMR (CDCI3) jednostka δ (pozycja węgla) A 165,5(1), 125,4(2), 141,2(3), 36,4(4), 77,6(5),42,3(6), 17,3(6-Me), 130,0(7), 131,9(8), 136,7(9), 26,2(10/14), (128,6(11/13), 127,6(12); B 171,0(1), 53,2(2), 35,0(3), 130,4(4), 129,1(5/9), /121,0(6/8), 146,7(7); C 175,2(1), 38,5(2), 13,9(2-Me), 41,6(3), D 170,7(1), 71,5(2), 39,5(3), 24,6(4), 22,7(4-Me), 21,2(5).

Kryptoficyna 49

[a]_D+68,l°(MeOH, c 0,075); UV λ_)ΙΜΧ(ε) 246(25500), 284 (5200); IR (neat) v_max 3401, 3282, 2962, 1744, 1728, 1668, 1540, 1505, 1464, 1258, 1198, 1177, 1066, 694 cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 624/626(0,8/0,3), 398/400 (43/14), 227(78), 195/197(58/26)91 (100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 624,2650 (wyliczone dla C34H41CIN2O7, błąd -4,8 mmu).

*H NMR (CDCI3): jednostka dominowa lub hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-2,7-oktadienowy (A) 5,77(2, d; 14,1), 6,67(3, m), 2,38(4, m), 2,50(4, m), 5,01(5, m), 2,56(6, m), l,13(6-Me, d; 6,5), 6,03(7, dd;15,8 i 8,6), 6,42(8, d; 15,8), 7,29-7,35(10/11/13/14, m), 7,23(12; m); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,82(2, m), 5,64(2-NH, m), 3,06(3, m), 3,13(3, m), 7,22(5, m), 3,87(7-OMe, s), 6,83 (8, m), 7,08(9, m); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,72(2, m), 1,22(2-Me, d; 6,7), 3,26(3, m), 3,53(3, m), 6,90(3-NH, m); kwas 2-hydroksywalerianowy (D) 4,81(2, dd; 8,8 i 3,9), 1,63(3, m), 1,33(4-H2, m). 0,74(5, t; 7,3).

Kryptoficyna 50

[a]_D +32° (CHCI3, c. 0,44); UV λ_ΜΧ(ε) 242(4933), 262 (3996), 274(3719), 286(2430), 332(359); IR (neat) v_max3412, 3274, 2958, 1752, 1724, 1676, 1648, 1503, 1465, 1258, 1177, 1066, 753 cm'¹; EIMS m/z (intensywność wzgl.) 640/642 (4/2), 398/400 (11/4), 280/282(10/3), 227(17), 195/197(57/18), 157(20), 141(3,91(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 640,2531 (wyliczone dla C34H41CIN2O7, błąd 2,1 mmu).

'Η NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylo-oktanoinowy (A) 5,73(2, d; 15,7), 6,67(3, ddd; 15,7,9,7 i 5,4), 2,45(4, m), 2,55(4, m), 5,13(5, ddd; 1,2,5,0 i 1,7), 1,78(6, m), l,15(6-Me, d, 9), 2,91(7, dd; 7,5 i 1,9), 3,68(8, d; 1,7), 7^25(10/14, m), 7,33-7,38(11/12/13; m); 3chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,80(2, ddd; 8,3,7,1 i 5,4), 5,61(2-NH, d; 8,3), 3,03(3, dd; 14,4 i 7,3), 3,13(3, dd; 14,4 i 5,6), 7,21(5, d; 1,9), 3,87(7-OMe, s), 6,83(8, d; 8,4), 7,07(9, dd; 8,4 i 2,2); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,71(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,3), 3,29(3, dt; 13,6 i 6,9), 3,49(3, ddd; 13,6,6,7 i 5,0), 6,92(3-NH, br t; 6,7); kwas 2-hydroksypentanowy (D) 4,75(2, dd; 9,2 i 3,7), 1,55(3, m), 1,65(3, m), 1,33(4-H2, m), 0,84(5, t; 7,3);

¹³C NMR (CDCI3) wartości jednostki δ (pozycja węgla) A 165,3(1), 125,3(2), 141,0(3), 36,9(4), 76,3(5), 40,8(6), 13,6(6-Me), 63,2(7), 59,1(8), 136,8(9), 125,5(10/14), 128,7(11/13), 128,5(12); B 170,9(1), 53,6(2), 35,1(3), 129,8(4), 131,0(5), 122,5(6), 154,0(7), 56,1 (7-OMe),

185 949

112,3(8), 128,5(9); C 175,6(1), 38,4(2), 14,l(2-Me), 41,2(3); D 170,4(1), 72,4(2), 32,7(3), 18,4(4), 13,5(5).

Kryptoficyna 54

EIMS m/z (intensywność względna) 654/656(17/10), 493(5), 411/413(12/4), 280(16), 227(25), 195/197(45/25), 141(30), 91(100); wysoka rozdzielczość EIMS m/z 654,2686 (wyliczona dla C35H43CIN2O8, błąd 2,2 mmu);

NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J wHz) (A) 5,73(2, d; 15,4), 6,66(3, ddd; 15,5,9,7,5,7), 2,64(4, m), 2,53(4, m), 5,16(5, ddd; 11,0,4,2,1,7), 1,79(6, m), l,14(6-Me,d; 6,8), 2,89(7, dd; 7,4,1,8), 3,69(8, d; 1,9), 7,25(10/14, m), 7,30-7,38(11/12/13, m); (B), 4,81(2, m), 5,63(2-NH, d; 8,6), 3,03(3, dd; 14,5,7,3), 3,13(3, dd; 14,5,5,5), 7,21(5, d; 2,2), 3,87(7-OMe, s), 6,83(8, d; 8,4), 7,07(9, dd; 8,4,2,2); C 2,73(2, m), l,22(2Me, d; 7,3), 3,26(3, ddd; 13,4,6,8,6,8), 3,51(3, ddd; 13,4,6,8,5,3), 6,88(3-NH, brt; 6,8); (D) 4,73(2, d; 4,2), 1,78-1,82(3, m), 0,92(3-Me, d; 6,8), 1,36-1,41(4, m), 1,18-1,20(4, m), 0,80(5, t; 7,5);

¹³C NMR (CDCI3); jednostka δ (pozycja węgla) A 165,3(1), 125,4(2), 141,0(3), 36,6(4), 76,3(5), 40,6(6), 13,2(6-Me), 63,1(7), 58,7(8), 136,7(9), 125,4(10/14), 128,6(11/13), 128,5(12); B 170,9(1), 53,5(2), 35,0(3), 129,8(4), 131,0(5), 125,2(6), 153,9(7), 56,l(7-OMe), 112,2(8), 128,4(9); C 175,4(1), 38,5(2), 14,0(2-Me), 41,3(3); D 169,4(1), 76,5(2), 36,1(3), 15,6(3-Me), 24,0(4), 11,2(5).

Kryptoficyna 8

Do roztworu 3,8 mg Kryptoficyny 1 w 1,5 ml mieszaniny 2:1 1,2-dimetoksyetan/woda dodano 9 pL IN HC1. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godz., zobojętniono węglanem potasu i odparowany. Osad podzielono pomiędzy wodę i CH2CI2. Materiał rozpuszczalny w CH2CI2 oczyszczono za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych, otrzymując 3,3 mg czystej Kryptoficyny 8.

EIMS m/z (intensywność względna) 690/692/694 (0,8/0,5/0,2). EIMS wysoka rozdzielczość m/z 690,2533 (obliczona dla C35H44CI2N2O8, błąd -5,8 mmu).

¹H NMR (CDCI3): jednostka δ-aminowa lub -hydroksykwasowa (pozycja węgla, krotność; J w Hz) kwas 8-chloro-5,7-dihydroksy-6-metylo-8-fenylo-2-oktenoinowy (A) 5,79(2, d; 15,4), 6,69(3 ,ddd; 15,4,9,7 i 5,6), 2,68(4, ddt; 14,5, 5,5 i 1,8), 2,38(4, m), 5,11(5, ddd; 10,8,8,6 i 1,8), 2,51(6, m), l,05(6-Me, d; 7,0), 4,01(7, dd; 9,6 i 1,9), 4,65(8, d; 9,6),7,367,41(10/11/12/13/14, m); kwas leucynowy (D) 4,92(2, dd; 10,1 i 3,5), 1,76(3/4, m), 1,45(3, m), 0,94 (5, d; 6,6), 0,94(4-Me, d; 6,4); kwas 3-amino-2-metylopropionowy(C) 2,73(2, m), 1,22(2-Me, d; 7,2), 3,25(3, ddd; 13,6,6,8 i 6,1), 3,54(3, ddd;13,5,6,l i 3,4), 6,91(3-NH, brt; 6,1); 3-chloro-4-metoksyfenyloalanina (B) 4,82(2, ddd; 8,8, 7,2 i 5,6), 5,64(2-NH, d; 8,8), 3,03(3, dd; 15,4 i 7,2), 3,16(3, dd;15,4 i 5,6), 7,23(5, d; 2,2), 3,88(7-OCH₃, s), 6,85(8, d; 8,5), 7,09(9, dd; 8,5 i 2,2).

Kryptoficyna 35

Do kolby zawierającej 0,5 ml CH2CI2 dodano katalityczną ilość PtO2. Powietrze z butli usunięto, wprowadzono wodór i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 min. Do mieszaniny dodano roztwór 10 mg Kryptoficyny 1 w minimalnej ilości CH2CI2 i mieszano w temperaturze pokojowej przez 45 min. Katalizator usunięto przez filtrację przez filtr celit/bawełna, i odparowano rozpuszczalnik. Rozdział osadu na HPLC w układzie faz odwróconych na kolumnie Cl 8 pozwolił uzyskać 6,5 mg Kryptoficyny 35.

EIMS m/z (intensywność względna) 656/658(25/10), 412/414(25/12), 280/282(20/10), 195/197(78/25), 141(58), 91(100); EIMS wysokiej rozdzielczości m/z 656,2864 (wyliczona dla C35H45CIN2O8, błąd 0,0 mmu);

^rH NMR (CDCI3) wartości dla. jednostki δ -aminowej lub -hydroksykwasowej (pozycje węgla, krotność; J w Hz) kwas 2,3-dihydroksy-7,8-epoksy-5-hydroksy-6-metylo-8-fenylooktanowy (A) 2,32(2, ddd; 14,5, 9,2, 5,8), 2,10(2, ddd; 14,5, 9,2, 6,2), 1,5-1,8(3/4 nakładanie m), 5,07(5, ddd; 12,5,5,6,2,0), 1,80(6, m), l,12(6-Me, d; 7,0), 2,90(7, dd; 7,4, 1,8), 3,67(8, d; 1,8), 7,24(10/14, m), 7,32-7,38(11/12/13, m); 3-chloro-4-metoksy fenyloalanina (B) 4,71(2, ddd; 8,7, 6,4,6,3), 5,62(2-NH, d; 8,7), 3,08(2H-3, br d; 6,4), 7,19(5, d; 2,0), 3,87(7-OMe, s), 6,83(8, d; 8,5), 7,07(9, dd; 8,4,2,0); kwas 3-amino-2-metylopropionowy (C) 2,72(2, m),

185 949 l,18(2-Me, d; 6,9), 3,12(3, ddd; 11,4, 10,6, 5,6), 3,70(3, ddd), 6,76 (3-NH, br t,6,0); kwas leucynowy (D) 4,83(2, dd; 9,9, 3,8), 1,39(3, m), 1,70(3, m), 1,72(4, m), 0,87(4-Me, d; 5,3), 0,86 5 d; 5,3);

¹³C NMR (CDCI3) wartości dla jednostki δ (pozycja węgla) A 172,4(1), 36,2(2), 32,0(3), 21,1(4), 76,6(5), 40,2(6), 13,6(6-Me), 63,3(7), 59,2(8), 136,8(9), 125,6(10/14), 128,7(11/13), 128,6(12); B 170,7(1), 53,7(2), 35,5(3), 130,0(4), 131,1(5), 122,2(6), 153,8(7), 56,l(7-OMe), 112,1(8), 128,5(9); C 175,2(1), 38,2(2), 13,6(2-Me), 42,1(3); D 171,9(1), 71,7(2), 39,6(3), 24,5(4), 22,9(4-Me), 21,4(5).

Przykład 5

Analiza aktywności depolaryzacji mikrotubuli przez substancje kryptoficynowe

Winblastyna, cytochalazyna b, izotiocjanian tetrametylorodaminy, falloidyna (TRITC), sulforodamina B (SRB) i przeciwciała przeciw β-tubulinie i wimentynie pochodziły z firmy Sigma Chemical Company. Podstawowe medium Eaglea zawierające sole Earle'a (BME) otrzymano z firmy Gibco, a bydlęcą surowicę płodową (FBS) zakupiono w firmie Hyclone Laboratories. Linie komórkowe

Linię komórkową białaczki Jurkat T oraz komórki mięśni gładkich aorty szczurów A10 otrzymano z American Type Culture Collection i hodowano je w medium BME zawierającym 10% FSB i 50 pg/mL siarczanu gentamycyny. Komórki ludzkiego raka jajnika (SKOV3) oraz podlinię wyselekcjonowaną odporną na winblastynę (SKOV3) otrzymano w darze od doktora Victor Ling z Ontario Cancer Institute. Obie linie komórkowe trzymano w medium BME zawierającym 10% FBS i 50 pg/mL siarczanu gentamycyny. Winblastynę dodano do stężenia końcowego 1 pg/mL do komórek SKVB1 w 24 godziny po pasażu w celu utrzymania presji selekcyjnej dla komórek z nadekspresjąP-glikoproteiny.

Testy proliferacji komórkowej i zatrzymania cyklu komórkowego

Testy proliferacji komórkowej przeprowadzono według metody Skehan i wsp¹¹. W przypadku komórek Jurkat hodowle traktowano wskazanymi lekami jak to opisał Skehan¹¹, a liczby komórek policzono licząc komórki w hemacytometrze. Procent komórek w stadium mitozy określono za pomocą barwienia 0,4% barwnikiem Giemzy w PBS po ich szybkim, trzykrotnym płukaniu w PBS. Co najmniej 1000 komórek w każdej grupie lękowej oceniano pod względem obecności figur mitotycznych a indeks mi to tyczny obliczono jako stosunek komórek w stadium mitozy do całkowitej ilości komórek liczonych.

Testy immunofluorescencyjne

Komórki A-10 rosły prawie aż do konfluencji na szkiełkach przykrywkowych w medium BME/10% FSB. Związki rozpuszczone w PBS dodano we wskazanych stężeniach końcowych i komórki inkubowano przez dalsze 24 godziny. W celu wybarwienia mikrotubuli i intermedialnych filamentów, komórki utrwalano w zimnym metanolu i inkubowano w PBS zawierającym 10% cielęcej surowicy w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiążących. Następnie komórki inkubowano w 37°C przez 60 minut albo z monoklonalnym przeciwciałem anty-beta-tubulinowym albo z monoklonalnym przeciwciałem antywimentynowym w rozcieńczeniach zaleconych przez producenta. Związane przeciwciała pierwotne wizualizowano przez 45 minutową inkubację z króliczym, przeciwmysim IgG sprzężonym z fluoresceiną. Szkiełka umieszczono pod mikroskopem, i fluorescencję mierzono i fotografowano za pomocą mikroskopu Zeiss Photomicroscope 111 wyposażonego w epifluorescencyjną optykę dla fluoresceiny. W celu wybarwienia mikrofilamentów, komórki utrwalano w 3% paraformaldehydzie, prześwietlano w 0,2% Triton Χ-100 i redukowano chemicznie za pomocą borowodorku sodu (Img/ml). Następnie dodano PBS zawierający 100 nM TRITC-falloidynę, i mieszaninę inkubowano przez 45 min w 37°C. Komórki przepłukano szybko trzy razy za pomocą PBS, po czym nałożono na szkiełka mikroskopowe i fotografowano natychmiast jak opisano wyżej. Wpływ kryptoficyn i winblastyny na proliferację i cykl komórkowy komórek Jurkat.

Krzywe dla dawki i odpowiedzi biologicznej wpływu związków kryptoficynowych i winblastyny na komórkową proliferację oraz procent komórek w stadium mitozy pokazano kolejno na rysunkach 2A i 2B. Mniej niż 3% nietraktowanych komórek znajdowało się w stadium mitozy. Zarówno związki kryptoficynowe i winblastyna powodowały zależny od

185 949 dawki wzrost procentu komórek w stadium mitozy. Wzrost indeksu mitotycznego ściśle korelował ze spadkiem proliferacji komórkowej, to jest stężenia zarówno związków kryptoficynowych jak i winblastyny, które powodowały, że 50% komórek było w stadium mitozy były zasadniczo takie same jak stężenie hamujące komórkową proliferację o 50%. Wartości IC50 dla związków kryptoficynowych i winblastyny w odniesieniu do ich wpływów wynosiły odpowiednio 0,2 i 8 nM.

Wpływ cytochalazyny B, winblastyny i kryptoficyn na cytoszkielet.

Komórki mięśni gładkich aorty (A-10) rosnące na szklanych płytkach były traktowane za pomocą PBS, 2 μΜ cytochalazyny B, 100 nM winblastyny lub 10 nM związków kryptoficynowych. Po 24 godzinach, mikrotubule i pochodne wimentynowe filamentów wizualizowano za pomocą pośredniej immunofluorescencji a mikrofilamenty wybarwiono używając TRITC-falloidyny. Zbadano morfologiczne efekty każdego leku. Komórki nietraktowane wykazywały gęstą sieć mikrotubul pozostającą w związku z okołojądrowymi centrami sterującymi mikrotubulami. Wimentynowe filamenty pośrednie były także równomiernie rozmieszczone w cytoplazmie, podczas gdy pęki mikrofilamentów były skoncentrowane wzdłuż głównych osi komórki. Cytochalazyna B powodowała całkowitą depolimeryzację miokrofilamentów wraz z kumulacją parakrystalicznych resztek. Ten związek nie wpływał na dystrybucję mikrotubul i filamentów pośrednich. Zarówno winblastyna jak i związek kryptoficynowy powodowały znaczną deplecję mikrotubul. Żaden ze związków nie wpływał na rozmieszczenie mikrofilamentów, jednakże wimentynowe filamenty pośrednie uległy załamaniu, tworząc koncentryczne pierścienie wokół jąder komórek traktowanych zarówno winblastyna jak i związkiem kryptoficynowym.

Wpływ kryptoficyn i winblastyny na mikrotubule stabilizowane taksolem

Komórki A-10 traktowano przez 3 godz. za pomocą 0 lub 10 μΜ taxolu, po czym dodano PBS, 100 nM winblastyny lub 10 nM związku kryptoficynowego. Po 24 godz. badano rozmieszczenie mikrotubul za pomocą immunofluorescencji, jak opisano wyżej. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, mikrotubule w komórkach traktowanych taksolem tworzyły pęki, zwłaszcza przy biegunach komórek. Podobnie jak poprzednio, winblastyna powodowała całkowitą depolimeryzację mikrotubul w nietraktowanych komórkach. Jednakowoż, traktowanie za pomocą taksolu chroniło przed depolimeryzacją mikrotubul w odpowiedzi na winblastynę. Podobnie, pretraktowanie taksolem całkowicie chroniło mikrotubule przed depolimeryzacją powodowaną przez kryptoficynę.

Odwracalność depolimeryzacji mikrotubul przez winblastynę i kryptoficynę

Komórki A-10 traktowano 100 nM winblastyny lub 10 nM kryptoficyn przez 24 godz. co powodowało całkowitą depolimeryzację mikrotubul. Komórki następnie przemyto i inkubowano w medium bez leku przez czas 1 godz. lub 24 godz. Mikrotubule ulegały repolimeryzacji wkrótce po usunięciu winblastyny wykazując znaczący poziom ilości mikrotubul już po 1 godzinie i ich całkowitą, morfologiczną renowację po 24 godz. W odróżnieniu, mikrotubule nie pojawiały się w komórkach traktowanych związkami kryptoficynowymi zarówno po 1 godz. jak i po 24 godz. po usunięciu związku. Odwracalność hamowania proliferacji komórkowej przez kryptoficyny, winblastynę i taksol

Komórki SKOV3 traktowano przez 24 godziny za pomocą wcześniej oznaczonych dawek IC50 winblastyny, związków kryptoficynowych lub taksolu (np. wartości wyznaczone w doświadczeniach podsumowanych w tabeli 5). Po tym czasie gęstość komórkowa wzrosła z 0,4 do 0,5 + 0,05 jednostek adsorbancji (fig. 3), wskazując na 25% wzrost liczby komórek dla wszystkich trzech sposobów traktowania. Usunięcie leków spowodowało szybki wzrost komórek traktowanych winblastyną a ich ilości wzrosły około 3-krotnie w ciągu 24 godz. W odróżnieniu, komórki traktowane związkami kryptoficynowymi lub taksolem pozostawały zahamowane, a ich liczba zwiększyła się tylko od 0,2 do 0,4-krotnie w ciągu 24 godzin po usunięciu leku. Zdolność proliferacyjna komórek traktowanych kryptoficynami lub taksolem została następnie odzyskana gdyż ilość komórek wtedy podwoiła się w ciągu następnych 24 godz. Wpływ mieszanin winblastyny i kryptoficyn na proliferację komórkową.

Komórki SKOV3 traktowano mieszaninami kryptoficyn i winblastyny przez 48 godz. Następnie zmierzono procent przeżywających komórek następnie i wyliczono wartości IC50

185 949 dla każdej mieszaniny. Wpływ tych złożonych traktowań jak i traktowania za pomocą pojedynczego leku jest pokazany w postaci izobologramu (fig. 4). Wartości IC50 dla mieszanin związków kryptoficynowych i winblastyny układają się bardzo blisko do linii addytywności, co wskazuje, że te dwa leki wywołują tylko addytywne zahamowania komórkowej proliferacji.

Toksyczność kryptoficyn, winblastyny i taksolu wobec komórek SKOV3 i SKVLB1

Komórki SKVLB1 są oporne na leki przeciwnowotworowe pochodzenia naturalnego z powodu ich nadekspresji P-glikoproteiny 12. Zdolność taksolu, winblastyny i związków kryptoficynowych do hamowania wzrostu komórek SKOV3 i SKVLB1 podsumowano w tabeli 5. Taksol powodował zależną od dawki inhibicję proliferacji obu linii komórkowych, a wartości IC50 dla komórek SKOV3 i SKVLB1 wynosiły odpowiednio 1 i 8000 nM. Winblastyna także hamowała wzrost obu linii komórkowych, z wartościami IC50 równymi 0,35 i 4200 nM dla komórek odpowiednio SKOV3 i SKVLB1. Kryptoficyny wykazywały wartości IC50 równe 7 i 600 pM dla komórek odpowiednio SKOV3 i SKVLB1. Otrzymane wskaźniki oporności dla komórek SKVLB1 wobec tych związków zostały wyliczone jako wartości IC50 dla SKVLB1. Wartości IC50 dla komórek SKOV3 zostały także podane w tabeli 5.

Zostało przeto wykazane, że obecny wynalazek dostarcza nowych związków kryptoficynowych, które są silnymi inhibitorami proliferacji komórkowej działającymi przez rozerwanie sieci mikrotubulamej i zahamowanie mitoz. Związki kryptoficynowe rozrywają organizację mikrotubulamą, a przez to zwykłe funkcje komórkowe łącznie z podziałami mitotycznymi.

Klasyczne czynniki anty-mikrotubulame, jak kol chi cyna i alkaloidy barwinka zatrzymują podziały komórkowe i mitozy. Wydało się właściwe porównać wpływ jednego z tych czynników i związków kryptoficynowych na proliferację komórkową. W tym celu jako przedstawiciel klasycznych czynników anty-mikrotubulamych wybrano alkaloid barwinka winblastynę. Wobec tego, porównano wpływ związków kryptoficynowych i winblastyny na proliferację i przebieg cyklu komórkowego linii komórkowej komórek białaczki Jurkat T. Oba związki powodowały równoległe, dawkozależne zahamowania komórkowej proliferacji i nagromadzenie komórek w stadium mitozy.

Jako że efekty antymitotyczne są zwykle powodowane przez rozerwanie mikrotubul we wrzecionkach mitotycznych, wpływ związków kryptoficynowych na struktury cytoszkieletu charakteryzowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Barwienie immunofluoroscencyjne komórek traktowanych związkiem kryptoficynowym lub winblastyną jasno wykazało, że oba związki powodowały całkowitą utratę mikrotubul. Podobne badania z komórkami SKOV3 wykazały, że anty-mikrotubulame działania związków kryptoficynowych nie są ograniczone tylko do linii komórkowych mięśni gładkich. Żaden lek nie zmienił poziomu lub rozmieszczenia pęków mikrofilamentów, co łatwo było wywoływane przez cytochalazynę B, co wskazuje że zanik mikrotubul nie jest spowodowany poprzez niespecyficzny mechanizm, np. przez aktywację proteaz lub utratę ładunku energetycznego. Zarówno winblastyna jak i związki kryptoficynowe promują także znaczne załamanie się wimentynowych, filamentów pośrednich tak, że jasno barwiące się pierścienie tworzą się wokół jąder komórkowych.

Usunięcie winblastyny z medium hodowlanego spowodowało szybką repolimeryzację mikrotubul. Odwrotnie, komórki traktowane związkami kryptoficynowymi były pozbawione mikrotubul przez co najmniej 24 godz., po tym jak związek został usunięty z hodowli.

Obecny wynalazek wykazuje, że związki kryptoficynowe omijają indukowaną przez Pglikoproteinę oporność wielolekową. Transport przez P-glikoproteinę ogranicza zdolność naturalnych leków przeciwrakowych do hamowania wzrostu komórek rakowych, co prowadzi do nabycia na nowo lekoopomości¹³¹⁵. Alkaloidy barwinka, chociaż bardzo użyteczne w początkowych etapach chemioterapii, są bardzo dobrymi substratami dla transportu poprzez P-glikoproteinę, przez co mają bardzo ograniczoną użyteczność wobec raków MDR mediowanych przez P-glikoproteinę. Przeto, wynalezienie czynników, które nie prowadzą do oporności wielolekowej, może prowadzić do opracowania użytecznych i nowych środków przeciwrakowych. Związki kryptoficynowe według obecnego wynalazku wydają się być takimi czynnikami gdyż są one słabymi substratami dla transportu zachodzącego za pośrednictwem P-glikoproteiny. Fakt ten jest odzwierciedlony przez niski wskaźnik oporności komórkowej

185 949 wobec związków kryptificynowych w porównaniu z winblastyną taksolem i innymi lekami naturalnymi.

Totalna synteza kryptoficyn

Struktury nowozsyntetyzowanych związków zostały potwierdzone w prosty sposób stosując metodologię, która jest dobrze znana, obeznanym w dziedzinie. Dane spektroskopii masowej były spójne z danymi o składach cząsteczek. Dane z protonowego i węglowego NMR były bardzo podobne do danych dla kryptoficyny 1 i pokrewnych analogów, występujących w naturze i półsyntetycznych.

Następujące przykłady ilustrują totalną syntezę związków kryptoficynowych jak również ich zastosowanie jako środków terapeutycznych według obecnego wynalazku.

P r z y kł a d 6. Synteza Kryptoficyny 51

S-trans-3-Penten-2-ol (A)

Mieszaninę racematu trans-3-penten-2-olu (933 mg, 11 mM), laurynianu trójfluoroetylu (4,14g, 15 mmol) i wieprzowej lipazy trzustkowej (PPL, 2,0 g) w25ml bezwodnego eteru dietylowego mieszano przez 80 godz. Następnie PPL odfiltrowano i przemyto trzy razy eterem. Filtrat eterowy odparowano, a lepki olej poddano destylacji próżniowej. S-trans-3penten-2-ol (A) skondensowano w odbieralniku schłodzonym ciekłym azotem (383mg).

’HNMR (CDC1₃) δ 5,57(4-H; dq, -15,3/6,0), 5,47(3-H; ddd, -15,3/6,4/1,2), 4,19(2-H; 1:4:6:4:1 pentaplet, 6,4), 2,24(OH; bs), 1,63(5-H3; d, 6,0), 1,19(1-H3; d, 6,4).

¹³C NMR (CDCI3) δ 135,5(3), 125,5(4), 68,7(2), 23,3(5), 17,5(1).

S-trans-2-(2-propynyloksy)-3 -penten (B)

W czasie silnego mieszania, do mieszaniny S-enancjomeru A (628 mg, 7,3 mmole), wodorosiarczanu tetrabutyloamoniowego (138 mg, 0,41 mmoli) i 40% roztworu wodorotlenku sodowego w wodzie (5 ml), w temperaturze 0°C wkrapla się chlorek propargilu (767 mg, 10,3 mmoli, 745 μΐ). Silne mieszanie kontynuuje się w czasie nocy, po czym mieszaninę zobojętnia za pomocą kwasu solnego w temperaturze 0°C i eter propargilowy ekstrahuje pentanem. Z ekstraktu oddestylowuje się rozpuszczalnik i eter propargilowy oczyszcza za pomocą krótkiej kolumny z żelem krzemionkowym (2% eter dietylowy w pentanie), uzyskując 778 mg eteru propargilowego Β, [a]o-l 18,9° (c 2,0, CHCI3);

Ή NMR (CDCI3) δ 5,70(4-H; dq, 18,5/6,5), 5,31(3-H; ddd, 18,5/7,2/1,4), 4,15(1'-H; dd, -15,6/2,1), 4,01(Γ-Η; dd, -15,6/2,1), 4,01(2-H; m), 2,38(3'-H; t, 2,1), 1,73(5-H; dd, 6,5/1,4), 1,25(1H; d, 6,3).

(3R,4R)-4-metylohept-5(E)-en-1 -yn-3-ol (C).

Z roztworu butylolitu w heksanie (2,5 molowy, 5,1 ml, 12,8 mmola) pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje się rozpuszczalnik i pozostałość oziębia do temperatury -90°C. Powoli dodaje się roztwór propargilowego eteru B (454 mg, 3,66 mmoli) w 10 ml tetrahydrofuranu. Całość pozostawia się w czasie nocy pozwalając aby temperatura wzrosła do pokojowej, po czym reakcję przerywa się za pomocą dodania roztworu chlorku amonowego. Trzykrotnie ekstrahuje się eterem, z wysuszonego ekstraktu oddestylowuje się rozpuszczalnik, pozostałość oczyszcza za pomocą kolumny z żelem krzemionkowym (5% octan etylu w heksanie) i uzyskuje 322 mg alkoholu C (wydajność 71%), [a]o +32,9° (c 3,0, CHCI3); IR (NaCl) v_max, 3306, 2968, 1455, 1379, 1029, 975 cm’¹.

Ή NMR (CDCI3) δ 5,61(6-H; dq, 15,3/6,3), 5,38(5-H; dd, 15,3/7,7), 4,13(3-H; bs), 2,45(1-H; d, 1,5), 2,38(4-H; m), 2,20(OH; bd, 3,3), 1,68(7-H; d, 6,2), l,09(4-CH₃; d, 6,8).

¹³C NMR (CDCI3) δ 131,5(5), 127,9(6), 83,5(2), 73,6(1), 66,2(3), 43,4(4), 18,1(7), 15,7(4-Me).

(3S,4R)-3-t-butylodimetylosililoksy-4-metylohept-5E-enal (D).

W czasie mieszania do roztworu alkoholu C (248 mg, 2 mmole) i imidazolu ( 340 mg, 5 mmoli) w 3ml bezwodnego dimetyloformamidu dodaje się chlorek t-butylodimetylosililowy (452 mg, 3 mmole). Całość miesza się w czasie nocy i w celu rozłożenia nadmiaru chlorku t-butylodimetylosililowego, dodaje się 10 ml 10% roztworu wodorotlenku sodowego. Produkt ekstrahuje się eterem, ekstrakt kolejno przemywa wodą 0,5 normalnym kwasem solnym i wodą suszy i oddestylowuje z niego rozpuszczalnik. Pozostałość oczyszcza się za pomocą

185 949 chromatografii na żelu krzemionkowym, eluując heksanem i uzyskuje 457 mg (3R,4R)-3-tbutylodimetylosililoksy-4-metylohept-5 (E)-en-l-ynu (wydajność 96%), *H NMR (CDCI3) δ 5,50(6-H; dq, 15,3/6,1), 5,38(5-H; dd, 15,3/7,5), 4,16(3-H; dd, 5,7/1,7), 2,37(1-H; d, 1,7), 2,35(4-H; m), 1,68(7-H; d, 6,1), l,07(4-Me; d, 6,8), 0,90(CMe₃; s), 0,12(SiMe; s), 0,09(SiMe; s).

Stosując taki sam sposób postępowania uzyskuje się odpowiednią pochodną TBDPS, (3R,4R)-t-butylodifenylosililoksy-4-metylohept-5(E)-en-l-yn z wydajnością 92%, [a]o +32,9° (c 3,0, CHCI3).

'H NMR (CDCI3) δ 7,72/7,38 (2Ph-H₅), 5,32(6-H; m), 5,25(5-H; dd, 16,2/7,3) 4,29(3H; dd, 5,2/2,0), 2,38(4-H; m), 2,33(1-H; d, 2,0), 1,64 (7-H; d, 5,3), l,ll(4-Me; d, 6,9), 1,06(Cme3) ¹³C NMR (CDCI3) δ 136,1/135,9/133,6/129,7/129,6/127,5/127,3(Ph), 132,4(5), 126,1(6), 83,3(2), 73,5(1), 68,0(3), 43,6(4), 26,9(cMę₃), 18,0(7), 14,7(4-Me).

2-Metylobuten (1,15 ml, 2 molowy roztwór w tetrahydrofuranie, 2,3 mmole) dodaje się do 1,1 ml roztworu BH3 w tetrahydrofuranie (1 molowy, 1,1 mmola) w temperaturze -25°C i całość miesza w łaźni z lodem w czasie dwóch godzin. Następnie temperaturę obniża się do -50°C i w jednej porcji dodaje roztwór pochodnej TBS (238 mg, 1 mmol) w 1 ml tetrahydrofuranu. Usuwa się łaźnie chłodzącą i pozwala aby temperatura wzrosła do pokojowej w czasie jednej godziny. Następnie w temperaturze 0°C dodaje się 2,2 molowy roztwór KH2PO4/K2HPO4 (4,8 ml) i 30% nadtlenek wodoru (0,8 ml). Po upływie jednej godziny oddestylowuje się tetrahydrofuran i pozostałość ekstrahuje eterem. Z wysuszonego ekstraktu eterowego oddestylowuje się rozpuszczalnik, zaś pozostałość poddąje chromatografii na żelu krzemionkowym (1% octan etylu w heksanie) i uzyskuje 194 mg aldehydu D (wydajność 76%).

’H NMR (CDCI3) δ 9,78(1-H; t, 2,3), 5,46(6-H; dq, 15,3/6,1), 5,34(5-H; dd, 15,3/7,5), 4,13(3-H; m), 2,47(2-H; m), 2,31(4-H; m), 1,66(7-H; szerokie d, 6,1), 0,99(4-Me; d, 6,8), 0,87(CMe₃; s), 0,07(SiMe; s), 0,04(SiMe; s).

t-butylodifenylosililową (TBDPS) pochodną eterową aldehydu wytwarza się z wydajnością 83%.

‘H NMR (CDCI3) δ 9,52( 1-H; t, 2,4), 7, 69/7,40(2Ph-H₅), 5,28(6-H; m), 5,22(5-H; dd, 16,2/6,2), 4,19(3-H; m), 2,42(2-H; m), 2,29(4-H; m), l,60(7-H; d, 5,4), l,07(CMe₃), 1, 02 (4Me; d 6,9).

¹³C NMR (CDCI3) δ 202,0(1), 136,1/133,6/133,3/130,2/129,7/127,7/127,6(Ph), 132,3(5), 126,2(6), 72,8(3), 47,6(2), 42,2(4), 27.1(CMe₃), 19,6(CMe₃), 18,3(7), 14,9(4-Me).

(5S,6R)-5-t-Butylodimetylosililoksy-6-metylo-7-oksonona-2E,7E-dienokarboksylan metylu (E).

W czasie mieszania do roztworu aldehydu D (0,74 g, 2,9 mmoli) i fosfonooctanu trimetylu (632 mg, 3,5 mmoli) w 5 ml tetrahydrofuranu, oziębionego do temperatury -78°C, dodaje się tetrametyloguanidynę (435 μΐ, 3,5 mmoli). Po czasie 30 minut usuwa się łaźnie chłodzącą i całość miesza w czasie 4 godzin. Następnie mieszaninę zobojętnia się 1 normalnym kwasem solnym i produkt ekstrahuje eterem. Po wysuszeniu z ekstraktu oddestylowuje się rozpuszczalnik i pozostałość poddąje chromatografii na żelu krzemionkowym (5% octan etylu w heksanie) uzyskując 0,814 g E z wydajnością 90%.

'H NMR (CDCI3) δ 6,93(3-H; dt, 15,6/7,8), 5,62(2-H; dd, 15,6/1,2), 5,37(8-H; m), 5,37(7-H, m), 3,71(OCH₃, s), 3,61(5-H, m), 2,29(4-H₂, m), 2,22(6-H, m), 1,66(9-H₃; szerokie d, 6,1), 0,99(6-Me; d, 6,8), 0,88(C-Me₃; s), 0,03(SiMe; s), 0,01(SiMe; s).

t-Butylodifenylosililową (TBDPS) eterową pochodną aldehydu wytwarza się z wydajnością 90%.

'H NMR (CDC1₃) δ 7,68/7,38(2Ph-H₅), 6,75(3-H; dt, 15,6/7,4), 5,62(2-H; d, 15,6), 5,34(8-H; m), 5,29(7-H, m), 3,70(5-H, m), 3,68(OCH₃, s), 2,28(4-H₂; m), 2,20(6-H, m), 1,62(9-H₃; d, 5,3), l,08(CMe₃), 0,99(6-Me; d, 6,9).

¹³C NMR (CDC1₃) δ 166,7(1), 146,4(3), 136,0/134,2/133,8/129,62/129,56/127,5/127,4(Ph), 132,5(7), 125,8(8), 122,6(2), 76,2(5), 51,3(OCH₃), 41,7(6), 36,8(4), 27.0(CMe₃), 19,4(CMe₃), 18,1(9), 14,7(6-Me).

(5S,6R)-t-Butylodimetylosililoksy-6-metylo-7-oksohept-2(E)-enokarboksylan metylu (F).

185 949

Ozon przepuszcza się przez roztwór estru metylowego E (328 mg, 1,0 mmoli) i 97 μΐ pirydyny w 15 ml chlorku metylenu w temperaturze -78°C, zaś przebieg ozonolizy obserwuje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Po zaniku estru metylowego dodaje się około 500 mg pyłu cynkowego i 1 ml lodowatego kwasu octowego. Powoli temperaturę podnosi się do 25°Ć. Mieszaninę sączy się i przesącz kolejno przemywa nasyconymi roztworami siarczanu miedziowego i wodorowęglanu sodowego. Rozpuszczalnik oddestylowuje się i surowy aldehyd F (249 mg, 83%) stosuje w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.

’H NMR (CDC1₃) δ 9,96(7-H; t, 2,3), 6,96(3-H; dt, 15,7/7,6), 5,90(2-H; dd, 15,7/0,7), 4,05(5-H; m), 3,74(OMe; s), 2,51(6-H; m), 2,45(4-H₂; m), l,09(6-Me; d, 6,9), 0,88(CMe₃; s), 0,04(SiMe; s), 0,03(SiMe; s).

(5S,6R)-5-t-Butylodimetylosililoksy-6-metylo-8-fenylookta-2E,7E-dienokarboksylan metylu (G).

W czasie mieszania do roztworu aldehydu F (25,0 mg, 0,08 mmoli) w 1,5 ml tetrahydrofuranu w temperaturze -78°C dodaje się 0,80 ml oziębionej do temperatury -78°C mieszaniny chlorku benzylotrifenylofosfoniowego (268 mg, 0,69 mmoli, w 6,9 ml tetrahydrofuranu) i n-butylolitu (280 μΐ, 2,5 molowego roztworu w heksanie). Po czasie 15 minut usuwa się łaźnię oziębiającą i mieszanie kontynuuje w czasie dalszych 2 godzin. Reakcje przerywa się za pomocą dodania nasyconego roztworu chlorku amonowego i oddestylowuje tetrahydrofuran. Pozostałość dwukrotnie poddaje się ekstrakcji heksanem, połączone ekstrakty przemywa solanką suszy i oddestylowuje z nich rozpuszczalnik. Otrzymany olej stanowiący mieszaninę 5:1 izomerów E i Z, rozpuszcza się w 1,5 ml benzenu zawierającego tiofenol (0,02 molowy) i l,r-azobis(cykloheksanokarbonitryl) (VAZO, 0,006M) i mieszaninę ogrzewano we wrzeniu przez 5 godzin. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, dodano heksan (15 ml) a roztwór organiczny przemywano kolejno 10% NaOH i solanką suszono (MgSO₄) i odparowano. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym (2% EtOAc/heksan), uzyskując 24 mg (80%) związku G, [ajo +68,2° (C 1,5, CHC1₃); EIMS m/z 374 (<1%; M⁺), 359(1; M⁺-CH₃), 317(10; M-Bu), 275(10), 243(73), 143(20), 115(10), 97(64), 89(31), 73(100); HREIMS m/z 374,2232 (C₂₂H₃₄O₃Si, Δ +4,5mmu), 359,2031 (C₂iH₃iO₃Si, Δ +1,1 mmu), 3171579 (C₁₈H₂₅O₃Si, Δ -0,6mmu); UV (MeOH) Z_max (ε) 206(33500), 252(20100) nm; IR 2952, 2855, 1725, 1657, 1435,1257, 1168,1097, 970, 836, 775 cm’^f;

'H NMR δ 7,2-7,4(Ph-H₅; m), 6,96(3-H; ddd, 15,6/7,8/7,5), 6,37(8-H; d, 15,9), 6,16 (7H; dd, 15,9/8,1), 5,84(2-H; d, 15,6), 3,75(5-H; ddd, 10,2/6,0/4,2), 3,72(OMe; s), 2,44 (6-H; m), 2,36(4-H,; m), l,10(6-Me; d, 6,9), 0,91(Si-CMe₃; s), 0,06(Si-Me; s), 0,05(Si-Me; s);

¹³C NMR δ 166,8(1), 146,4(3), 137,6(Ph 1'), 131,9(8), 130,4(7), 128,5(Ph)375'), 127,0(Ph 4'), 126,0(Ph 276'), 122,9(2), (5), 51,4(OMe), 42,8(6), 37,6(4), 25.9(Si-CMe₃). 18,l(Si-CMe₃), 16,2(6-Me), -4,4(Si-Me), -4,5(Si-Me).

Obliczono dla C₂₅H₃₄O₃Si; C, 70,52; H, 9,17.

Znaleziono: C, 70,72; H, 9,42.

Kwas (5S,6R)-5-t-butylodimetylosililoksy-6-metylo-8-fenylokta-2E,7E-dienowy

Do roztworu estru G (159 mg, 0,43 mmola) w 7 ml acetonu dodano 5 ml IN wodnego LiOH. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25° C przez 3 godziny, rozcieńcza 20 ml eteru dietylowego i zakwasza do wartości pH 4 za pomocą 1 normalnego kwasu solnego. Oddziela się warstwę organiczną przemywa 20 ml porcjami solanki i wody, suszy nad siarczanem magnezowym i oddestylowuje rozpuszczalnik. Olejową pozostałość poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym, przy użyciu 40% octanu etylu w heksanie zawierającym 0,5% kwasu octowego i uzyskuje czysty kwas H w postaci ruchliwego oleju o barwie bladożółtej (145 mg, 95% wydajności): [a]_D +87,0° (c 1,4, CHC1₃); EIMS m/z 343(1; M⁺ -OH), 303(5), 275(9), 257(4), 229(62) , 213(16), 171(22), 143(37), 131(16), 115(23), 97(100), 91(44); HREIMS m/z 343,2107(C₂₁H₃iO₂Si, Δ -1,3 mmu), 229,1220(C₁₅Hi₇O₂, Δ +0,9 mmu); UV(MeOH) λπ,_3χ (ε) 206(24500), 252(15600) nm; IR v_max 3300-2800(szerokie), 2956, 2856, 1697, 1651, 1419, 1256, 1097, 836, 693 cm'¹;

'H NMR δ 10,4(COOH, bs, W,_/2 około 100), 7,2-7,4(Ph-H₅; m), 7,09(3-H; ddd, 15,6/7,6/7,6), 6,39(8-H; d, 15,9), 6,16(7-H; dd, 15,9/8,1), 5,85(2-H; d, 15,6), 3,78(5-H; ddd, 6,0/6,0/4,2), 2,46(6-H; m), 2,40(4-¾ m), l,12(6-Me; d, 6,9), 0,92(Si-CMe₃; s), 0,07(Si-Me₂; s);

185 949 ¹³C NMR δ 171,6(1), 149,1(3), 137,5(Phl'), 131,8(8), 130,5(7), 128,5(Ph 375'), 127,l(Ph 4'), 126,l(Ph 276'), 122,7(2), 74,9(5), 42,9(6), 37,6(4), 25,8 (Si-CMgj), 18,l(SiCMe₃), 16,1 (6-Me), -4,4(Si-Me), -4,5(Si-Me).

2,2,2-trichloroetylowy ester 3-(3-chloro-4-metoksyfenylo)-D-alaniny (I).

Próbkę pochodnej BOC D-chlorotyrozyny (160 mg, 0,35 mmoli) rozpuszcza się w 3 ml kwasu trifluorooctowego i pozostawia w temperaturze pokojowej w czasie 1 godziny. Nadmiar reagentu oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje pożądaną aminę I w postaci soli z kwasem trifluorooctowym (165 mg, wydajność 100%), [a]o +1,7° (c 5,2, CHCh); IR ν^χ 3400-2500 (szerokie), 1760,1680,1500, 1200, 1130, 1070, 805, 710 cm'¹;

Ή NMR δ 8,07 (NH₂, bm, W_1/2 około 45), 7,27(5-H; s), 7,12(9-H; d, 8,1), 6,88(8-H; d, 8,1), 4,86/4,67(CH₂CCl₃; AB q, -12,0), 4,41(2-H; b s, Wl/2 około 20), 3,86(OMe; s), 3,33(3H; dd, -14,4/3,6), 3,22(3-H'; dd, -14,4/6,6);

¹³C NMR δ 167,6(1), 155,0(7), 130,9(5), 128,8(9), 125,4(4), 123,1(6), 112,7(8), 93,4(CC1₃), 75,3(CH₂CC1₃), 56,l(OMe), 54,2(2), 34,9(3).

Związek J.

W czasie mieszania do roztworu H (25 mg, 0,07 mmoli) w 3 ml bezwodnego dimetyloformamidu w atmosferze argonu, kolejno dodaje się pentafluorodifenylofosfinian (FDPP, 32 mg, 0,08 mmoli), sól związku I z kwasem trifluorooctowym (35 mg, 0,07 mmoli) i diizopropyloetyloaminę (DIEA, 27 mg, około 36 μΐ, 0,21 mmoli, około 3 równoważników). Mieszanie kontynuuje się w temperaturze 25°C w czasie 1 godziny i następnie mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się 20 ml eteru dietylowego. Eterowe ekstrakty przemywa się 10 ml 1 normalnego kwasu solnego i kolejno 10 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodowego, 20 ml solanki i 20 ml wody, suszy nad siarczanem magnezowym i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostały olej o barwie bladożółtej poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym (15% octanu etylu w heksanie) i uzyskuje J w postaci bezbarwnego oleju (32 mg. wydajność 65%): [α]β +11,8° (c 1,2, CHC1₃); EIMS m/z 644/646/648/650(7/8/6/3; NT-t-Bu), 570/572/574(46/100/21), 536/538(18/15), 394/396(67/29), 275(20), 155/157(29/9); HREIMS m/z 644,0981 (C₂₉H₃₄C14NO₅Si, Δ -2,13 mmu); UV (ε) 204(54900), 230(23200), 248(19200) 284(3500) nm; IR 3290,2980,2850,1760,1680,1640,1505,1380,1270,1169, 990, 720 cm¹';

'H NMR jednostka A δ 7,2-7,4(Ph-H₅ ; m), 6,87(3-H; ddd, 15,0/7,8/7,5), 6,37(8-H; d, 16,2), 6,18(7-H; dd, 16,2/8,1), 5,82(2-H; d, 15,0), 3,75(5-H; ddd, 9,9/6,0/4,8), 2,46(6-H; m), 2,36(4-H₂; m), 1,11 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe₃; s), 0,07(Si-Me; s); 0,06(SiMe; s); jednostka B δ 7,19(5-H; d, 2,1), 7,04(9-H; dd, 8,4/2,1), 6,85(8-H; d, 8,4), 5,85(NH; d, 7,8), 5,08(2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,81/4,74 (CH₂CC1₃; AB q, -11,7), 3,87(OMe; s), 3,22(3-H; dd, -14,1/5,7), 3,12(3-H'; dd,-14,1/6,0).

¹³C NMR jednostka A δ 165,1(1), 143,0(3), 137,6(9), 132,0(8), 130,4(7), 128,5(11/13), 127,0(12), 126,0(10/14), 124,7(2), 75,0(5), 42,6(6), 37,6(4), 25, (Si-CM^), 18,1 (Si-CMe₃), 16,5(6-Me), -4,3(Si-Me), -4,6(Si-Me); jednostka B δ 170,1(1), 154,3(7), 131,1(5), 128,5(4/9), 122, 6 (6) 112,2(8), 94,2 (CC1₃), 74,8(CH₂CC1₃), 56,l(OMe), 53,0(2), 36,5(3).

(l'R,5S,6R)-N-r-(Karbo-2,2,2-trichloroetoksy)-2'-(3-chloro-4-metoksyfenylo)etylot-butylodimetylosililoksy-6-metylo-8-fenylookta-2E,7E-dienoamid (K).

Do roztworu J (50 mg, 0,07 mmoli) w 4 ml acetonitrylu dodaje się 400 μΐ 50% wodnego roztworu fluorowodoru i całość miesza w temperaturze 25°C w czasie 1 godziny. Ekstrahuje się do 30 ml eteru dietylowego, następnie przemywa eterowy ekstrakt 30 ml porcjami nasyconego wodorowęglanu sodowego, solanki i wody, suszy nad siarczanem magnezowym, oddestylowuje rozpuszczalnik i uzyskuje alkohol K w postaci bezbarwnej piany (40 mg, wydajność 95%): [a]o -6,1° (c 1,3, CHC₃); EIMS m/z (względna intensywność) 587/589/591/593(M+<l%), 552/554/556(1/2/0,5), 456/458/460/462 (1/2/1/0,2), 342/344/346(7/8/4), 212/214(15/5), 195/197 (6/2), 155/157 (99/34), 131(100), 91(77); HREIMS m/z 587,0721 (C₂₇H₂₉ ³⁵C1₄NO₅, Δ + 7,9 mmu); UV 4» (ε) 204(56500), 230 (22100), 248(18100), 284(3600) nm; IR v_max 3400, 3300, 2980, 1780, 1680, 1640, 1505, 1270, 1180, 1090, 1000, 770 cm¹'.

’H NMR jednostka A δ 7,2-7,4(Ph-H₅; m), 6,92(3-H; ddd, 15,3/7,8/7,5), 6,46(8-H; d, 15,9), 6,14(7-H; dd, 15,9/8,4), 5,90(2-H; d, 15,3), 3,65(5-H; ddd, 7,8/5,6/4,0), 2,39(6-H/4-H₂; szerokie m), 1,78(OH; szerokie s, W_t/₂ około 40 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6,9); jednostka B. δ

185 949

7,18(5-H; d, 1,8), 7,03(9-Η; dd, 8,4/1,8), 6,84(8-Η; d, 8,4), 5,97(ΝΗ; d, 7,8), 5,06(2-Η; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,79/4,72 (CH₂CC1₃; AB q, -12,0), 3,86(OMe; s), 3,20(3-H; dd, -14,1/5,7), 3,10(3-H'; dd, -14,1/6,0).

¹³C NMR jednostka A δ 165,3(1), 142,6(3), 137,0(9), 131,7(8), 131,0(7), 128,5(11/13), 127,3(12), 126,1(10/14), 125,0(2), 73,8(5), 43,2(6), 37,2(4), 16,8(6-Me); jednostka B 8 170,2(1), 154,2(7), 131,0(5), 128,4(9), 128,3(4), 122,5(6), 112,2(8), 94,2(CC1₃), 74,7(CH₂CC1₃), 56,l(OMe), 53,0(2), 36,5(3).

Kwas 3-(t-butoksykarbonylo)amino-2,2-dimetylopropionowy (M).

Do roztworu 3-amino-2,2-dimetylopropanolu-l (L) (3,0 g, 29 mmoli) w 51 ml 10% roztworu trietyloaminy w metanolu dodaje się diwęglan di-t-butylu (6,7 g, 31 mmoli) i całość miesza w temperaturze 25°C w czasie 1 godziny. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika pozostałość rozpuszcza się w chlorku metylenu (30 ml) i roztwór dwukrotnie przemywa 1 molowym roztworem wodorosiarczanu potasowego (pH 2) i raz nasyconym roztworem chlorku sodowego, po czym suszy nad siarczanem magnezowym. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje 5,8 g (wydajność 93%) 3-(butoksykarbonylo)amino2,2-dimetylopropanolu-l w postaci ciała stałego o barwie białej, które bezpośrednio stosuje się w następnym etapie bez dalszego oczyszczania (czystość wyższa niż 95%, na podstawie analizy NMR), temperatura topnienia 70,5-71,5°C; IR v_max 3350,1685, 1456 cm’¹;

’H NMR δ 4,87(NH; szerokie s), 3,72(OH; szerokie s), 3,19(1-H₂; d, 5,1), 2,95(3-H₂; d, 6,0), l,44(CMe₃; s), 0,85(2-Me₂; s);

¹³C NMR (CDC1₃) δ 157,6 (BOC CO), 79,7(CMe₃), 68,1(1), 47,1(3), 36,7(2), 28.3(CMe₃). 22,4(2-Me₂).

Do roztworu alkoholu 3-(t-butoksykarbonylo) amino-2,2-dimetylopropanolu-l (5,3 g, 25,9 mmoli) i nadjodanu sodowego (16,6 g, 77,7 mmoli) w czterochlorku węgla (52 ml), acetonitrylu (52 ml) i wodzie (78 ml) dodaje się wodzian trichlorku rutenu (122 mg) i całość miesza w temperaturze 25°C w czasie 24 godzin. Mieszaninę sączy się przez warstwę celitu i dodaje roztwór nasyconego węglanu potasowego w wodzie (50 ml). Oddziela się warstwę wodną, przemywa eterem (20 ml), zakwasza kwasem solnym do wartości pH 2 w temperaturze 0°C i ekstrahuje chlorkiem metylenu (trzykrotnie po 30 ml). Połączone ekstrakty przemywa się nasyconym roztworem chlorku sodowego i suszy nad siarczanem magnezowym. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymaną pozostałość poddaje się szybkiej chromatografii na odwróconej fazie, przy użyciu kolumny Cl8 (ODS 120A, 50 do 90% metanolu), następnie produkt krystalizuje z eteru i uzyskuje 3,7 g (wydajność 66%) związku M, w postaci ciała stałego o barwie białej i temperaturze topnienia 106-108°C; EIMS m/z (względna intensywność) 217(0,1), 161(11), 98(25), 88(71), 57(100); HREIMS m/z 217,1292 (Ci₀Hi₉NO₄, Δ +2,2 mmu); IR v_ma,_x 3450-2500, 1710, 1694, 1510 cm’¹;

*H NMR głównego konformera δ 5,03(NH; szerokie s), 3,26(3-H₂; m), l,45(CMe₃; s), 1,24(2-Me₂; s);

¹³C NMR (CDC1₃) δ 183,2(1), 156,3 (BOC CO), 79,6(CMe₃), 49,5/47,9 (2/3), 28.4(CMe₃). 22,9(2-Me₂).

(2S)-2-Hydroksy-4-metylopentanian allilu (N).

Do roztworu 2,66 g kwasu L-leucynowego (20 mmoli) i 1,74 g wodorowęglanu sodowego (20 mmoli) w 30 ml wody w temperaturze 0°C dodaje się 30 ml roztworu 6,44 g chlorku tetrabutyloamoniowego (20 mmoli) i 1,74 ml bromku allilu (20 mmoli) w chlorku metylenu. Całość silnie miesza się w czasie 24 godzin i oddestylowuje chlorek metylenu. Do pozostałości dodaje się 50 ml wody i wodną warstwę czterokrotnie ekstrahuje eterem dietylowym. Eterowy roztwór suszy się nad bezwodnym siarczanem sodowym i następnie oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość przeprowadza się przez krótką kolumnę z żelem krzemionkowym i uzyskuje 3,21 g allilowego estru N (wydajność 93%) w postaci bezbarwnego oleju. [a]o 8,4° (c 1,1, CHC1₃); IR v_max 3464, 2957, 1732, 1203, 1140, 1087 cm’¹;

*H NMR δ 5,92(allilowe 2-H; m), 5, 34(allilowe 3-H₂; dd, 17,4/1,1), 5,28(allilowy 3-H₂; dd, 10,5/1,1), 4,67(allil 1-H₂; d, 5,7), 4,23(2-H; szerokie s,), 2,64(OH; szerokie s), 1,89(4-H; m), 1,57(3-H₂; m), 0,96(5-H₃; d, 6,5), 0,95(4-Me; d, 6,7);

185 949 ¹³C NMR δ 175,3(1), 131,4(alliloweC-2), 118,6(3), 68,9(2), 65,7(allilowe C-l), 43,2(3), 24,1(4), 23,0(5), 21,3(4-Me).

(2S)-2-[3'-(t-butoksykarbonylo)amino-2',2'-dimetylopropanoiloksy]-4-metylopentanonian allilu (O).

Do roztworu 0,8 g M (3,7 mmoli), 0,76 g N (4,4 mmoli) i 92 mg DMAP w 10 ml bezwodnego chlorku metylenu w temperaturze 0°C dodaje się 0,84 g DCC (4,1 mmoli) w chlorku metylenu. Całość miesza się, w temperaturze 25°C w czasie 3 godzin i następnie sączy. Przesącz przemywa się nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodowego, suszy nad siarczanem sodowym i pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość poddaj e się szybkiej chromatografii (żel krzemionkowy, 5% octanu etylu w heksanie) i uzyskuje 1,0 g (wydajność 92%) czystego O w postaci bezbarwnego oleju, Rf 0,68 (octan etylu z heksanem w stosunku 17:83), [a]o -29,4° (c 18,1, CHCfi); EIMS m/z (intensywności względna) 371 (2, M⁺), 242(13), 184(12), 126(20), 84(100); HREIMS i/z 371,2317 (CigHpNOć, A-0,9mmu); IR (bez rozpuszczalnika) v_max 3385, 2963,1731,1720, 1513 cm'¹;

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃) δ jednostka C 5,39 (NH; przesłonięty szeroki s), 3,33(3-H; dd, -13,5/7,4), 3,27(3-H'_; dd, -13,5/5,9), 2,78(2-H, m), l,44(CMe₃; s), 1,23(2-Me; s), 1,22(2Me; s); δ jólnostka D 5,91 allilowe 2-H, ddt, 16,6/10,3/6,0 Hz), 5,34(allilowe 3-H_z; szeroki d, 16,6), 5,27(allilowe 3-H_E; szeroki d, 10,3), 5,08(2-H; dd, 9,6/3,6), 4,65(allilowe 1-H₂; m), 1,6l,9(3-H₂/4-H; m), 0,94(5-H₃; d, 6,3), 0,94(4-Me; d, 7,3).

¹³C NMR δ jednostka C 176,5 (1), 156,3 (BOC CO), 79,0(CMe₃), 48,6(3), 44,0(2), 28.4(CMe₃), 22,2/23,0(2-Me2); δ jednostka D 170,6 1), 131,4(allilowe C-2), 119,1 (allilowe C-3), 70,9(2), 6,0(allilowe C-l), 39,5(3), 24,8(4), 23,0(5), 21,5 4-Me).

Kwas (2S)-2-[3'-(t-butoksykarbonylo)amino-2',2'-dimetylopropanoiloksy]-4-metylopentanowy (P).

Do 10 ml roztworu 180 mg (0,49 mmoli) O i 60 mg (0,05 mmoli) tetrakis- (trifenylofosfino)palladu w bezwodnym tetrahydrofuranie (w atmosferze argonu) powoli dodaje się 470 μΐ (5,4 mmoli) bezwodnej morfoliny w czasie 10 minut. Całość miesza się w czasie 50 minut, dodaje 40 ml eteru i roztwór przemywa 1 normalnym kwasem solnym (40 ml) i następnie ekstrahuje nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego (dwukrotnie po 30 ml). Wodny ekstrakt zakwasza się 0,5 normalnym kwasem solnym i ekstrahuje eterem (40 ml). Eterowy ekstrakt przemywa się wodą (dwukrotnie po 30 ml), suszy nad siarczanem magnezowym, pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje się rozpuszczalnik i uzyskuje P w postaci ruchliwego, bezbarwnego oleju (152 mg, 95%); [a]o -22,2° (c 2,2, CHC1₃); EIMS m/z (względna intensywność) 331(1, M⁺), 275(1), 258(4), 231(9), 202(36), 174(13), 144(31), 126(16), 114(14), 98(54), 88(50), 84(100); HREIMS m/z 331,2004 (C₁₆H₂₉NO6, Δ -1,0 mmu);

Ή NMR (CDC1₃) jednostka C δ 5,41 (NH; dd, 5,7/5,4), 3,30(3-H₂; m), 2,68(2-H, m), l,43(CMe₃; szerokie s), l,21(2-Me; s); jednostka D δ 6,47(1-OH; szerokie s, Wi/₂ około 35), 5,09(2-H; dd, 9,3/2,7), l,7-l,9(3-H₂/4-H; m), 0,97(5-H₃; d, 6,0), 0,94(4-Me; d, 6,0).

¹³C NMR (CDC1₃) jednostka C δ 176,5(1), 156,5(BOC CO), 79,3(CMe₃), 48,6(3), 44,0(2), 28.3(CMe₃) , 23,0(2-Me), 22,2(2-Me); jednostka D δ 176,5(1), 156,5(BOC CO), 79,3(CMe₃), 48,6(3), 44,0(2), 28,3(CMe₃), 23,0(2-Me), 22,2(2-Me); jednostka D δ 175,4(1), 70,6(2), 39,5(3), 24,8(4), 23,0(5), 21,4(4-Me).

Związek Q.

Do roztworu alkoholu K (80 mg, 0,14 mmoli), kwasu P (68 mg, 0,21 mmoli) i DMAP (4 mg) w bezwodnym chlorku metylenu (4 ml), w czasie mieszania, w temperaturze 0°C w atmosferze argonu dodaje się DCC (44 mg, 0,21 mmoli) w bezwodnym chlorku metylenu (1 ml). Całość miesza się w temperaturze 0°C w czasie 30 minut. W tym czasie wytrąca się osad o barwie białej, następnie pozwala się aby temperatura wzrosła do pokojowej i mieszanie kontynuuje w czasie 4 godzin. Osad odsącza się, przesącz rozcieńcza eterem dietylowym (40 ml) i kolejno przemywa rozcieńczonym kwasem solnym (1 molowy, 40 ml), nasyconym wodorowęglanem sodowym (40 ml) i solanką (40 ml). Eterowe warstwy suszy się nad siarczanem magnezowym, pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje z nich rozpuszczalnik i uzyskuje produkt w postaci wosku. Przeprowadza się chromatografię (żel krzemionkowy, octan etylu w heksanie w stosunku 1:3) i uzyskuje czysty Q w postaci bezbarwnego, gęstego oleju (103

185 949 mg, 84%), [a]_D -3,1° (c 2,9, CHC1₃) ; EIMS m/z 800/802/804/806 (<1, M⁺ -C₅H₈O₂), 415/417/419/421 (5/3/3/2), 342/344/346(7/9/4), 286/288/290(2/6/2), 207(34), 178(22), 155/157(66/24), 131(36), 91(70), 70(100); HREIMSm/z 800,2179 (C^H^Os Cl₄, Δ -1,4 mmu) ; UV (MeOH) X_max (ε) 204 (51200), 230(18500), 248(17200), 282(2200) nm;( IR NaCl) v_max3376,2965,1755,1728,1678,1504,1258,1150,1067, 732 cm'¹;

’H NMR (CDC1₃) jednostka A δ 7,28-7,33(10-H/14-H/ll-H/13-H; m), 7,22(12-H; m), 6,78(3-H; ddd, 15,8/6,4/6,3), 6,40(8-H; d, 15,8), 6,01(7-H; dd, 15,8/8,7), 5,88(2-H; d, 15,8), 5,06(5-H; szerokie m, Wj/₂ około 20 Hz), 2,62(6-H; m), 2,53(4-H₂; szerokie m, około 15 Hz), l,12(6-Me; d, 6,8); jednostka B δ 7,18(5-H; d, 2,0), 7,05(9-H; dd, 8,5/2,0), 6,83(8-H; d, 8,5), 6,49(NH; d, 7,9), 5,06(2-H; szerokie m, W_V2 około 20 Hz), 4,79/4,70(CH₂CCl₃; AB q, -11,7), 3,85(OMe; s), 3,20(3-H_b; dd, -14,1/5,8), 3,07(3-H_a; dd, -14,1/6,7); jednostka C 5,38 (NH; szerokie t, 6,5), 3,27(3-H₂; d, 6,5), l,20(2-CH₃; s), 1,15(2-CH₃'; s); jednostka D 4,92%(2-H; dd, 10,0/3,8), 1,72(4-H; szerokie m, W_1/2 około 20 Hz), 1,67(3-¾ ddd, -14,1/10,0/5,0), 1,56(3-¾ ddd, -14,1/9,1/3,8), l,43(COOCMe₃; s), 0,86(4-CH₃; d, 6,4), 0,82(5-¾ d, 6,4).

^l3C NMR (CDC1₃) jednostka A δ 165,4(1), 139,3(3), 136,9(9), 131,7(8), 130,1(7), 128,6(11/13), 127,5(12), 126,2(10/14), 125,4(2), 76,5(5), 41,1(6), 33,4(4), 16,7(6-Me); jednostka B δ 170,0(1), 154,1(7), 131,2(5), 128,8(4), 128,5(9), 122,3(6), 112,1(8), 94,3(CH₂CC1₃), 74,6(CH₂CC1₃), 56,l(7-OMe), 53,2(2), 36,6(3); jednostka C 176,9(1), 156,4(COOCMe₃), 79,l(COOCMe₃), 48,7(3), 44,0(2), 22,8(2-Me), 22,3(2-Me'); jednostka D 170,7(1), 71,4(2), 39,5(3), 28,4(COOCMe₃), 24,8(4), 23,0(4-Me), 21,4(5).

Aminokwas R.

Do aminokwasu Q (100 mg, 0,11 mmoli) dodaj e się aktywowany pył cynkowy (400 mg, nadmiar) i kwas octowy (4 ml). Heterofazową mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków w czasie 45 minut, miesza w czasie 90 minut w temperaturze pokojowej i następnie wylewa na warstwę celitu. Substancje organiczne wymywa się z warstwy celitu za pomocą chlorku metylenu. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje kwas karboksylowy w postaci bezpostaciowego, bezbarwnego ciała stałego.

Bez oczyszczania surowy kwas rozpuszcza się w kwasie trifluorooctowym (TFA, 5 ml) i miesza w temperaturze pokojowej w czasie 1 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje się nadmiar kwasu trifluorooctowego i uzyskane bezpostaciowe ciało stałe oczyszcza się za pomocą chromatografii (Sep-Pak™, żel krzemionkowy, początkowo chlorkiem metylenu, a następnie 10% metanolem w chlorku metylenu) i uzyskuje trifluorooctanoamoniową sól pożądanego związku. Przeprowadza się liofilizację wodnego roztworu soli i uzyskuje wolny aminokwas R w postaci bezbarwnego, bezpostaciowego ciała stałego (68 mg, 91% w dwóch etapach); IR (NaCl) v_max 3300, 3200, 2965, 1693, 1606, 1504, 1441, 1259, 1201, 1146, 1066, 727 cm'¹;

’H NMR (CD₃OD) jednostka A δ 7,33 (10-H/14-H; d, 7,4), 7,28(11-H/13-H; t, 7,4), 7,18-7,23( 12-H; m), 6,69(3-H; ddd, 15,6/7,7/7,0), 6,43(8-H; d, 15,8), 6,04 (7-H; dd, 15,8/8,9), 6,00(2-H; d, 15,6), 5,01(5-H; ddd, 9,1/6,9/3,1), 2,64(4-¾ szerokie m, Wi_/2 około 30 Hz), 2,60(6-H; szerokie m, W1/2 około 20 Hz), 2,49(4-¾ ddd, 15,8/9,1/7,7), l,13(6-Me; d, 6,7); jednostka B δ 7,18-7,23 (5-H; m), 7,11(9-H; dd, 8,3/1,6), 6,92(8-H; d, 8,3), 4,59(2-H; szerokie m, Wi/₂ około 20 Hz), 3,81(OMe; s), 3,14(3-¾ dd, -13,7/4,3), 2,96(3-¾ m, W,_/2 około 20Hz); jednostka C 2,96 (3-¾ szerokie m, Wj/₂ około 20 Hz), 1,31(2-CH₃; s), 1,25(2-CH₃'; s); jednostka D 4,90(2-H; dd, 9,6/4,0), 1,66(4-H; szerokie m, Wi/₂ około 25 Hz), 1,59(3-¾ ddd, -14,4/9,6/4,8), 1,53(3-¾ ddd, -14,4/9,1/4,0), 0,81(4-CH₃; d, 6,5), 0,74(5-¾ d, 6,5).

¹³C NMR (CD₃OD) δ jednostka A 167,7(1), 140,7(3), 138,4(9), 133,0(8), 131,7(7), 129,6(11/13), 128,5(12), 127,3(10/14), 127,1(2), 78,4(5), 43,1(6), 35,7(4), 17,4(6-Me); jednostka B 179,8(1), 155,2(7), 132,3(4), 132,1(5), 130,1(9), 123,0(6), 113,4(8), 56,6(7-OMe), 56,6(2), 37,8(3); jednostka C 176,8(1), 48,2(3), 42,2(2), 23,3(2-Me), 23,3(2-Me'); jednostka D 172,0(1), 73,4(2), 40,7(3), 26,0(4), 23,1(4-Me), 21,8(5).

Kryptoficyna 51.

W czasie mieszania do roztworu aminokwasu T (75 mg, 0,11 mmoli) w bezwodnym dimetyloformamidzie (20 ml) w temperaturze pokojowej, w atmosferze argonu dodaje się

185 949 diizopropyloetyloaminę (DIEA, 44 mg, 60 (0,1, 0,34 mmoli, około 3 równoważników) i następnie pentafluorodifenylofosfonian (FDPP, 55 mg, 0,14 mmoli, około 1,3 równoważniki) w dimetyloformamidzie (2 ml). Całość miesza się w czasie 12 godzin, dodaje eter dietylowy (40 ml), eterowe warstwy kolejno przemywa kwasem solnym (1 molowy, 40 ml), solanka (40 ml) i woda (40 ml), suszy nad siarczanem magnezowym i rozpuszczalnik oddestylowuje pod zmniejszonym ciśnieniem.

Pozostałe ciało stałe w postaci wosku, oczyszcza się za pomocą chromatografii z odwróconą fazą (ODS, 10 μ, 30% wody w acetonitrylu, 3 ml na minutę) i uzyskuje kryptoficynę 51 w postaci bezbarwnego, bezpostaciowego ciała stałego (45 mg, 61%), [a]o +26,4° (c 0,25, CHC1₃); EIMS m/z 652/654(M⁺ 3/1), 632/634(3/2), 426/428(51/15), 227(64), 195/197(64/22), 155/157(71/15), 131(59), 91(100); HREIMS m/z 652,2936 (C36H45N2O7³⁵C1, Δ -2,1 mmu); UV (MeOH) (ε) 204(52000), 228(20400), 250(13400), 284(2800) nm; IR vmax3376, 3270, 2960, 1747, 1721, 1659, 1536, 1514, 1259, 1150, 1066, 1013,980, 694 cm’¹ *H NMR (CDCI3) jednostka A δ 7,32(10-H/14-H; dd, 8,0/1,5), 7,29(11-H/13-H; t, 8,0), 7,24(12-H; szerokie m, Wi_/2 około 15 Hz), 6,77(3-H; ddd, 15,2/10,8/4,3), 6,40(8-H; d, 15,8), 6,01(7-H; dd, 15,8/8,8), 5,76(2-H; dd, 15,2/1,1), 5,04(5-H; ddd, 11,1/6,4/1,9), 2,54(4-Hb/6-H; szerokie m, Wi/₂ około 15 Hz), 2,37(4-H_a; ddd, -14,3/11,1/10,8), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 8 7,20(5-H; d, 2,0), 7,05(9-H; dd, 8,4/2,0), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,61(NH; d, 7,8), 4,74(2-H; ddd, 7,8/7,6/5,4), 3,87(OMe; s), 3,11(3-H_b; dd, -14,2/5,4), 3,06(3-H_a; dd, -14,2/7,6); jednostka C 7,24(NH; szerokie m, W,/₂ około 15 Hz), 3,40(3-H_b; dd, -13,5/8,5), 3,12(3-H_a; dd, 13,5/3,6), 1,22(2-CH₃; s), 1,15(2-CH₃; s); jednostka D 4,85 (2-H; dd, 10,2/3,6), 1,66(3-H_b; ddd, -14,0/10,2/4,6), 1,61 (4-H; szerokie m, W_1/2 około 20,0 Hz), 1,33(3-H_a; ddd, -14,0/9 0/3,6), 0,74(4-CH₃; d, 6,6), 0,72(5-H₃; d, 6,6).

¹³C NMR (CDC1₃) jednostka A 6 165,1(1), 142,2(3), 136,7(9), 131,7(8), 130,1(7), 128,6(11/13), 127,5(12), 126,1(10/14), 124,6(2), 77,0(5), 42,2(6), 36,5(4), 17,3(6-Me); jednostka B 170,3(1), 154,1(7), 130,9(5), 129,5(4), 128,3(9), 122,5(6), 112,3(8), 56,l(7-OMe), 54,2(2), 35,3(3); jednostka C 178,0(1), 46,5(3), 42,7(2), 22,8(2-Me), 22,6(2-Me'); jednostka D 170,6(1), 71,5(2), 39,5(3), 24,5(4), 22,7(4-Me), 21,2(5).

Przykład7. Synteza kryptoficyny 52 i kryptoficyny 53.

W czasie mieszania, do roztworu kryptoficyny 51 (75 mg, 0,12 mmoli) w bezwodnym chlorku metylenu (7,5 ml) w temperaturze 0°C w atmosferze argonu dodaje się roztwór kwasu m-chloronadbenzoesowego (mCPBA, 50 mg, 0,23 mmole, około 2 równoważników, w przeliczeniu na 80% aktywnego tlenu) w chlorku metylenu (1 ml). Po czasie 30 minut mieszaninę reakcyjną pozostawia się do ogrzania do temperatury pokojowej) i miesza w czasie dalszych 12 godzin. Pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje się rozpuszczalnik i uzyskuje mieszaninę kryptoficyny 52 i kryptoficyny 53 w stosunku odpowiednio 1,8:1 (analiza za pomocą NMR) w postaci bezpostaciowego ciała stałego. Mieszaninę izomerycznych epitlenków rozpuszcza się w minimalnej ilości acetonitrylu i poddaje chromatografii na odwróconych fazach (YMC-ODS, 10 μ, 250 mm x 22,5 mm, 30% wody w acetonitrylu, 6 ml na minutę), w celu rozdzielenia kryptoficyny 52 (37 mg, 48%) i kryptoficyny 53 (19 mg, 25%).

Dane spektralne dla kryptoficyny 52.

[a]_D + 19,9° (c 0,5, CHC1₃); EIMS m/z 668/670(4/2, M⁴), 445(35), 244(12), 227(22), 195/197 (66/27), 184(45), 155/157(38/10), 91(100); HREIMS m/z 668,2873 (Cj^NzOg ³⁵C1, Δ -0,9 mmu), 445,2497 (C₂₅H₃₅NO₆, Δ -3,3 mmu); UV (MeOH) X_max (ε) 204(35100), 218(20900) nm; IR (NaCl) v_max 3415, 3270, 2960, 1748, 1721, 1650, 1536, 1504, 1260, 1192, 1150, 1066, 1013, 800, 698 cm¹;

‘H NMR (CDC1₃) jednostka A δ 7,33-7,38(11-H/12-H/13-H; szerokie m, W_]/2 około 25 Hz), 7,24 (10-H/14-H; m, W,_/2 około 15 Hz), 6,76(3-H; ddd, 15,1/10,8/4,3), 5,71 (2-H; dd, 15,2/1,7), 5,20(5-H; ddd, 11,0/5,0/1,8), 3,68(8-H; d, 1,9), 2,92(7-H; dd, 7,5/1,9), 2,57(4-H_b; ddd, -14,6/1,8/1,7), 2,45(4-H_a; ddd, -14,6/11,0/10,8), 1,78(6-H; szerokie m, Wi/₂ około 15 Hz), l,14(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,18(5-H; d, 2,2), 7,04(9-H; dd, 8,4/2,2), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,56(NH; d, 7,9), 4,73(2-H; ddd, 7,9/7,4/5,3), 3,87(OMe; s), 3,09(3-H_b; dd, -14,6/5,3), 3,05(3-H_a; dd, -14,6/7,4); jednostka C 7,20(NH; dd, 8,6/3,2), 3,41(3-H_b; dd, -13,4/8,6), 3,1O(3-H_a; dd, -13,4/3,2), 1,22(2-CH₃; s), 1,15(2-CH₃'; s); jednostka D 4,82(2-H; dd,

185 949

10,2/3,5), 1,73(3-¾ szerokie m, Wj/₂ około 20 Hz), 1,66(4-H; szerokie m, Wi/₂ około 20,0 Hz), 1 31(3-H_a; ddd, -13,8/9,1/3,5), 0,84(4-CH₃; d, 6,6), 0,82(5-H₃; d, 6,6);

ⁱ³C NMR (CDC1₃) jednostka A δ 164,9(1), 141,8(3), 136,7(9), 128,7(11/13), 128,3(12), 125,6(10/14), 124,7(2), 75,9(5), 63,0(7), 59,0(8), 40,7(6), 36,9(4), 13,5(6-Me); jednostka B 170,3(1), 154,1(7), 130,9(5), 129,5(4), 128,5(9), 122,6(6), 112,4(8), 56,l(7-OMe), 54,3(2), 35,3(3); jednostka C 178,0(1), 46,5(3), 42,8(2), 22,8(2-Me), 22,8(2-Me'); jednostka D 170,5(1), 71,2(2), 39,3(3), 24,6(4), 22,7(4-Me), 21,2(5).

Dane spektralne dla kryptoficyny 52.

[a]_D +20,8° (c 1,7, CHC1₃) ; EIMS m/z 668/670(5/4, M⁺), 445(32), 244(15), 227(24), 195/197(64/21), 184(60),155/157(33/9), 91(100); HREIMS m/z 668,2853 (C36H45N2O8³⁵C1, Δ 1,1 mmu); UV (MeOH) Zmax (ε) 204(38700), 218(22900) nm; IR(NaCl) 3415, 3280, 2917, 2849, 1748, 1722, 1660, 1504,1465, 1260, 1190, 1150, 1066, 755 cm¹';

*H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,29-7,36(11-H/12-H/13-H; szerokie m, Wi/₂ około 20 Hz), 7,23(10-H/14-H; dd, 8,3/1,7), 6,77(3-H; ddd, 15,1/10,9/4,3), 5,81(2-H; dd, 15,1/1,3), 5,17(5-H; ddd, 11,2/4,9/1,8), 3,58(8-H; d, 1,7), 2,90(7-H; dd, 7,8/1,7), 2,67(4-H_b; ddd, 14,7/11,2/10,9), 2,56(4-H_a; dddd, 14,7/4,3/1,8/1,3), 1,67-1,78(6-H; szerokie m, Wj/2 około 45), l,03(6-Me; d, 7,1); jednostka B 7,21(5-H; d, 2,1), 7,07(9-H; dd, 8,5/2,1), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,90(2-NH; d, 7,9), 4,75(2-H; ddd, 7,9/7,9/4,9), 3,85(7-OMe; s), 3,14(3-H_b; dd, 14,5/4,9), 3,03(3-H_a; dd, 14,5/7,9); jednostka C 7,29-7,36(3-NH; szerokie m, W]/₂ około 25), 3,43(3-H_b; dd, -13,7/8,8), 3,10(3-H_a; dd, 13,7/3,4), 1,23(2-CH₃; s), 1,17(2-CH₃'; s); jednostka D 4,92(2-H; dd, 10,3/3,2), 1,67-1,78 (3-Hb/4-H; szerokie m, Wi_/2 około 45), 1,48(3-H_a; ddd, 13,9/8.8/3,2), 0,89(4-CH₃; d, 6,6), 0,86(5-H₃; d, 6,6);

¹³CNMR (CDC1₃) δ jednostka A 165,1(1), 142,0(3), 137,0(9), 128,5(11/13),128,5(12), 125,3(10/14), 124,6(2), 76,7(5), 63,2(7), 56,2(8),40,8(6), 36,7(4), 13,4(6-Me); jednostka B 170,4 (1), 154,0(7),130,8(5), 129,7(4), 128,2(9), 122,5(6), 112,3(8), 56,l(7-OMe), 54,4(2), 35,3(3); jednostka C 177,9(1), 46,4(3),42,7(2), 23,0(2-Me), 22,7(2-Me); jednostka D 170,5(1), 71,3(2), 39,2(3), 24,7(4), 22,8(4-Me), 21,3(5).

Przykład 8. Syntezakryptoficyny 55.

Do roztworu kryptoficyny 52 (6 mg, 0,009 mmoli) w 0,6 ml mieszaniny 1,2dimetoksyetanu i wody, w stosunku 2:1, dodaje się 2 μΐ 12 normalnego kwasu solnego. Całość miesza się w temperaturze pokojowej w czasie 20 godzin, zobojętnia węglanem potasowym, sączy przez sączek 5 μ i oddestylowuje rozpuszczalnik. Substancję rozpuszczalną w acetonitrylu oczyszcza się za pomocą chromatografii HPLC na odwróconych fazach, przy użyciu kolumny C 18 (250 x 10 mm), stosując mieszaninę metanolu i wody w stosunku 4:1 i uzyskuje 3,0 mg kryptoficyny 55 (48%). [a]p +42,5° (c 1,1, CHC1₃) ; EIMS m/z 704/706/708(M⁺ mniejsze niż 1), 668/670(1,5/0,5, M⁺ -HC1), 445(6), 226(8), 195/197(16/5), 184(10), 155/157(33/11), 135(100), 91(99). 77(30); HREIMS m/z 668,2873 (M⁺ -HC1, C36H45N2O8³⁵C1, Δ -0,8 mmu); UV (MeOH) Xinax (ε) 204(48400), 218(29200), 284(1600) nm;

IR (NaCl) v_max 3410, 3286, 2959, 1748, 1723, 1666, 1538, 1504, 1455, 1257, 1178, 1066, 753 cm¹;

‘H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,35-7,42(10-H/11-H/12-H/13-H/14-H; m), 6,78(3-H; ddd, 15,1/10,6/4,5), 5,78(2-H; dd, 15,1/1,7), 5,16(5-H; ddd, 11,1/8,3/2,1), 4,65(8-H; d, 9,7), 4,01(7-H; szerokie d, 9,7), 2,69(4-H_b; dddd, -14,5/4,5/2,1/1,7), 2,50(6-H; szerokie m, Wi/₂około 15), 2,38(4-H_a; ddd, 14,5/11,1/10,6), 1,53(7-OH; s), l,04(6-Me; d, 7,1); jednostka B 7,21 (5-H; d, 2,2), 7,07(9-H; dd, 8,5/2,2), 6,85(8-H; d,8,5), 5,57(2-NH; d, 7,8), 4,74(2-H; ddd, 7,8/7,6/5,2), 3,88(7-OMe; s), 3,13(3-H_b; dd, 14,5/5,2), 3,05(3-H_a; dd,14,5/7,6); jednostka C 7,21(3-NH; m), 3,38(3-H_b; dd,13,5/8,3), 3,17(3-H_a; dd, 13,5/4,1), 1,23(2-CH₃; s), 1,17(2CH₃'; s); jednostka D 4,93(2-H; dd, 10,1/3,5), 1,78(3-H_b;ddd, 13,5/10,1/5,0), 1,72(4-H; szerokie m, Wi/₂ około 20), 1,43(3-H_a; ddd, 13,5/8,8/3,5), 0,92(4-CH₃; d, 6,6), 0,92(5-H₃;d, 6,4);

¹³C NMR (CDC1₃) δ jednostka A 165,1(C-1), 142,4(C-3),138,4(C-9), 129,0(C-l 1/13), 128,3(C-12), 128,0(C-10/14), 124,6(C-2), 76,l(C-5), 74,l(C-7), 62,0(C-8), 38,4(C-6), 36,5(C-4), 8,6(6-Me); jednostka B 170,3(C-l), 154,l(C-7), 30,9(C-5), 129,6(C-4), 129,2(C-9), 122,6(C-6), 112,3(C-8),56, l(7-OMe), 54,3(C-2), 35,3(C-3); jednostka C 177,8(C-1), 46,5(C-3), 42,8(C-2),

185 949

22,9(2-Me), 23,0(2-Me'); jednostka D 170,3(C-l), 71,3(C-2), 39,7(C-3), 24,8(C-4), 22,7(4-Me), 21,6(C-5). Uzyskuje się również odpowiedni diol, kryptoficyne56 (2,8 mg, wydajność 44%).

Przykład 9. Syntezakryptoficyny57.

Niewielką ilość dwutlenku platyny (około 1 mg) dodaje się do kolby zawierającej 0,5 ml chlorku metylenu. Z kolby wyciąga się powietrze i wprowadza wodór, po czym zawartość kolby miesza się w temperaturze pokojowej w czasie 20 minut.

Do kolby dodaje się roztwór zawierający 10,2 mg kryptoficyny 52 (0,015 mmoli) w chlorku metylenu (0,3 ml) i całość miesza w temperaturze pokojowej w czasie kolejnych 30 minut. Katalizator usuwa się za pomocą sączenia przez warstwę celitu i bawełny, a następnie, rozpuszczalnik oddestylowuje pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość poddaje się chromatografii HPLC na odwróconych fazach (ODS, 10 μ 250 x 22,5 mm, mieszanina acetonitrylu i wody w stosunku 3:1, 5 ml na minutę) i uzyskuje czystą kryptoficynę 57 (9,1 mg, 89%). [a]_D +3,4°(c=4,5, CHC1₃) ; EIMS m/z 670/672(M\ 9/3), 447 i (10), 246(63), 229(20), 195/197 (78/25), 184(58), 155/157(39/13), 128(21), 91(100), 77(23); HREIMS m/z 670,3037 (C₃6Ha₇N2O8³⁵C1, Δ -1,6 mmu); UV (MeOH) (ε) 204(31400), 218(12000), 284(1200) nm;

H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,30-7,37 (11/12/13-H; szerokie m), 7,23(10/14-H; szerokie dd, ) 7,9, 1,9), 5,03(5-H; ddd, 9,0, 5,6, 3,4), 3,66(8-H; d, 2,1), 2,89 (7-H; dd, 7,7, 2,1), 2,27(2-H_b; ddd, 14,3, 8,7, 6,2), 2,04(2-H_a; ddd, 14,3, 8,-8, 6/8), 1,64-1,75 (6-H/4-H₂; szerokie m), 1,61(3¾. szerokie m, W1/2 około 25), 1,11(6-Me; d, 7,1); i jednostka B 7,19(5-H; d, 2,1), 7,04(9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,83 5 (8-H; d, 8,3), 5,55(2-NH; d, 8,3), 4,65(2-H; ddd, 8,3, 7,3, 5,3), 3,87(7-OMe; s), 3,16(3-H_b; dd, 14,3, 7,3), 3,O8(3-H_a; dd, 14,3, 5,3); jednostka C 6,91(3NH; dd, 6,4, 6,4), 3,41(3-H_b; dd, 13,5, 6,4), 3,30(3-H_a; dd, 13,5, 6,4), 1,21(2-CH₃; s), 1,13(2CH₃'; s); jednostka D 4,80(2-H; dd, 9,8, 4,1), 0 l,64-l,75(3-Hb/4-H; szerokie m), 1,34 (3-H_a; ddd, 15,4, 10,1,4,1), 0,86(4-CH₃; d, 6,5), 0,84(5-H₃; d, 6,5);

¹³C NMR (CDC1₃, δ jednostka A 172,6(1), 136,9(9), 128,7(11/13), 128,5(12), 125,6(10/14), 76,8(5), 63,4(7), 59,2(8), 40,2(6), 36,2(2), 32,2(4), 21,4(3), 13,6(6-Me); jednostka B 170,4(1), 154,0(7), 15 131,1(5), 130,0(4), 128,5(9), 122,5(6), 112,2(8), 56,1(7OMe), 54,3(2), 35,3(3); jednostka C 177,6(1), 47,0(3), 43,1(2), 22,5(2-Me'), 22,4(2-Me); jednostka D 171,7(1), 72,0(2), 39,0(3), 24,6(4), 22,8(4-Me), 21,8(5).

Przykład 10. Syntezakryptoficyny58.

W czasie mieszania do roztworu kryptoficyny 57 (5,5 mg, 0,008 mmoli) w 3 ml chloroformu pozbawionego etanolu w temperaturze około -60°C dodaje się TMSC1 (odczynnik z firmy Aldrich, około 4,5 mg, około 5,2 μΐ, około 0,04 mmoli). Całość miesza się w czasie 20 minut, po czym za pomocą chromatografii cienkowarstwowej stwierdza zanik substancji wyjściowej. Lotne składniki mieszaniny reakcyjnej oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje bezpostaciowe ciało stałe. Substancję tę umieszcza się w acetonitrylu i poddaje chromatografii HPLC (ODS, 10μ 250 x 22,5 mm, mieszanina acetonitrylu i wody w stosunku 3:1, 5 ml na minutę) i uzyskuje czystą kryptoficynę 58 (5,4 mg, 93%) w postaci głównego produktu. [oi]d +7,2° (c 2,1, CHC1₃); EIMS m/z 706/708/710(M⁺, 27/23/8), 670/672(M* -HC1, 14/13), 583(54), 581(53), 485(23), 483(21), 447(34), 294(21), 282(39), 246(57), 195/197(87/27), 184(73), 155/157(45/10), 128(30), 91(95), 77(30), 69(100); HREIMS m/z 706,2844 (C36H48N2O8³⁵C12, Δ -5,6 mmu) , m/z 670,3070 (M⁺ -HC1, C₃₆H47N₂O₈ ³⁵C1, Δ -4,9 mmu); UV (MeOH) (ε) 204(331900), 218(11800), 284(1800) nm;.

H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,34-7,42(10/11/12/13/14-H; szerokie m), 5,01(5-H; ddd, 9,6, 8,3, 2,5), 4,65(8-H; d, 9,6), 4,00(7-H; dd, 9,6, 1,9), 2,42(6-H, ddq, 8,3, 1,9, 7,0), 2,29(2-H_b; ddd, 14,3, 9,4, 4,5), 2,06(2-H_a; ddd, 14,3, 8,3, 7,5), 1,62-1,82 (3-H₂/4-H₂, szerokie m), 0,99(6-Me; d, 7,0); jednostka B 7,20(5-H; d, 2,1), 7,06(9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,84(8-H; d, 8,3), 5,62(2-NH; d, 8,3), 4,61(2-H; ddd, 8,3, 7,7, 5,4), 3,87(7-OMe; s), 3,17(3-H_b; dd, 14,3, 7,7), 3,11(3-H_a; dd, 14,3, 5,4); jednostka C 6,97(3-NH; dd, 6,4, 6,2), 3,43(3-H_b; dd, 13,4, 6,2), 3,31(3-H_a; dd, 13,4, 6,4), 1,23(2-CH₃; s), 1,16 (2-CH₃'; s); jednostka D 4,93(2-H; dd, 10,0, 4,0), 1,86(3-H_b; ddd, 14,0, 10,0, 5,5), 1,58 (3-H_a; ddd, 14,0, 8,3, 4,0), 0,97(4-CH₃; d, 6,8), 0,94(5-H₃; d, 6,6);

^I3C NMR (CDC1₃) δ jednostka A 172,8(1), 138,7(9), 129,0(12), 128,9(11/13), 128,0(10/14), 76,5(5), 73,8(7), 5 62,1(8), 38,1(6), 35,9(2), 31,8(4), 21,4(3), 8,7(6-Me); jed

185 949 nostka Β 170,6(1), 153,9(7), 131,0(5), 130,2(4), 128,5(9), 122,4(6), 112,2(8), 56,l(7-OMe), 54,4(2), 35,0(3); jednostka C 177,2(1), 47,0(3), 43,2(2), 22,5(2-Me'), 22,4(2-Me); jednostka D 171,8(1), 72,0(2), 39,4(3), 24,9(4), 22,9(4-Me), 21,7(5).

Przykład 11. Syntezakryptoficyny61.

Do roztworu kryptoficyny 53 (95 mg, 0,007 mmoli) w 0,5 ml bezwodnego benzenu dodaje się siarczek trifenylofosfiny (4 mg, 0,014 mmoli) i następnie 0,65 ul kwasu trifluorooctowego w postaci roztworu w bezwodnym benzenie (100 μΐ). Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej w czasie 6 godzin, zobojętnia wodorowęglanem sodowym, sączy i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość rozdziela się pomiędzy wodę i chlorek metylenu. Substancje rozpuszczalne w chlorku metylenu oczyszcza się za pomocą HPLC na odwróconych fazach, przy użyciu kolumny Cl 8, oraz mieszaniny acetonitrylu i wody w stosunku 4:1 i uzyskuje czystą kryptoficynę 61 (1,9 mg, 37%).

[a]o +28,4° (c=0,7, CHCI3); EIMS m/z 684/686 (M⁺, nie obserwuje się), 652/654 (M⁺-S, 5/4), 426/428 (90/29), 294 (10), 227(100), 195/197(57/20), 184(20), 155/157 (34/9), 131(45), 129(44), 91(76), 77(27); HREIMS m/z 652,2973 (M⁺, S, C36H45N2O7³⁵C1, Δ -5,8 mmu); UV (MeOH) Zmax (ε) 204(26700), 218(11600), 284(820) nm; IR (NaCl) v_raax 3410, 3271,2958, 1749, 1724, 1670, 1503, 1463,1258, 1176, 1066, 758 cm¹’;

‘H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 30 7,29-7,34(11/12/13-H; m), 7,25(10/14-H; szerokie d, 6,6, 6,73(3-H; ddd, 15,2/10,6/4,5), 5,66(2-H; dd, 15,2/1,7), 5,22(5-H; ddd, 11,2/4,2/2,0), 3,68(8-H; d, 5,1), 3,01(7-H; dd, 8,4/5,1), 2,52(4-H_b; dddd, -14,4/4,5/2,0/1,7), 2,41(4-H_a; ddd, 14,4/11,2/10,6), 1,68-1,74(6-H; m), l,14(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,18(5-H; d, 2,2), 7,04(9-H; dd, 8,4/2,2), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,45(NH; d, 7,8), 4,75(2-H; ddd, 7,8/7,3/5,4), 3,87(OMe; s), 3,09(3-H_b; dd, -14,5/5,4), 3,05(3-H_a; dd, -14,5/7,3); jednostka C 7,17(NH; dd, 8,3, 3,9), 3,39(3-H_b; dd, -13,5/8,3), 3,14(3-H_a; dd, -13,5/3,9), 1,23(2-CH₃; s), 1,16(2-CH₃'; s); jednostka D 4,86(2-H; dd, 10,2/3,4), 1,77(3-H_b; ddd, -14,0, 10,2, 4,9), 1,68-1,74(4-H, m), 1,42(3-H_a; ddd, -14,0/8,7/3,4), 0,92(4-CH₃; d, 6,6), 0,88(5-H₃; d, 6,4);

¹³C NMR (CDC1₃) δ jednostka A 164,9(1), 141,7(3), 138,3(9),(128,8(11/13), 128,0(12), 126,7(10/14), 124,7(2), 76,6(5), 15 45,8(7), 43,9(8), 43,9(6), 36,6(4), 16,0(6-Me); jednostka B 170,2(1), 154,1(7), 130,0(5), 129,4(4), 128,3(9), 122,8(6), 112,4(8), 56,l(7-OMe), 54,2(2), 35,3(3); jednostka C 177,9(1), 46,5(3), 42,7(2), 22,9(2-Me), 22,8(2-Me'); jednostka D 170,4(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,7(4), 22,7(4-Me), 20 21,4(5).

Przykład 12. Syntezakryptoficyny81.

Związek S

Związek Sjest t-butylodifenylosililowym eterem (TBDMS) pochodnej F.

Związek T.

Do 10 ml roztworu chlorku p-metoksybenzylotrifenylofosfoniowego (1 mmol) w tetrahydrofuranie, w temperaturze -78°C dodaje się 400 μΐ roztworu butylolitu (1 mmol, 2,5 molowy w heksanie). Całość 30 miesza się w czasie 30 minut i następnie 2,64 ml dodaje do 3 ml roztworu, aldehydu S (75,0 mg, 0,24 mmoli) w tetrahydrofuranie w temperaturze -78°C. Po czasie 30 minut przestaje się oziębiać, lecz mieszanie kontynuuje się w czasie kolejnych dwóch godzin i w tym czasie temperaturę powoli podnosi się do 25°C. Reakcję przerwano nasyconym roztworem chlorku amonu i odparowano THF. Produkty dwukrotnie ekstrahuje się heksanem, połączone warstwy organiczne, przemywa solanką suszy i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość nanosi się na kolumnę ż żelem, poddaje szybkiej chromatografii (3% octanu etylu w heksanie) i uzyskuje 63 mg związku T i 40 mg 10 mieszaniny związku T i izomeru Z.

Związek T charakteryzują następujące właściwości: [a]o + 110,5° (c 0,75, CHC1₃); IR v_max 2956, 2857, 1724, 1608, 1511, 1428, 1250, 1173, 1111, 1037, 821, 703, 505 cm’¹; EIMS m/z (względna intensywność %) 497(mniej niż 1, M⁺ -OMe), 471(31, M⁺ -Bu'), 367(56), 294(31), 199(75), 135(100); wysokorozdzielczy EIMS 497,24770 (C32H37O3Si, Δ+3,5 mmu, M⁺ -OMe), 471,19859 (C29H₃iO4Si Δ +0,6 mmu, M⁺ -Bu').

'H NMR δ 7,71/7,68(SiPh₂, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H; d, 6,5), 7,45/7,43 (SiPh₂, 4'-H/4-H; t, 7,4), 7,39/7, 38(SiPh₂, 3'-H, 5'-H/3'-H, 5-H; dd, 7,4, 6,5), 7,24(10-H, 14-H; d, 8,7), 6,85(11-H, 13-H; d, 8,7), 6,79(3-H; dt, 15,7, 7,5), 6,19(8-H, d, 16,1), 6,00(7-H, dd, 16,1, 8,1),

185 949

5,66(2-H, dt, 15,7, 1,3), 3,82(5-Η, m), 3,81(-OCH₃, s), 3,69(COOCH₃, s), 2,41(6-H, m), 2,36(4-H, m), 2,30(4-H, m), l,12(6-Me; d, 7,0); l,09(CMe₃, s).

¹³C NMR (CDC1₃) δ 166,7(1), 158,8(12), 146,0(3), 136,0 (SiPh₂, 2', 672, 6), 134,1/133,7(SiPh₂, 171), 130,4(9), 130,0(8), 129,7/129,6(SiPh₂, 474), 129,5(7), 127,6/127,5(3', 573, 5), 127,1(10/14), 122,8(2), 113,9(11/13), 76,4(5), 55,2(OCH₃), 51,3(COOCH₃), 42,1(6), 37,1(4), 27.0(CMe₃), 30 19,5(CMe₃) , 16,2(6-Me).

Dodatkową porcję związku T uzyskuje się z mieszaniny T i izomeru Z. 40 mg mieszaniny E i Z izomerów, rozpuszcza się w 4 ml benzenowego roztworu tiofenolu (0,02 molowy) i acetonitrylu (0,006 molowy). Całość ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w czasie 5 godzin. Produkt izoluje się i oczyszcza za pomocą krótkiej kolumny do szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym i uzyskuje 37,2 mg związku T.

Związek U.

Do 6 ml acetonowego roztworu związku T (76 mg, 0,15 mmoli) dodaje się 4,4 ml 1 normalnego wodnego roztworu wodorotlenku litowego. Klarowny roztwór miesza się w czasie nocy. Aceton oddestylowuje się i wodny roztwór zakwasza 1 normalnym kwasem solnym. Produkt trzykrotnie ekstrahuje się octanem etylu. Organiczne warstwy suszy się i oddestylowuje z nich rozpuszczalnik. Produkt oczyszcza się za pomocą kolumny w żelem krzemionkowym (20% octanu etylu w heksanie z 0,5% kwasu octowego) i uzyskuje 62,2 mg związku U w postaci kwasu (81%); [a]_D +120,8° (c 3,1, CHC1₃); IR v_max 2960, 2858, 1695, 1650,1511,1427, 1250, 1111, 1036, 702 cm'¹;

'H NMR δ 7,73/7,70(SiPh₂, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H, d, 7,0), 7,50(SiPh₂, 4'-H/4-H, m), 7,44(SiPh₂, 3'-H, 5'-H/3-H, 5-H, m), 7,29(10-H, 14-H; d, 8,6), 6,96(3-H; dt, 15,6, 7,8), 6,89(11-H, 13-H,-d, 8,6), 6,22(8-H, d, 16,0), 6,03(7-H, dd, 16,0, 7,9), 5,70(2-H; d, 15,6), 3,88(5-H; m), 3,83(OCH₃, S), 2,43(6-H, m), 2,40(4-H, m), l,17(6-Me; d, 6,9); l,14(CMe₃; s);

^I3C NMR 171,7(1), 158,8(12), 148,8(3), 135,0(SiPh₂, 2', 672, 6), 133,9/133,7(SiPh₂, 171), 130,3(9), 130,0(8), 129,7(SiPh₂, 474), 129,4(7), 127,6(SiPh2, 3', 573, 5), 127,1(10,14), 122,5(2), 113,9(11,13), 76,2(5), 55,2(OCH₃), 42,3(6), 37,1(4), 27.0(Cme₃). I9,5(Cme₃), 16,0(6-CH₃).

Związek V.

Związek U (59 mg, 0,12 mmola), sól trifluorooctanową związku I (57,2 mg, 0,12 mmoli) i diizopropyloetyloaminę (DIEA, 62 μΐ, 0,36 mmoli) rozpuszcza się w 1,5 ml bezwodnego dimetyloformamidu. Do otrzymanego roztworu dodaje się FDPP (55 mg, 0,14 mmola) w 0,6 ml dimetyloformamidu i całość miesza się w czasie dwóch godzin. Dodaje się eter i organiczną warstwę kolejno przemywa się 1 normalnym kwasem solnym, nasyconym wodorowęglanem sodowym, oraz solanką. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika i oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 8% octan etylu w heksanie) uzyskuje się 74,2 mg związku V (72%); [a]_D +53,8° (c 1,6, CHC1₃); IR V_max 3286, 2959, 1760, 1667, 1640, 1607, 1510, 1253, 1174, 1111, 1067, 1027, 703 cm'¹ ; EIMS m/z (wzgędna intensywność %) 798/799/800/801/802/803/804/805 (31/14/44/17/23/10/6/3, M* -Bu'), 766(40),

694/695/696/697/698/699/700/701(70/31/100/38/58/19/14/5), 662(67), 622(71), 544(70), 518(83); wysokorozdzielczy EIMS 798,1443 (C^H^CfiNOóŚi, Δ -6,4 mmu, M⁺ -Bu').

'H NMR δ jednostka A 7, 69-7, 65 (SiPh₂, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H; d, 6,5), 7,41(SiPh₂, 4'-H/4-H, m), 7,35(SiPh₂, 3'-H, 5'-H/3-H, 5-H, m), 7,24(10-H, 14-H; d, 8,7), 6,85(11-H; 13-H, d, 8,7), 6,65(3-H; dt, 15,3, 7,5), 6,20(8-H, d,16,1), 6,03(7-H, dd, 16,1, 8,0), 5,50(2-H; d, 15,3), 3,81(OCH₃, s), 3,77 (5-H; m), 2,39 (6-H; m), 2,34 (4-H; m), 2,29 (4-H'; m), 1,11 (6Me; d, 6,9), 1,06 (CMe₃, s); jednostka B 7,15 (5-H; d, 1,8), 7,00(9-H; dd, 8,4, 1,8), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,65(NH; d, 7,7), 5,01(2-H ddd, 7,7, 6,0, 5,5), 4,78/4,72 (CH₂CC1₃, ABq, -11,9), 3,86 (OMe, s), 3,15(3-H; dd, 6,1, -14,5), 3,08(3-H'; dd, 5,8, -14,5).

¹³C NMR δ jednostka A 165,1(1), 158,8(12), 142,5(3), 136,0(SiPh₂, 2', 672, 6), 134, 2/133,6, (SiPh₂, 17Γ), 130,4(9), 129,9(8), 129, 7/129, 6(SiPh₂, 474), 129,5(7), 127,6/127,5(SiPh₂, 3', 573, 5), 127,1(10, 14), 124,6(2), 113,9(11/13), 76,4(5), 55,2(OMe), 42,1(6), 37,2(4), 27,0(CMe₃), 19.5(CMe₃), 16,6(6-Me); jednostka B 170,0(1), 154,2(7), 131,0(5), 128,4(4/9), 122,5(6), 112,1(8), 94,2(CCI₃), 74,7(CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 52,9(2), 36,4(3).

185 949

Związek W.

Do roztworu związku V (55,8 mg, 0,065 mmola) w 5,7 ml acetonitrylu dodaje się 2,0 ml 49% kwasu fluorowodorowego w temperaturze 0°Ć. Po czasie 5 minut usuwa się łaźnię lodową i, zawartość naczynia reakcyjnego silnie miesza w czasie 17 godzin. Produkt ekstrahuje się eterem i eterowy ekstrakt kolejno przemywa nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego i solanką. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika i przeprowadzeniu chromatografii z zastosowaniem normalnej fazy (kolumna z żelem krzemionkowym, 25% octan etylu w heksanie) uzyskuje się 31,6 mg związku W (79%); [a]o -3,7° (c 1,3, CHC1₃) ; IR v_max 3286, 2961, 1756, 1668, 1634, 1607, 1510, 1251, 1175, 1066, 812 cm¹.

'H NMR δ jednostka A 7,27 (10-H, 14-H; d, 8,5), 6,93(3-H, dt, 15,4, 7,6), 6,83 (11-H, 13-H, d, 8,5), 6,34(8-H; d, 15,9), 5,88(7-H, dd, 15,9, 8,2), 5,86(2-H; d, 15,4), 3,81(OCH₃, s), 3,8O(5-H; m), 2,40 (6-H; m), 2,36(4-H; m), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,17 (5-H; d, 1,9), 7,05(9-H; dd, 8,5, 1,9), 6,83(8-H; d, 8,5), 5,90(NH; d, 7,7), 5,03(2-H; ddd, 7,8, 5,9, 5,6), 4,79/4,72 (CH2CCI3, ABq, -11,9), 3,86 (OMe, s), 3,20(3-H; dd, 6,0, -14,3), 3,09(3-H'; dd, 5,9, -14,3).

¹³C NMR δ jednostka A 165,2(1), 159,1(12), 142,6(3), 131,3(9), 129,8(7), 128,7(8), 127,3(10, 14), 125,0(2), 114,0(11, 13), 73,8(5), 55,3(OMe), 43,3(6), 37,2(4), 16,9(6-Me); jednostka B 170,1(1), 154,2(7), 131,0(5), 128,5(4/9), 122,5(6), 112,2(8), 94,2(CC1₃), 74,7 (CH2CCI3), 56,1 (OMe), 53,0(2), 36,5(3).

Kwas (2S,2'R)-2-[3'-(t-butoksykarbonylo) amino-2'-metylopropanoiloksy]-4-metylopentanowy (AC).

Roztwór (S)-(+)-3-hydroksy-2-metylopropionianu metylu (X) (10 g, 85 mmoli) w 300 ml około 9 molowego roztworu amoniaku w metanolu, ogrzewa się do temperatury 50°C w zatopionej szklanej kolbie w czasie 168 godzin, przemywa azotem w celu usunięcia nadmiaru amoniaku i pod zmniejszonym ciśnieniem całkowicie oddestylowuje się rozpuszczalnik. Pozostałość uciera się z eterem, uzyskując (S)-3-hydroksy-2-metylopropionamid (5,7 g, wydajność 66%) w postaci ciała stałego o barwie białej, temperatura topnienia 85,5-87,5°C; [a]o+28,7° (c 3,5, MeOH); IR v_inax 3384, 2960, 1671, 1473 cm'¹; EIMS m/z (wzgedna intensywność %) 88(19, M -Me), 85(35), 73(69); HREIMS m/z 88,0397 (C₃H₆NO₂, Δ +0,2 mmu).

*H NMR δ 5,83(NH; szerokie s), 5,42(NH; szerokie s), 3,73(3-H₂; m), 2,55(2-H; m), l,19(2-Me; d, 7,2);

¹³C NMR δ 180,7(1), 65,4(3), 44,0(2), 14,5(2-Me).

Analiza elementarna: dla wzoru C4H9NO2:

obliczono: C 46,59, H 8,79, znaleziono: C 46,45, H 8,83.

Zawiesinę (S)-3-hydroksy-2-metylopropionamidu (2,1 g, 20 mmoli) w bezwodnym tetrahydrofuranie (20 ml) powoli dodaje się do 1 molowego kompleksu boranu z tetrahydrofiiranem (61 mmoli, 61 ml) oziębionego do temperatury 0°C. Całość ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w czasie 6 godzin, oziębia do temperatury 0°C i ostrożnie rozkłada za pomocą stężonego kwasu solnego (10 ml), po czym pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje się rozpuszczalnik. Zatężony roztwór nasyca się wodorotlenkiem sodowym (20 g), ekstrahuje chloroformem (czterokrotnie po 15 ml), łączy ekstrakty i suszy nad siarczanem magnezowym. Sączy się, oddestylowuje rozpuszczalnik, pozostałość destyluje pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje 1,4 g ( wydajność 77%) (R)-3-amino-2-metylopropanolu-l (Y) w postaci bezbarwnego oleju, temperatura wrzenia 110-112°C pod ciśnieniem 40 mmHg; [a]_D +8,9° (c 22,6, MeOH); IR v_max 3358, 1873, 1598, 1466 cm’¹;

‘H NMR δ 5,18 (NH₂: szerokie s), 3,8(1-H₂; m), 2,95(3-H; m), 2,68(3-H; m), 1,81(2-H; m), 0,82(2-Me; d, 7,2);

¹³C NMR δ 66,9(1), 46,4(3), 37,1(2), 14,4(2-Me).

Do roztworu aminoalkoholu Y (2,0 g, 22 mmoli) w 39 ml 10% roztworu trietyloaminy w metanolu, dodaje się diwęglan di-t-butylu (5,4 g, 25 mmoli) i całość miesza w temperaturze 25°C w czasie 30 minut. Następnie oddestylowuje się rozpuszczalnik, pozostałość rozpuszcza w chlorku metylenu i roztwór dwukrotnie przemywa 1 molowym roztworem wodorosiarczanu potasowego (pH 2) i raz nasyconym roztworem chlorku sodowego, po czym suszy nad siar

185 949 czanem magnezowym. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje 4,3 g (wydajność 100%) (R)-3-(t-butoksykarbonylo) amino-2-metylopropanolu-l w postaci gęstego oleju, który stosuje się w następnym etapie bez dalszego oczyszczania (czystość wyższa niż 95% - analiza NMR); IR v_max 3356,1976, 1686, 1523, 1456 cm'¹;

*H NMR δ 4,82 (NH; szerokie s), 3,54(1-H; dd, -11,4/4,2), 3,31 (1-H/3-H; m), 3,25(3-H; dd, -14,1/6,6), 1,77(2-H; m), l,44(CMe₃;), 0,87(2-Me; d 6,9).

Do roztworu alkoholu (R)-3-(t-butoksykarbonylo)-amino-2-metylopropanolu-l (2,2 g, 12 mmoli) i nadjodanu sodowego (7,5 g, 35 mmoli) w czterochlorku węgla (25 ml), acetonitrylu (25 ml) i wody (38 ml) dodaje się wodzian trójchlorku rutenu (51 mg, 0,25 mmola) i całość miesza w temperaturze 25°C w czasie 1 godziny. Mieszaninę rozcieńcza się chlorkiem metylenu (100 ml) i sączy przez warstwę celitu. Przesącz alkałizuje się (pH 9) za pomocą 2 molowego roztworu węglanu potasowego i wodną warstwę przemywa eterem. Wodną warstwę zakwasza się 1 molowym roztworem wodorosiarczanu potasowego do wartości pH 2, w temperaturze 0°C i ekstrahuje chlorkiem metylenu (trzykrotnie po 20 ml). Połączone ekstrakty przemywa się nasyconym roztworem chlorku sodowego i suszy nad siarczanem magnezowym. Pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje się rozpuszczalnik i uzyskuję 2,0 g (wydajność 85%) kwasu (R)-3-(t-butoksykarbonylo) amino-2-metylopropionowego (Z) w postaci gęstego ciała stałego. Czysty Z (1,75 g, wydajność 74%) krystalizuje z eteru, temperatura topnienia 69,5-70,5°C; [a]n -18,4° (c 2, MeOH); EIMS m/z (względna intensywność) 147 (60; M+ -Me₂C =CH₂), 130(12), 74(29), 57(100); HREIMSm/z 147,0517 (C5H9NO4, Δ+1,4 mmu); IR v_max 3322-2400, 2797,1711, 1654,1413 cm’¹;

*H NMR głównego konformera δ 5,00(NH; szerokie s), 3,32(3-H; m), 3,24(3-H'; m), 2,71(2-H; m), l,44(CMe₃; s), l,20(2-Me; d);

¹³C NMR, stosunek konformerów głównego do mniejszego (2:1) δ 180,7/179,5(1), 156,0/157,7(BOC-CO) , 79, 5/81,0 (CMe₃), 42,7/44,0(3), 39,9/40,2(2), 28, 3/28, 3 (CMe₃). 14, 6/14, 6 (2-Me).

Analiza elementarna : dla wzoru C9H17NO4 obliczono: C 53,18, H 8,43, znaleziono: C 53,04, H 8,62.

Do roztworu 2,66 g kwasu L-leucynowego (20 mmoli) i 1,74 g wodorowęglanu sodowego (20 mmoli) w 30 ml wody w temperaturze 0°C dodaje się 30 ml roztworu 6,44 g chlorku tetrabutyloamoniowego (20 mmoli) i 1,74 ml bromku allilu (20 mmoli) w chlorku metylenu. Całość silnie miesza się w czasie 24 godzin i następnie oddestylowuje chlorek metylenu. Dodaje się 50 ml wody i wodną warstwę czterokrotnie ekstrahuje się etrem dietylowym. Eterowy roztwór suszy się nad bezwodnym siarczanem sodowym i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość przeprowadza się przez krótką kolumnę z żelem krzemionkowym i uzyskuje 3,21 g (2S)-2-hydroksy-4-metylopentanonianu allilu (AA) (wydajność 93%) w postaci bezbarwnego oleju, [a]_D -8,4° (c 1,1, CHC1₃); IR v_mx 3464, 2957, 1732, 1203, 1140, 1087 cm'¹;

*H NMR δ 5,92(allil 2-H; m), 5,34(allil 3-H_z; dd, 17,4/1,1), 5,28 (allil 3-H_E; dd, 10,5/1,1), 4,67(allil 1-H₂; d, 5,7), 4,23(2-H; szerokie s), 2,64(OH; szerokie s), 1,89(4-H; m), 1,57(3-H₂; m), 0,96(5-H₃; d, 6,5), 0,95(4-Me; d, 6,7);

¹³C NMR δ 175,3(1), 131,4 (allil C-2), 118,6(3), 68,9(2), 65,7(allil C-l), 43,2(3), 24,1(4), 23,0(5), 21,3(4-Me).

Do roztworu 1,74 g związku Z (8,55 mmola), 1,34 g AA (8 mmoli) i DMAP (64 mg) w bezwodnym chlorku metylenu (12 ml), w temperaturze 0°C wkrapla się 8 ml roztworu DCC (2,47 g, 12 mmoli) w bezwodnym chlorku metylenu. Klarowny roztwór miesza się w temperaturze 0°C w czasie 30 minut i następnie w i temperaturze 23 °C w czasie 3 godzin. Odsącza się osad o barwie białej, oddestylowuje rozpuszczalnik i pozostałość rozpuszcza w eterze dietylowym. Eterowy roztwór kolejno przemywa się 0,5 normalnym kwasem solnym, wodorowęglanem sodowym i solanką. Eterowe warstwy suszy się nad siarczanem magnezowym, pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje z nich rozpuszczalnik i uzyskuje produkt, który oczyszcza się za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy) i uzyskuje 2,62 g (wydajność 92%) czystego (2S,2'R)-2-[3'-(t-butoksykarbonylo) amino-2'metylopropanoiloksy]-4-metylopentanonianu allilu (AB) w postaci bezbarwnego oleju, [o.]d

185 949

51,3° (c 3,41, CHC1₃); EIMS m/z (względna intensywność) 301(5,2), 284(4,0), 258(1,5), 228(43,5), 170(41,8), 130(74,5), 112(100); HREIMS m/z 301,1532 (C₄H₂₃NO₆, Δ -0,7 mmu, M-Me₂C=CH₂) , 284 1496 (Ci₄H₂₂NO₅, Δ +0,2 mmu); IR v_max 3395, 2962, 1747, 1715, 1515, 1251,1175, 1083 cm¹'.

*H NMR jednostka C δ 5,17(NH; szerokie s), 3,42(3-H; m), 3,22(3-H'; m), 2,78(2-H, m), l,43(CMe3; szerokie s), 1,21(2-CH₃; d, 7,1); jednostka D δ 5,90( allil 2-H; m), 5,33(allil 3-H₂; d, 15 16,3), 5,27(allil 3-H₂; d, 10,3), 5,09(2-H; dd, 9,7/3,7), 4,63(alkil 1-H₂; m), 1,80(3H₂; m) 1,64(4-H; m), 0,96(5-H₃; d, 6,5), 0,94(4-Me; d, 7,3).

¹³C NMR jednostka C δ 174,7(1), 156,0(BOC-CO), 79,2 (CMe₃), 43,1(3), 40,3(2), 28,3(CMe₃), 14,5(2-Me); jednostka D δ 170,4(1), 131,4 (allil C-2), 119,0 20 (allil C-3), 70,9(2), 65,9 (allil C-l), 39,6(3), 24,7(4), 23,0(5), 21,5(4-Me).

Do 10 ml roztworu 282 mg (0,8 mmola) AB i 91 mg (0,08 mmola) tetrakis(trifenylofosfino)palladu w bezwodnym tetrahydrofuranie powoli dodaje się 688 μΐ (8 mmoli) bezwodnej morfoliny. Całość miesza się w czasie 40 minut, rozpuszczalnik oddestylowuje i dodaje 100 ml chlorku metylenu. Roztwór skutecznie przemywa się 2 normalnym kwasem solnym i wodą. Sączy się organiczną warstwę i przesącz dwukrotnie ekstrahuje nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego. Po przemyciu chlorkiem metylenu, wodną warstwę w temperaturze 0°C zakwasza się do wartości pH 3 za pomocą wodorosiarczanu potasowego i trzykrotnie ekstrahuje eterem. Ekstrakt eterowy suszy się i po oddestylowaniu rozpuszczalnika uzyskuje 250 mg kwasu (2S,2'R)-2-[3'-(t-butoksykarbonylo)amino-2'-metylopropanoiloksy]-4-metylopentanowego (AC) (wydajność 100%), w postaci ciała stałego podobnego do wosku, [a]o -47,9° (c 4,7 CHCI3); EIMS m/z (względna intensywność) 261(12), 244(18), 217(28), 198(17), 188(100), 160(61); HREIMS m/z 261,1221 (C_hHi₉NO₆, Δ ) -0,8 mmu, MMe2C=CH₂), 244,1221 (C_nHi₈NO₅, Δ -3,6 mmu); IR v_max3376,2960,1738,1518,1174,786 cm¹'.

‘H NMR (CDC1₃+D₂O) jednostka C δ 3,49 (3-H; -, dd, -13, B/i: , 5), 3,12(3-H; dd, 13,8/8,7), 2,68(2-H, m), l,43(CMę₃; szerokie s), 1,2I(2-CH₃; d, 7,1); jednostka D δ 5,12(2-H; dd, 9,6/3,5), 1,90-1,68(3-5 H/4-H; m), 0,97 (5-H; d, 6,1), 0,94(4-Me; d, 6,0).

¹³C NMR jednostka C δ 174,6 lub 174,8(1), 156,1(BOC-CO), 79,5 (CMe₃), 43,0(3), 40,4(2), 28,3(CMę3), 14,5(2-Me); jednostka D δ 174,6(1), 70,5(2), 39,5(3), 24,7(4), 23.0(5), 21,4(4-Me).

Związek AD.

Alkohol W (34,8 mg, 0,056 mmola), związek AC (26,8 mg, 0,085 mmola) i DMAP (1,74 mg) rozpuszcza się w 283 μΐ chlorku metylenu. Do tej mieszaniny dodaje się 666 μΐ roztworu DCC (17,5 mg, 0,085 mmola) w chlorku metylenu. Całość miesza się w czasie nocy. Rozpuszczalnik oddestylowuje się w strumieniu azotu, dodaje eter i osad odsącza. Przesącz przemywa się kolejno 0,5 normalnym kwasem solnym, nasyconym wodorowęglanem sodowym i solanką. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika i przeprowadzeniu chromatografii (kolumna z żelem krzemionkowym, 25% octan etylu w heksanie) uzyskuje się 46 mg związku AD (90%); Ia]_D -11,8° (c 2,0 CHC1₃); IR 3369, 2961, 1737, 1511, 1252, 1174, 1066, 813, 756 cm*'.

‘H NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,25(10-H/14-H, dt, 8,5, 2,1), 6,84 (11-H/13-H, dt, 8,5, 2,1), 6,76(3-H, ddd, 15,5, 6,5, 6,4), 6,34(8-H, d, 15,6), 5,88(2-H, szerokie d, 15,5), 5,86(7-H, dd, 15,6, 8,7), 5,04(5, m), 3,80(OMe, s), 2,56(6-H, m), 2,52 (4-H, m), l,10(6-Me, d, 6,8); jednostka B 7,19(5-H, d, 2,1), 7,05(9-H, dd, 8,5, 2,1), 6,83(8-H, d, 8,5), 6,55 (NH, szerokie d, 7,3), 5,04(2-H, m), 4,78/4,70 (CH₂CC1₃, ABq, -11,8), 3,85 (OCH₃, s), 3,19(3-H, dd, 6,3, -13,8), 3,08(3-H', dd, 6,8, 13,8); jednostka C 5,14(NH, szerokie t, 6,3), 3,32(3-H; m), 3,20(3-H'; m) 2,73(2-H, m), l,42(CMę₃; s), 1,18(2-CH₃; d, 7,0); jednostka D 4,93(2-H; dd, 10,0/3 7)-, 1,67 (3-H/4-H; m), 1,55(3-H', m), 0,86(5-H; d, 6,5), 0,83(4-Me-H; d, 6,5).

^f3C NMR δ jednostka A 165,4(1), 159,1(12), 139,3(3), 131,1(9), 129,7(7), 128,5(8), 127,3(10,14), 125,4(2), 114,0(11,13), 76,5(5), 55,3(OMe), 41,1(6), 33,4(4), 16,7(6-Me); jednostka B 170,5(1), 154,1(7), 131,2(5), 128,9(4), 128,5(9), 122,4(6), 112,1(8), 94,3(CC1₃), 74,6(CH₂CC1₃), 56,l(OMe), 53,2(2), 36,6(3); jednostka C 175,2(1), 156,0 (BOC CO), 79,3(CMe₃), 43,1(3), 40,4(2), 28,3(CMe₃), 14,4(2-Me); jednostka D 170,1(1), 71,4(2), 39,5(3), 24,7(4), 22,9(5), 21,4(4-Me). Kryptoficyna 81.

185 949

Związek AD (46 mg, 0,05 mmola) miesza się z aktywowanym pyłem cynkowym (178 mg, nadmiar) w 1,3 ml kwasu octowego.

Mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków w czasie 45 minut i następnie miesza w czasie kolejnych 90 minut. Dodaje się 30 ml chlorku metylenu. Odsącza się ciało stałe i z przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość rozpuszcza się w 1,1 ml kwasu trifluorooctowego i roztwór miesza w czasie 1 godziny. Kwas trifluorooctowy oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i dodaje wodę. Po liofilizacji uzyskuje się aminokwas. Aminokwas rozpuszcza się w 4,6 ml dimetyloformamidu i do rotworu dodaje 26 μΐ DIEA i FDPP (30 mg, 0,075 mmola, w 2,2 ml dimetyloformamidu). Całość miesza się w czasie 6 godzin, rozpuszczalnik oddestylowuje i dodaje octan etylu. Roztwór przemywa się 0,5 normalnym kwasem solnym i solanką. Oddestylowuje się rozpuszczalnik, oczyszcza za pomocą chromatografii (żel krzemionkowy, eter) i uzyskuje 20,5 mg kryptoficyny 81 (61%); [a]_D +34,9° (c 0,45, CHC1₃); IR v_max .3409, 3270, 2958, 1746, 1725, 1672,1511, 1251, 1175, 1066, 1025, 972, 816 cm¹'.

'H NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,26 (10-H/14-H;. dt, 8,6, 2,5), 6,84(11-H/13-H; dt, 8,6,2,5), 6,68(3-H; ddd, 15,4, 9,9, 5,6), 6,35(8-H; d, 15,9), 5,86(7-H; dd, 15,9, 8,8), 5,77(2-H, dd, 15,4, 0,9), 4,99(5-H, ddd, 11,2, 6,0, 1,7), 3,80(OCH₃, s), 2,53 (4-H/6-H; m), 2,37 (4-H'; ddd, 11,2, 9,9, -14,6), l,12(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,22 (5-H; d, 2,2), 7,08(9-H; dd, 8,4, 2,4), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,64(NH; d, 8,6), 4,81(2-H; m), 3,86(OMe; s), 3,13(3-H; dd, 5,6, 14,5), 3,05(3-H'; dd, 7,1, -14,5); jednostka C 6,93 (NH; szerokie dd, 5,8, 5,6), 3,50(3-H; ddd, 5,2, 3,9, -13,5), 3,28(3-H'; ddd, 6,9, 6,7, -13,5), 2,71(2-H, m), 1,22 (2-CH₃; d, 7,3); jednostka D 4,84(2-H; dd, 10,1, 3,4), l,67(3-H/4-H; m), 1,38(3-H'; m), 0,78 (5-H, d, 6,5), 0,75(4-CH₃; d, 6,5).

¹³C NMR (125 MHz) δ jednostka A 165,4(1), 159,2(12), 141,4(3), 131,1(9), 129,6(7), 128,4(8), 127,3(10,14), 125,2(2), 114,1(11/13), 77,5(5), 55,3(OMe), 42,2(6), 36,4(4), 17,4(6Me); jednostka B 171,0(1), 154,0(7), 131,2(5), 129,9(4), 128,4(9), 122,5(6), 112,1(8), 56,2(OMe), 53,5(2), 35,1(3); jednostka C 175,6(1), 41,2(3), 38,3(2), 14,0(2-Me); jednostka 0170,9(1), 71,6(2), 39,5(3), 24,5(4), 22,7(5), 21,3(4-Me).

Przykład 14

Ogólny sposób przeprowadzania epoksydacji kryptoficyn typu styrenu.

Do roztworu kryptoficyny (około. 10 mg/ml) w chlorku metylenu dodaje się trzy równoważniki kwasu m-chloronadbenzoesowego w chlorku metylenu (około 10 mg/ml). Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej do zaniku substancji wyjściowej. Roztwór przeprowadza się przez krótką kolumnę z żelem krzemionkowym eluując chlorkiem metylenu i następnie mieszaniną chlorku metylenu i eteru dietylowego w stosunku 1:4 i uzyskuje mieszaninę dwóch epoksydów. Epoksydy rozdziela się za pomocą HPLC (C-18, mieszanina acetonitrylu i wody w stosunku 7:3).

Przykład 15.

Synteza kryptoficyny 97.

Do roztworu cyklicznego depsipeptydu, kryptoficyny 53 (9 mg, 0,013 mmola) rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (1 ml) dodaje się azydek sodowy (40 mg) i stężony kwas siarkowy (4 μΐ). Całość miesza się w temperaturze 75-85°C w czasie 2 dni. Następnie mieszaninę reakcyjną oziębia się do temperatury pokojowej, rozcieńcza eterem dietylowym (15 ml) i warstwę organiczną dwukrotnie przemywa się solanką (2 x 20 ml) i wodą (20 ml). Eterowe ekstrakty suszy się nad siarczanem magnezowym, rozpuszczalnik oddestylowuje pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskuje bezpostaciowe, bezbarwne ciało stałe, i zawierające głównie azydoalkohol, kryptoficynę 86. Produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii na odwróconych fazach (ODS, 1 μ 250 x 10 mm, 25% woda w acetonitrylu, 3 ml na minutę) i uzyskuje czysty azydoalkohol, loyptoficynę 86 w postaci bezbarwnego bezpostaciowego ciała stałego (7,4 mg, 77%).

Dane spektralne dla kryptoficyny 86.

[a]o -22,0 (C=3,0, CHC1₃); MS (El) m/z 482/484 (najwyższy obserwowany jon, M⁺ 229, 8/3), 625/627(14/5), 259 (7), 195/197(100/34), 184(14), 155/157(82/70), 91(23), 77(22); HRMS, m/z 482,1791, C₂₃H₃iN₂O₇C1³⁵ (Δ 2,9 mmu) ; MS (FAB) m/z (magie bullet matrix) 712/714(M⁺ + H, 79/36), 686/688 (31/12), 232(74), 184(100).

185 949 'Η NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7, 37-7, 42 (10/11/12/13/14-H, szerokie m, W1/2 około 20), 6,77 (3-H, ddd, 15,2, 10,6, 4,4), 5,77(2-H, dd, 15,2, 1,3), 5,45 (5-H, ddd, 11,0, 4,2, 2,0), 4,55(8-H, d, 5,7), 3,75(7-H, dd, 7,3, 5,7), 2,55(4-H_b; dddd, 14,5, 4,4, 2,0, 1,3), 2,43(4-H_a, ddd, 14,5, 11,0, 10,6), 2,34(7-OH, s), l,80(6-H, ddq, 7,3, 4,2, 7,0), 0,99(6-Me; d, 7,0); jednostka B 7,20(5-H; d, 2,2), 7,06(9-H; dd, 8,4, 2,2), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,76(NH; d, 7,7), 4,74(2H; ddd, 7,7, 7,5, 5,5), 3,87(OMe, s), 3,1O(3-H_b; dd, 14,5, 5,5), 3,06(3-H_a; dd, 14,5, 7,5); jednostka C 7,22(NH, dd, 8,4, 3,7), 3,40(3-H_b, dd, 13,6, 8,4), 3,14(3-H_a, dd, 13,6, 3,7), 1,23(2Me; s), 1,16(2-CH₃, s); jednostka D 4,85 (2-H, dd, 9,5, 5,1), l,71(3-H_b; ddd, 13,6, 9,5, 5,9), 1,59 (4-H; szerokie m, W_V2 około 25), l,50(3-Ha/ ddd, 13,6, 7,9, 5,1), 0,89(4-CH₃, d, 6,6), 0,85(5-H₃, d, 6,6; ¹³C NMR (CDC1₃) δ jednostka A : 165,3(1), 143,0(3), 135,1(9), 129,1(12), 128,9(11/13), 128,6(10/14), 124,3(2), 75,1(7), 74,6(5), 67,8(8), 39,3(6), 34,7(4), Il,9(6-Me); jednostka B: 170,5(1), 154,1(7), 130,9(5), 129,7(4), 128,3(9), 122,5(6), 112,4(8), 56,1(7OMe), 54,3(2), 35,3(3), jednostka C: 177,8(1), 46,5(3), 42,8(2), 22,9(2-Me), 22,7(2-Me'), jednostka D: 170,2(1), 71,4(2), 39,4(3), 24,7(4), 22,6(4-Me), 21,8(5).

Kryptoficyna 97.

Do roztworu cyklicznego depsipeptydu, kryptoficyny 86 (5,5 mg, 0,008 rnrnola), rozpuszczonego w mieszaninie eteru dietylowego i chlorku metylenu w stosunku 3:1 (0,5 ml), dodaje się eterowy roztwór (0,5 ml) trifenylofosfiny (3 mg, 0,011 mmola). Całość miesza się w temperaturze pokojowej w czasie trzech dni. Po tym czasie rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszcza w chlorku metylenu, po czym oczyszcza za pomocą chromatografii HPLC (kolumna CN, 10μ, 250 x 10 mm, 80% octan etylu w chlorku metylenu, 3 ml na minutę) i uzyskuje czystą kryptoficynę 97 w postaci bezpostaciowego, bezbarwnego ciała stałego (4,2 mg, 82%)

UV (MeOH) X_max (ε) 202(24400), 218(9400), 284(2200) nm; MS (El) m/z 667/669(M⁺, 11/3), 639/641(41/16), 442(21), 226(17), 195(43), 196(32) 197(100), 198(71), 199(11), 182/184(25/16), 155/157(63/22), 146(30), 91(40), 77(29); HRMS, obserwowane m/z 667,3061, C₃₆H₄6N₃O₇ ³⁵C1 (Δ -3,6 mmu).

*H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,35 (11-H/13-H; m, Wi/₂ około 15 Hz), 7,28(12-H, m), 7,16(10-H/14-H; m, W_1/2 około 15 Hz), 6,74(3-H, ddd, 15,2/9,0/6,1), - 5,69(2-H, d, 15,2), 5,21(5-H, ddd, 9,2/4,3/4,2), 2,79(8-H, szerokie s), 2,51(4-H₂; m), 2,11(7-H, szerokie d, 6,5), 1,48 (6-H, m), l,13(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,18(5-H; d, 2,1), 7,04(9-H; dd, 8,4, 2,1), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,53 (NH; m), 4,73 (2-H; ddd, 7,6, 5,6, 5,4), 3,87(OMe, s), 3,09(3-H_b; dd, 14,7, 5,4), 3,04(3-H_a; dd, 14,7, 7,6); jednostka C 7,20(NH, m), 3,40(3-H_b, dd, 13,5, 8,6), 3,11(3-H_a, dd, 13,5, 3,3), 1,22 (2-Me; s), 1,15(2-Me',s); jednostka D 4,84 (2-H, dd, 10,1, 3,7), l,71(3-H_b; m), 1,67(4-H; szerokie m, Wj_/2 około 25), 1,35(3-H_a, m), 0,86(4-Me, d, 6,7), 0,84(5-H₃, d, 6,5);

¹³C NMR (CDC1₃) δ jednostka A : 165,0(1), 142,1(3), 139,2(9), 128,8(11/13), 127,5(12), 125,4(10/14), 124,6(2), 76,6(5), 42,5(6), 42,1(7), 40,5(8), 36,6(4), 14,8(6-Me); jednostka B: 170,2(1), 154,1(7), 130,9(5), 129,5(4), 128,2(9), 122,6(6), 112,4(8), 56,1(7OMe), 54,3(2), 35,3(3), jednostka C: 177,9(1), 46,5(3), 42,7(2), 22,8(2-Me/2-Me'), jednostka D: 170,5(1), 71,3(2), 39,5(3), 24,6(4), 22,7(4-Me), 21,3(5).

Przykład 16. Syntezakryptoficyn 110-112 i 124.

Kryptoficyna 108.

Do mieszaniny kryptoficyny 90 i kryptoficyny 91 (27 mg, 0,045 mmola) w 0,8 ml tetrahydrofuranu dodaje się 400 μΐ wodnego roztworu kwasu nadjodowego (32 mg, 0,14 mmola). Klarowny roztwór miesza się w temperaturze pokojowej w czasie 5 godzin. Dodaje się wodę i wodny roztwór dwukrotnie ekstrahuje octanem etylu. Organiczną warstwę przemywa się wodą, suszy i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość oczyszcza się za pomocą chromatografii na odwróconych fazach na kolumnie ODS (mieszanina acetonitrylu i wody w stosunku 1:1) i uzyskuje kryptoficynę 108 z wydajnością 90%.

'H NMR (500 MHz) δ jednostka A 9,64(7-H, d, 1,9), 6,67(3-H, ddd, 15,3, 10,0, 5,4), 5,81 (2-H, dd, 15,3, 0,9), 5,32(5-H, ddd, 11,0, 6,6, 2,1), 2,65(6-H, qdd, 7,2, 6,9, 1,9), 2,53(4-H; m), 2,44(4-H', m), l,17(6-Me; d, 7,2); jednostka B 7,21(5-H; d, 15 2,2), 7,08(9-H; dd, 8,4, 2,2), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,91 (NH; d, 8,4), 4,80(2-H; m), 3,86(OMe, s), 3,16(3-H; dd, 5,4, 185 949

14,6), 3,00(3-H'; dd, 7,8, -14,6); jednostka C 7,05(NH, szerokie dd, 6,9, 5,0), 3,47(3-H, ddd, 4,6, 4,2, -13,5), 3,32(3-H', ddd, 6,9, 6,6, -13,5), 2,73 (2-H, m), 1,23(2-Me; d, 7,2); jednostka D 4,83 (2-H, dd, 9,5, 3,6), 1,75(3-H; m), l,70(4-H; m), 1,40 (3-H', ddd, 9,5, 3,9, -14,0), 0,93(5-H, d, 6,6), 0,88(4-Me-H, d, 6,6).

¹³C NMR (125 MHz) δ jednostka A : 200,6(7), 165,4(1), 140,5(3), 125,6(2), 73,7(5), 50,1(6), 36,1(4), 10,8(6-Me); jednostka B: 171,1(1), 154,0(7), 131,0(5), 129,9(4), 128,3(9), 122,4(6), 112,3(8), 56,l(OMe), 53,8(2), 35,0(3); jednostka C: 175,6(1), 41,0(3), 38,1(2), 14,1(2-Me); jednostka D: 170,4(1), 71,3(2), 39,3(3), 24,6(4), 22,9(5), 21,4(4-Me).

Kryptoficynę 108 wytwarza się za pomocą selektywnej ozonolizy kryptoficyny 82, sposobem opisanym powyżej dla ozonolizy E do F.

Ogólny sposób przeprowadzania reakcji Wittiga.

Butylolit (0,4 ml, 2,5 molowego roztworu w heksanie, 1 mmol) dodaje się do 10 ml roztworu chlorku arylotrifenylofosfoniowego (1 mmol) w tetrahydrofiiranie w temperaturze 78°C. Całość miesza się w czasie 15 minut w temperaturze -78°C i następnie umieszcza w łaźni z lodem w czasie 1 godziny. Trzy równoważniki uzyskanej mieszaniny dodaje się do roztworu kryptoficyny 108 w tetrahydrofiiranie (około 30 mg/ml) w temperaturze -78°C. Całość miesza się w czasie 20 minut i usuwa łaźnię oziębiającą. Po ogrzaniu się mieszaniny reakcyjnej do temperatury 25°C, reakcję przerywa się za pomocą nasyconego wodnego roztworu chlorku amonowego. Mieszaninę dwukrotnie ekstrahuje się octanem etylu. Organiczny ekstrakt przemywa się wodą suszy i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość oczyszcza się za pomocą szybkiej chromatografii na kolumnie ODS (mieszanina acetonitrylu i wody w stosunku 65:35) i uzyskuje mieszaninę izomerów E i Z (zawierającą 8% do 13% izomeru Z, w zależności od rodzaju grupy arylowej; analiza za pomocą NMR). Pożądany izomer E krystalizuje z eteru.

Kryptoficyna 110.

Reakcję Wittiga przeprowadza się na 5,1 mg p-fluorofenylowego analogu (zawierającego około 8% izomeru Z) z 7,3 mg kryptoficyny 108 (odzyskuje się około 1 mg nieprzereagowanego aldehydu). Po krystalizacji z eteru uzyskuje się 4,0 mg czystej kryptoficyny 110; [α]β +42,4° (MeOH, c2,l).

* H NMR δ jednostka A 7,29 (10-H/14-H; dd, 8,6, 5,6), 6,99(11-H/l 3-H, dt, 8,6, 8,5), 6,68(3-H, ddd, 15,3, 9,7, 5,6), 6,38(8-H, d, 15,8), 5,83(7-H, dd, 15,8, 8,8), 5,78(2-H, d, 15,3), 5,00(5-H, ddd, 10,8, 7,3, 1,3), 2,53(4-H/6-H, m), 2,36(4-H', m), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,21(5-H; d, 1,8), 7,07(9-H; dd, 8,4, 1,8), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,68(NH; d, 8,5), 4,82(2-H; m), 3,87(OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,04(3-H'; dd, 7,2, -14,4); jednostka C 6,95(NH, szerokie dd, 6,8, 5,9), 3,50(3-H, td, 4,4, -13,5), 3,28(3-H', ddd, 6,8, 6,7, -13,5), 2,72(2-H,m), 1,23(2-Me; d, 10 7,2); jednostka D 4,82(2-H, m), 1, 65 (3-H/4-H; m), 1,35(3-H'; ddd, 4,5, 3,8, -10,9) 0,78(5-H, d, 6,4), 0,74(4-Me-H, d, 6,4).

^f3C NMR (75 MHz) δ jednostka A : 165,4(1), 162,3(12, d, ¹ JC-f 245,8 Hz),- 141,4(3), 132,9(9), 130,6(7), 129,9(8), 127,6(10/14, d, ³JC-f8,0Hz), 125,2(2), 115,5(11,13, d, ²J_c-_F21,5 Hz), 77,4(5), 42,2(6), 36,4(4), 17,3(6-Me); jednostka B: 170,9(1), 153,9(7), 131,0(5), 129,9(4), 128,4(9), 122,4(6), 112,2(8), 56,l(OMe), 53,6(2), 35,1(3), jednostka C: 175,6(1), 41,1(3), 38,3(2), 14,0(2-Me), jednostka D: 170,9(1), 71,5(2), 39,5(3), 24,5(4), 22,7(5), 21,2(4-Me).

Kryptoficyna 111.

Reakcję Wittiga przeprowadza się na 43 mg p-tolilowego analogu (zawierającym 9% izomeru Z) z 55 mg kryptoficyny 108. Po krystalizacji z eteru, uzyskuje się 34 mg czystej kryptoficyny 111; [a]o +44,3° (CHCI3, c 0,6); EIMS m/z (intensywność względna, %) 652(2,9, M⁺), 497(3,6), 412(23,8), 242(20), 145(46), 105(75); wysokorozdzielczy EIMS 652,29094 (dla C36H45CIN2O7, Δ-0,6 mmu).

* H NMR δ jednostka A 7,21(10-H/14-H; d, 8,0), 7,11(11-H/13-H, d, 8,0), 6,68(3-H; ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 6,37(8-H, d, 15,8), 5,95(7-H, dd, 15,8, 8,6), 5,76(2-H, d, 15,2), 4,99 (5-H dd, 10,4, 6,2), 2,51 (4-H/6-H; m), 2,38(4-H', m), 2,32(12-Me, s), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,22(5-H; d, 2,1), 7,08(9-H; dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,80 (NH; d, 8,4), 4,81(2-H; m), 3,86(OMe, s), 3,14(3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,O3(3-H’; dd, 7,3, -14,4); jednostka C 6,98(NH, szerokie dd, 6,0, 5,7), 3,49(3-H, td, 4,6, -13,4), 3,29(3-H’, ddd, 6,7, 6,6, -13,4), 2,70(2-H, m),

185 949

1,22(2-Me; d, 7,2); jednostka D 4,81(2-H, m), l,65(3-H/4-H; m), 1,37(3-H', m), 0,78(5-H, d, 5,8), 0,73(4-Me-H, d, 6,4).

¹³C NMR (75 MHz) δ jednostka A : 165,5(1), 141,5(3), 137,4(12), 133,9(9), 131,7(7), 129,3(10/14), 129,0(8), 126,0(11/13), 125,1(2), 77,4(5), 42,2(6), 36,4(4), 21,1(12-Me), 17, 3 (6-Me);. jednostka B: 171,0(1), 153,9(7), 131,0(5), 129,9(4), 128,4(9), 122,4(6), 112,2(8), 56,l(OMe), 53,8(2), 35, 1(3); jednostka C: 175,6(1), 41,1(3), 38,3(2), 14,1 (2-Me); jednostka D: 170,9(1), 71,6(2), 39,5(3), 24,5(4), 22,7(5), 21,1(4-Me).

Kryptoficyna 112.

Reakcję Wittiga przeprowadza się na 35 mg 2-tienylowego analogu (zawierającym 13% izomeru Z) z 51 mg kryptoficyny 108. Po krystalizacji z eteru, uzyskuje się 25 mg czystej kryptoficyny 111.

* H NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,12(12-H; d, 4,9), 6,94(11-H, dd, 4,9, 3,4), 6,90(10-H; d, 3,4), 6,68(3-H, ddd, 15,2, 9,5, 5,3), 6,54 (8-H, d, 15,7), 5,83(7-H, dd, 15,7, 8,7), 5,78(2-H, d, 15,2), 4,96(5-H, dd, 9,5, 6,5, 2,51(4-H/6-H; m), 2,35(4-H', m), l,13(6-Me; d, 6,8,; jednostka B 7,21(5-H; d, 1,6), 7,07(9-H; dd, 8,4, 1,6), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,74(NH; d, 7,1), 4,82(2-H; m), 3,87 (OMe, s), 3,13(3-H; dd, 5,5, -14,4), 3,04(3-H'; dd, 7,1, -14,4; jednostka C 6,97(NH, szerokie t, 5,8), 3,50(3-H, ddd, 4,4, 4,3, -13,4), 3,28(3-H', ddd, 6,8, 6,6, 13,4), 2,71(2-H, m, 1,22(2-Me; d, 7,2); jednostka D 4,82(2-H, m), l,67(3-H/4-H; m), 1,39(3H', m), 0,80(5-H, d, 6,4), 0,77(4-Me-H, d, 6,4).

Kryptoficyna 124.

Reakcję Wittiga przeprowadza się na 131 mg p-chlorofenylowego analogu (zawierającym 10% izomeru Z) ze 153 mg kryptoficyny 108. Po krystalizacji z eteru, uzyskuje się 107 mg czystej kryptoficyny 124; [a]o +29,2° (CHC1₃, c 0,5); wysokorozdzielcza EIMS m/z 672,23691 (dla C35H42CI2N2O7, Δ 0,0 mmu).

’H NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,26(10-Η/11-H/12-H/13-H/14-H; s), 6,68(3-H; ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 6,36(8-H, d, 15,8), 5,98(7-H, dd, 15,8, 8,8), 5,77(2-H, d, 15,2), 5,00(5-H, szerokie dd, 9,4, 6,3), 2,54(4-H/6-H; m), 2,38(4-H', m), 2,38(4-H', m), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,22(5-H; d, 1,7), 7,07(9-H; dd, 8,4, 1,7), 6,84(8-H; d, 8,4), 5,73(NH; szerokie d, 7,8), 4,82(2-H; m), 3,86(OMe, s), 3,13(3-H; dd, 5,5, -14,4), 3,04(3-H'; dd, 7,2, -14,4); jednostka C 6,97 (NH, szerokie d, 5,8), 3,49(3-H, td, 4,2, -13,4), 3,29(3-H', ddd, 6,7, 6,6, -13,4), 2,71(2-H, m), 1,22(2-Me; d, 7,2); jednostka D 4,81(2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,35(3-H', m), 0,77(5-H, d, 7,1), 0,75(4-Me-H, d, 7,1).

¹³C NMR (75 MHz) δ jednostka A : 165,4(1), 141,3(3), 135,2(12), 133,2(9), 130,9(7), 130,6(8), 128,7(11/13), 127,3(10,14), 125,2(2), 77,3(5), 42,2(6), 36,5(4), 17,3(6-Me); jednostka B: 170,9(1), 153,9(7), 131,0(5), 129,8(4), 128,4(9), 122,4(6), 112,2(8), 56,l(OMe), 53,6(2), 35,1(3); jednostka C: 175,6(1), 41,1(3), 38,3(2), 14,l(2-Me); jednostka D: 170,8(1), 71,5(2), 39,6(3), 24,5(4), 22,8(5), 21,3(4-Me).

Przykład 17. Syntezakryptoficyn 115-120, 125 i 126.

Kryptoficyny 115 i 116.

Sposobem ogólnym opisanym powyżej dla epoksydacji kryptoficyn typu styrenu, kryproficynę 110 (3,5 mg) przekształca się w 2,0 mg kryptoficyny 115 i 1 mg kryptoficyny 116. Dane spektralne dla kryptoficyny 115.

[α]β +29,1° (MeOH, c 0,8); EIMS m/z (intensywność względna, %) 672(1,9, M⁺), 412(5,8), 245(17), 195(52), 155(31), 141(23), 135(15), 109(100); wysokorozdzielczy EIMS 668,2853 (dla C₃₅H₄₂C1FN₂O₈, A +3,4 mmu).

’H NMR (500 Mhz) δ jednostka A 7,22( 10-H/14-H; ddt, 8,7, 5,2, 2,0), 7,01(ll-H/13-H, ddt, 8,7, 8,5, 2,0), 6,68(3-H; ddd, 15,2, 9,7, 5,2), 5,74(2-H, dd, 15,2, 0,8), 5,15(5-H, ddd, 11,2, 5,0, 1,8), 3,67(8-H, d, 2,0), 2,88(7-H, dd, 7,4, 2,0), 2,54(4-H; dtd, S 5,2,1,8, -14,4), 2,44(4-H', ddd, 11,2, 9,7, -14,4), 1,79(6-H, m), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,21(5-H; d, 2,0), 7,06(9H; dd, 8,3, 2,0), 6,83(8-H; d, 8,3), 5, 63 (NH; d, 8,4), 4,80(2-H; ddd, 8,4, 7,2, 5,4), 3,87(OMe, s), 3,14(3-H; dd, 5,4, -14,4), 3,03(3-H'; dd, 7,2, -14,4); jednostka C 6,94 (NH, szerokie dd, 6,7, 5,0), 3,48(3-H, ddd, 5,0, 3,7, -13,4), 3,3O(3-H', ddd, 6,8, 6,7, -13,4), 2,72(2-H, m), 1,22(2-Me; d, 7,4); jednostka D 4,83(2-H, dd, 9,9, 3,6), 1,70 (3-H/4-H; m;, 1,35 (3-H', m), 0,87(5-H, d, 6,5), 0,85(4-Me-H, d, 6,5).

185 949 ¹³C NMR (125 MHz) δ jednostka A : 165,3(1), 162,9(12, d, 'JC-f 245,4 Hz), 141,0(3), 132,5(9), 127,3(10/14, d, ³Jc-f 8,3 Hz), 125,3(2), 115,7(11,13, d, ²J_c-f 21,9 Hz), 76,1(5), 63,0(7), 58,3(8), 40,5(6), 36,7(4), 13,4 (6-Me); jednostka B: 170,9(1,154,0(7), 131,0(5), 129,7(4), 128,4(9), 122,5(6), 112,3(8), 56,l(OMe), 53,6(2), 35,0(3); jednostka C: 175,6(1), 41,1(3,, 38,2(2), 14,l(2-Me); jednostka D: 170,7(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,5(4), 22,9(5), 21,3(4-Me).

Kryptoficyny 117 i 118.

Sposobem ogólnym opisanym powyżej dla epoksydacji kryptoficyn typu styrenu, przekształca się kryptoficynę 111 (6,2 mg) w 3,5 mg kryptoficyny 117 i 1 mg kryptoficyny 118.

Dane spektralne dla kryptoficyny 117.

[a]o +25,5° (MeOH, c 1,8); EIMS m/z (intensywność względna, %) 668(4,8, M⁺), 412(6,2), 280(11), 173(9,4), 145(15), 135(34), 105(100); wysokorozdzielczy EIMS m/z 668,28532 (dla C₃₆H4₅C1N₂O₈, Δ+1,1 mmu, M⁺).

'H NMR (500 MHz) δ jednostka A D 7,17/7,13(10-H/ll-H/13-H/14-H; A₂B₂ q, 8,0), 6,67(3-H; ddd, 15,4, 9,8, 5,6), 5,73(2-H, dd, 15,4, 0,9), 5,14(5-H, ddd, 11,2, 4,9, 2,0), 3,65(8H, d, 2,0), 2,91(7-H, dd, 7,6, 2,0), 2,54(4-H; szerokie dd, 5,6, -14,3), 2,44(4-H', ddd, 10,7, 9,8, -14,3), 2,35(12-Me, s), 1,77(6-H, m), l,14(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,21(5-H; d, 2,2), 7,07(9-H; dd, 8,5, 2,2), 6,83(8-H; d, 8,5), 5,65(NH; d, 8,5), 4,80(2-H; ddd, 8,3, 7,4, 5,6), 3,87(OMe, s), 3,13(3-H; dd, 5,6, -14,5), 3,02(3-H'; dd, 7,4, -14,5); jednostka C 6,93(NH, szerokie d, 6,8, 5,1), 3,48 (3-H, ddd, 5,1, 3,8, -13,2), 3,29(3-H', ddd, 6, 9, 6,8, -13,2), 2,71(2-H, m), 1,22(2-Me; d, 7,1); jednostka D 4,82(2-H, dd, 9,8, 3,6), l,70(3-H/4-H; m), 1,33(3-H', m), 0,85(5-H, d, 6,5), 0,84(4-Me-H, d, 6,5).

¹³C NMR (125 MHz) δ jednostka A : 165,3(1), 141,0(3), 138,4(12), 133,7(9), 129,4(10/14), 125,6(11/13), 125,3(2), 76,2(5), 62, 9(7), 59,0(8), 40,7(6), 36,7(4), 21,1(12Me), 13,6(6-Me); jednostka B: 170,9(1), 154,0(7), 131,0(5), 129,8(4), 128,4(9), 122,4(6), 112,3(8), 56,l(OMe), 53,6(2), 35,1(3); jednostka C: 175,5(1), 41,1(3), 38,3(2), 14,l(2-Me); jednostka D: 170,7(1), 71,3(2), 39,4(3), 24,5(4), 22,8(5), 21,2(4-Me).

Dane spektralne dla kryptoficyny 118.

Widmo *H NMR podobne jest do widma uzyskanego dla kryptoficyna 38, z tą różnicą że multiplety 7,30-7,38 dla protonów fenylowych, zastąpione są 4H multipletem przy 7,14 i 3H singletem przy 2,35 dla protonów p-tolilowych.

Kryptoficyny 119 i 120.

Sposobem ogólnym opisanym powyżej dla epoksydacji kryptoficyn typu styrenu, kryptoficynę 112 (8 mg), przekształca się w 1,2 mg kryptoficyny 119 i 0,5 mg kryptoficyny 120.

Dane spektralne dla kryptoficyny 119.

^lH NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,28(12-H; d, 5,2), 7,ll(10-H, d, 3,3), 7,00(ll-H, dd, 5,2, 3,3), 6,68(3-H; ddd, 15,1, 9,9, 5,2), 5,76(2-H, dd, 15,1, 1,3), 5,15(5-H, ddd, 11,2, 5,5, 1,8), 3,94(8-H,d 2,0), 3,10(7-H, dd, 7,5, 2,0), i 2,56(4-H; szerokie dd, 5,2, -14,3), 2,44(4-H', ddd, 11,2, 9,9, -14,3), 1,76(6-H, m), l,13(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,21(5-H; d, 2,3), 7,07(9H; dd, 8,4, 2,3), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,63(NH; d, 8,4), 4,80(2-H; ddd, 8,5, 7,4, 5,7), 3,87 (OMe, s), 3,13(3-H; dd, 5,7, -14,5), 3,03(3-H'; dd, 7,4, -14,5); jednostka C 6,95(NH, szerokie d, 6,5, 5,3), 3,48(3-H, ddd, 5,3, 3,6, -13,5), 3,31(3-H, ddd, 6,8, 6,5, -13,5), 2,72(2-H, m), 1,23(2-Me; d, 7,3); jednostka D 4,85(2-H, dd, 10,3, 3,5), l,70(3-H/4-H; m), 1,33(3-H', m), 0,86(5-H, d, 6,3), 0,85(4-Me-H, d, 6,3).

Kryptoficyny 125 i 126.

Sposobem ogólnym opisanym powyżej dla epoksydacji kryptoficyn typu styrenu, kryptoficynę 124 (47 mg), przekształca się w 26 mg kryptoficyny 125 i 12 mg kryptoficyny 126.

Dane spektralne dla kryptoficyny 125. [a]o +35,6° (CHC1₃, c=0,9); wysokorozdzielcza EIMS m/z 688,2301 (dla C₃5H4₂C1₂N₂O₈ Δ + 1,7 mmu).

'H NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,33(11-H/13-H, dt, 8,5, 2,0), 7,18(10-H//14-H, dt, 8,5, 2,0), 6,67(3-H; ddd, 15,1, 9,9, 5,2), 5,73(2-H, dd, 15,1, 0,9), 5,15(5-H, ddd, 11,0, 4,7, 1,5), 3,66(8-H,d 1,9), 2,87(7-H, dd, 7,4, 1,9), 2,53(4-H; m), 2,42(4-H', ddd, 10,6, 10,5, -14,4), 1,78(6-H, m), l,12(6-Me; d, 7,0); jednostka B 7,20(5-H; d, 2,1), 7,06(9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,83(8-H; d, 8,3), 5,72(NH; d, 8,1), 4,79(2-H; ddd, 8,3, 7,9, 5,4), 3,86(OMe, s), 3,12(3-H; dd,

185 949

5,4, -14,5), 3,02(3-H'; dd, 7,4, -14,5); jednostka C 6,97(NH, szerokie dd, 6,3, 5,5), 3,46(3-H, ddd, 4,4, 4,1, -13,7), 3,22(3-H’, ddd, 7,0, 6,3, -13,7), 2,70(2-H, m), 1,22(2-Me; d, 7,2); jednostka D 4,82(2-H, dd, 9,9, 3,4), l,70(3-H/4-H; m), 1,33(3-H', m), 0,87(5-H, d, 6,5), 0,84(4Me-H d, 6,5).

¹³C NMR (125 MHz) δ jednostka A 165,3(1), 141,0(3), 135,3(12), 134,4(9), 128,9(11/13), 126,9(10/14), 125,3(2), 76,0(5), 63,1(7), 58,2(8), 40,4(6), 36,7(4), 13,4(6-Me); jednostka B 170,9(1), 154,0(7), 131,0(5), 129,8(4), 128,3(9), 122,4(6), 112,3(8), 56,l(OMe), 53,7(2), 35,0(3); jednostka C 175,6(1), 41,0(3), 38,2(2), 14,l(2-Me); jednostka D 170,7(1), 71,2(2), 39,4(3), 24,5(4), 22,9(5), 21,3(4-Me).

Dane spektralne dla kryptoficyny 126.

’H NMR (300 MHz) δ jednostka A 7,26 (11-H/13-H, d, 8,1), 25 7,17(10-H//14-H, d, 8,1), 6,70(3-H; ddd, 15,1, 9,4, 5,3), 5,81 (2-H, d, 15,1), 5,14 (5-H, szerokie dd, 10,0, 4,5), 3,57(8-H, szerokie s), 2,85(7-H, szerokie d, 7,6), 2,66(4-H; m), 2,59(4-H', m), 1,77(6-H, m), l,04(6-Me; d, 7,0); jednostka B 7,23(5-H; szerokie s), 7,08(9-H; szerokie d, 8,4), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,82(NH; d, 6,8), 4,81 (2-H; ddd, 7,2, 6,8, 5,4), 3,86(OMe, s), 3,14(3-H; dd, 5,4, -14,1), 3,03(3-H'; dd, 7,4, -14,1); jednostka C 7,03(NH, szerokie t, 5,7), 3,47(3-H, ddd, 4,0, 3,7, 13,1), 3,34(3-H', ddd, 6,8, 6,4, -13,1), 2,72(2-H, m), 1,24(2-Me; d, 7,0); jednostka D 4,90(2H, dd, 10,0, 2,5), l,74(3-H/4-H; m), 1,45(3-H', m), 0,91(5-H, d, 6,5), 0,86(4-Me-H, d, 6,5).

^,3C NMR (125 MHz) δ jednostka A 165,4(1), 141,3(3), 135,6(12), 134,1(9), 128,8(11/13), 126,8(10/14), 125,2(2), 76,8(5), 63,3(7), 55,6(8), 40,8(6), 36,7(4), 13,4(6-Me); jednostka B 170,9(1), 153,9(7), 131,0(5), 129,8(4), 128,4(9), 122,3(6), 112,2(8), 56,l(OMe), 53,7(2), 35,0(3); jednostka C 175,7(1), 41,0(3), 38,2(2), 14,l(2-Me); jednostka D 170,8(1), 71,4(2), 39,3(3), 24,6(4), 23,1(5), 21,3(4-Me).

Przykład 18 Syntezakryptomycyny 121-123 i 127.

Związek AJ.

Do roztworu monowodzianu BOC-L-leucyny (1,245 g, 5 mmoli) w 30 ml bezwodnegochlorku metylenu dodaje się stały EDC (chlorowodorek l-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu) (0,53 g, 2,75 mmola) w atmosferze azotu w czasie mieszania w temperaturze 0°C. Mieszanie w temperaturze 0°C kontynuuje się w czasie 1,5 godziny, z mieszaniny oddestylowuje się rozpuszczalnik w temperaturze niższej niż 5°C i pozostałość rozcieńcza 35 ml oziębionego octanu etylu, po czym kolejno przemywa dwoma porcjami (10 ml) oziębionymi w lodzie roztworami: 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasowego, 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodowego, i solanką Oddziela się warstwę organiczną suszy nad siarczanem magnezowym w temperaturze 5°C i oddestylowuje rozpuszczalnik w temperaturze niższej niż 5°C. Uzyskany olej rozcieńcza się tetrahydrofuranem oziębionym w lodzie (5 ml) dodaje roztwór związku K (295 mg, 0,5 mmola) w oziębionym w lodzie bezwodnym tetrahydrofuranie (5 ml). Do mieszaniny w czasie mieszania dodaje się kilka kryształków DMAP i pozostawia do ogrzania do temperatury 25°C w czasie nocy. Następnie dodaje się 5% wodny roztwór wodorowęglanu sodowego (5 ml) i silnie miesza uzyskaną mieszaninę, dwufazową w temperaturze 25 °C w czasie 2 godzin. Dodaje się octan etylu (40 ml), wodną warstwę ekstrahuje dwukrotnie dodatkowymi porgami octanu etylu (po 20 ml), zaś połączone warstwy organiczne przemywa wodą solanką suszy nad siarczanm sodowym, sączy i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość sączy się przez warstwę żelu krzemionkowego z 25% octanem etylu w heksanach i uzyskuje związek AJ w postaci bezbarwnego oleju (385 mg, wydajność 96%); [a]_D 13,6° (CHC1₃, c=O,63); EIMS m/z (wzgędna intensywność) 805/803/801(M+,1%), 568/570/572/574(9/10/6/2), 523/525/527(5/6/1), 418/420/422/424 (15/15/6/2), 341/343/345/347 (58/70/35/9), 307/309/311(29/22/10), 224/227/228/229(10/100/31/14), 208/210/211/212 (20/83/45/54); HREIMS m/z 800,2218 (dla C₃₅H48³⁵CL|N₂O8 Δ -5,3 mmu).

Ή NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,21-7,35(Ph-H₅; m), 6,77(3-H; ddd, 6,7/6,7/15,3), 6,4(8-H; d, 15,8), 6,05(7-H, dd, 8,7/15,8), 5,9(2-H, d, 15,3), 5,0(5-H, m), 2,6(6-H, m), 2,55(4H₂; m), l,17(6-Me; d, 6,7); jednostka B 7,22(5-H; s), 7,05(9-H; d, 8,1), 6,84(8-H; d, 8,1), 6,55(NH; d, 7,8), 5,0(2-H; ddd, 5,5/7,1/7,8), 4,68-4,8(CH₂CCl₃; Abq, 11,9), 3,86(OMę, s), 3,2(3-H; dd, 5,5/14,0), 3,06(3-H'; dd, 7,1/14,0); jednostka D 4,8(NH; d), 4,2(2-H, m), 1,65(4-H; m), 1,55(3-H, m), l,4(CMe₃, s), 1,37(3-H', m), 0,85(4-Me, d, 6, 5), 0,8(5-H, d, 6,5);

185 949 ¹³CNMRÓ jednostka A 165,4(1), 139,3(3), 137,0(9), 131,5(8), 130,5(7), 128,5(11/13), -127,3(12), 126,2(10/12), 125,8(2), 76,2(5), 40,8(6), 33,4(4), 16,8(6-Me); jednostka B 170,0(1), 154,2(7), 131,0(5), 129,0(9), 122,5(6), 112,2(8), 94,4(CC1₃), 74,7 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 53,3(2), 36,5(3); jednostka D 173,2(1), 155,7(BOC-CO), 80,0(CMe₃), 52,4(2), 41,2(3), 28,3(cMe₃), 24,8(4), 22,8(4-Me), 21,6(5).

Związek AK.

Związek AJ (115 mg, 0,134 mmola) rozpuszcza się w TFA (3 ml) i utrzymuje w temperaturze 25°C w czasie 1 godziny. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, do pozostałości dodaje się chlorek metylenu, oddestylowuje, dodaje się toluen i oddestylowuje uzyskując bezpostaciowe ciało stałe. Produkt ten rozpuszcza się w bezwodnym tetrahydrofuranie (5 ml) i dodaje dietyloizopropyloaminę W ilości dostatecznej do doprowadzenia pH do wartości 8-9, co bada się za pomocą naniesienia niewielkiej ilości roztworu na wilgotny papierek wskaźnikowy. Roztwór oziębia się do temperatury 0°C, miesza i dodaje roztwór związku AL w tetrahydrofuranie (3 ml). W celu uzyskania związku AL, związek Z (55 mg, 0,27 mmola) rozpuszcza się w tetrahydrofuranie (3 ml) i dodaje dietyloizopropyloaminę (0,046 ml, 0,27 mmola). Do tej mieszaniny, po oziębieniu do temperatury 15°C, wkrapla się chlorek piwaloilowy (0,033 ml, 0,27 mmola) i całość miesza w temperaturze 15°C w czasie 10 minut, po czym ogrzewa do temperatury 0°C i miesza wczasig 20 minut. Otrzymaną zawiesinę przenosi się do roztworu związku AJ w tetrahydrofuranie. Całość miesza się w temperaturze 0°C i pozostawia w czasie nocy pozwalając aby temperatura wzrosła do 25°C. Po czasie 12 godzin utrzymywania w temperaturze 25°C, do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 5% wodny roztwór wodorowęglanu sodowego i całość silnie miesza w temperaturze 25°C w czasie 1,5 godziny. Następnie dodaje się octan etylu (40 ml) i rozdziela fazy. Wodną warstwę dodatkowo dwukrotnie ekstrahuje się octanem etylu (po 10 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemywa się 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodowego (20 ml), 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasowego (20 ml), solanką suszy nad siarczanem sodowym i oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostały olej poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym, eluując 35% octanem etylu w heksanach i uzyskuje związek AK w postaci bezbarwnej piany (98 mg, wydajność 83%); [a]o -8,3° (CHC1₃, c=O,88);

‘H NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,28-7,35 (Ph-H₄; m), 7,22(12-H, m), 6,75(3-H; ddd, 6,4/6,4/15,4), 6,4(8-H, d, 15,9), 6,04(7-H, dd, 8,6/15,9), 5,95(2-H, d, 15,4), 5,0(5-H, m), 2,6(4-H; m), l,l(6-Me; d, 6,8); jednostka B 7,22(5-H; d, 1,5), 7,15(NH, d,7,6), 7,05(9-H; dd, 1,5/8,2), 6,85(8-H; d, 8,2), 5,0(2-H; m), 4, 8-4, 68 (CH₂CC1₃; ABq, 12), 3,86(OMe, s), 3,2(3H; m), 3,1(3-H'; dd, 7,2/14,1); jednostka C 5,0(NH, m), 3,2(2-3-H, m), 2,55(2-H, m), 1,1(2Me; d, 7,1); jednostka D 6,12(NH, m), 4,4(2-H, m), 1,65(4-H; m), 1,55(3-H, m), 1,4(3-H', m), 0,86(4-Me, d, 6,8), 0,81(5-H, d, 6,8);

¹³C NMR (CDC1₃) δ jednostka A 165,8(1), 138,9(3), 131,5(8), 130,4(7), 128,6(11/13), 127,4(12), 126,2(10/14), 125,8(2), 76,3(5), 33,6(4), 16,6(6-Me);. jednostka B 170,2(1), 154,1(7), 136,9(4), 131,2(5), 128,6(9), 122, 3 (6),: 112, 2 (8) , 94,4(CC1₃), 74,5(CH₂,CC1₃), 56,l(OMe), 53,4(2), 36,6(3); jednostka C 175,4(1), 156,3(BOC-CO), 79,5(OCMe₃), 43,6(3), 41,3(2), 15,1(2-Me); jednostka D 172,6(1), 51,3(2), 40,5(3), 24,5(4), 22,7(4-Me), 21,5(5).

Kryptoficyna 121.

Związek AK (73 mg, 0,082 mmola) rozpuszcza się kwasie octowym (3,5 ml) dodaje aktywowany pył cynkowy (400 mg) i otrzymaną zawiesinę poddaje działaniu ultradźwięków w czasie 45 minut. Następnie miesza się w temperaturze 25°C w czasie i dodatkowych 1,5 godzin, mieszaninę rozcieńcza chlorkiem metylenu (5 ml) i sączy przez warstwę celitu. Ciało stałe przemywa się dodatkowo chlorkiem metylenu (10 ml) i z przesączu oddestylowuje rozpuszczalnik. Pozostałość bez dalszego oczyszczania rozpuszcza się w TFA (3 ml), utrzymuje w temperaturze 25°C w czasie 1 godziny i rozpuszczalnik oddestylowuje pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość miesza się z chlorkiem metylenu i oddestylowuje rozpuszczalnik, po czym miesza się z toluenem i oddestylowuje rozpuszczalnik. Uzyskuje się bezbarwne ciało stałe. Produkt ten rozpuszcza się w bezwodnym dimetyloformamidzie (3 ml), dodaje FDPP (43 mg, 0,108 mmola) i następnie odpowiednią ilością dietyloizopropyloaminy wartość pH doprowadza do 8-9, kontrolując za pomocą nanoszenia mieszaniny na wilgotny papierek

185 949 wskaźnikowy. Całość miesza się w temperaturze 25°C w czasie 16 godzin, mieszaninę rozcieńcza eterem (40 ml), przemywa 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasowego (2 razy po 1 ml), 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodowego (15 ml) i solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem sodowym oddestylowuje się rozpuszczalnik i pozostałość oczyszcza za pomocą HPLC na odwróconej fazie na kolumnie z żelem krzemionkowym C-18 (Econosil^RC-18, 22 x 250 mm), eluując mieszaniną acetonitrylu i wody w stosunku 65:35 przy szybkości 6 ml na minutę. Zbiera się frakcję eluowaną przy czasie retencji tR 48 minut, oddestylowuje z niej rozpuszczalnik i uzyskuje bezpostaciowe ciało stałe (26 mg, wydajność 50%): [a]D +46,5° (CHC13, c=0,81); EIMS m/z 637/639 (M+, 1%), 449/451 (2/1), 420(5), 411/413(7,5), 227/228(9/7), 195(10), 184(15), 167/168/169 (40/86/29), 155/157 (100/26), 91(85), 69(86); HREIMS m/z 637,2864 (dla C35H44³⁵C1N3O₆ Δ +5,5 mmu).

*H NMR δ jednostka A 7,21-7,35 (Ph-H₅; m), 6,75(3-H; ddd, 4,2/10,8/16), 6,4(8-H, d, 16), 6,04(7-H, dd, 8,8/16), 5,75(2-H, d, 16), 5,1(5-H, m), 2,55(4-H; m; 6-H, m), 2,35(4'-H, m); jednostka B 7,18(5-H; d, 2), 7,05(9-H; dd,2,0/8,3), 6,85(8-H; d, 8,3), 5,7(NH; d, 7,2), 4,7(2-H; ddd, 4,9/7,2/7,7), 3,86(OMe, s), 3,1(3-H; dd, 4,9/14,4), 3,0(3-H'; dd, 7,7/14,4); jednostka C 7,25(NH, m), 3,5 (3-H, m), 3,4(3-H', m), 2,55(2-H, m), 1,2(2-Me; d, 7,2); jednostka D 5,8(NH, d, 7,2), 4,4(2-H, m), 1,55(4-H; m), 1,38 (3-H₂, dd, 7,2/7,7), 0,76(4-Me, d, 6,6), 0,74(5-H, d, 6,6);

^l3C NMR (CDC1₃) δ jednostka A 165,1(1), 141,9(3), 136,8(9), 131,7(8), 130,2(7), 128,5(11/13), 127,3(14), 126,1(10/12), 125,1(2), 76,5(5), 42,3(6), 36,3(4), 17,2(6-Me); jednostka B 171,0 (1), 154,1(7), 130,8(5), 129,6(4), 128,4(9), 122,5(6), 112,4(8), 56,2(OMe), 54,4(2), 35,4(3); jednostka C 175,8(1), 41,0(3), 38,6(2), 14,8(2-Me); jednostka D 173,2(1), 51,1(2), 40,9(3), 24,7(4), 23,4(4-Me), 21,5(5).

Kryptoficyny 122 i 123.

Do mieszanego roztworu kryptoficyny 121 (20 mg, 0,032 mmola) w bezwodnym chlorku metylenu (1,3 ml), w temperaturze 0°C, w jednej porcji dodaje się 99% mCPBA (17 mg, 0,1 mmola). Następnie dodaje się bezwodny toluen (0,7 ml) i całość miesza w temperaturze 25°C w czasie 72 godzin. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymane ciało stałe oczyszcza za pomocą HPLC na odwróconych fazach na kolumnie z żelem krzemionkowym C-18 [Econosil^R C-18, 22 x 250 mm) eluując mieszaniną acetonitrylu i wody w stosunku 65:35 z szybkościąó ml na minutę. Kryptoficyna 122 (9 mg, 44%) eluuje się przy czasie retencji tR 37,5 minuty, zaś kryptoficyna 123 (5 mg, 23%) eluuje się przy czasie retencji tR 40 minut.

Kryptoficyna 122.

[a]_D +35,0° (CHCI3, c 1); EIMS m/z 653/655 (1,6/0,7, M⁺), 411/413 (20/5), 280/282 (39/19), 252/254 (13/8), 223/225/227 (19/10/23), 211/213 (18/6), 195/197 (51/13), 184/186 (49/11), 176/168/169 (20/16/21), 155/156/157 (95/59/42), 139/141/143 (60/40/24), 135/135 (30/11), 129/131 (40/29), 91(100); HREIMS m/z 653,2906 (dla C35H44³⁵C1N3O₇ Δ -3,8 mmu).

’H NMR (dć-aceton) δ jednostka A 6,65(3-H; ddd, 38/11,0/15,0), 5,9(2-H, dd, 1,9/15,0), 5,25(5-H, ddd, 1,9/4,9/11,5), 3,82(8-H, d, 2,0), 3,0(7-H, dd, 2,0/7,7), 2,65(4-H; dddd, 2,0/2,0/3,8/14,5), 2,4(4-H', ddd, 11,0/11,5/14,5), 1,85(6-H, dqd, 4,9/7,4/7,7), l,l(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,45(NH; d, 7,9), 7,22(9-H; dd, 2,0/8,4), 7,0(8-H; d, 8,4), 4,45(2-H; ddd, 3,6/7,9/11,2), 3,84(OMe, s), 3,2(3-H; dd, 3,6/14,5), 2,75(3-H'; dd, 11,2/14,5); jednostka C 7,8(NH, d, 8,8), 3,65(3-H, ddd, 3,3/8,8/13,2), 3,1(3-H', ddd, 2,1/2,1/13,2), 2,55(2-H, m); jednostka D 7,35(NH; d, 8,1), 4,25(2-H, ddd, 4,8/8,1/10,8), 1,65(4-H; m), 1,45(3-H, ddd, 5,1/10 8/13,7), 1,35(3-H'; 4,8/9,0/13,7), 0,8(4-Me/5-H, d, 6,5);

°C NMR δ jednostka A 165,9(1), 140,8(3), 138,6(9), 129,4(11/13), 129,2(12), 126,7(2), 126,6(10/14), 76,0(5), 63,9(7), 59,3(8), 41,2(6), 37,7(4), 13,9(6-Me); jednostka B 171,9(1), 154,6(7), 132,5(4), 131,4(5), 129,0(9), 122,4(6), 113,3(8), 56,9(2), 65,4(OMe), 36,4(3); jednostka C 177,2(1), 41,3(3), 38,9(2), 15,7(2-Me); jednostka D 174,2(1), 51,7(2), 40,6(3), 25,3(4), 23,1 (4-Me), 21,5(5).

Kryptoficyna 123.

[a]_D +25,2° (CHC1₃, c 0,58);

Ή NMR (CDC1₃) δ jednostka A 7,21-7,35(Ph-H₅; m), 6,75(3-H; ddd, 4,1/10,9/14,1), 5,85 (2-H, dd, 1,4/15,2), 5,25(5-H, m), 3,6(8-H,d, 2,0), 2,9(7-H, dd, 2,0/7,8), 2,7(4-H; m),

185 949

2,55(4-H, m), 1,75(6-Η, m), l,05(6-Me; d, 7,1); jednostka B 7,18(5-H; d, 2,0), 7,05(9-H; dd, 2,0/8,5), 6,85(8-H; d, 8,5), 5,95(NH; d, 7,7), 4,7(2-H; ddd, 4,9/7,7/8,1), 3,86(OMe, s), 3,15(3H; dd, 4,9/14,5), 3,O5(3-H'; dd, 8,1/14,5); jednostka C 7,25(NH, m), 3,55 (3-H, ddd, 4,6/8,7/13,3), 3,15(3-H', ddd, 3,0/3,1/13,3), 2,55(2-H, m), 1,2(2-Me; d, 7,3); jednostka D 6,0(NH, d, 8,2), 4,45(2-H, m), 1,6(4-H; m), 1,55(3-H₂, m), 0,88 (4-Me, d, 7,1), 0,87(5-H, d, 7,1.

Kryptoficyna 127.

Kryptoficynę 122 (5 mg, 0,0075 mmola) rozpuszcza się w chloroformie (2 ml) i oziębia do temperatury -40°C w atmosferze azotu. Chlorek trimetylosililowy (0,02 ml, 0,157 mmola) wkrapla się i otrzymaną mieszaninę miesza w temperaturze -40°C w czasie 1 godziny. Rozpuszczalnik oddestylowuje się i pozostałość sączy przez warstwę żelu krzemionkowego eluując 15% etanolem w eterze dietylowym. Uzyskuje się kryptoficynę 127 (4 mg, wydajność 77%); [a]_D +28,6° (CHC1₃, c 1,16); EIMS m/z 653(0,5; M* -HC1); 411(2), 182/184(22/26), 153/155(68/40), 135(31), 107/108/109/ (55/22/31), 91/92(100/30), 79/81(45/35); HREIMS m/z 653,2841 (dla C₃₅H44³⁵C1N₃O7 Δ 2,6 mmu).

'H NMR (CHC1₃) δ jednostka A 7,3-7,4 (Ph-H5, m), 6,75 (3-H; ddd, 4,2/10,9/15,0), 5,8(2-H, dd, 1,5/15,0), 5,2(5-H, ddd, 1,9/9,9/9,9), 4,65(8-H, d, 9,6), 4,0(7-H, szerokie d, 9,6), 2,65(4-H; m), 2,48(6-H, m), 2,35(4-H', ddd, 10,9/11,2/14,5), l,02(6-Me; d, 7,0); jednostka B 7,18(5-H; d, 2,2), 7,05(9-H; dd, 2,2/8,6), 6,85(8-H; d, 8,6), 6,05(NH; d, 7,7), 4,65(2-H; ddd, 4,7/7,7/8,6), 3,86(OMe, s), 3,15(3-H; dd, 4,7/14,6), 2,9(3-H' ; dd, 8,6/14,6); δ jednostka C 7,25(NH, szerokie dd, 4,1/5,7), 3,4 (3-H₂, m), 2,55(2-H, m), l,15(2-Me; d, 7,5); δ jednostka D 6,2(NH d, 8,2), 4,45(2-H, m), 1,65(4-H; m), 1,55(3-H₂, m), 0,93(4-Me, d, 6,8), 0,92(5-Me, d, 6,8).

¹³C NMR (CDC1₃) δ jednostka A 165,4(1), 142,4(3), 138,8(9), 128,8(11/13), 128,2(12), 128,0(10/14), 124,0(2), 75,6(5), 73,9(7), 62,1(8), 38,6(6), 36,4(4), 8,5 (6-Me) ; δ jednostka B 171,1(1), 154,0(7), 130,8(5), 129,8(4), 128,2(9), 122,4(6), 112,4(8), 56,l(OMe), 54,5(2), 35,4(3); jednostka C 175,8(1), 41,1(3), 38,8(2), 14,8(2-Me); δ jednostka D 173,2(1), 51,1(2), 40,9(3), 25,0(4), 22,8(5), 21,8(4-Me).

Przykład 19 Syntezakryptoficyn 128 i 130-134.

Kryproficyny 128, 130 i 131.

Surową mieszaninę 5,7 mg kryptoficyny 117 i 118, w stosunku 2:1, rozpuszcza się w chloroformie (0,5 ml) i poddaje działaniu chlorku trimetylosililowego (5 μΐ) w temperaturze -60°C w czasie 3 godzin. Otrzymaną mieszaninę chlorohydryn rozdziela się metodą HPLC na odwróconych fazach i uzyskuje kryptoficynę 128, kryptoficynę 130 i kryptoficynę 131. Przeprowadza się dalsze oczyszczanie za pomocą HPLC na normalnych fazach i uzyskuje czystą kryptoficynę 128 (2,1 mg).

Dane spektralne dla kryptoficyny 128.

[a]_D +51,4° (CHC1₃, c 0,4); IR v_max 3408, 3281, 2958, 1747, 1731, 1668, 1538 1505, 1258, 1179, 1067, 910, 733 cm’¹ ; EIMS m/z (względna intensywność %) 668 (0,3, M^ -HC1) 500(1,2), 445(4,2), 407(6), 318(12), 274(17), 240(33), 199(29), 155(31), 141(23), 135(15), 109(100); wysokorozdzielcza EIMS 668,2851 (dla C₃₆H₄₅C1N₂O₈ Δ +1,3 mmu M⁺-HC1 ’H NMR (500 MHz) δ jednostka A 7,27 (10-H/14-H, d, 8,0), 7, 18(11-H//13-H, d, 8,0), 6,69(3-H; ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 5,79(2-H, dd, 15,2, 0,8), 5,10(5-H, ddd, 11,0, 8,4, 1,7), 4,63(8H,d 9,6), 3/99 (7-H, szerokie d, 9,6), 2,67(4-H; szerokie dd, 5,4, -14,2), 2,49(6-H, dqd, 7,6, 7,6, 1,7), 2,36(4-H', td,. 10,7, -14,2), 2,35(12-Me, s), l,04(6-Me; d, 7,1); jednostka B 7,23(5H; d, 2,1), 7,09(9-H; dd, 8,5, 2,1), 6,84(8-H; d, 8,5), 5,83 (NH; d, 8,6), 4,80(2-H; ddd, 8,2, 7,5, 5,7), 3,87(OMe, s), 3,16(3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,00(3-H'; dd, 7,5, -14,4); jednostka C 6,94(NH, szerokie t, 5,8), 3,53 (3-H, ddd, 5,4, 4,1, -13,5), 3,24(3-H', ddd, 6,9, 6,6, -13,5), 2,74(2-H, m), 1,22(2-Me; d, 7,3); jednostka D 4,92 (2-H, dd, 9,9, 3,2), l,75(3-H/4-H; m), 1,47(3-H', m), 0,94(5-H, d, 6,4), 0,92(4-Me-H, d, 6,4).

¹³C NMR (125 MHz) δ jednostka A 165,6(1), 141,6(3), 139,2(12), 135,3(9), 129,7(10/14), 127,9(11/13), 125,2(2), 76,4(5), 74,0(7), 62,0(8), 38,4(6), 36,3(4), 21,1(12-Me), 8,6(6-Me); jednostka B 171,1(1), 153,9(7), 131,0(5), 130,0(4), 128,4(9), 122,4(6), 112,2(8), 56,l(OMe), 53,6(2), 35,0(3); jednostka C 175,3(1), 41,3(3), 38,3(2), 14,0(2-Me); jednostka D 170,6(1), 71,3(2), 39,7(3), 25 24,7(4), 23,1(5), 21,5(4-Me).

185 949

Dane spektralne dla kryptoficyny 130.

*H NMR (300 MHz) δ jednostka A 7,27 (10-H/14-H, d, 7,8), 7,16(11-H/13-H, d, 7,8), 6,69(3-H; ddd, 15,1, 9,6, 5,2), 5,75(2-H, d, 15,1), 5,40(5-H, ddd, 10,6, 3,0, 1,8), 5,05(8-H, d, 5,9), 3,74(7-H, ddd, 10,5, 5,4, 5,2), 2,59(4-H; m), 2,55(6-H, m), 2,37(4-H', m), 2,33(12-Me, s), l,06(6-Me; d, 6,9); jednostka B 7,21(5-H; szerokie s), 7,07(9-H; szerokie d, 8,4), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,77(NH; d, 6,6), 4,80(2-H; m), 3,87(OMe, s), 3,12(3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,02(3-H'; dd, 7,2, -14,4); jednostka C 7,00(NH, szerokie t, 6,5), 3,47(3-H, ddd, 4,3, 4,0, -13,3), 3,24(3H', ddd, 6,7, 6,6, -13,3), 2,72(2-H, m), 1,23(2-Me; d, 7,3); jednostka D 4,80 (2-H, m), 1,70(3H/4-H; m), 1,42(3-H', ddd, 7,9, 4,7, -13,0), 0,91(5-H, d, 6,4), 0,86(4-Me-H, d, 6,4).

^,3C NMR (125 MHz) δ jednostka A 165,5(1), 142,1(3), 138,8(12), 135,2(9), 129,5(10/14), 127,5(11/13), 124,8(2), 77,8(5), 74,2(7), 67,2(8), 39,4(6), 34,6(4), 21,1(12-Me), 12,3(6-Me); jednostka B 171,0(1), 153,9(7), 131,0(5), 129,5(4), 128,4(9), 112,2(8), 56,1 (OMe), 53,6(2), 35,0(3); jednostka C 175,6(1), 41,1(3), 38,3(2), 5 14,l(2-Me); jednostka D 170,3(1), 71,5(2), 39,5(3), 24,6(4), 22,7 (5), 21,6(4-Me).

Dane spektralne dla kryptoficyny 131.

’HNMR (300 MHz) δ jednostka A 7,18(10-H/ll-H/13-H/14-H, s), 6,64(3-H; ddd, 15,2, 9,8, 5,4), 5,70(2-H, d, 15,2), 5,06(5-H, szerokie t, 9,1), 4,86(8-H, d, 9,7), 4,06(7-H, szerokie d, 9,7), 2,54(4-H; szerokie dd, 5,2, -14,2), 2,37(12-Me, s), 2,13(4-H', m), 1,85(6-H, m), 0,97(6Me; d, 6,6); jednostka B 7,21(5-H; d, 2,1), 7,07(9-H; dd, 8,4,2,1), 6,83(8-H; d, 8,4), 5,66(NH; d, 10,0), 4,79 (2-H; szerokie q, 7,7), 3,87 (OMe, s), 3,14(3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,02(3-H'; dd, 7,2, -14,4); jednostka C 6,93(NH, szerokie t, 6,2), 3,51 (3-H, ddd, 5,0, 4,2, -13,5), 3,27(3-H', ddd, 6,7, 6,4, -13,5), 2,73(2-H, m), 1,23(2-Me; d, 7,3); jednostka D 4,86 (2-H, dd, 9,7, 3,4), l,75(3-H/4-H; m), 1,46(3-H', m), 0,94(5-H, d, 6,0), 0,93(4-Me-H, d, 6,4).

Kryptoficyny 132, 133 i 134.

Mieszaninę kryptoficyny 124 i jej izomeru Z (134 mg, 0,199 mmoli) rozpuszcza się w chlorku metylenu (6 ml) i poddaje reakcji z kwasem m-chloronadbenzoesowym (103 mg, 0,598 mmoli) w temperaturze pokojowej w czasie 36 godzin. W celu usunięcia kwasu chlorobenzoesowego powstającego w czasie reakcji, dodaje się bufor fosforanowy (10 ml, pH 8). Po upływie czasu 30 minut wodną warstwę zastępuje się siarczkiem dimetylu (50 μΐ) i świeżą próbką buforu fosforanowego (10 ml). Mieszanie kontynuuje się w czasie 30 minut. Oddziela się warstwę organiczną rozpuszczalnik oddestylowuje, a pozostałość suszy pod zmniejszonym ciśnieniem w czasie 12 godzin. Surową mieszaninę kryptoficyn rozpuszcza się w chloroformie (5 ml) i poddaje działaniu chlorku trimetylosililu (50 μΐ) w temperaturze 60°C w czasie 3 godzin. Oddestylowuje się rozpuszczalnik i pozostałość oczyszcza za pomocą HPLC na odwróconych fazach (Econosil ODS, żel krzemionkowy, 250 mm x 22 mm, 35% wody w acetonitrylu, 6 ml na minutę) i uzyskuje kryptoficynę 134 (tR 52,5 minut, 9 mg, 6%), częściowo oczyszczoną kryptoficynę 133 (tR 61 minut, 32 mg, 22%) i surową kryptoficynę 132 (tR 67,5 minut, 72 mg). Dalsze oczyszczanie prowadzi się za pomocą HPLC o normalnych fazach (Econosil, żel krzemionkowy, 250 mm x 10 mm, 56% octanu etylu w heksanie, 3 ml na minutę) i uzyskuje czystą kryptoficynę 132 (65 mg, 45%).

Dane spektralne dla kryptoficyny 132.

[a]_D+60,l° (CHCI3, c 1,1); EIMS m/z (względna intensywność %) 688 (1,6, M⁺ -HC1), 412(10), 261(11), 195(57), 184(28), 165(28), 155(92), 135(85); wysokorozdzielcza EIMS m/z 688, 23563 (dla C35H42CI2N2O8 Δ - 3,8 mmu, M⁺ -HC1).

*H NMR (500 MHz) δ jednostka a 7,33(10-Η/11-H/13-H/14-H, s), 6,67(3-H; ddd, 15,2, 9,9, 5,1), 5,79(2-H, dd, 15,2, 1,1), 5,10(5-H, ddd, 11,1, 8,1, 1,5), 4,63(8-H,d 9,5), 3,98(7-H, szerokie d, 9,3), 2,62(4-H; szerokie dd, 5,1, -14,2), 2,47(6-H, dqd, 7,4, 7,4, 1,5), 2,40(4-H', td, 10,8, -14,2), 2,35(12-Me, s), l,02(6-Me; d, 7,0); jednostka B 7,21(5-H; d, 2,1), 7,06(9-H; dd, 8,4, 2,1), 6,82(8-H; d, 8,4), 6,04(NH; d, 8,5), 4,74(2-H; td, 8,0, 5,4), 3,85(OMe, s), 3,13(3-H; dd, 5,3, -14,4), 2,95(3-H'; dd, 7,8, -14,4); jednostka C 7,00(NH, szerokie t, 5,9), 3,48(3-H, ddd, 5,0, 3,9, -13,4), 3,23(3-H', ddd, 6,6, 6,3, -13,4), 2,71(2-H, m), l,21(2-Me; d, 7,2); jednostka D 4,91(2H, dd, 9,7, 3,4), l,75(3-H/4-H; m), Γ,45(3-Η', m), 0,92(5-H, d, 6,6), 0,91(4-Me-H, d, 6,6).

^I3C NMR (125 MHz) δ jednostka A 165,7(1), 141,6(3), 137,3(12), 134,8(9), 129,4(11/13), 129,0(10/14), 125,2(2), 76,4(5), 74,0(7), 61,4(8), 38,4(6), 36,2(4), 8,7(6-Me);

185 949 jednostka Β 171,1(1), 153,9(7), 131,0(5), 130,1(4), 128,4(9), 122,3(6), 112,2(8), 56,l(OMe), 53,8(2), 34,9(3); jednostka C 175,3(1), 41,0(3), 38,1(2), 14,l(2-Me); jednostka D 170,6(1), 71,3(2), 39,7(3), 24,7(4), 23,1(5), 21,5(4-Me).

Dane spektralne dla kryptoficyny 134.

Widmo ’H NMR jest podobne do widma dla kryptoficyny 27, z tą różnicą, że dwa multiplety przy 7,31(10/14) i 7,36-7,40(11/12/13) dla protonów fenylowych zastąpione są przez dwa dublety przy 7,26(10/14) i 7,36(11/13) dla protonów p-chlorofenylowych.

Przykład 20. Zależności budowy od aktywności (SAR) oraz badania in vivo.

Cytotoksyczności kryptoficyn 1, 3 i 8 oraz nowych kryptoficyn, przeciwko liniom komórkowym ludzkich nowotworów KB i LoVo, przedstawiono w tabeli 6. Kryptoficyna 51 i kryptoficyna 3 wykazują porównywalne cytotoksyczności (wartości IC50 3,5-5,8 nM). Kryptoficyna 52 (IC50 43-70 pM) jest jednak nieznacznie mniej cytotoksyczna w porównaniu z kryptoficyną 1 (IC50 9-29 pM), oraz kryptoficyna 55 (33-47 pM) jest nieznacznie mniej cytotoksyczna w porównaniu z kryptoficyna 8 (IC50 9-19 pM) . Wartości IC50 dla cytotoksyczności kryptoficyn 117, 122, 125, 127, 128 i 132 są porównywalne z wartościami dla kryptoficyn 1, 8, 52 i 55, jednak dane te nie pozwalają na pełniejsze porównywanie.

Kryptoficyna 52 jest aktywna in vivo, lecz wymaga stosowania w przybliżeniu trzykrotnie wyższych dawek w porównaniu z kryptoficyną 1. Aktywność kryptoficyny 52 w badaniach in vivo przeciwko pięciu stałym nowotworom mysim i trzem stałym nowotworom ludzkim zestawiono w tabeli 7. Podobnie kryptoficyna 55 wykazuje aktywność w badaniach in vivo, lecz także wymaga stosowania trzykrotnie wyższych dawek w porównaniu z kryptoficyną 8. Aktywność kryptoficyny 55 w badaniach in vivo przeciwko sześciu stałym nowotworom mysim i czterem stałym nowotworom ludzkim, przedstawiono w tabeli 8. Wyniki badania in vivo wykazują dobrą korelację z wynikami badań in vitro.

Kryptoficyny 117, 125, 128 i 132 są aktywne przeciwko trzustkowemu gruczolakorakowi pochodzenia mysiego (Panc 03). Kryptoficyny 117 i 128 wydają się wykazywać wyższą aktywność, gdyż wymagają stosowania w niższych dawkach, niż kryptoficyny 118, podczas gdy kryptoficyny 125 i 132 są mniej aktywne i wymagają stosowania w wyższych dawkach niż kryptoficyny 1 i 8. Dane te przedstawiono w tabeli 9.

Wartości T/C są mniejsze niż 42% i można je uznać za aktywne, zgodnie ze standardami NCI; zgodnie ze standardami NCI wartości T/C mniejsze niż 10% są uważane za odpowiadające doskonałej aktywności i silnemu działaniu klinicznemu. „Gross log kill” określa się jako T-C/3,2 Td, gdzie T oznacza średni czas w dniach, w którym guzy w grupie poddawanej działaniu osiągają masę 750 mg, C oznacza średni czas w dniach, w którym guzy w grupie kontrolnej osiągają masę 750 mg, oraz Td oznacza czas podwajania objętości guza (T.H. Corbett i jego współpracownicy, Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, strony 35-87; Kluwer: Norwell, 1992). Wartości „gross log kill” większe od 2,8, mieszczące się w zakresie 2,0-2,8, 1,3-1,9, 0,7-1,2 i mniejsze niż 0,7, w czasie trwania kuracji lekiem w dniach 5-20, odpowiednio oznacza się jako l l l 1, +++, ++, +, oraz - (nieaktywne). Aktywność rzędu +++ do w badaniach klinicznych powinna powodować częściową lub całkowitą regresję guza o masie 100-300 mg, u większości myszy, którym wszczepiono stały nowotwór. Kryptoficyna 52 wykazuje wartości T/C rzędu od 0 do 14% dla nowotworów mysich i 4,1 do 16 dla nowotworów ludzkich i wartości „gross log kill” rzędu 1,1 do 2 wobec nowotworów mysich i 0 do 3,2 wobec nowotworów ludzkich. Kryptoficyna 1 wykazuje wartości T/C w granicach 0 do 27% i wartości „log kill” w granicach od niższych niż 1 do 2. Kryptoficyna 55 wykazuje wartości T/C w granicach od 0 do 4,4% i wartości „log kill” w zakresie 2,1 do wyższych niż 4,6 (wyleczenie) dla wszyskich prób, za wyjątkiem jednej, doświadczenie Colon 26, w którym wartość „gross log kill” wynosi 1,2. Kryptoficyna 8 w większości wykazuje wartości T/C 0% i „log kill” większy niż 2,8 (liczne wyleczenia), co przedstawiono w tabeli 10. Kryptoficyny 117 i 125 charakteryzują wartości T/C i wartości „gross log kill” porównywalne z wartościami dla innych kryptoficyn typu epoksydów, to znaczy kryptoficyny 1 i 52, podczas gdy kryptoficyny 128 i 132 wykazują wartości T/C i „gross log kill” porównywalne z wartościami dla innych kryptoficyn typu chloroficyn, to znaczy kryptoficyn 8 i 55.

185 949

Tabela 1

Dane z badania cytotoksyczności dla kryptoficyn i ich półsyntetycznych analogów. W celu porównania zamieszcza się dane z próby według Corbett'a/Valeriote'a, dla 5-fluorouracylu, etopozydu (VP-16) i taksolu

Typ cytotoksyczności (zróżnicowany w jednostkach strefy)
Związek	pg/płytkę	Próba^aCorbett'a	pg/płytkę	Próba^bValetiote'a	KBIC50	LoVo IC₅₀
1	12,5	E/T( > 400)c		N	0,005	0,003
2	25,0	E/T( > 400)c		N	0,007	0,0002
3	25,0	E/T( > 400)c		N	0,3	0,5
4	20,0	E/T( > 400)c		N	1,3	0,5
5	2,9	E/T( > 600)c		N	0,02	0,02
6	250,0	I			> 100	> 100
7					>750	>480
8	30,0	E/T( > 500)c	30	N	0,0002	0,01
9					15	nie zbadano
10					> 100	> 100
12					> 100	> 100
14					1,8	3
5-Fu	2,5	M/T( > 400)^d	2,5	LL( > 400)
VP-16	5,0	L(350), T (530)^d	5	LL (260)
Taksol	0,2	M/H/T( > 400)^d

^aL - selektywna białaczka (np. Z_L2ioo-Zc38 i Z₁₂io-Z_H8 > 250zu)

M - selektywny stały nowotwór mysi (np. Z_c38 - Z_L12io 250zu)

H - selektywny stały nowotwór ludzki (np. Z_H8 - Z_Li₂₁₀ > 250zu)

E - działanie cytotoksyczne skierowane zarówno przeciwko białaczce jak i liniom komórkowym stałego nowotworu (strefa hamowania > 250zu)

T - selektywny nowotwór (np. Z_u2io - Zlml, Zc₃₈ - Z_LML, oraz Z_H8 - Z_LMl 250zu)

I - nieaktywne (strefa hamowania < 250) 'Ή - nieselektywne działanie skierowane przeciwko komórkowym liniom nowotworowym (białaczka) i normalnym (CFU-GM)

LL - selektywna białaczka limfocytowa (Z_L12jo - Zcfu^m - 250zu)

ML - selektywna ostra białaczka szpikowa (AML) (Zaml - Zchj-gm - 250zu).

^c Selektywna przeciwko liniom komórkowym wrażliwym i opornym na lek (Zc₃₈ - Z_LML, Zmi? - Z_Lml - Z_Hs - Zlml)· ^d Selektywna tylko przeciwko liniom komórkowym wrażliwym na lek.

Tabela 2

Dane z badania cytotoksyczności kryptoficyn w próbach in vitro

Kryptoficyna	KB IC50 ng/ml	LoVo IC₅₀ ng/ml	SKOV3 IC₅₀ ng/ml
1	2	3	4
1	0,0025	0,001	0,026
2	0,023	0,021	0,18
3	1,8	0,6	2,8
4	6	2,5	21
5	12	2	7,4

185 949 ciąg dalszy tabeli 2

1	2	3	4
8	0,01	0,0022	0,15
12	18	3
15			12
16	0,08	0,02	0,64
17	4,7	5,9	11
18	15	4,5	23
19	9,8	5,9	41
21	0,01	0,0003	0,029
23	0,89	0,4	1,7
24	0,12	0,095	0,3
26	19	9,8	95
28	1,5	0,75	6,1
29	1	0,49	3,4
30	11	8	21
31	0,53	0,062	1,9
35	0,055	0,01	0,092
40	9,0	1,0	1,7
43	0,72	0,8	1,1
45	2,3	2,4	1,6
49	1,4	1,9	1,1
50	0,17	0,17	0,2
54	0,80	2,2	2,2

Tabela 3

Aktywność kryptoficyn w badaniach in vivo

Numer próby	Nowotwór SC	# iniekcji IV	Całkowita dawka mg/kg	% utraty masy ciała	T/C	Log kill	Wyleczenia S
1	2	3	4	5	6	7	8
1560	Colon 38	8	10,3	przyrost	6%	1,5	0/5
1694	Panc 03	8	16,0	przyrost	0%	2,0	0/5
1636	Colon 51	7	28,1	-11%	7%	1,3	0/5
1720	Mam 16/C	5	13,2	-1%	5%	1,4	0/5
1733	Mam 16/Taksol	5	16,5	0%	2%	1,8	0/4
1833	Ml 7/0 (Adr.Sens.)	5	5,4	-10%	23%	< 1	0/5
1749	Panc 02	5	11,0	-5%	20%	1,1	0/5
1596	Humań Sm Celi L. DMS 273 SCID	6	7,3	0%	27%	< 1	0/5
1806	ΜΧ-1 Humań Breast	8	12	-3%	3%	2,0	0/5

185 949 ciąg dalszy tabeli 3

1	2	3	4	5	6	7	8
1823	HI25 Humań Adenosąlung	8	14,4	-15% 1/5 śmierć	9%	1,1	0/5
1841	LNCaP Humań Prostatę	6	6,5	-6%	26%	< 1	0/5

Tabela 4

Aktywność analogów kryptoficyny w badaniach in vivo

Numer próby	Czynnik	Nowotwór SC	# iniekcji IV	mg/kg TD	% utraty masy ciała	T/C	Log kill	Wyleczenia S
1813	Kryptoficyna-2	P03	10	37	-2%	44%	< 1	0/5
1843	Kryptoficyna-3	P03	4	28/5	-9t	54%	< 1	0/5
1769	Kryptoficyna-5	C38	15	45	-2%	>10 0%	Nie	0/5
1825	Kryptoficyna-8	PO 3	11	106	-6%	4%	4,6	0/5
1885	Kryptoficyna-8	Mam 16/C	7	21,3	-4,5%	6%	2,5	0/5
1887 B	Kryptoficyna-8	C38	6	30	-2%	0%	2,8	1/5
1900	Kryptoficyna-8	Colon 51	9	67,5	-1%	7%	1,8	0/5
1843	Kryptoficyna 15	P03	5	18	-7%	83%	Nie	0/5
1878	Kryptoficyna 16	P03	9	82	-1%	89%	Nie	0/5
1813	Kryptoficyna 21	P03	9	27	-11% (1/5 śmierć)	61%	Nie	0/5
1843	Kryptoficyna 35	P03	7	23	-2%	11%	1,3	0/5

Tabela 5

Cytotoksyczność przeciwmitotycznych czynników wobec komórek SKOV3 i SKYLB1.

Komórki poddaje się działaniu związków wymienionych poniżej w różnych stężeniach, w czasie 48 godzin. Liczby komórek określa się sposobem opisanym w części „Metody” i oblicza wartość IC₅o dla każdego związku. Podaje się wartości średnie dla trzech prób ± SEM.

Linia komórkowa
Związek	SKOV3	SKYLB1	Współczynnik oporności
IC₅₀ (nM)
Winblastyna	0,35 ± 0,25	4200±1700	12000
Taksol	1 ±0,4	8000 ± 2000	8000
Kryptoficyny	0,007 ± 0,002	0,60 ±0,19	86

Tabela 6 Cytotoksyczność kryptoficyn in vitro

Kryptoficyna	KB IC50 nM	LoVo IC50 nM
1	2	3
1	0,0092	0,0104
3	3,1-4,6	1,9-5,8

185 949 ciąg dalszy tabeli 6

1	2	3
8	0,019	0,0091
51	3,5	5,2
52	0,043	0,070
53	4,2	5,5
55	0,033	0,047
57	0,064	0,27
58	0,048	0,20
61	21	15
81	5,5	5,7
82	310	45
90	0,34	0,30
91	30	34
97	3,6	5,7
110	4,6	5,3
111	4,8	3,2
112	5,4	6,2
115	0,039	0,048
117	0,036	0,031
118	2,3	1,2
119	4,4	6,1
120	4,6	6,4
122	0,021	6,9
125	0,05	0,006
127	0,176	0,075
128	0,023	2,5
132	0,082	0,037

Tabela 7

Podsumowanie czynności kryptoficyny 52 in vivo

Nr Eksp.	Guz SC	Łączna dawka mg/kg	Ilość iniekcji	% ubytek wagi ciała (Nadir)	T/C w %	Regresje częściowe	Regresje całkowite	Logio zabitych komó- rek	Wyleczenia i____	Dni bez guza	Czynność
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Guzy ludzkie
2069*	Okrężnica Η116 [dojrzały]	30	4	-6,3%	4,1	2/5	0/S	2,4	0/5	84	+ + +
2072*	Prostata LNCaP [dojrzały]	48	8	-4,8%	6,9	5/5	1/5	3,2	0/5	66	+ + + +

185 949 ciąg dalszy tabeli 7

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
2076*	Pęcherz/Trzustka	48	9	-2,3%	16	-	-	Brak	0/5	68	-
2087*	Płuca H125	Iniekcje w trakcie
Guzy mysie
2063	Sutka 17/Adr	24	12	-4,7%	10	-	-	1,6	0/5	18	+ +
2065	Okręż. 26/A	64	10	-14,0%	14	-	-	1,1	0/5	24	+
2068*	Okreż. 38 [dojrzały]	55	8	-22%	0	1/5	1/5	1,6	0/5	95	d—h
2080*	Sutka 16/C	30	3	-1,6%	5	-	-	1,2	1/5	59	+ +
2082	Sutka 16/C/Adr	36	4	0%	2	-	-	2	0/5	22	+ + +
2088*	Trzustki 02	Iniekcje w trakcie

*

W trakcie

Tabela 8

Podsumowanie czynności kryptoficyny 55 in vivo

Nr Eksp.	Guz SC	Łączna dawki mg/kg	Ilość iniekcji	% ubytek wagi ciała (Nadir)	T/C w%	Regresje częściowe	Regresje całkowite	Logio zabitych komórek	Wyleczenia	Dni bez guza	Czynność
Guzy ludzkie
2066*	TSU Prostatę	298,5	10	-8,1%	0	5/5	5/5	4,0	2/5	D	+ + + +
	(Upstaged)									94
2069*	Okrężnica HI 16	315*	7	-10,4%	0	4/5	3/5	6,3	2/5	d 84	d—1—1—Η
	[dojrzały]	157,5	7	-7,6%	8	4/5	0/5	3,6	0/5	d 84	d—1—h d·
2072**	Prostata LNCaP	300	12	-3,1%	0	5/5	5/5	5,9	3/5	d77	+ + + +
	[dojrzały]	200	5	-7,7%	0	4/5	3/5	6,0	0/6	d77	+ + + d~
2075**	Pęcherz/ Trzustka	320	8	0,0%	4,4	-	-	>2,0	1/5	d68	+ + +
2087*	Płuca H125	Iniekcje w trakcie
Guzy mysie
2064**	Sutka 16/C	144	10	-7,5%	0	-	-	3,9	0/5	d92	-H- + +
2065	Okręż. 26	260	10	-2%	0	-	-	U	0/5	d 24	+
2068	Okreż. 38 [dojrzały]	237	8	-13%	0	5/5	4/5	4,7	0/5	d 95	d—1—1—H
2070**	Trzustki 03	402	6	-6,0	0	-	-	>4,5	5/5	d 84	d—1—1—\|-
1		270	6	-5,0%	0	-	-	>4,5	4/5	d 84	+ + + +
l		180	4	-0,8%	0	-	-	>4,5	4/5	d 84	+ + + +
2071	Sutka 17/Adr	180	6	-4,7%	0	-	-	2,1	0/5	D 18	+ + +
2088*	Trzustki 02	Iniekcje w trakcie

* Daje 1/5 zgonów * * Eksperymenty w trakcie

185 949

Tabela 9

Ocena działania analogów kryptoficyny na wczesne stadium raka trzustki 03 u myszy samców BDF|

Klatka	Środek	Liczba iniekcji iv	Dawka łączna mg/kg	Zgony	% ubytku lub przybytku wagi (dni)	Średnia wielkość guza d. 14 (zakres)	T/C w%	Bez guza dnia 14
1	NoRx	-	-	-	+6,8% (12)	830 (393- 1458)	—	0/5
2	krypto #117	1	7,0	3/4	-20% (12)	0 (1 mysz)	0%	1/4
3		6	13,5	1/4	-8,2 (13)	75 (0-256)	9%	1/4
4	i	6	6,75	0/3	-2,4 (8)	247 (80-415)	30%	0/3
5	krypto #125	7	42	0/4	0% (10)	0(0-63)	0%	3/4
6		7	21	0/4	-1,6,% (10)	101 (0-126)	12%	1/4
7		7	10,5	0/4	0% (8)	295 (264467)	35%	0/4
8	krypto #128	3	57	1/4	-15,2% (10)	0 (all zero)	0%	3/4
9	i	4	32,5	0/4	-5,7% (6)	0 (all zero)	0%	4/4
10	i	4	16,25	0/4	0% (12)	0 (all zero)	0%	4/4
11	krypto #132	6	180	0/4	-5,7% (10)	0 (all zero)	0%	4/4
12		6	90	0/4	-3,3% (8)	0 (all zero)	0%	4/4
13	i	6	45	0/4	1,7% (10)	304 (108-505)	37%	0/4

Guzy implantowano dnia 0. Podawanie leku rozpoczęto dnia 3.

Dnia 14 wszystkie myszy były w dobrym stanie i przybrały na wadze. Nie było więcej zgonów.

Tabela 10

Aktywność kryptoficyn w badaniach in vivo

Numer próby	Nowotwór SC	# iniekcji IV	Całkowita dawka mg/kg	% utraty masy ciała	T/C	Log kill	Wyleczenia S
1	2	3	4	5	6	7	8
1828B	Trzustka 03	11	106	-6	4	4,65	0/5
1917	Trzustka 03	12	60	-1	0	2,8	0/5
1826A	Sutek 16/C	7	21,3	-4,5	6	12,5	0/5
1887B	Jelito 3B	6	30	+2	0	3,0	0/5
1954	Jelito 3B1	11 11	132 88	-8 -6	0 0	>4,5 >4,5	5/5 4/5
1965	Jelito 3B	10	100	-5,4	0	2,3	0/5
2007	JajnilkllS	6 6	80 60	-3,5	0 0	>2 >2	2/5 (d20) l/5(d20)
1994	Sutek	9	53,1	-0,9	0	3,2	0/6
	17/Adr	9	36,9	-1,8	0	2,6	0/5
1990	Sutek 17/Adr	7	55	-6	0	2,5	0/5
2001	Trzustka 02	9	126	-3,5	0	>2	1/5 (d25)
1931		9	67,5	-6	18	1,8	0/5
1974	IV Biał. P388	7	91	-11%	50%	2,3	0/5

185 949 ciąg dalszy tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7	8
1924	Jelito %1	9	67,5	-6	7	2,2	0/5
1946	Ludzki	11	50	-5,9	0	>4,5	0/5
	sutka ΜΧ-1	11	34,2	-4,5	0	4,5	0/5
1952	H125 ludzki	8	96	+ 3,8	0	1,8	0/5
	płuc	8	57,5	+9,8	0	1,8	0/5
1983	Ludzki prostaty TSU	7	94,5	-3,4	0	>4	5/5
1975	PC-3 ludzki	8	96	+ 3,1	7,3	1,6	0/6
	prostaty	8	87,2	+3,6	14, 7	0,9	0/5
1960	Zaaw. ludzki	8	108	-6,7	5/5	3,8	0/5
	jelita HI 16	8 8	76 53	-6,7 -3,3	pr 4/5 Pr 1/5 §	3,5 2,9	0/5 0/5
1979	Zaaw.	6	81	-3,2	5/5	9,1	4/5
	ludzki	6	57	-3,4	cr	7,1	4/5
	prostaty LNCP	6	40,2	-3,2	5/5 cr 5/5 cr	8,0	2/5

Odnośniki literaturowe

1. Eglof, G., Organie Chemistry: An Advanced Treatise, Gilmar et al. (ed.), pp. 31-46, John Wiley & Sons (1943).

2. Kemp, et al., Organie Chemistry. Worth Publishers, Inc. (1980).

3. Patterson, G. M. L. et al., J. Phycol. 27:530-536 (1991).

4. Corbett, T.H. et al., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, pp 35-87, Kluwer AcademicPublishers: Norwell, 1992.

5. Valeriote, F.A. et al., Discovery and Dęyelopment of Anticancer Agents, Kluwer Academic Publishers: Norwell, 1993; in press.

6. Schwartz, R.E. et al., J. Ind. Microbiol. 5:113-124 (1990).

7. Hirsch, C.F. etal., U.S. Patent 4,946,835, issued August 7, 1990.

8. Sesin, D.F., U.S. Patent 4,845,085, issued July 4,1989.

9. Sesin, D.F. and Liesch, J.M., U.S. Patent 4,868,208, issued September 19, 1989.

10. Sesin, D.F., U.S. Patent 4,845,086, issued July 4,1989.

11. Skehan, P. et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112 (1990).

12. Bradley, G. etal., CancerRes. 49:2790-2796 (1989).

13. Endicott, J.A. et al., Ann. Rev. Biochem. 58:137-171 (1989).

14. Beck, W.T., Biochem. Pharm. 36:2879-2887 (1987).

15. Moscow, J.A. etal., J. Natl. CancerInst. 80:14-20 (1988).

16. Trimurtulu, G. et al., J. Am. Chem. Soc. 116:4729-4737 (1994).

17. Smith, C.D. etal., CancerRes. 54:3779-3784 (1994).

185 949

185 949 % kontroli % kontroli

Figura 2

[Winblastyna] (nM')

185 949

Figura 3

Gęstość komórek (A560)

Czas inkubacji (godz.)

185 949

[Winblastyna] (pM)

185 949

Figura 5

Schemat 1

185 949

TJ tS

<c

CD oj 5 O) Ll

cn

M

Schemat2

185 949

c o <_> ra r o

185 949

cO

U o m rq

T

Schemat 4

185 949

Figura 10

Kryptoficyna 81 (a) chlorek p-metoksybenzylotrifenylofosfoniowy n-Ruf .i, THF, -78 do ^eC, 80%; (b) LiOH, aceton , 25 ^eC, 81%; (c) FDPP, DIEA, związek J_tDMF, 25 °C. 72%, (d) CH₃CN, 49% wodny i HF (7:3), 25 °C, 79%; (e) DCC, DMAP, związek AC, CH₂C12,25 °C, 90%; (f) Zn, HOAc, wakat .

°C; (g) TFA czysty 25 °C; (h) FDPP, DIEA, DMF, 25 ^eC, 61%.

Schemató

185 949

Figura 11

*NH₃, CH₃OH, 50 *C, zatopiona rurka?d, 66%; ^bBH₃-THF, THF, 0 -C wrzenie , 77%; ‘(Boc^O, Et₃N. CH₃OH, 25 -C. 100%; <iRuCl₃, NaIO₄, CC1₄, CH₃CN, H₂O, 25 *C, 74%; cDMAP, DCC, CH₂C1₂, 0 *C - 25 •c, 92%; THF, morfoiina , Pd(PPh₃)₄,25 *C, 100%.

Schemat?

185 949

Figura. 12

Kryptoficyna 90

Kryptoficyna 91 »LiOH, aceton , 25 'C, 87%; ^bFDPP, DIEA, w < I, DMF, 25 ’C, 70%; «CH3CN, 49% HF (7:3), 25’C, 92%; <*DCC, DMAP, AC, CH2CI2.25 *C, 86%; «Zn, HO Ac, sonikat, 25 *C; ΠΈΑ czysty, 25 *C; fFDPP, DIEA, DMF, 25 'C, 60%; ^hmCPBA, CH2CI2.25 ’C.

Schemat8

185 949

Figura. 13

Kryptoficyny 90 i 91

Kryptoficyna 82

Schemat9

185 949

Figura, 14

Kryptoficyna 121

(_a) BOC-bezwodnik L-leucyny , DMAP. THF. Odo 25’C. 96%; (b) TFA czysty,25’C; (c) związek AL, DIEA, THF, 0 to 25*C. 83% ( 2 etapy); (<j) Zn, HOAc, sonikat , 25’C; ( e) TFA 25’C; (f) FDPP, DIEA, DMF. 25’C, 50% ( 3 etapy); (g) DIEA, chlorek piwaloilu . THF, -15 tO 25 C.

SchematlO

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związki kryptoficynowe, przedstawione wzorem strukturalnym:

w którym:

Ar oznacza grupę fenylową lub grupę tienylową które są niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla lub atomami halogenu;

Ri oznacza halogen, grupę SH, grupę aminową, monoalkiloaminową dialkioaminową trialkiloamoniową alkilotiolową dialkilosulfoniową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla, siarczanową lub fosforanową;

R₂ oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć pierścień epoksydowy, pierścień azyrydynowy, pierścień episiarczkowy, pierścień siarczanowy lub pierścień monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Cis a C19;

R3 oznacza, grupę alkilową mającą Ido 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają, H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a Cu;

Rń oznacza grupę benzylową, hydroksybenzylową alkoksybenzylową halogenohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksy-benzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

R7, Rs R9 i Rio oznaczają niezależnie od siebie H lub grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla; i

Y i X niezależnie od siebie oznaczają O, NH lub grupę alkiloaminową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla;

z wyłączeniem związków, w których co najmniej jeden z R? i Rg oznacza H,

X i Y oba oznaczają O, a Ar oznacza fenyl.
2. Związek według zastrz. 1, w której Rg oznacza grupę etylową propylową izopropylową butylową izobutylową pentylowąlub izopentylową.
3. Związek według zastrz. 1, w której R7 oznacza grupę etylową propylową izopropylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową
4. Związek według zastrz. 1, w której R7 oznacza H, Rg oznacza metyl, R3 oznacza metyl, a X i Y nie oznaczająjednocześnie O.

185 949
5. Związek według zastrz. 1, w której R3 oznacza grupę etylową propylową izopropylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową
6. Związek według zastrz. 1, w której R9 oznacza grupę metylową etylową propylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową.
7. Związek według zastrz. 1, w której Rio oznacza grupę metylową etylową propylową butylową izobutylową pentylową lub izopentylową.
8. Związek według zastrz. 1, w której co najmniej jedna z grup przyłączonych do C3, Ce, C10, Ci6, C17 i Cis ma stereochemię R.
9. Związek według zastrz. 1, w której co najmniej jedna z grup przyłączonych do C3, Cć, C10, Ci6, C17 i Cis ma stereochemię S.
10. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cu a C19; R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; R$ oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R₉oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
11. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; R& oznacza 3-chloro-4metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
12. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rg oznacza 3-chloro-4metoksybenzyl, Ro oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
13. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri oznacza S-chloro, R2 oznacza R-hydroksyl, R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Rs oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rjo oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
14. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru, Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, Rgoznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
15. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri oznacza S-chloro, R2 oznacza R-hydroksyl, R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 oznaczają atomy wodoru, Rń oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
16. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą pierścień R,R-episiarczkowy; R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
17. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-metoksyfenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cis a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 aC^; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rs i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
18. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą pierścień R,R-azyrydynowy; R3, R7 i Rs oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rio oznacza wodór, a X i Y oznaczają tlen.
19. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-fluorofenyl, Ri i R2 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cis a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 aCu; R9 oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rs i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
20. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri i R2 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cis a C19 R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; R, oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rs i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.

185 949
21. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza 2-tienyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cis a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R₉oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
22. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-fluorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
23. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-fluorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3 i R₇ oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
24. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
25. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci3 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
26. Związek według zastrz. 1, w którym Aj oznacza 2-tienyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 aC^; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
27. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza 2-tienyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
28. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R₅ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a Ci4; Re oznacza 3-chloro- 4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru.
29. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru.
30. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S, S-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Ci3 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru.
31. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cig a C19; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 aCu; Re oznacza 3-chloro-4metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
32. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień R,R-epoksydowy; R₃ i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R₅ wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a C14; Re oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
33. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri i R₂ wzięte razem tworzą pierścień S,S-epoksydowy; R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem

185 949 tworzą podwójne wiązanie między Cb a Ci₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
34. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza fenyl, Ri oznacza S-chloro, R₂oznacza R-hydroksyl, R3 i R₇ oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cb a Ci₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, X oznacza tlen a Y oznacza azot podstawiony pojedynczym atomem wodoru.
35. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-tolil, R] oznacza S-chloro, R₂oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cb a Cj₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
36. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-tolil, Ri oznacza R-chloro, R₂oznacza S-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cb a Ci₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
37. Związek według zastrz. 1, w którym Aj oznacza p-tolil, Ri oznacza R-chloro, R₂oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 aCi₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
38. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, R| oznacza S-chloro, R₂ oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cb a C]₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
39. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri oznacza Rchloro, R₂ oznacza S-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między Cb a Ci₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
40. Związek według zastrz. 1, w którym Ar oznacza p-chlorofenyl, Ri oznacza R-chloro, R₂ oznacza R-hydroksyl, R3 i R7 oznaczają grupy metylowe, R4 i R5 wzięte razem tworzą podwójne wiązanie między C13 a Ci₄; Ró oznacza 3-chloro-4-metoksybenzyl, R9 oznacza izobutyl, Rg i Rio oznaczają wodór, a X i Y oznaczają tlen.
41. Sposób wytwarzania związku kryptoficynowego, przedstawionego wzorem strukturalnym:

w którym:

Ar oznacza grupę fenylową lub grupę tienylową które są niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla lub atomami halogenu;

Ri oznacza halogen, grupę SH, grupę aminową monoalkiloaminową dialkiloaminową trialkiloamoniową alkilotiolową dialkilosulfoniową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla, siarczanową lub fosforanową

185 949

R₂ oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem tworzyć pierścień epoksydowy, pierścień azyrydynowy, pierścień episiarczkowy, pierścień siarczanowy lub pierścień monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; lub

Ri i R₂ mogą wzięte razem, tworzyć podwójne wiązanie między Cig a C19;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a C14;

Rć oznacza grupę benzylową hydroksybenzylową alkoksybenzylową halo-genohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

R7 i Rg, R9 i Rio oznaczają niezależnie od siebie H lub grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla; i

Y i X niezależnie od siebie oznaczają O, NH lub grupę alkiloaminową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

- przegrupowania allilowo podstawionego E-alkenu o wzorze:

X

w którym X i R3 mają znaczenia podane powyżej, na drodze stereospecyficznego przegrupowania Wittiga;

- konwersji tak otrzymanego związku do pierwszego δ-aminokwasu lub 5-hydroksykwasu mającego następujący wzór strukturalny:

T³

X w którym Ar, X i R3 mają znaczenia podane powyżej,

- sprzęgania powyższego pierwszego δ-aminokwasu lub δ-hydroksykwasu z drugim aaminokwasem z wytworzeniem pierwszej podjednostki o następującym wzorze strukturalnym:

w którym X, Ar, R3 i R^ mają znaczenia podane powyżej, a P oznacza grupę zabezpieczającą

- sprzęgania trzeciego β-aminokwasu z czwartym α-hydroksykwasem lub a-aminokwasem z wytworzeniem drugiej podjednostki o następującym wzorze strukturalnym: i

185 949 w którym R7, R₈, R₉ i Rio mają znaczenia takie jak podane powyżej, a P oznacza grupę zabezpieczającą; i

- sprzęgania pierwszej podjednostki z drugą podjednostką z wytworzeniem związku kryptoficynowego o wzorze strukturalnym

w którym X, Ar, R₃, Ro, R7, Rg, R₉ i Rio mają znaczenia takie jak podane powyżej;

i w razie potrzeby, przekształcenie w znany sposób jednego lub obu wiązań podwójnych węgiel-węgiel powyższego związku kryptoficynowego do związku kryptoficynowego o poniższym wzorze strukturalnym:

w którym X, Ar, Ri, R₂, R₃, R4, R5, Ro, R7, R₈, R9 i Rjo mają znaczenia takie jak podane powyżej.
42. Kompozycja farmaceutyczna do hamowania proliferacji hiperproliferacyjnych komórek ssaczych, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość związku o wzorze strukturalnym:

185 949 w którym:

Ar oznacza grupę fenylową lub grupę tienylową które są niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla lub atomami halogenu;

Ri oznacza halogen, grupę SH, grupę aminową, monoalkiloaminową dialkiloaminową trialkiloamoniową alkilotiolową dialkilosulfoniową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla, siarczanową lub fosforanową;

R2 oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R2 mogą wzięte razem tworzyć pierścień epoksydowy, pierścień azyrydynowy, pierścień episiarczkowy, pierścień siarczanowy lub pierścień monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; lub

Ri i R2 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Cis a C19;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

R4 i R5 oznaczają. H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a C14;

Rć oznacza grupę benzylową, hydroksybenzylową alkoksybenzylową halo-genohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową, halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

R7, Rg, R9 i Rio oznaczają, niezależnie od siebie H lub grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla; i

Y i X niezależnie od siebie oznaczają O, NH lub grupę alkiloaminową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla;

z wyłączeniem związków, w których co najmniej jeden z R7 i R_g oznacza Η, X i Y oba oznaczają. O, a Ar oznacza fenyl, oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
43. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że dodatkowo zawiera co najmniej jeden środek przeciwnowotworowy.
44. Zastosowanie związku kiyptoficynowego o wzorze strukturalnym:

w którym:

Ar oznacza grupę fenylową lub grupę tienylową, które są niepodstawione lub podstawione grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla lub atomami halogenu;

Ri oznacza, halogen, grupę SH, grupę aminową, monoalkiloaminową dialkiloaminową trialkiloamoniową alkilotiolową dialkilosulfoniową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węglą siarczanową lub fosforanową

R2 oznacza grupę OH lub SH; lub

Ri i R2 mogą wzięte razem tworzyć pierścień epoksydowy, pierścień azyrydynowy, pierścień episiarczkowy, pierścień siarczanowy lub pierścień monoalkilofosforanowy, gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla; lub

Ri i R2 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między Cis a C19;

R3 oznacza grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla;

185 949

R4 i Rs oznaczają. H; lub

R4 i R5 mogą wzięte razem tworzyć podwójne wiązanie między C13 a C14;

Rć oznacza grupę benzylową hydroksybenzylową alkoksybenzylową halogenohydroksybenzylową dihalogenohydroksybenzylową halogenoalkoksybenzylową lub dihalogenoalkoksybenzylową gdzie alkoksyl ma 1 do 5 atomów węgla;

R7, Rg, R₉ i Rio oznaczają niezależnie od siebie H lub grupę alkilową mającą 1 do 5 atomów węgla; i

Y i X niezależnie od siebie oznaczają O, NH lub grupę alkiloaminową gdzie alkil ma 1 do 5 atomów węgla;

z wyłączeniem związków, w których co najmniej jeden z R7 i Rg oznacza Η, X i Y oba oznaczają. O, a Ar oznacza fenyl, do wytwarzania leku do hamowania proliferacji komórek ssaczych i leczenia chorób spowodowanych przez proliferujące komórki ssacze.
45. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym komórki ssacze sąhiperproliferacyjne.
46. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym komórki ssacze są ludzkie.
47. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym komórki ssacze mają fenotyp oporności wielolekowej.
48. Zastosowanie według zastrz. 44, do wytwarzania leku zawierającego dodatkowo co najmniej jeden dodatkowy środek przeciwnowotworowy.
49. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym choroba charakteryzujące się tworzeniem nowotworów.
50. Zastosowanie według zastrz. 49, w którym choroba jest wybrana z grupy składającej się z raka sutka, małokomórkowego raka płuc, nie-małokomórkowego raka płuc, raka okrężnicy, białaczki, czemiaką gruczolakoraka trzustki, raka ośrodkowego układu nerwowego (OUN), raka jajnika, raka prostaty, mięsaka tkanki miękkiej lub kości, raka głowy i szyi, raka gastrycznego, w tym raka trzustki i przełyku, raka żołądka, szpiczaką raka pęcherza, raka nerek, raka układu neuroendokrynologicznego, w tym raka tarczycy i choroby Hodgkin'a oraz nowotworowej choroby Hodgkin'a.
51. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym lek jest przeznaczony do podawania w połączeniu z co najmniej jedną dodatkową terapią skierowaną na poprawę choroby.

* * *