DE69633667T2 - Neue synthetische cryptophycine - Google Patents

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H. Thomas CORBETT
A. Frederick VALERIOTE
K. Thomas HEMSCHEIDT
Trimurtulu Golakoti
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Wayne State University
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Description

  • Diese Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung der U.S.-Regierung unter Grant Nos. CA12623 und CA53001 von The National Cancer Institute, Department of Health and Human Services, gemacht. Demgemäß hält die U.S.-Regierung bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Neoplastische Erkrankungen, die gekennzeichnet sind durch die Proliferation von Zellen, die nicht der normalen Kontrolle des Zellwachstums unterliegen, sind ein Haupttodesursache bei Menschen. Klinische Erfahrung in der Chemotherapie hat gezeigt, daß neue und wirksamere Arzneistoffe wünschenswert sind, um diese Erkrankungen zu behandeln. Solche Erfahrung hat auch gezeigt, daß Arzneistoffe, die das Mikrotubulus-System des Cytoskeletts aufbrechen, wirksam sein können bei der Hemmung der Proliferation neoplastischer Zellen.
  • Das Mikrotubulus-System eukaryotischer Zellen ist eine Hauptkomponente des Cytoskeletts und befindet sich in einem dynamischen Zustand von Zusammenbau und Zerlegung; das heißt, Heterodimere von Tubulin werden polymerisiert, um Mikrotubuli zu bilden, und Mikrotubuli werden zu ihren Bestandteilkomponenten depolymerisiert. Mikrotubuli spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von Zellarchitektur, -metabolismus und -teilung. Der dynamische Zustand von Mikrotubuli ist kritisch für deren normale Funktion. Im Hinblick auf Zellteilung wird Tubulin zu Mikrotubuli polymerisiert, die die Mitosespindel bilden. Die Mikrotubuli werden dann depolymerisiert, wenn die Verwendung der Mitosespindel erfüllt worden ist. Demgemäß umfassen Mittel, die die Polymerisation oder Depolymerisation von Mikrotubuli unterbrechen und dadurch Mitose hemmen, einige der wirksamsten chemotherapeutischen Mittel im klinischen Einsatz.
  • Solche Antimitosemittel oder -gifte können in drei Gruppen auf der Grundlage ihres molekularen Wirkungsmechanismus einklassifiziert werden. Die erste Gruppe besteht aus Mitteln, die Colchicin und Colcemid einschließen, die die Bildung von Mikrotubuli durch Komplexierung von Tubulin hemmen. Die zweite Gruppe besteht aus Mitteln, die Vinblastin und Vincristin einschließen, die die Bildung von parakristallinen Aggregaten von Tubulin induzieren. Vinblastin und Vincristin sind gut bekannte Antikrebsmittel. Ihre Wirkung der Zerstörung von Mikrotubuli der Mitosespindel hemmt vorzugsweise hyperproliferative Zellen. Die dritte Gruppe besteht aus Mitteln, die Taxol einschließen, das die Polymerisation von Tubulin fördert und somit Mikrotubuli-Strukturen stabilisiert.
  • Allein die Tatsache, Aktivität als ein Antimitosemittel zu besitzen, garantiert jedoch keine Wirksamkeit gegen eine Tumorzelle und sicher keine Tumorzelle, die einen arzneistoffresistenten Phänotyp zeigt. Vincaalkaloide, wie etwa Vinblastin und Vincristin, sind wirksam gegen neoplastische Zellen und Tumore, ihnen fehlt jedoch Aktivität gegen einige arzneistoffresistente Tumore und Zellen. Eine Basis für eine neoplastische Zelle, Arzneistoffresistenz (DR) oder multiple Arzneistoffresistenz (MDR) zu zeigen, ist durch die Überexpression von P-Glykoprotein. Verbindungen, die schlechte Substrate für den Transport von P-Glykoprotein sind, sollten nützlich sein bei der Umgehung solcher DR- oder MDR-Phänotypen.
  • Demgemäß erfordert das Auftreten des DR- oder MDR-Phänotyps bei vielen Tumorzellen und der klinisch nachgewiesene Wirkungsmodus von Antimikrotubulusmitteln gegen neoplastische Zellen die Entwicklung von Antimikrotubulusmitteln, die cytotoxisch gegen nicht-arzneistoffresistente neoplastische Zellen sowie cytotoxisch gegen neoplastische Zellen mit einem arzneistoffresistenten Phänotyp sind. Mittel, die sich in dieser Hinsicht als aussichtsreich erwiesen haben, schließen eine Klasse von Verbindungen ein, die als Kryptophycine bekannt sind.
  • Trimurtula et al. „Total structures of cryptophycins, potent antitumor depsipeptides from the blue-green alga nostoc sp. Strain GSV 224", Journal of the American Chemical Society, vol. 116, no. 11, 1994, S. 4729-4737, offenbart Kryptophycin-Verbindungen, die aus dem Nostoc sp.-Stamm GSV 224 isoliert sind. Diese Literaturstelle offenbart auch Derivate und Abbauprodukte der natürlichen vorkommenden Kryptophycine.
  • Im Hinblick auf Verfahren zur Herstellung von Kryptophycinen ist gegenwärtig kein Verfahren für eine Totalsynthese von Kryptophycinen bekannt. Kryptophycinverbindungen werden gegenwärtig über Isolierung aus Blaugrünalgen hergestellt oder sind halbsynthetische Variationen solcher natürlich hergestellten Verbindungen. Das Fehlen eines Totalsyntheseverfahrens macht es notwendigerweise schwierig, stereospezifische Kryptophycine herzustellen, die die Aktivität maximieren und die Stabilität der Verbindung erhöhen können. Forschungen haben zum Beispiel gezeigt, daß Kryptophycine mit einem intakten makrozyklischen Ring aktiver sind. Demgemäß wäre ein Totalsyntheseverfahren, das Kryptophycine mit einem makrozyklischen Ring, der stabiler ist als bei natürlich gewonnenen Kryptophycinen, erzeugen könnte, wünschenswert. Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Kryptophycinverbindungen mit der folgenden Struktur zur Verfügung:
    Figure 00030001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammengenommen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammengenommen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind.
  • Die vorliegender Erfindung stellt weiter Totalsyntheseverfahren zur Herstellung von Kryptophycinen bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von Kryptophycinen in Pharmazeutika bereit, um die Proliferation von Säugerzellen zu hemmen und Neoplasie zu behandeln.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt eine allgemeine Struktur ausgewählter Kryptophycinverbindungen der vorliegenden Erfindung und ein Numerierungssystem für die Hydroxysäureeinheiten A und D und Aminosäureeinheiten B und C in ausgewählten Ausführungsformen bereit;
  • 2A und B stellen graphisch die Wirkungen von Kryptophycinverbindungen und Vinblastin auf die Jurkatzellproliferation und -zellzyklusprogression dar. Jurkatzellen werden mit den angegebenen Konzentrationen an Kryptophycinverbindungen (A) oder Vinblastin (B) für 24 Stunden inkubiert. Für jede Probe wurden die Anzahl der lebensfähigen Zellen (∎) und der Mitoseindex (☐) bestimmt, wie im experimentellen Abschnitt beschrieben. Die Werte stellen die Mittelwerte ± Standardabweichung (sd) für Dreifachproben in einem von drei ähnlichen Experimenten dar;
  • 3 zeigt graphisch die Reversibilität der Wirkungen von Vinblastin, Kryptophycinen und Taxol auf das Zellwachstum. SKOV3-Zellen wurden mit 0,1 nM Vinblastin (☐), 0,1 nM Kryptophycinen (∎) oder 1 nM Taxol (⊠) zur Zeit = 0 behandelt. Diese Konzentrationen hemmten das Zellwachstum um 50% für jede Verbindung. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und in wirkstofffreiem Medium für die angegebene Zeit inkubiert. Die Zelldichte wurde durch Anfärbung mit Sulforhodamin B (SRB) bestimmt, wie beschrieben im experimentellen Abschnitt, und ist ausgedrückt als die mittlere ± sd Extinktion bei 560 nM für Dreifachproben in einem von drei Experimenten;
  • 4 stellt Isobologramme für kombinatorische Wirkungen von Vinblastin und Kryptophycinen auf die Zellproliferation bereit. SKOV3-Zellen wurden mit Vinblastin (0 – 600 pM) und/oder Kryptophycinen (1 – 100 pM) für 48 Stunden behandelt. Die Zellzahlen wurden dann durch SRB-Anfärbung bestimmt, wie beschrieben im experimentellen Abschnitt, und der IC50s (∎) und die Additivitätslinie (–) wurden für Kombinationen von Vinblastin und Kryptophycinverbindungen bestimmt. Werte stellen Mittelwerte für zwei Experimente dar, die jedes Dreifachproben enthielten;
  • 5 stellt ein erstes Schema zum Synthetisieren von Kryptophycinen gemäß der vorliegenden Erfindung bereit;
  • 6 stellt ein Schema zur Herstellung einer Hydroxysäureeinheit A bereit:
  • 7 stellt ein Schema zur Herstellung einer Untereinheit eines Kryptophycins, die eine Hydroxysäureeinheit A und Aminosäure B umfaßt, bereit;
  • 8 stellt ein Schema zur Herstellung der Untereinheit eines Kryptophycins, die eine Aminosäureeinheit C und Hydroxysäure D umfaßt, bereit;
  • 9 stellt ein erstes Schema zum Synthetisieren ausgewählter Kryptophycine gemäß der vorliegenden Erfindung bereit;
  • 10 stellt ein zweites Schema zum Synthetisieren ausgewählter Kryptophycine gemäß der vorliegenden Erfindung bereit;
  • 11 stellt ein Schema zum Synthetisieren einer Untereinheit eines Kryptophycins, die eine Hydroxysäure D umfaßt, bereit;
  • 12 stellt ein drittes Schema zum Synthetisieren ausgewählter Kryptophycine gemäß der vorliegenden Erfindung bereit;
  • 13 stellt ein viertes Schema zum Synthetisieren ausgewählter Kryptophycine gemäß der vorliegenden Erfindung bereit; und
  • 14 stellt ein fünftes Schema zum Synthetisieren ausgewählter Kryptophycine gemäß der vorliegenden Erfindung bereit.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Kryptophycinverbindungen mit der folgenden Struktur zur Verfügung:
    Figure 00080001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammengenommen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind.
  • Wie hierin verwendet haben die folgenden Begriffe die angegebenen Bedeutungen, soweit nicht eine gegenteilige Bedeutung klar aus der Verwendung im Kontext beabsichtigt ist: „Nieder-β-Aminosäure" bedeutet jede β-Aminosäure mit drei bis acht Kohlenstoffen und schließt lineare und nicht-lineare Kohlenwasserstoffketten ein; zum Beispiel 3-Amino-2-methylpropionsäure.
  • „veresterte Nieder-β-Aminosäure" bedeutet jede β-Aminosäure mit drei bis acht Kohlenstoffen, bei der der Wasserstoff der Carbonsäuregruppe mit einer Methylgruppe substituiert ist; zum Beispiel 3-Amino-2-propionsäuremethylester.
  • „Niederalkanoyloxygruppe" bedeutet eine Alkanoyloxygruppe mit einem bis sieben Kohlenstoffen und schließt lineare und nicht-lineare Kohlenwasserstoffketten ein.
  • „Nieder-α-Hydroxyalkanoyloxygruppe" bedeutet eine α-Hydroxyalkanoyloxygruppe mit zwei bis sieben Kohlenstoffe und schließt lineare und nicht-lineare Kohlenwasserstoffketten ein; zum Beispiel 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure.
  • „Niederalkoxygruppe" bedeutet eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, gebunden an ein Sauerstoffatom.
  • „Niederalkylgruppe" bedeutet eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffen und schließt lineare und nicht-lineare Kohlenwasserstoffketten ein, einschließlich zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, sec-Butyl-, methylierte Butylgruppen, Pentyl- und tert-Pentylgruppen.
  • „allylisch substituiertes Alken" bedeutet jedes Alken, das eine Alkylsubstitution enthält.
  • „Epoxidring" bedeutet einen dreigliedrigen Ring, dessen Hauptkette aus zwei Kohlenstoffen und einem Sauerstoffatom besteht.
  • „Aziridinring" bedeutet einen dreigliedrigen Ring, dessen Hauptkette aus zwei Kohlenstoffen und einem Stickstoffatom besteht.
  • „Episulfidring" bedeutet einen dreigliedrigen Ring, dessen Hauptkette aus zwei Kohlenstoffen und einem Schwefelatom besteht.
  • „Sulfatring" bedeutet einen fünfgliedrigen Ring, der aus einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Sauerstoff-Schwefel-Sauerstoff-Hauptkette besteht, mit zwei zusätzlichen Sauerstoffatomen, die mit dem Schwefelatom verbunden sind.
  • „Monoalkylphosphatring" bedeutet einen fünfgliedrigen Ring, der aus einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Sauerstoff-Phosphor-Sauerstoff-Hauptkette besteht, mit zwei zusätzlichen Sauerstoffatomen, von denen eines eine Niederalkylgruppe trägt, verbunden mit dem Phosphoratom.
  • „einfache unsubstituierte aromatische Gruppe" bezieht sich auf übliche aromatische Ringe mit 4n + 2 pi-Elektronen in einem monocyclischen konjugierten System (zum Beispiel Furyl, Pyrrolyl, Thienyl, Pyridyl) oder ein bicyclisches konjugiertes System (zum Bespiel Indolyl oder Naphthyl).
  • „einfache substituierte aromatische Gruppe" bezieht sich auf eine Phenylgruppe, die mit einer einzigen Gruppe substituiert ist (z.B. einer Niederalkylgruppe oder einem Halogen).
  • „heteroaromatische Gruppe" bezieht sich auf aromatische Ringe, die einen oder mehrere Nicht-Kohlenstoff-Substituenten enthalten, wie etwa Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel.
  • „Halogen" bezieht sich auf diejenigen Mitglieder der Gruppe im periodischen System, die historisch als die Halogene bekannt sind. Verfahren zur Halogenierung schließen die Zugabe von Halogenwasserstoffen, Substitution bei hoher Temperatur, Photohalogenierung etc. ein, sind aber nicht hierauf beschränkt, und solche Verfahren sind den Fachleuten bekannt. 1,2 Während der gesamten Offenbarung wird auf spezifische Kryptophycine nach Zahl Bezug genommen. Sofern nicht anders angegeben, entsprechen die Kryptophycine Verbindungen mit der folgenden Struktur:
    Figure 00120001
    worin die Nummern sich auf Verbindungen beziehen, wie dargestellt in der folgenden Tabelle:
    Figure 00120002
    Figure 00130001
    Figure 00140001
    db = Doppelbindung (wo entweder R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden oder wo R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden), Me = Methyl, 4-MB = 4-Methoxybenzyl, 3C4M – 3-Chlor-4-methoxybenzyl, 3C4OH = 3-Chlor-4-hydroxybenzyl, 3,5C4OH = 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzyl und 3,5C4M = 3,5-Dichlor-4-methoxybenzyl.
  • C18 ist der abschließende Kohlenstoff von Kryptophycin 108. C18 von Kryptophycin 108 ist substituiert wie folgt OHC18-C17, siehe 13.
  • Zusätzliche Kryptophycine, auf die in der Offenbarung Bezug genommen ist, schließen die Kryptophycine 5, 6, 7, 10, 12, 14 und 26 ein, die durch die folgenden Strukturen dargestellt sind:
    Figure 00140002
    KRYPTOPHYCIN 5
    Figure 00150001
    KRYPTOPHYCIN 6
    Figure 00150002
    KRYPTOPHYCIN 7
    Figure 00150003
    KRYPTOPHYCIN 10
    Figure 00160001
    KRYPTOPHYCIN 12
    Figure 00160002
    KRYPTOPHYCIN 14
    Figure 00160003
    KRYPTOPHYCIN 26.
  • Wie aus diesen Strukturen deutlich werden wird, haben die Kryptophycinverbindungen Gruppen, die zu chemischer Modifikation in der Lage sind. Die Stammverbindung der vorliegenden Erfindung betrachtet diejenigen Kryptophycine, die antineoplastische Aktivität zeigen. Die Derivate, die in der vorliegenden Erfindung exemplifiziert sind, schließen zum Beispiel Verbindungen mit dem Epoxidsauerstoff oder Hydroxygruppen an C-7 und C-8 von Einheit A oder der Leucinsäuregruppe von Einheit B von 1 ein. Solche Derivate der neuartigen und zuvor offenbarten Verbindungen, die gewünschte antineoplastische Aktivität zeigen, sind in der beanspruchten Erfindung eingeschlossen. Überdies wird die Beziehung zwischen der Struktur der Kryptophycinverbindungen und antineoplastischer Aktivität im experimentellen Abschnitt im folgenden dargelegt.
  • 22 zusätzliche Kryptophycinverbindungen, hierin bezeichnet als Kryptophycine 2, 4, 6, 7, 16 - 19, 21, 23, 24, 26, 28 – 31, 40, 43, 45, 50 und 54, sind offenbart in den U.S.-Patenten Nrn. 5,955,423 und 5,945,315, wobei diese Verbindungen entweder Metaboliten sind, die aus einem Stamm von Nostoc sp. isoliert worden sind, oder aus solchen Metaboliten semisynthetisiert worden sind. Ebenfalls offenbart in diesen Patentanmeldungen ist die Charakterisierung ausgewählter Kryptophycinverbindungen als Antimikrotubulusmittel mit klinischer Aktivität, exprimiert gegenüber einem breiten Spektrum von Tumoren, die in Mäuse implantiert worden sind, einschließlich DR- und MDR-Tumoren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Kryptophycinverbindungen mit der folgenden Struktur zur Verfügung:
    Figure 00170001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Kryptophycins ist R8 des Kryptophycins Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Kryptophycins ist R7 Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform dieses Kryptophycins ist R7 H, ist R8 Methyl, ist R3 Methyl, sind X und Y nicht beide O.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform dieses Kryptophycins bereit, in der R3 Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Kryptophycins ist R9 Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Kryptophycins ist R10 Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl.
  • Die Erfindung stellt weiter Kryptophycinverbindungen bereit, bei denen wenigstens eine der Gruppen, die an C3, C6, C10, C16, C17 und C18 gebunden sind, R-Stereochemie besitzt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat wenigstens eine der Gruppen, die an C3, C6, C10, C16, C17 und C18 gebunden sind, S-Stereochemie.
  • Eine Ausführungsform einer Kryptophycinverbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 Und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 51, ist wie folgt:
    Figure 00200001
    KRYPTOPHYCIN-51
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Epoxidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 52, ist wie folgt:
    Figure 00200002
    KRYPTOPHYCIN-52
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen S,S-Epoxidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 53, ist wie folgt:
    Figure 00210001
    KRYPTOPHYCIN-53
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 S-Chlor ist, R2 R-Hydroxyl ist, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 55, ist wie folgt:
    Figure 00210002
    KRYPTOPHYCIN-55
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Epoxidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 Wasserstoff sind, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 57, ist wie folgt:
    Figure 00220001
    KRYPTOPHYCIN-57
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 S-Chlor ist, R2 R-Hydroxyl ist, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 Wasserstoff sind, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 58, ist wie folgt:
    Figure 00220002
    KRYPTOPHYCIN-58
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Episulfidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 61, ist wie folgt:
    Figure 00230001
    KRYPTOPHYCIN 61
  • Eine weitere Ausführungsform einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, wenn Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Aziridinring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind. Die Struktur dieser Verbindung, Kryptophycin 97, ist wie folgt:
    Figure 00230002
    KRYPTOPHYCIN 97
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung der obigen Kryptophycinverbindungen sowie aller bisher bekannten Kryptophycine durch Totalsynthese zur Verfügung. Die Erfindung stellt weiter zur Verfügung, daß neuartige Kryptophycin-Metabolite, sowie zuvor offenbarte Kryptophycin-Metabolite, unter Verwendung der in dieser Erfindung bereitgestellten Verfahren synthetisiert werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Kryptophycins der Struktur zur Verfügung
    Figure 00240001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind,
    welches Auswählen eines allylisch substituierten E-Alkens; Umlagerung des allylisch substituierten E-Alkens über eine stereospezifische Wittig-Umlagerung; Überführen dieser Verbindung in eine erste δ-Aminosäure oder δ-Hydroxysäure; Koppeln der ersten Säure mit einer zweiten α-Aminosäure, um eine erste Teileinheit zu bilden; Koppeln einer dritten β-Aminosäure mit einer vierten α-Hydroxysäure oder α-Aminosäure, um eine zweite Teileinheit zu bilden; und Koppeln der ersten Teileinheit mit der zweiten Teileinheit, um ein besagtes Kryptophycin zu bilden, umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die nützlich ist zur Hemmung der Proliferation einer hyperproliferativen Säugerzelle, die eine wirksame Menge eines Kryptophycins mit der folgenden Struktur umfaßt:
    Figure 00260001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind; zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung weiter wenigstens ein zusätzliches antineoplastisches Mittel.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung einer Kryptophycinverbindung mit der folgenden Struktur:
    Figure 00280001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H sind; und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind,
    zur Herstellung eines Medikamentes zum Hemmen der Proliferation einer Säugerzelle zur Verfügung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Arzneimittel weiter wenigstens ein zusätzliches antineoplastisches Mittel.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung einer Kryptophycinverbindung mit der folgenden Struktur:
    Figure 00290001
    wobei
    Ar Methyl oder Phenyl oder irgendeine einfache unsubstituierte oder substituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist;
    R1 ein Halogen, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist;
    R2 OH oder SH ist; oder
    R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfidring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder
    R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können;
    R3, R7 und R8 jeweils Alkylgruppen mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    R4 und R5 H sind; oder
    R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können;
    R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halohydroxybenzyl-, Dihalohydroxybenzyl-, Haloalkoxybenzyl- oder Dihaloalkoxybenzylgruppe ist;
    R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nicht-linearer Kohlenwasserstoffketten, sind;
    und
    X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind,
    zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen der Proliferation einer hyperproliferativen Säugerzelle mit einem mehrfach arzneimittelresistenten Phänotyp zur Verfügung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Arzneimittel weiter wenigstens ein zusätzliches neoplastisches Mittel. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Säugerzelle menschlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der pathologische Zustand durch die Bildung von Neoplasmen gekennzeichnet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Neoplasmen ausgewählt aus der Gruppe, die aus Mammaneoplasmen, kleinzelligen Lungenneoplasmen, nicht-kleinzelligen Lungenneoplasmen, kolorektalen Neoplasmen, Leukämie, Melanome, Bauchspeicheldrüsenadenokarzinome, Zentralnervensystem(ZNS)-Neoplasmen, Eierstockneoplasmen, Prostataneoplasmen, Sarcome von weichem Gewebe oder Knochen, Kopf- und Halsneoplasmen, gastrische Neoplasmen, was Bauchspeicheldrüsen- und Speiseröhrenneoplasmen einschließt, Magenneoplasmen, Myelome, Blasenneoplasmen, Nierenneoplasmen, neuroendokrine Neoplasmen, was Schilddrüsenneoplasmen und Nicht-Hodgkin-Krankheits- und Hodgkin-Krankheits-Neoplasmen einschließt, besteht.
  • Das Verfahren zur Herstellung der Kryptophycinverbindungen ist zusammengefaßt in Schema 1, wie dargestellt in 5. Das Ausgangsmaterial ist ein 3E-Alken (a), substituiert an C-2 mit einer XH-Gruppe in der S-Konfiguration, wobei X Sauerstoff oder NH ist. L- Alanin und L-Milchsäure dienen als preiswerte Quellen für das Ausgangsmaterial a. Der Schlüsselschritt in der Synthese ist eine stereoselektive [2,3]-Wittig-Umlagerung (D.J-S. Tsai et al., J. Org. Chem. 1984, 49:1842-1843; K. Mikami et al., Tetrahedron 1984, 25:2303-2308; N. Sayo et al., Chem Lett. 1984, 259-262) des Propargylethers von a (b) zum (3R,4R)-3-(XH-substituiert)-4-alkylhept-5(E)-en-1-in (c), wobei X ein Sauerstoff oder ein geschützter Stickstoff (z.B. t-Butyldimethylsilylamino) ist. Verbindung c kann dann in den δ-Hydroxy- oder Aminosäure-Einheit-A-Vorläufer des Kryptophycins, Methyl-(5S,6R)-5-(XP-substituiert)-6-alkyl-8-arylocta-2E,7E-dieonat (d), überführt werden, worin P eine geeignete Schutzgruppe ist, unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Verfahren.
  • Eine Strategie zum Synthetisieren eines Kryptophycins, das aus einer δ-Hydroxy- oder Aminosäure-Einheit A, einer α-Aminosäure-Einheit B, einer β-Aminosäure-Einheit C und einer α-Hydroxy- oder Aminosäure-Einheit D besteht, ist, den Makrozyklus aus zwei Vorläufern zusammenzubauen, die Einheiten des Kryptophycinmoleküls darstellen, zum Beispiel einem A-B-Vorläufer (e), der die δ-Hydroxy- oder Aminosäure-Einheit A und die α-Aminosäure-Einheit B enthält, und einem C-D-Vorläufer (f), der die β-Aminosäure-Einheit C und die α-Hydroxy- oder Aminosäure-Einheit D enthält.
  • In dem hierin beschriebenen Verfahren wird ein Kryptophycin aus A-B- und C-D-Vorläufern in zwei Schritten zusammengebaut, indem (1) die Endgruppen der Einheiten A und D in den A-B-und C-D-Vorläufern verknüpft werden, um eine azyklische C-D-A-B-Zwischenstufe zu bilden, und (2) die Endgruppen der Einheiten B und C verknüpft werden, um das zyklische Produkt zu bilden.
  • In der Synthese von Krypotphycin 51, beschrieben im experimentellen Abschnitt, wird eine Esterbindung zwischen der δ-Hydroxygruppe von Einheit A in der A-B-Einheit und der Carbonsäuregruppe von Einheit D im C-D-Fragment gebildet, um eine azyklische C-D-A-B-Zwischenstufe zu bilden, und anschließend eine Amidbindung zwischen der Carbonsäuregruppe von Einheit B in der A-B-Einheit und der β-Aminogruppe von Einheit C in der C-D-Einheit gebildet. Verbindung K ist der A-B-Einheit-Vorläufer, Verbindung P ist der C-D-Einheit-Vorläufer und Verbindung R ist der azyklische C-D-A-B-Vorläufer von Kryptophycin 51. Verbindungen K und P haben Schutzgruppen an der Carbonsäuregruppe von Einheit B und der β-Aminogruppe von Einheit C, um die Kopplung zu Esterbildung zwischen den Einheiten A und D in Schritt 1 zu beschränken. Diese Schutzgruppen werden von der C-D-A-B-Zwischenstufe abgespalten, so daß Amidbildung zwischen den Einheiten B und C in Schritt 2 auftreten kann.
  • Die Synthese von Methyl-(5S,6R)-5-t-butyldimethylsilyloxy-6-methyl-8-phenylocta-2E,7E-dieonat (G), dem Einheit-A-Vorläufer des Kryptophycins 51, ist zusammengefaßt in Schema 2 (6). (S)-trans-3-Penten-2-ol (A), das Ausgangsmaterial, wurde durch enzymatische Auflösung der racemischen Verbindung hergestellt. Reaktion von A mit Propargylchlorid und Base unter Phasentransferbedingungen erzeugte Propargylether B in 86% Ausbeute. Behandlung von B mit Butyllithium bei -90°C führte zu Alkohol C in 71% Ausbeute. Die gewünschte 3R,4R-anti-Verbindung C war das einzige Produkt, das in der Wittig-Umlagerung gebildet wurde. Nach Schützen der Hydroxylgruppe von C als dem tert-Butyldimethylsilylether (oder tert-Butyldimethylsilylether) führte Hydroborierung der Dreifachbindung (H.C. Brown, Organic Synthesis Via Boranes, Wiley, 1975) zu einem Aldehyd D in 73% Ausbeute aus C. Als nächstes wurde D mit einer Horner-Emmons-Reaktion in 90% Ausbeute in den trans-α,β-ungesättigten Ester E überführt. Selektive Ozonolyse der C6-C7-Doppelbindung in D ergab Aldehyd F in 83% Ausbeute. Schließlich erzeugte eine Wittig-Reaktion von F mit Benzyltriphenylphosphoniumchlorid in Gegenwart von Butyllithium G in 80% Ausbeute. Die Ausbeute von G aus A betrug 26%.
  • Das Koppeln des Einheit-A-Vorläufers G mit der D-3-(3-Chlor-4-methoxyphenyl)-alanin-Einheit B, um den A-B-Vorläufer (K) herzustellen, ist in Schema 3 zusammengefaßt ( 7). Hydrolyse der Methylestergruppe in G mit Lithiumhydroxid in Aceton erzeugte Carbonsäure H in 95% Ausbeute. Koppeln von H mit Trichlorethylester I, um J herzustellen, konnte in 65% Ausbeute durchgeführt werden, indem eine Lösung von H in N,N-Dimethylformiad (DMF) mit einem kleinen Überschuß Pentafluorphenyldiphenylphosphinat (FDPP), einer äquimolaren Menge des Trifluoracetatsalzes von I, gefolgt von 3 Äquiv. Diisopropylamin (DIEA) bei 25°C behandelt wurde (S.Chen et al., Tetrahedron Lett. 1991, 32:6711-6714). Fluordesilylierung von J führte dann zu K in 95% Ausbeute.
  • Geschützte Aminosäure I wurde aus D-Tyrosin in fünf Schritten hergestellt. Als erstes wurde D-Tyrosin mit Sulfurylchlorid in Eisessig chloriert (R. Zeynek, Hoppe-Seyler's Z. f. Physiol. Chemie 1926, 144:247-254). Als nächstes wurde N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)-D-alanin in 94% Ausbeute durch Behandeln einer Suspension der Aminosäure in 50% wäßrigem Dioxan mit Di-tert-butyldicarbonat in Gegenwart von Triethylamin erhalten. Das resultierende Produkt wurde mit Dimethylsulfat in Gegenwart von Kaliumcarbonat in unter Rückfluß kochendem Aceton in 84% Ausbeute dimethyliert. Der Methylester wurde dann mit Natriumhydroxid in wäßrigem Dioxan verseift, um N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(3-chlor-4-methoxyphenyl)-D-alanin in 86% Ausbeute zu liefern. Einwirken von Trichlorethanol, Pyridin und DCC in Dichlormethan auf die BOC-geschützte Aminosäure führte zu Trichlorethylester I in 65% Ausbeute. Behandlung dieses Materials mit Trifluoressigsäure führte zu einer quantitativen Ausbeute des Trifluoracetatsalzes von I.
  • Die Synthese von (2S)-2-[3'-(tert-Butoxycarbonyl)amino-2',2'-dimethylpropanoyloxy]-4-methylpentansäure (P), dem C-D-Vorläufer, ist zusammengefaßt in Schema 4 (8). Der Ausgangspunkt für den Einheit-C-Teil von P war der Aminoalkohol L. Schutz der Aminogruppe in L durch Behandlung mit Di-tert-butyldicarbonat in Gegenwart von Triethylamin (93% Ausbeute), gefolgt von der Oxidation des primären Alkohols mit Rutheniumtetroxid (P.H.J. Carlsen et al., J. Org. Chem. 1981, 46:3936-3938), ergab Carbonsäure M (66% Ausbeute). L-Leucinsäure wurde in 93% Ausbeute unter Phasentransferbedingungen in Allylester N überführt, indem sie einer Mischung aus Allylbromid in Dichlormethan und wäßrigem Natriumbicarbonat, das Tetra-n-butylammoniumchlorid enthielt, ausgesetzt wurde (S. Friedrich-Bochnitschek et al., J. Org. Chem. 1989, 54:751-756). Die Kopplungsreaktion von M mit N wurde durchgeführt mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Dichlormethan, um O in 75% Ausbeute herzustellen. Spaltung des Allylesters in O wurde in THF, das Morpholin und katalytisches Tetrakis(triphenylphospin)-Palladium enthielt, durchgeführt, um P in 95% Ausbeute zu ergeben (P.D. Jeffrey et al., J. Org. Chem. 1982, 47:587-590).
  • Die Kopplung des A-B-Vorläufers (K) und des C-D-Vorläufers (P) wurde durchgeführt, wie dargestellt in Schema 5 (9). Behandlung von K und P mit DCC/DMAP in Dichlormethan führte zur vollständig geschützten C-D-A-B-Zwischenstufe (Q) in 84% Ausbeute. Reduktive Spaltung der Trichlorethylestergruppe in Q wurde erreicht unter Verwendung von aktiviertem Zinkstaub in Essigsäure. Die BOC-Schutzgruppe wurde dann mit Trifluoressigsäure abgespalten, um R als das Trifluoracetatsalz in 91 % Gesamtausbeute aus Q zu ergeben. Makrolactamisierung von R mit FDPP führte zu Kryptophycin 51 in 61 % Ausbeute (J. Dudash, Jr. et al., Synth. Commun. 1993, 23:349-356). Die Gesamtausbeute aus S-trans-3-Penten-2-ol (A) betrug 7%.
  • Kryptophycin 51 diente als der Vorläufer für Kryptophycin 52, das R,R-Epoxid, und Kryptophycin 53, das S,S-Epoxid. Seinerseits diente Kryptophycin 52 als der Vorläufer für Kryptophycin 55, das 18R,19S-Chlorhydrin, und Kryptophycin 57, das 13,14-Dihydro-Analog. Kryptophycin 57 diente als der Vorläufer für Kryptophycin 58. Kryptophycin 53 diente als der Vorläufer für Kryptophycin 61 unter Verwendung eines Verfahrens, das beschrieben ist von T.H. Chan und J.R. Finkenbine, J. Am. Chem. Soc. 1072, 94:28880-2882, und Kryptophycin 97 unter Verwendung eines Verfahrens, das beschrieben ist von Y. Ittah et al., J. Org. Chem. 1978, 43:4271-4273.
  • Für die Synthese von Kryptophycinen, die Ar-Gruppen haben, die verschieden sind von Phenyl, können Einheit-A-Vorläufer der allgemeinen Struktur d (Schema 1, R3 = Me) durch eine Wittig-Reaktion aus Aldehyd F (Schema 2; TBS-Schutzgruppe) oder S (Schema 6; TBPS-Schutzgruppe) mit dem geeigneten Aryltriphenylphosphoniumchlorid in Gegenwart von Butyllithium hergestellt werden Krpytophycin 81 wurde hergestellt aus Vorläufer d (Ar = p-Methoxyphenyl, R3 = Me), wie dargestellt in den Schemata 6 und 7 (10 und 11).
  • Die Ar-Gruppe kann auch in einer späteren Stufe der Synthese in das neue Kryptophycin eingeführt werden. Als erstes wird Vorläufer d (Ar = R3 = Me) durch Koppeln der geeigneten A-B-Vorläufer (e) und C-D-Vorläufer (f), wie dargestellt in Schema 8 (12) in Kryptophycin 82 überführt. Selektive Ozonolyse von Kryptophycin 82 oder periodische Säureoxidation der entsprechenden Epoxide Kryptophycin 90 und 91 führte zu einem Aldehyd, Kryptophycin 108. Eine Wittig-Reaktion von Kryptophycin 108 mit dem geeigneten Aryltriphenylphosphoniumchlorid in Gegenwart von Butyllithium ergab das neue Kryptophycin (Schema 9; 13). Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Kryptophycin 110 (Ar = p-Fluorphenyl), Kryptophycin 111 (Ar = p-Tolyl), Kryptophycin 112 (Ar = 2-Thienyl) und Kryptophycin 124 (Ar = p-Chlorphenyl) hergestellt. Kryptophycin 110 diente als der Vorläufer der Epoxide Kryptophycine 115 und 116, Kryptophycin 111 diente als der Vorläufer der Epoxide Kryptophycine 117 und 118 und der Chlorhydrine Kryptophycine 128, 130 und 131. Kryptophycin 112 diente als der Vorläufer der Epoxide Kryptophycine 119 und 120. Kryptophycin 124 diente als der Vorläufer der Epoxide Kryptophycine 125 und 126 und der Chlorhydrine Kryptophycine 132, 133 und 134.
  • Eine weitere Strategie zum Synthetisieren eines Kryptophycins ist, den Makrozyklus aus drei Vorläufern zusammenzubauen, zum Beispiel einem A-B-Vorläufer (e), der die δ-Hydroxy- oder Aminosäureeinheit A enthält, einem Vorläufer, der die δ-Hydroxy- oder Aminosäureeinheit D enthält, und einem Vorläufer, der die β-Aminosäure-Einheit C enthält. In dem hierin beschriebenen Verfahren wird ein Kryptophycin aus A-B-, C- und D-Vorläufern in drei Schritten zusammengebaut, indem (1) die Endgruppen der Einheiten A und D in den A-B- und D-Vorläufern verknüpft werden, um eine azyklische D-A-B-Zwischenstufe zu bilden, (2) die Endgruppen der Einheiten D und C in den D-A-B- und C-Vorläufern verknüpft werden, um eine azyklische C-D-A-B-Zwischenstufe zu bilden, und (3) die Endgruppen der Einheiten B und C verknüpft werden, um das zyklische Produkt zu bilden.
  • In der Synthese von Kryptophycin 121, die im experimentellen Abschnitt beschrieben ist, wird eine Esterbindung zwischen der δ-Hydroxygruppe von Einheit A in der A-B-Einheit und der Carbonsäuregruppe von Einheit D im D-Fragment gebildet, um eine azyklische D-A-B-Zwischenstufe zu bilden. Eine Amidbindung wird dann zwischen der Carbonsäuregruppe von Einheit C und der α-Aminogruppe von Einheit D im D-A-B-Fragment gebildet. Schließlich wird eine Amibindung zwischen der Carbonsäuregruppe von Einheit B in der A-Einheit und der β-Aminogruppe von Einheit C in der C-D-Einheit ausgebildet. Verbindung K ist der A-B-Einheit-Vorläufer, BOC-L-Leucinanhydrid ist der D-Einheit-Vorläufer und Verbindung AL ist der Einheit-C-Vorläufer. Verbindung AK ist der azyklische C-D-A-B-Vorläufer von Kryptophycin 121 (Schema 10; 14). Die Verbindungen K und BOC-L-Leucinanhydrid haben Schutzgruppen an der Carbonsäuregruppe von Einheit B und der α-Aminogruppe von Einheit D, um die Kopplung zu Esterbildung zwischen den Einheiten A und D in Schritt 1 zu beschränken. Die Schutzgruppe wird aus der δ-Aminogruppe von Einheit D in der D-A-B-Zwischenstufe abgespalten, so daß Amidbildung zwischen der Aminogruppe in Einheit B und der Carbonsäure C in Stufe 2 auftreten kann. Diese Schutzgruppen werden aus der C-D-A-B-Zwischenstufe entfernt, so daß die Amidbildung zwischen den Einheiten B und C in Stufe 2 auftreten kann.
  • Neue Kryptophycinverbindungen der vorliegenden Erfindung haben Epoxidringe, die durch Nukleophile mit anderen Geschwindigkeiten geöffnet werden als der Epoxidring in Kryptophycin 1, oder haben Chlorhydrin-Funktionalitäten, die Epoxidringe mit anderen Geschwindigkeiten bilden, als die Chlorhydrin-Funktionalität von Kryptophycin 8 in den Epoxidring von Kryptophycin 1 umgewandelt wird. Der Epoxidring von Kryptophycin 1 oder die Chlorhydrin-Funktionalität (ein maskierter Epoxidring) von Kryptophycin 8 ist für optimale in-vivo-Aktivität wesentlich. Wenn der Epoxid-Sauerstoff eliminiert wird (wie zu finden in Kryptophycin 3) oder der Epoxidring zu einem Diol hydrolysiert wird (wie zu finden in Kryptophycin 15), wird die Antitumoraktivität stark verringert. Kryptophycin 1 zeigt merkbare Toxizität in Tieren, verglichen mit Kryptophycin 8. Dies wird widergespiegelt im T/C (meist >0%) und in den logarithmischen Gesamtabtötungswerten (meist <2,0) für Kryptophycin 1 verglichen mit denjenigen für Kryptophycin 8 (meist T/C-Werte von 0% und logarithmische Gesamtabtötungswerte von >2,8). Kryptophycin 25, das entsprechende Bromhydrin-Analog, zeigt T/C- und logarithmische Gesamtabtötungswerte, die vergleichbar sind mit denjenigen für Kryptophycin 1. Der überraschende Unterschied in der in-vivo-Aktivität legt nahe, daß das Bromhydrin Kryptophycin 25 schneller in vivo in Kryptophycin 1 umgewandelt wird als Kryptophycin 8. Dies legt weiter nahe, daß das weniger toxische Kryptophycin 8 mehr Zeit haben könnte, an der Tumorstelle zu akkumulieren, bevor es in die aktive Verbindung Kryptophycin 1 umgewandelt wird. Die Epoxidgruppe von Kryptophycin 1 bindet sich möglicherweise kovalent an seinem Zielrezeptor in der Tumorzelle. Die neuen Kryptophycine in der vorliegenden Erfindung könnten potentiell bessere in-vivo-Aktivität als Kryptophycin 1 und Kryptophycin 8 besitzen, indem sie günstigere Geschwindigkeiten der Epoxidbildung in vivo aus den entsprechenden Chlorhydrin-Prodrugs und kovalente Bindung an den Zielrezeptor in der Tumorzelle zeigen.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind gegen Hydrolyse und Solvolyse stabiler als die Kryptophycine 1 und 21. Die Esterbindung, die die Einheiten C und D in Kryptophycin 1 verknüpft, ist relativ empfindlich gegen milde Basenhydrolyse, wobei sie sich bei pH 11 mit einer Halbwertszeit von 0,83 Stunden zu einer Hydroxysäure spaltet. Die C-D-Esterbindung in Kryptophycin 21, dem die Methylgruppe an C-2 von Einheit C fehlt, öffnet sich mit einer schnelleren Geschwindigkeit mit einer Halbwertszeit von 0,25 Stunden. Die C-D-Esterbindung ist auch empfindlich gegen Solvolyse. Wenn Methanol im Isolationsschema verwendet wird, tritt beträchtliche Methanolyse der Kryptophycine 1 und 21 auf. Kryptophycin 21 ist empfindlicher gegen Methanolyse als Kryptophycin 1. Kryptophycin 1 zeigt Antitumoraktivität, wohingegen Kryptophycin 21 inaktiv ist, möglicherweise weil die C-D-Esterbindung von Kryptophycin 21 in vivo schneller hydrolysiert wird als die C-D-Esterbindung von Kryptophycin 1. Hydrolyse der C-D-Esterbindung kann auch teilweise die verminderte in-vivo-Aktivität von Kryptophycin 1 über interperitoneale und subkutane Wege der Arzneistoffverabreichung erklären. Die C-D-Esterbindung von Kryptophycinen, die zwei Methylgruppen an C-2 von Einheit C besitzen, wie etwa diejenige, die in Kryptophycin 52 zu finden ist, ist bei pH 11 stabil.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und die zuvor offenbarten Kryptophycinverbindungen können therapeutisch als antineoplastische Mittel eingesetzt und dadurch in Verfahren zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen verwendet werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich „neoplastisch" auf ein Neoplasma, was ein abnormes Wachstum ist, wobei ein solches Wachstum aufgrund einer Proliferation von Zellen auftritt, die nicht den üblichen Wachstumsbeschränkungen unterliegen. Wie hierin verwendet, ist „antineoplastisches Mittel" jede Verbindung, Zusammensetzung, Mischung, Beimischung oder Gemisch, die/das den neoplastischen Phänotyp einer Zelle hemmt, eliminiert, retardiert oder umkehrt.
  • Chemotherapie, chirurgischer Eingriff, Strahlungstherapie, Therapie mit Modifikatoren der biologischen Reaktion und Immuntherapie werden gegenwärtig bei der Behandlung von Krebs verwendet. Jeder Therapiemodus hat spezifische Indikationen, die den Fachleuten bekannt sind, und einer oder alle können in einem Versuch eingesetzt werden, die Zerstörung neoplastischer Zellen insgesamt zu erreichen. Chemotherapie, die ein oder mehrere Kryptophycine einsetzt, wird von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Überdies wird auch Kombinationschemotherapie, Chemotherapie, die Kryptophycine in Kombination mit anderen neoplastischen Mitteln einsetzt, von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, da Kombinationstherapie im allgemeinen wirksamer ist als die Verwendung von einzelnen antineoplastischen Mitteln. Somit stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen zur Verfügung, die eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens einer neuen Kryptophycinverbindung der vorliegenden Erfindung enthalten, einschließlich nicht-toxischer Additionssalze derselben, die dazu dient, die oben angegebenen therapeutischen Nutzen zu liefern. Solche Zusammensetzungen können zusammen mit physiologisch tolerierbaren flüssigen, gelförmigen oder festen Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und Vehikeln bereitgestellt werden. Solche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Vehikel sind zu finden in United States Pharmacopeia Vol. XXII und National Formulary Vol. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989). Zusätzliche Behandlungsmodi sind bereitgestellt in AHFS Drug Information, 1993 hrg. vom American Hospital Formulary Service, S. 522-660.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter zur Verfügung, daß die pharmazeutische Zusammensetzung, die verwendet wird, um neoplastische Erkrankung zu behandeln, wenigstens eine Kryptophycinverbindung und wenigstens ein zusätzliches antineoplastisches Mittel enthält. Antineoplastische Verbindungen, die in Kombination mit Kryptophycin eingesetzt werden können, schließen diejenigen ein, die angegeben sind in The Merck Index, 11. Ausgabe Merck & Co., Inc. (1989), S. Ther 16-17. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können antineoplastische Mittel Antimetaboliten sein, die Methotrexat, 5-Fluoruracil, 6-Mercaptopurin, Cytosinarabinosid, Hydroxyharnstoff und 2-Chlordesoxyadenosin einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die in Betracht gezogenen antineoplastischen Mittel Alkylierungsmittel, die Cyclophosphamid, Melphalan, Busulfan, Paraplatin, Chlorambucil und Stickstoffsenfgas einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die antineoplastischen Mittel Pflanzenalkaloide, die Vincristin, Vinblastin, Taxol und Etoposid einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die in Betracht gezogenen antineoplastischen Mittel Antibiotika, die Doxorubicin (Adriamycin), Daunorubicin, Mitomycin c und Bleomycin einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die in Betracht gezogenen antineoplastischen Mittel Hormone, die Calusteron, Diomostavolon, Propionat, Epitiostanol, Mepitiostan, Testolacton, Tamoxifen, Polyestradiolphosphat, Megesterolacetat, Flutamid, Nilutamid und Trilotan einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließen die in Betracht gezogenen antineoplastischen Mittel Enzyme ein, die L-Asparaginase oder Aminoacridin-Derivate, die Amsacrin einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind, einschließen können, aber nicht hierauf beschränkt sind. Zusätzliche antineoplastische Mittel schließen diejenigen ein, die angegeben sind in Skeel, Roland T., „Antineoplastic Drugs and Biologic Response Modifier: Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agents, Handbook of Cancer Chemotherapy (3. Ausgabe), Little Brown & Co. (1991).
  • Die vorliegenden Kryptophycinverbindungen und -zusammensetzungen können Säugern für veterinäre Verwendung, wie etwa für Haustiere, und klinische Verwendung bei Menschen in einer ähnlichen Art und Weise zu anderen Therapeutika verabreicht werden. Im allgemeinen wird die für therapeutische Wirksamkeit erforderliche Dosierung gemäß dem Verwendungstyp und Verabreichungsmodus ebenso wie den besonderen Anforderungen einzelner Patienten variieren. Üblicherweise werden Dosierungen von etwa 0,001 bis 1.000 mg/kg, häufiger 0,01 bis 10 mg/kg, des Körpergewichtes des Patienten reichen. Alternativ können Dosierungen innerhalb dieser Bereiche durch konstante Infusion über einen längeren Zeitraum, der üblicherweise 24 Stunden übersteigt, verabreicht werden, bis die gewünschten therapeutischen Nutzen erreicht worden sind. Tatsächlich muß die Arzneistoffdosierung ebenso wie der Verabreichungsweg auf der Grundlage von relativer Wirksamkeit, relativer Toxizität, Wachstumseigenschaften des Tumors und Wirkung von Kryptophycinen auf den Zellzyklus, Arzneistoffpharmakokinetiken, Alter, Geschlecht, physischem Zustand des Patienten und vorheriger Behandlung ausgewählt werden.
  • Die Kryptophycinverbindungen, mit oder ohne zusätzliche antineoplastische Mittel, können in therapeutische Zusammensetzungen als natürliche oder Salzformen hineinformuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare nicht-toxische Salze schließen die Basenadditionssalze (gebildet mit freien Carboxyl- oder anderen anionischen Gruppen), die von anorganischem Basen, wie etwa zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden, und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet werden können. Solche Salze können auch als Säureadditionssalze mit irgendwelchen freien kationischen Gruppen gebildet werden und werden im allgemeinen mit anorganischen Säuren, wie etwa zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie etwa Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet. Zusätzliche Vehikel, die die weitere Erfindung bereitstellt, sind diejenigen, die den Fachleuten zugänglich sind, zum Beispiel diejenigen, die zu finden sind in United States Pharmacopeia Vol. XXII und National Formulary Vol. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989).
  • Die Geeignetheit bestimmter Trägerstoffe zur Einbeziehung in eine gegebene therapeutische Zusammensetzung hängt von dem bevorzugten Verabreichungsweg ab. Antineoplastische Zusammensetzungen können zum Beispiel für orale Verabreichung formuliert werden. Solche Zusammensetzungen werden typischerweise entweder als flüssige Lösung oder Suspensionen oder in festen Formen hergestellt. Orale Formulierungen schließen üblicherweise solche normalerweise eingesetzten Additive ein, wie etwa Bindemittel, Füllstoffe, Trägerstoffe, Konservierungsstoffe, Stabilisierungsmittel, Emulgatoren, Puffer und Vehikel, wie zum Beispiel pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspension, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern an und enthalten typischerweise 1 % bis 95% aktiven Inhaltsstoff, vorzugsweise 2% bis 70%.
  • Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch als injizierbare Zusammensetzungen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen; feste Formen, die zur Lösung, oder Suspension, in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können hergestellt werden. Solche injizierbaren Zusammensetzungen können subkutan, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, intrathekal oder intrapleural verabreicht werden. Der (Die) aktive(n) Inhaltsstoff(e) wird (werden) oft mit Verdünnungsmitteln oder Vehikeln vermischt, die physiologisch tolerierbar und mit dem (den) aktiven Inhaltsstoffen) kompatibel sind. Geeignete Verdünnungsmittel und Vehikel sind zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol oder dergleichen und Kombinationen davon. Zusätzlich können die Zusammensetzungen, falls gewünscht, geringe Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungsmittel oder Emulgatoren, Stabilisatoren oder pH-Pufferungsmittel.
  • Die Erfindung stellt weiter Kryptophycinverbindungen, die umfaßt sind von der allgemeinen Struktur, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Proliferation von Säugerzellen zur Verfügung, indem diese Zellen mit einer Kryptophycinverbindung in einer Menge in Kontakt gebracht werden, die ausreichend ist, um die Proliferation der Säugerzelle zu hemmen. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Arzneimittel zur Hemmung der Proliferation hyperproliferativer Säugerzellen. Für die Zwecke dieser Erfindung sind „hyperproliferative Säugerzellen" Säugerzellen, die nicht den charakteristischen Wachstumsbeschränkungen unterworfen sind, z.B. programmiertem Zelltod (Apoptose). Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist, wenn die Säugerzelle menschlich ist. Die Erfindung stellt weiter das Inkontaktbringen der Säugerzelle mit wenigstens einer Kryptophycinverbindung und wenigstens einem zusätzlichen antineoplastischen Mittel zur Verfügung. Die in Betracht gezogenen Typen von antineoplastischen Mitteln sind dieselben wie diejenigen, die hierin zuvor offenbart sind.
  • Die Erfindung stellt weiter Kryptophycinverbindungen, die umfaßt sind von der allgemeinen Struktur, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Proliferation hyperproliferativer Zellen mit arzneistoffresistenten Phänotypen zur Verfügung, einschließlich derjenigen mit mehrfach arzneistoffresistenten Phänotypen, indem besagte Zelle mit einer Kryptophycinverbindung in einer Menge in Kontakt gebracht wird, die ausreichend ist, um die Proliferation einer hyperproliferativen Säugerzelle zu hemmen. Eine bevorzugte Ausführungsform ist, wenn die Säugerzelle menschlich ist. Die Erfindung stellt weiter das Inkontaktbringen der Säugerzelle mit einer Kryptophycinverbindung und wenigstens einem zusätzlichen antineoplastischen Mittel zur Verfügung. Die in Betracht gezogenen Typen von antineoplastischen Mitteln sind dieselben wie diejenigen, die hierin zuvor offenbart sind.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann in einem Verfahren zur Linderung pathologischer Zustände verwendet werden, die durch hyperproliferative Säugerzellen hervorgerufen werden, zum Beispiel Neoplasie, indem einem Patienten eine wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die hierin zuvor bereitgestellt ist, verabreicht wird, um die Proliferation der hyperproliferierenden Zellen zu hemmen. Wie hierin verwendet, bezieht sich „pathologischer Zustand" auf jede Pathologie, die von der Proliferation von Säugerzellen herrührt, die nicht den normalen Beschränkungen des Zellwachstums unterworfen sind. Eine solche Proliferation von Zellen kann auf Neoplasmen beruhen, die folgende Neoplasmen einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sind: Mammaneoplasmen, kleinzellige Lungenneoplasmen, nicht-kleinzellige Lungenneoplasmen, kolorektale Neoplasmen, Leukämie, Melanome, Zentralnervensystem(ZNS)-Neoplasmen, Eierstockneoplasmen, Prostataneoplasmen, Sarcome von weichem Gewebe oder Knochen, Kopf- und Halsneoplasmen, gastrische Neoplasmen, was Bauchspeicheldrüsen- und Speiseröhrenneoplasmen einschließt, Magenneoplasmen, Myelome, Blasenneoplasmen, Nierenneoplasmen, neuroendokrine Neoplasmen, was Schilddrüsenneoplasmen und Lymphome einschließt, Nicht-Hodgkin-Neoplasmen und Hodgkin-Neoplasmen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die neoplastischen Zellen menschlich. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann auch in Verfahren zur Linderung solcher pathologischen Zustände unter Einsatz von Kryptophycin in Kombination mit anderen Therapien sowie anderen antineoplastischen Mitteln verwendet werden. Solche Therapien und ihre Geeignetheit für unterschiedliche Neoplasien sind zu finden in Cancer Principles and Practice of Oncology, 4. Ausgabe, Herausgeber DeVita, V., Hellman, S., und Rosenberg, S., Lippincott Co. (1993).
  • In der vorliegenden Offenbarung ist gezeigt, daß Kryptophycinverbindungen die Mikrotobulusstruktur in kultivierten Zellen potent aufbricht. Zusätzlich, und im Gegensatz zu den Vinca-Alkaloiden, scheinen Kryptophycinverbindungen ein schlechtes Substrat für die Arzneistoffabflußpumpe P-Glykoprotein zu sein. Kryptophycin 1 ist das Hauptcytotoxin im Blaugrünalgen(Cyanobacterien)-Nostoc-sp.-Stamm, der mit GSV 224 bezeichnet ist, und zeigt herausragende Aktivität gegen Tumore, die in Mäuse implantiert worden sind. Dieses zyklische Didepsipeptid ist zuvor aus Nostoc sp. ATCC-Zugangsnummer 53789 als ein Antipilzmittel isoliert worden und seine grobe Struktur wurde zuvor bestimmt. Die relative und absolute Stereochemie dieses potentiell wichtigen Arzneistoffes ist nun unter Verwendung einer Kombination chemischer und spektraler Techniken bestimmt worden. Vierundzwanzig weitere Kryptophycinverbindungen, Kryptophycine 2-7, 16-19, 21, 23, 24, 26, 28-31, 40, 43, 45, 49, 50 und 54, sind ebenfalls aus GSV 224 isoliert und ihre Gesamtstrukturen und Zytotoxizitäten bestimmt worden. Mehrere Derivate und Abbauprodukte sind beschrieben, sowohl chemisch als auch pharmakologisch. Die folgenden Beispiele dienen dazu, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, und sollen nicht als den Schutzumfang derselben beschränkend angesehen werden.
  • Experimenteller Abschnitt
  • In der experimentellen Offenbarung, die folgt, sind alle Gewichte in Gramm (g), Milligramm (mg), Mikrogramm (μg), Nanogramm (ng), Pikogramm (pg), Molen (mol) oder Millimolen (mmol) angegeben, alle Konzentrationen sind als Volumenprozent (%), molar (M), millimolar (mM), mikromolar (μM), nanomolar (nM), pikomolar (pM) oder normal (N) angegeben, alle Volumina sind angegeben in Litern (1), Millilitern (ml) oder Mikrolitern (μl) und lineare Messungen in Millimetern (mm), sofern nicht anders angegeben.
  • Die folgenden Beispiele belegen die Isolation und Synthese von Kryptophycinverbindungen sowie ihre Verwendung als therapeutische Mittel gemäß der Erfindung.
  • Beispiel 1 Analyse der Mikrotubulusdepolymerisierungsaktivität von Kryptophycin
  • Materialien
  • Vinblastin, Cytochalasin B, Tetramethylrhodaminisothiocyanat(TRITC)-Phalloidin, Sulforhodamin B (SRB) und Antikörper gegen β-Tubulin und Vimentin wurden von der Sigma Chemical Company bezogen. Basal Medium Eagle, das Earle-Salze enthielt (BME), stammte von Gibco und fötales Rinderserum (FBS) wurde von Hyclone Laboratories bezogen.
  • Zelllinien
  • Die Jurkat-T-Zell-Leukämielinie und A-10-Rattenaortaglattmuskelzellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten und wurden in BME kultiviert, das 10% FBS und 50 μg/ml Gentamycinsulfat enthielt. Menschliche Eierstockkarzinomzellen (SKOV3) und eine Unterlinie, die auf Resistenz gegen Vinblastin selektiert worden ist (SKVLB1), waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Victor Ling vom Ontario Cancer Institute. Beide Zelllinien wurden in BME gehalten, das 10% FBS und 50 μg/ml Gentamycinsulfat enthielt. Vinblastin wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml zu SKVLB1-Zellen 24 Stunden nach Durchgang zugegeben, um den Selektionsdruck für P-Glykoprotein überexprimierende Zellen aufrechtzuerhalten.
  • Zellproliferations- und Zyklusstopptests
  • Zellproliferationstests wurden durchgeführt, wie beschrieben von Skehan et al.11. Für Jurkat-Zellen wurden Kulturen mit den angegebenen Arzneistoffen, wie beschrieben in Skehan11, behandelt und Gesamtzellzahlen wurden durch Auszählen der Zellen in einem Hämazytometer bestimmt. Der Prozentanteil von Zellen in Mitose wurde durch Anfärben mit 0,4% Giemsa in PBS, gefolgt von drei schnellen Waschungen mit PBS, bestimmt. Wenigstens 1.000 Zellen pro Behandlung wurden auf das Vorhandensein von Mitosefiguren bewertet und der Mitoseindex wurde als das Verhältnis von Zellen mit Mitosefiguren zur Gesamtzahl der gezählten Zellen berechnet.
  • Immunfluoreszenztests
  • A-10-Zellen wurden bis nahe Konfluenz auf Glasdeckgläschen in BME/10% FBS gezogen. Verbindungen in PBS wurden bis zu den angegebenen Endkonzentrationen zugegeben und Zellen wurden für weitere 24 Stunden inkubiert. Für das Anfärben der Mikrotubuli und Intermediärfilamente wurden die Zellen mit kaltem Methanol fixiert und mit PBS, das 10% Kalbsserum enthielt, inkubiert, um nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren. Zellen wurden dann bei 37°C für 60 min mit entweder monoklonalem Anti-β-Tubulin oder mit monoklonalem Anti-Vimentin bei vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen inkubiert. Gebundene primäre Antikörper wurden anschließend durch eine 45-minütige Inkubation mit Fluorescein-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG visualiert. Deckgläschen wurden auf Mikroskop-Objektträger gelegt und die Fluoreszenzmuster wurden untersucht und unter Verwendung eines Zeiss Photomicroscope III, ausgestattet mit Epifluoreszenz-Optiken für Fluorescein, fotografiert. Für das Anfärben der Mikrofilamente wurden Zellen mit 3% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,2% Triton X-100 permeabilisiert und mit Natriumborhydrid (1 mg/ml) chemisch reduziert. PBS, das 100 nM TRITC-Phalloidin enthielt, wurde anschließend zugegeben, und man ließ die Mischung für 45 min bei 37°C inkubieren. Die Zellen wurden schnell dreimal mit PBS gewaschen, bevor die Deckgläschen aufgelegt wurden, und sofort fotografiert, wie oben beschrieben.
  • Wirkungen von Kryptophycinen und Vinblastin auf Jurkat-Zellproliferation und -Zellzyklus
  • Dosis-Reaktions-Kurven für die Wirkungen von Kryptophycinverbindungen und Vinblastin auf Zellproliferation und der Prozentanteil von Zellen in Mitose sind in den 2A bzw. 2B angegeben. Weniger als 3% der unbehandelten Zellen zeigten Mitosefiguren. Sowohl die Kryptophycinverbindungen als auch Vinblastin bewirkten dosisabhängige Anstiege des Prozentanteils Zellen, die in Mitose beobachtet wurden. Der Anstieg des Mitoseindex war eng korreliert mit Abnahmen der Zellproliferation, d.h. die Konzentrationen sowohl der Kryptophycinverbindungen als auch von Vinblastin, die bewirken, daß 50% der Zellen in Mitose akkumulierten, waren praktisch dieselbe wie die Konzentration, die Zellproliferation um 50% hemmte. Die IC50 für die Kryptophycinverbindungen und Vinblastin für diese Wirkungen betrugen 0,2 bzw. 8 nM.
  • Wirkungen von Cytochalasin B, Vinblastin und Kryptophycinen auf das Cytoskelett
  • Aortaglattmuskel(A-10)-Zellen wurden auf Glas-Deckgläschen gezüchtet und mit PBS, 2 μm Cytochalasin B, 100 nM Vinblastin oder 10 nM Kryptophycinverbindungen behandelt. Nach 24 Stunden wurden die Mikrotobuli und Vimentin-Intermediärfilamente durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert und die Mikrofilamente unter Verwendung von TRITC-Phalloidin angefärbt. Die morphologischen Wirkungen jedes Arzneistoffs wurden untersucht. Unbehandelte Zellen zeigten umfangreiche Mikrotubulusnetzwerke, vollständig mit perinukleären Mikrotubulus-Organisationszentren. Vimentin-Intermediärfilamente waren ebenfalls gleichmäßig im gesamten Cytoplasma verteilt, während Bündel aus Mikrofilamenten entlang der Hauptachse der Zelle konzentriert waren. Cytochalasin B bewirkte vollständige Depolymerisierung von Mikrofilamenten zusammen mit der Akkumulation parakristalliner Reste. Diese Verbindung beeinflußte die Verteilung von entweder Mikrotobuli oder Intermediärfilamente nicht. Sowohl Vinblastin als auch die Kryptophycinverbindung bewirkten merkbare Abreicherung von Mikrotubuli. Keine der beiden Verbindungen beeinflußte die Mikrofilamentorganisation; Vimentin-Intermediärfilamente kollabierten jedoch, wobei sie konzentrische Ringe um die Zellkerne bildeten, die mit entweder Vinblastin oder einer Kryptophycinverbindung behandelt worden waren.
  • Wirkungen von Kryptophycinen und Vinblastin auf Taxol-stabilisierte Mikrotubuli
  • A-10-Zellen wurden für 3 Stunden mit 0 oder 10 μM Taxol vor der Zugabe von PBS, 100 nM Vinblastin oder 10 nM Kryptophycinverbindung behandelt. Nach 24 Stunden wurde die Mikrotubulusorganisation mit Immunfluoreszenz untersucht, wie oben beschrieben. Verglichen mit denjenigen in Kontrollzellen, waren die Mikrotubuli in mit Taxol behandelten Zellen stark gebündelt, insbesondere in den Zellpolregionen. Wie zuvor bewirkte Vinblastin vollständige Depolymerisierung der Mikrotubuli in nicht-vorbehandelten Zellen. Vorbehandlung mit Taxol verhinderte jedoch die Mikrotubulusdepolymerisation in Reaktion auf Vinblastin. In ähnlicher Weise stabilisierte Taxol-Vorbehandlung Mikrotubuli vollständig gegen Kryptophycin-induzierte Depolymerisation.
  • Reversibilität der Mikrotubulusdepolymerisation durch Vinblastin und Kryptophycin
  • A-10-Zellen wurden mit entweder 100 nM Vinblastin oder 10 nM Kryptophycinen für 24 Std. behandelt, was zu vollständiger Mikrotubulusdepolymerisation führte. Die Zellen wurden dann gewaschen und in arzneistofffreiem Medium für Zeiträume von 1 Stunde oder 24 Stunden inkubiert. Die Mikrotubuli repolymerisierten schnell nach der Entfernung von Vinblastin, wobei signifikante Gehalte von Mikrotubuli nach 1 Stunde und vollständige morphologische Wiederherstellung nach 24 Stunden gezeigt wurde. Im Gegensatz dazu tauchten Mikrotubuli in Zellen, die mit Kryptophycinverbindungen behandelt worden waren, nach entweder 1 Stunde oder 24 Stunden nach Entfernung der Verbindung nicht wieder auf.
  • Reversibilität von Kryptophycin-, Vinblastin- und Taxol-Hemmung der Zellproliferation
  • SKOV3-Zellen wurden für 24 Stunden mit zuvor bestimmten IC50-Dosen von Vinblastin, Kryptophycinverbindungen oder Taxol behandelt (d.h. Werten, die in Experimenten bestimmt sind, zusammengefaßt in Tabelle 5). Während dieser Zeit stieg die Zelldichte von 0,4 auf 0,5 ± 0,05 Extinktionseinheiten (3), was einen 25% Anstieg der Zellzahl für alle drei Behandlungen zeigte. Entfernung der Arzneistoffe führte zu schnellem Wachstum der mit Vinblastin behandelten Zellen, so daß ihre Zahlen in 24 Stunden um ungefähr das Dreifache anstiegen. Im Gegensatz dazu blieben Zellen, die mit Kryptophycinverbindungen oder Taxol behandelt worden waren, gestoppt, wobei sie in den 24 Stunden im Anschluß an die Entfernung des Arzneistoffs nur um das etwa 0,2- bis 0,4-fache anstiegen. Die proliferative Kapazität von Kryptophycinen oder mit Taxol behandelten Zellen wurde anschließend wieder hergestellt, da die Zellen sich dann in den nächsten 24 Stunden verdoppelten.
  • Wirkungen von Kombinationen von Vinblastin und Kryptophycinen auf die Zellproliferation
  • SKOV3-Zellen wurden mit Kombinationen von Kryptophycinen und Vinblastin für 48 Stunden behandelt. Die Prozentanteile an überlebenden Zellen wurden dann bestimmt und die IC50s für jede Kombination wurden berechnet. Die Wirkungen dieser kombinatorischen Behandlungen sowie von Einzelarzneistoffbehandlungen sind als ein Isobologramm dargestellt (4). Die IC50 für Kombinationen von Kryptophycinverbindungen und Vinblastin fallen sehr dicht an die Additivitätslinie, was zeigt, daß diese zwei Arzneistoffe nur additive Hemmungen der Zellproliferation induzieren.
  • Toxizität von Kryptophycinen Vinblastin und Taxol gegenüber SKOV3- und SKVLB1-Zellen
  • SKVLB1-Zellen sind wegen Ihrer Überexpression von P-Glykoprotein resistent gegen Naturprodukt-Antikrebsmitte112. Die Fähigkeiten von Taxol, Vinblastin und Kryptophycinverbindungen, das Wachstum von SKOV3- und SKVLB1-Zellen zu hemmen, sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Taxol bewirkte dosisabhängige Hemmung der Proliferation beider Zelllinien mit IC50s für SKOV3- und SKVLB1-Zellen von 1 bzw. 8.000 nM. Vinblastin hemmte ebenfalls das Wachstum beider Zelllinien, mit IC50s von 0,35 bzw. 4.200 nM für SKOV3- bzw. SKVLB1-Zellen. Kryptophycine zeigten IC50s von 7 bzw. 600 pm für SKOV3- bzw. SKVLB1-Zellen. Die resultierenden Resistenzfaktoren für SKVLB1-Zellen gegenüber den Verbindungen werden berechnet wie die IC50s für SKVLB1. IC50s für SKOV3-Zellen sind ebenfalls in Tabelle 5 angegeben.
  • Somit ist gezeigt worden, daß die vorliegende Erfindung neuartige Kryptophycinverbindungen bereitstellt, sowie zuvor offenbarte Kryptophycinverbindungen, die potente Inhibitoren der Zellproliferation sind, wobei sie durch Aufbrechen des Mikrotubulinetzwerkes und Hemmung der Mitose wirken. Die Kryptophycinverbindungen brechen die Mikrotubulusorganisation auf und somit normale Zellfunktionen, einschließlich denjenigen der Mitose.
  • Klassische Antimikrotubulusmittel, wie etwa Colchicin und Vinca-Alkaloide, stoppen die Zellteilung bei Mitose. Es schien angemessen, die Wirkung eines dieser Mittel auf die Zellproliferation mit den Kryptophycinverbindungen zu vergleichen. Für diesen Zweck wurde das Vinca-Alkaloid Vinblastin als repräsentativ für die klassischen Antimikrotubulusmittel ausgewählt. Demgemäß wurde die Wirkung von Kryptophycinverbindungen und Vinblastin auf die Proliferation und Zellzyklusprogression der Jurkat-T-Zell-Leukämie-Zelllinie verglichen. Beide Verbindungen bewirkten parallele dosisabhängige Hemmungen der Zellproliferation und Akkumulation von Zellen in Mitose.
  • Da Antimitosewirkungen üblicherweise durch Aufbrechen von Mikrotubuli in den Mitosespindeln vermittelt werden, wurden die Wirkungen von Kryptophycinverbindungen auf die Cytoskelettstrukturen durch Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Immunfluoreszenzanfärbung von Zellen, die mit entweder einer Kryptophycinverbindung oder Vinblastin behandelt worden war, zeigte klar, daß beide Verbindungen den vollständigen Verlust von Mikrotubuli bewirkten. Ähnliche Studien mit SKOV3-Zellen zeigen, daß die Antimikrotubuliwirkungen von Kryptophycinverbindungen nicht einzig bei der Glattmuskelzelllinie auftreten. Keiner der beiden Arzneistoffe beeinflußte die Gehalte oder Verteilung von Mikrofilamentbündeln, wie leicht durch Cytochalasin B induziert, was darauf hinweist, daß der Verlust an Mikrotubuli nicht auf einem nicht-spezifischen Mechanismus beruhen könnte, z.B. Aktivierung von Proteasen oder Verlust von Energieladung. Sowohl Vinblastin als auch Kryptophycinverbindungen fördern auch merkbaren Kollaps von Vimentin-Intermediärfilamenten, so daß sich hell-färbende Ringe um den Zellkern gebildet wurden.
  • Das Entfernen von Vinblastin aus dem Kulturmedium führte zu schneller Repolymerisation von Mikrotubuli. Im Gegensatz blieben Zellen, die mit Kryptophycinverbindungen behandelt worden waren, abgereichert an Mikrotubuli für wenigstens 24 Stunden, nachdem die Verbindung aus den Kulturen entfernt war.
  • Die vorliegende Erfindung belegt, daß Kryptophycinverbindungen die von P-kGlykoproteinvermittelte mehrfache Arzneistoffresistenz umgehen. Transport durch P-Glykoprotein beschränkt die Fähigkeit von Naturprodukt-Antikrebsmitteln, das Wachstum von Tumorzellen mit erworbener oder de-novo-Arzneistoffresistenz zu hemmen13-15. Vinca-Alkaloide, die sehr nützlich im anfänglichen Ablauf der Chemotherapie sind, sind extrem gute Substrate für Transport durch P-Glykoprotein und sind so von sehr begrenztem Nutzen gegen von P-Glykoprotein vermittelten MDR-Tumoren. Daher sollte die Identifizierung von Mitteln, die mehrfache Arzneistoffresistenz überwinden, zur Entwicklung von nützlichen und neuartigen Antikrebsmitteln führen. Die Kryptophycinverbindungen der vorliegenden Erfindung scheinen solche Mittel zu sein, da sie schlechte Substrate für durch P-Glykoprotein vermittelten Transport sind. Diese Tatsache wird widergespiegelt im niedrigen Zellresistenzfaktor für Kryptophycinverbindungen, verglichen mit Vinblastin, Taxol und anderen Naturprodukt-Arzneistoffen.
  • Totalsynthese von Kryptophycinen
  • Die Strukturen der neuartigen synthetisierten Verbindungen, nämlich Kryptophycine 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58 und 61, wurden in einer direkten An und Weise bestätigt, unter Verwendung einer Methodik, die den Fachleuten gut bekannt ist. Massenspektrumdaten waren mit den Molekülzusammensetzungen konsistent. Protonen- und Kohlenstoff-NMR-Daten waren sehr ähnlich zu denjenigen von Kryptophycin 1 und verwandten natürlich vorkommenden und halbsynthetischen Analogen.
  • Die folgenden Beispiele zeigen die Totalsynthese von Kryptophycinverbindungen sowie ihre Verwendung als therapeutische Mittel gemäß der Erfindung.
  • Beispiel 2 Synthese von Kryptophycin 51
  • S-trans-3-Penten-2-ol (A)
  • Eine Mischung aus razemischem trans-3-Penten-2-ol (933 mg, 11 mmol), Trifluorethyllaurat (4,14 g, 15 mmol) und Schweineprankreas-Lipase (PPL, 2,0 g) in 25 ml wasserfreiem Diethylether wurde für 80 Stunden gerührt. Die PPL wurde dann abfiltriert und mit Ether dreimal gewaschen. Das Etherfiltrat wurde eingedampft und das klebrige Öl wurde dann einer Vakuumdestillation mit kurzem Weg unterzogen. Das S-trans-3-Penten-2-ol (A) wurde in einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten Falle kondensiert (383 mg). 1H-NMR (CDCl3) δ 5,57 (4-H; dq, -15,3/6,0), 5,47 (3-H; ddd, -15,3/6,4/1,2), 4,19 (2-H; 1:4:6:4:1-Pentuplett, 6,4), 2,24 (OH; bs), 1,63 (5-H3; d, 6,0), 1,19 (1-H3; d, 6,4). 13C-NMR (CDCl3) δ 135,5 (3), 125,5 (4), 68,7 (2), 23,3 (5), 17,5 (1).
  • S-trans-2-(2-Propinyloxy)-3-penten (B)
  • Zu einer kräftig gerührten Mischung aus S-Enantiomer A (628 mg, 7,3 mmol), Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (138 mg, 0,41 mmol) und 40% NaOH in Wasser (5 ml) bei 0°C wurde tropfenweise Propargylchlorid (767 mg, 10,3 mmol, 745 μl) zugegeben. Kräftiges Rühren wurde über Nacht fortgesetzt, woraufhin die Mischung mit HCl bei 0°C neutralisiert und der Propargylether in Penten hinein extrahiert wurde. Der Extrakt wurde eingedampft und der Propargylether wurde auf einer kurzen Silicagelsäule (2% Diethylether/Pentan) gereinigt, um 778 mg Propargylether B zu ergeben. [α]D -118,9° (c 2,0, CHCl3); 1H-NMR (CDCl3) δ 5,70 (4-H; dq, 18,5/6,5), 5,31 (3-H; ddd, 18,5/7,2/1,4), 4,15 (1'-H; dd, -15,6/2,1), 4,01 (1'-H; dd, -15,6/2,1), 4,01 (2-H; m), 2,38 (3'-H; t, 2,1), 1,73 (5-H; dd, 6,5/1,4), 1,25 (1H; d, 6,3).
  • (3R,4R)-4-Methylhept-5(E)-en-1-in-3-ol (C)
  • Ein Aliquot von Butyllithium-Hexanlösung (2,5 M, 5,1 ml, 12,8 mmol) wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand auf -90°C abgekühlt. Eine Lösung von Propargylether B (454 mg, 3,66 mmol) in 10 ml THF wurde langsam zugegeben. Nachdem man die Temperatur über Nacht auf Raumtemperatur hatte ansteigen lassen, wurde die Reaktionsmischung mit NH4Cl-Lösung gelöscht. Dreimalige Extraktion mit Ether, Eindampfen des getrockneten Extraktes und Reinigung des Rückstandes auf einer Silicagelsäule (5% EtOAC/Hexan) ergab 322 mg Alkohol C (71 % Ausbeute). [α]D +32,9° (c 3,0, CHCl3); IR (NaCl) νmax 3306, 2968, 1455, 1379, 1029, 975 cm-1. 1H-NMR (CDCl3) δ 5,61 (6-H; dq, 15,3/6,3), 5,38 (5-H; dd, 15,3/7,7), 4,13 (3-H; bs), 2,45 (1-H; d, 1,5), 2,38 (4-H; m), 2,20 (OH; bd, 3,3), 1,68 (7-H; d, 6,2), 1,09 (4-CH3; d, 6,8). 13C-NMR (CDCl3) δ 131,5 (5), 127,9 (6), 83,5 (2), 73,6 (1), 66,2 (3), 43,4 (4), 18,1 (7), 15,7 (4-Me).
  • (3S, 4R)-3-tert-Butyldimethylsilyloxy-4-methypt-5E-enal (D)
  • Zu einer gerührten Lösung von Alkohol C (248 mg, 2 mmol) und Imidazol (340 mg, 5 mmol) in 3 ml trockenem DMF wurde tert-Butyldimethylsilylchlorid (452 mg, 3 mmol) zugegeben. Nach Rühren der Mischung über Nacht wurden 10 ml 10% NaOH zugegeben, um das überschüssige tert-Butyldimethylsilylchlorid zu zerstören. Das Produkt wurde in Ether hinein extrahiert und der Extrakt nacheinander mit Wasser, 0,5 N HCl und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Reinigung des Rückstandes durch Chromatographie auf Silicagel mit Hexan ergab 457 mg (3R,4R)-3-tert-Butyldimethylsilyloxy-4-methylhept-5-(E)-en-1-in (96% Ausbeute). 1H-NMR (CDCl3) δ 5,50 (6-H; dq, 15,3/6,1), 5,38 (5-H; dd, 15,3/7,5), 4,16 (3-H; dd, 5,7/1,7), 2,37 (1-H; d, 1,7), 2,35 (4-H; m), 1,68 (7-H; d, 6,1), 1,07 (4-Me; d, 6,8), 0,90 (CMe3; s), 0,12 (SiMe; s), 0,09 (SiMe; s).
  • Unter Verwendung desselben Verfahrens wurde das entsprechende TBDPS-Derivat, (3R,4R)-3-tert-Butyldiphenylsilyloxy-4-methylhept-5(E)-en-1-in, in 92% Ausbeute gebildet. [α]D +32,9° (c 3,0, CHCl3). 1H-NMR (CDCl3) δ 7,72/7,38 (2Ph-H5), 5,32 (6-H; m), 5,25 (5-H; dd, 16,2/7,3), 4,29 (3-H; dd, 5,2/2,0), 2,38 (4-H; m), 2,33 (1-H; d, 2,0), 1,64 (7-H; d, 5,3), 1,11 (4-Me; d, 6,9), 1,06 (CMe3), 13C-NMR (CDCl3) δ 136,1/135,9/133,6/129,7/129,6/127,5/127,3 (Ph), 132,4 (5), 126,1 (6), 83,3 (2), 73,5 (1), 68,0 (3), 43,6 (4), 26,9 (CMe3), 19,4(CMe3), 18,0 (7), 14,7 (4-Me).
  • 2-Methylbuten (1,15 ml 2M Lösung in THF, 2,3 mmol) wurde zu 1,1 ml BH3; THF-Lösung (1M, 1,1 mmol) bei -25°C zugegeben und die Mischung wurde in einem Eisbad für 2 Stunden gerührt. Die Temperatur wurde auf -50°C abgekühlt und eine Lösung des TBS-Derivats (238 mg, 1 mmol) in 1 ml THF wurde auf einmal zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmen und für 1 Stunde verbleiben. Dann wurden 2,2 M KH2PO4/K2HPO4-Lösung (4,8 ml) und 30% H2O2 (0,8 ml) bei 0°C zugegeben. Eine Stunde später wurde das THF verdampft und der Rückstand wurde in Ether hinein extrahiert. Der getrocknete Etherextrakt wurde eingedampft und der Rückstand auf Silicagel (1% EtOAc/Hexan) chromatographiert, um 194 mg Aldehyd D zu ergeben (76% Ausbeute). 1H-NMR (CDCl3) δ 9,78 (1-H; t, 2,3), 5,46 (6-H; dq, 15,3/6,1), 5,34 (5-H; dd, 15,3/7,5), 4,13(3-H; m), 2,47 (2-H; m), 2,31 (4-H; m), 1,66 (7-H; br d, 6,1), 0,99 (4-Me; d, 6,8), 0,87 (CMe3; s), 0,07 (SiMe; s), 0.04 (SiMe; s).
  • Das tert-Butyldiphenylsilylether(TBDPS)-Derivat des Aldehyds wurde in 83% Ausbeute gebildet. 1H-NMR (CDCl3) δ 9,52 (1-H; t, 2,4), 7,69/7,40 (2Ph-H5), 5,28 (6-H; m), 5,22 (5-H; dd; 16,2/6,2), 4,19 (3-H; m), 2,42 (2-H; m), 2,29 (4-H; m), 1,60 (7-H; d, 5,4), 1,07 (CMe3), 1,02 (4-Me; d, 6,9). 13C-NMR (CDCl3) δ 202,0 (1), 136,1/133,6/133,3/130,2/129,7/127,7/ 127,6 (Ph), 132,3 (5), 126,2 (6), 72,8 (3), 47,6 (2), 42,2 (4), 27,1 (CMe3), 19,6 (CMe3), 18,3 (7), 14,9 (4-Me).
  • Methyl-(5S,6R)-5-tert-butyldimethylsilyloxy-3-methyl-7-oxonona-2E,7E-dienoat (E)
  • Zu einer gerührten Lösung von Aldehyd D (0,74 g, 2,9 mmol) und Trimethylphosphonoacetat (632 mg, 3,5 mmol) in 5 ml THF, abgekühlt auf -78°C, wurde Tetramethylguanidin (435 μl, 3,5 mmol) zugegeben. Nach 30 Minuten wurde das Kühlbad entfernt und die Mischung wurde für weitere 4 Stunden gerührt. Die Mischung wurde mit 1 N HCl neutralisiert und das Produkt wurde in Ether hinein extrahiert. Eindampfen des getrockneten Etherextraktes ließ einen Rückstand zurück, der auf Silicagel (5% EtOAc/Hexan) chromatographiert wurde, um 0,814 g von E (90% Ausbeute) zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3) δ 6,93 (3-H; dt, 15,6/7,8), 5,62 (2-H; dd, 15,6/1,2), 5,37 (8-H, m), 5,37 (7-H, m), 3,71 (OCH3, s), 3,61 (5-H, m), 2,29 (4-H2, m), 2,22 (6-H, m), 1,66 (9-H3; br d, 6,1), 0,99 (6-Me; d, 6,8), 0,88 (CMe3; s), 0,03 (SiMe; s), 0,01 (SiMe; s).
  • Das tert-Butyldiphenylsilylether(TBDPS)-Derivat des Aldehyds wurde in 90% Ausbeute gebildet. 1H-NMR (CDCl3) δ 7,68/7,38 (2Ph-H5), 6,75 (3-H; dt, 15,6/7,4), 5,62 (2-H; d, 15,6), 5,34 (8-H, m), 5,29 (7-H, m), 3,70 (5-H, m), 3,68 (OCH3, s), 2,28 (4-H2, m), 2,20 (6-H, m), 1,62 (9-H3; d, 5,3), 1,08 (CMe3), 0,99 (6-Me; d, 6,9). 13C-NMR (CDCl3) δ 166,7 (1), 146,4 (3), 136,0/134,2/133,8/129,62/129,56/127,5/127,4 (Ph), 132,5 (7), 125,8 (8), 122,6 (2), 76,2 (5), 51,3 (OCH3), 41,7 (6), 36,8 (4), 27,0 (CMe3, 19,4 (CMe3), 18,1 (9), 14,7 (6-Me).
  • Methyl-(5S, 6R)-5-tert-butyldimethylsilyloxy-6-methyl-7-oxohept-2(E)-enoat (F)
  • Ozon wurde durch eine Lösung von Methylester E (328 mg, 1,0 mmol) und 97 μl Pyridin in 15 ml CH2Cl2 bei -78°C hindurchgeleitet und das Fortschreiten der Ozonolyse wurde durch TLC-Analyse überwacht. Nachdem der Methylester verbraucht worden war, wurden etwa 500 mg Zinkstaub und 1 ml Eisessig zugegeben. Die Temperatur wurde langsam auf 25°C angehoben. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat wurde nacheinander mit gesättigter CuSO4- und NaHCO3-Lösung gewaschen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das rohe Aldehyd F (249 mg, 83%) im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. 1H- NMR (CDCl3) δ 9,96 (7-H; t, 2,3), 6,96 (3-H; dt, 15,7/7,6), 5,90 (2-H; dd, 15,7/0,7), 4,05 (5-H; m), 3,74 (OMe; s), 2,51 (6-H; m), 2,45 (4-H2; m), 1,09 (6-Me; d, 6,9), 0,88 (CMe3; s), 0,04 (SiMe; s), 0,03 (SiMe; s).
  • Methyl-(5S, 6R)-5-tert-butyldimethylsilyoxy-6-methyl-8-phenylocta-2E,7E-dienoat (G)
  • Zu einer gerührten Lösung von Aldehyd F (25,0 mg, 0,08 mmol) in 1,5 ml THF bei -78°C wurden 0,80 ml einer kalten (-78°C) Mischung aus Benzotriphenylphosphoniumchlorid (268 mg, 0,69 mmol, in 6,9 ml THF) und n-Butyllithium (280 μl, 2,5 M in Hexan) zugegeben. Nach 15 min wurde das kalte Bad entfernt und Rühren wurde für 2 h fortgesetzt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Aluminiumchloridlösung gelöscht und das THF wurde verdampft. Das Konzentrat wurde zweimal mit Hexan extrahiert und der kombinierte Extrakt wurde mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das restliche Öl, eine 5:1-Mischung des E- und Z-Isomers, wurde in 1,5 ml Benzol, das Thiophenol (0,02 M) und 1,1'-Azobis(cyclohexancarbonitril) (VAZO, 0,006 M) enthielt, gelöst und die Mischung wurde für 5 h unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen auf RT wurde Hexan (15 ml) zugegeben und die organische Lösung wurde nacheinander mit 10% NaOH und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingedampft. Chromatographie des Rückstandes auf Silicagel (2% EtOAc/Hexan) führte zu 24 mg (80%) von G. [α]D +68,2° (c 1,5, CHCl3); EIMS m/z 374 (<1%; M+), 359 (1; M+-CH3), 317 (10; M+-Bu), 275 (10), 243, (73), 143 (20), 115 (10), 97 (64), 89 (31), 73 (100); HREIMS m/z 374,2232 (C22H34O3Si, Δ + 4,5 mmu), 359,2031 (C2H31O3Si, Δ + 1,1 mmu), 317,1579 (C18H25O3Si, Δ -0,6 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 206 (33500), 252 (20100) nm; IR νmax 2952, 2855, 1725, 1657, 1435, 1257, 1168, 1097, 970, 836, 775 cm-1; 1H-NMR δ 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,96 (3-H; ddd, 15,6/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,84 (2-H; d, 15,6), 3,75 (5-H; ddd, 10,2/6,0/4,2), 3,72 (OMe; s), 2,44 (6-H; m), 2,36 (4-H2; m), 1,10 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe3; s), 0,06 (Si-Me; s), 0,05 (Si-Me; s); 13C-NMR δ 166,8 (1), 146,4 (3), 137,6 (Ph 1'), 131,9 (8), 130,4 (7), 128,5 (Ph 3'/5'), 127,0 (Ph 4'), 126,0 (Ph 2'/6'), 122,9 (2), 75,0 (5), 51,4 (OMe), 42,8 (6), 37,6 (4), 25,9 (Si-CMe3); 18,1 (Si-CMe3), 16,2 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me). Berechnet für C22H34O3Si: C, 70,52; H, 9,17. Gefunden: C, 70,72; H, 9,42.
  • (5S,6R)-5-tert-Butyldimethylsilyloxy-6-methyl-8-phenylocta-2E,7E-diensäure (H)
  • Zu einer Lösung von Ester G (159 mg, 0,43 mmol) in 7 ml Aceton wurden 5 ml 1 N wäßriges LiOH zugegeben. Die Mischung wurde bei 25°C für 3 h gerührt, mit 20 ml Et2O verdünnt und auf ≈ pH 4 mit 1 N HCl angesäuert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 20 ml-Portionen Salzlösung und Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingedampft. Chromatographie des restlichen Öls auf Silicagel mit 40% EtOAc in Hexan, das 0,5% AcOH enthielt, führte zu reiner Säure H als einem blaßgelben mobilen Öl (145 mg, 95% Ausbeute): [α]D +87,0° (c 1,4, CHCl3); EIMS m/z; 343 (1; M+-OH), 303 (5), 275 (9), 257 (4), 229 (62), 213 (16), 171 (22), 143 (37), 131 (16), 115 (23), 97 (100), 91 (44); HREIMS m/z 343,2107 (C21H31O2Si, Δ -1,3mmu), 229,1220 (C15H17O2, Δ +0,9mmu); UV λmax (ε) 206 (24500), 252 (15600) nm; IR νmax 3300-2800 (br), 2956, 2856, 1697, 1651, 1419, 1256, 1097, 836, 693 cm -1; 1H-NMR δ 10,4 (CO2H; bs, W1/2 ≈ 100), 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 7,09 (3-H; ddd, 15,6/7,6/7,6), 6,39 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,85 (2-H; d, 15,6), 3,78 (5-H; ddd, 6,0/6,0/4,2), 2,46 (6-H; m), 2,40 (4-H2; m), 1,12 (6-Me; d, 6,9), 0,92 (Si-CMe3; s), 0,07 (SiMe2; s); 13C-NMR δ 171,6 (1), 149,1 (3), 137,5 (Ph 1'), 131,8 (8), 130,5 (7), 128,5 (Ph 3'/5'), 127,1 (Ph 4'), 126,1 (Ph 2'/6'), 122,7 (2), 74,9 (5), 42,9 (6), 37,6 (4), 25,8 (Si-CMe3), 18,1 (Si-CMe3), 16,1 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).
  • 2,2,2-Trichlorethylester von 3-(3-Chlor-4-methoxyphenyl)-D-alanin (I)
  • Eine Probe des D-Chlortyrosin-BOC-Derivats (160 mg, 0,35 mmol) wurde in 3 ml reiner Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur für 1 h stehengelassen. Entfernen des überschüssigen Reagens unter verringertem Druck ergab das gewünschte Amin I als das Trifluoracetatsalz (165 mg, 100% Ausbeute), [α]D +1,7° (c 5,2, CHCl3): IR νmax 3400-2500 (br), 1760, 1680, 1500, 1200, 1130, 1070, 805, 710 cm-1; 1H-NMR δ 8,07 (NH2; br m, W1/2 45), 7,27 (5-H; s), 7,12 (9-H; d, 8,1), 6,88 (8-H; d, 8,1), 4,86/4,67 (CH2CCl3; AB q, -12,0), 4,41 (2-H; bs, W1/2 ≈ 20), 3,86 (OMe; s), 3,33 (3-H; dd, -14,4/3,6), 3,22 (3-H'; dd; -14,4/6,6); 13C-NMR δ 167,6 (1), 155,0 (7), 130,9 (5), 128,8 (9), 125,4 (4), 123,1 (6), 112,7 (8), 93,4 (CCl3), 75,3 (CH2CCl3), 56,1 (OMe), 54,2 (2), 34,9 (3).
  • Verbindung J
  • Zu einer gerührten Lösung von H (25 mg, 0,07 mmol) in 3 ml wasserfreiem DMF unter Argon wurden nacheinander Pentafluordiphenylphosphinat (FDPP, 32 mg, 0,08 mmol), Trifluoracetatsalz I (35 mg, 0,07 mmol) und Diisopropylethylamin (DIEA, 27 mg, ≈ 36 μl, 0,21 mmol, ≈ 3 Äquiv.) zugegeben. Rühren wurde bei 25°C für 1 h fortgesetzt und dann wurde die Reaktionsmischung mit 20 ml Et2O extrahiert. Der Etherextrakt wurde mit 10 ml 1 N HCl gewaschen, gefolgt von 10 ml gesättigter NaHCO3, 20 ml Salzlösung und 20 ml Wasser, getrocknet (MgSO4) und eingedampft. Das restliche blaßgelbe Öl wurde Chromatographie auf Silicagel (15% EtOAc in Hexan) unterworfen, um J als ein farbloses Öl zu ergeben (32 mg, 65% Ausbeute): [α]D +11,8° (c 1,2, CHCl3); EIMS m/z; 644/646/648/650 (7/8/6/3; M+-Bu), 570/572/574 (46/100/21), 536/538 (18/15), 394/396 (67/29), 275 (20), 155/157 (29/9); HREIMS m/z 644,0981 (C29H34Cl4NO5Si, Δ -2,13mmu); UV λmax (ε) 204 (54900), 230 (23200), 248 (19200), 284 (3500) nm; IR νmax 3290, 2980, 2850, 1760, 1680, 1640, 1505, 1380, 1270, 1169, 990, 720 cm-1; 1H-NMR Einheit A δ 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,87 (3-H; ddd, 15,0/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 16,2), 6,18 (7-H; dd, 16,2/8,1), 5,82 (2-H; d, 15,0), 3,75 (5-H; ddd, 9,9/6,0/4,8), 2,46 (6-H; m), 2,36 (4-H2; m), 1,11 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (SiCMe3; s), 0,07 (SiMe; s), 0,06 (SiMe; s); Einheit B δ 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,1), 6,85 (8-H; d, 8,4), 5,85 (NH; d, 7,8), 5,08 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,81/4,74 (CH2CCl3; AB q, -11,7), 3,87 (OMe; s), 3,22 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,12 (3-H; dd, -14,1/6,0). 13C-NMR Einheit A δ 165,1 (1), 143,0 (3), 137,6 (9), 132,0 (8), 130,4 (7), 128,5 (11/13), 127,0 (12), 126,0 (10/14), 124,7 (2), 75,0 (5), 42,6 (6), 37,6 (4), 25,9 (Si-CMe3), 18,1 (Si-CMe3), 16,5 (6-Me), -4,3 (Si-Me), -4,6 (Si-Me); Einheit B δ 170,1 (1), 154,3 (7), 131,1 (5), 128,5 (4/9), 122,6 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCl3), 74,8 (CH2CCl3), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).
  • (1'R,5S,6R)-N-1'-(Carbo-2'', 2'', 2''-trichlorethoxy)-2'-(3-chlor-4-methoxyphenyl)ethyl-5-tert-butyldimethylsilyloxy-6-methyl-8-phenyl-octa-2E,7E-dienamid (K)
  • Zu einer Lösung von J (50 mg, 0,07 mmol) in 4 ml MeCN wurden 400 μl 50% wäßrige HF zugegeben und die Mischung bei 1h bei 25°C gerührt. Extraktion in 30 ml Et2O hinein, gefolgt von Waschen des Etherextraktes mit 30 ml-Portionen gesättigter NaHCO3, Salzlösung und Wasser, Trocknen (MgSO4) und Eindampfen, ergab Alkohol K als einen farblosen Schaum (40 mg, 95% Ausbeute): [α]D -6,1° (c 1,3, CHCl3); EIMS m/z (rel. Intensität) 587/589/591/593 (M+, <1%), 552/554/556 (1/2/0,5), 456/458/460/462 (1/2/1/0,2), 342/344/346 (7/8/4), 212/214 (15/5), 195/197 (6/2), 155/157 (99/34), 131 (100), 91 (77); HREIMS m/z 587.0721 (C27H29 35Cl4NO5, Δ + 7,8 mmu); UV λmax 204 (56500), 230 (22100), 248 (18100), 284 (3600) nm; IR νmax 3400, 3300, 2980, 1780, 1680, 1640, 1505, 1270, 1180, 1090, 1000, 770 cm-1. 1H-NMR Einheit A δ 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,92 (3-H; ddd, 15,3/7,8/7,5), 6,46 (8-H; d, 15,9), 6,14 (7-H; dd, 15,9/8,4), 5,90 (2-H; d, 15,3), 3,65 (5-H; ddd 7,8/5,6/4,0), 2,39 (6-H/4-H2; bm), 1,78 (OH; bs, W1/2 ≈ 40 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6,9); Einheit B δ 7,18 (5-H; d, 1,8), 7,03 (9-H; dd, 8,4/1,8), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,97 (NH; d, 7,8), 5,06 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,79/4,72 (CH2CCl3; AB q, -12,0), 3,86 (OMe; s), 3,20 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,10 (3-H'; dd, -14,1/6,0). 13C-NMR Einheit A δ 165,3 (1), 142,6 (3), 137,0 (9), 131,7 (8), 131,0 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,1 (10/14), 125,0 (2), 73,8 (5), 43,2 (6), 37,2 (4), 16,8 (6-Me); Einheit B δ 170,2 (1), 154,2 (78), 131,0 (5), 128,4 (9), 128,3 (4), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCl3), 74,7 (CH2CCl3), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).
  • 3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-2 2-dimethylpropansäure (M)
  • Zu einer Lösung von 3-Amino-2,2-dimethylpropan-1-ol (L) (3,0 g, 29 mmol) in 51 ml einer 10% Lösung von Triethylamin in MeOH wurde Di-tert-butyldicarbonat (6,7 g, 31 mmol) zugegeben und die Mischung wurde bei 25°C für 1 h gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in CH2Cl2 (30 ml) gelöst und die Lösung wurde zweimal mit 1 M KHSO4 (pH 2) und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum lieferte 5,8 g (93% Ausbeute) 3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-2,2-dimethylpropan-1-ol als einen weißen Feststoff, der ohne weitere Reinigung direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde (>95% rein nach NMR-Analyse), Schmp. 70,5-71,5°C ; IR νmax 3350, 1685, 1456 cm-1; 1H-NMR δ 4,87 (NH; br s), 3,72 (OH; br s); 3,19 (1-H2; d, 5,1), 2,95 (3-H2; d, 6,0), 1,44 (CMe3; s), 0,85 (2-Me2; s); 13C-NMR (CDCl3) δ 157,6 (BOC CO), 79,7 (CMe3), 68,1 (1), 47,1 (3), 36,7 (2), 28,3 (CMe3), 22,4 (2-Me2).
  • Zu einer Lösung von Alkohol 3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-2,2-dimethylpropan-1-ol (5,3 g, 25,9 mmol) und Natriumperiodat (16,6 g, 77,7 mmol) in Tetrachlorkohlenstoff (52 ml), Acetonitril (52 ml) und Wasser (78 ml) wurde Rutheniumtrichlorid-Hydrat (122 mg) zugegeben, und die Mischung wurde bei 25°C für 1 h gerührt. Die Mischung wurde durch Celite filtriert und eine gesättigte Lösung von Kaliumcarbonat in Wasser (50 ml) wurde zugegeben. Die Wasserschicht wurde abgetrennt, mit Ether (20 ml) gewaschen, mit HCl bei 0°C auf pH 2 angesäuert und mit CH2Cl2 (30 ml × 3) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum lieferte einen Rückstand, der zunächst einer Umkehrphasenflashchromatographie auf einem C18-Silica (ODS 12Å, 50 bis 90% MeOH) unterworfen und dann aus Ether kristallisiert wurde, um 3,7 g (66% Ausbeute) M als einen weißen Feststoff zu ergeben, Schmp. 106-108°C; EIMS m/z (rel. Intensität) 217 (0,1), 161 (11), 98 (25), 88 (71), 57 (100); HREIMS m/z 217,1292 (C10H19NO4, Δ +2,2 mmu); IR νmax 3450-2500, 1710, 1694, 1510 cm-1; 1H-NMR des Hauptkonformers Δ 5,03 (NH; br s); 3,26 (3-H2; m), 1,45 (CMe3; s), 1,24 (2-Me2; s); 13C-NMR (CDCl3) δ 183,2 (1), 156,3 (BOC CO), 79,6 (CMe3), 49,5/47,9 (2/3), 28,4 (CMe3), 22,9 (2-Me2).
  • Allyl-(2S)-2-hydroxy-4-methylpentanoat (N)
  • Zu einer Lösung von 2,66 g L-Leucinsäure (20 mmol) und 1,74 g Natriumbicarbonat (20 mmol) in 30 ml Wasser bei 0°C wurden 30 ml einer CH2Cl2-Lösung von 6,44 g Tetrabutylammoniumchlorid (20 mmol) und 1,74 ml Allylbromid (20 mmol) zugegeben. Nach kräftigem Rühren der Mischung für 24 h wurde das CH2Cl2 verdampft. Etwa 50 ml Wasser wurden zugegeben und die wäßrige Schicht wurde viermal mit Et2O extrahiert. Die Etherlösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann eingedampft. Der Rückstand wurde durch eine kurze Si-Säule gegeben, um 3,21 g Allylester N (93% Ausbeute) als ein farbloses Öl zu ergeben: [α]D -8,4° (c 1,1, CHCl3); IR νmax 3464, 2957, 1732, 1203, 1140, 1087 cm-1; 1H-NMR δ 5,92 (Allyl 2-H; m), 5,34 (Allyl 3-Hz; dd, 17,4/1,1), 5,28 (Allyl 3-Hz; dd, 10,5/1,1), 4,67 (Allyl 1-H2; d, 5,7), 4,23 (2-H; br s), 2,64 (OH; br s), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H2; m), 0,96 (5-H3; d, 6,5), 0,95 (4-Me; d, 6,7); 13C-NMR δ 175,3 (1), 131,4 (Allyl C-2), 118,6 (3), 68,9 (2), 65,7 (Allyl C-1), 43,2 (3), 24,1 (4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).
  • Allyl-(2S)-2-[3'(tert-butoxycarbonyl)amino-2',2'-dimethylpropanoyloxy]-4-methylpentanoat (O)
  • Zu einer Lösung von 0,8 g M (3,7 mmol), 0,76 g N (4,4 mmol) und 92 mg DMAP in 10 ml trockenem CH2Cl2 bei 0°C wurden 0,84 g DCC (4,1 mmol) in CH2Cl2 zugegeben. Die Mischung wurde bei 25°C für 3 h gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde mit gesättigtem wäßrigen Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingedampft. Flashchromatographie (Silicagel, 5% EtOAc/Hexan) lieferte 1,0 g (92% Ausbeute) reines O als ein farbloses Öl: Rf 0,68 (17:83 EtOAc/Hexan), [α]D -29,4° (c 18,1, CHCl3); EIMS m/z (rel. Intensität) 371 (2, M+), 242 (13), 184 (12), 126 (20), 84 (100); HREIMS m/z 371,2317 (C19H33NO6, Δ -0,9mmu); IR (rein) νmax 3385, 2963, 1731, 1720, 1513 cm-1; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) Einheit C δ 5,39 (NH; verstecktes br s), 3,33 (3-H; dd, -13,5/7,4), 3,27 (3-H'; dd, -13,5/5,9), 2,78 (2-H, m), 1,44 (CMe3; s), 1,23 (2-Me; s), 1,22 (2-Me; s); Einheit D δ 5,91 (Allyl 2-H; ddt, 16,6/10,3/6,0 Hz), 5,34 (Allyl 3-Hz; bd, 16,6), 5,27 (Allyl 3-HE; bd, 10,3), 5,08 (2-H; dd, 9,6/3,6), 4,65 (Allyl 1-H2; m), 1,6-1,9 (3-H2/4-H; m), 0,94 (5-H3; d, 6,3), 0,94 (4-Me; d, 7,3). 13C-NMR Einheit C δ 176,5 (1), 156,3 (BOC CO), 79,0 (CMe3), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,4 (CMe3), 22,2/23,0 (2-Me2); Einheit D δ 170,6 (1), 131,4 (Allyl C-2), 119,1 (Allyl C-3), 70,9 (2), 66,0 (Allyl C-1), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).
  • (2S)-2-[3'-(tert-Butoxycarbonyl)amino-2',2'-dimethylpropanoyloxy]-4-methylpentansäure
  • Zu 10 ml einer Lösung von 180 mg (0,49 mmol) O und 60 mg (0,05 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium in trockenem THF (unter Argon-Atmosphäre) wurden langsam 470 μl(5,4 mmol) trockenes Morpholin über 10 min zugegeben. Nach Rühren für 50 min wurden 40 ml Ether zugegeben und die Lösung wurde mit 1 N HCl (40 ml) gewaschen und dann mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 30 ml) extrahiert. Der wäßrige Extrakt wurde mit Wasser (2 × 30 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft, um P als ein farbloses mobiles Öl zu ergeben (152 mg, 95%): [α]D -22,2° (c 2,2, CHCl3); EIMS m/z (rel. Intensität) 331 (1, M+), 275 (1), 258 (4), 231 (9), 202 (36), 174 (13), 144 (31), 126 (16), 114 (14), 98 (54), 88 (50), 84 (100), HREIMS m/z 331,2004 (C16H29NO6, Δ – 1,0mmu). 1H-NMR (CDCl3) Einheit C δ 5,41 (NH; dd, 5,7/5,4), 3,30 (3-H2; m), 2,68 (2-H; m), 1,43 (CMe3; br s), 1,22 (2-Me; s), 1,21 (2-Me; s); Einheit D δ 6,47 (1-OH; br s, W1/2 ≈ 35), 5,09 (2-H; dd, 9,3/2,7), 1,7-1,9 (3-H2/4-H; m), 0,97 (5-H3; d, 6,0), 0,94 (4-Me; d, 6,0). 13C-NMR (CDCl3) Einheit C δ 176,5 (1), 156,5 (BOC CO), 79,3 (CMe3), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,3 (CMe3), 23,0 (2-Me), 22,2 (2-Me); Einheit D δ 175,4 (1), 70,6 (2), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).
  • Verbindung Q
  • Zu einer Lösung von Alkohol K (80 mg, 0,14 mmol), Säure P (68 mg, 0,21 mmol) und DMAP (4 mg) in trockenem CH2Cl2 (4 ml), gerührt bei 0°C unter einer Argon-Atmosphäre, wurde DCC (44 mg, 0,21 mmol) in trockenem CH2Cl2 (1 ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei 0°C für 30 min gerührt, wobei sich während dieser Zeit ein weißer Niederschlag entwickelte, und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und für weitere 4 Stunden gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat mit Et2O (40 ml) verdünnt und nacheinander mit verdünnter HCl (1 M, 40 ml), gesättigter NaHCO3 (40 ml) und Salzlösung (40 ml) gewaschen. Die ätherische Schicht wurde getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft, um einen wachsartigen Feststoff zu ergeben. Chromatographie (Silica, EtOAc:Hexan, 1:3) führte zu reinem Q als einem farblosen, viskosen Öl (103 mg, 84%): [α]D -3,1° (c 2,9, CHCl3); EIMS m/z 800/802/804/806 (<1, M+-C5H8O2), 415/417/419/421 (5/3/3/2), 342/344/346 (7/9/4), 286/288/290 (2/6/2), 207 (34), 178 (2), 155/157 (66/24), 131 (36), 91 (70), 70 (100); HREIMS m/z 800,2179 (C38H48N2O8 35Cl4, Δ -1,4mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (51200), 230 (18500), 248 (17200), 282 (2200) nm; IR (NaCl) νmax 3376, 2965, 1755, 1728, 1712, 1678, 1504, 1258, 1150, 1067, 732 cm-1. 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 7,28-7,33 (10-H/14-H/11-H/13-H; m), 7,22 (12-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,8/6,4/6,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,7), 5,88 (2-H; d, 15,8), 5,06 (5-H; bm, W1/2 ≈ 20Hz), 4,79/4,70 (CH2CCl3, AB q, -11,7), 3,85 (OCH3; s), 3,20 (3-Hb; dd, -14,1/5,8), 3,07 (3-Ha; dd, -14,1/6,7); Einheit C 5,38 (NH; bt, 6,5), 3,27 (3-H2; d, 6,5), 1,20 (2-CH3; s), 1,15 (2-CH3; s); Einheit D 4,92 (2-H; dd, 10,0/3,8), 1,72 (4-H; bm, W1/2 ≈ 20 Hz), 1,67 (3-Hb; ddd, – 14,1/10,0/5,0), 1,56 (3-Ha; ddd, -14,1/9,1/3,8), 1,43 (CO2CMe3; s), 0,86 (4-CH3; d, 6,4), 0,82 (5-H3; d, 6,4). 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A 165,4 (1), 139,3 (3), 136,9 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,2 (10/14), 125,4 (2), 76,5 (5), 41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); Einheit B 170,0 (1), 154,1 (7), 131,2 (5), 128,8 (4), 128,5 (9), 122,3 (6), 112,1 (8), 94,3 (CH2CCl3), 74,6 (CH2CCl3), 56,1 (7-OMe), 53,2 (2), 36,6 (3); Einheit C 176,9 (1), 156,4 (CO2CMe3), 79,1 (CO2CMe3), 48,7 (3), 44,0 (2), 22,8 (2-Me), 22,3 (2-Me'); Einheit D 170,7 (1), 71,4 (2), 39,5 (3), 28,4 (CO2CMe3), 24,8 (4), 23,0 (4-Me), 21,4 (5).
  • Aminosäure R
  • Zur Aminosäure Q (100 mg, 0,11 mmol) wurde aktivierter Zn-Staub (400 mg, Überschuß) und AcOH (4 ml) zugegeben. Die heterogene Mischung wurde für 45 min einer Beschallung unterzogen, für weitere 90 min bei Raumtemperatur gerührt und dann auf ein Kissen aus Celite gegossen. Das organische Material wurde aus dem Celite-Kissen mit CH2Cl2 ausgewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen, was die Carbonsäure als einem farblosen amorphen Feststoff zurückließ.
  • Ohne Reinigung wurde die rohe Säure in Trifluoressigsäure (TFA, 5 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 1 Stunde absetzen gelassen. Nach dieser Zeit wurde überschüssige TFA im Vakuum abgezogen und der resultierende amorphe Feststoff wurde dann einer chromatischen Reinigung unterzogen (Sep-Pak®, Silica, anfangs CH2Cl2, dann 10% MeOH/CH2Cl2), was das Trifluoracetatammoniumsalz der gewünschten Verbindung lieferte. Wiederholte Lyophilisierung einer wäßrigen Lösung des Salzes führte zur freien Aminosäure R als einem farblosen amorphen Feststoff (68 mg, 91% über zwei Stufen): IR (NaCl) νmax 3300, 3200, 2965, 1693, 1606, 1504, 1441, 1259, 1201, 1146, 1066, 727 cm-1. 1H-NMR (CD3OD) δ Einheit A: 7,33 (10-H/14-H; d, 7,4), 7,28 (11-H/13-/, t, 7,4), 7,18-7,23 (12-H; m), 6,69 (3-H; ddd, 15,6/7,7/7,0), 6,43 (8-H; d, 15,8), 6,04 (7-H; dd, 15,8/8,9), 6,00 (2-H; d, 15,6), 5,01 (5-H; ddd, 9,1/6,9/3,1), 2,64 (4-Hb; bm, W1/2 ≈ 30 Hz), 2,60 (6-H; bm, W1/2 ≈20 Hz), 2,49 (4-Ha; ddd, 15,8/9,1/7,7), 1,13 (6-Me; d, 6,7); Einheit B 7,18-7,23 (5-H; m), 7,11 (9-H; dd, 8,3/1,6), 6,92 (8-H; d, 8,3), 4,59 (2-H; bm, W1/2 ≈ 20 Hz), 3,81 (OCH3; s), 3,14 (3-Hb; dd, -13,7/4,3), 2,96 (3-Ha; m, W1/2 ≈ 20 Hz); Einheit C 2,96 (3-H2; bm, W1/2 ≈ 20 Hz), 1,31 (2-CH3; s); 1,25 (2-CH3'; s); Einheit D 4,90 (2-H; dd, 9,6/4,0), 1,66 (4-H; bm, W1/2 ≈ 25 Hz), 1,59 (3-H6; ddd, -14,4/9,6/4,8), 1,53 (3-Ha; ddd, -14,4/9,1/4,0), 0,81 (4-Me; d, 6,5), 0,74 (5-H3; d, 6,5). 13C-NMR (CD3OD) δ Einheit A 167,7 (1), 140,7 (3), 138,4 (9), 133,0 (8), 131,7 (7), 129,6 (11/13), 128,5 (12), 127,3 (10/14), 127,1 (2), 78,4 (5), 43,1 (6), 35,7 (4), 17,4 (6-Me); Einheit B 179,8 (1), 155,2 (7), 132,3 (4), 132,1 (5), 130,1 (9), 123,0 (6), 113,4 (8), 56,6 (7-OMe), 56,6 (2), 37,8 (3), Einheit C 176,8 (1), 48,2 (3), 42,2 (2), 23,3 (2-Me), 23,3 (2-Me'); Einheit D 172,0 (1), 73,4 (2), 40,7 (3), 26,0 (4), 23,1 (4-Me), 21,8 (5).
  • Kryptophycin 51
  • Zu einer gerührten Lösung von Aminosäure T (75 mg, 0,11 mmol) in wasserfreiem DMF (20 ml) bei Raumtemperatur unter Argon wurde Diisopropylethylamin (DIEA, 44 mg, 60 μl, 0,34 mmol, ≈ 3 Äquiv.) zugegeben, gefolgt von Pentafluordiphenylphosphinat (FDPP, 55 mg, 0,14 mmol, ≈ 1,3 Äquiv.) in DMF (2 ml). Die Mischung wurde für 12 Stunden gerührt, Et2O (40 ml) wurde zugegeben und die Etherschicht wurde nacheinander mit HCl (1M, 40 ml), Salzlösung (40 ml) und H2O (40 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter verringertem Druck eingedampft. Der zurückbleibende wachsartige Feststoff wurde durch Umkehrphasenchromatographie (ODS, 10 μ, 30 % H2O/MeCN, 3 ml min-1) weiter gereinigt, um Kryptophycin 51 als einen farblosen amorphen Feststoff zu ergeben (45 mg, 61%): [α]D +26,4° (c 0,25, CHCl3); EIMS m/z 652/654 (M+, 3/1), 632/634 (3/2), 426/428 (51/15), 227 (64), 195/197 (64/22), 155/157 (71/15), 131 (59), 91 (100); HREIMS m/z 652,2936 (C36H45N2O7 35Cl, Δ -2,1 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (52000), 228 (20400), 250 (13400), 284 (2800) nm; IR (NaCl) νmax 3376, 3270, 2960, 1747, 1721, 1659, 1536, 1514, 1259, 1150, 1066, 1013, 980, 694 cm-1. 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A 7,32 (10-H/14-H; dd; 8,0/1,5), 7,29 (11-H/13-H; t, 8,0), 7,24 (12-H; bm, W1/2 ≈ 15 Hz), 6,77 (3-H, ddd, 15,2/10,8/4,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,8), 5,76 (2-H; dd, 15,2/1,1), 5,04 (5-H; ddd, 11,1/6,4/1,9), 2,54 (4-Hb/6-H; bm, W1/2 ≈ 15 Hz), 2,37 (4-Ha; ddd, -14,3/11,1/10,8), 1,13 (6-Me; d, 6,8); Einheit B 7,20 (5-H; d, 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,4/2,0), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,61 (NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,4); 3,87 (OMe; s), 3,11 (3-Hb; dd, -14,2/5,4), 3,06 (3-Ha; dd, -14,2/7,6); Einheit C 7,24 (NH; bm, W1/2 ≈ 15 Hz), 3,40 (3-Hb; dd, -13,5/8,5), 3,12 (3-Ha; dd, -13,5/3,6), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me', s); Einheit D 4,85 (2-H; dd, 10,2/3,6), 1,66 (3-Hb; ddd, -14,0/10,2/4,6), 1,61 (4-H; bm W1/2 ≈ 20,0 Hz), 1,33 (3-H; ddd, -14,0/9,0/3,6), 0,74 (4-Me; d, 6,6), 0,72 (5-H3; d, 6,6). 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A 165,1 (1), 142,2 (3), 136,7 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,1 (10/14), 124,6 (2), 77,0 (5), 42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); Einheit B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3); Einheit C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me), 22,6 (2-Me'); Einheit D 170,6 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).
  • Beispiel 3 Synthese von Kryptophycin 52 und Kryptophycin 53
  • Zu einer gerührten Lösung von Kryptophycin 51 (75 mg, 0,12 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (7,5 ml) bei 0°C unter Argon wurde eine Lösung von m-Chlorperbenzoesäure (mCPBA, 50 mg, 0,23 mmol, ≈ 2 Äquiv., bezogen auf 80% aktiven Sauerstoff) in Dichlormethan (1 ml) zugegeben. Nach 30 Minuten ließ man die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmen und rührte für weitere 12 Stunden. Das Lösungsmittel wurde dann unter verringertem Druck abgezogen, um eine 1,8:1-Mischung der Kryptophycine 52 bzw. 53 (nach NMR-Analyse) als einen amorphen Feststoff zu ergeben. Die Mischung der regioisomeren Epoxide wurde in minimalem Acetonitril gelöst und Umkehrphasenchromatographie unterzogen (YMC-ODS, 10 μ, 250 mm × 22,5 mm, 30% H2O/MeCN, 6 ml min-1), um Kryptophycin 52 (37 mg, 48%) und Kryptophycin 53 (19 mg, 25%) zu trennen.
  • Spektraldaten für Kryptophycin 52
  • [α]D +19,9° (c 0,5, CHCl3); EIMS m/z 668/670 (4/2, M+), 445 (35), 244 (12), 227 (22), 195/197 (66/27), 184 (45), 155/157 (38/10), 91 (100); HREIMS m/z 668,2873 (C36H45N2O8 35Cl, Δ -0,9mmu), 445,2497 (C25H35NO6, Δ -3,3mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (35100), 218 (20900) nm; IR (NaCl) νmax 3415, 3270, 2960, 1748, 1721, 1650, 1536, 1504, 1260, 1192, 1150, 1066, 1013, 800, 698 cm-1. 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A 7,33-7,38 (11-H/12-H/13-H; bm, W1/2 ≈ 25 Hz), 7,24 (10-H/14-H; m, W1/2 ≈ 15 Hz), 6,76 (3-H; ddd, 15,1/10,8/4,3), 5,71 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,20 (5-H; ddd, 11,0/5,0/1,8), 3,68 (8-H; d, 1,9), 2,92 (7-H; dd, 7,5/1,9), 2,57 (4-Hb; ddd, -14,6/1,8/1,7), 2,45 (4-Ha; ddd, -14,6/11,0/10,8), 1,78 (6-H; bm, W1/2 ≈ 15 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6,9); Einheit B 7,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,65 (NH; d, 7,9), 4,73 (2-H; ddd, 7,9/7,4/5,3), 3,87 (OMe; s), 3,09 (3-Hb; dd, -14,6/5,3), 3,05 (3-Ha; dd, -14,6/7,4); Einheit C 7,20 (NH; dd, 8,6/3,2), 3,41 (3-Hb; dd, -13,4/8,6), 3,10 (3-Ha; dd, -13,4/3,2), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me'; s); Einheit D 4,82 (2-H; dd, 10,2/3,5), 1,73 (3-Hb; bm, W1/2 ≈ 20 HZ), 1,66 (4-H; bm, W1/2 ≈ 20 Hz), 1,31 (3-Ha; ddd, -13,8/9,1/3,5), 0,84 (4-Me; d, 6,6), 0,82 (5-H3; d, 6,6); 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A 164,9 (1), 141,8 (3), 136,7 (9), 128,7 (11/13), 128,3 (12), 125,6 (10/14), 124,7 (2), 75,9 (5), 63,0 (7), 59,0 (8), 40,7 (6), 36,9 (4), 13,5 (6-Me), Einheit B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,5 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), Einheit C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,8 (2), 22,8 (2-Me), 22,8 (2-Me'), Einheit D 170,5 (1), 71,2 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).
  • Spektraldaten für Kryptophycin 53
  • [α]D +20,8° (c 1,7, CHCl3); EIMS m/z 668/670 (5/4, M+), 445 (32), 244 (15), 227 (24), 195/197 (64/21), 184 (60), 155/157 (33/9), 91 (100); HREIMS m/z 668,2853 (C36H45N2O8 35Cl, Δ 1,1 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (38700), 218 (22900) nm; IR (NaCl) νmax 3415, 3280, 2917, 2849, 1748, 1722, 1660, 1504, 1465, 1260, 1190, 1150, 1066, 755 cm-1. 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A 7,29-7,36 (11-H/12-H/13-H, bm, W1/2 ≈ 20 Hz), 7,23 (10-H/14-H; dd, 8,3/1,7), 6,77 (3-H; ddd, 15,1/10,9/4,3), 5,81 (2-H; dd, 15,1/1,3), 5,17 (5-H; ddd, 11,2/4,9/1,8), 3,58 (8-H; d, 1,7), 2,90 (7-H; dd, 7,8/1,7), 2,67 (4-H6; ddd, 14,7/11,2/10,9), 2,56 (4-Ha; ddd, 14,7/4,3/1,8/1,3), 1,67-1,78 (6-H; bm, W1/2 ≈ 45), 1,03 (6-CH3; d, 7,1); Einheit B 7,21 (5-H; d, 2,1), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,1), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,90 (2-NH; d, 7,9), 4,75 (2-H; ddd, 7,9/7,9/4,9), 3,85 (7-OCH3; s), 3,14 (3-Hb; dd, 14,5/4,9), 3,03 (3-H3; dd, 14,5/7,9); Einheit C 7,29-7,36 (3-NH; bm, W1/2 ≈ 25), 3,43 (3-Hb; dd, 13,7/8,8), 3,10 (3-Ha; dd, 13,7/3,4), 1,23 (2-CH3;s), 1,17 (2-CH3'; s); Einheit D 4,92 (2-H; dd, 10,3/3,2), 1,67-1,78 (3-Hb/4-H; bm, W1/2 ≈ 45), 1,48 (3-Ha; ddd, 13,9/8,8/3,2), 0,89 (4-CH3; d, 6,6), 0,86 (5-Ha; d, 6,6). 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A 165,1 (1), 142,0 (3), 137,0 (9), 128,5 (11/13), 128,5 (12), 125,3 (10/14), 124,6 (2), 76,7 (5), 63,2 (7), 56,2 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); Einheit B 170,4 (1), 154,0 (7), 130,8 (5), 129,7 (4), 128,2 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,3 (3); Einheit C 177,9 (1), 46,4 (3), 42,7 (2), 23,0 (2-Me), 22,7 (2-Me'); Einheit D 170,5 (1), 71,3 (2), 39,2 (3), 24,7 (4), 22,8 (4-Me), 21,3 (5).
  • Beispiel 4 Synthese von Kryptophycin 55
  • Zu einer Lösung von Kryptophycin 52 (6 mg, 0,009 mmol) in 0,6 ml 2:1 1,2-Dimethoxyethan/Wasser wurden 2 μl 12 N HCl zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 20 h absetzen gelassen, mit Kaliumcarbonat neutralisiert, durch einen 5 μ-Filter filtriert und eingedampft. Das in Acetonitril lösliche Material wurde durch Umkehrphasen-HPLC auf C18 (250 × 10 mm-Säule) unter Verwendung von 4:1 MeOH/H2O gereinigt, um 3,0 mg Kryptophycin 55 zu erhalten (48%). [α]D +42,5° (c 1,1, CHCl3); EIMS m/z 704/706/708 (M+ <1), 668/670 (1,5/0,5, M+-HCl), 445 (6), 226 (8), 195/197 (16/5), 184 (10), 155/157 (33/11), 135 (100), 91 (99), 77 (30); HREIMS m/z 668,2873 (M+ -HCl, C36H45N2O8 35Cl, Δ -0,8 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (48400), 218 (29200), 284 (1600) nm; IR (NaCl) νmax 340, 3286, 2959, 1748, 1723, 1666, 1538, 1504, 1455, 1257, 1178, 1066, 753 cm-1. 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A 7,35-7,42 (10-H/11-H/12-H/13-H/14-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,1/10,6/4,5), 5,78 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,16 (5-H; ddd, 11,1/8,3/2,1), 4,65 (8-H; d, 9,7), 4,01 (7-H; bd, 9,7), 2,69 (4-Hb; dddd, -14,5/4,5/2,1/1,7), 2,50 (6-H; bm, W1/2 ≈ 15), 2,38 (4-Ha; ddd, -14,5/11,1/10,6), 1,53 (7-OH, s), 1,04 (6-Me, d, 7,1); Einheit B 7,21 (5-H; d, 22), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,2), 6,85 (8-H; d, 8,5), 5,57 (2-NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,2), 3,88 (7-OCH3; s), 3,13 (3-H6; dd, 14,5/5,2), 3,05 (3-Ha; dd, 14,5/7,6); Einheit C 7,21 (3-NH; m), 3,38 (3-Hb; dd, 13,5/8,3), 3,17 (3-Ha; dd, 13,5/4,1), 1,23 (2-CH3; s), 1,17 (2-CH3; s), Einheit D 4,93 (2-H; dd, 10,1/3,5), 1,78 (3-Hb; ddd, 13,5/10,1/5,0), 1,72 (4-H; bm, W1/2 ≈ 20), 1,43 (3-Ha; ddd, 13,5/8,8/3,5), 0,92 (4-CH3; d, 6,6), 0,92 (5-H3, d, 6,4). 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A 165,1 (C-1), 142,4 (C-3), 138,4 (C-9), 129,0 (C-11/13), 128,3 (C-12), 128,0 (C-10/14), 124,6 (C-2), 76,1 (C-5), 74,1 (C-7), 62,0 (C-8), 38,4 (C-6), 36,5 (C-4), 8,6 (6-Me); Einheit B 170,3 (C-1), 154,1 (C-7), 130,9 (C-5), 129,6 (C-4), 129,2 (C-9), 122,6 (C-6), 112,3 (C-8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (C-2), 35,3 (C-3); Einheit C 177,8 (C-1), 46,5 (C-3), 42,8 (C-2), 22,9 (2-Me), 23,0 (C-2-Me'); Einheit D 170,3 (C-1), 71,3 (C-2), 39,7 (C-3), 24,8 (C-4), 22,7 (4-Me), 21,6 (C-5). Das entsprechende Diol, Kryptophycin 56 (2,8 mg, 44% Ausbeute), wurde ebenfalls erhalten.
  • Beispiel 5 Synthese von Kryptophycin 57
  • Eine kleine Menge PtO2 (≈ 1 mg) wurde zu einem Kolben zugegeben, der 0,5 ml CH2Cl2 enthielt. Die Luft im Kolben wurde evakuiert, H2 wurde eingebracht und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten gerührt. Eine Lösung, die 10,2 mg Kryptophycin 52 (0,015 mmol) in CH2Cl2 (0,3 ml) enthielt, wurde zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur für weitere 30 Minuten gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite/Baumwolle entfernt und das Lösemittel wurde im Vakuum abgezogen. Umkehrphasen-HPLC des Rückstandes (ODS, 10 μ, 250 × 22,5 mm, MeCN/H2O (3:1), 5 ml min-1) lieferte rohes Kryptophycin 57 (9,1 mg, 89%): [α]D +3,4 (c = 4,5, CHCl3); EIMS m/z 670/672 (M+ 9/3), 447 (10), 246 (63), 229 (20), 195/197 (78/25), 184 (58), 155/157 (39/13), 128 (21), 91 (100), 77 (23); HREIMS m/z 670,3037 (C36H47N2O8 35Cl, Δ -1,6 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (31400), 218 (12000), 284 (1200) nm; 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 7,30-7,37 (11/12/13-H, bm), 7,23 (10/14-H, bdd, 7,9, 1,9), 5,03 (5-H, ddd, 9,0, 5,6, 3,4), 3,66 (8-H, d, 2,1), 2,89 (7-H, dd, 7,7, 2,1), 2,27 (2-Hb, ddd, 14,3, 8,7, 6,2), 2,04 (2-Ha, ddd, 14,3, 8,8, 6,8), 1,64-1,75 (6-H/4-H2, bm), 1,61 (3-H2, bm, W1/2 ≈ 25), 1,11 (6-CH3, d, 7,1), Einheit B: 7,19 (5-H, d, 2,1), 7,04 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,3), 5,55 (2-NH, d, 8,3), 4,65 (2-H, ddd, 8,3, 7,3, 5,3), 3,87 (7-OCH3, s), 3,16 (3-Hb, dd, 14,3, 7,3), 3,08 (3-Ha, dd, 14,3, 5,3), Einheit C: 6,91 (3-NH, dd, 6,4, 6,4), 3,41 (3-Hb, dd, 13,5, 6,4), 3,30 (3-Ha, dd, 13,5, 6,4), 1,21 (2-CH3, s), 1,13 (2-CH3', s), Einheit D: 4,80 (2-H, dd, 9,8, 4,1), 1,64-1,75 (3-Hb/4-H, bm), 1,34 (3-Ha, ddd, 15,4, 10,1, 4,1), 0,86 (4-CH3, d, 6,5), 0,84 (5-H3, d, 6,5); 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 172,6 (1), 136,9 (9), 128,7 (11/13), 128,5 (12), 125,6 (10/14), 76,8 (5), 63,4 (7), 59,2 (8), 40,2 (6), 36,2 (2), 32,2 (4), 21,4 (3), 13,6 (6-Me), Einheit B: 170,4 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 130,0 (4), 128,5 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), Einheit C: 177,6 (1), 47,0 (3), 43,1 (2), 22,5 (2-Me'), 22,4 (2-Me), Einheit D: 171,7 (1), 72,0 (2), 39,0 (3), 24,6 (4), 22,8 (4-Me), 21,8 (5).
  • Beispiel 6 Synthese von Kryptophycin 58
  • Zu einer gerührten Lösung von Kryptophycin 57 (5,5 mg, 0,008 mmol) in 3 ml ethanol-freiem Chloroform bei ≈ -60°C wurde TMSCl zugegeben (verwendet wie erhalten von Aldrich, ≈ 4,5 mg, ≈ 5,2 μl, ≈ 0,04 mmol). Die Reaktionsmischung wurde für 20 Minuten gerührt, wonach TLC zeigte, daß kein Ausgangsmaterial übrig geblieben war. Die flüchtigen Komponenten wurden dann unter verringertem Druck abgezogen, um einen amorphen Feststoff zurückzulassen. Dieses Material wurde in Acetonitril aufgenommen und HPLC unterzogen (ODS, 10 μ, 250 × 22,5 mm, MeCN/H2O (3:1), 5 ml min-1), um reines Kryptophycin 58 (5,4 mg, 93%) als das Hauptprodukt zu liefern: [α]D +7,2 (c = 2,1, CHCl3); EIMS m/z 706/708/710 (M+, 27/23/8), 670/672 (M+-HCl, 14/13), 583 (54), 581 (53), 485 (23), 483 (21), 447 (34), 294 (21), 282 (39), 246 (57), 195/197 (87/27), 184 (73), 155/157 ( 45/10), 128 (30), 91 (95), 77 (30), 69 (100); HREIMS m/z 706,2844 (C36H48N2O8 35Cl2, Δ -5,6 mmu), m/z 670,3070 (M+-HCl, C36H47N2O8 35Cl, Δ -4,9 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (331900), 218 (11800), 284 (1800) nm; 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 7,34-7,42 (10/11/12/13/14-H, bm), 5,01 (5-H, ddd, 9,6, 8,3, 2,5), 4,65 (8-H, d, 9,6), 4,00 (7-H, dd, 9,6, 1,9), 2,42 (6-H, ddq, 8,3, 1,9, 7,0), 2,29 (2-Hb, ddd, 14,3, 9,4, 4,5), 2,06 (2-Ha, ddd, 14,3, 8,3, 7,5), 1,62-1,82 (3-H2/4-H2, bm), 0,99 (6-CH3, d, 7,0), Einheit B: 7,20 (5-H, d, 2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,84 (8-H, d, 8,3), 5,62 (2-NH, d, 8,3), 4,61 (2-H, ddd, 8,3, 7,7, 5,4), 3,87 (7-OCH3, s), 3,17 (3-Hb, dd, 14,3, 7,7), 3,11 (3-Ha, dd, 14,3, 5,4), Einheit C: 6,97 (3-NH, dd, 6,4, 6,2), 3,43 (3-Hb, dd, 13,4, 6,2), 3,31 (3-Ha, dd, 13,4, 6,4), 1,23 (2-CH3, s), 1,16 (2-CH3', s), Einheit D: 4,93 (2-H, dd, 10,0, 4,0), 1,86 (3-Hb, ddd, 14,0, 10,0, 5,5), 1,58 (3-Ha, ddd, 14,0, 8,3, 4,0), 0,97 (4-CH3, d, 6,8), 0,94 (5-H3, d, 6,6); 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 172,8 (1), 138,7 (9), 129,0 (12), 128,9 (11/13), 128,0 (10/14), 76,5 (5), 73,8 (7), 62,1 (8), 38,1 (6), 35,9 (2), 31,8 (4), 21,4 (3), 8,7 (6-Me), Einheit B: 170,6 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,2 (4), 128,5 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,0 (3), Einheit C: 177,2 (1), 47,0 (3), 43,2 (2), 22,5 (2-Me'), 22,4 (2-Me), Einheit D: 171,8 (1), 72,0 (2), 39,4 (3), 24,9 (4), 22,9 (4-Me), 21,7 (5).
  • Beispiel 7 Synthese von Kryptophycin 61
  • Zu einer Lösung von Kryptophycin 53 (5 mg, 0,007 mmol) in 0,5 ml trockenem Benzol wurde Triphenylphosphinsulfid (4 mg, 0,014 mmol) zugegeben, gefolgt von 0,65 μl Trifluoressigsäure als einer Lösung in trockenem Benzol (100 μl). Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 6 h absetzen gelassen, mit Natriumbicarbonat neutralisiert, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Wasser und CH2Cl2 aufgeteilt. Das in CH2Cl2 lösliche Material wurde durch Umkehrphasen-HPLC auf C18 unter Verwendung von 4:1 MeCN/H2O gereinigt, um reines Kryptophycin 61 (1,9 mg, 37%) zu erhalten. [α]D +28,4 (c = 0,7, CHCl3); EIMS m/z 684/686 (M+, nicht beobachtet), 652/654 (M+-S, 5/4), 426/428 (90/29), 294 (10), 227 (100), 195/197 (57/20), 184 (20), 155/157 (34/9), 131 (45), 129 (44), 91 (76), 77 (27); HREIMS m/z 652,2973 (M+-S, C36H45N2O7 35Cl, Δ -5,8 mmu); UV (MeOH) λmax (ε) 204 (26700), 218 (11600), 284 (820) nm; IR (NaCl) νmax 3410, 3271, 2958, 1749, 1724, 1670, 1503, 1463, 1258, 1176, 1066, 758 cm-1. +1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 7,29- 7,34 (11/12/13-H; m), 7,25 (10/14-H, bd, 6,6), 6,73 (3-H, ddd, 15,2/10,6/4,5), 5,66 (2-H; dd, 15,2/1,7), 5,22 (5-H, ddd, 11,2/4,2/2,0), 3,68 (8-H, d, 5,1), 3,01 (7-H, dd, 8,4/5,1), 2,52 (4-Hb, dddd, -14,4/4,5/2,0/1,7), 2,41 (4-Ha, ddd, -14,4/11,2/10,6), 1,68-1,74 (6-H, m), 1,14 (6-Me, d, 6,9); Einheit B: 7,18 (5-H, d, 2,2), 7,04 (9-H, dd, 8,4/2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,45 (NH, d, 7,8), 4,75 (2-H, ddd, 7,8/7,3/5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-Hb, dd, -14,5/5,4), 3,05 (3-Ha, dd, – 14,5/7,3); Einheit C 7,17 (NH, dd, 8,3, 3,9), 3,39 (3-Hb, dd, -13,5/8,3), 3,14 (3-Ha, dd, – 13,5/3,9), 1,23 (2-Me, s), 1,16 (2-Me', s); Einheit D 4,86 (2-H, dd, 10,2/3,4), 1,77 (3-Hb, ddd, -14,0/10,2/4,9), 1,68-1,74 (4-H, m), 1,42 (3-Ha, ddd, -14,0/8,7/3,4), 0,92 (4-Me, d, 6,6), 0,88 (5-H3, d, 6,4). 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 164,9 (1), 141,7 (3), 138,3 (9), 128,8 (11/13), 128,0 (12), 126,7 (10/14), 124,7 (2), 76,6 (5), 45,8 (7), 43,9 (8), 43,9 (6), 36,6 (4), 16,0 (6-Me), Einheit B: 170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,4 (4), 128,3 (9), 122,8 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3), Einheit C: 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,9 (2-Me), 22,8 (2-Me'), Einheit D: 170,4 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,7 (4-Me), 21,4 (5).
  • Beispiel 8 Synthese von Kryptophycin 97
  • Zu einer Lösung des cyclischen Depsipeptids, Kryptophycin 53 (9 mg, 0,013 mmol), gelöst in Dimethylsulfoxid (1 ml), wurden Natriumazid (40 mg) und konzentrierte Schwefelsäure (4 μl) zugegeben. Die Mischung wurde dann bei 75-85°C für zwei Tage rühren gelassen. Nach dieser Zeit wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Et2O (15 ml) verdünnt und die organische Schicht mit Salzlösung (2 × 20 ml) und H2O (20 ml) gewaschen. Der ätherische Extrakt wurde dann getrocknet (MgSO4) und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, um einen amorphen, farblosen Feststoff zu liefern, der überwiegend der Azidoalkohol, Kryptophycin 86, war. Reinigung wurde erreicht durch Umkehrphasen-Chromatographie (ODS, 10 μ, 52 × 10 mm, 25% H2O/MeCN, 3 ml min-1), um den reinen Azidoalkohol, Kryptophycin 86, als einen amorphen farblosen Feststoff (7,4 mg, 77%) zu liefern.
  • Spektraldaten für Kryptophycin 86
  • [α]D -22,0 (c=3,0, CHCl3); MS (EI) m/z 482/484 höchstes beobachtetes Ion, M* -229 (8/3), 625/627 (14/5), 259 (7), 195/197 (100/34), 184 (14), 155/157 (82/70), 91 (23), 77 (22); HRMS beob. m/z 482,1791, C23H31N2O7 35Cl (Δ 2,9 mmu); MS (FAB) m/z (magic bullet matrix) 712/714 (M* +H, 79/36), 686/688 (31/12), 232 (74), 184 (100). 1H NMR (CDCl3) δ-Einheit A: 7,37-7,42 (10/11/12/13/14-H, bm, W1/2=20), 6,77 (3-H, ddd, 15,2, 10,6, 4,4), 5,77 (2-H, dd, 15,2, 1,3), 5,45 (5-H, ddd, 11,0, 4,2, 2,0), 4,55 (8-H, d, 5,7), 3,75 (7-H, dd, 7,3, 5,7), 2,55 (4-Hb, dddd, 14,5, 4,4, 2,0, 1,3), 2,43 (4-Ha, ddd, 14,5, 11,0, 10,6), 2,34 (7-OH, s), 1,80 (6-H, ddq, 7,3, 4,2, 7,0), 0,99 (6-Me, d, 7,0), Einheit B: 7,20 (5H, d, 2,2), 7,06 (9-H, dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,76 (NH, d, 7,7), 4,74 (2-H, ddd, 7,7, 7,5, 5,5), 3,87 (OCH3, s), 3,10 (3-Hb, dd, 14,5, 5,5), 3,06 (3-Ha, dd, 14,5, 7,5), Einheit C: 7,22 (NH, dd, 8,4, 3,7), 3,40 (3-Hb, dd, 13,6, 8,4), 3,14 (3-Ha, dd, 13,6, 3,7), 1,23 (2-CH3, s), 1,16 (2-CH3, s), Einheit D: 4,85 (2-H, dd, 9,5, 5,1), 1,71 (3-Hb, ddd, 13,6, 9,5, 5,9), 1,59 (4-H, bm, W1/2=25), 1,50 (3-Ha, ddd, 13,6, 7,9, 5,1), 0,89 (4-CH3, d, 6,6), 0,85 (5-H3, d, 6,6); 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 165,3 (1), 143,0 (3), 135,1 (9), 129,1 (12), 128,9 (11/13), 128,6 (10/14), 124,3 (2), 75,1 (7), 74,6 (5), 67,8 (8), 39,3 (6), 34,7 (4), 11,9 (6-Me), Einheit B: 170,5 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,7 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), Einheit C: 177,8 (1), 46,5 (3), 42,8 (2), 22,9 (2-Me), 22,7 (2-Me'), Einheit D: 170,2 (1), 71,4 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,6 (4-Me), 21,8 (5).
  • Kryptophycin 97
  • Zu einer Lösung des cyclischen Depsipeptids, Kryptophycin 86 (5,5 mg, 0,008 mmol), gelöst in Et2O/CH2Cl2 (3:1, 0,5 ml), wurde eine ätherische Lösung (0,5 ml) von Triphenylphosphin (3 mg, 0,011 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur für drei Tage absetzen gelassen. Nach dieser Zeit wurde das Lösemittel im Vakuum abgezogen und der Rückstand in CH2Cl2 gelöst und HPLC-Reinigung (CN-Säule, 10μ, 250 × 10 mm, 80% EtOAc/CH2Cl2, 3 ml min-1) unterzogen, um reines Kryptophycin 97 als einen amorphen farblosen Feststoff zu liefern (4,2 mg, 82%).
  • UV (MeOH) λmax (ε) 202 (24400), 218 (9400), 284 (2200) nm; MS (EI) m/z 667/669 (M+, 11/3 ), 639/641 (41/16), 442 (21), 226 (17), 195 (43), 196 (32), 197 (100), 198 (71), 199 (11), 182/184 (25/16), 155/157 (63/22), 146 (30), 91 (40), 77 (29); HRMS, beob. m/z 667,3061, C36H46N3O7 35Cl (Δ -3,6 mmu). 1H-NMR (CDCl3) δ Einheit A 7,35 (11-H/13-H; m, W1/2=15 Hz), 7,28 (12-H, m), 7,16 (10H/14-H; m, W1/2=15 Hz), 6,74 (3-H; ddd, 15,2/9,0/6,1), 5,69 (2-H; d, 15,2), 5,21 (5-H; ddd, 9,2/4,3/4,2), 2,79 (8-H, bs), 2,51 (4-H2, m), 2,11 (7-H, bd, 6,5), 1,48 (6-H, m), 1,13 (6-Me, d, 6,9); Einheit B: 7,18 (5-H, d, 2,1), 7,04 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,53 (NH, m), 4,73 (2-H, ddd, 7,6, 5,6, 5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-Hb, dd, 14,7, 5,4), 3,04 (3-Ha, dd, 14,7, 7,6), Einheit C: 7,20 (NH, m), 3,40 (3-Hb, dd, 13,5, 8,6), 3,11 (3-Ha, dd, 13,5, 3,3), 1,22 (2-Me', s), 1,15 (2-Me, s), Einheit D: 4,84 (2-H, dd, 10,1, 3,7), 1,71 (3-Hb, m), 1,67 (4-H, bm, W1/2=25), 1,35 (3-Ha, m), 0,86 (4-Me, d, 6.7), 0,84 (5-H3, d, 6,5); 13C-NMR (CDCl3) δ Einheit A: 165,0 (1), 142,1 (3), 139,2 (9), 128,8 (11/13), 127,5 (12), 125,4 (10/14), 124,6 (2), 76,6 (5), 42,5 (6), 42,1 (7), 40,5 (8), 36,6 (4), 14,8 (6-Me), Einheit B:170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,2 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), Einheit C: 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me/2-Me'), Einheit D: 170,5 (1), 71,3 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,3 (5).
  • Vergleichsbeispiel 9 Synthese der Kryptophycine 121-123 und 127
  • Verbindung AJ
  • Zu einer Lösung von BOC-L-Leucin-Monohydrat (1,245 g, 5 mmol) in 30 ml wasserfreiem CH2Cl2 wurde festes EDC (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid) (0,53 g, 2,75 mmol) unter N2 mit Rühren bei 0°C zugegeben. Nach Rühren bei 0°C für 1,5 h wurde die Mischung unter 5°C konzentriert und der Rückstand wurde mit 35 ml kaltem EtOAc verdünnt und nacheinander mit jeweils zwei Portionen (10 ml) von eiskalten Lösungen von 5% wäßrigem KHSO4, 5% wäßrigem NaHCO3 und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und bei 5°C getrocknet (MgSO4) und unter 5°C eingedampft. Das restliche Öl wurde mit eiskaltem THF (5 ml) verdünnt und zu einer Lösung von Verbindung K (295 mg, 0,5 mmol) in eiskaltem wasserfreiem THF (5 ml) zugegeben. Einige Kristalle DMAP wurden dann zur Mischung zugegeben, die gerührt und über Nacht 25°C erreichen gelassen wurde. 5% wäßrige NaHCO3-Lösung (5 ml) wurde zugegeben und die resultierende zweiphasige Mischung wurde bei 25°C für 2 h kräftig gerührt. EtOAc (40 ml) wurde zugegeben, die wäßrige Phase wurde mit zusätzlichem EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (NaSO4), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde durch einen Silicagel-Pfropfen mit 25% EtOAc in Hexanen filtriert, um Verbindung AJ als ein farbloses Öl zu liefern (385 mg, 96% Ausbeute): [α]D 13,6° (c=0,63, CHCCl3); EIMS m/z (rel. Intensität) 805/803/801 (M+, 1%), 568/570/572/574 (9/10/6/2), 523/525/527 (5/6/1), 418/420/422/424 (15/15/6/2), 341/343/345/347 (58/70/35/9), 307/309/311 (29/22/10), 224/227/228/229 (10/100/31/14), 208/210/211/212 (20/83/45/54); HREIMS m/z 800,2218 (C35H48 35Cl4N2O8, Δ -5,3 mmu); 1H-NMR (CDCl3) Einheit A δ 7,21-7,35 (Ph-H5; m), 6,77 (3-H; ddd, 6,7/6,7/15,3), 6,4 (8-H; d, 15,8), 6,05 (7-H; dd, 8,7/15,8), 5,9 (2-H; d, 15,3), 5,0 (5-H; m), 2,6 (6-H; m), 2,55 (4-H2; m), 1,17 (6-Me; d, 6,7); Einheit B δ 7,22 (5-H; s), 7,05 (9-H; d, 8,1), 6,84 (8-H; d, 8,1), 6,55 (NH; d, 7,8), 5,0 (2-H; ddd, 5,5/7,1/7,8), 4,68-4,8 (CH2CCl3; ABq, 11,9), 3,86 (OMe; s), 3,2 (3-H; dd, 5,5/14,0), 3,06 (3-H': dd, 7,1/14,0); Einheit D δ 4,8 (NH; d), 4,2 (2-H; m), 1,65 (4-H; m), 1,55 (3-H; m), 1,4 (CMe3; s), 1,37 (3-H'; m), 0,85 (4-Me; d, 6,5), 0,8 (5-H; d, 6,5; 13C-NMR Einheit A δ 165,4 (1), 139,3 (3), 137,0 (9), 131,5 (8), 130,5 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,2 (10/12), 125,8 (2), 76,2 (5), 40,8 (6), 33,4 (4), 16,8 (6-Me); Einheit B δ 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 129,0 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,4 (CCl3), 74,7 (CH2CCl3), 56,1 (OMe), 53,3 (2), 36,5 (3), Einheit D δ 173,2 (1), 155,7 (BOC-CO), 80,0 (CMe3), 52,4 (2), 41,2 (3), 28,3 (CMe3), 24,8 (4), 22,8 (4-Me), 21,6 (5).
  • Verbindung AK
  • Verbindung AJ (115 mg, 0,134 mmol) wurde in TFA (3 ml) gelöst und für 1 h bei 25°C stehengelassen. Das Lösemittel wurde abgezogen und der Rückstand wurde wiederholt aus der CH2Cl2, dann aus Chloroform eingedampft, um einen amorphen Feststoff zurückzulassen. Der Feststoff wurde in wasserfreiem THF (5 ml) gelöst und ausreichend Diethylisopropylamin wurde zugegeben, um den pH der Lösung auf pH 8 bis 9 einzustellen, wenn ein Aliquot der Lösung auf feuchtes pH-Papier getüpfelt wurde. Die Lösung wurde unter Rühren auf 0°C abgekühlt und eine Lösung von Verbindung AL in THF (3 ml) wurde zugegeben. Um Verbindung AL herzustellen, wurde Verbindung Z (55 mg, 0,27 mmol) in THF (3 ml) gelöst und Diethylisopropylamin (0,046 ml, 0,27 mmol) wurde zugegeben. Zu dieser Mischung wurde, nach Abkühlen auf -15°C, Pivaloylchlorid (0,033 ml, 0,27 mmol) tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde bei -15°C für 10 min und bei 0°C für 20 min gerührt. Die resultierende Suspension wurde dann in die Lösung von Verbindung AJ in THF überführt. Die resultierende Mischung wurde bei 0°C gerührt und über Nacht 20°C erreichen gelassen. Nach 12 Std. bei 25°C wurde 5% wäßrige NaHCO3-Lösung zugegeben und die resultierende Mischung wurde bei 25°C für 1,5 h kräftig gerührt. EtOAc (40 ml) wurde zugegeben und die Phasen wurden getrennt. Die wäßrige Phase wurde mit zusätzlichem EtOAc (2 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 5% wäßriger NaHCO3-Lösung (20 ml), 5% wäßriger KHSO4-Lösung (20 ml) und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Das restliche Öl wurde über Silicagel chromatographiert, das mit 35% EtOAc in Hexanen eluiert wurde, um Verbindung AK als einen farblosen Schaum zu liefern (98 mg, 83% Ausbeute): [α]D -8,3 (c 0,88, CHCl3); 1H-NMR (CDCl3) Einheit A δ 7,28-7,35 (Ph-H4; m), 7,22 (H-12; m), 6,75 (H-3; ddd, 6,4/6,4/15,4), 6,4 (H-8; d, 15,9), 6,04 (H-7; dd, 8,6/15,9), 5,95 (H-2; d, 15,4), 5,0 (H-5; m), 2,6 (H-4; m), 1,1 (6-Me; d, 6,8); Einheit B δ 7,22 (H-5, d, 1,5), 7,15 (NH; d, 7,6) 7,05 (H-9; dd, 1,5/8,2), 6,85 (H-8; d, 8,2), 5,0 (H-2; m), 4,8-4,68 (CH2CCl3; ABq, 12), 3,86 (OMe; s), 3,2 (H-3; m), 3,1 (H-3'; dd, 7,2/14,1); Einheit C δ 5,0 (NH; m), 3,2 (H2-3; m), 2,55 (H-2; m), 1,1 (2-Me; d, 7,1); Einheit D δ 6,12 (NH; m), 4,4 (H-2; m), 1,65 (H-4, m), 1,55 (H-3; m), 1,4 (H-3'; m), 0,86 (4-Me; d, 6,8), 0,81 (5-H; d, 6,8); 13C-NMR (CDCl3) Einheit A δ 165,8 (1), 138,9 (3), 131,5 (8), 130,4 (7), 128,6 (11/13), 127,4 (12), 126,2 (10/14), 125,8 (2), 76,3 (5), 33,6 (4), 16,6 (6-Me); Einheit B δ 170,2 (1), 154,1 (7), 136,9 (4), 131,2 (5), 128,6 (9), 122,3 (6), 112,2 (8), 94,4 (CCl3), 74,5 (CH2CCl3), 56,1 (OMe), 53,4 (2), 36,6 (3); Einheit C δ 175,4 (1), 156,3 (BOC-CO), 79,5 (OCMe3), 43,6 (3), 41,3 (2), 15,1 (2-Me); Einheit D δ 172,6 (1), 51,3 (2), 40,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (4-Me), 21,5 (5).
  • Kryptophycin 121
  • Verbindung AK (73 mg, 0,082 mmol) wurde in AcOH (3,5 ml) gelöst, aktivierter Zn-Staub (400 mg) wurde zugegeben und die resultierende Suspension wurde 45 min beschallt. Nach Rühren bei 25°C für zusätzliche 1,5 h wurde die Mischung mit CH2Cl2 (5 ml) verdünnt und durch Celite® filtriert. Die Feststoffe wurden mit zusätzlichem CH2Cl2 (10 ml) gewaschen und das resultierende Filtrat wurde eingedampft. Der Rückstand wurde, ohne weitere Reinigung, in TFA (3 ml) gelöst, bei 25°C für 1 h gehalten und das Lösungsmittel in Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde wiederholt aus CH2Cl2, dann aus Toluol eingedampft, bis ein farbloser Feststoff erhalten wurde. Dieser Feststoff wurde in trockenem DMF (3 ml) gelöst, FDPP (43 mg, 0,108 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von einer ausreichenden Menge Diethylisopropylamin, um den pH der Lösung auf pH 8 bis 9 einzustellen, wenn ein Aliquot auf feuchtes pH-Papier getüpfelt wurde. Nach Rühren bei 25°C für 16 Std. wurde die Mischung mit Ether (40 ml) verdünnt und mit 5% wäßriger KHSO4-Lösung (2 × 1 ml), 5% wäßriger NaHCO3 (15 ml) und Salzlösung gewaschen. Nach Trocknen (Na2SO4) und Eindampfen wurde der Rückstand durch Umkehrphasen-HPLC auf C-18-Silica (Econosil® C-18, 22 × 250 mm) unter Elution mit CH3CN/Wasser 65:35 mit 6 ml/min gereinigt. Die Fraktion, die bei tR 48 min eluierte, wurde gesammelt und eingedampft, um einen amorphen Feststoff zurückzulassen (26 mg, 50% Ausbeute): [α]D +46,5° (c 0,81, CHCl3); EIMS m/z 637/639 (M+, 1%), 449/451 (2/1), 420 (5), 411/413 (7/5), 227/228 (9/7), 195 (10), 184 (15), 167/168/169 (40/86/29), 155/157 (100/26), 91 (85), 69 (86); HREIMS m/z 637,2864 (C35H44 35CIN3O6, Δ + 5,5 mmu); 1H-NMR Einheit A δ 7,21-7,35 (Ph-H5; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,2/10,8/16), 6,4 (H-8; d, 16), 6,04 (H-7; dd, 8,8/16), 5,75 (H-2; d, 16), 5,1 ((H-5; m), 2,55 (H-4; m; H-6; m), 2,35 (H-4'; m); Einheit B δ 7,18 (H-5; d, 2), 7,05 (H-9; dd, 2,0/8,3), 6,85 (H-8; d, 8,3), 5,7 (NH; d, 7,2), 4,7 (H-2; ddd, 4,9/7,2/7,7), 3,86 (OMe; s), 3,1 (H-3; dd, 4,9/14,4), 3,0 (H-3'; dd, 7,7/14,4); Einheit C δ 7,25 (NH; m), 3,5 (H-3; m), 3,4 (H-3'; m), 2,55 (H-2; m), 1,2 (2-Me; d, 7,2); Einheit D δ 5,8 (NH; d, 7,2), 4,4 (H-2; m), 1,55 (H-4; m), 1,38 (H2-3; dd, 7,2/7,7), 0,76 (4-Me; d, 6,6), 0,74 (H-5; d, 6,6): 13C-NMR (CDCl3) Einheit A δ 165,1 (1), 141,9 (3), 136,8 (9), 131,7 (8), 130,2 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (14), 126,1 (10/12), 125,1 (2), 76,5 (5), 42,3 (6), 36,3 (4), 17,2 (6-Me); Einheit B δ 171,0 (1), 154,1 (7), 130,8 (5), 129,6 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,4 (8), 56,2 (OMe), 54,4 (2), 35,4 (3); Einheit C 6 175,8 (1), 41,0 (3), 38,6 (2), 14,8 (2-Me); Einheit D δ 173,2 (1), 51,1 (2), 40,9 (3), 24,7 (4), 23,4 (4-Me), 21,5 (5).
  • Beispiel 10 Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) und In-Vivo-Evaluation
  • Die Cytoxizitäten der Kryptophycine 1, 3 und 8 und der neuen Kryptophycine gegen die menschlichen Tumorzelllinien KB und LoVo sind in Tabelle 4 dargestellt. Kryptophycin 51 und Kryptophycin 3 zeigen vergleichbare Cytotoxizitäten (IC50 3,5 – 5,8 nM). Kryptophycin 52 (IC50 43 – 70 pM) ist jedoch etwas weniger cytotoxisch als Kryptophycin 1 (IC50 9 – 29 pM) und Kryptophycin 55 (33 – 47 pM) ist etwas weniger cytotoxisch als Kryptophycin 8 (IC50 9 – 19 pM). Die Cytotoxizitäts-IC50 für Kryptophycine 117, 122, 125, 127, 128 und 132 sind vergleichbar mit denjenigen für die Kryptophycine 1, 8, 52 und 55; die Daten erlauben jedoch gegenwärtig keine aussagekräftigeren Vergleiche.
  • Kryptophycin 52 ist in vivo aktiv, aber erfordert grob die dreifache Gesamtdosierung, verglichen mit Kryptophycin 1. Die in-vivo-Aktivität von Kryptophycin 52 gegen fünf massive Tumore murinen Ursprungs und drei menschliche massive Tumore ist in Tabelle 7 zusammengefaßt. In ähnlicher Weise war Kryptophycin 55 in vivo aktiv, erforderte aber die dreifache Gesamtdosierung, verglichen mit Kryptophycin B. Die in-vivo-Aktivität von Kryptophycin 55 gegen sechs massive Tumore murinen Ursprungs und vier menschliche massive Tumore ist in Tabelle 8 zusammengefaßt. Die in-vivo-Daten scheinen mit dem in-vitro-Daten zu korrelieren.
  • Die Kryptophycine 117, 125, 128 und 132 sind in vivo gegen ein Bauchspeicheldrüsenadenokarzinom murinen Ursprungs (Panc 03) aktiv. Kryptophycine 117 und 128 scheinen potenter zu sein, da sie kleinere Gesamtdosen erfordern als die Kryptophycine 1 bzw. 8, wohingegen die Kryptophycine 125 und 132 weniger potent sind, weil sie höhere Gesamtdosen erfordern als die Kryptophycine 1 bzw. 8. Die Daten sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
  • T/C-Werte, die niedriger sind als 42% werden nach NCI-Standards als aktiv angesehen; T/C-Werte, die niedriger sind als 10%, werden nach NCI-Standards als hervorragende Aktivität und potentielle klinische Aktivität aufweisend angesehen. Logarithmische Bruttoabtötung wird definiert als T-C/3,2 Td, worin T die mittlere Zeit in Tagen für die Tumore der behandelten Gruppe, um 750 mg zu erreichen, ist, C die mittlere Zeit in Tagen für die Tumore der Kontrollgruppe, um 750 mg zu erreichen, ist und Td die Tumorvolumenverdopplungszeit ist (T.H. Corbett et al., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, S. 35-87; Kluwer: Norwell, 1992). Logarithmische Bruttoabtötungswerte von >2,8, 2,0 – 2,8, 1,3 – 1,9, 0,7 – 1,2 und <0,7 bei Arzneistoffbehandlungsdauern von 5 bis 20 Tagen werden mit + + + +, + + +, + +, + bzw. – (inaktiv) bewertet. Eine Aktivitätsbewertung von + + + bis + + + +, die klinische Aktivität anzeigt, ist erforderlich, um teilweise oder vollständige Regression von Massen mit einer Größe von 100 bis 300 mg der meisten transplantierten massiven Tumoren von Mäusen zu bewirken. Kryptophycin 52 zeigt T/C-Werte im Bereich von 0 bis 14% für murine Tumore und 4,1 bis 16 für menschliche Tumore und logarithmische Bruttoabtötungswerte im Bereich von 1,1 bis 2 für murine Tumore und 0 bis 3,2 für menschliche Tumore. Kryptophycin 1 zeigt T/C-Werte im Bereich von 0 bis 27% und logarithmische Abtötungswerte im Bereich von < 1 bis 2. Kryptophycin 55 zeigt T/C-Werte im Bereich von meist 0 bis 4,4% und logarithmische Abtötungswerte im Bereich von 2,1 bis >4,6 (Heilungen) für alle bis auf einen Versuch, das Colon-26-Experiment, das einen logarithmischen Bruttoabtötungswert von 1,2 zeigte. Kryptophycin 8 zeigt T/C-Werte von meist 0% und logarithmische Abtötungswerte von >2,8 (mehrere Heilungen), wie dargestellt in Tabelle 10. Die Kryptophycine 117 und 125 scheinen T/C- und logarithmische Bruttoabtötungswerte zu haben, die vergleichbar sind mit denjenigen anderer Kryptophycine vom Epoxid-Typ, nämlich den Kryptophycinen 1 und 52, wohingegen die Kryptophycine 128 und 132 T/C- und logarithmische Bruttoabtötungswerte haben, die vergleichbar sind mit denjenigen anderer Kryptophycine vom Chlorophycin-Typ, nämlich den Kryptophycinen 8 und 55.
  • Tabelle 1. In-Vivo-Aktivität von Kryptophycin 1
    Figure 00810001
  • Tabelle 2. In-Vivo-Aktivität von Kryptophycinanalogen
    Figure 00820001
  • Tabelle 3 Cytotoxizitäten von Antimitosemitteln für SKOV3- und SKVLB1-Zellen
  • Die Zellen wurden mit variierenden Konzentrationen der unten angegebenen Verbindungen für 48 Stunden behandelt. Zellzahlen wurden bestimmt, wie angegeben im Abschnitt Methoden, und die IC50 für jede Verbindung wurde berechnet. Werte stellen den Mittelwert ± SEM für drei Experimente dar.
  • Figure 00830001
  • Tabelle 4 In-Vitro-Cytotoxizitätdaten fürs Kryptophycine
    Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • IN-VIVO-AKTIVITÄT VON KRYPTOPHYCIN-8
    Figure 00880001
  • Literaturstellen
    • 1. Eglof, G., Organic Chemistry; An Advanced Treatise, Gilmar et al. (Hrg.), S. 31-46, John Wiley & Sons (1943).
    • 2. Kemp, et al., Organic Chemistry, Worth Publishers, Inc. (1980).
    • 3. Patterson, G.M. L. et al., J. Phycol. 27:530-536 (1991).
    • 4. Corbett, T.H. et al., Cytotoxic Anticancer Drugs; Models and Concepts for Drug Discovery and Development, S. 35-87, Kluwer Academic Publishers: Norwell, 1992.
    • 5. Valeriote, F.A. et al., Discovery and Development of Anticancer Agents, Kluwer Academic Publishers: Norwell, 1993; in Druck.
    • 6. Schwartz, R.E. et al., J. Ind. Microbiol. 5:113-124 (1990).
    • 7. Hirsch, C.F. et al., U.S. Patent 4,946,835, erteilt am 7. August 1990.
    • 8. Sesin, D.F., U.S. Patent 4,845,085, erteilt am 4. Juli 1989.
    • 9. Sesin, D.F. und Liesch, J.M., U.S. Patent 4,868,208, erteilt am 19. September 1989.
    • 10. Sesin, D.F., U.S. Patent 4,845,086, erteilt am 4. Juli 1989.
    • 11. Skehan, P. et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112 (1990).
    • 12. Bradley, G. et al., Cancer Res. 49:2790-2796 (1989).
    • 13. Endicott, J.A. et al., Ann. Rev. Biochem. 58:137-171 (1989).
    • 14. Beck, W.T., Biochem. Pharm. 36:2879-2887 (1987).
    • 15. Moscow, J.A. et al,. J. Natl. Cancer Inst. 80:14-20 (1988).
    • 16. Trimurtulu, G. et al., J. Am. Chem, Soc. 116:4729-4737 (1994).
    • 17. Smith, C.D. et al., Cancer Res. 54:3779-3784 (1994).

Claims (24)

  1. Kryptophycin mit der folgenden Struktur:
    Figure 00900001
    Formel 1 wobei Ar eine Methyl- oder Phenyl- oder aromatische Gruppe mit 4n+2 π-Elektronen in einem monocyclischen oder bicyclischen konjugierten System oder eine mit einer einzigen Gruppe oder einer heteroaromatischen Gruppe substituierte Phenylgruppe ist; R1 ein Halogenatom, SH, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylammonium, Alkylthio, Dialkylsulfonium, Sulfat oder Phosphat ist; R2 OH oder SH ist; oder R1 und R2 zusammen einen Epoxidring, einen Aziridinring, einen Episulfid-Ring, einen Sulfatring oder einen Monoalkylphosphatring bilden können; oder R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden können; R3, R7, R8 jeweils Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer oder nichtlinearer Kohlenwasserstoffketten, sind; R4 und R5 H sind; oder R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden können; R6 eine Benzyl-, Hydroxybenzyl-, Alkoxybenzyl-, Halogenhydroxybenzyl-, Dihalogenhydroxybenzyl-, Halgenalkoxybenzyl- oder Dihalogenalkoxybenzylgruppe ist; R9 und R10 jeweils unabhängig H oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, einschließlich linearer und nichtlinearer Kohlenwasserstoffketten, sind; und X und Y jeweils unabhängig O, NH oder Alkylamino sind.
  2. Kryptophycin nach Anspruch 1, wobei R8 Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl ist.
  3. Kryptophycin nach Anspruch 1, wobei R7 Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl ist.
  4. Kryptophycin nach Anspruch 1, wobei R3 Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl ist.
  5. Kryptophycin nach Anspruch 1, wobei R9 Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl ist.
  6. Kryptophycin nach Anspruch 1, wobei R10 Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Isopentyl ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei zumindest eine der Gruppen, die an C3, C6, C10, C16, C17 und C18 gebunden ist, eine R-Stereochemie aufweist.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei zumindest eine der Gruppen, die an C3, C6, C10, C16, C17 und C18 gebunden ist, eine S-Stereochemie aufweist.
  9. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen eine Doppelbindung zwischen C18 und C19 bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Epoxidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen S,S-Epoxidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 S-Chlor ist, R2 R-Hydroxyl ist, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Epoxidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 Wasserstoff sind, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 S-Chlor ist, R2 R-Hydroxyl ist, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 Wasserstoff sind, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  15. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Episulfidring bilden, R3, R7 und R8 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  16. Verbindung mit der Struktur gemäß Formel 1, wobei Ar Phenyl ist, R1 und R2 zusammen einen R,R-Aziridinring bilden, R3, R7 und R7 Methyl sind, R4 und R5 zusammen eine Doppelbindung zwischen C13 und C14 bilden, R6 3-Chlor-4-methoxybenzyl ist, R9 Isobutyl ist, R10 Wasserstoff ist und X und Y Sauerstoff sind.
  17. Verfahren zur Herstellung einer Kryptophycinverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, das die folgenden Schritte aufweist: Auswählen eines Allyl-substituierten E-Alkens; Umgruppieren des Allyl-substituierten E-Alkens durch eine stereospezifische Wittig-Umgruppierung; Überführen dieser Verbindung in eine erste δ-Aminosäure oder δ-Hydroxysäure; Koppeln der ersten Säure mit einer zweiten α-Aminosäure, um eine erste Teileinheit zu bilden; Koppeln einer dritten β-Aminosäure mit einer vierten α-Hydroxysäure oder α-Aminosäure, um eine zweite Teileinheit zu bilden; und Koppeln der ersten Teileinheit mit der zweiten Teileinheit, wodurch ein Kryptophycin erzeugt wird.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung, die für die Hemmung der Proliferation einer hyperproliferativen Mammaliazelle vorteilhaft ist, die eine wirksame Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
  19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die ferner mindestens ein weiteres antineoplastisches Mittel aufweist.
  20. Verwendung einer Kryptophycinverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikamentes für die Hemmung der Proliferation einer Mammaliazelle.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Medikament ferner mindestens ein weiteres antineoplastisches Mittel aufweist.
  22. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikamentes für die Hemmung der Proliferation einer hyperproliferativen Mammaliazelle mit einem mehrfach arnzeimittelresistenten Phenotyp.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Medikament ferner mindestens ein weiteres antineoplastisches Mittel aufweist.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die ferner mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel aufweist, das auf die Hemmung dieser Proliferation ausgerichtet ist.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000501067A (ja) * 1995-08-30 2000-02-02 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 医薬化合物
US6680311B1 (en) 1996-08-30 2004-01-20 Eli Lilly And Company Cryptophycin compounds
JP2001500484A (ja) * 1996-08-30 2001-01-16 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 医薬化合物の製造法
IL128610A (en) * 1996-08-30 2004-07-25 Lilly Co Eli Cryptophycin compound and its use as a medicament for treating neoplasm
EP0956295A1 (de) * 1996-09-06 1999-11-17 Eli Lilly And Company Herstellungsverfahren für arzneistoffe
KR20010029475A (ko) * 1996-09-06 2001-04-06 피터 지. 스트링거 약제학적 화합물의 제조 방법
JP2001502298A (ja) * 1996-09-06 2001-02-20 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 方法および新規中間体
NZ336918A (en) * 1997-02-26 2001-11-30 Lilly Co Eli Selective epoxidation process for preparing pharmaceutical compounds comprising Cryptophycin 52
AU6338698A (en) * 1997-02-26 1998-09-18 Eli Lilly And Company Tripeptide and tetrapeptide pharmaceutical compounds
EP0870501A1 (de) * 1997-04-11 1998-10-14 Eli Lilly And Company Verwendung von specifischen Cryptophycin Derivaten zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Pilzinfektionen
EP0870506A1 (de) * 1997-04-11 1998-10-14 Eli Lilly And Company Zusammentsetzungen enthaltend ein Cryptophycin Derivat in Kombination mit einem synchronisierten Wirkstoff oder Aktivierungsmittel zur Behandlung von Krebs
EP0870510A3 (de) * 1997-04-11 1999-09-15 Eli Lilly And Company Synergistische Zusammensetzung enthaltend Cryptophycinderivate und synergistische mikrotubuli Mitteln
US6103913A (en) * 1998-10-16 2000-08-15 Eli Lilly And Company Process for preparing enollactone derivatives
US6376230B1 (en) 1998-10-16 2002-04-23 Eli Lilly And Company Stereoselective process for producing intermediates of cryptophycins
AU1123200A (en) * 1998-10-16 2000-05-08 Eli Lilly And Company Stereoselective process for producing antineoplastic agents
WO2000034252A2 (en) * 1998-12-07 2000-06-15 Eli Lilly And Company Process for the preparation of cryptophycin derivatives
US6372936B1 (en) * 1999-06-09 2002-04-16 Eli Lilly And Company Optical resolution of aminoisobobutyric acid
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
US11530204B2 (en) * 2019-09-30 2022-12-20 The Regents Of The University Of Michigan Biocatalytic synthesis of cryptophycin anticancer agents

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946835A (en) * 1988-07-15 1990-08-07 Merck & Co., Inc. Antifungal fermentation product and method
US4868208A (en) * 1988-07-15 1989-09-19 Merck & Co., Inc. Antifungal agent and method
US4845086A (en) * 1988-08-09 1989-07-04 Merck & Co., Inc. Antifungal agent
US4845085A (en) * 1988-08-09 1989-07-04 Merck & Co., Inc. Antifungal agent
WO1995017093A1 (en) * 1993-12-21 1995-06-29 University Of Hawaii New cryptophycins

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Publication number Publication date
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