NO326685B1 - Kryptofyciner samt anvendelse derav og farmasoytisk blanding - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kryptofyciner samt anvendelse derav og farmasøytisk blanding.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Neoplastiske sykdommer som kjennetegnes ved proliferasjonen av celler som ikke er underlagt den normale cellevekstkontroll, er en vesentlig årsak til dødsfall blant mennesker. Klinisk erfaring innen kjemoterapi har vist at det er behov for nye og mer effektive medikamenter til behandling av disse sykdommene. Erfaringen har også vist at medikamenter som forstyrrer celleskjelettets mikrotubuli-system kan være effektivt til å hindre proliferasjonen av neoplastiske celler.

Mikrotubuli-systemet til eukaryote celler er en hovedkomponent av celleskjelettet og er i en dynamisk sammensetnings- og adskillings-tilstand; hvilket vil si at heterodimerer av tubulin polymeriseres for å danne mikrotubuli, og mikrotubuli depolymeriseres til deres bestanddelskomponenter. Mikrotubuli spiller en nøkkelrolle ved reguleringen av celle-arkitektur, -metabolisme og deling. Den dynamiske tilstand til mikrotubuli er avgjørende for deres normale funksjon. Med hensyn til celledeling, polymeriseres tubulin til mikrotubuli som danner den mitotiske spindel. Mikrotubuli depolymeriseres deretter når anvendelsen av den mitotiske spindel har skjedd. Midler som forstyrrer polymerisering eller depolymerisering av mikrotubuli, og derved inhiberer mitose, utgjør således noen av de mest effektive klinisk anvendte kjemoterapeutiske midler.

Slike antimitotiske midler eller gifter, kan inndeles i tre grupper på grunnlag av deres molekylære virkningsmekanisme. Den første gruppe består av midler, inklusivt kolkicin og kolkemid, som inhiberer dannelsen av mikrotubuli ved sekvestrering av tubulin. Den andre gruppen består av midler, inklusivt vinblastin og vinkristin, som induserer dannelsen av parakrystallinske aggregater av tubulin. Vinblastin og vinkristin er velkjente anticancer-medikamenter. Deres forstyrrende virkning på de mitotiske spindel-mikrotubuli inhiberer fortrinnsvis hyperproliferative celler. Den tredje gruppe består av midler, inklusivt taxol, som fremmer polymeriseringen av tubulin og således stabiliserer mikrotubuli-strukturene.

At noe har aktivitet som et antimitotisk middel garanterer imidlertid ikke effekt mot en tumorcelle, og slett ikke en tumorcelle som oppviser en medikamentresistent fenotype. Vinkaalkaloider, så som vinblastin og vinkristin, er effektive mot neoplastiske celler og svulster, men de mangler imidlertid aktivitet mot enkelte medikamentresistente svulster og celler. Et grunnlag for en neoplastisk celle som oppviser DR (drug resistance) eller MDR (multiple-drug resistance) er via overekspresjon av P-glykoprotein. Forbindelser som er dårlige substrater for transport av P-glykoproteiner burde være anvendelige i å omgå slike DR- eller MDR-fenotyper.

Eksistensen av DR- eller MDR-fenotype i mange tumorceller, og den klinisk utprøvede virkningsmåte for anti-mikrotubuli-midler mot neoplastiske celler, gjør det følgelig nødvendig å utvikle anti-mikrotubuli-midler som er cytotoksiske overfor ikke-medikamentresistente neoplastiske celler så vel som cytotoksiske overfor neoplastiske celler av en medikamentresistent fenotype. Midler som har vist seg lovende i så henseende, innbefatter en klasse av forbindelser kjent som kryptofyciner.

Når det gjelder fremgangsmåter for fremstilling av kryptofyciner er det for tiden ikke kjent noen metode for totalsyntese av kryptofyciner. Kryptofycin-forbindelser fremstilles for øyeblikket via isolering fra blågrønnalger eller utgjør halvsyntetiske varianter av slike naturlig produserte forbindelser. Mangelen på en totalsyntese-metode gjør det nødvendigvis vanskelig å fremstille stereospesifikke kryptofyciner som kan maksimalisere forbindelsens aktivitet og øke stabiliteten. For eksempel har forskning vist at kryptofyciner med en intakt makrocyklisk ring er mer aktive. En totalsyntese-metode som kunne produsere kryptofyciner med en makrocyklisk ring og som er mer stabile enn de naturlig avledede kryptofyciner ville således være ønskelig. Foreliggende oppfinnelse løser disse problemene.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer kryptofycin, kjennetegnet ved strukturen:

hvor

Ar er fenyl;

R-i er halogen;

R2 er OH; eller

R-i og R2 kan sammen danne en epoksidring, en aziridinring, en episulfidring, eller en dobbeltbinding mellom Ci8 og C19;

R3 er en C1-C5 alkylgruppe;

R4 og R5 er H; eller

R4 og R5 danner sammen en dobbeltbinding mellom C13 og Cu;

R6 er en benzyl-, halogenbenzyl- eller Ci-C5-alkoksyhalogenbenzylgruppe;

R7og R8 er hver uavhengig C1-C5 alkylgruppe;

R9 er H;

R10erCrC5alkyl; og

X og Y er hver uavhengig O.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten farmasøytisk blanding egnet for inhibering av proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle, kjennetegnet ved at den omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelsen av kryptofycinforbindelsen ifølge krav 1, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en sykdom kjennetegnet ved proliferasjon av en pattedyrcelle og for inhibering av proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle som har en MDR-fenotype (multiple drug resistant).

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 angir en generell struktur av utvalgte kryptofycin-forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse og et nummereringssystem for hydroksysyre-enhetene A og D og aminosyre-enhetene B og C i utvalgte utførelsesformer; Figur 2A og B viser grafisk virkning av kryptofycin-forbindelser og vinblastin på Jurkatcelleproliferasjon og cellecyklus-utvikling. Jurkatceller ble inkubert med de angitte konsentrasjoner kryptofycin-forbindelse (A) eller vinblastin (B) i 24 timer. For hver prøve ble antallet levende celler (■) og den mitotiske indeks ( ) bestemt som beskrevet under Eksperimentell del. Verdiene representerer gjennomsnitt standardavvik (sd) for tre parallellprøver i ett av tre lignende forsøk; Figur 3 viser grafisk reverserbarheten av virkningene av vinblastin, kryptofyciner og taxol på cellevekst. SKOV3-celler ble behandlet med 0,1 nM vinblastin ( ), 0,1 nM kryptofyciner (■) eller 1 nM taxol ( ) på tidspunktet = 0. Disse konsentrasjonene av hver av forbindelsene inhiberte celleveksten med 50%. Etter 24 timer ble cellene vasket og inkubert i medikamentfritt medium i det angitte tidsrom. Celletettheten ble bestemt ved farving med sulforhodamin B (SRB) som beskrevet under Eksperimentell del og er uttrykt som gjennomsnittet ± sd absorbans ved 560 nm for tre parallellprøver i ett av tre forsøk; Figur 4 er isobologrammer for kombinasjonsvirkninger av vinblastin og kryptofyciner på celleproliferasjon. SKOV3-celler ble behandlet med vinblastin (0-600 pM) og/eller kryptofyciner (1-100 pM) i 48 timer. Celleantallet ble deretter bestemt ved SRB-farving som beskrevet i Eksperimentell del, og ICso-verdier (■) og additivitets-linjen (----) ble bestemt for kombinasjoner av vinblastin og kryptofycin-forbindelser. Verdiene representerer gjennomsnittet av to forsøk som hvert besto av tre parallellprøver; Figur 4 viser et første reaksjonsskjema for syntetisering av kryptofyciner i henhold til foreliggende oppfinnelse; Figur 6 viser et reaksjonsskjema for fremstilling av en hydroksysyre-enhet A; Figur 7 viser et reaksjonsskjema for fremstilling av subenheten av et kryptofycin som omfatter en hydroksysyre-enhet A og aminosyre B; Figur 8 viser et reaksjonsskjema for fremstilling av subenheten av et kryptofycin som omfatter en aminosyre-enhet C og hydroksysyre D; Figur 9 viser et reaksjonsskjema for å syntetisere utvalgte kryptofyciner i henhold til foreliggende oppfinnelse; Figur 10 viser et reaksjonsskjema for å syntetisere en subenhet av et kryptofycin som omfatter en hydroksysyre D.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig nye kryptofycin-forbindelser som har følgende struktur:

hvor

Ar er fenyl;

Ri er halogen;

R2 erOH; eller

Ri og R2 kan sammen danne en epoksidring, en aziridinring, en episulfidring, eller en dobbeltbinding mellom Ci8 og Ci9;

R3 er en CrC5 alkylgruppe;

R4 og R5 er H; eller

R4 og R5 danner sammen en dobbeltbinding mellom C13 og Ci4;

R6 er en benzyl-, halogenbenzyl- eller CrC5-alkoksyhalogenbenzylgruppe;

R7og R8 er hver uavhengig CrC5 alkylgruppe;

R9 er H;

Ri0er Ci-C5alkyl; og

X og Y er hver uavhengig O.

Ifølge ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse er R8 etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre kryptofycin-forbindelser hvor R7 er etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre kryptofycin-forbindelser hvor R8 er metyl, R3 er metyl; X og Y er begge O.

De etterfølgende betegnelser har de angitte betydninger med mindre det av sammenhengen klart fremgår en annen betydning: «lavere p-aminosyre» betyr en hvilken som helst p-aminosyre som har tre til åtte karbonatomer og innbefatter lineære og ikke-lineære hydrokarbonkjeder, som for eksempel 3-amino-2-metylpropionsyre.

«forestret lavere p-aminosyre» betyr en hvilken som helst p-aminosyre som har tre til åtte karbonatomer hvor hydrogenet i karboksylsyregruppen er substituert med en metylgruppe; for eksempel 3-amino-2-metylpropionsyre-metylester.

«lavere alkanoyloksygruppe» betyr en alkanoyloksygruppe med ett til syv karbonatomer og innbefatter lineære og ikke-lineære hydrokarbonkjeder.

«lavere a-hydroksyalkanoyloksygruppe» betyr en a-hydroksyalkanoyloksygruppe med to til syv karbonatomer og innbefatter lineære og ikke-lineære hydrokarbonkjeder; for eksempel 2-hydroksy-4-metyl-valeriansyre.

«lavere alkoksylgruppe» betyr en hvilken som helst alkylgruppe med ett til fem karbonatomer bundet til et oksygenatom.

«lavere alkylgruppe» betyr en alkylgruppe med ett til fem karbonatomer og innbefatter lineære og ikke-lineære hydrokarbonkjeder, inklusivt for eksempel metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, sek-butyl, metylerte butylgrupper, pentyl og tert-pentylgrupper.

«allylisk substituert alken» betyr et hvilket som helst alken som inneholder en alkylsubstituent.

«epoksidring» betyr en treleddet ring hvis skjelett består av to karbon- og ett oksygen-atom.

«aziridinring» betyr en treleddet ring hvis skjelett består av to karbon- og ett nitrogen-atom.

«episulfidring» betyr en treleddet ring hvis skjelett består av to karbon- og ett svovel-atom.

«sulfatring» betyr en femleddet ring bestående av et karbon-karbon-oksygen-svovel-oksygen-skjelett med ytterligere to oksygenatomer forbundet med svovelatomet.

«monoalkylfosfatring» betyr en femleddet ring bestående av et karbon-karbon-oksygen-fosfor-oksygen-skjelett med to ytterligere oksygenatomer, hvorav det ene har en lavere alkylgruppe forbundet med fosforatomet.

«enkel usubstituert aromatisk gruppe» refererer seg til vanlige aromatiske ringer som har 4n+2pi-elektroner i et monocyklisk konjugert system (for eksempel furyl, pyrrolyl, tienyl, pyridyl) eller et bicyklisk konjugert system (for eksempel indolyl eller naftyl).

«enkel substituert aromatisk gruppe» refererer seg til en fenylgruppe substituert med en enkelt gruppe (f.eks. en lavere alkylgruppe eller halogen).

«heteroaromatisk gruppe» refererer seg til aromatiske ringer som inneholder én eller flere ikke-karbonsubstituenter så som oksygen, nitrogen eller svovel.

«halogen» refererer seg til medlemmer av den gruppe i det periodiske system som tradisjonelt er kjent som halogener. Halogeneringsmetoder innbefatter, men er ikke begrenset til, addisjon av hydrogen-halogenider, substitusjon ved høy temperatur, fotohalogenering, etc, og slike metoder vil være kjent for fagmannen.<1,2>

En utførelsesform av en kryptofycin-forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når R3 er etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når R10 er metyl, etyl, propyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når minst én av gruppene knyttet til C3, C6, Cio, Ci6, Ci7 og Ci8 har R-stereokonfigurasjon.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når minst én av gruppene knyttet til C3, C6, Cio, Ci6, C17 og Ci8 har S-stereokonfigurasjon.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når R3 og R7 er metyl, R4 og R5 er tatt sammen for å danne en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, R8 er metyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl, X er oksygen og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 kan sammen danne en dobbeltbinding mellom Ci8 og Cig.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 sammen danner en epoksidring.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når nevnte epoksidring er valgt fra R,R-epoksidring eller S,S-epoksidring.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 sammen danner en episulfidring.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når R4 og R5 er H.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når R4 og R5 sammen danner en andre binding mellom C13 og Ci4.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci8 og Ci9, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom C13 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksy-benzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 sammen danner en fi,R-epoksidring, R3, R7 og Re er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når R-i og R2 danner sammen en S,S-epoksidring, R3, R7 og Ra er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri er S-klor, R2 er fl-hydroksyl, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 danner sammen en dobbelt-binding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl, og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 sammen danner en fl.fl-epioksidring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 er hydrogen, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri er S-klor, R2 er R-hydroksyl, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 er hydrogen, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ri og R2 sammen danner en fl,f?-episulfidring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom C13 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, R9 er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

En ytterligere utførelsesform av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse er når Ar er fenyl, Ri og R2 sammen danner en f?,F?-aziridinring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Ci4, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

Kryptofycinene kan være metabolitter produsert av en dyrket stamme av Nostoc sp. av blågrønnalger (cyanobacteria), hvoretter disse forbindelsene er isolert fra kulturen. De kan også være derivater av disse naturlig produserte metabolittene, som er kjemisk modifisert etter metodene beskrevet i den Eksperimentelle del av denne søknad, med alternative metoder for å frembringe de eksemplifiserte forbindelsene så vel som ikke-eksemplifiserte forbindelser som vil være tilgjengelige for fagmannen.

Ovennevnte kryptofycin-forbindelser kan fremstilles gjennom dyrkning av en stamme av Nostoc sp. De morfologiske karakteristika for Nostoc sp. av blågrønnalger (cyanobacteria) slik de fremgår av US-patent 4.946.835, er at de er filamentære og består av vegetative celler. I lengre filamenter sees leilighetsvis heterocyster i en interkalær posisjon; akineter sees ikke. Reproduksjon skjer ved hormogoni i tillegg til vilkårlig trichom-brudd. Grunnlaget for en identifikasjon av Nostoc sp. finnes i J. Gen. Micro., 111:1-61 (1979).

En Nostoc sp. kan dyrkes og nye kryptofycin-metabolitter, så vel som tidligere omtalte kryptofycin-metabolitter, kan isoleres fra denne kulturen. Nostoc sp. stammen med betegnelsen GSV 224 er den stammen som dyrkes og som det isoleres forbindelser fra.

Kjemisk modifisering av en kryptofycin-metabolitt isolert etter ovennevnte metode gir en distinkt forbindelse. Fremgangsmåter for kjemisk modifisering av kryptofycin-forbindelser for å frembringe ytterligere forbindelser innenfor rammen av oppfinnelsen vil være kjent for fagmannen. Dessuten er ytterligere fremgangsmåter beskrevet mer detaljert i den Eksperimentelle del av denne søknad.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en hvilken som helst stamme av Nostoc sp. og fortrinnsvis mot Nostoc sp. GSV 224-stammen for produksjon av kryptofycin-forbindelser. Med dette for øyet ble GSV 224-stammen av Nostoc sp. deponert 7. oktober 1993 i henhold til Budapestavtalen om internasjonal deponering av mikroorganismer for patentformål i the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A. under ATCC tilgangsnummer 55483. Andre stammer av Nostoc sp., særlig stamme MB 5357, tidligere deponert av Merck & Co. under ATCC tilgangsnummer 53789, er stammer som vurderes utnyttet for foreliggende oppfinnelse.

Som for andre organismer er kjennetegnene for Nostoc sp. gjenstand for variasjon. For eksempel kan rekombinanter, varianter eller mutanter av de angitte stammer, oppnås ved behandling med forskjellige kjente fysiske og kjemiske mutagener, som for eksempel ultrafiolett bestråling, røntgenbestråling, gammabestråling og N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Alle naturlige og induserte varianter, mutanter og rekombinanter av de angitte stammer som bibeholder karakteristikaene for produksjon av en kryptofycin-forbindelse kan anvendes.

Kryptofycin-forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å dyrke en stamme av Nostoc sp. under submerse aerobe betingelser i et egnet kulturmedium inntil det er produsert betydelig antibiotisk aktivitet. Andre dyrkningsteknikker, så som overflatevekst på stivnede medier, kan også benyttes for å produsere disse forbindelsene. Det kulturmedium som benyttes for å dyrke disse spesifiserte stammene, kan innbefatte én av mange nitrogen- og karbon-kilder og uorganiske salter som er kjent for fagmannen. Produksjonsøkonomi, optimale utbytter og lettvint produktisolering er faktorer som må tas i betraktning når de karbonkilder og nitrogenkilder som skal benyttes, velges. Blant de uorganiske næringssaltene som kan inngå i dyrkningsmediet er de vanlige løselige saltene som er i stand til å gi jern-, kalium-, natrium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, klorid-, karbonat-, fosfat-, sulfat-, nitrat-ioner og lignende ioner.

Essensielle sporelementer som er nødvendige for veksten og utviklingen av organismene må også inngå i dyrkningsmediet. Slike sporelementer opptrer vanligvis som forurensninger i andre bestanddeler av mediet i tilstrekkelige mengder til å møte organismenes vekstkrav. Det kan være ønskelig å tilsette små mengder (dvs.

0,2 ml_/L) av et antiskum-middel, så som polypropylenglykol (molvekt ca. 2000) til dyrkningsmedier i storskala dersom skumming blir et problem.

For fremstilling av vesentlige mengder av kryptofycin-forbindelsene, kan det benyttes submers aerob dyrkning i tanker. Små mengder kan oppnås ved risteflaskekultur. På grunn av den tidsforsinkelse i metabolittproduksjon som vanligvis forbindes med inokulering av store tanker med organismene, er anvendelse av et vegetativt inokulum å foretrekke. Det vegetative inokulum fremstilles ved å inokulere et lite volum kulturmedium med deler av den vegetative trichom- eller heterocyst-holdige form av organismen for å oppnå en frisk, aktivt voksende kultur av organismen. Det vegetative inokulum overføres deretter til en større tank. Mediet som benyttes for det vegetative inokulum kan være det sammen som det som benyttes for større kultiveringer eller fermentering, men andre medier kan også benyttes.

Organismene kan dyrkes ved temperaturer mellom ca. 20°C og 30°C og en innfallende belysningsintensitet på ca. 100 til 200 u.mol fotoner m"<2>sek'<1> (fotosyntetisk aktiv bestråling).

Som vanlig for aerobe submerse dyrkningsprosesser av denne type innføres karbondioksyd-gass i kulturen ved tilsetning til den sterile luftstrøm som bobles gjennom kulturmediet. For å oppnå effektiv produksjon av kryptofycin-forbindelsene bør andelen av karbondioksyd være ca. 1% (ved 24°C og 1 atmosfæres trykk).

Teknikkens stand, nærmere bestemt US-patent 4.946.835, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse, angir fremgangsmåter for dyrkning av Nostoc sp.

Produksjon av kryptofycin-forbindelsen kan under dyrkningen følges opp ved å teste prøver av buljongen mot organismer som er kjent som følsomme overfor disse antibiotika. En anvendelig testorganisme er Candida albicans.

Etter deres fremstilling under aerobe submerse dyrkningsbetingelser, kan kryptofycin-forbindelser ifølge oppfinnelsen isoleres fra kulturen og fra kulturmediet etter kjente fremgangsmåter. Isoleringen oppnås i alminnelighet ved først å filtrere kulturmediet for å fraskille algecellene og deretter frysetørke de fraskilte cellene. De frysetørkede algene kan ekstraheres med et passende løsningsmiddel, så som etanol, metanol, isopropanol eller diklormetan. Kryptofycinene kan separeres ved å underkaste dette ekstrakt, så vel som kulturmediet, hurtigkromatografi på omvendt-fase kolonne. Kryptofycinene kan renses ved omvendt-fase høytrykks væskekromatografi (HPLC).

Som det fremgår av deres strukturer har kryptofycin-forbindelsene grupper som er i stand til kjemisk modifisering. Artsforbindelsen for foreliggende oppfinnelse er kryptofyciner som oppviser antineoplastisk aktivitet. For eksempel inkluderer de derivater som er eksemplifisert i foreliggende oppfinnelse, forbindelser som epoksid-oksygen eller hydroksygrupper på C-7 og C-8 i enhet A eller leucinsyregruppen på enhet B i Figur 1. Slike derivater av de nye og tidligere beskrevne forbindelser som oppviser den ønskede antineoplastiske aktivitet, omfattes av foreliggende oppfinnelse. Sammenhengen mellom strukturen av kryptofycin-forbindelsene og anti-neoplastisk aktivitet er dessuten angitt nedenfor i den Eksperimentelle del.

Nye kryptofycin-metabolitter, så vel som tidligere beskrevne kryptofycin-metabolitter, kan syntetiseres ved å benytte de fremgangsmåter som er beskrevet her.

Et kryptofycin kan fremstilles ved utvelging av et allylisk substituert E-alken; omleiring av det allylisk substituerte E-alken via en stereospesifikk Wittig-omleiring; omdannelse av denne forbindelse til en første 8-aminosyre eller 8-hydroksysyre; kobling av den første syre til en andre a-aminosyre for å danne en første subenhet; kobling av en tredje |3-aminosyre til en fjerde a-hydroksysyre eller a-aminosyre for å danne en andre subenhet; og kobling av den første subenhet til den andre subenhet for å danne et kryptofycin.

Proliferasjonen av en pattedyrcelle kan inhiberes ved at pattedyrcellen bringes i kontakt med en kryptofycin-forbindelse i en tilstrekkelig mengde til å inhibere celleproliferasjonen, hvor kryptofycin-forbindelsen har følgende struktur:

hvor

Ar er fenyl;

R-i er halogen;

R2 er OH; eller

R-, og R2 kan sammen danne en epoksidring, en aziridinring, en episulfidring, eller en dobbeltbinding mellom Cis og C^;

R3 er en C1-C5 alkylgruppe;

R4 og R5 er H; eller

R4 og R5 danner sammen en dobbeltbinding mellom C13 og Ci4;

R6 er en benzyl-, halogenbenzyl- eller CrC5-alkoksyhalogenbenzylgruppe;

R7og Rs er hver uavhengig C1-C5 alkylgruppe;

R9 er H;

R10er Ci-C5alkyl; og

X og Y er hver uavhengig O.

Cellen kan videre bringes i kontakt med minst ett ytterligere anti-neoplastisk middel. Den pattedyrcelle som kontaktes kan være hyperproliferativ og den hyperproliferative cellen kan være en human celle.

Proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle som er av MDR-fenotype kan inhiberes og omfatter at cellen bringes i kontakt med en mengde av en kryptofycin-forbindelse som effektivt forstyrrer den dynamiske tilstand av mikrotubuli-polymerisering og depolymerisering for å stanse cellemitosen, hvorved proliferasjon av cellen inhiberes, idet kryptofycin-forbindelsen har følgende struktur:

hvor

Ar er fenyl;

Rt er halogen;

R2 er OH; eller

R1 og R2 kan sammen danne en epoksidring, en aziridinring, en episulfidring, eller en dobbeltbinding mellom C-i8 og Ci9;

R3 er en CrC5 alkylgruppe;

R4 og R5 er H; eller

R4 og R5 danner sammen en dobbeltbinding mellom C13 og Cu;

R6 er en benzyl-, halogenbenzyl- eller Ci-C5-alkoksyhalogenbenzylgruppe;

R7og R8 er hver uavhengig C1-C5 alkylgruppe;

R9 er H;

Rioer CrC5alkyl; og

X og Y er hver uavhengig O.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfattes anvendelse av kryptofycinforbindelsen ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle som har en MDR-fenotype (multiple drug resistant).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelse ifølge krav 25, idet den patologiske tilstand kjennetegnes ved dannelse av neoplasmer.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfattes anvendelse ifølge krav 30, idet neoplasmene er valgt fra gruppen bestående av mamma-, småcellet lunge-, ikke-småcellet lunge-, kolorektal-, leukemi-, melanom-, pankreasadenokarsinom-, sentralnervesystem, ovarie-, prostata-, sarkom av bløtvev eller ben, hode og hals, gastriske som innbefatter pankreas og øsofagus, mavesekk, myelom, blære, nyre, neuroendokrine som innbefatter thyreoidea og non-Hodgkins og Hodgkins sykdomneoplasmer.

Fremgangsmåten for fremstilling av kryptofycin-forbindelsene er sammenfattet i Reaksjonsskjema 1, som vist i Figur 5. Utgangsmaterialet er et 3E-alken (a) substituert i C-2 med en XH-gruppe i S-konfigurasjon, hvor X er oksygen eller NH. L-alanin og L-melkesyre tjener som billige kilder for utgangsmaterialet a. Nøkkeltrinnet i syntesen er en stereoselektiv [2,3] Wittig-omleiring (D.J-S. Tsai et. al., J. Org. Chem. 1984, 49:1842-1843; K. Mikami et. al., Tetrahedron, 1984, 25:2303-2308; N. Sayo er. al., Chem. Lett. 1984, 259-262) av propargyleteren av a (b) til (3R,4R)-3-(XH-substituert)-4-alkylhept-5(E)-en-1-yn (c) hvor X er et oksygen eller beskyttet nitrogen (f. eks. t-butyldimetylsilylamino). Forbindelse c kan deretter omdannes til 8-hydroksy- eller aminosyre-enhet A-forløperen av kryptofycin, metyl-(5S,6R)-5-(XP-substituert)-6-alkyl-8-aryl-okta-2E,7E-dienoat (d), hvor P er en passende beskyttelsesgruppe, ved å benytte kjente fremgangsmåter.

En syntesestrategi for et kryptofycin som er sammensatt av en S-hydroksy-eller aminosyre-enhet A, en a-aminosyre-enhet B, en p-aminosyre-enhet C og en a-hydroksy- eller aminosyre-enhet D, består i å sette makroringen sammen fra to forløpere som representerer deler av kryptofycin-molekylet, for eksempel en A-B-forløper (e) som inneholder 8-hydroksy- eller aminosyre-enhet A og a-aminosyre-enhet B og en C-D-forløper (f) som inneholder p-aminosyre-enheten C og a-hydroksy- eller aminosyre-enheten D.

I den her beskrevne fremgangsmåte settes et kryptofycin sammen fra A-B- og C-D-forløpere i to trinn ved (1) å forbinde endene av enhetene A og D i A-B- og C-D-forløperne under dannelse av et acyklisk C-D-A-B-mellomprodukt og (2) forbinde endene av enhetene B og C for å danne det cykliske produkt.

Strukturer til kryptofycinene 51, 52, 53, 55, 57, 58 og 61 er angitt nedenfor:

Ved syntesen av kryptofycin 51 beskrevet i den Eksperimentelle del, dannes en esterbinding mellom 8-hydroksygruppen av enhet A i A-B-delen og karboksylgruppen i enhet D i C-D-fragmentet, for å danne et acyklisk C-D-A-B-mellomprodukt, hvoretter en amidbinding dannes mellom karboksylsyregruppen av enhet B i A-B-delen og (3-aminogruppen av enhet C i C-D-enheten. Forbindelse K er forløperen for A-D-delen, forbindelse P er forløperen for C-D-delen og forbindelse R er den acykliske C-D-A-B-forløper av Kryptofycin 51. Forbindelsene K og P har beskyttelsesgrupper på karboksylsyregruppen i enhet B og p-aminogruppen i enhet C for å begrense kobling til esterdannelse mellom enhetene A og D i trinn 1. Disse beskyttelsesgruppene fjernes fra C-D-A-B-mellomproduktet slik at amiddannelse kan skje mellom enhetene B og C i trinn 2.

Syntesen av metyl-(5S,6R)-5-t-butyldimetylsilyloksy-6-metyl-8-fenyl-okta-2E,7E-dienoat (G), som er enhet A-forløperen av Kryptofycin 51, er sammenfattet i Reaksjonsskjema 2 (Figur 6). Utgangsmaterialet, (S)-trans-3-penten-2-ol (A), ble fremstillet ved enzymatisk spaltning av den racemiske forbindelse. Reaksjon av A med propargylklorid og base under fase-overføringsbetingelser dannet propargyleter B i 86% utbytte. Behandling av B med butyllitium ved -90°C førte til alkohol C i 71% utbytte. Den ønskede 3R,4R-anti-forbindelse C var det eneste produkt som ble dannet under Wittig-omleiringen. Etter beskyttelse av hydroksylgruppen av C som tert-butyldimetylsilyleteren (eller tert-butyldimetylsilyleteren) førte hydroborering av trippelbindingen (H.C. Brown, Organic Synthesis Via Boranes, Wiley, 1975) til et aldehyd D i 73% utbytte fra C. Deretter ble D omdannet til den trans-oc,p-umettede ester E gjennom en Horner-Emmons-reaksjon i 90% utbytte. Selektiv ozonolyse av C6-C7 dobbeltbindingen i D, ga aldehydet F i 83% utbytte. Endelig førte en Wittig-reaksjon av F med benzyltrifenylfosfoniumklorid i nærvær av butyllitium, til G i 80% utbytte. Utbyttet av G fra A var 26%.

Koblingen av enhet A-forløperen G med D-3-(3-klor-4-metoksyfenyl)-alanin enhet B for å frembringe A-B-forløperen (K) er sammenfattet i Reaksjonsskjema 3 (Figur 7). Hydrolyse av metylestergruppen i G med litiumhydroksyd i aceton, førte til karboksylsyre H i 95% utbytte. Kobling av H med trikloretylester I for å danne J kunne oppnås i 65% utbytte ved å behandle en løsning av H i N,N-dimetylformamid

(DMF) med et lite overskudd av pentafluorfenyl-difenylfosfinat (FDPP), en ekvimolar mengde av trifluoracetatsaltet av I, etterfulgt av 3 ekv. diisopropyletylamin (DIEA) ved 25°C (S. Chen et. al., Tetrahedron Lett. 1991, 32:6711-6714). Fluoro-desilylering av J førte deretter til K i 95% utbytte.

Den beskyttede aminosyre I ble fremstillet fra D-tyrosin i fem trinn. I det første ble D-tyrosin klorert med sulfurylklorid i iseddik (R. Zeynek, Hoppe-Seyler's Z. f. Physiol. Chemie 1926,144:247-254). Deretter ble N-(tert-butoksykarbonyl)-3-(3-klor-4-hydroksyfenyl)-D-alanin oppnådd i 94% utbytte ved å behandle en suspensjon av aminosyren i 50% vandig dioksan med di-tert-butyldikarbonat i nærvær av trietylamin. Det resulterende produkt ble dimetylert med dimetylsulfat i nærvær av kaliumkarbonat i tilbakeløpskokende aceton i 84% utbytte. Metylesteren ble deretter forsåpet med natriumhydroksyd i vandig dioksan for å gi N-(tert-butoksykarbonyl)-3-(3-klor-4-metoksyfenyl)-D-alanin i 86% utbytte. Eksponering av den BOC-beskyttede aminosyre for trikloretanol, pyridin og DCC i diklormetan, førte til trikloretylester I, i 65% utbytte. Behandling av dette materialet med trifluoreddiksyre førte til trifluoracetatsaltet av I i kvantitativt utbytte.

Syntesen av (2S)-2-[3'-(tert-butoksykarbonyl)amino-2',2'-dimetylpropanoyl-oksy]-4-metylpentansyre (P), som utgjør C-D-forløperen, er sammenfattet i Reaksjonsskjema 4 (Figur 8). Startpunktet for enhet C-delen av P var aminoalkoholen L. Beskyttelse av aminogruppen i L ved behandling med di-tert-butyldikarbonat i nærvær av trietylamin (93% utbytte), etterfulgt av oksydasjon av den primære alkohol med ruthenium-tetroksyd (P.H.J. Carlsen et. al., J. Org. Chem., 1981, 46:3936-3938) ga karboksylsyren M (66% utbytte). L-leucinsyre ble omdannet til al ly leste r N i 93% utbytte under fase-overføringsbetingelser, ved å utsette den for en blanding av allylbromid i diklormetan og vandig natriumbikarbonat inneholdende tetra-n-butylammoniumklorid (S. Friedrich-Bochnitschek er. al., J. Org. Chem. 1989, 54:751-756). Koblingsreaksjonen av M med N ble foretatt med 4-dimetylaminopyridin (DMAP) og dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i diklormetan for å frembringe 0 i 75% utbytte. Spaltning av allylesteren i O ble foretatt i THF som inneholdt morfolin og katalytisk tetrakis(trifenylfosfin)-palladium for å gi P i 95% utbytte (P.D. Jeffrey et. al., J. Org. Chem., 1982, 47:587-590).

Kobling av A-B-forløperen (K) og C-D-forløperen (P) ble foretatt som vist i Reaksjonsskjema 5 (Figur 9). Behandling av K og P med DCC/DMAP i diklormetan førte til det fullstendig beskyttede C-D-A-B-mellomprodukt (Q) i 84% utbytte. Reduktiv spaltning av trikloretylestergruppen i Q ble oppnådd ved å benytte aktivert sinkstøv i eddiksyre. BOC-beskyttelsesgruppen ble deretter fjernet med trifluoreddiksyre for å gi R som trifluoracetatsaltet i et total utbytte fra Q på 91%. Makrolaktamisering av R med FDPP førte til Kryptofycin 51 i 61% utbytte (J. Dudash, Jr., et. al., Synth. Commun. 1993, 23:349-356). Totalutbyttet fra S-trans-3-penten-2-ol (A) var 7%.

Kryptofycin 51 tjente som forløper for fl.ft-epoksidet, Kryptofycin 52, og S,S-epoksidet, Kryptofycin 53.1 sin tur tjente Kryptofycin 52 som forløper for Kryptofycin 55, 18R,19S-klorhydrinet, og Kryptofycin 57, 13,14-dihydro-analogen. Kryptofycin 57 tjente som forløper for Kryptofycin 58. Kryptofycin 53 tjente som forløper for Kryptofycin 61 ved å benytte en fremgangsmåte beskrevet av T.H. Chan & J.R. Finkenbine, J. Am. Chem. Soc, 1972, 94:2880-2882 og Kryptofycin 97 ved å benytte en fremgangsmåte beskrevet av Y.lttah er. al., J. Org. Chem. 1978, 43:4271-4273.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og de tidligere omtalte kryptofycin-forbindelsene, kan benyttes terapeutisk som anti-neoplastiske midler og således benyttes i metoder for behandling av neoplastiske sykdommer. I denne sammenheng gjelder «neoplastisk» en neoplasme som har en unormal vekst, hvor veksten inntrer som følge av en proliferasjon av celler som ikke er underlagt de vanlige vekstbegrensningene. I denne sammenheng er et «anti-neoplastisk middel» en hvilken som helst forbindelse, sammensetning, feilesblanding eller blanding som inhiberer, eliminerer, forsinker eller reverserer, den neoplastiske fenotype av en celle.

Kjemoterapi, kirurgi, bestrålingsterapi, terapi med midler som modifiserer biologisk respons, og immunterapi, benyttes for tiden ved behandling av kreft. Hver terapimåte har spesifikke indikasjoner som er kjent for fagmannen, og én eller alle kan benyttes i et forsøk på å oppnå total ødeleggelse av neoplastiske celler. Kjemoterapi kan gjøre bruk av én eller flere kryptofyciner. Kombinasjons-kjemoterapi, kjemoterapi som gjør bruk av kryptofyciner i kombinasjon med andre neoplastiske midler og kombinasjonsterapi er i alminnelighet mer effektiv enn anvendelsen av de enkelte anti-neoplastiske midler. Ifølge et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse således farmasøytisk blanding egnet for inhibering av proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle, kjennetegnet ved at den omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Slike blandinger kan også tilveiebringes sammen med fysiologisk tolererbare flytende, gelaktige eller faste bærere, fortynningsmidler, adjuvanser og hjelpestoffer. Slike bærere, fortynningsmidler, adjuvanser og hjelpestoffer finnes i United States Pharmacopeia Bd.. XXII oa National Formularv Bd. XVII. U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989). Ytterligere behandlingsmetoder tilveiebringes gjennom AHFS Drua Information. 1993 utg. av the Americal Hospital Formulary Service, s. 522-660.

Den farmasøytiske blandingen som benyttes for å behandle neoplastisk sykdom kan også inneholde ett ytterligere anti-neoplastisk middel. Anti-neoplastiske forbindelser som kan benyttes i kombinasjon med kryptofycin inkluderer de som er angitt i The Merck Index. 11 utg. Merck & Co., Inc. (1989), s. Ther. 16-17. De anti-neoplastiske midlene kan være antimetabolitter som kan innbefatte metotrexat, 5-fluoruracil, 6-merkaptopurin, cytosin-arabinosid, hydroksyurea og 2-klordeoksyadenosin. De aktuelle anti-neoplastiske midlene kan være alkyleringsmidler som kan innbefatte cyklofosfamid, melfalan, busulfan, paraplatin, klorambucil og nitrogen-sennepsgass. De anti-neoplastiske midlene kan være alkaloider som kan innbefatte vinkristin, vinblastin, taxol og etoposide. De anti-neoplastiske midlene kan videre være antibiotika som kan innbefatte doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, mitomycin c, og bleomycin. De anti-neoplastiske midlene kan være hormoner som kan innbefatte calusterone, diomostavolone, propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, tamoxifen, polyøstradiol-fosfat, megesterol-acetat, flutamid, nilutamid og trolotan. De anti-neoplastiske midlene kan innbefatte enzymer som kan være L-asparaginase eller aminoakridin-derivater som kan inkludere amsacrine. Ytterligere anti-neoplastiske midler inkluderer de som er omtalt i Skeel, Roland, T., «Antineoplastic Drugs and Biologic Response Modifier: Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agents,» Handbook of Cancer Chemothera<py> (3. utg. red.), Little Brown & Co. (1991). Foreliggende kryptofycin-forbindelser og blandinger kan administreres til pattedyr for veterinærmedisinsk anvendelse, for eksempel for husdyr, og for klinisk anvendelse for mennesker, på lignende måte som andre terapeutiske midler. Generelt vil den dose som fordres for terapeutisk effekt variere med brukstype og administrasjonsmåte, så vel som med den enkelte pasients særlige krav. I alminnelighet vil doser variere fra ca. 0,001 til 1000 mg/kg, oftest 0,01 til 10 mg/kg, av pasientens kroppsvekt. Alternativt kan doseringer innenfor disse områdene administreres ved konstant infusjon over et lengre tidsrom, vanligvis mer enn 24 timer, inntil de ønskede terapeutiske fordeler er oppnådd. Medikamentdosering så vel som administrasjonsmåte, må velges på grunnlag av relativ effektivitet, relativ toksisitet, svulstens vekstkarakteristika og effekten av kryptofyciner på cellecyklus, medikamentfarmakokinetiske forhold, alder, kjønn, pasientens fysiske tilstand og tidligere behandlinger.

Kryptofycin-forbindelsene kan formuleres som terapeutiske blandinger i naturlige former eller saltformer. Farmasøytisk akseptable ugiftige salter inkluderer baseaddisjonssaltene (dannet med frie karboksylgrupper eller andre anioniske grupper) som kan skrive seg fra uorganiske baser som for eksempel natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- eller jern(lll)-hydroksyder og fra slike organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, histidin, prokain og lignende. Slike salter kan også blandes som syreaddisjonssalter med en hvilken som helst fri kationisk gruppe og vil i alminnelighet bli dannet med uorganiske syrer, som for eksempel saltsyre eller fosforsyrer eller organiske syrer som eddik-, oksal-, vin-, mandel-syre og lignende. Ytterligere hjelpestoffer som kan inngå er slike som er tilgjengelige for fagmannen, for eksempel ut fra United States Pharmaco<p>eia Bd. XXII oa National Formularv Bd. XVII. U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989).

Hvorvidt en bestemt bærer egner seg for inkludering i en gitt terapeutisk blanding, avhenger av den foretrukne administrasjonsmåte. For eksempel kan anti-neoplastiske blandinger formuleres for peroral administrering. Slike blandinger fremstilles typisk enten som flytende løsninger eller suspensjoner eller i faste former. Perorale formuleringer innbefatter vanligvis slike normalt anvendte tilsetningsstoffer som bindemidler, fyllstoffer, bærere, konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, buffere og hjelpestoffer, som for eksempel farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat og lignende. Disse blandingene har form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, formuleringer med forsinket frigjøring eller pulvere, og inneholder i alminnelighet 1%-95% virkestoff, fortrinnsvis 2%-70%.

Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles som injektabilia, enten som flytende løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Faste former egnet for løsning i, eller suspensjon i, væske før injeksjon, kan også fremstilles. Slike injektabilia kan administreres subkutant, intravenøst, intraperitonealt, intramuskulært, intratekalt eller intrapleuralt. Virkestoffet eller virkestoffene, blandes ofte med fortynnings- eller hjelpestoffer som er fysiologisk tolererbare og forlikelige med virkestoffene. Egnede fortynningsmidler og hjelpestoffer er for eksempel vann, saltvann, dekstrose, glycerol eller lignende, samt kombinasjoner av disse. Om ønskes kan blandingene dessuten inneholde mindre mengder ytterligere substanser, så som fukte- eller emulgerings-midler, stabilisatorer eller pH-buffere.

Kryptofycin-forbindelser ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å inhibere proliferasjonen av pattedyrceller, ved at disse cellene bringes i kontakt med en kryptofycin-forbindelse i tilstrekkelig mengde til å inhibere proliferasjonen av pattedyrcellen. Proliferasjonen av hyperproliferative pattedyrceller kan inhiberes. I denne sammenheng er «hyperproliferative pattedyrceller» pattedyrceller som ikke er gjenstand for de karakteristiske vekstbegrensningene, f.eks. programmert celledød

(apoptose). Det er spesielt foretrukket at pattedyrcellen er en human celle.

Kryptofycin-forbindelser ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å inhibere proliferasjonen av hyperproliferative celler av medikamentresistente fenotyper, inklusivt celler av MDR-fenotyper, ved å bringe cellene i kontakt med en kryptofycin-forbindelse i tilstrekkelig mengde til å inhibere proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle. Pattedyrcellen er fortrinnsvis en human celle. Pattedyrcellen kan bringes i kontakt med en kryptofycin-forbindelse og minst ett ytterligere anti-neoplastisk middel. Typene av anti-neoplastiske midler som det her er tale om, er de samme som de ovenfor omtalte.

Patologiske tilstander forårsaket av hyperprolifererende pattedyrceller, for eksempel neoplasi, kan lindres ved å administrere vedkommende en effektiv mengde av en farmasøytisk blanding som omtalt ovenfor, for å inhibere proliferasjonen av de hyperproliferative cellene. I denne sammenheng refererer «patologisk tilstand» seg til en hvilken som helst sykdom som skriver seg fra proliferasjonen av pattedyrceller som ikke er gjenstand for de normale cellevekstbegrensninger. Slik proliferasjon av celler kan skyldes neoplasmer, inklusivt, men ikke begrenset til, følgende neoplasmer: mamma-, småcellede lunge-, ikke-småcellede lunge-, colorektale-, leukemi-, melanom-, sentralnervesystem-(CNS), ovarie-, prostata-celler, sarkom av mykt vev eller ben, hode og hals, mave, inklusivt pancreas og øsofagus, mavesekk, myelom, blære, nyre, neuroendokrine celler som innbefatter thyreoidkreft og lymfom, non-Hodgkins sykdom og Hodgkins sykdom. De neoplastiske cellene er fortrinnsvis humane celler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten metoder for å lindre slike patologiske tilstander ved å benytte kryptofycin i kombinasjon med andre terapier, så vel som andre anti-neoplastiske midler. Slike terapier og deres relevans for ulike neoplasier kan finnes i Cancer Princi<p>les and Practice of Oncoloav. 4. utg., red. DeVita, V., Hellman, S., & Rosenberg., S., Lippincott Co. (1993).

I foreliggende beskrivelse er det vist at kryptofycin-forbindelser har evne til å forstyrre mikrotubuli-strukturen i dyrkede celler. I tillegg, og i motsetning til vinkaalkaloider, synes kryptofycin-forbindelser å være et dårlig substrat for «drug-efflux»-pumpen P-glykoprotein.

De etterfølgende eksempler tjener til å illustrere visse foretrukne utførelsesformer og aspekter ved foreliggende oppfinnelse.

Eksperimentell del

I den eksperimentelle beskrivelse som her følger, er alle vekter angitt i gram (g), milligram (mg), mikrogram (u.g), nanogram (ng), pikogram (pg), mol (mol) eller millimol (mmol), alle konsentrasjoner er angitt som volumprosent (%), molar (M), millimolar (mM), mikromolar (u.M), nanomolar (nM), pikomolar (pM) eller normal (N), alle volumer er angitt i liter (L), milliliter (ml_) eller mikroliter (uL) og lineære mål angitt i millimeter (mm), med mindre annet er angitt.

De etterfølgende eksempler demonstrerer isoleringen og syntesen av kryptofycin-forbindelser så vel som deres anvendelse som terapeutiske midler.

Ved screening av ekstrakter av over 1000 blågrønnalger (cyanobacteria) for anti-tumoraktivitet, ble det lipofile ekstrakt av Nostoc sp. GSV 224 funnet å være sterkt cytotoksisk<3>, idet det oppviste MIC-verdier (minimum inhibitory consentrations) på 0,24 ng/mL mot KB, en human nasofaryngeal karsinomcellelinje, og 6 ng/mL mot LoVo, en human colorektal adenokarsinomcellelinje. Av større betydning er det at dette ekstrakt oppviste en signifikant tumorselektiv cytotoksisitet i Corbett-testen.<4,5>

Eksempel 1 Strukturbestemmelse

Bestemmelsen av strukturene til Kryptofycinene ble foretatt på en enkel måte ved å benytte velkjent metodikk. De massespektrometriske dataene var i overensstemmelse med molekylsammensetningene. Proton- og karbon-NMR-data oppnådd fra COSY-, HMQC-, HMBC- og NOESY-spektra gjorde det mulig å sette sammen alle totalstrukturer av disse depsipeptidtype forbindelsene. Nærværet av de forskjellige hydroksy- og aminosyre-enheter i hver forbindelse ble bekreftet ved gasskromatografisk massespektrometrisk analyse. Totalstrukturer, inklusivt absolutt stereokonfigurasjon, ble bestemt ved å benytte en kombinasjon av kjemisk nedbrytningsteknikk og spesielle analytiske teknikker på passende derivater av kryptofycin-forbindelsene.

Eksempel 2 Analyse av kryptofyciners mikrotubuli-depolymeriseri ngsakti vitet

Materialer

Vinblastin, cytochalasin B, tetrametylrhodamin-isotiocyanat (TRITC)-phalloidin, sulforhodamin B (SRB) og antistoffer mot (3-tubulin og vimentin ble anskaffet fra Sigma Chemical Company. Basalt Medium Eagle inneholdende Earles salter (BME) var fra Gibco og føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Hyclone Laboratories.

Cellelinjer

Jurkat T-celle-leukemilinje og rotte A-10 aorta-glattmuskelceller ble anskaffet fra the American Type Culture Collection og dyrket i BME inneholdende 10% FBS og 50 u.g/mL gentamycinsulfat. Humane ovariekarsinomceller (SKOV3) og en sublinje som var blitt selektert med henblikk på resistens mot vinblastin (SKVLB1) var en gave fra Dr. Victor Ling ved Ontario Cancer Institute. Begge cellelinjene ble holdt i BME inneholdende 10% FBS og 50 ug/mL gentamycinsulfat. Vinblastin ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 u.g/mL til SKVLB1 -celler 24 timer etter passasje for å opprettholde seleksjonstrykk for celler med overekspresjon av P-glykoprotein.

Tester for celleproliferasjon og syklus-stans

Celleproliferasjonstester ble foretatt som beskrevet av Skehan era/.,<11>. For Jurkatceller ble kulturene behandlet med de angitte medikamenter som beskrevet av Skehan<11>, og det totale antall celler ble bestemt ved telling av cellene i et hemacytometer. Prosentandelen av celler i mitose ble bestemt ved farving med 0,4% Giemsa i PBS etterfulgt av tre hurtige vaskinger med PBS. Minst 1000 celler per behandling ble vurdert med henblikk på nærvær av mitotiske figurer, og mitoseindeksen ble beregnet som forholdet mellom celler med mitotiske figurer og det totale antall opptelte celler.

I m m u nof I uorescens-bestemmelser

A-10 celler ble dyrket nesten til konfluens på dekkglass i BME/10% FBS. Forbindelser i PBS ble tilsatt til de angitte sluttkonsentrasjonene, og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer. For farving av mikrotubuli og intermediatfilamenter, ble cellene fiksert med kald metanol og inkubert med PBS inneholdende 10% kalveserum for å blokkere uspesifikke bindingsseter. Cellene ble deretter inkubert ved 37°C i 60 min., enten med monoklonalt anti-p-tubulin eller med monoklonalt anti-vimentin i fortynninger anbefalt av produsenten. Bundne primære antistoffer ble deretter synliggjort med en 45 minutters inkubering med fluorescein-konjugert kanin anti-mus IgG. Dekkglassene ble montert på objektglass, og fluorescensmønsteret ble undersøkt og fotografert ved å benytte et Zeiss fotomikroskop III utstyrt med epifluorescensoptikk for fluorescein. For farving av mikrofilamenter ble cellene fiksert med 3% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,2% Triton X-100 og redusert kjemisk med natriumborhydrid (1 mg/mL). PBS inneholdende 100 nM TRITC-phalloidin ble deretter tilsatt, hvorpå blandingen fikk inkuberes i 45 minutter ved 37°C. Cellene ble vasket hurtig tre ganger med PBS før dekkglassene ble montert, og umiddelbart fotografert som beskrevet ovenfor.

Virkninger av kryptofyciner og vinblastin på Jurkatcelle-proliferasjon og cellecyklus

Dose/respons-kurver for virkningene av kryptofycin-forbindelser og vinblastin på celleproiiferasjon og prosentandelen av celler i mitose, er angitt i henholdsvis

Figur 2A og 2B. Mindre enn 3% av ubehandlede celler oppviste mitotiske figurer. Både kryptofycin-forbindelsene og vinblastin forårsaket doseavhengige økninger i prosentandelen av celler observert i mitose. Økningen av den mitotiske indeks var sterkt korrelert med nedgangen i celleproiiferasjon, dvs. de konsentrasjonene av både kryptofycin-forbindelser og vinblastin som bevirket at 50% av de cellene som samlet seg i mitose, praktisk talt var de samme som den konsentrasjon som inhiberte celleproiiferasjon med 50%. IC5o-verdiene for kryptofycin-forbindelsene og vinblastin, med henblikk på disse virkningene, var henholdsvis 0,2 og 8 nM.

Effekt av cytochalasin B, vinblastin og kryptofycin på celleskjelettet

Glatte muskelceller fra aorta (A-10) celler ble dyrket på dekkglass og behandlet med PBS, 2 uM cytochalasin B, 100 nM vinblastin eller 10 nM kryptofycin-forbindelser. Etter 24 timer ble mikrotubuli og vimentin-intermediatfilamenter synliggjort ved indirekte immunfluorescens, og mikrofilamenter ble farvet ved å benytte TRITC-phalloidin. De morfologiske virkningene av hvert medikament ble undersøkt. Ubehandlede celler oppviste omfattende mikrotubuli-nettverk som var fullstendige med perinukleære mikrotubuli-organiserende sentra. Vimentin-intermediatfilamenter var også jevnt fordelt gjennom cytoplasmaet, mens bunter av mikrofilamenter var konsentrert langs cellenes hovedakse. Cytochalasin B forårsaket fullstendig depolymerisering av mikrofilamenter sammen med akkumuleringen av parakrystallinske levninger. Denne forbindelse påvirket ikke fordelingen hverken av mikrotubuli eller intermediatfilamenter. Både vinblastin og kryptofycin-forbindelsen forårsaket en markert uttynning av mikrotubuli. Ingen av forbindelsene påvirket mikrofilament-organisering, men vimentin-intermediatfilamenter falt fra hverandre under dannelse av konsentriske ringer rundt kjernen av celler behandlet med vinblastin eller med en kryptofycin-forbindelse.

Virkninger av kryptofyciner og vinblastin på taxol-stabiliserte mikrotubuli

A-10 celler ble behandlet i 3 timer med 0 eller med 10 u.M taxol før tilsetning av PBS, 100 nM vinblastin eller 10 nM kryptofycin-forbindelse. Etter 24 timer ble mikrotubuli-organiseringen undersøkt ved immunfluorescens som beskrevet ovenfor. Sammenlignet med mikrotubuli i kontrollceller var mikrotubuli i taxol-behandlede celler sterkt sammenfiltret, spesielt i cellenes polare regioner. Som tidligere forårsaket vinblastin fullstendig depolymerisering av mikrotubuli i ikke-forbehandlede celler. Forbehandlingen med taxol forhindret imidlertid mikrotubuli-depolymerisering som respons på vinblastin. Tilsvarende stabiliserte taxol-forbehandling mikrotubuli fullstendig mot kryptofycin-indusert depolymerisering.

Reversibilitet av mikrotubuli-depolymerisering med vinblastin og kryptofycin

A-10 celler ble behandlet med 100 nM vinblastin eller med 10 nM kryptofyciner i 24 timer, hvilket resulterte i fullstendig mikrotubuli-depolymerisering. Cellene ble deretter vasket og inkubert i medikamentfritt medium i tidsrom fra 1 time til 24 timer. Mikrotubuli repolymerisertes hurtig etter fjerning av vinblastin og oppviste betydelige nivåer av mikrotubuli etter 1 time og fullstendig morfologisk restitusjon etter 24 timer. Mikrotubuli opptrådte derimot ikke igjen i celler behandlet med kryptofycin-forbindelser 1 time eller 24 timer etter fjerning av forbindelsen.

Reversibilitet av kryptofycin-, vinblastin- og taxol-inhibering av celleproiiferasjon

SKOV3-celler ble behandlet i 24 timer med forutbestemte IC50-doser av vinblastin, kryptofycin-forbindelser eller taxol (dvs. verdier bestemt i forsøk sammenfattet i Tabell 1). I løpet av dette tidsrom øket celletettheten fra 0,4 til 0,5+0,05 absorbansenheter (Figur 3), hvilket tyder på en 25% økning i celleantall for alle tre behandlingene. Fjerning av medikamentene resulterte i hurtig vekst av de vinblastin-behandlede cellene slik at deres antall øket ca. tre ganger i løpet av 24 timer. Celler behandlet med kryptofycin-forbindelser eller taxol, forble stanset, idet de kun øket 0,2 til 0,4 ganger i løpet av de påfølgende 24 timer etter fjerning av medikamentet. Den proliferative kapasitet av kryptofycin- eller taxol-behandlede celler ble senere gjenopprettet siden cellene doblet seg i løpet av de neste 24 timene.

Virkninger av kombinasjoner av vinblastin og kryptofyciner på celleproiiferasjon

SKOV3-celler ble behandlet med kombinasjoner av kryptofyciner og vinblastin i 48 timer. Prosentandelen overlevende celler ble deretter bestemt og IC50-verdiene for hver kombinasjon beregnet. Virkningene av disse kombinasjonsbehandlingene så vel som av enkelt-medikamentbehandlinger, er vist som et isobologram (Figur 4). IC50-verdiene for kombinasjoner av kryptofycin-forbindelser og vinblastin falt meget nær linjen for additivitet, hvilket tyder på at disse to medikamentene kun induserer additive inhiberinger av celleproiiferasjon.

Toksisitet av kryptofyciner, vinblastin og taxol overfor SKOV3- og SKVLB1-celler

SKVLB1-celler er resistente overfor naturlige anti-cancer-medikamentprodukter som følge av deres overekspresjon av P-glykoprotein<12>. Den evne taxol, vinblastin og kryptofycin-forbindelser har til å inhibere veksten av SKOV3-og SKVLB1-celler er sammenfattet i Tabell 1. Taxol forårsaket doseavhengig inhibering av proliferasjonen av begge cellelinjer med ICso-verdier for SKOV3- og SKVLB1-celler på henholdsvis 1 og 8000 nM. Vinblastin inhiberte også veksten av begge cellelinjer med IC5o-verdier på 0,35 og 4200 nM for henholdsvis SKOV3- og SKVLB1 -celler. Kryptofyciner oppviste IC5o-verdier på 7 og 600 pM for henholdsvis SKOV3- og SKVLB1-celler. De resulterende resistensfaktorer for SKVLB1-celler overfor forbindelsene er beregnet som IC5o-verdier for SKVLB1. IC5o-verdier for SKOV3-celler er også angitt i Tabell 1.

Det er således vist at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye kryptofycin-forbindelser, så vel som tidligere beskrevne kryptofycin-forbindelser, som er potente inhibitorer av celleproiiferasjon og som virker ved forstyrrelse av mikrotubuli-nettverket og inhibering av mitose. Kryptofycin-forbindelsene forstyrrer mikrotubuli-organiseringen og derved normale cellefunksjoner, inklusivt funksjonene ved mitose.

Klassiske anti-mikrotubuli-midler, så som kolkicin og vinkaalkaloider, stanser celledeling ved mitose. Det syntes fornuftig å sammenligne effekten av ett av disse midlene på celleproiiferasjon med kryptofycin-forbindelsene. Av den grunn ble vinkaalkaloidet vinblastin, valgt som representativt for de klassiske anti-mikrotubuli-midlene. Effekten av kryptofycin-forbindelser og vinblastin på proliferasjonen og cellecyklus-utviklingen av Jurkat T-celle leukemi-cellelinjen ble sammenlignet. Begge forbindelsene forårsaket parallelle doseavhengige inhiberinger av celleproiiferasjon og akkumulering av celler i mitose.

Siden anti-mitotiske virkninger vanligvis medieres av forstyrrelse av mikrotubuli i mitose-spindlene, ble virkningen av kryptofycin-forbindelser på celleskjelett-strukturer karakterisert ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Immunfluorescensfarving av celler behandlet enten med en kryptofycin-forbindelse eller med vinblastin, viste klart at begge forbindelsene forårsaket fullstendig tap av mikrotubuli. Lignende studier med SKOV3-celler viser at anti-mikrotubuli-virkningene av krypotofycin-forbindelser ikke er enestående for glattmuskel-cellelinjen. Ingen av medikamentene påvirket nivåene eller fordelingen av mikrofilamentbunter, som lett ble indusert av cytochalasin B, hvilket tyder på at tapet av mikrotubuli ikke nødvendigvis skyldes en ikke-spesifikk mekanisme, f.eks. aktivering av proteaser eller tap av energi-oppladning. Både vinblastin og kryptofycin-forbindelser fremmer også markert sammenbruddet av vimentin-intermediatfilamenter, slik at skinnende farvede ringer ble dannet rundt cellekjernen.

Fjerning av vinblastin fra kulturmediet resulterte i hurtig repolymerisering av mikrotubuli. Derimot forble celler behandlet med kryptofycin-forbindelser uttynnet for mikrotubuli i minst 24 timer etter at forbindelsen var fjernet fra kulturene.

Foreliggende oppfinnelse demonstrerer at kryptofycin-forbindelser omgår P-glykoprotein-mediert MDR. Transport med P-glykoprotein begrenser evnen til naturlige anti-cancer-medikament til å inhibere veksten av tumorceller med ervervet eller de novo medikamentresistens.<13>"<15> Vinkaalkaloider er, selv om de er meget anvendelige i det initiale kjemoterapi-forløp, ekstremt gode substrater for transport med P-glykoprotein, og er således av meget begrenset anvendelse mot P-glykoprotein-medierte MDR-tumorer. Påvisning av midler som unngår denne MDR skulle derfor kunne føre til utvikling av egnede og nye anti-cancer-midler. Kryptofycin-forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse synes å utgjøre slike midler siden de er dårlige substrater for P-glykoprotein-mediert transport. Dette faktum gjenspeiles av den lave celleresistensfaktor for kryptofycin-forbindelser sammenlignet med vinblastin, taxol og andre naturlige medikamenter.

Totalsyntese av kryptofyciner

Strukturen av de nye syntetiserte forbindelsene, dvs. Kryptofycinene 51, 52, 53, 55, 57, 58 og 61 ble enkelt bekreftet ved å benytte metodikk som er velkjent for fagmannen. Massespektroskopiske data var i overensstemmelse med den molekylære sammensetning.

De etterfølgende eksempler demonstrerer totalsyntesen av kryptofycin-forbindelser så vel som deres anvendelse som terapeutiske midler i henhold til oppfinnelsen.

Eksempel 3 Syntese av Kryptofycin 51

S-trans-3-penten-2-ol (A)

En blanding av racemisk trans-3-penten-2-ol (933 mg, 11 mmol), trifluoretyllaurat (4,14 g, 15 mmol) og pankreaslipase fra svin (PPL, 2,0 g) i 25 mL vannfri dietyleter ble omrørt i 80 timer. PPL ble deretter frafiltrert og vasket med eter tre ganger. Eterfiltratet ble fordampet og den klebrige olje deretter underkastet «short-path»-vakuumdestillasjon. S-trans-3-penten-2-ol (A) ble kondensert i en kjølefelle inneholdende flytende nitrogen (383 mg).

<1>H NMR (CDCI3) 5 5,57 (4-H; dq, -15,3/6,0), 5,47 (3-H; ddd, -15,3/6,4/1,2), 4,19 (2-H; 1:4:6:4:1, pentett, 6,4), 2,24 (OH; bs), 1,63 (5-H3; d, 6,0), 1,19 (1-H3; d, 6,4).

<13>C NMR (CDCI3) 8 135,5 (3), 125,5 (4), 68,7 (2), 23,3 (5), 17,5 (1).

S-trans-2-(2-propynyloksy)-3-penten (B)

Til en kraftig omrørt blanding av S-enantiomer A (628 mg, 7,3 mmol), tetrabutylammonium-hydrogensulfat (138 mg, 0,41 mmol) og 40% NaOH i vann (5 ml_) ble det ved 0°C dråpevis tilsatt propargylklorid (767 mg, 10,3 mmol, 745 uL). Kraftig omrøring ble fortsatt over natten hvoretter blandingen ble nøytralisert med HCI ved 0°C og propargyleteren ekstrahert over i pentan. Ekstraktet ble inndampet og propargyleteren renset på en kort silikagelkolonne (2% dietyleter/pentan) for å gi 778 mg propargyleter B, [a]D -118,9° (c=2,0, CHCI3); <1>H NMR (CDCI3): 8 5,70 (4-H; dq, 18,5/6,5), 5,31 (3-H; ddd, 18,5/7,2/1,4), 4,15 (1'-H; dd, -15,6/2,1), 4,01 (1'-H; dd, -15,6/2,1), 4,01 (2-H; m), 2,38 (3'-H; t, 2,1), 1,73 (5-H; dd, 6,5/1,4), 1,25 (1H; d, 6,3).

(3R,4R)-4-metylhept-5(E)-en-1 -yn-3-ol (C)

En alikvot butyllitium-heksanløsning (2,5 M, 5,1 ml_, 12,8 mmol) ble inndampet i vakuum og residuet avkjølt til -90°C. En løsning av propargyleter B (454 mg,

3,66 mmol) i 10 ml_ THF ble langsomt tilsatt. Etter at temperaturen hadde fått anta romtemperatur i løpet av natten, ble reaksjonen avbrutt med NH4CI-løsning. Ekstraksjon med eter tre granger, inndampning av det tørkede ekstrakt og rensing av residuet på en silikagelkolonne (5% EtOAc/heksan) ga 322 mg alkohol C (71% utbytte), [oc]D +32,9° (c=3,0 CHCI3); IR (NaCI) vmax 3306, 2968, 1455, 1379, 1029, 975 cm"<1.1>H NMR (CDCI3) 8 5,61 (6-H; dq, 15,3/6,3), 5,38 (5-H; dd, 15,3/7,7), 4,13 (3-H; bs), 2,45 (1-H; d, 1,5), 2,38 (4-H; m), 2,20 (OH; bd, 3,3), 1,68 (7-H; d, 6,2), 1,09 (4-CH3; d, 6,8). <13>C NMR (CDCI3) 8 131,5 (5), 127,9 (6), 83,5 (2), 73,6 (1), 66,2 (3), 43,4(4), 18,1 (7), 15,7 (4-Me).

(3S,4R)-3-tert-butyldimetylsilyloksy-4-metylhept-5E-enal (D)

Til en omrørt løsning av alkohol C (248 mg, 2 mmol) og imidazol (340 mg,

5 mmol) i 3 mL tørr DMF ble det tilsatt tert-butyldimetylsilylklorid (452 mg, 3 mmol). Etter omrøring av blandingen over natten ble 10 mL 10% NaOH tilsatt for å ødelegge overskuddet av tert-butyldimetylsilylklorid. Produktet ble ekstrahert over i eter og ekstraktet vasket suksessivt med vann, 0,5N HCI og med vann, tørket og inndampet. Rensing av residuet ved kromatografi på silikagel med heksan ga 457 mg (3R,4R)-3-tert-butyldimetylsilyloksy-4-metylhept-5(E)-en-1-yn (96% utbytte).

<1>H NMR (CDCI3) 5 5,50 (6-H; dq, 15,3/6,1), 5,38 (5-H; dd, 15,3/7,5), 4,16 (3-H; dd, 5,7/1,7), 2,37 (1-H; d, 1,7), 2,35 (4-H; m), 1,68 (7-H; d, 6,1), 1,07 (4-Me; d, 6,8), 0,90 (CMe3; s), 0,12 (SiMe; s), 0,09 (SiMe; s).

Ved å benytte samme fremgangsmåte ble det tilsvarende TBDPS-derivat (3R,4R)-3-tert-butyldifenylsilyloksy-4-metylhept-5(E)-en-1-yn dannet i 92% utbytte, [cc]D +32,9° (c=3,0, CHCI3). <1>H NMR (CDCI3) 8 7,72/7,38 (2Ph-H5), 5,32 (6-H; m), 5,25 (5-H; dd, 16,2/7,3), 4,29 (3-H; dd, 5,2/2,0), 2,38 (4-H; m), 2,33 (1-H; d, 2,0), 1,64 (7-H; d, 5,3), 1,11 (4-Me; d, 6,9), 1,06 (CMe3).

<13>C NMR (CDCI3) 8 136,1/135,9/133,6/129,7/129,6/127,5/127,3) (Ph), 132,4 (5), 126,1 (6), 83,3 (2), 73,5 (1), 68,0 (3), 43,6 (4), 26,9 (Cjytea), 19,4 (CMe3), 18,0 (7), 14,7 (4-Me).

2-metylbuten (1,15 mL 2M løsning i THF, 2,3 mmol) ble tilsatt til 1,1 mL BH3THF-løsning (1M, 1,1 mmol) ved -25°C og blandingen omrørt i et isbad i 2 timer. Temperaturen ble deretter senket til -50°C og en løsning av TBS-derivat (238 mg, 1 mmol) i 1 mL THF tilsatt i én porsjon. Kjølebadet ble fjernet og reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur og holdt der i 1 time. Deretter ble en 2,2M løsning av KH2PO4/K2HPO4 (4,8 mL) og 30% H202 (0,8 mL) tilsatt ved 0°C. En time senere ble THF fordampet og residuet ekstrahert over i eter. Det tørkede eterekstrakt ble inndampet og residuet kromatografert på silikagel (1% EtOAc/heksan) for å gi 194 mg aldehyd D (76% utbytte). <1>H NMR (CDCI3) 8 9,78 (1-H; t, 2,3), 5,46 (6-H; dq, 15,3/6,1), 5,34 (5-H; dd, 15,3/7,5), 4,13 (3-H; m), 2,47 (2-H; m), 2,31 (4-H; m), 1,66 (7-H; brd, 6,1), 0,99 (4-Me; d, 6,8), 0,87 (CMe3; s), 0,07 (SiMe; s), 0,04 (SiMe, s).

Tert-butylfenylsilyleter(TBDPS)-derivatet av aldehydet ble dannet i 83% utbytte. <1>H NMR (CDCI3) 8 9,52 (1-H; t, 2,4), 7,69/7,40 (2Ph-H5), 5,28 (6-H; m), 5,22 (5-H; dd, 16,2/6,2), 4,19 (3-H; m), 2,42 (2-H; m), 2,29 (4-H; m), 1,60 (7-H; d, 5,4), 1,07 (CMe3), 1,02 (4-Me; d, 6,9). 13C NMR (CDCI3) 8 202,0 (1), 136,1/133,6/133,3/130,2/129,7/127,7/127,6 (Ph), 132,3 (5), 126,2 (6), 72,8 (3), 47,6 (2), 42,2 (4), 27,1 (CMga). 19,6 (CMe3), 18,3 (7), 14,9 (4-Me).

Metyl-(5S,6R)-5-tert-butyldimetylsilyloksy-6-metyl-7-oksonona-2E,7E-

dienoat (E)

Til en omrørt løsning av aldehyd D (0,74 g, 2,9 mmol) og trimetylfosfonoacetat (632 mg, 3,5 mmol) i 5 mL THF avkjølt til -78°C, ble det tilsatt tetrametylguanidin (435 |iL, 3,5 mmol). Etter 30 minutter ble kjølebadet fjernet og blandingen omrørt i ytterligere fire timer. Blandingen ble nøytralisert med 1N HCI og produktet ekstrahert over i eter. Inndampning av det tørkede eterekstrakt etterlot et residuum som ble kromatografert på silikagel (5% EtOAc/heksan) for å gi 0,814 g av E (90% utbytte). <1>H NMR (CDCI3) 5 6,93 (3-H; dt, 15,6/7,8), 5,62 (2-H; dd, 15,6/1,2), 5,37 (8-H, m), 5,37 (7-H, m), 3,71 (OCH3, s), 3,61 (5-H, m), 2,29 (4-H2) m), 2,22 (6-H, m), 1,66 (9-H3; brd, 6,1), 0,99 (6-Me; d, 6,8), 0,88 (CMe3; s), 0,03 (SiMe; s), 0,01 (SiMe; s). Tert-butyldifenylsilyleter(TBDPS)-derivatet av aldehydet ble dannet i 90% utbytte;

<1>H NMR (CDCI3) 8 7,68/7,38 (2Ph-H5), 6,75 (3-H; dt, 15,6/7,4), 5,62 (2-H; d, 15,6), 5,34 (8-H, m), 5,29 (7-H; m), 3,70 (5-H, m), 3,68 (OCH3, s), 2,28 (4-H2, m), 2,20 (6-H, m), 1,62 (9-H3; d, 5,3), 1,08 (CMe3), 0,99 (6-Me; d, 6,9). 13C NMR (CDCI3) 8 166.7 (1), 146,4 (3), 136,0/134,2/133,8/129,62/129,56/127,5/127,4 (Ph), 132,5 (7), 125.8 (8), 122,6 (2), 76,2 (5), 51,3 (OCH3), 41,7 (6), 36,8 (4), 27,0 (CMeg), 19,4 (CMe3), 18,1 (9), 14,7 (6-Me).

Metyl-(5S,6R)-5-tert-butyldimetylsilyloksy-6-metyl-7-oksohept-2(E)-enoat (F)

Ozon ble sendt gjennom en løsning av metylester E (328 mg, 1,0 mmol) og 97 uL pyridin i 15 mL CH2CI2 ved -78°C, hvorpå utviklingen av ozonolysen ble fulgt ved TLC-analyse. Etter at metylesteren var forbrukt ble ca. 500 mg sinkstøv og 1 mL iseddik tilsatt. Temperaturen ble langsomt øket til 25°C. Blandingen ble filtrert og filtratet vasket suksessivt med mettede løsninger av CuS04 og NaHC03. Etter fordampning av løsningsmidlet ble det rå aldehyd F (249 mg, 83%) benyttet i det neste trinn uten ytterligere rensing. <1>H NMR (CDCI3) 8 9,96 (7-H; t, 2,3), 6,96 (3-H; dt, 15,7/7,6), 5,90 (2-H; dd, 15,7/0,7), 4,05 (5-H; m), 3,74 (OMe; s), 2,51 (6-H; m), 2,45 (4-H2; m), 1,09 (6-Me; d, 6,9), 0,88 (CMe3; s), 0,04 (SiMe; s), 0,03 (SiMe; s).

Metyl-(5S,6R)-5-t-butyldimetylsilyloksy-6-metyl-8-fenyl-okta-2E,7E-dienoat (G) Til en omrørt løsning av aldehyd F (25,0 mg, 0,08 mmol) i 1,5 mL THF ved -78°C, ble det tilsatt 0,80 mL av en kald (-78°C) blanding av benzyltrifenyl-fosfoniumklorid (268 mg, 0,69 mmol i 6,9 mL THF) og n-butyllitium (280 ^L, 2,5M i heksan). Etter 15 minutter ble kjølebadet fjernet og omrøring fortsatt i 2 timer. Reaksjonen ble avbrutt med mettet ammoniumkloridløsning og THF fordampet. Konsentratet ble ekstrahert to ganger med heksan og de kombinerte ekstraktene vasket med saltvann, tørket og inndampet. Den gjenværende olje, en 5:1 blanding av E- og Z-isomerene, ble løst i 1,5 mL benzen inneholdende tiofenol (0,02M) og 1,1'-azobis(cykloheksankarbonitril)

(VAZO, 0.006M) og blandingen tilbakeløpsbehandlet i 5 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble heksan (15 mL) tilsatt og den organiske løsningen vasket suksessivt med 10% NaOH og saltvann, tørket (MgS04) og inndampet. Kromatografi av residuet på silikagel (2% EtOAc/heksan) førte til 24 mg (80%) av G, [a]D +68,2°

(c=1,5, CHCIg); EIMS m/z 374 (<1%; M<+>), 359 (1; M<+> -CH3), 317 (10; M<+> -Bu); 275 (10), 243 (73), 143 (20), 115 (10), 97 (64), 89 (31), 73 (100); HREIMS m/z 374,2232 (C22H3403Si, A +4,5 mmu), 359,2031 (C2iH3i03Si, A +1,1 mmu), 317,1579 (Ci8H2503Si, A -0,6 mmu); UV (MeOH) kmax(e) 206 (33.500), 252 (20.100) nm;

IR vmax 2952, 2855, 1725, 1657, 1435, 1257, 1168, 1097, 970, 836, 775 cm"<1>;

<1>H NMR 8 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,96 (3-H; ddd, 15,6/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,84 (2-H; d, 15,6), 3,75 (5-H; ddd, 10,2/6,0/4,2), 3,72 (OMe; s), 2,44 (6-H; m), 2,36 (4-H2; m), 1,10 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe3; s), 0,06 (Si-Me; s), 0,05 (Si-Me; s); <13>C NMR 8 166,8 (1), 146,4 (3), 137,6 (Ph V), 131,9 (8), 130,4 (7), 128,5 (Ph 375'), 127,0 (Ph 4'), 126,0 (Ph 276'), 122,9 (2), 75,0 (5), 51,4 (OMe), 42,8 (6), 37,6 (4), 25,9 (Si-CMe^), 18,1 (Si-CMe3), 16,2 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).

Beregnet for C22H3403Si: C, 70,52; H, 9,17

Funnet: C, 70,72; H, 9,42.

(5S,6R)-5-t-butyldimetylsilyloksy-6-metyl-8-fenylokta-2E,7E-diensyre (H)

Til en løsning av ester G (159 mg, 0,43 mmol) i 7 mL aceton, ble det tilsatt

5 mL 1N vandig LiOH. Blandingen ble omrørt ved 25°C i 3 timer, fortynnet med

20 mL Et20 og surgjort til «pH 4 med 1N HCI. Det organiske lag ble fraskilt og vasket med 20 mL porsjoner saltvann og vann, tørket (MgS04) og inndampet. Kromatografi av den gjenværende olje på silikagel med 40% EtOAc i heksan inneholdende 0,5% AcOH, resulterte i ren syre H som en blekgul mobil olje (145 mg, 95% utbytte): [a]D +87,0° (c=1,4, CHCI3); EIMS m/z 343 (1; M<+> -OH), 303 (5), 275 (9), 257 (4), 229 (62), 213 (16), 171 (22), 143 (37), 131 (16), 115 (23), 97 (100), 91 (44); HREIMS m/z 343,2107 (C2iH3i02Si, A -1,3 mmu), 229,1220 (C15H1702, A +0,9 mmu); UV kmax(e) 206 (24.500), 252 (15.600) nm; IR vmax 3300-2800 (br), 2956, 2856, 1697, 1651, 1419, 1256, 1097, 836, 693 cm'<1>; <1>H NMR 8 10,4 (C02H; bs, Wi/2«100), 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 7,09 (3-H; ddd, 15,6/7,6/7,6), 6,39 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,85 (2-H; d, 15,6), 3,78 (5-H, ddd, 6,0/6,0/4,2), 2,46 (6-H; m), 2,40 (4-H2; m), 1,12 (6-Me; d, 6,9), 0,92 (Si-CMe3; s), 0,07 (Si-Me2; s); <13>C NMR 8 171,6 (1), 149,1 (3), 137,5 (Ph V), 131,8 (8), 130,5 (7), 128,5 (Ph 375'), 127,1 (Ph 4'), 126,1 (Ph 276'), 122,7 (2), 74,9 (5), 42,9 (6), 37,6 (4), 25,8 (Si-CMeg). 18,1 (Si-CMe3), 16,1 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).

2,2,2-trikloretylester av 3-(3-klor-4-metoksyfenyl)-D-alanin (I)

En prøve av D-klortyrosin BOC-derivatet (160 mg, 0,35 mmol) ble løst i 3 mL ufortynnet trifluoreddiksyre og fikk stå ved romtemperatur i 1 time. Fjerning av overskudd av reagens under redusert trykk førte til det ønskede amin I som trifluoracetatsaltet (165 mg, 100% utbytte), [<x]D -1,7° (c=5,2, CHCI3); IR vmax 3400-2500 (br), 1760, 1680, 1500, 1200, 1130, 1070, 805, 710 cm-<1>;<1>H NMR 8 8,07 (NH2; brm, Wi/2=45), 7,27 (5-H; s), 7,12 (9-H; d, 8,1), 6,88 (8-H; d, 8,1), 4,86/4,67 (CH2CCI3; ABq, -12,0), 4,41 (2-H; bs, W1/2«20), 3,86 (OMe; s), 3,33 (3-H; dd, -14,4/3,6), 3,22 (3-H'; dd, -14,4/6,6); <13>C NMR 8 167,6 (1), 155,0 (7), 130,9 (5), 128,8 (9), 125,4 (4), 123,1 (6), 112,7 (8), 93,4 (CCI3), 75,3 (CH2CCI3), 56,1 (OMe), 54,2 (2), 34,9 (3).

Forbindelse J

Til en omrørt løsning av H (25 mg, 0,07 mmol) i 3 mL vannfritt DMF under argon, ble det suksessivt tilsatt pentafluordifenylfosfinat (FDPP, 32 mg, 0,08 mmol), trifluoracetatsalt I (35 mg, 0,07 mmol) og diisopropyletylamin (DIEA, 27 mg, =36 uL, 0,21 mmol, =3 ekv.). Omrøring ble fortsatt ved 25°C i 1 time, hvoretter reaksjonsblandingen ble ekstrahert med 20 mL Et20. Eterekstraktet ble vasket med 10 mL 1N HCI og deretter med 10 mL mettet NaHC03, 20 mL saltvann og 20 mL vann, tørket (MgS04) og inndampet. Den gjenværende blekgule olje ble underkastet kromatografi på silikagel (15% EtOAc i heksan) for å gi J som en farveløs olje (32 mg, 65% utbytte); [cc]D +11,8° (c=1,2, CHCI3); EIMS m/z; 644/646/648/650 (7/8/6/3); M<+> -<t>Bu), 570/572/574 (46/100/21), 536/538 (18/15), 394/396 (67/29), 275

(20), 155/157 (29/9); HREIMS m/z 644,0981 (C29H34CI4N05Si, A -2,13 mmu); UV ^max(e) 204 (54.900), 230 (23.200), 248 (19.200), 284 (3500) nm; IR vmax3290, 2980, 2850, 1760, 1680, 1640, 1505, 1380, 1270, 1169, 990, 720 cm-<1>; <1>H NMR enhet A 8 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,87 (3-H; ddd, 15,0/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 16,2), 6,18 (7-H; dd, 16,2/8,1), 5,82 (2-H, d, 15,0), 3,75 (5-H; ddd, 9,9/6,0/4,8), 2,46 (6-H, m), 2,36 (4-H2; m), 1,11 (6-Me, d, 6,9), 0,91 (SiCMe3; s), 0,07 (SiMe; s), 0,06 (SiMe; s), enhet B 8 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,1), 6,85 (8-H, d, 8,4), 5,85 (NH; d, 7,8), 5,08 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,81/4,74 (CH2CCI3; ABq, -11,7), 3,87 (OMe; s), 3,22 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,12 (3-H'; dd, -14,1/6,0), <13>C NMR enhet A 8 165,1 (1), 143,0 (3), 137,6 (9), 132,0 (8), 130,4 (7), 128,5(11/13), 127,0(12), 126,0(10/14), 124,7 (2), 75,0 (5), 42,6 (6), 37,6 (4), 25,9 (Si-CMe^), 18,1 (Si-CMe3), 16,5 (6-Me), -4,3 (Si-Me), -4,6 (Si-Me); enhet 8 8 170,1 (1), 154,3 (7), 131,1 (5), 128,5 (4/9), 122,6 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCI3), 74,8 (CH2CCI3), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

(1'R,5S,6R)-N-1'-(karbo-2",2",2"-trikloretoksy)-2'-(3-klor-4-metoksyfenyl)etyl-5-t-butyldimetylsilyloksy-6-metyl-8-fenyl-okta-2E,7E-dienamid (K)

Til en løsning av J (50 mg, 0,07 mmol) i 4 mL MeCN ble det tilsatt 400 |iL 50% vandig HF og blandingen omrørt i 1 time ved 25°C. Ekstraksjon over i 30 mL Et20 etterfulgt av vask av eterekstraktet med 30 mL porsjoner mettet NaHC03, saltvann og vann, tørking (MgS04) og inndampning, ga alkohol K som et farveløst skum (40 mg, 95% utbytte); [oc]D -6,1° (c=1,3, CHCI3); EIMS m/z (rel. intensitet) 587/589/591/593 (M<+>, <1%), 552/554/556 (1/2/0,5), 456/458/460/462 (1/2/1/0,2), 342/344/346 (7/8/4), 212/214 (15/5), 195/197 (6/2), 155/157 (99/34), 131 (100), 91 (77); HREIMS m/z 587,0721 (C27H29<35>CI4N05, A +7,9 mmu); UV Xmax 204 (56.500), 230 (22.100), 248 (18.100), 284 (3600) nm; IR vmax 3400, 3300, 2980, 1780,1680, 1640, 1505, 1270, 1180, 1090, 1000, 770 cm"<1>.<1>H NMR enhet A 8 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,92 (3-H; ddd, 15,3/7,8/7,5), 6,46 (8-H; d, 15,9), 6,14 (7-H; dd, 15,9/8,4), 5,90 (2-H; d, 15,3), 3,65 (5-H; ddd, 7,8/5,6/4,0), 2,39 (6-H/4-H2; bm), 1,78 (OH; bs, W1/2=40Hz), 1,14 (6-Me, d, 6,9), enhet 8 8 7,18 (5-H; d, 1,8), 7,03 (9-H; dd, 8,4/1,8), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,97 (NH, d, 7,8), 5,06 (2-H, ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,79/4,72 (CH2CCI3; ABq, -12,0), 3,86 (OMe, s), 3,20 (3-H, dd, 14,1/5,7), 3,10 (3-H'; dd, -14,1/6,0).

<13>C NMR enhet A 8 165,3 (1), 142,6 (3), 137,0 (9), 131,7 (8), 131,0 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,1 (10/14), 125,0 (2), 73,8 (5), 43,2 (6), 37,2 (4), 16,8 (6-Me);

enhet B 8 170,2 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (9), 128,3 (4), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCI3), 74,7 (CH2CCI3), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

3-(tert-butoksykarbonyl)amino-2,2-dimetylpropansyre (M)

Til en løsning av3-amino-2,2-dimetylpropan-1-ol (L) (3,0 g, 29 mmol) i 51 mL av en 10% løsning av trietylamin i MeOH, ble det tilsatt di-tert-butyl-dikarbonat (6,7 g, 31 mmol) og blandingen omrørt ved 25°C i 1 time. Etter fjerning av løsningsmidlet ble residuet løst i CH2CI2 (30 mL) og løsningen vasket to ganger med 1M KHSO4 (pH 2) og én gang med mettet NaCI-løsning og deretter tørket (MgS04). Fjerning av løsningsmidlet i vakuum førte til 5,8 g (93% utbytte) av 3-(tert-butyloksykarbonyl)amino-2,2-dimetylpropan-1-ol som et hvitt faststoff som ble benyttet direkte i det neste trinn uten ytterligere rensing (>95% rent ifølge NMR-analyse), smp. 70,5-71,5°C; IR vmax 3350, 1685, 1456 cm"<1>; <1>H NMR 8 4,87 (NH; br s), 3,72 (OH; brs), 3,19 (1-H2; d, 5,1), 2,95 (3-H2; d, 6,0), 1,44 (CMe3; s), 0,85 (2-Me2; s); <13>C NMR (CDCI3) 8 157,6 (BOC CO), 79,7 (CMe3), 68,1 (1), 47,1 (3), 36,7 (2), 28,3 (CMe3), 22,4 (2-Me2).

Til en løsning av alkohol 3-(tert-butoksykarbonyl)amino-2,2-dimetylpropan-1-ol (5,3 g, 25,9 mmol) og natriumperjodat (16,6 g, 77,7 mmol) i karbontetraklorid (52 mL), acetonitril (52 mL) og vann (78 mL) ble det tilsatt rutheniumtrikloridhydrat (122 mg), hvorpå blandingen ble omrørt ved 25°C i 1 time. Blandingen ble filtrert gjennom Celite og tilsatt en mettet løsning av kaliumkarbonat i vann (50 mL). Det vandige lag ble fraskilt, vasket med eter (20 mL), surgjort med HCI til pH 2 ved 0°C og ekstrahert med CH2CI2 (30 mL x 3). De kombinerte ekstraktene ble vasket med mettet NaCI-løsning og tørket (MgS04). Fjerning av løsningsmiddel i vakuum førte til et residuum som først ble underkastet omvendt-fase hurtigkromatografi på C18 silika (ODS 120Å, 50 til 90% MeOH) og deretter krystallisert fra eter for å gi 3,7 g (66% utbytte) av M som et hvitt faststoff, smp. 106-108°C; EIMS m/z (rel. intensitet) 217 (0,1), 161 (11), 98 (25), 88 (71), 57 (100); HREIMS m/z 217,1292 (C10H19NO4, A +2,2 mmu); IR vmax3450-2500, 1710, 1694, 1510 cm"<1>; <1>H NMR av hovedkonformer 8 5,03 (NH; brs), 3,26 (3-H2; m), 1,45 (CMe3; s), 1,24 (2-Me2; s); <13>C NMR (CDCI3) 8 183,2 (1), 156,3 (BOC CO), 79,6 (CMe3)), 49,5/47,9 (2/3), 28,4 (CMe3), 22,9 (2-Me2).

Allyl-(2S)-2-hydroksy-4-metylpentanoat (N)

Til en løsning av 2,66 g L-leucinsyre (20 mmol) og 1,74 g natriumbikarbonat (20 mmol) i 30 mL vann ved 0°C, ble det tilsatt 30 mL av en CH2CI2-løsning av 6,44 g tetrabutylammoniumklorid (20 mmol) og 1,74 mL allylbromid (20 mmol). Etter kraftig omrøring av blandingen i 24 timer, ble CH2CI2 fordampet. Ca. 50 mL vann ble tilsatt og det vandige lag ekstrahert fire ganger med Et20. Eterløsningen ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet. Residuet ble sendt gjennom en kort Si-kolonne for å gi 3,21 g allylester N (93% utbytte) som en farveløs olje,

[a]D -8,4° (c=1,1, CHCI3); IR Vmax 3464, 2957,1732, 1203,1140,1087 cm"<1>; <1>H NMR 8 5,92 (allyl 2-H; m), 5,34 (allyl 3-Hz; dd, 17,4/1,1), 5,28 (allyl 3-HE; dd, 10,5/1,1), 4,67 (allyl 1-H2; d, 5,7), 4,23 (2-H; brs), 2,64 (OH; brs), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H2; m), 0,96 (5-H3; d, 6,5), 0,95 (4-Me; d, 6,7); <13>C NMR 8 175,3 (1), 131,4 (allyl C-2), 118,6 (3), 68,9 (2), 65,7 (allyl C-1), 43,2 (3), 24,1 (4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).

Allyl-(2S)-2-[3'-(tert-butoksykarbonyl)amino-2',2'-dimetylpropanyloksy]-4-metylpentanoat (O)

Til en løsning av 0,8 g M (3,7 mmol), 0,76 g N (4,4 mmol) og 92 mg DMAP i 10 mL tørr CH2CI2 ble det ved 0°C tilsatt 0,84 g DCC (4,1 mmol) i CH2CI2. Blandingen ble omrørt ved 25°C i 3 timer og filtrert. Filtratet ble vasket med mettet vandig natriumbikarbonat, tørket (Na2S04) og inndampet i vakuum. Hurtigkromatografi (silikagel, 5% EtOAc/heksan) førte til 1,0 g (92% utbytte) av ren O som en farveløs olje, Rf 0,68 (17:83 EtOAc/heksan), [cc]D -29,4° (c=18,1, CHCI3); EIMS m/z (rel. intensitet) 371 (2, M<+>), 242 (13), 184 (12), 126 (20), 84 (100); HREIMS m/z 371,2317 (C19H33NO6, A -0,9 mmu); IR (ufortynnet) vmax3385, 2963, 1731,1720,1513 cm"<1>;<1>H NMR (300 MHz, CDCI3) enhet CS 5,39 (NH; skjult brs), 3,33 (3-H; dd, -13,5/7,4), 3,27 (3-H'; dd, -13,5/5,9), 2,78 (2-H; m), 1,44 (CMe3; s), 1,23 (2-Me; s), 1,22 (2-Me; s); enhet D 8 5,91 (allyl 2-H; ddt, 16,6/10,3/6,0 Hz), 5,34 (allyl 3-Hz; bd, 16,6), 5,27 (allyl 3-HE; bd, 10,3), 5,08 (2-H; dd, 9,6/3,6), 4,65 (allyl 1-H2; m), 1,6-1,9 (3-H2/4-H; m), 0,94 (5-H3; d, 6,3), 0,94 (4-Me; d, 7,3). 13C NMR enhet C 8 176,5 (1), 156,3 (BOC CO), 79,0 (CMe3), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,4 (CjMe3), 22,2/23,0 (2-Me2); enhet D 8 170,6 (1), 131,4 (allyl C-2), 119,1 (allyl C-3), 70,9 (2), 66,0 (allyl C-1), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

(2S-2-[3'-(ter1-butoksykarbonyl)amino-2',2'-dimetylpropanoyloksy]-4-metylpentansyre (P)

Til en 10 mL løsning av 180 mg (0,49 mmol) 0 og 60 mg (0,05 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladium i tørr THF (under argonatmosfære) ble det langsomt tilsatt 470 uL (5,4 mmol) tørr morfolin i løpet av 10 minutter. Etter omrøring i 50 minutter ble 40 mL eter tilsatt og løsningen vasket med 1N HCI (40 mL) og deretter ekstrahert med mettet natriumbikarbonat (2 x 30 mL). Det vandige ekstraktet ble surgjort med 0,5N HCI og ekstrahert med eter (40 mL). Eterekstraktet ble vasket med vann (2 x 30 mL), tørket (MgS04) og inndampet i vakuum for å gi P som en farveløs mobil olje (152 mg, 95%); [a]D -22,2° (c=2,2, CHCI3); EIMS m/z (rel. intensitet) 331 (1, M<+>), 275 (1), 258 (4), 231 (9), 202 (36), 174 (13), 144 (31), 126 (16), 114 (14), 98 (54), 88 (50), 84 (100); HREIMS m/z 331,2004 (C16H29N06, A -1,0 mmu). <1>H NMR CDCI3) enhet C 8 5,41 (NH; dd, 5,7/5,4), 3,30 (3-H2; m), 2,68 (2-H; m), 1,43 (CM_e3: brs), 1,22 (2-Me; s), 1,21 (2-Me; s); enhet D 8 6,47 (1-OH; brs, W1/2=35), 5,09 (2-H; dd, 9,3/2,7), 1,7-1,9 (3-H2/4-H; m), 0,97 (5-H3; d, 6,0), 0,94 (4-Me; d, 6,0). 13C NMR (CDCI3) enhet C 8 176,5 (1), 156,5 (BOC CO), 79,3 (CMe3), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,3 (CMe3), 23,0 (2-Me), 22,2 (2-Me); enhet D 8 175,4 (1), 70,6 (2), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).

Forbindelse O

Til en løsning av alkohol K (80 mg, 0,14 mmol), syre P (68 mg, 0,21 mmol) og DMAP (4 mg) i tørr CH2CI2 (4 mL) omrørt ved 0°C under argonatmosfære, ble det tilsatt DCC (44 mg, 0,21 mmol) i tørr CH2CI2 (1 mL). Blandingen ble omrørt ved 0°C i 30 minutter, hvorunder det oppsto et hvitt bunnfall, hvorpå blandingen fikk oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i ytterligere 4 timer. Bunnfallet ble frafiltrert og filtratet fortynnet med Et20 (40 mL) og vasket suksessivt med fortynnet HCI (1M, 40 mL), mettet NaHC03 (40 mL) og saltvann (40 mL). Eterlaget ble tørket (MgS04) og inndampet i vakuum til et voksaktig faststoff. Kromatografi (silika, EtOAc:heksan, 1:3) førte til ren Q som en farveløs, viskøs olje (103 mg, 84%),

[a]D -3,1° (c=2,9, CHCI3); EIMS m/z 800/802/804/806 (<1, M<+->C5H802), 415/417/419/421 (5/3/3/2), 342/344/346 (7/9/4), 286/288/290 (2/6/2), 207 (34), 178 (22), 155/157 (66/24), 131 (36), 91 (70), 70 (100); HREIMS m/z 800,2179 (C38H48N208<35>CI4, A -1,4 mmu); UV (MeOH) Xmax (e) 204 (51.200), 230 (18.500), 248

(17.200), 282 (2200) nm; IR (NaCI) vmax 3376, 2965, 1755, 1728, 1712, 1678, 1504, 1258, 1150, 1067, 732 cm"<1.1>H NMR (CDCI3) 8 enhet A: 7,28-7,33 (10-H/14-H/11-H/13-H; m), 7,22 (12-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,8/6,4/6,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,7), 5,88 (2-H; d, 15,8), 5,06 (5-H; bm, W1/2=20Hz), 2,62 (6-H; m), 2,53 (4-H2; bm, Wi/2=15Hz), 1,12 (6-CH3; d, 6,8); enhet 8 7,18 (5-H; d, 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,5/2,0), 6,83 (8-H; d, 8,5), 6,49 (NH; d, 7,9), 5,06 (2-H; bm, Wi/2=20Hz), 4,79/4,70 (CH2CCI3; ABq, -11,7), 3,85 (OCH3; s), 3,20 (3-Hb; dd, -14,1/5,8), 3,07 (3-Ha; dd, -14,1/6,7); enhet C5.38 (NH; bt, 6,5), 3,27 (3-H2; d, 6,5), 1,20 (2-CH3; s), 1,15 (2-CH3'; s); enhet 0 4,92 (2-H; dd, 10,0/3,8), 1,72 (4-H; bm W1/2=20Hz), 1,67 (3-Hb; ddd, -14,1/10,0/5,0), 1,56 (3-Ha; ddd, -14,1/9,1/3,8), 1,43 (C02CMe3; s), 0,86 (4-CH3; d, 6,4), 0,82 (5-H3; d, 6,4). <13>C NMR (CDCI3) 8 enhet A 165,4(1), 139,3 (3), 136,9 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6(11/13), 127,5(12), 126,2 (10/14), 125,4 (2), 76,5 (5), 41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); enhet 8 170,0 (1), 154,1 (7), 131,2 (5), 128,8 (4), 128,5 (9), 122,3 (6), 112,1 (8), 94,3 (CHj-CCIa), 74,6 (CH2CCI3), 56,1 (7-OMe), 53,2 (2), 36,6 (3); enhet C 176,9 (1), 156,4 (C02CMe3), 79,1 (COgCMeg), 48,7 (3), 44,0 (2), 22,8 (2-Me), 22,3 (2-Me'); enhet D 170,7 (1), 71,4 (2), 39,5 (3), 28,4 (C02CMe3), 24,8 (4), 23,0 (4-Me), 21,4 (5).

Aminosyre R

Til aminosyren Q (100 mg, 0,11 mmol) ble det tilsatt aktivert Zn-støv (400 mg, overskudd) og AcOH (4 mL). Den heterogene blandingen ble ultralydbehandlet i 45 minutter, omrørt i ytterligere 90 minutter ved romtemperatur og deretter helt over på et lag Celite. Det organiske materialet ble vasket fra Celitelaget med CH2CI2. Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum, hvilket etterlot karboksylsyren som et farveløst amorft faststoff.

Uten rensing ble den rå syren løst i trifluoreddiksyre (TFA, 5 mL) og satt tilside ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble overskudd av TFA fjernet i vakuum og det resulterende amorfe faststoff underkastet kromatografisk rensing (Sep-Pak™, silika, først CH2CI2 deretter 10% MeOH/CH2CI2), hvilket førte til trifluoracetat-ammoniumsaltet av den ønskede forbindelse. Gjentatt lyofilisering av en vandig løsning av saltet resulterte i den frie aminosyre R som et farveløst amorft faststoff (68 mg, 91% over to trinn); IR (NaCI) vmax 3300, 3200, 2965, 1693, 1606, 1504, 1441, 1259, 1201, 1146, 1066, 727 cm"<1>. <1>H NMR (CD3OD) 8 enhet A: 7,33 (10-H/14-H; d, 7,4), 7,28 (11-H/13-H; t, 7,4), 7,18-7,23 (12-H; m), 6,69 (3-H; ddd, 15,6/7,7/7,0), 6,43 (8-H; d, 15,8), 6,04 (7-H; dd, 15,8/8,9), 6,00 (2-H; d, 15,6), 5,01 (5-H; ddd, 9,1/6,9/3,1), 2,64 (4-Hb; bm, W1/2«30Hz), 2,60 (6-H; bm, W1/2=20Hz), 2,49 (4-Ha; ddd, 15,8/9,1/7,7), 1,13 (6-Me; d, 6,7); enhet 8 7,18-7,23 (5-H; m), 7,11 (9-H; dd, 8,3/1,6), 6,92 (8-H, d, 8,3), 4,59 (2-H; bm, Wi/2=20Hz), 3,81 (OCH3; s), 3,14 (3-Hb; dd, -13,7/4,3), 2,96 (3-Ha; m, W1/2=20Hz); enhet C2.96 (3-H2; bm, W1/2=20Hz), 1,31 (2-CH3; s), 1,25 (2-CH3'; s); enhet D 4,90 (2-H; dd, 9,6/4,0), 1,66 (4-H; bm, W1/2=25Hz), 1,59 (3-Hb; ddd, -14,4/9,6/4,8), 1,53 (3-Ha; ddd, -14,4/9,1/4,0), 0,81 (4-Me; d, 6,5), 0,74 (5-H3; d, 6,5). <13>C NMR (CD3OD) 5 enhet A 167,7 (1), 140,7 (3), 138,4(9), 133,0 (8), 131,7 (7), 129,6(11/13), 128,5(12), 127,3 (10/14), 127,1 (2), 78,4 (5), 43,1 (6), 35,7 (4), 17,4 (6-Me); enhet B 179,8 (1), 155,2 (7), 132,3 (4), 132,1 (5), 130,1 (9), 123,0 (6), 113,4 (8), 56,6 (7-OMe), 56,6 (2), 37,8 (3); enhet C 176,8 (1), 48,2 (3), 42,2 (2), 23,3 (2-Me), 23,3 (2-Me'); enhet D 172,0 (1), 73,4 (2), 40,7 (3), 26,0 (4), 23,1 (4-Me), 21,8 (5).

Kryptofycin 51

Til en omrørt løsning av aminosyren T (75 mg, 0,11 mmol) i vannfritt DMF (20 mL) ble det ved romtemperatur under argon, tilsatt diisopropyletylamin (DIEA, 44 mg, 60 u,L, 0,34 mmol, «3 ekv.) og deretter pentafluordifenylfosfinat (FDPP,

55 mg, 0,14 mmol, =1,3 ekv.) i DMF (2 mL). Blandingen ble omrørt i 12 timer, tilsatt Et20 (40 mL) og eterlaget vasket suksessivt med HCI (1M, 40 mL), saltvann (40 mL) og H20 (40 mL), tørket (MgS04) og inndampet under redusert trykk. Det gjenværende voksaktige faststoff ble ytterligere renset ved omvendt-fase kromatografi (ODS, 10 \ i, 30% H20/MeCN, 3 mL min"<1>) for å gi Kryptofycin 51 som et farveløst amorft faststoff (45 mg, 61%), [cc]D +26,4° (c=0,25, CHCI3); EIMS m/z 652/654 (M<+>, 3/1), 632/634 (3/2), 426/428 (51/15), 227 (64), 195/197 (64/22), 155/157 (71/15), 131 (59), 91 (100); HREIMS m/z 652,2936 (C^sNzOy^CI, A

-2,1 mmu); UV (MeOH) Xmax(e) 204 (52.000), 228 (20.400), 250 (13.400), 284

(2800) nm; IR (NaCI) vmax3376, 3270, 2960, 1747, 1721, 1659, 1536, 1514, 1259, 1150, 1066, 1013, 980, 694 cm'<1.1>H NMR (CDCI3) 5 enhet A 7,32 (10-H/14-H; dd, 8,0/1,5), 7,29 (11-H/13-H; t, 8,0), 7,24 (12-H; bm, W1/2«15Hz), 6,77 (3-H; ddd, 15,2/10,8/4,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,8), 5,76 (2-H; dd, 15,2/1,1), 5,04 (5-H; ddd, 11,1/6,4/1,9), 2,54 { A- HJ6- H; bm, W1/2=15Hz), 2,37 (4-Ha; ddd, -14,3/11,1/10,8), 1,13 (6-Me; d, 6,8); enhet B 7,20 (5-H; d, 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,4/2,0), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,61 (NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,4), 3,87 (OMe; s), 3,11 (3-Hb; dd, -14,2/5,4), 3,06 (3-Ha; dd, -14,2/7,6); enhet C 7,24 (NH; bm, W1/2=15Hz), 3,40 (3-Hb; dd, -13,5/8,5), 3,12 (3-Ha; dd, -13,5/3,6), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me'; s); enhet 0 4,85 (2-H; dd, 10,2/3,6), 1,66 (3-Hb; ddd, -14,0/10,2/4,6), 1,61 (4-H; bm, Wi/2=20,0Hz), 1,33 (3-Ha; ddd, -14,0/9,0/3,6), 0,74 (4-Me; d, 6,6), 0,72 (5-H3; d, 6,6). <13>C NMR (CDCI3) 8enhet/» 165,1 (1), 142,2 (3), 136,7 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,1 (10/14), 124,6 (2), 77,0 (5), 42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); enhet B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,3 (9), 122,5

(6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3); enhet C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me), 22,6 (2-Me'); enhet O 170,6 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Eksempel 4 Syntese av Kryptofycin 52 og Kryptofycin 53

Til en omrørt løsning av Kryptofycin 51 (75 mg, 0,12 mmol) i vannfritt diklormetan (7,5 mL) ble det ved 0°C under argon tilsatt en løsning av m-klorperbenzoesyre (MCPBA, 50 mg, 0,23 mmol, =2 ekv., basert på 80% aktivt oksygen) i diklormetan (1 mL). Etter 30 minutter fikk reaksjonsblandingen oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i ytterligere 12 timer, løsningsmidlet ble deretter fjernet under redusert trykk for å gi en 1,8:1 blanding av henholdsvis Kryptofycin 52 og 53 (ifølge NMR-analyse) som et amorft faststoff. Blandingen av regioisomere epoksyder ble løst i et minimum acetonitril og underkastet omvendt-fase kromatografi (YMC-ODS, 10 u, 250 mm x 22,5 mm, 30% H20/MeCN, 6 mL min'<1>) for å skille kryptofycin 52 (37 mg, 48%) og kryptofycin 53 (19 mg, 25%).

Spektraldata for Kryptofycin 52

[a]D +19,9° (c=0,5, CHCI3); EIMS m/z 668/670 (4/2, M<+>), 445 (35), 244 (12), 227 (22), 195/197 (66/27), 184 (45), 155/157 (38/10), 91 (100); HREIMS m/z 668,2873 (C36H45N208<35>CI, A -0,9 mmu), 445,2497 (C25H35N06l A -3,3 mmu); UV (MeOH) kmax(e) 204 (35.100), 218 (20.900) nm; IR (NaCI) vmax 3415, 3270, 2960, 1748, 1721, 1650, 1536, 1504, 1260, 1192, 1150, 1066, 1013, 800, 698 cm'<1>.

<1>H NMR (CDCI3) 8 enhet A 7,33-7,38 (11-H/12-H/13-H; bm, W1/2=25Hz), 7,24 (10-H/14-H; m, Wi/2=15Hz), 6,76 (3-H; ddd, 15,1/10,8/4,3), 5,71 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,20 (5-H; ddd, 11,0/5,0/1,8), 3,68 (8-H; d, 1,9), 2,92 (7-H; dd, 7,5/1,9), 2,57 (4-Hb;

ddd, -14,6/1,8/1,7), 2,45 (4-Ha; ddd, -14,6/11,0/10,8), 1,78 (6-H; bm, W1/2=15Hz), 1,14 (6-Me; d, 6,9); enhet 8 7,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,56 (NH; d, 7,9), 4,73 (2-H; ddd, 7,9/7,4/5,3), 3,87 (OMe; s), 3,09 (3-Hb; dd,

-14,6/5,3), 3,05 (3-Ha; dd, -14,6/7,4); enhet C 7,20 (NH; dd, 8,6/3,2), 3,41 (3-Hb; dd, -13,4/8,6), 3,10 (3-Ha; dd, -13,4/3,2), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me'; s); enhet D 4,82 (2-H; dd, 10,2/3,5), 1,73 (3-Hb; bm, W1/2=20Hz), 1,66 (4-H; bm, Wi/2=20Hz), 1,31 (3-Ha; ddd, -13,8/9,1/3,5), 0,84 (4-Me; d, 6,6), 0,82 (5-H3; d, 6,6); <13>C NMR (CDCI3) 8 enheta 164,9 (1), 141,8 (3), 136,7 (9), 128,7(11/13), 128,3 (12), 125,6 (10/14), 124,7 (2), 75,9 (5), 63,0 (7), 59,0 (8), 40,7 (6), 36,9 (4), 13,5 (6-Me); enhet B 170,3 (1) , 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,5 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2) , 35,3 (3); enhet C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,8 (2), 22,8 (2-Me); 22,8 (2-Me'); enhet D 170.5 (1), 71,2 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Spektraldata for Kryptofycin 53

[oc]D +20,8° (c=1,7, CHCI3); EIMS m/z 668/670 (5/4, M<+>), 445 (32), 244 (15), 227 (24), 195/197 (64/21), 184 (60), 155/157 (33/9), 91 (100); HREIMS m/z 668,2853 (C36H45N208<35>CI, A 1,1 mmu), UV (MeOH) A.max(e) 204 (38.700), 218 (22.900) nm; IR (NaCI) vmax3415, 3280, 2917, 2849, 1748, 1722, 1660, 1504, 1465, 1260, 1190, 1150,1066, 755 cm"<1>.<1>H NMR (CDCI3) 8 enhet A 7,29-7,36 (11-H/12-H/13-H; bm,

W1/2=20Hz), 7,23 (10-H/14-H; dd, 8,3/1,7), 6,77 (3-H; ddd, 15,1/10,9/4,3), 5,81 (2-H; dd, 15,1/1,3), 5,17 (5-H; ddd, 11,2/4,9/1,8), 3,58 (8-H; d, 1,7), 2,90 (7-H; dd, 7,8/1,7), 2,67 (4-Hb; ddd, 14,7/11,2/10,9), 2,56 (4-Ha; dddd, 14,7/4,3/1,8/1,3), 1,67-1,78 (6-H; bm, W1/2=45), 1,03 (6-CH3; d, 7,1); enhet 8 7,21 (5-H; d, 2,1), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,1), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,90 (2-NH; d, 7,9), 4,75 (2-H; ddd, 7,9/7,9/4,9), 3,85 (7-OCH3; s), 3,14 (3-Hb; dd, 14,5/4,9), 3,03 (3-Ha; dd, 14,5/7,9); enhet C 7,29-7,36 (3-NH; bm, W1/2«25), 3,43 (3-Hb; dd, 13,7/8,8), 3,10 (3-Ha; dd, 13,7/3,4), 1,23 (2-CH3; s), 1,17 (2-CH3'; s); enhet D 4,92 (2-H; dd, 10,3/3,2), 1,67-1,78 (S-H^-H; bm, W1/2«45), 1,48 (3-Ha; ddd, 13,9/8,8/3,2), 0,89 (4-CH3; d, 6,6), 0,86 (5-H3; d, 6,6); <13>C NMR (CDCI3) 8 enhet A 165,1 (1), 142,0 (3), 137,0 (9), 128,5(11/13), 128,5(12), 125,3 (10/14), 124.6 (2), 76,7 (5), 63,2 (7), 56,2 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); enhet 8 170,4 (1) , 154,0 (7), 130,8 (5), 129,7 (4), 128,2 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2) , 35,3 (3); enhet C 177,9 (1), 46,4 (3), 42,7 (2), 23,0 (2-Me); 22,7 (2-Me'); enhet D 170,5 (1), 71,3 (2), 39,2 (3), 24,7 (4), 22,8 (4-Me), 21,3 (5).

Eksempel 5 Syntese av Kryptofycin 55

Til en løsning av Kryptofycin 52 (6 mg, 0,009 mmol) i 0,6 mL 2:1 1,2-dimetoksyetan/vann ble det tilsatt 2 uL 12N HCI. Løsningen fikk omrøres ved romtemperatur i 20 timer, ble nøytralisert med natriumkarbonat, filtrert gjennom et 5 u. filter og inndampet. Det acetonitril-løselige materialet ble renset ved omvendt-fase HPLC på C18 (250 x 10 mm kolonne) under bruk av 4:1 MeOH/H20, for å oppnå 3,0 mg Kryptofycin 55 (48%). [cc]D +42,5° (c=1,1, CHCI3); EIMS m/z 704/706/708 (M<+> <1), 668/670 (1,5/0,5, M<+> -HCI), 445 (6), 226 (8), 195/197 (16/5), 184 (10), 155/157 (33/11), 135 (100), 91 (99), 77 (30); HREIMS m/z 668,2873

(M<+> -HCI, C36H45N20835CI, A -0,8 mmu); UV (MeOH) A,max(e) 204 (48.400), 218 (29.200), 284 (1600) nm; IR (NaCI) vmax 3410, 3286, 2959, 1748, 1723, 1666, 1538, 1504, 1455, 1257, 1178, 1066, 753 cm'<1.><1>H NMR (CDCI3) 8 enhet A 7,35-7,42 (10-H/11-H/12-H/13-H/14-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,1/10,6/4,5), 5,78 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,16 (5H; ddd, 11,1/8,3/2,1), 4,65 (8-H, d, 9,7), 4,01 (7-H; bd, 9,7), 2,69 (4-Hb; dddd, -14,5/4,5/2,1/1,7), 2,50 (6-H; bm, Wi/2=15), 2,38 (4-Ha; ddd,

-14,5/11,1/10,6), 1,53 (7-OH; s), 1,04 (6-Me, d, 7,1); enhet B 7,21 (5-H; d, 2,2), 7,07 (9-H, dd, 8,5/2,2), 6,85 (8-H; d, 8,5), 5,57 (2-NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,2), 3,88 (7-OCH3; s), 3,13 (3-Hb; dd, 14,5/5,2), 3,05 (3-Ha; dd, 14,5/7,6); enhet C 7,21 (3-NH; m), 3,38 (3-Hb; dd, 13,5/8,3), 3,17 (3-Ha; dd, 13,5/4,1), 1,23 (2-CH3; s), 1,17 (2-CH3'; s); enhet 04,93 (2-H; dd, 10,1/3,5), 1,78 (3-Hb; ddd, 13,5/10,1/5,0), 1,72 (4-H; bm, Wi/2=20), 1,43 (3-Ha; ddd, 13,5/8,8/3,5), 0,92 (4-CH3; d, 6,6), 0,92 (5-H3, d, 6,4). <13>C NMR (CDCI3) 8enheta 165,1 (C-1), 142,4 (C-3), 138,4 (C-9), 129,0 (C-11/13), 128,3 (C-12), 128,0 (C-10/14), 124,6 (C-2), 76,1 (C-5), 74,1 (C-7), 62,0

(C-8), 38,4 (C-6), 36,5 (C-4), 8,6 (6-Me); enhet B 170,3 (C-1), 154,1 (C-7), 130,9 (C-5), 129,6 (C-4), 129,2 (C-9), 122,6 (C-6), 112,3 (C-8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (C-2), 35,3 (C-3); enhet C 177,8 (C-1), 46,5 (C-3), 42,8 (C-2), 22,9 (2-Me), 23,0 (C-2-Me'); enhet D 170,3 (C-1), 71,3 (C-2), 39,7 (C-3), 24,8 (C-4), 22,7 (4-Me), 21,6 (C-5). Det tilsvarende diol, Kryptofycin 56 (2,8 mg, 44% utbytte) ble også oppnådd.

Eksempel 6 Syntese av Kryptofycin 57

En liten mengde Pt02 (=1 mg) ble tilsatt til en kolbe inneholdende 0,5 mL CH2CI2. Luften i kolben ble evakuert, H2 innført og blandingen omrørt ved romtemperatur i 20 minutter. En løsning av 10,2 mg Kryptofycin 52 (0,015 mmol) i CH2CI2 (0,3 mL) ble tilsatt og blandingen omrørt ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom Celite/bomull og løsningsmidlet fjernet i vakuum. Omvendt-fase HPLC av residuet (ODS, 10 u., 250 x 22,5 mm, MeCN/H20) (3:1), 5 mL min"<1>) førte til rent Kryptofycin 57 (9,1 mg, 89%).

[<x]D +3,4 (c=4,5, CHCI3); EIMS m/z 670/672 (M<+>; 9/3), 447 (10), 246 (63), 229 (20), 195/197 (78/25), 184 (58), 155/157 (39/13), 128 (21), 91 (100), 77 (23); HREIMS m/z 670,3037 (C36H47N20835CI, A -1,6 mmu); UV (MeOH) A.max(e) 204 (31.400), 218 (12.000), 284 (1200) nm; <1>H NMR (CDCI3) 8 enhet A 7,30-7,37 (11/12/13-H; bm) 7,23 (10/14-H; bdd, 7,9, 1,9), 5,03 (5-H; ddd, 9,0, 5,6, 3,4), 3,66 (8-H; d, 2,1), 2,89 (7-H; dd, 7,7, 2,1), 2,27 (2-Hb; ddd, 14,3, 8,7, 6,2), 2,04 (2-Ha; ddd, 14,3, 8,8, 6,8), 1,64-1,75 (6-H/4-H2, bm), 1,61 (3-H2; bm, Wi/2=25), 1,11 (6-CH3 ; d, 7,1); enhet B 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H; d, 8,3), 5,55 (2-NH; d, 8,3), 4,65 (2-H; ddd, 8,3, 7,3, 5,3), 3,87 (7-OCH3; s), 3,16 (3-Hb; dd, 14,3, 7,3), 3,08 (3-Ha; dd, 14,3, 5,3); enhet C 6,91 (3-NH; dd, 6,4, 6,4), 3,41 (3-Hb; dd, 13,5, 6,4), 3,30 (3-Ha; dd, 13,5, 6,4), 1,21 (2-CH3; s), 1,13 (2-CH3'; s); enhet D: 4,80 (2-H; dd, 9,8, 4,1), 1,64-1,75 (3-Hb/4-H; bm), 1,34 (3-Ha; ddd, 15,4, 10,1, 4,1), 0,86 (4-CH3; d, 6,5), 0,84 (5-H3; d, 6,5). 13C NMR (CDCI3) 8 enhet A: 172,6 (1), 136,9 (9), 128,7 (11/13), 128,5 (12), 125,6 (10/14), 76,8 (5), 63,4 (7), 59,2 (8), 40,2 (6), 36,2 (2), 32,2 (4), 21,4 (3), 13,6 (6-Me); enhet B: 170,4 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 130,0 (4), 128,5 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3); enhet C: 177,6 (1), 47,0 (3), 43,1 (2), 22,5 (2-Me'), 22,4 (2-Me); enhet D: 171,7 (1), 72,0 (2), 39,0 (3), 24,6 (4), 22,8 (4-Me), 21,8 (5).

Eksempel 7 Syntese av kryptofycin 58

Til en omrørt løsning av Kryptofycin 57 (5,5 mg, 0,008 mmol) i 3 mL etanolfri kloroform ble det ved ca. -60°C tilsatt TMSCI (benyttet som oppnådd fra Aldrich, =4,5 mg, =5,2 uL, =0,04 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 minutter, inntil TLC indikerte at intet utgangsmateriale var tilbake. De flyktige komponentene ble deretter fjernet under redusert trykk for å etterlate et amorft faststoff. Dette materialet ble tatt opp i acetonitril og underkastet HPLC (ODS, 10 \ i, 250 x 22,5 mm, MeCN/H20 (3:1), 5 mL min'<1>) for å gi rent kryptofycin 58 (5,4 mg, 93%) som hovedproduktet. [oc]D +7,2 (c=2,1, CHCI3); EIMS m/z 706/708/710 (M<+>, 27/23/8), 670/672 (M<+>, -HCI), 14/13), 583 (54), 581 (53), 485 (23), 483 (21), 447 (34), 294 (21), 282 (39), 246 (57), 195/197 (87/27), 184 (73), 155/157 (45/10), 128 (30), 91 (95), 77 (30), 69 (100); HREIMS m/z 706,2844 (C36H48N208<35>CI2, A -5,6 mmu), m/z 670,3070 (M<+> -HCI, C36H47N208<35>CI, A -4,9 mmu); UV (MeOH) Xmax(e) 204 (331900), 218 (11800), 284 (1800) nm; <1>H NMR (CDCI3) 6 enhet A: 7,34-7,42 (10/11/12/13/14-H; bm), 5,01 (5-H; ddd, 9,6, 8,3, 2,5), 4,65 (8-H; d, 9,6), 4,00 (7-H; dd, 9,6, 1,9), 2,42 (6-H; ddq, 8,3, 1,9, 7,0), 2,29 (2-Hb; ddd, 14,3, 9,4, 4,5), 2,06 (2-Ha; ddd, 14,3, 8,3, 7,5), 1,62-1,82 (3-H2/4-H2; bm), 0,99 (6-CH3; d, 7,0); enhet B: 7,20 (5-H; d, 2,1), 7,06 (9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,84 (8-H; d, 8,3), 5,62 (2-NH; d, 8,3), 4,61 (2-H; ddd, 8,3, 7,7, 5,4), 3,87 (7-OCH3; s), 3,17 (3-Hb; dd, 14,3, 7,7), 3,11 (3-Ha; dd, 14,3, 5,4); enhet O. 6,97 (3-NH; dd, 6,4, 6,2), 3,43 (3-Hb; dd, 13,4, 6,2), 3,31 (3-Ha; dd, 13,4, 6,4), 1,23 (2-CH3; s), 1,16 (2-CH3'; s); enhet D: 4,93 (2-H; dd, 10,0, 4,0), 1,86 (3-Hb; ddd, 14,0, 10,0, 5,5), 1,58 (3-Ha; ddd, 14,0, 8,3, 4,0), 0,97 (4-CH3; d, 6,8), 0,94 (5-H3; d, 6,6); <13>C NMR (CDCI3) 8 enhet A: 172,8 (1), 138,7 (9), 129,0 (12), 128,9 (11/13), 128,0 (10/14), 76,5 (5), 73,8 (7), 62,1 (8), 38,1 (6), 35,9 (2), 31,8 (4), 21,4 (3), 8,7 (6-Me); enhet B: 170,6 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,2 (4), 128,5 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,0 (3); enhet C: 177,2 (1), 47,0 (3), 43,2 (2), 22,5 (2-Me'), 22,4 (2-Me); enhet D: 171,8 (1), 72,0 (2), 39,4 (3), 24,9 (4), 22,9 (4-Me), 21,7 (5).

Eksempel 8 Syntese av Kryptofycin 61

Til en løsning av kryptofycin 53 (5 mg, 0,007 mmol) i 0,5 mL tørr benzen ble det tilsatt trifenylfosfinsulfid (4 mg, 0,014 mmol) og deretter 0,65 ul trifluoreddiksyre som en løsning i tørr benzen (100 uL). Løsningen fikk omrøres ved romtemperatur i 6 timer, ble nøytralisert med natriumbikarbonat, filtrert og inndampet. Residuet ble fordelt mellom vann og CH2CI2. Det CH2CI2-løselige materialet ble renset ved omvendt-fase HPLC på C18 under bruk av 4:1 MeCN/H20 for å oppnå rent Kryptofycin 61 (1,9 mg, 37%). [a]D +28,4° (c=0,7, CHCI3); EIMS m/z 684/686 (M<+>, ikke observert), 652/654 (M<+->S, 5/4), 426/428 (90/29), 294 (10), 227 (100), 195/197 (57/20), 184 (20), 155/157 (34/9), 131 (45), 129 (44), 91 (76), 77 (27); HREIMS m/z 652,2973 (M<+->S, C36H45N20735CI, A -5,8 mmu); UV (MeOH) kmax(e) 204 (26.700), 218(11.600), 284 (820) nm; IR (NaCI) vmax 3410, 3271, 2958, 1749, 1724, 1670, 1503, 1463, 1258, 1176, 1066, 758 cm"<1>.<1>H NMR (CDCI3) 5 enhet A 7,29-7,34 (11/12/13-H; m), 7,25 (10/14-H; bd, 6,6), 6,73 (3-H; ddd, 15,2/10,6/4,5), 5,66 (2-H; dd, 15,2/1,7), 5,22 (5-H; ddd, 11,2/4,2/2,0), 3,68 (8-H; d, 5,1), 3,01 (7-H; dd, 8,4/5,1), 2,52 (4-Hb; dddd, -14,4/4,5/2,0/1,7), 2,41 (4-Ha, ddd, -14,4/11,2/10,6), 1,68-1,74 (6-H; m), 1,14 (6-Me; d, 6,9); enhet 07,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,45 (NH; d, 7,8), 4,75 (2-H; ddd, 7,8/7,3/5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-Hb; dd, -14,5/5,4), 3,05 (3-Ha; dd, -14,5/7,3); enhet C 7,17 (NH; dd, 8,3, 3,9), 3,39 (3-Hb; dd, -13,5/8,3), 3,14 (3-Ha; dd, -13,5/3,9), 1,23 (2-Me; s), 1,16 (2-Me'; s); enhet 0 4,86 (2-H; dd, 10,2/3,4), 1,77 (3-Hb; ddd, -14,0/10,2/4,9), 1,68-1,74 (4-H; m), 1,42 (3-Ha; ddd, -14,0/8,7/3,4), 0,92 (4-Me; d, 6,6), 0,88 (5-H3; d, 6,4). <13>C NMR (CDCI3) 5 enheta 164,9(1), 141,7 (3), 138,3 (9), 128,8(11/13), 128,0(12), 126,7(10/14), 124,7 (2), 76,6 (5), 45,8 (7), 43,9 (8), 43,9 (6), 36,6 (4), 16,0 (6-Me); enhet B 170,2 (1) , 154,1 (7), 130,9 (5), 129,4 (4), 128,3 (9), 122,8 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2) , 35,3 (3); enhet C 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,9 (2-Me), 22,8 (2-Me'); enhet D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,7 (4-Me), 21,4 (5).

Eksempel 9 SAR (Structure-Activity Relationships) og in vivo evaluering

Cytotoksisiteten av Kryptofycinene mot de humane tumorcellelinjene KB og L0V0 er vist i Tabell 2.

Kryptofycin 52 er aktiv in vivo. In vivo aktiviteten av Kryptofycin 52 mot fem solide svulster fra mus og tre humane solide svulster er sammenfattet i Tabell 3. Tilsvarende var Kryptofycin 55 aktiv in vivo. In vivo aktiviteten av Kryptofycin 55 mot seks solide svulster fra mus og fire humane solide svulster, er sammenfattet i Tabell 4. De oppnådde in vivo data synes å korrelere med in vitro dataene.

T/C-verdier som er mindre enn 42% ansees ifølge NCI-standarder å være aktive; T/C-verdier som er mindre enn 10% ansees ifølge NCI-standarder å ha fremragende aktivitet og potensielt klinisk aktivitet. Total log dreping er definert som T-C/3,2 Td, hvor T er median-tidspunktet i dager for at svulstene i den behandlede gruppe skulle nå 750 mg, C er median-tidspunktet i dager for at svulstene i kontrollgruppen skulle nå 750 mg og Td er doblingstiden for tumorvolumet (T.H. Corbett et. al,. Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, s. 35-87; Kluwer: Norwell, 1992). Verdier for total log-dreping på

>2,8, 2,0-2,8,1,3-1,9, 0,7-1,2, og <0,7 med en medikamentbehandlingstid på 5-20

dager, gis skår henholdsvis ++++, +++, ++ , + og - (inaktivt). En aktivitetsverdi på +++ til ++++, som indikerer klinisk aktivitet, fordres for å bevirke partiell eller fullstendig regresjon av masser på 100-300 mg av de fleste solide svulster transplantert i mus.

Kryptofycin 52 oppviser T/C-verdier varierende fra 0 til 14% for murine tumorer og 4,1 til 16 for humane tumorer, samt totalverdier for log dreping varierende fra 1,1 til 2 for murine tumorer og 0 til 3,2 for humane tumorer. Kryptofycin 55 oppviser T/C-verdier varierende fra høyst 0 til 4,4% og verdier for log dreping varierende fra 2,1 til

>4,6 (helbredelse) for alle forsøk unntatt ett, nemlig colon 26-forsøket som oppviste en verdi for log dreping på 1,2.

Tabell 1. Cytotoksisiteter av antimitotiske midler for SKOV3 og SKVLB1 celler

Celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av de nedenfor angitte forbindelsene i 48 timer. Celleantall ble deretter bestemt som angitt i Metode-delen, og IC5o-verdien for hver forbindelse ble beregnet. Verdiene representerer gjennomsnittet ± SEM for tre forsøk.

Referanser

1. Eglof, G., Oraanic Chemistrv: An Advanced Treatise. Gilmar et. al., (red.), ss. 31-46, John Wiley & Sons (1943)

2. Kemp, et. al., Oraanic Chemistrv. Worth Publishers, Inc. (1980).

3. Patterson, G. M. L. et. al., J. Phycol. 27:530-536 (1991).

4. Corbett, T. H. et. al., Cvtotoxic Anticancer Druas: Models and Concepts for Drua Discovery and Development, ss. 35-87, Kluwer Academic Publishers: Norwell, 1992. 5. Valeriote, F. A. er. al., Discovery and Development of Anticancer Agents, Kluwer Academic Publishers: Norwell, 1993; undertrykking.

6. Schwartz, R.E. er. al., J. Ind. Microbiol. 5:113-124 (1990).

7. Hirsch, C. F. et. al., U.S. patent 4.946.835, 7. august, 1990.

8. Sesin, D. F., U.S. patent 4.845.085, 4. juli, 1989.

9. Sesin, D.F. og Liesch, J. M., U.S. patent 4.868.208, 19. september, 1989.

10. Sesin, D. F., U.S. patent 4.845.086, 4. juli, 1989.

11. Skehan, P. et. al., J. Nati. Cancer Inst. 82:1107-1112(1990).

12. Bradley, G. er. al., Cancer Res. 49:2790-2796 (1989).

13. Endicott, J. A. et. al., Ann. Rev. Biochem. 58:137-171 (1989).

14. Beck, W. T., Biochem. Pharm. 36:2879-2887 (1987).

15. Moscow, J. A. et. al., J. Nati. Cancer Inst. 80:14-20 (1988).

16. Trimurtulu, G. et. al., J. Am. Chem. Soc. 116:4729-4737 (1994).

17. Smith, C. D. et. al., Cancer Res. 54:3779-3784 (1994).

Claims (31)

1. Kryptofycin, karakterisert ved strukturen: hvor Ar er fenyl; Ri er halogen; R2 er OH; eller Ri og R2 kan sammen danne en epoksidring, en aziridinring, en episulfidring, eller en dobbeltbinding mellom Ci8 og Cig; R3 er en C1-C5 alkylgruppe; R4 og R5 er H; eller R4 og R5 danner sammen en dobbeltbinding mellom C13 og Ci4; R6 er en benzyl-, halogenbenzyl- eller CrCs-alkoksyhalogenbenzylgruppe; Ryog R8 er hver uavhengig C1-C5 alkylgruppe; R9 er H; Ri0erCrC5alkyl; og X og Y er hver uavhengig O.

2. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at R8 er etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

3. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at R7 er etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

4. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at R8 er metyl, R3 er metyl; X og Y er begge 0.

5. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at R3 er etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

6. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Rio er metyl, etyl, propyl, butyl, isobutyl, pentyl eller isopentyl.

7. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at minst én av gruppene knyttet til C3, C6, Cio, Ci6, Ci? og Ci8 har fl-stereokonfigurasjon.

8. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at minst én av gruppene knyttet til C3, C6, Cio, Ci6, Ci? og Ci8 har S-stereokonfigurasjon.

9. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at R3 og R7 er metyl, R4 og R5 er tatt sammen for å danne en dobbeltbinding mellom Ci3 og C14, R8 er 3-klor-4-metoksybenzyl, R8 er metyl, R9 er hydrogen, R10 er isobutyl, X er oksygen og Y er oksygen.

10. Kryptofycin ifølge krav 9, karakterisert ved at Ri og R2 kan sammen danne en dobbeltbinding mellom Ci8 og C19.

11. Kryptofycin ifølge krav 11, karakterisert ved at R, og R2 sammen danner en epoksidring.

12. Kryptofycin ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte epoksidring er valgt fra R,R-epoksidring eller S,S-epoksidring.

13. Kryptofycin ifølge krav 9, karakterisert ved at Ri og R2 sammen danner en episulfidring.

14. Kryptofycin ifølge krav9, karakterisert ved at R4ogR5erH.

15. Kryptofycin ifølge krav 9, karakterisert ved at R4 og R5 sammen danner en andre binding mellom C13 og Cu.

16. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert vedatRi og R2 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci8 og Cig, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksy-benzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

17. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri og R2 sammen danner en f?,fl-epoksidring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, R9 er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

18. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri og R2 danner sammen en S,S-epoksidring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

19. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved atRi er S-klor, R2 er fl-hydroksyl, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 danner sammen en dobbelt-binding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl, og X og Y er oksygen.

20. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri og R2 sammen danner en ft.fl-epioksidring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 er hydrogen, R8 er 3-klor-4-metoksybenzyl, R9 er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

21. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er S-klor, R2 er R-hydroksyl, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 er hydrogen, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, Rg er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

22. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri og R2 sammen danner en /?,/?-episulfidring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom C13 og Cu, Re er 3-klor-4-metoksybenzyl, R9 er hydrogen, Ri0 er isobutyl og X og Y er oksygen.

23. Kryptofycin ifølge krav 1, karakterisert ved at Ar er fenyl, Ri og R2 sammen danner en F?,fl-aziridinring, R3, R7 og R8 er metyl, R4 og R5 sammen danner en dobbeltbinding mellom Ci3 og Cu, R6 er 3-klor-4-metoksybenzyl, R9 er hydrogen, R10 er isobutyl og X og Y er oksygen.

24. Farmasøytisk blanding egnet for inhibering av proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle, karakterisert ved at den omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

25. Anvendelse av kryptofycinforbindelsen ifølge krav 1, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en sykdom kjennetegnet ved proliferasjon av en pattedyrcelle.

26. Anvendelse ifølge krav 25, idet pattedyr-cellen er hyperproliferativ.

27. Anvendelse ifølge krav 26, idet den hyper-proliferative cellen er en human celle.

28. Anvendelse av kryptofycinforbindelsen ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av proliferasjonen av en hyperproliferativ pattedyrcelle som har en MDR-fenotype (multiple drug resistant).

29. Anvendelse ifølge krav 28, idet pattedyrcellen er en human celle.

30. Anvendelse ifølge krav 25, idet den patologiske tilstand kjennetegnes ved dannelse av neoplasmer.

31. Anvendelse ifølge krav 30, idet neoplasmene er valgt fra gruppen bestående av mamma-, småcellet lunge-, ikke-småcellet lunge-, kolorektal-, leukemi-, melanom-, pankreasadenokarsinom-, sentralnervesystem, ovarie-, prostata-, sarkom av bløtvev eller ben, hode og hals, gastriske som innbefatter pankreas og øsofagus, mavesekk, myelom, blære, nyre, neuroendokrine som innbefatter thyreoidea og non-Hodgkins og Hodgkins sykdomneoplasmer.